CN100543036C - 递送治疗或诊断试剂的导向蛋白质 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含有与治疗性或诊断性制剂偶联的血管生成抑制剂的组合物。在一具体实施方式中，该组合物是编码偶联有治疗性或诊断性制剂的血管生成抑制剂的融合基因或该融合基因产物。在一具体实施例中，该组合物可用于治疗血管生成相关疾病如癌症的方法中。

Description

递送治疗或诊断试剂的导向蛋白质

本申请要求2002年5月6日提交的美国临时专利申请60/383,063的优先权，其内容纳入本文作参考。

发明领域

本发明涉及细胞生物学、分子生物学、癌生物学和医学领域。更具体说，本发明涉及包含偶联有治疗性或诊断性制剂的血管生成抑制剂的组合物，和这种组合物在治疗学和癌症治疗中的应用。

发明背景

不断增长的证据揭示许多疾病，从年龄相关的黄斑变性、动脉硬化、类风湿性关节炎到癌症都与血管生成，即新血管形成相关(Folkman.2001)。在这些血管生成依赖性疾病中，癌症是最主要的目标疾病(Brem，1999；Ferrara和Alitalo，1999；Keshet和Ben-Sasson，1999；Carmeliet和Jain，2000)。根据抗血管生成理论，正在开发的有几十种新的治疗剂。在Folkman的重要出版物中，原发和转移部位肿瘤的生长依赖于向肿瘤提供营养和氧的新血管生成(Folkman，1971)。以后的三十多年，变得更加令人信服的是，新血管生成在转移表型中起着关键作用。已证明新血管生成是许多肿瘤的关键性预后因素及治疗目标。

了解到肿瘤生长和转移与血管生成程度密切相关，促进了研究实验室和药厂开发抑制血管生成而切断对肿瘤的血供之策略(Brem，1999；Ferrara和Alitalo，1999；Keshet和Ben-Sasson，1999；Kerbel，2001；Risau，1998：Klohs和Hamby，1999；Rosen，2000；Butke和DeNardo，2001；Taraboletti和Margosio，2001；Glaspy，2002)。尽管此科学理论和正在临床考核研究的实验药物评价前途光明，鉴于临床前动物实验所显示的令人兴奋的抗癌作用，学者们仍需要看见这些研究的显著阳性结果。

最近的二项临床研究涉及二种内源性血管生成抑制剂，内皮抑制素和血管抑制素。这些蛋白质已显示对癌症新血管生成是特异的，而对正常的血管生长没有作用。在动物研究中已显示它们能能抑制癌生长而无明显副作用，也不诱导药物抗性(Boehm等，1997)。然而人癌症临床试验的结果与临床前试验的极好结果不相符(Thomas等，2003；Herbst等，2002；Eder等，2002)。这些试验中的肿瘤反应极其少见。如果肿瘤有反应，则肿瘤退化的速度非常缓慢。某些病例中，一年以上才见到肿瘤退化的患者超过25％。迄今，采用这些血管生成抑制剂的临床试验没见到快速肿瘤缩小。虽然在这些临床试验中肿瘤反应不常见，但这些内源性血管生成抑制剂的确显示了非常好的安全性。

与动物模型中所见的肿瘤特异性血管生成相反，对肿瘤特异性血管已研究了相对较长的时间。因此，人体肿瘤中的血管比小鼠肿瘤中的更成熟。某些实施例中，这些内源性抑制剂抑制血管生成需要较长时间，才能阻断供给肿瘤的血流引起肿瘤细胞凋亡。这些血管生成抑制剂通过抑制癌细胞生长而不是杀伤癌细胞而发挥其功能。它们的作用机制称为“细胞静止”而非“细胞毒性”。与细胞毒制剂如化疗药物相反，这些细胞静止性血管生成抑制剂不能有效攻击常见于晚期肿瘤的已良好建立的肿瘤血管。因此这些制剂迄今在大多数注册患者为晚期、并且采用的大部分治疗无效的临床试验中，没能显示显著的抗癌作用。

与本文所述相对无毒性但效能较差的抗血管生成蛋白质相反，已试图采用各种强的治疗性蛋白质或多肽及编码它们的核酸来治疗癌症(不一定只是杀伤癌细胞)，或已提出这类应用。这些物质例如，包括自杀蛋白、凋亡诱导蛋白、细胞因子、白介素、TNF家族蛋白质和编码它们的核酸。具体例子包括：GM-CSF、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白介素-1β、白介素-2、白介素-4、白介素-5、白介素-6、白介素-8、白介素-10白介素-12、白介素-13、白介素-14、白介素-16、白介素-18、白介素-23、白介素-24、肿瘤坏死因子超家族成员14、肿瘤坏死因子超家族成员13B、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子超家族成员12、细胞间粘附分子-1、淋巴细胞功能性抗原-3、协同刺激分子B7-1、协同刺激分子B7-2、FMS-相关酪氨酸激酶3配体、CD40配体、表面抗原CD70、T-细胞活化细胞表面糖蛋白配体、协同刺激分子OX-40、TNF-相关活化诱导细胞因子、肿瘤坏死因子超家族成员11、胞嘧啶脱氨酶、HSV胸腺嘧啶激酶、FAS配体、胱冬酶3、TGF-α1、TGF-α2、TRAIL、Bax、BaK、Bik、Bok、Noxa、Bcl-2家族蛋白质、颗粒溶素(NKG5)、颗粒酶A、颗粒酶B和穿孔素。

例如，IL-12和干扰素-α(Glaspy，2002)已用于治疗肾细胞癌和黑色素瘤。然而在癌症患者中常见显著的全身毒性，从而限制了提高剂量及它们的临床效果。IL-12显示了强大而广谱的抗癌作用(Trinchieri，2003)。然而在一些临床试验中显示了不能接受的副作用(Leonard等，1997)，阻碍了其作为抗癌制剂的应用前景。

为了最大程度减少细胞因子如白介素及表1所列那些治疗性蛋白质的全身副作用，已采用许多蛋白质将这些认为有毒性的治疗性蛋白质靶向肿瘤特异性的血管。此外，也可利用将小分子与能特异性靶向肿瘤新生血管的蛋白质偶联，给肿瘤显影。这些方法中的一些小结于表1中。

表1

 

靶向工具	治疗性/诊断性制剂	评论
			内皮抑制素(Yang等，2002)	99mTc	利用小分子99mTc作为显影分子。发明人所用蛋白质为融合分子，可用于基因治疗而无须纯化蛋白质。
纤连蛋白ED-B结构域的特异性抗体片断(Halin等，2002)	IL-12	对血管生成标志之一纤连蛋白ED-B结构域特异性的靶向抗体片断。然而其不具有抗血管生成活性。
			纤连蛋白ED-B结构域特异性抗体片段(Carnemolla等，2002)	IL-12	类似的方法，见(Halin等，2002)。
血管抑制素-内皮抑制素(Scappaticci等，2001)	血管抑制素-内皮抑制素	将二种抗血管生成蛋白质融合在一起显示比单一分子更好的抗血管生成作用。ThE新融合蛋白仍为细胞静止性而非细胞毒性。
			VEGF(Veenendaal等，2002；Arora等，1999；Hotz等，2002)	白树毒蛋白(Veenendaal等，2002)白喉毒素(Arora等，1999；Hotz等，2002)	VEGF对其受体有特异性，其在肿瘤血管中有丰富表达。它可触发血管生成通路。VEGF不是抗血管生成蛋白。
对靶I-A<sup>d</sup>，一种肿瘤特有血管的标志的抗体B21-2(Huang等)《1997》	组织因子(tTF)的截短形式	此法也利用肿瘤血管的特异性抗体作为靶向工具，无内源性抗血管生成性能。tTF可诱导血栓形成从而阻断血流

其它靶向策略包括将肿瘤标志(B细胞淋巴瘤的CD20、乳腺癌的Her-2/neu、结肠、头颈癌等的EGFR)，或肿瘤特异性血管标志(纤连蛋白的ED-B结构域、整合素αvβ3、VEGF受体等)的特异性抗体与治疗制剂，如白介素、细胞因子、白树毒蛋白、白喉毒素、放射性同位素等交联，制备免疫毒素(Kreitman，1999)。然而大多数免疫毒素策略虽然获得了临床疗效，但只有极少数被批准，如Zevalin^TM(ibritumomabtiuxetan)(IDEC Phamaceuticals；San Diego，CA)和Baxxar(Corixa；Seatlle，Washington)。

WO 99/16889描述了含有血管抑制素的连接有不同或互补活性第二分子的氨基酸序列的融合蛋白质。在具体实施例中，该第二分子选自内皮抑制素、人I型干扰素、血小板反应蛋白、干扰素诱导蛋白10(IP-10)和血小板因子4。其它实施例中，该融合蛋白用于抗肿瘤治疗。

从上述可见，需要能克服该领域以上问题并能治疗血管生成依赖性疾病的组合物和方法。

发明概述

本发明克服了上述问题，导致得以诊断和治疗血管生成依赖性疾病的化合物和疗法。

在本申请书中，将血管生成抑制剂与治疗或诊断制剂交联。在许多实施例中，血管生成抑制剂是抗血管生成蛋白或多肽。鉴于它们对癌的新生血管而非正常血管的亲和力，这些蛋白质和多肽可用作靶向蛋白，将治疗性或诊断性制剂输送给患病细胞和/或组织附近。

偶联有血管生成抑制剂的治疗性蛋白制剂，与单用血管生成抑制剂或治疗性蛋白制剂相比，显著提高了治疗效果。采用血管生成抑制剂作为输送(归巢，home-in)蛋白或制剂，可将治疗剂递送到癌细胞和/或组织附近，是因为血管生成抑制剂能与血管生成特异性疾病的特定血管相缔合和/或结合。这些治疗剂治疗作用的增强是由于其局部浓度提高的结果。

此外，也可将血管生成抑制剂与诊断试剂偶联。例如，可将它们与绿荧光蛋白、荧光素酶、放射性同位素或它们的组合相偶联。这些血管生成抑制剂-诊断试剂偶联物将促进患者的诊断。

在广泛的实施例中，本发明涉及含有与治疗或诊断制剂相偶联的血管生成抑制剂的组合物。本发明某些优选方面涉及一种融合蛋白，其含有的抗血管生成多肽区域与治疗性蛋白或多肽区域，或诊断性蛋白或多肽区域相连接，或涉及编码这类融合蛋白的核酸。然而，在其它实施例中，可将血管生成抑制剂与治疗或诊断性制剂化学交联。

普通技术人员将会懂得，通过阅读本申请书中任何目前已知的抗血管生成蛋白，或进一步发现要达到本发明的目的，需采用本发明中所述内容。本文中所用的具体抗血管生成蛋白质或多肽将在本申请书中其它部分中作更详细叙述。提供的某些特别优选的例子包括内皮抑制素、肿瘤抑制素(tumstatin)、血管抑制素和VEGF受体2的可溶性部分。

本领域技术人员通过阅读本申请书将会很好了解本文中所用的治疗制剂。某些情况下，该治疗制剂是一种治疗性蛋白质或多肽。然而小分子、化学治疗药物、毒素、放射活性化合物和可用于本发明获得治疗效果的任何其它形式的治疗剂也属于本发明范围内。

如本申请书其它部分中更详细描述的那样，本发明示范性的治疗蛋白质和多肽包括，但不以任何方式限于：自杀性蛋白质、凋亡诱导性蛋白质、细胞因子、白介素和TNF家族蛋白质。示范性的诊断蛋白质和多肽包括例如绿荧光蛋白和荧光素酶。以上所述只是可与抗血管生成序列相融合的治疗性蛋白质的例子。本领域技术人员懂得也可采用其它治疗性和诊断性蛋白质。

在本发明某些优选实施例中，血管生成抑制剂是如本文中所述的抗血管生成多肽。某些优选实施例包括内皮抑制素、肿瘤抑制素、血管抑制素和可溶性VEGF受体2作为抗血管生成多肽。本发明某些优选治疗性实施例包括的治疗性蛋白质或多肽有白介素蛋白质或多肽，例如，白介素-12；自杀性蛋白如胞嘧啶脱氨酶，或凋亡诱导蛋白如天然或突变性bik蛋白质。本发明某些优选诊断性实施例包括的诊断性蛋白质或多肽有绿荧光蛋白或荧光素酶。某些特别优选治疗性实施例包括内皮抑制素/白介素-12、血管抑制素/白介素-12、肿瘤抑制素/白介素-12、可溶性VEGF受体2/白介素-12、内皮抑制素/胞嘧啶脱氨酶、血管抑制素/胞嘧啶脱氨酶、、肿瘤抑制素/胞嘧啶脱氨酶、可溶性VEGF受体2/胞嘧啶脱氨酶、内皮抑制素/突变体bik、肿瘤抑制素/突变体bik和可溶性VEGF受体2/突变体bik。而某些特别优选的诊断性实施例包括：内皮抑制素/绿荧光蛋白、血管抑制素/绿荧光蛋白、肿瘤抑制素/绿荧光蛋白、可溶性VEGF受体2/绿荧光蛋白、内皮抑制素/荧光素酶、血管抑制素/荧光素酶、肿瘤抑制素/荧光素酶和可溶性VEGF受体2/荧光素酶。

虽然本发明最简单的实施例涉及一种血管生成抑制剂与一种治疗性或诊断性制剂的偶联，但没有理由不去构成本发明更为复杂的组合物。例如，可以将二种或多种血管生成抑制剂与一种治疗性或诊断性制剂相偶联，一种血管生成抑制剂与二种或多种治疗性或诊断性制剂相偶联，或甚至二种或多种血管生成抑制剂与二种或多种治疗性或诊断性制剂偶联。某些情况下，本文中偶联的多个血管生成抑制剂、治疗剂和/或诊断试剂是相同的，例如二个内皮抑制素多肽与一个白介素-12多肽偶联。或者，本文中偶联的多个血管生成抑制剂、治疗剂和/或诊断试剂是不同的，例如一个内皮抑制素多肽与一个白介素-12多肽和一个胞嘧啶脱氨酶多肽偶联。技术人员能够按照本申请书所述实施本发明这类实施例。

在本发明关于融合蛋白的实施例中，本领域技术人员懂得，该融合蛋白通常是由编码连接有治疗性蛋白或多肽区域或诊断性蛋白或多肽区域的抗血管生成多肽区域的核酸序列所表达的。此类核酸中，编码抗血管生成多肽区域的核酸序列，可位于编码治疗性蛋白或多肽区域或诊断性蛋白或多肽区域的核酸序列的5’或3’端。另外，本发明不限于编码这些融合蛋白的核酸应怎样构成表达载体的方法。可在分别构建步骤中将抗血管生成核酸和治疗性或诊断性核酸构建到一个载体中。或者，可先将它们融合，然后构建到一表达载体中。本发明还涉及包含连接有治疗性蛋白或多肽区域或诊断性蛋白或多肽区域的抗血管生成多肽区域融合蛋白的编码核酸。可将这种核酸包含在一载体中，与脂质复合，和/或包含在药学上可接受的赋形剂中。

本发明的某些具体实施例涉及制备融合蛋白和编码此种融合蛋白的核酸的方法，该方法包括：获得编码含有抗血管生成多肽区域或其互补物的融合蛋白的第一核酸；获得编码治疗性蛋白或多肽区域或诊断性蛋白或多肽区域或其互补物的第二核酸；和利用该第一核酸和第二核酸，产生包含连接有治疗性蛋白或多肽区域或诊断性蛋白或多肽区域的抗血管生成多肽区域融合蛋白的编码核酸。这些方法还包括测定编码该融合蛋白核酸在合适条件下表达该融合蛋白的能力，和/或诊断或治疗活性。这类方法还包括给予对象编码该融合蛋白的核酸。

除了采用融合蛋白方法外，可采用化学交联剂，将治疗性或诊断性蛋白或小分子制剂与抗血管生成蛋白、多肽或肽交联。本领域技术人员知道对某些氨基酸侧链特异性的交联剂可从商业来源购得。具体交联剂的选择取决于所涉及的蛋白质(或小分子治疗性或诊断性制剂)。

采用化学交联方法，可实施的方法包括：获得血管生成抑制剂；获得治疗性或诊断性制剂；将血管生成抑制剂与治疗性或诊断性制剂交联，产生偶联有治疗性或诊断性制剂的血管生成抑制剂。这种方法还可包括测定偶联有治疗性或诊断性制剂的血管生成抑制剂的诊断或治疗作用，和/或给予受试者偶联有治疗性或诊断性制剂的血管生成抑制剂。在一具体实施例中，将表达抗血管生成基因的产品与所需分子(治疗或诊断)交联，纯化交联产物，和给予患者(如为了治疗目的或诊断目的，或二者)或实验动物(为研究目的)。

本发明一些方面涉及包括用包含偶联有治疗性或诊断性制剂的血管生成抑制剂的组合物处理细胞的方法。该细胞是受试者的细胞，或者是细胞培养物。某些实施例中，该细胞是测试对象如小鼠的细胞。其它实施例中，所述受试者是人。

本发明优选方面涉及治疗或诊断血管生成依赖性疾病的方法，包括但不限于：癌症、老年相关性黄斑退化、动脉硬化、血管纤维瘤、新生血管性青光眼、动静脉畸变、骨不连合骨折、关节炎、风湿性关节炎、狼疮、结缔组织疾病、遗传性出血性毛细血管扩张综合征、牛皮癣、角膜移植物新血管生成、化脓性肉芽肿、延迟性伤口愈合、晶状体后纤维组织形成、糖尿病视网膜病变、硬皮病、肉芽形成、血管瘤、沙眼、血友病性关节、血管粘连、肥大性疤痕、多发性硬化、再狭窄和肥胖症。本领域技术人员将从本文了解“血管生成依赖性疾病”的定义。某些具体实施例所治疗的癌症，例如但不限于：头颈癌、卵巢癌、甲状腺癌、口腔癌、前列腺癌、黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、血管瘤、肉瘤、肺癌、脑癌、胰腺癌、肝癌、膀胱癌、胃肠道癌、白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。这些方法的一些实施例包括给予受试者偶联有治疗性或诊断性制剂的血管生成抑制剂，例如但不限于，包含在药学上可接受的赋形剂中的融合蛋白。其它实施例包括给予受试者编码包含偶联有治疗性蛋白或多肽区域或诊断性蛋白或多肽区域的抗血管生成多肽区域的融合蛋白的核酸。这些情况下，所述核酸可包含在质粒、逆转录病毒载体和腺病毒载体、腺相关病毒载体中，或与脂质结合。另外，可将所述核酸分散在药学上可接受的赋形剂中。

本发明的具体方面涉及治疗或诊断癌症的方法，该方法包括：获得包含连接有治疗性蛋白或多肽区域或诊断性蛋白或多肽区域的抗血管生成多肽区域的融合蛋白，或包含连接有治疗性蛋白或多肽区域或诊断性蛋白或多肽区域的抗血管生成多肽区域融合蛋白的编码核酸；和给予患者该融合蛋白或编码该融合蛋白的核酸。

本发明的其它具体方面涉及诊断和/或治疗制剂药盒，其在适当的容器中含有本发明的融合蛋白或编码融合蛋白的核酸。

本发明上述相当广泛的特征和技术优点是为了详细说明本发明，阅读后可更好了解本发明。本发明的其它特征和优点在以下描述，将形成本发明权利要求的主题。本领域技术人员知道，可不难利用本文所披露的概念和具体实施例作基础，修改或设计其它结构来实施与本发明相同的目的。本领域技术人员还应认识到这类等同的结构不会脱离本发明权利要求所设定的思路和范围。通过以下描述并结合附图考虑，将会更好了解本发明的特征性新特点，其组织和操作方法，及其它目的和优点。然而，应明确理解，每张附图目的只是阐明和描述而不是限制本发明。

附图的简要说明

为了更完整了解本发明，现参见以下描述并结合附图。

图1A和1B显示可检测到抗血管生成-治疗/诊断性融合蛋白。图1A显示收集的293T细胞上清液的抗内皮抑制素抗体的免疫印迹结果(18KD内皮抑制素(□)，58KD内皮抑制素-CD(

)和93KD endo-IL-12(←))。图1B，采用ELISA试剂盒(内皮抑制素特异性)。

图2A到2H显示与内皮抑制素相比较，endo-CD融合蛋白在内皮导管(2A-2D)和迁移(2E-2H)试验中显示了相似的抗血管生成作用。图2A到2C中，研究了HUVEC细胞管的形成，图2E到2G研究了细胞迁移。图2D和2H中，观察了5个视野，计数了各个细胞管和迁移的细胞并取平均值。

图3A到3D显示可测定融合基因的治疗或诊断功能。图3A和3A显示MTT试验结果。图3C显示用Endo-GFP融合基因转染的293T细胞中绿荧光蛋白的表达。图3D中研究了用转染了内皮抑制素-GM-CSF质粒的COS-7细胞的条件培养液刺激时，NSF60细胞的增殖。

图4A到4F显示内皮抑制素-GFP可特异性靶向内皮细胞。

图5A到5C显示在B-16亲代肿瘤的血管壁中测到GFP信号。图5A表明在利用B-16内皮抑制素-GFP稳定细胞系的肿瘤实验组中测到GFP。图5B显示在A对侧肿瘤血管壁(

)中测到GFP。图5C显示在对照组双侧B-16亲代细胞系中测到GFP。

图6显示稳定的克隆所表达的内皮抑制素抑制了对侧和局部区域肿瘤的生长。对照组中测定了所有的肿瘤并一起平均。测定了实验组的肿瘤并按它们的细胞系(B-16亲代黑色素瘤细胞系或内皮抑制素-GFP稳定的克隆系)平均。

图7A到7C显示，在不同的独立动物研究中，与单用IL-12或内皮抑制素相比，endo-IL-12具有高度抗癌作用。图7A显示抗B16F10肿瘤的肿瘤内基因治疗。图7B显示与图7A相似的抗B16F10肿瘤的肿瘤内基因治疗，例外的是远处原发肿瘤用2×10⁵细胞攻击。图7C提供endo-IL-12与单用IL-12和内皮抑制素相比较的说明。

图8A到8D显示稳定的克隆或活体外转染所表达的融合蛋白对远处肿瘤的高度抗癌作用。图8A显示活体外用抗血管生成化疗处理内皮抑制素-CD融合基因(Endo：内皮抑制素；CD：胞嘧啶脱氨酶；Endo-CD：融合基因)。图8B显示活体外用抗血管生成免疫疗法治疗时，Tum5-IL12显示对远处肿瘤有更佳的肿瘤抑制作用(Tum5：肿瘤抑制素抗血管生成缺失性突变体；IL-12：白介素12；Tum5-IL12：融合基因)。图8C说明在存在该融合蛋白时远处CT26结肠癌的生长。将不同基因注射到远离所测定肿瘤(不直接注射基因行处理)的CT26肿瘤部位。图8D对远处肿瘤用稳定的细胞系内皮抑制素-IL12治疗。

发明详述

定义

如本文所用，“一个”或“一种”可指一个或多个。如权利要求中所用，当与词“包含”合用时，“一个”或“一种”可指一个或一个以上。如本文所用“另一个”可指至少有第二个或多个。

术语“治疗有效量”本文用于指能改善某些疾病相关症状所需化合物的量。例如，治疗癌症时，能改善癌到任何程度，或能中止癌症任何症状的化合物应是治疗有效的化合物。例如，癌症的改善可能是抑制了癌细胞和/或组织的血管生成，抑制或阻止了细胞生长，促进细胞死亡或它们的联合作用。某化合物的治疗有效量不要求治愈某病而是提供对某病的治疗。

此申请书将整个PCT国际申请WO 99/16889的内容纳入作为参考。

为了提供癌症治疗领域中用的组合物和方法，本发明人研究了肿瘤血管特异性的内源性血管生成抑制剂。具体实施例中，本发明人构建了偶联有治疗性或诊断性制剂的血管生成抑制剂。一些具体实施例中，偶联有治疗性或诊断性制剂的血管生成抑制剂是两种成分：抗血管生成组分和治疗性(或诊断性)组分的融合物。一具体实施例中，偶联有治疗性或诊断性制剂的血管生成抑制剂是编码含有两种蛋白组分的融合蛋白质的融合基因。因此，可将抗血管生成蛋白和治疗性(或诊断性)蛋白二者的编码序列相连接，进而产生细胞静止性抗血管生成蛋白与细胞毒性蛋白的融合蛋白。此外，也可将抗血管生成蛋白与诊断性蛋白，如绿荧光蛋白和荧光素酶融合，通过抗血管生成蛋白将其(荧光蛋白)引入肿瘤特异性血管中。另一实施例中，采用本领域的标准方法，化学连接抗血管生成蛋白组分和治疗或诊断蛋白组分。在示范性实施例中，通过将编码至少一种抗血管生成蛋白的核酸，与至少一种治疗性或诊断性核酸相融合来产生融合基因构建物。

由于血管生成抑制剂对新形成的癌瘤血管，而非正常血管具有亲和力，这些蛋白可用作靶向性蛋白将治疗剂输送到癌细胞附近而不会扩散毒性。连接有这些血管生成抑制剂的治疗性蛋白/制剂与单用血管生成抑制剂或治疗性蛋白/制剂相比，将能显著增强对癌瘤的杀伤和抗癌作用。

抗血管生成蛋白质

任何抗血管生成蛋白、多肽或肽可用于(制备)偶联了治疗性或诊断性制剂的血管生成抑制剂，例如本发明的示范性靶向融合基因产物。血管生成抑制剂(也称为抗血管生成化合物)是那些能抑制、减少、停止、延缓、阻碍、预防、阻止、减慢、逆转或妨碍血管生成的制剂。在一具体实施例中，组织中的血管生成对产生该血管的组织，如肿瘤或视网膜起着有利作用。

示范性实施例包括血管生成素-2、血管抑制素、抗凝血酶III(AT3)、尿激酶的氨基未端片段、钙网蛋白、内皮抑制素、VEGF受体2(可溶性片段，经去除跨膜区而制备)、VEGF受体1(可溶性片段，经去除跨膜区而制备)、干扰素α诱导蛋白10、血纤蛋白溶酶原的5Kringle结构域、血纤蛋白溶酶原的Kringle-5结构域、哺乳动物丝氨酸蛋白酶抑制剂、干扰素-γ诱导的单核因子、血管抑制性趋化因子融合基因、色素上皮衍生因子、MMP-2的C未端血色素结合结构域、血小板因子4(CXCL4)、增殖素相关蛋白、内皮特异性受体酪氨酸激酶、金属蛋白酶-1的组织抑制剂、金属蛋白酶-2的组织抑制剂、金属蛋白酶-3的组织抑制剂、金属蛋白酶-4的组织抑制剂、肌钙蛋白I-2(快速抽动骨骼肌)、色氨酰-tRNA合成酶的Ser94-Gln471片段、血小板反应蛋白、肿瘤抑制素，或它们的组合。本领域技术人员知道，如何采用本领域熟知的方法，通过进入国家生物技术信息中心提供的GenBank数据库公众可得的序列，获得这些蛋白质、多肽或肽的序列，及编码它们的核酸序列。抗血管生成序列的示范性实施例包括(括号中为它们的GenBank序列号)：内皮抑制素(AF333247；SEQID NO：37)；血管抑制素(SEQ ID NO：38)；肿瘤抑制素(AF258351；SEQ ID NO：39)和血小板反应蛋白(M81339；SEQ ID NO：40)。

这些抗血管生成核酸的任何一种，以及该领域已知的其它抗血管生成物质或近期已鉴定而此地未列出的抗血管生成物质，都可作为抗癌症或血管生成依赖性疾病基因治疗剂的成分，可与本文所列或该领域熟知的或近期可能已鉴定的治疗性和/或诊断性蛋白融合后输送。或者，可表达和纯化这些融合核酸和那些本文未列出的核酸编码的融合蛋白，用于蛋白疗法靶向癌症和其它血管生成依赖性疾病。

本领域技术人员知道，在某些实施方式中，抗血管生成序列可提供对疾病的治疗，和/或可提供对疾病的诊断能力。

治疗性/诊断性蛋白质

本发明的许多组合物含有治疗性或诊断性蛋白或多肽，或编码它们的核酸。任何这类治疗性或诊断性蛋白或多肽，或编码核酸都可用于本发明，无论是技术人员目前已知的或此申请书发表后发现的。

本领域技术人员知道有各种治疗性蛋白或多肽及编码它们的核酸，对治疗血管生成依赖性疾病包括癌症有益。在具体实施例中，这类治疗性蛋白或多肽可包括但不限于：自杀性蛋白质、毒素蛋白质、促凋亡蛋白质、细胞因子蛋白质和/或抗血管生成蛋白质。

在本发明的具体方法和组合物中，该治疗性多肽或蛋白质是本身存在其它化合物时，能引起细胞死亡的“自杀性蛋白质”。这种自杀性蛋白质的一个代表性例子是单纯疱疹病毒的胸苷激酶。其它例子包括带状疱疹病毒的胸苷激酶(VZV-TK)、细菌基因胞嘧啶脱氨酶(其可将5-氟胞嘧啶转变成高毒性化合物5-氟尿嘧啶)、p450氧化还原酶、羧肽酶G2、β-葡糖醛酸酶、青霉素-V-酰胺酶、青霉素-G-酰胺酶、β-内酰胺酶、硝基还原酶、羧肽酶A、linamarase(也称为β-葡糖苷酶)、大肠杆菌gpt基因和大肠杆菌Deo基因，及本领域已知的其它物质。某些实施例中，自杀性蛋白质可将前药转变成毒性化合物。“前药”本文指用于本发明方法中可被转变为毒性产物，如对肿瘤细胞有毒性的产物的任何化合物。自杀性蛋白质可将此种前药转变成毒性产物。此种前药的代表性例子包括：更昔洛韦、无环鸟苷和FIAU(1-(2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯糖呋喃糖酰基)-5-碘尿嘧啶)；对氧化还原酶为异环磷酰胺；对VZV-TK为6-甲氧基嘌呤阿拉伯糖苷；对胞嘧啶脱氨酶为5-氟胞嘧啶；对β-葡糖醛酸酶为阿霉素；对硝基还原酶为CB1954和硝基呋噻咪唑；对羧肽酶A为N-(氰基乙酰)-L-苯丙氨酸或N-(3-氯丙酰)-L-苯丙氨酸。该领域普通技术人员不难给予这种前药。普通技术人员不难确定前药的最适剂量和给药途径。在具体实施例中，给予前药的剂量从约1-20mg/天/公斤体重到约1-50mg/天/公斤体重，或约1-100mg/天/公斤体重。

一些实施例中，所述治疗性蛋白或多肽是癌抑制剂，如p53或Rb，或编码此类蛋白或多肽的核酸。当然，技术人员知道有各种各样这类癌抑制剂，和如何获得它们和/或编码它们的核酸。

治疗性蛋白或多肽的其它例子包括促凋亡治疗性蛋白或多肽，例如p15、p16或p21^WAF-1。一个具体实施例涉及的促凋亡蛋白或多肽是野生型Bik，或含有与野生型Bik相似或比其更高活性的突变体Bik。在某些具体实施例中，该Bik突变体含有Thr³³，Ser³⁵替代或Thr³³和Ser³⁵双替代。在其它具体实施例中是用Asp替代。其内容纳入本文作参考的2003年4月2日提交的美国临时专利申请No.60/459,901描述了Bik、Bik突变体和编码它们的核酸序列。

细胞因子和编码它们的核酸也可用作治疗性蛋白和多肽。例子包括：GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)；TNFα(肿瘤坏死因子α)；干扰素包括但不限于IFN-α和IFN-γ；和白介素包括但不限于白介素-1(IL1)、白介素-β(IL-β)、白介素-2(IL2)、白介素-4(IL4)、白介素-5(IL5)、白介素-6(IL6)、白介素-8(IL8)、白介素-10(IL10)、白介素-12(IL12)、白介素-13(IL13)、白介素-14(IL14)、白介素-15(IL15)、白介素-16(IL16)、白介素-18(IL18)、白介素-23(IL23)、白介素-24(IL24)，虽然本领域知道还有其它物质。

治疗性蛋白或多肽的示范性、但非限制性或综合性名单包括(括号中为编码它们的核酸6enBank登录号)：单纯疱疹病毒1型(突变体KG111)的胸苷激酶(SEQ ID NO：1；J04327)、单纯疱疹病毒2型(株9637)的胸苷激酶(tk)(SEQ ID NO：2；M29941)、带状疱疹病毒的胸苷激酶(SEQ ID NO：3；M36160)、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(SEQ ID NO：4；S56903)、p450氧化还原酶(SEQ ID NO：5；D17571)、羧肽酶G2(SEQ ID NO：5；M12599)、β-葡糖醛酸酶(SEQ ID NO：7；M15182)、青霉素-V-酰胺酶(SEQ ID NO：8；M15660)、青霉素-G-酰胺酶(SEQ ID NO：9；AF161313)、β-内酰胺酶(SEQ ID NO：10；AY029068)、硝基还原酶(SEQ ID NO：11；A23284)、羧肽酶A(SEQ ID NO：12；M27717)、linamarase(SEQ ID NO：13；S35175)、大肠杆菌gpt(SEQ ID NO：14；X00221)、大肠杆菌Deo(SEQ ID NO：15；X03224)、p53(SEQ ID NO：16；AF307851)；Rb(SEQ ID NO：17；XM-053409)；p15(SEQ ID NO：18；U19796)；p16[(SEQ ID NO：19；U12818)(SEQ ID NO：20；U12819)和(SEQ ID NO：21；U12820)]、p21WAF-1(SEQ ID NO：22；AF497972)、GM-CSF(SEQID NO：23；M10663)、TNFα(SEQ ID NO：24；AY066019)、IFN-α(SEQ ID NO：25；M34913)、IFN-α(SEQ ID NO：26；J00219)；干扰素γ、干扰素β(SEQ ID NO：27；M28983)、IL-β、IL2(SEQ ID NO：28；K02056)、IL3(SEQ ID NO；29；M14743)、IL4(SEQ ID NO：30；M23442)、IL5、IL6(SEQ ID NO：31；M29150)、IL7(SEQ ID NO：32；J04156)、IL8、IL10(SEQ ID NO：33；U16720)、IL12A(SEQ ID NO：34；NM_000882)、IL12B(SEQ ID NO：35；NM_002187)、IL13、IL14、IL15(SEQ ID NO：36；U14407)、IL16、IL18、IL23、IL24、肿瘤坏死因子超家族成员14、肿瘤坏死因子超家族成员13B(也称为BlyS，BAFF，THANK)、可溶形式、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子超家族成员12(也称为Apo3L)、细胞间粘附分子-1、淋巴细胞功能相关相关抗原-3、协同刺激分子B7-1、协同刺激分子B7-2、FMS-相关酪氨酸激酶3配体、CD40配体、表面抗原CD70、T-细胞活化细胞表面糖蛋白配体、协同刺激分子OX-40配体(原先称gp34)、TNF相关活化诱导细胞因子、全长(同种型1，ODF；RANKL)、肿瘤坏死因子超家族成员11、TNF相关活化诱导细胞因子、可溶形式(同种型2，sODF，sRANKL)、肿瘤坏死因子超家族成员11、颗粒溶素(Granulysin，NKG5)、颗粒酶A、颗粒酶B和穿孔素。

诊断性蛋白的例子包括绿荧光蛋白(M62653；SEQ ID NO：41)、荧光素酶(SEQ IDNO：42)或它们的组合。

在本发明的具本实施例中，编码治疗性或诊断性蛋白或多肽的核酸区段包含在载体中，如非病毒载体、病毒载体或其组合中。病毒载体可以是腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体。非病毒载体可以是质粒或脂质体。核酸区段也可包含在药物组合物中。

治疗性或诊断性融合核酸的任何组合可作为基因疗法制剂输送，用于抗癌症或血管生成依赖性疾病，作为与本文所列出的或该领域所知的抗血管生成基因产物一起的一种成分。或者，可表达和纯化这些融合基因编码的融合蛋白，用于蛋白质治疗靶向癌症和其它血管生成依赖性疾病。

本领域技术人员知道，治疗序列也可作为诊断序列，反之亦然。在其它实施例中，在偶联有治疗制剂的血管生成抑制剂之前，使用偶联有诊断试剂的血管生成抑制剂。通用实施方案

本发明涉及靶向性抗血管生成融合多肽和/或编码它们的核酸，以及关于使用它们的方法。因此在示范性实施例中，本发明证明内源性血管生成抑制剂，如内皮抑制素、肿瘤抑制素、血管抑制素等能特异性靶向新血管的形成，这是血管生成依赖性疾病，包括癌症的特征。虽然任何癌症均可用本发明治疗或预防，一些癌症的例子包括：头颈癌、卵巢癌、甲状腺癌、口腔癌、前列腺癌、黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、血管瘤、肉瘤、肺癌、脑癌、胰腺癌、肝癌、膀胱癌、胃肠道癌、白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。

具体说，可将这些抗血管生成蛋白质与治疗性或诊断性蛋白质融合，作为引导工具将该融合蛋白输送到病理性血管生成部位附近。融合基因构建物所编码的这些融合蛋白质通过联合抗血管生成和治疗性蛋白质二者的功能，可提高治疗效果。此外，抗血管生成蛋白通过抗血管生成蛋白所提供的将该融合蛋白靶向患病部位的靶向功能，可最大程度减少治疗性蛋白的全身毒性作用。

在一具体实施例中，本发明涉及用抗血管生成靶向融合蛋白治疗哺乳动物癌症。例如，人卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌和其它癌症可用本文所述组合物，或本领域技术人员可按本文所述同样方法治疗。某些实施例中，例如通过病毒或非病毒输送系统将其输送给合适的受体动物，以抑制血管生成，抑制肿胀生长和发展，或联合作用。

制备示范性的抗血管生成靶向融合蛋白。在本发明的优选实施例中，这些融合物能选择性抑制血管生成，抑制细胞增殖、抑制癌细胞生长，或联合作用。该领域技术人员按照本说明书所述，可产生其它示范性抗血管生成靶向融合蛋白质。

在本发明的某些实施例中，提供了预防个体中细胞生长的方法，该方法包括给予该个体抗血管生成靶向融合蛋白。在一具体实施例中，给予脂质体包裹的多肽，和/或该多肽还包含一蛋白转导结构域(Schwarze等，1999)。某些实施例中，以聚核苷酸方式给予抗血管生成靶向融合蛋白，其中，所述聚核苷酸含有可影响氨基酸水平修饰的变化，如可用定点诱变产生这种变化。给予的此种修饰的抗血管生成靶向融合聚核苷酸可包含在载体中，如质粒、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、脂质体或它们的组合中。

本发明的其它实施例中，提供了处理细胞的方法，该方法包括使细胞接触抗血管生成靶向融合多肽。具体实施例中，所述细胞是人的细胞，该细胞位于动物体内，和/或所述动物是人。

靶向融合物的产生

虽然可用化学合成方法，或通过二分子间的化学键产生本发明的嵌合蛋白质，但优选通过融合方法产生它们，即将抗血管生成分子的编码序列和治疗或诊断分子的编码序列相融合，并置于能指导该融合聚核苷酸在适当宿主细胞中表达的调节序列控制下。优选实施例中，该嵌合蛋白的各成分具有它们各自作为抗血管生成分子和治疗或诊断分子部分的功能活性。

可用分子生物学领域熟知的方法实现两个全长编码序列的融合。优选的融合性聚核苷酸只含有第一编码序列5’端的AUG翻译起始密码子，但没有第二编码序列的起始密码子，以避免产生两个分离的编码产物。此外，可将一前导序列置于该聚核苷酸的5’端，以将表达的产物靶向宿主细胞中的特定部位或腔室，有利于基因表达后的分泌或后续纯化。两个编码序列可直接融合不用接头，或用一接头。在一具体实施例中，连接抗血管生成和治疗/诊断蛋白质的接头包含VPGVG(弹性蛋白Val-Pro-Gly-Val-Gly)或Gly-Gly-Gly-Ser-Gly。其它接头是该领域技术人员知道的，见WO 99/16889所述，其内容纳入本文作参考。

根据本发明的目的，可采用编码融合蛋白的聚核苷酸来产生重组DNA分子，以指导该融合蛋白、融合肽的片段或其功能等价物在合适的细胞中表达。由于遗传密码子的固有简并性，可采用编码基本上相同的或功能等价的氨基酸序列的其它DNA序列，来实施本发明的融合蛋白质的克隆和表达。这类DNA序列包括那些在严谨条件下能与融合序列或其互补序列杂交的序列，这是该领域技术人员熟知的。

可用于本发明的改变的序列，包括可导致能产生编码相同的或功能等价的融合基因产物的，有不同核苷酸残基缺失、添加或替代的序列。该基因产物本身在融合序列中可含有导致沉默变化的氨基酸残基的缺失、添加或替代，从而产生的融合蛋白是功能相等的。可根据所涉及残基的极性、带电性、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性上的相似性，进行这类氨基酸替代，这是该领域技术人员所熟知的。

可工程改造本发明的DNA序列以改变融合编码序列的不同端，包括但不限于本文中将更加详细叙述的能修饰基因产物加工和表达的变化。例如，可用本领域熟知的技术，即定点诱变，插入新的限制性位点，改变糖基化模式，磷酸化等，来导入突变。

在本发明一实施例中，可用本领域熟知的化学方法全部或部分合成该融合蛋白的编码序列(见例如，Caruther等，Crea和Horn，1980；Chow和Kempe，1981)。例如，可用固相技术合成这些分子的活性结构域，从树脂上切下，用制备性高效液相层析纯化，然后化学连接形成嵌合蛋白(如见Creighton，1983，Proteins Structures和Molecular Principles，W.H.Freeman和Co.，N.Y.50-60页)。合成肽的组成可用氨基酸分析或测序证实(如，Edman degradation procedure；见Creighton，1983，Proteins Structures和Molecular Principles，W.H.Freeman和Co.，N.Y.34-49页)。或者，将合成或重组方法产生的融合蛋白的两部分，用该领域熟知的方法以化学接头相偶联(Brinkmann和Pastan，1994)。

为了表达具有生物活性的融合蛋白，可将编码嵌合蛋白或功能等价物的核苷酸序列插入到适当的表达载体中，即该载体含有能转录和翻译所插入编码序列的必须元件，本文中另有更详细描述。该融合基因产物，及经重组融合表达载体转染或转化的宿主细胞或细胞系可用于各种目的，包括但不限于产生能结合该蛋白质表位的抗体(如单克隆或多克隆)以促进其纯化。

可采用本领域技术人员熟知的方法，构建含有融合蛋白编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体，，本文中另有更详细描述。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/基因重组。

可采用各种宿主表达载体系统来表达融合蛋白编码序列，这些是本领域熟知的。

可能需要特异性起始信号来有效翻译插入的融合蛋白编码序列。这些信号包括ATG起始密码子和毗邻序列。当整个融合基因，包括其自身起始密码子和毗连序列被插入到适当的表达载体时，可不需要其它翻译控制信号。然而，当融合蛋白编码序列不包含自身起始密码子时，必须提供含有ATG起始密码子的外源性翻译控制信号。另外，该起始密码子必须位于该融合蛋白编码序列的读框中，以确保整个插入物的翻译。此外源性翻译控制信号和起始密码子可以有各种来源，即天然的和合成的。通过加入合适的转录增强元件、转录终止子等可提高表达效率(见Bittner等，1987)。

定义和影响靶向融合基因产物的技术及基因

靶向融合基因产物和基因

术语“靶向融合基因产物”和“靶向融合物”本文用于指具有在所述融合物中，含至少一种抗血管生成组分和至少一种治疗和/或诊断组分的氨基酸序列的蛋白质或多肽，其生物活性在于它们能执行类似于其天然组分的至少一种活性，在某些实施例中，这二种组分能执行类似于不同的天然二组分的活性。例如，它们能优先执行抗血管生成活性、促凋亡活性、抗细胞增殖活性、抗肿瘤活性和/或与产生的抗靶向融合基因产物至少一种组分的抗靶向融合抗体起交叉反应的抗体活性。术语“靶向融合基因产物”包括靶向分子的同类物，其能显示至少某些与天然靶向融合物共同的生物活性。此外，诱变领域技术人员知道尚未公开的或未发现的其它同类物，可用于构建靶向融合同类物。

术语“靶向融合物的突变形式”指与编码上述靶向融合基因产物至少一部分的DNA序列基本相同的任何DNA序列。该术语也指与这种DNA序列相容的RNA或反义序列。“靶向融合基因”也可含有有关控制序列的任何组合。

术语“基本上相同”当用于明确靶向融合氨基酸序列或靶向融合核酸序列时，指具体对象序列，例如突变序列，虽与其各个组分的序列有一个或多个替代、缺失、添加或其组合的不同，但其基本作用仍保留了各个组分至少一部分的至少某些生物活性。或者，如果：(a)该DNA同类序列衍生自靶向融合基因编码区的至少一部分；或(b)该DNA同类序列能在中等严谨条件下与(a)所述的和编码生物活性靶向融合物的DNA序列的至少一部分杂交；或(c)：与(a)或(b)中所述DNA同类序列至少一部分遗传密码子具有简并性的DNA序列时，就说该DNA同类序列是与上述特定DNA序列“基本相同”。基本上相同的同类蛋白质，与天然蛋白质组分相应序列的相似性高于约80％。具有较低程度相似性但有相当生物活性的序列认为是等价物。在确定核酸序列时，能编码基本上相似的氨基酸序列的所有对象核酸序列，均认为与参比核酸序列相似，而不论密码子序列中的差异。

相似性性百分率

可通过例如采用购自Wisconsin大学，Geneticist Computer Group的GAP计算机程序，比较序列信息来测定相似性百分率。GAP程序采用经Smith et al.，1981修定的Needleman等，1970的排列对比方法。简而言之，GAP程序将相似性定义为：排列对比在两个序列的短符号中，相似符号(即核苷酸或氨基酸)的数目除以符号的总数。GAP程序的优选默认参数包括：(1)核苷酸的统一比较矩阵(包括相同值为1，不相同值为0)，和Gribskov等，1986的加权比较矩阵，见Schwartz等，1979；(2)一个空格罚分3.0，一个符号和一个空格增加0.01罚分；和(3)未端空格不罚分。核酸序列

在某些实施例中，本发明涉及采用靶向性融合核酸、基因和基因产物，或相应的蛋白、多肽或肽。术语“基本上相同于靶向融合物的序列”指该序列基本上对应于靶向融合基因的至少一部分，但有相对较少的碱基或氨基酸(不论是DNA或蛋白质)与靶向融合物(或其生物功能等价物，当指蛋白质时)不同。术语“生物功能等价物”是本领域熟知的，本文进一步有详细定义。因此，氨基酸序列具有约70％--80％；或更优选81％--90％；或甚至更优选约91％--99％之间是相同的，或与靶向融合物的氨基酸至少一部分功能上相等的序列，是“基本上相同的”序列。

本发明包括其序列至少一部分含有功能上相等的密码子的靶向融合核酸。术语“功能上相等的密码子”本文用于指编码相同氨基酸的密码子，如精氨酸或丝氨酸的6个密码子，也指编码生物学上相等氨基酸的密码子(表1)。

氨基酸      密码子

丙氨酸      Ala           A        GCA         GCC         GCG       GCU

半胱氨酸    Cys           C        UGC         UGU

天冬氨酸    Asp           D        GAC         GAU

谷氨酸      Glu           E        GAA         GAG

苯丙氨酸    Phe           F        UUC         UUU

甘氨酸      Gly           G        GGA         GGC         GGG       GGU

组氨酸      His           H        CAC         CAU

异亮氨酸    Ile           I        AUA         AUC         AUU

赖氨酸      Lys           K        AAA         AAG

亮氨酸      Leu           L        UUA         UUG         CUA       CUC      CUG    CUU

甲硫氨酸    Met           M        AUG

天冬酰胺    Asn           N        AAC         AAU

氨基酸         密码子

脯氨酸         Pro          P        CCA        AAA        AAU

谷氨酰胺       Gln          Q        CAA        CAG

精氨酸         Arg          R        AGA        A66        CGA       C6C      CGG    CGU

丝氨酸         Ser          S        AGC        AGU        UCA       UCC      UCG    UCU

苏氨酸         Thr          T        ACA        ACC        ACG       ACU

缬氨酸         Val          V        GUA        GUC        GUG       GUU

色氨酸         Trp          W        UGG

酪氨酸         Tyr          Y        UAC        UAU

也已知道氨基酸和核酸序列可包含额外的残基，如额外的N-或C-端氨基酸或5’或3’序列，仍然具有本文上述一种序列的基本性能，只要该序列符合上述的标准，包括在所述蛋白表达时保留了该蛋白质的生物活性。具体可加在核酸序列上的未端序列，例如包含侧接于该编码区5’或3’部分的各种非编码序列，或包含已知存在于基因中的各种内部序列，即内含子。

本发明还包括与本申请书所述序列互补或基本互补的DNA区段的用途。“互补的”核酸序列是按照标准的Watson-Crick互补法则碱基配对的那些序列。术语“互补序列”本文指，当与上述相同的核苷酸作比较进行评估时是基本上互补的，或能在上述相对严谨条件下与所述核酸区段杂交的核酸序列。

生物功能等价物

如上所述，可对偶联有治疗性或诊断性制剂的血管生成抑制剂，如抗血管生成靶向融合物结构中的至少一部分进行修饰或变化，仍可获得具有同样或所需特性的分子。一具体实施例中，本领域技术人员懂得，偶联有治疗或诊断制剂的血管生成抑制剂的范围，包括连接有治疗性蛋白或多肽区域，或诊断性蛋白或多肽区域的抗血管生成多肽区域；或包括含有连接于治疗性蛋白或多肽区域，或诊断性蛋白或多肽区域的抗血管生成多肽区域的融合蛋白的编码核酸。

例如，某些氨基酸可替代蛋白质结构中的其它氨基酸而不会显著丧失活性。因为在许多实施例中，正是蛋白质的这种相互反应能力和性质确定了该蛋白质的生物功能活性，可在蛋白质序列(或，当然可在其DNA编码序列)中进行某些氨基酸序列的替代，仍能获得同样性能的或甚至具有对抗性能的蛋白质(如拮抗剂和激动剂)。本发明人认为，可在靶向融合蛋白或多肽(或其DNA上)序列的至少一部分中进行各种变化，而不会显著丧失它们的所需生物活性或用途。

本领域技术人员还熟知生物功能等价蛋白质或肽定义的本质是如下的概念：即可在该分子定义部分进行变化的数目是有限制的，使之仍能产生具有可接受水平的相等生物活性的分子。因此生物功能相等的肽，本文定义为那些其中某些氨基酸，并非大多数或所有氨基酸被替代的肽。当然，可不难制备多种含有不同替代的不同蛋白质/肽，并用于本发明。

也熟知，某些残基，如活性位点中的残基，对蛋白质或肽的生物或结构性能显得特别重要。这类残基一般是不能互换的。

氨基酸替代，例如可用于修饰靶向融合物的替代，通常是根据氨基酸侧链取代基的相对相似性进行的，例如它们的疏水性、亲水性、所带电荷、大小等。氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型分析揭示，精氨酸、赖氨酸和组氨酸都是带阳电残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸大小相似；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有通常相似的形状。因此，根据这些考虑，精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，定义为生物功能等价物。

在制造这类变化时，应考虑氨基酸的亲水性指数。各氨基酸根据它们的疏水性和带电特征设定亲水指数，即异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。

氨基酸亲水指数赋予蛋白质相互反应生物功能的重要性通常是本领域知道的(Kyte和Doolittle，1982，纳入本文作参考)已知某些氨基酸可取代具有相似亲水指数或评分的其它氨基酸，仍能保留相似的生物活性。根据亲水性指数进行变化，优选亲水指数在±2内的氨基酸取代，在±1内的那些取代特别优选，在±0.5内的那些取代甚至更特别优选。

本领域也知道，可根据亲水性有效进行相似氨基酸的取代。美国专利No.4,554，101(纳入本文作参考)说明了蛋白质的最大局部平均亲水性受其毗邻氨基酸亲水性的影响，关系到其免疫原性和抗原性，即蛋白质的生物性能。已知，一个氨基酸可取代另一个具有相似亲水值的氨基酸，仍能获得生物学上等同的蛋白质。

如美国专利No.4,554,101中所详述，为以下氨基酸残基设定如下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±0.1)；谷氨酸(+3.0±0.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±0.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。

根据相似的亲水性值进行变化时，优选亲水性值在±2内的氨基酸取代，在±1内的那些取代特别优选，在±0.5内的那些取代甚至更特别优选。

虽然讨论集中在因氨基酸变化产生的功能上相等的多肽上，将会理解这些变化可能受到编码核酸变化的影响；还要考虑到遗传密码子的简并性，即二个或多个密码子可编码同一个氨基酸。

联合治疗

为了提高偶联有治疗或诊断制剂的血管生成抑制剂，如抗血管生成靶向融合蛋白或编码它们的表达构建物的效率，可能需要将这些组合物与能有效治疗血管生成相关疾病的其它制剂，如抗癌症制剂联用。例如，“抗癌症制剂”能通过抑制癌细胞和/或组织的血管生成、杀伤癌细胞、诱导癌细胞凋亡、降低癌细胞生长速度、减少转移发生或数量、减少肿瘤体积、抑制肿瘤生长、减少肿瘤或癌细胞的血供、促进针对癌细胞的肿瘤免疫应答反应、防止或抑制癌症进展或提高癌症受试者寿命而负面影响受试者的癌瘤。更一般说，这些其它组合物以有效杀伤或抑制细胞增殖的联合剂量提供。此方法可能包括使细胞同时与表达构建物和制剂或多种因素相接触。这可通过使细胞与第一种组合物或包含二种制剂的药物相接触，或使细胞同时与不同的组合物或药物接触而实现，其中，第一种组合物含有表达构建物，另一种含有第二种制剂。

肿瘤细胞对化疗和放疗制剂的耐受性提出了临床肿瘤学的主要问题。当前癌症研究的一个目标是通过联合化疗和放疗与基因治疗，找到提高化疗和放疗疗效的方法。例如，通过逆转录病毒载体系统将单纯疱疹病毒胸苷激酶(HS-tK)基因输送到脑肿瘤中时，成功地诱导了对抗病毒剂更昔洛韦的易感性(Culver等，1992)。在本发明上下文中，考虑除其它促凋亡或细胞周期调节剂外，可将靶向融合基因治疗，相似地与化疗、放疗或免疫治疗干预结合起来应用。

或者，此种组合疗法可先于或后于其它药物治疗几分钟至几星期。在其它药物和表达构建物分别施加于细胞的实施方式中，通常可保证在各次输药时间之间不会有显著的失效期，这样所述制剂和表达构建物仍能发挥对细胞的有益联合作用。在此类例子中，考虑可使细胞在约12-24小时内，更优选在约6-12小时内，与二种药物相互接触。某些情况下，可能需要明显延长治疗时间，然而各次给药之间的失效时间是几分钟(2，3，4，5，6或7)至几小时(1，2，3，4，5，6，7，或8)。在具体实施例中，可采用各种组合，基因疗法是“A”，而另一种制剂，如化疗、放疗、手术或免疫治疗是“B”：

A/B/A  B/A/B  B/B/A  A/A/B  A/B/B  B/A/A  A/B/B/B  B/A/B/B

B/B/B/A  B/B/A/B  A/A/B/B  A/B/A/B  A/B/B/A  B/B/A/A

B/A/B/A  B/A/A/B  A/A/A/B  B/A/A/A  A/B/A/A  A/A/B/A

给予患者本发明的治疗性表达构建物，将按照给予化疗药物的通用方案，并考虑到载体的毒性，(如果有的话)。预计可按需要重复治疗周期。也考虑各种标准疗法及手术干预可与上述细胞过度增殖疗法联合应用。

基于核酸的表达系统

载体

在一实施例中，靶向融合核酸包含在载体中。术语“载体”用于指运载核酸的分子，可将核酸序列插入其中而导入细胞并能在细胞中复制。核酸序列可以是“外源性的”，意味着它对载体所导入的细胞是异物，或者此核酸序列与细胞中某序列同源但其在宿主细胞核酸中的位置是通常未见的。载体包括质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人造染色体(如YACs)。本领域技术人员能通过标准的重组技术(见Maniatis等，1988 Ausubel等，1994，二者内容纳入本文作参考)熟练地构建载体。

术语“表达载体”指含有编码能被转录的基因产物至少一部分的核酸序列的载体。某些情况下这些序列不被翻译，例如在产生反义分子或核酶情况下。表达载体可含有各种“控制序列”，指在特定宿主生物中转录和翻译所需的、与编码序列操作性相连接的核酸序列。除了控制转录和翻译的调控序列外，载体和表达载体可包含具有其它功能和上述功能的核酸序列。

启动子和增强子

“启动子”是一种位于核酸序列中启动转录和控制转录速度区域的调控序列。它含有调节蛋白质和分子，如RNA聚合酶和其它转录因子可结合的遗传元件。短语“操作性位于”，“操作性连接于”，“在控制下”和“在转录控制下”指启动子在与核酸序列的关系中，处在正确的功能位置和/或取向，控制着转录的启动和/或该核酸序列的表达。启动子可与或可不与“增强子”连接，增强子指参与核酸序列转录活化的顺式作用调控序列。

启动子可以是天然与某基因或某序列相连的启动子，如可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5’非编码序列而得到。这种启动子称为“内源性启动子”。相似地，增强子可以天然与某核酸序列相连或位于该序列下游或上游。另外，可通过将编码核酸区段置于重组或异源性启动子的控制下而获得某些好处，异源启动子指在天然情况下通常不与该核酸序列相连的启动子。重组或异源增强子也指在其天然情况下不与该核酸序列相连的增强子。这类启动子或增强子可包括其它基因的启动子或增强子，从其它原核细胞、病毒或真核细胞分离得到的启动子或增强子，和“天然不产生的”启动子或增强子，即含有不同转录调控区的不同元件，和/或能改变表达的突变性启动子或增强子。除了用合成方法产生启动子和增强子的核酸序列外，可采用重组克隆技术和/或核酸扩增技术，包括PCRTM，与本文所述组合物连接，来产生这些序列(见美国专利4,683,202；5,928,906，分别纳入本文作参考)。另外，考虑也可采用能指导核酸序列在核外细胞器，如线粒体、叶绿体等中转录和/或表达的调控序列。

当然，重要的是采用能有效指导DNA区段在选择用于表达的细胞、细胞器和生物体中表达的启动子和/或增强子。分子生物学领域的技术人员通常知道蛋白质表达所用的启动子、增强子和细胞的类型，例如见Sambrook等(1989)，纳入本文参考文献。所用的启动子可以是组成型、组织特异性、可诱导性，和/或能在适当条件下指导高水平表达导入的DNA区段，因而在大规模生产重组蛋白和/或肽时具有优越性。启动子可以是异源的或内源的。

在一具体实施例中，所用的启动子是组织特异性的和/或是患病组织(如癌)周围微环境特异性的，细胞特异性的，或细胞类型特异性的。在一具体实施例中，本发明采用了2002.5.5提交的美国临时专利申请No____，题名为“BIPARTITE T-CELLFACTOR(TCF)-RESPONSIVE PROMOTER”和2003.5.5提交的美国非临时专利申请Express Mail号EU 110397859US中所述的启动子，此二专利内容纳入本文作参考。

组织特异性启动子或元件的鉴定及其活性的特征分析试验是该领域技术人员熟知的。此类区域的例子包括：人LIMK2基因(Nomoto等1999)、促生长素抑制素受体2基因(Kraus等，1998)、小鼠附睾视黄酸结合基因(Lareyre等，1999)、人CD4(Zhao-Emonet等，1998)、小鼠2(XI)胶原(Tsumaki等，1998)、DIA多巴胺受体基因(Lee等，1997)、胰岛素样生长因子II(Wu等，1997)、人血小板内皮细胞粘附分子-1(Almendro等，1996)。

启动信号和内部核糖体结合位点

编码序列的有效翻译还可能需要特异性启动信号。这些信号包括ATG启动密码子或毗连序列。可能需要提供外源性翻译调控信号包括ATG启动密码子。本领域普通技术人员不难确定这一点并提供必须的信号。已很好知道启动密码子必须是“框内”，即与所需编码序列同处读框内以保证整个插入物的翻译。外源性翻译控制信号和启动密码子可以是天然的或合成的。加入合适的转录增强子元件可提高表达率。

在本发明某些实施例中，采用内部核糖体进入位点(IRES)元件来产生多个基因或多顺反子信使。IRES元件能绕过5’甲基化加帽(Cap)依赖性翻译的核糖体扫描模式，在内部位点开始翻译(Pelletier和Sonenberg，1988)。已报道了小RNA病毒家族二成员(脊髓灰质炎和脑脊髓炎)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，1988)，及哺乳动物信使的IRES(Macejak和Sarnow，1991)。可将IRES元件连接到异源性开放读框内。可一起转录各自被IRES分开的多个开放读框，产生多顺反子信使。借助IRES元件各开放读框能进入核糖体得到有效翻译。采用一个启动子/增强子转录一个信使，能有效表达多个基因(见美国专利5,925,565和5,935,819，纳入本生长作参考)。

多克隆位点

载体可含有多个克隆位点(MCS)，该位点是含有多个限制性酶切位点的核酸区域，可采用任一区域与标准重组技术结合来消化该载体(见Carbonelli等，1999；Levenson等，1998；Cocea，1997，纳入本文作参考)。“限制性酶消化”指采用只在核酸分子特定位置起作用的酶催化切割核酸分子。可从市场上购买到许多这些限制性酶。这类酶的用途广为本领域技术人员所知道。通常，采用能在MCS内切割的限制性酶使载体线性化或片段化，以保证外源序列连接入该载体。“连接”指在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键，二片段彼此可毗连或不毗连。涉及限制性酶和连接反应的技术是重组技术领域技术人员所熟知的。

剪接位点

大多数转录的真核RNA分子将经历RNA剪接去除原代转录物中的内含子。含基因组真核序列的载体可能需要供体和/或受体剪接位点，以确保转录物的正确加工而表达蛋白质(见Chandler等，1997纳入本文作参考)。

聚腺苷酸信号

表达时，通常要有一聚腺苷酸信号来行使转录物的正确聚腺苷酸化。不认为聚腺苷酸信号的性质对成功实施本发明是关键性的，和/或可采用任何这类序列。优选例包括SV40聚腺苷酸信号和/或牛生长激素聚腺苷酸信号，能方便地和/或已知能在各种靶细胞中很好发挥功能的聚腺苷酸信号。还考虑可用采转录终止位点作为表达盒中的元件。这些元件的作用是提高信使水平和/或尽量减少读取盒中的其它序列。

复制起始位点

为了在宿主细胞中扩增载体，其可含有一个或多个复制起始位点(常称为“ori”)此位点是一种能启动复制的特定核酸序列。此外，如果宿主细胞是酵母菌，可采用自主复制序列(ARS)。

可选择性和可筛选性标志

本发明某些实施例中，可通过在表达载体中含有一标志，而在体外或体内鉴定含有本发明核酸结构的细胞。这种标志可赋予细胞一种可鉴定的变化，有易于鉴定含有该表达载体的细胞。通常，可选择标志赋予的性能是可让其被选择出来的标志。阳性选择标志是存在此标志时而得以选出的标志，而阴性可选择标志是该标志存在时阻止其选择的标志。阳性可选择标志的一个例子是抗药性标志。

通常包含药物选择性标志有助于转化子的克隆和鉴定，例如，能赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、零霉素和组氨醇抗性的基因可用作可选择标志。除了能赋予表型而得以区分实施本发明而建立的转化子的标志外，也考虑其它类型的标志，包括诸如基于比色分析的GFP等可筛选标志。或者，可采用可筛选酶，如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员也知道可能在FACS分析时如何利用免疫标志。不认为所用标志很重要，只要其能与编码基因产物的核酸同时被表达。可选择和可筛选标志的其它例子是该领域技术人员熟知的。宿主细胞

术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”本文中可互换使用。所有这些术语也包括其子代，即任何和所有的后代。可理解所有子代由于故意或非故意的突变而不可能相同。在表达异源性核酸序列的段落中，“宿主细胞”指原核或真核细胞，包括能复制载体，和/或表达载体编码的异源基因的任何可转化生物体。宿主细胞可被用作载体的受体。宿主细胞可被“转染”或“转化”，指外源性核酸转移到或导入到宿主细胞中的过程。转化细胞包括原代目标细胞及其子代。

宿主细胞可衍生自原核或真核细胞，取决于所需结果是该载体的复制，还是部分或全部表达载体编码的核酸序列。可购得许多细胞系和培养物用作宿主细胞，可从美国典型培养物中心(ATCC)获得它们，ATCC是活培养物和基因材料挡案保管服务机构(www.atcc.org)。本领域技术人员能根据载体的骨架和需要的结果确定合适的宿主。例如，可将质粒或粘粒导入原核宿主细胞复制出许多载体。可用作宿主细胞进行载体复制和/或表达的细菌细胞包括：DH5α，JM109和KC8，以及许多可从市场购买到的细菌宿主，如

感受态细胞和SOLOPACK^TM GOLD细胞(

LaJolla)。另外，细菌细胞如大肠杆菌LE392可用作噬菌体病毒的宿主细胞。

用于载体复制和/或表达的真核宿主细胞包括：HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、Cos、CHO、Saos和PC12。本领域技术人员可购得和知道各种细胞类型的许多宿主细胞。相似地，病毒载体可用于真核或原核宿主细胞，特别是允许载体复制或表达的那些细胞。

某些载体可采用使其能在原核和真核二种细胞中均能复制和/或表达的调控序列。本领域技术人员还知道培养上述宿主细胞维持它们并使载体复制的条件。也了解和知道大规模生产载体及生产载体编码的核酸和它们的同源多肽、蛋白质或肽的技术和条件。

表达系统

已存在含有上述部分或所有组成的许多表达系统。原核和/或真核系统可用于本发明来产生核酸序列，或它们的同源多肽、蛋白质和肽。许多这类系统可从市场购得。

昆虫细胞/杆状病毒系统可产生高水平异源核酸区段的蛋白质表达，见美国专利No.5,871,986；4,879,236所述，二者纳入本文参考，可从INVITROGEN和BACPACK^TMBACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM FROM 

以

 2.0名称买到。

表达系统的其它例子包括s COMPLETE CONTROL^TM的可诱导哺乳动物表达系统，其包括合成的蜕皮激素-可诱导受体，或其pET表达系统，一种大肠杆菌表达系统。可诱导表达系统的另一个例子可从

购买到，它携带有T-REX^TM(四环素调节的表达)系统，一种采用全长CMV启动子的可诱导哺乳动物表达系统。

也提供酵母菌表达系统，称为毕赤嗜甲醇表达系统，设计用于在嗜甲醇毕赤酵母菌中高水平生产重组蛋白质。本领域技术人员知道怎样表达载体，如表达构建物来生产核酸序列或其同源的多肽、蛋白质或肽。

核酸递送

本发明诸方面的总体方法涉及上述组合物和/或治疗剂，其提供含有编码特定的和/或所需蛋白质、多肽和肽的基因构建物，从而允许这些蛋白质发挥所需要的活性。本发明中，所需的蛋白质、多肽或肽是含有血管生成抑制剂和治疗或诊断序列的靶向融合物。虽然认为该基因构建物和/或蛋白质可被直接输送，但优选实施方式包括向细胞提供特定和所需蛋白质、多肽和肽的编码核酸。这样提供后，细胞的转录和翻译机制能合成蛋白性组合物，及该表达构建物可提供的任何组分。提供反义物、核酶和其它抑制剂时，优选的方式也是向细胞提供编码该构建物的核酸。

在本发明某些实施例中，可将编码该基因的核酸稳定整合入细胞的基因组中。其它实施例中，此核酸可作为DNA的分离的游离体区段稳定维持在细胞中。这类核酸区段和“游离体”编码的序列在宿主细胞周期同步过程中，能充分保留和独立复制。表达构建物如何被输送给细胞，和/或在细胞中核酸如何保留取决于所用的表达构建物的类型。

利用病毒载体输送DNA

某些病毒能感染细胞并通过受体介导的内吞机制进入细胞整合到宿主细胞基因组中，和/或稳定表达病毒基因，从而使它们成为外源基因转移到哺乳动物的有吸引力的候选者。本发明优选的基因治疗载体通常是病毒载体。

虽然某些病毒能接受异种遗传物质，但受到它们可容纳的核苷酸数量的限制，和/或它们可感染的细胞范围限制，已证明这些病毒成功地进行了基因表达。然而，腺病毒不能将其遗传物质整合入宿主基因组中，和/或因而基因表达不需要宿主复制机制，使其非常适合快速有效的异源基因表达。制备复制缺陷性感染病毒的技术是本领域熟知的。

当然，采用病毒输送系统，需要充分纯化病毒粒子，使其基本上没有不良污染物，如缺陷性干扰性病毒颗粒、内毒素和其它热原质，从而不会在接受该载体构建物的细胞、动物和个体中引起任何不良反应。纯化载体的优选方法包括采用浮力密度梯度离心，如氯化铯梯度离心。

腺病毒载体

输送表达构建物的具体方法包括利用腺病毒表达载体。虽然已知腺病毒载体整合入基因组DNA的能力低，但这些载体赋予的高效基因转移抵消了此缺点。“腺病毒表达载体”意味着包括含有腺病毒序列的那些构建物，能(a)支持该构建物的包装和/或(b)能最终克隆到其中的组织和/或细胞特异性结构中表达。

该表达载体含有经基因工程改造形式的腺病毒。已知腺病毒的基因组成是36kb的线性双链DNA病毒，允许用长达7kb的外源序列置换腺病毒DNA的大片段(Grunhaus和Horwitz，1992)。与逆转录病毒相反，腺病毒感染宿主细胞不会导致染色体整合，因为腺病毒DNA能以游离体方式复制而无潜在的基因毒性。还有，腺病毒结构上稳定。和/或大量扩增后未测到基因组重排。

腺病毒特别适合用作基因转运载体，因为其基因组大小适中，易操作，滴度高，靶细胞范围广泛和/或感染力高。该病毒基因组二端含有100-200个碱基对的反向重复序列(ITR)，它们是病毒DNA复制和/或包装所必须的顺式元件。其基因组的早期(E)和/或晚期(L)区域含有受病毒DNA复制驱动的不同转录单位。其E1区(E1A和/或E1B)编码负责调节病毒基因组和/或几种细胞基因转录的蛋白质。E2区(E2A和E2B)表达导致合成病毒DNA复制的蛋白质。这些蛋白质参与DNA复制、后期基因表达/或宿主细胞关闭(Renan，1990)。后期基因的产物包括大多数病毒衣壳蛋白，只是在主要后期启动子(MLP)产生的一个原代转录物经过有效加工后才表达。在感染后期此MLP(位于16.8m.u.)特别有效，和/或此启动子产生的所有mRNA含有5’-三联前导序列(TPL)，使它们能优先翻译mRNA。

在此系统中，通过穿梭载体和前病毒载体之间的同源重组产生重组腺病毒。由于二个前病毒之间有可能重组，因此可产生野生型腺病毒。故从单一空斑分离单克隆病毒和/或检测其基因组结构很是重要。

产生和/或增殖复制缺陷性的此种腺病毒依赖于独特的辅助细胞系，称为293细胞，产生自身Ad5DNA片段转化的人胚肾细胞，能组成性表达E1蛋白质(E1A和/或E1B；Graham等，1977)，此腺病毒载体在293细胞帮助下能在E1区、D3区和二区中携带外源DNA(Graham和Prevec，1991)。最近已报道了在E4区中含有缺失的腺病毒载体(美国专利5,670,488，纳入本文作参考)。

实际上腺病毒可包装大约105％的野生型基因组(Ghosh-Choudhury等，1987)提供额外的大约2kbDNA容量。加上E1和/或E3区中可替代的大约5.5kbDNA，此腺病毒载体的最大容量在7.5kb，和/或该载体总长的大约15％。该载体骨架中保留了80％以上的腺病毒基因组。

辅助细胞系可衍生自人细胞，如人胚肾细胞、肌细胞、造血细胞和其它人胚胎间充质和上皮细胞。或者，辅助细胞可衍生自其它种类哺乳动物的允许人腺病毒(生长)的细胞。这类细胞包括，如Vero细胞和其它猴胚胎间充质和/或上皮细胞。如上所述，优选的辅助细胞系是293。

最近，Racher等，(1995)公开了培养293细胞和/或增殖腺病毒3的改进方法。一种方式中，通过在含100-200ml培养液的1升硅化旋转瓶(Techne，Cambridge，UK)中接种单个细胞培养成天然细胞集落。以40rpm搅拌后用台酚兰估计细胞活力。另一方式中，如下采用Fibra-Cel微载体(Bibby Sterlin，Stone，UK)(5g/l)。细胞接种：重悬于5ml培养液中，加入到250ml Erlenmeyer瓶的载体(50ml)中，和/或静置1-4小时，偶而搅动。用50ml新鲜培养液替换原培养液和/或摇动。为产生病毒，让细胞生长至80％铺满，然后更换培养液(至25％最终体积)和/或加入0.05MOI的腺病毒。培养物静置过夜，然后体积增加到100％和/或再摇动72小时。

除了要求腺病毒载体是复制缺陷型和至少是条件缺陷型的之外，不认为腺病毒载体的性质对成功实施本发明是关键性的。腺病毒可以是已知的42种不同血清型和A-F亚组中的任何一种。优选亚组C的5型腺病毒作为起始材料，以获得用于本发明的条件性复制缺陷型腺病毒载。这是因为5型腺病毒是人腺病毒，已知道其大量的生化和遗传信息，并且历史上其已被用于采用腺病毒作载体的大多数构建物中。

如上所述，本发明典型的载体是复制缺陷型的、不含有腺病毒的E1区。因此最方便的是在E1编码序列已被去除的部位导入转化结构。然而，该结构插入腺病毒序列中的部位对本发明不是关键的。可如Karlsson等，(1986)所述，将编码感兴趣基因的聚核苷酸插入E3取代载体中E3缺失区位置，辅助细胞系和辅助病毒则互补了E4缺失的E4区。

腺病毒的培养和/或操纵是该领域技术人员知道的，其显示体外和体内有着广泛的宿主范围。使病毒可获得高滴度，如每毫升109-1011空斑形成单位，它们具有高感染力。腺病毒的生命周期不需要整合入宿主细胞基因组中。腺病毒输送的外源基因是游离体，因此对宿主细胞基因毒性低。接种野生型腺病毒的研究未见副作用报道(Couch等，1963；Top等，1971)，证明作为体内基因转运载体它们是安全的和/或有治疗潜力。

腺病毒载体已用于真核基因表达(Levrero等，1991；Gomez-Foix等，1992)和疫苗开发(Grunhaus和Horwitz，1992；Graham和Prevec，1992)。最近，动物研究提示，重组腺病毒可用于基因治疗(Straford-Perricaudet和Perricaudet，1991a；(Straford-Perricaudet等，1991b；Rich等，1993)。给予不同组织，包括气管灌注(Rosenfeld等，1991；Rosenfeld等，1992)、肌肉注射(Ragot等，1993)、外周静脉注射(Herz和Gerard，1993)和/或脑内定位接种(Le Gal La Salle等，1993)。重组腺病毒和腺相关病毒(见下)能感染和转导非分裂性人原代细胞。

AAV载体

腺相关病毒是用于本发明细胞转导的一种有吸引力的载体系统，因为它整合频率高，可感染非分裂细胞，使其可将基因输送到哺乳动物细胞中，例如组织培养物中(Muzyczka，1992)和体内。AAV感染性具有广泛宿主范围(Tratschin等，1984；Laughlin等，1986；Lebkowski等，1988；McLaughlin等，1988)。关于rAAV载体产生和用途的详述见美国专利No.5,139,941和/或4,797,368，各自纳入本文作参考。

证明AAV可用于基因输送的研究包括LaFace等，(1988)；Zhou等(1993)；Flotte等(1993)；Walsh等(1994)。重组AAV载体已成功用于体外和/或体内转导标志基因(Kaplitt等，1994；Lebkowski等，1988；Samulski等，1985；McLaughlin等，1988)和涉及人类疾病的基因(Flotte等，1992；Luo等，1994；Ohi等，1990；Walsh等，1994；Wei等，1994)。最近AAV已批准用于治疗膀胱纤维变性的I期人试验。

AAV是一种依赖性细小病毒，需要另一种病毒(或是腺病毒或疱疹病毒家族某成员)共感染才能在培养细胞中经历产毒性感染(Muzyczka，1992)。缺少辅助病毒共感染时，野生型AAV基因组通过其两未端整合入人染色体19中，在那儿以潜伏状态作为前病毒居留(Kotin等，1990；Samulski等，1991)。然而，rAAV整合不限于染色体19，除非AAV的Rep蛋白也表达(Shelling和Smith，1994)。当携带AAV前病毒的细胞加上辅助病毒感染时，可从该染色体和从重组质粒中“拯救”了AAV基因组，和/或建立正常的产毒性感染(Samulski等，1989；McLaughlin等，1988；Kotin等，1990；Muzyczka，1992)。

通常，通过共转染含有侧接二个AAV末端重复序列的感兴趣基因的质粒(McLaughlin等，1988；Samulski等，1989；各自纳入本文作参考)和/或含有野生型AAV编码序列而无末端重复序列的质粒，如Pim45(mCcARTY等，1991；纳入本文作参考)。也用腺病毒和和携带AAV辅助功能所需腺病毒基因的质粒感染和转染细胞。以此种方式制备的rAAV病毒贮藏液污染有腺病毒，必须用物理方法与rAAV颗粒分离(例如氯化铯密度离心)。或者，可采用含AAV编码区的腺病毒载体和含AAV编码区及某些和所有腺病毒辅助基因的细胞系(Yang等，1994；Clark等，1995)。也可采用携带rAAV DNA作为整合前病毒的细胞系(Flotte等，1995)。

逆转录病毒

逆转录病毒作为基因输送载体具有应用前景，因为它们能将其基因整合入宿主基因组中，而转运大量的外源性遗传物质，能感染广谱的物种和细胞类型，并被包装在特定的细胞系中(Miller，1992)。

逆转录病毒是一组单链RNA病毒，特征是能通过逆转录过程在感染细胞中将其RNA转变成双链DNA(Coffin，1990)。产生的DNA然后稳定整合入细胞染色体中成为前病毒，和/或指导病毒蛋白质的合成。整合导致在受体细胞和/或其后代中保留该病毒的基因序列。逆转录病毒基因组含有分别编码衣壳蛋白质、聚合酶和包膜组分的三个基因gag，pol和/或env。Gag基因上游的序列含有基因组包装到病毒粒子中的信号。这些病毒含有的强启动子和增强子也是整合入宿主细胞基因组所需要的(Coffin，1990)。

为了构建逆转录病毒载体，将编码感兴趣基因的核酸插入病毒基因组某些病毒序列处产生复制缺陷型病毒。为了产生病毒粒子，需构建含gag，pol和env基因但无LTR的包装细胞系和包装组分(Mann等，1983)。当将含cDNA的重组质粒，与逆转录病毒LTR和包装序列一起导入(例如通过磷酸钙沉淀)此细胞系中时，包装序列能使重组质粒进行RNA转录并被包装成为病毒颗粒，然后分泌到培养液中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等，1983)。收集含重组逆转录病毒的培养液，任选地浓缩，用于基因转运。逆转录病毒载体能感染广泛的各种细胞类型。然而，其整合和/或稳定表达需要宿主细胞分裂(Paskind等，1975)。

与采用缺陷性逆转录病毒载体有关的是可能在包装细胞中出现野生型复制活性病毒。这可能是由于gag，pol env序列上游重组病毒插入物的完整序列整合入宿主细胞基因组中所致。然而，现已有新的包装细胞系可大大减少重组的可能性(Markowitz等，1988；Hersdorffer等，1990)。

已报道了采用第二代逆转录病毒载体输送基因。Kasahara等(1994)制备了莫洛尼小鼠白血病病毒的工程改造变体，只能正常感染小鼠细胞，其包膜蛋白经过修饰，故该病毒能特异性结合和感染携带有红细胞生成素(EPO)受体的人细胞。这一点是通过将EPO序列的一部分插入包膜蛋白中产生具有新结合特性的嵌合蛋白而实现的。

用于本发明的具体逆转录病毒载体包括慢病毒和Indiana水疱性口炎病毒。

其它病毒载体

可采用其它病毒地载体作为本发明中的表达构建物。可采用衍生自病毒，如痘苗病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988)、仙台病毒、巨细胞病毒和单纯疱疹病毒的载体。对于各种哺乳动物细胞它们可赋予几种有吸引力的特征(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988；Horwich等，1990)。

随着最近发现的缺陷型乙肝病毒，对于不同病毒序列的结构-功能关系有了新的观点。体外研究显示，该病毒尽管其基因组缺失了80％以上，仍可保留辅助-依赖性包装和逆转录能力(Horwich等，1990)。这提示，其基因组的大部分可用外源遗传物质替代。Chang等最近将氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因导入鸭乙肝病毒基因组的聚合酶、表面和/或pre-表面抗原编码序列位置。将其与野生型病毒共转染入禽肝癌细胞系中。用含有高滴度重组病毒的培养液感染了原代鸭肝细胞。转染后至少24天中测到CAT基因的稳定表达。

某些其它实施例中，基因疗法的载体是HSV。使HSV成为有吸引力的载体的因素是其基因组的大小和组成。因为HSV大，与其它较小病毒系统相比，加入多个基因和表达盒不成问题。此外，可得到具有不同性能(温度、强度等)的不同病毒控制序列，使其比其它系统能在更大程度上控制表达。还有一个优点是该病毒具有较少剪接的信使，易于基因操作。HSV也较易操纵和/或可高滴度生长。因此就获得足够MOI所需体积和重复剂量需要较少而言，输送问题不大。

修饰的病毒

本发明其它实施例中，待输送的核酸包含在经基因工程改造能表达特异性结合配体的感染性病毒中。因而该病毒颗粒能特异性结合靶细胞的同源受体，将其组分输送给细胞。依靠在病毒包膜上化学加入乳糖残基化学修饰逆转录病毒，最近设计开发了特异性靶向逆转录病毒载体的新方法。此种修饰可使该病毒通过唾液酸糖蛋白受体感染肝细胞。

设计了使重组逆转录病毒靶向的另一种方法，是采用抗逆转录病毒包膜蛋白和/或抗特异性细胞受体的生物素化抗体。该抗体用链霉亲和素经生物素组分偶联(Roux等，1989)。采用抗主要组织相容性复合体I类和II类的抗体，他们证明可体外用亲嗜性病毒感染各种带有这些表面抗原的人细胞(Roux等，1989)。

DNA输送的其它方法

本发明的不同实施例中，将DNA作为表达构建物输送给细胞。为了有效表达基因构建物，必须将该表达构建物输送给细胞。如上所述，优选的输送方法是通过病毒感染，其中表达构建物包含在感染性病毒颗粒中。然而，本发明也考虑用几种非病毒方法转运表达构建物到细胞中。本发明一实施例中，表达构建物只由裸露重组DNA和/或质粒组成。该构建物的转运可采用物理和/或化学方法透过细胞膜进行。如下所述这些方法的一些可成功采纳用于体内和/或活体内。

脂质体介导的转染

本发明另一实施例中，可将表达构建物包裹在脂质体中。脂质体是以磷脂双层膜和/或内部水性介质为特征的囊泡性结构。多室脂质体具有被水性介质分隔的多层脂质层。当将磷脂悬浮在过量水溶液中时可自发性形成脂质体。在形成封闭结构和/或包裹水份和/或将溶质溶解在脂质双层间之前，脂成分经历了自身重排(Ghosh和Bachhawat，1991)。也考虑表达构建物与脂转染胺(Lipofectamine，Gibco BRL)的复合物。脂质体介导的核酸输送和外源DNA的体外表达已非常成功(Nicolan和SENS，1982；Fraley等，1979；Nicolau等，1987)。Wong等(1980)证明了在培养的鸡胚、Hela和肝癌细胞中脂质体介导的外源DNA输送和/或表达的可行性。

本发明某些实施例中，可将脂质体与血凝性病毒(HVJ)组成复合物，显示促进了与细胞膜的融合和/或促进了脂质体包裹DNA进入细胞(Kaneda等，1989)。本发明其它实施例中，将脂质体与核内非组蛋白性染色体蛋白质(HMG-1)复合和/或结合运用(Kato等，1991)。其它实施例中，将脂质体与HVJ和HMG-1二者复合和/或结合运用。其它实施例中，输送载体可包含配体和脂质体。当在DNA构建物中采用细菌启动子时，也需要将合适的细菌聚合酶包含在脂质体中。

本发明人考虑可将neu-抑制性基因产物用脂质体介导的基因转移导入细胞。Nabel等(1990)提出，可将这类构建物与脂质体偶联，通过导管直接导入。采用这些方法，neu-抑制性基因产物可在体内特定部位有效表达，不只是在静脉注射可抵达的肝、脾细胞中表达。因此，本发明还包含neu-抑制基因产物编码DNA构建物的组合物(配制成DNA/脂质体复合物)，和使用这种构建物的方法。

如美国专利No.5，641,484所述，脂质体特别适合治疗HER2/neu介导的癌症。脂质体的制备

脂质体的制备

可用Gao等(1991)的方法制备动物细胞靶向融合物的有效转染试剂阳离子脂质体。Gao等描述了一步合成的新的阳离子胆固醇衍生物。据报道此种脂质制备的脂质体用于转染更有效，对处理细胞的毒性比用Lipofectin试剂制备的低。这些脂质是DC-Chol(“3’(N-(N’N’-二甲基胺乙烷)-氨甲酰胆固醇”)和DOPE(“二油酰磷酯酰乙醇胺”)。生产这些脂质体的步骤如下。

通过简单的胆甾烯基氯甲酸酯和N，N-二甲基乙烯二胺反应合成DC-Chol。将胆甾烯基氯甲酸酯溶液(2.25g，5mmol，用无水氯仿配)0℃逐滴加入到过量N，N-二甲基乙烯二胺的溶液(2ml，18.2mmol，溶于3ml无水氯仿)中。蒸发除去溶剂后，4℃在无水乙醇中重结晶纯化残留物，真空干燥。产品是白色DC-Chol粉末。

在氯仿中混合1.2μmol DC-Chol和8.0μmol DOPE制备阳离子脂质体。干燥该混合物，真空干燥，在一试管中重悬于1ml stero 20mM Hepes缓冲液(pH7.8)中。4℃水合24小时后，超声波仪超声分散5-10分钟，形成平均直径150-200nm的脂质体。

制备脂质体/DNA复合物，发明人采用如下步骤。将待转染的DNA放在DMEM/F12培养液中，比例为15μgDNA比50μlDMEM/F12。用DMEM/F12稀释DC-Chol/DOPE脂质体混合物至50μl DMEM/F12比100μl脂质体。然后轻轻混合DNA稀释液和脂质体稀释液，37℃培育10分钟。培育后DNA/脂质体复合物易于注射。

可通过含有，例如磷酯酰胆碱(PC)、磷酯酰丝氨酸(PS)、胆固醇(Chol)、氯化N-[1-2，3-二油酰基丙基]-N，N-三甲胺(DOTMA)、二油酰磷酯酰乙醇胺(DOPE)和/或者说β-[N-(N’N’-二甲基胺乙烷]氨甲酰基胆固醇(DC-Chol)，及该技术人员所知的其它脂类组成的脂质体进行脂质体转染。该领域技术员知道有各种脂质体转染技术可用于本发明。这些技术中有Nicolau等，1987；Nabel等，1990和Gao等，1991所述的那些。在一具体实施例中，脂质体含有DC-Chol。更具体说，在优选实施例章节中发明人的脂质体含有按照Gao等(1991)所说制备的DC-Chol和DOPE。发明人还预备使用含DOTMA的脂质体，其可从San Diego，Calif.的Vical，Inc.，以商标名Lipofectin^TM购买到。

可用各种方法将脂质体导入与细胞接触。细胞培养时，可简单地将脂质体-DNA复合物分散加入在细胞培养液中。体内应用时，通常注射脂质体-DNA复合物。静脉注射可使脂质体介导DNA复合物转运到例如肝和脾。为了让DNA转染进入通过静脉注射不能进入的细胞，可将脂质体-DNA复合物直接注射到动物机体中的特定部位。例如，通过导管注射入主动脉壁。其它例子中，发明人采用腹膜内注射使基因转运到小鼠中。

制备脂质体复合物所用的脂质可以是上述脂质。具体说，DOTMA、DOPE和/或DC-Chol可构成脂质体复合物的全部或一部分。发明人特别成功的是用含有DC-Chol的复合物。在优选实施例中，脂质将含有DC-Chol和DOPE。虽然预计任何比例的DC-Chol与DOPE都可用，但预计所含DC-Chol与DOPE的比例在1:20和2:1的脂质特别优异。发明人发现约1:10-1:5比例的DC-Chol:DOPE制备的脂质体有用。

在一具体实施例中，采用能提高靶向融合物在细胞核中保留所需的最小区域，这样不会在接受靶向融合基因构建物的细胞中导入不需要的DNA。该领域技术人员熟知的技术，如限制性酶切，将能产生靶向融合物的小区域。这些区域抑制neu的能力不难通过实施例中所述试验测定。

本发明某些实施例中，将脂质体与血凝性病毒(HVJ)组成复合物，显示能促进与细胞膜的融合和促进脂质体包裹的DNA进入细胞(Kaneda等，1989)。其它实施例中，将脂质体与核内非组蛋白性染色体蛋白质(HMG-1)复合和/或结合运用(Kato等，1991)。还有其它实施例中，将脂质体与HVJ和HMG-1二者复合和/或结合运用。这类表达构建物已成功用于在体外和体内转运和表达核酸，它们也适合于本发明。当在DNA构建物中采用细菌启动子时，还需要将合适的细菌聚合酶包含在脂质体中。通过含靶向融合物的脂质体体内治疗癌症

根据以上提供的技术，本领域技术人员知道，可用至少一种靶向融合物处理任何细胞，在具体实施例中，任何癌细胞都可这样处理。例如，在某些实施例中，被处理的细胞分别是HER2/neu-阳性或HER2/neu-阴性。

其内容纳入本文作参考的美国专利No.5,641,484说，可采用脂质体介导的直接基因转运技术来获得对活的宿主中HER2/neu-过度表达的人癌细胞的抑制。其所述实施方案如下。给雌性裸小鼠(5-6周龄)腹腔内SK-OV-3细胞(2×10⁶/100μl)。SK-OV-3细胞是人卵巢癌细胞能在裸鼠腹腔中生长。5天后，给小鼠腹腔注射各种化合物。某些小鼠只注射治疗性DNA，某些注射按上述方法制备的脂质体/治疗性DNA复合物，所述小鼠注射200μl所述化合物。首次注射后，在小鼠活着期间每7天重复注射。

上述结果表明脂质体介导的基因转运可抑制HER2/neu-过度表达的人卵巢癌细胞生长。因此，预计脂质体介导的靶向融合物基因疗法通过将靶向融合物直接靶向HER2/neu-癌基因，可作为HER2/neu-过度表达的人卵巢癌的强力治疗制剂。

用靶向融合物脂质体转染治疗人的疾病

根据美国专利No.5,641,484所述的动物体内研究结果，本领域技术人员会理解和预计有极大的可能采用抗血管生成靶向融合物与脂质体的复合物，来治疗HER2/neu-介导的癌症。认为临床研究可证明这些效果。本领域技术人员将会知道直接确定采用靶向融合物抑制癌症的最好治疗方案。这在医学领域中不是常规实施的实验问题而是优化问题。裸鼠的体内研究提供了开始优化剂量和输送方案的起始点。注射次数开始是一周一次，如美国专利No.5,641,484所述小鼠研究那样做。然而，注射次数可调整优化，从一天到每隔二周，每月一次，取决于初步临床试验的结果和特殊患者的需要。人的剂量最初可从小鼠所用靶向融合物的量推测确定，约每50克体重15μg质粒DNA。据此，50kg的妇女每剂需要用15mgDNA治疗。当然，此剂量可上调或下调，如这类方案常规那样，取决于初步临床试验的结果和特殊患者的需要。预计这些临床试验将证明靶向融合物治疗人HER2/neu-过度表达癌症的用途。剂量和频率方案最初可根据动物体内研究的数据，如该领域经常做的那样。

电穿孔

本发明某些实施例中，通过电穿孔将表达构建物导入细胞中。电穿孔包括将细胞和/或DNA悬液暴露于高压放电。

采用电穿孔转染真核细胞已相当成功。以此方式已采用人免疫球蛋白κ基因转染了小鼠前B淋巴细胞(Potter等，1984)和用氯霉素乙酰转移转移酶基因转染了大鼠肝细胞(Tur-Kaspa等，1986)。

磷酸钙和DEAE-葡聚糖

本发明其它实施例中，采用磷酸钙沉淀将表达构建物导入细胞。已用此技术以腺病毒5型DNA转染了人KB细胞(Graham和Van Der Eb，1973)。还以此方式用新霉素标志基因转染了小鼠L(A9)、小鼠C127、CH0、CV-1、BHK、NTH3T3和/或Hela细胞(Chen和Okayama，1987)，用各种标志基因转染了大鼠肝细胞(Rippe等，1990)。

另一实施例中，采用DEAE-葡聚糖然后用聚乙二醇将表达构建物输送给细胞。以此方式将报告质粒导入小鼠骨髓瘤和/或红白血病细胞(Gopal，1985)。

粒子轰击技术

本发明另一实施例将裸DNA表达构建物转运入细胞涉及颗子轰击技术。此方法依靠加速包被DNA的微粒到高速使微粒穿过细胞膜和/或进入细胞而不杀伤它们(Klein等，1987)。已开发了加速小粒子的几种装置。一种装置依靠高压电产生的电流进而提供运动力(Yang等，1990)。所用微粒由生物学椭性物质如钨和金珠组成。

直接微粒加载和/或超声加载

本发明其它实施例包括用直接微粒加载和/或超声加载导入表达构建物。已采用直接微粒将核酸构建物导入蟾蜍卵母细胞(Harland和Weintraub，1985)，和/或通过超声加载用胸苷激酶基因园子染了LTK-成纤维细胞(Fechheimer等，1987)。

腺病毒辅助转染

本发明某些实施例中，采用腺病毒辅助的转染将表达构建物导入细胞。据报道采用腺病毒偶联系统提高了转染效率(Kelleher和Vos，1994；Cotton等，1994)。

药物制备

本发明的药物组合物含有有效量的偶联有治疗或诊断性制剂的一种或多种形式的血管生成抑制剂，如溶于或分散于药学上可接受的运载体或赋形剂中的抗血管生成靶向融合物和/或其它制剂。短语“药学上或药理学上可接受的”指当给予动物，例如人(适当时)，不会产生副作用、过敏或其它不良反应的分子实体和组合物。本领域技术人员通过本文所公开的内容，知道含有至少一种靶向融合物形式或其它活性成分的药学组合物的制备方法，例如见Remington的Pharmaceutical Scinces，第18版，Mack Printing Company，1990，纳入本文参考文献。另外，对于动物(如人)给药，应知道制品应符合FDA公署生物标准要求的无菌、无热原，总体安全和纯度标准。

“药学上可接受的运载体”本文用于包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(如抗菌剂，抗真菌剂)、等渗剂、吸收延缓剂、盐类、防腐剂、药物、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、增甜剂、调味剂、染料等物质和它们的组合，这是本领域普通技术人员知道的(见例如，Remington的Pharmaceutical Scinces，第18版，Mack Printing Company，1990，1289-1329页，纳入本文参考文献)。除了与活性成分不相容的常规运载体外，认为均可用于治疗或药学组合物中。

所述靶向融合物形式可含不同类型的运载体，取决于给药途径如注射是否要以固体、液体或气溶胶形式给药，是否需要除菌。本发明组合物可通过静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、肿瘤内、肌肉内、腹膜内、皮下、膀胱内、粘膜、心包内、口服、局部、采用气溶胶、注射、输液、持续输液、局部灌注直接浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、配制在霜膏中、在脂质组合物(如脂质体)中或通过该领域普通技术人员知道的其它方法或上述方法的任何组合给予(见例如，Remington的Pharmaceutical Scinces，第18版，Mack Printing Company，1990，纳入本文参考文献)。

给予患病动物本发明组合物的确切剂量由物理和生理因素，如体重、疾病严重性、待治疗疾病的类型、原有和共同的治疗措施、受试者的特发病和给药途径所决定。负责给药的医生将决定组合物中活性成分的浓度和受试者个体的适合剂量。

某些实施例中，药物组合物可含有，例如至少约0.1％的活性成分。其它实施例中，该活性成分含有重量单位的约2％-75％，或约25％-60％，及例如可从其中推断出的任何范围。其它非限制性例子中，每次给药的一个剂量也可含约1μg/kg/体重，约5μg/kg/体重，约10μg/kg/体重，约50μg/kg/体重，约100μg/kg/体重，约200μg/kg/体重，约350μg/kg/体重，约500μg/kg/体重，约1mg/kg/体重，约5mg/kg/体重，约10mg/kg/体重，约50mg/kg/体重，约100mg/kg/体重，约200mg/kg/体重，约350mg/kg/体重，约500mg/kg/体重，约1000mg/kg/体重，或更多，和可从其中推断出的任何范围。可从上列数字推断出的范围的非限制性例子中，可根据上述数字给予约5mg/kg/体重-100mg/kg/体重，约5μg/kg/体重-约500mg/kg/体重等。

无论如何，该组合物可含有各种抗氧化剂以防止一种或多种万分的氧化。此外可用防腐剂，如各种抗菌和抗真菌剂包括对羟基苯丙酸酯(如甲基对羟基苯丙酸酯、丙基对羟基苯丙酸酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。

该靶向融合物形式可配制成游离碱、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐，如与蛋白质组分的游离氨基形成的盐，或与无机酸，如盐酸、磷酸，或有机酸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸形成的盐。与游离羧基形成的盐也可衍生自无机碱，如氢氧化钠、钾、铵、钙或铁；或有机碱如异丙胺、三甲基胺、组胺或普鲁卡因。

在该组合物是液体形式的实施例中，运载体可以是溶剂或分散介质，含有但不限于：水、多元醇(如甘油、丙烯二醇、液态聚乙二醇等)、脂质(如甘油三酯、植物油、脂质体)和它们的组合。例如，可通过采用包衣如卵磷酯；通过用运载体如液体多元醇或脂分散维持所需颗粒大小；用表面活性剂如羟丙基纤维素；或这些方法的组合来维持适当的流动性。许多情况下，优选包含等渗剂如糖、氯化钠或其组合。

其它实施例中，本发明可采用滴眼剂、滴鼻液或喷雾、气溶胶或吸入剂。通常将这类组合物设计成与靶组织类型相容。一非限制性例子中，滴鼻液常设计成以液滴或喷雾形式给予鼻通道的水溶液。制备的滴鼻液在许多工作方面类似于鼻分泌液，从而可维持正常的纤毛运动。优选实例中，滴鼻水溶液通常等渗或轻度缓冲维持pH约5.5-6.5。此外，类似于眼科制品的抗微生物防腐剂、药物或适合的药物稳定剂，如需要可包含有配方中。例如，各种已知的商品化滴鼻制品，包括抗菌素或抗组胺药。

某些实施例中，制备通过口服消化途径给予的靶向融合物形式。这些实施例中，固体组合物可含有，例如溶液、悬浮液、乳液、片剂、药丸、胶囊(如硬或软衣壳明胶胶囊)、缓释制剂、口颊吸收组合物、栓剂、酏剂、悬浮剂、糖浆、糯米纸囊剂或它们的组合。口服组合物可直接加到饮食中。口服给药的优选运载体包括椭性稀释剂、可同化食用运载体或它们的组合。本发明其它方面。可将口服组合物制成糖浆或酏剂。糖浆或酏剂可含有，例如至少一种活性制剂、增甜剂、防腐剂、芳香剂、染色剂、防腐剂功它们的组合。

在某些优选实施例中，口服组合物可含有一种或多种粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、调味剂和它们的组合。某些实施例中，此组合物可含有以下一种或多种种物质：粘合剂如西黄嗜胶、阿拉伯胶、谷物淀粉、明胶或其组合；赋形剂如磷酸二钙、甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁或其组合；崩解剂如谷物淀粉、土豆淀粉、海藻酸或其组合；润滑剂如硬脂酸镁；增甜剂如蔗糖、乳糖、糖精或其组合；芳香剂如薄荷、冬青油、樱桃香精、橙子香精等；或上述物质的组合。当剂量单位形式是胶囊时，除上述类型物质外可含有运载体如液体运载体。可存在各种其它物质如包衣剂或可修饰剂量单位的物理形式。例如药片、药丸，或可用虫胶、糖或二者包裹胶囊。

适合于其它给药方式的其它制剂包括栓剂。栓剂是重量和形状不同的固体剂量形式，医学上常用于插入直肠、阴道或尿道。插入后，糖锭变软，融化或溶于体腔液体中。通常对于栓剂，传统的运载体包括例如聚亚烷基二醇、甘油三脂或其组合。某些实施例中，栓剂可由含有约0.5％--10％，优选约1％--2％范围活性成分的混合物组成。

灭菌可注射溶液通过在适当溶剂中加入所需量的活性组分与上述各种其它成分，然后按需要过滤除菌而配制。通常在含有基础分散介质和/或其它万分的无菌运载体中，加入不同的除菌活性成分配成分散设计师。配制灭菌注射液、悬浮液或乳液用的灭菌粉剂时，优选的配制方法是真空干燥或冻干技术，可从事先过滤除菌的液体介质产生活性成分加上其它所需成分的粉末。如需要液体介质应适当缓冲，注射前该液体稀释液先用足够的盐或葡萄糖做成等渗。也考虑制备供直接注射的高浓度组合物制品，考虑用DMSO作为溶剂可导致极快的渗透，输送高浓度的活性制剂到小区域中。

该组合物在制备和贮存条件下必须稳定，防止微生物如细菌和真菌污染。须知应将内毒素的污染保持最低，在安全水平例如在0.5ng/mg蛋白质之下。

在具本实施例中，可在该组合物采用延迟吸收剂如单硬脂酸镁、明胶或其组合来延缓可注射组合物的吸收。

在本发明的一具本实施例中，所用的组合物是抗血管生成靶向融合物，其表达至少部分受2002.5.5提交的美国临时专利申请No____，题为“BIPARTITE T-CELLFACTOR(TCF)-RESPONSIVE PROMOTER”和2003.5.5提交的美国非临时专利申请Express Mail号EU110397859US(二文内容纳入本文作参考)中所述启动子的调节，其中，所述融合物含有脂质体，如DC-Chol、DOTMA等。

实施例

此文包括以下实施例以显示本发明的优选实施方式。本领域技术人员应懂得，实施例中按照本发明人发现的代表性技术所公开的技术，在实施本发明中工作良好，可认为构成了实施本发明的优选方式。然而，本领域技术人员阅读了此公开内容后，知道可在所分开的具体实施方式中作出许多修改仍能获得类似结果，但这为脱离本发明的思路和范围。

实施例1

实验材料和方法

免疫印迹：采用阳离子脂质体法，用含有内皮抑制素、内皮抑制素-胞嘧啶脱氨酶(endo-CD)和内皮抑制素-白介素12(endo-IL12)的质粒转染293细胞。转染后用无血清培养液置换原培养液。培养24小时后收集上清液用抗内皮抑制素抗体作免疫印迹。

ELISA：用编码内皮抑制素-IL12或内皮抑制素-GM-CSF的质粒，以阳离子脂质体转染COS-7细胞。转染后用无血清培养液置换原培养液。收集上清液作ELISA检测内皮抑制素蛋白。

实施例2

抗血管生成一治疗/诊断性融合基因的表达

图1显示，产生融合蛋白后，可测到抗血管生成-治疗/诊断性融合蛋白。图1A，293细胞上清液的抗内皮抑制素抗体免疫印迹。可测到18KD内皮抑制素(□)、58KD内皮抑制素-CD(

)和93KD endo-IL12(←)。图1B说明采用ELISA试剂盒(内皮抑制素特异性)也可测到和和定量内皮抑制素-IL12和内皮抑制素-GM-CSF融合蛋白。

实施例3

特征分析融合蛋白的抗血管生成和治疗/诊断功能的实验材料和方法

内皮管试验：在96孔板各孔中加入50μl Matrigel(Collaborative BiomoleculesBedford，MA)并使其聚合。使含5,000个人脐带内皮细胞(HUVEC)的无抗菌素EGM-2悬浮培养液通过包被有Matrigel的各孔。收集用不同质粒(内皮抑制素、内皮抑制素-CD和CD)转染的293T细胞上清液处理的细胞。所有试验一式三份进行。37℃培养细胞12-24小时，显微镜观察。给细胞摄影。观察5个视野计数内皮管数取平均值。

迁移试验：用Boyden小室试验在HUVEC上测试内皮抑制素对VEGF-诱导的趋化作用的抑制效果。胰酶处理后，洗涤，用含0.5％FBS的M199培养液稀释细胞，将10，000个细胞接种在上室小孔中，加入从转染不同质粒(内皮抑制素、内皮抑制素-CD和CD)的293T收集的上清液。将含2％FBS加10ng/ml VEGF的M199培养液放在下室中作为趋化吸引剂。用8μm孔径的聚碳酸酯滤膜将含细胞小室与趋化吸引剂分开。37℃培养小室6-8小时。弃去非迁移细胞后用PBS洗涤上室孔，用塑料叶片刮滤膜固定在4％福尔马林PBS中，用DAPI荧光染料染色，置于载玻片上。采用高强荧光视野记录贩个独立的均匀着色图象。观察5个视野计数内皮管数取平均值。所有试验一式三份进行。

MTT试验：用MTT试验测定了5FC与胞嘧啶脱氨酶(CD)反应转变为5FU对293细胞的细胞毒作用。发肯人采用不同的质粒(内皮抑制素、内皮抑制素-CD和CD)转染293T细胞培育12-14小时。胰酶处理后，洗涤，用含2％FBS加不同浓度5FU或5FC的DMEM培养液稀释细胞，在96孔板各孔中接种5,000个细胞。37℃培养平板3-4天。发明人加入20μlMTT液并培育2小时，然后各孔加入100μl裂解液培育过夜。次日测定570nm时的吸光度。

绿荧光表达：以同样方法用含内皮抑制素-GFP的质粒转染293T细胞。培养36小时后荧光显微镜观察GFP荧光。

NSF60(GM-CSF依赖性)细胞增殖试验：为了定量测定内皮抑制素-GM-CSF的生物活性，采用了该因子依赖性细胞系NSF60。用转染了对照质粒、编码内皮抑制素-GM-CSF质粒的COS-7细胞条件培养液，或二种浓度的重组GM-CSF，培养NSF60细胞。培养48小时后，用2mg/ml Cell Titer 96TM MTS试剂粉末(3-(4’5-二甲基噻唑基-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯)-2-(4-磺基苯)-2H-四唑内盐)(Promega，USA)和0.92mg/ml吩嗪硫酸二甲酯(Sigma，USA)，测定作为生物活性标志的脱氢酶活性，确定NSF60细胞质增殖。

实施例4

融合蛋白拥有抗血管生成和治疗/诊断性二种功能

图2显示，与内皮抑制素比较endo-CD融合蛋白在内皮管(图2A-2D)和迁移(图2E-2H)试验中显示了类似的抗血管生成作用。从内皮抑制素基因转染细胞收集的上清液，从内皮抑制素-CD融合基因转染细胞收集的上清液显示了对HUVEC细胞管形成(图2A、2B、2C)和细胞迁移(图2E、2F、2G)的抑制作用。图2D和2H中，观察了5个视野，计数了内皮管和迁移细胞数并取平均值。

图3说明可测到融合基因的治疗或诊断性功能。图3A和3B中提供MTT试验结果。如所提供的不同浓度5FU或5FC与CD基因转染，可用荧光显微镜检测到转染endo-GFP融合基因的293T细胞中的绿荧光蛋白表达。图3D中，转染内皮抑制素-GM-CSF质粒的COS-7细胞的条件培养液可刺激NSF60细胞增殖。用转染内皮抑制素-GM-CSF质粒的COS-7细胞的条件培养液，培养的NSF60细胞上清液的OD₄₀₅值略高于用15.6nM重组GM-CSF蛋白培养细胞的值。因此，内皮抑制素-GM-CSF质粒编码的蛋白质显示了GM-CSF的功能，如GM-CSF依赖性NSF60细胞增殖所证明的那样。

实施例5

抗血管生成-治疗/诊断性融合蛋白的肿瘤特异性靶向作用的实验材料和方法体外内皮细胞的靶向

为了证明抗血管生成-治疗或诊断性融合基因的特异性靶向作用，发明人将原先建立的293T内皮抑制素-GFP稳定克隆细胞接种在10cm平板中。同时在4小室板中接种不同的细胞系(MDA-231乳腺癌细胞、小鼠内皮细胞SVEC和人内皮细胞HUVEC)。细胞粘附后，发明人将4孔板放入10cm板中，加入足够的培养液覆盖所有的孔。培养48小时后，用PBS洗涤4孔板，在荧光显微镜下观察绿荧光。

体内肿瘤靶向

发明人将2×10⁵个亲代细胞系或内皮抑制素-GFP稳定克隆的B16细胞皮下注射到7-9周龄的B57小鼠。各鼠注射二个部位。实验组中，发明人将B16亲代细胞注射在一部位，B16内皮抑制素-GFP细胞注射另一部位。对照组中，二部位均接受B16亲代肿瘤细胞。14天后，收集肿瘤并固定。发明人用抗GFP抗体作免疫组化染色。

实施例6

抗血管生成-治疗/诊断性融合蛋白的肿特异性靶向作用

图4显示内皮抑制素-GFP可特异性靶向内皮细胞。与293T内皮抑制素-GFP稳定克隆细胞培养48小时后，可在SVEC小鼠内皮细胞(E)但不是MDA-231乳腺癌细胞(B)中检测到大量绿色荧光信号。

图5。在B-16亲代肿瘤的血管壁中测到GFP信号。图5A显示实验组。B-16内皮抑制素-GFP稳定细胞系中可见弥散的GFP信号。图5B显示5A对侧的肿瘤(来自B-16亲代细胞系)中，血管壁中(

)发现GFP信号。图5C中，对照组来自双侧B-16亲代细胞系的肿瘤中未能测到GFP信号。

实施例7

动物模型的实验材料与方法

内皮抑制素--GFP抑制局部和远处肿瘤生长

用内皮抑制素一GFP质粒转染B16黑色素瘤细胞。建立稳定克隆后，发明人给7-9周龄的B57小鼠皮下注射来自亲代细胞系或内皮抑制素-GFP稳定克隆的2×10⁵个B16细胞。动物分成二组，每组10只小鼠，每鼠注射二部位。实验组中，发明人将B16亲代细胞注射在一部位，B16内皮抑制素-GFP细胞注射另一部位。对照组中，二部位均接受B16亲代肿瘤细胞。14天时收集肿瘤并计算。肿瘤体积±S.D绘图。

融合蛋白对局部肿瘤的高度抗癌作用

B16F10黑色素瘤模型一在6-7周龄的C57/BL6有免疫力雌鼠的右腹侧皮下注射1×10⁶个或2.5×10⁵个B16-F10细胞。接种4天后，将编码荧光素酶、内皮抑制素、IL12或内皮抑制素-IL12和阳离子脂质体复合物(100μl盐水中)的不同质粒DNA直接注射入肿瘤(约5mm直径)中。重复治疗每天三次，间隔四天。接种肿瘤17天后测定各实验组的肿瘤大小。

CT-26结肠癌模型--将CT-26结肠癌细胞(2×10⁵个)皮下注射到7-9周龄B57CL6小鼠右腹侧。同时将另一组CT-26黑色素瘤细胞(2×10⁵个)皮下注射到该小鼠左腹侧。肿瘤攻击四天后，在左侧CT-26肿瘤中注射含荧光素酶(Luc)、内皮抑制素(Endo)、白介素-12(IL-12)或Endo-IL12融合基因的不同质粒。重复此程序每周二次，每隔二天测定肿瘤大小。计算右侧远处肿瘤的大小并按治疗期绘图。

实施例8

抗血管生成-治疗/诊断性融合蛋白的动物模型

图6显示稳定克隆细胞表达的内皮抑制素-GFP抑制了对侧和局部的肿瘤生长。对照组中，测定了所有的肿瘤并取平均值。按细胞系(B16亲代黑色素瘤细胞系或内皮抑制素-GFP稳定克隆)测定实验组的肿瘤并取平均值。

图7显示与单用IL12或内皮抑制素相比，在不同的独立动物研究中，endo-IL12具有高度抗癌作用。图7A中为针对B16F10的肿瘤内基因治疗。与内皮抑制素和IL-12基因相比，内皮抑制素-IL12显示了对皮下异种移植物B16-F10黑色素癌有最显著的抗癌作用。图7B为与图7A相似的抗B16F10肿瘤的肿瘤内基因治疗，除最初远处肿瘤用2×10⁵个细胞攻击外。如图7C所示，endo-IL12仍显示比单用IL-12和内皮抑制素更好的疗效。

实施例9

融合蛋白对远处肿瘤抗癌作用的实验材料和方法

活体外转染：第0天，给7-9周龄的B57CL6小鼠右侧腹皮下注射B16-F10黑色素瘤细胞(2×10⁵个)。各组10只小鼠。发明人用含有荧光素酶(Luc)、内皮抑制素(Endo)、胞嘧啶脱氨酶(CD)和内皮抑制素-CD(end-CD)、肿瘤抑制素的抗血管生成缺失突变体(tum5)、白介素-12(IL-12)或Tum5-IL12融合基因的不同质粒转染B16F10黑色素瘤细胞。转染后收获这些黑色素瘤细胞在第一天注射到不同组小鼠的左腹侧。在第4、7、10天重复此程序3次。测定右腹侧远处肿瘤的大小，计算体积按治疗期绘图。

稳定的克隆：给7-9周龄B57CL6小鼠右腹侧皮下注射来2×10⁵个B16-F10黑色素瘤细胞。二天后，在左侧皮下注射B16F10癌细胞稳定表达内皮抑制素、IL-12或end0-IL12的克隆细胞2×10⁵个。每周二次反复注射稳定的克隆癌细胞。每二天测定右腹侧远处肿瘤的大小。

实施例10

融合蛋白对远处肿瘤的高度抗癌作用

图8显示稳定克隆或活体外转染表达的融合蛋白对远处肿瘤具有高度抗癌作用。图8A，内皮抑制素-CD融合基因抗血管生成-化疗的活体外治疗，显示对对侧肿瘤生长有较好的抑制作用(Endo：内皮抑制素；CD：胞嘧啶脱氨酶；Endo-CD：融合基因)。图8B显示Tum5-IL12融合基因抗血管生成免疫疗法的活体外治疗对远处肿瘤有较好的肿瘤抑制作用(Tum5：肿瘤抑制素抗血管生成缺失突变体；IL12：白介素-12；Tum5-IL12：融合基因)。图8C表明远处CT-26结肠癌的生长受到Endo-IL12基因治疗的最显著抑制。将各种基因注射到远离测定肿瘤部位的未直接注射基因治疗的CT-26肿瘤中。图8D显示用内皮抑制素-IL12稳定细胞系治疗远处肿瘤。Endo-IL12显示了比其它治疗蛋白更好的抗癌症效果。

实施例11

结果的显著性分析

以上结果显示，如本文提供的研究结果表明所证实的那样，搞血管生成融合基因可用于基因治疗和诊断试剂。图1中，该融合基因可导致融合蛋白的表达，用免疫印迹和ELISA可检测到。如图2和图3所示该融合蛋白是有功能的，具有抗血管生成能力，以及该功能至少部归功于该结合的蛋白质。在这些功能试验中，如内皮管形成和迁移试验所证明的那样，融合蛋白内皮抑制素-CD能抑制血管生成，程度上类似于野生型内皮抑制素。此外，结合于典型内皮抑制素的治疗/诊断性蛋白质仍具有其野生型式的功能。内皮抑制素-GFP能呈现绿色荧光。内皮抑制素-GM-CSF能诱导其生长依赖于GM-CSF的NSF60细胞增殖。内皮抑制素-CD可将无毒性的5-FC转变成有毒性的5-FU，从而杀伤293T和HUVEC(人脐带血管内皮细胞)细胞。

在体外(图4)和病理学研究(图5)中，内皮抑制素-GFP显示是内皮细胞特异性的。图4中，当与含内皮抑制素-GFP的条件培养液一起培养时只有内皮细胞(SVEC)显示GFP信号。图5中，内皮抑制素-GFP能从内皮抑制素-GFP稳定表达的克隆肿瘤(图5A)转移到远处亲代B16F10黑色素瘤细胞中，抗内皮抑制素-GFP抗体可检测到内皮抑制素-GFP(图5B)。相反，当不给携带B16-F10肿瘤的小鼠接种内皮抑制素-GFP稳定克隆肿瘤时，该亲代细胞则不显示GFP信号(图5C)。换言之，融合蛋白中的内皮抑制素组分可导致GFP蛋白在远处肿瘤血管部位表达。因此证明了可用抗血管生成蛋白(此例中是内皮抑制素)输送非肿瘤血管特异性蛋白(此例中是GFP)到肿瘤部位。此外，内皮抑制素-GFP在其它实施例中可作为诊断工具，因为可检测到GFP发出的荧光信号，内皮抑制素可靶向肿瘤的新生血管。

最后，该融合基因及其编码的蛋白质可用作治疗制剂。本发明人采用融合基因，如内皮抑制素-IL12治疗黑色素瘤(图7A和7B)和带有结肠癌的小鼠(图7C)，显示比单用内皮抑制素或IL-12具有高度抗癌症作用。这些基因编码的融合蛋白作为蛋白治疗制剂，在用该融合基因(图8C)或稳定的克隆(图8D)作为“蛋白质工厂”，活体外治疗肿瘤细胞(图8A和8B)或注射入已建株的肿瘤的其它动物研究中，也显示有效(图8)，并且所分泌的蛋白质能抑制远处肿瘤的生长。

实施例12

偶联有治疗性或诊断性制剂的抗血管生成抑制剂的活体内试验

抗癌症治疗剂的一种有用生物性能是其能减少体内致瘤性。为测试此可能性，在某些实施例中，本文的研究中没有利用偶联有治疗或诊断性制剂的血管抑制剂的抗肿瘤活性。例如，可在裸鼠癌症模型中进行活体内致癌性试验。可在培养板中通过SN脂质体输送融合基因转染示范性的癌细胞系，人乳腺癌细胞系MCF-7和前列腺癌细胞系PC-3。24小时后，小心收集受处理的细胞接种在裸鼠的乳房脂肪垫中(mfp)(对MCF-7)或皮下结缔组织(对PC-3)中。例如接种4百万个MCF-7细胞和1百万个PC-3细胞。用空载体pcDNA3转染的细胞作为对照。每周测定接种肿瘤的大小。

此种“活体内试验”绕过了体内基因输送问题，显示在最佳输送条件下，含有抗血管生成性能融合基因的肿瘤细胞比对照的肿瘤生长能力差。

实施例13

偶联有治疗性或诊断性制剂的抗血管生成抑制剂的体内试验

在某些实施例中，本领域技术人员根据本文所述制备偶联有治疗或诊断性制剂的血管生成抑制剂，如本文所述抗血管生成融合基因产物，用于以下体内研究。通过注射用偶联有治疗或诊断性制剂的血管生成抑制剂，治疗已长有肿瘤的小鼠，与适当的对照相比，显示能抑制小鼠肿瘤的生长。

乳腺癌的全身基因疗法包括，例如非病毒基因输送系统(SN)和融合基因。可全身给予SN-融合基因，显示能抑制例如植入裸鼠中的人乳腺癌细胞的生长和转移，某些实施例中，延长了被治疗动物的生命。

显然，上述方法证明本发明的特异性融合基因是有用的。按照本文提供的说明，本领域技术人员可制备和测试任何数量的融合基因的抗血管生成活性、抗细胞增殖活性、抗肿瘤活性、促凋亡活性或这些活性的组合。

实施例14

偶联有治疗或诊断性制剂的示范性血管生成抑制剂的测定

在动物研究中，如细胞系、细胞培养物和/或模型中，除上述实施例所述的之外，测试了偶联有治疗或诊断性制剂的血管生成抑制剂的相关抗肿瘤活性。在本发明的一般料施例中，通过载体，如脂质体、腺病毒载体或其组合，将融合基因输送给裸鼠模型观察其抗肿瘤活性。一旦证明了抗肿瘤活性，进一步用有免疫能力的小鼠检查潜在的毒性，随后进行临床试验。

在一具体实施例中，至少在一种动物中测定抗血管生成融合基因的优先的生长抑制活性。简而言之，例如，将癌细胞系注射到裸鼠乳房脂肪垫中产生乳腺异种植入物模型。任何癌细胞都包括在本发明的范围内，不论其基因型或表达水平(如不论是HER-2/neu阳性或HER-2/neu阴性)。在一具体实施例中，采用HER-2/neu过度表达的乳腺癌细胞系(如SKBR3和/或MDA-MB361)进行试验。当肿瘤长到特写大小时将融合基因，某些实施例中，将对照，与可接受运载体如脂质体的混合物给予小鼠。比较这些治疗所致的肿瘤大小和存活曲线，并作统计学分析。

本发明某些实施例中，采用小鼠动物模型研究靶向抗血管融合基因产品。在一具体实施例中，采用双侧黑色素瘤或结肠肿瘤模型。在另一实施例中，采用一侧肿瘤内基因治疗方案。在另一实施例中，在该靶向融合多肽中采用自杀性治疗基因，腹腔内给予动物模型前药(如5FC)然后输入自杀性治疗基因。在某些实施例中，测定对侧肿瘤大小来评价肿瘤靶向效果。除自杀性基因治疗外，也可采用，例如给予内皮抑制素-胞嘧啶脱氨酶和5FC作为前药，来评价内皮抑制素-IL12。在某些实施例中，也可测定同侧肿瘤的大小来评价化疗的效果。

实施例15

偶联有治疗或诊断性制剂的其它血管生成抑制剂的制备

根据上述实施例提供的资料和本说明书中的说明，加上专业知识，本领域技术人员将会有兴趣和能够制备偶联有治疗或诊断性制剂的其它融合性血管生成抑制剂，从而能确定其在本发明中采用本文所述方法学的用途。

实施例16

偶联有治疗或诊断性制剂的其它血管生成抑制剂的测定

除本文所述示范性实施例外，一旦产生了偶联有治疗或诊断性制剂的血管生成抑制剂，可如上所述用相关细胞系的细胞培养物进行测定。另外，可用FACS分析进行抗血管生成融合基因产品的测定。此外在具体实施例中，可采用本文所述的活体内系统或体内系统测定其它抗血管生成融合基因产品。

实施例17

临床试验

此实施例是关于采用偶联有治疗或诊断性制剂的血管生成抑制剂治疗人的方案的开发。在具体实施例中，该偶联有治疗或诊断性制剂的血管生成抑制剂，是包括蛋白质、肽或多肽，或编码抗血管生成融合蛋白、肽或多肽的核酸，单独或与其它药物组合的抗血管生成融合基因产品。在一具体实施例中，也采用其它药物来治疗血管生成，如抑制肿瘤。在一具体实施例中，用药物来治疗癌症。该抗血管生成融合蛋白质、肽或多肽，或编码抗血管生成融合蛋白、肽或多肽的核酸，和抗癌药物治疗可用于临床治疗各种癌症。这种治疗在对常规化疗方案具有抗性的肿瘤治疗，如治疗卵巢、乳腺、前列腺、胰腺、脑、结肠和肺癌患者中是特别有用的工具。

本领域技术人员通过阅读本说明书将会明白实行临床试验，包括患者的治疗和监测的各种要素。提供以下信息作为通用指导，以指导这些已建立的抗血管生成蛋白质、肽或多肽，或编码抗血管生成融合蛋白、肽或多肽的核酸在临床试验中的运用。

选择进行临床研究的患者是患转移性乳腺癌、上皮性卵巢癌、胰腺癌、结肠癌或其它癌症，和通常处于发生癌症高危险中，原先接受过癌症治疗现已缓解，或对至少一种常规治疗无反应的患者。在一示范性临床试验方案中，患者可在胸腔或腹腔中安置Tenckhoff导管或其它适合的装置，以便进行一系列的胸腹腔渗出液采样。通常希望知道胸腹腔中是否有已知的小室、肌酐水平在2mg/dl以下，胆红素水平在2mg/dl以下。患者应呈现正常的血凝模式。对于抗血管生成融合蛋白质、肽或多肽，或编码抗血管生成融合蛋白、肽或多肽的核酸，和其它抗癌药物的给药，可在胸腔或腹腔中放置Tenckhoff导管或其它装置，除非这些装置先前手术时已放好。可获得胸腹腔液的样品，从而可测定和记录此类液体中的基线水平、细胞组成、细胞学参数、LDH和相应的标记(CEA、CA15-3、CA125、PSA、p38(磷酸化和非磷酸化形式)细胞中的Akt(磷酸化和非磷酸化形式)(抗血管生成融合蛋白质、肽或多肽，或编码它们的核酸)。

以同样方法，可单独或与其它抗癌药物一起给予抗血管生成融合蛋白质、肽或多肽，或编码抗血管生成融合蛋白、肽或多肽的核酸。给药可在胸腹腔中，直接注射于肿瘤，或以全身方式。起始剂量可为0.5mg/kg体重。每剂可治疗3个患者，毒性不超过3级。可100％递增(0.5mg，1mg，2mg，4mg)提高剂量直到测到药物毒性相关等级2。此后剂量可按25％递增。如果对于某患者，大量的抗血管生成融合蛋白质、肽或多肽，或编码抗血管生成融合蛋白、肽或多肽的核酸，和大量抗癌药物应用，测到的内毒素联合水平超过5EU/kg，可将给予的剂量均分成二次输注，间隔6小时。

可在短时间内输注，或以恒定的输注速度在7-21天期间，给予抗血管生成融合蛋白质、肽或多肽，或编码抗血管生成融合蛋白、肽或多肽的核酸和/或其它抗癌药物有组合。可单独给予，或与抗癌药物和/或大黄素样酪氨酸激酶抑制剂一起，给予抗血管生成融合蛋白质、肽或多肽，或编码抗血管生成融合蛋白、肽或多肽的核酸输注。输注的剂量水平取决于每次所达到的毒性程度。因此，如果在一次输液，或以恒定速度输液一段时间后毒性达到II级时，应撒消下一步剂量或停止恒定速度输液除非毒性改善。可将增加剂量的抗血管生成融合蛋白质、肽或多肽，或编码突变蛋白、肽或多肽的核酸，与抗癌药物组合给予患者组，直到大约60％的患者显示了不可接受范围的III或IV级毒性。此值的2/3剂量可认为是安全剂量。

当然，在治疗前和间隔约3-4周后，应检查身体、测量肿瘤和作实验检测。实验检测应包括：CBC、分化和血小板计数、尿液检查、SMA-12-100(肝和肾功能试验)、血凝情况和任何其它合适的化学试验，以确定患病程度，或确定当前症状的原因。也应监测血清中的相应生物学标记，如CEA、CA15-3、p38(磷酸化和非磷酸化形式)和Akt(磷酸化和非磷酸化形式)、p185等。

为监测疾病进程和评价抗肿瘤反应，考虑应每隔4周检查患者的相应肿瘤标志，如果最初异常，每周检查CBC、分化和血小板计数二次共4周；如果没观察到骨髓抑制，每周一次。如果任何患者有长时间骨髓抑制，劝告作骨髓检查以排除肿瘤入侵骨髓引起各类血细胞减少。应每隔4周作血凝情况检查。应每周进行SMA-12-100。第一次给药后72小时可采取胸/腹腔渗出液样品，然后前二个疗程中每周一次，然后每4周一次直到研究进展或研究结束。可评估体液中的细胞组成、细胞学参数、LDH和相应的标志(CEA、CA15-3、CA125、ki67和Tunel试验以测定凋亡，Akt)和细胞中的Akt。当疾病可测定时应每隔4周记录肿瘤的测定数据。每隔8周应重复适当的放射检查评价肿瘤反应。首次治疗后4和8周和研究结束时重复肺呼吸量测定和DLCO。每隔4周作尿分析。

通过可接受的测定数据确定临床反应。例如，所有可测定的疾病参数消失至少一个月可认为是完全反应。而所有可评定的肿瘤结节两垂直直径之和减少50％或更多，或在至少一个月内未发现肿瘤增大，可认为是部分反应。类似地，在一个或多个部位疾病进程中，所有可测定的病损两垂直直径之和减少50％或更多，可认为是混合反应。

参考文献

本说明书所提到的所有专利和出版物表明了本发明涉及领域技术人员的水平。所有纳入本文作参考的专利和出版物以同样程度纳入，就象各出版物特定和单独纳入作参考那样。

专利

美国专利No.4,683,202

美国专利No.4,797,368

美国专利No.4,879,236

美国专利No.5,139，941

美国专利No.5,220,007

美国专利No.5,284,760

美国专利No.5,354,670

美国专利No.5,366,878

美国专利No.5,389,514

美国专利No.5,635,377

美国专利No.5,641,484

美国专利No.5,670,488

美国专利No.5,789,166

美国专利No.5,798,208

美国专利No.5,830,650

美国专利No.5,871,986

美国专利No.5,925,565

美国专利No.5,928,906

美国专利No.5,935,819

PCT国际专利申请WO 99/16889。

出版物

Folkman，Semin.Oncol，28(6)：536-542，2001.

Brem，Cancer Control，6(5)：436-458，1999.

Ferrara和Alitalo，Nat.Med.，5(12)：13591364，1999.

Keshet和Ben-Sasson，J.Cl in.Invest.，104(11)：14971501，1999.

Carmeliet和Jain，Nature，407(6801)：249-257，2000.

Folkman，N.ENGL.J.Med.，285(21)：1182-1186，1971.

Kerbel，J.Clin.Oncol.，19(18)：45S-51S，2001.

Risau，Circ.Res.，82(8)：926-928，1998.

Klohs和Hamby，Curr.Opin.Biotechnol.，10(6)：544-549，1999.

Rosen，Oncologist，5(1)：2027，2000.

Burke和DeNardo，Crit.Rev.Oncol.Hematol.，39(1-2)：155-171，2001.

Taraboletti和Margosio，Curr.Opin.Pharmacol.，1(4)：378-384，2001.

Glaspy，Semin.Oncol.，29(7)：41-46，2002.

Boehm，Nature，390(6658)：404-407，1997.

Thomas等，J.Clin.Oncol.，21(2)：223-231，2003.

Herbst等，J.Clin.Oncol.，20(18)：3792-3803，2002.

Eder等，J.Clin.Oncol.，20(18)：3772-3784，2002.

Beecken Kramer，和Jonas，J.Cell Mol.Med.，4(4)：262-269，2000.

Bouma-ter Steege等，Crit.Rev.Eukaryot.Gene Expr.，11(4)：319-334，2001.

Cao，Prog.Mol.Subcell.Biol.，20：161-176，1998.

Cao，Int.J.Biochem.Cell Biol.，33(4)：357-369，2001.

Folkman，Semin.Oncol.，29(6：16)：15-18，2002.

Kirsch等，Neurooncol.，50(1-2)：173-180，2000.

Ryan和Wilding，Drugs Aging，17(4)：249-255，2000.

Reed，Nat.Rev.Drug Discov.，1(2)：111-121，2002.

Baliga和Kumar，Hematol.Oncol.，20(2)：63-74，2002.

Chao和Korsmeyer，Annu.Rev.Immunol.，16：395-419，1998.

Trinchieri，Nat.Rev.Immunol.，3(2)：133-146，2003.

Leonard等，Blood，90(7)：2541-2548，1997.

Yang等，CANCER BIOTHER.Radiopharm.，17(2)：233-245，2002.

Halin等，Nat.Biotechnol.，20(3)：264269，2002.

Carnemolla等，Blood，99(5)：1659-1665，2002.

Scappaticci等，Angiogenesis，4(4)：263-268，2001.

Veenendaal等，99(12)：7866-7871，2002.

Arora等，Cancer Res.，59(1)：I83-188，1999.

Hotz等，J.Gastrointest.Surg.，6(2)：159-166，2002.

Huang等，Science，275(5299)：547-550，1997.

Kreitman，Curr.Opin.Immunol.，11(5)：570-578，1999.

Penichet和Morrison，J.Immunol.Methods，248(1-2)：91101，2001.

Lode等，Proc.NATL.Acad.Sci.USA，96(4)：1591-1596，1999.

Ruehlmann等，Cancer Res.，61(23)：8498-8503，2001.

Dreier等，Bioconjug.Chem.，9(4)：482-489，1998.

Niethammer等，Cancer Res.，61(16)：6178-6184，2001

虽然本发明的内容及其优点已作了详细描述，但应知道可作出各种变化、替代和改变而不脱离本文权利要求所确定的思路和范围。然而，本发明的范围不希望受到此说明书所述的过程、机制、制造方法、材料的组成、工具、方法和步骤的限制。本领域技术人员不难理解，可利用本发明公开的内容、现有的或后来发展的过程、机制、制造方法、材料的组成、工具、方法和步骤，进行基本上相同的工作或获得基本上与相应实施例相同的结果。因此本发明的权利要求将这类过程、机制、制造方法、材料的组成、工具、方法和步骤包括在其范围内。

序列表

<110>M.-C.恒(HUNG，MIEN-CHIE)

     K.-L.兰(LAN，KENG-LI)

     F.欧阳(OU-YANG，FU)

     J.-C.刘(LIU，JAW-CHING)

     K.-H.兰(LAN，KENG-HSIN)

<120>递送治疗或诊断试剂的导向蛋白质

<130>UTFC：797WO

<140>未知

<141>2003-05-06

<150>60/383,063

<151>2002-05-06

<160>42

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>1606

<212>DNA

<213>单纯疱疹病毒

<400>1

<210>2

<211>1659

<212>DNA

<213>单纯疱疹病毒

<400>2

<210>3

<211>1524

<212>DNA

<213>水痘带状疱疹

<220>

<221>modified_base

<222>(1199)

<223>n＝a，c，g，t/u

<400>3

<210>4

<211>1634

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>4

<210>5

<211>2457

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>5

<210>6

<211>2048

<212>DNA

<213>假单胞菌属(Pseudomonas)

<400>6

<210>7

<211>2191

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>7

<210>8

<211>1616

<212>DNA

<213>球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)

<400>8

<210>9

<211>2409

<212>DNA

<213>巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)

<400>9

<210>10

<211>876

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>10

<210>11

<211>1167

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>11

<210>12

<211>1622

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>12

<210>13

<211>1705

<212>DNA

<213>木薯(Manihot esculenta)

<400>13

<210>14

<211>1057

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>14

<210>15

<211>1718

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>15

<210>16

<211>2521

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>16

<210>17

<211>4741

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>17

<210>18

<211>809

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>18

<210>19

<211>340

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>19

<210>20

<211>585

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>20

<210>21

<211>422

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>21

<210>22

<211>10907

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>22

<210>23

<211>756

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>23

<210>24

<211>4830

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>24

<210>25

<211>737

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>25

<210>26

<211>5961

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>26

<210>27

<211>2430

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>27

<210>28

<211>5561

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>28

<210>29

<211>674

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>29

<210>30

<211>9900

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>30

<210>31

<211>1102

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>31

<210>32

<211>1589

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>32

<210>33

<211>8868

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>33

<210>34

<211>1444

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>34

<210>35

<211>2347

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>35

<210>36

<211>1202

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>36

<210>37

<211>306

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>37

<210>38

<211>1062

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>38

<210>39

<211>738

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>39

<210>40

<211>2780

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>40

<210>41

<211>966

<212>DNA

<213>维多利亚水母(Aequorea victoria)

<400>41

<210>42

<211>2387

<212>DNA

<213>Photinus pyralis

<400>42

Claims (6)

1.一种编码多肽的核酸，所述多肽为连接有胞嘧啶脱氨酶的内皮抑制素多肽。

2.一种方法，包括将实体癌肿瘤中的癌细胞与权利要求1所述的核酸接触，所述方法不用于治疗目的。

3.如权利要求2所述的方法，所述癌细胞选自头颈癌、卵巢癌、甲状腺癌、口腔癌、前列腺癌、黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、血管瘤、肉瘤、肺癌、脑癌、胰腺癌、肝癌、膀胱癌或胃肠道癌。

4.如权利要求2所述的方法，所述核酸包含在质粒、逆病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或脂质体中。

5.如权利要求2所述的方法，所述核酸分散在药学上可接受的赋形剂中。

6.权利要求1所述核酸用于制造治疗实体癌的药物的用途。

Images