CA2201282A1

CA2201282A1 - Materiel viral et fragments nucleotidiques associes a la sclerose en plaques, a des fins de diagnostic, prophylactiques et therapeutiques

Info

Publication number: CA2201282A1
Application number: CA002201282A
Authority: CA
Inventors: Herve Perron; Frederic Beseme; Frederic Bedin; Glaucia Paranhos-Baccala; Florence Komurian-Pradel; Colette Jolivet-Reynaud; Bernard Mandrand
Original assignee: Individual
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 1995-08-03
Filing date: 1996-08-02
Publication date: 1997-02-20
Anticipated expiration: 2016-08-02
Also published as: EP1916304A2; JPH11502416A; NO971493D0; DE69637264D1; DE69637264T2; US20070117189A1; BR9606566A; US6579526B1; ATE541933T1; ATE374252T1; BG62977B1; SK56797A3; JP5143814B2; NZ316080A; JP2010047604A; PL319512A1; AU6823296A; CZ135797A3; FR2737500B1; AU730080B2

Abstract

Matériel viral, à l'état isolé ou purifié, dont le génome comprend une séquence nucléotidique choisie dans le groupe incluant les séquences SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 52, SEQ ID NO 53 et SEQ ID NO 56, leurs séquences complémentaires, et leurs séquences équivalentes, notamment les séquences nucléotidique présentant, pour toute suite de 100 monomères contigus, au moins 50 % et préférentiellement au moins 70 % d'homologie avec respectivement lesdites séquences SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 52, SEQ ID NO 53 et SEQ ID NO 56, et leurs séquences complémentaires.

Description

W097/06260 ~'~ 0~ 2 ~3~ PCT~R96/01244 MATERIEL VIRAL ET F~aM~NTS NUCLEOTIDIQUES ASSOCIES A LA
S~T-~RQ,~E EN PLAQUES, A DES FINS DE DIAGNOSTIC, PROPHYLACTIQUES ET ~U~PEuTIQuEs La Sclérose en Plaques (SEP) est une maladie démyélinisante du système nerveux central (SNC) dont la cause complète reste encore inconnue.
De nombreux travaux ont étayé l'hypothèse d'une étiologie virale de la maladie, mais aucun des virus connus testés ne s'est avéré être l'agent causal recherché: une revue des virus recherchés depuis des années dans la SEP a été faite par E. Norrby (1) et R.T.
Johnson (2).
Récemment, un rétrovirus, différent des rétrovirus humains connus a été isolé chez des patients atteints de SEP (3,4 et 5). Les auteurs ont aussi pu montrer que ce rétrovirus pouvait être tr~n~ in vitro, que des patients atteints de SEP produisaient des anticorps susceptibles de reconnaitre des protéines associées à l'infection des cellules leptoméningées par ce rétrovirus, et que l'expression de ce dernier pouvait être fortement stimulée par les gènes immédiats-précoces de certains herpesvirus (6).
Tous ces résultats plaident en faveur du rôle dans la SEP d'au moins un rétrovirus inconnu ou d'un virus ayant une activité transcriptase inverse détectable selon la méthode publiée par H. Perron (3) et qualifiée d'activité "RT de type LM7". Le contenu de la publication identifiée par (3) est incorporé à la présente description, par référence.
Récemment, les travaux de la Demanderesse ont permis d'obtenir deux lignées continues de cellules infectées par des isolats naturels provenant de deux patients différents atteints de SEP, par un procédé de culture tel que décrit dans le document WO-A-93 20188, dont le contenu est incorporé par référence à la présente W097/06260 ~ - PCT~R96/01244 22~ t Z~

description. Ces deux lignées dérivées de cellules de plexus-choroïdes humains, denommees LM7PC et PLI-2 ont eté
déposées à l'E.C.A.C.C. respectivement le 22 juillet 1992 et le 8 janvier 1993, sous les numéros 92 072201 et 93 010817, conformément aux dispositions du Traité de Budapest. Par ailleurs, les isolats viraux possedant une activité RT de type LM7 ont également été déposés à
l'E.C.A.C.C. sous la dénomination globale de "souches". La "souche" ou isolat hé~ergé par la lignée PLI-2, dénommée POL-2, a été déposée aupres de l'E.C.A.C.C. le 22 juillet 1992 sous le n V92072202. La "souche" ou isolat hébergé par la lignee LM7PC, denommee MS7PG, a ete déposée auprès de l'E.C.A.C.C. le 8 janvier 1993 sous le n V93010816.
A partir des cultures et des isolats précités, caractérisés par des criteres biologiques et morphologiques, on s'est ensuite attaché a caractériser le matériel nucléique associé aux particules virales produites dans ces cultures.
Les portions de génome déja caractérisées ont été
utilisées pour mettre au point des tests de détection moléculaire du génome viral et des tests immunosérologiques, utilisant les séquences d'aminoacides codés par les séquences nucléotidiques du génome viral, pour détecter la réponse immunitaire dirigée contre des épitopes associés a l'infection et/ou l'expression virale.
Ces outils ont déjà permis de confirmer une association entre la SEP et l'expression des séquences identifiées dans les brevets cités plus loin. Cependant, le systeme viral découvert par la Demanderesse, s'apparente a un système rétroviral complexe. En effet, les séquences retrouvées encapsidées dans les particules virales extracellulaires produites par les différentes cultures de cellules de patients atteints de SEP, montrent clairement qu'il y a co-encapsidation de génomes rétroviraux apparentés, mais différents du génome W097/06260 ~ 3 1 2 8 2 PCT~R96/01244 rétroviral "sauvage" qui produit les particules virales infectantes. Ce phenomene a ete obseve entre des rétrovirus réplicatifs et des retrovirus endogenes appartenant à la même famille, voire même héterologues. La notion de retrovirus endogene est tres importante dans le contexte de notre decouverte car, dans le cas de MSRV-l, on a observe que des s~equences retrovirales endogenes comprenant des sequences homologues au genome MSRV-1, existent dans l'ADN humain normal. L'existence d'elements retroviraux endogenes (ERV) apparentes a MSRV-1 par tout ou partie de leur genome, explique le fait que l'expression du rétrovirus MSRV-l dans les cellules humaines puisse interagir avec des sequences endogenes proches. Ces interactions sont retrouvees dans le cas de retrovirus endogènes pathogènes et/ou infectieux (par exemple certaines souches ecotropes du Murine Leukaemia virus), dans le cas de retrovirus exogènes dont la sequence nucleotidique peut être retrouvee partiellement ou en totalite, sous forme d'ERVs, dans le genome de l'animal hôte (ex. virus exogène de la tumeur ~ ;re de la souris transmis par le lait). Ces interactions consistent principalement en (i) une transactivation ou co-activation d'ERVs par le retrovirus replicatif, (ii) une encapsidation "illegitime" d'ARN apparentes d'ERVS, ou d'ERVs -voire d'ARN cellulaires- possedant simplement des sequences d'encapsidation compatibles, dans les particules rétrovirales produites par l'expression de la souche réplicative, parfois transmissibles et parfois avec une pathogènicité propre, et (iii) des recombinaisons plus ou moins importantes entre les genomes co-encapsides, notamment dans les phases de transcription inverse, qui conduisent à la formation de genomes hybrides, parfois transmissibles et parfois avec une pathogénicité propre.
Ainsi,(i) différentes séquences apparentées à
MSRV-1 ont été retrouvées dans les particules virales purifiées; (ii) l'analyse moléculaire des différentes W097/06260 . ; ~ . PCT~R96/01244 22~

régions du génome rétroviral MSRV-1 doit être faite en analysant systématiquement les séquences co-encapsidées, interférantes et/ou recombinées qui sont générées par l'infection et/ou l'expression de MSRV-1, de plus, certains clones peuvent avoir des parties de séquences défectives produites par la réplication rétrovirale et les erreurs de matrice et/ou de transcription de la transcriptase inverse; (iii) les familles de séquences apparentées à une même région genomique rétrovirale sont les supports d'une détection diagnostique globale qui peut être optimisée par l'identification de régions invariables parmi les clones exprimés et par l'identification de trames de lectures responsables de la production de polypeptides antigéniques et/ou pathogènes qui peuvent n'être produits que par une partie, voire un seul, des clones exprimés et dans ces conditions, l'analyse systématique des clones exprimés dans une région d'un gène donné permet d'évaluer la fréquence de variation et/ou de recombinaison du génome MSRV-l dans cette région et de définir les séquences optimales pour les applications, notamment diagnostiques; (iv) la pathologie provoquée par un rétrovirus tel que MSRV-1 peut être un effet direct de son expression et des protéines ou peptides produits de ce fait, mais aussi un effet de l'activation, de l'encapsidation, de la recombinaison de génomes apparentés ou hétérologues et des protéines ou peptides produits de ces faits ; ainsi ces génomes associés à l'expression de et/ou l'infection par MSRV-1 sont-ils une partie intégrante de la pathogénicité potentielle de ce virus et donc, constituent des supports de détection diagnostique et des cibles thérapeutiques particulières. De même tout agent associé a, ou, co-facteur de ces interactions responsables de la pathogénie en cause, tel que MSRV-2 ou le facteur gliotoxique décrits dans la demande de brevet publiée sous le N FR-2 716 198, peut participer à
l'élaboration d'une stratégie globale et très efficace de ~ W097/06260 ~ 2 0 1 2 8 2 ~ f PCT~R96/01244 diagnostic, de pronostic, de suivi thérapeutique et/ou de therapeutique integrée de la SEP notamment, mais aussi de toute autre maladie associee aux memes agents.
Dans ce contexte, on a fait une decouverte parallèle dans une autre maladie autoimmune, la polyarthrite rhumatoïde (PR), qui a ete decrite dans la demande de brevet français deposée sous le N95 02960.
Cette découverte montre que, en appliquant des approches methodologiques similaires à celles qui furent utilisees dans les travaux de la Demanderesse sur la SEP, on a pu identifier un rétrovirus exprime dans la PR qui partage les sequences decrites pour MSRV-l dans la SEP et aussi, la co-existence d'une sequence associee MSRV-2 egalement decrite dans la SEP. En ce qui concerne MSRV-l, les sequences detectees communement dans la SEP et la PR, concernent les gènes pol et gag. En l'etat actuel des connaissances, on peut associer les séquences gag et pol decrites aux souches MSRV-l exprimees dans ces deux maladies.
La presente demande de brevet a pour objet differents resultats, supplementaires par rapport à ceux déjà proteges par les demandes de brevet français :
-N 92 04322 du 03.04.1992, publiee sous le N 2 689 519 ;
-N 92 13447 du 03.11.1992, publiee sous le N 2 689 521 ;
-N 92 13443 du 03.11.1992, publiee sous le N 2 689 520 ;
-N 94 01529 du 04.02.1994, publiee sous le N 2 715 936 ;
-N 94 01531 du 04.02.1994, publiee sous le N 2 715939 ;
-N 94 01530 du 04.02.1994, publiee sous le N 2 715 936 ;
-N 94 01532 du 04.02.1994, publiee sous le N 2 715 937 ;
-N 94 14322 du 24.11.1994, publiee sous le N 2 727 428 ;
et - N 94 15810 du 23.12.1994, publiee sous le N 2 728 585.
La presente invention concerne tout d'abord un materiel viral, à l'etat isole ou purifie, pouvant être apprehende ou caractérise de differentes manières :

W097/06260 22 ~1 Z~ PCT~R96/01244 - son génome comprend une séquence nucléotidique choisie dans le groupe incluant les séquences SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 52, SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 56, SEQ ID NO 58, SEQ ID NO 59, SEQ ID NO 60, SEQ ID NO 61, SEQ ID NO 89, leurs séquences complémentaires, et leurs séquences équivalentes, notamment les séquences nucléotidiques présentant, pour toute suite de lOO monomères contigus, au moins 50 % et préférentiellement au moins 70 % d'homologie avec respectivement lesdites séquences SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 52, SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 56, SEQ ID NO 58, SEQ ID NO 59, SEQ ID NO 60, SEQ ID NO 61, SEQ ID NO 89, et leurs séquences complémentaires ;
- la région de son génome comprenant les gènes env, pol et une partie du gène gag, à l'exclusion de la sous-région ayant une séquence identique ou équivalente à
SEQ ID NO 1, code pour tout polypeptide présentant, pour toute suite contigue d'au moins 30 acides aminés, au moins 50 %, et de préférence au moins 70 % d'homologie avec une séquence peptidique codée par toute séquence nucléotidique choisie dans le groupe incluant SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 52, SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 56, SEQ ID NO 58, SEQ ID NO 59, SEQ ID NO 60, SEQ ID NO 61, SEQ ID NO 89, et leurs séquences complémentaires ;
- le gène pol comprend une séquence nucléotidique identique ou équivalente, partiellement ou totalement, à
SEQ ID NO 57, à l'exclusion de SEQ ID NO 1.
- le gène gag comprend une séquence nucléotidique identique ou équivalente, partiellement ou totalement, a SEQ ID NO 88.
Comme évoqué précédemment, selon la présente invention, le matériel viral tel que défini précédemment est associé a la SEP. Et tel que défini par référence au gène pol ou gag de MSRV-l, et plus particulièrement aux ~ W O 97/06260 2 ~ O I ~ & 2 PCTAFR96/01244 séquences SEQ ID NOS 51, 56, 57, 59, 60, 61, 88 et 89, ce matériel viral est associe a la PR.
La presente invention concerne egalement differents fragments nucleotidiques, comprenant chacun une sequence nucleotidique choisie dans le groupe incluant .
(a) toutes les sequences génomiques, partielles et totales, du gène pol du virus MSRV-1, sauf la séquence totale du fragment nucleotidique defini par SEQ ID NO 1 ;
(b) toutes les sequences genomiques, partielles et totales, du gene env de MSRV-1 ;
(c) toutes les sequences genomiques partielles du gène gag de MSRV-1 ;
(d) toutes les sequences genomiques chevauchant le gène pol et le gène env du virus MSRV-1, et chevauchant le gène pol et le gène gag ;
(e) toutes les sequences, partielles et totales, d'un clone choisi dans le groupe incluant les clones FBd3 (SEQ ID NO 46), t pol (SEQ ID NO 51), JLBcl (SEQ ID NO 52), JLBc2 (SEQ ID NO 53), GM3 (SEQ ID NO 56), FBdl3 (SEQ ID NO 58), LB19 (SEQ ID NO 59), LTRGAG12 (SEQ ID NO 60), FP6 (SEQ ID NO 61), G+E+A (SEQ ID NO 89), à l'exclusion de toute séquence nucléotidique identique à ou comprise dans la séquence définie par SEQ ID NO 1 ;
(f) les séquences complémentaires auxdites séquences genomiques ;
(g) les séquences équivalentes auxdites séquences (a) à (e), notamment les sequences nucleotidiques présentant, pour toute suite de 100 monomères contigus, au moins 50 % et de préférence au moins 70 %
d'homologie avec lesdites séquences (a) à (d), à condition que ce fragment nucléotidique ne comprenne pas ou ne consiste pas en la séquence ERV-9 telle que décrite dans LA MANTIA et al. (18).

W097/06260 ~ PCT~R96/01244 22~ 2'~ ~

Par séquences génomiques, partielles ou totales, on inclut toutes séquences associées par co-encapsidation ou par co-expression, ou recombinées.
Préférentiellement, un tel fragment comprend :
- ou une séquence nucléotidique identique à une séquence génomique partielle ou totale du gène pol du virus MSRV-l, sauf à la séquence totale du fragment nucléotidique défini par SEQ ID NO l, ou identique à
toute séquence équivalente a ladite séquence génomique partielle ou totale, notamment homologue a cette derniere ;
- ou une séquence nucléotidique identique a une séquence génomique partielle ou totale du gene env du virus MSRV-l, ou identique a toute séquence complémentaire de lS ladite séquence nucléotidique, ou identique à toute séquence équivalente à ladite séquence nucleotidique, notamment homologue à cette dernière.
De manière particulière, l'invention concerne un fragment nucléotidique comprenant une séquence nucléotidique codante, partiellement ou totalement identique à une séquence nucléotidique choisie dans le groupe incluant :
-la séquence nucléotidique définie par SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 62 ou SEQ ID NO 89 ;
-les séquences complémentaires a SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 62 ou SEQ ID NO 89 ;
-les séquences équivalentes et notamment homologues à
SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 62 ou SEQ ID NO 89 ;
-les séquences codant pour tout ou partie de la séquence peptidique définie par SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 63 ou SEQ ID NO 90 ;
-les séquences codant pour tout ou partie d'une séquence peptidique équivalente, notamment homologue à
SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 63 ou SEQ ID NO 90, susceptible d'être reconnue par des sera de patients infectés par le ~ W097/06260 ~ 2 0 i 2 ~ ~ PCT~R96/01244 virus MSRV-1, ou chez lesquels le virus MSRV-1 a eté
reactive.
L'invention concerne aussi toute sonde nucleique de detection d'un agent pathogène et/ou infectant associe à la SEP, susceptible de s'hybrider specifiquement sur tout fragment tel que précédemment défini, appartenant ou compris dans le génome dudit agent pathogène. Elle concerne en outre toute sonde nucléique de détection d'un agent pathogène et/ou infectant associé à la PR, suceptible de s'hybrider spécifiquement sur tout fragment tel que défini précédemment par reference aux gènes pol et gag, et en particulier par rapport aux sequences SEQ ID
NOS 40, 51, 56, 59, 60, 61, 62, 89 et SEQ ID NOS 39, 63 et 90 .
L'invention concerne aussi une amorce pour l'amplification par polymerisation d'un ARN ou d'un ADN
d'un materiel viral, comprenant une sequence nucleotidique identique ou equivalente à au moins une partie de la sequence nucleotidique de tout fragment tel que défini précédemment, notamment une sequence nucleotidique présentant pour toute suite de 10 monomères contigus, au moins 70 % d'homologie avec au moins ladite partie dudit fragment. Preférentiellement, la séquence nucléotidique d'une telle amorce est identique à l'une quelconque des séquences choisies dans le groupe incluant SEQ ID NO 47 a SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 55 et SEQ ID NO 64 SEQ ID NO 86.
De maniere générale, l'invention embrasse également tout ARN ou ADN, et notamment vecteur de réplication, comprenant un fragment genomique du materiel viral tel que precédemment défini, ou un fragment nucléotidique tel que précédemment défini.
L'invention s'intéresse egalement aux différents peptides codés par tout cadre de lecture ouvert appartenant a un fragment nucléotidique tel que précédemment défini, notamment tout polypeptide, par exemple tout oligopeptide formant ou comprenant un W097/06260 ~' f ~ PCT~R96/01244 ~
2201 2~2 déterminant antigenique reconnu par des sera de patients infectes par le virus MSRV-l, et/ou chez lesquels le virus MSRV-1 a eté réactivé. Préférentiellement, ce polypeptide est antigénique, et est codé par le cadre de lecture ouvert commençant dans le sens 5'-3', au nucléotide 181, et finissant au nucléotide 330 de SEQ ID NO 1.
A titre particulier, l'invention concerne un polypeptide antigénique, reconnu par les sera de patients infectés par le virus MSRV-1, et/ou chez lesquels le virus MSRV-1 a été réactivé, dont la séquence peptidique est identique, partiellement ou totalement, ou équivalente a la séquence définie par SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 63 et SEQ ID NO 87 ; une telle sequence est identique par exemple a toute sequence choisie dans le groupe incluant les séquences SEQ ID NO 41 à SEQ ID NO 44, SEQ ID NO 63 et SEQ ID NO 87.
La présente invention propose également des anticorps mono- ou polyclonaux, diriges contre le virus MSRV-1, obtenus par reaction immunologique d'un organisme humain ou animal, à un agent immunogène constitué par un polypeptide antigénique tel que défini précédemment.
L'invention s'intéresse ensuite :
- aux réactifs de détection du virus MSRV-1, ou d'une exposition a ce dernier, comprenant à titre de substance réactive, un peptide, not~mment antigénique, tel que précédemment défini, ou un anti-ligand, not~mment anticorps dudit peptide ;
- a toutes compositions diagnostiques, prophylactiques, ou thérapeutiques, comprenant un ou plusieurs peptides, notamment antigéniques, tels que précédemment définis, ou un ou plusieurs anti-ligands, notamment anticorps des peptides, considérés precedemment ; une telle composition est preférentiellement, et a titre d'exemple, une composition vaccinale. t W097/06260 ~ 2 0 1 2 8 2 PCT~R96/01244 , L'invention s'intéresse également à toute composition diagnostique, prophylactique, ou thérapeutique, notamment pour inhiber l'expression d'au moins un agent pathogene et/ou infectant associé a la SEP, comprenant un fragment nucléotidique tel que précédemment défini, ou un polynucléotide, notamment oligonucléotide, dont la séquence est partieilement identique a celle dudit fragment, sauf a celle du fragment ayant la séquence nucléotidique SEQ ID NO 1. De la même maniere, elle s'intéresse a toute composition diagnostique, prophylactique, ou thérapeutique, notamment pour inhiber l'expression d'au moins un agent pathogene et/ou infectant associé à la PR, comprenant un fragment nucléotidique tel que précédemment défini par référence aux genes pol et gag, et en particulier par rapport aux séquences SEQ ID
NOS 40, 51, 56, 59, 60, 61, 62 et 89 .
Selon l'invention, ces mêmes fragments, ou polynucléotides, notamment oligonucléotides, peuvent entrer dans toutes compositions appropriées, pour détecter, selon tout procédé ou méthode convenable, un agent pathologique, et/ou infectant, associé
respectivement à la SEP et à la PR, dans un échantillon biologique. Dans un tel procédé, on met en contact un ARN
et/ou un ADN présumé appartenir ou provenant dudit agent pathologique et/ou infectant, et/ou leur ARN et/ou ADN
complémentaire, avec une telle composition.
La présente invention concerne également tout procédé pour détecter la présence ou l'exposition à un tel agent pathologique et/ou infectant, dans un échantillon biologique, en mettant en contact cet échantillon avec un peptide, notamment antigénique, tel que précédemment défini, ou un anti-ligand, notamment anticorps de ce peptide, tel que précédemment défini.
En pratique, et par exemple, un dispositif de détection du virus MSRV-l comprend un réactif tel que précédemment défini, supporté par un support solide, W097/06260 ~ PCT~R96/01244 220128~ ~

immunologiquement compatible avec le réactif, et un moyen de mise en contact de l'échantillon biologique, par exemple un échantillon de sang ou de liquide céphalo-rachidien, susceptible de contenir des anticorps 5 anti-MSRV-l, avec ce réactif, dans des conditions permettant une éventuelle réaction immunologique, tout ceci avec des moyens de détection du complexe immun formé
avec ce réactif.
Pour terminer, l'invention concerne également la 10 détection d'anticorps anti-MSRV-l, dans un échantillon biologique, par exemple un échantillon de sang ou de liquide céphalo-rachidien, selon lequel on met en contact cet échantillon avec un réactif tel que précédemment défini, consistant en un anticorps, dans des conditions 15 permettant leur éventuelle réaction immunologique, et on détecte ensuite la présence du complexe immun ainsi formé
avec le réactif.
Avant de détailler l'invention, différents termes utilisés dans la description et les revendications sont à
20 présent définis -- par souche ou isolat, on entend toute fraction biologique infectante et/ou pathogène, contenant par exemple des virus et/ou des bactéries et/ou des parasites, générant un pouvoir pathogène et/ou antigénique, hébergée 25 par une culture ou un hôte vivant ; à titre d'exemple, une souche virale selon la définition précédente peut contenir un agent co-infectant, par exemple un protiste pathogène, - le terme "MSRV" utilisé dans la présente description désigne tout agent pathogène et/ou infectant, 30 associé à la SEP, notamment une espèce virale, les souches atténuées de ladite espèce virale, ou les particules défectives interférentes ou contenant des génomes co-encapsidés ou encore des génomes recombinés avec une partie du génome MSRV-l, dérivées de cette espèce. Il est 35 connu que les virus et particulièrement les virus r contenant de l'ARN ont une variabilité, consécutive ~ W097/06260 ~ G i ~ 8 2 - - ` ` PCT~R96/01244 notamment à des taux relativement élevés de mutation spontanée (7), dont il sera tenu compte ci-après pour définir la notion d'équivalence, - par virus humain, on entend un virus susceptible d'infecter ou d'être hébergé par l'être humain, - compte tenu de toutes les variations et/ou recombinaison naturelles ou induites, pouvant être rencontrées dans la pratique de la présente invention, les objets de cette dernière, définis ci-dessus et dans les revendications, ont été exprimés en comprenant les équivalents ou dérivés des différents matériels biologiques définis ci-après, notamment des séquences homologues nucléotidiques ou peptidiques, - le variant d'un virus ou d'un agent pathogène et/ou infectant selon l'invention, comprend au moins un antigène reconnu par au moins un anticorps dirigé contre au moins un antigène correspondant dudit virus et/ou dudit agent pathogène et/ou infectant, et/ou un génome dont toute partie est détectée par au moins une sonde d'hybridation, et/ou au moins une amorce d'amplification nucléotidique spécifique dudit virus et/ou agent pathogene et/ou infectant, comme par exemple pour le virus dit MSRV-l, celles ayant une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N 20 à SEQ ID N 24, SEQ ID N 26, SEQ ID N 16 à SEQ ID N l9, SEQ ID N 31 à SEQ ID N 33, SEQ ID N 45, SEQ ID N 47, SEQ ID N 48, SEQ ID N 49, SEQ ID N 50, SEQ ID N 45 et leurs séquences complémentaires, dans des conditions d'hybridation déterminées bien connues de l'homme de l'art, - selon l'invention, un fragment nucléotidique ou un oligonucléotide ou un polynucléotide est un encha~nement de monomères, ou un biopolymère, caractérisé
par la séquence informationnelle des acides nucléiques naturels, susceptible de s'hybrider à tout autre fragment nucléotidique dans des conditions prédéterminées, W097/06260 2 ~ ~ ~ 2 ~ 2 - 1 PCT~R96/01244 ~

l'encha~nement pouvant contenir des monomères de structures chimiques différentes et être obtenu à partir d'une molécule d'acide nucléique naturelle et/ou par recombinaison génétique et/ou par synthèse chimique ; un fragment nucléotidique peut être identique à un fragment génomique du virus MSRV-l considéré par la présente invention, notamment un gène de ce dernier, par exemple pol ou env dans le cas dudit virus ;
- ainsi un monomère peut être un nucléotide naturel d'acide nucléique, dont les éléments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée;
dans 1'ARN le sucre est le ribose, dans 1'ADN le sucre est le désoxy-2-ribose; selon qu'il s'agit de l'ADN ou l'ARN, la base azotée est choisie parmi l'adénine, la guanine, l'uracile, la cytosine, la thymine; ou le nucléotide peut être modifié dans l'un au moins des trois éléments constitutifs ; à titre d'exemple, la modification peut intervenir au niveau des bases, générant des bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la désoxyuridine, ladiméthylamino-5-désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine et toute autre base modifiée favorisant l'hybridation; au niveau du sucre, la modification peut consister dans le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide ~8), et au niveau du groupement phosphate, la modification peut consister dans son remplacement par des esters, notAmm~nt choisis parmi les esters de diphosphate, d'alkyl et arylphosphonate et de phosphorothioate, - par "séquence informationnelle", on entend toute suite ordonnée de monomères, dont la nature chimique et l'ordre dans un sens de référence, constituent ou non une information fonctionnelle de meme qualité que celle des acides nucléiques naturels, - par hybridation, on entend le processus au cours duquel, dans des conditions opératoires appropriées, W097/06260 ~ 2 a ~ 2 ~`? r, ' ~ PCT~R96/01244 deux fragments nucléotidiques, ayant des séquences suffisamment complémentaires, s'apparient pour former une structure complexe, notamment double ou triple, de preférence sous forme d'hélice, - une sonde comprend un fragment nucléotidique synthétisé par voie chimique ou obtenu par digestion ou coupure enzymatique d'un fragment nucléotidique plus long, comprenant au moins six monomeres, avantageusement de l0 a 100 monomeres, de préférence 10 a 30 monomeres, et possédant une spécificite d'hybridation dans des conditions determinees ; de preférence, une sonde possédant moins de 10 monomères n'est pas utilisee seule, mais l'est en presence d'autres sondes de taille aussi courte ou non ; dans certaines conditions particulières, il peut être utile d'utiliser des sondes de taille superieure à 100 monomeres ; une sonde peut notamment être utilisee a des fins de diagnostic et il s'agira par exemple de sondes de capture et/ou de detection, - la sonde de capture peut être immobilisee sur un support solide par tout moyen approprie, c'est-à-dire directement ou indirectement, par exemple par covalence ou adsorption passive, - la sonde de détection peut être marquée au moyen d'un marqueur choisi notamment parmi les isotopes radioactifs, des enzymes notamment choisis parmi la péroxydase et la phosphatase alcaline et ceux susceptibles d'hydrolyser un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent, des composés chimiques chromophores, des composés chromogenes, fluorigenes ou luminescents, des analogues de bases nucléotidiques, et la biotine, - les sondes utilisées a des fins de diagnostic de l'invention peuvent être mises en oeuvre dans toutes les techniques d'hybridation connues, et notamment les ter-hn;ques dites "DOT-BLOT" ~9), "SOUTHERN BLOT" ~10), "NORTHERN BLOT" qui est une technique identique a la technique "SOUTHERN BLOT" mais qui utilise de l'ARN comme -W097/06260 2 2 0 1 2 8 ~ ` - PCT~R96/01244 cible, la technique SANDWICH (11) ; avantageusement, on utilise la technique SANDWICH dans la presente invention, comprenant une sonde de capture specifique et/ou une sonde de detection spécifique, étant entendu que la sonde de S capture et la sonde de détection doivent présenter une séquence nucléotidique au moins partiellement différente, - toute sonde selon la présente invention peut s'hybrider in vivo ou in vitro sur l'ARN et/ou sur l'ADN, pour bloquer les phénomènes de réplication, notamment traduction et/ou transcription, et/ou pour degrader ledit ADN et/ou ARN, - une amorce est une sonde comprenant au moins six monomères, et avantageusement de 10 à 30 monomères, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées, pour l'initiation d'une polymérisation enzymatique, par exemple dans une technique d'amplification telle que la PCR (Polymerase Chain Reaction), dans un procédé d'elongation, tel que le séquençage, dans une méthode de transcription inverse ou analogue, - deux séquences nucléotidiques ou peptidiques sont dites équivalentes ou dérivées l'une par rapport à
l'autre, ou par rapport à une séquence de référence, si fonctionnellement les biopolymères correspondants peuvent jouer sensiblement le même rôle, sans être identiques, vis-à-vis de l'application ou utilisation considérée, ou dans la technique dans laquelle elles interviennent ; sont notamment équivalentes deux séquences obtenues du fait de la variabilité naturelle, notamment mutation spontanée de l'espèce a partir de laquelle elles ont été identifiées, ou induite, ainsi que deux séquences homologues, l'homologie étant définie ci-apres, - par "variabilité", on entend toute modification, spontanée ou induite d'une séquence, notamment par substitution, et/ou insertion, et/ou délétion de nucléotides et/ou de fragments nucléotidiques, ~ W097/06260 2 2 ~ ~ 2 ~ 2 ~ PCT~R96/01244 et/ou extension et/ou racourcissement de la séquence à
l'une au moins des extrémités; une variabilité non naturelle peut résulter des techniques de génie génétique utilisées, par exemple du choix des amorces de synthèse dégénérées ou non, retenues pour amplifier un acide nucléique; cette variabilité peut se traduire par des modifications de toute séquence de départ, considérée comme référence, et pouvant être exprimées par un degré
d'homologie par rapport a ladite séquence de référence, - l'homologie caractérise le degré d'identité de deux fragments nucléotidiques ou peptidiques comparés ;
elle se mesure par le pourcentage d'identité qui est notamment déterminé par comparaison directe de séquences nucléoditiques ou peptidiques, par rapport a des séquences nucléotidiques ou peptidiques de référence, - ce pourcentage d'identité a été spécifiquement déterminé pour les fragments nucleotidiques, notamment clones relevant de la présente invention, homologues aux fragments identifiés pour le virus MSRV-1 par SEQ ID N 1 a N 9, SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 51 à SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 56 et SEQ ID NO 57, ainsi que pour les sondes et amorces homologues aux sondes et amorces identifiées par SEQ ID NO 20 a SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 16 a SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 31 a SEQ ID NO 33, SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 48, SEQ ID NO 49, SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 55, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 56 et SEQ ID NO 57 ; à titre d'exemple, le plus faible pourcentage d'identité observé entre les differents consensus généraux en acides nucléiques obtenus a partir de fragments d'ARN viral de MSRV-1, issu des lignées LM7PC
et PLI-2 selon un protocole détaille plus loin, est de 67%
dans la région décrite a la figure 1, - tout fragment nucléotidique est dit équivalent ou dérivé d'un fragment de référence, s'il présente une séquence nucléotidique équivalente a la séquence du fragment de référence ; selon la définition précédente, W097/06260 ~ 2 0 ~ 2 ~ PCT~R96/01244 sont notamment équivalents à un fragment nucléotidique de référence :
(a) tout fragment susceptible de s'hybrider au moins partiellement avec le complément du fragment de S référence, (b) tout fragment dont l'alignement avec le fragment de référence conduit à mettre en évidence des bases contigues identiques, en nombre plus important qu'avec tout autre fragment provenant d'un autre groupe taxonomique, (c) tout fragment resultant ou pouvant resulter de la variabilité naturelle de l'espèce, à partir de laquelle il est obtenu, (d) tout fragment pouvant résulter des techniques de génie génétique appliquées au fragment de référence, (e) tout fragment, comportant au moins huit nucléotides contigus, codant pour un peptide homologue ou identique au peptide codé par le fragment de référence, (f) tout fragment différent du fragment de référence, par insertion, délétion, substitution d'au moins un monomere, extension, ou raccourcissement à l'une au moins de ses extrémités ; par exemple, tout fragment correspondant au fragment de référence, flanqué a l'une au moins de ses extrémités par une sequence nucléotidique ne codant pas pour un polypeptide, - par polypeptide, on entend notamment tout peptide d'au moins deux acides aminés, notamment oligopeptide, protéine, extrait, séparé, ou substantiellement isolé ou synthétisé, par l'intervention de la main de l'homme, notamment ceux obtenus par synthèse chimique, ou par expression dans un organisme recombinant, - par polypeptide codé de maniere partielle par un fragment nucléotidique, on entend un polypeptide présentant au moins trois acides aminés codés par au moins neuf monomeres contigus compris dans ledit fragment nucléotidique, W097/06260 ~ ~1 2 ~ PCT~R96/01244 - un acide amine est dit analogue à un autre acide aminé, lorsque leur caractéristiques physico-chimiques respectives, telles que polarité, hydrophobicité, ettou basicite, et/ou acidité, et/ou neutralité, sont sensiblement les mêmes ; ainsi, une leucine est analogue à une isoleucine.
- tout polypeptide est dit équivalent ou dérivé
d'un polypeptide de référence, si les polypeptides comparés ont sensiblement les mêmes propriétés, et notamment les mêmes propriétés antigéniques, immunologiques, enzymologiques et/ou de reconnaissance moléculaire ; est notamment équivalent à un polypeptide de référence :
(a) tout polypeptide possedant une sequence dont au moins un acide amine a été substitué par un acide aminé
analogue, (b) tout polypeptide ayant une séquence peptidique équivalente, obtenue par variation naturelle ou induite dudit polypeptide de référence, ettou du fragment nucléotidique codant pour ledit polypeptide, (c) un mimotope dudit polypeptide de référence, (d) tout polypeptide dans la séquence duquel un ou plusieurs acides aminés de la série L sont remplacés par un acide aminé de la série D, et vice versa, (e) tout polypeptide dans la séquence duquel on a introduit une modification des chaînes latérales des acides aminés, telle que par exemple une acétylation des fonctions amines, une carboxylation des fonctions thiol, une estérification des fonctions carboxyliques, (f) tout polypeptide dans la sequence duquel une ou des liaisons peptidiques ont été modifiées, comme par exemple les liaisons carba, rétro, inverso, rétro-inverso, réduites, et méthylène-oxy, (g) tout polypeptide dont au moins un antigène est reconnu par anticorps dirigé contre un polypeptide de référence, W097/06260 . -. t - ~ PCT~R96/01244 ~ 2 0 ~

- le pourcentage d'identité caracterisant l'homologie de deux fragments peptidiques compares est selon la presente invention d'au moins 50~ et de préference au moins 70 %.
Etant donne qu'un virus possedant une activité
enzymatique tra-nscriptase inverse peut être génétiquement caractérisé aussi bien sous forme d'ARN que d'ADN, il sera fait mention aussi bien de l'ADN que de l'ARN viral pour caractériser les séquences relatives a un virus possedant une telle activite transcriptase inverse, dit MSRV-1 selon la présente description.
Les expressions d'ordre utilisées dans la présente description et les revendications, telles que "premiere séquence nucléotidique" ne sont pas retenues pour exprimer un ordre particulier, mais pour définir plus clairement l'invention.
Par détection d'une substance ou agent, on entend ci-après aussi bien une identification, qu'une quantification, ou une séparation ou isolement de ladite substance ou dudit agent.
L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui va suivre faite en référence aux figures annexées dans lesquelles :
- la figure 1 représente des consensus généraux en acides nucléiques des clones MSRV-lB amplifiés par la techn;que PCR dans la région "pol" définie par Shih ~12), à partir d'ADN viral issu des lignées LM7PC et PLI-2, et identifiés sous les références SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, et SEQ ID NO 6, et le consensus commun avec amorces d'amplification portant la référence SEQ ID NO 7, - la figure 2 donne la définition d'une trame de lecture fonctionnelle pour chaque famille de type MSRV-lB/"PCR pol", lesdites familles A à D étant définies respectivement par les sequences nucléotidiques SEQ ID NO
3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, et SEQ ID NO 6, décrites à la figure 1, W097/06260 PCT~R96/01244 ~201 ~32;; "` ~`

- la figure 3 donne un exemple de consensus des séquences de MSRV-2B, identifié par SEQ ID NO 11, - la figure 4 est une représentation de l'activité transcriptase inverse (RT) en dpm (désintegration par minute), dans les fractions de saccharose prelevées sur un gradient de purification des virions produits par les lymphocytes B en culture d'un patient atteint de SEP, - la figure 5 donne, dans les memes conditions exprimentales qu'à la figure 4, le dosage de l'activité
transcriptase inverse dans la culture d'une lignée de lymphocytes B obtenue à partir d'un témoin exempt de SEP, - la figure 6 représente la séquence nucléotidique du clone PSJ17 (SEQ ID NO 9), - la figure 7 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO 8, du clone dénommé M003-P004, - la figure 8 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO 2 du clone F11-1 ; la partie repérée entre les deux flèches dans la région de l'amorce correspond à une variabilité imposée par le choix de l'amorce ayant servi au clonage de Fll-1 ; sur cette meme figure, la traduction en acides aminés est représentée, - la figure 9 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO 1, et une trame fonctionnelle de lecture possible en acides aminés de SEQ ID NO l; sur cette séquence, les séquences consensus du gène pol sont soulignées, - les figures 10 et ll donnent les résultats d'une PCR, sous forme de photographie sous lumière ultra-violette d'un gel d'agarose imprégné de bromure d'éthidium, des produits d'amplification obtenus à partir des amorces identifiées par SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, et SEQ ID NO 19.
- la figure 12 donne une représentation matricielle de l'homologie entre SEQ ID NO 1 de MSRV-1 et celle d'un rétrovirus endogène dénommé HSERV9 ; cette W097/06260 ~ 2 0 ~ 2 & 2, ~ PCT~R96/01244 ~

homologie d'au moins 65 % est mise en evidence par un trait plein, l'absence de trait signifiant une homologie inferieure à 65 % ;
- la figure 13 represente la séquence nucléotidique SEQ ID NO 46 du clone FBd3, - la figure 14 représente l'homologie de séquence entre le clone FBd3 et le rétrovirus HSERV-9 ;
- la figure 15 represente la sequence nucléotidique SEQ ID NO 51 du clone t pol ;
- les figures 16 et 17 représentent respectivement les séquences nucléotidiques SEQ ID NO 52 et SEQ ID NO 53, des clones JLBcl et JLBc2 respectivement ;
- la figure 18 représente l'homologie de séquence entre le clone JLBcl et le clone FBd3, - et la figure 19 l'homologie de séquence entre le clone JLBc2 et le clone FBd3 ;
- la figure 20 représente l'homologie de séquence entre les clones JLBcl et JLBc2 ;
- les figures 21 et 22 representent l'homologie de séquence entre le rétrovirus HSERV-9, et respectivement les clones JLBcl et JLBc2 ;
- la figure 23 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO 56 du clone GM3 ;
- la figure 24 représente l'homologie de séquence entre le rétrovirus HSERV-9 et le clone GM3 ;
- la figure 25 représente la localisation des différents clones étudiés, par rapport au génome du rétrovirus connu ERV9 ;
- la figure 26 représente la position des clones F11-1, M003-P004, MSRV-lB et PSJ17 dans la région dénommée ci-après MSRV-1 pol * ;
- la figure 27, éclatée en trois figures successives 27a, 27b, 27c représente un cadre de lecture possible, couvrant l'ensemble du gène pol ;

~ W097/06260 ,...~ ., PCT~R96/01244 ~20 1 2~2` ; `-- la figure 28 représente selon SEQ ID NO 40, la séquence nucléotidique codant pour le fragment peptidique POL2B, ayant la séquence en acides aminés identifiée par SEQ ID NO 39 ;
- la figure 29 représente les valeur de DO
(tests ELISA) à 492 nm obtenues pour 29 serums de patients SEP et 32 serums de témoins sains testés avec un anticorps anti-IgG ;
- la figure 30 représente les valeurs de DO
(tests ELISA) à 492 nm obtenues pour 36 sérums de patients SEP et 42 sérums de témoins sains testés avec un anticorps anti-IgM ;
- les figures 31 à 33 représentent les résultats obtenus (intensité relative des spots) pour 43 octapeptides chevauchants couvrant la séquence en acides aminés 61-110, selon la technique Spotscan, respectivement avec un pool de sérums de SEP, avec un pool de sérums témoins et avec le pool de sérums SEP apres deduction d'un bruit de fond correspondant au signal maximum detecté sur au moins un octapeptide avec le sérum témoin (intensité = 1), étant entendu que ces sérums ont été dilués au 1/50eme. La barre a l'extrême droite represente un standard d'échelle graphique sans rapport avec le test sérologique ;
- la figure 34 représente les SEQ ID NO 41 et SEQ ID NO 42 de deux polypeptides comprenant immuno-dominantes, tandis que SEQ ID NO 43 et 44 représentent des polypeptides immuno-réactifs et spécifiques a la SEP ;
- la figure 35 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO 59 du clone LB19 et trois trames de lecture potentielles en acides aminés de SEQ ID NO 59 ;
- la figure 36 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO 88 (GAG*) et une trame de lecture potentielle en acides aminés de SEQ ID NO 88 ;

W097/06260 2 2 0 ~ ~ 8 2 . ~ PCT~R96/01244 - la figure 37 représente l'homologie de séquence entre le clone FBdl3 et le rétrovirus HSERV-9 ; selon cette représentation, le trait plein signifie un pourcentage d'homologie supérieur ou égal à 70% et l'absence de trait signifie un pourcentage d'homologie inférieur ;
- la figure 38 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO 61 du clone FP6 et trois trames de lecture potentielles en acides aminés de SEQ ID NO 61 ;
- la figure 39 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO 89 du clone G+E+A et trois trames de lecture potentielles en acides aminés de SEQ ID NO 89 ;
- la figure 40 représente un cadre de lecture trouvé dans la région E et codant pour une protéase rétrovirale MSRV-1 identifiée par SEQ ID NO 90 ;
- la figure 41 représente la réponse de chaque sérum de patients atteints de SEP indiqué par le symbole (+) et de patients sains symbolisé par (-), testé avec un anticorps anti-IgG exprimée en densité optique nette à 492 nm;
- la figure 42 représente la réponse de chaque sérum de patients atteints de SEP indiqué par les symboles (+) et (QS) et de patients sains (-), testé avec un anticorps anti-IgM exprimée en densité optique nette à 492 nm.

~ MYLE 1 : ObL~:L.~10N DE C~.ON~..C DENOMMES MSRV-1B
ET MSRV-2B, DEFTNT~.C~NT RESPE~11V~LIENT UN RETROVIRUS
MSRV-1 ET UN AGENT CO_1N~LANT MSRV2, PAR AMPLIFICATION
PCR ~NICHEE~ DES REGIONS POL CON~v~S DES RETROVIRUS, Une technique PCR dérivée de la technique publiée par Shih (12) a été utilisée. Cette technique permet, par traitement de tous les composants du milieu réactionnel ~ WO 97/06260 ; ~ PCT/FR96/01244 22~ 2~2 ~ ``

par la DNase, d'éliminer toute trace d'ADN contaminant.
Elle permet parallèlement, par l'utilisation d'amorces différentes mais chevauchantes dans deux séries successives de cycles d'amplifications PCR, d'augmenter 5 les chances d'amplifier un ADNc synthétisé à partir d'une quantité d'ARN faible au départ et encore réduite dans 1'échantillon par l'action parasite de la DNAse sur l'ARN.
En effet, la DNase est utilisée dans des conditions d'activité en excès qui permettent d'éliminer toute trace 10 d'ADN contaminant, avant inactivation de cette enzyme restant dans l'échantillon par chauffage à 85C pendant 10 minutes. Cette variante de la technique PCR décrite par Shih (12), a été utilisée sur un ADNc synthétisé à partir des acides nucléiques de fractions de particules 15 infectantes purifiées sur gradient de saccharose, selon la technique décrite par H. Perron (13), à partir de l'isolat "POL-2" (ECACC nV92072202) produit par la lignee PLI-2 (ECACC n92072201) d'une part, et à partir de l'isolat MS7PG (ECACC nV93010816) produit par la lignée LM7PC
(ECACC n93010817) d'autre part. Ces cultures ont été
obtenues selon les méthodes ayant fait l'objet des demandes de brevet publiées sous les n WO 93/20188 et WO 93/20189.
Après clonage avec le TA Cloning Kit~9 des 25 produits amplifiés par cette technique et analyse de la séquence à l'aide d'un séquençeur automatique "Automatic Sequencer, modèle 373A" d'Applied Biosystems, les séquences ont été analysées à l'aide du logiciel Geneworks~, sur la dernière version disponible de la 30 banque de données Genebank~9.
Les séquences clonées et sequencees à partir de ces échantillons correspondent notamment à deux types de séquences: un premier type de sequence, retrouvé dans la majorité des clones (55 % des clones issus des isolats 35 POL-2 des culture PLI-2, et, 67 % des clones issus des isolats MS7PG des cultures LM7PC), qui correspond à une W097/06260 ~ 2 ~ 1 2 & 2 ~ PCT~R96/01244 famille de séquences "pol" proches mais différentes du rétrovirus endogene humain dénommé ERV-9 ou HSERV-9, et un second type de séquence qui correspond à des séquences très fortement homologues à une séquence attribuée à un autre agent infectant et/ou pathogène dénommé MSRV-2.
Le premier type de séquences représentant la majorité des clones est constituée de séquences dont la variabilité permet de définir quatre sous-familles de séquences. Ces sous-familles sont suffisamment proches entre elles pour qu'on puisse les considerer comme des quasi-espèces provenant d'un même retrovirus, tel que cela est bien connu pour le retrovirus HIV-l (14), ou comme le résultat de l'interférence avec plusieurs provirus endogènes co-régulés dans les cellules productrices. Ces éléments endogènes plus ou moins defectifs sont sensibles aux mêmes signaux de regulation générés éventuellement par un provirus réplicatif, puisqu'ils appartiennent à la même famille de rétrovirus endogènes (15). Cette nouvelle famille de rétrovirus endogènes ou, alternativement, cette nouvelle espèce rétrovirale dont on a obtenu en culture la génération de quasi-espèces, et qui contient un consensus des séquences décrites ci-dessous est dénommée MSRV-lB.
Dans la figure 1 sont présentés les consensus généraux des séquences des différents clones MSRV-lB
séquencés lors de cette expérience, ces séquences étant respectivament identifiées par SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, et SEQ ID NO 6. Ces séquences présentent une homologie en acides nucléiques allant de 70 % à 88 % avec la séquence HSERV9 référencée X57147 et M37638 dans la base de données Genebank~. Quatre séquences nucléiques "consensus" représentatives de différentes quasi-espèces d'un rétrovirus MSRV-lB éventuellement exogène, ou de différentes sous-familles d'un rétrovirus endogène MSRV-lB, ont été définies. Ces consensus représentatifs sont présentés dans la figure 2, avec la traduction en acides aminés. Une trame de lecture fonctionnelle existe ~ W097/06260 2 2 0 i 2 ~ ~ ~ ` PCT~R96/01244 pour chaque sous-famille de ces sequences MSRV-lB, et l'on peut voir que la trame de lecture ouverte fonctionnelle correspond à chaque fois à la sequence en acides amines venant en deuxième ligne sous la sequence en acide nucléiques. Le consensus géneral de la séquence MSRV-lB, identifié par SEQ ID NO 7 et obtenu par cette technique PCR dans la région "pol" est présenté dans la figure l.
Le deuxième type de séquence représentant la majorité des clones séquencés est représenté par la séquence MSRV-2B presentée dans la figure 3 et identifiee par SEQ ID NO ll. Les differences observees dans les séquences correspondant aux amorces PCR s'expliquent par l'utilisation d'amorces dégénérées en mélange utilisees dans des conditions techniques différentes.
La séquence MSRV-2B (SEQ ID NO ll) est suffisamment divergente des séquences rétrovirales déjà
décrites dans les banques de donnees pour qu'on puisse avancer qu'il s'agit d'une région de sequence appartenant à un nouvel agent infectant,-denomme MSRV-2. Cet agent infectant s'apparenterait a priori, d'apres l'analyse des premières séquences obtenues, à un rétrovirus, mais, étant donnée la techn;que utilisée pour obtenir cette séquence, il pourrait aussi s'agir d'un virus à ADN dont le génome code pour une enzyme qui possede accessoirement une activité transcriptase inverse comme c'est le cas, par exemple, pour le virus de l'hépatite B, HBV (12). De plus, le caractère aléatoire des amorces dégénérées utilisées pour cette technique d'amplification PCR peut très bien avoir permis, du fait d'homologies de séquences imprévues ou de sites conservés dans le gène d'une enzyme apparentée, l'amplification d'un acide nucléique provenant d'un agent pathogène et/ou co-infectant prokaryote ou eukaryote (protiste).

W097/06260 ~ 0~ 2 ~ ~ ~ ; PCT~R96/01244 ~ I~LE 2 : O~ NllON DE ~T-~N~,~ DENO~MES MSRV-lB
ET MSRV-2B, DEFINISSANT UNE F~MTT~T~ MSRV-l et MSRV2, PAR
AMPLIFICATION PCR "NICHEE" DES REGIONS POL CON~:~v~S DES
RETROVIRUS, SUR DES PREPARATIONS DE LYMPHOCYTES B D'UN
N~uv~:AU CAS DE SEP

La même tPchn;que PCR modifiée d'apres la technique de Shih (12) a été utilisée pour amplifier et séquencer le matériel nucléique ARN present dans une fraction de virions purifiee au pic d'activite transcriptase inverse "de type LM7", sur gradient de saccharose selon la ~echn;que decrite par H. Perron ~13), et selon les protocoles mentionnés dans l'exemple 1, a partir d'une lignée lymphoblastoïde spontanee, obtenue par auto-immortalisation en culture de lymphocytes B d'un patient SEP séropositif pour le virus d'Epstein-Barr (EBV), apres mise en culture des cellules lymphoïdes sanguines dans un milieu de culture approprié
contenant une concentration appropriée de cyclosporine A.
Une représentation de l'activité transcriptase inverse dans les fractions de saccharose prélevées sur un gradient de purification des virions produits par cette lignée est présentée dans la figure 4. De même, les surnageants de culture d'une lignée B obtenue dans les memes conditions à
partir d'un témoin exempt de SEP ont été traités dans les memes conditions, et le dosage de l'activité transcriptase inverse dans les fractions du gradient de saccharose s'est avéré négatif partout (bruit de fond) et est présenté dans la figure 5. La fraction 3 du gradient correspondant à la lignée B de SEP et la même fraction sans activité
transcriptase inverse du gradient témoin non-SEP, ont été
analysées par la meme technique RT-PCR que précédemment, dérivée de Shih ~12), suivie des memes étapes de clonage et de séquençage tels que décrites dans l'exemple 1.
Il est tout à fait notable que les séquences de type MSRV-1 et MSRV-2 soient retrouvées dans le seul W097/06260 2 ~ PCT~R96/01244 matériel associé a un pic d'activite transcriptase inverse "de type LM7" provenant de la lignee lymphoblastoïde B de SEP. Ces sequences n'ont pas ete retrouvees avec le matériel de la lignée lymphoblastoïde B témoin ~non-SEP) dans 26 clones recombinants pris au hasard. Seules les séquences contaminantes de type Mo-MuLV provenant de la transcriptase inverse commerciale utilisée pour l'étape de synthèse de l'ADNc et des séquences sans analogie rétrovirale particulière ont été retrouvées chez ce témoin, du fait de l'amplification "consensus" des séquences de polymérases homologues que réalise cette technique PCR. De plus, l'absence de cible concentrée qui fait compétition pour la réaction d'amplification dans l'échantillon témoin permet l'amplification de contaminants dilués. La différence de résultats est à
l'évidence hautement significative (chi-2, pC0,001).

~I~LE 3 : O~ lON D'UN CLONE PSJ17, DEFINISSANT UN RETROVIRUS MSRV-l, PAR REACTION DE
TRANSCRIPTASE INVERSE ENDOGENE SUR UNE PREPARATION DE
VIRION ISSUE DE LA LIGNEE PLI-2.

Cette approche vise à obtenir des séquences d'ADN
rétrotranscrites à partir de 1'ARN supposé rétroviral dans l'isolat, en utilisant l'activité transcriptase inverse présente dans ce même isolat. Cette activité transcriptase inverse ne peut théoriquement fonctionner qu'en présence d'un ARN rétroviral, lié à un ARNt amorce ou hybridé à des brins courts d'ADN déjà rétro-transcrits dans les particules rétrovirales ~16). Ainsi l'obtention de séquences rétrovirales spécifiques dans un matériel contaminé par des acides nucléiques cellulaires, a été
optimisée selon ces auteurs grâce a l'amplification enzymatique spécifique des portions d'ARN viraux par une activité transcriptase inverse virale. Les auteurs ont .

W097/06260 ; ~ ' ; PCT~R96/01244 ~201 2~ --pour cela, déterminé les conditions physico-chimiques particulières dans lesquelles cette activité enzymatique de transcription inverse sur des ARN contenus dans des virions pouvait être effective in vitro. Ces conditions S correspondent a la description technique des protocoles présentés ci-dessous (réaction de RT endogene, purification, clonage et séquençage).
L'approche moléculaire a consisté à utiliser une préparation de virion concentré, mais non purifié, obtenu à partir des surnageants de culture de la lignée PLI-2 préparés selon la méthode suivante : les surnageants de culture sont collectés deux fois par semaine, pré-centrifugés a 10 000 trs/min pendant 30 minutes pour eliminer les debris cellulaires, et ensuite, congelés a -80C ou utilisés tels quels pour les étapes suivantes.
Les surnageants frais ou décongelés sont centrifugés sur un coussin de PBS-glycérol 30% a 100 OOOg (ou 30 000 trs/min dans un rotor LKB-HITACHI de type 45 T) pendant 2h a 4C. Après élimination du surnageant, le culot sédimenté est repris dans un petit volume de PBS et constitue la fraction de virion concentré, mais non purifié. Cet echantillon viral concentre mais non purifié
a eté utilisé pour effectuer une reaction dite de transcription inverse endogene, telle que decrite ci-après.
Un volume de 200 ~l de virion purifié selon le protocole décrit ci-dessus et contenant une activité
transcriptase inverse d'environ 1-5 millions de dpm est décongelé à 37C jusqu'à apparition d'une phase liquide, puis placé sur de la glace. Un tampon 5 fois concentré a eté prépare avec les composants suivants: Tris-HCl pH 8,2, 500 mM; NaCl 75 mM; MgCl2 25 mM; DTT 75 mM et NP 40 0,10 % ; 100 ~l de tampon 5X + 25 ~l d'une solution de dATP lOOmM + 25 ~l d'une solution de dTTP 100 mM + 25 ~l d'une solution de dGTP 100 mM + 25 ~l d'une solution de dCTP 100 mM + 100 ~l d'eau distillée stérile + 200 ~l de -~ W097/06260 2 2 ~ 1 2 ~ ` PCT~R96/01244 la suspension de virions (activité T.I. de 5 millions de DPM) dans le PBS ont été mélangés et incubés à 42C
pendant 3 heures. Après cette incubation le mélange réactionnel est directement ajouté à un mélange tamponné
phénol/chloroforme/alcool isoamylique (Sigma ref. P 3803);
la phase aqueuse est Gollectée et un volume d'eau distillée stérile est ajouté à la phase organique pour ré-extraire le matériel nucléique résiduel. Les phases aqueuses collectées sont regroupées et les acides nucléiques contenus sont précipités par addition d'acétate de sodium 3M, pH 5,2 au 1/10 de volume + 2 volumes d'éthanol + 1 ~l de glycogène (Boehringer-Mannheim ref. 901 393) et mise à -20C de l'échantillon pendant 4h ou la nuit à +4C. Le précipité obtenu après centrifugation est ensuite lavé avec de l'éthanol à 70% et resuspendu dans 60 ml d'eau distillée. Les produits de cette réaction ont ensuite été purifiés, clonés et séquencés selon le protocole décrit ci-après: des ADN
bouts francs avec des adénines non-appariées aux extrémités ont été générés: une réaction de "remplissage"
a d'abord été effectuée: 25 ~l de la solution d'ADN
précédemment purifiée ont été mélangés avec 2 ~l d'une solution 2,5 mM contenant, en quantité equimolaire, dATP + dGTP + dTTP ~ dCTP / 1 ~1 d'ADN polymérase T4 (Boehringer-Mannheim ref. 1004 786) / 5 ~l de lOX
"incubation buffer for restriction enzyme" (Boehringer-Mannheim ref. 1417 975) / 1 ~l d'une solution à 1 % de sérum-albumine bovine / 16 ~l d'eau distillée stérile. Ce mélange a été incubé 20 minutes à 11C. 50 ~l de tampon TE
et 1 ~l de glycogène (Boehringer-Mannheim ref. 901 393) y ont été ajoutés avant extraction des acides nucléiques avec du phénol/chloroforme/alcool isoamylique (Sigma ref. P 3803), et précipitation à l'acétate de sodium comme décrit précédemment. L'ADN précipité après centrifugation est resuspendu dans 10 ~l de tampon 10 mM
Tris pH 7,5. Puis, 5 ~l de cette suspension ont été

W097/06260 PCT~R96/01244 ~201 ~2 3 `J

mélangés avec 20~1 de tampon Taq 5X, 20 ~1 de 5mM dATP, 1 ~1 (5U) de Taq ADN polymérase (AmplitaqTM) et 54 ~1 d'eau distillée stérile. Ce mélange est incubé 2 h à 75C
avec un film d'huile à la surface de la solution. L'ADN en suspension dans la solution aqueuse prélevée en dessous du film d'huile après incubation est précipité comme décrit précédemment et resuspendu dans 2 ~1 d'eau distillée stérile. L'ADN obtenu a été inséré dans un plamide à
l'aide du kit TA CloningTM. Les 2 ~1 de solution d'ADN ont été mélangés avec 5 ~1 d'eau distillée stérile, 1~1 d'un tampon de ligation 10 fois concentré "10X LIGATION
BUFFER", 2 ~1 de "pCRTM VECTOR" (25 ng/ml) et 1 ~1 de "TA
DNA LIGASE". Ce mélange a été incubé une nuit à 12C. Les étapes suivantes ont été réalisées conformément au instructions du kit TA Cloning~ (British Biotechnology). A
la fin de la procédure, les colonies blanches de bactéries recombinantes (white) ont été repiquées pour être cultivées et permettre l'extraction des plasmides incorporés selon la procédure dite de "miniprep" (17). La préparation de plasmide de chaque colonie recombinante a été coupée par une enzyme de restriction appropriée et analysée sur gel d'agarose. Les plasmides possédant un insert détecté sous lumiere W apres marquage du gel au bromure d'éthidium, ont été sélectionnés pour le séquençage de l'insert, apres hybridation avec une amorce complémentaire du promoteur Sp6 présent sur le plasmide de clonage du TA cloning kit~. La réaction préalable au séquençage a ensuite été effectuée selon la m~thode préconisée pour l'utilisation du kit de séquençage "Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit" (Applied Biosystems, ref. 401384) et le séquençage automatique a été réalisé avec l'appareil "Automatic Sequencer, modele 373 A" Applied Biosystems, selon les instructions du fabricant.
L'analyse discriminante sur les banques de données informatiques des séquences clonées à partir des W097/06260 PCT~R96/01244 2201 2$~

fragments d'ADN presents dans le melange reactionnel a permis de mettre en evidence une sequence de type rétroviral. Le clone correspondant PSJ17 a éte entièrement ~ sequencé et la séquence obtenue, presentee dans la figure 6 et identifiee apr SEQ ID N9, a ete analysee a l'aide du lo~iciel "Geneworks~" sur les banques de donnees actualisées i'Genebank~". L'analyse des banques de données n'a pas permis de trouver de séquence identique déja décrite. Seule une homologie partielle a pu etre retrouvée avec certains éléments rétroviraux connus. L'homologie relative la plus intéressante concerne un retrovirus endogene denomme ERV-9, ou HSERV-9, selon les références (18).

EXEMPLE 4 : AMPLIFICATION PCR DE LA SEQUENCE
NUCLEIQUE CO~1~NU~ ENTRE LA REGION 5' DEFINIE PAR LE CLONE
"POL MSRV-lB" ET LA REGION 3' DEFINIE PAR LE CLONE PSJ17.

Cinq oligonucléotides, M001, M002-A, M003-BCD, P004 et P005, ont été définis pour amplifier de l'ARN
provenant de virions purifiés POL-2. Des réactions de contrôle ont été effectuées de maniere a contrôler la présence de contaminants (réaction sur de l'eau).
L'amplification consiste en une étape de RT-PCR selon le protocole décrit dans l'Exemple 2, suivie d'une PCR
"nichée" selon le protocole PCR décrit dans le document EP-A-0 569 272. Dans le premier cycle RT-PCR, les amorces M001 et P004 ou P005 sont utilisées. Dans le deuxieme cycle PCR, les amorces M002-A ou M003-BCD, et l'amorce POO4 sont utilisées. Les amorces sont positionnées comme suit :
,.

M001 Poo4 P005 W097/06260 PCT~R96/01244 ~20 1 2&2 ' ~

,.
ARN

< > < >
pol MSRV-lB PSJ17 Leur composition est :
amorce M001: GGTCITICCICAIGG (SEQ ID NO 20) amorce M002-A: TTAGGGATAGCCCTCATCTCT (SEQ ID NO 21) amorce M003-BCD: TCAGGGATAGCCCCCATCTAT(SEQ ID NO 22) amorce P004: AACCCTTTGCCACTACATCAATTT (SEQ ID NO 23) amorce P005: GCGTAAGGACTCCTAGAGCTATT (SEQ ID NO 24) Le produit d'amplification "nichée" obtenu et dénommé M003-P004 est présenté dans la figure 7, et correspond à la séquence SEQ ID NO 8.

EXEMPLE S : ANPLIFICATION ET CLONAGE D'UNE
PORTION DU GENOME RETROVIRAL MSRV-1 A L'AIDE D'UNE
SEQUENCE DEJA ID~N~ ~, DANS UN ECHANTILLON DE VIRUS
PURIFIE AU PIC D'A~ lVl' ~: TRANSCRIPTASE INVERS~

Une technique PCR dérivée de la technique publiée par Frohman (19) a été utilisée. La technique dérivée permet, à l'aide d'une amorce spécifique en 3' du génome à
amplifier, d'élonguer la séquence vers la région 5' du génome à analyser. Cette variante technique est décrite dans la documentation de la firme "Clontech Laboratories Inc., (Palo-Alto California, USA) fournie avec son produit "5'-AmpliFINDERTM RACE Kit", qui a été utilisé sur une fraction de virion purifié comme décrit précédemment.
Les amorces 3' spécifiques utilisées dans le protocole du kit pour la synthèse du cDNA et l'amplification PCR sont respectivement complementaires aux séquences MSRV-1 suivantes :
cDNA : TCATCCATGTACCGAAGG (SEQ ID N25) amplification : ATGGGGTTCCCAAGTTCCCT (SEQ ID N26) W097t06260 PCT~R96/01244

2~0~2~2 Les produits issus de la PCR ont été purifiés apres purification sur gel d'agarose selon les méthodes conventionnelles (17), puis resuspendus dans 10 ml d'eau distillée. Une des propriétés de la polymérase Taq consistant à ajouter une adénine à l'extémité 3' de chacun des deux brins d'ADN, l'ADN obtenu a été directement inséré dans un plamide a l'aide du kit TA CloningTM
(British Biotechnology). Les 2 ~l de solution d'ADN ont été mélangés avec 5 ~l d'eau distillée stérile, 1 ~l d'un tampon de ligation 10 fois concentré "lOX LIGATION
BUFFER", 2 ~l de "pCRTM VECTOR" (25 ng/ml) et 1 ~l de "TA DNA LIGASE". Ce mélange a été incubé une nuit a 12C.
Les étapes suivantes ont été réalisées conformément au instructions du kit TA Cloning~ (British Biotechnology). A
la fin de la procédure, les colonies blanches de bactéries recombinantes (white) ont été repiquées pour être cultivées et permettre l'extraction des plasmides incorporés selon la procédure dite de "miniprep" ~17). La préparation de plasmide de chaque colonie recombinante a été coupée par une enzyme de restriction appropriée et analysée sur gel d'agarose. Les plasmides possédant un insert détecté sous lumiere W apres marquage du gel au bromure d'éthidium, ont été sélectionnés pour le séquençage de l'insert, apres hybridation avec une amorce complémentaire du promoteur Sp6 présent sur le plasmide de clonage du TA Cloning Kit~. La réaction préalable au séquençage a ensuite été effectuée selon la méthode préconisée pour l'utilisation du kit de séquencage "Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit" (Applied Biosystems, ref. 401384) et le séquençage automatique a été réalisé avec l'appareil "Automatic Sequencer, modele 373 A" Applied Biosystems selon les instructions du fabricant.
Cette technique a d'abord été appliquée a deux fractions de virion purifié comme décrit ci-apres, sur 2~0~&~
W097/06260 , PCT~R96/01244 saccharose à partir de l'isolat "POL-2" produit par la lignee PLI-2 d'une part, et à partir de l'isolat MS7PG
produit par la lignée LM7PC d'autre part. Les surnageants de cultures sont collectés deux fois par semaine, pré-centrifuges à 10 000 trs/min pendant 30 minutes pour eliminer les débris cellulaires, et ensuite, congeles à -80C ou utilises tels quels pour les etapes suivantes.
Les surnageants frais ou decongeles sont centrifuges sur un coussin de PBS-glycerol 30% à 100 000g (ou 30 000 trs/min dans un rotor LKB-HITACHI de type 45 T) pendant 2 h à 4C. Après elimination du surnageant, le culot sedimente est repris dans un petit volume de PBS et constitue la fraction de virions concentres, mais non purifiés. Le virus concentré est ensuite dépose sur un gradient de sucrose dans un tampon PBS sterile (15 à
50 ~ poids/poids) et ultracentrifuge à 35 000 trs/min (100 000g) pendant 12 h à +4C dans un rotor à godets. 10 fractions sont recueillies et 20 ~1 sont préleves dans chaque fraction après homogenéisation pour y doser l'activite transcriptase inverse selon la technique decrite par H. Perron (3). Les fractions contenant le pic d'activite RT "de type LM7" sont ensuite diluées dans du tampon PBS sterile et ultracentrifugees une heure à
35 000 trs/min (100 000g) pour sedimenter les particules virales. Le culot de virion purifié ainsi obtenu est alors repris dans un petit volume d'un tampon adequat pour l'extraction d'ARN. La reaction de synthèse de cDNA
mentionnee plus haut est réalisee sur cet ARN extrait de virion extracellulaire purifié. L'amplification PCR selon la technique citee plus-haut a permis d'obtenir le clone Fl-ll dont la séquence identifiée par SEQ ID NO 2, est présentee dans la figure 8.
Ce clone permet de definir, avec les différents clones préalablement séquencés, une region de longueur importante (1,2 kb) representative du gene "pol" du rétrovirus MSRV-l, telle que présentée dans la figure 9.

W097/06260 ~ . PCT/FR96/01244 Cette séquence dénommée SEQ ID NO 1 est reconstituée à
partir de différents clones se recouvrant a leurs extrémités, en corrigeant les artéfacts liés aux amorces et aux techniques d'amplification ou de clonage, qui S interromperaient artificiellement la trame de lecture de~
l'ensemble. Cette séquence sera identifiée ci-après sous la dénomination "région MSRV-1 pol *". Son degré
d'homologie avec la séquence HSERV-9 est représenté à la figure 12.
Dans la figure 9, la trame de lecture potentielle avec sa traduction en acides aminés est présentée en-dessous de la séquence en acides nucléiques.

~:~I~LE 6 : DETECTION DE SEQUENCES SPECIFIQUES
MSRV-1 et MSRV-2 DANS DIFFERENTS ECHANTILLONS DE PLASMA
PROVENANT DE PA~ S A~ S DE SEP OU DE TEMOINS.

Une technique PCR a été utilisée pour détecter les génomes MSRV-1 et MSRV-2 dans des plasmas obtenus après prélèvement de sang sur EDTA de patients atteints de SEP et de témoins non-SEP.
L'extraction des ARN de plasma a été effectuée selon la technique décrite par P. Chomzynski ~20), après addition d'un volume du tampon contenant du guanidinium thiocyanate à 1 ml de plasma gardé congelé à -80C après recueil.
Pour MSRV-2, la PCR a été effectuée dans les mêmes conditions et avec les amorces suivantes :
- amorce 5', identifiee par SEQ ID NO 14 5' GTAGTTCGATGTAGAAAGCG 3' ;
- amorce 3', identifiee par SEQ ID NO 15 5' GCATCCGGCAACTGCACG 3'.
Cependant des résultats similaires ont aussi été
obtenus avec les amorces PCR suivantes dans deux W097/06260 ~ 2 PCT~R96/01244 amplifications successives par PCR "nichée" sur échantillons d'acides nucléiques non-traites par la DNase.
Les amorces utilisees pour cette premiere etape de 40 cycles avec une temperature d'hybridation de 48C
sont les suivantes :
- amorce 5', identifiée par SEQ ID NO 27 5' GCC~.~T~TCACCCGCCATGG 3', correspondant à une amorce PCR MSRV-2 5', pour une premiere PCR sur prélevement de patients, 0 -amorce 3', identifiée par SEQ ID NO 28 5' GCATCCGGCAACTGCACG 3', correspondant a une amorce PCR MSRV-2 3', pour une premiere PCR sur prélèvement de patients.
Après cette étape, lO~l du produit d'amplification sont prélevés et utilisés pour réaliser une deuxième amplification PCR dite "nichée" avec des amorces situées à l'intérieur de la région déjà amplifiée.
Cette deuxième étape se déroule sur 35 cycles, avec une température d'hybridation des amorces ("annealing") de 50C. Le volume réactionnel est de lOO~l.
Les amorces utilisées pour cette deuxième étape sont les suivantes :
- amorce 5', identifiée par SEQ ID NO 29 5' CGCGATGCTGGTTGGAGAGC 3', correspondant à une amorce PCR MSRV-2 5', pour une PCR-nichée sur prelèvement de patients, - amorce 3', identifiee par SEQ ID NO 30 5' TCTCCACTCCGAATATTCCG 3', correspondant à une amorce PCR MSRV-2 3', pour une PCR-nichee sur prelevement de patients.
Pour MSRV-l, l'amplification a eté effectuée en deux etapes. De plus, l'échantillon d'acides nucleiques est préalablement traité par la DNase et un contrôle PCR
sans RT (transcriptase inverse AMV) est effectué sur les deux étapes d'amplification, de maniere a vérifier que l'amplification RT-PCR provient exclusivement de l'A~N

W097/06260 = 1 ; PCT~R96/01244 1~ 2 0 1 2 ~3 2 - r MSRV-l. En cas de contrôle sans RT positif, l'echantillon aliquoté d'ARN de départ est a nouveau traité par la DNase et amplifié a nouveau.
Le protocole de traitement par la DNase dépourvue d'activité RNAse est le suivant: l'ARN extrait est aliquoté en présence de "RNAs~ inhibitor"
(Boehringer-Mannheim) dans de l'eau traitée au DEPC à une concentration finale de 1 ~g dans 10 ~l; à ces 10 ~l, est ajouté 1~1 de "RNAse-free DNAse" (Boehringer-Mannheim) et 1,2 ~l de tampon à pH 5 contenant 0,1 M/l d'acétate de sodium et 5 mM/l de MgSO4; le mélange est incubé 15 min. à
20C et porté à 95C pendant 1,5 min. dans un "thermocycler".
La premiere étape de RT-PCR MSRV-l est effectuée selon une variante du procédé d'amplification d'ARN tel que décrit dans la demande de brevet n EP-A-0 569 272.
Notamment, l'étape de synthese d'ADNc est effectuée a 42C
pendant une heure; l'amplification PCR se déroule sur 40 cycles, avec une température d'hybridation des amorces 20 ("annealing") de 53C. Le volume réactionnel est de 100~1.
Les amorces utilisées pour cette premiere étape sont les suivantes :
- amorce 5', identifiée par SEQ ID NO 16 5' AGGAGTAAGGAAACCCAACGGAC 3' ;
- amorce 3', identifiée par SEQ ID NO 17 5' TAAGAGTTGCACAAGTGCG 3'.
Après cette étape, 10~1 du produit d'amplification sont prélevés et utilisés pour réaliser une deuxième amplification PCR dite "nichée" avec des amorces situées à l'intérieur de la région déjà amplifiée.
- Cette deuxième étape se déroule sur 35 cycles, avec une température d'hybridation des amorces ("annealing") de 53C. Le volume réactionnel est de 100~1.
Les amorces utilisées pour cette deuxième étape sont les suivantes :
- amorce 5', identifiée par SEQ ID NO 18 W097/06260 2 2 0 ~ 2 & 2 ~ PCT~R96/01244 ~

5' TCAGGGATAGCCCCCATCTAT 3' ;
- amorce 3', identifiée par SEQ ID NO 19 5' AACCCTTTGCCACTACATCAATTT 3'.
Dans les figures 10 et 11, sont presentes les resultats de PCR sous forme de pho~ographies sous lumière ultra-violette de gels d'agarose imprégnés de bromure d'éthidium, dans lesquels on a effectué une électrophorèse des produits d'amplification PCR déposés séparément dans les différents puits.
La photographie du haut (figure 10) représente le résultat de l'amplification spécifique MSRV-2.
Le puits numéro 8 contient un mélange de marqueurs de poids moléculaire ADN et les puits 1 à 7 représentent, dans l'ordre, les produits amplifiés à
partir des ARN totaux de plasmas provenant de 4 temoins sains exempts de SEP (puits 1 à 4) et de 3 patients atteints de SEP, à différents stades de la maladie (puits 5 a 7).
Dans cette série, du matériel nucléique MSRV-2 est detecte dans le plasma d'un cas de SEP sur les 3 testes et dans aucun des 4 plasmas témoins. D'autres resultats obtenus sur des series plus etendues confirment ces resultats.
La photographie du bas (figure 11) represente le resultat de l'amplification specifique par RT-PCR "nichee"
MSRV-1:
le puits nl contient le produit PCR effectue avec de l'eau seule, sans addition de transcriptase inverse AMV; le puits n2 contient le produit PCR effectue avec de l'eau seule, avec addition de transcriptase inverse AMV; le puits numero 3 contient un melange de marqueurs de poids moleculaire ADN; les puits 4 à 13 contiennent, dans l'ordre, les produits amplifies a partir des ARN totaux extraits de fractions de gradient de saccharose (collectees du haut vers le bas) sur lequel un culot de virion provenant d'un surnageant de culture ~ W097/06260 ~ S PCT~R96/01244 ~201 2~2 ` -infectée par MSRV-1 et MSRV-2 a été centrifugé à
l'équilibre selon le protocole decrit par H. Perron (13);
dans le puits 14 rien n'a été déposé; dans les puits 15 à 17, on a déposé les produits amplifiés d'ARN extrait de plasmas provenant de 3 patients différents atteints de SEP, à différents stades de la maladie.
Le génome rétroviral MSRV-1 est bien retrouvé
dans la fraction du gradient de saccharose contenant le pic d'activité transcriptase inverse mesurée selon la technique décrite par H. Perron ~3), avec une très forte intensité (fraction 5 du gradient, deposee dans le puits n8). Une légère amplification a eu lieu dans la première fraction (puits n4) correspondant vraisemblablement à de l'ARN libere par des particules lysées qui flottaient à la surface du gradient; de même, des débris aggrégés ont sédimenté dans la dernière fraction (fond de tube) entraînant quelques copies de génome MSRV-1 gui ont donné lieu à une amplification de faible intensité.
Sur les 3 plasmas de SEP testés dans cette série, l'ARN MSRV-l a été retrouvé dans un cas, produisant une amplification très intense (puits n17).
Dans cette série, le génome ARN rétroviral MSRV-l correspondant vraisemblablement à des particules de virus extracellulaire présentes dans le plasma en nombre extrèmement faible, a été détecte par RT-PCR "nichée" dans un cas de SEP sur les 3 testés. D'autres résultats obtenus sur des séries plus étendues confirment ces résultats.
De plus, la spécificité des séquences amplifiées par ces techniques PCR peut être vérifiée et évaluée par - la technique "BLOSA" telle que décrite par F. Mallet (21) et dans le document FR-A-2 663 040.
Pour MSRV-1 les produits de la PCR nichée sus-décrite peuvent être testés dans deux systèmes ELOSA
permettant de détecter séparément un consensus A et un consensus B+C+D de MSRV-1, correspondant aux sous-familles W097/06260 22 0 ~ 2 ~ . PCT~R96/01244 ~

. ~ ., ~

décrites dans l'exemple 1 et les figures 1 et 2. En effet, les séquences proches du consensus B+C+D sont retrouvées essentiellement dans les échantillons d'ARN provenant de virions MSRV-1 purifiés à partir de cultures ou amplifiés S dans des liquides biologiques extra-celluaires de patients SEP, alors que les séquences proches du consensus A sont essentiellement retrouvées dans l'ADN cellulaire humain normal.
Le système ELOSA/MSRV-1 pour la capture et l'hybridation spécifique des produits PCR de la sous-famille A utilise un oligonucléotide de capture cpVlA avec une liaison amine en 5' et un oligonucléotide de détection biotinylé dpVlA ayant respectivement pour séquence:
- cpVlA identifié par SEQ ID NO 31 5' GATCTAGGCCACTTCTCAGGTCCAGS 3', correspondant à
l'oligonucléotide de capture ELOSA des produits PCR-nichée MSRV-l ef~ectuée avec les amorces identifiées par SEQ ID NO 16 et SEQ ID NO 17, suivie eventuellement de l'amplification avec les amorces identifiees par SEQ ID NO 18 et SEQ ID NO 19 sur prelèvement de patients ;
- dpVlA identifie par SEQ ID NO 32 5' CAT~ llGGICAGGCAITAGC 3' correspondant à
l'oligonucleotide de capture ELOSA de la sous-famille A
des produits PCR-"nichee" MSRV-1 effectuée avec les amorces identifiées par SEQ ID NO 16 et SEQ ID NO 17, suivie éventuellement de l'amplification avec les amorces identifiées par SEQ ID NO18 et SEQ ID NO 19 sur prélèvement de patients.
Le système ELOSA/MSRV-1 pour la capture et l'hybridation specifique des produits PCR de la sous-famille B+C+D utilise le même oligonucleotide de détection biotinylé dpVlA et un oligonucléotide de capture cpVlB avec une liaison amine en 5'ayant pour sequence :
- dpVlB identifié par SEQ ID N33 5' CTTGAGCCAGTTCTCATACCTGGA 3', correspondant à
l'oligonucléotide de capture ELOSA de la sous-famille _ ~ W097/06260 22 0 ~ 2~ 2 PCT~R96/01244 B + C + D des produits PCR-"nichée" MSRV-l effectuee avec les amorces identifiees par SEQ ID NO 16 et SEQ ID NO 17, suivie eventuellement de l'amplification avec les amorces identifiées par SEQ ID NO 18 et SEQ ID NO l9 sur prélèvement de patients.
Ce système de détection ELOSA a permis de vérifier qu'aucun des produits PCR ainsi amplifiés à
partir de plasmas de patients SEP traités par la DNase ne contenait de séquence de la sous-famille A et que tous étaient positifs avec le consensus des sous-familles B, C et D.
Pour MSRV-2, une technique ELOSA similaire a été
évaluée sur des isolats provenant de cultures cellulaires infectées en utilisant les amorces d'amplification PCR
suivantes :
- amorce 5', identifiée par SEQ ID NO 34 5' AGTGYTRCCMCARGGCGCTGAA 3', correspondant à une amorce PCR MSRV-2 5', pour PCR sur prélèvement de cultures, - amorce 3', identifiée par SEQ ID NO 35 5' GMGGCCAGCAGSAKGTCATCCA 3', correspondant à une amorce PCR MSRV-2 3', pour PCR sur prélèvement de cultures, et les oligonucléotides de capture avec une liaison amine en 5' cpV2, et de détection biotinylé dpV2, ayant pour séquences respectives :
-cpV2 identifiée par SEQ ID NO 36 5 GGATGCCGCCTATAGCCTCTAC 3', correspondant à un oligonucléotide de capture ELOSA des produits de la PCR
MSRV-2 effectuée avec les amorces SEQ ID NO 34 et SEQ ID NO 35, ou éventuellement avec les amorces dégénérées définies par Shih ~12), -dpV2 identifié par SEQ ID NO 37 5' AAGCCTATCGCGTGCAGTTGCC 3', correspondant à un oligonucléotide de détection ELOSA des produits de la PCR
MSRV-2 effectuée avec les amorces SEQ ID NO 34 et W097/06260 2 2 0 ~ 2~ . t~ PCT~R96/01244 ~

SEQ ID NO 35, ou éventuellement avec les amorces dégénérées définies par Shih (12).
Ce système d'amplification PCR avec un couple d'amorces différent de ceux qui ont été précédemment décrits pour l'amplification sur les échantillons de patients, a permis de confirmer l'infection par MSRV-2 de cultures in vitro et d'échantillons d'acides nucléiques utilisés pour les travaux de biologie moléculaire.
En fin de compte, les premiers résultats de détection PCR du génome d'agents pathogenes et/ou infectants, montrent qu'il est vraisemblable que du "virus" libre peut circuler dans le flux sanguin de patients en phase de poussée aigue, en dehors du système nerveux. Ceci est compatible avec l'existence quasi-systématique de "brèches" dans la barrière hémato-encéphalique des patients en phase active de SEP.

~:~r.l~LE 7 : Ob~ ON DE SEQUENCES DU GENE "env"
DU GENOME RETROVIRAL MSRV-l.

Ainsi que cela a déja été décrit dans l'exemple 5, une technique PCR dérivée de la technique publiée par Frohman (l9) a été utilisée. La technique dérivée permet, a l'aide d'une amorce spécifique en 3' du génome à amplifier, d'élonguer la séquence vers la région 5' du génbme à analyser. Cette variante t~c-hn;que est décrite dans la documentation de la firme "Clontech Laboratories Inc., (Palo-Alto California, USA) fournie avec son produit "5'-AmpliFINDERTM RACE Kit", qui a été
utilisé sur une fraction de virion purifié comme décrit précédemment.
Afin de réaliser une amplification de la région 3' du génome rétroviral MSRV-l en englobant la région du gène "env", une étude a été réalisée pour déterminer une séquence consensus dans les régions LTR de ~ W097/06260 2 ~ O t ~ ~ ~ PCT~R96/01244 même type que celles du rétrovirus endogène défectif HSERV-9 (18,24), avec lequel le rétrovirus MSRV-l présente des homologies partielles.
La même amorce 3' spécifique a été utilisée dans le protocole du kit pour la synthèse du ADNc et l'amplification PCR ; sa séquence est la suivante :

GTGCTGATTGGTGTATTTACAATCC (SEQ ID N0 45) La synthèse de l'ADN complémentaire (ADNc) et l'amplification PCR monodirectionelle avec l'amorce ci-dessus, ont été réalisées en une étape, selon le procédé décrit dans le brevet EP-A-O 569 272.
Les produits issus de la PCR ont été extraits après purification sur gel d'agarose selon les méthodes conventionnelles (17), puis resuspendus dans 10 ml d'eau distillée. Une des propriétés de la polymérase Taq consistant à ajouter une adénine à l'extémité 3' de chacun des deux brins d'ADN, l'ADN obtenu a été directement inséré dans un plamide à l'aide du kit TA CloningTM
(British Biotechnology). Les 2 ~l de solution d'ADN ont été mélangés avec 5 ~l d'eau distillée stérile, 1 ~l d'un tampon de ligation 10 fois concentré
"lOX LIGATION BUFFER", 2 ~l de "pCRTM VECTOR" (25 ng/ml) et 1 ~l de "TA DNA LIGASE". Ce mélange a été incubé une nuit à 12C. Les étapes suivantes ont été réalisées conformément au instructions du kit TA Cloning~
(British Biotechnology). A la fin de la procédure, les colonies blanches de bactéries recombinantes (white) ont été repiquées pour etre cultivées et permettre l'extraction des plasmides incorporés selon la procédure dite de "miniprep" (17). La préparation de plasmide de chaque colonie recombinante a été coupée par une enzyme de restriction appropriée et analysée sur gel d'agarose. Les plasmides possédant un insert détecté sous lumière W
apres marquage du gel au bromure d'éthidium, ont été

WO 97/06260 2 2 0 ~ 2 ~ ~ ~, . s PCT/FR96/01244 ~

sélectionnés pour le séquençage de l'insert, après hybridation avec une amorce complementaire du promoteur Sp6 présent sur le plasmide de clonage du TA Cloning Kit~9.
La réaction préalable au sequençage a ensuite été
effectuée selon la méthode préconisée pour l'utilisation du kit de séquençage "Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit" (Applied Biosystems, ref. 401384) et le séquençage automatique a été réalisé
avec l'appareil "automatic sequencer, modèle 373 A Applied Biosystems selon les instructions du fabricant.
Cette approche technique a été appliquée à un échantillon de virion concentré comme décrit ci-après, à
partir d'un mélange de surnageants de culture produits par des lignées lymphoblastoïdes B telles que décrites dans l'exemple 2, établies à partir des lymphocytes de patients atteints de SEP et présentant une activité transcriptase inverse détectable selon la technique décrite par Perron et coll. (3): les surnageants de cultures sont collectés deux fois par semaine, pré-centrifugés à lO OOO trs/min pendant 30 minutes pour éliminer les débris cellulaires, et ensuite, congeles à -80C ou utilises tels quels pour les etapes suivantes. Les surnageants frais ou decongeles sont centrifugés sur un coussin de PBS-glycérol 30% à
lOO OOOg pendant 2 h à 4C. Après élimination du surnageant, le culot sédimenté constitue l'échantillon de virions concentr~s, mais non purifiés. Le culot ainsi obtenu est alors repris dans un petit volume d'un tampon adéquat pour l'extraction d'ARN. La réaction de synthèse de ADNc mentionnée plus haut est réalisée sur cet ARN
extrait de virion extracellulaire concentre.
L'amplification RT-PCR selon la te~--hn;que citée plus-haut a permis d'obtenir le clone FBd3 dont la séquence identifiée par SEQ ID N0 46, est présentée dans la figure 13.
Dans la figure 14, l'homologie de séquence entre le clone FBd3 et le rétrovirus HSERV-9 est représentée sur ~ W097/06260 ;;~ PCT~R96/01244 22012~
~ ....

le tableau matriciel par un trait plein, pour toute homologie partielle supérieure ou égale a 65 ~. On peut constater que des homologies existent dans les régions flanquantes du clone (avec le gene pol en 5' et avec le gene env puis le LTR en 3'), mais que la région interne est totalement divergente et ne présente aucune homologie, même faible, avec le gene "env" d'HSERV9. De plus, il apparait que le clone FBd3 contient une région "env" plus longue que celle qui est décrite pour l'endogene défectif HSERV-9 ; on peut ainsi constater que la région divergente interne constitue un "insert" entre les régions d'homologie partielle avec les gènes défectifs HSERV-9.

~;~I~LE 8 : AMPLIFICATION, ~T-ON~ ET SEQUENCAGE

cTn~-~ PSJ17 ET FBd3.

Quatre oligonucléotides, F1, B4, F6 et Bl, ont été définis pour amplifier de 1'ARN provenant de virions concentrés des souches POL2 et MS7PG. Des réactions de contrôle ont été effectuées de manière à contr61er la présence de contaminants (réaction sur de l'eau).
L'amplification consiste en une premiere étape de RT-PCR
selon le protocole décrit dans la demande de brevet EP-A-0 569 272, suivie d'une deuxième étape de PCR
effectuée sur 10 ~1 de produit de la première étape avec des amorces internes à la première région amplifiée (PCR "nichée"). Dans le premier cycle RT-PCR, les amorces F1 et B4 sont utilisées. Dans le deuxième cycle PCR, les amorces F6 et l'amorce B1 sont utilisées. Les amorces sont positionnées comme suit :

WO 97/06260 ~ 2 0 t 2 ~ 2 PCT/FR96/01244 ~
s~

Fl F6 Bl B4 ARN

s PSJ17 FBd3 > < / _ _ _ 5'pol MSRV--1 3' pol MSRV--1 5'env.
Leur composition est:

amorce Fl : TGATGTGAACGGCATACTCACTG(SEQ ID NO 47) amorce B4: CCCAGAGGTTAGGAACTCCCTTTC (SEQ ID N0 48) 15 amorce F6: GCTAAAGGAGACTTGTGGTTGTCAG(SEQ ID N0 49) amorce B1: CAACATGGGCATTTCGGATTAG (SEQ ID N0 50) Le produit d'amplification "nichee" obtenu et dénommé "t pol" est présenté dans la figure 15, et correspond à la séquence SEQ ID NO 51.

Is~Ll~LE 9 ~ ON DE NC~uv~il.LES SEQu~ S, BPRTM~!~ EN ARN DANS LES CE~L~I.ES EN CU~TURE PROD~ISANT
MSRV-l, ET COMPRENANT UNE REGION "env" DU GENOME
25 RETROVIRali ~SRV--1.

Une banque d'ADNc a été réalisée selon la procédure décrite par le fabricant des kits "cDNA synthesis module, cDNA rapid adaptator ligation 30 module, cDNA rapid cloning module, lambda gtlO in vitro packaging module" (Amersham, ref RPN1256Y/Z, RPN1712, RPN1713, RPN1717, N334Z) à partir de 1'ARN messager extrait de cellules d'une lignée lymphoblastoïde B telle que décrite dans l'exemple 2, établie à partir des 35 lymphocytes d'un patient atteint de SEP et présentant une W097/06260 ~ ` PCT~R96/01244 2201 2~2 activite transcriptase inverse detectable selon la technique décrite par Perron et coll. (3).
Des oligonucleotides ont ete définis pour amplifier de l'ADNc cloné dans la banque nucléique entre la region 3' du clone PSJ17 (pol) et la region 5'(LTR) du clone FBd3.Des réactions de contrôle ont été effectuées de maniere à contrôler la présence de contaminants (réaction sur de l'eau). Des réactions PCR effectuées sur les acides nucléiques clones dans la banque avec differents couples d'amorces ont permis d'amplifier une serie clones reliant des sequences pol aux sequences env ou LTR de type MSRV-1.
Deux clones sont representatifs des sequences obtenues dans la banque de cDNA cellulaire :
- le clone JLBcl, dont la sequence SEQ ID NO 52 est presentee dans la figure 16 ;
- le clone JLBc2, dont la sequence SEQ ID NO 53 est presentee dans la figure 17.
Les sequences des clones JLBcl et JLBc2 sont homologues a celle du clone FBd3, ainsi que cela apparait dans les figures 18 et 19. L'homologie entre le clone JLBcl et le clone JLBc2 est representee dans la figure 20.
Les homologies entre les clones JLBcl et JLBc2 d'une part, et la séquence HSERV9 d'autre part, sont présentées respectivement dans les figures 21 et 22.
on remarque que la région d'homologie entre JLBl, JLB2 et FBd3 comprend, avec quelques variations de séquence et de taille de "l'insert", la séquence supplémentaire absente ("insérée") dans la sequence env HSERV-9, telle que décrite dans l'exemple 8.
On remarque aussi que la région "pol" clonée est tr~s homologue a HSERV-9, ne possède pas de cadre de lecture (en tenant compte des erreurs de séquences induites par les techniques utilisees, jusqu'au séquenceur automatique inclus) et diverge des séquences MSRV-l obtenues à partir de virions. Etant donné que ces W097/06260 2 2 0 1 2 ~ 2 PCT~R96/01244 L~

séquences ont été clonées à partir de l'ARN de cellules exprimant des particules MSRV-l, il est probable qu'elles proviennent d'éléments rétroviraux endogènes apparentés à
la famille ERV9 ; ce, d'autant plus que les gènes pol et S env sont présent sur un même ARN qui n'est à 1'évidence pas l'ARN génomique MSRV-l. Certains de ces éléments ERV9 possèdent des LTR fonctionnels activables par des virus réplicatifs codant pour des transactivateurs homologues ou hétérologues. Dans ces conditions, la parenté entre MSRV-l et HSERV-9 rend probable la transactivation des éléments ERV9 endogènes défectifs (ou non) par des protéines transactivatrices MSRV-l homologues, voire identiques.
Un tel phénomène peut induire une interférence virale entre l'expression de MSRV-l et les éléments endogènes apparentés. Une telle interférence conduit généralement à une expression dite "défective-interférente", dont certaines caractéristiques ont été retrouvées dans les cultures étudiées infectées par MSRV-l. De plus, un tel phénomène n'est pas sans générer l'expression de polypeptides, voire de protéines rétrovirales endogènes qui ne sont pas nécessairement tolérées par le système immunitaire. Un tel schéma d'expression aberrante d'éléments endogènes apparentés à
MSRV-l et induite par ce dernier est susceptible de multiplier les antigènes aberrants et, donc, de contribuer à l'induction de processus autoimmuns tels qu'on les observe dans la SEP.
Il est cependant essentiel de noter que les clones JLBcl et JLBc2 diffèrent de la sé~uence ERV9 ou HSERV9 déjà décrite, en ce qu'ils possèdent une région env plus longue comprenant une région supplementaire totalement divergente d'ERVg. On peut donc définir leur parenté avec la famille endogène ERV9, mais ils constituent à l'évidence des éléments originaux, jamais décrits à ce jour. En effet, l'interrogation des banques de données de séquences nucléiques disponibles dans la ~ W097/06260 ;~ PCT~R96/01244 22~1 2~

version n 15 (1995) du logiciel "Entrez" (NCBI, NIH, Bethesda, USA) n'a pas permis d'identifier de séquence homologue connue dans la région env de ces clones.

EXEMPLE 10 : Ob.~. lON DES SEQ~ENCES SITUEES DANS
LA REGION 5' pol et 3' gag DU GENOME RETROVIRAL MSRV-l.

Ainsi que cela a déjà été décrit dans l'exemple 5, une technique PCR derivee de la technique publiée par Frohman (19) a été utilisée. La t~hn; que dérivée permet, à l'aide d'une amorce specifique en 3' du génome à amplifier, d'élonguer la sequence vers la région 5' du génome à analyser. Cette variante technique est décrite dans la documentation de la firme "Clontech Laboratories Inc., (Palo-Alto California, USA) fournie avec son produit "5'-AmpliFINDERTM RACE Kit", qui a été
utilisé sur une fraction de virion purifié comme décrit précédemment.
Afin de réaliser une amplification de la région 5' du génome rétroviral MSRV-1 partant de la séquence pol déja séquencée (clone Fll-l) et s'etendant vers le gene gag, des amorces specifiques MSRV-l ont eté
définies.
Les amorces 3' spécifiques utilisées dans le protocole du kit pour la synthèse du ADNc et l'amplification PCR sont respectivement complémentaires aux séquences MSRV-1 suivantes :

ADNc : (SEQ ID NO 54) CCTGAGTTCTTGCACTAACCC
amplification : (SEQ ID NO 55) GTCCGTTGGGTTTCCTTACTCCT

Les produits issus de la PCR ont été extraits après purification sur gel d'agarose selon les méthodes W097/06260 ~? ~ PCT~R96/01244 conventionnelles (17), puis resuspendus dans 10 ml d'eau distillée. Une des propriétés de la polymérase Taq consistant à ajouter une adénine a l'extémité 3' de chacun des deux brins d'ADN, l'ADN obtenu a été directement inséré dans un plamide a l'aide du kit TA CloningTM
(British Biotechnology). Les 2 ~1 de solution d'ADN ont été mélangés avec 5 ~1 d'eau distillée stérile, 1 ~l d'un tampon de ligation 10 fois concentré
"lOX LIGATION BUFFER", 2 ~l de "pCRTM VECTOR" (25 ng/ml) et 1 ~l de "TA DNA LIGASE". Ce mélange a été incubé une nuit à 12C. Les étapes suivantes ont été réalisées conformément au instructions du kit TA Cloning~
(British Biotechnology). A la fin de la procédure, les colonies blanches de bactéries recombinantes (white) ont ete repiquées pour être cultivées et permettre l'extraction des plasmides incorporés selon la procédure dite de "miniprep" ~17). La préparation de plasmide de chaque colonie recombinante a eté coupée par une enzyme de restriction appropriée et analysée sur gel d'agarose. Les plasmides possédant un insert détecté sous lumière UV
après marquage du gel au bromure d'éthidium, ont été
sélectionnés pour le séquençage de l'insert, après hybridation avec une amorce complémentaire du promoteur Sp6 présent sur le plasmide de clonage du TA Cloning Kit~.
La réaction préalable au séquençage a ensuite été
effectuée selon la méthode préconisée pour l'utilisation du kit de séquençage "Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit" (Applied Biosystems, ref. 401384) et le séquençage automatique a été réalisé
avec l'appareil "automatic sequencer, modèle 373 A Applied Biosystems selon les instructions du fabricant.
Cette approche technique a été appliquée à un échantillon de virion concentré comme décrit ci-après, à
partir d'un mélange de surnageants de culture produits par des lignées lymphoblastoïdes B telles que décrites dans l'exemple 2, établies à partir des lymphocytes de patients W097/06260 =j ~ ~ r PCT~R96/01244 ~20~ 2~32 ~

atteints de SEP et présentant une ~ctivité transcriptase inverse detectable selon la technique decrite par Perron et coll. (3) : les surnageants de cultures sont collectes deux fois par semaine, pre-centrifuges à lO OOO trs/min pendant 30 minutes pour éliminer les débris cellulaires, et ensuite, congelés à -80C ou utilisés tels quels pour les étapes suivantes. Les surnageants frais ou décongelés sont centrifugés sur un coussin de PBS-glycerol 30 % à
lOO OOOg pendant 2 h à 4C. Après elimination du surnageant, le culot sedimente constitue l'echantillon de virions concentres, mais non purifies. Le culot ainsi obtenu est alors repris dans un petit volume d'un tampon adéquat pour llextraction d'ARN. La réaction de synthèse de ADNc mentionnée plus haut est realisée sur cet ARN
extrait de virion extracellulaire concentré.
L'amplification RT-PCR selon la technique citée plus-haut a permis d'obtenir le clone GM3 dont la séquence identifiée par SEQ ID N0 56, est présentée dans la figure 23.
Dans la figure 24, l'homologie de séquence entre le clone GMP3 et le rétrovirus HSERV-9 est représentée sur le tableau matriciel par un trait plein, pour toute homologie partielle superieure ou égale à 65 %.
En synthèse, sur la figure 25 est représentée la localisation des différents clones précédemment étudiés, par rapport au génome ERV9 connu. Sur la figure 25, la région env MSRV-l étant plus longue que le gène env de ERV9 de référence, la région supplémentaire est représentée au-dessus du point d'insertion selon un "V", étant entendu que le matériel inséré présente une variabilité de séquences et de taille entre les clones représentés (JLBcl, JLBc2, FBd3). Et sur la figure 26, est représentée la position de différents clones étudiés dans la région MSRV-l pol *.
Gr~ce au clone GM3 précédemment décrit, on a pu définir un cadre de lecture possible, couvrant l'ensemble W097/06260 2 2 0 1 2 ~ PCT~R96/01244 du gene pol, réferencé selon SEQ ID NO 57, représente aux figures successives 27a a 27c.

EXEMPLE ll Dh~ lON D'ANTICORPS SPECIFIQUES
ANTI-MSRV-l DANS LE SERUM HUMAIN.

L'identification de la sequence du gene pol du rétrovirus MSRV-l et d'un cadre de lecture ouverte de ce gene a permis de déterminer la séquence SEQ ID NO 39 en acides aminés d'une région dudit gene, référencée SEQ ID NO 40 (cf figure 28).
Différents peptides synthétiques correspondant a des fragments de la séquence protéique de la transcriptase inverse MSRV-l codée par le gene pol, ont été testés pour leur spécificité antigénique vis a vis de sera de patients atteints de SEP et de témoins sains.
Les peptides ont été synthétisés chimiquement par synthese en phase solide, selon la technique de Merrifield (Barany G, and Merrifielsd R.B, 1980, In the Peptides, 2, 1-284, Gross E and Meienhofer J, Eds Academic Press, New York). Les modalités pratiques sont celles décrites ci-apres.
a) SYnthese des PePtides:
Les peptides ont été synthétisés sur une résine phénylacétamidométhyle (PAM) /polystyrene/divinylbenzène (Applied Biosystems, Inc. Foster City, CA), en utilisant un synthétiseur automatique "Applied Biosystems 430A". Les acides aminés sont couplés sous forme d'esters d'hydroxybenzotriazole (HOBT). Les acides aminés utilisés proviennent de Novabiochem (Lauflerlfingen, Suisse) ou de Bachem (Bubendorf, Suisse).
La synthese chimique a été effectuée en utilisant un protocole de double couplage avec la N-méthyl-pyrrolidone (NMP) comme solvant. Les peptides ont étécoupés de la résine ainsi que les protections latérales, W097/06260 ~ 2 ~1 ~ 8 ~ PCT~R96/01244 de manière simultanée, à l'aide d'acide fluorhydrique (HF) dans un appareil approprié (appareil de coupure de type I, Peptide Instiute, Osaka, Japon).
Pour lg de peptidylrésine, l0ml de HF, lml S d'anisole et lml de diméthylsulfure 5DMS sont utilisés. Le mélange est agité durant 45 minutes à -2C. Le HF est alors evapore sous vide. Après lavages intensifs à
l'ether, le peptide est elue de la résine par de l'acide acetique 10%, puis lyophilisé.
Les peptides sont purifiés par chromatographie liquide haute performance préparative sur une colonne VYDAC de type Cl8 (250 x 21 mm) (The Separation Group, Hesperia, CA, USA). L'elution est réalisée par un gradient d'acetonitrile à un débit de 22 ml/min. Les fractions collectées sont contrôlées par une élution en condition isocratique sur une colonne VYDAC~. Cl8 analytique (250 x 4,6 mm), à un debit de lml/min. Les fractions qui presentent le même temps de retention sont réunies et lyophilisées. La fraction majoritaire est ensuite analysée par chromatographie liquide haute performance analytique, avec le système décrit précédemment. Le peptide qui est considéré comme de pureté acceptable se traduit par un pic unique representant 95 % minimum du chromatogramme.
Les peptides purifiés sont ensuite analysés dans le but de contrôler leur composition en acides aminés, à
l'aide d'un analyseur d'acides aminés automatique Applied Biosystems 420H. La mesure de la masse moléculaire chimique (moyenne) des peptides est obtenue en utilisant la spectrométrie de masse L.S.I.M.S. en mode d'ion positif sur un instrument à double focalisation VG. ZAB.ZSEQ relié
à un système d'acquisition DEC-VAX 2000 (VG analytical Ltd, Manchester, Angleterre).
La réactivité des différents peptides a éte testee contre des sera de patients atteints de SEP et contre des sera de témoins sains. Ceci a permis de selectionner un peptide dénommé POL2B dont la séquence est WO 97/06260 ~ 2 0 1 2 ~ r f ~ PCT~R96tO1~44 ~

représentee a la figure 28 dans l'identificateur SEQ ID NO 39 ci-dessous, code par le gene pol de MSRV-1 (nucléotides 181 a 330).
b) ProPriétés antiqéniques :
Les propriétés antigéniques du peptide POL2B ont été mises en évidence selon le protocole ELISA décrit ci-dessous.
Le peptide POL2B lyophilisé a été dissous dans de l'eau distillée sterile a une concentration de lmg/ml.
Cette solution-mere a ete aliquotee et gardee a +4C pour usage sous quinzaine, ou congelee à -20C, pour un usage dans les 2 mois. Un aliquot est dilue dans une solution de PBS (Phosphate Buffer Saline) afin d'obtenir une concentration finale de peptide de 1 microgramme/ml.
100 microlitres de cette dilution sont deposes dans chaque puits de plaques de microtitration (plastique "high-binding", COSTAR ref: 3590). Les plaques sont recouvertes d'un adhesif de type "plate-sealer" et maintenues une nuit à +4C, pour la phase d'adsorption du peptide sur le plastique. L'adhesif est enlevé et les plaques sont lavées trois fois avec un volume de 300 microlitres d'une solution A (PBS lx, 0,05% Tween 20~), puis retournées sur un tissu absorbant. Les plaques ainsi égouttées sont remplies avec 200 microlitres par puits d'une solution B (solution A + 10 % de sérum de chèvre), puis recouvertes d'un adhésif et incubées de 45 minutes à
1 heure, a 37C. Les plaques sont ensuite lavées trois fois avec la solution A, comme décrit précédemment.
Les échantillons de sérum a tester sont préalablement dilués au 1/50ème dans la solution B et 100 microlitres de chaque sérum dilué a tester sont déposés dans les puits de chaque plaque de micrititration.
Un contrôle négatif est déposé dans un puits de chaque plaque, sous la forme de 100 microlitres de tampon B. Les plaques recouvertes d'un adhésif sont alors incubées l à

3 heures, a 37C. Les plaques sont ensuite lavées trois ~ W097/06260 2 2 0 1 2 ~ 2 PCT~Rg6/01244 fois avec la solution A, comme décrit précédemment.
Parallèlement, un anticorps de chevre marqué a la peroxydase et dirigé contre les IgG (Sigma Immunochemicals ref. A6029) ou les IgM (Cappel ref.: 55228) humaines est dilué dans la solution B (dilution 1/5000 pour l'anti-IgG
et, 1/1000 pour l'anti-IgM). 100 microlitres de la dilution adéquate de l'anticorps marqué sont alors déposés dans chaque puits des plaques de microtitration et les plaques recouvertes d'un adhésif sont incubées 1 a 2 heures, a 37C. Un nouveau lavage des plaques est ensuite effectué comme décrit précédemment. Parallelement, le substrat de la peroxydase est préparé selon les indications du kit "Sigma fast OPD kit"
(Sigma Immunochemichals, ref. P9187). 100 microlitres de solution-substrat sont déposés dans chaque puits et les plaques sont placées a l'abri de la lumiere pendant 20 a 30 minutes, a température ambiante.
Une fois la réaction colorée stabilisée, les plaques sont immédiatement placées dans un lecteur spectrophotométrique de plaques ELISA, et la densité
optique (D.O.) de chaque puits est lue a une longueur d'onde de 492 nm. Alternativement, 30 microlitres d'HCL lN
sont déposés dans chaque puits pour stopper la réaction et les plaques sont lues au spectrophotometre dans les 2sl 24 heures.
Les échantillons sérologiques sont déposés en double ou en triple et la densité optique tD.O.) correspondant au sérum testé est calculée en faisant la moyenne des D.O. obtenues pour un même échantillon, a la même dilution.
La D.O. nette de chaque sérum correspond a la D.O. moyenne du sérum de laquelle est soustraite la D.O.
moyenne du témoin négatif (solution B : PBS, Tween 20 0,05%, 10% sérum de chevre).
c) Détection d'anticorPs IqG anti-MSRV-1 par ELISA :

~ - =

W097/06260 l ~ PCT~R96/01244 ~
~0 1 2~

La technique décrite ci-dessus a eté utilisée avec le peptide POLB2 pour rechercher la présence d'anticorps IgG spécifiques anti-MSRV-1 dans le sérum de 29 patients, pour lesquels un diagnostic certain ou probable de SEP a été posé selon les critères de Poser (23), et de 32 témoins sains (donneurs de sang).
Dans la figure 29, les résultats de chaque sérum testé avec un anticorps anti-IgG, sont représentés. Chaque barre verticale représente la densité optique (D.O a 492 nm) nette d'un sérum testé. L'axe des ordonnées indique la D.O. nette au sommet des barres verticales. Les 29 premieres barres verticales situées a gauche de la ligne pointillée verticale, représentent les sera de 29 cas de SEP testés et les 32 barres verticales situées a droite de la ligne pointillée verticale, représentent les sera de 32 témoins sains (donneurs de sang).
La moyenne des D.O nettes des SEP testées est de : 0,62. Le graphique permet de visualiser 5 témoins dont la D.O. nette émerge au dessus des valeurs groupées de la population témoin. Ces valeurs peuvent représenter la présence d'IgG spécifiques chez des patients séropositifs non-malades. Deux méthodes ont donc été
évaluéespour déterminer le seuil statistique de positivité
du test.
La moyenne des D.O. nettes des témoins, y compris les témoins avec des D.O. nettes élevées, est de 0,36.
Sans les 5 témoins dont les D.O. nettes sont supérieures ou égales a 0,5, la moyenne des témoins "négatifs" est de 0,33. L'écart type des témoins négatifs est de 0,10. Un seuil de positivité théorique peut être calculé selon la formule :

valeur seuil (moyenne des D.O. nettes des témoins séronégatifs) + (2 ou 3 x écart-type des D.O. nettes des témoins seronegatifs).

W097/06260 PCT~R96/01244 2 2 ~ 1 2 ~

Dans le premier cas, on considère qu'il existe des séropositifs non-malades et la valeur seuil est egale à : 0,33 + (2 x 0,10) = 0,53. Les resultats negatifs représentent un "bruit de fond" non spécifique de la presence d'anticorps specifiquement diriges contre un epitope du peptide.
Dans le deuxième cas, si l'ensemble des temoins constitues de donneurs de sang en bonne sante apparente est pris comme base de reference, sans exclure les serums a priori seropositifs, l'ecart-type des "temoins non-SEP"
est de 0,116. La valeur seuil devient alors :
0,36 + (2 x 0,116) = 0,59.
Selon cette analyse, le test est specique de la SEP. A cet egard, on constate que le test est specifique de la SEP, puisque comme montre dans le tableau 1, aucun temoin n'a une D.O. nette au-dessus de ce seuil. En fait ce résultat reflète le fait que les titres d'anticorps chez les patients atteints de SEP sont en majorité plus élevés que chez des temoins sains ayant ete en contact avec MSRV-1.

WO 97/06260 ;~ ~ 0 t 2 8 ~ PCT/FR96/01244 '~RT.~;!~U N 1 SEP TF~AO~NS
0,681 0,3 15 1,0425 ~,56 0,5675 0,3 65 0,63 0,449 0,s88 0,2~25 ~,64~ 0.5~
~,663~ 0.52 0,5'~ 0.253 0 7~6r 05 0,~''^ 0.~
o, ~ 0,~26 0,4~ 25 0,~1 0,7'~55 ~,~27 0,85- 0,3f 0~
0,64~ S
0,5?~ 0l4295 o,~~r~ 0,29~
0,671 0,347 0,5g6 ~ g5 ~,6~.7. ~,372 Q,6^~ 0,1~' o,~ 0,272 0,~ 0,~26 o,~ r 0,19~ 5 o,~ 0,22 ~, ' 0,3-0,37~ 0._~
Q,~97 0,307 0,~395 0,21 g a.4~1 0,2265 0,2605 MOYF~NF 0,62 0.33 F~.DRT l'YPF0.14 0,10 VAI FUR SF~ll o 53 ~ W097/06260 ~ 01 2 ~ 2 PCT~Rg6/01244 En fonction du premier mode de calcul et comme représenté à la figure 29 et dans le tableau correspondant 1, 26 des 29 sérums SEP donnent un résultat positif (D.O. nette supérieure ou égale à 0,50) indiquant la présence d'IgG spécifiquement dirigées contre le peptide POL2B, donc contre une partie de l'enzyme transcriptase inverse du rétrovirus MSRV-1 codée par son gène pol et, par conséquent, contre le rétrovirus MSRV-1.
Ainsi, environ 90 % des patients SEP testés ont réagi contre un épitope porté par le peptide POL2B et présentent des IgG circulantes dirigées contre ce dernier.
Cinq donneurs de sang, en apparente bonne santé, sur 32 presentent un résultat positif. Ainsi, il appara~t qu'environ 15 % de la population non-malade peut avoir été
en contact d'un épitope porte par le peptide POL2B dans des conditions ayant conduit à une immunisation active qui se traduit par la persistance d'IgG sériques spécifiques.
Ces conditions sont compatibles avec une immunisation contre la transcriptase inverse du rétrovirus MSRV-1, lors d'une infection par le (et/ou réactivation du) rétrovirus MSRV-1. L'absence de pathologie neurologique apparente évoquant la SEP chez ces témoins séropositifs peut indiquer qu'ils sont porteurs sains, ont éliminé un virus infectieux après s'être immunisés ou qu'ils constituent une population à risque de porteurs chroniques. En effet, les données épidémiologiques montrant qu'un agent pathogène présent dans l'environnement des régions à haute prévalence de SEP, peut être la cause de cette maladie, impliquent qu'une fraction de la population exempte de SEP
a nécessairement été en contact avec un tel agent pathogene. On a montré que le rétrovirus MSRV-1 constitue tout ou partie de cet "agent pathogene" a l'origine de la SEP et il est donc normal que des témoins pris dans une population saine présentent des anticorps de type IgG
contre des composants du rétrovirus MSRV-l. Ainsi, la différence de séroprévalence entre les SEP et la W097/06260 ~ PCT~R96/01244 population témoin est extrèmement significative :
test "chi-2", p<O,00l. Ces résultats sont donc en faveur d'un rôle étiopathogénique de MSRV-l dans la SEP.
d) Détection d'anticorps IqM anti-MSRV-l Par ELISA :
La technique ELISA avec le peptide POL2B a été
utilisée pour rechercher la présence d'anticorps spécifiques IgM anti-MSRV-l dans le sérum de 36 patients, pour lesquels un diagnostic certain ou probable de SEP a été posé selon les critères de Poser (23), et de 42 témoins sains (donneurs de sang).
Dans la figure 30, les résultats de chaque sérum testé avec un anticorps anti-IgM, sont représentés. Chaque barre verticale représente la densité optique (D.O à
492 nm) nette d'un sérum testé. L'axe des ordonnées indique la D.O. nette au sommet des barres verticales. Les 36 premières barres verticales situées à gauche de la ligne verticale coupant l'axe des abscisses représentent les sérums de 36 cas de SEP testés et les barres verticales situées à droite de la ligne pointillée verticale, représentent les sérums de 42 témoins sains ~donneurs de sang). La ligne horizontale tracée au milieu du graphique représente un seuil théorique délimitant les résultats positifs (dont le sommet de la barre est situé
au dessus) et les résultats négatifs (dont le sommet de la barre est situé au dessous).
La moyenne des D.O. nettes des SEP testées est de : 0,l9.
La moyenne des D.O. nettes des témoins est de : 0,09.
L'écart type des témoins négatifs est de : 0,05.

~ W097/06260 2 2 0 1 2 ~ 2 PCT~R96/01244 -, "; ~

Etant donné la faible difference entre la moyenne et l'écart-type des temoins, le seuil de positivité
théorique peut être calculé selon la formule :

valeur seuil = (moyenne des D.O. nettes des témoins séronégatifs) + (3 x ecart-type des D.O. nettes des temoins seronegatifs).
La valeur seuil est donc egale a 0,09+
(3 x 0,05) = 0,26 ; soit, en pratique, 0,25.
Les resultats negatifs representent un "bruit de fond" non specifique de la presence d'anticorps specifiquement diriges contre un epitope du peptide.
Selon cette analyse et comme montre à la figure 30 et dans le tableau 2 correspondant, le test IgM
est specique de la SEP, puisqu'aucun temoin n'a une D.O.
nette au-dessus du seuil. 7 des 36 serums SEP produisent un resultat IgM positif ; or l'étude des données cliniques révèle que ces serums positifs ont eté prélevés lors d'une premiere poussée de SEP ou d'une poussée aigue chez des malades non-traites. Il est connu que les. IgM dirigees contre des agents pathogenes sont produites lors des primo-infections ou lors de réactivations suivant une phase de latence dudit agent pathogene.
La différence de séroprevalence entre les SEP et la population temoin est extrèmement significative :
test "chi-2", p<O,OOl.
Ces resultats sont en faveur d'un rôle étiopathogénique de MSRV-l dans la SEP.
La détection des anticorps IgM et IgG contre le peptide POL2B permet d'evaluer l'evolution d'une infection par MSRV-l et/ou de la réactivation virale de MSRV-l.

WO 97/06260 ~ ? ~ PCT/FR96/01244 ~
220 1 2~2 q'~RT.~U N 2 SEP TEMOINS
0,0~4 ~:1,243 (),087 0,1 1 0,~ O,Og~
0,1 15 0,028 0,~8~3 0,094 0,~2~ ~,038 0,0g7 0, 17~
0 108 0,146 O,û' 8 0,049 0,25~ 0 161 Q,2'~ 0,-13 0,22~ 0,1)7 0,314 0,0 3 0,522 0.1~7 0,306 0,02 0.143 0 0~2 0.375 0 0~i2 0 1~2 0,07~
0,157 0,0 3 0,16^ 0 0~`6 1 ,05 0,0~' 1 Q,104 û, 3 0,187 0,1 3 0,044 Q,1 07 ,0s3 0,1 78 0,153 0,1 14 0,07 Q,078 û,033 0,11 8 0,104 {1,177 0 187 Q,026 û,04~ ~;),024 o,o~;~ 0,~46 0,1~i O, 16 0,0' ~J,04 0,0~3 0,1:~28 û,~173 0,073 0,ûQ8 0,074 0,141 0,2~g 0,0"7 ~ ) 7 MOYE~ NE Q,19 0.~9 ECART TYPE0,23 0,05 VALEl.lR SEUI_ 0.26 ~ W097/06260 PCT~R96/01244 22~1 ~f32 ,,~~`,C~l~

e) Recherche d'épitoPes immunodominants dans le pePtide POL2B :
Afin de réduire le bruit de fond non-spécifique et d'optimiser la détection des réponses des anticorps anti-MSRV-1, la synthèse d'octapeptides, successivement decales d'un aminoacide, couvrant l'ensemble de la sequence determinee par POL2B, a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessous.
La synthese chimiques d'octapeptides chevauchants couvrant la séquence en acides aminés 61-110 représentée dans l'identificateur SEQ ID NO 39 a été realisee sur membrane de cellulose activée selon la technique de BERG
et al. (1989. J. Ann. Chem. Soc., 111, 8024-8026) commercialisée par Cambridge Research Biochemicals sous la dénomination commerciale Spotscan. Cette technique permet la synthese simultanée d'un grand nombre de peptides et leur analyse.
La synthèse est realisee avec des acides amines esterifies dont le groupement ~-amine est protege par un groupement FMOC (Nova Biochem) et les groupements lateraux par des groupements protecteurs tels que trityl, t-butyl ester ou t-butyl ether. Les acides amines esterifies sont solubilisés dans du N-methyl pyrrolidone (NMP) a la concentration de 300 nM, et 0,9 ~1 sont deposes au niveau de taches de depôt de bleu de bromophenol. Apres incubation de 15 minutes, un nouveau depôt d'acides amines est realise suivi d'une autre incubation de 15 minutes. Si le couplage entre deux acides aminés s'est effectué
correctement on observe une modification de coloration (passage du bleu au vert-jaune). Apres trois lavages dans du DMF, une étape d'acetylation est effectuee par de l'anhydride acetique. Ensuite, les groupements amines - terminaux des peptides en cours de synthese sont deproteges par de la piperidine 20 % dans le DMF. Les taches de depot sont recolorées par une solution de bleu de bromophénol a 1 % dans le DMF, lavées trois fois au W097/06260 ; PCT~R96/01244 ~ 2 ~ ~ 2 ~

méthanol et sechees. L'ensemble de ces operations constitue un cycle d'addition d'un acide amine et ce cycle est répeté jusqu'à l'achèvement de la synthèse. Lorsque tous les acides aminés ont été ajoutés, le groupement NH2-terminal du dernier acide amine est deprotege par de la pipéridine à 20 % dans le DMF et acétylé par de l'anhydride acétique. Les groupements protecteurs de la chaîne latérale sont enlevés par un mélange de dichlorométhane/acide trifluoroacétique/triisobutylsilane (Sml/5ml/250~1). L'immunoreactivité des peptides est ensuite testée par ELISA.
Après synthèse en double des différents octapeptides sur deux membranes différentes, ces dernières sont rincées avec du méthanol et lavées dans du TBS
(Tris 0,lM pH 7,2), puis incubées une nuit à température ambiante dans un tampon de saturation. Après plusieurs lavages dans du TBS-T (Tris 0,lM pH 7,2 - 0,05~ Tween 20), une membrane est incubée avec une dilution au 1/50 d'un sérum de réference provenant d'un patient atteint de SEP
et l'autre membrane avec une dilution au 1/50 d'un pool de sérums de témoins sains. Les membranes sont incubées

4 heures à température ambiante. Apres lavages avec du TBS-T, un conjugué anti-immunoglobulines humaines marqué a la ~-galactosidase (commercialisé par Cambridge Research Biomedicals) est ajoute a une dilution au 1/200 et l'ensemble est incube deux heures a temperature ambiante.
Apres lavages des membranes par du TBS-T 0,05~ et du PBS, l'immunoréactivité au niveau des différentes taches est révélée par addition de 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-~-D-galactopyranoside dans du potassium. L'intensité decoloration des taches est estimee qualitativement avec une valeur relative de 0 a 5 comme représenté aux figures 31 a 33 annexées.
On peut ainsi déterminer deux régions immunodor;n~ntes a chaque extrémité du peptide POL2B
correspondant respectivement aux séquences en acides ~ W097/06260 2 2 (~ 1 2 ~ 2 ; . ` 3;S PCT/FR96/01244 aminés 65-75 (SEQ ID NO 41) et 92-109 (SEQ ID NO 42), selon figure 34, et comprises respectivement entre les octapeptides Phe-Cys-Ile-Pro-Val-Arg-Pro-Asp (FCIPVRPD) et Arg-Pro-Asp-Ser-Gln-Phe-Leu-Phe (RPDSQFLF), et, Thr-Val-Leu-Pro-Gln-Gly-Phe-Arg (TVLPQGFR) et Leu-Phe-Gly-Gln-Ala-Leu-Ala-Gln (LFGQALAQ) et une région moins réactive, mais apparemment plus spécifique, puisqu'elle ne produit aucun bruit de fond avec le sérum témoin, représentée par les octapeptides Leu-Phe-Ala-Phe-Glu-Asp-Pro-Leu (LFAFEDPL) (SEQ ID NO 43) et Phe-Ala-Phe-Glu-Asp-Pro-Leu-Asn (FAFEDPLN) (SEQ ID NO 44).
Ces régions permettent de définir de nouveaux peptides plus spécifiques et plus immunoréactifs selon les techniques habituelles.
Il est ainsi possible, grâce aux découvertes effectuées et aux méthodes mises au point par les inventeurs, de réaliser un diagnostic de l'infection et/ou de la réactivation MSRV-1, et d'évaluer une thérapie dans la SEP sur la base de son efficacité à "negativer" la détection de ces agents dans les fluides biologiques des patients. De plus, la détection précoce chez des personnes ne présentant pas encore de signes neurologiques de SEP, pourrait permettre d'instaurer un traitement d'autant plus efficace sur l'évolution clinique ultérieure qu'il précederait le stade lésionnel qui correspond a l'apparition des troubles neurologiques. Or, à ce jour, un diagnostic de SEP ne peut être établi avant l'installation d'une symptomatologie neurologique lésionnelle et, donc, aucun traitement n'est instauré avant l'émergence d'une clinique évocatrice de lésions du système nerveux central déja conséquentes. Le diagnostic d'une infection et/ou réactivation de MSRV-1 et/ou MSRV-2 chez l'homme est donc - déterminant et la présente invention en fournit les moyens.
Il est ainsi possible, outre de réaliser un diagnostic de l'infection et/ou de la réactivation MSRV-1, W097/06260 ~ 2 0 1 2 8 ~ PCT~R96/01244 d'evaluer une therapie dans la SEP sur la base de son efficacite a "n~gativer" la detection de ces agents dans les fluides biologiques des patients.

5~I~LE 12 : O~-~ .lON D'UN CLON~ LBl9 CO~ ~NANT
UNE PARTIE DU GENE GAG DU RETROVIRUS MSRV-l Une te~-hn;que PCR derivee de la technique publiee par Gonzalez-Quintial R et al. (l9) et PLAZA et al (25) a été utilisée. A partir des ARNs totaux extrait d'une fraction de virion purifié comme decrit précedemment, la cDNA a ete synthetise a l'aide d'une amorce specifique (SEQ ID N64)en 3' du genome à amplifier, en utilisant la EXPANDTM REVERSE TRANSCRIPTASE (BOEHRINGER MANNHEIM).
cDNA :
AAGGGGCATG GACGAGGTGG TGGCTTATTT (S EQ ID NO65)(anti--sens) Apres purification, une queue poly G a ete ajoutee a l'extremite 5' du cDNA a l'aide du kit "Terminal transferases kit" commercialisé par la société Boehringer M~nnheim, selon le protocole du fabriquant.

Une PCR d'ancrage a ~té réalisée a l'aide des amorces 5' et 3'suivantes:
AGATCTGCAG AATTCGATAT CPCCCCCCCC CCCCCC (SEQ ID N9l) (sens),et A~ATGTCTGC GGCACCAPTC TCCATGTT (SEQ ID NO64) (anti--sens) Ensuite, une PCR d'ancrage semi-nichée a été réalisée avec les amorces 5' et 3'suivantes:
AGATCTGCAG APTTCGATAT CA (SEQ ID N92)(sens), et A~ATGTCTGC GG~Z~C~I~t\TC TCCATGTT (SEQ ID NO64) (anti--sens) Les produits issus de la PCR ont été purifiés apres purification sur gel d'agarose selon les méthodes conventionnelles (17), puis resuspendus dans ~ W097/06260 ~ 2 1~ 1 2 ~ ~ PCT~R96/01244 10 microlitres d'eau distillee. Une des propriétes de la polymerase Taq consistant à ajouter une adenine à
l'extemite 3' de chacun des deux brins d'ADN, l'ADN obtenu a ete directement insére dans un plamide à l'aide du kit S TA CloningTM (British Biotechnology). Les 2 ~l de solution d'ADN ont été melanges avec 5 ~l d'eau distillée stérile, 1 ~l d'un tampon de ligation 10 fois concentré "lOX
LIGATION BUFFER", 2 ~l de "pCRTM VECTOR" (25 ng/ml) et 1 ~l de "T4 DNA LIGASE". Ce melange a ete incube une nuit à 12C. Les etapes suivantes ont ete realisées conformément au instructions du kit TA Cloning~ (British Biotechnology). A la fin de la procédure, les colonies blanches de bacteries recombinantes (white) ont eté
repiquées pour être cultivées et permettre l'extraction lS des plasmides incorporés selon la procédure dite de "miniprep" (17). La préparation de plasmide de chaque colonie recombinante a ete coupée par une enzyme de restriction appropriée et analysée sur gel d'agarose. Les plasmides possédant un insert détecté sous lumière W
après marquage du gel au bromure d'ethidium, ont ete sélectionnés pour le séquençage de l'insert, après hybridation avec une amorce complementaire du promoteur Sp6 present sur le plasmide de clonage du TA Cloning Kit~.
La reaction prealable au sequençage a ensuite eté
effectuee selon la methode preconisee pour l'utilisation du kit de sequençage "Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit" (Applied Biosystems, ref. 401384) et le sequençage automatique a ete realise avec l'appareil "Automatic Sequencer, modèle 373 A"
Applied Biosystems selon les instructions du fabricant.
L'amplification PCR selon la technique citee plus-haut a été utilisee sur un ADNc synthetise à partir - des acides nucléiques de fractions de particules infectantes purifiées sur gradient de saccharose, selon la technique décrite par H. Perron (13), à partir de surnageants de culture de lymphocytes B d'un patient W097/06260 ~ ' PCT~R96/01244 2~0~ 2~2 ;-t i ~

atteint de SEP, immortalisés par la souche B95 du virus d'Epstein-Barr (EBV) et exprimant des particules rétrovirales associées à une activité transcriptase inverse telle que décrite par Perron et coll. (3) et dans les demandes de brevets français SEP 10, 11 et 12. le clone LBl9 dont la sequence identifiée par SEQ ID NO 59, est présentée dans la figure 35.
Ce clone permet de définir, avec le clone GM3 préalablement séquencé et le clone G+E+A (cf Exemple 15), une région de 690 paires de bases représentative d'une partie significative du gène gag du rétrovirus MSRV-l, telle que présentée dans la figure 36. Cette séquence dénommee SEQ ID NO 88 est reconstituee à partir de differents clones se recouvrant à leurs extrémités. Cette séquence est identifiée sous la dénomination région MSRV-1 "gag*". Dans la figure 36, une trame de lecture potentielle avec la traduction en acides amines est présentée en-dessous de la séquence en acides nucléiques.

~I~LE 13 ~ ON D'UN CLONE FBdl3 COl. ~ANT
UNE REGION DE GENE pol APPARENTEE AU RETROVIRUS MSRV-1 ET
~NE REGION ENV APP~MM~NT INCOMPLETE COl.~ ~NAN~ UN CADRE
DE LECTURE (ORF) FO~ ~ POUR UNE GLYCOPRO- ~'lN~.

Extraction des ARN viraux: les ARN ont été
extraits selon la méthode brièvement décrite ci-après.
Un "pool" de surnageant de culture de lymphocytes B de patients atteints de SEP (650ml) est centrifugé 30 minutes à 10 000 g. Le culot viral obtenu est resuspendu dans 300 microlitres de PBS/lOmM MgC12. Le matériel est traité par un mélange DNAse (lOOmg/ml)/RNAse (SOmg/ml) 30 minutes à 37C puis par de la protéinase K
(5Omg/ml) 30 minutes à 46C.
Les acides nucléiques sont extraits par un volume d'un mélange phénol/SDS 0,1% (V/V) chauffé à 60OC puis réextraits par un volume de phénol/chloroforme (1/1; V/V).

~ W097/06260 2 2 0 1 2 ~ ~ PCT~R96/01244 ; "

La précipitation du matériel est effectué par 2,5 V d'éthanol en présence de 0,1 V d'acétate de sodium pH=5,2. Le culot obtenu après centrifugation est resuspendu dans 50 microlitres d'eau DEPC stérile.
L'echantillon est de nouveaux traité par 50mg/ml de DNAse "RNAse free" 30 minutes à température ambiante, extrait par un volume de phénol/chloroforme, et précipité
en présence d'acétate de sodium et d'éthanol.
L'ARN obtenu est quantifié par un lecture de D.O.
à 260 nm. La présence de MSRV-1 et l'absence de contaminant ADN est contrôlé par une PCR et une RTPCR
MSRV-1 spécifique associé à un ELOSA spécifique du génome MSRV-1.

Synthèse de cDNA:
5 mg d'ARN sont utilisés pour synthétiser un cDNA
amorce par un oligonucléotide polydT selon les instructions du kit "cDNA Synthesis Module" (ref RPN 1256, Amersham) avec quelques modifications: la retrotranscription est effectuee à 45C au lieu des 42C
recommandes.
Le produit de synthèse est purifie par une double extraction et une double purification suivant les instructions du fabriquant.
La presence de MSRV-l est verifiee par une PCR
MSRV-1 associee à un ELOSA spécifique du génome MSRV-1.

"Lonq Distance PCR": (LD-PCR) 500 ng de cDNA sont utilisés pour l'étape de LD-PCR (Expand Long Template System; Boehringer (ref.1681 842))-Plusieurs couples d'oligonucléotides ont eté
- utilisés. Parmi ceux-ci, le couple défini par les amorces suivantes :
amorce 5': GGAGAAGAGC AGCATAAGTG G (SEQ ID N66) amorce 3': GTGCTGATTG GTGTATTTAC AATCC (SEQ ID N67).

W097/06260 ~ PCT~R96/01244 ~
~0~ 28~

Les conditions d'amplification sont les suivantes: 94C 10 secondes 56C 30 secondes 68C 5 minutes ;
10 cycles puis 20 cycles avec un incrément de 20 secondes à chaque cycle sur le temps d'élongation. A
l'issue de cette premiere amplification, 2 microlitres du produit d'amplification sont soumis a une deuxieme amplification dans les mêmes conditions que précédemment.
Les LD-PCR sont conduites dans un appareil PCR
Perkin modèle 9600 dans des microtubes a paroi fine (Boehringer).
~ es produits d'amplification sont contrôlés par électrophorèse de 1/5 du volume d'amplification (10 microlitres) en gel d'agarose 1~. Pour le couple d'amorces décrit ci-dessus, on obtient une bande d'environ 1,7 Kb.

Clonaqe du fraqment amPlifié:
Le produit PCR a été purifié par passage sur un gel d'agarose preparatif puis sur une colonne Costar (Spin; D. Dutcher) selon les instructions du fournisseur.
2 microlitres de la solution purifiee sont raboutes avec 50 ng de vecteur PCRII selon les instructions du fournisseur (TA Cloning Kit; British Biotechnology)).
Le vecteur recombinant obtenu est isolé par transformation de bacteries DH5aF' competentes. Les bacteries sont selectionnees sur leur resistance à
l'ampicilline et la perte du metabolisme pour le Xgal (=colonies blanches). La structure moleculaire du vecteur recombinant est confirmee par minipreparation plasmidique et hydrolyse par l'enzyme EcoR1.
FBdl3, un clone positif pour tous ces criteres a été sélectionné. Une préparation a large échelle du ~ W097/06260 , PCT~R96/01244 ~ 2 0 ~ 2 $ ~ ` ~

plasmide recombinant a éte effectue à l'aide du kit Midiprep Quiagen (ref 12243) selon les instructions du fournisseur.
Le séquen~age du clone FBdl3 est effectué grâce au kit Prism Ready Amplitaq FS dye terminator Perkin (ref.
402119) suivant les instructions du fabriquant. Les réactions de séquences sont déposees sur un sequençeur automatique Perkin de type 377 ou 373A. La stratégie de séquençage consiste en une "marche sur le gene" réalisée sur les deux brins du clone FBdl3.
La séquence du clone FBdl3 est identifiee par SEQ ID NO 58.
Dans la figure 37, l'homologie de sequence entre le clone FBdl3 et le rétrovirus HSERV-9 est représentée sur le tableau matriciel par un trait plein, pour toute homologie partielle supérieure ou egale a 70 ~. On peut constater que des homologies existent dans les regions flanquantes du clone (avec le gene pol en 5' et avec le gène env puis le LTR en 3'), mais que la region interne est totalement divergente et ne presente aucune homologie, même faible, avec le gène env d'HSERV-9. De plus, il apparait que le clone FBdl3 contient une région "env" plus longue que celle qui est décrite pour l'endogène défectif HSERV-9 ; on peut ainsi constater que la région divergente interne constitue un "insert" entre les régions d'homologie partielle avec les genes défectifs HSERV-9.
Cette séquence supplémentaire détermine une orf potentielle, dénommée ORF B13, qui est représentée par sa séquence aminoacide SEQ ID NO 87.
La structure moléculaire du clone FBdl3 a été
analysée à l'aide du logiciel GeneWork et des banques de données Genebank et SwissProt.
5 sites de glycosylation ont été trouvés.
La protéine n'a pas d'homologie significative avec des séquences déjà connues.

W097/06260 ~ ~ f ~ PCT~R96/01244 Il est probable que ce clone provienne d'une recombinaison avec un élément rétroviral endogene (ERV), liée a la réplication de MSRV-l.
Un tel phénomene n'est pas sans générer l'expression de polypeptides, voire de protéines rétrovirales endogenes qui ne sont pas nécessairement tolerées par le systeme immunitaire. Un tel schéma d'expression aberrante d'éléments endogenes apparentes à
MSRV-l et/ou induite par ce dernier est susceptible de multiplier les antigènes aberrants et, donc, de contribuer a l'induction de processus autoimmuns tels qu'on les observe dans la SEP. Il constitue à l'évidence un élément original, jamais décrit à ce jour. En effet, l'interrogation des banques de données de séquences nucléiques disponibles dans la version n 19 (1996) du logiciel "Entrez" (NCBI, NIH, Bethesda, USA) n'a pas permis d'identifier de séquence homologue connue comprenant l'ensemble de la région env de ce clone.

EXEMP~E 14 : O~~ ON D'UN CLONE FP6 CO........ ~:~ANT
UNE PARTIE DU GENE pol, AVEC UNE REGION CODANT POUR
L ~ ~N~ YII~: TRANSCRIPTASE INVERSE ~M~T~5UE AU CLONE PO~*
MSRV-1, ET UNE REGION 3'pol DIVERGENTE DES SEQUENCES
EQUIVALENTES DECRITES DANS LES ~T.ON~ POL*, tpol~ FBd3, JLBcl et JLBc2.

Une 3'RACE a été effectuée sur de l'ARN total extrait de plasma d'un patient atteint de SEP. Un plasma témoin sain, traité sous les mêmes conditions, a été
utilisé comme contrôle négatif. La synthèse de cDNA a été
réalisée avec l'amorce oligo dT modifiée suivante:
5' GACTCGCTGC AGATCGATTT ~ ll TTTT 3'(SEQ ID NO 68) et la transcriptase inverse "Expand RT" de Boehringer selon les conditions préconisées par la société. Une PCR a éte effectuée avec l'enzyme Klentaq (Clontech) sous les conditions suivantes : 94C 5 min puis W097/06260 1.~ PCT~R96/01244 2 2 1~ 3 2 93C 1 min, 58C 1 min, 68C 3 min pendant 40 cycles et 68C pendant 8 min et avec un volume réactionnel final de Amorces utilisées pour la PCR :
- amorce 5', identifiée par SEQ ID NO 69 5' GCCATCAAGC CACCCAAGAA CTCTTAACTT 3' ;
- amorce 3', identifiée par SEQ ID NO 68 (=la même que pour le cDNA) Une deuxième PCR dite "semi-nichée" a été
réalisée avec une amorce 5' située à l'intérieur de la région déjà amplifiée. Cette deuxième PCR a été effectuée sous les mêmes conditions expérimentales que celles utilisées lors de la première PCR, en utilisant 10 ~l du produit d'amplification issu de la premiere PCR.
Amorces utilisées pour la PCR semi-nichée:
- amorce 5', identifiée par SEQ ID NO 70 5' CCAATAGCCA GACCATTATA TACACTAATT 3' ;
- amorce 3', identifiée par SEQ ID NO 68 (=la même que pour le cDNA) Les amorces SEQ ID NO 69 et SEQ ID NO 70 sont spécifiques de la région pol* : position n403 à n422 et n641 à n670 respectivement.
Un produit d'amplification a ainsi été obtenu à
partir de l'ARN extracellulaire extrait du plasma d'un patient atteint de SEP. Le fragment correspondant n'a pas été observé pour le plasma d'un témoin sain. Ce produit d'amplification a été cloné de la façon suivante.
L'ADN amplifié a été inséré dans un plasmide à
l'aide du kit TA CloningTM. Les 2 ~l de solution d'ADN ont été mélangés avec 5 ~l d'eau distillée stérile, 1 ~l d'un tampon de ligation 10 fois concentré "lOX LIGATION
BUFFER", 2 ~l de "pCRTM VECTOR" (25 ng/ml) et 1 ~l de "TA
DNA LIGASE". Ce mélange a été incubé une nuit à 12C. Les étapes suivantes ont été réalisées conformément au instructions du kit TA Cloning~ (British Biotechnology). A
la fin de la procédure, les colonies blanches de bactéries W097/06260 2 ~ 2 ~ = PCT~R96/01244 S.~ ..

recombinantes (white) ont éte repiquees pour etre cultivées et permettre l'extraction des plasmides incorporés selon la procédure dite de "miniprep" (17). La préparation de plasmide de chaque colonie recombinante a été coupée par une enzyme de restriction appropriée et analysée sur gel d'agarose. Les plasmides possédant un insert détecté sous lumière W après marquage du gel au bromure d'éthidium, ont été sélectionnés pour le séquençage de l'insert, après hybridation avec une amorce complémentaire du promoteur Sp6 présent sur le plasmide de clonage du TA cloning kit~. La réaction préalable au séquencage a ensuite été effectuée selon la méthode préconisée pour l'utilisation du kit de séquençage "Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit" (Applied Biosystems, ref. 401384) et le séquençage automatique a été réalisé avec l'appareil "Automatic Sequencer, modèle 373 A" Applied Biosystems, selon les instructions du fabricant.
Le clone obtenu, nommé FP6, permet de définir une région de 467 pb homologue à 89% à la région pol* du rétrovirus MSRV-1, et une région de 1167 pb homologue à
64% à la région pol d'ERV-9 (n1634 à 2856).
Le clone FP6 est représenté sur la figure 38 par sa sequence nucleotidique identifiée par SEQ ID NO 61. Les trois trames de lecture potentielles de ce clone sont présentées par leur séquence aminoacide sous la séquence nucléotidique.

~ I~LE 15 : O~-~:,..lON D'UNE REGION D~'~MM~
GIE+A CO~..~NANT UNE ORF POUR UNE PROTEASE RETROVIRALE PAR
AMPLIFICATION PCR DE LA SEQUENCE NUCLEIQUE CO~ NU~: ENTRE
LA REGION 5' D~1N1~ PAR ~E CLONE "GM3" ET LA REGION 3' D~1N1~ PAR LE CLONE POL*, A PARTIR DE L'ARN T'~T~TT D'UN
POOL DE pT-~C~-~ DE PA~l~N-S A~ N~S DE SEP.

~ W097/06260 2 2 0 1 2 ~ 2 =; o ~ ' PCT~R96/01244 Des oligonucléotides spécifiques des séquences MSRV-l déjà identifiées par la Demanderesse ont été
définis pour amplifier l'ARN rétroviral provenant de virions présents dans le plasma de patients atteints de SEP. Des réactions de contrôle ont été effectuées de manière à contrôler la présence de contaminants (réaction sur de l'eau). L'amplification consiste en une étape de RT-PCR , suivie d'une PCR "nichée". Des couples d'amorces ont été définis pour amplifier trois régions chevauchantes (dénommées G, E et A) sur les régions définies par les séquences des clones GM3 et pol*, préalablement décrits.

RT-PCR semi nichée pour l~amPlification de la réqion G:
-dans le premier cycle RT-PCR, les amorces suivantes sont utilisées :
amorce l : SEQ ID NO 7l (sens) amorce 2 : SEQ ID NO 72 (anti-sens) -dans le deuxième cycle PCR, les amorces suivantes sont utilisées :
amorce l : SEQ ID NO 73 (sens) amorce 4 : SEQ ID NO 74 (anti-sens) RT-PCR nichée Pour l'amplification de la réqion E:
-dans le premier cycle RT-PCR, les amorces suivantes sont utilisées :
amorce 5 : SEQ ID NO 75 (sens) amorce 6 : SEQ ID NO 76 (anti-sens) -dans le deuxième cycle PCR, les amorces suivantes sont utilisées :
amorce 7 : SEQ ID NO 77 (sens) amorce 8 : SEQ ID NO 78 (anti-sens) RT-PCR semi nichée pour l'amplification de la réqion A:
-dans le premier cycle RT-PCR, les amorces suivantes sont utilisées :
amorce 9 : SEQ ID NO 79 (sens) amorce lO :SEQ ID NO 80 (anti-sens) W097/06260 ~ 2 ~ 2 - ' ' ' PCT~R96/01244 .-.' J ~

-dans le deuxieme cycle PCR, les amorces suivantes sont utilisées :
amorce 9 : SEQ ID NO 81(sens) amorce 11 :SEQ ID NO 82 (anti-sens) Les amorces et les régions G, E et A qu'elles définissent sont positionnees comme suit :

10 cDNA

15 < >< >
GM3 POL*

La sequence de la région définie par les différents clones G, E et A a été déterminée après clonage et séquencage des produits d'amplification "nichée".
Les clones G, E et A ont été rassemblés par PCR
avec les amorces 1 en 5' du fragment G et 11 en 3' du fragment A, précédemment decrites. Un fragment G+E+A
d'environ 1580bp a été amplifié et inséré dans un plasmide à l'aide du kit TA Cloning (marque de commerce). La séquence du produit d'amplification correspondant à G+E+A
a été déterminée et l'analyse des recouvrements G+E et E+A
a été réalisée. La sequence est représentée dans la figure 39, et correspond à la séquence SEQ ID NO 89.
Une trame de lecture codant pour une protéase rétrovirale MSRV-1 a été trouvee dans la region E. La séquence aminoacide de la protéase, identifiée par SEQ ID
NO 9O, est présentée dans la figure 40.

~:~.I~LE 16 : O~ ~L.-~lON D'UN CLONE LTRGAG12, APPARENTE A~ UN ~T~M~NT RETROVIR~L ENDOGENE (ERV) PROCHE

W097/06260 2 2 ' I PCT~R96/01244 DE MSRV-1, DANS L'ADN D'UNE LIGNEE LYMPHOBLASTOIDE DE SEP
PRODUISANT DES VIRIONS ET EXPRIMANT LE RETROVIRUS MSRV-1.

Une PCR nichée a été effectuée sur l'ADN extrait d'une lignée lymphoblastoïde (lymphocytes B immortalisés par le virus EBV, souche B95, comme décrit précédemment et comme cela est bien connu de l'homme de l'art) exprimant le rétrovirus MSRV-l et provenant des lymphocytes du sang périphérique d'un malade atteint de SEP.
Dans la première étape PCR, les amorces suivantes sont utilisées :
amorce 4327 : CTCGATTTCT TGCTGGGCCT TA (SEQ ID NO 83) amorce 3512 : GTTGATTCCC TCCTCAAGCA (SEQ ID NO 84) Cette étape comprend 35 cycles d'amplification avec les conditions suivantes: 1 min à 94C, 1 min à 54C
et 4 min à 72C.
Dans le deuxième étape PCR, les amorces suivantes sont utilisées :
amorce 4294 : CTCTACCAAT CAGCATGTGG (SEQ ID NO 85) amorce 3591 : TGTTCCTCTT GGTCCCTAT (SEQ ID NO 86) Cette étape comprend 35 cycles d'amplification avec les conditions suivantes: 1 min à 94C, 1 min à 54C
et 4 min à 72C.
Les produits issus de la PCR ont été purifiés après purification sur gel d'agarose selon les méthodes conventionnelles (17), puis resuspendus dans 10 ml d'eau distillée. Une des propriétés de la polymérase Taq consistant à ajouter une adénine à l'extémité 3' de chacun des deux brins d'ADN, l'ADN obtenu a été directement inséré dans un plamide à l'aide du kit TA CloningTM
(British Biotechnology). Les 2 ~1 de solution d'ADN ont été mélangés avec 5 ~1 d'eau distillée stérile, 1 ~1 d'un tampon de ligation lO fois concentré "lOX LIGATION
~ ~", 2 ~1 de "pCRTM VECTOR" (25 ng/ml) et 1 ~1 de "TA DNA LIGASE". Ce mélange a été incubé une nuit à 12C.
Les étapes suivantes ont été réalisées conformément au W097/06260 ~ 2 ~ ~ PCT~R96/01244 instructions du kit TA Cloning~ (British Biotechnology). A
la fin de la procédure, les colonies blanches de bactéries recombinantes (white) ont été repiquées pour être cultivées et permettre l'extraction des plasmides incorporés selon la procedure dite de "miniprep" (17). La preparation de plasmide de chaque colonie recombinante a ~te coupee par une enzyme de restriction appropriee et analysee sur gel d'agarose. Les plasmides possedant un insert detecte sous lumière W apres marquage du gel au bromure d'ethidium, ont ete selectionnes pour le sequencage de l'insert, après hybridation avec une amorce complementaire du promoteur Sp6 présent sur le plasmide de clonage du TA Cloning Kit~. La réaction prealable au séquençage a ensuite ete effectuee selon la méthode préconisée pour l'utilisation du kit de séquençage "Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit" (Applied Biosystems, ref. 401384) et le séquençage automatique a été realise avec l'appareil "Automatic Sequencer, modèle 373 A" Applied Biosystems selon les instructions du fabricant.
Ainsi, un clone denomme LTRGAG12 a pu être obtenu et est representé par sa séquence interne identifiee par SEQ ID NO 60.
Ce clone est vraisemblablement representatif d'éléments endogenes proches d'ERV-9, présent dans l'ADN
humain, not~r~?nt dans l'ADN de patients atteints de SEP, et pouvant interferer avec l'expression du retrovirus MSRV-l, donc pouvant avoir un rôle dans la pathogenie associee au retrovirus MSRV-1 et pouvant servir de marqueur d'une expression specifique dans la pathologie concernée.

EXEMPLE 17 : DETECTION D'ANTICORPS SPECIFIQUES
ANTI-MSRV-1 DANS ~E SERUM EUNAIN.

W097/06260 ~ 2 ~ PCT~R96/01244 L'identification de la séquence du gène pol du rétrovirus MSRV-1 et d'un cadre de lecture ouverte de ce gène a permis de déterminer la séquence SEQ ID NO 63 en acides aminés d'une région dudit gène, référencée par SEQ ID NO 62.
Différents peptides synthétiques correspondant à
des fragments de la séquence protéique de la transcriptase inverse MSRV-1 codée par le gène pol, ont été testés pour leur spécificité antigénique vis à vis de sera de patients atteints de SEP et de témoins sains.
Les peptides ont été synthétisés chimiquement par synthèse en phase solide, selon la technique de Merrifield (22). Les modalités pratiques sont celles décrites ci-après.
a) SYnthèse des peptides:
Les peptides ont été synthétisés sur une résine phénylacétamidométhyle (PAM)/polystyrène/divinylbenzène (Applied Biosystems, Inc. Foster City, CA), en utilisant un synthétiseur automatique "Applied Biosystems 430A". Les acides aminés sont couplés sous forme d'esters d'hydroxybenzotriazole (HOBT). Les acides aminés utilisés proviennent de Novabiochem (Lauflerlfingen, Suisse) ou de Bachem (Bubendorf, Suisse).
La synthèse chimique a été effectuée en utilisant un protocole de double couplage avec la N-méthyl-pyrrolidone (NMP) comme solvant. Les peptides ont été
coupés de la résine ainsi que les protections latérales, de manière simultanée, à l'aide d'acide fluorhydrique (HF) dans un appareil approprié (appareil de coupure de type I, Peptide Instiute, Osaka, Japon).
Pour 1 g de peptidylrésine, 10 ml de HF, 1 ml d'anisole et 1 ml de diméthylsulfure 5DMS sont utilisés.
Le mélange est agité durant 45 minutes à -2C. Le HF est alors évaporé sous vide. Après lavages intensifs à
l'éther, le peptide est élué de la résine par de l'acide acétique 10%, puis lyophilisé.

W097/06260 ~ PCT~R96/01244 ~
223 1 2~

Les peptides sont purifiés par chromatographie liquide haute performance préparative sur une colonne VYDAC de type C18 (250 x 21 mm) (The Separation Group, Hesperia, CA, USA). L'élution est réalisée par un gradient d'acétonitrile à un débit de 22 ml/min. Les fractions collectées sont contrôlées par une élution en condition isocratique sur une colonne VYDAC~ C18 analytique (250 x 4,6 mm), à un débit de 1 ml/min. Les fractions qui présentent le même temps de rétention sont réunies et lyophilisées. La fraction ma~oritaire est ensuite analysée par chromatographie liquide haute performance analytique, avec le système décrit précédemment. Le peptide qui est considéré comme de pureté acceptable se traduit par un pic unique représentant 95 % minimum du chromatogramme.
Les peptides purifiés sont ensuite analysés dans le but de contrôler leur composition en acides aminés, à
l'aide d'un analyseur d'acides aminés automatique Applied Biosystems 420H. La mesure de la masse moléculaire chimique (moyenne) des peptides est obtenue en utilisant la spectrométrie de masse L.S.I.M.S. en mode d'ion positif sur un instrument à double focalisation VG. ZAB.ZSEQ relié
à un système d'acquisition DEC-VAX 2000 (VG analytical Ltd, Manchester, Angleterre).
La réactivité des différents peptides a été
testée contre des sera de patients atteints de SEP et contre des sera de témoins sains. Ceci a permis de selectionner un peptide dénommé S24Q dont la séquence est identifiée par SEQ ID NQ 63, codé par une séquence nucléotidique du gène pol de MSRV-1 (SEQ ID NO 62).
b) ProPriétés antiqéniques :
Les propriétés antigéniques du peptide S24Q ont été mises en évidence selon le protocole ELISA décrit ci-dessous.
Le peptide S24Q lyophilisé a été dissous à une concentration de 1 mg/ml dans de l'acide acétique à 10%.
Cette solution-mère a été aliquotée et gardée à +4C pour W097/06260 ~ PCT~R96/01244 ;~ 2 ~ d 2 - i usage sous quinzaine, ou congelee a -20OC, pour un usage dans les 2 mois. Un aliquot est dilue dans une solution de PBS (Phosphate Buffer Saline) afin d'obtenir une concentration finale de peptide de 5 microgrammes/ml.
lOO microlitres de cette dilution sont deposes dans chaque puits de plaques de microtitration Nunc Maxisorb (nom commercial). Les plaques sont recouvertes d'un adhesif de type "plate-sealer" et maintenues 2 heures a +37C, pour la phase d'adsorption du peptide sur le plastique.
L'adhesif est enleve et les plaques sont lavees trois fois avec un volume de 300 microlitres d'une solution A (PBS
lx, O,05% Tween 20~), puis retournees sur un tissu absorbant. Les plaques ainsi égouttées sont remplies avec 250 microlitres par puits d'une solution B (solution A +
lO ~ de serum de chevre), puis recouvertes d'un adhesif et incubees l heure, a 37OC. Les plaques sont ensuite lavées trois fois avec la solution A, comme décrit précédemment.
Les echantillons de serum à tester sont préalablement dilués au l/lOOème dans la solution B et lOO microlitres de chaque sérum dilué à tester sont déposés dans les puits de chaque plaque de microtitration.
Un contrôle négatif est déposé dans un puits de chaque plaque, sous la forme de lOO microlitres de tampon B. Les plaques recouvertes d'un adhésif sont alors incubées l heure 30 min. à 37C. Les plaques sont ensuite lavées trois fois avec la solution A, comme décrit précédemment.
Pour la réponse IgG, un anticorps de chèvre marqué à la peroxydase et dirigé contre les IgG humaines (commercialisé par Jackson Immuno Research Inc.) est dilué
dans la solution B (dilution l/lO OOO). lOO microlitres de la dilution adéquate de l'anticorps marqué sont alors déposés dans chaque puits des plaques de microtitration et les plaques recouvertes d'un adhésif sont incubées l heure, à 37C. Un nouveau lavage des plaques est ensuite effectué comme décrit précédemment. Parallèlement, le substrat de la peroxydase est préparé selon les :

W097/06260 ~ 2 ~ 2 PCT~R96/01244 indications des kits bioMérieux. 100 microlitres de solution-substrat sont déposés dans chaque puits et les plaques sont placées a l'abri de la lumiere pendant 20 a 30 minutes, à température ambiante.
Une fois la réaction colorée stabilisée, 50 microlitres de Color 2 (nom commercial-bioMérieux) sont déposés dans chaque puits pour stopper la réaction. Les plaques sont immédiatement placées dans un lecteur spectrophotométrique de plaques ELISA, et la densité
optique (D.O.) de chaque puits est lue a une longueur d'onde de 492 nm.
Les échantillons sérologiques sont déposés en double ou en triple et la densité optique (D.O.) correspondant au serum teste est calculee en faisant la moyenne des D.O. obtenues pour un même échantillon, a la meme dilution.
La D.O. nette de chaque sérum correspond a la D.O. moyenne du sérum de laquelle est soustraite la D.O.
moyenne du temoin négatif (solution B : PBS, Tween 20 0,05%, 10% sérum de chèvre).
c) Detection d'anticorps IqG anti-MSRV-1 fS240) par ELISA :
La technique décrite ci-dessus a été utilisée avec le peptide S24Q pour rechercher la présence d'anticorps IgG specifiques anti-MSRV-1 dans le sérum de 15 patients, pour lesquels un diagnostic certain de SEP a eté pose selon les criteres de Poser (23), et de 15 temoins sains (donneurs de sang).
Dans la figure 41, les résultats de chaque sérum testé avec un anticorps anti-IgG, sont représentés. Chaque barre verticale represente la densite optique (D.O a 492 nm) nette d'un serum teste. L'axe des ordonnees indique la D.O. nette au sommet des barres verticales. Les 15 premières barres verticales situées à gauche de la ligne pointillee verticale, representent les sérums de 15 temoins sains (donneurs de sang) et les 15 barres W097/06260 PCT~R96tO1244 f 2 0 ~ 2 ~ 2 = ` - ~

verticales situees à droite de la ligne pointillee verticale, representent les serums de 15 cas de SEP
testés. Le graphique permet de visualiser 2 témoins dont la D.O. émerge au dessus des valeurs groupées de la population témoin. Ces valeurs peuvent représenter la présence d'IgG spécifiques chez des patients séropositifs non-malades. Deux méthodes ont donc été évaluées pour déterminer le seuil statistique de positivité du test.
La moyenne des D.O. nettes des témoins, y compris les témoins avec des D.O. nettes élevées, est de 0,129 et l'écart type est de 0,06. Sans les 2 témoins dont les D.O.
sont supérieures à 0,2, la moyenne des témoins "négatifs"
est de 0,107 et l'écart-type de 0,03. Un seuil de positivité théorique peut être calculé selon la formule :
valeur seuil (moyenne des D.O. nettes des témoins égatifs) + (2 ou 3 x écart-type des D.O. nettes des témoins négatifs).
Dans le premier cas, on considère qu'il existe des séropositifs non-malades et la valeur seuil est égale à : 0,11 + (3 x 0,03) = 0,20. Les résultats négatifs représentent un "bruit de fond" non spécifique de la présence d'anticorps spécifiquement dirigés contre un épitope du peptide.
Dans le deuxième cas, si l'ensemble des témoins constitués de donneurs de sang en bonne sante apparente est pris comme base de reference, sans exclure les serums a priori séropositifs, l'écart-type des "témoins non-SEP"
est de 0,116. La valeur seuil devient alors :
0,13 + (3 x 0,06) = 0,31.
Selon cette dernière analyse, le test est spécique de la SEP. A cet égard, on constate que le test est specifique de la SEP, puisque comme montre dans le tableau 1, aucun témoin n'a une D.O. nette au-dessus de ce seuil. En fait ce résultat reflète le fait que les titres d'anticorps chez les patients atteints de SEP sont en 2 ;~ 2 majorité plus élevés que chez des témoins sains ayant été
en contact avec MSRV-1.
En fonction du premier mode de calcul et comme represente a la figure 41 et dans le tableau 3, 6 des 15 serums SEP donnent un resultat positif (D.O. supérieure ou egale a 0,2) indiquant la présence d'I~G specifiquement dirigées contre le peptide S24Q, donc contre une partie de 1'enzyme transcriptase inverse du rétrovirus MSRV-l codée par son gene pol et, par conséquent, contre le rétrovirus MSRV-l.
Ainsi, environ 40 ~ des patients SEP testés ont réagi contre un épitope porté par le peptide S24Q et présentent des IgG circulantes dirigées contre ce dernier.
2 donneurs de sang, en apparente bonne santé, sur présentent un résultat positif. Ainsi, il appara~t qu'environ 13 % de la population non-malade peut avoir été
en contact d'un épitope porté par le peptide S24Q dans des conditions ayant conduit a une immunisation active qui se traduit par la persistance d'IgG sériques spécifiques. Ces conditions sont compatibles avec une immunisation contre la transcriptase inverse du rétrovirus MSRV-1, lors d'une infection par le (et/ou réactivation du) rétrovirus MSRV-1. L'absence de pathologie neurologique apparente évoquant la SEP chez ces témoins séropositifs peut indiquer qu'ils sont porteurs sains, ont éliminé un virus infectieux apres s'être immunisés ou qu'ils constituent une population a risque de porteurs chroniques. En effet, les données épidémiologiques montrant qu'un agent pathogène présent dans l'environnement des régions a haute prévalence de SEP, peut etre la cause de cette maladie, impliquent qu'une fraction de la population exempte de SEP a nécessairement été en contact avec un tel agent pathogene.
On a montré que le rétrovirus MSRV-1 constitue tout ou partie de cet "agent pathogene" a l'origine de la SEP et il est donc normal que des témoins pris dans une W097/06260 2 ~ O 1 2 ~ PCT~R96/01244 population saine présentent des anticorps de type IgG
contre des composants du rétrovirus MSRV-1.
Enfin, la détection d'anticorps anti-S24Q chez seulement une SEP sur deux testée ici, peut refléter le fait que ce peptide ne représente pas un épitope immunodominant MSRV-l, que des variations inter-individuelles de souches peuvent induire une immunisation contre un motif peptidique divergent dans la même région, ou encore que l'évolution de la maladie et les traitements suivis peuvent moduler dans le temps la réponse anticorps contre le peptide S24Q.

T~RT-T!~U N3 TEMOI~S SEP
0,10_ 0,136 0,05 0,391 0, ~ 0,37 O,_~ O,_19 0, ~ 0" 67 0" ~ 0, 41 0,__~ 0,_02 0,0 0,18 0 , 1~ ~ 0 , ' 1: .
0,_ 2 0, ~^
0,_ 7 0, 0,~3 0,~^~
0,0 0,. ~
0,073 0,--~
0,132 0,074 Moyenne 0,129 Ecart Type 0,06 æeuil 0,31 d) Détection d'anticorps IqM anti-MSRV-1 par ELISA :
La technique ELISA avec le peptide S24Q a été
utilisée pour rechercher la présence d'anticorps spécifiques IgM anti-MSRV-1 dans les mêmes sérums que précédemment.

W097/06260 . , PCT~R96/01244 Dans la figure 42, les résultats de chaque sérum testé avec un anticorps anti-IgM, sont représentés. Chaque barre verticale représente la densité optique (D.O à
492 nm) nette d'un serum testé. L'axe des ordonnées indique la D.O. nette au sommet des barres verticales. Les 15 premi~res barres verticales situees à gauche de la ligne verticale coupant l'axe des abscisses représentent les sérums de 15 témoins sains (donneurs de sang) et les barres verticales situées a droite de la ligne pointillée verticale, représentent les sérums de 15 cas de SEP
testés.
La moyenne des D.O. des SEP testees est de : 1,6.
La moyenne des D.O. nettes des temoins est de : 0,7.
L'ecart type des temoins negatifs est de : 0,6.
Le seuil de positivite theorique peut être calcule selon la formule :
valeur seuil = (moyenne des D.O. des temoins negatifs) + (3 x ecart-type des D.O. des temoins negatifs) La valeur seuil est donc egale a 0,7+ (3 x 0,6) = 2,5 ;
Les résultats négatifs representent un "bruit de fond" non spécifique de la présence d'anticorps spécifiquement diriges contre un epitope du peptide.
Selon cette analyse et comme montre a la figure 42 et dans le tableau 4 correspondant, le test IgM
est specique de la SEP, puisqu'aucun temoin n'a une D.O.
nette au-dessus du seuil. 6 des 15 serums SEP produisent un resultat IgM positif La difference de seroprévalence entre les SEP et la population temoin est extrèmement significative :
test "chi-2", p<0,002.
Ces resultats sont en faveur d'un rôle etiopathogenique de MSRV-1 dans la SEP.
Ainsi, la detection des anticorps IgM et IgG
contre le peptide S24Q permet d'evaluer, seul ou en combinaison avec d'autres peptides MSRV-1, l'evolution ~ W097/06260 2 2 ~ PCT~Rg6/01244 d'une infection par MSRV-1 et/ou de la réactivation virale de MSRV-1.
;

T~RT-~U N4 TEMOI~S S::P
1, ~ 0,~74 0,~ 6,.~7 0,~ 2, 3 0,4 6 1,~5 0,8 5 1,7 7 2,2_5 0,273 0,301 1,7~6 0,138 0,6~8 0,16 2,603 1,073 0,802 1,3~6 0,2~5 0, 3 0,1~7 0, ~. 2,~1 0, 0,. 7 O ~ ~S r, O ~ 9 Moyenne 0,7 Ecart Type 0,6 Valeur seuil 2,5 Il est possible, grâce aux nouvelles découvertes effectuées et aux nouvelles méthodes mises au point par les inventeurs, de permettre la réalisation perfectionnée de tests diagnostiques de l'infection et/ou de la réactivation MSRV-1, et d'évaluer une thérapie dans la SEP
et/ou la PR, sur la base de son efficacité a "négativer"
la détection de ces agents dans les fluides biologiques des patients. De plus, la détection précoce chez des personnes ne présentant pas encore de signes neurologiques de SEP, ou de signes rhumatologiques de PR, pourrait permettre d'instaurer un traitement d'autant plus efficace sur l'évolution clinique ultérieure qu'il précederait le stade lésionnel qui correspond a l'apparition des troubles cliniques. Or, à ce jour, un diagnostic de SEP ou de PR ne peut être établi avant l'installation d'une symptomatologie lésionnelle et, donc, aucun traitement W097/06260 ~ 2 ~ ~ 2 ~ 2 ~ E,~ PCT~R96/01244 n'est instaure avant l'emergence d'une clinique evocatrice de lésions ddéjà conséquentes. Le diagnostic d'une infection et/ou réactivation de MSRV-l et/ou MSRV-2 chez 1'homme est donc déterminant et la presente invention en fournit les moyens.
Il est ainsi possible, outre de realiser un diagnostic de l'infection et/ou de la reactivation MSRV-l, d'evaluer une therapie dans la SEP sur la base de son efficacite a "negativer" la detection de ces agents dans les fluides biologiques des patients.

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W097/06260 ~ 2 0 1 2 ~ 2 ~ PCT~R96/01244 ~

~20) Chomzynski P. et N. Sacchi, Analytical Biochemistry 1987, 162, 156-159.
~21) F. Mallet et coll., Journal of Clinical Microbiology 1993; 31, 1444-1449.
5 ~22) G. Barany and R.B. Merrifielsd, 1980, In the Peptides, 2, 1-284, Gross E and Meienhofer J, Eds Academic Press, New York.
~23) Poser et al, Gbers G.C. eds. The diagnosis of multiple sclerosis Thieme Stratton Inc, New York 1984 :
225-229.
~24) La Mantia et coll., Nucleic Acid Research 1989, 17, 5913-22.
~25) PLAZA, A ; KONO, D.H ; THEOFILOPOULOS, A.N. NEW HUMAN
V~ GENES AND POLYMORPHIC VARIANTS. J. Imm; 147(12):
4360-4365, 1991.

WO 97/06260 2 2 0 1 ~ ~ 2 PCT/FR96/01244 LISTE DE SEQUENCES
, (1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: BIOMERIEUX
(B) RUE: AUCUNE
(C) VILLE: MARCY L'ETOILE
tE) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 69280 (ii) TITRE DE L~lNv~hlloN:
15 ( iii ) NOMBRE DE SEQUENCES: 92 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATT~TJR:
(A) TYPE DE ~U~PORL: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (c) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) 25 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LoN~u~uK: 1158 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (c) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: 1in~Aire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc ( xi ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
CC~l L ' GCCA CTACATCAAT TTTAGGAGTA AGGAAACC~ A~Gr-A~GTG GAGGTTAGTG 60 ~AA~AAcTcA GGATTATCAA TGAGGCTGTT GllC~l~lAT ACCCAGCTGT ACCTAACCCT 120 TATA~Ar7TGC l~CC~AAT AccAr~A~GAA GCAGAGTGGT TTACAGTCCT GGACCTTAAG 180 40 GATGCCTTTT TCTGCATCCC TGTACGTCCT GACTCTCAAT ~ GC CTTTGAAGAT 240 C~llGAACC CAACC~-~A ACTCACCTGG A~llllAC CCCAAGGGTT CAGGGATAGC 300 C~lC AGTACATGGA TGATTTACTT TTAGTCGCCC GTTCAr-AA~C CTTGTGCCAT 420 CAAGCCACCC AAr7AAcTcTT AA~~ C ACTACCTGTG GCTACAAGGT TTC~AAAC~A 480 AGGGCCCTCA GTGAGGAACG TATCCAGCCT ATACTGGCTT ATCCTCATCC C~AAACCCTA 600 AAGCAACTAA GAGG~llC~l TGG~-ATAA~A GG~ GCC ~AAAA~A~AT TCCCAGGTAC 660 ASCC~ATAG C~Ar-ACCATT ATAT~ CTA ATTANGGAAA CTr~-AA~GC r-~ATACCTAT 720 TTAGTAAGAT G~-A~ACCTAC AGAAGTGGCT TTCCAGGCCC TAAArpAGGC CCTAPCC~AA 780 GCCCCAGTGT TCAGCTTGCC AACAGGGCAA GA.~ TATATGCCAC A~-~AAAAACA 840 GCAGTAGCAG TCTNAGTATC TGAAGCAGTT AAAAT~ATAC AGGGAAGA~-~ TCTTNCTGTG1020 WO 97/06260 , r ; ~ PCT~R96/01244 2;~01~32 ~

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LO.._J~UR: 297 paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: 1; né~; re (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
CC~111GCCA CTACATCAAT TTTAGGAGTA AG~-A~CC~-~ ~CG~ GTG GAGGTTAGTG 60 ~ rTCA GGATTATCAA TGAGGCTGTT G1LC~1AT ACCCAGCTGT ACCTAACCCT 120 T~ TGC 11 .CC~T ~C~-~G~-GAA GCAGAGTGGT TTACAGTCCT GGACCTTAAG 180 20 GATGCCTTTT TCTGCATCCC TGTACGTCCT GACTCTCAAT 1~11~111GC CTTTGAAGAT 240 CCTTTGAACC CAACG~ A ACTCACCTGG A~1~111 ~AC CCCAAGGGTT CAAGGGA 297 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 85 paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MnT.T'CUT.T~': ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
GTTT~GGr-~T ANCC~1~ATC TCTTTGGTCA GGTACTGGCC CAAGATCTAG GCCACTTCTC 60 AGGTCCAGSN A~G1~CC TTCAG 85 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 86 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
GTTCAGGGAT AGCCCCC~TC TATTTGGCCA GGCACTAGCT CAATACTTGA GCCAGTTCTC 60 ~ W O 97/06260 PCTAFR96/01244 2; j~.~

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 85 paires de bases ; 5 (B) TYPE: nucleotide (C) NOM8RE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: ];n~;~e (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
GTTCARRGA TAGCCCC~.~TC TATTTGGCCW RGYATTAGCC CAAGACTTGA GYCAATTCTC 60 ATACCTGGA CA~1~1 l~lCC TTYRG 85 (2) INFORUATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 85 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: S imple (D) CONFIGURATION: 1 ineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:

30 ATACGTGGAC A~1~1 1G1lCC TTTGG 85 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LO..~U~U~: 111 paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOT~T~'CUT~: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
45 GTGTTGCCAC AGGGGTTTAR RGATANCYCY CA1~1rl~11G GYCWRGYAYT RRCYCR~KAY 60 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LON~U~UK: 645 paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple W O 97t06260 ; PCTA~R96/01244 ~
2 ~ `

(D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
TCAGGGATAG CCCCr-A~CTA TTTGGCCAGG CATTAGCCCA AGACTTGAGT CAATTCTCAT 60 ACCTGGACAC l~ll~lCCll CAGTACATGG ATGATTTACT TTTAGTCGCC CGTTCAGAAA 120 C~~ GCCA TCAAGCCACC CAAGAACTCT TAA~lll~l CACTACCTGT GGCTACAAGG 180 TTTC~AACC A~AGGCTCGG CTCTGCTCAC AGGAGATTAG ATACTNAGGG CTA~AATTAT 240 CCAAAGGCAC CAGGGCCCTC AGT~-AG~-AAC GTATCCAGCC TATACTGGCT TATCCTCATC 300 CCAaAACCCT AAAGCAACTA AGAGGGTTCC TTGGCATAAC AG~.lll~lGC c~-~AAA~Ar-A 360 TTCCCAGGTA CASCC~ATA GCC~ACr~T TATATP~-~CT AATTANGGAA ACTCA~-AAAG 420 C~AA~A~CTA TTTAGTAAGA TGGACACCTA CAGAAGTGGC TTTCCAGGCC CTAAA~AAGG 480 15 CCCTAACCr-~ AGCCCCAGTG TTCAGCTTGC CAACAGGGCA AGA.llll~l TTATATGCCA 540 r~AAAAAAC AGGAATAGCT CTAGGAGTCC TTACGCAGGT CTCAGGGATG AGCTTGCAAC 600 CCGTGGTATA CCTGAGTAAG GAAATTGATG TAGTGGCA~A GGGTT 645 20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA ~LQULN~::
(A) LOI.~u~u~: 741 paires de bases (B) TYPE: nucleotide ( c ) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: li neA ire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
CAAGCCACCC AAr-AAcTcTT A~A~.~CC~C ACTACCTGTG GCTACAAGGT TTCr-AAArrA 60 AAGGCTCAGC TCTGCTCACA GGAGATTAGA TACTTAGGGT TA~AATTATC CAAAGGCACC 120 AGGGGC~ 'A GTGAGGAACG TATCCAGCCT ATA~lGGGll ATCCTCATCC ~AAACCCTA 180 35 AAGCAACTAA GAGG~l~CCl TAGCATGATC AGGlll~lGC C~-~AAA~AAG ATTCCCAGGT 240 A~A~C~AAAA TAGcr-Ar~Acc ATTATATAr-~ CTAATTAAGG AAACTCAGAA AGC~AATACC 300 TATTTAGTAA GATGGACACC ~AAArA~AAG G~lllC~AGG CCC~AAA~-~A GGCCCTAACC 360 CAAGCCCCAG TGTTCAGCTT GCrAA~AGGG CAAGATTTTT CTTTATATGG r~ AAAA 420 ArAGr-AATcG CTCTAGGAGT CCTTA~ArPG GTCCGAGGGA TGAGCTTGCA ACCCGTGGCA 480 TACCTGAATA AGGAAATTGA TGTAGTGGCA AAGGGTTGGC CTCAl..~lll ATGGGTAATG 540 GTGTGGACAT CTCATGATGT GAACGGCATA CTCACTGCTA AA~-GA~-ACTT GTG~.l lGl~A 660 ~AArrATT TACTTAANTA TCAGGCTCTA TTACTTGAAG AGCCAGTGCT GNGACTGCGC 720 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA ~LyUL.._~:
(A) Lu.. ~u~u~: 93 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire W O 97/06260 2 2 0 1 2 ~ PCTAFR96/01244 (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:

0 (2) INFORMATIONS POUR La SEQ ID N0: ll:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LON~U~U~: 96 paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:

( 2 ) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LON~U~UK: 748 paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple ~D) CONFIGURATION ~; ne~ire (ii) TYPE DE MOT~CUT~: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:

TTCGATGTAG AAAGCGCCCG GAAA~ACGCG GGACCAATGC GTCGCCAGCT TGCGCGCCAG 120 40 CGC~1~1G CCATTGGCCA GCGCCACGCC GATATCACCC GCCATGGCGC CGGAGAGCGC 180 CAG~A~.A~CG GCGGCCAGCG GCGCATTCTC AACGCCGGGC TCGTCGAACC ATTCGGGGGC 240 GATTTCCGCA CGACCGCGAT G~1GG''GGA GAGCCAGGCC CTGGCCAGCA ACTGGCACAG 300 45 l lC~ AG ANGCGCACCA GCCC~-AAGGC ATTGGCGAGA TCGGTCAGCG CCAAGGCGCC 480 G~-A~TATTCG GAGTGGAGAC GGAGGTGGAC GAAGCGCGGC GAATTCATCC GCGTATTGTA 600 ACGG~1~ACA CCTTCCGCAA AGCATTCCGG ACGTGCCCGA TTGACCCGGA G~-AACCCCGC 660 .

W O 97/06260 ~ ~ 0 ~ 2 ~ 2 ` ! PCTrFR96/01244 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCB:
(A) LG,.--U~U~: 18 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE 8RINS: S imple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:

(2) 1NrUK~ATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LO.~U~UK: 20 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: S imple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
GTAGTTCGAT GTA~AAA~.CG 20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LON~U~U~: 18 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: 5 imple (D) CONFIGURATION 1;n~A;re ( ii ) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA ~YU~N~:
50 (A) LO.. JU~U~ 23 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ~ W O 97/06260 2 2 ~ 3 2 ; ~- ~ PCT/FR96/01244 ., . -(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16:
S AGGAGTAAG ~-~AACC~CG GAC 23 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 17:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases (B) TYPE: nucleotide (c) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 18:
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LO~U~UK: 21 paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18:
35 TCAGGGATAG CCCCC~TCTA T 21 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: l9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: li néA ire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19:
AACC~l~GC CACTACATCA ATTT 24 W O 97/06260 2 ~ ~ ~ 2 ~ 2 PCTAFR96/01244 ~

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 20: -(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LON~U~UK: 15 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) N~MRR~ DE 8RINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(iX) CARACTERISTIQUES:
( B ) EMPT~r~M~NT: 5, 7, 10, 13 (D) AUTRES INFORMATIONS: G représente l'inosine (i) (Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 20:
G~C~1GCCG CAGGG 15 (2) INFORMaTIONS POUR LA SEQ ID NO: 21:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: ~; n~ ire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA ~yU~N~: SEQ ID NO: 21:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 22:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases (B) TYPE: nucléotide ( C ) NOMRR~ DE BRINS: S imple (D) CONFIGURATION: liné~ire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA ~QU~N~: SEQ ID NO: 22:
TCAGGGATAG CC~C~TCTA T 21 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 23:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LON~U~UK: 24 paires de bases ~ W O 97/06260 2 2 0 1 2 ~ 2 ` ~ ~ PCT~R96/01244 (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire ~ 5 ( ii ) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 23 AACC~lGC CACTACATCA ATTT 24 (2) l~r~ -~TIONS POUR LA SEQ ID NO: 24:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LC.. _J~UK: 23 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ll) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 24 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 25:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire ( ii ) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 25 TCATCCATGT ACCr~ G 18 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 26:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LON~u~uK: 20 paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE M~T~CUT-T'`: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 26 ATGGGGTTCC CAA~llCC~l 20 -W O 97/06260 2 2 0 ~ PCT/FR96/01244 ~

102 r (2) lNru~ATIoNs POUR LA SEQ ID NO: 27:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (i~) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 27 GCC~-~T~TCA CCCGCCATGG 20 (2) INFORUATIONS POUR LA SEQ ID NO: 28:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 28 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 29:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LON~U~UK: 20 paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) D~S~TPTION DE LA ~D~N~: SEQ ID NO: 29 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 30:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LON~U~UK: 20 paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC

~ W O 97/06260 2 2 0 1 2 ~ 2 ` ~ PCTrFR96/01244 (Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 30 .. 5 (23 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 31:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LON~UhUK: 26 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 31 GATCTAGGCC A~11~AGG TCCAGS 26 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 32:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LON~U~UK: 23 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(iX) CARACTERISTIQUES:
(B) EMPT.~M~NT: 6, 12, 19 (D) AUTRES INFORMATIONS: G représente l'inosine (i) (Xi) DESCRIPTION DE LA ~yU~N~: SEQ ID NO: 32 CA~ 1G GGCAGGCAGT AGC 23 2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 33:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
so (Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 33 -W O 97/06260 ~ 2 ~ PCTAFR96/01244 2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 34:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 22 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: li n~ i re (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 34 2) INFORMaTIONS POUR LA SEQ ID NO: 35:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 22 paires de bases ( B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGUR~TION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 35 2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 36:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LG..~u~uK: 22 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOM~k~ DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: li n~ i re (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 36 2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 37:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LO1.~u~u~: 22 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc ~ W O 97/06260 2 2 0 ~ ~ 8 2 `~ t' PCTAFR96/01244 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 37 .. S
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 38:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 40 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 38:
~G~TCTA GAATTCGGCT ATAGGCGGCA TCCGGCAAGT 40 (2) l~r~ -~IONS POUR LA SEQ ID NO: 39:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ( ii ) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 39:
cf figure 28 (2) l~r~ '~IONS POUR LA SEQ ID NO: 40:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) TCE,urJu~: paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: li~ire ( ii ) TYPE DE MOT.T~`CYT.~: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 40:
cf figure 28 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 41:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

W O 97/06260 22 ~ ; PCT~FR96/01244 (A) LONGUEUR: paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 41:
cf figure 34 (2) l~rO~ATIONS POUR LA SEQ ID NO: 42:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 42:
25 cf figure 34 ~2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 43:
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LO..~u~ paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 43:
cf figure 34 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 44:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) Lc~u~:u~ paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGUR~TION: lineaire r (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 44:

W O 97/06260 ~ 2 :0 1 2 ~ i PCTIFR96/01244 cf f igure 34 (2) INFORUATIONS POUR LA SEQ ID NO: 45:
(i) CAR~CTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOT~CUT~: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 45:

(2) INFORUATIONS POUR LA SEQ ID NO: 46:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LON~U~UK: paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 46:
cf f igure 13 (2) INFORNATIONS POUR LA SEQ ID NO: 47:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA ~:Q~N~:
35 (A) LG.. ~u~u~: 23 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA ~YU~N~: SEQ ID NO: 47:

~ 45 ; (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 48:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire W O 97/06260 22 a ~ 2!~.2 ~_ PCT/FR96/01244 tii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 48:

CC~GA~GTT AGGAACTCCC TTTC 24 (2) 1N~IaTIONS POUR LA SEQ ID NO: 49:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOT~CUT~: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 49:

(2) INFORMATIONS POUR La SEQ ID NO: 50:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LON~U~U~: 22 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 50:

(2) INFORNaTIONS POUR LA SEQ ID NO: 51:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: 1; n~ire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA ~;QU~C;~;: SEQ ID NO: 51:
r cf figure 15 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 52:

W O 97/06260 ~ 2 0 t ~ ' PCTAFR96/01244 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LO..~U~U~ paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 52:
cf figure 16 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 53:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LON~U~U~: paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 53:
cf figure 17 30 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 54:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA ~QU_..CE:
(A) LON~U~U~: 21 paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(xi) DESCRIPTION DE LA ~YU~N~: SEQ ID NO: 54:

(2) INFORUATIONS POUR LA SEQ ID NO: SS:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LCI.~U~UK: 23 paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: 1; n~ ire (ii) TYPE DE ~T~T"CUT~: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 55:
~lCC~ .GGG i~1C~ LACT CCT 23 W O 97/06260 22 0 ~ 2~ PCT/FR96/01244 (2) INFORMATIONS POUR ~A SEQ ID NO: 56:
(i) CA'AACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LON~U~U~: paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 56:
cf figure 23 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 57:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA ~YU~CE:
(A) LO~U~UK: paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 57:
cf figure 27 (27a à 27c) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 58:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
35 (A) LU.. ~U~UK: 1722 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 58:
TGr.ArA~Ar, CAGCATAAGT TGGCTGGCAG AAGTAGGGAA AGACAGCAAG 50 45 AAGTAA~r.AA AAAAAF~r.Pr.l~ AAGTf~Ar7Ar.A AAr.AAA~AAA GAGAGGAAGA 100 AArAAAr.AAG AACTTGAAGA G~r-AAAr-AAC TAGT~AAr.AA AAAA~r7TAT 150 ACCCTATTCC TTTAAAAGCC AGGGTA~ATT ~1~1ULACC TAGCCAAGGC 200 ATA11~11`1 TATGTGGAAC ATCAACCTAT ATCTGCCTCC CCACTAACTG 250 GACAGGCACC TGAACCTTAG ~ AAG TCCrA~r.~TT AACATTGCCC 300 50 rAr.r.AAA~CA GACCCTATTG GTAC~1 A AAGCTA~AGT CCCGl~AGTG 350 CTAC~GGAAC TGGAATAGCC GGTTTATCTA CTTCATTATC CTACTACCAT 450 ACACTCTCAA AGAATTTCTC AGACAGTTTG ~.~Ar.AA~TAA TGA~ATCTAT 500 TCTTACTTTA CAATCCCAAT TAGACTCTTT GGCAGCAATG A~1~1CUAAA S50 55 ACCGCCGAGG CCr~CA~CTC CTCACTGCTG Ar~AAr,r.ArG ACTCTGCACC 600 ~ W O 97/06260 2 2 0 1 2 ~ 2 ~ -~ ` PCT/FR96/01244 TTTCAAACTC TTATAr-r-AAr- CTCTGGAGTT GGGCAACATG G~ll~l.CCA 750 r TATTTTTAAG ~~ 7 ' ~'A AAl ~711 I C CTCTAGGATC GAAGCCATCA 850 5 AGCTAr~r-~T GGTCTTACAA ATGr-~ACCCC AAATGAGTTC AAcTAAr-~A~- 900 TTCTACr~AG GACCCCTGGA ACGATCCACT GGCACTTCCA CTAGCCTAGA 950 GAl CCC~lC TGGPAr,A~r' TACAACTGCA GGGCCCCl C TTTGCCCCTA 1000 TCCAGCAGGA AGTAGCTAGA GCGGTCATCG GCCA~ATTCC CAACAGCAGT 1050 IGGG~ , CC TGTTTAGAGG GGGGATTGAA GAGGTGACAG CCTGCTGGCA 1100 10 GCCTCACAGC C~ ~, .GGY TCTCAGTGCC TCCTCAGCCT TGGTGCCCAC 1150 ~ GGG CTGGACAAGG CCGGAGCCAG CTCCCTCAGC TTGCAGGGAG 1250 GGGCCAGCAT GAGTTCCAGG TGGGCGTGGG CTCGGCGGGC CC~r~CTCG 1350 TTCGCTGGGC CTTAGCTGCC llCCCC~lGG GGCAGGGCTY CGGGAACMTG 1450 CAGCCTGCCC ATGCTTGAGC cccc~Arccc GCCGTGGGTT CYTGCACAGC 1500 CCAAGCTTCC CGGACAAGCA Cr~CCC~llA TCCACGGTGC CCAGTCCCAT 1550 r~Acr~ccc~ AGGGTTGAGG AGTGCGGGCA CACAGCGCGG GATTGGCAGG 1600 G~lC~.GAGT CTGGTGGGGA CTTGGAGAAT CTTTATGTCT AGCTAAGGGA 1700 25 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 59:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LON~u~u~: 495 paires de bases (B) TYPE: nucleotide (c) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MoT~cuT~: ADNc 35 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 59:
~l.CCC~AC TAATAAGGAC CCCC~ll-`A ACCrAAAr~G TcrAAAAGGA r~TAr~rAAA 60 GGAGTAAACA ATrAAr~AAA GAGTGCCAAT A~lCC~lGGT TATGCACCCT CCAAGCGGTG 120 Gr-Ar-AAr-AAT TCGGCCCAGC CAGAGTGCAT GTAC~ llll ~~ ACA CTTGAAGCAA 180 ATTAAAATAr ACNTAGGTNA ATTNTCAGAT AGCCCTGATG GYTATATTGA 1~.. L AcAA 240 GGATTAGGAC AAlC~ll-GA TCTGACATGG ArArATATAA TATTACTGCT AAATCAGACG 300 CTAACCTCAA ATGArAr-AAr- TGCTGCCATA ACTGGAGCCC GAGAGTTTGG CAATCTCTGG 360 TATCTCAGTC AGGTCAATGA TAGGATGACA ACGGAGGAAA r~rAACrATT cccr-~r~r~GG 420 CAGCAGGCAG TTCCCAGTGT AG~ ~ AT TGGr-~r~r~ AATr-~r-A~c~ TGGAGATTGG 480 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6Q:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LON~U~U~: 2503 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lin~Aire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 60:

-WO 97/06260 ~ 2 ~ ~ 2 & ~ PCT/FR96/01244 c~A~A~rcc ACCAATTCCG GANCACATTT TGGC~-~C~C GAAGGGACTT TCGCATATCG 60 CCAAGCGGTG AG~Ç~AT~GC CGAGCGGTGA GAC~lllCCC AATCGCCAAG CAGTGAGTAC 120 cATr-~r-~ccc CTTTCACTTG CTA~ ~lC CTA ~Ll~. TTAGAATTCG GGGGCTA~AT 180 ACCGGGCATC TGTCAGCCAT TTAAAAGTGA CTAGCGGGCC GCCGGACTAA ~P~CGGGT 240 5 GTCAAGCTTT CTGGGAAAGG G~-~l AAC A~rcccr~Ac TCTTTGGAGT TGGGACCGTT 300 GGTTTGCCTA r-~AC~GCTT CCG~ll~CC TGTACTTCTG GGCTGAGCCG TGGGTTGACA 360 GTr-~G~-AAA GCCATGCATC TCCGGGGTCT C~-M~A~TG ..G~l-GACC CTGCGGCCAT 420 TGACCCTTGC C~lGGGTC CTAATGCCTG CrAr.Ar-~AAC llC~l~CGC ~-~-~-~lC 540 0 TGAAGCTAGA ACCGCTTCTA APAATTGCTA CCTGGTCTCT GGTGCTTTTC CTAkL~ C 600 CTATA~Ar~AA TGAWTTCTAG TATTAAACTC CAGGACTCTG TTAC~l.~ll TAGGCACCCG 660 GGCTCACCAA Tr-Ar-~AAr-~C ACAG~ lG CCCAAGGCCC CATCGTAGTG GGGACTACCT 720 GGAATTTTAG GA-CC~lC~l CAGACTAACA GGCCTAACAA AAGTTATTCC TGAAGCTAGG 780 ATATGGGGAG CCTr~r-~T TGTATCCCTC CTATTCATAT AAGTGAGAAC A~AAGGTGTC 840 lS A~lC~AA CCCTGAAGAT CCC~lCC~.C CCTCAGGGTA TGGCC~LC~A TTTCATTTTT 900 GTGGCATAAC ATCTTTATAG GATGGGGTAA AGTCCCA~TA CTAACAGGAG AATGCTTAGG 960 ACTCTAACAG ~llll-GAGA ATGCGTCAGT AAGGGCCACT A~ATCTGATT ~ AGTC 1020 G~lC~lC~.l ~.GG.~lAGG AGGACAGGCA AGGTTGTGCA G~.-~CGAG AATGCGTCAG 1080 TAAGGACCAC TAAATCCGAC ~llC~.CG~l CCTCCATGTG GTCTGGGAGG APAACTAGTG 1140 20 TTTCTGCTGC TGC~-CG~lG AGCGCAACTA TTCAAGTCAG CAGGGTCCAG GGACCGTTGC 1200 AGG~ GG GCAGGGGTTG TTTCTGCTGC TGCATTGGTG AATGCAACTA TTCTGATCAG 1260 CAGGGTCCCA GGACCATTGC AG~-C~llGG GCAGGGAGAG AA~A~A~Ç~ AACCAAPACT 1320 GTGGGCGGTT ll~l~-l ~A TATGGGAAAC ACTCAGGCAT CAACAGGTTC ACCCTTGA~A 1380 TGCATCCTAA GCCATTGGGA CCAATTTGAC cr~r~A~r~cc T~-A~A~G~r, GAGGCTCATT 1440 25 l ~ l.C~lGCA CTACGGCTTG GCCCÇ~TAT 1 l~lll~ G ATGGGGAAAA ATGGCCACCT 1500 GAGGGAAGCA CAAATTACAA TAYTATCCTA CAGCYTGATC ...l~.~lAA GAGGGAAGGC 1560 AAATGGAGTG AATACCTTAT GTCCAAGCTT .Cl.ll~ATT GAGGGAGAAT ~Ç~r~CTAT 1620 GCAAAGCTTG CAATTTACAT CC~-Ar-~GGAG GACCCTTCAG CTTACCCCr-~ TATCCTAGCC 1680 TCCCTATAGC llCC~llC~l ATTGATGATA ~lC~l~-L AA-~lCCC~-l Gcc~Ar~rG 1740 30 AAATA~GCAA AGA~ATCTCC AAAGGTCCAC AAAA~CCCCC GGGCTATCGG TTAl~lCC~l 1800 TCAAGYTGTA GGGGGAGGGG AATTTGGCCC AACCCGGGTG CAl~lCC~ll ~lCCC. 1~l 1860 GATTTAAAGC AGATCAAGGC AGACCTGGGG AAG-lll AG ATGATCCTGA TAGGTACATA 1920 GAl~lC~AC AGGGTCTAGG GCA~ACCTTT GACCTCACTT GGAGAGACGT CATGCTACTG 1980 TTAGATCA~A CCCTGGCCTT TAATGA~AAG AATGCGGCTT TAGCTGCAGC CTGAGAGTTT 2040 35 Gr-A~-ATACCT GGTATCCTAG TCAAGTAaAT ~-~AAr7AATGA CAGCC~7AA~-~ AAGGGACAAC 2100 ~lc~l~AcTG GTCAGCAACC CATCCCCAGT ATGGATCCCC ACTGGGACTT TGACTCAGAT 2160 CATGGGGACT GGAGTCGTAA ACAl l~llG A~ ~llC TGGAAGGACT AAGGAGAATT 2220 GGr~AAaAAr7c CCATGAATTA TTCAATGATA Tcracr-ATAA CCCAGGGAaA G~-~A~-AAAAT 2280 C~ll~lGCCT ~C~LCGAGCG GCTAr-~A~.~r. GCCTTAAGAA AATATACTCC C~ ACCC 2340 40 GAATCACTCG AGGGTCAATT GATTCTA~AA GATAAGTTTA TTArCr~ATC AGCr~rAr-AT 2400 ATr.-Ar~r-Ar-AA AGCTCCAaAA GCAAGCCCTG AGCCTGAACA AAATCTAGAG ACATTATTAA 2460 ACCTGGCAAC ~llGGl~llC TATAATAr,GG Ac~AAr7Ar~GA ACA 2503 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 61:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LO..~J~uK: 1167 paires de bases (B) TYPE: nucléotide 50( C ) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc 55(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 61:
AAGGAAACTC ~r-AA~GCCAA TACC~TTTA GTAAGATGGA r~C~r~AAGC AGAAGCAGCT 60 TTCCAGGCCC TAAAr.~pATC CCTAACCr-~ GCCCCAGTGT TAAGCTTGCC AACGGGGCAA 120 GA~lll~ll TATATGTCAC A~AAAAA~G GAATAGCTCT AGGAGTCCTT ACACAGGTCC 180 60 AAGGr-Ar-AAG CTTGCAACCT GTGGCATACC TGAGTAAGGA AACTGATGTA NTGGCAaAGG 240 GTTGGCCTCA ll~lllAcAG GTAGGGCAGC AGTAGCAGTC TTA~lll~lG AaACAGTTAA 300 ~ W O 97/06260 2 2 0 1 2~ ~ 2i j ~` PCT/FRg6/01244 ,. . .i ~, i .

AATAATAC~AG G~.AA~.A~-ATC TTA~l~l~lG GACATCTCAT GATGTGAACG GCATACTCAC 360 TGCTAAA~-'AG GACTTGTGGC TGTCAGACAA CCATTTACTT AAATAGCAGG TTCTATTACT 420 TGAAGTGCCA GTGCTGCGAC TGCACATTTG TGCAACTCTT AACCCAGCCA CAlll~l~CC 480 A~A~7AATGAA ~AAAA~ATAG AA~ATAACTG T~-AA~AAGTA ATTGCTCAAA CCTATGCTGC 540 TCGAGGGGAC CTTCTAGAGG llCC~-lGAC TGATCCCGAC CTCAACTTGT ATACTGATGG 600 AA~lLC~llG G~-~-A'A~AAG GACTTTGAAA AGCGGGGTAT GCAGTGATCA GTGATAATGG 660 AATACTTGAA AGTAATCGCC TCACTCCAGG AACTAGTGCT CACCTGGCkG AACTAATAGC 720 GTATGCTTAC CTA~L ~CC ATGCCCATGC AGCAATATGG A~-~r-~ GG AATTCCTAAC 840 Ar~A~AccTAA AGAGGTGGCA GTCTTACACT GCCAGGGTCA TCAGGAAGAA GAGGAAAGGG 960 AAATAr-~AGG CAATCGCCAA GCGGATATTG AAG~AAAAAA AGCCGCAAGG CAGGACTCTC 1020 CATTAr-A'AAT GCTTPTA~-AA GGACCCCTAG TATGGGGTAA lCCC~l~lGG ~-AAA~pp~c 1080 CCCAGTACTC AGCAGGAAAA ATA~-AATAGG AAACCTCACA AGGACATACT llC~CCCCT 1140 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 62:
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 78 paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 62:
30 TC~-AAAGGCA CCAGGGCCCT CAGTGAGGAA CGTATCCAGC CTATACTGGC TTATCCTCAT 60 CC~AAAACCC TAAAGCAA 78 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 63:
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LON~u~u~: 26 residus d'acide aminé
(B) TYPE: acides amines (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) D~CrRTpTIoN DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 63:
Ser Lys Gly Thr Arg Ala Leu Ser Glu Glu Arg Ile Gln Pro Ile Leu Ala Tyr Pro His Pro Lys Thr Leu Lys Gln (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 64:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LG ~u~u~: 28 paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: line A ire W O 97/06260 ~ f'~rii PCT/FR96/01244 (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 64:
5 A~ATGTCTGC GG~-~C~TC TCCATGTT 28 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 65:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LO~u~u~: 30 paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 65:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 66:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LO~U~UK: 21 paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 66:

35 G~.~ C AGCATAAGTG G 21 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 67:
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LON~u~u~: 25 paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lin~i~e (ii) TYPE DE M~T~CrJT~T~`: ADNc (xi) DT'S~-~TPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 67: t (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 68:

_ ~ W O 97/06260 2 ~ O ~ ? ~ 2 ` PCT~Rg6/01244 .

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 34 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOT~T'`CUT~T'`: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 68:
GACTCGCTGC AGATCGATTT Illlllllll TTTT 34 15 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 69:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases (B) TYPE: nucléotide ( c ) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: li n~A; re (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 69:
GCCATCAAGC CACC~G~A CTCTTAACTT 30 30 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 70:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LO..~U~UK: 30 paires de bases (B) TYPE: nucléotide ( c) ~. MRR~ DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA ~yu~N~: SEQ ID NO: 70:
C~-~T~GCCA GACCATTATA TACACTAATT 30 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 71:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE M~T.~CUT.T~': ADNc W O 97/06260 `'i i PCTAFR96/01244 (Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 71:
GC~T~CTG ~rC~ GTT 23 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 72:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LO..~U~UK: 23 paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 72:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 73:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LON~U~U~: 25 paires de bases ( B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: I;n~;re (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 73:

(2) INFORMATIONS POUK LA SEQ ID NO: 74:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA ~QU~N~:
(A) LO..~U~UK: 24 paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: I; ne~ire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 74:
AA~11.. CCC .l,lC~AGAT CCTC 24 t (2) IN~.~ r~IONS POUR LA SEQ ID NO: 75:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LON~U~UK: 22 paires de bases ~ W O 97/06260 2 2 0 i 2 ~ 2 PCT/FR96/01244 (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 75:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 76:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ( ii ) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 76:
~ ~lCC~llG G~L1C~'A CTCCT 25 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 77:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 77:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 78:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LON~U~U~: 25 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION- linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: :
CCG~G G~1~'~1'A CTCCT 25 W O 97t06260 2 2 ~ 1 2 ~ 2 ` PCT~R96/01244 ~

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 79:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 2S paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 79:
15 AGGAGTAAGG A~ACCCAACG GACAG 25 (2) lNrur-~LTIoNs POUR LA SEQ ID NO: 80:
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 80:
30 TGT~T~T GGTCTGGCTA TTGGG 2S

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 81:
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) P~-~CRTPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 81:
45 AGGAGTAAGG ~CC~ACG GACAG 2S

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 82:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LG~.~u~:u~: 26 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ~ W O 97/06260 ~ ~ ~ 1 2 ~ ? -~ ; PCT~R96/01244 (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 82:
s TTCGGCAGAA AC~L~L LATG CCAAGG 26 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 83:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 22 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOM8RE DE BRINS: simple (D) CON~I~UKATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: :

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 84:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LON~U~U~: 20 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) rT~MRR~ DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 84:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 85:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA ~QU~N~:
(A) LO~U~U~: 20 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 85:

CTCTAC~AT CAGCATGTGG 20 W O 97/06260 2 2 0 ~ 2 ~ 2 PCT/FR96/01244 ~

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 86:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 86:

~ C~~ GGTCCCTAT 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 87:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 433 residus d'acide amine ( B) TYPE: acides aminés (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 87:
MATATGTGIA GLSTSLSYYH TLSKNFSDSL QEIMKSILTL QSQLDSLAAM SO
TT~QNRR~PHL LTAEKGGLCT FT.~.T~C~FYT NQSGIVRDAT WHLQERASDI 100 T`ATRT.Q~VLQ MEpQMSSTNN FYQGPLERST GTSTSLEIPL ~KTT.QT~QGPF 200 ~RT.RA.CM.CSR WAWARRAPHS GSEGLSTWAR QMLCSTSSLG LSCLPRGAGL 350 ~AACPCLS PPPRRGFLHS Ps~K~L STVPSPINHP RVEECGHTAR 400 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 88:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA ~U~:
(A) LON~U~U~: 693 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ( ii ) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 88:
~1CCC~;~AC TAATAAr-GAC CCCC~ A ACCrAAA~AG TC~-AAAAG~-A ~ATA~A~AAA 60 GGAGTAAACA AT~-AA~A~ GAGTGCCAAT ATTCCCTGGT TATGCACCCT CCAAGCGGTG 120 G~-A~-AA~-AAT TCGGCCCAGC CAGAGTGCAT GTAC~LL1 ~1~L~L~ACA CTTGAAGCAA 180 ATTAAAAT~G ACNTAGGTNA ATTNTCAGAT AGCCCTGATG GYTATATTGA ~ LACAA 240 GGATTAGGAC AALC~iL1GA TCTGACATGG ArArATATAA TATTACTGCT AAATCAGACG 300 CTAACCTCAA AT~-AGP~-A~G TGCTGCCATA ACTGGAGCCC GAGAGTTTGG CAAl~L~LGG 360 TATCTCAGTC AGGTCAATGA TAGGATGACA ACGGAGGAAA ~AGA~CGATT CCCrA~.~GGG 420 CAGCAGGCAG TTCCCAGTGT AG~LCCL~AT TGGGACACAG AAT~-A~P TGGAGATTGG 480 W O 97/06260 ~ 2 0 1 2 ~ 2 PCT/FR96/01244 AATTATTCAA TGATGTCCAC TATAACACAG GGGAAAGGAA GAAaATCCTA CTGCCTTTCT 600 AaaAGGGAAA AGTTGGGCAA ATTGAATGCC TAA 693 s (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 89:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LO.. ~U~UK: 1577 paires de bases (8) TYPE: nucleotide (c) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: 1ineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 89:
AACTTGCGTG CTAGAAGGAC TAAGGAaaAC TAGGAAGACT ATGAATTATT CAATGATGTC 60 20 CACTATAA~ CAGGGGAAAG ~-~A~-7AAAATC CTACTGCCTT TCTGGAGAGA CTAAGGGAGG 120 CATTGAGGAA G~7ATACCAGG CAAGTGGACA TTGGAGGCTC TGGAAAAGGG AAAAGTTGGG 180 CAAATTGAAT GCCTAATAGG GCTTGCTTCC AGTGCAGTCT ACAAGGACGC TTTA~-AAAA~ 240 Al~.7~C~AAG TA~AAATAAG CCGCCCCTCG TCCATGCCCC TTATGTCAAG GGAATCACTG 300 GAAGGCCTAC TGCCCCAGGG GACr7A~-GTC CTCTGAGTCA GAAGCCACTA ACCTGATGAT 360 CCCGGGTATG TTTGACCATT GAGAGCCAGG AAGTTAACTG 1~lC~lGGAC ACTGGCGCAG 480 C~ AGT CTTACTTTCC ~7lCC~AGAC AA~Ll~lC~lC CAGATCTGTC ACTATCCGAG 540 GGGTCCTAAG ACAGCCAGTC ACTA~TACT TCTCTCAGCC ACTAAGTTGT GACTGGGGAA 600 CTTTACTCTT TTCACATGCT TTTCTAATTA TGCCTGAaAG CCCCACTCCC TTGTTAGGGA 660 30 ~A~A~TTTT AGCAAAAGCA GGGGCCATTA TACACCTGAA ~ATA~r.AAA~ GGAATACCCA 720 ATG~-A~A~-C AAAGAATGCC C~l~llC AAGTTAaACT AaAGGATTCT GC~lC~l~lC 840 CCTACCAaAG GAAGTACCCT CTTAr-ACCCG AGGCCCTACA AGGACTCAaA AGATTGTTAA 900 GGACCTA~AA GCCCAAGGCC TAGTAAAACC ATGCAGTAGC CCCTGCAATA CTCCAATTTT 960 35 AGGAGTAAGG AAACC~-~ACG GACAGTGGAG GTTAGTGCAA GATCTCAGGA TTATTAATGA 1020 GG~l~l L 111 CCTCTATACC CAGCTGTATC TAGCCCTTAT ACTCTGCTTT CCCTAATACC 1080 A~AGGAA~CA GAGTAGTTTA CA~lC~lGGA CCTTAAGGAT GC~l~lll~ GCA-lCC~l~7l 1140 ACATCCTGAT TCTCAATTCT l~lll~l~l~ TGAAGATCCT TT~-AACC~A TGTCTCAATT 1200 40 AGCCCAAr,~C TTGAGCCAAT TCTCATACCT GGACATCTTG lC~llCGGTA TGGGATGATT 1320 TAATTTTAGC CACCC~ll` A GAaACCTTGT GCCATCAAGC CACCCAAGCG TTCTTAaATT 1380 TCCTCACTCC GTGTGGCTAC AAG~ll lC~A AACCA~AGGC TCAGCTCTGC TCACAGCAGG 1440 TTAAATACTT AGGGTTAAaA TTATCCA~AG GCACCAGGGC C~l~l~lGAG GAATGTATCC 1500 AACCTGTACT GGCTTATCTT CATCC~-~AAA CCCTAAAGCA ACTAA~-AAGG TCCTTGGCAT 1560 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 90:
( i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 182 residus d~acide amine (B) TYPE: acides amines (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 90:
SSæ~T~-AR~- KCQPMPSPSE PRVCLTIESQ EVNCLLDTGA AFSVLLSCPR 50 60 RDTT.AKPGAT IHLNIGKGIP ICCPLLEEGI NPEVWAIEGQ YGQAKNARPV 150 = . . . -- -- --W O 97/06260 ~ 2 PCT~FR96/01244 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 91:
s (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LOh~u~uK: 36 paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lin~A;re (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 91:

AGATCTGCAG AATTCGATAT CACCCCCCCC CCCCCC

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 92:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA ~Q~N~:
(A) LONGUEUR: 22 paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: l;n~Aire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 92:
AGATCTGCAG AATTCGATAT CA

Claims

1/ Matériel viral, à l'état isolé ou purifié, dont le génome comprend une séquence nucléotidique choisie dans le groupe incluant les séquences SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 52, SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 56, SEQ ID NO 58, SEQ ID NO 59, SEQ ID NO 60, SEQ ID NO 61, SEQ ID NO 89, leurs séquences complémentaires, et leurs séquences équivalentes, notamment les séquences nucléotidiques présentant, pour toute suite de 100 monomères contigus, au moins 50 % et préférentiellement au moins 70 % d'homologie avec respectivement lesdites séquences SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 52, SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 56, SEQ ID NO 58, SEQ ID NO 59, SEQ ID NO 60, SEQ ID NO 61, SEQ ID NO 89, et leurs séquences complémentaires.

2/ Matériel viral, à l'état isole ou purifié, dont la région du génome comprenant les gènes env, pol et une partie du gène gag, à l'exclusion de la sous-région ayant une séquence identique ou équivalente a SEQ ID NO 1, code pour tout polypeptide présentant, pour toute suite contigüe d'au moins 30 acides aminés, au moins 50 %, et de préférence au moins 70 % d'homologie avec une séquence peptidique codée par toute séquence nucléotidique choisie dans le groupe incluant SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 52, SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 56, SEQ ID NO 58, SEQ ID NO 59, SEQ ID NO 60, SEQ ID NO 61, SEQ ID NO 89, et leurs séquences complémentaires.

3/ Matériel viral, à l'état isolé ou purifié, dont le gène pol comprend une séquence nucléotidique identique ou équivalente, partiellement ou totalement, à
SEQ ID NO 57, à l'exclusion de SEQ ID NO 1.

4/ Matériel viral, à l'état isole ou purifié, dont le gène gag comprend une séquence nucléotidique identique ou équivalente, partiellement ou totalement, à
SEQ ID NO 88.

5/ Matériel viral, à l'état isolé ou purifié, associé à la sclérose en plaques, dont le génome comprend une séquence nucléotidique choisie dans le groupe incluant les séquences SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 52, SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 56, SEQ ID NO 58, SEQ ID NO 59, SEQ ID NO 60, SEQ ID NO 61, SEQ ID NO 89, leurs séquences complémentaires, et leurs séquences équivalentes, notamment les séquences nucléotidiques présentant, pour toute suite de 100 monomères contigus, au moins 50 % et préférentiellement au moins 70 % d'homologie avec respectivement lesdites séquences SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 52, SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 56, SEQ ID NO 58, SEQ ID NO 59, SEQ ID NO 60, SEQ ID NO 61, SEQ ID NO 89, et leurs séquences complémentaires.

6/ Matériel viral, à l'état isolé ou purifié, associé a la sclérose en plaques, dont la région du génome comprenant les gènes env, pol et une partie du gène gag, à
l'exclusion de la sous-région ayant une séquence identique ou équivalente à SEQ ID NO 1, code pour tout polypeptide présentant, pour toute suite contigüe d'au moins 30 acides aminés, au moins 50 %, et de préférence au moins 70 %
d'homologie avec une séquence peptidique codée par toute séquence nucléotidique choisie dans le groupe incluant SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 52, SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 56, SEQ ID NO 58, SEQ ID NO 59, SEQ ID NO 60, SEQ ID NO 61, SEQ ID NO 89, et leurs séquences complémentaires.

7/ Matériel viral, à l'état isolé ou purifié, associé à la sclérose en plaques, dont le gène pol comprend une séquence nucléotidique identique ou équivalente, partiellement ou totalement, à SEQ ID NO 57, à l'exclusion de SEQ ID NO 1.

8/ Matériel viral, à l'état isolé ou purifié, associé à la sclérose en plaques, dont le gène gag comprend une séquence nucléotidique identique ou équivalente, partiellement ou totalement, à SEQ ID NO 88.

9/ Matériel viral, à l'état isolé ou purifié, associé à la polyarthrite rhumatoïde, dont le génome comprend une séquence nucléotidique choisie dans le groupe incluant les séquences SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 56, SEQ ID NO 59, SEQ ID NO 60, SEQ ID NO 61, SEQ ID NO 89, leurs séquences complémentaires, et leurs séquences équivalentes, notamment les séquences nucléotidiques présentant, pour toute suite de 100 monomères contigus, au moins 50 % et préférentiellement au moins 70 % d'homologie avec respectivement lesdites séquences SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 56, SEQ ID NO 59, SEQ ID NO 60, SEQ ID NO 61, SEQ ID NO 89, et leurs séquences complémentaires.

10/ Matériel viral, à l'état isolé ou purifié, associé à la polyarthrite rhumatoïde, dont la région du génome comprenant le gène pol et une partie du gène gag, à
l'exclusion de la sous-région ayant une séquence identique ou équivalente à SEQ ID NO 1, code pour tout polypeptide présentant, pour toute suite contigüe d'au moins 30 acides aminés, au moins 50 %, et de préférence au moins 70 %
d'homologie avec une séquence peptidique codée par toute séquence nucléotidique choisie dans le groupe incluant SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 56, SEQ ID NO 59, SEQ ID NO 60, SEQ ID NO 61, SEQ ID NO 89, et leurs séquences complémentaires.

11/ Matériel viral, à l'état isolé ou purifié, associé à la polyarthrite rhumatoïde, dont le gène pol comprend une séquence nucléotidique identique ou équivalente, partiellement ou totalement, à SEQ ID NO 57, à l'exclusion de SEQ ID NO 1.

12/ Matériel viral, à l'état isolé ou purifié, associé à la polyarthrite rhumatoïde, dont le gène gag comprend une séquence nucléotidique identique ou équivalente, partiellement ou totalement, à SEQ ID NO 88.

13/ Fragment nucléotidique comprenant une séquence nucléotidique choisie dans le groupe incluant :

(a) toutes les séquences génomiques, partielles et totales, du gène pol du virus MSRV-1, sauf la séquence totale du fragment nucléotidique défini par SEQ ID NO 1 ;
(b) toutes les séquences génomiques, partielles et totales, du gène env de MSRV-1 ;
(c) toutes les séquences génomiques partielles du gène gag de MSRV-1 ;
(d) toutes les séquences génomiques chevauchant le gène pol et le gène env du virus MSRV-1, et chevauchant le gène pol et le gène gag ;
(e) toutes les séquences, partielles et totales, d'un clone choisi dans le groupe incluant les clones FBd3 (SEQ ID NO 46), t pol (SEQ ID NO 51), JLBc1 (SEQ ID NO 52), JLBc2 (SEQ ID NO 53), GM3 (SEQ ID NO 56), FBd13 (SEQ ID NO 58), LB19 (SEQ ID NO 59), LTRGAG12 (SEQ ID NO 60), FP6 (SEQ ID NO 61), G+E+A (SEQ ID NO 89), à l'exclusion de toute séquence nucléotidique identique à ou comprise dans la séquence définie par SEQ ID NO 1 ;
(f) les séquences complémentaires auxdites séquences génomiques ;
(g) les séquences équivalentes auxdites séquences (a) à (e), notamment les séquences nucléotidiques présentant, pour toute suite de 100 monomères contigus, au moins 50 % et de préférence au moins 70 %
d'homologie avec lesdites séquences (a) à (e), ledit fragment nucléotidique ne comprenant pas ou ne consistant pas en la séquence ERV-9.

14/ Fragment nucléotidique comprenant une séquence nucléotidique choisie dans le groupe incluant :
(a) toutes les séquences génomiques, partielles et totales, du gène pol du virus MSRV-1, sauf la séquence totale du fragment nucléotidique défini par SEQ ID NO 1 ;

(b) toutes les séquences génomiques partielles du gène gag de MSRV-1 ;
(c) toutes les séquences génomiques chevauchant le gène pol et le gène env du virus MSRV-1, et chevauchant le gène pol et le gène gag ;
(d) toutes les séquences, partielles et totales, d'un clone choisi dans le groupe incluant les clones t pol (SEQ ID NO 51), GM3 (SEQ ID NO 56), LB19 (SEQ ID NO 59), LTRGAG12 (SEQ ID NO 60), FP6 (SEQ ID NO 61), G+E+A (SEQ ID NO 89), à l'exclusion de toute séquence nucléotidique identique à ou comprise dans la séquence définie par SEQ ID NO 1 ;
(e) les séquences complémentaires auxdites séquences génomiques ;
(f) les séquences équivalentes auxdites séquences (a) à (e), notamment les séquences nucléotidiques présentant, pour toute suite de 100 monomères contigus, au moins 50 % et de préférence au moins 70 %
d'homologie avec lesdites séquences (a) à (e), ledit fragment nucléotidique ne comprenant pas ou ne consistant pas en la séquence ERV-9.

15/ Fragment selon la revendication 14, comprenant une séquence nucléotidique identique à une séquence génomique partielle ou totale du gène pol du virus MSRV-1, sauf à la séquence totale du fragment nucléotidique défini par SEQ ID NO 1, ou identique à toute séquence équivalente à ladite séquence génomique partielle ou totale, notamment homologue à cette dernière.

16/ Fragment nucléotidique selon la revendication 15, comprenant une séquence nucléotidique codante, partiellement ou totalement identique à une séquence nucléotidique choisie dans le groupe incluant :
- la séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 62 et SEQ ID NO 89 ;
- les séquences complémentaires à SEQ ID NO 40, SEQ ID
NO 62 ou SEQ ID NO 89 ;

-les séquences équivalentes et notamment homologues à
SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 62 ou SEQ ID NO 89 ;
-les séquences codant pour tout ou partie de la séquence peptidique définie par SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 63 ou SEQ
ID NO 90 ;
-les séquences codant pour tout ou partie d'une séquence peptidique équivalente, notamment homologue à
SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 63 ou SEQ ID NO 90, susceptible d'être reconnue par des sera de patients infectés par le virus MSRV-1, ou chez lesquels le virus MSRV-1 a été
réactivé.

17/ Fragment selon la revendication 13, comprenant une séquence nucléotidique identique à une séquence génomique partielle ou totale du gène env du virus MSRV-1, ou identique à toute séquence complémentaire de ladite séquence nucléotidique, ou identique à toute séquence équivalente à ladite séquence nucléotidique, notamment homologue à cette dernière.

18/ Fragment selon la revendication 13, comprenant une séquence nucléotidique identique à une séquence partielle ou totale d'un clone choisi dans le groupe incluant les clones FBd3 (SEQ ID NO 46), t pol (SEQ ID NO 51), JLBc1 (SEQ ID NO 52), JLBc2 (SEQ ID NO 53), GM3 (SEQ ID NO 56), FBd13 (SEQ ID NO 58), LB19 (SEQ ID NO 59), LTRGAG12 (SEQ ID NO 60), FP6 (SEQ ID NO 61), G+E+A (SEQ ID NO 89), à l'exclusion de toute séquence nucléotidique identique à ou comprise dans la séquence définie par SEQ ID NO 1.

19/ Fragment selon la revendication 14, comprenant une séquence nucléotidique identique à une séquence partielle ou totale d'un clone choisi dans le groupe incluant les clones t pol (SEQ ID NO 51), GM3 (SEQ ID NO 56), LB19 (SEQ ID NO 59), LTRGAG12 (SEQ ID NO 60), FP6 (SEQ ID NO 61), G+E+A (SEQ ID NO 89), à l'exclusion de toute séquence nucléotidique identique à
ou comprise dans la séquence définie par SEQ ID NO 1.

20/ Sonde nucléique de détection d'un agent pathogène et/ou infectant associé à la sclérose en plaques, caractérisée en ce qu'elle est susceptible de s'hybrider spécifiquement sur tout fragment selon l'une quelconque des revendications 13 à 19, appartenant ou compris dans le génome dudit agent pathogène.

21/ Sonde nucléique de détection d'un agent pathogène et/ou infectant associé à la polyarthrite rhumatoïde, caractérisée en ce qu'elle est susceptible de s'hybrider spécifiquement sur tout fragment selon l'une quelconque des revendications 14, 15, 16, et 19, appartenant ou compris dans le génome dudit agent pathogène.

22/ Amorce pour l'amplification par polymérisation d'un ARN ou d'un ADN d'un matériel viral, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique identique ou équivalente à au moins une partie de la séquence nucléotidique d'un fragment selon l'une quelconque des revendications 13 à 19, notamment une séquence nucléotidique présentant pour toute suite de 10 monomères contigus, au moins 70 % d'homologie avec au moins ladite partie dudit fragment.

23/ Amorce selon la revendication 22, caractérisée en ce que sa séquence nucléotidique est identique à l'une quelconque des séquences choisies dans le groupe incluant SEQ ID NO 47 à SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 55, et SEQ ID NO 64 à SEQ ID NO 86.

24/ ARN ou ADN, et notamment vecteur de réplication, comprenant un fragment génomique du matériel viral selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, ou un fragment selon l'une quelconque des revendications 13 à 19.

25/ Peptide codé par tout cadre de lecture ouvert appartenant à un fragment nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 13 à 19, notamment polypeptide, par exemple oligopeptide formant ou comprenant un déterminant antigénique reconnu par des sera de patients infectés par le virus MSRV-1, et/ou chez lesquels le virus MSRV-1 a été réactivé.

26/ Polypeptide antigénique selon la revendication 25, caractérisé en ce que le cadre de lecture ouvert le codant commence, dans le sens 5'-3', au nucléotide 181, et finit au nucléotide 330 de SEQ ID NO 1.

27/ Polypeptide, notamment oligopeptide antigénique reconnu des sera de patients infectés par le virus MSRV-1, ettou chez lesquels le virus MSRV-1 a été
réactivé, caractérisé en ce que sa séquence peptidique est identique, partiellement ou totalement, ou équivalente à
la séquence définie par SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 63, SEQ ID NO 87.

28/ Oligopeptide antigénique selon la revendication 27, caractérisé en ce que sa séquence peptidique est identique a une séquence choisie dans le groupe incluant les séquences SEQ ID NO 41 a SEQ ID NO 44, SEQ ID NO 63 et SEQ ID NO 87.

29/ Peptide codé par tout cadre de lecture ouvert appartenant à un fragment nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 14, 15, 16 et 19, notamment polypeptide, par exemple oligopeptide formant ou comprenant un déterminant antigenique reconnu par des sera de patients infectes par le virus MSRV-1, et/ou chez lesquels le virus MSRV-1 a été reactive.

30/ Polypeptide antigenique selon la revendication 29, caractérisé en ce que le cadre de lecture ouvert le codant commence, dans le sens 5'-3', au nucléotide 181, et finit au nucléotide 330 de SEQ ID NO 1.

31/ Polypeptide, notamment oligopeptide antigénique reconnu des sera de patients infectés par le virus MSRV-1, et/ou chez lesquels le virus MSRV-1 a été
réactivé, caractérisé en ce que sa séquence peptidique est identique, partiellement ou totalement, ou équivalente à
la séquence definie par SEQ ID NO 39 ou SEQ ID NO 63.

32/ Oligopeptide antigénique selon la revendication 31, caractérisé en ce que sa séquence peptidique est identique a une séquence choisie dans le groupe incluant les séquences SEQ ID NO 41 a SEQ ID NO 44, et SEQ ID NO 63.

33/ Anticorps mono- ou polyclonal dirigé contre le virus MSRV-1, caractérisé en ce qu'il est obtenu par réaction immunologique d'un organisme humain ou animal, a un agent immunogène constitué par un polypeptide antigénique selon l'une quelconque des revendications 25 a 28.

34/ Anticorps mono- ou polyclonal dirigé contre le virus MSRV-1, caractérisé en ce qu'il est obtenu par réaction immunologique d'un organisme humain ou animal, a un agent immunogene constitué par un polypeptide antigénique selon l'une quelconque des revendications 29 a 32.

35/ Réactif de détection du virus MSRV-1, ou d'une exposition audit virus, caractérisé en ce qu'il comprend, a titre de substance réactive, un peptide, notamment antigénique, selon l'une quelconque des revendications 25 a 32, ou un anti-ligand, notamment anticorps dudit peptide.

36/ Composition diagnostique, prophylactique, ou thérapeutique, comprenant un peptide, notamment antigénique, selon l'une quelconque des revendications 25 a 28, ou un anti-ligand, notamment anticorps dudit peptide, selon la revendication 33.

37/ Composition diagnostique, prophylactique, ou thérapeutique, comprenant un peptide, notamment antigénique, selon l'une quelconque des revendications 29 a 32, ou un anti-ligand, notamment anticorps dudit peptide, selon la revendication 34.

38/ Composition immunothérapeutique active, notamment composition vaccinale, selon la revendication 36 ou 37.

39/ Composition diagnostique, prophylactique, ou thérapeutique, notamment pour inhiber l'expression d'au moins un agent pathogène et/ou infectant associé à la sclérose en plaques, comprenant un fragment nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 13 à 19, ou un polynucléotide, notamment oligonucléotide, dont la séquence est partiellement identique à celle dudit fragment, sauf à celle du fragment ayant la séquence nucléotidique SEQ ID NO 1.

40/ Composition diagnostique, prophylactique, ou thérapeutique, notamment pour inhiber l'expression d'au moins un agent pathogène et/ou infectant associé à la polyarthrite rhumatoïde, comprenant un fragment nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 14, 15, 16 et 19, ou un polynucléotide, notamment oligonucléotide, dont la séquence est partiellement identique à celle dudit fragment, sauf à celle du fragment ayant la séquence nucléotidique SEQ ID NO 1.

41/ Procédé pour détecter un agent pathologique et/ou infectant associé à la sclérose en plaques, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce que l'on met en contact un ARN et/ou un ADN présumé appartenir ou provenant dudit agent pathologique et/ou infectant, ou leur ARN et/ou ADN complémentaire, avec une composition comprenant un fragment nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 13 à 19, ou un polynucleotide notamment oligonucléotide dont la séquence est partiellement identique à celle dudit fragment, sauf à
celle du fragment ayant la séquence nucléotidique SEQ ID NO 1.

42/ Procédé pour détecter un agent pathologique et/ou infectant associe à la polyarthrite rhumatoïde, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce que l'on met en contact un ARN et/ou un ADN présumé appartenir ou provenant dudit agent pathologique et/ou infectant, ou leur ARN et/ou ADN complémentaire, avec une composition comprenant un fragment nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 14, 15, 16 et 19, ou un polynucléotide notamment oligonucléotide dont la séquence est partiellement identique à celle dudit fragment, sauf à
celle du fragment ayant la séquence nucléotidique SEQ ID NO 1.

43/ Procédé pour détecter la présence ou l'exposition à un agent pathologique et/ou infectant associé à la sclérose en plaques, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce que l'on met en contact ledit échantillon avec un peptide, notamment antigénique, selon l'une quelconque des revendications 25 à 28, ou un anti-ligand, notamment anticorps, dudit peptide, selon la revendication 33.

44/ Procédé pour détecter la présence ou l'exposition à un agent pathologique et/ou infectant associé à la polyarthrite rhumatoïde, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce que l'on met en contact ledit échantillon avec un peptide, notamment antigénique, selon l'une quelconque des revendications 29 à 32, ou un anti-ligand, notamment anticorps, dudit peptide, selon la revendication 34.

45/ Dispositif de détection du virus MSRV-1, comprenant un réactif selon la revendication 35, supporté
par un support solide, immunologiquement compatible avec ledit réactif, caractérisé en ce qu'il comprend un moyen de mise en contact d'un échantillon biologique, tel qu'un échantillon de sang ou de liquide céphalo-rachidien, susceptible de contenir des anticorps anti-MSRV-1, avec ledit réactif, dans des conditions permettant une éventuelle réaction immunologique, et des moyens de détection du complexe immun formé avec ledit réactif.

46/ Procédé de détection d'anticorps anti-MSRV-1, dans un échantillon biologique, tel qu'un échantillon de sang ou de liquide céphalo-rachidien, caractérisé en ce qu'on met en contact ledit échantillon et un réactif selon la revendication 35, consistant en un anticorps, dans des conditions permettant une éventuelle réaction immunologique, et on détecte ensuite la présence d'un complexe immun formé avec ledit réactif.