CN100349620C - 制备生物合成的用于移植的生物材料的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种制备移植材料的方法，所述材料源于适合在人或动物移植中作为外科手术假体和血管假体的自体、同种异体或异种的生物和组织工程化的生物合成组织和生物组织。该所得材料可抑制体内钙化，且提供无孔生物基质，该基质能阻止血管生成和组织内生的穿透，适合于移植的活细胞如内皮细胞的附着和滞留而无须另外包被细胞外基质蛋白。此方法包括室温下戊二醛浓度从0%逐级增加到不超过5%重量/体积，pH由酸向碱的逐步变化，此方法可维持所述材料的显微结构和细胞内层。附加柔韧性、顺应性、血液相容性以及强度和持续性会随最终的应用而变化。戊二醛逐渐并且全面地渗透该材料，使所述组织的胶原成分发生交联。

Description

制备生物合成的用于移植的生物材料的方法
技术领域
本发明涉及一种制造生物和生物合成材料的方法，此材料适用于移植以替换或增殖受损的，发病的或缺失的组织，结构或器官。此法具体不限于用自体、同种异体或异种的哺乳动物源性材料来维持组织微结构，并抑制体内钙化、组织内生及透壁性血管的生成。在一种实施方案中，其最终结果为移植活性细胞在体内环境附着滞留。
背景技术
前文已述例如用戊二醛来进行组织稳定和固定的方法以增加强度、中和抗原位点和对人体移植所用的生物和生物合成组织灭菌。美国专利4319363、4466139和4691588(Ketharanathan)公开了在戊二醛浓度恒定pH恒定的条件下，在静态流体环境中制备生物和生物合成材料，以赋予强度和持续性，中和抗原位点并将所述材料灭菌。美国专利3966401(Hancock和Fogarty)描述了一种用棕色液体如戊二醛在生理范围内，对组织如心脏瓣膜施压，并释放压力从而保持自然组织弹性的方法。另外，美国专利4798611(Freeman)公开了用交联剂如戊二醛处理后，通过2～8百万格雷的γ射线辐射异种材料来进行灭菌，提高其顺应性和降低其抗原性的方法。
有文献报道了移植的经戊二醛处理过的生物组织假体，特别是人造心脏瓣膜中的体内钙化。美国专利4466139所述的材料当用作狗体内的血管导管时，其壁上出现体内显微钙化，但这种钙化没有导致此材料的失效。移植前贮存于50％的醇中可降低钙化的程度但不会根除。人们设计出一些方法以试图减少或根除钙化现象。美国专利4648881(Caroebtuer等)描述了一种用无磷酸盐的溶液抑制生物组织钙化的方法，美国专利5931969(Carpentier等)公开了在热处理溶液中处理至少半固定的组织，并诱导组织/溶液移动15到60天。美国专利5843181(Jaffe和Hancock)公开了一种方法，它将生物组织于固定前浸泡于至少一种pH为5～8的缓冲液中，使其基本达到无细胞化。美国专利5746775(Levy和Hirsch)公开了将组织用戊二醛预处理后，置于含抗钙化剂的60％～80％的低脂酒精水溶液中至少20分钟来抑制体内钙化。
文献记载了多种用细胞外基质蛋白预处理底物，以模拟蛋白表面从而促进移植的活细胞在合成材料表面生长，附着和滞留的方法。例如，美国专利4820626(Williams和Jarrell)公开了用人血浆和纤维蛋白胶体包被聚酯移植材料，使内皮细胞附着在合成的血管移植物表面，铺满度至少为50％。美国专利5632778(Goldstein)介绍一种方法以杀伤间质胶原中的天然细胞，去除潜在致免疫活性可溶分子，然后将此无细胞的组织用细胞外材料进行处理，并移植自体或同种异体的细胞，然后植入该移植物材料。
人们广泛关注移植中合成材料的合适孔径，其可促进由组织内生而致的愈合或生物化，最近还将其用于透壁血管生成以促进内皮化。一个不利方面是难以控制组织内生，尤其在内径6mm或更狭窄的血管导管内的内生极易导致腔内狭窄、血栓形成及闭塞、然后使移植失败。
发明内容
本发明提供了一种自哺乳动物的自体、同种异体或异种组织制造移植材料的方法。所述组织包含20％～80％，优选40％重量的胶原。
所述方法包括用交联剂处理所述组织30分钟到6个小时，包括在所述时间段内所述交联剂浓度从起始的0％～0.25％重量/体积变化到终末的0.5％～5％重量/体积及在所述时间段内所述交联剂pH从起始的1～3变化到终末的5～8。
优选所述方法包括用所述交联剂处理所述组织约2.5个小时。
优选所述方法在所述时间段内使所述交联剂浓度和所述pH逐步增加。
优选所述起始浓度约为0％重量/体积，优选所述终浓度约为2.5％重量/体积。
优选所述起始pH约为1.5，优选所述终末pH约为7.4。
该组织可以为自体、同种异体或异种的，例如来自人、绵羊、牛或猪的材料。该组织可以为组织工程化生物材料或经组织工程手段构建在替代动物中的持久或可降解支架上的材料或是实验室里组织培养系统所得的材料。该组织可以为天然生物材料，如输尿管、胸膜或血管。该组织构型可以为管状、片状或三维状。
优选交联剂为戊二醛。
此材料优选置于循环流体浴或转子(rotating drum)中进行处理。循环浴中，管状材料可连接于流动系统从而使流体以200到400mL/min(优选300mL/min)的速度流过每条管的腔。优选所述方法还包括在所述时间段后，用浓度为0.5％到5％(优选2.5％)重量/体积、pH5～8(优选7.4)的交联剂(优选其新鲜溶液)在20℃～27℃(优选25℃)进一步处理所述组织1小时到5天(优选48小时)。
优选组织和交联剂溶液维持在20℃～27℃，优选约25℃。
所述组织的构型在处理时优选用可压缩性模板维持，从而使组织未被固定或仅一端被固定以使它在所述模板上运动。
因此，在不破坏该组织的前提下可维持该组织的显微结构。
优选所述方法包括在所述组织交联后对其作灭菌处理，优选用化学灭菌法或用15～30千格雷(kgys)，优选25千格雷的γ辐射灭菌。
所述方法可选择包括在灭菌前将组织在2％重量/体积的过氧化氢中浸泡30分钟到1.5小时，优选约1小时。
所述方法可选择包括γ辐射灭菌前将组织在5％重量/体积的甘氨酸中保温2到24小时，优选12小时。
优选此方法包括在移植前将所述材料在50％体积/体积的乙基醇(即乙醇)中贮存最少3星期、优选三个月。
因而，人们已发现此种组织处理方式可以提供具有完整的显微结构及细胞内层，能抑制体内钙化，组织内生和透壁血管形成的材料并提供适于移植的活细胞进行附着的微环境。而且，根据所需最终应用，通过在有功能的范围内改变所述方法，可使血液相容性、顺应性和柔韧性改变。
本发明亦提供经由上述方法处理的移植材料。
附图简述
为进一步清楚阐述本发明，现举例并参考附图介绍一个优选实施方案。
图1是根据本发明优选实施方案的方法处理在犬类模型中作为血管替代物植入127天后的牛输尿管的苏木精伊红染色(H&E)显微照片。
图2是按照美国专利4466139的方法处理在犬类模型中作为血管替代物植入90天后的牛输尿管的苏木精伊红染色显微照片。
图3是附着在根据此优选实施方案的方法加工的牛输尿管流动表面的，抗CD31标记的人大隐静脉内皮细胞单层的显微照片。
具体实施方案
本发明是基于如下的惊人发现：将组织工程化的自体、同种异体和异种生物合成的生物材料或天然生物材料，与浓度渐增的交联剂(如戊二醛)在由酸逐渐变碱的pH环境中接触，并置于动态流体环境中，优选在加工后于50％体积/体积的醇中贮存至少3周，由此能提供具有完整显微结构、能阻止组织内生和血管生成的无孔生物基质，还能抑制体内钙化，并适于移植的活细胞进行附着和滞留。而且，于处理期间未被固定或一端被固定在可压缩性模板上的生物合成或生物材料，由于交联剂的逐渐穿透，可控制柔韧性和顺应性。
此所得材料具有持久的生物显微结构以及稳定化细胞(例如组织工程化材料上的成纤维细胞和哺乳动物输尿管内侧的尿道上皮细胞)排列的表面，此材料对移植的活细胞具有亲和力并能在所需的生物条件下使它们滞留。移植的活细胞更易于通过多个细胞结合位点与这些细胞内层的天然细胞外基质(ECM)蛋白相互作用，其中每个细胞结合位点可比单个ECM或ECM衍生物多出一个以上的蛋白配体，所述单个ECM或ECM衍生物是用来包被聚酯和聚四氟乙烯材料以辅助内皮细胞附着的。据推测，即使所述生物基质与戊二醛交联，此ECM结合位点仍可为移植细胞识别并可供这些细胞附着。当为生物合成材料时，该组织工程化生物界面接触到生存环境，仅作为内部骨架结构的此合成成分绝不与活结构(living structure)接触。
对于具体的应用或具体的材料，可通过时间参数、功能范围内戊二醛浓度百分比及pH的改变来改变所述材料的特征。例如，为实验室制造的自体组织时，戊二醛可用于将组织繁殖控制在最适水平，而为非自体组织时，戊二醛使该材料无免疫原性。可通过动力学处理的程度(degree)和强度来改变其柔韧性、依附性和持续性的程度。
因此，根据本发明的一种优选方案，在通过处理自体、同种异体和异种组织(如用于外科移植的，管状、扁平片状和三维的，组织工程化生物合成和生物材料及天然生物组织)来制造移植材料的方法中，首先从该组织外部去除多余组织。
之后，将该组织固定在可压缩性模板上，使模板上此组织的运动不受限制。为管状组织时，该组织以不固定方式置于可压缩性心轴上。
将此固定好的组织置于转子上以10rpm～20rpm，优选12rpm旋转，或置于约25℃的循环浴中。当置于循环浴中时，此管状组织可连接到流动系统使流体以大约300mL/min流过此腔。
将交联剂如戊二醛加到所述鼓或者浴中。在2.5小时内令其浓度从0％逐渐增加到最大预设值2.5％重量/体积，所述溶液的pH从1.5逐渐上升到7.4。
当戊二醛溶液达到预定的最终浓度和pH，将此组织从转子中取出，置入戊二醛新鲜溶液的循环浴中，然后将该溶液维持在2.5％重量/体积，pH7.4，25℃中。或者，如该组织已于循环浴中，如上更新该溶液。若该组织与流动系统连接，需去掉流动系统再如上更新溶液。将此组织在循环浴中保存约48小时，之后将此组织在2％重量/体积的过氧化氢中浸泡1小时。
之后，将此组织(或现为移植材料)在1％重量/体积的戊二醛和50％体积/体积的乙醇溶液中化学灭菌不少于18小时，或者可用15～30kgys，但优选25kgys的γ辐射灭菌。
所述组织可选择灭菌前，于5％重量/体积的甘氨酸中保温2～24小时，但优选12小时。
最终，此组织在50％体积/体积的乙醇中贮存最少三星期，优选三个月。
实施例1：
将根据本实施方案来处理组织的方法如下应用于作为血管假体使用的牛输尿管。
清洁条件下采集牛输尿管，4℃运至实验室。从输尿管骨盆端泵入生理盐水，将输尿管远端或膀胱端临时捆束并使此腔内盐水的压力上升至115mm汞柱。记录此输尿管中段的直径。将比输尿管直径稍窄的，并固定在钝鼻钢引入器(blunt nosed steel introducer)上的可压缩性硅树脂心轴无创伤地置入充压的输尿管。取出此金属引入器，从该输尿管外部去除多余的组织。然后将此输尿管固定在此硅树脂的一端，使其随硅树脂移动。将此被固定的输尿管置于温度21℃的12rpm的转子上。随着3个小时内磷酸缓冲液的加入，戊二醛浓度逐渐从0增加到预定的2.5％重量/体积，溶液pH从1.5上升到5.9。一旦达到所述戊二醛溶液预定的浓度和pH，将该输尿管从转子中取出，并置于pH7.4，2.5％重量/体积的戊二醛循环浴中24小时。
从戊二醛中取出所述材料，在缓冲盐水中简单淋洗，然后置于50％体积/体积的乙醇中。去除此可压缩性心轴，并用压力测验确定此材料的完整性。
将该材料在1％戊二醛的50％体积/体积的乙醇溶液中浸泡不少于18小时，以对其作化学灭菌，用50％体积/体积的乙醇淋洗所述材料以去掉灭菌液，并将它贮存在50％体积/体积的乙醇中至少三星期。
实施例2
体内抑制钙化的作用在灰狗体内作如下评估。
将按照本实施方案制备的源于牛输尿管的内直径6mm长度不少于10cm的移植物植入远端主动脉与最近接合处连接的主动脉-髂骨窝位置。植入内直径4mm长度不少于6cm的移植物作为股骨间位移植物。
未应用抗凝或抗血小板的治疗。
在预定间隔作阶段性血管造影以确认明显性(patency)并检测血管瘤，扩张或狭窄。在预定间隔，移植结束时或动物痛苦时处死动物。
最后对外植体进行肉眼和显微镜检查。
比较本发明加工的移植材料与美国专利4466139的移植材料的明显性，壁完整性和腔完整性时发现此二者无差异。然而显微镜检查发现用本实施方案方法加工的13个假体在植入1到18个月时无钙化现象。图1为按照本实施方案加工的，在犬类模型中作为血管替代物植入127天的牛输尿管的苏木精伊红染色(H&E)显微图片。此外植体的移植物壁上无显微钙化。如图所示，所述流动表面FS指向右侧。
与此相比，在相同时期用美国专利4466139的方法加工的25例假体，其中的11例(即44％)在壁上出现了显微钙化区域，主要位于接合位置。图2为按照美国专利4466139加工，作为犬类模型的血管替代物植入90天的牛尿管的苏木精伊红染色显微照片。在此外植体上，远端接合壁上可见显微钙化(Ca)区域。此移植物在外植体上是明显的(patent)。如图所示，所述流动表面(FS)指向右侧。
实施例3：
将人大隐静脉内皮细胞移植到加工的牛输尿管表面，对其附着性和黏附性评估如下。
用已公布的或改良的技术分离，收集并接种人的大隐静脉内皮细胞。人的大隐静脉内皮细胞从手术室取得的人大隐静脉逆向屈张节段分离，并置于含氨苄西林(100μg/mL)、庆大霉素(50μg/mL)、二性霉素B(2.5μg/mL)、L-谷氨酰胺(2.5mM)和碳酸钠(0.23％)的冰冻Hanks平衡盐溶液(HBSS，Sigma，澳大利亚)中运至实验室并在4℃保存。用外科手术线捆绑该静脉末端。应用改良酶收集技术：在37℃条件下将静脉在10mL 2mg/mL的胶原酶(Worthington type IV，Sigma)中浸泡10分钟，再以10秒钟间隔的自动速度振荡涡旋1分钟。所收集的细胞悬液在4℃，800g离心5分钟，用含加热灭活胎牛或小牛血清(FCS，CSL澳大利亚)、肝素(50μg/mL)和内皮细胞补充营养(Sigma澳大利亚)的7.5mL M199(Sigma澳大利亚)重悬所得细胞沉淀。将细胞接种于明胶包被的直径10cm的Petri组织培养皿中，在37℃、5％CO2、95％湿度的温箱(NuAire美国)中培养。细胞生长至铺满后传代3次。
用含有0.25％胰蛋白酶/0.2％EDTA(Sigma澳大利亚)的胰蛋白酶从组织培养皿上洗脱内皮细胞1分钟。用20％FCS和M199灭活所述胰蛋白酶活性，并将该细胞悬液在4℃800g离心5分钟。将细胞沉淀在培养基中重悬至浓度为1×106细胞/mL。
在内径4mm长度不少于10cm的导管中注入此细胞溶液，在37℃温箱中滚动(16rotation/h)1小时。接种后，在37℃、二氧化碳5％下孵育该导管，在孵育0、24、48和72小时后取导管标本(1cm)以评估细胞覆盖率及细胞密度。
将接种了人大隐静脉内皮细胞的导管孵育72小时，其细胞饱和度可达50％以上。将此导管置于480mL/min、剪切压力11.4达因/cm2的体外流动培养基中1小时。此培养基是由一个体外流动系统(由血液监控泵(GambroBMM10-1/3)及与外流线(outflow line)相连的三条平行的接种导管组成)分送的。
用抗CD31抗体(PECAM)标记细胞后测定流动内皮细胞的前后覆盖率。标记细胞用碱性磷酸酶标记的链霉抗生物素/生物素系统和5溴-4氯-3吲哚磷酸-氮兰四唑(BCIP/NBT)色素(Dako澳大利亚)来检测，。
结果：
饱和单层内皮细胞可牢固黏附在由尿道上皮细胞组成的生物基质表面，并在体外剪切压力11.4达因/cm2下保持黏附。图3为用碱性磷酸酶标记的链霉抗生物素/生物素系统和BCIP/NBT色素来检测抗CD31标记细胞的显微照片。图3显示，置于体外剪切压力11.4达因/cm2下1小时以后，人大隐静脉单层内皮细胞(EC)仍附着在按照本实施方案加工的牛输尿管的流动表面。在此图中，固有层标记为LP，尿道上皮细胞标记为URO。
由此，本实施方案的方法可应用于自体、同种异体和异种组织来制备适用于人或者动物的移植材料，用于替换或增殖受损的，发病的或缺失的组织、结构或器官。为赋予作为内植体的生物或者生物合成组织在具体应用中的所需特征，可对此方法予以调整。此所得材料可作为，例如小型血管冠状或外周旁路移植物，人造组织心脏瓣膜或防止组织内生进而支架内狭窄的支架生物栓子，植入心血管系统。此加工材料的无孔和组织密封性可抑制组织内生和形成延壁血管，而这正是导致小直径合成旁路移植物植入失效的主要原因之一。所述材料也可植入非心血管环境，例如作为人造皮肤、疝气修补补丁或人造韧带。通过在植入前将活细胞加入所述材料，可进一步强化该材料的功能，例如将内皮细胞添加到小血管置换物的流动表面能提供抗凝功能以避免血液凝结。
对于本领域技术人员，对此发明可作明显修改，但所有修改均不应超出本发明通过前述正文和图表确认的范围。

Claims (35)

1.制备源于哺乳动物的自体、同种异体或异种组织的移植材料的方法，所述组织含有20％到80％重量的胶原，该操作方法包括：用交联剂处理所述组织30分钟到6小时，在上述时间段内，所述交联剂的浓度从起始浓度的0％～0.25％重量/体积变化到终末浓度的0.5％～5％重量/体积，所述交联剂的pH从起始pH的1～3变化到终末pH的5～8。
2.权利要求1的方法，其中所述组织含有为40％重量的胶原。
3.权利要求1或2的方法，其中所述时间段为2.5个小时。
4.权利要求1的方法，包括在所述时间段内使所述交联剂浓度和所述pH逐步增加。
5.权利要求1的方法，其中所述起始浓度为0％。
6.权利要求1的方法，其中所述终末浓度为2.5％重量/体积。
7.权利要求1的方法，其中所述起始pH为1.5。
8.权利要求1的方法，其中所述终末pH为7.4。
9.权利要求1的方法，其中所述组织来自人、绵羊、牛或猪。
10.权利要求1的方法，其中所述组织为组织工程化生物材料、用组织工程手段构建在替代动物中的持久或可降解支架上的材料，或实验室里通过组织培养系统进行组织工程化的材料。
11.权利要求1中的方法，其中所述组织为天然生物材料。
12.权利要求1的方法，其中所述交联剂为戊二醛。
13.权利要求1的方法，包括在循环流体浴或转子中处理所述材料。
14.权利要求1的方法，其中所述材料为管状的并具有腔，所述方法包括在循环流体浴或转子中处理材料，并将所述材料连接到流动体系，使流体以200～400mL/min的速度流过所述材料的腔。
15.权利要求14的方法，其中所述流体流过所述材料腔的速度为300mL/min。
16.权利要求1的方法，包括在所述时间段后，用浓度0.5％～5％重量/体积、pH5～8的交联剂在20℃～27℃进一步处理所述组织1小时到5天。
17.权利要求16的方法，包括在所述时间段后，用浓度为2.5％重量/体积的交联剂处理所述组织。
18.权利要求16或17的方法，包括在所述时间段后，用pH为7.4的交联剂处理所述组织。
19.权利要求16的方法，包括在所述时间段后，在25℃用交联剂处理所述组织。
20.权利要求16的方法，其中进一步处理48小时。
21.权利要求1的方法，包括在20℃～27℃维持所述组织和交联剂溶液。
22.权利要求21的方法，包括在25℃维持所述组织和交联剂溶液。
23.权利要求1的方法，包括处理过程中用可压缩性模板维持所述组织的构型。
24.权利要求23的方法，其中所述组织未被固定或仅一端被固定以便允许所述材料在模板上移动。
25.权利要求1的方法，包括将所述组织交联后对其进行灭菌。
26.权利要求25的方法，包括灭菌前将所述组织在为2％重量/体积的过氧化氢中浸泡30分钟到1.5个小时。
27.权利要求26的方法，包括灭菌前将所述组织在重量/体积为2％的过氧化氢中浸泡1小时。
28.权利要求25到27中任一项的方法，包括用化学法灭菌所述组织。
29.权利要求25到27中任一项的方法，包括用15～30千格雷的γ辐射来灭菌所述组织。
30.权利要求29的方法，包括用25千格雷的γ辐射对所述组织灭菌。
31.权利要求29的方法，包括在γ辐射灭菌前将所述组织在5％重量/体积的甘氨酸中保温2～24小时。
32.权利要求31的方法，包括在γ辐射灭菌前将所述组织在5％重量/体积的甘氨酸中保温12小时。
33.权利要求1的方法，包括在移植前将所述材料贮存在50％体积/体积的乙醇中最少3星期。
34.权利要求33的方法，包括在移植前将所述材料贮存在50％体积/体积的乙醇中最少3个月。
35.一种移植材料，其为权利要求1到34中任一项的方法所制造。
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