CA2304577A1 - Procede de regulation de la desinfection de liquides - Google Patents
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Abstract
La présente invention est relative à un procédé de régulation de la désinfection d'un liquide comprenant la mesure du taux de microorganismes survivants et l'ajustement, en fonction dudit taux, de la nature et/ou des doses du (des) agent(s) chimique(s) ou physique(s) utilisé(s) pour ladite désinfection. Le procédé selon l'invention présente notamment l'avantage d'être rapide et aisément automatisable.
Description
TITRE
"Procédé de régulation de la désinfection de liquides"
La p rés ente i nventi on es t, de mani è re géné rale, relative à des moyens pour la régulation de la désinfection de liquides. Elle concerne plus parti culi è rement des moyens de régulati on mettant en oeuvre la mes ure d' activi tés enzymati ques .
La ga ranti e de quali té et d' i nnocui té de li qui des des ti nés à êt re en contact avec un homme ou un animal, tels qu' une eau des ti née à la cons ommati on, un li qui de alimentaire, une eau de baignade, une eau destinée à des p répa rati ons pha rmaceuti ques ou bi otechnologi ques , dépend di rectement de la fi abi li té et de la s ens ibi li té des techniques employées pour mesurer le nombre de mi c roo rganis mes s u rvi vants dans ledi t li qui de.
Les méthodes actuellement employées pour la régulation de la désinfectio n d' un liquide utilisent les techniques de culture sur gélose et/ou les techniques de mi c ros copi es .
Les techniques de culture sur gélose consistent à
compte r le nombre de coloni es bacté ri er~nes s e développant sur différents milieux nutritifs gélosés normalisés (e. g.
norme f rançais e NF T 90-414, Ess ais des Eaux, Recherche et dénombrement des coliformes et des coliformes
"Procédé de régulation de la désinfection de liquides"
La p rés ente i nventi on es t, de mani è re géné rale, relative à des moyens pour la régulation de la désinfection de liquides. Elle concerne plus parti culi è rement des moyens de régulati on mettant en oeuvre la mes ure d' activi tés enzymati ques .
La ga ranti e de quali té et d' i nnocui té de li qui des des ti nés à êt re en contact avec un homme ou un animal, tels qu' une eau des ti née à la cons ommati on, un li qui de alimentaire, une eau de baignade, une eau destinée à des p répa rati ons pha rmaceuti ques ou bi otechnologi ques , dépend di rectement de la fi abi li té et de la s ens ibi li té des techniques employées pour mesurer le nombre de mi c roo rganis mes s u rvi vants dans ledi t li qui de.
Les méthodes actuellement employées pour la régulation de la désinfectio n d' un liquide utilisent les techniques de culture sur gélose et/ou les techniques de mi c ros copi es .
Les techniques de culture sur gélose consistent à
compte r le nombre de coloni es bacté ri er~nes s e développant sur différents milieux nutritifs gélosés normalisés (e. g.
norme f rançais e NF T 90-414, Ess ais des Eaux, Recherche et dénombrement des coliformes et des coliformes
2 PCT/FR98/02045 the rmotolé rapts ) . Ces techni ques p rés entent plus i eurs i nconvéni ents .
On peut en premier lieu citer le fait qu' elles ne donnent leurs résûltats qu' au bout de 24 heures en moyenne, ce qui diffère d' autant l' éventuel ajustement du procédé de désinfection.
Les techni ques de culture sur gélos e cont rai gnent, de plus , à la réalis ati on de batte ri es de cultures microbiologiques pour l' analyse de chaque échantillon de liquide. En effet, toutes les familles microbiennes. et bacté ri ennes en pa rte cule e r, ne s e développent pas s u r le même mi li eu put ri ti f ; ai ns i , on peut ne détecte r aucun coliforme après culture sur le milieu nutritif normalisé
pour la détecte on des coli fo rmes , mais t couve r bon nombre d' aut ces bacté ri es ap rès cultu re s u r d' aut ces mi li eux put ri ti fs . Le choix des mi li eux put ri ti fs gélos és déte rmine donc la quali té de l' analys e. Ce choi x es t d' autant plus délicat qu' il a parfois été observé un nombre plus important de colonies après culture sur un mi li eu aut re que le mi li eu put ri ti f no rmalis é pour la détection de ces mêmes colonies. I1 a par exemple été
démont ré que 1 es dénomb rements de 1 a f lo re bacté ri enne aérobie revivifiable étaient plus importants sur milieu gélosé R2A que sur le milieu nutritif normalisé
correspondant (voi r par exemple "A new rapid medium for enumeration and subculture of bacteria from potable wate r" de Reas one r D. J. et Godrei ch E. F. , App. Envi ronm.
Microbiol. (1985) 49-p.l-7). Pour établir un diagnostic négatif fiable, les techniques de culture sur gélose appellent donc à une multiple cation des analys es . Les techni ques de culture sur gélos e ne pe rmettent de plus pas ais ément d' automates e r la régulati on du procédé de désinfection.
On peut en premier lieu citer le fait qu' elles ne donnent leurs résûltats qu' au bout de 24 heures en moyenne, ce qui diffère d' autant l' éventuel ajustement du procédé de désinfection.
Les techni ques de culture sur gélos e cont rai gnent, de plus , à la réalis ati on de batte ri es de cultures microbiologiques pour l' analyse de chaque échantillon de liquide. En effet, toutes les familles microbiennes. et bacté ri ennes en pa rte cule e r, ne s e développent pas s u r le même mi li eu put ri ti f ; ai ns i , on peut ne détecte r aucun coliforme après culture sur le milieu nutritif normalisé
pour la détecte on des coli fo rmes , mais t couve r bon nombre d' aut ces bacté ri es ap rès cultu re s u r d' aut ces mi li eux put ri ti fs . Le choix des mi li eux put ri ti fs gélos és déte rmine donc la quali té de l' analys e. Ce choi x es t d' autant plus délicat qu' il a parfois été observé un nombre plus important de colonies après culture sur un mi li eu aut re que le mi li eu put ri ti f no rmalis é pour la détection de ces mêmes colonies. I1 a par exemple été
démont ré que 1 es dénomb rements de 1 a f lo re bacté ri enne aérobie revivifiable étaient plus importants sur milieu gélosé R2A que sur le milieu nutritif normalisé
correspondant (voi r par exemple "A new rapid medium for enumeration and subculture of bacteria from potable wate r" de Reas one r D. J. et Godrei ch E. F. , App. Envi ronm.
Microbiol. (1985) 49-p.l-7). Pour établir un diagnostic négatif fiable, les techniques de culture sur gélose appellent donc à une multiple cation des analys es . Les techni ques de culture sur gélos e ne pe rmettent de plus pas ais ément d' automates e r la régulati on du procédé de désinfection.
3 PCT/FR98/02045 Les bacté ri es s ont de plus capables , et en particulier à la suite d' un stress environnemental tel que l' appli cati on d' un p rocédé de dés i nfecti on, d' adopte r une forme de résistance sous laquelle elles ne se multiplient plus tout en assurant un métabolisme minimal dès restauration de conditions environnementales plus favo Tables , ces bacté ri es pou r rai ent rep rendre leu r multiplication. De telles bactéries sont dites "non cultivables mais viables" : elles ne sont pas détectables par les techniques de culture sur gélose classiques et peuvent représ ente r un ris que bi ologi que pour le cons ommateu r.
Une méthode actuellement disponible pour cantrôler de manière quasi-certaine l' efficacité de la désinfection d' un li qui de uti lis e des techni ques de mi cros copi es as s oci ées à des colo rati ons s péci fi ques . Cette méthode permet une discrimination entre bactéries cultivables, bactéries non cultivables mais viables et bactéries mortes. Elle nécessite cependant la mise en oeuvre de plusieurs tests de colorations pour chaque échantillon et es t techni quement di f fi ci lement automates able.
La présente invention vise à pallier les inconvénients des techniques de l' art antérieur et p Topos e un p rocédé de régulati on de la dés i nf ecti on d' un liquide, caractérisé en ce qu' il comprend A. à une étape de ladite désinfection ci-après désignée étape 2, la mesure de l' activité d' au moins une enzyme pa r mis e en contact des mi c roo rganismes éventuellement p Tés ents dans ledi t li qui de avec un substrat choisi comme étant capable de révéler l' activité
de cette ou ces enzyme (s ) , notamment par trans formation dudi t s ubs t rat en compos és colo Tés , f luo Tes cents ou luminescents ou par disparition dudit substrat, cette WO 99!16896 4 PCT/FR98/02045 activité enzymatique étant ci-après nommée activité
p rop re, B à une étape ci-après désignée étape 1, antérieure à ladite étape 2, la mesure de l' activité de la ou des même (s ) enzyme (s ) qu' en A, ceiae activité étant ci-après désignée activité initiale, C. la traduction, pour chaque enzyme, desdites activité propre et activité initiale, en taux de microorganismes survivants dans le ledit liquide à
l' étape 2 de ladite désinfection, et cela par l' intermédiaire d' un système de référence, pré-établi à
l' ai de d' un échanti l lon dudi t li qui de prélevé à ladi te étape 1 puis exposé à des doses de désinfectant (s ) croissantes, ainsi que D. l' aj us terrent, en foncti on dudi t taux de microorganismes survivants, de la nature et/ou des doses du ( des ) agent (s ) chi mi que (s ) ou phys i que (s ) uti lis é (s ) pour ladite désinfection.
Pa r mi c roo rganis mes s u rvi vants , nous ent dans endons la prsente demande microorganismes cultivables et/ou microorganismes non cultivables mais viables.
Par taux de microorganismes survivants, nous entendons dans la prsente demande le rapport entre concent rati on en mi c roo rganis mes s u rvi vants ledi dans t liquide ladite tape 2 de dsinfection et la concent rati on en mi c roo rganis mes s u rvi vants mme dans le liquide ladite tape 1. Ce taux de microorganismes survivants est prfrentiellement exprim en valeurs d' abattement sous la forme de puissances ngatives de 10, ou en log d' abattement qui co r res pond - loglc (abattement).
Ladite tape 1 peut, par exemple, correspondre une tape "avant dsinfection" dudit liquide et ladite tape 2 une tape quelconque du procd de dsinfection, (tapes " aprs dsinfection" dudit liquide y compris ) .
Le procd selon l' invention s' adresse des liquides dans lesquels les ventuellement microorganismes prs ents s ont s oumis des condi ti ons tout--fai t pa rti culi res , s avoi r condi ti ons ds i nf ecti des de on, induis ant un s t ress notabledes cellules .
Le procédé de la régulation de la désinfection d' un li qui de s elon l' i nventi on s' adres s e pa rti culi è rement aux liquides destinés à être mis en contact avec un homme ou un animal, que cela soit par simple contact, absorption, i nges ti on, i ns ti 11 ati on ou i nj ecti on. I 1 s' app li que pa rti culi è rement à des li qui des des ti nés à êt re en contact avec un homme ou un animal tel qu' une eau de bai gnade, une eau des ti née à la cons ommati on, une eau des ti née à des p répa rati ons pha rmaceuti ques ou biotechnologiques, ou un liquide alimentaire.
Ladi te mis e en contact des mi c roo rganis mes éventuellement p rés ents dans ledi t li qui de avec ledi t substrat peut être réalisée par mise en contact directe dudi t li qui de ou d' un échanti l lon dudi t li qui de avec ledi t s ubs t rat, ou bi en pa r mis e en contact d' un concent ré des di ts mi c roo rganis mes éventuel l eurent p rés ents tel que filtrat, ou culot de centrifugation, dudit li qui de ou échanti llon de li qui de, avec ledi t s ubs t rat.
Préalablement à la mesure de l' activité de certaines enzymes telles que la glucose-6-phosphate déshydrogénase ou la glutathion réductase, le procédé selon l' invention comprend, de manière avantageuse, l' étape de faire subir audi t li qui de, échanti l lon de li qui de, ou concent ré, un t rai terrent de lys e, notamment pa r s oni cati on.
Préalablement à la mesure de l' activité d' autres enzymes telles que catalase ou superoxyde dismutase, l' étape de lyse préalable peut être évitée . l' activité
de ces enzymes peut être mesurée à l' aide d' un substrat diffusant à l' intérieur des microorganismes, tel que la lucigénine et le peroxyde d' hydrogène.
Selon un aspect avantageux de l' invention, la ou les enzyme (s ) dont la ( ou les ) acti vi té (s ) es t (s ont ) mes u rée (s ) p rés ente ( ent ) , dans ledi t li qui de, échantillon de liquide, ou concentré, un rapport entre activité propre et activité initiale en relation affine, et avec une pente significative différente de zéro, préférentiellement inférieure à -0,2, avec le taux de 1 S mi c roo rgani s mes s u rvi vants s u r au moi ns une zone de valeurs desdits taux de microorganismes survivants. C' est par exemple le cas de la glucose-6-phosphate déshydrogénase pour des log d' abattement compris entre 0 et 3 envi ron, de la glutathion réductas e pour des log d' abattement compris entre 4 et 7 envi ron, de la superoxyde dismutase pour des log d' abattement compris ent re 3 et 6 envi ron.
D' autres enzymes d' intérêt peuvent notamment fai re parti e de la farci lle des dés hydrogénas es ou de la farci lle des enzymes impli quées dans la répons e au s t ress oxydant.
Pour déterminer si une (ou des ) enzyme (s ) est (sont) appropriée (s ) à la mise en oeuvre de la méthode de régulation selon l' invention sur un liquide donné, il pourra être procédé comme suit - prélèvement d' au moins un échantillon dudit li qui de et mes u re de 1 a concent rati on en mi c roo rganis mes survivants (microorganismes cultivables et/ou microorganismes non cultivables mais viables ) , notamment par culture surgélose et/ou par colorations et obs e rvati ons au mi c ros cope, WO 99/16896 ~ PCTlFR98/02045 - dosage de l' activité de chaque enzyme candidate, sur cet ou ces échantilion(s) de liquide, - expos i ti on dudi t ( des di ts ) échanti llon (s ) de liquide à différentes doses de désinfectant (s ) dans des conditions par ailleurs équivalentes (e. g. conditions de durée d'exposition, de température), - mesure de l' activité de chaque enzyme candidate ap rés expos i ti on aux di f f é rentes dos es de désinfectant(s), - réalisation, pour chaque enzyme candidate, d' une courbe présentant les pourcentages d' activité (activité
enzymatique mesurée, après exposition aux différentes doses de désinfectant (s ) rapportée à l' activité
enz ymati que co r res pondante avant expos i ti on ) en foncti on des log d' abattement mesurés (tels que ci-avant définis ) , - détermination, pour chaque enzyme candidate, de la zone de log d'abattement pour laquelle la pente de ladite cou rbe es t s i gni fi cati vement di f f é rente de z é ro, préférentiellement inférieure à -0, 2, cette zone cons ti tuant la gamme de répons e de l' enzyme candidate considérée sur ledit liquide, - une enzyme candi date es t app rop ri ée à la mis e en oeuvre de la méthode selon l' invention sur ledit liquide si sa gamme de réponse comprend les valeurs de log d' abattement correspondant aux objectifs de désinfection visés pour le liquide considéré.
Selon un aspect particulièrement avantageux de l' i nventi on, la ou au moi ns une des enzyme (s ) dont la ( ou les ) acti vi té (s ) es t (s ont ) mes u rée (s ) es t une glucos e-6-phos phate des hydrogénas e, une malate dés hydrogénas e, une glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase, une catalase, une superoxyde dismutase ou une glutathion reductase.
Ladite (ou au moins une des dites ) activité (s ) enzymatique (s ) est (sont) alors mesurée (s ) par t Tans fo rmati on d' un s ubs t rat et le cas échéant, en présence d' un co-facteur, tel que respectivement glucose-6-phosphate et co-facteur I~DP, L-malate et co-facteur NAD, glycéraldéhyde-3-phosphate et co-facteur I~D, S lucigénine, peroxyde d'hydrogène, glutathion oxydé et co-facteur NADPH.
Selon un mode avantageux de réalisation de l' invention, lesdites mesures d' activité propre et d' activité initiale sont faites à l' aide d' un appareil de détecti on d' i mens i té lumi neus e tel que spectrophotomètre, spectrofluoromètre, ou luminomètre, présentant éventuellement plusieurs canaux d' analyse.
Selon un aut re mode avantageux. de réalis ati on, de l' i nventi on, 1 adi te t raducti on en taux de mi c roo rganis mes 1S survivants à l' aide dudit système de référence pré-établi comprend, pour chaque enzyme, le calcul du rapport entre activité propre et activité initiale, éventuellement exprimé en pourcentage.
Selon encore un autre mode avantageux de réalisation de l' inventi on, ledi t s ys tème de réfé rence s e prés ente sous une forme graphique telle qu' une ou pïusieurs courbe (s ) mettant, pour chaque enzyme, ledit rapport entre activité propre et activité initiale en relation avec des valeurs de taux de microorganismes survivants 2S tels que des log d' abattement. Ledi t rappo rt ent re activité propre et activité initiale est également désignée par "activité relative" dans la présente demande.
Selon un aspect de cet autre mode avantageux de réalisation de l' invention, lesdites mesures s pect romét ri ques peuvent notamment êt re réalis ées , pour chaque activité enzymatique mesurée, à température cons tante, notamment à 25 ° C, et à longueur d' onde constante, notamment à une longueur d' onde comprise entre 3S 240 et 550 nm, par exemple à 340 nm. Lesdites mesures peuvent êt re enregis t rées de mani è re conti nue ou dis c tète sur un intervalle de temps de 30 min envi ton. Dans le cas où l' on reche rche des s ens i bi li tés de mes ure plus élevées, la luminométrie est préférentiellement utilisée.
L' étape d' ajustement de désinfection du procédé
s elon l' i nventi on peut s e fai re pa r s ui vi réguli e r de l' évo luti on du taux de mi c roo rganis mes s u rvi vants ( e . g.
exprimé en abattement, log d' abattement ou indice D) à
l' ai de des i ndi cateu rs enzymati ques ci -avant prés entés , et cela jusqu' à obtention de l' objectif de désinfection fi xé:
L' étape d' ajustement de désinfection du procédé
selon l' invention peut également se faire par ajout de l' équivalent "dos e de désinfectant (s ) " correspondant à la différence entre le taux de microorganismes survivants visé (valeur consigne) et le taux de microorganismes effectivement mesuré sur ledit liquide, échantillon de li qui de, ou concent ré, à une étape de ou ap rès dés i nfecti on.
Avantageux eurent, ledi t équi valent dos e de désinfectant (s ) est tel que lu sur une courbe de référence représentant le taux de microorganismes cultivables en fonction de la dose de désinfectant (s ) à
laquelle ledi t li qui de es t expos é.
L' i nventi on donne des tés ul tats pa rti culi è rement avantageux pou r des li qui des comp tenant des mi c roo rganismes chois is pa rmi le groupe cors ti tué
notamment par le genre Escherichia, Alcaligenes, Bacillus, Flavobacterium, Methylobacterium, Pseudomonas, Klebsiella, Enterobacterium, Agrobacterium, Streptococcus, Micrococcus, Salmonella.
Le procédé de régulation de la désinfection d' un li qui de s elon l' i nventi on peut, de mani è re particulièrement avantageuse, être facilement automatisé
WO 99/16896 1~ PCT/FR98/02045 s u r un p rocédé de dés i nf ecti on de li qui de. Cont rai rement aux techni ques de l' a rt anté ri eu r, le p rocédé s elon l' invention permet un contrôle microbiologique sûr, Tapi de et ais é à mett re en oeuvre.
De manière préférentielle, ledit taux de microorganismes survivants est exprimé en valeur d' abat terrent ( concent rati on en mi c roo rgani s mes s u rvi vants rappo rtée à la concent rati on i ni ti al e en mi c roo rganis mes survivants, telle que mesurée à ladite étape 1, de log d' abattement (-loglo (abattement) ) ou d' indice D (= log d' abattement ) . Ledi t i ndi ce D cons ti tue également un indice de la qualité microbiologique du liquide cors i dé ré.
Ledit procédé de régulation de la désinfection d' un li qui de s elon l' i nventi on cons i dè re, comme microorganismes survivants, ceux des microorganismes présents qui sont cultivables et/ou ceux des mi c roo rganismes p rés ents qui ne s ont pas culti vables mai s qui s ont vi ables . Dans le cas où l' on s ouhai te teni r compte à la fois des microorganismes cultivables et des microorganismes non cultivables mais viables, ledit s ys tème de réfé rence met alo rs avantageas eurent, pour chaque enzyme, ledi t rappo rt ent re acti vi té p rop re et activité initiale en relation avec des valeurs de taux de mi c roo rganismes s urvi vants rés ultant de l' addi ti on des valeurs de taux de microorganismes cultivables et des valeurs de taux de microorganismes non cultivables mais vi ables , tels que mes urés à 1' ai de des techni ques classiques.
Pa rmi les di ts agents chi mi ques ou phys i ques avantageas eurent uti lis és pour ladi te désinfecti on, peuvent être cités le chlore et ses dérivés, les W, l' ozone, H202, les membranes filtrantes, la température, les ult ra-s ons , les rayonnements i onis ants .
D' aut res ca radé ris ti ques et avantages de la p rés ente i nventi on appa raît ront enco re à t rave rs les exemples de xéalis ati on s ui vants , donnés à ti t re i ndi cati f et non lirai tati fs .
Lesdits exemples font référence aux figures l, 2 et La fi Bure 1 représ ente le taux de bacté ri es Es cherichia col.i cultivables (exprimé en valeur d' abattement par rapport à la population initiale) en foncti on de la concent rati on en chlo re li b re appli quée (mg/1) , La figure 2 représente l' activité glucose-6-phosphate déshydrogénase (ZWF) , exprimée en ~ de l' activité maximale mesurée, en fonction du taux de bactéries cultivables (exprimé en valeurs d' abattement pa r rappo rt à la populati on mi c robi enne i ni ti ale ) , La fi Bure 3 rep rés ente l' acti vi té glutathi on réductas e, exprimée en ~ de l' activi té ini ti ale (maximale) mesurée, en fonction du taux de bactéries cultivables (exprimé en valeurs d' abattement par rapport à la population microbienne maximale).
EXEMPLE 1 Contrôle microbiologique d'une eau en désinfection destinée à la consommation humaine.
On che rche à déte rmi ne r s i des acti vi tés enzymati ques peuvent tons ti tue r un i ndi cateu r fi able du taux de mi c roo rgani s mes s u rvi vants dans un li qui de en dés i nfecti on tel qu' une eau des ti née à la cors ommati on humai ne.
Méthodes et Résultats A ce titre, on réalise un inoculum par culture pure d'Escherichia coli (souche MG1655 disponible auprès de l' Institut Pasteur) sur milieu nutritif â 25°C (milieu LB
comprenant 10 g/1 de tryptone B3cto, 5 g/1 d'extrait de levure ~cto, 10 g/1 de NaCl, pH ajusté à 7). Les bacté ri es s ont récoltées en phas e exponenti elle de croissance par centrifugation puis lavées à l'aide d'un tampon phosphate (pH 7 ; 0, 05 M) . Les culots sont remis en suspension (environ 5.10 celJules/ml) dans des solutions de tampon phosphate (pH 7 ; 0, 05 M) comprenant du chlore libre à différentes concentrations (de 0, 0 à
2, 0 mg/1) . Les différentes suspensions bactériennes sont ens ui te placées s ous agi tati on à 25 ° C. Au bout de 2 0 mi n, on prélève alors pour analyses des échantillons de ces suspensions bactériennes (volume de 100 à 1 000 ml par activité enzymatique à mesurer) .
Pour chaque échantillon, on mesure en parallèle le taux de microorganismes survivants et différentes acti vi tés enzyniati ques s elon les méthodes s ui vantes .
Numération des microorganismes survivants On compte, pou r chaque échanti l lon de s us pens i on bactérienne, le nombre de microorganismes qui ont survécu, i. e. le nombre de bactéries cultivables et/ou le nombre de bactéries non cultivables mais viables.
La numé rati on des mi c roo rganis mes s u rvi vants peut s e fai re s elon des techni ques classi ques connues de l' homme du métier . par exemple, par étalement sur un milieu gélosé tel qu'un milieu de TSA (Tryptic Soy Agar, Difco) pour la numération des bactéries cultivables, et par la techni que du C. T. C. pour la numé rati on des bacté ri es non cultivables mais viables ( Schaule G. , Flemrning H. C. et F~.dgway H. F. 1993, Use of 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride for quantifying planktonic and sessile bacteria in drinking water, Appl. Environ. Microbiol. 59 : 3850-3857) .
A parti r du nombre moyen ni mesuré; on calcule alors la content rati on moyenne ( Ci ) en mi c roo rganis mes survivants à chacune des doses i de chlore libre testée.
Chaque content rati on moyenne Ci en mi c roo rganis mes survivants est alors exprimée relativement à la concentration maximale en microorganismes survivants telle que mesurée avant désinfection (concentration maximale Cmax) . Dans le cas de la prés ente i llus trati on, Cma~ co r res pond à la content rati on moyenne en microorgani.smes survivants telle que mesurée en l' absence de chlore libre. Chaque Ci est ainsi traduite en valeur d' abattement (ou d' élimination) à l' aide de la formule abattement = Ci ~ Cmax Ce taux de microorganismes survivants ~' Cmex représente également une mesure de la qualité de dés i nf ecti on.
Les rés ul tats des numé rati ons de mi c roo rganis mes culti vables s ont i l lus t rés pa r la fi gu re 1 où es t repo rté
le taux de bactéries E. coli cultivables ~en fonction de la dose en chlore libre subie. En ordonnée de la figure 1, sont reportées les valeurs d' abattement (ou d' é lirai nati on ) co r res pondant aux content rati ons en microorganismes cultivables telles qu' obtenues par numration, et rapportes la concentration maximale mesure avant dsinfection . 10 indique, une concentration en microorganismes cultiv ables gale la concept rati on maximale mes ure ; 10-' indi que que la concentration en microorganismes cultivables a diminu d' un facteur de 10, 10-' indique que la concentration en microorganismes cultivables a diminu d' un facteur de 10~
etc. En abs ciss e de la fi gure 1, es t repo rte la concentration initiale en chlore libre de la suspension bactrienne correspondante. On procde l' identique avec ~
les rsultats des numrations de microorganismes non cultivables mais viables, qui peuvent, si dsir, tre addi ti onns aux rs ul t ats de num rati on des microorganismes cultivables.
Activités enzymatiques Parallèlement à la numération des microorganismes survivants ci-avant décrite, sont mesurées différentes acti vi tés enzymati ques .
Sont i ci plus pa rti culi è rement repo rtées les expériences relatives à deux enzymes . la glucose-6-phosphate déshydrogénase (ci-après désignée ZWF) et la glutathion réductase. Ces enzymes sont communément p rés entes che z de nomb ceux mi c roo rganis mes , el les s ont donc s us ceptibles de pouvoi r représ ente r l' ens emble des popul ati ons mi c robi ennes prés entes dans les s us pens i ons et ainsi de donner l' image résultante de la désinfection réalis ée.
Dans les expé ri ences i ci déc ri tes , les bacté ri es en s us pers i on s ont à de t rop f ai bles concept rati ons pou r que leurs activités enzymatiques puissent être correctement mes urées di rectement sur l' échanti llon li qui de p rélevé
s ans concept rati on p réalable. Les échanti llons de suspensions sont donc ici filtrés (membrane de 0,22 Eun) de manière à en récolter les microorganismes. Les microorganismes peuvent également étre récoltés par centrifugation à 3 000 g pendant 10 min à 4°C.
Les études compa rate ves menées mont cent qu' i 1 es t préférable de lyser les microorganismes préalablement à
la mesure d' activités ZWF ou glutathion réductase. Les fi lt res ( ou culot ) s ont donc i ci placés dans un s ys tème permettant la lyse des microorganismes récoltés préalablement à une mesure d' activité ZWF ou glutathion réductase, la lyse des microorganismes se fait de manière préférentielle par une sonde à ultrasons (2 cycles de 30s sous ultra-sons et 30s en repos ) . On peut noter que, pour mes ure r l' acte vi té d' enzymes aut res que ZWF ou glutathi on réductase, telles que e. g. catalase ou superoxyde dismutase, la lyse préalable des microorganismes peut êt re évi tée en uti lis ant un s ubs t rat di f fus ant tel que la luci géni ne et le pe roxyde d' hydrogène.
Les di f f é rentes acte vi tés enzymati ques peuvent êt re mes urées s elon des techni ques connues de l' homme du méti e r. ~i èvement, pou r chaque acte vi té enzymati que à
mes u re r, les mi c roo rganismes de chaque échanti l lon s ont placés en contact avec un s ubs t rat choisi de mani è re à ce que l' enzyme ci blée puiss e catalys e r s a t rans fo rmati on et à ce que cette t Tans fo rmati on enzymati que puiss e êt re aisément suivie par les techniques analytiques classiques telles que spectrocolorimétrie, spectrofluorométrie, ou lame nomé t ri e pou r les quel les une automates ati on es t réalis able.
Pou r mes u re r une acte vi té glucos e- 6-phos phate déshydrogénase, on place les microorganismes de l' échanti l lon en contact avec un s ubs t rat compos é de WO 99/Ib896 16 PCT/FR98/02045 glucose-6-phosphate 0, 6 mM et de nicotinamide adénine dinucléotide phosphate sous forme oxydée (1~F~DP 0, 2 mM) en p rés ence d' une s oluti on s tabi lis ant le pH ( aj out de tampon Tris pH 7,6 MgCl2 lOmM). Ce substrat conduit, en . p rés ence de glucos e- 6-phos phate dés hydrogénas e, à la formation de nicotinamide adénine dinucléotide phosphate s ous f o rme rédui te ~ (NADPH ) dont on peut s ui v re l' apparition par spectrocolorimétrie à la longueur d' onde de 340 nm (Fraenkel D. G. et Levisohn S. R 1967, Glucose and gluconate metabolism in an Escherichia coli mutant lacking phosphoglucose isomerase, J. B~ct 93 . 1571-1578).
Pou r mes u re r une acti vi té glutathi on réductas e, or_ place les microorganismes de l' échantillon en contact avec un s ubs t rat compos é de ni coti nami de adéni ne dinucléotide phosphate sous forme réduite (NA.DPH 0, 2 mM) et de glutathion oxydé (disulfure de glutathion GS-SG 2,5 mM) en p rés ence d' une s oluti on s tabi lis ant le pH ( tampon phos phate 100 mM pH 7 ) . Sous l' acti on catalyti que de la glutathi on réductas e, ce s ubs t rat es t t rans fo rmé en nicotinamide adénine dinucléotide phosphate sous forme oxydée (I~DP) et en glutathion sous forme réduite (GSH) .
La disparition de NFLDPH est alors suivie au spectrocolorimétre à la longueur d' onde de 340 nm (Lopez-83rea J. et Lee C. Y. 1979, Mouse liver glutathione reductase: purification, kinetics and regulation, Eur. J.
I~ochem. 98 : 487-499) .
Les mes ures d' acti vi tés enzymati ques s ont i ci réalis ées à une tempé rature Gons tante i demi que ( 25 ° C) à
l' aide d' un spectrophotomètre PERKIN-ELMER modèle lambda 1.
La valeur de densi té opti que mes urée avant le déma r rage de 1 a réacti on enz ymati que cors i dé rée s e rt de WO 99/Ib896 1 ~ PCT/FR98/02045 "blanc de mesure". Les valeurs de densités optiques p rop res de chaque mi li eu réacti onnel s ont alo rs enregistrées au cours du temps.
L' acti vi té enzymati que p rop re de l' échanti llon es t ensuite calculée dans la partie linéaire de la courbe rep rés entant la deus i té opti que p rop re obs e ruée ap rès la mise en contact du substrat avec l' enzyme ciblée (par exemple, entre 5 min et 35 min) . Le calcul de la pente de la cou rbe "dens i té opti que p rop re de l' échanti l lon en foncti on du temps " dans l' i nte rvalle de temps 5 -35 mi n considéré donne une valeur de cette variation de densité
opti que p rop re.
Pour chaque enzyme, les activités enzymatiques propres mesurées aux différentes doses de désinfectants ( quanti té de s ubs t rat cons ommé ou p rodui t pa r uni té de temps ) s ont chacune exprimées en °s de la valeur ini ti ale d' activité enregistrée pour la méme enzyme, i. e. en ~ de la valeur d' activité mesurée, pour la même enzyme, à la plus faible dose de désinfectant . dans la présente i l lus t rati on, l' acti vi té p rop re glucos e-6-phos phate déshydrogénase (ZWF) et l' activité propre glutathion réductas e des échanti l lons s ont exp rimées en ~ de l' activité propre glucose-6-phosphate déshydrogénase (ZWF) et, respectivement, glutathion réductase telle que mesurée pour les suspensions bactériennes ne comportant pas de chlore libre (i, e. avant désinfection) . Ce rapport ent re acti vi té enzymati que p rop re du li qui de à une étape du procédé de désinfection (i. e. en cours ou après désinfection) et activité enzymatique propre de ce même li qui de avant dés i nf ecti on es t i ci dés i gné acti vi té
enzymatique relative du liquide â ladite étape de dés i nf ecti on.
WO 99/16896 1 g PCT/FR98/02045 Les activi tés enzymati ques relatives obtenues s ont alo rs compa rées aux mes unes de numé rati ons mi c robi ologi ques . Les rés ultats des numé rati ons de microorganismes cultivables sont illustrés par les figures 2 et 3.
La fi gu re 2 rep rés ente, en o rdonnée, l' acti vi té
glucose-6-phosphate déshydrogénase (ZWF) mesurée, exprimée en % du maximum (activité initiale) d' activité
enregistré, et, en abscisse, le nombre correspondant de E. col.i cultivables obtenu par numération.
La fi gure 3 rep rés ente, en o rdonnée, l' acti vi té
glutathion réductase mesurée, exprimée en % du maximum d' activité enregistré (activité initiale), et, en abscisse, le nombre correspondant de E, coli cultivables obtenu pa r numé rati on.
En figure 2 tout comme en figure 3, le nombre de microorganismes survivants est exprimé en fonction du log d' abattement subi selon la formule suivante log d' abattement = - loglo ( Ci / C~X) où Ci et C~X sont tels que définis ci-avant.
Si nécess ai re, les mêmes types de fi gures peuvent êt re réalis ées en tenant compte des rés ultats des numérations de microorganismes non cultivables mais vi ab 1 es .
En figure 2 tout comme en figure 3, les valeurs de log d' abattement s ont repo rtées sur l' axe des abs ciss es de la manière suivante . 1E+00 représente un nombre de microorganismes cultivables égal au nombre maximal enregistré (suspension ne présentant pas de chlore libre) ; lE-O1 représente un nombre de microorganismes cultivables égal au nombre maximal enregistré diminué
d' un nomb re de mi c roo rgani s mes co r res pondant à une valeu r de log d' abattement de 1 ; lE-02 représente un nombre de microorganismes cultivables égal au nombre maximal enregistré diminué d' un nombre de microorganismes correspondant à une valeur de log d'abattement de 2, et ainsi de suite jusqu' à lE-07 qui représente un nombre de microorganismes cultivables égal au nombre maximal enregistré diminué d' un nombre de microorganismes correspondant à une valeur de log d'abattement de 7.
On peut noter que cette valeur de log d'abattement cons ti tue également un indi ce de la quali té
mi c robi ologi que du li qui de cons i dé ré, i ndi ce que nous nommons D.
Les résultats obtenus montrent que le suivi de l' acti vi té glucos e- 6-phos phate dés hydrogénas e ( acti vi té
relative ) es t un indi cateur représ entati f du nombre de microorganismes survivants pour une gamme d' échantillons allant des échanti lions de li qui de n' ayant s ubi aucun traitement d' élimination des microorganismes jusqu' aux échantilions de liquide présentant un log d' abattement (ou d' élimination) inférieur ou égal à 3 envi ron. (cf.
figure 2) .
Les résultats obtenus montrent également que l' activité glutathion réductase (activité relative) est un i ndi cateu r rep rés entati f du nomb re de mi c roo rganis mes s u rvi vants pou r une gamme d' échanti l ions de li qui de présentant un log d' abattement (ou d' élimination) compris entre 4 et 7 envi ron. (cf. figure 3) . En effet, l' activi té de la glutathi on réductas e n' es t pas s i gni fi cati vement af f ectée avant que ne s oi ent atteints 4 log d' abattement. Une p Topo rti onnali té s i gni fi cati ve ent re acti vi té relative et log d' abattement n' es t observée, pour cette enzyme, que sur la zone des log d' abattement compris entre 4 et 7 envi ron.
WO 99/16896 PC'T/FR98/02045 De mani è re s imi lai re, nous avons pu démont re r que l'activité (relative) superoxyde dismutase (mesures en luminométrie à l' aide de lucigénine) est un indicateur représentatif du nombre de microorganismes survivants 5 , pou r une gamme d' échanti l lons de li qui de p rés entant ur~
log d' abattement (ou d' élimination) compris entre 3 et 6 envi ron. Les s uperoxydes dismutas es et les catalas es p rés entent de plus l' avantage de ne pas nécess i te r de traitement de lyse : la mesure de leur activité peut être 10 réalis ée sur un s ubs t rat di f fus ant tel que la luci Béni ne, ou respectivement le peroxyde d' hydrogène, par lumi nomét ri e.
Les différentes enzymes testées ne couvrent donc pas les mêmes domaines de sensibilité . l' activité relative 15 de la glucos e-6-phos phate dés hydrogénas e ( ZWF) es t ur~
i ndi cateu r rep rés entati f du nomb re de mi c roo rganis mes s u rvi vants ( log d' abattement ) dans des échanti l lors de liquide n' ayant subi que de faibles diminutions relatives de populati ons mi c robi ennes , l' acti vi té relati ve de la 20 s upe roxyde dismutas e et de la glutathi on réductas e s ont des indicateurs représentatifs du nombre de microorganismes survivants (log d' abattement) dans des échanti llons de li qui de ayant s ubi des di mi nuti ons relati ves de populati ons mi c robi ennes moyennes à fo ries .
Les mêmes types de gammes de s ensibi li té
(proportionnalité entre activité relative et log d' abattement pour certaines zones de valeurs de log d' abattement ) ont pu êt re obs e rvés en mes urant l' acti vi té
relative de la malate déshydrogénase, la glycéraldéhyde-3-phosphate dés hydrogénas e, les catalas es (s oi t par mesure de la consommation de peroxyde d' hydrogène à 240 nm dans une s oluti on tamponnée à pH 7 s oi t pa r chi mi olumi nes cence ) . L' homme du méti e r pou r ra t rouve r WO 99/16896 21 PC'f/FR98/02045 d' autres exemples d' enzymes et de protocoles de mesure d' activités enzymatiques dans différents ouvrages de référence tels que . Oxidative stress and the molecular biology of antioxidant defenses, 1997, Cold Spring Harbor Laboratory Press 0-87969-502-1/97 ; Lehninger 1977, »ochimie, Flammarion ISH~1 2-257-25009-5 ; Methods in Enzymology, Academic Press Inc. , e. g. volumes I-XLI-XLII-89-105 et 234.
Toute enzyme pour laquelle une proportionnalité
significative (pente significative, par exemple inférieure à -0,2) entre activité relative et log d'abattement peut être mise en évidence, par exemple en suivant le protocole ci-dessus décrit, constitue ur.
indicateur fiable selon l' invention.
Les mêmes types de gammes de s ens i bi li té enzymati que peuvent êt re obtenus en appli quant aux s uspensi ons de E.
coli non pas des doses croissantes de chlore mais des dos es croiss antes en ozone ou des dos es croiss antes en W.
Discussion I1 apparaS~t donc que la mesure d' activités enzymatiques permet de suivre l' évolution des populations mi c robi ennes dans un li qui de en dés i nf ecti on. Ces différents indicateurs enzymatiques de survie microbienne permettent de rendre compte de la totalité des populations microbiennes . microorganismes cultivables et mi c roo rganismes non culti vables mais vi ables .
On peut par exemple suivre l' activité relative ZWF
pour des log d' abattement inférieurs à 3, et l' activité
relative glutathion réductase pour des log d' abattement supérieurs à 4. Dans le cas où une mesure précise d' un log d' abattement compris entre 3 et 4 est requise, on peut alors par exemple mesurer une activité relative s upe roxyde dis mutas e.
Dans le cas où la désinfection effectuée n' a pas à
condui re à des log d' abattement s upé ri eurs à 6, on peut alors soit simplement suivre l' activité relative superoxyde dismutase, qui ne commencera à répondre qu' à
parti r de log d' abattement supérieurs à 3, soit suivre l' activité relative ZWF jusqu' aux log d' abattement de 3, puis l' activité relative superoxyde dismutase au-delà.
Les différents types d' indicateurs enzymatiques de s u rvi e mi c robi enne ci -avant p rés entés pe rmettent donc de connaître la valeur de log d' abattement du liquide contrôlé, et par là même, son indice D de qualité
microbiologique, sa valeur d' abattement, et le nombre de microorganismes qui y survivent. Ils donnent donc in fine une mesure de la vitesse et de l' efficacité du procédé de désinfection appliqué.
Si 1 e nomb re de mi c roo rganis mes s u rvi vants dans le liquide contrôlé (e. g. exprimé sous la forme d' un log d' abattement ou indice de qualité de désinfection) ne correspond pas à l' objectif de désinfection fixé (e. g.
valeur consigne du log d' abattement ou de qualité de désinfection) , la dose de désinfectant (s ) appliquée audit li qui de ( e . g. la concent rati on en chlo re lib re, en ozone, la dose d' U. V. , de température, d' ultra-sons, de rayonnements i onis ants ) peut êt re aj us tée en cons équence.
Cette augmentation ou diminution de la dose de désinfectant (s ) peut se fai re en suivant de manière réguli è re l' évoluti on du nomb re de mi c roo rganis mes survivants (log d' abattement) à l' aide des indicateurs enzymati ques ci -avant p rés entés et cela j us qu' à obtenti on de l' obj ecti f de dés i nf ecti on fi xé.
L' ajustement de la dose de désinfectant (s ) peut également se tai re à l' aide de courbes de référence pré
s établi es sur un échanti llon dudi t li qui de rep rés entant le taux de~ microrganismes survivants, e. g. exprimé en valeurs de log d' abattement, en fonction de la dose de désinfectant (s } appliquée (e. g. doses croissantes de chlore libre, d' ozone, d' U. V. , de température ultra-sons, rayonnements i onis ants ) .
De telles courbes de référence permettent de lire les valeurs de doses de désinfectant (s ) équivalentes respectivement au taux mesuré et taux dési ré de mi c roo rgani s mes s u rvi vants t e ls qu' obtenus à l' ai de des indicateurs enzymatiques ci-avant présentés. I1 suffit alors d' augmenter ou de diminuer la dose de dés i nfectant (s ) appli quée au li qui de sont rôlé de la di f fé rence lue ent re ces équi valents dos es de désinfectant(s).
De telles courbes de référence peuvent par exemple ê t re obtenues en dénomb Tant 1 es mi c roo rgani s mes s u rvi vants dans un échanti 1 lon dudi t li qui de expos ë à
des doses croissantes de désinfection (e.g.
concentrations croissantes en chlore libre, en ozone, dos es c roiss antes en U. V. de rayonnements i onis ants , d' ultra-sons, valeurs croissantes de température) .
Le procédé de régulation de la désinfection d' un li qui de s elon l' i nventi on pe rmet donc, à l' ai de de mes unes d' activi tés enzymati ques , de cont rôle r de mani ë re complète, simple et rapide (moins d' une heure) la désinfection d' un liquide, et cela quel que soit l' état phys i o logi que ou l' i demi té des mi c roo rganis mes qui y survivent. Le procédé de régulation de la désinfection WO 99/16896 2~ PCT/F'R98/02045 d' un li guide s elon l' i nventi on prés ente de plus l' avantage pa rti culi e r d' êt re ais ément automatis able, contrai rement aux procédés mettant en oeuvre les techni ques de mi c ros copi es ou de cultures mi c robi ologi ques .
Il demeure bien entendu que la présente invention n' est pas limitée aux exemples de réalisation décrits et représ entés ci-dess us , mais qu' elle en englobe toutes les variantes. C' est ainsi que notamment les mesures d' activités enzymatiques peuvent être réalisées par des techniques analytiques autres que celles ci-dessus menti onnées .
Une méthode actuellement disponible pour cantrôler de manière quasi-certaine l' efficacité de la désinfection d' un li qui de uti lis e des techni ques de mi cros copi es as s oci ées à des colo rati ons s péci fi ques . Cette méthode permet une discrimination entre bactéries cultivables, bactéries non cultivables mais viables et bactéries mortes. Elle nécessite cependant la mise en oeuvre de plusieurs tests de colorations pour chaque échantillon et es t techni quement di f fi ci lement automates able.
La présente invention vise à pallier les inconvénients des techniques de l' art antérieur et p Topos e un p rocédé de régulati on de la dés i nf ecti on d' un liquide, caractérisé en ce qu' il comprend A. à une étape de ladite désinfection ci-après désignée étape 2, la mesure de l' activité d' au moins une enzyme pa r mis e en contact des mi c roo rganismes éventuellement p Tés ents dans ledi t li qui de avec un substrat choisi comme étant capable de révéler l' activité
de cette ou ces enzyme (s ) , notamment par trans formation dudi t s ubs t rat en compos és colo Tés , f luo Tes cents ou luminescents ou par disparition dudit substrat, cette WO 99!16896 4 PCT/FR98/02045 activité enzymatique étant ci-après nommée activité
p rop re, B à une étape ci-après désignée étape 1, antérieure à ladite étape 2, la mesure de l' activité de la ou des même (s ) enzyme (s ) qu' en A, ceiae activité étant ci-après désignée activité initiale, C. la traduction, pour chaque enzyme, desdites activité propre et activité initiale, en taux de microorganismes survivants dans le ledit liquide à
l' étape 2 de ladite désinfection, et cela par l' intermédiaire d' un système de référence, pré-établi à
l' ai de d' un échanti l lon dudi t li qui de prélevé à ladi te étape 1 puis exposé à des doses de désinfectant (s ) croissantes, ainsi que D. l' aj us terrent, en foncti on dudi t taux de microorganismes survivants, de la nature et/ou des doses du ( des ) agent (s ) chi mi que (s ) ou phys i que (s ) uti lis é (s ) pour ladite désinfection.
Pa r mi c roo rganis mes s u rvi vants , nous ent dans endons la prsente demande microorganismes cultivables et/ou microorganismes non cultivables mais viables.
Par taux de microorganismes survivants, nous entendons dans la prsente demande le rapport entre concent rati on en mi c roo rganis mes s u rvi vants ledi dans t liquide ladite tape 2 de dsinfection et la concent rati on en mi c roo rganis mes s u rvi vants mme dans le liquide ladite tape 1. Ce taux de microorganismes survivants est prfrentiellement exprim en valeurs d' abattement sous la forme de puissances ngatives de 10, ou en log d' abattement qui co r res pond - loglc (abattement).
Ladite tape 1 peut, par exemple, correspondre une tape "avant dsinfection" dudit liquide et ladite tape 2 une tape quelconque du procd de dsinfection, (tapes " aprs dsinfection" dudit liquide y compris ) .
Le procd selon l' invention s' adresse des liquides dans lesquels les ventuellement microorganismes prs ents s ont s oumis des condi ti ons tout--fai t pa rti culi res , s avoi r condi ti ons ds i nf ecti des de on, induis ant un s t ress notabledes cellules .
Le procédé de la régulation de la désinfection d' un li qui de s elon l' i nventi on s' adres s e pa rti culi è rement aux liquides destinés à être mis en contact avec un homme ou un animal, que cela soit par simple contact, absorption, i nges ti on, i ns ti 11 ati on ou i nj ecti on. I 1 s' app li que pa rti culi è rement à des li qui des des ti nés à êt re en contact avec un homme ou un animal tel qu' une eau de bai gnade, une eau des ti née à la cons ommati on, une eau des ti née à des p répa rati ons pha rmaceuti ques ou biotechnologiques, ou un liquide alimentaire.
Ladi te mis e en contact des mi c roo rganis mes éventuellement p rés ents dans ledi t li qui de avec ledi t substrat peut être réalisée par mise en contact directe dudi t li qui de ou d' un échanti l lon dudi t li qui de avec ledi t s ubs t rat, ou bi en pa r mis e en contact d' un concent ré des di ts mi c roo rganis mes éventuel l eurent p rés ents tel que filtrat, ou culot de centrifugation, dudit li qui de ou échanti llon de li qui de, avec ledi t s ubs t rat.
Préalablement à la mesure de l' activité de certaines enzymes telles que la glucose-6-phosphate déshydrogénase ou la glutathion réductase, le procédé selon l' invention comprend, de manière avantageuse, l' étape de faire subir audi t li qui de, échanti l lon de li qui de, ou concent ré, un t rai terrent de lys e, notamment pa r s oni cati on.
Préalablement à la mesure de l' activité d' autres enzymes telles que catalase ou superoxyde dismutase, l' étape de lyse préalable peut être évitée . l' activité
de ces enzymes peut être mesurée à l' aide d' un substrat diffusant à l' intérieur des microorganismes, tel que la lucigénine et le peroxyde d' hydrogène.
Selon un aspect avantageux de l' invention, la ou les enzyme (s ) dont la ( ou les ) acti vi té (s ) es t (s ont ) mes u rée (s ) p rés ente ( ent ) , dans ledi t li qui de, échantillon de liquide, ou concentré, un rapport entre activité propre et activité initiale en relation affine, et avec une pente significative différente de zéro, préférentiellement inférieure à -0,2, avec le taux de 1 S mi c roo rgani s mes s u rvi vants s u r au moi ns une zone de valeurs desdits taux de microorganismes survivants. C' est par exemple le cas de la glucose-6-phosphate déshydrogénase pour des log d' abattement compris entre 0 et 3 envi ron, de la glutathion réductas e pour des log d' abattement compris entre 4 et 7 envi ron, de la superoxyde dismutase pour des log d' abattement compris ent re 3 et 6 envi ron.
D' autres enzymes d' intérêt peuvent notamment fai re parti e de la farci lle des dés hydrogénas es ou de la farci lle des enzymes impli quées dans la répons e au s t ress oxydant.
Pour déterminer si une (ou des ) enzyme (s ) est (sont) appropriée (s ) à la mise en oeuvre de la méthode de régulation selon l' invention sur un liquide donné, il pourra être procédé comme suit - prélèvement d' au moins un échantillon dudit li qui de et mes u re de 1 a concent rati on en mi c roo rganis mes survivants (microorganismes cultivables et/ou microorganismes non cultivables mais viables ) , notamment par culture surgélose et/ou par colorations et obs e rvati ons au mi c ros cope, WO 99/16896 ~ PCTlFR98/02045 - dosage de l' activité de chaque enzyme candidate, sur cet ou ces échantilion(s) de liquide, - expos i ti on dudi t ( des di ts ) échanti llon (s ) de liquide à différentes doses de désinfectant (s ) dans des conditions par ailleurs équivalentes (e. g. conditions de durée d'exposition, de température), - mesure de l' activité de chaque enzyme candidate ap rés expos i ti on aux di f f é rentes dos es de désinfectant(s), - réalisation, pour chaque enzyme candidate, d' une courbe présentant les pourcentages d' activité (activité
enzymatique mesurée, après exposition aux différentes doses de désinfectant (s ) rapportée à l' activité
enz ymati que co r res pondante avant expos i ti on ) en foncti on des log d' abattement mesurés (tels que ci-avant définis ) , - détermination, pour chaque enzyme candidate, de la zone de log d'abattement pour laquelle la pente de ladite cou rbe es t s i gni fi cati vement di f f é rente de z é ro, préférentiellement inférieure à -0, 2, cette zone cons ti tuant la gamme de répons e de l' enzyme candidate considérée sur ledit liquide, - une enzyme candi date es t app rop ri ée à la mis e en oeuvre de la méthode selon l' invention sur ledit liquide si sa gamme de réponse comprend les valeurs de log d' abattement correspondant aux objectifs de désinfection visés pour le liquide considéré.
Selon un aspect particulièrement avantageux de l' i nventi on, la ou au moi ns une des enzyme (s ) dont la ( ou les ) acti vi té (s ) es t (s ont ) mes u rée (s ) es t une glucos e-6-phos phate des hydrogénas e, une malate dés hydrogénas e, une glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase, une catalase, une superoxyde dismutase ou une glutathion reductase.
Ladite (ou au moins une des dites ) activité (s ) enzymatique (s ) est (sont) alors mesurée (s ) par t Tans fo rmati on d' un s ubs t rat et le cas échéant, en présence d' un co-facteur, tel que respectivement glucose-6-phosphate et co-facteur I~DP, L-malate et co-facteur NAD, glycéraldéhyde-3-phosphate et co-facteur I~D, S lucigénine, peroxyde d'hydrogène, glutathion oxydé et co-facteur NADPH.
Selon un mode avantageux de réalisation de l' invention, lesdites mesures d' activité propre et d' activité initiale sont faites à l' aide d' un appareil de détecti on d' i mens i té lumi neus e tel que spectrophotomètre, spectrofluoromètre, ou luminomètre, présentant éventuellement plusieurs canaux d' analyse.
Selon un aut re mode avantageux. de réalis ati on, de l' i nventi on, 1 adi te t raducti on en taux de mi c roo rganis mes 1S survivants à l' aide dudit système de référence pré-établi comprend, pour chaque enzyme, le calcul du rapport entre activité propre et activité initiale, éventuellement exprimé en pourcentage.
Selon encore un autre mode avantageux de réalisation de l' inventi on, ledi t s ys tème de réfé rence s e prés ente sous une forme graphique telle qu' une ou pïusieurs courbe (s ) mettant, pour chaque enzyme, ledit rapport entre activité propre et activité initiale en relation avec des valeurs de taux de microorganismes survivants 2S tels que des log d' abattement. Ledi t rappo rt ent re activité propre et activité initiale est également désignée par "activité relative" dans la présente demande.
Selon un aspect de cet autre mode avantageux de réalisation de l' invention, lesdites mesures s pect romét ri ques peuvent notamment êt re réalis ées , pour chaque activité enzymatique mesurée, à température cons tante, notamment à 25 ° C, et à longueur d' onde constante, notamment à une longueur d' onde comprise entre 3S 240 et 550 nm, par exemple à 340 nm. Lesdites mesures peuvent êt re enregis t rées de mani è re conti nue ou dis c tète sur un intervalle de temps de 30 min envi ton. Dans le cas où l' on reche rche des s ens i bi li tés de mes ure plus élevées, la luminométrie est préférentiellement utilisée.
L' étape d' ajustement de désinfection du procédé
s elon l' i nventi on peut s e fai re pa r s ui vi réguli e r de l' évo luti on du taux de mi c roo rganis mes s u rvi vants ( e . g.
exprimé en abattement, log d' abattement ou indice D) à
l' ai de des i ndi cateu rs enzymati ques ci -avant prés entés , et cela jusqu' à obtention de l' objectif de désinfection fi xé:
L' étape d' ajustement de désinfection du procédé
selon l' invention peut également se faire par ajout de l' équivalent "dos e de désinfectant (s ) " correspondant à la différence entre le taux de microorganismes survivants visé (valeur consigne) et le taux de microorganismes effectivement mesuré sur ledit liquide, échantillon de li qui de, ou concent ré, à une étape de ou ap rès dés i nfecti on.
Avantageux eurent, ledi t équi valent dos e de désinfectant (s ) est tel que lu sur une courbe de référence représentant le taux de microorganismes cultivables en fonction de la dose de désinfectant (s ) à
laquelle ledi t li qui de es t expos é.
L' i nventi on donne des tés ul tats pa rti culi è rement avantageux pou r des li qui des comp tenant des mi c roo rganismes chois is pa rmi le groupe cors ti tué
notamment par le genre Escherichia, Alcaligenes, Bacillus, Flavobacterium, Methylobacterium, Pseudomonas, Klebsiella, Enterobacterium, Agrobacterium, Streptococcus, Micrococcus, Salmonella.
Le procédé de régulation de la désinfection d' un li qui de s elon l' i nventi on peut, de mani è re particulièrement avantageuse, être facilement automatisé
WO 99/16896 1~ PCT/FR98/02045 s u r un p rocédé de dés i nf ecti on de li qui de. Cont rai rement aux techni ques de l' a rt anté ri eu r, le p rocédé s elon l' invention permet un contrôle microbiologique sûr, Tapi de et ais é à mett re en oeuvre.
De manière préférentielle, ledit taux de microorganismes survivants est exprimé en valeur d' abat terrent ( concent rati on en mi c roo rgani s mes s u rvi vants rappo rtée à la concent rati on i ni ti al e en mi c roo rganis mes survivants, telle que mesurée à ladite étape 1, de log d' abattement (-loglo (abattement) ) ou d' indice D (= log d' abattement ) . Ledi t i ndi ce D cons ti tue également un indice de la qualité microbiologique du liquide cors i dé ré.
Ledit procédé de régulation de la désinfection d' un li qui de s elon l' i nventi on cons i dè re, comme microorganismes survivants, ceux des microorganismes présents qui sont cultivables et/ou ceux des mi c roo rganismes p rés ents qui ne s ont pas culti vables mai s qui s ont vi ables . Dans le cas où l' on s ouhai te teni r compte à la fois des microorganismes cultivables et des microorganismes non cultivables mais viables, ledit s ys tème de réfé rence met alo rs avantageas eurent, pour chaque enzyme, ledi t rappo rt ent re acti vi té p rop re et activité initiale en relation avec des valeurs de taux de mi c roo rganismes s urvi vants rés ultant de l' addi ti on des valeurs de taux de microorganismes cultivables et des valeurs de taux de microorganismes non cultivables mais vi ables , tels que mes urés à 1' ai de des techni ques classiques.
Pa rmi les di ts agents chi mi ques ou phys i ques avantageas eurent uti lis és pour ladi te désinfecti on, peuvent être cités le chlore et ses dérivés, les W, l' ozone, H202, les membranes filtrantes, la température, les ult ra-s ons , les rayonnements i onis ants .
D' aut res ca radé ris ti ques et avantages de la p rés ente i nventi on appa raît ront enco re à t rave rs les exemples de xéalis ati on s ui vants , donnés à ti t re i ndi cati f et non lirai tati fs .
Lesdits exemples font référence aux figures l, 2 et La fi Bure 1 représ ente le taux de bacté ri es Es cherichia col.i cultivables (exprimé en valeur d' abattement par rapport à la population initiale) en foncti on de la concent rati on en chlo re li b re appli quée (mg/1) , La figure 2 représente l' activité glucose-6-phosphate déshydrogénase (ZWF) , exprimée en ~ de l' activité maximale mesurée, en fonction du taux de bactéries cultivables (exprimé en valeurs d' abattement pa r rappo rt à la populati on mi c robi enne i ni ti ale ) , La fi Bure 3 rep rés ente l' acti vi té glutathi on réductas e, exprimée en ~ de l' activi té ini ti ale (maximale) mesurée, en fonction du taux de bactéries cultivables (exprimé en valeurs d' abattement par rapport à la population microbienne maximale).
EXEMPLE 1 Contrôle microbiologique d'une eau en désinfection destinée à la consommation humaine.
On che rche à déte rmi ne r s i des acti vi tés enzymati ques peuvent tons ti tue r un i ndi cateu r fi able du taux de mi c roo rgani s mes s u rvi vants dans un li qui de en dés i nfecti on tel qu' une eau des ti née à la cors ommati on humai ne.
Méthodes et Résultats A ce titre, on réalise un inoculum par culture pure d'Escherichia coli (souche MG1655 disponible auprès de l' Institut Pasteur) sur milieu nutritif â 25°C (milieu LB
comprenant 10 g/1 de tryptone B3cto, 5 g/1 d'extrait de levure ~cto, 10 g/1 de NaCl, pH ajusté à 7). Les bacté ri es s ont récoltées en phas e exponenti elle de croissance par centrifugation puis lavées à l'aide d'un tampon phosphate (pH 7 ; 0, 05 M) . Les culots sont remis en suspension (environ 5.10 celJules/ml) dans des solutions de tampon phosphate (pH 7 ; 0, 05 M) comprenant du chlore libre à différentes concentrations (de 0, 0 à
2, 0 mg/1) . Les différentes suspensions bactériennes sont ens ui te placées s ous agi tati on à 25 ° C. Au bout de 2 0 mi n, on prélève alors pour analyses des échantillons de ces suspensions bactériennes (volume de 100 à 1 000 ml par activité enzymatique à mesurer) .
Pour chaque échantillon, on mesure en parallèle le taux de microorganismes survivants et différentes acti vi tés enzyniati ques s elon les méthodes s ui vantes .
Numération des microorganismes survivants On compte, pou r chaque échanti l lon de s us pens i on bactérienne, le nombre de microorganismes qui ont survécu, i. e. le nombre de bactéries cultivables et/ou le nombre de bactéries non cultivables mais viables.
La numé rati on des mi c roo rganis mes s u rvi vants peut s e fai re s elon des techni ques classi ques connues de l' homme du métier . par exemple, par étalement sur un milieu gélosé tel qu'un milieu de TSA (Tryptic Soy Agar, Difco) pour la numération des bactéries cultivables, et par la techni que du C. T. C. pour la numé rati on des bacté ri es non cultivables mais viables ( Schaule G. , Flemrning H. C. et F~.dgway H. F. 1993, Use of 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride for quantifying planktonic and sessile bacteria in drinking water, Appl. Environ. Microbiol. 59 : 3850-3857) .
A parti r du nombre moyen ni mesuré; on calcule alors la content rati on moyenne ( Ci ) en mi c roo rganis mes survivants à chacune des doses i de chlore libre testée.
Chaque content rati on moyenne Ci en mi c roo rganis mes survivants est alors exprimée relativement à la concentration maximale en microorganismes survivants telle que mesurée avant désinfection (concentration maximale Cmax) . Dans le cas de la prés ente i llus trati on, Cma~ co r res pond à la content rati on moyenne en microorgani.smes survivants telle que mesurée en l' absence de chlore libre. Chaque Ci est ainsi traduite en valeur d' abattement (ou d' élimination) à l' aide de la formule abattement = Ci ~ Cmax Ce taux de microorganismes survivants ~' Cmex représente également une mesure de la qualité de dés i nf ecti on.
Les rés ul tats des numé rati ons de mi c roo rganis mes culti vables s ont i l lus t rés pa r la fi gu re 1 où es t repo rté
le taux de bactéries E. coli cultivables ~en fonction de la dose en chlore libre subie. En ordonnée de la figure 1, sont reportées les valeurs d' abattement (ou d' é lirai nati on ) co r res pondant aux content rati ons en microorganismes cultivables telles qu' obtenues par numration, et rapportes la concentration maximale mesure avant dsinfection . 10 indique, une concentration en microorganismes cultiv ables gale la concept rati on maximale mes ure ; 10-' indi que que la concentration en microorganismes cultivables a diminu d' un facteur de 10, 10-' indique que la concentration en microorganismes cultivables a diminu d' un facteur de 10~
etc. En abs ciss e de la fi gure 1, es t repo rte la concentration initiale en chlore libre de la suspension bactrienne correspondante. On procde l' identique avec ~
les rsultats des numrations de microorganismes non cultivables mais viables, qui peuvent, si dsir, tre addi ti onns aux rs ul t ats de num rati on des microorganismes cultivables.
Activités enzymatiques Parallèlement à la numération des microorganismes survivants ci-avant décrite, sont mesurées différentes acti vi tés enzymati ques .
Sont i ci plus pa rti culi è rement repo rtées les expériences relatives à deux enzymes . la glucose-6-phosphate déshydrogénase (ci-après désignée ZWF) et la glutathion réductase. Ces enzymes sont communément p rés entes che z de nomb ceux mi c roo rganis mes , el les s ont donc s us ceptibles de pouvoi r représ ente r l' ens emble des popul ati ons mi c robi ennes prés entes dans les s us pens i ons et ainsi de donner l' image résultante de la désinfection réalis ée.
Dans les expé ri ences i ci déc ri tes , les bacté ri es en s us pers i on s ont à de t rop f ai bles concept rati ons pou r que leurs activités enzymatiques puissent être correctement mes urées di rectement sur l' échanti llon li qui de p rélevé
s ans concept rati on p réalable. Les échanti llons de suspensions sont donc ici filtrés (membrane de 0,22 Eun) de manière à en récolter les microorganismes. Les microorganismes peuvent également étre récoltés par centrifugation à 3 000 g pendant 10 min à 4°C.
Les études compa rate ves menées mont cent qu' i 1 es t préférable de lyser les microorganismes préalablement à
la mesure d' activités ZWF ou glutathion réductase. Les fi lt res ( ou culot ) s ont donc i ci placés dans un s ys tème permettant la lyse des microorganismes récoltés préalablement à une mesure d' activité ZWF ou glutathion réductase, la lyse des microorganismes se fait de manière préférentielle par une sonde à ultrasons (2 cycles de 30s sous ultra-sons et 30s en repos ) . On peut noter que, pour mes ure r l' acte vi té d' enzymes aut res que ZWF ou glutathi on réductase, telles que e. g. catalase ou superoxyde dismutase, la lyse préalable des microorganismes peut êt re évi tée en uti lis ant un s ubs t rat di f fus ant tel que la luci géni ne et le pe roxyde d' hydrogène.
Les di f f é rentes acte vi tés enzymati ques peuvent êt re mes urées s elon des techni ques connues de l' homme du méti e r. ~i èvement, pou r chaque acte vi té enzymati que à
mes u re r, les mi c roo rganismes de chaque échanti l lon s ont placés en contact avec un s ubs t rat choisi de mani è re à ce que l' enzyme ci blée puiss e catalys e r s a t rans fo rmati on et à ce que cette t Tans fo rmati on enzymati que puiss e êt re aisément suivie par les techniques analytiques classiques telles que spectrocolorimétrie, spectrofluorométrie, ou lame nomé t ri e pou r les quel les une automates ati on es t réalis able.
Pou r mes u re r une acte vi té glucos e- 6-phos phate déshydrogénase, on place les microorganismes de l' échanti l lon en contact avec un s ubs t rat compos é de WO 99/Ib896 16 PCT/FR98/02045 glucose-6-phosphate 0, 6 mM et de nicotinamide adénine dinucléotide phosphate sous forme oxydée (1~F~DP 0, 2 mM) en p rés ence d' une s oluti on s tabi lis ant le pH ( aj out de tampon Tris pH 7,6 MgCl2 lOmM). Ce substrat conduit, en . p rés ence de glucos e- 6-phos phate dés hydrogénas e, à la formation de nicotinamide adénine dinucléotide phosphate s ous f o rme rédui te ~ (NADPH ) dont on peut s ui v re l' apparition par spectrocolorimétrie à la longueur d' onde de 340 nm (Fraenkel D. G. et Levisohn S. R 1967, Glucose and gluconate metabolism in an Escherichia coli mutant lacking phosphoglucose isomerase, J. B~ct 93 . 1571-1578).
Pou r mes u re r une acti vi té glutathi on réductas e, or_ place les microorganismes de l' échantillon en contact avec un s ubs t rat compos é de ni coti nami de adéni ne dinucléotide phosphate sous forme réduite (NA.DPH 0, 2 mM) et de glutathion oxydé (disulfure de glutathion GS-SG 2,5 mM) en p rés ence d' une s oluti on s tabi lis ant le pH ( tampon phos phate 100 mM pH 7 ) . Sous l' acti on catalyti que de la glutathi on réductas e, ce s ubs t rat es t t rans fo rmé en nicotinamide adénine dinucléotide phosphate sous forme oxydée (I~DP) et en glutathion sous forme réduite (GSH) .
La disparition de NFLDPH est alors suivie au spectrocolorimétre à la longueur d' onde de 340 nm (Lopez-83rea J. et Lee C. Y. 1979, Mouse liver glutathione reductase: purification, kinetics and regulation, Eur. J.
I~ochem. 98 : 487-499) .
Les mes ures d' acti vi tés enzymati ques s ont i ci réalis ées à une tempé rature Gons tante i demi que ( 25 ° C) à
l' aide d' un spectrophotomètre PERKIN-ELMER modèle lambda 1.
La valeur de densi té opti que mes urée avant le déma r rage de 1 a réacti on enz ymati que cors i dé rée s e rt de WO 99/Ib896 1 ~ PCT/FR98/02045 "blanc de mesure". Les valeurs de densités optiques p rop res de chaque mi li eu réacti onnel s ont alo rs enregistrées au cours du temps.
L' acti vi té enzymati que p rop re de l' échanti llon es t ensuite calculée dans la partie linéaire de la courbe rep rés entant la deus i té opti que p rop re obs e ruée ap rès la mise en contact du substrat avec l' enzyme ciblée (par exemple, entre 5 min et 35 min) . Le calcul de la pente de la cou rbe "dens i té opti que p rop re de l' échanti l lon en foncti on du temps " dans l' i nte rvalle de temps 5 -35 mi n considéré donne une valeur de cette variation de densité
opti que p rop re.
Pour chaque enzyme, les activités enzymatiques propres mesurées aux différentes doses de désinfectants ( quanti té de s ubs t rat cons ommé ou p rodui t pa r uni té de temps ) s ont chacune exprimées en °s de la valeur ini ti ale d' activité enregistrée pour la méme enzyme, i. e. en ~ de la valeur d' activité mesurée, pour la même enzyme, à la plus faible dose de désinfectant . dans la présente i l lus t rati on, l' acti vi té p rop re glucos e-6-phos phate déshydrogénase (ZWF) et l' activité propre glutathion réductas e des échanti l lons s ont exp rimées en ~ de l' activité propre glucose-6-phosphate déshydrogénase (ZWF) et, respectivement, glutathion réductase telle que mesurée pour les suspensions bactériennes ne comportant pas de chlore libre (i, e. avant désinfection) . Ce rapport ent re acti vi té enzymati que p rop re du li qui de à une étape du procédé de désinfection (i. e. en cours ou après désinfection) et activité enzymatique propre de ce même li qui de avant dés i nf ecti on es t i ci dés i gné acti vi té
enzymatique relative du liquide â ladite étape de dés i nf ecti on.
WO 99/16896 1 g PCT/FR98/02045 Les activi tés enzymati ques relatives obtenues s ont alo rs compa rées aux mes unes de numé rati ons mi c robi ologi ques . Les rés ultats des numé rati ons de microorganismes cultivables sont illustrés par les figures 2 et 3.
La fi gu re 2 rep rés ente, en o rdonnée, l' acti vi té
glucose-6-phosphate déshydrogénase (ZWF) mesurée, exprimée en % du maximum (activité initiale) d' activité
enregistré, et, en abscisse, le nombre correspondant de E. col.i cultivables obtenu par numération.
La fi gure 3 rep rés ente, en o rdonnée, l' acti vi té
glutathion réductase mesurée, exprimée en % du maximum d' activité enregistré (activité initiale), et, en abscisse, le nombre correspondant de E, coli cultivables obtenu pa r numé rati on.
En figure 2 tout comme en figure 3, le nombre de microorganismes survivants est exprimé en fonction du log d' abattement subi selon la formule suivante log d' abattement = - loglo ( Ci / C~X) où Ci et C~X sont tels que définis ci-avant.
Si nécess ai re, les mêmes types de fi gures peuvent êt re réalis ées en tenant compte des rés ultats des numérations de microorganismes non cultivables mais vi ab 1 es .
En figure 2 tout comme en figure 3, les valeurs de log d' abattement s ont repo rtées sur l' axe des abs ciss es de la manière suivante . 1E+00 représente un nombre de microorganismes cultivables égal au nombre maximal enregistré (suspension ne présentant pas de chlore libre) ; lE-O1 représente un nombre de microorganismes cultivables égal au nombre maximal enregistré diminué
d' un nomb re de mi c roo rgani s mes co r res pondant à une valeu r de log d' abattement de 1 ; lE-02 représente un nombre de microorganismes cultivables égal au nombre maximal enregistré diminué d' un nombre de microorganismes correspondant à une valeur de log d'abattement de 2, et ainsi de suite jusqu' à lE-07 qui représente un nombre de microorganismes cultivables égal au nombre maximal enregistré diminué d' un nombre de microorganismes correspondant à une valeur de log d'abattement de 7.
On peut noter que cette valeur de log d'abattement cons ti tue également un indi ce de la quali té
mi c robi ologi que du li qui de cons i dé ré, i ndi ce que nous nommons D.
Les résultats obtenus montrent que le suivi de l' acti vi té glucos e- 6-phos phate dés hydrogénas e ( acti vi té
relative ) es t un indi cateur représ entati f du nombre de microorganismes survivants pour une gamme d' échantillons allant des échanti lions de li qui de n' ayant s ubi aucun traitement d' élimination des microorganismes jusqu' aux échantilions de liquide présentant un log d' abattement (ou d' élimination) inférieur ou égal à 3 envi ron. (cf.
figure 2) .
Les résultats obtenus montrent également que l' activité glutathion réductase (activité relative) est un i ndi cateu r rep rés entati f du nomb re de mi c roo rganis mes s u rvi vants pou r une gamme d' échanti l ions de li qui de présentant un log d' abattement (ou d' élimination) compris entre 4 et 7 envi ron. (cf. figure 3) . En effet, l' activi té de la glutathi on réductas e n' es t pas s i gni fi cati vement af f ectée avant que ne s oi ent atteints 4 log d' abattement. Une p Topo rti onnali té s i gni fi cati ve ent re acti vi té relative et log d' abattement n' es t observée, pour cette enzyme, que sur la zone des log d' abattement compris entre 4 et 7 envi ron.
WO 99/16896 PC'T/FR98/02045 De mani è re s imi lai re, nous avons pu démont re r que l'activité (relative) superoxyde dismutase (mesures en luminométrie à l' aide de lucigénine) est un indicateur représentatif du nombre de microorganismes survivants 5 , pou r une gamme d' échanti l lons de li qui de p rés entant ur~
log d' abattement (ou d' élimination) compris entre 3 et 6 envi ron. Les s uperoxydes dismutas es et les catalas es p rés entent de plus l' avantage de ne pas nécess i te r de traitement de lyse : la mesure de leur activité peut être 10 réalis ée sur un s ubs t rat di f fus ant tel que la luci Béni ne, ou respectivement le peroxyde d' hydrogène, par lumi nomét ri e.
Les différentes enzymes testées ne couvrent donc pas les mêmes domaines de sensibilité . l' activité relative 15 de la glucos e-6-phos phate dés hydrogénas e ( ZWF) es t ur~
i ndi cateu r rep rés entati f du nomb re de mi c roo rganis mes s u rvi vants ( log d' abattement ) dans des échanti l lors de liquide n' ayant subi que de faibles diminutions relatives de populati ons mi c robi ennes , l' acti vi té relati ve de la 20 s upe roxyde dismutas e et de la glutathi on réductas e s ont des indicateurs représentatifs du nombre de microorganismes survivants (log d' abattement) dans des échanti llons de li qui de ayant s ubi des di mi nuti ons relati ves de populati ons mi c robi ennes moyennes à fo ries .
Les mêmes types de gammes de s ensibi li té
(proportionnalité entre activité relative et log d' abattement pour certaines zones de valeurs de log d' abattement ) ont pu êt re obs e rvés en mes urant l' acti vi té
relative de la malate déshydrogénase, la glycéraldéhyde-3-phosphate dés hydrogénas e, les catalas es (s oi t par mesure de la consommation de peroxyde d' hydrogène à 240 nm dans une s oluti on tamponnée à pH 7 s oi t pa r chi mi olumi nes cence ) . L' homme du méti e r pou r ra t rouve r WO 99/16896 21 PC'f/FR98/02045 d' autres exemples d' enzymes et de protocoles de mesure d' activités enzymatiques dans différents ouvrages de référence tels que . Oxidative stress and the molecular biology of antioxidant defenses, 1997, Cold Spring Harbor Laboratory Press 0-87969-502-1/97 ; Lehninger 1977, »ochimie, Flammarion ISH~1 2-257-25009-5 ; Methods in Enzymology, Academic Press Inc. , e. g. volumes I-XLI-XLII-89-105 et 234.
Toute enzyme pour laquelle une proportionnalité
significative (pente significative, par exemple inférieure à -0,2) entre activité relative et log d'abattement peut être mise en évidence, par exemple en suivant le protocole ci-dessus décrit, constitue ur.
indicateur fiable selon l' invention.
Les mêmes types de gammes de s ens i bi li té enzymati que peuvent êt re obtenus en appli quant aux s uspensi ons de E.
coli non pas des doses croissantes de chlore mais des dos es croiss antes en ozone ou des dos es croiss antes en W.
Discussion I1 apparaS~t donc que la mesure d' activités enzymatiques permet de suivre l' évolution des populations mi c robi ennes dans un li qui de en dés i nf ecti on. Ces différents indicateurs enzymatiques de survie microbienne permettent de rendre compte de la totalité des populations microbiennes . microorganismes cultivables et mi c roo rganismes non culti vables mais vi ables .
On peut par exemple suivre l' activité relative ZWF
pour des log d' abattement inférieurs à 3, et l' activité
relative glutathion réductase pour des log d' abattement supérieurs à 4. Dans le cas où une mesure précise d' un log d' abattement compris entre 3 et 4 est requise, on peut alors par exemple mesurer une activité relative s upe roxyde dis mutas e.
Dans le cas où la désinfection effectuée n' a pas à
condui re à des log d' abattement s upé ri eurs à 6, on peut alors soit simplement suivre l' activité relative superoxyde dismutase, qui ne commencera à répondre qu' à
parti r de log d' abattement supérieurs à 3, soit suivre l' activité relative ZWF jusqu' aux log d' abattement de 3, puis l' activité relative superoxyde dismutase au-delà.
Les différents types d' indicateurs enzymatiques de s u rvi e mi c robi enne ci -avant p rés entés pe rmettent donc de connaître la valeur de log d' abattement du liquide contrôlé, et par là même, son indice D de qualité
microbiologique, sa valeur d' abattement, et le nombre de microorganismes qui y survivent. Ils donnent donc in fine une mesure de la vitesse et de l' efficacité du procédé de désinfection appliqué.
Si 1 e nomb re de mi c roo rganis mes s u rvi vants dans le liquide contrôlé (e. g. exprimé sous la forme d' un log d' abattement ou indice de qualité de désinfection) ne correspond pas à l' objectif de désinfection fixé (e. g.
valeur consigne du log d' abattement ou de qualité de désinfection) , la dose de désinfectant (s ) appliquée audit li qui de ( e . g. la concent rati on en chlo re lib re, en ozone, la dose d' U. V. , de température, d' ultra-sons, de rayonnements i onis ants ) peut êt re aj us tée en cons équence.
Cette augmentation ou diminution de la dose de désinfectant (s ) peut se fai re en suivant de manière réguli è re l' évoluti on du nomb re de mi c roo rganis mes survivants (log d' abattement) à l' aide des indicateurs enzymati ques ci -avant p rés entés et cela j us qu' à obtenti on de l' obj ecti f de dés i nf ecti on fi xé.
L' ajustement de la dose de désinfectant (s ) peut également se tai re à l' aide de courbes de référence pré
s établi es sur un échanti llon dudi t li qui de rep rés entant le taux de~ microrganismes survivants, e. g. exprimé en valeurs de log d' abattement, en fonction de la dose de désinfectant (s } appliquée (e. g. doses croissantes de chlore libre, d' ozone, d' U. V. , de température ultra-sons, rayonnements i onis ants ) .
De telles courbes de référence permettent de lire les valeurs de doses de désinfectant (s ) équivalentes respectivement au taux mesuré et taux dési ré de mi c roo rgani s mes s u rvi vants t e ls qu' obtenus à l' ai de des indicateurs enzymatiques ci-avant présentés. I1 suffit alors d' augmenter ou de diminuer la dose de dés i nfectant (s ) appli quée au li qui de sont rôlé de la di f fé rence lue ent re ces équi valents dos es de désinfectant(s).
De telles courbes de référence peuvent par exemple ê t re obtenues en dénomb Tant 1 es mi c roo rgani s mes s u rvi vants dans un échanti 1 lon dudi t li qui de expos ë à
des doses croissantes de désinfection (e.g.
concentrations croissantes en chlore libre, en ozone, dos es c roiss antes en U. V. de rayonnements i onis ants , d' ultra-sons, valeurs croissantes de température) .
Le procédé de régulation de la désinfection d' un li qui de s elon l' i nventi on pe rmet donc, à l' ai de de mes unes d' activi tés enzymati ques , de cont rôle r de mani ë re complète, simple et rapide (moins d' une heure) la désinfection d' un liquide, et cela quel que soit l' état phys i o logi que ou l' i demi té des mi c roo rganis mes qui y survivent. Le procédé de régulation de la désinfection WO 99/16896 2~ PCT/F'R98/02045 d' un li guide s elon l' i nventi on prés ente de plus l' avantage pa rti culi e r d' êt re ais ément automatis able, contrai rement aux procédés mettant en oeuvre les techni ques de mi c ros copi es ou de cultures mi c robi ologi ques .
Il demeure bien entendu que la présente invention n' est pas limitée aux exemples de réalisation décrits et représ entés ci-dess us , mais qu' elle en englobe toutes les variantes. C' est ainsi que notamment les mesures d' activités enzymatiques peuvent être réalisées par des techniques analytiques autres que celles ci-dessus menti onnées .
Claims (20)
1. Procédé de régulation de la désinfection d'un liquide, caractérisé en ce qu'il comprend :
A. à une étape de ladite désinfection ci-après désignée étape 2, la mesure de l'activité d'au moins une enzyme par mise en contact des microorganismes éventuellement présents dans ledit liquide avec un substrat choisi comme étant capable de révéler l'activité
de cette ou ces enzyme(s), cette activité enzymatique étant ci-après nommée activité propre, B à une étape ci-après désignée étape 1, antérieure à ladite étape 2, la mesure de l'activité de la ou des même(s) enzyme(s) qu'en A, cette activité étant ci-après nommée activité initiale, C. la traduction, pour chaque enzyme, desdites activité propre et activité initiale, en taux de microorganismes survivants dans le ledit liquide à
l'étape 2 de ladite désinfection, et cela par l'intermédiaire d'un système de référence, pré-établi à
l'aide d'un échantillon dudit liquide prélevé à ladite étape 1 puis exposé à des doses de désinfectant(s) croissantes, ainsi que D. l'ajustement, en fonction dudit taux de microorganismes survivants, de la nature et/ou des doses du (des) agent(s) chimique(s) ou physique(s) utilisé(s) pour ladite désinfection.
A. à une étape de ladite désinfection ci-après désignée étape 2, la mesure de l'activité d'au moins une enzyme par mise en contact des microorganismes éventuellement présents dans ledit liquide avec un substrat choisi comme étant capable de révéler l'activité
de cette ou ces enzyme(s), cette activité enzymatique étant ci-après nommée activité propre, B à une étape ci-après désignée étape 1, antérieure à ladite étape 2, la mesure de l'activité de la ou des même(s) enzyme(s) qu'en A, cette activité étant ci-après nommée activité initiale, C. la traduction, pour chaque enzyme, desdites activité propre et activité initiale, en taux de microorganismes survivants dans le ledit liquide à
l'étape 2 de ladite désinfection, et cela par l'intermédiaire d'un système de référence, pré-établi à
l'aide d'un échantillon dudit liquide prélevé à ladite étape 1 puis exposé à des doses de désinfectant(s) croissantes, ainsi que D. l'ajustement, en fonction dudit taux de microorganismes survivants, de la nature et/ou des doses du (des) agent(s) chimique(s) ou physique(s) utilisé(s) pour ladite désinfection.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite étape 1 correspond à une étape avant désinfection dudit liquide et en ce que ladite étape 2 correspond à une étape quelconque de ladite désinfection.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit liquide est un liquide destiné à être en contact avec un homme ou un animal tel qu'une eau de baignade, une eau destinée à la consommation, une eau destinée à des préparations pharmaceutiques ou biotechnologiques, ou un liquide alimentaire.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite mise en contact des microorganismes éventuellement présents dans ledit liquide avec ledit substrat est réalisée par mise en contact dudit liquide ou d'un échantillon dudit liquide avec ledit substrat.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite mise en contact des microorganismes éventuellement présents dans ledit liquide, ou échantillon de liquide, avec ledit substrat est réalisée par mise en contact d'un filtrat, ou d'un culot de centrifugation, dudit liquide ou échantillon de liquide, avec ledit substrat.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit liquide, échantillon de liquide, ou concentré, subissent, préalablement auxdites mesures de l'activité d'au moins une enzyme, un traitement de lyse, notamment par sonication.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la ou les enzyme(s) dont la (ou les) activité(s) est (sont) mesurée(s) présente(ent) dans ledit liquide, échantillon de liquide, ou concentré, un rapport entre activité propre et activité
initiale en relation affine, et avec une pente significativement différente de zéro, préférentiellement inférieure à -0,2, avec le taux de microorganismes survivants sur au moins une zone de valeurs desdits taux de microorganismes survivants.
initiale en relation affine, et avec une pente significativement différente de zéro, préférentiellement inférieure à -0,2, avec le taux de microorganismes survivants sur au moins une zone de valeurs desdits taux de microorganismes survivants.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la ou au moins une des enzyme(s) dont la (ou les) activité(s) est (sont) mesurée(s) est une glucose-6-phosphate des hydrogénase, une malate déshydrogénase, une glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase, une catalase, une superoxyde dismutase, ou une glutathion reductase.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que lesdites lesdites mesures d'activité propre et d'activité initiale sont faites à
l'aide d'un spectrophotomètre, d'un spectrofluoromètre, ou d'un luminomètre présentant éventuellement plusieurs canaux d'analyse.
l'aide d'un spectrophotomètre, d'un spectrofluoromètre, ou d'un luminomètre présentant éventuellement plusieurs canaux d'analyse.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que ladite traduction en taux de microorganismes survivants à l'aide dudit système de référence comprend, pour chaque enzyme, le calcul du rapport entre activité propre et activité
initiale, éventuellement exprimé en pourcentage.
initiale, éventuellement exprimé en pourcentage.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que ledit système de référence se présente sous une forme graphique telle qu'une ou plusieurs courbe(s) mettant, pour chaque enzyme, ledit rapport entre activité propre et activité
initiale en relation avec des valeurs de taux de microorganismes survivants.
initiale en relation avec des valeurs de taux de microorganismes survivants.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que lesdites mesures spectrométriques sont réalisées pour chaque activité enzymatique mesurée, à température constante, notamment à 25°C, et à longueur d'onde constante notamment à une longueur d'onde comprise entre 240 et 550 nm, par exemple à 340 nm.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisé en ce que lesdites mesures spectrométriques sont réalisées de manière continue ou discrète sur un intervalle de temps de 30 min environ.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que ledit ajustement des doses du (des) agent(s) chimique(s) ou physique(s) se fait par ajout de l'équivalent "dose de désinfectant(s)" correspondant à la différence entre le taux de microorganismes survivants visé et le taux de microorganismes mesuré sur ledit liquide, échantillon de liquide, ou concentré.
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé
en ce que ledit équivalent dose de désinfectant(s) est tel que lu sur une courbe de référence représentant le taux de microorganismes survivants en fonction de la dose de désinfectant(s) à laquelle ledit liquide est exposé.
en ce que ledit équivalent dose de désinfectant(s) est tel que lu sur une courbe de référence représentant le taux de microorganismes survivants en fonction de la dose de désinfectant(s) à laquelle ledit liquide est exposé.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que ledit liquide comprend des microorganismes choisis parmi le groupe constitué par le genre Escherichia, Alcaligenes, Bacillus, Flavobacterium, Methylobacterium, Pseudomonas, Klebsiella, Entercbacterium, Agrobacterium, Streptococcus, Micrococcus, Salmonella.
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'il est automatisé sur un procédé de désinfection de liquide.
18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que ledit taux de microorganismes survivants est exprimé en valeur d'abattement (contentration en microorganismes survivants rapportée à la contentration initiale en microorganismes survivants, telle que mesurée à ladite étape 1, de log d'abattement (-log 10 (abattement)) ou d' indice D (= log d'abattement).
19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que lesdits microorganismes survivants sont des microorganismes cultivables et/ou des microorganismes non cultivables mais viables.
20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, caractérisé en ce que lesdits agents chimiques ou physiques utilisés pour la désinfection sont choisis parmi le groupe constitué par le chlore et ses dérivés, les UV, l' ozone, H2O2, les membranes filtrantes, la température, les ultra-sons, les rayonnements ionisants.
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