CA2216602A1 - Procede de detection de microorganismes par separation et culture sur un systeme gelifie, systeme gelifie et necessaire de dosage pour mettre en oeuvre ce procede, utilisation en microbiologie - Google Patents

Abstract

La présente invention a trait à un procédé de détection de la présence ou de l'absence de microorganismes appartenant à l'ensemble des bactéries et des levures dans un échantillon liquide (5) d'un matériau biologique; ce procédé comprend l'introduction de l'échantillon liquide (5) dans un tube de centrifugation (6a, 6b) au-dessus d'un système gélifié (10) qui comporte au moins (a) une première phase (1), dite de révélation, qui est un gel comportant un milieu de culture de microorganismes et un réactif induisant une variation de mesure optique détectable en présence de microorganismes, ledit gel étant un mélange intime d'eau et de particules polymériques absorbant l'eau, qui ont été gonflées de telle façon que dans ledit mélange intime lesdites particules polymériques aient (.alpha.) une concentration en poids sec comprise entre 0,05 et 0,2 g/ml et (.beta.) un diamètre à l'état gonflé compris entre 90 et 320 µm, l'eau dudit mélange intime provenant en totalité ou en partie dudit milieu de culture; la centrifugation; puis la révélation de la présence ou de l'absence de microorganismes dans ledit échantillon liquide (5) au niveau de ladite première phase (1) du système gélifié (10), par ledit réactif induisant une variation de mesure optique détectable.

Description

WO 96129427 PCTI~R9610~)419 PROCEDE DE DE7~ECTlON DE MlcRooRGAN~ ~Fs PAR
.L SEPARATION ET CULTURE SUR UN SYSTEME GELIFIE, SYSTEME
GELIFIE ET NECESSAIRE DE DOSAGE POUR MEWRE EN OEUVRE
CE PROCEDE, UTILISATION EN MICROBIOLOGIE

Dc-.mne de l'inventwn La ~ s~ e invention a trait à un nouveau proc~dé pour d~tecter 10 la présence ou l'absence de microorg~ni~mes app~enant à l'ensemble des bactéries et des levures. Ce procédé met en oeuvre une ter~lnique de séparation, de culture et de révélation sur un même système gélifié.
Elle conce,-~ également ledit système gélifié en tant que produit industriel nouveau, d'une part, et le n~cess~ire, kit ou trousse de dosage 15 permettant de mettre en oeuvre ledit procédé, d'autre part.
Elle conce~..e enfin l'-.tilic~tion dudit procédé et dudit système gélifié en microbiologie (not~mmerlt en bactériologie ou mycologie), en particulier dans le ~om~in~- de la détection des infections bactériennes (plus particuliè.e...e..t celle des infections urinaires et des septicémies).

2 o Art antérieur Quand on veut apprécier la présence ou l'absence de microors~nismes tels que les bactéries et les levures, not~mment selon une méthode colorimétrique, on doit tenir compte des rés--lt~t~ suivants:
- les vrais positifs (TP), 25 - les faux positifs (FP), - les vrais négatifs (I~N), et - les faux négatifs (FN).
D'un point de vue pratique, à partir des résultats TP, FP, TN et FN théoriquement possibles, quatre valeurs (exprimées en pourcentages) ont

3 O été définies, à savoir:
- la sensibilité (Sen), - la spécificit~- (Spe), - la valeur prédictive positive (PPV), et - la valeur prédictive négative (NPV), 35 telles que:

Sen = 100.TP/(TP +FN), Spe = 100.TN/(TN+FP), PPV = 100.TP/(TP+FP), et NPV = 100.TNi(TN+FN), 5 pour évaluer le caractère si~nific~tif ou la pertinence des mesures.
On sait que l'on a déjà préconisé ou utilisé une technique de détection ou de filtration colorimétrique pour apprécier la présence ou l'absence de bactéries dans l'urine, d'une part, et une technique de séparation sur gel pour mettre en évidence des agglutinats érythrocytaires, 0 d'autre part.
En ce qui concerne la détec~ion colorimétrique, on connaît de la publication EP-A~ 496 409 un procédé de révélation de bactéries Gram-négatif. Ce procédé com~r~ nd la filtration d'un éch~ntillon biologique (notamment l'urine) co~.te.~ant des bactéries sur un ~uypoll poreux (~ tre des pores 0,75-1,2 ~m) pour retenir les bactéries sur ledit suppu,l, puis la détection des bactéries Gram-négatif par la réaction de leurs déhydrog~..ascs avec un réactif coloré d'oxydo-réduction (notamment un sel de tétr~ m ou la résazurine) en inhibant au moyen d'un agent caotrope et d'un d~telgenl non-ionique du type alkyl-~ co~ide les réactions de réduction in~ ites par les bactéries Gram-positif.
En ce qui concerne la techni~lue de filtration colorimétrique, on conn~ît not~mment des tests commerc~ és par la société dite VrrEK
SYSTEMS (Hazlewood, Mo.) sous les nomenclatures de "Bac-T-Screen~)n (test semi-automatique) et de "FiltraCheck(g)-UTI" (test m~mlel).
La mise en oeuvre de ces tests comprend la filtration d'un éch~ntillon d'urine sur un filtre en papier imprégné d'un révélateur pour retenir et colorer les bactéries éventuellement présentes dans l'éch~ntillon;
la filtration est réalisée avec une différence de pression, aussi un appareillage relativement compliqué est requis; la princip~l~ source d'erreurs (r~s..lt~tc 30 FP et FN) est due à la présence possible dans l'urine d'un grand nombre d'érythrocytes, de leucocytes et/ou de cellules épithéliales (la présence d'érythrocytes et/ou de leucocytes dans l'urine est déjà en soi un signe de dysfonctionnement) .
Selon la littérature, voir à cet effet (a) les pages 272 (tableau 3) et 35 274 (chapitre "Colorimetric Filtrationn) de l'article de M. PEZZLO, Clin.

wo 96/29427 PCTlFR96Jo~419 Microbiol. Rev., 1988, 1 (No 2), 268-280, et (b) la page 86 (alinéa "Système coloration filtration" et t~hle~ ) de l'article de F.W. GOLDSTEIN, Méd.
Mal. Infect., 1991, ~, 83-88, les tests Bac-T-Screen(~) et FiltraCheck(~-UTI
sont (i) rapides (1-2 minut~s)? (ii) effic~ces quand la population bactérienne 5 est 2 105 CFU/ml, mais (iii) in~ticf~ nt~ quand ladite population bactérienne est inférieure à 105 CFU/ml. Globalement pour l'ensemble de ces deux tests on a selon les deux articles précités, lors de screenin~.c urinaires, pour des populations b~etériennes 2 105 CFU/ml: Sen = 93-95%, Spe = 76-77%, PPV = 32%, et NPV =
o 97-99%;
> 104 CFU/ml : Sen = 85-89 % , Spe = 81 % , et NPV = 84-86 ~ ; et 2 103 CFU/ml: Sen = 76-84%, et NPV = 67-72~.
Il existe donc un besoin d'améliorer la fiabilité des mesures pour des populations bactériennes inf~rieures à 105 CFU/ml.
En ce qui concerne la technique de séparation sur gel des érythrocytes pour apprécier l'~p~ l;on él~lluocytaire on co~ aît les publications FR-A-2 577 321 et EP-A-0 454 509.
Selon FR-A-2 577 321, la formation ou la présence d'agglutinats érythrocytaires sont mises en évidence par (1) dépôt d'un milieu liquide 20 contenant des érythrocytes sur un gel (i) disposé dans un tube de centrifugation à fond conique, et (ii) l~i~s~nt passer les globules libres plus facilement que les ~ggl,~ c ~-.oL~ .l un gel commercialisé sous le nom de "Sephadex~) G 100 Ultrafine" par la société dite PHARMACIA FINE
CHEMICAL (Uppsala, Suède)], puis (2) centrifugation douce.
2s Selon EP-A-0 454 509, on opère de façon sensiblement analogue par centrifugation douce en remplaçant le gel de FR-A-2 577 321 par un système gélifié constitué par un m~l~n~e de deux gels de dextrane (voir not~mment page 3 lignes 24 et page 4 lignes 6-7 de EP-A-0 454 509): le produit "Sephadex~) G 100 Ultrafine" précité qui, à l'état sec, se ~,Cse.~le 3 O SOUS la forme de particules ayant un diamètre de 20 à 50 ,um, et le produit:
"Sephadex(~) HP Ultrafine" qui, à l'état sec, se présente sous la forme de particules ayant un ~i~m~tre de 13 à 23 ~m.
Eu égard aux in~iic~tions fournies dans EP-A-0 454 509 (page 3 lignes 24 et 42-43, et page 4 lignes 14-15), il semble clair que le système gélifié de EP-A-0 454 509 ne COIII~JU1le qu'une seule phase.

WO 96/29427 PCT/F~R96/00419 Telle que décrite dans FR-A-2 577 321 et EP-A-O 454 509, la teçhnique de séparation sur gel par centrifugation n' est pas direcle~.,e.
transposable à la détection de la présence ou l'absence de microorg~ni~mes.
En particulier les gels préconisés, à savoir les produits "Sephadex(~) G 100 5 Ultrafine" et "Seph~dex(~) HP Ultrafine", ne permettent pas le passage des microor~ni~mes tels que les bactéries et les levures lors de la centrifugation douce [i.e. selon l'art antérieur: une int~ ~ inférieure ou égale à 1500 g, en particulier une illlensi~é inférieure à 1000 g (not~mment de l'ordre de 400-500 g, EP-A-O 454 509 si~n~l~nt, page 4 ligne 49, une intensité de 10 430 g)] ni la s~ Lion des b~ctéries des autres cel~ s.
But de l 'invention Selon l'invention on se pr~osc de foulnir une nouvelle solution terhnique pour détecter dans un éçh~ntillon d'un matériau biologique la présence ou l'absence de microorg~ni~mes app~lenant à l'ensemble des 15 bactéries et des levures, cette nouvelle solution terhnique donnant des résultats plus fiables pour des populations microbiennes inférieures à 10~
gc.lllcs/ml (dans ce qui suit on considérera par commodité que l bactérie/ml ou 1 levure/ml col.~s~ol d a~ro,umativement à 1 CFU/ml) que les tests "Bac-T-Screen@9n et "FiltraCheckg)-UTI" précités relatifs à l'évaluation des 20 infections urinaires bactériennes.
Cette nouvelle solution techni~lue met en oeuvre une terhni~ue particulière de s~a.alion des microorg~nicmes sur un système gélifié
conten~nt un milieu de culture, qui est différente de celle proposée par les publications FR-A-2 577 321 et EP-A-O 454 509 précitées, et qui évite de 25 mettre en oeuvre l'isolement des microorg~ni.cm~s sur un système gélosé
st~n~rd ou la mise en culture n~cess~ire à leur multiplication, avant centrifugation.
Objet de l 'invention Ce but est obtenu en faisant appel à un système gélifié qui sépare 3 0 sélectivement les microorg~nicmes éventuellement présents dans un éch~ntillon d'un matériau biologique des autres composants notamment les c~ lles, les peptides et les protéines, d'une part, et qui permet la pousse desdits microorg~ni~mes in sin~ pendant la centrifugation puis le cas éché~nt après ladite centrifugation et leur révélation, d'autre part.

WO 96/29427 PCTI~R9f '~~~19 Selon un premier aspect de l'invention, on préconise un nouveau procédé de d~tection de la présence ou de l'absence de micloor~nicmçs appartenant à l'ensemble des bactéries et des levures dans un éch~ntillon liquide d'un matériau biologique susceptible de conlenir des cellnl~s autres s que celles desdits microorg~nicmes, ledit procédé, qui met en oeuvre une te~ hnique de s~ lion sur gel, étant caractérisé en ce qu'il coll-plcnd les étapes concict~nt à:
(1~) faire appel à un système gélifié qui (i) sépare en fonction de leur taille les micloorp~nicmPs, éventuellement ~l~se.lts dans ledit éch~ntilkr.
o liquide et qui provie~ dudit matériau biologique, des autres co~ osants solides que peut colll~nir ledit éc-h~ntillQn liquide, (ii) est essenti~llPm~nt illl~lllléable à l'eau po~al~t être pl~se.lte dans ledit éch~ntillon liquide et aux subst~ncec dissoutes éventuçllP-merlt Sel-~ S dans ledit éch~ntillQn liquide, et (iii) coll-~ulLe au moins (a) une première phase, dite de révélation, qui est un gel CGIll~O~lU
un milieu de culture de microo,g~nicmçs et un réactif i~.d..;c~
une variation de Ille;~U~ optique détect~hle en ~ sencc de microor~nicmes, ledit gel étant un me~l~n~e intime d'eau et de particules polymériques absorbant l'eau, qui ont été gonflées de 2 o telle façon que dans ledit m~l~nge intime lesrli~es particules polymériques aient une concellL.alion en poids sec comprise entre 0,05 et 0,2 g/ml et un ~ m~tre à l'état gonflé compris entre 90 et 320 ~m, l'eau dudit m~l~nge intime provenant en totalité ou en partie dudit milieu de culture;
25 (2~) introduire ledit éch~ntillon liquide dans un tube de centrifugation au-dessus dudit système gelifié préalablement disposé dans ledit tube de centrifugation;
(3~) centrifuger le contenu dudit tube résultant; et, (4~) révéler la présence ou l'absence de micloor~nicmec dans ledit éch~ntillon liquide provenant dudit matériau biologique, au niveau de ladite première phase du système gélifié, par ledit réactif induisant une variation de mesure optique ~étçct~hle.
Si les microorg~nicmes sont à une concel,~ion trop faible dans ledit ~ch~ntillon liquide, la révélation de l'étape (4~) intervient après 3 5 mllltiplic~ion des microor~~nicln~os dans ledit milieu de culture, à une WO ~6/29427 PCT/FR96/00419 température comprise entre la te,l.pélal~lre ambiante et 45~C, en au plus 24 h (de préférence en 1-2 h) pour les bactéries et en au plus 36 h (de préférence en 24-30 h) pour les levures.
Selon un second aspect de l'invention, on préconise, en tant que s produit industriel nouveau, ledit système gélifié qui (i) sépare en fonction de leur taille les microorg~ni~rnes, éventuellement présents dans ledit éch~ntillon liquide et qui proviennent dudit matériau biologique, des autres composants solides que peut conlelur ledit éçh~ntillon liquide, (ii) est es.~entiellement imperrnéable à l'eau pouvant être pr~se,lle dans ledit o érh~ntillon liquide, et (iii) comporte au moins (a) une première phase, dite de révélation, qui est un gel comportant un milieu de culture de microorg~ni.cmes et un réactif intl-lic~nt une variation de mesure optique détect~hle en présence de microor~nismes, ledit gel étant un m~ nge intime d'eau et de particules polyrnériques absorbant l'eau, qui ont été gonflées de telle façon que dans ledit m~l~nge intime les~it~s particules polymériques aient une concenllation en poids sec comprise entre 0,05 et 0,2 g/ml et un tli~mètre à l'état gonflé compris entre 90 et 320 ~m, l'eau dudit m~l~nEe intime provenant en totalité ou en 2 o partie dudit milieu de culture.
Selon encore un autre aspect de l'invention, on préconise un n~cess~ire, kit ou trousse de dosage cGl.lyrenant notamment:
- ledit système gélifié ou les phases le co.~ nt~ et - le cas éché~nt, des souches de microor~ni~m~s de référence lyophili~ées et/ou leurs mili~l~x de culture pour permettre de réaliser des éch~ntillons-étalons.
Selon enfin un autre aspect de l'invention, on ~i~cGI~ise ili.c~tion dudit procédé et dudit système gélifié en microbiologie, notamment dans (i) la détection des infections bactériennes (en particulier telles que les infections urinaires et les septicémies), (ii) l'identification des souches de microorg~ni~mes, et (iii) l'évaluation de la rési~t~nc.e de souches de microorg~ni~mes vis-à-vis des antibiotiques.
Brève desw.y~on des ~essins WO 96/29427 PCTlt~9G/00 ~19 Les ~ieScinc annexés joints en annexe représentent de façon Js schématique des tubes de centl;rlgation garnis ch~cl~n d'un système gélifié
selon l'invention:
- la figure 1 repr~_se"le un tube de centrifugation, col,.po.Lant un système gélifié constitué d'une seule phase, à savoir la phase dite de révélation;
- les figures 2a et 2b rep,~selllent un tube de centrifugation co.llpoll~nt un système gélifié con~ é de deux phases qui sont, du bas vers le haut, la phase de révélation et la phase de protection, et montré avant (Fig. 2a) et après (Fig. 2b) ce.lL,;rugation;
- la figure 3 l~rCs~nLe un tube de c~nLllrugation, co-llpo~lant un ~y~l~.--c gélifié col,~Lilué de deux phases qui sont, du bas vers le haut la phase de révélation et la phase d'absorption;
- les figures 4a et 4b ,~r~sc.l~ un système gélifié analogue à celui de la figure 3, qui coll",o,Le en outre la phase de protection et est vu avant (figure 4a) et après (figure 4b) centrifugation;
- la figure ~ sente un tube de centrifugation, comportant un système gélifié con~lit~é de trois phases qui sont du bas vers le haut la phase barrière, la phase de révélation et la phase d'absorption;
- les figures 6a et 6b ~ se.ltenL un système gélifié analogue à celui de la figure 5, qui CGIll~Olle en outre la phase de protection et qui est montré
avant (figure 6a) et après (figure 6b) cellLI;~ugation;
- les figures 7 et 8 l~ sell~n~ chac~n un système gélifié préféré selon l'invention où la phase de révélation a une ép~icse~r faible;
- la figure 9 ,~ senle une coupe d'un tube de centrifugation selon l'invention pourvu à son fond d'un c~pill~ire; et, - la figure 10 ,~ sellle une we de face d'un autre tube de centrifugation selon l'invention qui est également pourvu d'un capillaire.
Abréviations Par commodité, les abréviations et acronymes suivants ont été
utilisés dans le texte de la ~l~sel-te invention:
Ala alanyle BT bleu de tétrazolium CFU unité formant colonie (en anglais: "colony-forming unitn) DIC coagulation intrav~cc~ ire ~icsémin~e EDTA acide éthylèn~i~minotétraacétique WO 96/29427 PcT~ )o1l9 FN faux négatifs (en anglais: "false négatives") FP faux positifs (en ~n~l~i.c: "false positives") Hyp hydroxyprolyle, Hyp représente 3Hyp (3-hydroxyprolyle) etlou 4Hyp (~hydroxyprolyle) INT iodo.f,4Otct,~olium Leu leucyle Lys lysyle MA 4-méthylcoumarinyl-7-amino MUG ~méthylumbelliféryl-~-D-glucuronide MW poids moléculaire NA ~-naphtylamino NADH nicol;i~ le-~de'nine rlinl~rl~oti~e hydrogéné
NBT nitrobleu de ~tl~olil-m NPV valeur prédictive négative (en ~n~ ic :"negative predictive valuen) NTC chlorure de l.~oté~ olium OM Illc~ule optique Phe a-phénylalanyle Phg a-phcnylglycyle pNA p-nitro~nilino 2 0 PPV valeur prédictive positive (en ~n~ ic: "positive predictive valuen) Pro prolyle RT ~e.ll~lu~c ambiante (15-20~C) Sen sensibilité (en anglais: nsensitivity") Spe spécificité (en anglais: "specificityn) TN vrais négatifs (en anglais: "true negatives") TP vrais positifs (en ~n~l~ic: "true positives") TTC chlorure de triphényltctrazolium YNB source d'azote commerc~ cée sous la nomenclature commerciale "YEAST NlTROGEN BASE"
3 0 ~es~ on ~éf~lée de l 'inven~ion ", Par "matériau biologique" on entend ici:
- un liquide co.~orcl humain ou ~nim~l, qui est aqueux, not~mment l'urine, le sang, le plasma, le liquide rachidien, le liquide pleural, le lait;

WO 96/29427 PCTJ~5''1)0 119 - une eau quelconque, not~mment l'eau vive (sources, rivières), l'eau ct~n~nte (mares, réservoirs, piscines), l'eau industrielle (eau du robinet, eau des c~n~ tions et cir~uils intervenant en particulier en tant que fluide thermique ou én~lgctique, eau usée), l'eau de boisson;
5 - une boisson, notamment d'origine agro-alimentaire et à base d'eau telle que les jus de fruits, les sodas, le lait précité, le vin, la bière;
- un ~liment d'origine ~nim~le et/ou végétale ou une yr~alalion alim~n~
- un extrait de plante not~ lell~ un extrait ~que~, alcoolique ou o hydroalcoolique, en particulier un jus de pression ou un extrait aqueux;
- un produit solide ou visqueux, tel que not~mment le pus, les biopsies, les feces, le crachat, la salive, une plante, une partie de plante, un sol, le sable, ledit prod.lil pouvant contenir ou non de l' eau dans sa composition; et, - d'une manière générale, l'en~,ironne.,lent de l'homme (not~mment le sol et l'eau ylecit~s, d'une part, et l'atmosphère ambiante, d'autre part); des ~ .ples sont donnés ci-après pour l'évaluation de la qualit6 bactériologique et mycologique de l'atmosph~re des blocs o~ratoi~s.
20 En bref, ledit matériau biologique sera choisi parmi l'en~e.. ble con~ é par les liquides colyolels, les ~limerltc, les boissons et les produils de l'envi,o"l,e",e.l~ (y compris les plantes et leurs e~LIaits).
En pratique, il est recomm~n~ mais non essentiel que ledit matériau biologique soit un produit aqueux; il suffit pour mettre en oeuvre le procédé de détection de l'invention de façon optimale que ledit matériau biologique soit transformé (notamment par broyage, dilacération, extraction et/ou addition d'eau) en un éch~ntillon liquide ou soit déjà sous forme liquide pour être testé. De façon avantageuse ledit éch~ntillon liquide sera un éch~ntillon aqueux liquide.
Par "cellule" on entend ici toute cellule biologique qui n'est pas une bactérie ni une levure . Par n matériau cellulaire" on entend ici un matériau choisi parmi ~i) les celll-les, (ii) les fragments ~estlitPs cellules (n :~t~mmtont les fr~mentc de paroi cellulaire~, (iii) le contenu ~es-lites cellnles logé à l'intérieur de la paroi et (iv) leurs m~ nges.

Le matériau biologique selon l'invention, dans lequel on veut déterminer la présence ou l'absence de microorg~ni.cm~s, et son éch~ntillQn liquide peuvent contenir un matériau cellulaire.
A titre d'information, l'urine d'un patient peut contenir:
5 (A) des microor~nicmes en cas d'infection urinaire, tels que:
- les bactéries Gram-négatif, notamment les Escherichia coli, ~lebsieUa (en particulier l~lebsieUa aerogenes, ~lebsieUa pneumoniae), Proteus (en particulier Proteus vulgaris, Proteus mirabilis), Pse~omonas (en particu-lier Pse~ omQnas aeruginosa), Serratia (en particulier Serratia ma~L~s~r"s) 0 et/ou Enterob~t~r (en particulier Entero~t~r aerogenes), - les b~rt~ries Gram-positif, n~t~mment les Staphylococcus (en particulier Staphylococcl~s aureus, Sta~hylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyhcus), Streptococcus (en particulier Streptococcus faecalis, Streptococcus foeci.~n), Enterococcus et/ou Corynebacterium, et/ou lS - les levures notamment les ~nq~i~t n1bic~n~s~ ~nt~ n glabra~ nri~nn~
nc~men~l~blre Torulopsis glabr~a), (~ n tropicalis et/ou Can~da kruse~, qui sont susceptibles d'être pathogènes (ces souches peuvent induire des septicémies et des DIC), d'une part; et, 20 (B) un matériau ce-llul~ire co.~pr,nant des ce-lll.les (en particulier érythrocytes, leucocytes et/ou c~ -les épithec~ ps)~ des enzymes c~llnl~ires (en particulier urokin~ce urinaire, leucocyte esl~asc et/ou phosphatase), des antibiotiques pouvant ~llulber ou fausser la détection des microorg~nicm~o.s présents dans l'urine), des peptides, des protéines, des pigments et/ou des 25 fragments de paroi cellnl~ire, d'autre part.
Selon l'invention, on va faire migrer, à travers le système gélifié, les particules non dissoutes dans l'éch~ntillon liquide dudit matériau biologique, de façon à séparer en fonction de leur taille les microorg~ni~m~s des autres composants solides et non dissous provenant dudit matériau 30 biologique par centrifugation, d'une part, puis on va en général faire pousser in situ lesdits microorg~ni~mes~ d'autre part, afin de les détecter.
Par "réactif induisant une variation de mesure optique détectable"
(autre nomenclature: "réactif colorimétrique"), on entend ici un produit qui, en présence d'un microorganisme a~ ant à l'ensemble des bactéries et 35 des levures, provoque une variation de OM appréciée soit à l'oeil nu soit au WO 96/29427 PCIII;:R9610041g moyen d'un colorimètre. En d'autre terme le réactif changeant de couleur en présence de microor~ni~mes induit un changell.cnt de couleur dans le spectre visible ou un changement de fluorescence ou de lllminescence notamment dans le domaine W.
Un tel "réactif colorirnétrique" peut-être (i) un indicateur coloré
de pH, tel que le rouge de phénol, (ii) un in~ teur coloré d'oxydo-réduction, tel que notamment le dichloroindophénol, la résazurine ou un sel de tétrazolium (par exemple BT, INT, NBT, NTC ou TTC), (iii) un ~ubsLI~t chromogène, tel que H-L-Ala-pNA, H-L-Leu-pNA, H-L-Phe-pNA, H-L-0 Pro-pNA, H-L-Lys-pNA, H-L-Hyp-pNA, un ~u~al~t fluorogène, tel que H-L-Ala-NA, H-L-Leu-NA, H-L-Phe-NA, H-L-Pro-NA, H-L-Lys-NA, H-L-Hyp-NA, H-L-Ala-MA, H-L-Leu-MA, H-L-Phe-MA, H-L-Pro-MA, H-L-Lys-MA, H-L-Hyp-MA, MUG phospl-~le, (iv) un ~ulJsL.~t clivable par une osi~ce des microor~ni~mes telle que la ~-D-~luGo~si~l~ce ou mieux la ~-D-5 g~l~otosi~l~ce, ou (v) un substrat chimiolllminescent~ tel un CO~ OS~ de luciférine.
Les indicateurs colorés d'oxydo-réduction sont princip~lement des composés oxydants qui révèlent la ~l~sence de micfoor~ni~mes par ré~rtion avec au moins une substance réductrice provenant desdits microor&~nicmes, 2 o telle que not~mment NADH et les déhydrog~nases. Le m~c~ni~mlo- est analogue à celui illustré ci-après pour la l~s&,U~;n~o résazurine + NADH ~ résorufine + NAD+

Les substrats chromogènes et fluorogènes que l'on pré~ere selon 1' invention, à savoir H-L-Ala-pNA, H-L-Leu-pNA, H-L-Phe-pNA, H-L-Pro-pNA, H-L-Lys-pNA, H-L-Hyp-pNA, H-L-Ala-NA, H-L-Leu-NA, H-L-Phe-NA, H-L-Pro-NA, H-L-Lys-NA et H-L-Hyp-NA sont clivés par les aminopeptidases produites par les microorg~ni~mes. D'autres substrats ~, 30 peptidiques clivables par les~lites aminopepti~es~ qui sont décrits dans la demande PCT publiée WO-A-90/03726, sont également ~Itili~hles dans la présente invention.
Comme indiqué ci-dessus le système gélifié selon l'invention, qui intervient à l'étape (1 ~) du procédé préconisé, comporte au moins une 3s couche gélifiée, à savoir la "phase de révélation" également désign~e ici par WO 96/29427 PCTI~1~;5.'00~19 commodité "première phase" ou "première couche". La phase de révélation est constitl~ée d'une substance polymérique (notamment du type dextrane ou analogue) préalablement gonflée avec de l'eau de façon à follllel un gel reten~nt dans sa masse (ou au niveau de sa face inférieure pour les plus 5 ~ osses particules), lors de la centrifugation, les particules non solubles conlellues dans ledit éçh~ntillon liquide et ayant une taille se situant entre 0,5 et 8 ,um.
Il est important que, à l'état gonflé, ladite substance polymérique de la phase de révélation soit à une col-ce~ tion en poids sec de 0,05 à 0,2 10 g/ml (de pr~ llce à une cor cel.l.~tion de 0,1 g/ml) et se présente (dans le gel) sous la forme de particules gonflées ayant un ~i~m2~tre de 90 à 320 ~Lm, pour retenir dans sa masse ou au voisinage de sa face inférieure les b~ctér;es (longueur: 0,5 à 5 ~m; r1i~m~tre: 0,1 à 2 ~m) et la majeure partie des levures (~ mètre S à 12 ~m) mais ne pas retenir les cellules.
De façon pratique, la ~ubslance polymérique de la phase de révélation sera pré~l~hlemel t gonflée avec le milieu de culture destiné à la pousse des microor~nicmps~ ledit milieu de culture contpn~nt le réactif colorimétrique précité indllic~nt une variation de OM.
Le système gélifié selon l'invention peut en outre co.llpo.ler pour la mise en oeuvre de l'étape (1~) du procédé préconisé
(b) une seconde phase, dite d'absorption, essenti~ .ment imper-méable à l'eau pouvant être pl~se.,le dans ledit éch~ntillon liquide et aux s-)b~ r~s qui y sont dissoutes, qui retient dans sa masse les particules non solubles conlenues dans ledit ér~ntillon liquide 2 5 et ayant une taille inférieure à 5 ~m mais laisse passer les particules ayant une taille supérieure ou égale à 5 ~m lors de la centrifugation, et qui est conctit~-ée (i) d'un gel ou (ii) de particules de silice ou de silicate ayant une granulométrie inférieure à 0,1 ,um, ladite seconde phase reposant sur ladite 3 o première phase, ledit mél~nge intime étant essentiellement imperméable à l'eau pouvant être ylcsell~e dans ledit éch~ntillon liquide.
Selon une variante de réalisation, la "phase d'absorption" ou "deuxième phase" ou encore "deuxième couche" est un gel constitué par un m~!~nge intime d'eau et de particules polymériques absorbant l'eau, qui ont WO 96/29427 PCT)FR96100419 été gonflées de telle façon que dans ledit m~l~nge intime lesdites particules polymériques aient (a) une conce.,tlaLion en poids sec comprise entre 0,2 et 1 g/ml et (~) un diamètre à l'état gonflé compris entre 160 et 530 ~m.
Dans ce cas la phase d'absorption est conctit-lée d'une substance 5 polymérique (not~mm~nt du type dextrane ou analogue) préalablement gonflée avec de l'eau de façon à former un gel, comme ladite première phase, mais de façon à retenir dans sa masse (ou au niveau de sa face inférieure pour les plus grosses particules), lors de la centrifugation, les particules non solubles contenues dans ledit éch~ntillon liquide et ayant une 10 taille plus faible se situant entre 0,1 et 0,5 ~m, d'une part, et les particules non solubles ne traversant pas ladite première phase (i.e. taille inférieure à
5 ~m), d'autre part.
Selon une autre variante, la phase d'absorption est une couchc particulaire conctituée d'une matière minérale, micronisée de façon à avoir à
5 l'état sec une granulométrie inférieure à 0,1 ~m, d'une part, et ne gonflant esse~ti~-llement pas en présence d'eau, d'autre part. Cette matière minérale sera avanta~ se"lent choisie parmi l'ensemble coll~lilué par la silice (notamment le sable, le quartz ou le verre~ et les .silic~tes tels que les min~silir~tes. Parmi les sitiç~tes, on recomm~ntle plus particulièrement le 20 kaolin qui est une argile non gonflante en présence d'eau.
On a en effet collsl~c que les subst~n~s minérales telles que la silice et le kaolin ayant une granulométrie inférieure à 0,1 ~m permettent le passage des microofg~nicmes et retic,lilenl l'eau ainsi que les subsl~..r,es dissoutes susceptibles d'être l,~sulLes dans ledit éch~ntillon liquide.
2s Ainsi la phase d'absorption va empêch~r le passage des particules solides non dissoutes dans ledit éch~ntillon liquide telles que l'hémoglobine, les pigments (notamment les pigments urinaires quand on cherche à ~étecter la présence ou l'absence de microor~nicmes dans l'urine en cas d'infection urinaire), les enzymes, les inhibiteurs, et va retenir les particules non dissoutes comme les fragmenls de cellules lysées. A titre d'exemple, ces fragments sont retenus après traitement avec un agent lytique ou en présence d'un agent lytique. Cet agent lytique peut être un détergent tel que la saponine pour la lyse des érythrocytes.
Il est important que, (1) ladite substance polymérique de la phase d'absorption, à l'état gonflé, soit à une concent-a~ion en poids sec de 0,2 à

1 g/ml (de préférence à une concentration de 0,35 g/ml) et se présente (dans le gel) sous la forme de particules gonflées ayant un diamètre de 160 à
530 ,um, et que (2) les particules minérales telles que la silice et le kaolin micronisés aient un diamètre homogène.
Quand elle est présente dans ledit système gélifié, ladite seconde phase renferme avantageusement une ou plusieurs subst~nces inhibant les éventuels cont~min~nt~ ou lysant les cçll~ s (notamment les érythrocytes et/ou les leucocytes) et/ou élimin~nt les lipides (cas de la clarification des éch~ntillons de lait à tester), qui sont contenus dans ledit éc~l~ntillon liquide o provenant dudit matériau biologique et susceptibles d'il!lelrérel à l'étape (4~) en ré~gi~s~nt avec ledit réactif in~ nt une variation de mesure optique ~étect~le en p,~sence de microor~ni~mes.
Quand ladite seconde phase n'est pas présente dans le système gélifié de l'invention, il est recomm~n~ié que la ou les~lites substances 5 (inhibitrices, lysantes et/ou élimin~nttos) soient incluses dans ladite première phase.
Le système gélifié selon l'invention peut en outre con.~ollel pour la mise en oeuvre de l'étape (1~) du procédé préconisé
(c) une troisième phase, dite barrière, infr~nr~liss~hle lors de la centrifugation de l'étape (3~), par les microorg~nicm~s éventuellement p.~,se.,ls, ladite troisième phase étant disposée sous la première phase de telle façon que ladite première phase repose sur ladite troisième phase.
Ladite troisième phase (ou "troisième couche") est soit une 25 paraffine soit un gel d'une ~ul)sL~ce polymérique. Quand elle est une paraffine, il s'agit d'une paraffine solide fondant à une température supérieure à la telll~latul~ de multiplication aes microorg~ni~mes, par exemple:
- une paraffine fondant à une température supérieure ou égale à 30~C, quand la culture pour la pousse des microorganismes intervenant à
l'étape (4~) est réalisée à RT, - une paraffine fondant à une température supérieure ou égale à 45~C, quand la culture pour la pousse des microorg~ni~mes intervenant à
l'étape (4~) est réalisée à 37~C, ou WO 96129427 PCTI~ U0~119 - une paraffine fondant à une te~ é-dtule supérieure ou égale à S0-55~C, quand la culture pour la pousse des microor~nicmes intervenant à
l'étape (4~) est réalisée à 45~C.
De préférence, on fera appel à une paraffine fondant à une 5 température supéneure ou égale à 50~C qui sera introdl~ite à l'état fondu dans le tube de centrifugation.
Quand la phase barrière est un gel, ledit gel sera constitué par un m~!~nge intime d'eau et de particules polymériques absorbant l'eau, qui ont été gonflées de telle façon que dans ledit mc~l~nge intime lest~ites particules o polymériques aient (a) une concelllla~ion en poids sec comprise entre 0,04 et 0,2 g/ml et (,~) un ~ mèt~e à l'état gonflé compris entre 30 et 130 ~m.
Ledit gel est coll~ ué d'une substance polymérique (not~mment du type dextrane ou analogue) préalablement gonflée avec de l'eau de façon à forrner un gel, comme ladite première phase, mais de façon à retenir dans sa masse ou au niveau de sa face supérieure, lors de la centrifugation, les particules non solubles, con~ es dans ledit ~ch~ntillon liquide et ayant une taille plus il~lpollante (i.e. hille s~ ;eure ou égale à 5 ou 8 ~m).
Ainsi la phase barrière va retenir à sa surface supérieure (cas de la paraffine solide) ou dans sa masse (cas du gel) les cellules, not~mment les 20 érythrocytes ayant en moyenne une taille de 5-8 ~m, les leucocytes ayant en moyenne une taille de 10-12 ~m, les c~ es épith~ les (en particulier dans le cas de l'urine) ayant en moyenne une taille de 20-S0 ~m, les cylindres ayant en moyenne une taille supérieure à 40 ~m, les cristaux ayant en moyenne une taille de 20-200 ~m, les fragments de paroi cellulaire 25 (notamment, lorsque les cellules auront été lysées lors de la traversée, durant la centrifugation, de la première phase ou de 1 ' ensemble deuxième phase/première phase).
De façon pratique, quelle que soit la nature de la phase barrière, les particules solides contenues dans ledit éch~ntillon liquide vont se ~y~Lil 30 selon un gradient: les plus petites (i.e. les moins lourdes d'entre elles) au-dessus des plus grandes (i.e. les plus lourdes d'entre elles).
Quand le système gélifié ne comporte pas la phase barrière, il est important que ledit système gélifié soit disposé dans un tube de centrifugation à fond conique (comme envisagé dans les documents FR-A-2 35 577 321 et EP-A-0 454 509 précités) ou à fond pourvu d'un capillaire. Dans ce cas, la ~ iLion des particules solides les plus lourdes est réalisée au fond du tube de centrifugation comme indiqué ci-dessus, les micro-org~ni~mes étant disposés juste au-dessus des cellules.
Il est important que, à l'état gonflé, ladite substance polymérique du gel de la phase barrière soit à une concentration en poids sec de 0,04 à
0,2 g/ml (de préférence à une concentration de 0,14 g/ml) et se présente sous la forme de particules gonflées ayant un ~ m~tre de 30 à 130 ,um.
Quand la phase barrière est présente dans le système gélifié selon l'invention, ledit système gélifié peut être logé dans un tube de centrifugationquelconque, not~mment un tube à fond rond ou sphérique.
La présence de la phase d'absorption est avantageuse en ce sens qu'elle permet d'éviter que le liquide (prinrir~leln~nt l'eau) dudit éch~ntillonliquide soit en contact avec la phase de révélation avant et après la centrifugation .
La présence simult~ne'e de la phase d'absorption et de la phase barrière est avantageuse en ce sens qu'elle autorise l'--tili~tion d'une phase de révélation de faible ép~i~sellr. Par suite les microorganismes p~esellts dans la masse ou au niveau de la face inférieure de ladite phase de révélation seront plus concent~s dans un volume donné et par suite plus facilement détect~hles lors de la révélation colorimétrique (soit à l'oeil nu soit au moyend'un colorimètre).
Le système gélifié selon l'invention qui cG.I-plw-d ladite première phase seule ou associée avec au moins l'une ~es~ites seconde phase et troisième phase est i~ cable au liquide dudit éf~h~ntillon liquide. Lors de 2 5 la centrifugation, ledit liquide et les ingrédients qui y sont dissous ne traversent pas ledit système gélifié, en revanche les ingrédients non dissous dans ledit érh~ntillon liquide migrent dans l'ép~i~seur dudit système gélifié etsont séparés en fonction de leurs tailles comme expliqué ci-dessus.
Le système gélifié selon l'invention peut en outre comporter pour la mise en oeuvre de l'étape (1~) du procédé préconisé
(d) une quatrième phase, dite de protection, qui (i) est une huile inerte de densité inférieure à celle de l'eau, de préférence une huile de paraffine, (ii) avant centrifugation, repose sur ladite première phase en l'absence de la seconde phase, ou ladite seconde phase 3s quand celle-ci est l,r~sen~e dans ledit système gélifié, et (iii) après WO 96/29427 PCT/FR96)00419 cenkifugation selon l'étape (3~), repose sur l'eau dudit éch~ntillon liquide.
L'huile de la phase de protection est n~cess~irement inerte vis-à-- vis des con~tit~ntc du système gélifié et des composants de l'éch~ntillon 5 liquide. On recomm~n~e pius particulièrement une huile qui fond à une température inférieure à RT et qui a un point d'ébullition supérieur à 50~C
voire supérieur à 55~C. Convient en particulier une huile de paraff~ne. de façon pratrique, on introduira un volume de 0,25 à 1 ml de la phase de protection dans un tube de cen~ ;rugation de S ml.
Selon l'invention, la phase de protection remplit avantage.. se",el,l deux fonctions: elle évite la déshydratation et la cont~min~tion du système gélifié, lors du stork~ge, d'une part, et elle permet de ne pas dégrader, lors de l'introduction dudit érh~ntillon liquide dans le tube de centri~fugation par coulée, la couche dudit système gélifié sur laquelle elle repose, d'auke part.
On recomm~nde de façon p-~rér~e, à l'étape (1~) de faire appel soit à un système gélifié co~ "ant, de haut en bas, dans un tube de centrifugation à fond conique:
- ladite quatrième phase, - ladite seconde phase, et 2 o - ladite première phase, soit à un système gélifié co~.lpie--ant, de haut en bas, dans un tube de centrifugation à fond rond ou sphérique:
- ladite quatrième phase, - ladite seconde phase, 25 - ladite première phase, et - ladite troisième phase, soit à un système gélifié co"-prenant, de haut en bas, dans un tube de centrifugation dont le fond est un c~pill~ire:
- le cas éché~nt, ladite quatrième phase et/ou, ladite seconde phase, et 3 o - dans le capillaire, ladite première phase.
La centrifugation de l'étape (3~) est une centrifugation supérieure à 500g et se situant dans l'intervalle de 1000 g à 5000 g (soit appro-ximativement, selon les dispositifs de centrifugation usuels, à une vitesse angulaire de 2200 à 4500 tours/minute). Cette centrifugation a une durée 35 d'au moins 5 minutes et de préférence une durée de 10 à 30 minutes. De WO 96129427 PCI~/FR96/00419 façon avantageuse, la centrifugation selon l'invention sera réalisée à 2000 4000g pendant 15 minutP.s.
Ladite centrifugation selon l'invention est en général effectuée à
RT. On peut, si cela est requis, réaliser ladite centrifugation à une 5 te~ ulc; comprise entre RT et 45~C (de préférence entre RT et 37~C), c'est-à-dire à une température analogue à celle de la culture prévue à l'étape (4~) pour la pousse des microorg~nicmes pouvant être présents dans ledit éch~ntillon liquide, mais l'utilic~tion d'une température supérieure à RT
n'est pas essentielle pen~nt la centrifugation.
Quand la phase de protection est présente dans le système gélifié
de l'invention, le liquide dudit éch~ntillon liquide migre à travers ladite phase de protection au cours de la cenL,;rugation; après ladite centrifi~ tion ledit liquide dépourvu des con~titll~qnt~ solides non-dissous qui ont ég~l~m~rt migré se trouve situé entre ladite phase de protection et la phase d'absorption 5 (si celle-ci est ~l~senle) ou la phase de révélation (en l'absence de la phase d'absorption dans ledit système gélifié).
La révélation prévue à l'étape (4~) intervient pendant la centri-fugation, d'une part, et le cas éch~nt après culture des microorg~ni~mes à
une te.l~ lurc comprise entre RT et 45~C, d'autre part. La durée de la 20 culture requise pour la pousse des microor~Pnismes est en général fonction de la concen~lation initiale desdits microor~nicmes (bactéries et/ou levures) dans ledit é~h~ntillon liquide.
En pratique, pour un éch~ntillon liquide ayant une concentration initiale en bactéries inférieure au seuil de détection (i.e. 103 germes/ml), il 25 faut prévoir une durée de culture d'au plus 24h (de préférence une durée de 1-2h), sauf pour les souches de Staphylococcus aureus qui ont une multiplication relativement lente (pour les~lites souches de Staphylococcus il faut co."l~ter environ 24 h de culture).
Pour un érh~ntillon liquide ayant une concentration initiale en 30 levures inférieure au seuil de détection (i.e. 103 germes/ml), il faut prévoir une durée d'au plus 36 h (de préférence une durée de 24-30 h). Pour favoriser la détection desdite levures, il est recomm~n~é d'inco,~oler un ~ntib~t~térien tel que décrit dans le document WO-A-90/03726 précité, notamment la gentamycine, dans la phase d'absorption et/ou la phase de révclation, afin d'inhiber la croi~s~nce des bactéries ou de détruire les~iites bactéries.
Le milieu de culture utilisé pour gonfler la phase de révélation - comporte une source de carbone, une source d'azote et des oligoéléments, 5 par exemple une peptone (5 à 20 gA), un sucre (1 à 20 g/l, de préférence g/l), un extrait de levure (1 à 5 g/l) et des vit~min~s (10 à 20 ml) avec un tampon pour stabiliser le pH à une valeur se situant entre 6,0 et 8,0. Pour les bactéries, ce milieu est constitué par un exemple d'un bouillon coeur-cervelle additionné d'un sucre. Pour les levures ce milieu peut être soit identique à
0 celui des bactéries soit diff~rent, par exemple: un milieu YNB+glllGose~ un milieu Sabouraud, un milieu YNB+m~ltose (qui sont décrits dans WO-A-90/03726 précité).
Pour les bact~ries Gram-négatif, on utilisera avantageusement comme milieu de culture le bouillon coeur-cervelle+sucre contenant en tant que réactif préféré induisant une variation de mesure optique détect~hle:
- la r~sa~u,ine, à la conce~ ation finale de 0,0~ g/ml (0,2 mM), - le rouge de phénol, à la concenLlalion finale d'environ 0,065 g/ml (0,17 mM), - le substrat chromogène H-L-Ala-pNA, à la concenL~ation finale d'environ 0,50 g/l (2 mM), ou - le substrat fluorogène H-L-Ala-NA (environ 2 mM), ce milieu étant tall.pol.nc à pH 6,5-8,0 au moyen d'un tampon phosphate ou Tris (0, 1 M), et pouvant conlcl~ir le cas éch~nt:
- un activateur a~p~l~llant à l'ensemble des cations divalents, not~mment 2s Mg2+, Ca2+ ou Mn2+ (par exemple une solution de MnC12 ou MnS04 à 30 mg/l environ), - un réactif de diazotation tel que le p-diméthylaminocinn~m~ldéhyde ou le Fast Blue BB, et/ou - un ou plusieurs inhibiteurs des réactions parasites liées notamment à la présence d'enzymes dans ledit é~h~ntillon liquide à tester (par exemple dans le cas du screening des urines : 1' aprotinine pour inhiber l'urokinase urinaire et l'EDTA pour inhiber les phosph~t~ces).
Le ou les inhibiteurs peuvent en pratique être disposés dans la phase de révélation et/ou la phase d'absorption.

Pour les bactéries Gram-positif, on utilisera avantageusement le milieu décrit ci-dessus relativement aux bactéries Gram-négatif avec comme réactif préféré in-lni~nt une variation de mesure optique ~i~tect~hle - la résazunne à la concentration finale d'environ 0,OS g/ml, s - le substrat chromogène H-L-Leu-pNA à la concen~aLion finale d'environ 2 mM, ou - le substrat fluorogène H-L-Leu-NA à la concentration finale de 2 mM, le pH étant tamponné à 6,0-8,0, ledit milieu pouvant comporter le cas ~c~l~~nt un activateur, un réactif de diazotation et/ou un ou plusieurs o inhibiteurs comme indiqué ci-dessus.
Pour les levures, on utilisera avantageusement un milieu YNB+sucre ta~ o..,.~ à pH 6,5-8,0, avec comme réactif p~fér~ in~ nt une variation de ..~c;,urc optique ~étect~hle, le ~ub~liat chromogène H-L-Pro-pNA ou un substrat équivalent, un inhibiteur essentiel étant un antibiotique tel que la gentamycine, la streptomycine ou le chloramphénicol pour inhiber la croi~s~nce des bactéries. Ledit inhibiteur essentiel peut également être dans la phase d'absorption.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieu~c compris à la lecture de la description qui va suivre des ~essin~ et d'exemples 20 de ré~lis~tion. Bien entend~l l'ensemble de ces éléments n'est nullement limit~tif mais est donné à titre d'illustration.
Le système gélifié 10 selon l'invention est logé dans un tube de centrifugation à fond conique 6a, à fond sphérique 6b ou à fond pourvu d'un c~pill~ire 6c. Ledit système gélifié 10 col--~lc;--d au moins une couche, à
25 savoir la phase de révélation 1 qui est un gel préalablement gonflé au moyen d'un milieu aqueux de culture de microorg~ni~mes, et le cas échéant une ou plusieurs autres couches, à savoir la phase d'absorption 2 qui est soit un gel préalablement gonflé avec de l'eau et pouvant contenir un ou plusieurs inhibiteurs (tels que l'aprotinine et l'EDTA), soit une couche particulaire 30 (silice ou kaolin) micronisée à une granulométrie inférieure à 0,1 ~m, la phase barrière 3 qui est un gel préalablement gonflé avec de l'eau ou une couche de paraffine solide dans les conditions de centrifugation et de culture, et/ou la phase de protection 4 qui est une couche de paraffine liquide dans les-lites conditions.

WO 96/29427 PCT)lF1~96/00419 La figure 1 a trait à un système gélifié 10 selon l'invention comportant une seule couche, la phase de révélation 1, logée dans un tube de centrifugation à fond conique 6a. L'é~h~ntillon liquide 5 est vers~ au-dessus de ladite phase de révéiation 1. Par centrifugation les particules non 5 dissoutes dans ledit éch~ntillon liquide migrent dans l'épaisseur de la phase de révélation, en revanche le liquide dudit éch~ntillon liquide S et les ingrédients dissous ne traversent pas la phase de révélation. Après ladite centrifugation, les particules les plus grosses qui sont les plus lourdes se trouvent réparties au fond du tube 6a en fonction de leurs tailles, au fond les 10 ce~ les et, au-dessus ~e.s~lites cellules, les microor~qniemes qui sont situés au voisinage de la partie inférieure de la phase de révélation 1.
Le système gélifié selon la figure 1 donne de bons rés.llt~t~, cependant il n'est pas totalement s~ticf~ nt en ce sens que le gel de la phase de révélation 1 (i) est au contact dudit éch~ntillon liquide 5 pen~nt la 15 centrifugation et la culture, et (ii) peut par suite être dilué par ledit éçh~ntillon liquide 5.
Les figures 2a et 2b ont trait au même système gélifié 10 avant (fig. 2a) et après (fig. 2b) centrifugation. Par ~y~OlL au système gélifié de lafigure 1, le système gélifié des figures 2a et 2b comporte en outre une 20 couche d'huile (paraffine liquide) con~titu~nt la phase de protection. On verse dans le tube 6a la phase de révélation 1 puis la phase de protection 4, procède à une centrifugation (2000-3000 g pendant 10-20 minutes) pour tasser ledit système gélifié 10. On verse ensuite dans le tube 6a éch~ntillon liquide S à tester. Ledit éch~ntillon liquide S se re~a lit au-dessus de la phase 2 5 de protection 4 (voir figure 2a) avant centrifugation.
Lors de la centrifugation ledit éch~ntillon liquide S migre à travers la phase de protection 4 avec les ingrédients solubles qu'il contient. Ses particules solides migrent à travers la phase de révélation 1, les plus lourdes ~es-lites particules se répartissent au fond du tube comme indiqué ci-dessus 30 pour la figure 1. Après centrifugation, le liquide de l'éch~ntillon liquide 5 est situé entre la phase de protection 4 et la phase de révélation 1 (voir figure 2b).
Le système gélifié des figures 2a et 2b est certes meilleur que celui de la figure 1, il présente néanmoins l'inconvénient d'un contact de l'éch~ntillon liquide S avec la phase de révélation 1 après centrifugation pendant l'étape dite de culture.
La figure 3 a trait à un système gélifié 10 selon l'invention comprenant deux couches: la phase de révélation 1 et la phase d'absorption 5 2. On verse dans le tube de centrifugation à fond conique 6a la phase de révélation 1 puis la phase d'absorption 2, centrifuge (1000-3000 g pen~l~nt 10-20 miml~es) pour tasser ledit système gélifié 10. On verse ensuite dans le tube 6a l'éch~ntillon liquide 5 à tester. Ledit éch~ntillon liquide S se r~palLil au-dessus de la phase d'absorption.
Lors de la centrifugation de l'étape (3~), les particules solides contenues dans l'éch~ntillon liquide S migrent en fonction de leurs tailles à
travers la phase d'absorption 2 et/ou la phase de révélation 1, en revanche le liquide dudit éch~ntillon liquide 5 et les ingrédients qui y sont dissous ne traversent pas la phase d'absorption 2.
Après la centrifugation de l'étape (3~), on retrouve au fond du tube 6a les particules les plus grosses et lourdes dudit éch~ntillon liquide 5 selon la r~p~Lilion donnée ci-dessus pour les figures 1 et 2a-2b.
Le fait que la phase de révélation 1 soit isolée du liquide dudit éch~ntillon liquide S par la phase d'absorption 2, après la centrifugation de 20 l'étape (3~), d'une part, et que la phase d'absorption 2 absorbe les particules de faible taille, d'autre part, constitue un avantage.
Les figures 4a [avant centrifugation] et 4b [après centrifugation selon l'étape (3~)] ont trait à un système gélifié 10 selon l'invention analogueà celui de la figure 3 mais comportant en plus, dans un tube de centrifugation 25 à fond conique 6a, une couche d'huile (huile de paraffine), à savoir la phasede protection 4. On verse dans le tube 6a la phase de révélation 1, la phase d'absorption 2 puis la phase de protection 4, procède à une centrifugation (1000-3000 g pendant 10-20 minutes) pour tasser ledit système gélifié 10. On verse ensuite dans le tube 6a l'éch~ntillon liquide 5 à tester. Ledit éch~ntillon 3 o liquide 5 se répartit au-dessus de la phase de protection 4 (voir figure 4a).
Lors de la centrifugation de l'étape (3~) l'éch~ntillon liquide S
migre à travers la phase de protection 4, et les particules solides qu'il contient migrent également en fonction de leur taille à travers la phase d'absorption 2 et/ou la phase de révélation 1, en revanche le liquide dudit 35 éch~ntillon liquide S et les ingrédients qui y sont dissous ne traversent pas la WO 96/29427 PCTIE~'R96/0041g phase d'absorption 2. Après centrifugation, les particules les plus ~losses et les plus lourdes se trouvent réparties au fond du tube 6a comme indiqué plus haut.
La figure 5 a trait à un système gélifié 10 selon l'invention 5 comportant trois couches, à savoir de bas en haut: la phase barrière 3, la phase de révélation 1 et la phase d'absorption 2, la couche 1 étant un gel, la couche 2 étant soit un gel soit une phase particulaire, et la couche 3 étant soit un gel soit une paraffine solide.
Dans un tube à fond sphérique 6b, on verse succescivement la 10 phase barrière 3 (préalablement fondue, si elle est conctit.lée par une paraffine solide à une te~ alul~ de RT à 50-55~C, puis refroidie), la phase de révélation 1 puis la phase d'absorption 2. On procède à une centrifug~tiQn (1000-3000 g pendant 10-20 minutes) pour tasser ledit système gélifié 10. On verse ensuite dans le tube 6b l'éçh~ntillon liquide 5 à tester. Ledit éch~ntillon lS liquide 5 se r~p~ LiL au-dessus de la phase d' absorption 2 avant la centrifugation de l'étape (3 ~).
Lors de la centrifugation de l'étape (3~) le liquide dudit éch~ntillon liquide 5 et les consl;l~-~ntc dissous qu'il contient ne migrent pasà travers la phase d'absorption 2; seules migrent à travers le système gélifi6 20 10 constitué par l'encemhle phase d'absorption/phase de révélation/phase barrière, en fonction de leur taille, les particules solides dudit érh~ntillon liquide 5. Quand la phase b~~ 3 est une paraffine solide toutes les particules gl'OSSeS et lourdes ne traversent pas son ép~icseu- mais se répartissent en fonction de leur taille au niveau de l'interface phase de 25 révélation/phase barrière.
La configuration des couches 2, 1 et 3 selon la figure 5 (il en est de même pour le système gélifié des figures 6a et 6b) offre l'avantage de pouvoir tliminl~er l'épaisseur de la phase de révélation 1 prise en sandwich entre la phase d'absorption 2 et la phase barrière 3 et d'améliorer ainsi la 30 lecture de la variation de OM soit à l'oeil nu (changement de couleur) soit au moyen d'un colorimètre.
Les figures 6a [avant la centrifugation de l'étape (3~)] et 6b [après la centrifugation de l'étape (3~)] ont trait à un système gélifié 10 selon l'invention, qui est analogue à celui de la figure 5, mais comportant en outre 35 une couche d'huile 4 (huile de paraffine) cons~ituant la phase de protection.

La l~p~Lilion des particules solides de l'érh~ntillon liquide S s'effectue comme indiqué pour la figure 5, la phase de protection 4 permçtt~nt la migration dudit éc~ ~ntillon liquide 5 lors de la centrifugation de l'étape (3~).
Les substances polymériques qui intervi~nn~nt à l'état gonflé dans 5 les gels (de haut en bas) de la phase d'absorption 2, de la phase de révélation 1 et de la phase barrière 3, sont avantageusement des particules de dextrane.
Conviennent en particulier les produits de la p~mme Sephadex(~) G
commerci~licés par la société dite PHARMACIA FrNE CHEMICALS
(Uppsala, Suède), à savoir:
o - pour la phase d'absorption 2, le produit G 25C, - pour la phase de révélation 1, les produits G 25 à G 100 de granulométrie dite grossière à moyenne, tels que G 25M, G 50C, G
50M, G 75 et G 100 (le produit préféré étant G 100), - pour la phase barrière 3, les produits G 150 à G 200 de granulométrie dite moyenne à superfine, tels que les G 150, G l50S, G 200 et G 200S
(les produits préférés étant G 200 et surtout G 200S).
Les caractéristiques de ces pi~luits du type dextrane sont consignées dans le tableau I ci-après.

WO 96/29427 PCTIFR96l00419 TABLE 4U l Phase Gel (A) Domaine de fractionn.oment (B) (C) Absorption G 25C 100-300 1000-5000 100-5000 Révélation G 50M 50-150 1500-30000 500-10000 BaITière G l50S 10-40 5000-150000 1000-150000 G 200S 10~0 5000-250000 1000-200000 Notes:
(A) ~ m~tre en ~m des particules à l'état sec (B): peptides et protéines globulaires (C): de~ es G 25C: "Seph~tox~) G 25 Coarse"
G 25M: "Sephadex(~) G 25 Medium"
G 50C: "Sephadex~) G 50 Coarse"
G 50M: "Seph~ex~) G 50 Medium"
G 75 : "Sephadex~) G 7S"
G 100 : '~ceph~lex~) G 100"
G 150 : "Sephadex~) G 150 Superfine"
G 200 : "Seph~ex~ G 200"
G 200S: "Sephadex@3) G 200 Superfine"
s Dans les tableaux II et m ci-après, on a donné pour les gels préférés, les caractéristiques relatives à la granulométrie à l'état gonflé et àla conce.lL.~ion, qui sont importantes selon l'invention.

TABLEAU II

PhaseGel Diamètre des grains (~m) à l'état gonflé
(A) (B) Absorption G 25C 160-530 172-516 Révélation G 100 90-320 103-311 Barrière G 200S 30-130 32-129 (A): domaine de l'invention (B): domaine préféré

TABLEAU III
Phase Gel Co lcentration (g/ml) (A) (B) (C) Absorption G 25C 0,2 0,35 Révélation G 100 0,05 0,1 0,2 Barrière G 200S 0.040,14 0,2 Notes:
(A): conce"l,alion minim~le selon l'invention (B): con~nL,~tion préférée selon l'invention (C): conce..ll~tion maximale selon l'invention En se référant aux conce."l~tions minim~les et maximales des gels fournis dans le tableau m, il convient de remarquer que:
(1) si le gel en contact avec le liquide de l'éch~ntillon liquide 5 (i.e.
0 couche 1 de la figure 1 ou couche 2 des figures 3 et 5) est plus concentré, il y a un risque de passage dudit échantillon liquide 5 à
travers ledit gel pendant la centrifugation;
(2) si tous les gels sont plus concentrés, la détection de la présence ou de l'absence de microorg~ni~mes est gravement perturbée;
(3) si l'un au moins des gels est plus dilué, on peut avoir des échanges de liquide entre l'éch~ntillon liquide et le gel sous-jacent, d'une part, ou entre deux gels adjacents, d'autre part, ce qui fausse ladite détection.

WO 96/29427 PCT/l~R96~û419 On peut supprimer la phase barrière 3, comme cela est illustré par les figures 1, 2a-2b, 3 et 4a4b, lorsque les grosses particules (érythrocytes, leucocytes, autres cellules) n'ont pas d'activité sur le réactif in~ ic~nt une variation de mesure optique détectable. Cela est notamment le cas quand 5 ledit réactif est la résazurine.
On peut supprimer la phase d'absorption 2 et la phase barrière 3 comme cela est illustré par les figures 1 et 2a-2b, quand ~uc~me substance (dissoute ou particulaire) présente dans l'érh~ntillon liquide 5 n'a d'activité
sur ledit réactif in-lni~nt une variation de mesure optique ~étect~hle ou 10 lorsque toute inle.r~i,nce possible peut être inhibée pen~l~nt la révélation de l'étape (4~).
Si la concentration des microorg~ni~m~, qui sont éventu~ ment présents dans l~éctl~ntillon liquide S à tester et qui ont migré lors de la centrifugation de l'étape (3~) pour se trouver dans la phase de révélation 1 (soit dans l'ép~i~se.-r de ladite phase 1, soit au-dessus de l'interface phase l/phase 3 ou phase l/paroi inférieure du tube 6a), est supérieure au seuil de détection du réactif de la phase de révélation 1 jn~ nt une variation de mesure optique détect~l~le il n'y a pas lieu de procéder à la multiplication desmicroorg~nism~s par culture in silu à l'étape (4~).
En revanche, si après ladite centrifugation la concenL~at~on des microorg~nicmes est inférieure au seuil de détection, il est requis d'el,~e~,~ "dre ladite m-.ltiplic~tion par culture in situ dans le tube de centrifugation au niveau de ladite phase de révélation 1, de préférence à une température de 37~C.
2s Le tube de centrifugation 6a, 6b ou 6c est réalisé en un matériau transparent (plastique ou verre). De préférence, le tube de centrifugation utile selon l'invention sera réalisé en plastique et fabriqué par moulage. En variante, ledit tube peut être transparent sur au moins une partie de sa surface périphérique en regard de zone garnie avec la phase de révélation 1.
3 o Selon l'invention, le seuil de détection des microor~ni~m.os, rapporté à la concentldtion initiale desdits microorg~ni~mPs dans ledit éc~l~ntillon liquide 5, est de 103 germeslml, c'est-à-dire nettement inférieur au seuil de 105 germes/ml des techniques antérieures illustrées notamment par les tests Bac-T-Screen(g) et FiltraCheck(~)-UTI précités.

Cette amélioration est due au fait que, selon l'invention, on (a) concentre les inicroorg~ni~mes de l'é~h~ntillon liquide 5, qui ont migré lors de la centrifugation, dans la phase de révélation 1, puis (~) le cas éch~nt, les fait multiplier dans le milieu nutritif.
Pour concenL~ les microor~ni~mes dans la phase de révélation, il est recomm~nrlé selon l'invention de faire appel à une phase de révélation 1 ayant un volume et une épaisseur les plus faibles possibles. Par suite, la forme du tube de centrifugation sera choisie de telle façon que le facteur de concentration des microor~ni~mes, qui est directement proportionnel au rapport volume de l'érh~ntillon à tester/volume de la phase de révélation, soit maximal. Le volume de la phase de révélation est déterminé par la formule V = 7~R2h (où V est exprimé en ml, R le rayon et h la h~ut~llr sont exprimés en cm). Plus le ~i~mètre du tube est faible, plus le facteur de concenll~tion augmente. A titre d'exemple, le facteur de concentration peut être un multiple de 103 quand le rayon du tube est divisé par 10.
Le c~pill~ire du tube 6c permet une bonne conce~ lion des microorg~nismes dans la phase de révélation.
Les figures 7 et 8 mon~ des sy~L~.nes gélifiés ~r~réi~s selon l'invention, tels qu'ils se présentent après cenLIirugation. Le tube de la figure 7, qui a un contenu simil~ire à celui de la figure 4b, comporte une phase de révélation 1 de volume plus faible que ceux de la phase 2 et de l'éch~ntillon 5, qui est logée au fond dudit tube de centrifugation 6a dans la portion inférieure de la partie conique.
Le tube 6b de la figure 8, qui a un contenu simil~ire à celui de la figure 6b, p,Csente un fond sphérique (qui peut avoir un diamètre plus petit que celui du reste du tube) où est logé la phase barrière 3 et la phase de révélation 1. Ce fond est tel que la phase de révélation l prise en sandwich entre la phase barrière 3 inférieure et la phase d'absorption 2 supérieure ait un volume et une épaisseur les plus faibles possibles.
3 o A titre d'exemple, si on fait appel à un tube en plastique transparent, selon la figure 8, ayant un volume de 12 ml, un rii~m~tre intérieur de 1,35 cm et dans lequel on introduit un volume de 6 ml d'éch~ntillon d'urine à tester, pour obtenir la phase de révélation 1 sous la forme d'un ~nne~u de 0.2 cm de hauteur, il faut que le volume de ladite 35 phase 1 à utiliser ait pour valeur de V = ~.(1,35/2)2.0,2 i.e., environ WO 96/29427 PCTJ~R96,1~D4~9 0,3 ml. Le facteur de concentration (F) des microorganismes de l'urine est alors de 6/0,~ = 20 pour qu'un ~nne~ll coloré soit visible. Comme la réaction positive débute par un point représentant moins du dixième du ~i~m~tre du t~lbe, le volume réactionnel utile de la phase de révélation 1 5 devient alors de 0,003 ml, ce qui conduit à un facteur de concentration de 6/0,003 = 2000, soit une augmentation du seuil de sensibilité du facteur de conce.lLration d'un multiple de 103 visé ci-dessus. En variante, lorsque la section de la partie inférieure du tube est ~liminuée d'un facteur 10 (i.e.
divisée par 10; soit 0,135 cm de di~mètre)~ V devient 0,3 x 10-2 ml, soit 0 une ~u~ment~tion de 102 du facteur F pour un ~nn.o~o et une ~U~mçnt~tion de 103 dudit facteur F pour un point.
Les figures 9 et 10 présentent ch~c~ne un tube de centrif~g~ti-n 6c qui est en matière plastique ~a.,s~ nte (par exemple en polystyrène ou polycarbonate) et qui est utile selon l'invention. Le tube 6c offre l'avantage 15 de pouvoir procédé à une numération des microorg~ni~mes présents dans la phase de révélation logée dans le capillaire.
Selon la figure 8, le tube 6c est pourvu à son extrémité inférieure d'un capillaire 7 situé le long de l'axe dudit tube et destiné à recevoir la phase de révélation (référencée 1 ci-dessus). La partie cylindrique du tube 6c 20 est en relation avec l'ouverture du c~pill~ire 7 par l'interm~~ ire d'une portion tronconique 20. La phase de révélation est logée dans le tube capillaire jusqu'à la ligne 22 qui collc~ond à l'intersection du tronc de cône 20 avec l'ouverture du c~rill~ire 7. Au-dessus de la ligne 22 est logée, le cas éc~ nt, la phase de protection (référencée 4 ci-dessus) et/ou la phase 25 d'absorption (référencée 2 ci-dessus). La paroi cylindrique extérieure du tube 6c se prolonge vers le bas en regard du capillaire par deux pattes (ou prolongements) 8 et 9 qui sont sensiblement rii~métralement opposés et assurent la stabilité du tube quand il est disposé debout. Ces pattes 8 et 9 constituent un socle; entre elles sont ménagées deux fenêtres permettant 30 d'observer à l'oeil nu ou au moyen d'un dispositif optique (colorimètre, sl~ccLio",~tre, etc.) le contenu du capillaire 7 avant centrifugation, puis après centrifugation ou culture en vue de procédé à la numération des bactéries ou des lewres ~lCse"tcs.
Le tube 6c de la figure 10 est réalisé de façon à procéder à la 35 numération des bactéries ou des levures ~ sen~es comme indiqué ci-dessus WO 96/29427 ~ PCT/FB96/00419 pour le tube de la figure 9, d'une part, et à recueillir lesdites bactéries ou levures présentes afin de les identifier, d'autre part. Ce tube comporte un capillaire 7, une paroi tronconique 20 et une paroi cylindrique interne 17, l'intersection de la surface 20 avec l'ouverture du capillaire 7 constituant la 5 ligne 22. L'ouverture de la portion cylindrique 17 vers l'extérieur est soit parallèle à l'axe du tube 6c, soit en forme d'entonnoir comme ~ resenté en 11.
La surface extérieure du tube 6c de la figure 10 comporte au voisinage de l'e~ CI~ité supérieure une ou plusieurs gorges 14 et/ou 15 où
o peut être logé un joint torique (notamment en caoutchouc) non représenté ici, l'une de ces gorges 14 est disposée entre deux collerettes ou lèvres 12 et 13, une autre de ces gorges 15 est disposée entre la collerette 13 et la surface extérieure 16 du tube. Une butée ~nnlll~ire 18 est prévue sur ladite surface extérieure 16. L'ensemble collerette 12 et/ou 13 + surface extérieure 16 est 15 ~estin~e à être obtu,~e par un bouchon cylindrique notamment en matière plastique recouvrant la partie supérieure externe du tube 6c jusqu'à la butée 18. Les pattes ou prolongements 8 et 9 servent de socle pour m~int~onir debout le tube de centrifugation 6c CGIllllIC indiqué ci-dessus pour le tube de la figure 9. L'une de ces pattes 8 peut présenter une portion de surface 20 dirigée vers l'extérieur qui est plane, afin de recevoir le cas éch~nt7 des indications m~nl-~crites ou collées. Les pattes 8 et 9 peuvent également comporter sur leur surface dirigée vers l'extérieur un ensemble de plusieurs gorges 19 et de lèvres 21 alternées, de façon à pouvoir, si cela est n~cess~ire, logé le tube 6c de la figure 10 (qui peut avoir une h~llteur très 2s petite notamment 30 mm) dans l'ouverture supérieure d'un autre tube de centrifugation (plus grand) convenant au dispositif de centrifugation utilisé.
L'observation et la numération des bactéries ou levures présen~es dans la phase de révélation logée dans le capillaire 7 jusqu'à la h~llt~-r de la ligne 22 sont effect~~es comme indiqué plus haut pour le tube de la figure 9 3 o au moyen des fenêtres ménagées entre les pattes 8 et 9.
Pour recl~eillir les microorganismes présents dans la phase de révélation logés dans le capillaire 7 du tube de la figure 10, (1~) on retourne ledit tube pour jeter le surnageant, ladite phase de révélation restant dans le capillaire, (2~) on place un joint torique dans la gorge 14, (3~) on insère 35 l'ensemble collerette 12 + joint logé dans la gorge 14 + collerette 13 +

WO 96/29427 ~CTJFR96100419 surface 16 à l'intérieur de l'ouverture d'un second tube de centrifugation contenant le milieu liquide de récupération, jusqu'à ce que le second tube de centrifugation vienne en contact avec la butée 18, le tube 6c étant m~intenu retourné (c'est-à-dire capillaire 7 dirigé vers le haut), (4~) on agite 5 l'ensemble des deux tubes de centrifugation ainsi raccordés par leurs ouvertures, puis (5~) on centrifuge, à 1000-2000 g, pendant 2-S minlltes~
pour faire passer la phase de révélation, initialement contenu dans le capillaire 7, dans le liquide de récupération qui se trouve au fond du second tube.
0 Cette façon de procéder permet la récupération aisée des microor~nicmes ~r~se~lls sans cont~min~tion et sans perte notable. Cette technique est bien plus efficace que celle qui consiste à procéder au prélèvement de la phase de révélation logée dans le c~pill~ire 7 au moyen d'une aspiration avec une seringue; en effet les particules polymériques 5 gonflées du gel conctitl-~n~ la phase de révélation ne l)assel~L pas facilement à
travers l'aiguille de la seringue du fait de leurs dimensions.
En variante, on peut recueillir la majeure partie de la phase de révélation conlcna--l des microor~nismes en utilic~nt le tube de la figure 9.
Dans ce but, (la) on jette le surnageant situé au-dessus de la ligne 22, (2a) 20 on ajoute une solution aqueuse de lavage, obture le tube 6c et agite, (3a) on centrifuge à 1000-2000 g pendant 2-5 minutçs~ (4a) on reproduit les opérations (2a) et (3a) jusqu'à ce que le surnageant soit incolore, (~a) on jette le surnageant rés-llt~nt, ajoute une solution ~ql~ence de récupération et agite pour recueillir le milieu liquide résnlt~nt co.llenant la majeure partie de 25 la phase de révélation et par suite des micloorg~nismes présents.
D'un point de vue pratique, pour que la phase de révélation reste dans le capillaire lorsque le tube 6c est retourné avant agitation puis centrifugation, il est important que le Ai~mètre interne du capillaire soit inférieur ou égale à 2,5 mm. Un diamètre interne convenable se situe entre 3 o 1,2 et 2,3 mm. On a obtenu de très bons résultats avec des diamètres intérieurs de 2,0 et 2,2 mm.
Pour améliorer la sensibilité de la détection des microorg~nicmes et obtenir une bonne récupération de la phase de révélation, il est recomm~nAé de satisfaire au moins une des conditions suivantes et de 35 préférence l'ensemble Aes~lites conditions:

~ .

A- le diamètre interne du c~pill~ire est inférieure à 2,5 mm, B- I'angle a de la portion tronconique 20 est inférieur ou égale à 30~ (i.e.
< 7~/6), c'est-à-dire que la génératrice de cette portion tronconique est faiblement inrlin~e par rapport à l' axe vertical du tube (angle d'inrlin~icon inférieur ou égale à a/2), C- le volume du c~r~ ire est inférieur ou égale à 0,6 ml et de pl~f~rence inférieur ou égale à 0,1 ml.
Si la condition B ou la condition C n'est pas s~ticfaite, il y a un risque de dépôt de traces de phase de révélation sur la paroi interne du tube 0 et par suite de microorg~nicmes~ surtout au-dessus du voisinage de l'inter-section 22.
Exemple I
Dans un tube de centrifugation en plastique transpa~ t, d'un volume de 5 ml et d'un diamètre intérieur de 1,10 cm on introduit successivement:
- 0,5 ml d'un gel G 200S/eau ~iict~ e~ dans lequel G 200S est à une concenlralion en poids sec de 0,2 g/ml et a une granulométrie à l'état gonflé de 40-100 ~m, pour former la phase barrière;
- 0,25 ml d'un gel G 100/milieu de culture aqueux, dans lequel G 100 est à une concenL.~ion en poids sec de 0,2 g/ml et a une granulométrie à
l'état gonflé de 120-300 ~m, ledit milieu de culture aqueux ayant la composition suivante:
bouillon de coeur-cervelle 37 g/l glucose S g/l agarose (type IX) 0,33 g/l pH 7,4iO,l et contenant 0,05 g/ml de résazurine, pour forrner la phase de révélation; et, - 0,5 ml d'un gel G 25C/eau distillée, dans lequel G 25C est à une concentration en poids sec de 1 g/ml et a une granulométrie à l'état gonflé de 40-110 ~m, pour former la phase d'absorption.
On procède à une cenl.ifugation (1000-3000 g pendant 10-20 minutes à RT) pour tasser le système gélifié rés--lt~nt. En variante, ladite centrifugation de tassage peut être effectuée après l'introduction de ch~cune des-lites phases avant d'introduire la phase suivante.
On dispose d'un système gélifié prêt à l'emploi.

WO 96/29427 PCTJl:'R96J004~9 F~etnple 2 On introduit, au-dessus du système gélifié ~r~al~ selon l'exemple 1 ci-dessus, 1 ml d'huile de paraffine en tant que phase de protection.
On.obtient ainsi un dispositif pour détecter la présence ou s l'absence de microorg~nicmec dans un éch~ntillon d'un matériau biologique, ledit dispositif étant stable au stork~ge.
Exemple 3 Dans un tube de centrifugation en plastique trans~ar~nt, d' un volume de 5 ml et d'un ~i~m~tre intérieur de 1,10 cm, on i~ odui 0 succescivement:
- 0,5 ml de paraffine fondant à une temp~,dlul~ superieure ou égale à
50~C (l'intro~u~tion de cette paraffine est effectu~e à l'~tat fondu), pour former (après refroidissement jusqu'à RT) la phase barrière;
- 0,2~ ml d'un gel G 100/milieu de culture aqueux, dans lequel G 100 est à une concentration en poids sec de 0,2 g/ml et a une granulométrie à
l'état gonflé de 103-311 ~m, ledit milieu de culture aqueux ayant la co.,.~osition suivante:
bouillon de coeur-cervelle 37 g/l glucose ~ g/l agarose (type IX) 0,33 g/l pH 7,4iO,l et contenant 2 mM de H-L-Ala-NA en tampon phosphate (0,1 M) à pH
8,0, pour former la phase de révélation; et, - 0,5 ml d'un gel G 25C/eau tlictill~e dans lequel G 25C est à une concellL.dtion en poids sec de 1 g/ml et a une granulométrie d l'état gonflé de 32-129 ~m, l'eau ~li.ctill~e lltilicée pour élaborer ce gel co"le"ant 0,06 g/ml d'EDTA, pour former la phase d'absorption.
On procède à une centrifugation (1000-3000 g pendant 10-20 mimltes à RT) pour tasser le système gélifié résl~lt~nt. En variante, ladite centrifugation de tassage peut être effectuée après l'introduction de ~h~tnln~
~sdites phases avant d'introduire la phase suivante.
On dispose d'un système gélifié prêt à l'emploi.
Exemple 4 On introduit, au~essus du système gélifié ~rCpar~ selon l'exemple 3 ci-dessus, 0,25 ml d'huile de paraffine en tant que phase de protection.

On obtient ainsi un dispositif pour détecter la présence ou l'absence de microor~nismes dans un éch~ntillon d'un matériau biologique, ledit dispositif étant stable au stockage.
E~cemple 5 On procède comme indiqué à l'exemple 3 avec la différence que le milieu de culture aqueux utilisé pour le gonflement de G100 en we d'obtenir la phase de révélation contient en outre un réactif de diazotation, lep-diméthylaminocinn~m~ldéhyde.
Exemple 6 0 Dans un tube de centrifugation en plastique transparent ayant un fond conique, un diamètre intérieur (dans sa portion cylindrique) de 1 cm et un volume de 5 ml, on introduit succes~ivement:
- 0,20 ml d'un gel G 100/milieu de culture aqueux, dans lequel G 100 est à une concentration en poids sec de 0,2 g/ml et a une granulométrie à
l'état gonflé de 103-311 ~m, ledit milieu de culture aqueux ayant la composition suivante:
YNB 6,7 g/l m~ltose 20,0 g/l gentamycine 0,05 g/l cycloheximide 0,5 g/l pH 6,0 et conten~nt 1 mM de H-L-Pro-pNA (ce milieu de culture contenant un substrat spécifique des souches de CnqrrjAn albicans permett~nt de distinguer lesdits ~nqAiAn albicans des autres CnqAjAn), pour former la phase de révélation; et, - 0,5 ml de kaolin micronisé et ayant une granulométrie homogène de 0,055-0,060 ~m, pour former la phase d'absorption.
On tasse le système gélifié résultant par centrifugation à 2000 g pendant 15 minutes à RT.
3 o On dispose ainsi d' un système gélifié prêt à 1' emploi, qui est spérifiquement destiné à l'identific~tion des CnqAj(~T albicalls parmi un encemble de souches non isolées de f~n~Ai~n EJcemple 7 On introduit au-dessus du système gélifié préparé selon l'exemple 6, 1 ml d'huile de paraffine, pour former la phase de protection et on CA 022l6602 l997-09-l7 WO 96/29427 PcT~ ' 119 centrifuge à 2000 g pendant 15 minntes à RT pour tasser le système gélifié
rés--lt~nt emples 8 et 9 On procède cornme indiqué à l'exemple 6 ci-dessus mais en ~-tilic~nt comme milieu nutritif 0,20 ml du milieu nutritif de l'exemple 1 conten~nt de la l~sa,uline pour l'obtention de la phase de révélation afin de alel un système gélifié spécifique de la détection des bactéries ~exemple 8). A partir du système gélifié ainsi obtenu, on ~l~p~e selon l'exemple 7 un système gélifié prêt à l'emploi qui est pourvu de la phase de protection 0 (exemple 9).
Exemples 10 et 11 On procède comme indiqué à l'exemple 6 ci-dessus mais en ~-tili~nt comme milieu nutritif 0,20 ml d'un milieu nutritif spérifique des souches d'Aspergillus pour l'obtention de la phase de révélation afin de préparer un système gélifié spécifique de la détection de ces levures (exemple 10). A partir du système gélifié ainsi obtenu, on yr~c selon l'exemple 7 un système gélifié prêt à l'emploi qui est pourvu de la phase de protection (exemple 11).
Exemple 12 2 o On a introduit dans les tubes co.-~e-.~nt les systèmes gélifiés préparés selon les exemples 1 et S, un volume de 1 à 4 ml d'urine stérilisée (où on a inL,~.lit dirfér~ es concenLI~tions de souches d'Escherichia coli) ou d'urine d'un patient atteint d'infection urinaire provoquée par des souches d'Escheridia co~. Après 20 minutes de celll.irugation à 3000-5000 g et à RT
on observe, avec un éch~ntillon d'urine d'infection urinaire contPn~nt des souches d'Escheridia coli à la conce,llld~-on de 105 CFU/ml, un point rose avec la résazurine (i.e. système gélifié préparé selon l'exemple 1) et un point rouge avec le m~l~nge H-L-Ala-NA/réactif de diazotation (i.e. système gélifié préparé selon l'exemple 5). Ces points colorés situés au niveau de la phase de révélation s'étendent et forment chacun un ~nnP~u coloré après quelques heures à RT ou 37~C.
Les résultats obtenus avec la résazurine ont été consignés ci-après dans le tableau IV.

WO 96129427PCT/~ oo~l9 ~ TABLEAU IV
Détec~on de souches d 'Escherichia coli avec la résa~urine LectureBact~ries/ml en urine d'infection urinaire lo8 107 lo6 10~ < 104 103 àt = 0,5 h +++ +++ +++ ++ + +/-àt = 2h +++ +++ +++ +++ +++ +++

5 Exemple 13 Des essais compl~-..Pn~ s ont été réalisés sur des lots d'urine provenant de 50 personnes (35 personnes étant ~tt~inteS d'infection urinaire bactérienne, 15 personnes utili~ées pour contrôle ne souffrant pas d'infection ;naile). Les sy~è.llcs gélifiés des exemples 1-5 ont été utilisés o simultanément pour chaque éch~ntillon d'urine testé 2 ml d'urine ont été
introduits dans ch~rlln des tubes de ce~llr;filgation.
Après centrifu~tior- à 3000-5000 g pendant 15 minlltes à RT puis culture in situ à 37~C pe~ nt 24 h, on a observé avec ces érh~ntillons d'urine une amélioration des Sen, Spe et NPV (pour de faibles 5 concentrations bactériennes) avec les systèmes gélifiés selon l'invention par o-l aux tests Bac-T-Screen(~) et FiltraCheck(~)-UTI précités. Une partie des résultats obte,..ls est con~i~n~e ci-après pour une concentration dans les éch~ntillons d'urine de 103 bactéries/ml:
Sen = 95-98%
2 o Spe = 93-97 %
NPV = 91-94%
Exemple 14 Le système gélifié de l'exemple 2 a été utilisé pour apprécier la présence ou l'absence de bactéries dans 8 blocs opératoires. Les tubes (d'un volume de 15 ml), garnis dudit système gélifié et pourvus ou non d'une collerette du type entonnoir au niveau de leur orifice supérieur, ont été
disposés pendant 24 h dans des blocs opératoires au voisinage des arrivées de gaz, à une h~uteur de 1,50 m et à une distance de 1 m du mur le plus proche. Avec une pipette, on a fait couler de l'eau distillée pour rincer la 3 o partie exposée de chaque tube et de chaque collerette présente. Après centrifugation (30 minutes à 3000 g) et culture in sin~ à 37~C pendant 24 h, on a pu ~lét~cter dans l'un des blocs opératoires la pr6sence de bactéries dans l'atmosphère ambiante (prin~ip~lement des souches de Staphylococcus). Le bloc opératoire cont~min~ a été stérilisé.
Exemple 15 On a d~coupé puis finement dilacéré les filtres (membranes cellulosiques) des conduits d'aération de 6 blocs o~atoiles. Le matériau ainsi obtenu a été trituré avec de l'eau ~ till~e; le surnageant rés~-lt~nt a été
introduit à raison de 1 à 2 ml dans des tubes obtenus selon le procédé des exemples 2 et 11. Après centrifugation à 3000-5000 g pendant 15 minutes à
o RT puis culture in situ à 37~C pendant 24 h, on a pu ~étecter dans l'un dessix blocs opératoires la présence de bactéries (prin~ir~l~ment des souches de P~e.~c~ onn~) et dans un autre desdits blocs opératoires la pl~,sence de levures (dans le cas d'espèce des souches d'AspergzUus). Les deux blocs opératoires cont~min~s ont éte stérilisés.
Fremple 16 Du lait "clarifié" (i.e. délipidé) et stérilisé a été cont~min~ avec des souches de (~nrt~ (à une conccnllalion supérieure ou égale à 105 gCl l"cs/ml) et réparti à raison de 2,5 ml dans des lots de tubes de centrifugation (5 tubes par lot) p-~al~s selon le procédé de l'exemple 7:
20 - le lot A cont~on~nt des souches isolées de Candida n~bi~n~
- le lot B co.~ ..t des souches isolées de Cnq~id(~ glabrata, - le lot C contenant des souches isolées de C~nn~l;do krusei, - le lot D contenant des souches non isolées de divers C~n~ ;~ (i.e. dessouches de Cn~ n albicans associées à d'autres souches de Cn~ n), et - le lot témoin étant constitué par ledit lait clarifié et stérilisé.
Après centrifugation à 35004000 g pendant 20 minlltes à RT, puis culture in situ à 37~C pendant 1-2h, on a constaté que le système gélifié
de l'exemple 7 donnait une réaction colorée positive avec les tubes des lots A
et D et ne donnait ~uc~n~o réaction colorée positive avec les lots B et C et le lot témoin.
F~emple 17 Un érh~ntillon d'hémoculture (provenant d'un patient infecté) préalablement mis en contact avec de la saponine (pour lyser les érythrocytes présents) est introduit à raison de 1 à 3 ml dans un tube de centrifugation WO 96/29427 PCT/FRg6/00419 garni du système gélifié préparé selon le procédé de l'exemple 4. On centrifuge à 3000-5000 g pendant lS minlltes à RT. Après culture in situ à
37~C pendant 1-2 h, on observe une réaction colorée positive dans ledit tube de centrifugation, ceci indiquant la présence de bactéries Gram-négatif dans 5 l'hémoculture.
En variante en intro~ nt dans la phase de révélation ou dans l'ensemble phase de révélation/phase d'absorption un antibiotique de façon à
avoir un jeu de plusieurs tubes contenant ch~c--n un antibiotique différent, on peut apprécier la ré~i~hnce des bactéries contenues dans des hémocultures 0 vis-à-vis d'antibiotiques usuels.
mple 18 On découpe et dilacère fillelllelll de la viande boeuf. Au Illat~l;au ainsi obtenu, on ajoute du sérum physiologique et des bactéries (107 germes/ml de souches de Staphylococcus epiderrnidis). On rec~eille le 5 surnageant et l'introduit à raison de 1-2 ml dans un tube contenant le système gélifié ~l~pa.~ selon le procédé de l'exemple 2.
On centrifuge à 3000-5000 g pen-l~nt lS minutes à RT culture in situ à 37~C pendant 24 h. On observe le changement de couleur à la partie inférieure de la phase de révélation ce qui confirme la présence de bactéries 20 dans l'é~h~ntillon testé.
Exemple 19 Dans un tube en c nLIir~gation en plastique transpal~"ll d'une hauteur de 30 mm, qui est pourvu d'un capillaire ('I) = 2,2 mm; volume =
0,045 ml) et qui est conforme à la figure 10, on introduit successivement en 25 centrifugeant après chaque introduction (1000-3000 g pendant 10-20 minllses à RT pour tasser chaque couche:
- 0,045 ml d'un gel G 100/milieu de culture aqueux, dans lequel G 100 est à une conce~ tion en poids sec de 0,2 g/ml et a une granulomètre à
l'état gor..lé de 103-311 ~m, ce milieu contenant de la résazurine, et 30 - 0,5 ml d'huile de paraffine.
On introduit ensuite un éch~ntillon d'urine d'un patient atteint d'infection urinaire provoquée par des souches d'Escherichia coli. Après 20 minlltes à 3000-5000 g à RT on observe 1 heure après le début de la centrifugation la coloration de la caractéristique de la présence de bactéries.

La n~ ion des bactéries est faite optiquement (spectromètre, densitomètre ou a~alcil de MacFARLAND destiné à la mesure de la turbidimétrie), le cas éeh~nt avec des solutions d'urine étalon contenant J ch~cun une quantité connue d 'Escher~chia coli.
On récupère la phase de révélation comme expliqué plus haut au moyen d'un deuxième tube de cenL,;r.lgation contenant la solution aqueuse de récupération afin de réaliser des antibiogr~mmes pour apprécier la rési~t~n des bactéries reclleillic vis-à-vis de plusieurs antibiotiques.
On obtient des résnlt~tc particuli~le.llelll effiç~ces quand on ~iminlle le volume du c~pill~ire 7 jusqu'à 0,02-0,03 ~l.
Selon l'invention, on LlCco.~;c~ un n~cess~ , kit ou trousse de dosage qui CGIllpGlle au moins (1) un tube de centrifugation à fond conique 6a contenant un système gélifié
constitué, de haut en bas, de la phase de protection 4, la phase d'absorption 2 et de la phase de révélation 1, un tube de centrifugation à fond sphérique 6b conten~nt un système gélifié co..~ ué, de haut en bas, de la phase de protection 4, de la phase d'absorption 2, de la phase de révélation et de la phase barrière 3, ou un tube de centrifugation à fond c~pill~ire 6c co--~e .~
un système gélifié constitué de la phase de révélation sur laquelle repose, le cas ~c~ nt la couche de protection et/ou l'ensemble couche de protection +
couche d'absorption; et/ou, (2) des flacons co.~ nt les matériaux constitutifs (i.e. le ou les gels, la substance particulaire, la paraffine solide et/ou la paraffine liquide) des-lites phases, le réactif induisant une variation de mesure optique détectable en présence de microor&~nicmes7 et le cas éçh~nt7 le milieu de culture pour le gonflement de ladite phase de révélation 1.
On préconise également l'utili~tion du procédé et du système gélifié selon l'invention pour - détecter la présence ou l'absence de bactéries dans un échantillon de 3 O sang ou d'urine, notamment dans le domaine du screening des hémocultures et du screening urinaire;
- identifier une souche de microorg~ni~me dans un éch~ntillon biologique en utili~nt au niveau de la phase de révélation (a) un réactif ind~ nt une variation de mesure optique détectable et (~) un milieu de culture, 3 5 qui sont spécifiques de ladite souche, - procéder à la numération des microor~ani~mes présents dans la phase de révélation, - recueillir la phase de révélation contenant des microor~ani~mes en vue d'étudier ces derniers, ou 5 - déterminer la ré~i~t~nce de souches de microor~ni~mss vis-à-vis d'un ensemble d'antibiotiques usuels.

Claims (25)

REVENDICATIONS

1 . Procédé de détection de la présence ou de l'absence de microorganismes appartenant à l'ensemble des bactéries et des levures dans un échantillon liquide (5) d'un matériau biologique susceptible de contenir des cellules autres que celles desdits microorganismes, ledit procédé, qui met en oeuvre une technique de séparation sur gel, étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à:
(1°) faire appel à un système gélifié (10) qui (i) sépare en fonction de leur taille les microorganismes, éventuellement présents dans ledit échantillon liquide (5) et qui proviennent dudit matériau biologique, des autres composants solides que peut contenir ledit échantillon liquide, (ii) est essentiellement imperméable à l'eau pouvant être présente dans ledit échantillon liquide et aux substances dissoutes éventuellement présentes dans ledit échantillon liquide, et (iii) comporte au moins (a) une première phase (1), dite de révélation, qui est un gel comportant un milieu de culture de microorganismes et un réactif induisant une variation de mesure optique détectable en présence de microorganismes, ledit gel étant un mélange intime d'eau et de particules polymériques absorbant l'eau, qui ont été gonflées de telle façon que dans ledit mélange intime lesdites particules polymériques aient (.alpha.) une concentration en poids sec comprise entre 0,05 et 0,2 g/ml et (.beta.) un diamètre à l'état gonflé compris entre 90 et 320 µm, l'eau dudit mélange intime provenant en totalité ou en partie dudit milieu de culture;
(2°) introduire ledit échantillon liquide (5) dans un tube de centrifugation (6a, 6b) au-dessus dudit système gélifié (10) préalablement disposé
dans ledit tube de centrifugation;
(3°) centrifuger le contenu dudit tube (6a, 6b) résultant; et, (4°) révéler la présence ou l'absence de microorganismes dans ledit échantillon liquide (5) provenant dudit matériau biologique, au niveau de ladite première phase (1) du système gélifié (10), par ledit réactif induisant une variation de mesure optique détectable.

2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la révélation de l'étape (4°) intervient après multiplication des microorganismes sur ledit milieu de culture, à une température comprise entre la température ambiante et 45°C, en au plus 24 h (de préférence en 1-2 h) pour les bactéries et en au plus 36 h (de préférence en 24-30 h) pour les levures.

3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la centrifugation de l'étape (3°) est réalisée à 1000-5000 g.

4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que, à l'étape (1°), ledit système gélifié comporte en outre (b) une seconde phase (2), dite d'absorption, essentiellement imperméable à l'eau pouvant être présente dans ledit échantillon liquide et aux substances qui y sont dissoutes, qui retient dans sa masse les particules non solubles contenues dans ledit échantillon liquide et ayant une taille inférieure à 5 µm mais laisse passer les particules ayant une taille supérieure ou égale à 5 µm lors de la centrifugation, et qui est constituée (i) d'un gel ou (ii) de particules de silice ou de silicate ayant une granulométrie inférieure à 0,1 µm, ladite seconde phase reposant sur ladite première phase, ledit mélange intime étant essentiellement imperméable à l'eau pouvant être présente dans ledit échantillon liquide.

5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que ladite seconde phase (2) est un gel constitué par un mélange intime d'eau et de particules polymériques absorbant l'eau qui ont été gonflées de telle façon que dans ledit mélange intime lesdites particules polymériques aient (.alpha.) une concentration en poids sec comprise entre 0,2 et 1 g/ml et (.beta.) un diamètre à
l'état gonflé compris entre 160 et 530 µm.

6. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que ladite seconde phase (2) est une couche constituée d'une matière minérale micronisée de façon à avoir à l'état sec une granulométrie inférieure à 0,1 µm, d'une part, et ne gonflant essentiellement pas en présence d'eau, d'autrepart.

7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que ladite matière minérale est choisie parmi l'ensemble constitué par la silice et les silicates, notamment le kaolin.

8. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que ladite seconde phase (2) renferme une ou plusieurs substances (i) inhibant les éventuels contaminants, (ii) lysant les cellules et/ou (iii) éliminant les lipides, qui sont contenus dans ledit échantillon liquide (5) provenant dudit matériau biologique et susceptible d'interférer à l'étape (4°) en réagissant avec ledit réactif induisant une variation de mesure optique détectable en présence de microorganismes.

9. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que, à l'étape (1°), ledit système gélifié comporte en outre (c) une troisième phase (3), dite barrière, infranchissable lors de la centrifugation de l'étape (3°), par les microorganismes éventuellement présents, ladite troisième phase étant disposée sous la première phase (1) de telle façon que ladite première phase (1) repose sur ladite troisième phase (3).

10. Procédé suivant la revendication 9, caractérisé en ce que ladite troisième phase (3) est une paraffine solide fondant à une température supérieure à la température de multiplication des microorganismes.

11. Procédé suivant la revendication 9, caractérisé en ce que ladite troisième phase (3) est un gel constitué par un mélange intime d'eau et de particules polymériques absorbant l'eau, qui ont été gonflées de telle façon que dans ledit mélange intime lesdites particules polymériques aient (a) une concentration en poids sec comprise entre 0,04 et 0,2 g/ml et (.alpha.) une diamètre à l'état gonflé compris entre 30 et 130 µm.

12. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que, à l'étape (1°), ledit système gélifié comporte en outre (d) une quatrième phase (4), dite de protection, qui (i) est une huile inerte de densité inférieure à celle de l'eau, de préférence une huile de paraffine, (ii) avant centrifugation, repose sur (.alpha.) ladite première phase (1) en l'absence de la seconde phase (2), ou (.beta.) ladite seconde phase (2) quand celle-ci est présente dans ledit système gélifié (10), et (iii) après centrifugation selon l'étape (3°), repose sur l'eau dudit échantillon liquide (5).

13. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 et 4 à 12, caractérisé en ce que, à l'étape (1°), on fait appel (i) à un système gélifié comprenant, de haut en bas, dans un tube de centrifugation à fond conique (6a):
- ladite quatrième phase (4), - ladite seconde phase (2), et - ladite première phase (1);
(ii) à un système gélifié comprenant, de haut en bas, dans un tube de centrifugation à fond rond ou sphérique (6b):
- ladite quatrième phase (4), - ladite seconde phase (2), - ladite première phase (1), et - ladite troisième phase (3);
(iii) à un système gélifié comprenant dans un tube de centrifugation à fond pourvu d'un capillaire 6c: ladite première phase (1) sur laquelle repose, le cas échéant, ladite quatrième phase (4) et/ou ladite seconde phase (2);
où ladite première phase (1) a un volume plus faible que ceux de ladite seconde phase (2) et dudit échantillon liquide (5) pour concentrer les microorganismes lors de la centrifugation.

14. Système gélifié (10) utilisable suivant le procédé de la revendication 1, ledit système gélifié, étant caractérisé en ce qu'il comporte au moins (a) une première phase (1), dite de révélation, qui est un gel comportant un milieu de culture de microorganismes et un réactif induisant une variation de mesure optique détectable en présence de microorganismes, ledit gel étant un mélange intime d'eau et de particules polymériques absorbant l'eau, qui ont été gonflées de telle façon que dans ledit mélange intime lesdites particules polymériques aient (a) une concentration en poids sec comprise entre 0,05 et 0,2 g/ml et (.beta.) un diamètre à l'état gonflé compris entre 90 et 320 µm, l'eau dudit mélange intime provenant en totalité ou en partie dudit milieu de culture.

15. Système gélifié suivant la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comporte en outre (b) une seconde phase (2), dite d'absorption, essentiellement imperméable à l'eau pouvant être présente dans ledit échantillon liquide et aux substances qui y sont dissoutes, qui retient dans sa masse les particules non solubles contenues dans ledit échantillon liquide et ayant une taille inférieure à 5 µm mais laisse passer les particules ayant une taille supérieure ou égale à 5 µm lors de la centrifugation, et qui est constituée (i) d'un gel ou (ii) de particules de silice ou de silicate ayant une granulométrie inférieure à 0,1 µm, ladite seconde phase reposant sur ladite première phase, ledit mélange intime étant essentiellement imperméable à l'eau pouvant être présente dans ledit échantillon liquide.

16. Système gélifié suivant la revendication 15, caractérisé en ce que ladite seconde phase 2 est un gel constitué par un mélange intime d'eau et de particules polymériques absorbant l'eau qui ont été gonflées de telle façon que dans ledit mélange intime lesdites particules polymériques aient (a) une concentration en poids sec comprise entre 0,2 et 1 g/ml et (.beta.) un diamètre à
l'état gonflé compris entre 160 et 530 µm.

17. Système gélifié suivant la revendication 15, caractérisé en ce que ladite seconde phase 2 est une couche constituée d'une matière minérale micronisée de façon à avoir à l'état sec une granulométrie inférieure à 0,1 µm, d'une part, et ne gonflant essentiellement pas en présence d'eau, d'autrepart.

18. Système gélifié suivant la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comporte en outre (c) une troisième phase (3), dite barrière, infranchissable après centrifugation, par les microorganismes éventuellement présents, ladite troisième phase étant disposée sous la première phase (1) de telle façon que ladite première phase (1) repose sur ladite troisième phase (3).

19. Système gélifié suivant la revendication 18, caractérisé en ce que ladite troisième phase (3) est une paraffine solide fondant a une température supérieure à la température de multiplication des microorganismes.

20. Système gélifié suivant la revendication 18, caractérisé en ce que ladite troisième phase est un gel constitué par un mélange intime d'eau et de particules polymériques absorbant l'eau, qui ont été gonflées de telle façon que dans ledit mélange intime lesdites particules polymériques aient (.alpha.) une concentration en poids sec comprise entre 0,04 et 0,2 g/ml et (.beta.) un diamètre à l'état gonflé compris entre 30 et 130 µm.

21. Système gélifié suivant la revendication 18, caractérisé en ce qu'il comporte en outre (d) une quatrième phase (4), dite de protection, qui (i) est une huile inerte de densité inférieure à celle de l'eau, de préférence une huile de paraffine, (ii) avant centrifugation, repose sur (a) ladite première phase (1) en l'absence de la seconde phase (2), ou (.beta.) ladite seconde phase (2) quand celle-ci est présente dans ledit système gélifié (10), et (iii) après centrifugation, repose sur l'eau dudit échantillon liquide (5).

22. Tube de centrifugation pourvu à son fond d'un capillaire, utile pour mettre en oeuvre le procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que ledit tube comporte une surface interne tronconique 20 reliant la partie cylindrique du tube au capillaire, l'angle a du cône étant inférieur à 30°, et en ce que la phase de révélation est logée dans la totalité du capillaire (7).

23. Tube de centrifugation selon la revendication 22 permettant la numération des bactéries présentes dans la phase de révélation et/ou la récupération de ladite phase de révélation.

24. Nécessaire de dosage, utile dans la mise en oeuvre du procédé
suivant l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'il comporte (A) au moins un tube de centrifugation à fond conique (6a) contenant un système gélifié constitué, de haut en bas, de la phase de protection (4), la phase d'absorption (2) et de la phase de révélation (1), un tube de centrifugation à fond sphérique (6b) contenant un système gélifié constitué, de haut en bas, de la phase de protection (4), de la phase d'absorption (2), de la phase de révélation (1) et de la phase barrière (3), ou un tube de centrifugation pourvu à son fond d'un capillaire 6c contenant un système gélifié constitué de la phase de révélation (1) logée dans le capillaire (7), une phase de protection (4) et/ou une phase d'absorption (2) reposant sur ladite phase de révélation (1); et/ou (B) des flacons contenant les matériaux constitutifs desdites phases, le réactifinduisant une variation de mesure optique détectable en présence de microorganismes, et au moins le milieu de culture pour le gonflement de ladite phase de révélation (1).

25. Utilisation du procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 13, ladite utilisation étant caractérisée en ce qu'elle comprend - la détection de la présence ou de l'absence de bactéries dans un échantillon de sang ou d'urine, notamment dans le domaine du screening des hémocultures et du screening urinaire ;
- l'identification d'une souche de microorganisme dans un échantillon biologique en utilisant au niveau de la phase de révélation (.alpha.) un réactifinduisant une variation de mesure optique détectable et (.beta.) un milieu de culture, qui sont spécifiques de ladite souche, - la numération des microorganismes présents dans la phase de révélation, - le recueil de la phase de révélation contenant des microorganismes en vue d'étudier ces derniers, ou - déterminer la résistance de souches de microorganismes vis-à-vis d'un ensemble d'antibiotiques usuels.