CN100462434C - 新型碱性蛋白酶-变体和含有该种新型碱性蛋白酶-变体的洗涤剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新型碱性蛋白酶-变体。该蛋白酶-变体在迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)碱性蛋白酶的计数上在氨基酸-位61，位199和/或211具有变异和其他至少一个有助于分子稳定的修改，特别是在位-3和/或4上的基因突变。特别优选的是迟缓芽孢杆菌(B.lentus)-碱性蛋白酶的变体S3TN41/G61A/V1991和S3T/V41/G61A/V1991/L211D。本发明还涉及该酶在各种不同技术工艺中，特别是在洗涤剂中使用该新型碱性蛋白酶-变体的可能性。

Description

新型碱性蛋白酶-变体和含有该种新型碱性蛋白酶-变体的洗涤剂

技术领域

本发明涉及新型碱性蛋白酶-变体。该蛋白酶-变体在迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)碱性蛋白酶的计数上在氨基酸-位61，位199和/或211具有变异和其他至少一个有助于分子稳定的修改，特别是在位-3和/或4上的点突变。特别优选的迟缓芽孢杆菌(B.lentus)-碱性蛋白酶的变体S3TN41/G61A/V1991和S3T/V41/G61A/V1991/L211D。本发明还涉及该酶在各种不同技术工艺中，特别是在洗涤剂中使用该新型碱性蛋白酶-变体的可能性。

背景技术

枯草杆菌蛋白酶-型的酶(Subtilasen，subtilopeptidase，EC3.4.21.62)基于其高效催化氨基酸的作用被列为系列-蛋白酶。其来源和分泌于天然的微生物，特别是芽孢杆菌属(Bacillus)-种中。起着非特定肽链内切酶的作用，也就是说其可使得在肽或蛋白质内所存在的任意酰胺键发生水解。其pH-最佳值大多处于明显的碱性区域。一有关该族的概况例如可见R.Siezen在“Subtilisin enzymes”75-95页的文章“Subtilases：Subtilisin-like Proteases”，由R.Bott和C.Betzel出版，New York，1996。枯草杆菌蛋白酶适合于许多技术的应用，可作为化妆品和特别是作为洗涤剂的活性有效成分。

除其他酶例如淀粉酶，脂肪酶或纤维素酶外，蛋白酶可在洗涤剂中被用作活性成分。它能使在洗涤物，例如纺织物或餐具，上的含蛋白污物发生分解。水解产物由于其较高的溶解性可与洗涤漂浮物一道被冲洗出来或被洗涤剂中的成分侵袭，溶解，乳化或悬浮。由此在酶和其他洗涤剂的成分间产生协同作用。对于洗涤剂蛋白酶而言，基于其有益的酶特性如稳定性或PH-最佳值枯草杆菌蛋白酶占有重要的地位。下面对其中最重要方面和对其技术开发最重要的对策加以叙述。

对于洗涤剂蛋白酶开发而言，基本的对策是，首先将微生物天然产生的酶分离出来和根据其基本的特性对其应用的可能性进行试验。然后可对其分子进行改良。例如按照专利申请WO 93/07276 A1，Gaithersburg，MD，USA，Chemgen Corp.公司和Austin，TX，USA，VistaChemical Company的来自于(芽孢)杆菌属(Bacillus spec.)164-A1含有蛋白酶的164-A1适合于在洗涤剂中使用。其它例如Novozymes公司的来自于Bacillus sp.的碱性蛋白酶PD138，NCIMB 40338(WO93/18140 A1)，Tokyo，Japan，Kao Corp.公司的来自于Bacillus sp.ferm.的BP-3376族的蛋白酶K-16(US-专利5344770)和按照WO 96/25489A1(Procter & Gamble公司，Cincinatti，OH，USA)来源于嗜冷性微生物黄细菌(Flavobacterium balustinum)。

来自于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)或枯草杆菌(B.subtilis)的枯草杆菌蛋白酶BPN’在Vasantha等人在J.Bacteriol.，Vol.159，811-819页(1984)和J.A.Wells等人在Nucleic Acids Research，Vol.11，7911-7925页的文章中是已知的。枯草杆菌蛋白酶BPN’特别是对于位置计数而言起着作为枯草杆菌蛋白酶参照酶的作用。例如在专利申请EP 130756的BPN’计数中给出了所有相关枯草杆菌蛋白酶的点突变(基因点突变)。在这一方面仅仅是位-217，其相当于按照本发明的位-211的酶；对此特别强调非特定的替换；给出了所有的，直至以M，W，C或K替换；优选是以A或S替换的。

在专利申请CA 2049097 A1中，对该分子的多突变，特别是其在洗涤剂中的稳定性进行了研究。这里该变体具有替换Y217K和Y217L以及双突变S63D/Y217K，也就是说这些替换相应于迟缓芽孢杆菌-碱性蛋白酶的位211，以及61和211。当然未导入氨基酸，在该位置上的氨基酸相当于一该专利申请的蛋白酶。

例如在专利申请WO 95/07991 A2和WO 95/30010 A1中介绍了通过在酶的环-区域进行的点突变反应并同时在提高水解率的条件下获得的具有与底物减少键和的变体。WO 95/07991 A2涉及分子的第六个环；这里显示双突变，在其中除一其它的突变外例如在氨基酸的位217(相当于在迟缓芽孢杆菌-碱性蛋白酶的211)突变为D。因为在BPN’中在位205上(相当于199)是I，这里最多是对该两个位置作了描述，当然总是与其它在枯草杆菌蛋白酶环区域的突变和酶特性的特殊变异相结合。具有该种BPN’-变体的洗涤剂例如在专利申请WO 95/29979A1中被公开。在WO 95/30010 A1中，在其他五个环-区域发生了另一突变，其中如在位63(相当于61)，但在该位置上仅突变为D或E。与此相对，在本专利申请中所研究的两个氨基酸位处于位3和4，不是在环-区域中。另外还涉及到大量的在该文中所给出的不稳定替换，特别是枯草杆菌蛋白酶BPN’的不稳定突变。

E.L.Smith等人(1968)在J.Biol.Chem.，Vol.243，第2184-2191页和Jacobs等人(1985)在Nucl.Acids Res.，卷13，第8913-8926页中介绍了枯草杆菌蛋白酶Carlsberg。其天然产生于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中，以及可从Genencor International Inc.公司，Rochester，New York，USA以商品名Maxatase和从Novozymes A/S，Bagsvaerd，Daenemark以商品名Alcalase

获得。借助点突变所获得的在同时较高水解率的条件下具有与底物减少键和的变体例如是在专利申请WO 96/28566 A2中已知的。这里涉及到变体，在该变体中在分子的环-区域内发生了一或多重替换。唯一在洗涤剂中测试过的相应于本专利申请的在位置上具有替换的变体是多重突变体，在其中除其他外替换G62(相应于迟缓芽孢杆菌-碱性蛋白酶的位61)突变为N，D，Q，E，P或S，但不是A，V204(相当于位199)突变为各种不同的其他氨基酸，但不为I和L216(相当于位211)突变为14种其他的氨基酸，其中也有D。通过上文仅对涉及本专利申请的变体3T-因为在枯草杆菌蛋白酶Carlsberg的位3天然地被T所占据-和211D进行了描述。

蛋白酶PB92得自于亲碱性的细菌Bacillus nov.spec.和可从Gist-Brocades公司，Delft，荷兰以商品名Maxacal

获得。在专利申请EP283075A2中叙述了其原始的序列。借助点突变所获得的适合于在洗涤剂中使用的该酶变体例如在专利申请WO 94/02618 A1和EP 328229A1中作了公开。在第一个专利中仅描述了在位211处采用不同的氨基酸进行替换，但未采用D替换。第二个专利公开了，特定的两个基61和211所处的区域与底物发生了结合。其中对于突变特别有意义的位61未曾提及，对211建议进行Y替换，其仅在与至少一其他的替换结合时才可使相应配方的洗涤效率得到提高。

枯草杆菌蛋白酶147和309被Novozymes公司以商品名Esperase

以及Savinase进行销售。其原始来源于芽孢杆菌属(Bacillus)-族，在专利申请GB 1243784 A中进行了公开。在专利申请WO 94/02618 A1(见上)，WO 89/06279 A1，WO 95/30010 A2和WO 99/27082 A1中公开了通过点突变所开发的该酶其他变体在洗涤剂中的应用。

专利申请WO 89/06279 A1追求的目标是，获得较高氧化稳定性，提高蛋白水解率和改良洗涤效果。因此在特定位置上的替换应改变枯草杆菌蛋白酶147或309(该数值与来自于迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)DSM5 483的碱性蛋白酶一致)分子的物理或化学特性；这里所述的位199描述为无特殊的替换。在专利申请WO 95/30011 A2中介绍了枯草杆菌蛋白酶309的变体，其在分子的环-区域中具有点突变和由此在同时提高水解率的条件下还可减少在底物上的吸附。位61，199和211也处于该范围内。此外对位211而言，建议替换L211D；对位61建议将G替换为N，D，Q，E，P或S；对199而言同样有大量的可能性，但是不是I。在专利申请WO 99/27082 A1中例如由枯草杆菌蛋白酶309开发了改良洗涤效率的变体，通过插入至少一氨基酸加大了其活性环。但其不涉及如在本专利申请中的取代。

枯草杆菌蛋白酶DY最早由Nedkov等人于1985在Biol.ChemHoppe-seyler，Band366，第421-430页中述及。例如按照专利申请WO96/28557 A2，其可通过在活性环中的有目的性的点突变来达到在洗涤剂中使用的最佳效果。由此可产生具有减少吸附和提高水解率的变体，为此在位62(相应于迟缓芽孢杆菌-碱性蛋白酶的61)上的G被N，D，Q，E，P或S替换，在位204(相应于199)不是204I和在位216(相应于211)可为数目众多，其中也有D.因为枯草杆菌蛋白酶DY在位3上天然含有T，由此同样描述了一变体3T/211D。

天然产至热放线普通菌素(Thermoactinomyces vulgaris)的酶热酶(Thermitase)最早由Meloun等人(FEBS Lett.1983，S.195-200)报道。例如在专利申请WO 96/28558 A2中给出了由于在环-区域的取代使得该变体减少了吸收和提高了水解率。那里描述了在位221(相应于B.lentus-碱性蛋白酶的211)被14个氨基酸替换，其中还有D，和在位70(相应于61)由G被替换为N，D，Q，E，P或S。由于在热酶的位209(相应于199)天然存在I，因此本发明申请中主要蛋白酶的变体199I和211D为最多。特别是通过在位3的苏氨酸和/或在位4的异亮氨酸(按照B.lentus-碱性蛋白酶)还可产生不稳定性。热酶在相应的同源位10和11中含有氨基酸S和R(与WO 91/00345 A1的顺序相比)。除此之外热酶还涉及到相对于其他的枯草杆菌蛋白酶而言具有总共更大序列偏差的分子。因此在突变蛋白热酶和得自于B.lentus DSM 5483(见下面)的碱性蛋白酶间仅具有45％的同一性(62％类似的氨基酸)。

对蛋白酶K而言还涉及一蛋白酶，该蛋白酶相对于来自于B.1entus的碱性蛋白酶而言具有较少同源性。其突变蛋白仅具有33％的同一性(46％类似的氨基酸)。蛋白酶K来源于微生物体Tritirachium albumLimber和最早由K.-D.Jany和B.Mayer1985在Biol.Chem.Hoppe-Seyler，Bd.366，S.485-492中进行了描述。WO 88/07581 A1公开了非常相似的蛋白酶TW3和TW7以及在洗涤剂中的应用。在专利申请WO96/28556 A2中对蛋白酶K叙述了大量的替换，如在位220(相应于B.lentus-碱性蛋白酶的211)被替换为14种其他的氨基酸，其中也有D，和在位68(相应于61)由G变为N，D，Q，E，P或S。由于在蛋白酶K的位208(相应于199)上天然存在有I和在位4(相应于3)上存在有T，因此本发明申请中的蛋白酶变体3T，199I和211D为最多。

最后还列举了来自于枯草杆菌(Bacillus subtilis)的杆孢菌肽酶F(Bacillopeptidase F)，该肽酶在位61和199含有可供支配的氨基酸丙氨酸，以及异亮氨酸。其与按照本发明的蛋白酶-变体相比仅具有少量的相似性：确定在氨基酸面上仅具有30％的同一性，以及类似的氨基酸仅有38％。该酶在上述的Siezen等人的文章中被述及，但至今未有在洗涤剂中使用的描述和权利要求。

另外对于技术应用，特别是在洗涤剂中适合的蛋白酶而言在专利申请EP 199404 A2，EP 251446 A1，WO 91/06637 A1和WO 95/10591 A1中进行了描述，其被Procter & Gamble Comp.，Cincinatti，OH，USA称作“蛋白酶A”，“蛋白酶B”，“蛋白酶C”以及“蛋白酶D”。专利申请EP 199404的蛋白酶为不同的BPN’-变体，它是以专利申请EP 130756 A1(见上)为基础，但是不具有按照本发明重要位置的变体。在EP 251446 A1中公开了大量的BPN’-变体，也有217-变体(相应于B.lentus-碱性蛋白酶的位211)；其仅提出了所有可能的替换；而对于随之出现的变体217D的特性未公开。“蛋白酶C”按照专利申请WO 91/06637 A1是由于在位123和/或274的BPN’点突变才显得出色。对“蛋白酶D”而言涉及变体，首先是来自于B.lentus的蛋白酶，其按照WO 95/10591 A1在位76(按照BPN’-计数，相应于B.lentus-碱性蛋白酶的位74)和另外其它的位置拥有突变。其中还可是位217(相应于211)；但在其中未述及D的替换。类似的相应在洗涤剂和化妆品中应用的例子还有US 6066611 A：那里还是述及与在位76的替换结合，理论上还有217D的替换但并非优选。

另外已知可获得的蛋白酶是Novozymes公司的商品名为

和

Genencor公司的商品名为

Purafect 

和

Advanced Biochemicals Ltd.公司Thane，印度，的商品名为和Wuxi Snyder Bioproducts Ltd.公司，中国，的商品名为

的酶。

为改进枯草杆菌蛋白酶洗涤效率的一种对策为，基于已知单一氨基酸的功能在已知分子中插入统计学的或有目的性的点突变和将所获得的变体进行洗涤效果的评价。该对策例如在专利US 5700676和专利申请EP 130756 A1(见上面)中加以了应用。作为唯一的本发明所涉及位置，在那里叙述了一在位217(相应于B.lentus-碱性蛋白酶的位211)相对所有19种氨基酸单独或并行替换，对本专利申请而言无重要的替换。同样的还有专利US 5801038。在专利US 5441882中，叙述了一借助特定单一替换来改变酶本身或其他特性的方法，由此对本专利申请而言在位217(相应于B.lentus-碱性蛋白酶的位211)无重要的替换。在专利US 4760025给出了相应仅具有一个替换的变体；这里又仅仅是位217，和未公开对其具体的替换。

为改善枯草杆菌蛋白酶的洗涤效率，在大量的专利申请中给出了在活性环中插入其他氨基酸的对策，因此除已述及的WO 99/27082A1外例如还有已公开的专利申请WO 00/37599 A1，WO 00/37621 A1至WO 00/37627和WO 00/71683 A1至WO 00/71691 A1。原理上可用于所有属于分群I-S1(真的枯草杆菌蛋白酶)或I-S2(高碱性的枯草杆菌蛋白酶)的枯草杆菌蛋白酶。

另一效率改良的对策为，改变分子的表面电荷和/或等电离点和使得其与底物的相互作用发生改变。这种变体例如在专利US 5665587和专利申请EP 405901 A1和WO 91/00334 A1中作了介绍。在那里述及了大量的位置，特别是3，4和217(相应于B.lentus-碱性蛋白酶的3，4和211)，但没有公开真实的相应的变体。在专利申请WO 91/00345A1同样涉及了该位置，也未给出真实的相应的变体。在WO 92/11348A1中公开了为减少PH-值-依赖的分子电荷变体的点突变。在其中顶多述及了按照本发明标出的S3T和L211D替换；在其中无重要的具体替换。在专利申请WO 00/24924 A2中，由该原理得出了一适合于在洗涤剂中应用的变体确认的方法；此外所有公开的变体均具有至少一在位103的替换，优选的许多变体都不是按照本发明重要的替换。按照WO 96/34935 A2，为在洗涤剂中获得效力改良的目的提高了分子的疏水性，但却可能对酶的稳定性产生影响。

在专利申请WO 99/20727 A2中表明的枯草杆菌蛋白酶变体，如同按照专利申请WO 00/24924 A2的方法所获得的一样：其所有至少获得一在位103上替换的与许多其它可能发生的替换相结合，但不在相应于B.lentus蛋白酶位61的位上。优选的是具有至少6个替换的多次变体，在其中间还有位205和217(相应于B.lentus-碱性蛋白酶的199和211)；具体的在按照本专利申请重要的替换199I中仅享有50多种变体中的两个。同样的突变在有关洗涤剂的专利申请WO99/20723A2和WO 99/20726 A2中被公开，其还含有另外的一淀粉酶，以及漂白剂。

现代的酶开发方向为，将来自于已知的，相互有同源关系的蛋白质元素通过统计学的方法结合成一具有至今为止还未达到其特性的新酶。这类方法在下述直接演化的概念中进行了总结。例如有下列的方法：StEP-法(Zhao等人，(1988)，Nat.Biotechnol.，Band16，S.258-261)，机遇引动复合法(Random priming recombination)(Shao等人，(1988)，Nucleic Acids Res.，Band26，S.681-683)，DNA-重组法(shuffling)(Stemmer，W.P.C.(1994)，Nature，Band370，S.389-391)或RACHITT法(Coco，W.M.等人，(2001)，Nat.Biotechnol.，Band19，S.354-359)。

一其他，特别的补充对策是，提高所涉及蛋白酶的稳定性和由此提高其作用效果。可通过与一聚合物的结合使在化妆品中所使用的蛋白酶获得稳定，例如在专利US 523891中所述；其随之出现皮肤相容性的改善。而对于洗涤剂而言，则通常采用点突变来改善稳定性。按照专利US 6087315和US 6110884蛋白酶可通过将特定的铬氨酸-基与其它基团替换来加以稳定。在WO 89/09819 A1和WO 89/09830 A1中描述了热稳定性的BPN’-变体，其在位217(相应于B.lentus-碱性蛋白酶的211)中具有一K或L的替换，和另外对217K在位63(相应于位61)被替换为S63D。

其它描述通过点突变实现稳定的可能性例如有：

-按照WO 92/19729 A1，以及EP 583339 B1和US-专利5858757和按照EP516200 A1特定的氨基酸基与脯氨酸的替换；

-按照EP 525610 A1，EP 995801 A1和US-专利5453372在分子的表面引入极性的或带电的基团，此外是在相应于B.lentus蛋白酶的V4位置；与此相对改变为V4I，如在本专利申请中导入一弱极性的氨基酸；

-增强与金属的结合，特别是借助钙-结合位的诱变酶，例如按照专利申请书WO 88/08028 A1和WO 88/08033 A1的规则；

-通过修改或诱变酶封堵自溶，例如按照专利US 5543302。

在专利申请EP 398539A1中公开了一种多稳定对策的结合。由此可使得枯草杆菌蛋白酶获得稳定和由此改善洗涤效果，(1.)钙-结合位的氨基酸由强阴性的基团替换，(2.)天然的Asn-Gly次序缺失或突变，(3.)间位-基被其他的替换和(4.)再加之在催化中心附近的特定氨基酸取代。在本专利申请的按照本发明的变体中不涉及前3种可能性。对第4种可能性而言仅涉及位61和211。然而其建议，在该位天然存在的氨基酸(S63，以及枯草杆菌蛋白酶BPN’的Y217)用G，以及L来替换。而与此相对，在本专利申请的分子中正好在该位置上是用不见于G或L的其它氨基酸作替换的。

在专利US 5340735，US 5500364，US 5985639和US 6136553中给出了其它的枯草杆菌蛋白酶，特别是来源于Bacillus.lentus的，借助点突变进行稳定的可能性。突变位置可通过三维结构的分析来确定。在位61和211处的变体在该文中未被述及。

例如在文件EP 755999 A1和WO 98/30669 A1中指出，蛋白酶，特别是在洗涤剂中进行过洗涤效果改良的效率改良后的蛋白酶可与α-淀粉酶和其他洗涤剂酶一同使用。例如在专利申请WO 97/07770 A1中已知，那些作为洗涤剂蛋白酶(见下述)中的某些个别的也可适合在化妆品中使用。蛋白酶的另外的应用可能性例如在专利申请EP380362 A1中所介绍的，其涉及有机化学合成，为此按照该专利申请，借助将B.lentus-碱性蛋白酶计数的点突变使在位61(通过突变成D)和/或211(通过突变成K或L)的单独突变或还有其他突变实现稳定的这类枯草杆菌蛋白酶是合适的。同样在这方面也未述及本发明的重要替换。

对来自于B.lentus-碱性蛋白酶而言，涉及来自Bacillus.species.的高碱性蛋白酶。按照专利申请WO 91/02792 A1，给出一该菌种的标号DSM 5483；其中还公开了该野生型酶的排列次序和生物化学特性。在WO 92/21760 A1和WO 95/23221 A1中公开了通过点突变所获得的酶变体适合用于洗涤剂。

该野生型酶来源于自养绿色植物，其原始的是通过按照亲碱性的芽孢杆菌属-菌种的筛选来获得的，本身对氧化和洗涤剂的作用显示出相对高的稳定性。在专利申请WO 91/02792 A1，以及专利EP 493398 B1和US 5352604中，描述了在宿主地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC 53926中其异种的表达。在该所述的US-专利的权利要求书中，位208，210，212，213和268被标记为特征的B.lentus-碱性蛋白酶；其相应于在成熟的蛋白质的计数中的位97，99，101，102和157，在其中该酶有别于成熟的

Goddette等人(1992)在J.Mol.Biol.，Band 228，S.580-595上的：“The crystal structure of the Bacillus Lentusalkaline protease，Subtilisin BL，at1.4

resolution”文章中描述了此酶的三维结构。

还有在专利申请WO 92/21760 A1，以及专利US 5340735中公开了野生型-酶B.lentus-碱性蛋白酶(来源于B.lentus DSM 5483)在其氨基酸序列上为SEQ ID NO：52和在其核苷酸序列上为SEQ ID NO：106。另外在该专利申请中公开了51种不同的，由其所产生的变体，这些变体在个别或多个位置上与野生型不同和由此变得稳定。其中还有S3T，V4I和199I的替换。按照该专利申请，最优选的是由AmericanType Culture Collection，10801 University Boulevard，Manassas，VA20110-2209，USA(http://www.atcc.org)标记为ATCC68614的具有S3T/V4I/A188P/V193M/V199I的替换变体M131。其对于本专利申请而言仅作为原始酶(starting enzyme)(见例1)和在序列表中按其DNA-，以及氨基酸序列在SEQ ID NO.1和2中给出。所有这些均衍生自于Bacillus.lentus DSM 5483的碱性蛋白酶。由WO-文章派生出的US-专利US 5500364和US 5985639指出，通过在其它位置的点突变可获得稳定性改良的变体。

在专利申请WO 95/23221 A1中给出了通过有目的性的突变获得效率改良的B.lentus-碱性蛋白酶-变体应用在洗涤剂中，该变体被看作所述及分子的进一步开发。其中一些同样具有三个替换S3T，V4I和V199I。除此之外，与来自于B.lentus DSM 5483的野生型-酶相比它们都有两个或三个其他的点突变。有时候其还在位211，以及211D(变体F49，F54和F55)还有其他的突变。合乎逻辑的在该专利申请，以及附属的US-专利US 5691295，US 5801039和US 5855625中对具有211D和211E替换的变体提出了权利要求。在专利US 6107589中明确了附属的对策，即有目的性的在底物-结合袋(Bindungstasche)附近改变电荷比例。

如所有通过长期进行的工作所证明的，对技术上可应用的蛋白酶有高的需求，部份是大量的，部分仅与至今已知的蛋白酶在个别位置上有区别。其揭示了在大量上和细微处的各种效率区别。首先其表现在洗涤剂中的应用。对其开发而言，人们不可能不顾及酶的特性，例如一洗涤剂配方的前后关系，而仅以可估计的酶催化性能来作结算。这里其他的因素如对高温和氧化剂的稳定性，表面活性剂引起的变性，褶皱效应(Faltungseffekte)或所希望的与其他组分的协效性等起着重要的作用，其通常仅可通过试验来确定。

本发明的主要任务是，找出在技术应用中改良效率的枯草杆菌蛋白酶，特别是找出能改进洗涤剂的洗涤效率的枯草杆菌蛋白酶。分任务是不仅单提高该蛋白酶的水解活性，同时还要保持在相应配方中的稳定性。

另一分任务是提供对该种蛋白酶可编码的核酸，和载体，宿主细胞和获得这种蛋白酶可采用的制备方法。另外为该种蛋白酶提供相应的制剂，特别是洗涤剂，相应的洗涤方法以及相应的应用可能性。最后应阐明所发明蛋白酶的技术应用可能性。

令人惊奇地发现，在位61对羟苯基甘氨酸与其他氨基酸的替换，特别是与脂肪族的氨基酸替换和非常特别的是与丙氨酸替换可大大有助于提高洗涤效率。借助酶作用，其他如与在位199的异亮氨酸和/或其他某些氨基酸基如在位211的天冬酰胺酸的替换可能对该贡献有利。这种效果的提高是通过在位3或4的氨基酸苏氨酸和异亮氨酸，可能通过一稳定因子被加强。

发明概述

按照本发明该任务也通过枯草杆菌蛋白酶-型的碱性蛋白酶获得解决，其特征是，该蛋白酶按照来自于Bacillus lentus的枯草杆菌蛋白酶的计数，在位61相对于原始酶具有一与氨基酸丙氨酸，颉氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，胱氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，苏氨酸，组氨酸，赖氨酸或精氨酸之一的替换，主要是与氨基酸丙氨酸，颉氨酸，亮氨酸或异亮氨酸，特别优选的是与丙氨酸的替换。

更优选的是这样的溶液，在其中对于在位61的替换之外还附加在位199上具有一异亮氨酸；是那些在位61有一上述的氨基酸，在位199是异亮氨酸，在位211为天冬酰胺酸和为稳定在位3是苏氨酸和/或在位4是异亮氨酸的溶液。特别优选的溶液是这样的蛋白酶，其来源于B.lentus-碱性蛋白酶，特别是来源于B.lentus-碱性蛋白酶S3T/V4I/G61A/V199I或B.lentus-碱性蛋白酶S3T/V4I/G61A/V199I/L211D的这两个变体之一。在本发明对象中还包括了所述蛋白酶的的进一步开发和衍生物。

作为分任务的溶液和因此作为当时本发明的对象，按照本发明给出了按本发明的蛋白酶进行编码的核酸，以及载体，宿主细胞和获得这种蛋白酶可采用的制备方法。另外为该种蛋白酶提供相应的制剂，特别是洗涤剂，相应的洗涤方法以及相应的应用可能性。最后应阐明所发明蛋白酶的技术应用可能性。

附图简述

图1为多种不同蛋白酶的氨基酸序列比对的结果；和

图2为载体pUC18M131图谱。

发明详述

对蛋白质而言，按照本专利申请的含义是由来源于天然的氨基酸组成，尽可能地为直链型，为执行其功能多半理解为能呈现三维结构的聚合物。在本专利申请中标记了19种蛋白，天然存在的具有国际上常用的1-和3-字母-码的L-氨基酸。

一该标记与一数字的结合表示为各蛋白质，即在某一位置上具有该氨基酸基。因此对S3而言，例如表示为在位3上的丝氨酸(S)基，按照所述及蛋白质的N-末端开始的计数。例如一采用氨基酸苏氨酸(T)在该位置上的点突变按照专业术语可被简写为S3T。对具有多个点突变的变体标示而言，可将该替换用斜杠相互分开。因此变体S3T/V4I表示为，之前在位3存在的丝氨酸(S)被苏氨酸(T)和在位4上的颉氨酸(V)被异亮氨酸(I)所替换。

只要没有其他的提示，该按照本发明的位置指示涉及各所述及的蛋白质成熟的形式，但不是信号肽(见下述)。

对酶而言，按照本专利申请的含义理解为是一具有一定生物化学功能的蛋白质。例如分解蛋白的酶或具有分解蛋白功能的酶通常被理解为它们可水解蛋白质的酰胺键和，特别是这些存在于内部时，和因此也可标记为内肽酶。枯草杆菌蛋白酶是这类内肽酶，其产至于和至少分泌于天然的格兰氏阳性细菌，或例如从分子生物学方法派生出的，和部分范围，如能形成结构的或具有功能的区域与天然的枯草杆菌蛋白酶均质化。例如在R.Siezen的文章“subtiloses：类枯草杆菌蛋白酶”中所表达的，该文可见于，R.Bott和C.Betzel，“枯草杆菌蛋白酶”New York，1996，一书的75-95页。

大量的蛋白质被称作预蛋白质，其与一信号肽相结合。应理解为该蛋白质的N-末端部分功能大都是，保障由细胞和/或其正确皱褶生成的蛋白质能进入到胞浆围膜或周围培养基中。随后该信号肽在天然条件下可借助一其他蛋白质的信号肽酶分解，由此其不需要相邻存在的N-末端的氨基酸即可发挥本身的催化活性。按照在WO 91/02792 A1的图1，该来源于Bacillus lentus DSM 5483的枯草杆菌预蛋白质含有380个氨基酸。而该成熟的蛋白质相反仅含有269；以该成熟的蛋白质的第一个氨基酸开始计数，此时为丙氨酸，按照该预蛋白质的序列应位于数字112。按照本专利申请的SEQ ID NO.1，该来源于B.licheniformis  ATCC 68614的枯草杆菌蛋白酶的信号肽为111个氨基酸长度和该成熟的肽为269个氨基酸。若没有该划分，该完整的蛋白质具有380个氨基酸的长度，如SEQ ID NO.2所表明的。按照序列表同样也作为特别优选的实施实例。

对技术应用而言，基于其酶化活性，突变肽，即在制备后所产生的酶比预蛋白质更为优选。

前蛋白质为非活性的蛋白质预备阶段。其信号序列前身标记为预-前-蛋白质。

对核酸而言，按照本专利申请的含义理解为是天然的来源于核苷酸组成的作为承载信息作用的分子，其可对在蛋白质或酶中的直链氨基酸顺序进行编码，可作为单独线段，作为该单独线段补充的单独线段或作为双线段存在。作为天然持久的信息承载体，对分子生物学工作而言优选是核酸DNA。与此相对，对在自然环境下本发明的实现而言，例如在一实验细胞中，应形成一RNA，因此在本发明的实施实例中也用对本发明重要意义的RNA-分子表达。

按照本专利申请的理解，蛋白质相应的核酸信息单位被标注为基因。对DNA而言，这两种补充线段的序列在各所有三个可能的选择定向(Leserastern)上均需注意。另外还应注意对同样的氨基酸可采用不同的密码子-三重线编码，因此可在各种不同的和可能情况下的仅具有少量统一性的核苷酸序列中得出一确定的氨基酸-顺序(遗传密码的蜕变)。除此之外，不同的有机体具有使用密码子的区别。基于该原理，无论氨基酸序列还是核苷酸序列均需考虑包括在保护范围内，和对于给出的核苷酸序列仅作为某种氨基酸序列的一种范例编码。

对目前专业人员已知的方法，例如结合分子生物学和/或蛋白化学的标准方法采用化学合成或在化合物中的聚合物酶-链反应(PCR)，依据已知的DNA-和/或氨基酸序列可制备出完整的基因。这种方法例如为在“生物化学百科全书”(Lexikon der Biochemie)，SpektrumAkademischer出版社，柏林，1999，Band 1，S.267-271和Band 2，S.227-229中是已知的。如果菌种采集能被追溯到菌种源上时就更有可能。采用PCR-引物(Primern)，依据一已知序列可将其合成，可没有问题的从该菌种合成相应的基因：进行克隆和如希望的话还可进一步培育。归属于此的例如还包括地点指向(ortsgerichtete)或随机控制(zufallsgesteuerte)的突变基因.

核苷酸序列的改变，如借助已知的分子生物化学方法所进行的，被标记为突变。按照改变的方式人们例如可将其认为是缺失-，插入-或取代突变或这些，在其中不同的基因或部分的基因相互合并(重组)，这就是基因突变。该附属的有机体将标记为突变体，由突变的核酸衍生的蛋白质标记为变体。因此例如缺失-，插入-，取代突变或合并可导致缺失-，插入-，取代突变或合并基因和在蛋白质层面上产生相应的缺失-，插入-，或取代变体，以及合并蛋白质。

对载体而言，按照本专利申请被理解为由核酸所组成的成分。其作为特征的核酸领域含有一有益的基因。其使得在一物种或一细胞链中可越过多代或细胞分裂作为剩余的基因组进行独立的复制，产生稳定的遗传成分。载体是在细菌中应用中的特殊质粒，即循环遗传成分。人们在遗传工程学中区分为不同载体，这些起着储存和在一定程度上具有遗传学工作的载体称之为所谓的克隆载体，这是一方面，另一方面将那些在宿主细胞中可实现有意义基因功能的载体，就是说使所涉及蛋白质作出表达。该载体被标记为表达载体。

借助同源作用，即与已知酶的比较，例如借助于顺序作用，可由氨基酸-或核苷酸-序列推断出所涉及酶的酶催化活性。其也可通过不参与真正反应的蛋白质的其它方面加以定性或定量修改，例如其可涉及酶稳定性，活性，反应条件或底物特性。

蛋白水解酶或蛋白酶的概念可理解为超出催化活性中心少量氨基酸基功能之外的所有的功能，即通过所有剩余蛋白质或部分或许多部分剩余蛋白质对真正的催化活性领域所产生的作用。即使仅仅这种修改功能或部分活性，只要其支持蛋白水解反应，按照本发明就可理解为蛋白水解活性。例如与底物，中间-或成品的结合，活化或阻止或对水解活性调节影响的传递均属于这类助功能或部分活性。此外例如其还涉及远离活性中心的结构成分的形成。对涉及本发明的可蛋白水解蛋白质的第二个前提条件是，通过真正的活性基的化学行为单独的或还附加通过修改部分的作用形成肽键的水解。除此之外也可将其他蛋白酶的活性通过一个或多个部分，例如按照本发明的蛋白质定性或定量的加以修改。该其他因素的影响同样可看作为蛋白水解的活性。蛋白水解活性酶还包括在给定的时间段内通过抑制剂被阻止其活性的酶。起决定性的是其对相应蛋白水解-反应的基本特性。

对片段而言，应理解为所有小于天然蛋白质或相应完整传递的基因和例如通过合成获得的蛋白质或肽。基于其氨基酸序列可对所涉及的完整蛋白质进行推断。例如其可采用相同的结构或具有相同蛋白水解活性或部分活性，例如底物的复合。起始蛋白质的片段和缺失变体通常是一样的；在片段更可能是较小碎块形成时，没有缺失突变，更可能是短区段，因此仅缺少个别的分功能。

对嫁接或杂交蛋白质而言，按照本专利申请被理解为是这样的蛋白质，其是由来源于天然的相同或不同生物的不同聚肽链成分所组成。其也被称作重组或合并突变。该合并的意义例如是，在合并作用帮助下按照本发明的蛋白质部分被变成或修改为具有酶的功能。这里嫁接的蛋白质是来源于单个聚肽链或是具有不同功能的多个亚单位对于本发明而言并不重要。为实现最后述及的选择，例如可用后转移或先在纯化步骤后再通过一有目的性的蛋白水解将一单个的嫁接聚肽链分解成多段。

对通过插入突变所获得的蛋白质而言可理解为是这类的变体，其可通过已知的方法在起始序列中借助一核酸-，或蛋白片段的嵌入来获得。借助嫁接蛋白质可推导其基本的相同性。可通过不可改变的蛋白部分与总蛋白质的大小比例来对它们进行区别。在这类插入突变的蛋白质中外来蛋白质部分少于在嫁接蛋白中的。

插入突变，即一部份序列颠倒，即可作为缺失，也可作为插入的特殊形式。因此被视作为一区别于原始氨基酸顺序的不同分子部分的新编组。其既可看作为缺失变体，插入变体，也可被看作原始蛋白质的重组-变体。

按照本专利申请，衍生物被理解为是本身氨基酸链可被化学修改的蛋白质。这一衍生化例如可通过与宿主有机体蛋白质的生物合成相关联的生物学方法来完成。为此在要求上可采用分子生物学的方法。但也可通过化学法来完成，如通过一氨基酸侧链的化学改造或通过一其他化合物与蛋白质的共俩结合。对这样的化合物而言，例如也可涉及其他的蛋白质，例如通过双官能的化合物与按照本发明的蛋白质结合。当在结合的物质中涉及一抑制剂时，这样的修改例如可影响底物特性或与底物的结合强度或导致酶活性暂时的封闭，例如其对于存储时其具有重要意义。同样对衍生化而言，可理解为与一大分子载体的共俩结合。

按照本发明的规定所有的酶，蛋白质，片段和衍生物，只要是未明确说明的，均以总概念蛋白质来表述。

对酶的效率而言，理解为在各所涉及的技术领域中的作用效果，其是基于真实的酶活性，另外还依赖于其他对各工艺过程的重要因素。对此例如包括稳定性，底物结合，与底物所承载的材料的相互作用或与其他组成物的相互作用，特别是协同作用。

对洗剂的洗涤效率或洁净效率而言，按照本发明的规定应理解为该涉及的洗剂对被污染的物品，如衣物或具有硬表面的物体的作用效果。对这种洗剂的个别成分，例如各个酶，在整个洗剂中的贡献要作出评价。因为仅由酶的酶解特性不能作出它对洗剂效率的贡献简单得出结论。这里作为另外的因素例如稳定性，底物结合，与洗涤物的结合或与洗剂其他组成物的相互作用，特别是协同作用在去污效果上也起着作用。

本专利申请对给出的任务确定了对策，对来源于Bacillus lentusDSM5483的，特别是相对与在专利申请WO 91/02792 A1，WO92/21760 A1和WO 95/23221 A1中所公开分子的枯草杆菌蛋白酶，尤其特别的是对于在洗涤剂中使用变体M131S3T/V4I/A188P/V193M/V199I和F49 S3T/V4I/A188P/V193M/V199I/L211D可得到进一步的改良。附属的技术规范还可在其它相应的，特别是在高同源的蛋白酶，最特别的是在枯草杆菌蛋白质-型中加以应用。

按照本发明特别重要的是来源于Bacillus lentus DSM 5483(WO92/21760 A1)的枯草杆菌蛋白酶的计数位3，4，61，199和211的成熟蛋白质。按照表1其可与最重要来源的枯草杆菌蛋白酶发生同源作用；该同源作用可使其在其他的枯草杆菌蛋白酶上传布。因此例如在R.Siezen的文章“枯草杆菌蛋白酶：类枯草杆菌蛋白酶”，75-95页，该文可见于“枯草杆菌蛋白酶”，R.Bott和C.Betzel出版，New York，1996一书中，相对于已知序列的枯草杆菌蛋白酶BPN’对超过20种的枯草杆菌蛋白酶作出了顺序组合。

表1：五种特殊按照本发明重要位置的同源作用

 

参照-酶	按照序列的文献	位3	位4	位61	位199	位211
							Bacillus lentus-碱性蛋白酶	WO 92/21760A1	S3	V4	G61	V199	L211
BPN’	Wells等人(见上)	S3	V4	S63	I205	Y217
							枯草杆菌蛋白酶Carlsberg	Smith等人(见上)	T3	V4	G62	V204	L216
BP92	EP 283075A2	S3	V4	G61	V199	L211
							枯草杆菌蛋白酶309	WO 89/06279A1	S3	V4	G61	V199	L211
热酶	WO 91/00345A1	S10	R11	G70	I209	L221
							蛋白酶K	WO 91/00345A1	T4	A6	G68	I208	I220

在按照本发明的表1中给出了一按本发明的Bacillus lentus-碱性蛋白酶-变体S3T/V4I/G61A/V199I和S3T/V4I/G61A/V199I/L211D的氨基酸序列的组合顺序，其具有最重要的，导入描述的枯草杆菌蛋白酶，即枯草杆菌蛋白酶309(Savinase

)，枯草杆菌蛋白酶PB92，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg和枯草杆菌蛋白酶BPN’。

本发明规范在其他方面的使用应以在枯草杆菌蛋白酶和广泛相同的反应抗理间的高度结构一致性为依据。因此可以预计，该所述及的点突变将在各涉及的分子上下关系中发挥可对比的作用。特别是基于本发明的规范可以预计，这类在目前技术条件下被开发用于洗涤剂的枯草杆菌蛋白酶，可通过这种点突变的接纳进一步改善其在洗涤效率中的贡献。

对于按照Bacillus lentus-碱性蛋白酶计数的位61而言，叙述了以目前技术条件(见上)所进行的氨基酸N，D，Q，E，P和S的替换，特别是与其他本发明未涉及的点突变配合。枯草杆菌蛋白酶与中性的，一含羟基的氨基酸苏氨酸，与碱性氨基酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸，与芳香族的氨基酸苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，与含硫的氨基酸胱氨酸，蛋氨酸和与脂肪族的氨基酸丙氨酸，颉氨酸，亮氨酸，异亮氨酸的替换至今未见报道；特别是未在改善酶的效率，和特别是改善其相应洗涤剂的洗涤效率上被涉及。这将由本发明来完成。

按照本发明，其涉及在位61上的效率改良替换，首先涉及到一与脂肪族氨基酸，即丙氨酸，颉氨酸，亮氨酸，异亮氨酸的替换，特别优选的是丙氨酸。其特征如同在例子中研究的Bacillus lentus-碱性蛋白酶的变体S3T/V4I/G61A/V199I和(芽孢杆菌属(Bacillus lentus)-碱性蛋白酶S3T/V4I/G61A/V199I/L211D。惊奇地发现，一在位61的氨基酸对羟苯基甘氨酸与一其他氨基酸，特别是与脂肪族氨基酸和最特别是与丙氨酸的替换有助于大大提高的洗涤效率。

作为一来源于Bacillus lentus枯草杆菌蛋白酶的变体，它与按本发明的B.lentus蛋白酶变体S3T/V4I/G61A/V199I/L211D具有最高的协调性，其可看作WO 95/23221 A1中已知的具有特征性替换的S3T/V4I/A188P/V199M/V199I/L211D的B.lentus-碱性蛋白酶-变体F49。与S3T/V4I/G61A/V199I最相似的变体是相应在WO 92/21760 A1中已知的和在WO 95/23221 A1中作为M131标记的B.lentus-碱性蛋白酶-变体S3T/V4I/A188P/V193M/V199I。

本发明在两个替换位A188P和V193M上各有一个位61上的变异。例如在专利申请WO 95/30011 A2中可看到的是，B.lentus-枯草杆菌蛋白酶的氨基酸193处于第6个环的起始处，而氨基酸188不在环上，而是处于蛋白质间的紧密区域。就这点而言两个突变处在分子结构不同的区域。按照本发明还惊喜地发现，在两个位置188和193上的回复形成野生型的氨基酸和在第1个环的位61的附加突变可产生出一种酶，其在洗涤效率上优于至今已知的酶，特别是迄今已知的B.lentus-碱性蛋白酶变体。其特别可以在实例3，5和7所给出的结果来证明。

例如在专利申请CA 2049097 A1，EP 380362 A1和WO 95/30010A1(见上)中虽然推荐了在位61上的变异，但仅生成酸性氨基酸。在一系列的有关稳定性的点突变专利申请中，如WO 96/28556 A2和特别是WO 95/30011 A2(见上面)对在位61(大多数枯草杆菌蛋白酶天然的含有对羟苯基甘氨酸)作出了附加的这种替换描述(N，D，Q，E，P和S)，这意谓着对分子已有非常大的变化和也许会影响由于第一个环所产生的底物-相互作用。在EP 398539 B1中与此相反甚至建议突变的发生应导致只有源自天然的B.Lentus的枯草杆菌蛋白酶存在时在相应的枯草杆菌蛋白酶的该处才能引入氨基酸对羟苯基甘氨酸。鉴于技术水平的原因惊奇地发现，正好是这个位置的变化，才有利于对一带有脂肪族侧链的氨基酸的作用，和尤其特别的是丙氨酸替换显示对酶作用的反应有优越性。

从应用技术使用的观点，特别是在洗涤剂中惊奇的是，其可导致效率的改良，特别是该种酶对不同污物的洗涤效率加以了改善，对此将在本专利申请的实施实例2至7中展示。

相应于这一考虑还有其他这一类的变体是优选的，除所述的按照B.Lentus的枯草杆菌蛋白酶的计数在位61的替换外，还具有在位199氨基酸异亮氨酸的替换。例如在WO 92/21760 A1中描述了这种替换对B.lentus DSM 5483枯草杆菌蛋白酶的酶特性的影响。

其它优选的是枯草杆菌蛋白酶-型的碱性蛋白酶，其特征是，按照B.Lentus的枯草杆菌蛋白酶的计数在位199上的该酶具有异亮氨酸，在位211为天冬酰胺酸和在位61为氨基酸丙氨酸，颉氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，胱氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，苏氨酸，组氨酸，赖氨酸或精氨酸之一，优选是丙氨酸，颉氨酸，亮氨酸或异亮氨酸，特别优选是丙氨酸。即其涉及天然的也涉及通过突变所获得的在该位置的氨基酸分子。

例如在专利申请WO 95/23221 A1的例10中描述了在位211后氨基酸基天冬酰胺酸对相应洗涤剂的洗涤效果提升的贡献。

优选按照本发明的碱性蛋白酶的特征是，其至少具有稳定作用。由此提高在储存时和/或其使用期间的稳定性，因此使得之前所述及的氨基酸有益的作用，以及氨基酸交换在较长时间内保持和加强。

按照本发明蛋白酶的稳定性例如可通过与聚合物的结合来提高。其方法之一例如专利US 5230891中所述。其要求蛋白质在相应的洗涤剂中使用前应与这种聚合物经过化学偶联步骤进行结合。

优选是通过分子的点突变过程本为实现稳定化作用。其在蛋白质提取后不需要其它的加工步骤。为此一些适合的点突变按目前的技术水平是已知的。按照专利US 6087315和US 6110884可通过将特定的酪氨酸-基与其它替换来达到稳定。按照本发明的规范，来源于B.lentus的蛋白质相当于按照SEQ ID NO.2在位89，161，165，208和257进行酪氨酸-基的替换；在B.lentus-碱性蛋白酶中，两个在那里另外给出的位置均已被酪氨酸占据。

其它的可能性例如有：

-按照EP 583339 B1，特定氨基酸基与脯氨酸的替换；这相当于是对来源于B.lentus的酶替换S55P，A96P，A166P，A188P和/或S253P；

-按照EP 995801 A1，在分子表面导入极性的或带电的基团；

-改变与金属离子的结合，特别是钙-结合位的改变，例如按照专利申请书WO 88/08028 A1和WO 88/08033 A1。按照第一个文献，将一个或多个与该钙-结合的氨基酸-基与负电荷的氨基酸进行替换。按照D.W.Goddette等人(1992)在J.Mol.Biol.，Band 228，580-595页发表的文章，来源于B.lentus的枯草杆菌蛋白酶占据下述的两个钙-结合位：Ca1(具有较高的键合亲和性)，包括位置2Q(s)，D40(s，2×)，L73^*，N75(m)，177(s)，V79(m)和位Ca3(具有较低的键合亲和性)，包括位置A168，A163，Y165，水273，317；各都按照来自B.Lentus的枯草杆菌蛋白酶的编号。

-按照专利申请WO 88/08033 A1的规范，为达到稳定化必须通过钙-结合和同时至少将下述两个基胱氨酸/甘氨酸的突变之一导入；例如在来自B.Lentus的枯草杆菌蛋白酶中其涉及在位60/61，115/116和212/213中的NG-顺序。

-按照专利US 5453372，可通过在表面的特定突变来保护变性剂如表面活性剂对蛋白质的影响；那里所给出的位置相应于在B.lentus-碱性蛋白酶中的位134，155，158，164，188和/或189。

在专利3中给出了US 5340735，US 5500364，US 5985639和US613655其他可对比的可能性。

对于按照本发明的碱性蛋白酶稳定而言，优选涉及在按照来自B.Lentus的枯草杆菌蛋白酶的计数位3上的氨基酸苏氨酸。例如从专利申请WO 92/21760 A1的表3中表明，该与野生型酶的分子替换不仅在提高温度时，同时对表面活性剂的作用也是稳定的。该分子所属的位3和4的N-末端在经过加工后处于有活性中心的表面，尤其是缝隙的顶端。不受束缚的端点与分子的基特别是通过非共价的相互作用相结触而有助于保持成球状结构。不考虑该理论，人们也可设想限制在该不受束缚端点绕性的所有突变都有助于稳定整个分子。

同样对于一按照本发明的碱性蛋白酶的稳定化而言，优选其涉及在按照来自B.Lentus的枯草杆菌蛋白酶在计数位4上的氨基酸异亮氨酸。该替换的稳定化作用同样在专利申请WO 92/21760 A1的表3中作了说明。

特别优选的是该分子即在位3上与苏氨酸替换又在位4被异亮氨酸加以了稳定，并对其效率作了改善。

相应的本发明的枯草杆菌蛋白酶在本发明的洗涤剂配方实例中相对于现时技术水平已知的酶使效率提升，该酶不具有稳定化作用。不考虑与该理论相结合，人们可以猜想，该所涉及变体的稳定性有助于在洗涤漂浮物中的酶活性能保持足够长的时间，从而支持了改良的效率。

除此之外，每一该替换也可以其他的方式来改善分子的效率，特别是在洗涤剂中，例如通过与一底物或与相应洗涤剂中其他的组成物的相互作用。

特别优选的实施实例是，在其中按照本发明的碱性蛋白酶的特征是按照B.Lentus的枯草杆菌蛋白酶的计数在位3上为苏氨酸，在位4上是异亮氨酸，在位61上是丙氨酸和在位199上是异亮氨酸。

这样的变体对一相应洗涤剂的洗涤效率的贡献在本专利申请实施实例3，5和7中进行了讨论。

尤其特别优选的是这样的实施实例，在其中按照本发明的碱性蛋白酶的特征是，按照B.Lentus的枯草杆菌蛋白酶的计数在位3上为苏氨酸，在位4上是异亮氨酸，在位61上是丙氨酸，在位199上是异亮氨酸和在位211上为天冬酰胺酸。

这样的变体对一相应洗涤剂的洗涤效率的贡献在本专利申请实施实例2，4和6中进行了讨论。

优选这种变体来源于一(芽孢)杆菌属-枯草杆菌蛋白酶，特别是来自Bacillus lentus-枯草杆菌蛋白酶。

该(芽孢)杆菌属-蛋白酶一开始就具有有利于各种不同技术应用可能性的特性。其中包括对于较高的温度，氧化和变性剂具有一定程度的稳定性。此外人们采用微生物蛋白酶获得了大量有关其生物工程产品的经验，例如有益的克隆载体的结构形式，宿主细胞的选择和发酵条件或风险的评估，例如过敏原反应。

特别是来自Bacillus lentus的枯草杆菌蛋白酶，以及由天然的蛋白酶衍生出的枯草杆菌蛋白酶，是按目前技术水平确定了例如在洗涤剂中的应用。属于这方面的有开始时述及的枯草杆菌蛋白酶147，枯草杆菌蛋白酶309和B.lentus-碱性蛋白酶。人们获得了该蛋白酶制备和应用的经验资源，有利于按照本发明的酶进一步开发。例如获得了其与其他化学化合物，例如洗涤剂的组成物的兼容性。

作为这里适合的起始菌种可以按德国汇编集订货号DSM 5483从Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH公司，Mascheroder Weg 1B，38124布伦瑞克市(Braunschweig)(http://www.dsmz.de)订货和例如可使用在专利申请WO 91/02792 A1，WO92/21760 A1或WO 95/23221A1述及的B.lentus-菌种。该种变体可通过应用分子生物学的标准方法，例如PCR和已知的点突变-法，由上述的或同源的菌种来制备。

特别优选的和在实例中述及的变体为在实施实例1中由B.lentus的B.lentus-碱性蛋白酶制备的，其可以名称ATCC68614从AmericanType Culture Collection，10801 University Boulevard，Manassas，VA20110-2209，美国(http://www.atcc.org)订货。在本发明的序列表中以SEQ ID NO.1和2公开了该酶的核苷酸序列，以及其氨基酸序列。

该序列例如可用于引物的结构确定，以从格兰氏阳性细菌的DNA-制剂中，优选是格兰氏阳性细菌例如B.lentus中制备一对该种蛋白酶编码的核酸，例如在本专利申请的规范应用中进行突变反应和制备，往往还按已知的方法进行修改。除此之外，基于基因编码的变种还可考虑许多其他的核酸，其同样也可为该变体进行编码和同样可供本发明对象择优选择。

这里特别涉及的是按照以SEQ ID NO.3所给出的核苷酸顺序的序列表，但首先是按照SEQ ID NO.4所给出的氨基酸顺序的序列表的B.lentus-碱性蛋白酶S3T/V4I/G61A/V199I。其改良的洗涤效率贡献将在采用本专利申请相应的应用实施中加以证明。

同样优选的是相应上述的一种碱性蛋白酶，其特征是，其来源于B.lentus DSM 5483或ATCC68614的枯草杆菌蛋白酶之一，特别是按照在SEQ ID NO.6所给出的氨基酸序列以及在SEQ ID NO.5所给出的核苷酸序列的B.lentus-碱性蛋白酶S3T/V4I/G61A/V199I/L211D。

如其在本专利申请的应用实例中所描述的，在实验中相对于对照分子其表现出最强的效率改善。其可同上所描述的一样来获得。

一优选的实施实例是一由上述蛋白酶产生的蛋白质，特别是与至少一其他蛋白质的至少一部分通过片段化或缺失突变，通过插入突变，通过取代突变或通过合并来获得。

该方法是按照目前的技术水平形成的。因此相应的分子生物学方法，例如在Fritsch，Sambrook和Maniatis的手册“分子克隆：实验室手册”，Cold Spring Harbour Laboratory Press，New York，1989中有详细的叙述。

例如这里包括通过取代突变，或通过进一步的点突变赋予其它特性的变体，以适合于特殊的使用目的，例如在WO 00/36069 A1中公开的通过表面电荷的变化，或例如在WO 99/27082 A1中公开的通过催化剂或相关环的底物结合的改变。也可使变体在较大的区域经受一突变处理。例如使其达到生成片段或缺失突变的目的，以获得蛋白酶的特殊分功能的选择或相反将其关闭，例如底物结合，以及通过特定的分子区域与其他化合物产生的相互作用。

按照本发明的蛋白酶可借助插入，取代或合并获得附加的功能。例如可考虑与特定地点(Domaenen)结合，如纤维素-化合-地点，例如在公开文献WO 99/57154 A1至WO 99/57157中所描述的。在这里所标注的氨基酸-链键可被实现，借助于来自于蛋白酶的均一的合并蛋白，键链-区域和结合地点(Bindungsdomaenen)的形成。这样的结合地点也可来源于同样的或其他的蛋白酶，以增强按照本发明的蛋白质与一蛋白酶-底物的结合。其可提高局部蛋白酶-浓度，在单独应用时，例如在原料的处理时是有益的。

按照一另外的实施实例，本发明蛋白质的特征是，还可再行衍生。

这在对其相应的使用目的最佳化时特别重要。这里有化学修改，例如在专利申请DE 4013142 A1中所描述的，例如其也可通过与低-或高-分子的化合物的偶联进行修改，如将天然的不同有机体来源的蛋白质与蛋白生物合成相结合实施，例如在合成时借助真核生物的宿主细胞将一脂肪酸基与近N-末端的结合或产生糖基化作用。由此本发明的实施实例制备了蛋白水解酶或片段的附加衍生物。

结合按照本发明的蛋白质在洗涤剂中的使用表明，与其它洗涤活性物质或酶的结合具有特别的意义。可对比的结合-物例如在有关纤维素-结合地点的专利申请WO 00/18865 A1和WO 00/57155 A1中进行了叙述。与此类似也可进行大分子化合物偶联，如聚乙二醇，以使得该分子的其他特性如稳定性或皮肤相容性获得改善。这样的修改例如在专利US 5230891中作了描述，以使得所涉及的蛋白酶更适合于在化妆品中的应用。

对按照本发明的蛋白质衍生物而言，也可非常广义地理解为酶的制备处理。按照蛋白质的提取，加工或制备处理可共同出现含有各种其他物质的蛋白质，例如来自于生产微生物的培养。即使是用于蛋白酶生产的微生物的培养成熟物就显示有蛋白水解活性，这表明粗提取物具有可钝化其他的似蛋白活性的相应用途。

借助采用特定的其他材料，例如可提高蛋白质的储藏稳定性。因此按照本发明也还包括按本发明具体蛋白质所有制备处理，与在一特定的制备处理中酶活性是否显示无关。因此可以认为，希望在储存时没有或仅具较小活性，当使用时才显示出其蛋白酶水解作用。例如其可取决于该蛋白质的皱褶状况或与按照本发明蛋白质制备处理时一个或多个伴随物可逆的结合。蛋白酶与蛋白酶-抑制剂特别的共同制备处理在现在技术水平下是已知的(WO 00/01826 A2)。其次还有合并蛋白质，在其中抑制剂通过键链，特别是通过氨基酸-键链与各蛋白酶相结合(WO 00/01831 A2)。

特别期望的是所述及的按照本发明蛋白质的进一步开发，衍生化和制备处理，如果其还具有蛋白水解的活性，那末这就是其按照本发明的应用可能性的前提。首先相对于起始分子或非衍生化的分子通过各种突变和/或衍生化手段获得的蛋白酶提高了蛋白水解活性和在其所期望的技术使用领域尤其特别是改善了效率。这里特别是其在洗涤剂中洗涤效率的改良。

例如可将按照本发明的点突变与其他涉及催化反应的点突变相结合，这些突变大致是在活性中心进行的。因此例如就可采用专利申请WO 95/30011 A2的说明，使按照本发明的蛋白酶，它涉及到，来源于B.lentus-枯草杆菌蛋白酶，在环-区域发生突变或附加导入氨基酸。这样的工作在下述编号的专利中进行了描述，即WO 00/37599A1，WO00/37621 A1至WO 00/37627和WO 00/71683 A1至WO 00/71691 A1。

与其它有效成分在反应媒介中互相作用的酶的一个区域的缺失，可能是通过皱褶效应，会妨碍整个的反应，其可产生一所期望的进一步开发。类似的是，为了成功提高蛋白水解率可考虑与其它有效的酶的合并，即与其它蛋白酶合并。

例如在储存时通过与一抑制剂结合对一蛋白水解活性的可逆封锁可阻止蛋白的自动水解和由此可在反应介质中被稀释时产生一高的蛋白水解率。例如与特殊结合地点的偶联在洗涤过程中可提高蛋白酶相对于漂浮物在接近底物处的浓度和由此提高酶对洗涤效率的贡献。

在另一实施实例中所述的蛋白质或衍生物的特征是，其可进一步地被稳定或具有一个以上的上述的稳定作用。

这里基于实用的原因致点突变的方法对本发明特别重要。所有上面述及到的可能性也可与按照本发明的变体结合使用。按照WO89/09819 A1可以认为，多种稳定作用的突变有相加的效果。由此例如按照本发明的通过氨基酸3T或4I之一，或两者一起被稳定的变体借助与一聚合物的偶联或用一上述其他的方法进一步达到稳定。

第二个发明的对象是核酸。包括相应优选的用于第一个发明对象的蛋白质或衍生物编码的核酸。

核酸是几乎所有常见的分子生物学研究和进一步开发以及蛋白质产品的起点。特别是基因序列和附属氨基酸-序列，每种突变和蛋白质的表达。该方法例如在Fritsch，Sambrook和Maniatis的手册“分子克隆：实验室手册”，Cold Spring Harbour Laboratory Press，New York，1989中有叙述。

在DNA层面上按照本发明的酶可通过所有一般的概念“蛋白质工程”总结的不同应用方法来优选。特别是可通过下述的在蛋白质层面上可实现的特性来达到：所获得蛋白质氧化稳定性的改良，对变性剂或蛋白酶稳定性的改善，耐高温性，耐酸和强碱性的条件，对钙或其他辅助因素的敏感性改变，免疫性或过敏原作用的降低。

对按照本发明突变的基因而言例如包括那些单独的，有目的性的碱基替换或随机性的点突变的，个别碱基一或部分顺序缺失的，与其他基因或基因片段合并的或对转化起作用的基因。这种突变或修改可通过所涉及核酸产生的酶来达到特殊的应用。这样的突变可采用目的性的指向或通过机遇的方法，例如对克隆基因的活性施用，指向性的辨别-和/或筛一选方法。

对给蛋白片段编码的核酸而言特别的是所有三个选择定向无论是有义的(sense)-或反义的(antisense)-方位均应注意。这样的寡核苷酸可通过聚合物酶-碳链反应(PCR)用作合成起始点所应用的核酸。这样的寡核苷酸，特别是当其覆盖相应的5种氨基酸-位3，4，61，199和211之一的区域时，被强调地包括在按照本发明的保护范围内。其还包括那些正好在该位置具有可变序列的寡核苷酸，因此在众多引物的种群中存在相应SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.5的一个位置编码的寡核苷酸。其同样也包括反义的-寡核苷酸，例如其可用于表达-调节。

按照本发明的蛋白酶的进一步开发特别可按照P.N.Bryan(2000)在Biochim.Biophys.Acta中的文章“蛋白质工程”，Band 1543，S.203-222，来加以思考。

首先该发明对象涉及到枯草杆菌-蛋白酶编码的核酸，该核酸序列与SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.5中所给出的核苷酸序列之一一致。该一致特别涉及相应于在位199异亮氨酸，在位211天冬酰胺酸，在位3苏氨酸和/或在位4异亮氨酸，和尤其是在位61丙氨酸编码的或包括该区域的氨基酸序列SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6。

如上和在实例中所表示的，该位置特别优选是按照本发明的碱性蛋白酶代表。该样板在其他枯草杆菌蛋白酶的应用通过所述及的其它分子在一个或多个该位置上的突变得以实现。按照已知的方法(见上)其仅出现在核酸层面上。

其优选适用于来自Bacillus lentus-蛋白酶序列的核酸，特别是Bacillus lentus DSM 5483-蛋白酶序列的。在最特别优选的情况中该核酸可为一按照本发明的变体的B.lentus-碱性蛋白酶S3T/V4I/G61A/V199I或B.lentus-碱性蛋白酶S3T/V4I/G61A/V199I/L211D编码和/或与一在SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.5中给出的核苷酸相一致。这种一致性涉及具有该变体特征的区域和特别优选的是完整的序列。

在保护区域中例如也包括这样的核酸，其可为蛋白水解活性的插入-或合并突变体编码。因此对活性起作用的区域例如可通过结合纤维素的地点合并或在催化非活性的区域中引入点突变，以使得所产生的蛋白质与聚合物的偶联成为可能或降低过敏原反应。

一特殊的发明对象为载体。其含有一前所述及的核酸区域和特别是一前已述及编过码的蛋白质或衍生物的核酸区域。

考虑到本发明重要的核酸，可将其相应的置于载体中。这在目前技术水平中已有详细的描述和其在数量或品种上，无论是用于克隆或是用于表达均是商业上可得的。由此例如为来源于细菌质粒，病毒或噬菌体的载体，或大量的是合成的载体。其是分子生物学或生物化学研究，所述及基因或附属蛋白质的表达的合适的起点。

对按照本发明的载体而言其首先涉及克隆载体，其含有一前所述及的核酸区域和特别是一前已述及编过码的蛋白质或衍生物的核酸区域。

克隆载体除适合于储存，生物学的扩大或有益基因的选择外还适合于所述及基因的分子生物学特性描述。同时其可制备成所述及核酸的可运输和易于储存的形态是不与细胞结合的分子生物技术的起点，例如PCR或In-vitro-突变-方法。

同样，对按照本发明的载体而言其首先涉及表达载体，它含有一前所述及的核酸区域和特别是一前已述及编过码的蛋白质或衍生物和可进行生物合成的核酸区域。

这种表达载体是相应核酸在生物学生产体系中实现的基础和由此制备附属的蛋白质。本发明对象优选的实施实例是表现载体，其具有所有用于表达所必备的基因成分，例如天然，原始在该基因前定位的启动子或一来自于其他有机体的启动子。该成分例如可整理为所谓的表达磁带形式。特别优选的是其与所选择的表达体系，特别是宿主细胞(见下面)相一致。

一特有的发明对象是细胞，其可以任何形式用于开发，修改或按照本发明的蛋白质或衍生物的生产。其中特别是含有一前所述及的载体或其特征区域的细胞，无论是在质粒的还是染色体的确定位置。

例如其可进行相应基因的扩大，也可用于突变或转录和翻译和最后生物技术产品中。

首先涉及宿主细胞，其可与一前所述及的蛋白质或衍生物制备或引发其表达，特别是使用一前已述及的核酸区域，最特别是使用一前已述及的表达载体。

构成蛋白质的宿主细胞可用于其生物技术产品。其必须通过合适的载体来获得所涉及的基因，也可以说被转化。该载体或其特征的区域可在宿主细胞中的染色体作为自身基因成分存在或整合在一染色体中。

作为宿主细胞理论上所有的有机体均适合，即原核生物，真核生物或Cyanophyta。优选的是这样的宿主细胞，其可很好地运用基因，例如涉及与表达载体的转变和稳定性的建立，例如单细胞的真菌或细菌。对此，优选的宿主细胞在微生物和生物技术使用上应表现出众。例如其涉及易培养，高生长率，对发酵介质较少的要求和对异种蛋白有好的生产率-和分泌率。基于此每种按照本发明的蛋白质可从多种宿主有机体中获得。通常可从大量不同的现有技术水平可提供的体系中通过实验可确认对个别情况最佳表达体系。

优选的实施实例为这样的宿主细胞，基于相应的基因成分其活性是可调的，例如通过控制化合物的添加，通过改变培养条件或与相应细胞密度的的依赖性。这种可控制的表达能使感兴趣的蛋白质实现经济化生产。适合的是表达载体和宿主细胞相互一致，例如涉及表达所必需的基因成分(核糖体-结合位，启动子，终止剂)或密码子-用法(codon-Usage)。后者例如可这样达到最佳化，在基因中各由所述及的宿主不良翻译的密码子可通过各适用的具有相同意义的宿主加以替换。

在一优选的实施实例中该宿主细胞的特征是，其是一细菌，特别是一往周围培养基中分泌新生成蛋白质的细菌。

由于短的生长期和低的培养条件要求使细菌表现出众。由此可建立廉价的方法。对此人们对发酵技术中的细菌投入了大量的经验财富。对于一特殊的产品而言，按照通过试验得出的理由如营养源，产品培养率，所需的时间等，有不同的格兰氏阴性或格兰氏阳性的细菌是适合的。

对格兰氏阴性细菌而言，例如E.coli，在围膜间隙中可分泌大量的蛋白质。这对于特殊的应用是有益的。格兰氏阳性细菌，例如Bacill，与此相对所分泌的蛋白质立刻会进入细胞周围的营养培养基中，按照另一优选的实施实例可将按照本发明制备的蛋白质直接纯化。在专利申请WO 01/81597中，甚至公开了一种可达到的方法，可使格兰氏阴性的细菌制备蛋白质。

优选的细菌，其特征是，其是格兰氏阳性的细菌，特别是属于(芽孢)杆菌种属的，最特别的是种Bacillus lentus，Bacillus licheniformis，Bacillus amyloliquefaciens，Bacillus subtilis或Bacillus alcalophilus。

一本发明的实施实例使用了Bacillus lentus，特别是B.lentus DSM5483本身，以制备按照本发明的蛋白质(同源的)。与此相对，优选的是异种的表达。这里优选的是(芽孢)杆菌种属细菌，因为其在格兰氏阳性细菌中具有最佳的生产技术特性。这里包括这样的种Bacilluslichenfiformis，Bacillus amyloliquefaciens，Bacillus subtilis或其他的种或Bacillus alcalophilus的菌种。该采用Bacillus lentus的种具有一类似的密码子-用法和产生可对比的枯草杆菌蛋白酶本身，必然地可促进相对应的合成装置(syntheseapparat)。

另一优点为，通过该方法可获得具有来源于宿主菌种产生的内源枯草杆菌蛋白酶的按照本发明蛋白质的混合物。在专利申请WO91/02792(EP 493398 B1)中描述了一在Bacillus lichenfiformis中B.lentus-碱性蛋白酶的共表达；在那里还公开了大量可能的表达载体。该体系也可应用于新发现的按照本发明的变体中。

另外优选的是宿主细胞，其特征是，其是真核生物细胞，特别是那些使产生的蛋白质翻译后修改的细胞。

例如对真核生物而言为真菌如放线菌属(Actinomyceten)或酵母如酵母菌属(Saccharomyces)或Kluyveromyces。对修改而言，特别涉及这样的蛋白合成体系，例如包括低分子化合物的结合如膜支持(Membrananker)或低聚糖。这种低聚糖-修改可如予期地降低过敏原作用。

一独立的发明对象是一按照本发明的蛋白水解酶或衍生物的制备方法。

对使用一上述的核酸和/或使用一上述的载体和/或使用一上述的宿主细胞的上述蛋白水解酶或衍生物的制备方法提出了权利要求。

例如依据上述的DNA-和氨基酸-序列，例如也可由序列表推导出，按照已知的分子生物学方法合成相应的寡肽和寡核苷酸以及完整的基因和蛋白质。以已知生产枯草杆菌蛋白酶的微生物为前提也可分离出其他的天然产枯草杆菌蛋白酶的产物，确定了其枯草杆菌蛋白酶的序列和对相应作出的规定进行了进一步的开发。类似的按照在专利申请WO 91/02792中所公开的载体的实例开发了新的表达载体。基于所属的核酸序列，本发明的实施实例还可为无细胞表达体系，理解为在玻璃试管中进行蛋白质生物合成。所有上述涉及的成分也可结合成新的方法，以制备按照本发明的蛋白质。彼此对每一按照本发明的蛋白质而言，方法步骤有多种组合的可能性，因此对每一具体个别的情况可通过实验获得最佳的方法。

一特殊的发明对象是含有按照本发明的上述蛋白水解酶的制剂。特别涉及洗涤剂，最特别的是含量为2μg至20mg/g的制剂(洗剂)。

实际上按照本发明的酶的所有技术使用的可能性取决于，该功能化的酶应在一相应的介质中使用。因此例如该微生物学的应用可能性要求在介质中将该酶，通常以高纯度的制备形式与必需的反应对象或共因素结合在一起。原料处理的制剂或化妆品的制备同样可通过特殊的配方而具特征性。按照本发明所有的配方应理解为含有按照本发明酶的制剂。

作为优选的实施实例，洗涤剂被列为本发明的对象。如在本专利申请的实施实例中所指出的，令人惊奇地确定，一具有在位61(按照B.lentus-碱性蛋白酶的计数)与氨基酸丙氨酸，颉氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，胱氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，苏氨酸，组氨酸，赖氨酸或精氨酸之一，特别是与氨基酸丙氨酸，颉氨酸，亮氨酸或异亮氨酸之一，最特别的与丙氨酸替换的枯草杆菌蛋白酶-变体显示对各种不同的污染物无论是在纺织物或是硬表面上相对于未突变的分子具有一明显的效率提升。该效果无论是在不同温度或是不同浓度均可重现。

具有上述变体的制剂是相应优选的。这里特别包括B.lentus-碱性蛋白酶-变体S3T/V4I/G61A/V199I和S3T/V4I/G61A/V199I/L211D，以及所衍生出的分子。

对该发明对象而言包括所有想象到的洗涤剂类型，无论是浓缩物，或者是稀释使用的制剂；在机洗或手洗中或者是去污按商业标准应用。对此例如包括用于纺织物，地毯，天然纤维的按照本发明所标示的洗涤剂。例如还包括用于机洗餐具或手洗餐具的餐具清洗喷剂或硬表面如金属，玻璃，瓷器，陶器，瓷砖，石头，刷漆的表面，合成材料，木头或皮具的清洁剂；对这些均可采用按照本发明标示的洗涤剂。本发明的实施实例给出了各洗涤剂的类型，以充实按照本发明的蛋白质。

本发明的实施实例包括所有按照现有技术水平产生的和/或所有目的性指向的按照本发明的制剂。对此例如包括固体的，粉末颗粒状的，液体的，如胶状的或糊状的制剂，还可能是来自多相经压缩或未压缩的；其它例如还包括：挤出物，颗粒，片剂或袋状，无论是以大容器或分成份的包装。

按照本发明的制剂为每克制剂含有本发明酶的量为2μg至20mg和更优选的是5μg至17.5mg，20μg至15mg，50μg至10mg，100μg至7.5mg，200μg至5mg和500μg至1mg/g。由此产生40μg至4g和优选的是50μg至3g，100μg至2g，200μg至1g和特别优选是400μg至400mg/每次使用。

在这种制剂中的酶活性可按照在“表面活性剂”，Band7(1970)，S.125-132中的方法进行确定。其相应的以PE(蛋白酶-单位)给出。该制剂的蛋白酶活性可达到1.500.000蛋白酶单位/g配制品。

除按照本发明的酶外，按照本发明的制剂还可含有其他的组成物如表面活性剂，例如非离子的，阴离子的和/或两性离子的表面活性剂，和/或漂白剂，和/或增效助剂以及其它常规的组成物。

作为非离子表面活性剂首先是使用烷氧基化的，有益的是乙氧基化的，特别是具有8至18个C-原子的伯醇和平均1至12Mol环氧乙烷(EO)/Mol醇，在其中醇基为直链的或优选是在2-位可分出甲基支链的，以及在混合物中含有直链的和甲基支链基团，正如通常在羰基醇残基中的一样。特别是具有来源于天然的12至18个C-原子的直链醇的基的醇乙氧基化合物，例如来源于椰子-，棕榈-，牛油-或油-醇，和平均具有2至8EO/Mol醇。对优选的乙氧基化的醇而言例如包括带有3EO或4EO的C_12-14-醇，带有7EO的C_9-11-醇，带有3EO，5EO，7EO或8EO的C_13-15-醇，带有3EO，5EO或7EO的C_12-18-醇或它们的混合物，如来源于带有3EO的C_12-14-醇和带有5EO的C_12-18-醇的混合物。该所给出的乙氧基化度为统计学的中间值，其对于特殊的产品而言是可以是整数也可能是分数数值。优选的乙氧基化率会给出一限制性的均质化分布(窄范围乙氧基化物，NRE)。另外对该非离子表面活性剂而言，还可使用具有多于12EO的脂肪醇。例如具有14EO，25 EO，30 EO或40 EO的牛油醇。

另一类优选可使用的非离子型表面活性剂，其要末是单一的非离子型的表面活性剂或与其他非离子型表面活性剂结合使用，是烷氧基化的，首先是乙氧基化的或乙氧基化和丙氧基化的脂肪酸烷基酯，优选是在烷碳链上具有1至4个碳原子的，特别是脂肪酸甲基酯。

另一类对使用有利的非离子表面活性剂是烷基聚糖甙(APG)。可被采用的烷基聚糖甙满足于分子通式RO(G)z，在R中是一直链或支链的，特别是在2-位可分出甲基支链的，饱和的或不饱和的，具有8至22，首先是12至18个C-原子的脂肪族基和G为一符号，其相当于一带有5或6个C-原子的糖单位，首先是葡萄糖。该糖基化率z处于1.0至4.0间，首先是1.0至2.0间和特别是1.1至1.4间。优选是使用直链的烷基聚糖甙，也可使用在聚糖甙基中为一葡萄糖基和烷基是一n-烷基的烷基聚糖甙。

也可使用氧化胺型，例如N-椰子烷基-N，N-二甲基氧化胺和N-牛油烷基-N，N-二羟乙基氧化胺，和脂肪酸链烷醇酰胺的非离子表面活性剂。该非离子表面活性剂部分首先是不超过乙氧基化脂肪醇，特别是不超过一半。

另外适合的表面活性剂是具有通式(II)的聚羟基脂肪酸酰胺，

     R1

     I

R-CO-N-[Z]     (II)

在RCO中为一脂肪族的具有6至22个碳原子的酰基，R¹为氢，一具有1至4个碳原子的烷基-或羟烷基和[Z]是一直链的或支链的具有3至10个碳原子和3至10个羟基的多羟烷基。对该多羟基脂肪酸酰胺而言涉及已知的物质，其可通过常规的用氨，一烷基胺或一链烷醇酰胺与一还原糖的还原胺化，和然后再与一脂肪酸，一脂肪酸烷基酯或一脂肪酸酰基氯的酰化来获得。

对多羟基脂肪酸酰胺基团而言还包括通式(III)的化合物，

    R1-O-R²

     I

R-CO-N-[Z]       (III)

在R中是一直链的或支链的具有7至12个碳原子的烷基-或链烯基，R¹为一直链的，支链的或环状的烷基或一具有2至8个碳原子的芳香基残基和R²为一直链的，支链的或环状的烷基或一芳香基或一具有1至8个碳原子的烷氧基，这里优选的是C_1-4-烷基-或苯基和[Z]为一支链的多羟烷基，该烷基碳链至少被两个羟基基团取代，或烷氧基化的，首先是乙氧基化的或丙氧基化的衍生物。

优选是通过一还原糖的还原胺化来获得的，例如葡萄糖，果糖，麦芽糖，乳糖，半乳糖，甘露糖或木糖。N-烷氧基或N-芳氧基-取代化合物例如可通过脂肪酸甲酯在一醇化物催化剂的存在下转化成所期望的多羟基脂肪酸酰胺。

作为阴离子表面活性剂可使用磺酸酯或硫酸盐型的。作为磺酸酯型的表面活性剂首先为C_9-13烷基苯磺酸酯，烯烃磺酸酯，即烯烃-和羟基烷烃磺酸酯的混合物，以及二磺酸酯，例如将具有终端或内部位双键的C_12-18-单烯烃与气态的三氧化硫磺化和然后将该磺化产物进行碱性或酸性水解。适合的还有具有C_12-18-烷烃的烷烃磺酸酯，例如通过氯磺化作用或磺化氧化作用然后水解以及中和所获得的。同样还有α-硫代脂肪酸的酯(酯磺酸酯)，例如氢化椰子-，棕榈-或牛油脂肪酸的α-磺化的甲基酯是适合的。

另外合适的阴离子表面活性剂是硫酸酯化的脂肪酸甘油酯。对脂肪酸甘油酯而言可为单-，二-和三酯以及其混合物，其可通过将一单甘油与1至3Mol的脂肪酸酯化或将甘油三酯与0.3至2.0Mol的甘油交换来获得。优选的硅化的脂肪酸甘油酯是具有6至22个碳原子的饱和脂肪酸，例如己酸，辛酸，癸酸，月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸或山嵛酸的硅化产品。

作为烷(烯)烃硫酸盐优选的是碱金属的-和特别是C₁₂-C₁₈-脂肪醇的硫酸半酯的钠盐，例如来自椰油醇，牛油醇，月桂基-，肉豆蔻基-，十六烷基-，十八烷-醇或C₁₀-C₂₀-羰基醇和其各该碳链长度的仲醇的半酯。另外优选的是所述碳链长度的通过石油化学合成获的具有直链烷基的烷(烯)烃硫酸盐，其具有一与来源于油脂化学原料的化合物类似的降解性能。对洗涤技术有兴趣的是C₁₂-C₁₆-烷基硫酸盐和C₁₂-C₁₅-烷基硫酸盐以及C₁₄-C₁₅-烷基硫酸盐。2，3-烷基硫酸盐也适合于作为阴离子表面活性剂。

同样适合的是含有1至6Mol环氧乙烷乙氧基化的直链或支链C_7-21-醇，如含有平均3.5Mol环氧乙烷(EO)的2-甲基-支链化的C_9-11-醇或含有1至4EO的C_12-18-脂肪醇的硫酸单酯。由于其高发泡性其在洗涤剂中仅可少量使用，例如以最高5Gew.-％的量，通常为1至55Gew.-％。

另外适合的阴离子表面活性剂还有烷基硫代琥珀酸的盐，其也被称作硫代琥珀酸盐或硫代琥珀酸酯和该硫代琥珀酸与醇，首先是脂肪醇和特别是乙氧基化的脂肪醇的单酯或二酯。优选的硫代琥珀酸盐含有C_8-18-脂肪醇基或其混合物。特别优选的硫代琥珀酸盐含有一脂肪醇基，该基来源于乙氧基化的可用作非离子型表面活性剂的脂肪醇(叙述见上)。对此还有特别优选的有硫代琥珀酸盐，其脂肪醇-基来源于具有相应同系物分布的乙氧基化脂肪醇。同样也可使用的是烷(烯)基在碳链上具有8至18个碳原子的烷(烯)基琥珀酸或其盐。

其它的阴离子表面活性剂特别是皂。适合的有饱和脂肪酸皂，如月桂酸盐，肉豆蔻酸盐，棕榈酸盐，硬脂酸盐，氢化的芥酸盐和山嵛酸盐例如特别是天然脂肪酸，如椰子-，棕榈-或牛油酸来源的混合盐。

包括皂在内的阴离子表面活性剂可以其钠-，钾-或铵盐以及有机碱的可溶性盐，如单-，二-或三乙醇胺形式出现。首先该阴离子表面活性剂是钠-或钾盐，特别是钠盐。

在按照本发明的洗涤剂中可含有首先是5Gew.-％至50Gew.-％的该表面活性剂，特别是是8 Gew.-％至30Gew.-％，以成品洗剂计算。

按照本发明的洗剂可含有漂白剂。对漂白剂而言，在水中可放出H₂O₂的化合物，如过碳酸钠，过硼酸钠四水合物和过硼酸钠单水合物具有特别的意义。其他可使用的漂白剂例如是过氧化焦磷酸，柠檬酸盐过氧化氢以及可放出H₂O₂的过酸化的盐或过酸，如过硫酸盐以及过硫酸。可使用的还有过氧化氢水合尿素，过尿素，其具有通式H₂N-CO-NH₂·H₂O₂。特别对于用于硬表面洗涤的洗剂而言，例如机洗餐具冲洗，其更喜欢含有来源于有机漂白剂类的漂白剂，虽然原则上其也可在纺织物洗涤的洗剂中使用。典型的有机漂白剂是二酰基过氧化物，例如过氧化二苯甲酰。其他典型的有机漂白剂为过氧酸，这里作为举例的特别是烷基过氧酸和芳基过氧酸。优选的代表是过氧化苯甲酸和环取代的衍生物，例如烷基过氧化苯甲酸，也可使用过氧-α-萘甲酸和过邻苯二甲酸单镁盐，脂肪族的或脂肪族取代的过氧化硬脂酸，ε-邻苯二亚胺过氧已酸(邻苯二亚胺过氧正已酸，PAP)，o-羰基苯甲酰胺基过氧已酸，N-壬烯基酰胺基过己二酸和N-壬烯基酰胺基过琥珀酸盐，和脂肪族的和芳香族的过氧二羧酸，如1，12-二过氧基羧酸，1，9-二过氧基壬二酸，二过氧癸二酸，二过氧巴西酸，二过氧磷苯二甲酸，2-癸基二过氧丁烷-1，4-二酸，N，N-对苯二酰-二(6-氨基过已酸)。

洗剂中漂白剂的含量可为1至40Gew.-％和特别是10至20Gew.-％，这里使用过硼酸盐单水合物或过碳素酸盐是有益的。

为在60℃或低于该温度下洗涤，和特别是在洗涤准备阶段达到一改良的漂白作用，该洗剂可含有漂白活化剂。作为漂白活化剂的有效成分可使用化合物，其在过水解条件下释放出带有1至10个碳原子的脂肪族的过氧化羧酸，特别是2-4个碳原子的，和/或有时为取代的过苯甲酸。适合的是这类物质，其含有所述C-原子数的O-和/或N-酰基基团和/或有时取代的苯甲酰基基团。优选的是多元酰基化的亚烷基二胺，特别是四乙酰亚乙基二胺(TAED)，酰基化的三嗪衍生物，特别是1，5-二乙酰-2，4-二氧代六氢化-1，3，5-三嗪(DADHT)，酰基化的甘脲，特别是1，3，4，6-四乙酰甘脲(TAGU)，N-酰基酰亚胺，特别是N-壬酰-琥珀酰亚胺(NOSI)，酰基化的苯酚磺酸盐，特别是正-壬酰-或异-壬酰-氧代苯酚磺酸盐(n-或iso-NOBS)，酰基化的羟基羧酸，如三乙基-O-乙酰基柠檬酸盐(TEOC)，羧酸酐，特别是邻苯二甲酸酐，羧氨基苯甲酸酐和/或琥珀酸酐，羧酸酰胺，如N-甲基二乙酰胺，乙交酯，酰基化的多价醇，特别是三乙酸甘油酯，乙烯基二乙酸甘油酯，异丙基醋酸酯，2，5-二乙酰氧-2，5-二氢呋喃和在德国专利申请DE196 16 693和DE 196 16 767中已知的烯醇酯以及乙酰化的山梨醇和甘露糖醇以及在欧洲专利申请EP 0 525 239中述及的混合物(SORMAN)，酰基化的糖衍生物，特别是五乙酰葡萄糖(PAG)，五乙酰果糖，四乙酰木糖和八乙酰乳糖以及有时为乙酰化的，有时是N-烷基化的葡糖胺以及葡糖酸内酯，三唑以及三唑衍生物和/或颗粒状的己内酰胺和/或己内酰胺衍生物，优选是N-乙酰化的内酰胺，例如N-苯甲酰己内酰胺和N-乙酰己内酰胺，其在国际专利申请WO94/27970，WO 94/28102，WO 94/28103，WO 95/00626，WO 95/14759和WO 95/17498中已知的。来自德国专利申请DE 196 16 769已知的亲水取代的酰基乙缩醛和在德国专利申请DE 196 16 770和国际专利申请WO 95/14075中所述及的酰基内酰胺同样为优选使用。也可使用来自于德国专利申请DE 44 43 177中已知的传统漂白活化剂组合物。同样还可使用腈衍生物如氰基吡碇，四价腈(Nitrilquats)例如N-烷基氨乙酰腈(N-Alkylammoniumacetonitrile)，和/或氨基氰衍生物。优选的漂白活化剂是钠-4-(辛酰氧代)-苯磺酸盐，正-壬酰-或异-壬酰氧代苯磺酸盐(n-或iso-NOBS)，十一烷酰-氧代苯磺酸盐(UDOBS)，十二烷酰氧代苯磺酸钠(DOBS)，癸酰基氧代苯甲酸(DOBA，OBC10)和/或十二烷酰氧代苯磺酸盐(OBS 12)，以及N-甲基吗啉基-乙腈(MMA)。这种漂白活化剂通常在洗涤剂中的用量为0.01至20Gew.-％，优选是0.1至15Gew.-％，特别是1Gew.-％至10Gew.-％，以总组成计算。

对传统的漂白活化剂可增加或代替其位置含有所谓的漂白催化剂。对这类物质而言涉及增强漂白作用的过渡金属盐以及过渡金属配合物，例如Mn-，Fe-，Co-，Ru-或Mo-盐salen配合物或羰基配合物。合适的漂白催化剂还有Mn-，Fe-，Co-，Ru-，Mo-，Ti-，V-和Cu-与含氮的三角-配位体的配合物以及Co-，Fe-，Cu-和Ru-氨合配合物，这里优选在DE 197 09 284 A1中所述及的化合物。按照WO 99/63038乙酰睛-衍生物也是可以的和按照WO 99/63041与淀粉酶组合的有漂白活化作用的过渡金属配位化合物具有一增强漂白活化的效果。

按照本发明的洗剂通常含有一个或多个增效助剂，特别是沸石，硅酸盐，碳酸盐，有机的共增效助剂和-这里其使用不会产生对生态的影响-还有磷酸盐。后者特别是在用于餐具机洗的洗涤剂中优选被用作助洗剂。

这里需列举的是结晶的，层状的具有通式NaMSi_xO_2x+1·yH₂O的硅酸钠，此外M意味着钠或氢，x为一1.6至4的数字，优选是1.9至4.0和y是一0至20的数字优选的x值是2，3或4。该结晶层状的硅酸盐例如在欧洲专利申请EP 0 164 514中所描述的。优选的所述通式的结晶层状硅酸盐为其中M为钠和x为数字2或3的那些。特别优选的不仅是β-而且还有δ-二钠硅酸盐Na₂Si₂O₅·yH₂O。该类化合物例如商业上可得的标称为

(Clariant公司)。由此对

主要涉及一具有通式Na₂Si₂O₅·yH₂O的δ-二钠硅酸盐，对

主要涉及一β-二钠硅酸盐。通过与酸(例如柠檬酸或碳酸)的反应由β-二钠硅酸盐可产生Kanemit NaHSi₂O₅·yH₂O，在商业上标称为

以及

(Clariant公司)。其优点为，可使用该层状硅酸盐的化学改性物。因此例如可对该层状硅酸盐的碱性作适当的影响。掺加磷酸盐或碳酸盐的层状硅酸盐与δ-二钠硅酸盐相比改变了结晶形态，溶解得更快和与δ-二钠硅酸盐相比提高了与钙结合能力。而在专利申请DE19601063中给出了含有通式xNa₂O·ySiO₂·zP₂O₅的层状硅酸盐，具有相应的x对y的比例为0.35至0.6，x对z的比例为1.75至1200和y对z的比例为4至2800。当特别是使用细颗粒状的层状硅酸盐时，该层状硅酸盐的溶解性还可提高。也可使用含有其他组成物的结晶层状硅酸盐化合物。这里特别是含有纤维素衍生物的化合物具有一体化的作用优点和特别是在片状洗涤剂中使用时，以及含有聚羧酸盐的化合物，例如柠檬酸，以及聚合的聚羧酸盐，例如丙烯酸共聚物。

可使用的还有具有模型Na₂O：SiO₂从1：2至1：3.3，优选是从1：2至1：2.8和特别是从1：2至1：2.6的非结晶钠硅酸盐，其可延迟溶解和具有二次洗涤特性。这里该相对于传统非结晶钠硅酸盐的延迟溶解性可通过多种方式，例如通过表面活性剂处理，共混化，压实/压缩或通过过干燥来实现。按照本发明概念“非结晶”也可理解为“X-射线非结晶”。也就是说，该硅酸盐在X-射线绕射试验时无明显的像结晶物质那样典型的X-射线反射，充其量是一或多个弯曲角多倍单位宽度的散射X-射线的畸峰。当该硅酸盐颗粒在电子绕射试验中产生不明显的或甚至明显的弯曲畸峰时，甚至也可作为好的或甚至特别好的增效助剂特性。这可以这样解释，该产品具有等级10至数百纳米的微结晶范围，这里优选的值是最大至50nm和特别是最大至20nm。特别优选的是压实/压缩的非结晶硅酸盐，共混化的非结晶硅酸盐和过干燥的X-射线非结晶的硅酸盐。

一还可使用的，细结晶的，合成的和含结合水的沸石首先是沸石A和/或沸石P。作为沸石P特别优选的是沸石MAP

(Crosfield公司的商业产品)。但适合的还有沸石X以及A，X和/或P的混合物。商业上可得的和按照本发明优选使用的例如是一沸石X和沸石A(约80Gew.-％的沸石X)的共-结晶，其被CONDEA Augusta S.P.A公司以市场名VEGOBOND

销售和可由通式

nNa₂O·(1-n)K₂O·Al₂O₃·(2-2.5)SiO₂·(3.5-5.5)H₂O

描述。合适的沸石具有一平均颗粒尺寸小于10μm(体积分配；测定方法：Coulter Counter)和优选含有18至22Gew.-％，特别是20至22Gew.-％的结合水。

当然也可使用通常已知的磷酸盐作为增效助剂物质，只要使用不存在生态上的问题。在商业上大量可获得的磷酸盐中，作为特别优选的磷酸五钠-以及五钾盐(聚磷酸三钠以及-钾盐)的碱金属磷酸盐在洗涤剂工业中具有最大的意义。

这里碱金属磷酸盐是不同磷酸的碱金属(特别是钠-和钾-)-盐的总称，在其中除高分子的代表外可区分为偏磷酸(HPO₃)n和正磷酸H₃PO₄。这里该磷酸盐具有许多的优点：有作为碱的载体，防止在机械部件上形成钙盐层以及在织物中产生钙盐结痂和此外有助于洗涤效率的作用。

磷酸二氢钠，NaH₂PO₄，以二水合物(密度1.91gcm^-3，熔点60℃)和单水合物(密度1.91gcm^-3)存在。两种盐均为白色的，在水中极易溶解的粉末，其在加热时失去结晶水和在200℃变为弱酸性的磷酸二盐(二磷酸氢二钠盐，Na₂H₂P₂O₇)，在更高的温度下变为三偏磷酸钠盐(Na₃P₃O₉)和长链高分子量偏磷酸钠(见下)。NaH₂PO₄反应为酸性；可通过将磷酸与氢氧化钠调节至PH-值4.5和糊状物喷雾干燥来制备。磷酸二氢钾(一价的或一元的磷酸钾，二磷酸钾，KDP)，KH₂PO₄是一白色密度2.33gcm^-3的盐，具有一253℃的熔点[分解产生聚磷酸钾盐(KPO₃)x]和在水中易溶。

磷酸氢二钠(二元的磷酸钠盐)，Na₂HPO₄，为无色的，在水中极易溶解的结晶盐。其以无水的和带有2Mol的水(密度2.066gcm^-3，在95℃失去水)，7Mol的水(密度1.68gcm^-3，熔点48℃失去5个H₂O)和12Mol的水(密度1.52gcm^-3，熔点35℃失去5个H₂O)，在100℃时失去所有的水和在强烈加温时将转变为二磷酸盐Na₄P₂O₇。磷酸氢二钠可在酚酞指示剂存在下通过磷酸与碳酸钠溶液的中和来制备。磷酸氢二钾(二元的或二碱的磷酸钾盐)，K₂HPO₄是一非结晶的，白色盐，在水中易溶。

三钠磷酸盐，三元的磷酸钠盐，Na₃PO₄，为无色的结晶，十二水和物的三钠磷酸盐的密度为1.62gcm^-3和熔点为73-76℃(分解)，十水和物的三钠磷酸盐(相应于19-20％的P₂O₅)的熔点在100℃和无水的三钠磷酸盐(相应于39-40％的P₂O₅)的密度为2.536gcm^-3。三钠磷酸盐在水中呈碱性反应易溶和可通过将一精确的1Mol二钠磷酸盐和1Mol NaOH溶液的蒸发来制备。三钾磷酸盐(三元的或三碱的磷酸钾盐)，K₃PO₄是一白色，熔融状，颗粒状的密度为2.56gcm^-3的粉末，具有1340℃的熔点和在水中呈碱性反应易溶。例如其可通过将托马斯熔渣与碳和硫酸钾一道加热来制备。虽然价格较高，但在洗涤剂工业中相对于钠-化合物具有更易溶解性而倍受偏爱。

四钠二磷酸(焦磷酸钠盐)，Na₄P₂O₇，以无水形式(密度2.534gcm^-3，熔点988℃，也有给出880℃)和十水合物(密度1.815-1.836gcm^-3，熔点95℃时失去水)存在。这两种物质为无色的，在水中呈碱性反应的可溶性结晶。Na₄P₂O₇可通过将二钠磷酸盐加热至>200℃或通过将磷酸与碳酸钠以化学计算的比例转化和将该溶液通过喷雾脱水来制备。该十水合物与重金属盐和硬度构成物生成配合物和由此降低水中的硬度。钾二磷酸盐(焦磷酸钾盐)，K₄P₂O₇，以三水合物存在和为无色的，吸湿的具有密度2.33gcm^-3的粉末，其在水中可溶，这里1％的溶液在25℃的PH-值为10.4。

通过Na₄P₂O₇以及K₄P₂O₇的缩合可产生高分子的钠-和钾磷酸盐，人们可将其区分为环状的代表，钠-以及钾偏磷酸盐和链状形式的钠-以及钾聚磷酸盐。特别是对后者有大量的名称被使用：熔融-或灼烧磷酸盐，格雷姆盐(可溶性偏磷酸钠)，四聚偏磷酸盐和长链高分子量偏磷酸盐。所有高分子的钠-和钾磷酸盐被标称为缩合的磷酸盐。

技术上重要的五钠三磷酸盐，Na₅P₃O₁₀(钠三聚磷酸盐)，是一具有通式NaO-[P(O)(ONa)-O]n-Na(n＝3)的无水的或带有6个H₂O的结晶状的，白色，水溶性的盐。在100g水中于室温下可溶解约17g，在60℃下约20g，在100℃下约32g的结晶无水盐；将溶液两步加热至100℃后通过水解可产生约8％的正磷酸盐和15％的二磷酸盐。五钠三磷酸盐的制备可通过将磷酸与碳酸钠溶液或氢氧化钠以化学计算的比例反应和再将该溶液喷雾脱水来完成。类似于如格雷姆盐和钠二磷酸盐，五钠三磷酸盐可溶解许多不溶解的金属化合物(包括钙皂等)。五钾三磷酸盐，K₅P₃O₁₀(钾三聚磷酸盐)例如为在商业上可得的50％的溶液(>23％的P₂O₅，25％的K₂O)形式。该钾聚磷酸盐已在洗涤剂工业中被使用。另外还有钠钾三聚磷酸盐，其同样按照本发明是可使用的。例如其可通过将钠三偏磷酸盐与KOH水解：

(NaPO₃)₃+2KOH→Na₃K₂P₃O₁₀+H₂O

其按照本发明同样与钠三聚磷酸盐，钾三聚磷酸盐或其两种的混合物一样被使用；按照本发明可使用的还有钠三聚磷酸盐和钠钾三聚磷酸盐的混合物或钾三聚磷酸盐和钠钾三聚磷酸盐的混合物或钠三聚磷酸盐和钾三聚磷酸盐和钠钾三聚磷酸盐的混合物。

作为有机的共增效助剂，在按照本发明的洗涤剂中特别使用了聚羧酸盐或聚羧酸，聚合的聚羧酸盐，聚天冬氨酸，聚乙缩醛，有时还有氧化的糊精，其他的有机共增效助剂以及膦酸酯(盐)。对该材料类随后还将述及。

可使用的有机其增效助剂例如有以其钠盐形式使用的聚羧酸，这里聚羧酸应理解为这样的羧酸，其具有多个酸基团。例如柠檬酸，已二酸，琥珀酸，戊二酸，苹果酸，酒石酸，马来酸，富马酸，糖酸，氨基羧酸，次氮基三醋酸(NTA)，只要该种使用不为生态的原因所阻止，以及它们的混合物。优选的盐是多羧酸如柠檬酸，已二酸，琥珀酸，戊二酸，酒石酸，糖酸和它们的混合物的盐。

同样可使用这样的酸。其除其增效作用外还具有典型的二元成分的特性和由此在洗涤剂中起着较低的或较平缓的PH-值调整的作用，如果通过其余成分的混合所给出的PH-值不是期望的。这里特别是有益于体系和环境友好的酸如柠檬酸，醋酸，酒石酸，苹果酸，乳酸，乙醇酸，琥珀酸，戊二酸，已二酸，葡糖酸和它们任意的混合物。但也有矿物酸，特别是硫酸或碱，特别是氨-或碱性氢氧化物可作为PH-调节剂。这种调节剂在按照本发明的洗剂中含有的量优选是不超过20Gew.-％，特别是从1.2Gew.-％至17Gew.-％。

作为增效助剂合适的还有成聚合物的聚羧酸盐，例如聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸的碱金属盐，例如这样的相应分子量为500至70000g/mol的。

对于该聚合的聚羧酸盐所给出的摩尔质量而言，对本文涉及各酸的重均摩尔质量Mw，其通常可通过凝胶渗透色谱法来确定(GPC)，这里使用一UV-检测器。该测定与公开的通过所研究聚合物的结构使用特性给出实际的摩尔质量值的聚丙烯酸-标准不同。该结果明显地偏离摩尔质量结果，这里使用聚苯乙烯磺酸作为标准。该相对聚苯乙烯磺酸所测定的摩尔质量通常明显的高于本文中所给出的摩尔质量。

合适的聚合物特别是聚丙烯酸盐，优选的是具有分子量为2 000至20 000g/mol。基于其优越的溶解性，优选的是来源于该类的短碳链的聚丙烯酸盐，其摩尔质量为从2 000至10 000g/mol，特别是从3 000至5 000g/mol。

其它适合的是共聚合的聚羧酸盐，特别是这些含有甲基丙烯酸的丙烯酸和含有马来酸的丙烯酸或甲基丙烯酸。作为特别适合的是含有马来酸的丙烯酸共聚物，其含有50至90Gew.-％的丙烯酸和50至10Gew.-％的马来酸。其相应的分子量，以游离酸为计，通常为2 000至70 000g/mol，优选是20 000至50 000g/mol和特别是30 000至40 000g/mol。该(共)聚合的聚羧酸盐即可使用粉末也可使用水状的溶液。洗剂中(共)聚合的聚羧酸盐含量可为0.5至20Gew.-％，特别是1至10Gew.-％。

为改善其水溶性，该聚合物还可含有作为单体的烯丙基磺酸，例如烯丙氧基苯磺酸和甲基烯丙基磺酸。

特别优选的还是生物学可降解的具有两个以上不同单体单位的聚合物，例如这作为单体的是丙烯酸和马来酸的盐以及乙烯基醇或乙烯基醇衍生物或作为单体的是丙烯酸和2-烷基烯丙基磺酸的盐以及糖-衍生物。

其它优选的共聚物是这类物质作为单体，优选是丙烯醛和丙烯酸/丙烯酸盐以及丙烯醛和乙烯基乙酸盐。

同样作为其他优选的增效助剂有聚合的氨基二羧酸，其盐或其前体物质。特别优选的是聚天冬氨酸以及其盐或衍生物。

其它适合的增效助剂物质是聚乙缩醛，其可通过将二醛与含有5至7个C-原子和至少3个羟基的多元醇羧酸转换反应来获得。优选的聚乙缩醛为获自于二醛的如乙二醛，戊二醛，对苯二醛以及其混合物和获自于多元醇羧酸的如葡糖酸和/或葡庚糖酸。

其它适合的有机增效助剂是糊精，例如通过淀粉的部分水解来获得的碳水化合物的低聚物以及聚合物。该水解可按照常规的，例如酸或酶催化的方法来进行。首先涉及具有中等摩尔质量范围从400至500000g/mol的水解产物。这里优选的是具有一葡萄糖-当量(DE)的范围为0.5至40，特别是从2至30的聚糖，这里DE是一与葡萄糖相比普遍使用的聚糖还原作用的计量单位，葡萄糖的DE为100。可使用的即有具有DE在3和20间的麦芽糖糊精和具有DE在20和37间的干燥葡萄糖浆也有所谓的具有更高摩尔质量在2 000至30 000g/mol的黄糊精和白糊精。

对该种糊精的氧化衍生物而言涉及其与氧化剂的反应产物，该氧化剂至少可将糖环的一个醇基团氧化为羧酸基团。对于按照本发明的洗剂特别优选的有机增效助剂是来自于EP 472 042，WO 97/25399和EP 755 944的氧化的淀粉，以及其衍生物。

氧化丁二酸氢盐和丁二酸氢盐的其他衍生物，首先是乙烯基二胺丁二酸盐，也是其它适合的共增效助剂。对此优选使用在其分子上含有钠-或镁盐的乙烯基二胺-N，N’-丁二酸氢盐(EDDS)。另外优选的是甘油丁二酸氢盐和甘油三丁二酸盐。在沸石-，碳酸盐-和/或含硅酸盐的配方中适合的使用量在3和15Gew.-％间。

其他可使用的共增效助剂例如是乙酰化的羟基羧酸以及其盐，其有时也可是内酯和其至少含有4个碳原子和至少一个羟基以及最多两个酸基团。

另一具有共增效助剂特性的物质类别为磷酸。这里特别涉及羟基烷烃-以及氨基烷烃磷酸。作为共增效助剂在羟基烷基磷酸中1-羟基乙基-1，1-二磷酸(HEDP)具有特别的意义。其首先是以钠盐来使用的，这里可将中性的二钠盐和碱性的(PH 9)四钠盐反应。作为氨基烷烃磷酸首先是乙烯基二胺四亚甲基磷酸(EDTMP)，二乙烯基三胺五亚甲基磷酸(DTPMP)以及其更高的同系物。其首先使用的是中性反应的钠盐，例如EDTMP的正己烷钠盐以及DTPMP的七-和八钠盐。这里作为增效助剂优选使用来源于磷酸类的HEDP。此外该氨基烷基磷酸具有明显的重金属结合性能。特别是当洗剂中含有漂白剂时，优选使用氨基烷基磷酸盐，特别是DTPMP，或所述磷酸盐的混合物。

除此之外所有具有可与碱土金属离子结合成配合物的化合物均可作为共增效助剂。

在按照本发明的洗剂中有时可含有最高至90Gew.-％量的增效助剂物质。优选是含有最高75Gew.-％的量。特别是在按照本发明的用于硬表面洗涤，特别是餐具机洗的洗剂中，增效助剂物质含量为5Gew.-％至88Gew.-％，这里在该洗剂中首先是不使用水不溶解的增效助剂材料。在一按照本发明用于特殊餐具机洗的洗剂的优选的实施实例中，含有20Gew.-％至40Gew.-％的水溶性增效助剂，特别是碱金属柠檬酸盐，5Gew.-％至15Gew.-％的碱金属碳酸盐和20Gew.-％至40Gew.-％的碱金属二硅酸盐。

在液体至以胶状洗涤剂组成中使用的溶剂，例如可为来源于一元或多元醇，链烷醇胺或乙二醇醚类的，只要其在给定的浓度范围内与水是可溶的即可。首先选择的溶剂是乙醇，正-或异-丙醇，丁醇，乙烯基乙二醇甲醚，乙烯基乙二醇乙醚，乙烯基乙二醇丙醚，乙烯基乙二醇单-正-丁醚，二乙烯基乙二醇-甲醚，二乙烯基乙二醇乙醚，丙烯基乙二醇甲-，乙或丙-醚，二丙烯基乙二醇单甲-或乙醚，二-异丙基乙二醇单甲-或乙醚，甲氧基-，乙氧基-或丁氧基三甘醇，1-丁氧基乙氧基-2-丙醇，3-甲基-3-甲氧基丁醇，丙烯基-乙二醇-t-丁醚以及这些溶剂的混合物。

在按照本发明的液体至以胶状洗涤剂中，溶剂可使用的量为0.1至20Gew.-％间，优选是低于15Gew.-％和特别是低于10Gew.-％。

为调整粘度，按照本发明的组分可含有一或多个增稠剂，以及增稠体系。该高分子材料，也被称作浸胀剂，大都可吸收液体和由此被浸胀，以最终转变成粘稠的或胶体的溶液。

适合的增稠剂是无机的或聚合的有机化合物。属于无机化合物增稠剂的例如有聚硅酸，陶土矿物如蒙脱土，沸石，硅酸和膨润土。有机的增稠剂可为来源于天然的聚合物，天然变异的聚合物和完全合成的聚合物。天然来源的聚合物例如是琼脂，角叉菜，黄蓍胶，阿拉伯胶，藻酸盐，果胶，聚糖，瓜尔胶粉，角豆树籽仁粉，淀粉，糊精，明胶和酪蛋白。作为增稠剂使用的天然变异的聚合物首先是来源于变性淀粉和纤维素类的。例如这里有所谓的羧甲基纤维素和其他纤维素醚，羟基乙基-和丙基纤维素以及角豆树籽仁粉醚。完全合成的增稠剂是聚合物如聚丙酰-和聚甲基丙酰-化合物，乙烯基聚合物，聚羧酸，聚醚，聚亚胺，聚酰胺和聚氨酯。

该增稠剂的用量可为最高5Gew.-％，优选是从0.05至2Gew.-％和特别优选是从0.1至1.5Gew.-％的，以成品组成计算。

按照本发明的洗涤剂有时可含有作为其他组成物的配合物形成剂，电解质和其他的助剂如外观增白剂，防再污染剂，银腐蚀抑制剂，色转移抑制剂，泡沫抑制剂，磨蚀材料，色素-和/或香精材料，以及微生物有效成分和/或UV-吸收剂。

按照本发明的纺织物洗涤剂可含有作为外观增白剂的二胺基二苯乙烯二磺酸的衍生物以及其碱金属盐。适合的例如有4，4’-双(2-苯胺基-4-吗啉代-1，3，5-三丫嗪基-6-氨基)二苯乙烯-2，2’-二磺酸或类似构成的化合物，其在吗啉代-基团上可含有一二乙醇胺基基团，甲基氨基基团，苯胺基基团或2-甲氧基乙基氨基基团。另外增白剂可为取代的二苯基苯乙烯基型的，例如4，4’-双(2-硫代苯乙烯基)-二苯基，4，4’-双(4-氯-3-硫代苯乙烯基)-二苯基，或4-(4-氯苯乙烯基)-4′-(2-硫代苯乙烷基)-二苯基的碱性盐。也可使用所述外观增白剂的混合物。

防再污染剂的任务是将从织物纤维中溶解的污物保持分散于漂浮物中。这里适合的水溶性的胶体多方有机性质的，例如淀粉，胶，明胶，淀粉或纤维素的醚羧酸或醚磺酸的盐，或淀粉或纤维素的酸性硫酸酯的盐。含有水溶性的，酸性基团的聚酰胺也适合于该目的。另外也可采用其他如上所述的淀粉衍生物，例如醛淀粉。优选的是纤维素醚，如羧甲基纤维素(Na-盐)，甲基纤维素，羟基烷基纤维素和混合醚，如羟甲基乙基纤维素，羟甲基丙基纤维素，甲基羧甲基纤维素和其混合物，例如用量为0.1至5Gew.-％，以洗剂计。

为达到银腐蚀抑制剂的作用，在按照本发明的用于餐具的洗涤剂中使用了银腐蚀抑制剂。其是目前技术水平已知的，例如苯三吡咯，氯化铁(III)或CoSO₄。例如在欧洲专利EP 0 736 084 B1中已知的，对于与酶共同的应用而言特别适合的银腐蚀抑制剂是锰-，钛-，锆-，铪_-，钒-，钴-或铈盐和/或-配合物，在其中该所述的金属以氧化段II，III，IV，V和VI之一存在。例如该种化合物为MnSO₄，V₂O₅，V₂O₅，VO₂，TiOSO₄，K₂TiF₆，K₂ZrF₆，Co(NO₃)₂，Co(NO₃)₃，以及其混合物。

“污垢-去除”-有效成分或“污垢-相斥剂”大多是聚合物，其会在洗涤剂的应用中使洗涤纤维产生污物排斥的特性和/或支持其余洗涤剂成分产生使污物分离的能力。一可比较的效果也可在对硬表面洗涤的应用中被观察到。

特别有效的和长期以来已知的污垢-去除-有效成分是含有二羧酸-，亚烃基乙二醇-和聚亚烃基乙二醇单位的共聚酯。例如对此是来源于聚乙烯基对苯二酸酯和聚氧乙烯基乙二醇(DT 16 17 141，以及DT 2200 911)的共聚物或混合聚合物。在德国公开说明书DT 22 53 063中述及酸性的洗剂，其含有一来自于二元羧酸和一亚烃基-或环亚烃基聚乙二醇的共聚物。在德国专利说明书DE28 57 292和DE 33 24 258和欧洲专利说明书EP 0 253 567中叙述了来源于乙烯基对苯二酸酯和聚环氧乙烷-对苯二酸酯的聚合物和其在洗涤剂中的应用。欧洲专利EP066 944涉及含有一来源于乙二醇，聚乙二醇，芳香族的二羧酸和磺化芳香族的二羧酸以特定摩尔比例的共聚物的洗剂。在欧洲专利EP 0185 427中已知含有乙烯基-和/或丙烯基-对苯二酸酯-和聚环氧乙烷-对苯二酸酯-单位的甲基-或乙基基团-终端封闭的聚酯和含有该种污垢-去除-聚合物的洗涤剂。欧洲专利EP 0 241 984涉及一聚酯，其除了氧乙烯基-基团和对苯二酸单位外还含有取代的乙烯基单位以及甘油单位。由欧洲专利EP 0 241 985中已知聚酯，其除氧乙烯基-基团和对苯二酸单位外还含有1，2-丙烯基-，1，2-丁烯基-，和/或3-甲氧基-1，2-丙烯基基团以及甘油单位，和所具有的C₁-至C₄-烷基基团为终端基封闭的。在欧洲专利EP 0 272 033中，已知至少含有聚-丙烯基对苯二酸酯-和聚氧乙烯基对苯二酸酯单位通过C_1-4-烷基-或酰基终端基团封闭的聚酯。欧洲专利EP 02 749 07述及磺化乙基终端基团封闭的含对苯二酸酯的污垢-去除-聚酯。按照欧洲专利申请EP 0 357 280通过不饱和封端基团的磺化制备了含有对苯二酸酯-，亚烃基乙二醇-和聚-C_2-4-乙二醇-单位的污垢-去除-聚酯。国际专利申请WO 95/32232涉及酸性的，芳香族的污物分离能力的聚酯。在国际专利申请WO 97/31085中，已知具有多种功能单位的棉花材料的非聚合的污垢-相斥剂-有效成分：第一个单位，其例如可为阳离子的，通过静电的相互作用产生在棉花表面上的吸附，第二个单位，其产生疏水的，起着在水/棉花-界面上保持有效成分的作用。

对于在按照本发明的织物洗涤剂中可使用的色转移抑制剂而言，特别涉及聚乙烯基吡硌烷酮，聚乙烯基咪唑，聚合的N-氧化物如聚-(乙烯基吡啶-N-氧化物)和乙烯基吡硌烷酮与乙烯基咪唑的共聚物。

对于机械洗涤方法而言在洗剂中加入泡沫抑制剂是有益的。作为泡沫抑制剂例如适合的有天然或合成的大部分为C_18-24-脂肪酸的皂。适合的非表面活性剂类的泡沫抑制剂例如是有机聚硅氧烷和其与细粉状的，有时是硅烷化的硅酸的混合物以及石蜡，蜡，微结晶蜡和他们与硅烷化的硅酸或二硬脂基亚乙基二酰胺的混合物。不同泡沫抑制剂的混合使用也具有优点，例如来自于硅酮，石蜡或蜡的这些。首先是将泡沫抑制剂，特别是含有硅酮-和/或石蜡的泡沫抑制剂，与成粒的，在水中可溶解的以及可分散的载体物相结合。这里特别优选的是石蜡和二硬脂基亚乙基二酰胺的混合物。

除此之外，按照本发明的用于硬表面的洗涤剂还可含有磨蚀作用的，特别是来自于包括石英粉，木粉，合成材料粉，白垩粉和微玻璃球以及其混合物的成分。在按照本发明的洗涤剂中所含有的磨蚀材料优选是不超过20Gew.-％，特别是从5Gew.-％至15Gew.-％。

在洗涤剂中加入色素-和香料，以改善产品的美感印象和为消费者提供除洗涤效率外的一可见和可感的“典型的和不可混淆的”产品。作为香精油以及香料可使用单一的有嗅味的化合物，例如合成的酯，醚，醛，酮，醇和碳氢化合物类的产品。酯类的嗅化合物例如有苄基醋酸酯，苯氧基乙基异丁酸酯，p-叔-丁基环己基醋酸酯，乙酸里哪酯，二甲基苄基-甲基醋酸酯(carbinylacetat)，苯基乙基醋酸酯，苯甲酸里哪酯，苄基甲酸酯，乙基甲基苯基-甘油酯，烯丙基环己基丙酸酯，苯乙烯基烯丙基丙酸酯和苄基水扬酸酯。对于醚而言例如有苄基乙基醚，对醛而言例如有链烷状的具有8-18个C-原子的柠檬醛，香茅醛，香茅基氧化次乙基醛，兔耳草醛(Cyclamenaldehyd)，羟基香茅醛，百合醛(Lilial)和Bourgeonal，对酮而言例如有Jonone，α-异甲基紫罗酮和甲基-柏木酮，对醇而言是茴香脑，香茅醇，丁子香酚，香叶醇，里哪醇，苯基乙基醇和萜品醇，对碳水化合物而言主要包括萜烯如苎烯和蒎烯。但偏爱的是采用不同嗅味物的混合物，使其产生一适合的香味。香精油可为天然获得的嗅味物的混合物，如来自于植物来源的，例如松-，柠檬-，茉莉-，绿叶-，玫瑰-或衣兰油。同样适合的有麝香葡萄，洋苏叶油，甘菊油，丁香油，滇荆芥油，薄荷油，樟叶油，椴花油，刺柏果油，岩兰油，香油，古蓬香酯油和岩蔷薇油以及橙油，橙花油，橙皮油和檀香油。通常在洗涤剂中色素的含量为小于0.01Gew.-％，而香料最高可为总材料的2Gew.-％。

香料可直接加入到洗涤剂中进行加工，但将香料先加到载体上是有益的，其可加强香精在洗涤物上的粘附性和由此通过缓慢的香味释放产生长期持续的香味，特别是对所处理的纺织物而言。作为这样的载体材料而言例如是环化糊精，这里该环化糊精-香精-复合物还可用其他的辅助材料进行覆层。另一优选的香料载体是所述的沸石X，其本身或与表面活性剂一道还可吸收香料。优选这里的洗涤剂含有所述的沸石和首先至少已被沸石部分吸收的香料。

优选的色素，其对专业人员而言选择并不困难，应对于洗剂中的组成物和光有高储藏稳定性和不敏感性，以及没有显著直接上染性，对于纺织物纤维不会发生染色。

对抵御微生物而言，洗涤剂可含有抗微生物的有效成分。这里人们按照抗微生物作用的广谱和作用方式将其区分为抑制细菌和杀菌的，抑制真菌和杀真菌的。该类的重要物质例如是亚苄基毒芹属氯化物，烷基芳基磺酸酯，卤代苯酚和苯酚醋酸汞。在按照本发明的说明中，抗微生物的作用和抗微生物的有效成分的概念为专业术语，其例如在K.H.Wallhaeusser的“杀菌，消毒实践-保存：病原菌识别-工业卫生学(Praxis der Sterilisation，Desinfektion-Konvervierung：Keimidentifizierung-Betriebshypiene)”(第5版-Stuttgart；New York：Thieme，1995)中有描述，这里所有述及的抗微生物作用的物质均可使用。适合的抗微生物的有效成分首先是选自于醇，胺，醛，抗微生物的酸以及其盐，羧酸酯，酸酰胺，苯酚，苯酚衍生物，联苯，联苯烷烃，尿素衍生物，氧-氮-缩醛以及-甲缩醛(formale)，苄脒，异噻唑啉，邻苯二甲酰亚胺衍生物，吡啶衍生物，抗微生物表面活性化合物。胍，抗微生物的两性化合物，喹啉，1，2-二溴-2，4-二氰基丁烷，碘代-2-丙基-丁基-氨基甲酸酯，碘，碘递体，过氧化合物，卤素化合物以及上述物的任意混合物。

这里抗微生物的有效成分还可选择乙醇，正丙醇，异丙醇，1，3-丁二醇，苯氧基乙醇，1，2-丙二醇，甘油，十一碳烯酸，苯甲酸，水杨酸，二水合醋酸，邻-苯基苯酚，N-甲基吗啉-乙腈(MMA)，2-苄基-4氯代苯酚，2，2’-亚甲基-双-(6-溴-4-氯苯酚)，4，4’-二氯-2’-羟基二苯基醚(Dichlosan)，2，4，4’-三氯-2’-羟基二苯基醚(Trichlosan)，氯已糖二精(Chlorhexidin)，N-(4-氯苯基)-N-(3，4-二氯苯基)-脲，N，N’-(1，10-二癸烷基-二-1-吡啶基-4-内嗡盐)-双-(1-辛胺)-二氢氯化物，N，N-双-(4氯苯基)-3，12-二亚胺基-2，4，11，13-四氮杂-四癸烷二酰亚胺酰胺，葡糖鱼精蛋白，抗微生物的表面活性季铵化化合物，胍以及二-和多胍，例如1，6-双-(2-乙基已基-二胍基-己烷)-二氢氯化物，1，6-二-(N₁，N₁’-苯基二胍基-N₅，N₅’)-己烷-四氢氯化物，1，6-二-(N₁，N₁’-苯基-N₁，N₁’-甲基二胍基-N₅，N₅’)-己烷-二氢氯化物，1，6-二-(N₁，N₁’-2，6-二氯苯基二胍基-N₅，N₅’)-己烷-二氢氯化物，1，6-二-[N₁，N₁’-贝塔-(p-甲氧基苯基)-二胍基-N₅，N₅’]-己烷-二氢氯化物，1，6-二-(N₁，N₁’-阿尔法-甲基-贝塔-甲基二胍基-N₅，N₅’)-己烷-二氢氯化物，1，6-二-(N₁，N₁’-p-硝基苯基二胍基-N₅，N₅’)-己烷-二氢氯化物，欧米伽：欧米伽-二-(N₁，N₁’-苯基二胍基-N₅，N₅’)-二-正-丙基醚-二氢氯化物，欧米伽：欧米伽-二-(N₁，N₁’-p-氯苯基二胍基-N₅，N₅’)-二-正-丙基醚-四氢氯化物，1，6-二-(N₁，N₁’-2，4-二氯苯基二胍基-N₅，N₅’)-己烷-四氢氯化物，1，6-二-(N₁，N₁’-p-甲基苯基二胍基-N₅，N₅’)-己烷-二氢氯化物，1，6-二-(N₁，N₁’-2，4，5-三氯苯基二胍基-N₅，N₅’)-己烷-四氢氯化物，1，6-二-[N₁，N₁’-阿尔法-(p-氯苯基)乙基二胍基-N₅，N₅’]-己烷-二氢氯化物，欧米伽：欧米伽-二-(N₁，N₁’-p-氯苯基二胍基-N₅，N₅’)m-二甲苯-二氢氯化物，1，12-二-(N₁，N₁’-p-氯苯基二胍基-N₅，N₅’)-十二烷-二氢氯化物，1，10-二-(N₁，N₁’-苯基二胍基-N₅，N₅’)-癸烷-四氢氯化物，1，12-二-(N₁，N₁’-苯基二胍基-N₅，N₅’)-十二烷-四氢氯化物，1，6-二-(N₁，N₁’-o-氯苯基二胍基-N₅，N₅’)-己烷-二氢氯化物，1，6-二-(N₁，N₁’-o-氯苯基二胍基-N₅，N₅’)-己烷-四氢氯化物，乙烯基-二-(1-甲苯基双胍)，乙烯基-二-(p-甲苯基双胍)，乙烯基-二-(3，5-二甲基苯基双胍)，乙烯基-二-(p-叔-戊基苯基双胍)，乙烯基-二-(壬基苯基双胍)，乙烯基-二-(苯基双胍)，乙烯基-二-(N-丁基苯基双胍)，乙烯基-二-(2，5-叔-二乙氧基苯基双胍)，乙烯基-二-(2，4-二甲基苯基双胍)，乙烯基-二-(o-二苯基双胍)，乙烯基-二-(混合的戊基萘基双胍)，N-丁基-三甲基-双-(苯基双胍)和相应的盐如醋酸盐，葡糖酸盐，氢氯酸盐，氢溴酸盐，柠檬酸盐，亚硫酸氢盐，氟化物，聚马来酸盐，N-椰子烷基肌氨酸盐，亚磷酸盐，富马酸盐，乙烯基二胺四醋酸盐，亚胺基二醋酸盐，肉桂酸盐，硫代氰酸盐，精氨酸盐，苯四酸盐，四羧基丁酸盐，苯甲酸盐，戊二酸盐，单氟磷酸盐，全氟丙酸盐以及它们的任意混合物。另外适合的还有卤化的混合二甲苯-和甲酚衍生物，如p-氯间甲酚或p-氯-间-二甲苯，以及天然植物来源(例如调味品或草药)，动物来源以及微生物来源的抗微生物的有效成分。这里首先可使用抗微生物作用的表面活性季铵化的化合物，一天然植物来源和/或动物来源的抗微生物的有效成分，非常优选的至少是一来源于微生物的抗微生物的有效成分，包括咖啡因，可可碱和茶碱以及醚化的油如丁子香酚，百里酚和香叶醇，和/或至少一天然的动物来源的抗微生物的有效成分，包括酶如牛奶蛋白，溶菌酶和乳过氧化物酶，和/或至少一含有铵-，锍-，磷嗡-，碘嗡或砷嗡基团的抗微生物作用的表面活性季铵化的化合物，过氧化化合物和氯化合物。也可使用生物来源的物质，所谓的抑菌剂。

作为抗微生物的有效成分适合的季铵化合物(QAV)具有通式(R¹)(R²)(R³)(R⁴)N⁺X^-，在R¹至R⁴中具有相同的或不同的C₁-C₂₂-烷基，C₇-C₂₈-芳烷基或杂环基，这里有两个或当具有一芳香族的结合如吡啶时甚至三个基团与杂环上的氮原子结合，例如-吡啶鎓化合物或-咪唑鎓化合物，和X^-为卤化物离子，硫酸盐离子，羟离子或类似的阴离子。对一最佳的抗微生物的有效成分而言，首先至少基团中的一个具有一8至18的碳链长度，特别是12至16的。

QAV可通过将三价的胺与烷基化剂反应，例如甲基氯化物，苯基氯化物，二甲基硫酸盐，十二烷基溴化物，也可是环氧乙烷来制备。该三价的胺与一长碳链烷基-和两个甲基的烷基化作用特别容易完成，三价的胺与两个长碳链基和一个甲基的季铵化作用也可在甲基氯化物的帮助下在一温和的条件下来进行。具有三个长烷基-或羟基-取代的烷基-的胺活性较小优选是与二甲基硫酸盐进行季铵化。

适合的QAV例如是亚苄基毒芹属氯化物(N-烷基-N，N’-二甲基-苄基-氯化铵，CAS No.8001-54-5)，Benzalkon B(m，p-二氯苄基-二甲基-C12-烷基氯化铵，CAS No.58390-78-6)，苯基氧嗡氯化物(苯基-十二烷基-双-(2-羟基乙基)-氯化铵，Cetrimoniumbromid(N-十六烷基-N，N’-三甲基-溴化铵，CAS No.57-09-0)，Benzetoniumchlorid(N，N-二甲基-N-[2-[2-[p-(1，1，3，3-四甲基丁基)-苯氧基]乙氧基]乙基]-苄基氯化铵，CAS No.121-54-0)，二烷基二甲基氯化铵如二-正-癸基-二甲基-氯化铵(CAS No.7173-51-5-5)，二癸基二-甲基溴化铵(CAS No.2390-68-3)，二辛基-二甲基-氯化铵，1-十六烷基吡啶嗡氯化物(CASNo.123-03-5)和噻唑啉碘化物(CAS No.15764-48-1)以及其混合物。特别优选的QAV是具有C₈-C₁₈-烷基的亚苄基毒芹属氯化物，特别是C₁₂-C₁₄-烷基-苄基-二甲基-氯化铵。

亚苄基毒芹属卤化物和/或取代的亚苄基毒芹属卤化物例如可为商业上作为 ex Lonza，

 ex Mason， exWitco/和

 ex Lonza，以及

 ex Lonza可得的。其它商业上可得的抗微生物的有效成分是N-(3-氯烯丙基)-六氯化铵如

和

 ex Dow，Benzetoniumchlorid如

1622 ex Rohm & Haas，甲基Benzetoniumchlorid如10X ex Rohm & Haas，十六烷基吡啶嗡氯化物如Cepacolchlorid exMerrell Labs。

该抗微生物的有效成分的使用量为从0.0001 Gew.-％至1 Gew.-％，优选是从0.001 Gew.-％至0.8Gew.-％，特别优选是从0.005 Gew.-％至0.3 Gew.-％和特别是从0.01 Gew.-％至0.2 Gew.-％。

洗剂可含有UV-吸收剂，其可依附到所处理的纺织物上和改善纤维的光照耐久性和/或其他配方成分的光照耐久性。对UV-吸收剂而言可使用有机物质(光保护滤光器)，其具有吸收紫外射线的作用和可将所吸收的能量以较长波幅辐射，例如以热重新放出。

具有所希望特性的化合物例如是可通过无辐射降活化的有效的在2-和/或4-位上取代有苯酮的化合物和衍生物。另外适合的有取代的苯并三唑，在3-位上苯取代的丙烯酸酯(肉桂酸衍生物，有时在2-位上有氰基)，水扬酸酯，有机的Ni-配合物以及天然物质如7-羟基香豆素和内生的尿刊酸。特别有意义的是联苯-和首先是二苯乙烯衍生物例如在EP 0728749 A中述及的和商业上作为

FD或

FR ex Ciba。作为所谓的UV-B-吸收剂：3-亚苄基-莰酮-2-以及3-亚苄基降莰酮-2和其衍生物，例如3-(4-甲基亚苄基)莰酮-2，如在EP0693471 B1中所述及的；4-氨基苯甲酸衍生物，首先是4-(二甲基氨基)苯甲酸-2-乙基已基酯，4-(二甲基氨基)苯甲酸-2-辛基酯和4-(二甲基氨基)苯甲酸-2-戊基酯；肉桂酸的酯，首先是4-甲氧基肉桂酸-2-乙基已基酯，4-甲氧基肉桂酸丙酯，4-甲氧基肉桂酸异戊酯，2-氰基-3，3-苯基肉桂酸-2-乙基已基酯(Octocrylene)；水杨酸的酯，首先是水杨酸-2-乙基已基酯，水杨酸-4-异丙基苄基酯，水杨酸薄荷基酯；苯酮的衍生物，首先是2-羟基-4-甲氧基苯酮，2-羟基-4-甲氧基-4’-甲基苯酮，2，2’-二羟基-4-甲氧基苯酮；亚苄基丙二酸的酯，首先是4-甲氧基亚苄基丙二酸二-2-乙基己基酯；三嗪衍生物，例如2，4，6-三苯胺基-(p-碳-2’-乙基-1’-己氧基)-1，3，5-三嗪和辛基三嗪酮，如在EP 0818450 A1中所述及的或二辛基丁酰胺基三嗪酮

HEB)；丙烷-1，3-二酮；酮基三芳癸烷(5.2.1.0)-衍生物，如在EP 0694521 B1中所述及的。其它适合的还有2-苯基苯并咪唑-5-磺酸和其碱金属-，碱土金属-，铵-，烷基铵-，链烷醇铵-和葡糖铵盐；苯酮的磺酸盐生物，首先是2-羟基-4-甲氧基苯酮-5-磺酸和它们的盐；3-苄基亚基莰酮-2的磺酸衍生物，例如4-(2-氧代-3-亚冰片基甲基)苯酚-磺酸和2-甲基-5-(2-氧代-3-亚冰片基)磺酸和它们的盐。

作为典型的UV-A-滤光器特别合适的是苯甲酰基甲烷的衍生物，例如1-(4’-叔丁基苯基)-3-(4’-甲氧基苯基)丙烷-1，3-二酮，4-叔丁基-4’-甲氧基二苯甲酰基甲烷(Parsol 1789)，1-苯基-3-(4’-异丙基苯基)-丙烷-1，3-二酮以及烯胺化合物，如在DE 19712033 A1(BASF)中所述的。该UV-A和UV-B-滤光器当然也可使用混合物。除所述及的可溶性物体外，还可使用非溶解的光保护颜料，即细分散的，首先是毫微克量级的金属氧化物以及盐。合适金属氧化物的例子特别是氧化锌和氧化钛和此外是铁，锆，硅，锰，铝和铈的氧化物以及其混合物。作为盐可使用硅酸盐(滑石)，硫酸钡或硬脂酸锌。该氧化物和盐可以颜料的形式在皮肤养护和皮肤保护的乳液中和装饰化妆品中使用。这里该颗粒的平均粒径应小于100nm，首先是在5和50nm间和特别是处于15和30nm间。可具有球状的外形，但也可使用椭圆的或其他偏离球形形状的颗粒。还可对该颜料进行表面处理，也就是说进行亲水或疏水处理。典型的例子是包衣的二氧化钛，例如二氧化钛T805(Degussa)或 T2000(Merck)：对此作为疏水的包衣剂优选是硅酮和特别优选是三烷氧基辛基硅烷或Simethicone。首先是使用可微生物降解的氧化锌。其它适合的UV-光保护滤光器可见P.Finkel在SOEFW-Journal122(1996)，S.543中所述的。

该UV-吸收剂通常的使用量是从0.01Gew.-％至5Gew.-％，首先是从0.03Gew.-％至1Gew.-％。

对于洗涤剂常规的组成物而言，通常也包括洗涤活性的酶。同时生产的洗涤剂，其特征是添加了按照本发明蛋白质以外的其他酶，优选的按照本发明的实施方法，属于此的例如包括其他的蛋白酶，但也包括氧化还原酶，角质酶，酯酶和/或半纤维素酶，和特别优选的是脂肪酶，淀粉酶，纤维素酶和/或β-葡糖酶。

酶如蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶或纤维素酶几十年来已被用作为洗涤剂的活性成分。其对所述及洗剂的洗涤效果的贡献是通过蛋白酶对含蛋白污物的分解，淀粉酶对含淀粉污物的分解和脂肪酶的脂肪分解活性来完成的。纤维素酶通过超出其清除污物，即一次洗涤效率之外，特别是其在洗涤剂中二次洗涤效率的贡献和其对织物的纤维作用而优选在洗涤剂中被使用。各种水解产物将被其他的洗涤剂-成分侵蚀，溶解，乳化或悬浮或由于其高溶解性与洗涤漂浮物被冲洗出去，由此在合适的条件下在酶和其它成分间产生协同效果。

蛋白酶对天然纤维，特别是对棉花或丝绸的作用与通过纤维素酶对洗剂的二次洗涤效果贡献有可比的效果。通过其对这类织物表面结构的作用对材料产生一光滑的影响和由此不发生洗涤物的起皱。

其他的酶通过其特殊的酶催化作用可拓宽相应洗剂的洗涤效果。对此例如包括半纤维素酶例如β-葡糖酶(WO 99/06515 A1和WO99/06516 A1)，氧化还原酶例如漆酶(WO 00/39306 A2)或果胶-可溶的酶(WO 00/42145 A1)，其可在特殊的洗涤剂中加以应用。

对在按照本发明的洗剂中的应用而言，首先是获自于微生物有机体，如细菌或真菌，的酶。其可按照已知的方法通过对合适有机体的发酵来制备，例如在德国公开专利文件DE 1940488，和DE 2121397，US-美国专利文件US 3623957，US 4264738，欧洲专利申请EP 006638A2以及国际专利申请WO 91/02792 A1中所述的。

一按照本发明的蛋白质和/或其他的含蛋白物特别是可在储存期间借助稳定剂以及通过物理的影响，来保护使不产生变性，蜕变或失活，氧化或蛋白水解分解。

一组稳定剂是可逆的蛋白酶抑制剂，其当洗剂在洗涤漂浮物中稀释时会解体。苄脒-氯化氢和Leupeptin是为此目的产生的。通常可使用硼砂，硼酸，硼酸(Boronsaeuren)或其盐或酯，首先是具有芳香族基团的衍生物，如按照WO 95/12655 A1邻位-取代的，按照WO92/19707 A1间位-取代的和按照专利US 5972873对位-取代的苯基硼酸，以及其盐或酯。在专利申请WO 98/13460 A1和EP 583534 B1中公开了肽醛，即带有被还原的C-末端(Terminus)的寡肽，由2-50个单体构成，用于洗涤剂蛋白酶的可逆抑制作用。对肽基可逆的蛋白酶抑制剂而言还包括卵类粘蛋白(WO 93/00418 A1)。例如按照专利申请WO 00/01826 A2公开了在含蛋白酶的洗剂中用于枯草杆菌蛋白酶的特殊的，可逆的肽-抑制剂，和在WO 00/01831 A2中公开了相应的来自于蛋白酶和抑制剂的合并蛋白质。

其他的酶稳定剂是氨基醇如一-，二，三乙醇-和-丙醇胺和它们的混合物，脂肪族的羧酸可至C₁₂，例如在专利申请EP 378261 B1和WO97/05227 A1中已知的，如琥珀酸，其他的二羧酸或所述酸的盐。按照专利申请DE 19650537 A1，为该目的公开了终端基团封闭的脂肪酸酰胺烷氧基化物。特定的作为增效助剂使用的有机酸可，如在WO97/18287 A1中所公开的，作为补充对所含有的酶起稳定作用。

低分子的脂肪族醇，首先是多元醇，例如甘油，乙二醇，丙二醇或山梨糖醇是其他通常适用的酶稳定剂。同样还使用钙盐，例如醋酸钙或在专利文件EP 028865 B2中为此目的公开的甲酸钙，和按照EP378262 B1的镁盐。

聚酰胺-低聚物(WO 99/43780 A1)或聚合的化合物如木质素(WO97/00932 A1)，水溶性的乙烯基-共聚物(EP 828762 B1)或，如在EP702712 B1中所公开的，纤维素-醚，丙烯酰基-聚合物和/或聚酰胺可以稳定由于物理的影响或PH-值-波动对酶制备-处理过程的影响。含有聚胺-N-氧化物的聚合物(EP587550 B1和EP 581751 B1)同时可起到酶稳定剂和色转移抑制剂的作用。其他的聚合稳定剂是在WO97/05227 A1中除其他成分外公开的直链状C₈-C₁₈的聚氧化烯。同专利申请WO 97/43377 A1和WO 98/45396 A1一样，烷基聚苷可稳定按照本发明的洗剂的酶催化的成分和甚至提高其效率。浸润化的含-氮化合物，如在WO 98/17764 A1中所公开的，具有一即是污垢-去除-剂又是酶-稳定剂的双重功效。按照专利申请WO 97/32958 A1，疏水的，非离子聚合物在与其他稳定剂的混合物中起着稳定纤维素酶的作用，因此这样的或类似的成分也适合于按照本发明的酶。

如在EP 780466 A1中所公开的，还原剂和抗氧化剂可提高酶抵御氧化蜕变的稳定性。含硫的还原剂例如是在专利文件EP 080748和EO 080223中已知的。其它的例子是亚硫酸钠(EP 533239 B1)和还原糖(EP 656058 B1)。

稳定剂的复合也有大量的应用，例如来源于专利申请WO96/31589 A1的聚醇，硼酸和/或硼砂，硼酸或硼砂，来源于专利申请EP 126505 B1的还原盐和琥珀酸或其他的二羧酸的复合或如在EP080223 B1中公开的硼酸或硼砂与多元醇或多胺化合物和与还原盐的复合。肽-醛-稳定剂的作用按照WO 98/13462 A1可通过硼酸和/或硼酸衍生物与多元醇的复合得到提高，和按照WO 98/13459 A1通过钙-离子的补充应用还可再提高。

给出了按照本发明制备含有已稳定酶活性的洗剂的优选实施模式。特别优选的是含有通过多种方法被稳定酶的洗剂。

由于按照本发明的洗剂可按所有可想象的形式提供，因此按照本发明的酶，以及蛋白质被制备成可满足用于各种按照本发实施模式的相应洗剂配方的添加形式。由此例如包括液体配方形式，固体的颗粒或胶囊。

提供胶囊化的形式是为保护酶或其他的组成物免受其它成分，例如漂白剂的影响或实现一可控的释放。按照胶囊的大小可分为毫米-，微米-和纳米胶囊，这里对酶而言特别优选的是微米胶囊。这样的胶囊例如是在专利申请WO 97/24177 A1和DE 19918267 A1中公开的。一可能的胶囊化方法是，将蛋白质在蛋白溶液混合物和淀粉或淀粉衍生物的溶液或悬浮液进行包胶囊。一这样的胶囊化方法在专利申请WO01/38471 A1以标题“微胶囊化酶的生产方法”作了叙述。

在固体的洗剂中蛋白质例如可以干燥的，颗粒状的和/或胶囊化的形式使用。其可被分别的，即作为特殊的相，或在该相中与其他成分一道，压实或不压实的被应用。如果微胶囊化的酶是在固体中被加工的话，那末按照目前技术水平已知的方法在加工过程中带入的水溶液将被脱去，如喷雾干燥，离心分离或通过再增溶结晶作用。按照该方法所获得的小颗粒通常具有50至200μm的粒径。

对液体的，似胶态的或糊状的按照本发明的洗剂，酶还有按照本发明的从目前技术水平所进行的蛋白提取和制备处理的蛋白质可以浓缩的水或非水的溶液，悬浮相或乳化液中加以使用，但也可以似胶或胶囊化或作为干燥的粉末加以应用。这种按照本发明的洗涤剂通常可通过简单的与组成物的混合来制备，其可以材料或溶液形态加入到一自动混合器中。

除一次洗涤效果外，该在洗涤剂中所含的蛋白酶可产生进一步的作用，其他的酶作用成分可通过蛋白水解活化或在相应的作用时间之后被钝化。可比较的可调节功能对按照本发明的酶也是可能的。在一本发明的实施方法中是含有对蛋白酶敏感材料胶囊的洗剂该材料，例如按一预定的时间点被按本发明的蛋白质水解和释放出其组成物。在其他的多相洗剂中也可获得一可比较的效果。

另一实施方法给出了一用于织物原料处理或修饰的的洗剂，其特征是，其单独或除其他的活性组成物外含有一上面述及的蛋白水解酶，特别是对含有天然的成分的纤维或纺织物和尤其特别的是对棉花或丝绸。

特别是天然的纤维，如棉花或丝绸，具有优良的特性的，微观的表面结构。该结构可产生，例如在R.Breier在Melliand Textilbericht，1.4.2000(S263)中有关棉织物的文章所叙述的，长期的不期望的影响，如起皱。为防止该影响天然的原料可采用按照本发明的洗剂处理，例如有助于使基于蛋白质结构上的起鳞的表面结构变为平滑和由此产生起皱的相反作用。在一特别优选的实施实例中制造了用于天然成分的纤维或纺织物的洗剂，特别优选是用于棉花或丝绸。

在一优选的实施实例中含有按照本发明蛋白酶的洗剂将如此设计，其可定期地作为修饰剂使用，例如通过在洗涤过程中加入，在洗涤后使用或与洗涤无关使用。该所期望的效果为，获得平整的织物表面结构和/或防止和/或减少织物的损伤。

一特有的发明对象是给出纺织物或硬表面物的机械洗涤的方法，其特征是，在至少一个方法步骤中按照本发明的蛋白水解酶被活化。

纺织物机械洗涤的方法具有这样的优点，在多步的方法步骤中将不同的洗涤活性物质加入到洗涤物中和经一定作用时间后进行洗除，或将该洗涤物以其他方式用一洗涤剂或该洗剂的溶液处理。其同样适合于纺织物以外的所有材料机械洗涤的方法，包括所谓的硬表面概念的。该方法在至少一个方法步骤中涉及按照本发明的蛋白酶，和给出了本发明的实施实例。

优选的方法是，在其中以从40μg至4g量和更优选的是从50μg至3g量，从100μg至2g量，从200μg至1g量，特别优选的是从400μg至400mg量使用一按照本发明的酶。

由于按照本发明的酶已天然地具有一蛋白水解活性和可在不含有洗涤作用成分的媒介中发挥作用，例如在单纯的缓冲液中，一纺织物机洗方法的单独分步骤为，除有稳定作用的化合物，盐或缓冲物外只期望加入按本发明的酶作为唯一具有洗涤活性的成分。并给出了一特别优选的本发明实施实例。

本发明对象的优选实施实例给出了纺织原料的处理或织物修饰的方法，其特征是，在至少一个按照本发明的步骤中一按照本发明的蛋白水解酶被活化。这里例如涉及将材料加工为织物的预备工序进行防皱砑光，或例如涉及在洗涤织物的方法中充实修饰的成分。基于上述的蛋白酶对特定织物的作用，在优选的实施实例中涉及纺织物原料或含有天然成分的织物，特别是棉花或丝绸。

一特殊的发明题目给出了按照本发明的用于纺织物或硬表面洗涤的蛋白水解酶的应用。按照本发明的酶，特别是采用相应的上述方法，去除在纺织物或硬表面上含蛋白的污物。这里涉及的优选实施模式除用于机洗方法外，也应用于例如手洗或人工除去纺织物或硬表面上的污斑。

按照本发明的酶优选的用量是每次从40μg至4g和更优选是从50μg至3g，从100μg至2g，从200μg至1g，特别优选是从400μg至400mg。

一本发明题目的优选实施实例给出了按照本发明的用于洗涤剂组成物活化或钝化蛋白水解酶的应用。如已知的，洗涤剂的蛋白质-成分可通过蛋白酶的作用被钝化。将该在其他方面所不期望的作用有目的地加以使用，也是本发明的一个题目。通过蛋白水解将一其它成分活化，同样也是可能的，其可产生一来源于原来酶的杂种蛋白质和由此获得适当的抑制剂，其例如在专利申请WO 00/01831 A2中所公开的。另一这种调整作用的实例是将活性成分加以保护或通过蛋白酶对胶囊材料中作用达到控制活性。由此按照本发明的蛋白质可用于钝化-，活化-或释放反应。

下面将汇总所有其他的，除洗涤剂问题外的涉及本发明题目的技术方法，应用和未被注意的各种附属物质，只要其与按照本发明的蛋白质有关。该汇总不应被理解为是最终的列举，而是最重要的，熟悉目前已知的按照本发明的蛋白酶的使用可能性的汇总。其表明，其他的技术领域也可通过使用按照本发明的蛋白酶进行开发，因此其被包括在本发明的保护范围内。

一本发明题目的实施实例给出了按照本发明的蛋白水解酶在生物化学或分子生物学分析上的应用，特别是在酶化分析中的应用。按照本发明和按照Roempp的“化学百科全书”(第2版，Stuttgart/New York：Georg Thieme Verlag，1999)该酶化分析理解为生物化学的分析技术，其可应用于特殊的酶或底物，以一方面可确定底物的身份和浓度或另一方面可确定酶的身份和活性。应用领域是所有的与生物化学相关的应用工作领域。一优选的本发明题目的实施实例描述了有关序列分析方面的确定终端基团的应用。

另一本发明题目的实施实例给出了一按照本发明蛋白水解酶在制备处理，纯化或合成天然物质或生物学有价值物质上的应用。例如其在天然产物或生物学有价值物质的洁净过程中是必要的，以从中除去蛋白污染物。此处例如可能涉及低分子的化合物，所有细胞内含物-或存储物质或蛋白质。其不仅以实验室规模，同时也可以大工业规模，例如可用生物工程技术制备有价值的物质。

一按照本发明的蛋白水解酶在蛋白质或其它低分子化合物合成中的应用那时会实现天然催化反应的翻转，例如当将蛋白质片段互相结合在一起时，或将氨基酸结合在不是以蛋白质为主组成的化合物上时。该应用的可能性例如在专利申请EP 380362 A1中作了介绍。

另一本发明题目的实施实例给出了一按照本发明蛋白水解酶在天然原料的处理中的应用，当其需要清除蛋白质污染物时。其首先应理解为该原料不是由微生物方法得到的，而是来自于农业的。

一优选的实施实例给出了在表面处理中的应用，和最特别的是在一对经济具有意义的原料皮带的处理工艺方法中的应用。在鞣制工艺过程中，特别是在碱性变软步骤(Roempp的“化学百科全书”，第2版，Stuttgart/New York：Georg Thieme Verlag，1999)水溶性的蛋白质借助蛋白水解酶从皮质材料中溶出。特别是在碱性条件下和有变性剂存在时，适合采用按照本发明的蛋白酶。

另一本发明题目的实施实例给出了一按照本发明蛋白水解酶在纺织品制造的原料或中间产品制备和处理中的应用。对此的例子是棉花的加工处理，其必须在一作为精整加工标记的工艺中从被囊成分中释放出来；一另外的毛处理方法；类似的也出现于粗丝的加工。酶化的方法与化学法相比基于其对环境的耐受性具有特别的优越性。

在一优选的实施实例中，按照本发明的蛋白质可用于除去纺织物的，尤其是中间产品的或有价值材料的保护层或整平其表面，特别是在其进入下一加工步骤进行进一步加工前。

另一本发明题目的实施实例给出了一按照本发明的蛋白质在纺织原材料处理或织物修饰的应用，特别是毛或丝绸或含毛-或含丝绸的混纺织物的表面处理。其即适合于这种织物的制造，也适合于在消费时的护理，例如结合织物洗涤时的应用(见上)。

另一本发明题目的实施实例给出了一按照本发明蛋白水解酶在照相胶片处理中的应用，特别是含明胶的或类似保护层的去除。采用这种保护层，特别是这样的来自于含-银盐的明胶-乳化液用于胶片，例如X-射线胶片的涂层，该银盐必须在曝光后从载体上溶去。这里在碱性或微变性的反应条件下特别可使用按照本发明的蛋白酶。

一特有的本发明题目给出了一按照本发明的蛋白水解酶在食品或饲料制造中的应用。蛋白酶很早以前就被用于食品或饲料中。对此的例子是凝乳酶在奶酪或其它奶制品成熟过程中的应用。该过程可增产按照本发明的蛋白质或完全由该蛋白质彻底实施。用于非实用目的的碳水化合物丰富的食品或食品原料，例如面粉或糊精，也可采用相应的蛋白酶处理，以使其除去所含的蛋白质。按照本发明的蛋白酶也特别适合于在碱性或微变性的条件下的实施应用。

其相应的也适合于饲料的生产。这里除空气除去蛋白质外有意义的还在于，将含蛋白质的原料或混合物用蛋白酶只需短时间进行处理，以使其更容易为家畜所消化。

在另一本发明题目的实施实例中，按照本发明的蛋白质可用于化妆品的目的。含有按照本发明的蛋白水解酶的化妆品制剂，化妆品的方法其中包括一按照本发明的蛋白水解酶和一按照本发明的蛋白水解酶在化妆目的方面的应用，特别是在相应的方法或相应的制剂中的应用都列入权利要求。

蛋白酶在人类皮肤的细胞更新过程(脱落)中起着举足轻重的作用(T.Egelrud等人，Acta Cerm.Venerol.，Band 71(1991)，S.471-474)。相应的蛋白酶也可作为生物活性的成分在皮肤护理剂中加以使用，以支持在干燥皮肤中增加的细胞桥粒结构的分解，例如按照专利申请WO95/07688 A1或WO 99/18219 A1。枯草杆菌-蛋白酶的使用，特别是已述及的B.lentus-碱性蛋白酶-变体在化妆品中的应用例如在WO97/07770 A1中已述及。按照本发明的蛋白酶，特别是经过突变后或通过添加相应的与其相互作用的物质用以控制活性的蛋白酶，适合于在皮肤-或头发洗涤-或护理剂中作为活性的成分。特别优选的是对酶进行这样的处理，其如上所述的，例如通过与大分子的载体(比较US-专利5230891)的偶联实现稳定化和/或通过在高过敏原位置上的点突变的衍生化，使其对人的皮肤有较高相容性。

相应的该种蛋白水解酶在化妆品中的应用也包括在本发明的题目中，特别是在相应的制剂中的应用，例如香波，肥皂或洗涤洗剂，或在护理剂中，例如所给出的膏霜剂型。在一脱皮药剂中的应用也包括在权利要求中。

实施例

例1

按本发明的蛋白酶的制备

所有的分子生物学的工作步骤按照标准方法进行，例如在Fritsch，Sambrook和Maniatis的手册“分子克隆：实验室手册”，Cold SpringHarbour Laboratory Press，New York，1989，或在国际专利申请WO92/21760 A1中所给出的。

突变载体的结构

突变采用蛋白酶变体B.lentus-碱性蛋白酶M131来进行。该变体已在WO 92/21760 A1中所述和来源的菌种为按照该申请使用American Type Culture Collection公司，Rockville，MD，USA的标记为Bacillus lichenformis ATCC 68614。在该菌种中在Bacillus中复制的质粒pCB56M131含有在表达链中的基因，由启动子，核糖核蛋白键合位以及ATG-起始-编码和来源于Bacillus lichenformis ATCC 53926的碱性蛋白酶的22个氨基端点的氨基酸，与预-前-蛋白质合并的和Bacillus lentus DSM 5483-碱性蛋白酶突变的序列组成。该变体B.lentus-碱性蛋白酶M131与天然的序列相比具有下述的突变：S3T，V4I，A188P，V193M，V199I。

对突变而言，总表达链可借助受限性酶Bam HI和Sac I截断和在同样的由Bam HI和Sac I截断的载体pUC18(Amersham PharmaciaBiotech，Freiburg)中进行克隆。然后采用这样获得的载体pUC18M131进行随后的突变步骤。该载体pUC18M131列于表2中。该用于B.lentus-碱性蛋白酶M131的表达链所含有的DNA-片段被表示于SEQID NO.1中；SEQ ID NO.2给出了由此来源的氨基酸序列。在SEQ IDNO.1中所给出的Bam HI-Sac I-片段可在图2所给出的载体pUC18M131的位置1至177I中延伸；剩余的载体区域是与所采用的起始质粒pUC18一致的。

突变

首先对来源于Bacillus lentus DSM 5483在位188和193上的碱性蛋白酶原始的序列进行重建。对此按照生产商的说明采用Stratagene公司(La Jolla，CA，USA)的QuikChange-方法。按照该体系，通过使用该两个互补的，含有突变的质粒可在聚合酶反应中生产一突变的质粒。在借助Dpn I，如在QuikChange

-方法中所述的，起始质粒的消化后，反应物将转换为E.coli XL-1蓝。由此获得的，在质粒的确定位置中含有克隆的感兴趣的基因同样可借助于一通过突变嵌入的受限性截断位方便的加以确认，此时可通过DNA-序列在一传统工具包的帮助下按照链中断法进行检查。同样的方法也用于下述的突变步骤。

对在位188上的氨基酸编码的在GCC(丙氨酸)上的三倍体(Tripletts)CCA(脯氨酸)的迁移而言，可使用两个引物5’-TAC CAGTAT GGC GGG CTT GAC ATT-3’以及5-AAT AAG CCC GGC GCCATA CTG TGA-3’。其除突变外直接含有一氨基酸序列未改变的Nar I-受限性截断位。

对在位193上的氨基酸编码的在ATT(异亮氨酸)上的三倍体ATG(蛋氨酸)的迁移而言，可使用两个引物5’-GGG CTT GAC ATT GTGGCA CCC GGG GTA AAC-3’以及5’-GTT TAC CCC GGG TGC CACAAT GTC AAG CCC-3’。其除突变外直接含有一氨基酸序列未改变的Xma CI-受限性截断位。

一含有双突变质粒的克隆可为下述在位61GGG(对羟苯基甘氨酸)的在GCT(丙氨酸)上的三倍体的突变提供一模板。对此可使用这两个互补的含有序列为5’-CAA GAT GGG AAT GCT CAT GGCACG CAT-3’以及5’-ATG CGT GCC ATG AGC ATT CCC ATC TTG-3’的引物。由此已有了变体B.lentus-碱性蛋白酶的S3T/V4I/G61A/V199I的基因。

以该突变为前提，然后制取第二个特别优选的变体在位211的亮氨酸被突变为氨基酸天冬氨酸。对此使用这两个互补的含有序列为5’-ACG TAT GCC AGC GAC AAC GGT ACA TCG-3’以及5’-CGA TGTACC GTT GTC GCT GGC ATA CGT-3’的引物。所获得的克隆然后借助DNA-序列进行检查。

总蛋白酶DNA-序列编码的突变S3T/V4I/G61A/V199I的基因，列于序列表的SEQ ID NO.3中。由此可推导出在序列表的SEQ ID NO.4中所给出的氨基酸序列。在序列表SEQ ID NO.5，以及SEQ ID NO.6中给出了该突变的S3T/V4I/G61A/V199I/211D的DNA-，以及蛋白质序列。由于该变体偏离于来源于野生型-酶B.lentus DSM 5483的位置，这些变体可标注为B.lentus-碱性蛋白酶S3T/V4I/G61A/V199I，以及B.lentus-碱性蛋白酶S3T/V4I/G61A/V199I/211D。

突变体表达和蛋白酶制备处理

含有突变序列的表达链代替在SEQ ID NO.1中新表示的片段作为Bam HI-Sac I-片段重新被克隆回载体pCB56M131中，和被转换为Bacillus subtilis DB 104。该菌种Bacillus subtilis DB 104具有基因类型his，nprR2，nprE18，aprA3(Kawamura，F.和Doi，R.H.(1984)，J.Bacteriol.，Band 160，S.442-444)。该DNA转换为Bacillus中符合按照在WO91/02792中所述的来源于Chang和Cohen所开发的原生质体方法的变体(1979；Molec.Gen.Genet.，Band 168，S.111-115)。

由此所获得的蛋白酶-阳性的克隆体在检验后可在500ml MLBSP-培养基中(10g/l Casiton；20g/l Trypton；10g/l酵母萃取液，所有来自Becton Dickison公司，Cockeysville；5g/l NaCl；27g/l琥珀酸钠；100mg/lMgSO₄·7H₂O；75mg/l CaCl₂·7H₂O；0.5μM MnCl₂；0.5μM FeSO₄；2％(w/v)葡萄糖；50mM PIPES-缓冲溶液(来源于一PH7.2的1M的菌种溶液)；75mM KPO₄(来源于一PH7.0的1.5M的菌种溶液)；PH＝7.0，用KOH调整的-以及10μg/ml四环素)在2000ml-振荡烧瓶中于37℃和200转/分钟下培育72小时。在细胞离心分离后所获得的上层液在测定蛋白酶活性后(按照在“表面活性剂”，Band 7(1970)，S.125-132中所述的方法)可用于随后的试验。

例2

对于下述例子而言，采用标准污染的纺织物，其可从官方合作材料检验和试验研究院(Eidgenoessischen Material-Pruefungs-und-Versuchsanstalt)，St.Gallen，瑞士(EMPA)，或洗涤研究院(Waeschereiforschungsanstalt)，Krefeld，来获得。在例2中将使用下述的污染物/纺织物：A(在棉花上的血/牛奶/炭黑)，B(在棉花上的血/牛奶/墨汁)，C(在聚酯-棉花-混纺织物上的血/牛奶/墨汁)和D(在棉花上的蛋/炭黑)。

采用该试验材料对不同的洗涤剂配方对洗涤效果的影响进行了试验。对此对每一漂浮物比例调定为1：12和在40℃下洗涤30分钟。加入量为每升洗涤漂浮物加入相关洗剂5.88g。水的硬度为16°德国硬度。

作为控制-洗涤剂采用一具有下述组成的洗涤剂-基本-配方(所有指示为重量百分数Gew.-％)：4％的直链烷基苯磺酸盐(钠盐)，4％的C₁₂-C₁₈-脂肪醇硫酸盐(钠盐)，5.5％的含有7个EO的C₁₂-C₁₈-脂肪醇，1％的钠皂，11％的碳酸钠，2.5％的非结晶的二硅酸钠，20％的过硼酸钠-四水合物，5.5％的TAED，25％的沸石A，4.5％的多羧酸酯，0.5％的磷酸盐，2.5％的泡沫抑制剂，5％的硫酸钠，其余：水，增白剂，盐。对不同的试验系列加入了下述的蛋白酶，其各为在每升洗涤漂浮物中的蛋白水解活性最终浓度为2.250PE：B.lentus-碱性蛋白酶F49(WO 95/23221；生产商：Biozym公司，Kundl，奥地利)，Savinase

(Novozymes A/S公司，Baegsvaerd，丹麦)，以及按照本发明的蛋白酶B.lentus-碱性蛋白酶S3T/V4I/G61A/V199I/211D。

在洗涤后，所洗涤纺织物的白度按照与硫酸钡的比较来测定，硫酸钡的给定值为100％。该测定可借助一分光光度计Datacolor SF500-2在条件460nm(UV-栅拦过滤器3)，30mm遮光板(blende)，无光泽，光类型D65，10°，d/8°下来进行。所获得的结果以百分数给出，即与硫酸钡加以比较的百分数，各起始数值见表2。所给出的是4次测定的平均值。从中可对所含酶对所使用洗剂的洗涤效率的贡献直接作出推断。

表2：

可以看出，B.lentus-碱性蛋白酶S3T/V4I/G61A/V199I/L211D对所有污染较所给出的蛋白酶B.lentus-碱性蛋白酶F49和

相比具有一明显改善的洗涤效果。

例3

采用与例2中相同污染物A，B和C的棉纺织品同样按照例2的方法进行了试验。区别仅在于，在本例的相同的洗涤剂配方中将按照本发明的蛋白酶B.lentus-碱性蛋白酶S3T/V4I/G61A/V199I与变体B.lentus-碱性蛋白酶S3T/V4I/V199I和同样已知的蛋白酶B.lentus-碱性蛋白酶F49和进行了比较。其同样进行了浓度的调整，使得各为在每升洗涤漂浮物中的蛋白水解活性最终浓度为2.250PE，温度为40℃。

试验系列的测定和运算同样如在例2中所述的。在下表3中给出了获得的结果。

表3：

从两种变体B.lentus-碱性蛋白酶S3T/V4I/G61A/V199I和变体B.lentus-碱性蛋白酶S3T/V4I/V199I可以看出，氨基酸对羟苯基甘氨酸在位61上与脂肪族的氨基酸丙氨酸的交换可获得相对于不同污染和不同织物的在洗涤剂配方中的酶的效率改善。并且明显的优于所给出的蛋白酶B.lentus-碱性蛋白酶F49和

例4

对具有硬的，光滑表面的器皿采用标准的(A)嫩的蛋和(B)蛋/牛奶污染处理和在45℃下采用一家用餐具清洗机Typ

G676的常规程序进行洗涤。每次洗涤使用20g清洗剂；水的硬度为16°德国硬度。

作为清洗剂采用一下述的基本-配方(所有指示为重量百分数Gew.-％)：55％的三聚磷酸钠盐(以无水的计算)，4％的非结晶的二硅酸钠(以无水的计算)，22％的碳酸钠，9％的过硼酸钠，2％的TAED，2％的非离子表面活性剂，其余：水，色素，香精。该基本-配方将对不同的试验的不同蛋白酶B.lentus-碱性蛋白酶F49，以及按照本发明的蛋白酶变体B.lentus-碱性蛋白酶S3T/V4I/G61A/V199I/L211D的相同活性加入，使每个洗涤过程的给定活性为10.000 PE。其相应于在每g洗涤剂浓缩物中约有0.1mg的蛋白酶-蛋白。

在洗涤后，污染物的去除可按重量法以百分数加以确认。对此可采用污染时的重量与洗涤后器皿的重量差和器皿的起始重量与器皿未清洗时的起始重量的重量差比较来获得。该比较可以百分数方式给定。所获得的结果列于表4中。所给出的是9次测定的平均值。从中可对所含酶对所使用洗剂的洗涤效率的贡献直接给出推断。

表4：

该结果表明，按照本发明的B.lentus-碱性蛋白酶S3T/V4I/G61A/V199I/L211D在机械餐具洗涤剂的洗涤效率上具有优于其他所测试的蛋白酶，至少是相等的；和可使用一相比较低的使用活性。

例5

具有硬的，光滑表面的器皿采用与前述例子相同的污染物和在附加一污染物D(面条卤汁)处理和以同样方式在45℃下清洗。区别仅在于，在本例的相同的洗涤剂配方中将按照本发明的蛋白酶B.lentus-碱性蛋白酶S3T/V4I/G61A/V199I与变体B.lentus-碱性蛋白酶S3T/V4I/V199I和同样已知的蛋白酶B.lentus-碱性蛋白酶F49和Savinase

进行比较。其同样进行了浓度的调整，使得各为在每次洗涤过程中蛋白水解活性为10.000 PE。测定同样如在上例中所述。在表5中给出了获得的结果。

表5：

可以看出，变体B.lentus-碱性蛋白酶S3T/V4I/V199I的变体B.lentus-碱性蛋白酶S3T/V4I/G61A/V199I相对于不同的污染物在洗涤剂的洗涤效率上具有优势。该效率的提高仅可归因于在位61上的变化。相对于所有测试的污染物具有优于

的效果；相对于污染物C和D也具有优于B.lentus-碱性蛋白酶F49的效果。

例6

如例4，将器皿按照标准的污染物处理和按同样的方法采用各相同的洗涤剂配方，在45℃下清洗。唯一的不同是，各蛋白酶采用20.000PE。其相应于在洗涤剂浓缩物中约有0.2mg的蛋白酶。其以与例5的相同方法所获得的测试结果给于下述的表6中。

例6：

对使用较高的蛋白酶-活性而言，按照本发明的蛋白酶与为机械餐具清洗剂已推出的蛋白酶B.lentus-碱性蛋白酶F49和

相对照其对洗剂的总洗涤效率具有更高的贡献。

例7

按照上述例子的同样方法，对含有按照本发明的蛋白酶B.lentus-碱性蛋白酶S3T/V4I/G61A/V199I，变体B.lentus-碱性蛋白酶S3T/V4I/V199I，B.lentus-碱性蛋白酶F49或

的洗涤剂配方，含有污染物B和C的器皿又进行了一次试验。其进行了如此的浓度调整，使得在每次洗涤过程中蛋白水解活性为20.000 PE。温度为45℃。测定同样如在例5中所述的。在表7中给出了获得的结果。

表7：

可以看出，在洗涤剂中的变体B.lentus-碱性蛋白酶S3T/V4I/V199I的变体B.lentus-碱性蛋白酶S3T/V4I/G61A/V199I相对与不同的污染物同样在较高的浓度时其对洗涤效率的贡献具有优势。该效率的提高仅可归因于在位61上的变化。相对于所有测试的污染物而言，其相对于

具有明显的改善效果；相对于污染物D同样具有较B.1entus-碱性蛋白酶F49改善的效果。

序列表

<110>汉高两合股份公司

<120>新型碱性蛋白酶-变体和含有该种新型碱性蛋白酶-变体的洗涤剂

<130>H 4726

<140>

<141>

<150>DE 10153792.1-41

<151>2001-10-31

<160>6

<170>

 Ver.2.1

<210>1

<211>1773

<212>DNA

<213>地衣芽孢杆菌ATCC68614

<220>

<221>CDS

<222>(233)..(1375)

<220>

<221>肽

<222>(566)..(1375)

<400>1

<210>2

<211>380

<212>PRT

<213>地衣芽孢杆菌ATCC 68614

<400>2

<210>3

<211>1143

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>迟缓芽孢杆菌碱性蛋白酶

      S3T/V4I/G61A/V199I

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1143)

<220>

<221>肽

<222>(334)..(1143)

<400>3

<210>4

<211>380

<212>PRT

<213>人工序列

<223>迟缓芽孢菌碱性蛋白酶

     S3T/V4I/G61A/V199I

<400>4

<210>5

<211>1143

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>迟缓芽孢菌碱性蛋白酶

     S3T/V4I/G61A/V199I/L211D

<220>

<221>CDS

<222><1)..(1143)

<220>

<221>肽

<222>(334)..(1143)

<400>5

<210>6

<211>380

<212>PRT

<213>人工序列

<223>迟缓芽孢杆菌碱性蛋白酶

     S3T/V4I/G61A/V199I/L211D

<400>6

Claims (70)

1.枯草杆菌蛋白酶-型的碱性蛋白酶，其特征是，该蛋白酶按照来自于迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)的枯草杆菌蛋白酶的计数在相对于原始酶的位61上具有与丙氨酸，颉氨酸，亮氨酸或异亮氨酸的替换，并且在位199上具有异亮氨酸。

2.按照权利要求1的碱性蛋白酶，其特征是，该蛋白酶的第61位氨基酸是与丙氨酸的替换。

3.枯草杆菌蛋白酶-型的碱性蛋白酶，其特征是，该蛋白酶按照来自于迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)的枯草杆菌蛋白酶的计数在位199上具有异亮氨酸，在位211上具有天冬氨酸和在位61上具有丙氨酸，颉氨酸，亮氨酸或异亮氨酸。

4.按照权利要求3的碱性蛋白酶，其特征是，该蛋白酶的第61位是丙氨酸。

5.按照权利要求1至4之一的碱性蛋白酶，其特征是，该蛋白酶至少具有一种使之稳定化的作用。

6.按照权利要求5的碱性蛋白酶，其特征是，该蛋白酶按照来自于迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)的枯草杆菌蛋白酶的计数在位3具有苏氨酸。

7.按照权利要求5的碱性蛋白酶，其特征是，该蛋白酶按照来自于迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)的枯草杆菌蛋白酶的计数在位4具有异亮氨酸。

8.按照权利要求1至4之一的碱性蛋白酶，其特征是，该蛋白酶按照来自于迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)的枯草杆菌蛋白酶的计数在位3具有苏氨酸，在位4具有异亮氨酸，在位61具有丙氨酸和位199具有异亮氨酸。

9.按照权利要求1至4之一的碱性蛋白酶，其特征是，该蛋白酶按照来自于迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)的枯草杆菌蛋白酶的计数在位3具有苏氨酸，在位4具有异亮氨酸，在位61具有丙氨酸，在位199具有异亮氨酸和在位211上具有天冬氨酸。

10.按照权利要求1至4之一的碱性蛋白酶，其特征是，该蛋白酶来源于芽孢杆菌属-枯草杆菌蛋白酶。

11.按照权利要求10的碱性蛋白酶，其特征是，该蛋白酶是来源于迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)-枯草杆菌蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶。

12.按照权利要求11的碱性蛋白酶，其特征是，该蛋白酶是来源于迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)DSM5483的枯草杆菌蛋白酶。

13.按照权权利要求12的碱性蛋白酶，其特征是，该蛋白酶是按照SEQ ID NO.4所给出氨基酸序列的迟缓芽孢杆菌(B.lentus)-碱性蛋白酶S3T/V4I/G61A/V199I。

14.按照权利要求13的碱性蛋白酶，其特征是，该蛋白酶是按照SEQ ID NO.6所给出氨基酸序列的迟缓芽孢杆菌(B.lentus)-碱性蛋白酶S3T/V4I/G61A/V199I/L211D。

15.核酸，其编码权利要求1至14之一所述的蛋白酶。

16.用于编码枯草杆菌-蛋白酶的核酸，其核苷酸序列与在SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.5中所给出的核苷酸序列一致。

17.按照权利要求16的核酸，其特征是，该核苷酸序列对应于根据氨基酸序列SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6对异亮氨酸在位199，对天冬氨酸在位211，对苏氨酸在位3和/或对异亮氨酸在位4编码的区域中所给出的核苷酸序列或包括该区域的核苷酸序列。

18.按照权利要求16或17的核酸，其特征是，该核苷酸序列对应于对丙氨酸在位61编码的区域中所给出的核苷酸序列或包括该区域的核苷酸序列。

19.载体，其含有按照权利要求15至18之一所述的核酸。

20.按照权利要求19的载体，其特征是，该载体含有编码按照权利要求1至14之一所述的蛋白酶的核酸。

21.克隆载体，其含有按照权利要求15至18之一所述的核酸。

22.按照权利要求21的克隆载体，其特征是，该克隆载体含有编码按照权利要求1至14之一所述的蛋白酶的核酸。

23.表达载体，其含有按照权利要求15至18之一所述的核酸并对其进行生物合成。

24.按照权利要求23的表达载体，其特征是，该表达载体含有编码按照权利要求1至14之一所述的蛋白酶的核酸。

25.细胞，其含有按照权利要求19至24之一的载体。

26.宿主细胞，其表达或被诱导表达按照权利要求1至14之一所述的蛋白酶。

27.按照权利要求26的宿主细胞，其特征是，该宿主细胞使用按照权利要求15至18之一所述的核酸。

28.按照权利要求27的宿主细胞，其特征是，该宿主细胞使用按照权利要求23或24的表达载体。

29.按照权利要求26至28之一的宿主细胞，其特征是，该细胞是细菌。

30.按照权利要求29的宿主细胞，其特征是，该细胞是往周围培养基中分泌所产生蛋白质的细菌。

31.按照权利要求29的宿主细胞，其特征是，该细菌是格兰氏阳性细菌。

32.按照权利要求31的宿主细胞，其特征是，该细菌属于芽孢杆菌属。

33.按照权利要求32的宿主细胞，其特征是，该细菌是种迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，枯草杆菌(Bacillus subtilis)或嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)。

34.按照权利要求26至28之一的宿主细胞，其特征是，该细胞是真核细胞。

35.按照权利要求34的宿主细胞，其特征是，该细胞是翻译后修改所产生的蛋白质的真核细胞。

36.利用按照权利要求15至18之一的核酸和/或按照权利要求19至24之一的载体和/或按照权利要求25至35之一的宿主细胞制备按照权利要求1至14之一的蛋白酶的方法。

37.制剂，其特征是，该制剂含有按照权利要求1至14之一的蛋白酶。

38.按照权利要求37的制剂，其特征是，该制剂是洗涤剂。

39.按照权利要求37的制剂，其特征是，所述蛋白酶的含量从2μg至20mg/g制剂。

40.按照权利要求37至39之一的制剂，其特征是，该制剂还含有其他酶。

41.按照权利要求40的制剂，其特征是，该制剂含有其他的蛋白酶，淀粉酶，纤维素酶，半纤维素酶，氧化还原酶和/或脂肪酶。

42.用于纺织原料处理或织物修饰的制剂，其特征是，该制剂含有单独的或除其它活性成分外的按照权利要求1至14之一的蛋白酶。

43.按照权利要求42的制剂，其特征是，该制剂用于含有天然成分的纤维或纺织物。

44.按照权利要求42的制剂，其特征是，该制剂用于含有毛或丝绸的那些纤维或纺织物。

45.纺织物或硬表面的机械洗涤的方法，其特征是，该方法在至少一个步骤中可活化按照权利要求1至14之一的蛋白酶。

46.按照权利要求45的方法，其特征是，所述蛋白酶的每次使用含量从40μg至4g。

47.按照权利要求46的方法，其特征是，所述蛋白酶的每次使用含量从400μg至400mg。

48.纺织原料处理或纺织物养护的方法，其特征是，该方法在至少一个步骤中可活化按照权利要求1至14之一的蛋白酶。

49.按照权利要求48的方法，其特征是，该方法是对含有天然成分的纺织原料或纺织物进行处理。

50.按照权利要求48的方法，其特征是，该方法是对含有毛或丝绸的纺织原料或纺织物进行处理。

51.按照权利要求1至14之一的蛋白酶用于纺织物或硬表面洗涤的应用。

52.权利要求51的应用，其特征是，所述蛋白酶的每次用量从40μg至4g。

53.权利要求52的应用，其特征是，所述蛋白酶的每次用量从400μg至400mg。

54.按照权利要求1至14之一的蛋白酶用于洗涤剂成分活化或钝化的应用。

55.按照权利要求1至14之一的蛋白酶用于生物化学分析或低分子化合物或蛋白质合成的应用。

56.按照权利要求1至14之一的蛋白酶用于天然物质或生物有效物制备，纯化或合成的应用。

57.按照权利要求1至14之一的蛋白酶用于天然原料处理的应用。

58.按照权利要求57的应用，其特征是，处理是表面处理。

59.按照权利要求57的应用，其特征是，该应用用于皮革处理方法中。

60.按照权利要求1至14之一的蛋白酶用于纺织物生产中获得或处理原料或中间产品的应用。

61.按照权利要求60的应用，其特征是，该应用用于去除织物上的保护层。

62.按照权利要求1至14之一的蛋白酶用于纺织原料处理或织物修饰的应用。

63.按照权利要求62的应用，其特征是，该应用用于毛或丝绸或含毛或丝绸的混纺物处理。

64.按照权利要求1至14之一的蛋白酶用于照相胶片处理的应用。

65.按照权利要求64的应用，其特征是，该应用用于去除含明胶的保护层。

66.按照权利要求1至14之一的蛋白酶用于食品或饲料制造的应用。

67.含有按照权利要求1至14之一的蛋白酶的化妆品。

68.包括按照权利要求1至14之一的蛋白酶的化妆品的生产方法。

69.按照权利要求1至14之一的蛋白酶用于化妆品目的的应用。

70.按照权利要求69的应用，其特征是，所述蛋白酶用于相应的方法或相应的制剂的应用。

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