CN100372871C

CN100372871C - Il-18bp启动子,其制备及用途

Info

Publication number: CN100372871C
Application number: CNB2003801048864A
Authority: CN
Inventors: D·诺维克; M·鲁宾斯坦; V·胡尔金
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 2002-10-10
Filing date: 2003-10-09
Publication date: 2008-03-05
Anticipated expiration: 2023-10-09
Also published as: EA200500624A1; JP4579688B2; DK1556412T3; EA007460B1; CY1109904T1; SI1556412T1; ATE454401T1; DE60330886D1; CA2501879A1; NO20051938L; NO334018B1; BR0315222A; EP1556412B1; EP1556412A2; IL167768A; IL152232A0; KR101140498B1; CA2501879C; JP2006501839A; CN1726225A

Abstract

本发明涉及白介素-18结合蛋白(IL-18BP)的启动子、其制备及用途。

Description

IL-18BP启动子，其制备及用途

发明领域

发明背景

细胞因子结合蛋白(可溶性细胞因子受体)通常是其各自细胞表面细胞因子受体的胞外配体结合结构域。它们或通过可变换的剪接或通过细胞表面受体蛋白裂解而产生。过去已对这些可溶性受体进行了叙述，例如，IL-6和IFN-γ的可溶性受体(Novick等人，1989)、TNF(Engelmann等人，1989；Engelmann等人，1990)、IL-1和IL-4(Maliszewski等人，1990)和IFN-α/β(Novick等人，1994；Novick等人，1992)。一种称为骨保护素(OPG，也称破骨抑制因子—OCIF)的细胞因子结合蛋白是TNFR/Fas家族的一个成员，似乎是仅作为分泌性蛋白存在的可溶性受体的第一个例子(Anderson等人，1997；Simonet等人，1997；Yasuda等人，1998)。

在IL-18柱上进行亲和纯化从尿中得到了白介素-18结合蛋白(IL-18BP)(Novick等人，1999)。IL-18BP在体外消除了IFN-γ对IL-18的诱导以及NF-κB对IL-18的活化。另外，IL-18BP还通过注射LPS抑制了小鼠中IFN-γ的诱导。IL-18BP基因位于人染色体11上，在包括IL-18BP基因的8.3kb基因组序列中没发现编码跨膜结构域的外显子。迄今为止，在人身上发现了通过变换剪接mRNA可产生IL-18BP的四种同种型。它们被命名为IL-18BP a、b、c和d，它们的N末端相同，但C末端不同(Novick等人，1999)。这些同种型与IL-18的结合能力不同(Kim等人，2000)。在四种同种型中，人IL-18BP(hIL-18BP)同种型a和c对IL-18具有中和能力已为人所知。最富含的IL-18BP同种型，即剪接变体同种型a，对IL-18具有高亲和力，结合速率快，解离速率慢，解离常数(Kd)约为0.4nM(Kim等人，2000)。IL-18BP在脾中固有地表达(Novick等人，1999)，循环的血浆浓度为2.5ng/ml(Novick等人，2001)。有人利用计算机模型(Kim等人，2000)和基于类似蛋白质IL-1β与IL-1R I型的相互作用(Vigers等人，1997)对参与IL-18和IL-18BP相互作用的残基进行了描述。在IL-18与IL-18BP结合的模型中，已经提出IL-18的42位上Glu残基和89位上Lys残基分别与IL-18BP的Lys-130和GIu-114结合(Kim等人，2000)。

如上所述，IL-18诱导IFN-γ，最近又有报导，IFN-γ反过来在体外诱导产生IL-18BPa mRNA(Muhl等人，2000)。所以，IL-18BPa可用作“中断”信号，以终止炎症反应。

IL-18BP与一些痘病毒编码的蛋白质家族高度同源(Novick等人，1999；Xiang和Moss，1999)。通过该推定病毒性IL-18BP抑制IL-18可减弱炎症抗病毒性Th1反应。

脓毒症的血清IL-18BP水平很高，表示它具有体内调节免疫反应的作用(Novick等人，2001)。事实上，IFN-γ可诱导各种细胞产生IL-18BP，提示它用作IL-18介导的免疫反应的负反馈抑制剂(Muhl等人，2000)。

初步结果显示，在白细胞、结肠、小肠、前列腺，特别是脾细胞中检测到IL-18BP mRNA(Novick等人，1999)。脾细胞的成分细胞由巨噬细胞、淋巴细胞和浆细胞以及循环产生的其他细胞组成。

不同类型细胞之间控制转录、启动子和增强子的元件活性差别很大。启动子和增强子由与参与转录的细胞蛋白质特异性相互作用的DNA序列短阵列组成(综述见Dynan和Tjian，1985；McKnight和Tjian，1986；Sassone-Corsi和Borreli，1986以及Maniatis等人，1987)。不同识别序列的组合和关连转录因子的数量决定了一给定基因在一特定细胞类型中转录的效率。很多真核细胞启动子含有两种识别序列：TATA盒和上游启动子元件。TATA盒位于转录起始位点上游25-30bp处，被认为参与了指导RNA聚合酶II在正确位点开始合成RNA。与此相反，上游启动子元件决定转录的初始速度。增强子元件可刺激连锁同源或异源启动子转录增加1000倍。然而，增强子不同于上游启动子元件，当被置于转录起始位点下游或与启动子相距较远时，它们都有活性。细胞基因的许多增强子在特定组织或细胞类型中专一地运作(综述见Voss等人，1986；Maniatis等人，1987)。另外，一些增强子只有在诱导物如激素或金属离子存在的特定条件下才有活性(综述见Sassone-Corsi和Borrelli，1986；Maniatis，1987)。因为细胞增强子有不同的细胞特异性，所以选择导入真核细胞表达载体的启动子和增强子元件取决于需要在其中表达重组基因的细胞类型。反之，含有特异性启动子和细胞增强子的预构建载体也严格限于用在其中可获得表达的细胞类型中。

病毒产生的许多增强子元件有很宽的宿主范围，这些增强子元件在各种各样的组织内表现活性，尽管已经观察到不同细胞类型之间该活性有明显的数量差别。例如，SV40早期增强子同时在很多哺乳动物细胞类型中表现活性，因此可使用带此种增强子的载体(Dijkema等人，1985)。其他两个在很多细胞中表现活性的增强子/启动子组合由劳斯肉瘤病毒基因组的长复制(LTR)(Gorman等人，1982)以及由人巨细胞病毒产生(Boshart等人，1985)。

发明内容

本发明涉及编码人IL-18BP启动子的DNA序列(SEQ ID NO：1)，或其诸如SEQ ID NO：2或3所示的片段，或其功能性衍生物，其中所述DNA序列或其片段的3’端包含一或多个来自SEQ ID NO：5的5’端的核苷酸。

更具体地说，本发明的衍生物可以是在序列的沉默子元件中的一或多个AP1位点上发生突变的本发明DNA，该DNA序列还可以含有一个操作性连接于IL-18BP启动子的基因。

在本发明一个方面中，该基因编码例如IL-18BP或者异源蛋白质，如萤光素、干扰素-β、TNF、促红细胞生成素、组织纤溶蛋白启动剂、粒细胞集落刺激因子、锰超氧化物歧化酶、免疫球蛋白及其片段、生长激素、FSH、hCG、IL-18、hsLDLR和TNF受体结合蛋白。

本发明提供一种载体，它包含编码人IL-18BP启动子的DNA序列；一种包含该载体的宿主细胞，例如CHO、WISH、HepG2、Cos、CV-1、HeLA和Hakat U937细胞；一种生产重组蛋白质的方法，该方法包括培养宿主细胞和分离所产生的重组蛋白质。

本发明还提供一种重组病毒载体，其包括一部分病毒基因组、一编码感兴趣基因的DNA片段和一包括编码人IL-18BP启动子的DNA序列的DNA片段。更具体地说，所述病毒部分可以是例如腺伴随病毒、诸如HIV、HFV、MLV、FIV和VSV等逆转录病毒。

另一方面，本发明提供一种调节感兴趣基因的细胞特异性表达的方法，该方法包括在目标细胞如造血干细胞和单核细胞中用本发明的病毒载体转导目标哺乳动物细胞。感兴趣基因可以是例如赋予抗HIV感染性能的蛋白质。调节感兴趣基因的细胞特异性表达可用来治疗例如HIV感染、治疗造血失调如SCID、慢性肉芽肿疾病和地中海贫血。

本发明也提供一种用于治疗个体表现为体组织中IFNγ上升的疾病的基因疗法，该疗法包括给予有效量的本发明病毒载体，任选地还包括给予IL-6和/或TNF-α和/或IRF和/或C/EBPβ因子。

另一方面，本发明涉及一种转基因小鼠，其包括编码本发明DNA序列的DNA序列。

此外，本发明教导了编码人IL-18BP启动子的DNA序列(SED ID NO：1)或其片段或功能性衍生物在制备治疗疾病的药物中的用途，其中所述DNA序列或其片段的3’端包含一或多个来自SEQ ID NO：5的5’端的核苷酸。

本发明又提供了一种药物组合物，它包含治疗有效量的编码人IL-18BP启动子的DNA序列(SED ID NO：1)或其片段或功能性衍生物，其中所述DNA序列或其片段的3’端包含一或多个来自SEQ ID NO：5的5’端的核苷酸。

附图说明

图1所示为包括5个调节元件在内的IL-18BP基因启动子区的示意图。

图2所示为IL-18BP诱导的动力学以及与TNFα和IL-6的协同作用。(A)IFNγ以剂量和时间依赖方式诱导人WISH细胞产生IL-18BP。将细胞与所示浓度的IFNγ培育24小时和48小时。(B)TNFα、IL-6及其组合对IFNγ诱导的IL-18BP的协同作用。将HepG2细胞与IFNγ(100U/ml)、TNFα(20ng/ml)和IL-6(300U/ml)的所示组合一起培育。每种组合诱导的IL-18BP都比仅由IFNγ诱导的IL-18BP高很多(p<0.05)。数据以平均值±SD表示(A部分，n＝3；B部分，n＝4)。

图3所示为人和小鼠IL-18BP基因的保守性外显子-内含子组构示意图。将人IL-18BPa基因和小鼠IL-18BPd基因进行比较。图中示出外显子。也示出人IL-18BPa基因的转录起始位点、翻译起始位点(ATG)、终止密码子(Stop)和多腺苷酸化信号(PAS)。

图4所示为IFNγ对IL-18BP的诱导处于转录水平，取决于蛋白质从头合成(denovo synthesis)。(A)为HepG2细胞的IL-18BP mRNA的半定量RT-PCR，所述的HepG2细胞与放线菌素D(1μg/ml)预培育30分钟，洗涤，再与IFNγ(100U/ml)培育所示的时间。作为对照，给出β肌动蛋白mRNA的RT-PCR。(B)为HepG2细胞的IL-18BP mRNA的半定量RT-PCR，所述的HepG2细胞与环己酰亚胺(20μg/ml)预培育，再与IFNγ(100U/ml)培育所示的时间。

图5所示为携带人IL-18BP启动子的萤光素酶报导基因载体的基本活性和IFNγ诱导的活性。括号内为插入片段大小，自转录起始位点(+1)延伸。圆圈内数字代表各种效应元件：1.GAS，2.IRF-E，3.C/EBP-E(2个位点)，4.沉默子，5.远端增强子。实心方形表示特定效应元件上的突变。HepG2细胞与所示报导基因载体和pSV40βGAL共转染。将全部萤光素酶数值标准化为β-半乳糖苷酶活性。(A)未诱导细胞提取物的萤光素酶活性相对于pGL3基本型载体转染的细胞的活性。(B)选定载体转染并用IFNγ诱导的细胞的萤光素酶活性。诱导的活性相对于基本活性倍增，如(A)所示。

图6所示为IRF-1是小鼠IL-18BP的表达不可或缺的。图中示出被腹膜注射小鼠IFNγ(53,000u/小鼠)的C57B1/6IRF-1^-/-和对照C57B1/6小鼠的血清IL-18BP。注射前和注射后24小时使小鼠出血。通过ELISA试验测定血清IL-18BP。数据以平均值±SE表示(每组6只动物)。对照小鼠与IRF缺陷小鼠的血清IL-18BP之差以及对照小鼠内诱导产生的IL-18BP在统计学上有显著差异(p<0.05)。

图7所示为IRF-1和C/EBPβ在IL-18BP基因诱导及其缔合中的作用。(A)为对应于碱基-33至-75(IRF-E，左面)与-8至-55(GAS，右面)的dsDNA探针的电泳迁移率变动分析(EMSA，实施例18)。HepG2细胞用IFNγ处理所示时间，将核提取物与IRF-E或GAS探针反应。实心箭头所示为变动的带。使GAS复合物与所示抗体超移动(super shift)。空心箭头所示为超移动的带。(B)为HepG2细胞的IL-18BP mRNA的半定量RT-PCR，所述的HepG2细胞用IRF-1或C/EBPβ表达载体的所示组合转染。在图中示出的地方加入IFNγ，5小时后收获细胞。将数值标准化为β肌动蛋白mRNA。(C)为用含有整个IL-18BP启动子萤光素酶报导基因载体pGL3(1272)与所示浓度的pCDNA3-IRF-1(圆形)和1μg/10⁶细胞的pCDNA3-C/EBPβ转染细胞的萤光素酶活性。或者，用所示浓度的pCDNA3-C/EBPβ(方形)和0.1μg/10⁶pCDNA3-IRF-1转染细胞。将萤光素酶活性标准化为βGal活性。(D)为IFNγ(100U/ml，2小时)处理的细胞的核提取物和胞质提取物(提取物的制备见实施例17)的免疫印迹。提取物用所示抗体免疫沉淀(IP)和免疫印迹(IB)。

图8所示为IFNγ诱导后结合于IL-18BP启动子的因子。(A)用IFNγ处理后的近端C/EBPβE和总细胞提取物的EMSA。在图中示出的地方，使提取物与所示抗体超移动。(B)对应于用IFNγ处理后的远端增强子和总细胞提取物的探针的EMSA。在图中示出的地方，使提取物与所示抗体超移动，与对应于探针近端一半的dsDNA竞争或不竞争。实心箭头所示为变动的带。空心箭头所示为超移动的带。

具体实施方式

本发明涉及人IL-18BP启动子。该启动子驱动特定细胞例如单核细胞的IL-18BP的组成型表达，并且驱动许多细胞诱导IFNγ介导的IL-18BP表达。人IL-18BP启动子能够指导异源蛋白质中IFNγ诱导的组成型表达。

本发明涉及编码人IL-18BP启动子的DNA序列(SEQ ID NO：1)，或其片段或功能性衍生物，其中所述DNA序列或其片段的3’端包含一或多个来自SEQ ID NO：5的5’端的核苷酸。

在白细胞、结肠、小肠、前列腺，主要在脾细胞中检测到IL-18BP mRNA(Novick等人，1999)。以下其中一个实施例显示单核细胞中IL-18蛋白质组成型表达。

已经发现，IFNγ不但在单核细胞中而且在许多不同细胞中诱导IL-18BP表达，加入IL-6和TNFα可能进一步增强此诱导。

已经发现，蛋白质的从头合成是IFNγ激活IL-18BP基因所必需的。

通过5’RACE确定了人IL-18BPa mRNA的转录起始位点。

已经发现了位于IL-18BP基因上游的锌指结构蛋白质的3’端mRNA，它限制了潜在的IL-18BPa上游调节序列为碱基1上游的1601个碱基。

在此区(从转录近端到转录远端)内鉴定了6个调节元件(图1)：1-碱基-24至-32上γ-激活的序列(GAS)，2-跨越碱基-57至-69的IRF-1，2效应元件(IRF-E)，3-和4-在碱基-309至-322和-621至-634上的两个C/EBPβ效应元件，5-在残基-625至-1106上的沉默子，以及6-跨越碱基-1106至-1272的增强子元件。在HepG2细胞(人肝癌细胞系)测试一系列在1601bp片段的5’端渐进截短的萤光素酶报导基因载体。SEQ ID NO：1所示的1272kb区指导某些类型组织和细胞的基本表达以及IFNγ诱导。测定此区内连续截短的DNA片段的启动子活性，证明了接近SEQ ID NO：3所示转录起始位点的122bpDNA片段包含最小启动子。该最小启动子也是可诱导的。然而，该最小启动子上游的其他调节序列对诱导程度没有任何贡献。除了含有IRF-1和GAS元件外还含有两个C/EBPβ元件的635bp DNA片段(SEQ ID NO：2)，被发现能够使IFNγ诱导的萤光素酶表达达到最大。

对IRF-1缺陷小鼠进行的体内实验证实了IRF-1作为基本的IL-18BP表达介导剂以及IFNγ诱导的IL-18BP表达介导剂的重要作用。

已经发现，在IFNγ诱导后，IRF-1因子的表达被诱导，该因子与组成地存在于细胞中的C/EBPβ构成复合物。此复合物与近端GAS启动子元件及其毗邻IRF-E启动子元件结合。

已经发现，位于转录位点远端的增强子通过IRF-1与基本型启动子相互作用。

本发明涉及SEQ ID NO：1所示的IL-18BP启动子及其片段，以及调节基因表达的方法。更具体地说，本发明涉及能够指导基因表达的IL-18BP1272bp分离DNA序列(SEQ ID NO：1)或其片段，如635bp(SEQ ID NO：2)和122bp(SEQ ID NO：3)。

已经克隆了该IL-18BP启动子区并对其测序，它对应于IL-18BP转录起始位点上游的1272bp片段(SEQ.ID.NO：1)内的核苷酸。

本发明涵盖整个IL-18BP启动子(SEQ ID NO：1)，而且涵盖包含其片段(SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3)的DNA序列，它们能够指导基因转录因而最后指导基因表达，并且可与IL-18BP启动子区的其他部分或者与异源启动子或异源启动子元件使用来控制基因转录。该启动子或其片段受IFNγ诱导。过度表达IRF-1和/或C/EBPβ和/或用IL-6和/或TNFα处理可进一步增强这样的诱导。

SEQ ID NO：1所示启动子的功能性衍生物或其片段如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3都是突变体，其中1至10个，优选1至5个，更好是1个核苷酸或者被其他核苷酸置换，或者缺失，它们能够指导基因表达和IFNγ诱导。

运用本领域公知的各种方法可分离本发明包含IL-18BP启动子的DNA序列(SEQ ID NO：1)或其片段如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的片段。至少可采用以下三种主要的替换方法：

1)从含有DNA序列的基因组DNA分离该DNA序列；

2)化学合成DNA序列；以及

3)通过聚合酶链反应(PCR)合成DNA序列。

第一种方法可筛选人基因组DNA文库，以鉴定包含IL-18BP启动子或IL-18BP启动子元件的DNA序列。

第二种方法可化学合成包含IL-18BP启动子或IL-18BP启动子元件的DNA序列。例如，可合成一系列100个碱基寡核苷酸，它们再依次连接(通过合适的末端限制位点)形成正确的核苷酸线性序列，得到包含IL-18BP启动子区或IL-18BP启动子的DNA序列。

第三种方法可用PCR技术合成包含IL-18BP启动子区或IL-18BP启动子的DNA序列。简言之，可用长至少15个碱基的合成DNA寡核苷酸对(PCR引物)通过酶扩增目标序列上间插DNA区。不断重复模板热变性、引物退火和DNA聚合酶延长退火引物3’末端的循环，由此可扩增PCR引物5’端所限定的区段。见美国专利号4,683,195和4,683,202。

本发明的IL-18BP启动子能够导致异源基因基本表达，还可以通过IFNγ诱导异源基因的表达。因此，IL-18BP启动子具有基本活性和可诱导活性。

SEQ ID NO：1给出启动子的核苷酸序列或其有启动子活性的片段，本说明书描述这样的序列。已经确认，可以制备不影响启动子或启动子元件功能的核苷酸衍生物。这些修饰核苷酸序列可这样制备：例如，运用本领域公知的各种方法使核苷酸序列发生突变，这样的突变可引起一或多个核苷酸的缺失、置换插入、倒置或插入。例如，可采用Taylor，J.W.等人(Nucl.Acids Res.13，8749-8764(1985))和Kunkel(J.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82，482-492(1985))描述的定点诱变技术。此外，可通过商业途径购买定点诱变试剂盒。例如，可从Amersham公司(Arlington Heights，I11.)购买进行定点诱变的试剂盒。本发明包括分别与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的序列有至少50％相同性，优选至少75％相同性，更好至少90％相同性的DNA，只要它们保留了和/或增强了启动子活性。例如，SEQ ID NO：1所示一个衍生物是沉默子区所含三个AP1位点中一个或全部发生突变。

包含IL-18BP启动子、其片段和/或其衍生物的核苷酸序列可操作性地相连于任一感兴趣基因的编码区，以在适当宿主细胞中表达该基因。操作性地相连的目的在于将启动子和元件操作地连接起来。对于感兴趣基因的表达，最好使SEQ ID NO：1所示的整个IL-18BP启动子或其诸如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的片段或其衍生物操作性地连接于感兴趣的基因。如以下实施例部分所述，IL-18BP启动子或其诸如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的片段能够指导异源基因的表达。用本发明的启动子表达异源基因也在本发明构思之中。

启动子还可含有一个内含子，例如IL-18BP的第一个内含子。

“操作性地连接的”IL-18BP启动子或启动子元件将指导在适当阅读框内的核酸分子的转录。至于异源启动子，当本发明的启动子和元件控制这些异源启动子的功能时，它们可作操作性地连接。

如上所述，可用本发明的IL-18BP启动子、其片段或其衍生物序列来表达任一感兴趣基因。一般地，此目的使用表达载体。所以，本发明还涉及表达载体，其含有能够指导基因表达的分离DNA序列，该DNA序列包括IL-18BP启动子、其片段或其衍生物。表达载体最好含有这样的IL-18BP启动子、其片段或其衍生物：该启动子的核苷酸序列分别对应于SEQ ID NO：1、SEQ

ID NO：2或SEQ ID NO：3或其片段和/或其衍生物。此外，也优选使用这样的表达载体：它们还含有操作性地连接于IL-18BP启动子或其片段和/或其衍生物或其修饰核苷酸序列的同源或异源基因。

本发明使用的表达载体通常是“质粒”形式，为圆形双链DNA，它们的载体形式不会与染色体结合。然而，本发明包括这样一些其他形式的表达载体，它们具有相同功能并且后来为本领域所知。

用在本发明的表达载体一般含有一个复制起点、一个位于感兴趣基因前面(例如上游)的IL-18BP启动子、转录终止序列和残余载体。表达载体也可包括本技术领域公知的其他DNA序列，例如，使表达产物保持稳定的稳定性前导序列，分泌表达产物的分泌性前导序列、可以表达待调节结构基因的序列(如在生长培养液中加入或不加入营养物质或其他诱导剂)、能够在转化宿主细胞中提供表型分泌的标记序列、以及提供限制性内切核酸酶切割位点的序列。所用的实际表达载体的特性必须与将要采用的宿主细胞相容。本发明考虑的表达载体是至少能够指导感兴趣基因的转录最好是表达，而所述的转录或表达受IL-18BP启动子区或IL-18BP启动子或其修饰核苷酸序列支配。适当的复制起点包括例如猿猴病毒40(SV40)的复制起点。适当的终止序列包括例如猿猴病毒40(SV40)的终止序列。本发明的启动子可用于实际上任一感兴趣基因的表达，例如编码治疗性产物的基因，如干扰素-β、TNF、促红细胞生成素、组织纤溶蛋白启动剂、粒细胞集落刺激因子、锰超氧化物歧化酶、免疫球蛋白或其片段、生长激素、hsLDLR、FSH、hCG、IL-18、TNF受体结合蛋白及IL-18结合蛋白。所有这些物质都为本领域技术人员所知，其中很多可以通过商业途径获得。

运用本领域公知的标准重组DNA技术可构建含有所需编码和调控序列的适当表达载体，很多重组DNA技术在Sambrook等人的Molecular Cloning：A Laboratory Manua1，2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，N.Y.(1989)中有描述。

本发明也涉及含有表达载体的宿主细胞，所述的表达载体包含能够指导基因表达的分离DNA序列，该序列含有IL-18BP启动子区或IL-18BP启动子或其修饰核苷酸序列。较佳地，IL-18BP启动子区的核苷酸序列对应于SEQ ID

NO：1所示IL-18BP转录起始位点上游的1272bp，或者其片段，如对应于SEQ ID NO：2所示转录起始位点上游的635bp的核苷酸序列，或者其片段，如对应于SEQ ID NO：3所示转录起始位点上游的122bp的核苷酸序列。本发明也优选使用含有这样一个表达载体的宿主细胞，所述的表达载体还包含操作性地连接于SEQ ID NO：1所示IL-18BP启动子区或IL-18BP或其片段的同源或异源基因。适当的宿主细胞包括例如人HeLa细胞或非洲绿猴细胞CV-1和COS-1、CHO细胞、HepG2、WISH细胞、Hakat U937等等。

优选的宿主细胞含有IFNγ受体，可以诱导IL-18BP启动子，从而增强感兴趣基因的表达。

利用本技术领域公知的各种方法可将表达载体导入宿主细胞内。例如，通过磷酸钙沉淀方法可使宿主细胞与表达载体进行转染。不过，本发明也可采用将表达载体导入宿主细胞的其他方法，例如电穿孔法、生物弹射击融合法、脂质体融合法、核注射法以及病毒或抗菌素感染法。

一旦将表达载体导入了适当的宿主细胞，则可培养该宿主细胞并分离感兴趣基因所编码的多肽。另一个方法是，一旦将表达载体导入了适当的宿主细胞，则可培养该宿主细胞，在达到所需细胞密度之后，用IFNγ刺激宿主细胞并分离感兴趣基因所编码的多肽。

利用本技术领域公知的各种方法可鉴定含有表达载体的宿主细胞，其中所述的表达载体含有编码感兴趣基因的DNA序列。例如，可以采用DNA-DNA杂交、评估是否存在标记基因功能、通过测定感兴趣基因在宿主细胞内产生的mRNA转录物来评估转录水平、免疫检测基因产物等。

利用本技术领域公知的各种方法可测定本发明表达载体、质粒或DNA分子的DNA序列。例如，可以采用Sanger等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，5463-5467(1977))描述的双脱氧链终止法，或者Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，560-564(1977)中描述的Maxam-Gilbert方法。

应当理解，IL-18BP启动子内的特异性核苷酸或区域是调节所必需的。这些区域或核苷酸可位于元件的细小解剖结构旁侧，在分析启动子突变体的功能能力的实验中可对其进行研究。例如，用PCR技术可产生以下实施例部分所采用的启动子元件的单个碱基对突变或渐进缺失。以此方式，扩增了大量突变启动子区或缺失构建体，然后将它们克隆至报导基因构建体，再用转染和萤光素分析技术进行评估(见以下实施例部分)。可以将这些扩增片段克隆至IL-18BP启动子前后位置，也可以克隆至异源启动子构建体内。以此方式，可以鉴定在指导基因转录起重要作用的精确核苷酸序列。

此种分析也可鉴定不影响启动子功能或者可增加启动子功能的核苷酸变化。因此，也可以构建启动子或启动子元件的功能性衍生物。

足迹和凝胶移位分析有助于启动子区或启动子的功能分析。认识到在介导蛋白质结合中起重要作用的精确碱基对，证明了碱基在介导转录反应中的重要性。

所以，本发明还包括在DNA-蛋白质相互作用中起重要作用的碱基对。可对这类碱基对进行阐述。体外足迹实验可使用含有感兴趣区的基因组片段(Galas等人，Nucleic Acids Res.9，6505-6525(1981))。使分离的限制片段带上放射性标记，然后与核提取物一起培育，所用的核提取物用已有技术从含有将与该限制片段结合的DNA结合蛋白的细胞中制备(例如，Dignam等人，Nucleic Acids Res.11，1475-1489(1983))。将标记DNA片段与核提取物一起培育，DNAse I消化，再在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳。细胞提取物中DNA结合蛋白与它们在标记限制片段所含的识别序列结合，保护DNA免于被DNAse酶消化。保护区勾画出结合位点。该片段的Maxam和Gilbert测序反应可用作一个标记物，限定不受DNAse酶消化的核苷酸。

本发明还涉及与启动子或启动子元件相互作用的反式作用因子的鉴定和表征。顺式作用调节序列用作蛋白质的结合位点，被命名为顺式作用因子(TAF)(Dynan W.S.，Tjian T.Nature316，774-778(1985)；Maniatis，T.等人，Science236，1237-1245(1987))。假设每个基因各自的调节序列都与一或多个蛋白质结合，这些蛋白质就会以控制转录的方式相互作用以及与RNA聚合酶II相互作用。

在核提取物中鉴定了TAF能够结合顺式作用序列DNA片段，而且阻碍该DNA片段的电泳迁移(Dignam，J.D.等人，Nucleic Acids Res.11，1475-1489(1983)；Dynan，W.，Cell58，1-4(1989)；Fletcher，C.等人，Cell773-781(1987)；Scheidereit，C.等人，Cell 51，783-793(1987))。

顺式作用序列用于凝胶阻滞分析，确定核提取物的结合活性。凝胶移位分析技术在文献中已有描述，所采用的很多试剂同样可用在足迹实验中(Fried，M.等人，Nucleic Acids Res.9，6505-6525(1981)；Revzin，A.，Biotechniques7，346-355(1989)；Strauss，F.A.等人，Cell37，889-901(1984))。将32P标记的限制片段或互补oligo的退火配对与核提取物和poly d(I-C)在结合缓冲液中培育，此反应产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳。用自动射线照相术测定该DNA片段在凝胶上的位置，发现在蛋白质与该DNA结合的情况下此位置滞留。滞留程度随蛋白质尺寸相对地变化。

这样鉴定得到的结合蛋白再用已知技术纯化，最后克隆。

IL-18BP启动子也可用在转基因研究中。用转基因小鼠建立了一个有效的基因模型，用于研究包括癌症在内的许多人类疾病。转基因小鼠也提供了一个重要的体内方法，用于基因调节的研究中，这些研究已经确认并扩阔了转染报导基因(例如萤光素酶)实验得到的观察数据(Palmiter，F.L等人，Ann.Rev.Genet.20，465-499(1986))。在细胞培养模型中很少能进行针对解剖信号以获得基因表达关系的研究，而转基因模型可能最适合此类研究。因为调节序列种类之间有明显的保守性，以致于用小鼠转录机器可以准确地解释人调节信号，所以进行这种实验是可能的。

因此，在转基因小鼠中表达的构建体可提供很多关于IL-18BP基因调节的信息。

转基因小鼠可用本领域公知的方法制作。最常用来制作转基因动物的方法包括将DNA分子注入受精卵的雄原核内(Brinster等人，Cell27，223(1981)；Costantini等人，Nature294，982(1981)；Harpers等人.，Nature293，540(1981)；Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78，5016(1981)；Gordon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 73，1260(1976))。

一旦将DNA分子注入受精卵细胞，就可以把该细胞植入受者雌性动物的子宫内，让其发育为动物。所以，这样发育的动物的全部细胞都应含有导入基因序列。

饲养所得到的转基因小鼠或起始小鼠，分析其后代以建立表达转基因的起始小鼠系。可筛选转基因动物的多种组织，以便观察基因表达。对各种小鼠系的RNA进行研究，可以评价整合位点与转基因表达水平的不相关性。参见Hogan，B.等人的Manipulating the mouse embryo：a laboratorymanual，ColdSpring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1986)。

IL-18BP启动子和启动子元件为实施基因疗法提供了一个有用工具。

“基因疗法”是给予遗传物质以改变或操纵基因产物的表达，从而改变活细胞的生物性质，应用于治疗中。

细胞可以是异源细胞或自体细胞。可在体内对细胞进行改性，以后再给予受试者，或者通过直接给予受试者的基因治疗产物在体内对细胞进行改性。

就大部分而言，当IL-18BP基因在例如单核细胞中正常表达时，将使用包含IL-18BP启动子或其片段和/或其衍生物的构建体来引导这些细胞的基因表达。本领域已有的将构建体移入动物包括人的任何工具都可以采用。这包括病毒性载体，特别是逆转录病毒载体(参见，例如Zweibel等人，Science243，220(1989)及其引用文献)和其他方法。

已经发现，重组AAV载体将治疗基因传送到肝和骨胳肌肉具有很好的应用前景(Snyder等人，1997，Murphy等人，1997，Song等人，1998，Snyder等人，1999，Herzog等人，1997)。断裂凝血因子IX基因所产生的小鼠表现出严重的出血性失常，与在血友病B型病人发现的表型极为相似。据报导(Wang等人，1999)，在肝特异性增强子/启动子控制下单次门静脉注射编码犬齿因子IX cDNA的重组腺伴随病毒(AAV)载体，可长期性完全地治愈出血性失常。

转移基因最常用的载体是自致癌逆转录病毒如鼠类白血病病毒(MVL)产生的逆转录病毒载体，因为载体基因组整合到目标细胞的染色体内，产生稳定的转基因表达(I.M.Verma和N.Somia.Nature389，239(1997))。然而，已经证明，这些载体特别适合分裂细胞。现时使用的慢病毒属载体如HIV载体不发生细胞分裂(Mioshi et al.Science1999283：682-686)。慢病毒属感染不分裂细胞如巨噬细胞的能力使得它们成为基因转移工具的良好候选物。HIV载体有助于休眠人造血干细胞(HSC)的转导。

人造血干细胞(HSC)是实施基因疗法治疗遗传性异常出血和其他后天性疾病的一个很好目标，因为这些细胞具有再生整个造血系统的能力。例如造血干细胞能够再生单核细胞，而已知人类免疫程序缺陷病毒-1(HIV-1)的发病机理涉及单核细胞。

尽管使用造血干细胞对基因疗法进行了超过15年的研究，但仍存在一个重大障碍，即不能够有效地和稳定地将基因插入这些细胞中。最普遍使用的是molonery鼠白血病病毒(MLV)的逆转录病毒，但转移进入多潜能的人HSC的基因相对较少，而且基因表达通常不能令人满意。

最近，Kohn等人尝试用抑制HIV-1复制的基因对造血干细胞进行基因改造，产生对HIV-1感染有抗性的单核细胞(Kohn等人，1999)

理论上说，将能够带给HIV-1抗性的基因插入造血干细胞内，可以使后代成熟单核细胞和其他HIV-1易感细胞含有该种基因。

所以，使用在单核细胞中有活性的启动子，例如IL-18BP启动子或其片段，有利于HIV-1基因疗法。

大多数血液遗传疾病(例如，SCID、慢性肉芽肿疾病、地中海贫血等等)的基因疗法要求将基因体内转移到可移植的并可自我更新的HSC中以及调节一或多个细胞谱系内的转基因表达。

治愈影响HSC特定后代的失调或疾病(例如血色素疾病或地中海贫血、HIV-1感染)要求以细胞谱系特定方式限制治疗基因的表达(lotti等人，2002)。在此情况下，转移基因的转录导向是强制性的。不同细胞类型的基因表达取决于所用启动子的相对强度。然而，迄今进行的大部分临床前研究均依赖于使用病毒性组成型启动子来驱动转基因表达。例如，HIV-1载体使用内部的CMV启动子、小鼠CMV启动子和小鼠逆转录病毒载体LTR。在逆转录病毒载体框架内适当地调节转基因是很困难的，这是因为病毒长末端重复(LTR)和内部增强子-启动子与复合调节序列的不稳定遗传之间存在转录干扰。本发明使用已知可驱动单核细胞内转录的IL-18BP启动子来驱动HSC(这类单核细胞的前体)内的转基因表达。

以“抗HIV基因”对造血干细胞进行基因改造，移植后可能产生抗HIV感染的淋巴细胞和单核细胞。可回收感染HIV-1的病人的HSC，分离出CD34+细胞，在IL-18BP启动子(而不是逆转录病毒启动子)控制下用携带HIV-1抑制蛋白质的逆转录病毒载体体外转导，将这些细胞重新灌注入所述病人中(Kohn等人，1999)。

最常用的HSC来源是外周血造血干细胞(PBSC)，它们已经大量地取代了骨髓用在自体移植的架构中(Gale等人，1992和Kessinger等人，1991)。给予诸如G-CSF或GM-CSF等因子3至5天，PBSC可从骨髓流动到外周循环系统中，然后经白细胞去除法收集。一些研究已经表明，当移植外周血干细胞而非骨髓时，移植速度会更快(Henon等人，1992和Chao等人，1993)。G-CSF-移动的PBSC中所含的克隆源性祖细胞极易受逆转录病毒介导的基因转移影响，而PBSC中长期性重构干细胞的转导速度与骨髓一样低(Breni等人，1992，Cassel等人，1993，Dunba等人，1995)。已经发现，在感染HIV-1的病人中，G-CSF-移动的PBSC具有很好的流动性和易于收集，而且内源性HIV-1水平没有提高，至少在发病初期是这样(Junker等人，1997和Slobod等人，1996)。

另一个造血干细胞来源是脐带血(UCB)，它对逆转录病毒转导易感，其易感程度可能比骨髓细胞更高(Moritz等人，1993和Hao等人，1995)。使用UCB细胞的HSC特别有利于感染HIV-1的婴儿。因为传染主要发生在围产期，所以脐带血的造血干细胞数量和功能应该是正常的，此数量和功能在感染HIV-1的小孩和成人的骨髓可能会减少或减弱(Kearns等人，1997)。

已经研制出大量可抑制HIV-1复制的合成基因(“抗HIV-1基因”)，包括：反义、核酶、显性阴性突变体(如RevM10)、RNA诱物、防止病毒性蛋白质或细胞共受体表达的胞内抗体等等(Veres等人，1996，Zhou等人，1994，Couture等人，1996，Malim等人，1989，bahner等人，1993和Sullenger等人，1990，Lee等人，1994，Marasco等人，1997及Chen等人，1997)。很多情况下，这些抗HIV-1基因在模型系统中都能够显著地抑制HIV-1复制，而在某些情况下甚至限制病毒进入细胞(36，39-44)。如果需要，可使全部病人的HSC和得到的单核细胞无法支持HIV-1复制，从而有可能降低病毒负荷。理论上，需要降低3-log病毒负荷才能有效地抑制99.9％易感细胞中的HIV-1复制，这是高效抗逆转录病毒治疗通常产生的效果。然而，由于有效地转导高百分比人造血干细胞的能力有限，所以目前仍无法保护大部分易感细胞。另一个有效机制基于这样的可能性：被改造成不能支持有效HIV-1复制的细胞可能不会发生病毒诱导的细胞致病，因而与非保护细胞相比具有选择性存活优势。在此情形下，一部分受保护的细胞所包含的全部单核细胞百分比增大，这样可保存某些免疫功能。

本发明还涉及含有一药用载体和一包含本发明序列的病毒的药物组合物，所述序列对应于操作性地相连于编码适当药物的感兴趣基因的IL-18BP启动子区或启动子。这些组合物最好用于针对IFNγ水平上升的组织的药物。

现在对本发明进行详细描述，结合以下实施例将会更容易理解本发明，但所提供的实施例只起举例说明作用，并不以任何方式限制本发明。

实施例

实施例1单核细胞中IL-18BP的基本表达

在白细胞、结肠、小肠、前列腺，特别是脾细胞中检测到IL-18BP mRNA(Novick等人，1999)。脾细胞由巨噬细胞、淋巴细胞和浆细胞以及循环产生的其他细胞组成。

利用特异性ELISA试验测定细胞中IL-18BP蛋白质的表达(实施例12)。结果发现，人外周血单核细胞(PBMC)组成地产生IL-18BP(0.7-1.5ng/ml)。从组织细胞性淋巴肉瘤病人胸腔积液获得的恶性细胞所产生的细胞系U-937细胞不表达任何IL-18BP。该U-937细胞用佛波醇酯处理可被诱导发生末端单核细胞分化。只在TPA(10ng/ml)刺激细胞分化为巨噬细胞样细胞后才检测到基本IL-18BP表达(0.07±0.01ng/ml)。这些结果表明单核细胞和巨噬细胞中IL-18BP组成型产生。

实施例2各种不同细胞中IL-18BP表达的诱导

据报导，IFNγ诱导各种细胞系如角化细胞系、结肠癌细胞系以及初级肾系膜细胞产生IL-18BP mRNA和蛋白质(Muhl等人，2000)。本实施例研究IFNγ和其他细胞因子在各种人细胞系和外周血单核细胞(PBMC)中诱导IL-18BP。IFNγ以剂量依赖方式诱导IL-18BP表达(监测mRNA见实施例11，ELISA试验见实施例12)，WISH和HepG2细胞的EC50为50U/ml(图2A和2B)。IL-18BP明显积聚于WISH细胞的培养上清液中，因为IL-18BP在48小时的浓度高于24小时的浓度(图2A)。

人外周血单核细胞(PBMC)组成地产生IL-18BP(0.7-1.5ng/ml)，用IFNγ(100U/ml)处理后IL-18BP水平在24和48小时分别增加1.7±0.1和2.1±0.3倍(p<0.05，n＝4)。用TPA预处理PBMC后观察不到对IL-18BP产生的影响。

在U937细胞系中测试IFNγ对IL-18BP的诱导。IFNγ不诱导未分化U937细胞产生IL-18BP，但用佛波醇酯(TPA，10ng/ml)使其分化至巨噬细胞样细胞后，测得IL-18BP的基本水平是0.07±0.01ng/ml，以IFNγ(100U/ml，24小时)诱导后该水平增加4.6±0.05倍，96小时该水平获得进一步增加(未示出)。

在HepG2细胞中测试其他细胞因子如IFNα2、IFNβ、IL-1、IL-6、IL-12、IL-18和TNFα对IL-18BP表达的影响(图2B)。在IFNγ存在或不存在下使细胞与不同细胞因子培育，得到的结果表明(图1，PNAS网页)，IFNα2、IFNβ、IL-1、IL-6、IL-12、IL-18和TNFα不能单独诱导产生IL-18BP。但在HepG2细胞中IL-6和TNFα与IFNγ协同作用，增大IL-18BP的产生，有统计学意义。

这些结果显示IFNγ能够在单核细胞和许多不同细胞中诱导产生IL-18BP。加入IL-6和TNFα能够进一步加强IFNγ对IL-18BP的诱导。

实施例3IFNγ以转录方式调节IL-18BP基因，需要蛋白质从头合成

为了检查IFNγ对IL-18BP mRNA的诱导是否处于转录水平，在翻译抑制剂放线菌素D存在下测定干扰素对HepG2和WISH细胞的作用(图3A)。HepG2细胞用IFNγ处理3小时后经半定量RT-PCT检测到IL-18BP mRNA上升，而HAKAT和WISH细胞用IFNγ处理5小时后经半定量RT-PCT才检测到IL-18BP mRNA上升。以IFNγ刺激之前先用放线菌素D预处理HepG2和WISH细胞，发现不同时间点都没有IL-18BP mRNA的表达，这表明IFNγ刺激mRNA从头合成。

IFNγ处理后24小时或较后时间，IL-18BP的积聚是很明显的，这证明IL-18BP的表达取决于前述IFNγ对蛋白质如转录因子的诱导。因此，为了验证这一假设，还采用另一种蛋白质抑制剂环己酰亚胺来测试IFNγ对IL-18BPmRNA的诱导是否需要蛋白质从头合成。结果示于图3B中，显示用环己酰亚胺预处理细胞消除了IL-18BP mRNA的诱导。此结果表明蛋白质从头合成是IFNγ激活IL-18BP基因的必要条件。

实施例4确定IL-18BPa及其启动子区的转录起始位点，对IL-18BP启动子作图谱

为了研究IL-18BP启动子区，首先需要特异性地确定转录起始位点的位置。

通过5’RACE(RACE，见实施例14)测定人IL-18BPa mRNA的转录起始位点。由5’RACE仅得到一个PCR产物，它对应于IL-18BPa，是最丰富的剪切变体。对该产物作DNA序列分析，揭示转录起始位点和一个附加50bp外显子位于人IL-18BPa mRNA5’端的转录起始位点之后，对应于基因组IL-18BP DNA的位置785-835(可在Entrez pubmed核苷酸数据库中找到，accessionNo.AF110798)。由此，将该基因组DNA与加入了新5’外显子的mRNA对比，产生了一个新外显子-内含子图谱(见图4)。

有了IL-18BPa转录起始位点(碱基1)，可进一步分析对应于IL-18BP启动子区的碱基1上游的人基因组DNA(染色体11q克隆：RP11-757C15，Accession No AP000719.4，碱基152,178上游核苷酸)。通过BLAST程序将此DNA与NCBI的表达序列标志(EST)数据库作对比，发现一个在+链上编码锌指结构蛋白质的上游基因(Accession No.AK001961)。该锌指结构蛋白质的沉积(deposited)mRNA序列被“Instant RACE”程序(www.LabOnWeb.com，搜索到大范围的人ESTs)进一步拉长。该程序将锌指结构蛋白质的3’端mRNA置于基因组克隆RP11-757C15的核苷酸150,517上，由此限制了潜在的IL-18BPa上游调节序列为碱基1上游的1661个碱基。

实施例5探索能够启动异源基因组成型表达的IL-18BP基因上游最小启动子

为了找到能够指导异源基因如萤光素酶报导基因的表达的IL-18BP基因上游最小DNA片段，产生一个含有对应于碱基1上游DNA序列的最大1601bp并包括转录起始位点下游50bp(SEQ ID NO：5)的载体以及带有与萤光素酶基因融合的该DNA(图5)截短形式的载体(实施例15)。用包含1601bp上游DNA的载体(pGL3(1601)转染人HepG2细胞(人肝癌细胞系)，它的萤光素酶活性比空pGL3载体所得到的活性高10.3±0.9倍。当把同一个DNA以相反方向插入(pGL3(-1601)，观察不到这样的活性。此结果证实，碱基1上游1601bpDNA具有基本启动子活性。检查该1601bp DNA片段的序列，发现它不包括一个TATA盒元件，但接近转录起始位点的碱基-3至-9、-39至-48以及-122至-132有多个富GC结构域。通过程序TFSEARCH分析1601bp DNA序列，鉴定到一个在碱基-24至-32上由γ激活的序列(GAS)(图1)。进一步分析揭示，IRF1，2效应元件(IRF-E)跨越碱基-57至-69，而两个C/EBPβ效应元件(C/EBP-E)位于碱基-309至-322和-621至-634。

测试了一系列在1601bp片段5’端渐进截短的萤光素酶报导基因载体。结果列于图5A中，显示包括pGL3(122)在内的仅包含IRF和GAS元件的全部构建体在支持基本启动子活性方面至少与pGL3(1601)一样有效。

这些结果显示，含有IRF和GAS元件的122bp片段(SEQ ID NO：3)启动异源基因的基本活性是足够的(图5A)。

实施例6探索能够启动异源基因诱导型表达的IL-18BP基因上游最小启动子

为了鉴定能够启动IFNγ诱导的萤光素酶表达的IL-18BP基因上游最小DNA片段，在IFNγ存在下在转染HepG2细胞中测试了前一个实施例的截短DNA载体(图5B，转染见实施例16)。

结果列于图5B中，显示24小时后IFNγ使仅含有IRF-E和GAS元件的载体(pGL3(122)载体)的萤光素酶活性相对于基本表达水平增加了33倍。这一结果证实，IRF-E-GAS对单独就可以介导IFNγ对异源基因的诱导。C/EBP-E1和2元件(pGL3(656))使IFNγ诱导的萤光素酶活性显著增加，相对于基本活性增加88倍，证实了这些元件对IFNγ诱导性起重要作用。与之相反，在这样一种插入片段中插入一个附加上游DNA(pGL3(1106))，消除了萤光素酶活性在其基本水平以上的诱导。此结果提示一个沉默子元件位于碱基-656至-1106内(第二个C/EBP-E1元件上游)。已经证实，三个AP1效应元件存在于沉默子区，c-Jun与其结合并通过这三个AP1效应元件参与IL-18BP基因的沉默。

沉默子上游88个碱基(pGL3(1272))使启动子进一步延伸，恢复对IFNγ的应答，提示增强子元件位于碱基-1106至-1272，IFNγ使其激活可抑制毗邻沉默子的作用。该序列进一步延伸不会影响基本活性或IFNγ诱导的活性，提示全部上游调节序列都位于碱基-1至-1272之内(SEQ ID NO：1)。

所有被测试的构建体中pGL3(656)的诱导性最高，表示该DNA片段含有最佳诱导型IL-18BP启动子。

这些结果显示，最小诱导型启动子位于转录起始位点上游含有IRF-E和GAS元件的122bp(SEQ ID NO：3)，其中最大最佳诱导型启动子位于转录起始位点上游含有IRF-E和GAS元件以及两个C/EBPβ元件的656bp(SEQ IDNO：2)。

实施例7IRF-1参与体内IL-18BP表达

为了探索IRF-1(其结合位点可在IL-18BP启动子中找到)在IL-18BP表达中的参与程度，本实施例研究了IL-18BP在IRF-1缺陷小鼠中的表达。

测定IRF-1缺陷小鼠(Jackson laboratories，Bar Harbor ME)在给予小鼠IFNγ前后的IL-18BP水平，并与对照C57B1/6小鼠作比较(图6)。对照C57B1/6小鼠的基本血清IL-18BP是9.1±1.9ng/ml，给予IFNγ后显著上升至22.4±2.2ng/ml。相比之下，IRF-l缺陷小鼠的血清IL-18BP低于检测极限，给予IFNγ也只升到0.7±1.15ng/ml。这一结果确认了IRF-1作为IL-18BP基本活性和IFNγ诱导活性的介导剂的重要性。

实施例8在可诱导条件下结合于IL-18BP启动子的转录因子的检测

采用电泳迁移率变动分析(EMSA，实施例18)鉴定了IL-18BP启动子内不同效应元件之间的蛋白质-DNA相互作用。将对应于碱基-33至-75(含有IRF-E)和碱基-8至-55(含有GAS)的标记dsDNA探针与对照细胞和IFNγ处理细胞的核提取物结合。在细胞与IFNγ培育1小时后出现一个由含IRF-E的探针与核蛋白质组成的复合物，3小时应答达到最大(图7A，泳道1-5)。正如所料，加入IRF-E抗体引起“超移动”，而对照抗信号转导和转录启动因子1(STAT1)的抗体没有产生任何作用(数据未示出)。含GAS的探针与IRF-E相反，它组成地与一个蛋白质缔合(图7A，泳道6)，用IFNγ诱导细胞3至6小时后，该复合物被扩大(泳道7、8)。预料GAS与IFNγ诱导的STAT1二聚体结合。不过，该复合物不受STAT1抗体影响(泳道10)，提示IFNγ诱导的STAT1二聚物不与该GAS缔合。在IFNγ处理15至30分钟的细胞核提取物中也获得同一负面结果(数据未示出)。令人惊讶的是，C/EBPβ抗体消除了此复合物(泳道9)，它与IRF-1抗体一起超移动(泳道10)。所以，不论是否缺乏共有C/EBPβE，含GAS的DNA探针似乎都能与C/EBPβ结合。

EMSA得到的结果表示，用IFNγ诱导后IRF-1与IL-18BP启动子内的IRF-E元件结合。此外，还形成一个含有IRF-1和C/EBPβ的复合物，该复合物与GAS元件结合。

实施例9探索IRF-1-C/EBPβ复合物在IL-18BP诱导中的作用

为了进一步研究IRF-1和C/EBPβ在IL-18BP基因诱导中的作用，以半定量RT-PCR继而运用表达载体转染过度表达IRF-1和C/EBPβ来测定IL-18BPa

mRNA(实施例14，图7B)。在HepG2细胞中过度表达任一转录因子或两个因子之组合，不会诱导IL-18BP mRNA。这一结果提示，激活IL-18BP基因需要附加IFNγ诱导因子。用其中一个表达载体转染细胞再以IFNγ诱导，与单独IFNγ诱导相比，IL-18BP mRNA实际上是减少了。相比之下，共表达两个转录因子增加了IFNγ对IL-18BP mRNA的诱导。此结果提示，IRF-1和C/EBPβ必须以一定比率存在，可能的话，在转录起始复合物内形成一个复合物。为了进一步研究IRF-与C/EBPβ之间可能的相互作用，保持IRF-1表达载体数量不变，滴定分析与pGL3(1272)共转染的细胞随不同量的C/EBPβ表达载体的萤光素酶活性。类似地，保持C/EBPβ载体的数量不变，但改变IRF-1载体的数量，测定萤光素酶活性。两种情况都获得呈钟形的剂量反应曲线，提示实现最佳IL-18BP诱导需要这两个转录因子以固定摩尔比存在(图7C)。

进行免疫沉淀研究以确认IRF-1和C/EBPβ之间的物理缔合(实施例19，图7D)。用C/EBPβ抗体使IFNγ处理细胞的胞核和胞质蛋白质先后进行免疫沉淀(ip)和免疫印迹(ib)，结果揭示HepG2细胞中C/EBPβ组成型表达，并易位至胞核中应答IFNγ(上面)。与不受IFNγ诱导的C/EBPβ相反，用IRF-1抗体对细胞提取物作免疫沉淀(ip)和免疫印迹(ib)处理，结果揭示IFNγ诱导IRF-1表达。但与C/EBPβ相似，IRF-1在IFNγ诱导后易位到胞核(中间)。先用C/EBPβ抗体免疫沉淀再用IRF-1抗体免疫印迹，结果揭示核馏分存在一个稳定的IRF-1-C/EBPβ复合物(下面)。这些结果证实了IFNγ诱导后形成IRF-1-C/EBPβ复合物，是首次证明了该两个转录因子形成这类复合物。所以，在IFNγ诱导后，含有GAS的近端序列及其相邻IRF-E与C/EBPβ和IRF-1之复合物结合。实施例10探索C/EBP-E在IL-18BP启动子活性中的作用

在位置-309至-322和-621至-634上的两个C/EBPβ位点不带有相邻IRF-E。事实上，将对应于位置-309至-322上C/EBPβ位点的探针进行EMSA(实施例18)，发现了一条滞留带(实心箭头)，它与C/EBPβ抗体超移动(空心箭头)，但不与IRF-1抗体超移动(图8A)。所以，得出如下结论：该位点结合于C/EBPβ而非结合于C/EBPβ与IRF-1的复合物。此外，组成地表达C/EBPβ但缺少IRF-1的未诱导HepG2细胞核提取物产生了此类滞留带。事实上，IFNγ不能增加这些细胞中C/EBPβ的表达(图8D)，因此它不能增大此滞留带的强度(图8A)。较远的C/EBPβ位点也获得类似结果(数据未示出)。

这些结果显示，C/EBP转录因子与IRF-1不同，它组成型地表达并且不受IFNγ诱导；除了与IRF-1和GAS结合外，它还与IL-18BP启动子内两个C/EBP元件结合。

实施例11研究增强子在IL-18BP表达中的作用

通过EMSA(实施例18)以对应于核苷酸-1081至-1272的192bp DNA探针研究远端增强子的调节作用。对照HepG2细胞的核提取物与此探针形成一个复合物(图8B，实心箭头)。在IFNγ处理细胞后，该复合物密度更高，稍微有些滞留。使该复合物与针对IRF-1、C/EBPβ和cFos的抗体超移动。其中只有抗IRF-1抗体引起了超移动(图8B，空心箭头)。对应于核苷酸-1083至-1174的未标记dsDNA不与放射性标记探针竞争，这表示核蛋白质已经与残基-1175至-1272结合。因为只在近端区鉴定到IRF-E，所以此结果提示远端增强子可能与近端IRF-E缔合。

这些结果表示远端增强子通过IRF-1与基本型启动子相互作用。

实施例12IL-18BP的ELISA试验

参照Novick等人的描述(Novick等人，2001)，用双抗体ELISA试验测定人IL-18BP。利用兔抗原亲和纯化的针对小鼠IL-18BP的多克隆抗体和生物素化抗体(来自Cytolab，Israel)以双抗体ELISA试验测定小鼠IL-18BP。

实施例11RNA分离和逆转录(RT)-PCR

经无血清培养基处理后，在所示时间点收获HepG2和WISH细胞(10⁶)，用TRI试剂提取总RNA。根据制造商指示用随机六聚物和SuperscriptII(Invitrogen^TM，Leek，荷兰)制备cDNA。以下列引物进行PCR：人IL-18BP，5’CACGTCGTCACTCTCCTGG和5’CGACGTGACGCTGGACAAC；人IRF-15’GACCCTGGCTAGAGATGCAG和5’GAGCTGCTGAGTCCATCAG；人β肌动蛋白5’GTGGGGCGCCCCAGGCACCA和5’CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC。通过初始变性(92℃，2分钟)、28次变性(92℃，45秒)、退火(62℃，1分钟)、延伸(72℃，1.5分钟)以及最后延伸(72℃，10分钟)进行扩增。得到的PCR产物经琼脂糖(1％)凝胶电泳溶解。

实施例145’cDNA端(5’RACE)的快速扩增

根据制造商指示用5’RACE系统(GIBCO BRL)进行5’RACE。简言之，使IFNγ处理的WISH细胞的总RNA逆转录(实施例13)，所用的引物与IL-18BPa mRNA核苷酸89-70(GenBank Accession No.AF110799)互补，再在新合成端加上锚定DNA尾。然后，用该锚定DNA的互补正向引物和IL-18BPamRNA的核苷酸31-11的互补嵌套反向引物进行PCR。将得到的PCR产物亚克隆并作DNA序列分析。

实施例15质粒和克隆

采用含KpnI位点的有义引物(S4753.pg1)(5’CTATATGGTACCCACCCTTCCTTTTACTTTTTCC)和含Nhe I位点的反向引物(RlexA)(5’TATCGCTAGCCAGTCACACAGGGAGGCAGT)对基因组DNA进行PCR扩增，得到1601bp的整个推定IL-18BPa启动子区。将PCR产物克隆至pGEM-T Easy载体(Promega，Madison，WI)，作DNA序列分析加以验证。从pGEM-T Easy克隆分离出Kpn I-Nhe I片段，利用快速DNA连接试剂盒(Roche)使该片段与pGL3基本型载体(Promega)连接，得到pGL3(1601)。类似地，用同一个反向引物和以下有义引物分别制成一系列5’截短的报导基因(pGL3(1454)、pGL3(1274)、pGL3(1106)、pGL3(656)、pGL3(280)和pGL3(122))：

S334.pg15’：CTATATGGTACCCATGAACTAGACACCTAGAG；

S415.pg15’：CTATATGGTACCCTACAAGAAGTTTGAGATCA；

S501.pg15’：CTATATGGTACCCAGCCGTTGCACCCTCCCAATCAC；

1exD pg15’CTATATGGTACCGTCTTGGAGCTCCTAGAGG；

S504.pg15’CTATATGGTACCCACCAAAGTCCTGACACTTG，以及

S139.pg15’TTGGTACCCACTGAACTTTGGCTAAAGC。

作为对照，以相反方向将所有PCR产物克隆至pGL3基本型载体中。实施例16瞬时转染分析

根据制造商的指示，用FuGENE6和所示萤光素酶报导基因载体(0.5μg/孔)及pSV40βGAL(0.2μg/孔，Promega)转染6孔板内的HepG2或WISH细胞(0.5×10⁶/孔)。在一些情况下，与下列表达载体进行共转染：pcDNA3-IRF-1(0.07-1.5μg/孔，以色列Technion的Dr.B.Levy提供)；pcDNA3-C/EBPβ(0.5-2.5μg/孔，Weizmann Institute of Science的Dr.D.Zipori提供)。16小时后，在无血清培养中用IFNγ(100U/ml)、IL-6(150U/ml)、TNFα(10ng/ml)或其所示组合处理细胞24小时。然后收集细胞，溶解细胞，测定萤光素酶活性。所有结果均标准化为β-半乳糖苷酶活性。

实施例17核提取物和胞质提取物的制备

用冰冻磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗细胞三次，再立即冻存于液氮中。细胞沉淀物重悬于4倍收集细胞体积的胞质缓冲液(10mM pH7.9Hepes、10mMNaCl、0.1mM EDTA、5％(体积)甘油、1.5mM MgCl₂、1mM二硫苏糖醇(DTT)、0.5mM PMSF、50mM NaF、0.1mM Na₃VO₄、2mM EGTA、10mMEDTA、10mM Na₂MoO₄、亮抑酶肽、抑胃酶肽、抑酶肽各2μg/ml)中。溶胞产物离心(3000xg，10分钟)，收集含胞质蛋白质的上清液。沉淀物重悬于2.5倍收集细胞体积的核缓冲液(除NaCl的浓度增大至0.42M外，其他成分与胞质缓冲液相同)中。离心(15,000xg，20分钟，4℃)去除核残留物，上清液的等分试样冻存于液氮中，温度保存在-80℃。以牛血清白蛋白为标准，通过BCA蛋白质分析试剂盒(Pierce，Rockford USA)测定蛋白质的浓度。

实施例18电泳迁移率变动分析

以聚核苷酸激酶(New England Biolabs)使对应于选定效应元件的Ds寡核苷酸(10pmol)带上[³²p]3ATP标记。将核提取物(5μg蛋白质)与poly(dI-dC)(Amersham Pharmacia biotechnology)在20μl EMSA缓冲液(20mM pH7.5Hepes、5mM MgCl₂、2mM EDTA、5mM DTT和5％(体积)甘油)中预培育(15分钟，0℃)。再加入标记探针(3x10⁴cpm)，室温继续培育多30分钟。要进行超移动分析，加入探针之前将样品与所示抗体(4μg，1小时，0℃)一起培育。加入过量200倍的野生型或突变竞争物与相关探针。使反应混合物在5％非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。真空干燥凝胶，-80℃进行自动射线照相术，过夜。

实施例19免疫沉淀(ip)和免疫印迹(ib)分析

4℃下将核提取物或胞质提取物(80μg)与6μg所示多克隆抗体一起过夜培育，用蛋白质G琼脂糖珠粒(Pharmacia)室温免疫沉淀1小时。把珠粒在含10％DTT的SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸，还原条件下经SDS-PAGE(10％丙烯酰胺)溶解上清液。凝胶在硝基纤维素膜上印迹，用所示抗体检测蛋白质。通过Super Signal^TM(Pierce)检测试剂盒鉴定免疫复合物。

实施例20用IL-18BP启动子制备CHO r-hsLDLR

使缺乏二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的CHO-DUKX细胞(Urlaub G.等人，1980)与两个表达载体(一个含有LDLR的N-末端配体结合结构域，始于氨基酸残基Asp(+4)止于Glu291(+291)，另一个是pDHFR，含有DHFR的小鼠基因(DHFR受早期SV40启动子控制)、受IL-18BP启动子(SEQ ID NO：2)控制的sLDLR基因以及SV40早期区的转录终止元件)共转染，产生表达人可溶性LDLR的稳定重组CHO细胞。根据制造商所述的方案，以LipofectAmine(Gibco BRL)为转染试剂通过阳性脂质体进行转染。转染后72小时，将细胞转移到一个缺少脱氧基和核苷并加入了10％透析FCS的选择性培养基中。表达DHFR活性的细胞能够形成集落，用浸泡胰岛素的纸盘印出细胞，从而分离集落。该细胞生长，筛选r-hsLDLR活性。然后通过MTX使转染细胞进行基因扩增，再亚克隆，并选择稳定的生成克隆。

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序列表

<110>耶达研究发展有限公司

M鲁宾斯坦

D诺维克

Hurgin，Vladimi r

<120>IL-18BP启动子，其制备及用途

<130>596PCT

<150>152232

<151>2002-10-10

<160>5

<170>PatentIn版本3.1

<210>1

<211>1272

<212>DNA

<213>智人

<400>1

catgaactag acacctagag aagaaggatg tgact tgtag tatcctatgt ctaaattagg 60

aatatgaatc tggtttttct acaagaagtt tgagatcaca gctgactgtg ttcctgatgc 120

atccaccaaa cccagttcca tctgtgggcc tccctggctc tgtcaccagc cgttgcaccc 180

tcccaatcac aggagtcaca aacctcagac atgcagctcc tgtccacact taatatatgc 240

atgcattgga tcacccagcc ctggtctttc tgcctccatg gataactgca tgaccctgag 300

agaaaacctc cttagattta gcatcctagg ttcctcacac gcctcaccct gaatcctggc 360

cctcccgcag ccccagcgcc atttgtccca tcagtgacaa gattcatatt ctgatgtaga 420

ctctgttgcc agagccagtg ttgagccagt ccgcctcttc cccgggaagt gcctgccctt 480

ccctcctgtt agggttggct ctcgagcttg tgtgccagtt cctgggttgg ccgtgagagt 540

tctacagaca aggaggaagt gctctcggtg tatttcctgt ggtgggttca cacgcagcta 600

gacacagcta acttgagtct tggagctcct agagggaagc ttctggaaag gaaggctctt 660

caggacctct taggagccag gtaggagtct gggactacta gtgaacctag acctgtggct 720

ctggccagag gggctaggat gagagacaga gggtgtgatg gtgggtgctg ggagatgtag 780

ccgaccttgg ggctggtggc tgggggagtg ggtagcctgg gaaaggccag gatgtggacg 840

gactggtatg gcattgagcc tgaagtggtc caacttgggg ttccccagtg cctaggaaag 900

ttgtcccctt gaatgtcagt gtgaaggtga aggaggaagc agatgcctgt tcatatggaa 960

acaaagacct ggctgtgaag aggggaggcg gacaccaaag tcctgacact tgggcgggac 1020

agaattgatc tgtgagagac tcatctagtt cataccctag gtgaccctgg gggtggcatg 1080

ggggtagatt agagatccca gtctggtatc ctctggagag taggagtccc aggagctgaa 1140

ggtttctggc cactgaactt tggctaaagc agaggtgtca cagctgctca agattccctg 1200

gttaaaaagt gaaagtgaaa tagagggtcg gggcagtgct ttcccagaag gattgctcgg 1260

catcctgccc tt 1272

<210>2

<211>634

<212>DNA

<213>智人

<400>2

gcttctggaa aggaaggctc ttcaggacct cttaggagcc aggtaggagt ctgggactac 60

tagtgaacct agacctgtgg ctctggccag aggggctagg atgagagaca gagggtgtga 120

tggtgggtgc tgggagatgt agccgacctt ggggctggtg gctgggggag tgggtagcct 180

gggaaaggcc aggatgtgga cggactggta tggcattgag cctgaagtgg tccaacttgg 240

ggttccccag tgcctaggaa agttgtcccc ttgaatgtca gtgtgaaggt gaaggaggaa 300

gcagatgcct gttcatatgg aaacaaagac ctggctgtga agaggggagg cggacaccaa 360

agtcctgaca cttgggcggg acagaattga tctgtgagag actcatctag ttcataccct 420

aggtgaccct gggggtggca tgggggtaga ttagagatcc cagtctggta tcctctggag 480

agtaggagtc ccaggagctg aaggtttctg gccactgaac tttggctaaa gcagaggtgt 540

cacagctgct caagattccc tggttaaaaa gtgaaagtga aatagagggt cggggcagtg 600

ctttcccaga aggattgctc ggcatcctgc cctt 634

<210>3

<211>122

<212>DNA

<213>智人

<400>3

cactgaactt tggctaaagc agaggtgtca cagctgctca agattccctg gttaaaaagt 60

gaaagtgaaa tagagggtcg gggcagtgct ttcccagaag gattgctcgg catcctgccc 120

tt

122

<210>4

<211>1061

<212>DNA

<213>智人

<400>4

tgcagctcct gtccacactt aatatatgca tgcattggat cacccagccc tggtctttct 60

gcctccatgg ataactgcat gaccctgaga gaaaacctcc ttagatttag catcctaggt 120

tcctcacacg cctcaccctg aatcctggcc ctcccgcagc cccagcgcca tttgtcccat 180

cagtgacaag attcatattc tgatgtagac tctgttgcca gagccagtgt tgagccagtc 240

cgcctcttcc ccgggaagtg cctgcccttc cctcctgtta gggttggctc tcgagcttgt 300

gtgccagttc ctgggttggc cgtgagagtt ctacagacaa ggaggaagtg ctctcggtgt 360

atttcctgtg gtgggttcac acgcagctag acacagctaa cttgagtctt ggagctccta 420

gagggaagct tctggaaagg aaggctcttc aggacctctt aggagccagg taggagtctg 480

ggactactag tgaacctaga cctgtggctc tggccagagg ggctaggatg agagacagag 540

ggtgtgatgg tgggtgctgg gagatgtagc cgaccttggg gctggtggct gggggagtgg 600

gtagcctggg aaaggccagg atgtggacgg actggtatgg cattgagcct gaagtggtcc 660

aacttggggt tccccagtgc ctaggaaagt tgtccccttg aatgtcagtg tgaaggtgaa 720

ggaggaagca gatgcctgtt catatggaaa caaagacctg gctgtgaaga ggggaggcgg 780

acaccaaagt cctgacactt gggcgggaca gaattgatct gtgagagact catctagttc 840

ataccctagg tgaccctggg ggtggcatgg gggtagatta gagatcccag tctggtatcc 900

tctggagagt aggagtccca ggagctgaag gtttctggcc actgaacttt ggctaaagca 960

gaggtgtcac agctgctcaa gattccctgg ttaaaaagtg aaagtgaaat agagggtcgg 1020

ggcagtgctt tcccagaagg attgctcggc atcctgccct t 1061

<210>5

<211>51

<212>DNA

<213>智人

<400>5

cccagaagca gctctggtgc tgaagagagc actgcctccctg tgtgactgg 51

Claims

1.一种编码人IL-18BP启动子的DNA序列(SEQ ID NO：1)或其片段，所述片段包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3。

2.根据权利要求1所述的DNA序列，其特征在于，所述片段包含SEQ ID NO：2。

3.根据权利要求1所述的DNA序列，其特征在于，所述片段包含SEQ ID NO：3。

4.一种载体，它包含上述权利要求中任何一项所述的DNA序列。

5.一种宿主细胞，它包含权利要求4所述的载体。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，它是哺乳动物细胞。

7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自CHO、WISH、HepG2、Cos、CV-1、HeLA和Hakat U937细胞。

8.一种生产重组蛋白质的方法，其特征在于，所述方法包括培养权利要求5至7中任何一项所述的宿主细胞和分离所产生的重组蛋白质。

9.一种重组病毒载体，它包括一部分病毒基因组、一编码感兴趣基因的DNA片段和一包括编码权利要求1至3中任何一项所述人IL-18BP启动子的DNA序列的DNA片段，所述人IL-18BP启动子操作性地相连于感兴趣基因。

10.根据权利要求9所述的重组病毒载体，其特征在于，所述感兴趣基因选自干扰素-β、TNF、促红细胞生成素、组织纤溶蛋白启动剂、粒细胞集落刺激因子、锰超氧化物歧化酶、免疫球蛋白及其片段、生长激素、FSH、hCG、IL-18、hsLDLR和TNF受体结合蛋白。

11.根据权利要求9所述的重组病毒载体，其特征在于，所述一部分病毒基因组属于腺伴随病毒。

12.根据权利要求9所述的重组病毒载体，其特征在于，所述一部分病毒基因组属于逆转录病毒。

13.根据权利要求12所述的重组病毒载体，其特征在于，所述逆转录病毒选自HIV、HFV、MLV、FIV和VSV。

14.一种调节感兴趣基因的细胞特异性表达的体外方法，其特征在于，所述方法包括用权利要求9至13中任何一项所述的载体转导目标哺乳动物细胞。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述目标细胞是造血干细胞。

16.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述目标细胞是单核细胞。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述目标细胞是巨噬细胞。

18.根据权利要求14至17中任何一项所述的方法，其特征在于，所述感兴趣基因编码赋予抗HIV感染性能的蛋白质。