CA2529943A1

CA2529943A1 - Peptides derives de la proteine mmp-2 et leur utilisation en immunotherapie antitumorale

Info

Publication number: CA2529943A1
Application number: CA002529943A
Authority: CA
Inventors: Yannick Guilloux; Francine Jotereau; Emmanuelle Godefroy; Elisabeth Diez; Agnes Aubry
Original assignee: Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale); Universite De Nantes; Yannick Guilloux; Francine Jotereau; Emmanuelle Godefroy; Elisabeth Diez; Agnes Aubry
Current assignee: Universite de Nantes; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2003-06-25
Filing date: 2004-06-24
Publication date: 2005-01-06
Also published as: US7629439B2; US20070264275A1; WO2005000342A1; EP1635862A1; JP2007520198A; FR2856598B1; FR2856598A1

Abstract

L'invention est relative à des peptides constituant des épitopes T de l'antigène MMP-2, présentés par le CMH I. Ces peptides sont utilisables notamment en immunothérapie anti-tumorale.

Description

2 PCT/FR2004/001585 PEPTIDES DERIVES DE hA PROTEINE MMP-2 ET hEUR
UTILISATION EN IMMUNOTHERAPIE ANTITUMORAI~E.
La présente invention est relative à des peptides dérivés de la protéine MMP-2 et à leur utilisation en immunothérapie antitumorale.
La vaccination ou immunothérapie peptidique est une approche thérapeutique qui fait actuellement l' obj et d' un grand intérêt dans le cadre de la prévention ou du traitement des cancers. Son principe repose sur l'induction d'une réponse immune vis-à-vis de peptides représentant des épitopes T d'antigènes tumoraux reconnus par les lymphocytes T cytotoxiques (CTL), qui jouent un rôle majeur dans l'élimination des cellules cancéreuses exprimant ces antigènes à leur surface.
On rappellera que les CTL ne reconnaissent pas les antigènes protéiques entiers, mais des fragments peptidiques de ceux-ci, présentés par les molëcules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) exprimées à la surface de différentes cellules. Ce sont ces fragments peptidiques qui constituent les épitopes T.
Les épitoges présentés par le complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (CMH I) ont généralement 8 à 11 acides aminés, et sont reconnus par les cellules T
CD8+, qui représentent la composante majeure de la réponse cytotoxique. Les épitoges présentés par le complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMH II) ont généralement 13 à 18 acides aminés et sont reconnus par les cellules T CD4+.
L' identification de ces épitoges, et notamment de ceux présentés par le CMH I (compte tenu du rôle essentiel de la réponse CD8+ dans la cytotoxicité), constitue donc une ëtape essentielle pour le développement de compositions d'immunothérapie anti-tumorale.
Le mélanome est une tumeur maligne cutanée qui se développe aux dépens des mélanocytes épidermiques que sont les cellules pigmentaires de la peau. En France, on dénombre actuellement de 9 à 10 nouveaux cas pour 100.000 habitants chaque année, soit près de 5.000 nouveaux malades.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) Deux classes principales d'antigènes associés aux mélanomes (MAA) sont connues . les antigènes spécifiques, peu ou pas exprimés dans les tissus normâux, et les antigènes de différenciation mélanocytaire, qui sont également exprimés par les mélanocytes (pour revue, voir CASTELLI et al., 2000, J Cell Physiol, 182, 323-31 ;
KIRKIN et al., 2002, Cancer Invest, 20, 222-36).
En raison de la forte prévalence des cancers de type mélanome, il est souhaitable d'identifier d'autres antigènes tumoraux capables d'induire une réponse immunitaire cytotoxique antitumorale.
Les métalloprotéases matricielles (MMP) sont des endopeptidases Zn-dépendantes qui sont responsables de la dégradation de différents composants protéiques de la matrice extracellulaire (ECM) et des membranes basales (KHASIGOV et al., 2001, Biochemistry., 66(2), 130-40). A
l'heure actuelle, 21 membres de la famille MMP sont connus chez l'homme.
La sur-expression des MMPs est observée dans un grand nombre de cancers humains et est associée à un faible taux de survie. En effet, les MMPs ont la capacité
de potentialiser la progression tumorale en augmentant la croissance cellulaire, la migration cellulaire et l'angiogenèse (EGEBLAD and WERB, 2002, Nat. Rev. Cancer., 2(3), 161-74).
La protéine MMP-2 (également dénommée gélatinase A ou collagénase de type IV ; OMIM 120360) clive le collagène de type IV, la gélatine, ainsi que d'autres composants de la matrice extracellulaire. Cette protéine est exprimée dans nombre de cellules et de tissus sains ; elle est également sur-exprïmée dans de nombreux cancers. De nombreuses études ont montré qu'elle est impliquée dans la progression tumorale, les métastases et l'angiogenèse (LIOTTA et al., 1980, Nature., 284 (5751), 67-8 ; ITOH et al., 1998, Cancer. Res., 58(5), 1048-51 ;
BROOKS et al., 1998, Cell., 92(3), 391-400).

3 Du fait de sa sur-expression dans de nombreux types de tumeurs, et de son implication dans la transformation maligne et dans l'angiogenèse tumorale, il a été proposé d' utiliser MMP-2 comme cible de traitements antitumoraux, en inhibant son activité (EGEBLAD and WERB, précité ; COUSSENS et al., 2002, Science, 295 (5564), 2387-92).
Cependant, la protéine MMP-2 n'était pas considérée jusqu'à présent comme un antigène cible capable d'induire une réponse cytotoxique antitumorale. A
fortiori, aucun épitoge T de MMP-2 n'avait été identifié.
Les Inventeurs ont maintenant découvert que MMP-2 pouvait être apprêtée efficacement par des cellules de mélanome pour générer des épitoges T présentés par le CMH I, et induisant des lymphocytes T cytotoxiques capables de lyser ces cellules tumorales.
La présente invention a en conséquence pour objet l'utilisation d'une molécule choisie parmi .
- la métalloprotéase MMP-2 ;
- un fragment de ladite métalloprotéase comprenant un épitoge T présenté par le CMH I ;
un polynucléotide codant pour ladite métalloprotéase ou pour ledit fragment ;
pour l'obtention d'un médicament destiné à
l'immunothérapie anti-tumorale, et plus particulièrement au traitement de mélanomes exprimant MMP-2.
Des fragments de MMP-2 utilisables conformément à la présente invention englobent notamment tout peptide immunogène constitué par 8 à 11 acides aminés consécutifs de ladite métalloprotéase, et constituant un épitoge T présenté par le CMH I. Ces peptides immunogènes, ainsi que les polynucléotides codant pour ces peptides, font également partie de l'objet de la présente invention.
Dans le cadre de l'exposé de la présente invention, on entend par « épitoge T présenté par le

4 CMH I » un peptide capable d'induire une réponse CTL
spécifique contre l'antigène dont il est issu.
A titre d'exemple non limitatif de réalisation de la présente invention, les Inventeurs ont identifié un peptide présenté par HLA-A*0201, de séquence (code 1 lettre) GLPPDV~RV (SEQ ID NO . 1).
Ce peptide est capable d'induire une réponse CTL spécifique vis-à-vis de cellules de mélanomes HLA-A*0201 exprimant MMP-2, et est donc notamment utilisable pour l'obtention de mëdicaments destinés au traitement de patients HLA-A*0201.
D'autres épitopes T conformes à l'invention peuvent être obtenus de diverses manières à partir de l'antigène MMP-2.
Par exemple, il est connu que des peptides susceptibles de former un complexe avec un allèle du CMH I
donné ont en commun la présence, à certaines positions, de résidus d'acides aminés particuliers, dénommés e< résidus d'ancrage ». On a ainsi défini pour les différents allèles du CMH I, des motifs d'ancrage spécifiques, impliquant des acides aminés dénommés « résidus d'ancrage primaires ». Il a aussi été montré que des résidus situés en dehors des motifs d'ancrage primaires (résidus d'ancrage secondaires) pouvaient exercer un effet favorable ou défavorable sur l'affinité du peptide pour le CMH.
Le choix des séquences peptidiques susceptibles de constituer des épitopes présentés par un allèle du CMH I donné, peut s'effectuer, de manière classique, par l'analyse de la séquence peptidique de l'antigène MMP-2, afin de sélectionner les peptides possédant tout ou partie du motif d'ancrage primaire correspondant à cet allèle. Différentes bases de données répertoriant les motifs d'ancrage connus sont disponibles . à titre d'exemples, on citera la base SYFPEITHI (http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/; RAMMENSEE
et al., Immunogenetics, 50, 213-219, 1999), ou la base BIMAS (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla bïnd ; Parker et al., J. Immunol. 152, 163, 1994).
La présente invention a également pour objet des compositions comprenant au moins un peptide immunogène

5 conforme à l'invention ou un polynucléotide codant pour ledit peptide.
Il peut s'agir en particulier de compositions multiépitopiques, capables de générer une réponse CTL
polyspécifique, et qui dans ce but comprennent également un ou plusieurs autres) épitoge(s) immunogène(s). Ces autres épitoges peuvent être issus de MMP-2, ou d'un ou plusieurs autres antigènes.
Des compositions multiépitopiques conformes à
l'invention peuvent comprendre, pour être largement utilisables sur une population dont les individus portent des allèles HLA différents, des épitoges présentés par différentes molécules du CMH I. Elles peuvent également comprendre en outre au moins un épitoge présenté par une molécule du CMH II, et capable, d'induire une réponse T
auxiliaire.
Selon un mode de réalisation préféré d'une composition conforme à l'invention, elle comprend au moins un polypeptide chimérique comprenant une ou plusieurs copies d'un peptide immunogène conforme à l'invention.
Dans le cas d'une composition multiépitopique, ledit polypeptide chimérique comprend en outre une ou plusieurs copies d'au moins un autre épitoge immunogène.
On peut par exemple injecter au patient à
traiter un peptide immunogène, ou une composition conformes à l'invention tels que définïs ci-dessus, éventuellement associés à un adjuvant approprié. De même, des polynucléotides conformes à l'invention, de préférence intégrés dans des vecteurs d'acide nucléique, notamment des vecteurs viraux tels que des adénovirus, peuvent également être directement administrés par injection au patient à traiter.

6 La présente invention englobe également des cellules présentatrices de l'antigène présentant un épitope T issu de MMP-2 conforme à l'invention.
Des cellules présentatrices de l'antigène conformes à l'invention peuvent être obtenues à partir de toutes les cellules capables de présenter un antigène via le CMH I. Notamment, elles peuvent être obtenues à partir de cellules présentatrices de l'antigène professionnelles, par exemple des cellules dendritiques.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, lesdites cellules présentatrices de l'antigène sont chargées ïn vitro à l'aide d'un peptide immunogène selon l'invention, comme décrit par exemple par BAKKER et a1. (Cancer Res., 55, 5330-5334, 1995) ou VAN
ELSAS et a1. (Eur. J. Immunol., 26, 1683-1689, 1996).
Selon un autre mode de réalisation préféré de la présente invention, lesdites cellules présentatrices de l'antigène sont transfectées in vitro par un polynucléotide comprenant une séquence codant pour un peptide immunogène conforme à l'invention, par exemple un polynucléotide codant pour la protéine MMP-2 ou pour un fragment de celle-ci.
Les cellules présentatrices de l'antigène conformes à l'invention peuvent ensuite être injectées au patient à traiter, comme décrit par exemple par KAPLAN et al. (J. Immunol., 163(2), 699-707, 1999) ou KIM et al.
(Annals of Surgical Oncology, 5(1), 64-76, 1998).
La présente invention englobe aussi l'utilisation de la protéine MMP-2, ou d'un fragment de celle-ci, et notamment d'un peptide immunogène selon l'invention, pour la détection de CTLs dirigés contre MMP-2 dans un prélèvement biologique obtenu à partir d'un sujet atteint de mélanome.
Ces peptides peuvent également être utilisés pour réaliser le tri spécifique de ces CTLs. Les CTLs ainsi isolés peuvent ensuite être amplifiés in vitro et

7 réinjectés en grand nombre (de l'ordre du milliard) au patient.
La présente invention a ainsi pour objet un procédé de préparation de CTLs dirigés contre MMP-2, caractérisé en ce qu'il comprend la sélection, à partir de CTLs prélevés sur un patient atteint de mélanome, de ceux reconnaissant la protéine MMP-2, ou un fragment de celle ci, et notamment un peptide conforme à l'invention, et la multiplication in vitro des lymphocytes T ainsi sélectionnés.
La prësente invention a également pour objet une préparation de CTLs dirigés contre la protéine MMP-2, et en particulier une préparation de CTLs susceptibles d'être obtenue par le procédé défini ci-dessus.
La présente invention englobe également les médicaments comprenant un principe actif choisi parmï .
- un peptide immunogène conforme à
l'invention ;
- une composition multiépitopique conforme à
l'invention ;
- un polynucléotide conforme à l'invention ;
- une cellule présentatrice de l'antigène conforme à l'invention ;
- une préparation de CTLs conforme à
l'invention.
La présente invention sera mieux comprise à
l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant l'induction d'une réponse cytotoxique antitumorale par un peptide conforme à l'invention issu de l'antigène MMP-2.
EXEMPLE 1 . CARACTERISATION D'UN CLONE CTL (CLONE M134.12) RECONNAISSANT DES LIGNEES DE MELANOME HLA-A2.
Des clones CTL ont été obtenus en stimulant par des cellules tumorales autologues (selon le protocole décrit par PANDOLFINO et al., 1992, Eur. J. Immunol., 22(7), 1795-802) des lymphocytes infiltrant les tumeurs

8 (TIL) d'un patient (HLA A*0201, B*0801, Cw*0701) atteint de mélanome. Ces clones CTL sont capables de lyser spécifiquement les cellules tumorales autologues, et de sécréter du TNFa et de l' IFNy en réponse à la stimulation par ces cellules L'un de ces clones (CTL M134.12) a été retenu pour la suite des expérimentations.
Le clone CTL M134.12 a été co-cultivé en présence de la lignée autologue M134, et de différentes lignées allogéniques (M17, M113, M147, M153, M204, FM25, FM29, IPC 277/5, M25, M44, M88, M102, M117, M171, M199, M200) issues de mélanomes de différents patients HLA
A*0201.
Après 6 heures de culture, les surnageants ont été prélevés et leur concentration en TNFcx a été
déterminée par mesure de la cytotoxicité de ces surnageants de culture pour le clone 13 de WEHI 164, comme décrit par DE PLAEN et al. (Methods, 12, 125-42, 1997).
Les résultats sont illustrés dans la Figure 1.
En ordonnée, la concentration de TNFa en pg/ml.
En abscisse, les différentes lignées testées.
Le clone CTL M134.12. reconnaît, outre la lignée M134, neuf lignées cellulaires allogéniques de mélanome exprimant HLA A*0201. Ceci indique que ce clone CTL reconnaît un antigène commun à ces lignées et présenté
par l'allèle HLA A*0201.
EXEMPLE 2 . IDENTIFICATION DE L'ANTIGENE RECONNU PAR LE
CLONE CTL M134.12.
Pour identifier l'antigène reconnu par le clone CTL M134.12, une banque d'ADNc a été construite à
partir des ARNm de la lignée cellulaire tumorale M134.
Construction de la ban e d'ADNc Les ARNm Poly-(A)+ ont été extraits à partir des cellules M134 en utilisant le kit Fast Track 2.0 (Invitrogen Corp., Oxon, UK). La synthèse d'ADNc à partir des ARNm purifiés a été effectuée à l'aide d'un kit

9 (Stratagene Inc., La Jolla, CA). Les ADNc néo-synthétisés ont été ligaturés à des adaptateurs Eco RI, puis digérés par Xho I et enfin insérés au niveau des sites Eco RI et Xho I du vecteur d'expression eucaryote pcDNA3.1 (Invitrogen Corp.). Les plasmides recombinants obtenus ont été électroporés dans la souche E. soli XL1 (Stratagene Inc., La Jolla, CA). Après électroporation, près de 60.000 clones résistants à l'ampicilline ont été
isolés. Pour permettre le criblage de ces clones, 574 groupes (chacun de 100 clones bactériens résistants à
l'ampicilline) ont été créés. L'ADN plasmidique de chacun des groupes a été extrait par lyse alcaline à l'aide du kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen S.A.,Courtaboeuf, France).
Cet ADN plasmidique a ensuite été co-transfecté, dans des cellules COS-7, avec un vecteur HLA
A*0201 (pHLA A*0201, obtenu auprès de T. Boon, LICR, Bruxelles, Belgique).
Transfection des cellules COS-7 Les cellules COS-7, cultivées dans du milieu DMEM (Sigma) contenant 1 g de glucose/litre et 10~ de sérum de veau foetal, des antibiotiques et de la L-glutamine, ont étê transfectées par le vecteur pHLA-A*0201, seul ou en association avec l'ADN plasmidique issu de l'un des groupes de la banque d'ADNc de M134. La transfection a été effectuée selon le protocole à la DEAE-dextran-chloroquine (BRICHARD, Exp. Med. 1993, 1(78): 489-495). 2.104 cellules COS-7 ont été transfectées avec 100 ng de plasmide pHLA-A*0201 et, pour la co-transfection, 100 ng d'ADN plasmidique de la banque de M134. 48h après transfection, ces cellules COS-7 ont été utilisées pour stimuler le clone CTL M134.12 T. Après 6 heures de co-culture, les surnageants de culture ont été prélevés et leur concentration en TNF a été déterminée par la mesure de leur cytotoxicité pour le clone 13 de WEHI 164, comme décrit ci-dessus.

Parmi les groupes testés, un groupe positif (270) a été identifié. 96 plasmides distincts de ce groupe ont été testés individuellement pour leur capacité à
induire la sécrétion de TNFa par le clone CTL M134.12.
5 L'un de ces plasmides, dénommé pNA134-A, induisant une sécrétion de TNFa comparable à celle obtenue en présence de la lignée cellulaire M134 a été
sélectïonné.
La Figure 2 compare la sécrétion de TNFa par

10 le clone CTL M134.12, en l'absence de cellules stimulatrices, en présences de cellules M134, en présence de cellules COS-7 non-transfectées, en présence de cellules COS-7 transfectées par le plasmide pHLA-A*0201 seul, et en présence de cellules COS-7 co-transfectées par les plasmides pHLA-A*0201 et pNAl34-A.
Le séquencage de pNA134-A montre qu'il contient un ADNc de l,3kb dont la séquence correspond à
l'extrémité 3' de la séquence codant pour la métalloprotéase MMP-2 (numéro d'accession . NM_004530). La protéine MMP-2 est donc l'antigène reconnu par le clone CTL M134.12.
L'insert du plasmide pNA134-A code pour les acides aminés 501-661 de MMP-2.
Afin de mieux préciser la région de MMP-2 reconnue par le clone CTL M134.12 des plasmides contenant des variants tronqués de l'insert d'ADNc de NA134-A
(fragment 20 codant pour les acides aminés 501-661 de MMP
2, et fragment 25 codant pour~les acides aminés 501-556 de MMP-2) ont été construits.
Un plasmide comprenant la totalité de l'ADNc de MMP-2 a également été construit.
Chacun de ces plasmides a été co-transfecté
avec pHLA A*0201 dans des cellules COS-7, qui ont ensuite été testées pour leur capacité à induire la sécrétion de TNFa par le clone CTL M134.12.

11 Les constructions testées sont schématisées sur la Figure 3 qui indique également leur capacité à
induire ou non la sécrétion de TNFa par le clone CTL
M134.12.
Ces résultats montrent que l'épitope T reconnu par le clone CTL M134.12 se situe entre les acides aminés 556 et 593 de MMP-2.
Une série de peptides (séquences GLPPDVQRV
(SEQ ID NO . 1), LGLPPDVQRV (SEQ ID NO . 2), LPPDVQRV (SEQ
ID NO . 3) et GLPPDVQR (SEQ ID NO . 4)) dérivés de la région 556-593 de la protéine MMP-2 ont été synthétisés (Synt:em Nîmes, France).
Ces peptides ont été utilisés pour sensibiliser des cellules T2 marquées au 5lCr. Ces cellules ont été incubées 60 minutes à 37°C avec différentes concentrations de chacun des peptides à
tester. Des cellules effectrices CTL M134.12 ont ensuite .été rajoutées dans un rapport cellules effectrices/cellules cibles de 10/1. La quantité de 5lCr relarguée dans le surnageant est mesurée 4 heures plus tard.
Les résultats sont illustrés par la Figure 4.
En ordonnée, le pourcentage de lyse spécifique.
En abscisse, la concentration de peptide LGLPPDVQRV (~), GLPPDVQRV (~), LPPDVQRV (~), ou GLPPDVQR (:C) en nM.
Ces résultats montrent que le peptide GLPPDVQRV est le plus efficace pour sensibiliser les cellules T2 à la lyse par le clone CTL M134.12.
EXEMPLE 3 . EXPRESSION DE MMP-2 DANS DIFFÉRENTS TYPES
CELLULAIRES, ET RECONNAISSANCE SPECIFIQüE DE CELLULES DE
MELANOME PAR LES CTLS M134.12 Il est connu que MMP-2 est exprimé de façon constitutive par des tissus comme l'endomètre, le foie ou l'aorte (KHASIGOV, Biochemistry, 2001), et par un nombre important de types cellulaires tels que les macrophages, les trophoblastes (YAMAMOTO, Cancer. Res., 1996), les

12 lymphocytes T activés par l'IL-2 (LEPPERT, JI,1995 Esparza J., BLOOD,- 1999), les fibroblastes, les kératinocytes, les chondrocytes, les cellules endothéliales, les monocytes, ou les ostéoblastes (BIRKEDAL-HANSEN,Crit. Rev.
Oral. Biol. Med., 1993).
La capacité du clone CTL M134.12 à reconnaître des cellules (tumorales ou saines) de différents types, exprimant MMP-2 (expression vérifiée par RT-PCR et immunohistochimie) et HLA-A2 a été testée, par mesure de la sécrétion de TNFa par le clone CTL M134.12 en réponse à
la stimulation par ces cellules. Le protocole utilisé est identique à celui décrit à l'exemple 1 ci-dessus.
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau I ci-dessous.

13 Tableau I
Type cellulaireCellules ciblesReconnaissance par le clone CTL M134.12 M17 +

M113 +

M134 +

M 147 +

M153 +

Mlanome M204 +

FM25 +

FM29 +

IPC 277/5 +
O

GMEL -Cancer colorectalSw480 -Carcinome de A498 -rein Ovaire OVCAR

Thyrode TT -Mianocytes 98M09 -c Kratinocytes K1 -Fibroblastes MG -c Endothlium HAEC#8186 -Ces résultats montrent que 10 des lignées cellulaires de mélanome qui expriment MMP-2 sont reconnues par le clone CTL M134.12.
En revanche, bien qu'exprimant MMP-2 et HLA-A2, aucune des autres lignées de cellules cancéreuses, et aucune lignée de cellules non-cancéreuses n'est reconnue par le clone CTL M134.12.
En conclusion, malgré le profil d'expression ubiquitaire de la protéine MMP-2, seules les cellules de mélanome paraissent avoir la capacité de présenter efficacement un épitoge de cette protéine.

SEQUENCE LISTING
<110> INSERM
<120> Peptides dérivés de la protéine MMP-2 et leur utilisation en immunothérapie antitumorale <130> M7Pah-598/77 <160> 4 <170> Patentln version 3.1 <210>1 <211>9 <212>PRT

<213>Homo sapiens <400> 1 Gly Leu Pro Pro Asp Val Gln Arg Val <210>2 <211>10 <212>PRT

<213>Homo sapiens <400> 2 Leu Gly Leu Pro Pro Asp Val Gln Arg Val <210>3 <211>8 <212>PRT

<213>Homo sapiens <400> 3 Leu Pro Pro Asp Val Gln Arg Val <210>4 <211>8 <21z>PRT

<213>Homo sapiens <400> 4 ily Leu Pro Pro 5sp val Gln Arg

Claims

1) Utilisation d'une molécule choisie parmi :
- la métalloprotéase MMP-2 ;
- un fragment de ladite métalloprotéase comprenant un épitoge T présenté par le CMH I ;
- un polynucléotide codant pour ladite métalloprotéase ou pour ledit fragment ;
pour l'obtention d'un médicament destiné à
l'immunothérapie anti-tumorale.

2) Peptide immunogène constituant un épitoge T
présenté par le CMH I, caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment de 8 à 11 acides aminés consécutifs de la métalloprotéase MMP-2.

3) Peptide immunogéne selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est défini par la séquence GLPPDVQRV.

4) Polynucléotide codant pour un peptide selon une quelconque des revendications 2 ou 3.

5) Composition comprenant au moins un peptide selon une quelconque des revendications 2 ou 3, ou un polynucléotide selon la revendication 4.

6) Utilisation d'un peptide selon une quelconque des revendications 2 ou 3, ou d'un polynucléotide selon la revendication 4 pour l'obtention d'un médicament.

7) Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit médicament est destiné au traitement de mélanomes.

8) Cellule présentatrice de l'antigène isolée exprimant une molécule du CMH I, caractérisée en ce qu'elle est chargée in vitro par un peptide selon une quelconque des revendications 2 ou 3.

9) Cellule présentatrice de l'antigène exprimant une molécule du CMH I, caractérisée en ce qu'elle est transfectée par un polynucléotide comprenant une séquence codant pour un peptide immunogène selon une quelconque des revendications 2 ou 3.

10) Utilisation de la métalloprotéase MMP-2 ou d'un fragment de celle-ci pour la détection de lymphocytes T cytotoxiques dirigés contre MMP-2 dans un prélèvement biologique obtenu à partir d'un sujet atteint de mélanome.

11) Procédé de préparation de lymphocytes T
cytotoxiques dirigés contre la métalloprotéase MMP-2, caractérisé en ce qu'il comprend la sélection, à partir de lymphocytes T cytotoxiques prélevés sur un patient atteint de mélanome, de ceux reconnaissant MMP-2 ou un fragment de celle-ci, et la multiplication in vitro des lymphocytes T
ainsi sélectionnés.

12) Préparation de lymphocytes T cytotoxiques dirigés contre la métalloprotéase MMP-2, laquelle préparation est susceptible d'être obtenue par le procédé
selon la revendication 11.

13) Médicament, comprenant un principe actif choisi parmi :
- un peptide immunogène selon une quelconque des revendications 2 ou 3 ;
- un polynucléotide selon la revendication 4 ;
- une cellule présentatrice de l'antigène selon une quelconque des revendications 8 ou 9 ;
- une préparation de lymphocytes T
cytotoxiques selon la revendication 12.