CA2295927A1 - Composition pour la conservation de quantites determinees et reproductibles de micro-organismes, et procede d'obtention - Google Patents
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Abstract
Composition pour la conservation de micro-organismes en quantités précises comprenant au moins une substance susceptible de former le squelette de pastilles lenticulées, au moins une substance saturante et des quantités déterminées et reproductibles de micro-organismes. Cette composition, sous la forme de pastilles, peut être utilisée comme matériau de référence pour le contrôle de fiabilité des méthodes microbiologiques ou pour le contrôle de fertilité des milieux de culture microbiologiques.
Description
Composition pour la conservation de quantités déterminées et reproductibles de micro-organismes, et procédé
d'obtention s La présente demande est relative à une composition pour la conservation de quantités déterminées et reproductibles de micro-organismes.
Elle est en outre relative à des pastilles lenticulées comprenant une telle composition.
io Elle a également pour objet un procédé de fabrication de ces pastilles.
La présence de benzène dans l'eau minérale Perrier, de Listeria dans !es fromages ou l'épizootie d'encéphalopathie spongiforme bovine ont eu un retentissement considérable. Les entreprises dans les ~s domaines de l'eau, de l'agro-alimentaire ou de la santé, positionnées sur des secteurs sensibles, ont des clients très attentifs à la qualité des produits qui leur sont fournis. Aussi, la prévention des situations de crise est-elle vitale. En effet, un incident, tel qu'une contamination, peut avoir des répercussions graves sur la santé des consommateurs et des 2o conséquences économiques désastreuses pour les entreprises (production gâchée, détérioration de l'image). De ce fait, le risque d'une contamination constitue une -préoccupation majeure pour les pouvoirs publics qui instaurent des contraintes réglementaires, nationales, européennes ou internationales, de plus en plus fortes en termes de 2s sécurité microbiologique et les industriels qui mettent en place des plans d'assurance qualité incluant en particulier la recherche des points critiques de contamination dans les procédés.
Aussi, de très nombreux laboratoires publics ou privés réalisent, chaque année, plusieurs milliers d'analyses chimiques et WO 99/00485 ~ PCT/FR98/01335 microbiologiques dans les domaines de l'agro-alimentaire, de l'environnement ou de la santé.
Des études interlaboratoires ont clairement démontré que les laboratoires travaillaient généralement avec une assez bonne précision s mais que des écarts importants existaient entre les résultats obtenus par les différents laboratoires.
Ainsi, des résultats par excès peuvent ëtre observés dans des laboratoires présentant des étuves mal réglées alors que des résultats par défaut sont observés dans des laboratoires utilisant des milieux de ~o culture de mauvaise qualité.
Ces résultats erronés peuvent avoir un impact économique ou sur la santé publique important. Les résultats par excès peuvent conduire à
refuser à tort un lot de produits, programmer inutilement, des travaux d'assainissement pour améliorer la qualité d'une plage, ou inquiéter sans i > raison la population en interdisant la consommation de l'eau du robinet.
Inversement, des résultats par défaut peuvent faire encourir un risque aux consommateurs en autorisant, la vente de produits contaminés, la distribution d'eau mal désinfectée ou la baignade dans une eau polluée.
2o Afin de garantir la fiabilité des mesures, il a été demandé aux laboratoires de contrôle d'être accrédités. Initialement, cette accréditation définissait uniquement des obligations de moyens (personnel qualifié, locaux adaptés, maintenance des appareils de mesure, contrôle des matières premières et écriture des procédures 2s analytiques). Actuellement, elfe exige en plus des obligations de résultats. Cette nouvelle exigence impose la mise en place d'un système de qualité comprenant des contrôles internes et la participation à des essais inter-laboratoires.
WO 99/00485 ' PCT/FR98/01335 Pour la mise sous contrôle des chaînes analytiques en interne et l'organisation d'essais inter-laboratoires, il est impératif de disposer de matériaux de référence. Ces matériaux de référence doivent être stables dans le temps et doivent permettre de reconstituer aisément des s échantillons de contrôle homogènes et renfermant une quantité précise du produit à doser.
En chimie, ces matériaux de référence existent depuis de nombreuses années. Par contre, dans le domaine de la microbiologie, il est particulièrement difficile de conserver des quantités précises de to micro-organismes. En effet, le nombre de micro-organismes peut augmenter, si ie milieu de conservation permet leur multiplication au cours de la fabrication , du transport ou du stockage, ou diminuer, s'ils meurent durant la fabrication, le transport, le stockage ou au moment de la reconstitution de l'échantillon contrôle avant l'emploi.
~ s Des méthodes de conservation de micro-organismes comme la lyophilisation et le cryoconservation ont déjà été décrites dans l'état de la technique. Néanmoins, ces méthodes entraînent, au moment du conditionnement, des taux de mortalité importants parmi les micro-organismes conservés, et en conséquence ne permettent pas de 2o maîtriser précisément la quantité finale de micro-organismes survivants.
Ainsi, deux brevets faisant appel à une méthode de congélation brutale en azote liquide ne décrivent pas la conservation de bactéries, ou de micro-organismes et n'abordent pas le problème des dosages quantitatifs.
2s Le brevet US- 5 364 756 décrit une méthode de cryoconservation de cellules eucaryotes. Une suspension de ces cellules est préparée dans un tampon comprenant des agents cryoprotecteurs, puis la solution est nébulisée par ultrasons afin de former des microgouttelettes qui sont rapidement refroidies et séchées.
Le brevet US-5 405 616 concerne la conservation de molécules pharmacologiquement actives. Les particules comprenant ces molécules sont constituées principalement d'une macromolécule hydrophile soluble dans l'eau formant un squelette. Diverses protéines sont mentionnées, s principalement des protéines d'origine végétale.
Des quantités précises de micro-organismes peuvent être obtenues à partir d'échantillons naturellement ou artificiellement contaminés. Cependant, la conservation de tels échantillons ne peut dépasser 24 heures et exige une température inférieure à 10°C.
~o Des quantités précises en diverses bactéries ont également été
obtenues après congélation dans un milieu contenant du sérum et de l'inositol (1993 Peterz et Steneryd, J. of Appl. Bacteriol., 74, 143-148) ou dans du lait écrémé ( 1994, Schijven, Havellaar et Bahar, Appl. and Environ. Microbiol., 60, 4160-4162). II s'avère cependant que ces i s suspensions bactériennes congelées ne sont pas stables au-delà de trois mois pour le premier type de préparation et d'un an pour le second.
De plus, elles exigent des conditions de transport très contraignantes (délais brefs et maintien de la température en dessous de -70°C). Enfin leur stabilité en cas de décongélation et de recongélation successives 2o n'a pas été démontrée.
Actuellement, seule l'atomisation réussit à concilier les contraintes de conservation, de stabilité et de transport avec l'exigence de disposer d'une quantité précise de micro-organismes.
Des suspensions de Bacilles cereus dans du lait concentré,
d'obtention s La présente demande est relative à une composition pour la conservation de quantités déterminées et reproductibles de micro-organismes.
Elle est en outre relative à des pastilles lenticulées comprenant une telle composition.
io Elle a également pour objet un procédé de fabrication de ces pastilles.
La présence de benzène dans l'eau minérale Perrier, de Listeria dans !es fromages ou l'épizootie d'encéphalopathie spongiforme bovine ont eu un retentissement considérable. Les entreprises dans les ~s domaines de l'eau, de l'agro-alimentaire ou de la santé, positionnées sur des secteurs sensibles, ont des clients très attentifs à la qualité des produits qui leur sont fournis. Aussi, la prévention des situations de crise est-elle vitale. En effet, un incident, tel qu'une contamination, peut avoir des répercussions graves sur la santé des consommateurs et des 2o conséquences économiques désastreuses pour les entreprises (production gâchée, détérioration de l'image). De ce fait, le risque d'une contamination constitue une -préoccupation majeure pour les pouvoirs publics qui instaurent des contraintes réglementaires, nationales, européennes ou internationales, de plus en plus fortes en termes de 2s sécurité microbiologique et les industriels qui mettent en place des plans d'assurance qualité incluant en particulier la recherche des points critiques de contamination dans les procédés.
Aussi, de très nombreux laboratoires publics ou privés réalisent, chaque année, plusieurs milliers d'analyses chimiques et WO 99/00485 ~ PCT/FR98/01335 microbiologiques dans les domaines de l'agro-alimentaire, de l'environnement ou de la santé.
Des études interlaboratoires ont clairement démontré que les laboratoires travaillaient généralement avec une assez bonne précision s mais que des écarts importants existaient entre les résultats obtenus par les différents laboratoires.
Ainsi, des résultats par excès peuvent ëtre observés dans des laboratoires présentant des étuves mal réglées alors que des résultats par défaut sont observés dans des laboratoires utilisant des milieux de ~o culture de mauvaise qualité.
Ces résultats erronés peuvent avoir un impact économique ou sur la santé publique important. Les résultats par excès peuvent conduire à
refuser à tort un lot de produits, programmer inutilement, des travaux d'assainissement pour améliorer la qualité d'une plage, ou inquiéter sans i > raison la population en interdisant la consommation de l'eau du robinet.
Inversement, des résultats par défaut peuvent faire encourir un risque aux consommateurs en autorisant, la vente de produits contaminés, la distribution d'eau mal désinfectée ou la baignade dans une eau polluée.
2o Afin de garantir la fiabilité des mesures, il a été demandé aux laboratoires de contrôle d'être accrédités. Initialement, cette accréditation définissait uniquement des obligations de moyens (personnel qualifié, locaux adaptés, maintenance des appareils de mesure, contrôle des matières premières et écriture des procédures 2s analytiques). Actuellement, elfe exige en plus des obligations de résultats. Cette nouvelle exigence impose la mise en place d'un système de qualité comprenant des contrôles internes et la participation à des essais inter-laboratoires.
WO 99/00485 ' PCT/FR98/01335 Pour la mise sous contrôle des chaînes analytiques en interne et l'organisation d'essais inter-laboratoires, il est impératif de disposer de matériaux de référence. Ces matériaux de référence doivent être stables dans le temps et doivent permettre de reconstituer aisément des s échantillons de contrôle homogènes et renfermant une quantité précise du produit à doser.
En chimie, ces matériaux de référence existent depuis de nombreuses années. Par contre, dans le domaine de la microbiologie, il est particulièrement difficile de conserver des quantités précises de to micro-organismes. En effet, le nombre de micro-organismes peut augmenter, si ie milieu de conservation permet leur multiplication au cours de la fabrication , du transport ou du stockage, ou diminuer, s'ils meurent durant la fabrication, le transport, le stockage ou au moment de la reconstitution de l'échantillon contrôle avant l'emploi.
~ s Des méthodes de conservation de micro-organismes comme la lyophilisation et le cryoconservation ont déjà été décrites dans l'état de la technique. Néanmoins, ces méthodes entraînent, au moment du conditionnement, des taux de mortalité importants parmi les micro-organismes conservés, et en conséquence ne permettent pas de 2o maîtriser précisément la quantité finale de micro-organismes survivants.
Ainsi, deux brevets faisant appel à une méthode de congélation brutale en azote liquide ne décrivent pas la conservation de bactéries, ou de micro-organismes et n'abordent pas le problème des dosages quantitatifs.
2s Le brevet US- 5 364 756 décrit une méthode de cryoconservation de cellules eucaryotes. Une suspension de ces cellules est préparée dans un tampon comprenant des agents cryoprotecteurs, puis la solution est nébulisée par ultrasons afin de former des microgouttelettes qui sont rapidement refroidies et séchées.
Le brevet US-5 405 616 concerne la conservation de molécules pharmacologiquement actives. Les particules comprenant ces molécules sont constituées principalement d'une macromolécule hydrophile soluble dans l'eau formant un squelette. Diverses protéines sont mentionnées, s principalement des protéines d'origine végétale.
Des quantités précises de micro-organismes peuvent être obtenues à partir d'échantillons naturellement ou artificiellement contaminés. Cependant, la conservation de tels échantillons ne peut dépasser 24 heures et exige une température inférieure à 10°C.
~o Des quantités précises en diverses bactéries ont également été
obtenues après congélation dans un milieu contenant du sérum et de l'inositol (1993 Peterz et Steneryd, J. of Appl. Bacteriol., 74, 143-148) ou dans du lait écrémé ( 1994, Schijven, Havellaar et Bahar, Appl. and Environ. Microbiol., 60, 4160-4162). II s'avère cependant que ces i s suspensions bactériennes congelées ne sont pas stables au-delà de trois mois pour le premier type de préparation et d'un an pour le second.
De plus, elles exigent des conditions de transport très contraignantes (délais brefs et maintien de la température en dessous de -70°C). Enfin leur stabilité en cas de décongélation et de recongélation successives 2o n'a pas été démontrée.
Actuellement, seule l'atomisation réussit à concilier les contraintes de conservation, de stabilité et de transport avec l'exigence de disposer d'une quantité précise de micro-organismes.
Des suspensions de Bacilles cereus dans du lait concentré,
2> atomisées et encapsulées dans de la gélatine, ont été utilisées comme matériaux de référence après transport à température ambiante (Paul H.
Int Veld, 1993, Int. J. of Food Microbiol.,20, 23-36).
Cependant, cette technique est d'une mise en oeuvre difficile car elle nécessite une dissolution de la gélatine dans un milieu de reconstitution maintenu à 37°C. De plus certaines espèces comme Aeromonas hydrophila, Pseudomonas aeruginosa et Campylobacter jejuni ne peuvent être conservées de manière stable par atomisation.
Cette méthode n'est pas non plus recommandée pour la conservation de s pathogènes du système respiratoire transmissibles par aérosols comme Legionella pneumophila. Enfin, les matériaux de référence préparés par atomisation ont un coût élevé.
II ressort donc de l'état de la technique que l'on ne connaissait pas de méthode facile à mettre en oeuvre et peu coûteuse permettant de o conserver de manière stable des quantités précises de micro-organismes.
Le demandeur a résolu ce problème en trouvant une composition particulière permettant de conserver la viabilité des micro-organismes.
La présente invention est donc relative à une composition pour la is conservation en quantités déterminées et reproductibles de micro-organismes comprenant en combinaison des quantités efficaces d'au moins une substance susceptible de former le squelette de pastilles lenticulées et d'au moins une substance saturante ainsi que des micro-organismes.
2o Pour la présente invention, on entend par quantités reproductibles de micro-organismes des variations du ratio entre deux mesures comprises, dans 95% des cas, entre 0,25 et 4 et encore plus préférentiellement entre 0,5 et 2 .
Ladite composition comprend entre environ 10 et 60%, de 2s substances susceptibles de former le squelette des pastilles lenticulées.
Préférentiellement on utilise un mélange d'albumine et d'amidon, contenant entre environ 20 et 40% d'albumine et entre environ 2 et 5%
d'amidon (en poids total de la composition). Après congélation et séchage ces molécules forment un squelette fortement poreux et en même temps mécaniquement stable, qui se dissout rapidement dans l'eau.
De manière avantageuse, l'albumine rentrant dans cette composition est de l'ovalbumine. L'ovalbumine peut être en particulier s sous la forme d'une préparation de blanc d'oeuf. Le blanc d'oeuf constitue un milieu stérile et riche en protéines protectrices au sein duquel il est possible de disperser de manière homogène les micro-organismes. Elle peut néanmoins être toute autre albumine (sérum albumine bovine), ou toute protéine, présentant la même fonction.
~o L'amidon peut être tout type d'amidon, et en particulier des amidons naturels ainsi que modifiés, des dextrines, des dextrines et de la maltodextrine. II peut être substitué par toute autre macromolécule hydrophile, en particulier des protéines végétales, ou leurs hydrolysats, des collagènes, des gélatines, de l'hydrolysat d'élastine ou des ~ s mélanges des substances précitées.
Ladite composition comprend également entre environ 40 et 90%
de substance saturante. La matière saturante peut être constituée d'un ou plusieurs sels ou sucres mélangés. Ces sels ou sucres peuvent être ajoutés sous forme de poudre, de saumure ou de sirop. En utilisant du ?o saccharose, préférentiellement entre environ 60 et 80%, la composition présente une activité en eau inférieure à 0,9. De ce fait, les dommages cellulaires occasionnés par la congélation et le séchage sont limités, et le développement des micro-organismes est empêché en particulier lors d'un transport éventuel à température ambiante.
2s Selon une mise en oeuvre de l'invention, la composition contient un ou plusieurs types de micro-organismes. Ils peuvent être des bactéries anaérobies strictes, aéro-anaérobies ou aérobies strictes, des bactéries psychrophiles, mésophifes ou thermophiles, des bactéries halophiles, des entérobactéries, des streptocoques, des staphylocoques, WO 99/00485 ~ PCT/FR98/01335 des bactéries pathogènes (Saimonella, Campylobacter, Yersinia, Listeria, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas, Vibrio, etc.), des levures ou des moisissures ou champignons, des bactériophages ou des virus, ou des kystes de protozoaires.
s De manière avantageuse la présente composition contient entre 102 et 10", et préférentiellement entre 102 et 109 micro-organismes par gramme. Une telle composition peut être avantageusement mise sous forme de pastilles, et en particulier de pastilles de forme lenticulée, présentant un diamètre compris entre 1 et 10 mrn.
~o De telles pastilles présentent avantageusement une masse comprise entre environ 1 et 250 mg, préférentiellement entre environ 2 et 100 mg et encore plus préférentiellement entre 10 et 25 mg.
Les pastilles selon la présente invention peuvent être avantageusement obtenues par un procédé de fabrication comprenant i ~ ies étapes suivantes:
a) incorporation des micro-organismes à la substance squelette;
b} diminution de l'activité en eau par ajout progressif de la substance saturante;
c) mise en forme des pastilles, et 2o d) séchage des pastilles sous vide et à une température inférieure à environ -10°C.
De manière préférentielle, le mélange est effectué de la manière suivante:
a) mélange de l'albumine et des micro-organismes;
2s b) ajout de l'amidon, puis c) ajout du saccharose.
Plusieurs modes de séchage sont envisageables.
Avantageusement, le séchage des pastilles est effectué dans un dessiccateur durant entre environ 12 heures et 10 jours.
WO 99/00485 $ PCT/FR98/01335 En vue d'une stabilité optimale, c'est-à-dire sur une durée de plus de 12 mois, les pastilles peuvent être stockées à -70°C en présence d'un sachet déshydratant. Elles peuvent néanmoins être conservées 3 mois à
-20°C et 4 jours à température ambiante, ce qui facilite notamment leur s transport puisqu'aucune condition particulière et compliquée de transport n'est requise.
Un milieu de reconstitution approprié pour la mise en oeuvre de l'invention doit limiter au maximum le choc osmotique au moment de la dissolution des pastilles. Une solution de sel de mer synthétique à 23 g/l io est recommandée comme reconstituant, car elle présente un niveau de récupération des micro-organismes plus élevé que les diluants habituellement employés en microbiologie que sont le Ringer, la peptone saline ou l'eau distillée. Une telle solution peut être celle commercialisée par la Société Aquarium Systems {MENTOR, OHIO, USA) sous ia ~s dénomination Instant Ocean, ou le milieu DSM commercialisé par la Société SANOFI PASTEUR (Marnes la Coquette, FRANCE).
La dissolution des pastilles doit s'effectuer à température ambiante. Si l'échantillon n'est pas analysé dans la demie heure qui suit la reconstitution, il est recommandé de le maintenir dans la glace ?o fondante, afin de garantir une bonne stabilité.
Ces pastilles contenant des micro-organismes stables dans le temps, homogènes et susceptibles d'ëtre reconstituées sous forme de suspension, de manière reproductible, c'est-à-dire avec des quantités variant faiblement d'un essai à l'autre constituent de véritables matériaux 2> de référence particulièrement adaptés au contrôle de la fiabilité des mesures (contrôle interne et externe de qualité) dans le domaine de la bactériologie des eaux, des boissons et des produits alimentaires en général de la pharmacie, de la cosmétique, et de l'environnement.
_._._-__~ ~_.__._ WO 99/00485 ~ PCT/FR98/01335 Ce type de matériau de référence peut également ëtre utilisé de façon avantageuse pour les « challenge tests » dans le domaine de l'agro-alimentaire. Pour cette utilisation particulière, les pastilles contiennent un ou plusieurs micro-organismes. Les pastilles peuvent être s directement introduites dans le produit à tester (barquette, sachet de salade, plat cuisiné, etc.). Les produits sont ensuite placés dans les conditions réelles de conservation et l'évolution de la contamination introduite de manière quantifiée dans les produits est suivie selon les méthodes de dénombrement habituelles.
~o Plus généralement, ce nouveau type de matériau de référence peut être utilisé pour l'analyse microbiologique quantitative:
- contrôle de présencelabsence de micro-organismes - contrôle de la fertilité des milieux de culture - contrôle d'efficacité d'antibiotiques, de substances bactéricides i > ou bactériostatiques, - contrôle de stérilisation (ultra-violets, chloration, ozonisation, filtration, etc.).
Selon un autre aspect de l'invention, les pastilles comprenant au moins un type de micro-organismes, peuvent ëtre avantageusement 2o utilisées dans certains produits en tant qu'agents de démarrage pour l'ensemencement des souches en vue de maîtriser un paramètre microbiologique crucial intervenant dans un procédé biotechnologique, et en particulier de fermentation.
Ainsi, des pastilles contenant certaines levures, telles que par 2s exemple S. cerevisae, S. calbergensis, S. ellipsoidus, peuvent être utilisées pour la fabrication du pain, de la bière haute et basse pression, du vin et autres alcools.
Les pastilles contenant des bactéries lactiques peuvent avantageusement être utilisées pour la fabrication de laits fermentés et WO 99/00485 ~ ~ PCT/FR98/01335 de yaourt, ainsi que dans l'industrie pharmaceutique pour la fabrication de produits destinés au réensemencement de la flore intestinale.
Des pastilles contenant des spores fongiques activées, peuvent ëtre utilisées directement ou après dilution à une teneur désirée en s micro-organismes, dans l'industrie alimentaire, en particulier en fromagerie ou en salaison. Lesdites compositions peuvent par exemple être répandues ou incorporées dans les produits à transformer tels les fromages ou les produits de salaison.
Ainsi, des pastilles contenant ceriains genres bactériens, tels que io par exemple Rhizobium, Pseudomonas, Bacillus, Arthrobacter, Serratia et Azospirillum, peuvent ëtre utilisées en agriculture et dans l'industrie de l'environnement.
La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples qui suivent.
is Les figures suivantes illustrent en outre la présente invention .
Les figures 1 et 2 illustrent la reconstitution de pastilles lenticulées contenant respectivement des bactéries Escherichia coli et Enterococcus faecalis, dans de l'eau distillée, du milieu de RINGER et du milieu DSM.
En ordonnées sont portées les valeurs Log (E. cols) pour la figure 20 7 et Log (E. faecalis) pour la figure 2.
La figure 3 est une analyse statistique des résultats de reconstitution obtenus avec Escherichia coli pour chacun des trois milieux de reconstitution. Cette figure illustre l'effet du milieu de reconstitution avec étude du rendement.
2s Les figures 4A à 4C illustrent la stabilité de pastilles lenticulées contenant Escherichia coli et stockées à respectivement +4°C, à -20°C
et à -70°C. Ainsi, les figures 4A et 4C, illustrent l'effet de la température de stockage avec étude de !a stabilité des matériaux de référence, avec .. .,... .. ....,_ ...__,...~ __...... __. .............._.__.~..e_....n. ..
._..
WO 99/00485 ~ ~ PCT/FR98/01335 pour la figure 4A E. coli conservé à + 4°C, pour la figure 4B E. coli conservé à -20°C et pour la figure 4C E.coli conservée à -70°C.
Les figures 5A et 5B illustrent la stabilité de pastilles lenticulées contenant Klebsiella planticola et stockées à respectivement + 4°C et à
-s 20°C. Ainsi, les figures 5A et 5B illustrent l'effet de la température de stockage avec étude de la stabilité des matériaux de référence avec pour la figure 5A Klebsiella planficola conservé à +4°C et pour la figure 5B Klebseilla planticola conservée à -20°C.
Les figures 6A à 6C illustrent fa stabilité de pastilles ~ o lenticulées contenant Staphylococcus aureus stockées respectivement à
+4°C, -20°C et -70°C.Ainsi, les figures 6A à 6C
illustrent l'effet de la température de stockage avec étude de la stabilité des matériaux de référence, cette figure correspondant à Staphylococcus aureus conservé
à + 4°C, -20°C et -70°C.
~s Les figures 7A à 7C illustrent la stabilité de pastilles lenticulées contenant Enferococcus faecalis stockées respectivement à +4°C, -20°C
et - 70°C.
Les figures 8A et 8B représentent les cartes de contrôle respectivement de la moyenne et de l'écart type obtenues pour le 2o dénombrement d'Escherichia coli sur une période de plus de 30 jours.
Les figures 9A et 9B représentent les cartes de contrôle respectivement de la moyenne et de l'écart type obtenues pour le dénombrement d'Enterococcus faecalis sur une période de plus de 30 fours.
2s Les figures 10A et 10B représentent les cartes de contrôle respectivement de la moyenne et de l'écart type obtenues pour S.
aureus sur une période de 30 semaines .
WO 99/00485 ~ ~ PCT/FR98/01335 Les figures 11A et 11B représentent les cartes de contrôle respectivement de la moyenne et de l'écart type obtenues pour Clostridium sporogenes sur une période de 30 semaines.
s EXEMPLE 1:
FABRICATION DE PASTILLES LENTICULEES.
1. Fabrication des pastilles Des bactéries, sous forme de bouillons de culture, ou de colonies remises en suspension dans 0,25 ml de milieu DSM sont mélangées to durant 3 min. dans 10 ml de blanc d'oeuf (environ 15g).
1,2g d'amidon sont alors ajoutés et l'ensemble est mélangé durant 30 secondes.
32g de sucre glace sont progressivement ajoutés tout en maintenant le brassage durant 7 min.
~s Enfin, le brassage est prolongé durant 3 mn sans ajout.
Le brassage est effectué pour ces différentes étapes dans un mixeur réglé à 700 tlmin.
La composition ainsi obtenue est alors répartie en gouttes sur une plaque plastique, à l'aide d'une seringue de 10 ml munie d'une aiguille 2o de 1,2 x 40mm.
La plaque est placée dans un dessiccateur, puis l'ensemble est mis sous vide et placé à -20°C durant 4 jours.
Les pastilles lenticulées, ou lenticules, ainsi obtenues sont récupérées puis stockées à + 4°C ou -20°C dans un flacon muni d'un ?s sachet dessiccateur.
_._...._~_...~_.._.~..
WO 99/00485 ~' PCT/FR98/01335 2. Echantillon bactérien L'échantillon bactérien peut être ajouté au mélange sous deux formes:
s - sous forme de bouillon;
- sous forme de colonies récupérées sur boîte.
L'échantillon sous forme de bouillon est utilisé lorsque la mortalité
après séchage a été jugée importante lors d'un premier essai de conditionnement sous forme de lenticules. En effet le bouillon permet ~o après centrifugation une concentration importante de bactéries difficilement réalisable avec des colonies.
L'échantillon sous forme de colonies a l'avantage d'être très facilement quantifiable. II est utilisé lorsque le taux de survie après séchage est jugé correct. Son utilisation implique l'ajout de 0,25 ml de is DSM, ce qui évite la modification des quantités vis-à-vis du mélange utilisant ie bouillon.
Int Veld, 1993, Int. J. of Food Microbiol.,20, 23-36).
Cependant, cette technique est d'une mise en oeuvre difficile car elle nécessite une dissolution de la gélatine dans un milieu de reconstitution maintenu à 37°C. De plus certaines espèces comme Aeromonas hydrophila, Pseudomonas aeruginosa et Campylobacter jejuni ne peuvent être conservées de manière stable par atomisation.
Cette méthode n'est pas non plus recommandée pour la conservation de s pathogènes du système respiratoire transmissibles par aérosols comme Legionella pneumophila. Enfin, les matériaux de référence préparés par atomisation ont un coût élevé.
II ressort donc de l'état de la technique que l'on ne connaissait pas de méthode facile à mettre en oeuvre et peu coûteuse permettant de o conserver de manière stable des quantités précises de micro-organismes.
Le demandeur a résolu ce problème en trouvant une composition particulière permettant de conserver la viabilité des micro-organismes.
La présente invention est donc relative à une composition pour la is conservation en quantités déterminées et reproductibles de micro-organismes comprenant en combinaison des quantités efficaces d'au moins une substance susceptible de former le squelette de pastilles lenticulées et d'au moins une substance saturante ainsi que des micro-organismes.
2o Pour la présente invention, on entend par quantités reproductibles de micro-organismes des variations du ratio entre deux mesures comprises, dans 95% des cas, entre 0,25 et 4 et encore plus préférentiellement entre 0,5 et 2 .
Ladite composition comprend entre environ 10 et 60%, de 2s substances susceptibles de former le squelette des pastilles lenticulées.
Préférentiellement on utilise un mélange d'albumine et d'amidon, contenant entre environ 20 et 40% d'albumine et entre environ 2 et 5%
d'amidon (en poids total de la composition). Après congélation et séchage ces molécules forment un squelette fortement poreux et en même temps mécaniquement stable, qui se dissout rapidement dans l'eau.
De manière avantageuse, l'albumine rentrant dans cette composition est de l'ovalbumine. L'ovalbumine peut être en particulier s sous la forme d'une préparation de blanc d'oeuf. Le blanc d'oeuf constitue un milieu stérile et riche en protéines protectrices au sein duquel il est possible de disperser de manière homogène les micro-organismes. Elle peut néanmoins être toute autre albumine (sérum albumine bovine), ou toute protéine, présentant la même fonction.
~o L'amidon peut être tout type d'amidon, et en particulier des amidons naturels ainsi que modifiés, des dextrines, des dextrines et de la maltodextrine. II peut être substitué par toute autre macromolécule hydrophile, en particulier des protéines végétales, ou leurs hydrolysats, des collagènes, des gélatines, de l'hydrolysat d'élastine ou des ~ s mélanges des substances précitées.
Ladite composition comprend également entre environ 40 et 90%
de substance saturante. La matière saturante peut être constituée d'un ou plusieurs sels ou sucres mélangés. Ces sels ou sucres peuvent être ajoutés sous forme de poudre, de saumure ou de sirop. En utilisant du ?o saccharose, préférentiellement entre environ 60 et 80%, la composition présente une activité en eau inférieure à 0,9. De ce fait, les dommages cellulaires occasionnés par la congélation et le séchage sont limités, et le développement des micro-organismes est empêché en particulier lors d'un transport éventuel à température ambiante.
2s Selon une mise en oeuvre de l'invention, la composition contient un ou plusieurs types de micro-organismes. Ils peuvent être des bactéries anaérobies strictes, aéro-anaérobies ou aérobies strictes, des bactéries psychrophiles, mésophifes ou thermophiles, des bactéries halophiles, des entérobactéries, des streptocoques, des staphylocoques, WO 99/00485 ~ PCT/FR98/01335 des bactéries pathogènes (Saimonella, Campylobacter, Yersinia, Listeria, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas, Vibrio, etc.), des levures ou des moisissures ou champignons, des bactériophages ou des virus, ou des kystes de protozoaires.
s De manière avantageuse la présente composition contient entre 102 et 10", et préférentiellement entre 102 et 109 micro-organismes par gramme. Une telle composition peut être avantageusement mise sous forme de pastilles, et en particulier de pastilles de forme lenticulée, présentant un diamètre compris entre 1 et 10 mrn.
~o De telles pastilles présentent avantageusement une masse comprise entre environ 1 et 250 mg, préférentiellement entre environ 2 et 100 mg et encore plus préférentiellement entre 10 et 25 mg.
Les pastilles selon la présente invention peuvent être avantageusement obtenues par un procédé de fabrication comprenant i ~ ies étapes suivantes:
a) incorporation des micro-organismes à la substance squelette;
b} diminution de l'activité en eau par ajout progressif de la substance saturante;
c) mise en forme des pastilles, et 2o d) séchage des pastilles sous vide et à une température inférieure à environ -10°C.
De manière préférentielle, le mélange est effectué de la manière suivante:
a) mélange de l'albumine et des micro-organismes;
2s b) ajout de l'amidon, puis c) ajout du saccharose.
Plusieurs modes de séchage sont envisageables.
Avantageusement, le séchage des pastilles est effectué dans un dessiccateur durant entre environ 12 heures et 10 jours.
WO 99/00485 $ PCT/FR98/01335 En vue d'une stabilité optimale, c'est-à-dire sur une durée de plus de 12 mois, les pastilles peuvent être stockées à -70°C en présence d'un sachet déshydratant. Elles peuvent néanmoins être conservées 3 mois à
-20°C et 4 jours à température ambiante, ce qui facilite notamment leur s transport puisqu'aucune condition particulière et compliquée de transport n'est requise.
Un milieu de reconstitution approprié pour la mise en oeuvre de l'invention doit limiter au maximum le choc osmotique au moment de la dissolution des pastilles. Une solution de sel de mer synthétique à 23 g/l io est recommandée comme reconstituant, car elle présente un niveau de récupération des micro-organismes plus élevé que les diluants habituellement employés en microbiologie que sont le Ringer, la peptone saline ou l'eau distillée. Une telle solution peut être celle commercialisée par la Société Aquarium Systems {MENTOR, OHIO, USA) sous ia ~s dénomination Instant Ocean, ou le milieu DSM commercialisé par la Société SANOFI PASTEUR (Marnes la Coquette, FRANCE).
La dissolution des pastilles doit s'effectuer à température ambiante. Si l'échantillon n'est pas analysé dans la demie heure qui suit la reconstitution, il est recommandé de le maintenir dans la glace ?o fondante, afin de garantir une bonne stabilité.
Ces pastilles contenant des micro-organismes stables dans le temps, homogènes et susceptibles d'ëtre reconstituées sous forme de suspension, de manière reproductible, c'est-à-dire avec des quantités variant faiblement d'un essai à l'autre constituent de véritables matériaux 2> de référence particulièrement adaptés au contrôle de la fiabilité des mesures (contrôle interne et externe de qualité) dans le domaine de la bactériologie des eaux, des boissons et des produits alimentaires en général de la pharmacie, de la cosmétique, et de l'environnement.
_._._-__~ ~_.__._ WO 99/00485 ~ PCT/FR98/01335 Ce type de matériau de référence peut également ëtre utilisé de façon avantageuse pour les « challenge tests » dans le domaine de l'agro-alimentaire. Pour cette utilisation particulière, les pastilles contiennent un ou plusieurs micro-organismes. Les pastilles peuvent être s directement introduites dans le produit à tester (barquette, sachet de salade, plat cuisiné, etc.). Les produits sont ensuite placés dans les conditions réelles de conservation et l'évolution de la contamination introduite de manière quantifiée dans les produits est suivie selon les méthodes de dénombrement habituelles.
~o Plus généralement, ce nouveau type de matériau de référence peut être utilisé pour l'analyse microbiologique quantitative:
- contrôle de présencelabsence de micro-organismes - contrôle de la fertilité des milieux de culture - contrôle d'efficacité d'antibiotiques, de substances bactéricides i > ou bactériostatiques, - contrôle de stérilisation (ultra-violets, chloration, ozonisation, filtration, etc.).
Selon un autre aspect de l'invention, les pastilles comprenant au moins un type de micro-organismes, peuvent ëtre avantageusement 2o utilisées dans certains produits en tant qu'agents de démarrage pour l'ensemencement des souches en vue de maîtriser un paramètre microbiologique crucial intervenant dans un procédé biotechnologique, et en particulier de fermentation.
Ainsi, des pastilles contenant certaines levures, telles que par 2s exemple S. cerevisae, S. calbergensis, S. ellipsoidus, peuvent être utilisées pour la fabrication du pain, de la bière haute et basse pression, du vin et autres alcools.
Les pastilles contenant des bactéries lactiques peuvent avantageusement être utilisées pour la fabrication de laits fermentés et WO 99/00485 ~ ~ PCT/FR98/01335 de yaourt, ainsi que dans l'industrie pharmaceutique pour la fabrication de produits destinés au réensemencement de la flore intestinale.
Des pastilles contenant des spores fongiques activées, peuvent ëtre utilisées directement ou après dilution à une teneur désirée en s micro-organismes, dans l'industrie alimentaire, en particulier en fromagerie ou en salaison. Lesdites compositions peuvent par exemple être répandues ou incorporées dans les produits à transformer tels les fromages ou les produits de salaison.
Ainsi, des pastilles contenant ceriains genres bactériens, tels que io par exemple Rhizobium, Pseudomonas, Bacillus, Arthrobacter, Serratia et Azospirillum, peuvent ëtre utilisées en agriculture et dans l'industrie de l'environnement.
La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples qui suivent.
is Les figures suivantes illustrent en outre la présente invention .
Les figures 1 et 2 illustrent la reconstitution de pastilles lenticulées contenant respectivement des bactéries Escherichia coli et Enterococcus faecalis, dans de l'eau distillée, du milieu de RINGER et du milieu DSM.
En ordonnées sont portées les valeurs Log (E. cols) pour la figure 20 7 et Log (E. faecalis) pour la figure 2.
La figure 3 est une analyse statistique des résultats de reconstitution obtenus avec Escherichia coli pour chacun des trois milieux de reconstitution. Cette figure illustre l'effet du milieu de reconstitution avec étude du rendement.
2s Les figures 4A à 4C illustrent la stabilité de pastilles lenticulées contenant Escherichia coli et stockées à respectivement +4°C, à -20°C
et à -70°C. Ainsi, les figures 4A et 4C, illustrent l'effet de la température de stockage avec étude de !a stabilité des matériaux de référence, avec .. .,... .. ....,_ ...__,...~ __...... __. .............._.__.~..e_....n. ..
._..
WO 99/00485 ~ ~ PCT/FR98/01335 pour la figure 4A E. coli conservé à + 4°C, pour la figure 4B E. coli conservé à -20°C et pour la figure 4C E.coli conservée à -70°C.
Les figures 5A et 5B illustrent la stabilité de pastilles lenticulées contenant Klebsiella planticola et stockées à respectivement + 4°C et à
-s 20°C. Ainsi, les figures 5A et 5B illustrent l'effet de la température de stockage avec étude de la stabilité des matériaux de référence avec pour la figure 5A Klebsiella planficola conservé à +4°C et pour la figure 5B Klebseilla planticola conservée à -20°C.
Les figures 6A à 6C illustrent fa stabilité de pastilles ~ o lenticulées contenant Staphylococcus aureus stockées respectivement à
+4°C, -20°C et -70°C.Ainsi, les figures 6A à 6C
illustrent l'effet de la température de stockage avec étude de la stabilité des matériaux de référence, cette figure correspondant à Staphylococcus aureus conservé
à + 4°C, -20°C et -70°C.
~s Les figures 7A à 7C illustrent la stabilité de pastilles lenticulées contenant Enferococcus faecalis stockées respectivement à +4°C, -20°C
et - 70°C.
Les figures 8A et 8B représentent les cartes de contrôle respectivement de la moyenne et de l'écart type obtenues pour le 2o dénombrement d'Escherichia coli sur une période de plus de 30 jours.
Les figures 9A et 9B représentent les cartes de contrôle respectivement de la moyenne et de l'écart type obtenues pour le dénombrement d'Enterococcus faecalis sur une période de plus de 30 fours.
2s Les figures 10A et 10B représentent les cartes de contrôle respectivement de la moyenne et de l'écart type obtenues pour S.
aureus sur une période de 30 semaines .
WO 99/00485 ~ ~ PCT/FR98/01335 Les figures 11A et 11B représentent les cartes de contrôle respectivement de la moyenne et de l'écart type obtenues pour Clostridium sporogenes sur une période de 30 semaines.
s EXEMPLE 1:
FABRICATION DE PASTILLES LENTICULEES.
1. Fabrication des pastilles Des bactéries, sous forme de bouillons de culture, ou de colonies remises en suspension dans 0,25 ml de milieu DSM sont mélangées to durant 3 min. dans 10 ml de blanc d'oeuf (environ 15g).
1,2g d'amidon sont alors ajoutés et l'ensemble est mélangé durant 30 secondes.
32g de sucre glace sont progressivement ajoutés tout en maintenant le brassage durant 7 min.
~s Enfin, le brassage est prolongé durant 3 mn sans ajout.
Le brassage est effectué pour ces différentes étapes dans un mixeur réglé à 700 tlmin.
La composition ainsi obtenue est alors répartie en gouttes sur une plaque plastique, à l'aide d'une seringue de 10 ml munie d'une aiguille 2o de 1,2 x 40mm.
La plaque est placée dans un dessiccateur, puis l'ensemble est mis sous vide et placé à -20°C durant 4 jours.
Les pastilles lenticulées, ou lenticules, ainsi obtenues sont récupérées puis stockées à + 4°C ou -20°C dans un flacon muni d'un ?s sachet dessiccateur.
_._...._~_...~_.._.~..
WO 99/00485 ~' PCT/FR98/01335 2. Echantillon bactérien L'échantillon bactérien peut être ajouté au mélange sous deux formes:
s - sous forme de bouillon;
- sous forme de colonies récupérées sur boîte.
L'échantillon sous forme de bouillon est utilisé lorsque la mortalité
après séchage a été jugée importante lors d'un premier essai de conditionnement sous forme de lenticules. En effet le bouillon permet ~o après centrifugation une concentration importante de bactéries difficilement réalisable avec des colonies.
L'échantillon sous forme de colonies a l'avantage d'être très facilement quantifiable. II est utilisé lorsque le taux de survie après séchage est jugé correct. Son utilisation implique l'ajout de 0,25 ml de is DSM, ce qui évite la modification des quantités vis-à-vis du mélange utilisant ie bouillon.
3. Séchage du lot de pastilles.
2o Un essai de séchage à différentes températures d'un même lot de lenticule d'E.coli a été effectué.
Mode opératoire:
- 10 gouttes d'un même lot de fabrication sont placées pour 2s séchage à +44°C
- 10 autres gouttes sont placées pour séchage sous hotte à flux laminaire à température ambiante.
- les 10 dernières gouttes sont placées à -20°C à l'intérieur d'un dessiccateur dans lequel le vide a été réalisé.
WO 99/00485 ~ '~ PCT/FR98/01335 Après 2 jours de séchage, les lenticules sont reconstituées dans un tube de 9 ml de milieu de RINGER.
ml de chacun des tubes sont ensuite filtrés sur milieu Tergitol TTC (AFNOR T 90-414).
s Résultats Les résultats sont exprimés dans le tableau 1 ci-après.
Ces résultats montrent que le séchage à -20°C à l'intérieur d'un dessiccateur sous vide permet d'obtenir une viabilité supérieure aux ~o autres méthodes de séchage.
RECONSTITUTION DE SOLUTIONS BACTERIENNES A
PARTIR DES PASTILLES LENTICULEES.
~s 1. Stabilité de l'échantillon reconstitué à température ambiante.
aJi E.coli ( souche WR~ disponible auprès de la Collection Hollandaise RIVM).
Mode ouératoire:
20 - 4 lenticules d'E. coli obtenues selon l'exemple 1 sont placées respectivement dans des tubes contenant les milieux reconstituants DSM, RINGER et Eau Distillée Stérile;
- 2 ml de chaque tube sont ensuite versés à différents intervalles de temps (0, 10, 20, 40 minutes) dans un flacon (type Pasteur microbio) 2s contenant 400 ml d'eau du robinet.
Les résultats sont résumés dans la figure 1.
- 2 répliquats de filtration sont effectués sur chaque flacon (filtration automatique de 100 ml sur automate SARAH).
On remarque pour E. colis T ... _.~
WO 99/00485 ~ 5 PCT/FR98/01335 - Une stabilité dans chacun des reconstituants;
- Un nombre de colonies beaucoup plus important (environ 10 fois plus) pour la lenticule reconstituée dans le DSM par rapport aux deux autres lenticules reconstituées respectivement dans le RINCER et dans s l'Eau Distillée Stérile.
by Enterococcus faecalis.
(souche disponible auprès de la Collection Tchèque CCM sous le n°
2541 ).
io Mode opératoire:
- une lenticule d'Enterococcus faecalis obtenue selon l'exemple 1 est placée dans un tube de chaque reconstituant (DSM, RINCER, Eau Distillée Stérile);
~s - 1 ml de chaque tube est ensuite versé à différents intervalles de temps (O, 10, 20, 40 minutes) dans un flacon (type Pasteur microbio) contenant 400 ml d'eau du robinet;
- 2 répliquats de filtration sont effectués sur chaque flacon (filtration automatique de 100 ml sur automate SARAH).
2o La figure 2 illustre les résultats obtenus.
On remarque donc pour Enterococcus faecalis:
~ dans de l'eau distillée stérile, une chute rapide du nombre de colonies récupérées en fonction du temps de contact de la lenticule avec le reconstituant (passage de 55 à 0 colonies récupérées en 20 minutes).
2s ~ dans le RINCER, une chute lente du nombre de colonies récupérées en fonction du temps de contact de ia lenticule avec le reconstituant (passage de 47 à 15 colonies récupérées en 40 minutes).
WO 99/00485 ~ 6 PCT/FR98/01335 ~ dans le DSM, une stabilité du nombre de colonies récupérées en fonction du temps avec un niveau de récupération beaucoup pius élevé.
2. Rendement des différents reconstituants Ces essais ont pour but de montrer que le milieu DSM permet une meilleure récupération de colonies par rapport à d'autres diluants comme le RINCER ou l'eau distillée stérile.
io Mode opératoire:
-10 comprimés d'E.coli obtenus selon l'exemple 1 sont reconstitués dans chacun des trois reconstituants (DSM, RINCER, eau distillée stérile).
- L'ensemble des tubes est placé à +4°C (eau + Ice Pack~) pour i s éviter tout effet de température, - Le contenu de chaque tube est intégralement déversé dans un flacon de 400 ml d'eau du robinet (flacon de type Pasteur microbio), - Tous les flacons sont ensuite filtrés par filtration automatique de 100 ml sur l'automate SARAH.
Résultats:
Ces résultats sont résumés dans la figure 3.
On note que - Pour le DSM, on récupère en moyenne environ 22 colonies par 2, filtration;
- Pour le RINCER, on récupère en moyenne environ 7 colonies par filtration;
- Pour l'eau distillée stérile, on récupère en moyenne environ 3 colonies par filtration.
T_ _ ...._......_-..~_.,_.._...__..._.....__.......
WO 99/00485 ~ ~ PCT/FR98/01335 Ainsi, pour le mëme lot de lenticules d'E. Coli , on récupère environ 3 fois plus de colonies lorsque le DSM est utilisé comme reconstituant par rapport au RINGER, et environ 7 fois plus de colonies par rapport à l'eau distillée stérile.
s Ces résultats (2.1 et 2.2) montrent donc que le DSM offre une meilleure stabilité et un meilleur rendement lors de ta reconstitution des lenticules.
Chacune des manipulations effectuées à l'aide de lenticules doit être préférentiellement effectuée à froid (pour une stabilité garantie au-io delà de 40 minutes) et en milieu DSM.
EXEMPLE 3:
VALIDATION DES LOTS DE LENTICULES
Cinq souches d'Escherichia coli, de Klebsiella planticola (souche ~ s disponible auprès de l'ATCC sous le n° 33.531 ), d'Enterococcus faecalis, de Straphylococcus aureus, et Clostridium sporogenes ont été
conditionnées sous forme de lenticules, tel que décrit dans l'exemple 1.
Mode opératoire:
2o La validation s'effectue en dénombrant 30 lenticules après séchage.
Chacune des lenticules est déposée dans un tube contenant 9 ml de DSM.
Les tubes précédemment à température ambiante sont placés à
2s +4°C (Bain d'eau + Ice Pack) dès que fa lenticule s'est dissoute dans le DSM (dissolution au Vortex~).
Une dissolution est effectuée lorsque la concentration de la lenticule est trop importante.
On filtre ensuite 5 ml de chacune des dilutions.
WO 99/00485 ~ g PCT/FR98/01335 Résultats:
Les résultats sont contenus dans le tableau 2 ci-après. Ces résultats montrent que pour tous les germes étudiés, le coefficient de s reproductibilité {SR) est inférieur à 0,20 en unités logarythmiques. SR
mesure la variabilité des résultats obtenus quand les mesures sont effectuées sur des pastilles différentes au sein d'un même laboratoire.
EXEMPLE 4:
STABIL1TE DES LOTS STOCKES.
Mode opératoire:
Les lenticuies sont conservées à + 4°C, -20°C ou -70°C
dans des flacons munis d'un sachet dessiccateur (un même lot est séparé en deux quantités identiques, stockées à deux températures différentes).
ts Chaque jour deux lenticules sont testées , cela pour chaque lot et pour chacune des températures de conservation (+4°C, - 20°C et -70°C).
Chaque lenticule est placée dans un tube contenant 10 ml de DSM, celle-ci est dissoute au Vortex~ à température ambiante. Les échantillons ainsi reconstitués sont placés à + 4°C avant la filtration.
2o La filtration s'effectue en deux répliquats de 5 ml pour chaque lenticule.
On a ainsi chaque jour la somme de quatre dénombrements pour chacune des deux températures de conservation ( + 4°C, - 20°C et - 70°C).
2s C'est le suivi de cette valeur qui permet d'établir la droite de régression permettant la visualisation de l'évolution dans le temps du lot.
Résultats:
Les résultats de stabilité sont représentés sous forme de droites de régression pour ___ _...__.T. ._.__ ~~._.._._ _.__.....__.._.
WO 99/00485 ~ 9 PCT/FR98/01335 ~ E. coli (Figs. 4A, 4B et 4C);
~ K. planticola (Figs.5A, 5B ) ~ S. aureus (Figs. 6A, 6B et 6C) ~ E.faecalis (Figs.7A, 7B, 7C).
s Les pentes nulles obtenues par régression linéaire montrent que pour les quatre germes étudiés, les lots sont stables au moins:
~ 1 semaine à +4°C:
~ 3 mois à - 20°C;
~ 1 an à - 70°C.
~ o Ces stabilités sont tout à fait compatibles avec une utilisation industrielle.
EXEMPLE 5:
Utilisation des pastilles lenticulées en tant que matériau de > > référence.
Les matériaux de référence peuvent être utilisés pour le contrôle de fertilité des milieux de culture, la maîtrise statistique des procédés et les essais d'aptitude par comparaison entre laboratoires.
1. Contrôle de la fertilité des milieux de culture.
Les normes AFNOR T90-432 et T90-433 imposent des critères de qualité pour la fabrication du milieu de culture en microplaque.
Le contrôle de qualité doit porter sur chaque lot de microplaques 2s fabriquées. Les microplaques à tester sont prélevées de manière aléatoire ou systématique afin de constituer un échantillon selon la norme AFNOR NFX 06-023, en respectant le niveau normal de prélèvement (9 microplaques contrôlées pour une taille de lot de 1000 microplaques fabriquées).
WO 99/00485 ~U PCT/FR98/01335 La fertilité du milieu de culture est mesurée par le rapport entre le nombre de micro-organismes observés avec le lot de microplaques testées et le nombre de micro-organismes attendus avec un matériau de référence stable (valeur-cible). Le niveau de concentration à mettre en s oeuvre après reconstitution du matériau de référence doit se situer autour du maximum de précision de la méthode, soit environ 500 germes/100 ml. Les seuils d'acceptation du lot de microplaques en essai sont : 0,66 à 1,50 fois la valeur-cible (66% < rendement (%) < 150%).
La souche à tester pour la norme T90-433 est E. coli WR1.
~ o Les souches à tester pour la norme T90-432 sont E. faecium WR63, E. faecalis CCM 2541 et E. hirae CCM 2423 Les tableaux 3 à 6 rapportent pour chacune des souches les résultats de fertilité obtenus sur la fabrication de microplaques de 1997.
Ils montrent une parfaite maîtrise de la fabrication par le producteur. En ~s effet, 90% des lots fabriqués répondent au critère de fertilité fixé dans les normes.
2. Maîtrise statistigue des procédés (contrôle interne de la ualité .
Avant la mise en place du contrôle interne de la qualité, le laboratoire doit étalonner sa chaîne analytique. Pour cela, afin de tenir compte des résultats obtenus dans les exemples précédents, les protocoles suivants ont été arrêtés:
~s Protocole de reconstitution des matériaux de référence:
~ Sortir le (s) tubes) du congélateur.
_ ._ ~_~_ WO 99/00485 2 ~ PCT/FR98/01335 ~ A l'aide d'une pince stérile, prélever la (les) pastilles) nécessaires) au contrôle (pastilles lenticulées fabriquées comme décrit dans l'exemple 1 ).
~ Replacer immédiatement le(s) tubes) au congélateur.
Laisser la (les) pastilles) 15 minutes à température ambiante.
~ Plonger chaque pastille dans un tube contenant 18 ml de diluant spécial pastille (suspension mère).
~ Laisser 15 minutes à température ambiante sans agiter.
~ Agiter doucement le(s) tubes} durant 30 secondes.
~o ~ Si les ensemencements ne sont pas réalisés dans l'heure qui suit la reconstitution, conserver le(s) tubes) de suspension mère dans la glace fondante (garantie d'une stabilité de quatre heures).
Protocole de préparation du diluant spécial pastilles:
is - Dissoudre 22,5g de sels marins (Instant Ocean) dans 1 litre d'eau distillée, - vérifier la salinité (20+/-3 pour 1000) ou la conductivité (25000 +/-4000 uS.cm-1}, - ajuster le pH (7.9+/-0.5).
20 - répartir en tubes de 18 ml.
- autoclaver à 120°C pendant 15 minutes.
Protocole de calibration:
~ Utiliser la suspension mère:
2s - Les pastilles 1 et 2 : filtrer 0.5 ml, - Les pastilles 3 et 4: filtrer 1.0 ml, - Les pastilles 5 et 6: filtrer 2.0 ml, - Les pastilles 7 et 8: filtrer 4.0 ml, - Les pastilles 9 et 10: filtrer 8.0 ml.
WO 99/00485 ~2 PCT/FR98/01335 ~ Vérifier la linéarité des résultats par régression linéaire. A partir de l'équation de la droite de régression, déterminer le volume de filtration à préconiser pour chaque matériau de manière à obtenir 25 colonies sur la membrane.
s Une fois centré sur cette valeur cible de 25 colonies, le laboratoire doit mettre en place, afin de déceler des dérives, des décentrages, des problèmes de répétabilité ou de reproductibilité, son contrôle interne.
Selon l'activité analytique du laboratoire, ce contrôle interne assure:
~ Une couverture journalière:
~o Les gros laboratoires réalisant une centaine d'analyses par jour peuvent tester 4 pastilles chaque jour. Les figures 8A et 8B; 9A et 9B
représentent les cartes de contrôle de la moyenne et de l'écart type obtenues en routine avec des pastilles selon l'invention contenant E. coli et E. faecalis sur une période de 30 jours.
is ~ Une couverture hebdomadaire:
Les petits laboratoires réalisant une centaine d'analyses par semaine peuvent tester 5 pastilles chaque semaine à raison d'une pastille par jour. Les figures 10A et 10B et 11A et 11B, représentent les cartes de contrôle de la moyenne et de l'écart type obtenues en routine 2o avec des pastilles selon l'invention contenant S. aureus et C.
sporogenes sur une période de 30 semaines.
Grâce à ce type de contrôle interne les laboratoires de microbiologie disposent maintenant d'un système d'alerte en temps réel (couverture quotidienne) ou en temps différé (couverture hebdomadaire) 2s avec possibilité de sélectionner les causes d'erreurs et mettre en place les actions correctives.
_ ___._._ WO 99/00485 2' PCT/FR98/01335 3. Essais d'aptitude des laboratoires par intercomloaraison contrôle externe de la qualité).
Un essai d'aptitude consiste à utiliser des intercomparaisons pour s déterminer la performance d'un laboratoire en matière d'essais ou de mesurages. La participation à des systèmes d'essais d'aptitude donne aux laboratoires un moyen objectif d'évaluer et de démontrer la fiabilité
des données qu'ils produisent. Les laboratoires complètent ainsi les procédures internes de maîtrise de la qualité en fournissant une mesure ~o externe supplémentaire de leurs compétences en matières d'essais.
L'Association Générale des Laboratoires d'Analyse de l'Environnement (A.G.L.A.E.) a organisé en Avril 98 un essai interlaboratoires regroupant 55 laboratoires français (métropole et départements d'Outre-mer). Des pastilles fabriquées comme décrit dans ~ s l'exemple 1 ont été utilisées comme matériau d'essai.
Les résultats obtenus lors d'un dénombrement des entérocoques sur un lot de pastilles contenant Enterococcus faecalis sont résumés dans le tableau 7.
Dans le tableau 7 ci-après, S" mesure la variabilité des résultats 20 obtenus quand les mesures sont effectuées sur la même pastille au sein d'un même laboratoire.
r correspond à la variabilité des résultats obtenus quand les mesures sont efiFectuées sur des pastilles différentes au sein d'un même laboratoire.
2s R mesure la variabilité des résultats obtenus quand les mesures sont effectuées sur des pastilles différentes et par différents laboratoires.
La valeur de 0,10 obtenue pour S" montre que les pastilles se dissolvent de manière homogène.
WO 99/00485 '4 La valeur de 0,18 obtenue pour r montre la bonne homogénéité
du lot de pastilles.
La valeur de 0,3 obtenue pour R est une valeur comparable aux résultats habituellement obtenus dans ce type d'essai inter-laboratoires, s et valide donc cette technique (stabilité des pastilles lors du transfert et mise en oeuvre aisée dans les laboratoires).
L'intérêt de la présente invention dans le cadre de ces essais inter-laboratoires réside dans la possibilité de conserver, même à
température ambiante, les pastilles. Ainsi, les essais inter-laboratoires ~o effectués les années précédentes nécessitaient de fournir à chaque laboratoire un échantillon consistant en un litre d'eau artificiellement contaminé. Cet échantillon devait donc parvenir en quelques heures à
chaque laboratoire, afin d'être certain que tous les laboratoires travaillaient dans les mêmes conditions.
is Les pastilles selon la présente invention permettent de résoudre ce problème et facilitent l'organisation de ce type d'essai.
Schage Nombre moyen de colonies sur 10 botes + 44C 24 sous hotte flux laminaire > 100 - 20C > 100 (*) (*) Boîtes deux fois plus chargées qu'à température ambiante.
WO 99/00485 ~~ PCT/FR98/01335 E.co K.planticolaE.faecalisS.aureus C.sporogenes Mirai= 8 6 8 28 8 Moyenne 24 22 18 61 19 =
Maxi= 70 83 38 135 44 SR 0,16 0,19 0,11 0,11 0,12 FERTILITE DES MICROPLAQUES MUIEC (SANOFI DIAGNOSTICS
PASTEUR) Lots de micropfaques E. coli NlR1/100 Rendement {%) Contrle ml 1 603 118% Accept 2 633 124% Accept 3 522 102% Accept
2o Un essai de séchage à différentes températures d'un même lot de lenticule d'E.coli a été effectué.
Mode opératoire:
- 10 gouttes d'un même lot de fabrication sont placées pour 2s séchage à +44°C
- 10 autres gouttes sont placées pour séchage sous hotte à flux laminaire à température ambiante.
- les 10 dernières gouttes sont placées à -20°C à l'intérieur d'un dessiccateur dans lequel le vide a été réalisé.
WO 99/00485 ~ '~ PCT/FR98/01335 Après 2 jours de séchage, les lenticules sont reconstituées dans un tube de 9 ml de milieu de RINGER.
ml de chacun des tubes sont ensuite filtrés sur milieu Tergitol TTC (AFNOR T 90-414).
s Résultats Les résultats sont exprimés dans le tableau 1 ci-après.
Ces résultats montrent que le séchage à -20°C à l'intérieur d'un dessiccateur sous vide permet d'obtenir une viabilité supérieure aux ~o autres méthodes de séchage.
RECONSTITUTION DE SOLUTIONS BACTERIENNES A
PARTIR DES PASTILLES LENTICULEES.
~s 1. Stabilité de l'échantillon reconstitué à température ambiante.
aJi E.coli ( souche WR~ disponible auprès de la Collection Hollandaise RIVM).
Mode ouératoire:
20 - 4 lenticules d'E. coli obtenues selon l'exemple 1 sont placées respectivement dans des tubes contenant les milieux reconstituants DSM, RINGER et Eau Distillée Stérile;
- 2 ml de chaque tube sont ensuite versés à différents intervalles de temps (0, 10, 20, 40 minutes) dans un flacon (type Pasteur microbio) 2s contenant 400 ml d'eau du robinet.
Les résultats sont résumés dans la figure 1.
- 2 répliquats de filtration sont effectués sur chaque flacon (filtration automatique de 100 ml sur automate SARAH).
On remarque pour E. colis T ... _.~
WO 99/00485 ~ 5 PCT/FR98/01335 - Une stabilité dans chacun des reconstituants;
- Un nombre de colonies beaucoup plus important (environ 10 fois plus) pour la lenticule reconstituée dans le DSM par rapport aux deux autres lenticules reconstituées respectivement dans le RINCER et dans s l'Eau Distillée Stérile.
by Enterococcus faecalis.
(souche disponible auprès de la Collection Tchèque CCM sous le n°
2541 ).
io Mode opératoire:
- une lenticule d'Enterococcus faecalis obtenue selon l'exemple 1 est placée dans un tube de chaque reconstituant (DSM, RINCER, Eau Distillée Stérile);
~s - 1 ml de chaque tube est ensuite versé à différents intervalles de temps (O, 10, 20, 40 minutes) dans un flacon (type Pasteur microbio) contenant 400 ml d'eau du robinet;
- 2 répliquats de filtration sont effectués sur chaque flacon (filtration automatique de 100 ml sur automate SARAH).
2o La figure 2 illustre les résultats obtenus.
On remarque donc pour Enterococcus faecalis:
~ dans de l'eau distillée stérile, une chute rapide du nombre de colonies récupérées en fonction du temps de contact de la lenticule avec le reconstituant (passage de 55 à 0 colonies récupérées en 20 minutes).
2s ~ dans le RINCER, une chute lente du nombre de colonies récupérées en fonction du temps de contact de ia lenticule avec le reconstituant (passage de 47 à 15 colonies récupérées en 40 minutes).
WO 99/00485 ~ 6 PCT/FR98/01335 ~ dans le DSM, une stabilité du nombre de colonies récupérées en fonction du temps avec un niveau de récupération beaucoup pius élevé.
2. Rendement des différents reconstituants Ces essais ont pour but de montrer que le milieu DSM permet une meilleure récupération de colonies par rapport à d'autres diluants comme le RINCER ou l'eau distillée stérile.
io Mode opératoire:
-10 comprimés d'E.coli obtenus selon l'exemple 1 sont reconstitués dans chacun des trois reconstituants (DSM, RINCER, eau distillée stérile).
- L'ensemble des tubes est placé à +4°C (eau + Ice Pack~) pour i s éviter tout effet de température, - Le contenu de chaque tube est intégralement déversé dans un flacon de 400 ml d'eau du robinet (flacon de type Pasteur microbio), - Tous les flacons sont ensuite filtrés par filtration automatique de 100 ml sur l'automate SARAH.
Résultats:
Ces résultats sont résumés dans la figure 3.
On note que - Pour le DSM, on récupère en moyenne environ 22 colonies par 2, filtration;
- Pour le RINCER, on récupère en moyenne environ 7 colonies par filtration;
- Pour l'eau distillée stérile, on récupère en moyenne environ 3 colonies par filtration.
T_ _ ...._......_-..~_.,_.._...__..._.....__.......
WO 99/00485 ~ ~ PCT/FR98/01335 Ainsi, pour le mëme lot de lenticules d'E. Coli , on récupère environ 3 fois plus de colonies lorsque le DSM est utilisé comme reconstituant par rapport au RINGER, et environ 7 fois plus de colonies par rapport à l'eau distillée stérile.
s Ces résultats (2.1 et 2.2) montrent donc que le DSM offre une meilleure stabilité et un meilleur rendement lors de ta reconstitution des lenticules.
Chacune des manipulations effectuées à l'aide de lenticules doit être préférentiellement effectuée à froid (pour une stabilité garantie au-io delà de 40 minutes) et en milieu DSM.
EXEMPLE 3:
VALIDATION DES LOTS DE LENTICULES
Cinq souches d'Escherichia coli, de Klebsiella planticola (souche ~ s disponible auprès de l'ATCC sous le n° 33.531 ), d'Enterococcus faecalis, de Straphylococcus aureus, et Clostridium sporogenes ont été
conditionnées sous forme de lenticules, tel que décrit dans l'exemple 1.
Mode opératoire:
2o La validation s'effectue en dénombrant 30 lenticules après séchage.
Chacune des lenticules est déposée dans un tube contenant 9 ml de DSM.
Les tubes précédemment à température ambiante sont placés à
2s +4°C (Bain d'eau + Ice Pack) dès que fa lenticule s'est dissoute dans le DSM (dissolution au Vortex~).
Une dissolution est effectuée lorsque la concentration de la lenticule est trop importante.
On filtre ensuite 5 ml de chacune des dilutions.
WO 99/00485 ~ g PCT/FR98/01335 Résultats:
Les résultats sont contenus dans le tableau 2 ci-après. Ces résultats montrent que pour tous les germes étudiés, le coefficient de s reproductibilité {SR) est inférieur à 0,20 en unités logarythmiques. SR
mesure la variabilité des résultats obtenus quand les mesures sont effectuées sur des pastilles différentes au sein d'un même laboratoire.
EXEMPLE 4:
STABIL1TE DES LOTS STOCKES.
Mode opératoire:
Les lenticuies sont conservées à + 4°C, -20°C ou -70°C
dans des flacons munis d'un sachet dessiccateur (un même lot est séparé en deux quantités identiques, stockées à deux températures différentes).
ts Chaque jour deux lenticules sont testées , cela pour chaque lot et pour chacune des températures de conservation (+4°C, - 20°C et -70°C).
Chaque lenticule est placée dans un tube contenant 10 ml de DSM, celle-ci est dissoute au Vortex~ à température ambiante. Les échantillons ainsi reconstitués sont placés à + 4°C avant la filtration.
2o La filtration s'effectue en deux répliquats de 5 ml pour chaque lenticule.
On a ainsi chaque jour la somme de quatre dénombrements pour chacune des deux températures de conservation ( + 4°C, - 20°C et - 70°C).
2s C'est le suivi de cette valeur qui permet d'établir la droite de régression permettant la visualisation de l'évolution dans le temps du lot.
Résultats:
Les résultats de stabilité sont représentés sous forme de droites de régression pour ___ _...__.T. ._.__ ~~._.._._ _.__.....__.._.
WO 99/00485 ~ 9 PCT/FR98/01335 ~ E. coli (Figs. 4A, 4B et 4C);
~ K. planticola (Figs.5A, 5B ) ~ S. aureus (Figs. 6A, 6B et 6C) ~ E.faecalis (Figs.7A, 7B, 7C).
s Les pentes nulles obtenues par régression linéaire montrent que pour les quatre germes étudiés, les lots sont stables au moins:
~ 1 semaine à +4°C:
~ 3 mois à - 20°C;
~ 1 an à - 70°C.
~ o Ces stabilités sont tout à fait compatibles avec une utilisation industrielle.
EXEMPLE 5:
Utilisation des pastilles lenticulées en tant que matériau de > > référence.
Les matériaux de référence peuvent être utilisés pour le contrôle de fertilité des milieux de culture, la maîtrise statistique des procédés et les essais d'aptitude par comparaison entre laboratoires.
1. Contrôle de la fertilité des milieux de culture.
Les normes AFNOR T90-432 et T90-433 imposent des critères de qualité pour la fabrication du milieu de culture en microplaque.
Le contrôle de qualité doit porter sur chaque lot de microplaques 2s fabriquées. Les microplaques à tester sont prélevées de manière aléatoire ou systématique afin de constituer un échantillon selon la norme AFNOR NFX 06-023, en respectant le niveau normal de prélèvement (9 microplaques contrôlées pour une taille de lot de 1000 microplaques fabriquées).
WO 99/00485 ~U PCT/FR98/01335 La fertilité du milieu de culture est mesurée par le rapport entre le nombre de micro-organismes observés avec le lot de microplaques testées et le nombre de micro-organismes attendus avec un matériau de référence stable (valeur-cible). Le niveau de concentration à mettre en s oeuvre après reconstitution du matériau de référence doit se situer autour du maximum de précision de la méthode, soit environ 500 germes/100 ml. Les seuils d'acceptation du lot de microplaques en essai sont : 0,66 à 1,50 fois la valeur-cible (66% < rendement (%) < 150%).
La souche à tester pour la norme T90-433 est E. coli WR1.
~ o Les souches à tester pour la norme T90-432 sont E. faecium WR63, E. faecalis CCM 2541 et E. hirae CCM 2423 Les tableaux 3 à 6 rapportent pour chacune des souches les résultats de fertilité obtenus sur la fabrication de microplaques de 1997.
Ils montrent une parfaite maîtrise de la fabrication par le producteur. En ~s effet, 90% des lots fabriqués répondent au critère de fertilité fixé dans les normes.
2. Maîtrise statistigue des procédés (contrôle interne de la ualité .
Avant la mise en place du contrôle interne de la qualité, le laboratoire doit étalonner sa chaîne analytique. Pour cela, afin de tenir compte des résultats obtenus dans les exemples précédents, les protocoles suivants ont été arrêtés:
~s Protocole de reconstitution des matériaux de référence:
~ Sortir le (s) tubes) du congélateur.
_ ._ ~_~_ WO 99/00485 2 ~ PCT/FR98/01335 ~ A l'aide d'une pince stérile, prélever la (les) pastilles) nécessaires) au contrôle (pastilles lenticulées fabriquées comme décrit dans l'exemple 1 ).
~ Replacer immédiatement le(s) tubes) au congélateur.
Laisser la (les) pastilles) 15 minutes à température ambiante.
~ Plonger chaque pastille dans un tube contenant 18 ml de diluant spécial pastille (suspension mère).
~ Laisser 15 minutes à température ambiante sans agiter.
~ Agiter doucement le(s) tubes} durant 30 secondes.
~o ~ Si les ensemencements ne sont pas réalisés dans l'heure qui suit la reconstitution, conserver le(s) tubes) de suspension mère dans la glace fondante (garantie d'une stabilité de quatre heures).
Protocole de préparation du diluant spécial pastilles:
is - Dissoudre 22,5g de sels marins (Instant Ocean) dans 1 litre d'eau distillée, - vérifier la salinité (20+/-3 pour 1000) ou la conductivité (25000 +/-4000 uS.cm-1}, - ajuster le pH (7.9+/-0.5).
20 - répartir en tubes de 18 ml.
- autoclaver à 120°C pendant 15 minutes.
Protocole de calibration:
~ Utiliser la suspension mère:
2s - Les pastilles 1 et 2 : filtrer 0.5 ml, - Les pastilles 3 et 4: filtrer 1.0 ml, - Les pastilles 5 et 6: filtrer 2.0 ml, - Les pastilles 7 et 8: filtrer 4.0 ml, - Les pastilles 9 et 10: filtrer 8.0 ml.
WO 99/00485 ~2 PCT/FR98/01335 ~ Vérifier la linéarité des résultats par régression linéaire. A partir de l'équation de la droite de régression, déterminer le volume de filtration à préconiser pour chaque matériau de manière à obtenir 25 colonies sur la membrane.
s Une fois centré sur cette valeur cible de 25 colonies, le laboratoire doit mettre en place, afin de déceler des dérives, des décentrages, des problèmes de répétabilité ou de reproductibilité, son contrôle interne.
Selon l'activité analytique du laboratoire, ce contrôle interne assure:
~ Une couverture journalière:
~o Les gros laboratoires réalisant une centaine d'analyses par jour peuvent tester 4 pastilles chaque jour. Les figures 8A et 8B; 9A et 9B
représentent les cartes de contrôle de la moyenne et de l'écart type obtenues en routine avec des pastilles selon l'invention contenant E. coli et E. faecalis sur une période de 30 jours.
is ~ Une couverture hebdomadaire:
Les petits laboratoires réalisant une centaine d'analyses par semaine peuvent tester 5 pastilles chaque semaine à raison d'une pastille par jour. Les figures 10A et 10B et 11A et 11B, représentent les cartes de contrôle de la moyenne et de l'écart type obtenues en routine 2o avec des pastilles selon l'invention contenant S. aureus et C.
sporogenes sur une période de 30 semaines.
Grâce à ce type de contrôle interne les laboratoires de microbiologie disposent maintenant d'un système d'alerte en temps réel (couverture quotidienne) ou en temps différé (couverture hebdomadaire) 2s avec possibilité de sélectionner les causes d'erreurs et mettre en place les actions correctives.
_ ___._._ WO 99/00485 2' PCT/FR98/01335 3. Essais d'aptitude des laboratoires par intercomloaraison contrôle externe de la qualité).
Un essai d'aptitude consiste à utiliser des intercomparaisons pour s déterminer la performance d'un laboratoire en matière d'essais ou de mesurages. La participation à des systèmes d'essais d'aptitude donne aux laboratoires un moyen objectif d'évaluer et de démontrer la fiabilité
des données qu'ils produisent. Les laboratoires complètent ainsi les procédures internes de maîtrise de la qualité en fournissant une mesure ~o externe supplémentaire de leurs compétences en matières d'essais.
L'Association Générale des Laboratoires d'Analyse de l'Environnement (A.G.L.A.E.) a organisé en Avril 98 un essai interlaboratoires regroupant 55 laboratoires français (métropole et départements d'Outre-mer). Des pastilles fabriquées comme décrit dans ~ s l'exemple 1 ont été utilisées comme matériau d'essai.
Les résultats obtenus lors d'un dénombrement des entérocoques sur un lot de pastilles contenant Enterococcus faecalis sont résumés dans le tableau 7.
Dans le tableau 7 ci-après, S" mesure la variabilité des résultats 20 obtenus quand les mesures sont effectuées sur la même pastille au sein d'un même laboratoire.
r correspond à la variabilité des résultats obtenus quand les mesures sont efiFectuées sur des pastilles différentes au sein d'un même laboratoire.
2s R mesure la variabilité des résultats obtenus quand les mesures sont effectuées sur des pastilles différentes et par différents laboratoires.
La valeur de 0,10 obtenue pour S" montre que les pastilles se dissolvent de manière homogène.
WO 99/00485 '4 La valeur de 0,18 obtenue pour r montre la bonne homogénéité
du lot de pastilles.
La valeur de 0,3 obtenue pour R est une valeur comparable aux résultats habituellement obtenus dans ce type d'essai inter-laboratoires, s et valide donc cette technique (stabilité des pastilles lors du transfert et mise en oeuvre aisée dans les laboratoires).
L'intérêt de la présente invention dans le cadre de ces essais inter-laboratoires réside dans la possibilité de conserver, même à
température ambiante, les pastilles. Ainsi, les essais inter-laboratoires ~o effectués les années précédentes nécessitaient de fournir à chaque laboratoire un échantillon consistant en un litre d'eau artificiellement contaminé. Cet échantillon devait donc parvenir en quelques heures à
chaque laboratoire, afin d'être certain que tous les laboratoires travaillaient dans les mêmes conditions.
is Les pastilles selon la présente invention permettent de résoudre ce problème et facilitent l'organisation de ce type d'essai.
Schage Nombre moyen de colonies sur 10 botes + 44C 24 sous hotte flux laminaire > 100 - 20C > 100 (*) (*) Boîtes deux fois plus chargées qu'à température ambiante.
WO 99/00485 ~~ PCT/FR98/01335 E.co K.planticolaE.faecalisS.aureus C.sporogenes Mirai= 8 6 8 28 8 Moyenne 24 22 18 61 19 =
Maxi= 70 83 38 135 44 SR 0,16 0,19 0,11 0,11 0,12 FERTILITE DES MICROPLAQUES MUIEC (SANOFI DIAGNOSTICS
PASTEUR) Lots de micropfaques E. coli NlR1/100 Rendement {%) Contrle ml 1 603 118% Accept 2 633 124% Accept 3 522 102% Accept
4 471 92% Accept 452 88% Accept 6 325 64% Refus 7 371 73% Accept 8 360 70% Accept 9' ' 817 160% Refus 742 145% Accept 11 633 124% Accept 12 479 94% Accept 13 471 92% Accept 14 409 80% Accept 387 76% Accept 16 381 75% Accept 17 315 62% Refus 18 789 i 54% Accept 19 772 1 51 % Accept 781 153% Accept 21 518 101 % Accept Valeur Cible 51 1
5 '6 FERTIL1TE DES MICROPLAQUES MUISF (SANOFI DIAGNOSTICS
PASTEUR) Lots de micro E. faecalis CCM 2541 Rendement Cont~Ole la ues /100 ml 96) 1 s61 132 Accept 2 601 i 20% Accept 3 433 8796 Accept 507 10256 Accept 72~Yo Accept
PASTEUR) Lots de micro E. faecalis CCM 2541 Rendement Cont~Ole la ues /100 ml 96) 1 s61 132 Accept 2 601 i 20% Accept 3 433 8796 Accept 507 10256 Accept 72~Yo Accept
6 327 66% Accept
7 326 6596 Refus
8 540 i 08~ Accept 592 119rb Accept 424 85~ Accept 441 8896 Accept 12 562 113~Yo Accept 13 570 1149 Accept 14 650 13086 Accept 602 121 ~ Accept 16 441 8896 Accept 17 436 8736 Accept i 8 595 11996 Accept 646 129% Accept 592 1196 Accept 21 S 7 7 10496 Accept 22 434 8796 Accept 23 495 9996 Accept 24 526 105% Accept 442 890 Acce t yaleur Cible 499 _.._ ~ ._ _.
WO 99/00485 ~~ PCT/FR98/01335 FERTILITE DES MICROPLAQUES MUISF fSANOFI DIAGNOSTICS
PASTEUR) Lots de microplaquesE. faecium WR63/100 Rendement (%) Contrle ml 1 746 105% Accept 2 656 92% Accept 3 626 88% Accept 4 1031 145% Accept 666 94% Accept 6 518 73% Accept 7 492 69% Accept 8 660 93% Accept
WO 99/00485 ~~ PCT/FR98/01335 FERTILITE DES MICROPLAQUES MUISF fSANOFI DIAGNOSTICS
PASTEUR) Lots de microplaquesE. faecium WR63/100 Rendement (%) Contrle ml 1 746 105% Accept 2 656 92% Accept 3 626 88% Accept 4 1031 145% Accept 666 94% Accept 6 518 73% Accept 7 492 69% Accept 8 660 93% Accept
9~ 588 83% Accept 61 1 86% Accept 11 460 65% Refus 12 802 113% Accept 13 990 139% Accept 14 696 98% Accept 742 104% Accept 16 1 147 16i % Refus 17 915 129% Accept 18 999 140% Accept 19 750 105% Accept 881 124% Accept 21 694 98~b Accept 22 869 122~o Accept 23 662 93% Accept 24 695 98% Accept 434 61 % Refus Valeur Cible 71 1 WO 99/00485 ~g PCT/FR98/01335 FERTILITE DES MICROPLAQUES MUISF (SANOFI DIAGNOSTICS
PAS
Lots de microplaquesE. hirae CCM 2423/100 Rendement (%) Contrle ml 1 447 95% Accept 2 457 97% Accept 3 462 98% Accept 4 493 104% Accept 400 85% Accept 6 376 80% Accept 7 396 84% Accept $ 475 101 % Accept 9~ S23 1 1 1 % Accept 436 92% Accept 1 1 414 88% Accept 12 568 120% Accept 13 565 120% Accept 14 575 122% Accept 1 S 545 11 S% Accept 16 498 105% Accept 17 554 117% Accept 18 410 87% Accept 19 301 64% Refus 564 119% Accept 21 584 124% Accept 22 484 102% Accept 23 544 115r Accept 24 590 125% Accept 329 70% Accept Valeur Cible 472 r __.__. __._a~._. ._ t WO 99/00485 2~ PCT/FR98/01335 en log du nombre de fermes dans 100 ml m~r~ 1,6?
soit 42 germes dans 100 ml s ~r~ 0,10 u r~X~ 0~1s _ 030 CVR % 6,5 S (x) a s~ 1,5
PAS
Lots de microplaquesE. hirae CCM 2423/100 Rendement (%) Contrle ml 1 447 95% Accept 2 457 97% Accept 3 462 98% Accept 4 493 104% Accept 400 85% Accept 6 376 80% Accept 7 396 84% Accept $ 475 101 % Accept 9~ S23 1 1 1 % Accept 436 92% Accept 1 1 414 88% Accept 12 568 120% Accept 13 565 120% Accept 14 575 122% Accept 1 S 545 11 S% Accept 16 498 105% Accept 17 554 117% Accept 18 410 87% Accept 19 301 64% Refus 564 119% Accept 21 584 124% Accept 22 484 102% Accept 23 544 115r Accept 24 590 125% Accept 329 70% Accept Valeur Cible 472 r __.__. __._a~._. ._ t WO 99/00485 2~ PCT/FR98/01335 en log du nombre de fermes dans 100 ml m~r~ 1,6?
soit 42 germes dans 100 ml s ~r~ 0,10 u r~X~ 0~1s _ 030 CVR % 6,5 S (x) a s~ 1,5
Claims (20)
1. Composition pour la conservation .de micro-organismes en quantités déterminées et reproductibles comprenant au moins une substance susceptible de former le squelette de pastilles lenticulées, au moins une substance saturante et des micro-organismes.
2. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle comprend entre environ 10 et 60% en poids de substances susceptibles de former le squelette de pastilles lenticulées et entre environ 40 et 90%
en poids de substances saturantes.
en poids de substances saturantes.
3. Composition selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisée en ce qu'elle comprend entre environ 20 et 40% en poids d'albumine.
4. Composition selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce qu'elle comprend entre environ 2 et 5% en poids d'amidon.
5. Composition selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle comprend entre environ 60 et 80%, en poids de saccharose.
6. Composition selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'albumine est de l'ovalbumine.
7. Composition selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle contient entre environ 100 et 10 11 bactéries/gramme.
8. Composition selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que les micro-organismes sont des bactéries, des virus, des levures, des protozoaires, ou des champignons.
9. Pastille caractérisée en ce qu'elle présente une composition selon l'une des revendications 1 à 8.
10. Pastille selon la revendication 9 caractérisée en ce qu'elle présente une masse comprise entre environ 1 mg et environ 250 mg, préférentiellement entre environ 2mg et 100 mg et encore plus préférentiellement entre environ 10 et 25 mg.
11. Pastille selon l'une des revendications 9 et 10 caractérisée en ce qu'elle est de forme lenticulée, et a un diamètre compris entre environ 1 et 10 mm.
12. Procédé de fabrication de pastilles selon l'une des revendications 9 à 11 comprenant les étapes suivantes:
- incorporation des micro-organismes aux substances formant le squelette, - diminution de l'activité en eau par ajout progressif de la substance saturante, - mise en forme des pastilles et - séchage des pastilles sous vide et à une température inférieure à environ -10°C.
- incorporation des micro-organismes aux substances formant le squelette, - diminution de l'activité en eau par ajout progressif de la substance saturante, - mise en forme des pastilles et - séchage des pastilles sous vide et à une température inférieure à environ -10°C.
13. Procédé selon la revendication 12 caractérisé en ce que le mélange est effectué de la manière suivante :
- mélange de l'albumine et des micro-organismes, - ajout de l'amidon, puis - ajout du saccharose.
- mélange de l'albumine et des micro-organismes, - ajout de l'amidon, puis - ajout du saccharose.
14. Procédé selon l'une des revendications 12 et 13, caractérisé
en ce que le séchage des pastilles est effectué dans un dessiccateur durant entre environ 12 heures et 10 jours.
en ce que le séchage des pastilles est effectué dans un dessiccateur durant entre environ 12 heures et 10 jours.
15. Procédé de reconstitution d'une suspension de micro-organismes à partir de pastilles selon l'une des revendications 9 à 11, ou obtenues par le procédé selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que les pastilles sont remises en suspension dans un milieu adéquat.
16. Procédé selon la revendication 15 caractérisé en ce que les pastilles sont reconstituées dans un milieu liquide contenant 23g/l de sel de mer.
17 Utilisation de pastilles selon l'une des revendications 9 à 11 comme matériau de référence en microbiologie.
18 Utilisation de pastilles selon l'une des revendications 9 à 11 pour le contrôle de fertilité des milieux de culture.
19. Utilisation de pastilles selon l'une des revendications 9 à 11 en tant que témoins positifs dans les « challenge tests ».
20. Utilisation de pastilles selon l'une des revendications 9 à 11 en tant qu'agents de démarrage dans les processus de fermentation.
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