CN101031798B - 侧向流系统和测定 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含测试条的侧向流测定和系统，用于检测和定量样本中的分析物，诸如包含细胞和液体的样本。一般的，本发明的用于侧向流测定，以便检测样本中的至少一种分析物的测试条包含：(1)层析条、样本过滤器、液体不可渗透的屏障、用于提供可结合到至少一种分析物上，或者在捕获分析物之后结合到捕获试剂的一种可移动的可检测试剂的工具，从而使可移动的可检测试剂通过层析条迁移，并与已经通过样本过滤器并也已通过层析条迁移的样本接触。测试条能检测(和定量)含有全细胞的样本中的分析物。

Description

侧向流系统和测定
发明人：周思亮、W.J.若特和刘宁
相关申请的交叉引用
本申请在此要求Zhou等人2005年6月2日提交的题为“定量侧向流系统和测定”的PCT申请(申请号PCT/US05/19348)、以及Zhou等人2004年7月29日提交的同样题为“定量侧向流系统和测定”的美国临时专利申请No.60/592,202的优先权。这两篇在先申请的公开内容通过引用全部结合于此。
技术领域
本申请一般涉及定性和定量测定及系统，该定性和定量测定及系统用于检测生物样本中，尤其是包含全血、红细胞、白细胞、或其它细胞类型的样本中至少一种分析物的存在，并测定或定量该至少一种存在的分析物的数量。
背景技术
很多人尝试设计用于检测例如包含全血、红细胞、白细胞的血液样本的生物样本中分析物的存在和数量的侧向流分析，但失败了。失败的原因很多，但可能主要归因于以下因素：例如产生高背景噪声的红细胞溶血、例如导致红细胞渗漏到层析条上的低过滤效率、需要相对较大量的样本(例如需要100μl样本或以上)、溶解偶联物或可检测试剂的低效、当存在细胞时由于细胞体积变化引起的体积变化、分析时间长。需要设计能够克服现有技术中一个或多个此类问题的侧向流测定和系统。
此外，需要简化用于侧向流测定的测试条的结构以提高测定效率和降低制造成本。
Polito等人的美国专利No.6,136,610阐述了用于实施侧向流测定的方法和装置。Thayer等人的美国专利No.6,528,323阐述了用于进行侧向流测定的双向侧向流测试条和方法。尽管这些专利中阐述的方法和系统对于检测和定量大多数分析物是有用的，但这些专利未教授这些方法和系统如何能用于分析含有包括红细胞和/或白细胞或其它细胞类型的细胞的样本。PCT出版的已公开专利申请No.WO03/008933阐述了用于对包含全细胞的样本进行侧向流测定的测试条。然而，WO03/008933中的测试条可被改良以简化结构、提高效率、可靠性、减少体积相关性并减少制造成本。
不同的策略已被用于从例如血液样本的样本中去除例如红细胞的细胞，以便于检测分析物，例如传染性疾病生物体或针对传染性疾病生物体的抗体。然而，至今为止，很少策略能有良好效果。例如，Doshi等人的美国专利No.5,766,552公开了使用多孔材料，诸如包含游离凝集剂和与成核微粒密切相关的微粒相关凝集剂的吸收垫。该过滤系统需要大约100μl全血，如图4中所示。
人类红血球在它们的细胞表面上包含几种跨膜蛋白质，这几种跨膜蛋白质可能是制造针对红细胞的抗体的合适靶点。例如，带3与氯化物和重碳酸盐穿越细胞元件的电中性交换相关联。带3是911氨基酸的糖蛋白，具有结合细胞骨架、血色素和糖酵解酶的43kDa氨基末端细胞溶质结构域，以及介导阴离子转运的52kDa羧基末端细胞元件结构域，如Wang，D.N.(1994)中所阐述的。
已提纯带3的两种肽，C1包含Ala893-Va1911而KS4包含Gly647-Arg656，如在Fu，G.等人(2004)中描述的，肽C1被发现具有酶活性，以剂量相关的方式在Leu118-SeM19处分解血型糖蛋白A9(GPA)，但肽KS4在相同条件下不分解GPA。
人红血球在它们的细胞表面上还包含另一种蛋白，血型糖蛋白。已报道血型糖蛋白(GPA)增强爪蟾卵细胞表面上带3阴离子转运活性的表达。Young，MT.和Tanner，M.J.(2003)。作者发现GPA的C末端胞质尾区增强带3向细胞表面的穿行，而细胞外剩余部分68-70增加带3的特殊阴离子转运活性。
至今为止，还是缺乏能用于在医疗点环境测定诸如血液样本的生物样本中的分析物的快速、有效和高效定量的侧向流测定和系统，或者能用于测定存在于例如从针刺手指得到的少量样本中的分析物的侧向流测定和系统，或者与量无关的能用于测定分析物的、或解决现有技术侧向流测定和系统中其它问题的侧向流测定和系统。
发明内容
因此，本发明的一个目的是为用于测定生物样本中的分析物的现有技术侧向流测定和系统所面临的问题提供解决方案，这些生物样本包括但不限于包含诸如红细胞、或白细胞、或其它细胞类型的细胞的样本。
本发明的另一目的是提供侧向流测定和系统，包含测试条和/或用于容纳该测试条的盒，该侧向流测定和系统可定量检测样品中的一种或多种分析物。
本发明的又一目的是提供如上的与现有技术的测定或系统相比，与量无关的侧向流测定和系统。
本发明的再一目的是提供如上的能使用少量样本实现的侧向流测定和系统，该量为例如在小于约100μl的范围内。或者，取样量少于约90μl，小于约80μl，小于约70μl，小于约60μl，小于约50μl，或为约40μl。
本发明的另一目的是提供如上的对溶解偶联物或可检测试剂有效的侧向流测定和系统。
本发明的又一目的是提供如上的提供对诸如红细胞的细胞的良好过滤的侧向流测定和系统。
根据本发明的目的之一，提供如下发明。
一般而言，本发明的一个实施方式包括用于侧向流测定的测试条，用于检测或定量含液体样本中的至少一种分析物，该测试条包括：
(1)第一元件，其中该第一元件包含样本过滤器，而该样本过滤器包含第一孔径和任选的第一凝集剂(agglutinating agent)；
(2)可任选地，第二元件，其中该第二元件包含第一液体收集器，而该第一液体收集器包含第二孔径，其中第二元件如果存在则与第一元件毛细作用接触；
(3)可任选地，第三元件，其中该第三元件包含偶联物垫，并且该偶联物垫如果存在则直接或间接地与层析条毛细作用接触，且其中偶联物垫包含至少一种可移动的可检测试剂，而该至少一种可移动的可检测试剂是第一可移动的可检测试剂；
(4)第四元件，其中该第四元件包含层析条，所述层析条包含第一端和第二端、至少一个捕获带、至少一个任选地包含对照试剂的对照带、和可任选地至少一种可移动的可检测试剂，其中该至少一种可移动的可检测试剂是第二可移动的可检测试剂，其中至少一个捕获带包含用于捕捉至少一种分析物的固定捕获试剂，其中层析条允许液体从第一端向第二端或从第二端向第一端的侧向流动，并且其中层析条与第一、第二或第三元件中的至少一个直接或间接地毛细作用接触；
(5)可任选地，第五元件，包含用于施加样本、缓冲液、或试剂的缓冲液垫，其中该第五元件如果存在则与第四元件毛细作用接触，并可任选地包含第二凝集剂；
(6)第六元件，其中该第六元件包含第一吸收垫，并且该第一吸收垫与层析带直接或间接毛细作用接触。
(7)可任选地，第七元件，其中该第七元件包含第二吸收垫，并且该第二吸收垫如果存在则与第六元件毛细作用接触；以及
(8)可任选地，第八元件，其中该第八元件包含第二液体收集器，并且该第二液体收集器如果存在则与第四元件和第五元件(如果存在)毛细作用接触；以及
其中测试条被配置成允许样本中至少一种分析物的检测或定量，并且样本包含红细胞。
测试条可包含第二元件，且第二孔径与第一孔径的比可小于约20并大于约1。
在一个可选实施方式中，测试条包含第二元件，并且其中第一元件的至少一部分置于第二元件之上。
在另一个可选实施方式中，测试条包含第二元件和偶联物垫，并且第一元件通过第二元件与偶联物垫毛细作用接触，但不与偶联物垫物理接触。
在又一个可选实施方式中，测试条包含第五元件，并且第五元件包含第二凝集剂。
在再一个可选实施方式中，第一吸收垫与第五元件直接或间接毛细作用接触。
本发明的另一个实施方式包含用于侧向流测定的测试条，该侧向流测定用于检测含液体样本中的至少一种分析物，该测试条包含：
(1)包含样本滤过器的第一元件，其中样本滤过器可任选地包含凝集剂；
(2)包含层析条的第二元件，其中层析条包含第一端和第二端、至少一个包含用于捕获至少一种分析物的固定捕获试剂的捕获带、至少一个对照带、以及可任选地第一可移动的可检测试剂，其中层析条支撑液体从第一端向第二端或从第二端向第一端的侧向流动，并且其中层析条与样本过滤器毛细作用接触；
(3)可任选地，包含偶联物垫的第三元件，其中该偶联物垫包含第二可移动的可检测试剂，并且偶联物垫如果存在则与层析条毛细作用接触；
(4)包含缓冲液垫的第四元件，其中缓冲液垫与偶联物垫或层析条毛细作用接触；
(5)包含第一吸收垫的第五元件；
(6)可任选地，包含第二吸收垫的第六元件；和
(7)可任选地，包含第一液体收集器的第七元件；
其中测试条被配置成允许样本中至少一种分析物的检测(定量或非定量)，并且样本包含红细胞。
本发明的再一个实施方式包含用于侧向流测定的测试条，该侧向流测定用于检测样本中的至少一种分析物，测试条包含：
(1)具有第一端和第二端的层析条，该测试条包含用于捕获分析物的捕获带；
(2)与层析条的第一端可操作性接触的液体传递元件，该液体传递元件选自样本垫或第一样本过滤器，该液体传递元件被放置为使施加到液体传递元件的液体经过液体传递元件传递并被施加到层析条；
(3)至少一个与液体传递元件可操作性接触的吸收垫；
(4)可任选地，与层析条的第二端可操作性接触的偶联物垫，该偶联物垫包含分析物的带标记的特异性结合配偶体(partner)；
(5)液体收集器，与偶联物垫(如果存在)或(如果不存在偶联物垫)与层析条的第二端可操作性接触，以使施加到液体收集器的液体经过液体收集器传递至偶联物垫(如果存在)，或传递至层析条的第二端(如果偶联物垫不存在)；
(6)第二样本过滤器，与液体收集器可操作性接触，以使经过第二样本过滤器传递的液体被施加到液体收集器；和
(7)可任选地，与层析条的一侧相接触的衬垫，衬垫被设置成使液体能够无障碍地从与层析条第一端可操作性接触的液体传递元件和从与层析条第二端可操作性接触的液体收集器或偶联物垫进入层析条。
本发明的又一个实施方式包含用于侧向流测定的测试条，该侧向流测定用于检测样本中的至少一种分析物，该测试条包含：
(1)具有第一端和第二端的层析条，测试条包含用于捕获分析物的捕获带；
(2)与层析条的第一端可操作性接触的第一样本过滤器，该第一样本过滤器放置成使施加到第一样本过滤器的液体经过第一样本过滤器传递并被施加到层析条；
(3)与至少一部分第一样本过滤器可操作性接触的至少一个吸收垫，从而该至少一个吸收垫能在层析条第一端从层析条抽出液体，该液体经过样本过滤器被吸回；
(4)可任选地，与层析条的第二端可操作性接触的偶联物垫，该偶联物垫包含分析物的可流动的带标记特异性结合配偶体；
(5)液体收集器，它与偶联物垫(如果存在)，或者与层析条的第二端(如果不存在偶联物垫)可操作性接触，以使施加到液体收集器的液体经过液体收集器传递至偶联物垫(如果存在)，或传递至层析条的第二端(如果偶联物垫不存在)；
(6)第二样本过滤器，与液体收集器可操作性接触，以使经过第二样本过滤器传递的液体被施加到液体收集器；和
(7)可任选地，与层析条的一侧相接触的衬垫，衬垫被设置成使液体能够无障碍地从与层析条第一端可操作性接触的第一样本过滤器、和从与层析条第二端可操作性接触的液体收集器或偶联物垫进入层析条。
本发明的又一个实施方式包含用于侧向流测定的测试条，该侧向流测定用于检测样本中的至少一种分析物，该测试条包含：
(1)包含第一端和第二端的层析条、包含用于捕获至少一种分析物的固定捕获试剂的至少一个捕获带、以及包含固定对照试剂的至少一个对照带；
(2)偶联物垫，其中偶联物垫与层析条的第二端毛细作用接触，且其中偶联物垫包含可移动的可检测试剂，该可检测试剂能够结合至少一种分析物或在捕获分析物后结合捕获试剂；
(3)在靠近第二端的一侧上毗邻偶联物垫的样本过滤器，其中样本过滤器可任选地包含凝集剂，并且样本过滤器与层析条毛细作用接触；
(4)可任选地，液体收集器(如果存在)置于样本过滤器和层析条之间；
(5)可任选地，置于层析条第一端处并与层析条毛细作用接触的缓冲液垫；
(6)置于层析条第一端处并与层析条直接或间接毛细作用接触的第一吸收垫；和
(7)可任选地，第二吸收垫(如果存在)与第一吸收垫毛细作用接触；其中测试条允许检测(定量或非定量)包含全细胞的样本中的分析物。
本发明的一组实施方式为：其中液体不可渗透的屏障至少一部分位于与层析介质第一端可操作接触的任何液体传递元件与层析介质之间，从而通过迫使液体在不可渗透的屏障下流动到层析介质第一端，暂时阻止通过液体传递元件的液体向层析介质的第一端方向流动。这提高了测定的灵敏度。屏障可以各种能实现该目的的配置存在，例如可以与第一端平齐(flush)或靠近第一端。
通常，本发明的一个使用液体不可渗透屏障的实施方式包括用于侧向流测定的测试条，该侧向流测定用于检测样本中的至少一种分析物，该测试条包含：
(1)包含第一端和第二端的层析条；
(2)位于层析条上的至少一个捕获带，其中捕获带包含用于捕获至少一种分析物的固定捕获试剂；
(3)可任选包含固定对照试剂的至少一个对照带；
(4)与层析条的第一端可操作性接触的第一样本过滤器，该第一样本过滤器可任选的含有用于凝集样本中细胞的凝集剂；
(5)液体不可渗透屏障，其中该屏障与层析条第一端直接物理接触，至少部分位于样本过滤器下，从而迫使来自样本过滤器的液体在不可渗透的屏障下流动到层析条第一端，以显著(substantially)延迟其从样本过滤器向层析条流动；和
(6)用于提供可移动的可检测试剂的工具，该试剂能与至少一种分析物或捕获试剂结合；和
(7)用于吸收过量液体的工具；
其中测试条能定量或非定量检测含有全细胞的样本中的分析物。
在本发明的另一个实施方式中，提供了如上的测试条，其中用于提供可移动的可检测试剂的工具包括偶联物垫，其中偶联物垫保留可移动的可检测试剂，直到在偶联物垫上加上液体以释放可移动的可检测试剂。
在另一个实施方式中，提供了如上的测试条，还包含缓冲液垫。在本发明的一个方面，缓冲液垫位于层析条的第二端或靠近第二端，并与偶联物垫直接物理接触。
在另一个实施方式中，提供了如上之一或多个的测试条，还含有第一吸收垫。在本发明的一个方面，第一吸收垫位于层析条的第一端或靠近第一端，并与层析条直接物理接触。
在本发明的另一个实施方式中，提供了如上的测试条，还包含第二吸收垫。在本发明的一个方面，第二吸收垫与第一吸收垫或层析条毛细作用接触。
在本发明的另一个实施方式中，提供了如上之一或多个的测试条，还包含第二样本过滤器。在本发明的一个方面，第二样本过滤器任选含有凝集剂。在本发明的另一个方面，第二样本过滤器与层析条毛细作用接触，并位于层析条的第二端或靠近第二端。
在本发明的另一个实施方式中，提供了如上的测试条，还包含液体收集器。在本发明的一个方面，液体收集器位于第二样本过滤器和偶联物垫之间，并与它们毛细作用接触。
在本发明的另一个实施方式中，提供了如上之一或多个的测试条，其中液体收集器位于第二样本过滤器和层析条之间，与它们直接物理接触。
在本发明的另一个实施方式中，提供了如上之一或多个的测试条，其中偶联物垫与第二样本过滤器和液体收集器毛细作用接触。
在本发明的另一个实施方式中，提供了如上之一或多个的测试条，其中：
(1)第一和第二样本过滤器每一个都可任选的含有凝集剂，第一和第二样本过滤器每一个都与层析条毛细作用接触，第一样本过滤器位于层析条的第一端或靠近第一端，第二样本过滤器与层析条的第二端相邻；
(2)液体收集器位于第二样本过滤器和层析条之间，并且与第二样本过滤器和层析条均毛细作用接触；
(3)偶联物垫位于层析条的第二端，与第二样本过滤器和液体收集器毛细作用接触；
(4)液体不可渗透的屏障与层析条的第一端直接物理接触，位于第一样本过滤器下方，从而迫使来自第一样本过滤器的液体在不可渗透屏障下流动到层析条第一端，以显著延迟其从样本过滤器向层析条第一端流动；和
(5)位于层析条第一端的第一吸收垫，它与层析条直接物理接触，并且比第一样本过滤器更靠近层析条的第一端；和
(6)可任选的，第二吸收垫，如存在，与第一吸收垫或层析条毛细作用接触。
在本发明的另一个实施方式中，提供了如上之一或多个的测试条，其中：
(1)液体收集器位于第二样本过滤器和层析条之间，与第二样本过滤器和层析条均直接物理接触；
(2)偶联物垫位于层析条的第二端，与第二样本过滤器直接物理接触，与液体收集器间接接触；
(3)液体不可渗透的屏障与层析条的第一端和第一样本过滤器直接物理接触，其中通过迫使来自第一样本过滤器的液体在不可渗透屏障下流动到层析条第一端，以显著延迟其从第一样本过滤器向层析条第一端流动。
本发明的还有一个实施方式是盒，含有本发明的测试条，其中该盒适合在装置中读数。
本发明的还有一个实施方式是用于进行检测或测定测试条上的分析物的测定法的仪器，该仪器包含：
(1)至少两个舱(bay)，每个舱装有本发明的盒；
(2)用于检测在插入每个舱中的盒的窗口-1和窗口-2中有液体加入的传感器；
(3)用于控制舱中的盒温的工具；和
(4)用于检测或测定每个盒中各测试条上被检测或测定的分析物、并报告分析物的每次检测或测定的工具。
本发明的还有一个实施方式是进行侧向流测定的方法，该侧向流测定是用于检测或测定含有液体的样本中的分析物，包括步骤：
(1)提供本发明的测试条；
(2)将样本加到样本过滤器中，足够使样本中的液体从样本过滤器移动到捕获带上，和；
(3)通过直接或间接在偶联物垫上加入样本或缓冲液，使可检测试剂移动，从而使可检测试剂移动到捕获带；和
(4)捕获样本中的分析物(如果存在)，捕获带上的可移动的可检测试剂检测或测定分析物的存在。
本发明的其它目的、特征或优点将在以下描述中部分地阐述，并且对于本领域普通技术人员而言在阅读本文的描述后将部分地变得显易见，或可通过实践本发明获知。本发明的目的和优点将通过特别在发明内容和所附权利要求中指出的元件和组合来实现和获得。此外，说明书中描述的优点，如果不包含在权利要求中，则不是对所公开发明的本质的限制。
本文中示意性地描述的发明在缺少任何未具体在此公开的元件或诸元件、限制或诸限制的情况下可被适当地实践。因此，例如，术语“包括”“包含”“含有”等都应理解为是可扩展的和无限制的。另外，本文中所采用的术语和表达作为描述的术语使用而不是限制，且并非旨在排除任何将来示出和描述的等效物或其任何部分来使用这些属于和表达，并且认识到在本发明权利要求要求的范围内各种改变都是可能的。因此，应理解：尽管本发明已通过优选实施方式和可选特征具体地公开，但本领域技术人员可采取本文所公开的本发明的更改和变化，并且这样的更改和变化被视为在本文公开的发明范围内。在此已对本发明进行了广泛的和一般性的描述。包含在上位公开范围内的狭义种类和亚属分类也形成这些发明的一部分。这包括以某种条件或否定限制从类中排除了任何主题内容的对每一发明的一般性描述，而与所排除的内容是否具体落入该一般性描述无关。另外，当对其它另选的实施方式有描述时，本发明的主题不应限于优选的实施方式。
另外，发明的特征和方面按照马库什(Markush)组描述时，本领域技术人员将认识到本发明因此也可以按照马库什组中任何单独成员或成员的亚组进行描述。还应理解以上描述是为了说明而不是限制。阅读以上描述后很多实施方式对于本领域人员而言将变得显而易见。本发明的范围因此不应参考上述描述确定，而是应参考所附权利要求和这些权利要求授权的整个等效范围来确定。所有文章和参考(包括专利申请)的公开通过引用结合于此。
附图说明
图1是用于容纳本发明测试条的盒的一个示例的平面俯视图。
图2是本发明测试条的一个实施方式的侧视图，其中样本施加在窗口1上。
图3是本发明测试条的另一实施方式的侧视图，其中样本施加在窗口2上。
图3A是图3所示装置的变体的侧视图，其中使用了缓冲液垫。
图3B是图3所示装置的另一变体的侧视图，其中缓冲液垫与层析介质直接接触。
图4是本发明测试条的又一个实施方式的侧视图，其中样本可施加在窗口1和窗口2上。
图4A是图4所示装置的一个变体的侧视图，其中使用了缓冲液垫。
图4B是图4所示装置的另一个变体的侧视图，其中缓冲液垫与层析介质直接接触。
图5是本发明测试条的一个实施方式的俯视图，和可与该测试条一起使用的盒的平面俯视图，示出了测试条和测试条的能在盒中看见的各个部分之间的对应性。
图6是本发明测试条的一个实施方式的俯视图，示出了在窗口1施加样本和在窗口2施加缓冲液后液体的双向流动。
图7是本发明测试条的另一个实施方式的俯视图，示出了在窗口1和在窗口2施加样本后液体的双向流动。
图8是测试条的总体类似于图3的另一实施方式的侧视图，但在该实施方式中，样本过滤器(18′)与层析介质(11′)通过液体收集器(19′)接触；从而偶联物在溶解后，过滤样本；或另选地，偶联物能够通过加入缓冲液溶解，然后加入血样(通常通过窗口2)。
图9是测试条的总体类似于图4的又一实施方式的侧视图，但在该实施方式中样本过滤器(18′)与层析介质(11′)通过液体收集器(19′)接触；从而偶联物在溶解后，过滤样本；或另选地，偶联物能够通过加入缓冲液溶解，然后加入血样(通常通过窗口2)。
图10是测试条的总体类似于图3和8的再一实施方式的侧视图，但在该实施方式中，样本过滤器(18＂)完全在液体收集器(19＂)上方；并且与层析介质(11＂)通过液体收集器(19＂)接触；从而偶联物在溶解后，过滤样本；或另选地，偶联物能够通过加入缓冲液溶解，然后加入血样(通常通过窗口2)。
图11是测试条的总体类似于图4和9的再一实施方式的侧视图，但在该实施方式中，样本过滤器(18＂)完全在液体收集器(19＂)上方；并且与层析介质(11＂)通过液体收集器(19＂)接触；从而偶联物在溶解后，过滤样本；或另选地，偶联物能够通过加入缓冲液溶解，然后加入血样(通常通过窗口2)。
图12是测试条的总体类似于图2的另一个实施方式的侧视图，但在样本过滤器或缓冲液垫下的第一端使用双面胶带。双面胶带也可以相似方式用于例如图4、4a、4b、9和11的装置中。
图13是测试条的总体类似于图3的另一个实施方式的侧视图，但在样本过滤器或缓冲液垫下的第一端使用双面胶带。双面胶带也可以相似方式用于例如图3、3a、3b、8和10的装置中。
图14是测试条的一个实施方式的详细侧视图，该测试条能使用金抗-DNP抗体和DNP-BSA作为对照来实施对人类丙型肝炎病毒(HCV)的间接测定。
图15是测试条的一个实施方式的详细侧视图，该测试条能使用金抗-DNP抗体和DNP-BSA作为对照来实施前列腺特异性抗原(PSA)夹心测定。
图16是测试条的一个实施方式的详细侧视图，该测试条能使用金抗-DNP抗体和DNP-BSA作为对照来实施人类HIV特异性抗体夹心测定。
图17是测试条的一个实施方式的详细侧视图，该测试条能使用金抗-DNP抗体和DNP-BSA作为对照来实施人类HIV特异性抗体间接测定。
图18是测试条的一个实施方式的详细侧视图，该测试条能使用金抗-DNP抗体和DNP-BSA作为对照来实施人类HIV特异性抗体和HCV特异性抗体间接测定。
图19是测试条的一个实施方式的详细侧视图，该测试条能使用金抗-DNP抗体和DNP-BSA作为对照来实施乙型肝炎表面抗原(HbsAg)和梅毒螺旋体(Treponema pallidum)抗体夹心测定。
本发明的详细描述
本发明公开了侧向流测定方法和系统，该方法和系统包含测试条和/或用于容纳该测试条的盒，用于测定样本中分析物的存在和/或数量，样本包括但不限于含以下物质的生物样本或其它样本：抗原、抗体、激素和其它分泌性蛋白、细胞表面蛋白、跨膜(transelement)蛋白、糖蛋白、酶、与细胞或其它蛋白相关联的蛋白、与例如细菌、病毒、真菌的病原体相关的蛋白、碳水化合物、药物、肽、毒素、核酸、小分子和适体。这种新的测定或系统能检测和/或定量少量样本中的分析物。通常，采样量小于约100μl，或小于约90μl，小于约80μl，小于约70μl，小于约60μl，小于约50μl，或约40μl。该测定或系统也能在样本中将液体与细胞分离，诸如红细胞、或白细胞、或其它细胞类型。该测定或系统基本上是与量无关的，从而不管样本中所存在的红细胞的体积的变化如何，结果都是恒定的。该测定或系统还具有低背景干扰和高效率。
I.本发明测定装置中使用的测定形式的一般原理
通常，本发明的测定装置可以进行免疫测定等测定法，或其它以夹心形式或间接测定形式进行的特异性结合测定法。
A.夹心测定形式
一般，本发明测定装置所进行的夹心测定形式被定义为一种测定形式，其中通过同时与两种分子结合而检测分析物，其中与分析物结合的两种分子都与分析物具有特异性亲和力。与分析物结合的分子之一被标记，并且是可移动的，而与分析物结合的另一种分子未标记，与层析条结合，如下所述。夹心测定形式也在本文中被称为直接测定形式。该形式与间接测定不同，如下文(B)部分所述。
对于夹心测定，如果分析物是抗原，则与分析物结合的两种分子都可以是与该抗原特异性结合的抗体。如果分析物具有相同表位的多个拷贝，例如聚合物或聚集物，或具有多个重复氨基酸序列区域的蛋白质，那么与分析物结合的两种分子可以是相同的抗体，它们与分析物上的相同表位结合。如果分析物不具有多个可被抗体结合的相同表位的拷贝，则与分析物结合的这两种分子将必须与不同表位结合。如果分析物本身是抗体，那么与分析物结合的分子之一可以是该抗体特异性针对的抗原；如果抗体上的多个结合位点都能被作为分析物的抗体结合，则与分析物结合的两种分子都可以是抗原。
B.间接测定形式
一般，本发明的测定装置所采用的间接测定形式被限定为一种测定形式，其中被标记的分子与分析物的结合是基于能将分析物与其它类似分子区别的特征，即分析物与固定在层析条上的另一种分子特异性结合。例如，如果分析物是具有特定结合特异性的抗体，例如人抗-HIV抗体，固定在层析条上的分子可以是HIV抗原。标记的分子则可以是标记的抗-人IgG，它与所有的人IgG抗体结合，不论它们与具体抗原结合的特异性如何。因此，分析物与具有结合HIV抗原的特异性以外的不同特异性的其它人IgG分子的唯一区别在于，仅抗-HIV抗体能通过与层析条上的捕获带中的HIV抗原结合而结合于层析条。通常，用间接测定检测具有特定特异性(即与特定抗原结合)的抗体。
II.测定形式中控制流动形式的一般原理
A.单向流动
在本文中使用时，术语“单向流动”覆盖了只在本发明测试装置的一端开始流动的所有形式。换言之，在使用单向流动的形式中，液体只加在测试条一端，通常通过窗口-2，如下所述。
B.双向流动
在“双向流动”中，连续在测试条的多个部位加液体，通常同时通过窗口1和窗口2；液体在层析条内的各方向上(即第一流动方向和第二流动方向)有足够的毛细梯度。下面提供了许多双向流动形式和装置的例子，例如使用图3和4的、图3A、3B、4A和4B的装置的形式。双向流动也包括本文中被称为“停止流动”和“逆向流动”的模式。
在“停止流动”模式中，只加在测试条一个部位的液体在层析介质的某一点停止流动。在停止流动模式中，加入窗口-1的液体(样本或缓冲液)是以相对较小量加样的，从而没有足够的液体流过硝基纤维素元件，并且在到达带标记的试剂(偶联物)之前流动停止。实现停流测定的目的是预湿润硝基纤维素元件，封闭某些非特异性蛋白结合位点以及确保硝基纤维素元件表面上的化学物质在标记试剂流进这些区域之前均匀地分布。这是与“逆流”测定相对照的，如下所述。
在“逆向流动”模式中，只加在测试条的一个部位上的液体在进行测定期间在层析介质内逆向流动。在逆流测定中，较大量的液体被加至窗口1从而这种液体能够流回。对于逆流测定，盒被构建为：当正确量的样本被加至窗口1时，液体沿测试条朝窗口2流下，经过对照和检测区域，然后终止，然后逆向朝吸收垫流回。然后样本被加至窗口2，并沿测试条朝吸收剂垫向上流。本领域技术人员能够通过适当选择加到测试条的液体量、测试条吸收元件的大小和吸收能力来安排这些操作形式。
III.形成本发明测定装置的一部分的元件
下面描述了形成本发明测定装置的一部分的某些元件。虽然根据所需的测定形式和要进行的测试类型，元件可被安排成各种布置，本文所限定的元件特征并不随各种不同的布置而改变。如本文所用的，根据本发明的测定装置的目的，所述元件可以是各种合适的物理形式，例如而不限于膜、垫、条或其它物理形式。
A.层析条
如本发明的测定装置中所用的层析条可由任意具有高蛋白结合能力和支持侧流测定的适当材料构成。一般来说，层析条为亲水性元件，且蛋白结合为非共价结合。尽管发明人并不旨在为下述理论所限制，目前关于蛋白质和硝化纤维素的结合理论是这样表述的，最初的交互作用是静电的，但随后的疏水交互作用和氢键则被认为是增强了结合。层析材料的一个示例是常用的硝化纤维元件，对其已作了处理使之成为疏水性材质，例如由Millipore Corporation(Billerica，MA)制造的一种硝化纤维元件。层析元件的另一个示例是由某种聚合体的微粒(诸如聚乙烯)熔合在一起。这些微粒可以是球形微粒。POREX公司(POREX Corporation，Fairbum，GA)生产的POREX Lateral-Flo元件就是这种类型的元件。层析条的尺寸可以为任何适于仪器或装置读取数据的尺寸或适于用肉眼读取的尺寸。例如，为了与美国专利No.6,136,610的装置一起使用，层析带的大小为大约5mmx44mm。当将例如HIV抗原或者HCV抗原的抗原涂在层析条上时，作为一种可选方式，这些抗原涂在含有海藻糖的溶液里。溶液中海藻糖的合适浓度为1.0％(w/w)。
当抗原或者抗体涂在层析条上时，由于其多孔性，蛋白质溶液将自身溶解到硝化纤维元件的整个厚度中。蛋白质与气孔表面结合。由于这种加样方法和结合的物理特性，与用将抗原或抗体涂覆到层析条的溶液润湿的其它区域相比，更多的蛋白质在线的上部和中心被结合。
本发明的测定装置中所用的层析条包括捕获带，如下所述。层析条通常还包括一种或多种对照带，也如下所述。
图2-13中本发明所指的层析条(9)包括至少一条用来捕获分析物的捕获带和至少一条对照带，以及可任选的第二条对照带。当结合图1的盒使用时，可从测试窗口(4)中看到捕获带和一条或多条对照带。捕获带包含能捕获样本中的分析物(如果存在)的材料。例如，如果侧流测定旨在测量血液样本中的乙肝(HBV)表面抗原(HBsAg)，则捕获带将包含固定在层析条上的乙肝(HBV)表面抗原(HBsAg)的抗体。如上所述，两条对照带之一是高对照带(HC)，而另一条则为低对照带(LC)。在本发明的一个实施方式中，图2-13的层析条(9)将在第二端(11)另外包含偶联物或者其他可检测试剂，用来检测所捕获的分析物。
B样本过滤器
本发明的测定装置通常使用样本过滤器(在某些情况下，两个样本过滤器)。样本过滤器(们)的位置可变，但样本过滤器的位置应使存在于样本中的液体当加到样本过滤器上时，能从样本过滤器直接或间接流动到层析条上。另一方面，样本过滤器是疏水性元件，或者是亲水性元件，或者是比如通常用于侧流测定中加样的合成复合物。这样的样本过滤器的示例，包括但不仅限于以下几种：疏水性过滤器，例如玻璃纤维过滤器(Ahlstrom Filtration，Inc.美国宾州Mount Holly Springs)；合成过滤器，比如Cytosep(Ahlstrom Filtration或者Pall Specialty Material，Port Washington，NY)；以及亲水性过滤器，比如纤维素(PallSpecialty Material)。在一实施例中，单个样本过滤器就足够了。在另一实施例中，可使用一个以上样本过滤器。本样本过滤器(12)不需要使用成核剂或者成核粒子。然而，样本过滤器可包含凝集剂，例如某种抗体或者化学复合物，如下所述。当(1)该测定作为双向侧流测定进行时，只向窗口1(图2)加样时，和(2)高浓度的非离子清洁剂例如TWEEN20存在于用于释放或溶解偶联物的偶联物释放缓冲液中时，凝集剂就不一定是必需的。在此时，释放偶联物的缓冲液中清洁剂的浓度应最少为大约0.1％。清洁剂和偶联物释放缓冲液的结合有利于从捕获带和对照带冲走红细胞或者溶解了的红细胞，并减少分析物和样本过滤器的非特异性结合。图3和图4设备中的样本过滤器相似地构造。样本过滤器可任选含有凝集剂，用于从样本除去某些物质，例如细胞。例如，如果样本含有红细胞，则凝集剂就可以是抗红细胞抗体或者是任何可凝集红细胞的植物凝集素。含有此类凝集剂的样本过滤器统称为“全血过滤器”。
样本过滤器的大小在所述参数范围内与层析条相适应。例如，如果与美国专利No.6,136,610中的装置一起使用时，样本过滤器在窗口1下使用时为大约5mmx8mm，在窗口2下使用时大约为5mm×13mm。在一个实施方式中，在样本过滤器中存在凝集剂，可用清洁剂例如非离子清洁剂，例如浓度为约0.002％的TWEEN20预处理该样本过滤器，然后加入凝集剂以获得最佳结果。
本发明的凝集剂可包括针对需要被过滤掉的细胞或者其他物质的抗体。例如，如果需要过滤掉的物质是血细胞，则本发明的凝集剂包括抗红细胞抗体或者抗白细胞抗体。该抗体可涉及一种细胞表面抗原。例如，抗红细胞(抗-RBC)抗体包括抗红细胞膜抗体，例如抗带3抗体或者抗血型糖蛋白抗体(例如抗血型糖蛋白A抗体)。这些抗体可在市场上买到，例如适于测定的一定浓度的兔抗人红细胞抗体(中国厦门Buo-shen Biotech)或者鼠抗人红细胞抗体(中国安徽Rui-Tai-En Scientific LLC)，浓度的范围为大约0.1mg/ml到大约1mg/ml，或0.2mg/ml到大约0.8mg/ml，或为0.25mg/ml到大约0.5mg/ml。
在本发明的另一实施例中，凝集剂为一种化学复合物，例如植物凝集素。植物凝集素是可以粘着细胞的蛋白或者糖蛋白，包括例如刀豆球蛋白A、小麦胚芽凝集素、大豆(Glysine max)和青豆(Phaseolus vulgaris)的凝集素、相思豆毒素、黄豆凝集素等，这些凝集素如在Goldstein等人(1980)Nature285：66和Schnebli，H.P.及Bachi，J.(1975)“凝集素和人红细胞的反应”(Reactions of Lectins with humanerythrocytes)Exot.Cell.Research91中所述可单独或者是组合使用。这些凝集素都可以在市场上买到。
C.样本垫
在一些应用中，特别是当样本不需要除去细胞或其它大颗粒时，样本垫可替换样本过滤器。术语“样本垫”指疏水性元件，例如可用来接收样本的疏水性元件。当样本是全血或者可以是全血时，样本垫中可包含上述的凝集剂。
样本垫的大小在所述参数范围内与层析条相适应。例如，如果与美国专利No.6,136,610中的装置一起使用时，样本垫在窗口1下使用时为大约5mmx8mm，在窗口2下使用时大约为5mm×13mm。可任选地用抗红细胞抗体或其它凝集剂预处理该样本垫，但如果在窗口1中加入缓冲液时不需要。此外，样本垫可以是亲水性的，含或不含凝集剂，如上所述。
D.偶联物垫
用术语“偶联物垫(conjugate pad)”描述一种用于本发明测定装置的许多实施方式中的元件。本发明的偶联物垫是由疏水性材料组成的，例如玻璃纤维(PallSpecialty Material)，并包含了可与样本中的分析物发生反应、或与在捕获带使捕获的分析物发生反应的偶联物或者可检测试剂。可检测试剂包括例如特别针对分析物的抗体或者抗原，它们与诸如有色物质、荧光物质、或化学发光物质的可检测物质偶联。胶态金就是有色物质的一个例子。这里的偶联物垫的尺寸适于所述参数范围内的的层析条。例如，如果与美国专利No.6,136,610中的装置一起使用，偶联物垫为大约5mmx8.5mm。可用含有海藻糖和酪蛋白的缓冲液对偶联物垫进行预封闭，虽然也可用其它缓冲液进行预封闭。例如，该缓冲液里海藻糖的含量约为大约2.5％到大约7.5％，如浓度约为大约5％。例如，缓冲液里酪蛋白的浓度约为大约0.25％到大约0.75％，如约0.5％酪蛋白。一种合适的缓冲液含5％的海藻糖和0.5％的酪蛋白，其它选择也是可行的。涂在垫上的偶联物可为海藻糖浓度为2.5％、酪蛋白的浓度为0.25％的溶液。海藻糖的目的是为了当偶联物在偶联物垫上变干时起稳定偶联物的作用，而不是阻止其与偶联物垫或者硝化纤维结合。通常情况下是用封闭蛋白来阻止结合。一种合适的封闭蛋白是浓度为0.5％的碱溶性的Hammarsten酪蛋白；或者可使用其它封闭蛋白。可用合成聚合物粘合剂加工过的玻璃纤维达到阻止结合的目的。当偶联物在偶联物垫上变干时可稳定偶联物的其他试剂是众所周知的，并且本发明并不局限于使用用海藻糖和酪蛋白预封闭过的偶联物垫。这些化合物包括但不限于，甘露醇(浓度为约5-10％w/w)。甘露醇是一种6碳环多元醇，但不是糖；这些化合物通常被称为糖醇。当在偶联物垫上变干时，可用于偶联物的其它糖醇包括甘油、山梨醇、木糖醇、赤藓醇、核糖醇、半乳糖醇和阿拉伯糖醇。还知道一些其它可稳定固定化抗体的化合物。这些包括聚乙二醇的硼酸盐缓冲溶液。硼酸盐的合适浓度为pH9.0的约1mM-5mM的硼酸盐。硼酸盐的特别合适的浓度是2mM硼酸盐，pH9.0。通常，聚乙二醇的分子量是约10,000-50,000；优选聚乙二醇的分子量是约20,000。优选聚乙二醇的浓度为约0.1％w/w。因此，特别优选的组合物使用0.1％w/w分子量约为20,000的聚乙二醇。这些化合物还可用于稳定可用于本发明测试条的其它蛋白，例如HCV抗原。
并不需要在本发明测定装置的所有实施方式中使用偶联物垫。在一些另选方式中，可省略偶联物垫，偶联物加在层析条上。这些另选方式如下所述。
E.液体收集器
术语“液体收集器”可用于描述本发明测定装置的一些配置中使用的元件。液体收集器通常是疏水元件，就像偶联物垫的疏水元件一样。和偶联物垫不同的是，液体收集器不含任何可检测的试剂，用作中间元件，通常用于直接或间接向层析条传递液体。液体收集器的大小在所述参数范围内与层析条相适应。通常，如果与美国专利No.6,136,610中的装置一起使用，液体收集器为大约5mmx13mm。
F.捕获带
如上所述，测试条总是包含至少一个捕获带。在本文中使用时，术语“捕获带”指层析条上包含至少一种分析物结合剂的区域或区带。分析物结合剂通常固定在带或区域内，从而在与可检测试剂反应后，该带或区域产生可观察的或可测量的结果，反映存在于样本中分析物的存在或数量。“捕获带”可包含用于捕获样本中一个以上分析物的一个以上捕获区域，在该情况下可使用一种以上分析物结合剂。例如，被视为在本发明范围内的两种分析组合是同时检测丙型肝炎病毒(HCV)和人类免疫缺陷病毒(HIV)的测定的组合，以及同时检测乙型肝炎表面抗原(HbsAG)和梅毒螺旋体抗原(TP)的测定的组合。其它组合仍是可能的，并且在本发明的范围内。
G.对照带
通常，本发明装置的层析条还包括一个或多个对照带，其中含有固定在对照结合区域中的对照试剂。对照试剂特异性结合至对照结合试剂以形成对照结合对，如在美国专利No.6,136,610中所描述的，该专利通过引用结合于此。本发明通常包含两个对照带，尽管并不要求使用两个对照带。两个对照带可相同或不同。具有对照结合对的一个特别优点是它们作为内部对照起作用，即，对可在单个测试条上对比分析物检测结果的对照。该对照可用于校正条与条之间的变化。对照之一可指定为高对照(“HC”)，而对照中的另一个可指定为低对照(“LC”)。当使用两个对照时HC与LC的比通常被预定为内部质量对照之一。另外，可通过用测试条反映密度(Dr)除以高对照(HC)或低对照(LC)的反映密度(Dr)，从而确定测试条(分析物)的RI(相对密度)。对于任何定量测定，都根据系列浓度标准试剂的RI来制定标准曲线。在定量测定时，根据样品RI与截断值RI的比或信号/截断值(S/C)来确定结果，而截断值根据大量阴性样本来确定。尽管通常本文中可使用任何常规的对照，但通常优选将不存在于样本中或不会与存在于样本中的化合物发生交叉免疫反应的化合物作为对照；例如，可购自Molecular Probes(Eugene，OR，cat#A-23018)的2，4-地乐酚苯醚小牛血清白蛋白可用作对照试剂。化合物2，4-地乐酚苯醚是不存在于人体内但作为半抗原起作用的小分子；即，当结合至较大分子(例如蛋白质载体)并注射进入抗体产生哺乳动物时它具有免疫原性，所述哺乳动物例如鼠、大鼠、牛、兔、马、绵羊或山羊。
H.缓冲液垫
本发明测定装置中的一些实施方式使用缓冲液垫。缓冲液垫是亲水性元件或者是合成复合物，例如Cytosep元件(Ahlstrom Filtration，Inc)。通常，缓冲液垫在装有测定装置的盒或其它装置中是可达到的，以用于添加试剂，例如图1盒中的窗口2。缓冲液垫的大小在所述参数范围内与层析条相适应。例如，如果与美国专利No.6,136,610中的装置一起使用时，缓冲液垫为大约5mmx13mm。在一些另选方式中，缓冲液垫可含有如上所述的凝集剂。
I.吸收垫
通常，本发明的测定装置包括一块或多块本发明的吸收垫。这些吸收垫用于在装置内引导液流。如上所述，吸收垫的大小和位置很大程度上决定了流动模式，如上所述。吸收垫是一种可吸收液体的亲水性元件，例如纤维素(Whatman，Kent，UK)或者纤维素-玻璃纤维复合物(Whatman，Kent，UK)。这里的吸收垫的大小在所述参数范围内与层析条相适应。例如，如果与美国专利No.6,136,610中的装置一起使用时，吸收垫为大约5mmx27mm。
J.衬垫
本发明的一些测定装置包括衬垫，用于支撑层析条。衬垫可用任何能支撑层析条的惰性材料制成，例如一片塑料材料(G & L Precosion cutting，San Jose，CA)。衬垫的大小在所述参数范围内与层析条相适应。例如，如果与美国专利No.6,136,610中的装置一起使用时，衬垫的尺寸为大约5mm x60mm。然而，另外也在本发明的范围内，在条的第二端的偶联物垫和样本过滤器，或样本垫或缓冲液垫，当它们存在时，也可与衬垫接触。
K.液体不可渗透的屏障
本发明测定装置的一些实施方式包含置于元件之间的液体不可渗透的屏障，所述元件例如在层析条第一端处或附近的样本过滤器和层析条本身。其它元件也可固定在过滤器上，例如缓冲液和样本垫，视测试条的构建方式而定。液体不可渗透的屏障可以是而不限于双面粘胶带。合适的双面粘胶带是Adhesives Research制造的聚酯胶带，但也可用其它有相似性质的胶带。双面粘胶带的功能是将液流引出样本过滤器，从而它可向层析条的第二端运动，并可延迟向后向层析条的第一端运动。使用双面粘胶带的其它细节如下所述。
实施例中使用的组件包括吸收垫，样本过滤器，缓冲液垫，层析条以及偶联物垫，具有由各生产厂家指定的特性，分别列在表1里。但是，可使用其它替换组件，并且在本领域中是众所周知的。
IV.本发明中可用的其它定义
对于此处的使用，“分析物”指将通过使用本发明的侧向流测试条和方法所检测的材料。“分析物”包含但不限于：抗原、抗体、激素(例如TSH、hCG、LH)、药物、心脏标记物(诸如肌钙蛋白I、心肌型肌酸激酶同功酶(CKMB)、肌红蛋白、C反应蛋白(CRP)、脂肪酸结合蛋白(FABP)、糖原磷酸化酶同功酶BB(GPBB)、B型利钠肽(BNP)和Pro-BNP、自身免疫性疾病标记物、肿瘤标记物(例如PSA、CEA、α-胎蛋白)、与细胞相关联的蛋白(“细胞蛋白”)、分泌性蛋白、酶、细胞表面或跨膜蛋白、糖蛋白和其它蛋白、与例如细菌、病毒、霉菌的病原体相关的蛋白或碳水化合物、肽、毒素、核素、适体和碳水化合物。当在本文中使用时，分析物还包含可被特异性非抗体结合蛋白(例如受体)检测的分子、以及可被特异性沃森-克力克碱基配对(杂交)检测的核酸。其它分析物贯穿说明书作进一步描述。
本文中的“分析物结合剂”是特异性结合将要分析的样本中的分析物的分子。“分析物结合剂”可以是抗体或抗原但并不局限于此。“分析物结合剂”包含生物工程蛋白、肽、包含具有分析物结合部位的抗原的异类混合物的半抗原和溶菌产物。在一个典型但非排他性的实施例中，分析物结合剂是用于结合要分析样本中抗原的抗体、或用于结合要分析样本中抗体的抗原。如果分析物是核酸分子，则分析物结合剂可以是例如通过沃森-克力克碱基配对的与其特异性结合的核酸分子，或者可以是在序列-特异性相互作用基础上结合核酸序列的蛋白质。如本文所用的，术语“特异性结合”或其它等价术语指，具有特异性结合活性的分子(例如但不限于抗体)仅仅与其目标而不和其它分子结合。该结合是受有关分子的三维结构控制的，由非共价作用，例如疏水键、氢键和盐桥介导。
在本文中使用时，术语“抗原”包含感染性抗原和其它微生物或其一部分，诸如细菌、病毒、衣壳、核壳体、或者病毒、霉菌、蛋白感染素或寄生虫的其它部分。感兴趣的分析物最好包含免疫原部分，从而针对用于检测目的部分可产生抗体。细菌包含革兰氏阳性和阴性细菌，比如炭疽芽孢杆菌、大肠埃希杆菌、沙门氏菌属类、志贺氏菌属类、鼠疫巴斯德(氏)菌、螺旋杆菌、霍乱弧菌、葡萄球菌类等。病毒包含HIV、甲乙丙丁型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、埃博拉病毒、乳头瘤病毒(例如HPV)、包含流感病毒的鼻病毒、SARS病毒、和牛痘病毒。“抗原”还包含抗体能针对其产生的化合物或感染剂的免疫原部分。另外，术语“抗原”也可包含要检测的抗体或可刺激抗体产生的微分子。例如，在检测人免疫缺陷病毒(HIV)或丙型肝炎病毒(HCV)时，人类抗HIV抗体或抗HCV抗体是要检测的抗原，例如通过抗-人IgG(免疫球蛋白G)。在检测例如风湿性关节炎、桥本(氏)甲状腺炎、系统性红斑狼疮的人体自身免疫疾病的情况下，和在以对自身抗原的异常抗体反应为特征的其它情况下，针对这样的自身抗原的人类抗体成为抗原。
在本文中使用时，术语“抗体”包含多克隆或单克隆抗体、或足以结合感兴趣抗原或分析物的片段。抗体片段可以是，例如，单节显性的Fab片段、单节显性的Fab′片段、或双节显性的F(ab)′2片段。也在术语“抗体”的范围内的是：由抗体工程产生的分子，例如单链抗体分子(ScFv)；或由单克隆抗体产生的人源化抗体或嵌合抗体，通过取代重链和轻链的恒定区可产生嵌合抗体，或者取代恒定区和可变区的结构部分可产生人源化抗体。然而，在大多数情况下，不需要这样的更改以产生适合与本发明一起使用的抗体。
在本文中术语“偶联物(conjugate)”和“可检测试剂”互换地使用，指偶联至诸如有色试剂、荧光试剂或化学发光试剂的可检测材料的抗体或抗原。在本发明的实践中，“偶联物”或“可检测试剂”特异性地结合要检测的分析物，或固定在捕获带上的所捕获的分析物。可任选地，“偶联物”或“可检测试剂”在捕获带上产生可测量的定量读数，该读数反映捕获带上存在的分析物的量。如在以下进一步描述的，捕获带内可直接测量的定量密度并不一定反映通过结合存在于捕获带内的分析物的量，但RI(相对密度)确实反映捕获带处存在的分析物的量。RI的使用如下所述。另外，以下还进一步描述了其它用于检测的可选方式。本文所用的“可移动的”偶联物或可检测试剂指能够被水性液体(例如但不限于样本或缓冲液)再溶解，然后能通过测试条迁移。
在本文中使用时，“可检测材料”指诸如在捕获带处可被偶联至抗原或抗体、并且可被检测的任何材料。该材料可以是微粒、有色材料、荧光材料、化学发光材料、生物发光材料、酶材料、或放射性材料，并可包含一种以上材料。这样的材料通常被称为标记。如果使用一种以上材料，则可使用可能材料的任何组合。例如，如果某测定意欲检测一种以上分析物，则使用的可检测材料可以是在不同波长处发荧光的荧光材料。微粒可以是如在美国专利No.6,136,610中所描述的带有或不带有机或无机包衣的胶态金微粒、胶体硫微粒、胶体硒微粒、胶体硫酸钡微粒、胶体硫酸亚铁微粒、金属碘酸盐微粒、卤化银微粒、硅微粒、胶态金属(含水的)氧化物微粒等、蛋白质或肽分子、脂质体、或有机聚合物乳胶微粒(例如聚苯乙烯乳胶珠)。微粒的大小可与层析条的孔隙率相关。
术语“可操作性接触”在本文中应用如下：两个固体组分在它们以如下方式或直接或间接接触时是可操作性接触：液体可通过毛细管现象或其它方式从两组分之一几乎不间断地流至另一个。“直接接触”表示两组分为物理接触，例如边缘-至-边缘或前方-至-后方。“间接接触”表示两组分没有物理接触，而是由一个或多个传导手段桥接。这种通过一个或多个传导手段的桥接可以是边缘-至-边缘或前方-至-后方的。在本文中使用时，术语“毛细作用接触”等同于可操作性接触。如本文所用的，术语“基本上”被定义为在所需程度上具有所述的性质，以实现特定功能，只要离该特性的偏差在所述装置或步骤的执行中不明显。
应理解前面一般描述和以下详细描述只是示例性的和阐述性的，而并不像权利要求所要求地限制本发明。此外，必须理解本发明不局限于所描述的具体实施例，具体实施例当然是可变的。另外，用于描述具体实施例的术语并不是为了作出限制，因为本发明的范围将仅由它的权利要求来限制。
另外，虽然本发明可单独使用、或与任何适于人工或自动读取结果的分析设备一起使用，但在本文中本发明使用美国专利No.6,136,610中的装置和盒为例，并且在本发明的一个实施例中，使用了美国专利No.6,528,323中的双向流机构。应理解本发明并不局限于使用这样的装置或盒。
参看图1，图1是可与本发明的测试条一起使用的盒(1)的平面俯视图，盒(1)有两个窗口。窗口1(2)可用于夹心法的加样，例如应用于乙肝表面抗原(HbsAg)的检测；或者可用于间接法双向横流检测中对分析物的检测，例如人体免疫缺陷病毒(HIV)抗体。窗口2(3)可用作夹心法测定中的加样窗口，或者可用作加试剂的窗口，例如间接法双向流检测中的缓冲液。盒(1)还包含一个检测窗口(4)用来观察试验结果。通过观察检测窗口(4)，可观测到用于待检测分析物的捕获带(5)—此分析物在本例中标记为人体免疫缺陷病毒(HIV)，同时还可观测到第一条对照带(6)——此带在本例中标记为HC，和第二条对照带(7)——此带在本例中标记为LC。为便于管理测试类型、产品有效期、和批间变化的调整，盒(1)还可有选择地包括条形码(8)。
在本发明中，如果使用了图1所示的盒，则窗口1(2)或窗口2(3)各自可用来添加样本或者试剂，具体如下所述。
V.本发明的具体测定装置和用这些装置进行的测定
A.图2
参看图2，图2是本发明一实施例的测试条的侧视图。在本实施例中，如图2所示，在层析条(9)的第一端(10)有一个样本过滤器(12)置于窗口1(图1的2)，窗口2(图1的3)上设置有缓冲液垫(14)。缓冲液垫(14)设置在偶联物垫(13)的上面，该偶联物垫(13)含有至少一种可移动的可检测试剂，通常称为“偶联物”，偶联物特异地与分析物结合、或与一个结合了分析物的试剂结合。比如，这样的偶联物可以是偶合了胶态金的分析物特异抗体或分析物特异抗原。可任选地，偶联物垫(13)还可包含与一个或多个对照带(6，7)上的固定对照试剂特异结合的第二个可移动的可检测试剂，比如如图6所示。对于全血测定，样本过滤器(12)包含有一种凝集剂用来与全血样本中的红细胞凝集。第一个样本吸收垫(15)设置在第一端(10)，在样本过滤器(12)的远离化学偶联物垫(13)或缓冲液垫(14)的一侧靠近样本过滤器(12)。也可以使用与第一个吸收垫(15)毛细作用接触的第二个可任选吸收垫(16).。第二个吸收垫(16)(如果存在)可直接置于第一个吸收垫(15)之上或与第一个吸收垫(15)重叠。第一个吸收垫(15)和层析条(9)的第一端(10)有毛细作用接触或者重叠。可任选地使用一个塑料衬垫(17)来支撑层析条(9)。层析条(9)还包含针对每一种要检测分析物的至少一条捕获带(5)和一条或者多条对照带(6，7)，比如如图6所示。每条捕获带(5)上都包含有一种固定的抗体或者固定的抗原，此抗体或抗原特异性地与样本中要检测的分析物发生反应。每条对照带(6，7)中任选地都包含着一种固定的抗体或抗原，此抗体或抗原与样本非特异性地发生反应，或者与偶联物垫(13)上的其他对照试剂发生特异性反应。
在用图2所示的形式进行间接测定的过程中，含全血的样本被加到窗口1(2)的样本过滤器(12)上，如图6所示。红细胞滞留在样本过滤器(12)上，而样本中的液体从样本过滤器(12)流到层析条(9)的第一端(10)，再从第一端(10)沿第一侧流方向流(图6的21)向第二端(11)(“第一液流”)。在第一次液体流动的过程中，样本液体流过捕获带(5)，捕获带(5)在艾滋测试条中含有HIV抗原或在丙肝测试条中含有HCV抗原，它们分别与样本中的诸如HIV抗体或者HCV抗体的分析物反应的。在第一次液体侧向流动的过程中，液体还会通过对照带(6，7)。更进一步地，第一侧向流方向(21)的液流，在最靠近偶联物垫的对照带(7)和偶联物垫(13)之间需要并明显地停止流动。样本中的分析物(如果存在)会在液体流动的过程中主要沿第一侧流方向(21)被捕获带(5)捕获，在测试条(5)上形成第一个免疫复合物，诸如HIV—人抗HIV抗体复合物。然后向缓冲液垫(14)添加缓冲液，以释放偶联物垫(13)里的偶联物。在一实施方式中，所释放的偶联物中包含至少一种或者两种带标记试剂，一种与测试条(5)上的第一个免疫复合物特异性反应，比如带标记的抗人IgG，以及可任选的，一种与对照带(6，7)上的对照试剂发生反应。所释放的偶联物再从层析条(9)的第二端(11)沿着第二侧流方向(22)向第一端(10)流动。在第二侧流方向(22)的液体流动过程中，在对照带(6，7)上形成一种带标记对照结合试剂和对照试剂的可检测复合物，在捕获带(5)上形成带标记的抗人IgG抗体和第一免疫复合物的第二个可检测免疫复合物。在间接测定中，允许在第一次流动期间样本中的分析物和捕获带(5)上的捕获试剂之间发生反应形成第一免疫复合物，以在第二次流动期间检测。
值得注意的是，当如图2的测试条配置被用于诸如血清或者血浆样本的非全血样本中分析物的测定时，样本过滤器(12)中不需要包含凝集剂。这样的配置可用于夹心测定和间接测定。在夹心测定中，比如HBsAg的检测中，如果最佳性能需要，可将缓冲液加到窗口1，样品加到窗口2。在HBsAg的夹心测定中，可将血清样本加入窗口1和窗口2，也可只加入窗口2。为了进行这些测定，如图6所示，向窗口1(2)的样本过滤器(12)加样。液体将从样本过滤器(12)流到层析条(9)的第一端(10)，再以第一侧流方向(图6的21)从第一端(10)流到第二端(11)，通过捕获带(5)和对照带(6，7)；液体在到达偶联物垫之前停止流动(见“停流”模式)，或者可任选地，流体可流入偶联物垫(13)并溶解偶联物(如果期望改进测定的执行)。通常情况下，在根据本发明的测试条进行的测定中，特别是间接测定中，最好使用停止流动模式，即不允许流体流过偶联物垫并接触偶联物，尤其是在间接测定(抗体检测)中，因为样本中的抗体将与偶联物中带标记的抗人IgG(或IgM)反应，在偶联物到达捕获带之前形成免疫复合物。这样就会产生假阴性的结果。因此，在间接测定中，从窗口1流出的流体不能与偶联物接触。然而，在夹心测定中，停止流动模式则不是必须的。
因此，在一实施方式中，来自样本的液体在对照带(7)和偶联物垫(13)之间停止了沿第一次侧流方向(21)的流动。在HbsAg夹心测定中，例如如果样本中存在正在检测的分析物，乙肝表面抗原将在包含比如固定的人抗乙肝表面抗原抗体(“固定捕获抗体”)的捕获带被捕获。在液体在第一侧流方向上流动的过程中，在捕获带(5)上形成了第一个免疫复合物，比如乙肝表面抗原和乙肝表面抗体的复合物。再一次，在液体在第二侧流方向(22)上流动的过程中，如果在第一次流动后样本中还剩有未结合的分析物，那么在第二次流动的过程中将会形成其它的第一免疫复合物。
样本的第二份试样被加到缓冲液垫(14)，它不需含有红细胞凝集剂。样本的液体流过偶联物垫(13)，偶联物被释放。偶联物包含有与样本中分析物反应的第一种带标记的可流动试剂，例如偶联于一种例如胶态金的可检测试剂的带标记的人抗乙肝表面抗原抗体。可任选地，偶联物包含与对照带(6，7)中的对照试剂发生反应的第二种可流动试剂。在液体在第二侧流方向(22)流动的过程中，如果样本中含有分析物，则诸如带标记的抗人乙肝表面抗原抗体和乙肝表面抗原的第二种免疫复合物将形成，就从层析条(9)的第二端(11)在第二侧流方向流到第一端(10)。当液流第二侧流方向继续时，带标记的对照粘合试剂和对照试剂的可检测复合物在对照带(6，7)形成；并且在捕获带(5)上形成包含第一和第二免疫复合物的可检测的第三免疫复合物。双向侧流有利于冲掉捕获带和对照带上的污染物，从而减少背景干扰。
图2的形式可用来检测血清或血浆样本中分析物的间接测定。在这种形式中，样本过滤器(12)中可任选地不含凝集剂。测定首先通过向窗口1(2)添加缓冲液或者其他液体试剂来预湿层析条(9)。然后向窗口2(3)添加缓冲液。来自样本的液体从例如偶联物垫释(13)放偶联物。样本中的分析物抗-HIV(如果存在)将与捕获带反应形成第一对抗原抗体结合体，即第一免疫复合物，它是在第一侧流方向(21)中液体流动过程中形成的。释放的复合物从层析条(9)的第二端(11)沿第二侧流方向(22)朝第一端(10)迁移。在第二侧流方向的液体流动过程中，在捕获带上形成标记的抗人IgG抗体和第一免疫复合物的可检测的第二免疫复合物，它可被检测到并定量。
与上面所述的实施例(未示出)有所不同，不使用偶联物垫(13)，并且固定的可检测试剂在第二端(11)结合于层析条(9)。在该实施例中，窗口2(图1的3)设置有缓冲液垫(14)，位于层析条(9)的顶端或者与层析条(9)重叠。缓冲液垫(14)可置于固定的可检测试剂的上方。
在上述实施例的另一种变体(未示出)中，不使用缓冲液垫(14)，偶联物垫(13)设置于层析条(9)的第二端的上方或与之重叠。可直接向偶联物垫(13)添加缓冲液。
在图2所示的实施方式中，优选样本过滤器(12)是疏水元件，或亲水元件或通常用于侧流测定中添加样品的此类合成复合物。
在图2所示的实施方式中，缓冲液垫(14)在盒(1)中是可达到的，用于通过窗口-2(3)加试剂。
B.图3和4
在又一实施例中，如图3所示，该测试条适于进行夹心测定，诸如用于同时检测乙肝表面抗原和用于检测对梅毒螺旋体(Treponema pallidum)，即梅毒病原体的抗体。在这种形式下，还有第二个样本过滤器(18)，一个液体收集器(19)，可任选的一个偶联物垫(13)，都置于层析条(9)的第二端(11)。在层析条(9)的第一端(10)还设置有一个第一样本过滤器(12)和至少一个吸收垫(15)。第一个吸收垫(15)置于第一个样本过滤器(12)的上方。图4示出了一个变体，其中第一个和可任选的第二个吸收垫放置成在层析条(9)的第一端(10)靠近样本过滤器(12)。
在如图3所示的实施例的一个变体(该变体未示出)，不使用偶联物垫，但在层析条(9)的第二端(11)上结合有可移动的可检测试剂。在这种结构下，液体收集器(19)直接与层析条(9)有毛细作用接触，液体收集器可被完全设置在层析条(9)的第二端(11)的上方，或者与层析条(9)重叠。
如图3所示的实施例的另一个变体(图上未示出)，用样本垫来代替第一个样本过滤器(12)来施加诸如缓冲液的试剂。样本垫包含能承载足以进行测定的缓冲液的吸收材料。
图4显示了一种变化形式，其中第一和可任选的第二吸收垫与层析条(9)第一端(10)的样本过滤器(12)相邻。图4的形式适合进行夹心测定法，例如那些用于前列腺特异性抗体(PSA)和甲状腺刺激性激素(TSH)的夹心测定法。
在使用图3和图4形式的测定的操作过程中，含有全血的样本被加到图1的窗口1(2)和窗口2(3)。在这个形式里，第一个样本过滤器(12)和第二个样本过滤器(13)最好是可过滤掉红细胞的全血过滤器。图7示出使用图4的实施例来进行夹心测定。向层析条(9)的第一端(10)向第一个样本过滤器(12)加入含红细胞的样本。来自样本的液体沿第一侧流方向从第一端(10)流到第二端(11)，途中流经捕获带(5)和对照带(6，7)。分析物(如果存在)将在捕获带(5)被捕获，从而分析物-抗体在捕获带(5)上形成第一免疫复合物。然后向窗口2(3)上的第二样本过滤器(18)加入同一个样本的第二试样。来自第二样本过滤器(18)的液体经过液体收集器(图4的19)和偶联物垫(13)到达第二端(11)，然后再沿第二侧流方向(22)从第二端(11)向第一端(10)移动，途中经过捕获带(5)和对照带(6，7)。分析物(如果存在)将在捕获带(5)上被检测试剂(诸如抗体)捕获，从而分析物-抗体复合物形成夹心。在这个形式里，加入窗口2(3)的分析物(例如乙肝表面抗原)首先与来自偶联物垫的偶联物结合，例如带标记的乙肝表面抗原抗体，比如偶联于胶态金的乙肝表面抗原抗体，以形成分析物-偶联物的复合物，然后该复合物流到捕获区、并与固定在捕获区上的乙肝表面抗原抗体发生反应，在那时加到窗口1(2)的样本也已捕获到了乙肝表面抗原。
在一种变体中，可省去向样本过滤器(12)的第一端(10)添加样本的步骤，并且样本可直接向窗口2(3)上的第二个样本过滤器(18)添加。在这种形式下，首先向窗口1加缓冲液以预湿测试条，从而缓冲液按第一次侧流方向(21)由第一端(10)向第二端(11)流动。接着向窗口2(3)加样。来自样本的液体经过液体收集器(19)和偶联物垫(13)到达第二端(11)，然后再从第二端(11)沿第二侧流方向(22)流过捕捉带(5)和对照带(6，7)。样本中的分析物和偶联物结合以形成复合物，复合物然后流向捕捉带和对照带。分析物-偶联物复合物在捕获带(5)上被捕获，从而形成夹心。
值得注意的是，当如图3或图4的测试条结构用于诸如血清或者血浆样本的非全血样本中分析物的测定时，图3中的样本过滤器(18)或者图4中的样本过滤器(18或12)不包含凝集剂。这种结构既可用于夹心测定也可用于间接测定。
在本文中使用时，“样本垫”以及“样本过滤器”指的是可用来承载样本，如全血样本、血清或者血浆的元件。术语“样本垫”是指可用来承载样本的吸水性元件，例如亲水性的膜。当样本是全血或者可以是全血时，样本垫中可包含上述的凝集剂。术语“样本过滤器”一般指可类似地用于承载样本的疏水性元件，比如玻璃纤维过滤器。样本过滤器也可包含如上所说的凝集剂。然而，样本过滤器也可以是亲水性元件，比如用抗红血球抗体或其他凝集剂预处理的样本垫。在本文中使用时，术语“全血过滤器”指的是含有凝集剂的样本过滤器。然而，当图2的测试条配置用来测定除全血样本外的其他样本中的分析物时，诸如血清、血浆或者其他生物制剂，过滤器(12)上不需要凝集剂。这个配置可适用于夹心测定和间接测定。在夹心测定中，例如乙肝表面抗原的测定中，如图6所示，为了达到最好的效果，将样本或者缓冲液加到窗口1(2)上的样本过滤器(12)。在例如乙肝表面抗原这种夹心测定中，可向窗口1和窗口2加样，也可以只向窗口2加样。液体将会从样本过滤器(12)流到层析条(9)的第一端(10)，再以第一侧流方向从第一端(10)流到第二端(11)，通过捕获带(5)和对照带(6，7)；液体在到达偶联物垫(13)之前停止流动(“停止流动”模式)，或者可任选地，如果需要改进实验效果，则液体流入偶联物垫(13)并溶解偶联物。在间接测定中停止流动模式特别适用，因为样本中的抗体被排除与偶联物中的带标记的抗人IgG或者IgM相互作用，从而在偶联物流到捕获带之前就形成复合物，从而导致假阴性结果。
在本发明的一个实施例中(如图3A和图4A所示)，偶联物垫(13a)置于层析条的第二端(11a)，而缓冲液垫(14a)置于偶联物垫(13a)的上方。在该实施例中，偶联物垫(13a)与层析条(9a)的第二端(11a)交迭，交迭的距离足以供液体从缓冲液垫(14a)流过偶联物垫(13a)到达层析条(9a)上。交迭的距离可以是大约0.5mm到大约10mm之间，或大约1mm到大约8mm，大约2mm到大约5mm，或大约2mm到3mm。
缓冲液垫(14a)可以是任何合适大小，只要它能如上所述吸收或承载足够量的液体来溶解偶联物垫(13a)里或者层析条(9a)上的可检测试剂即可。在一实施方式中，缓冲液垫比偶联物垫大。在另一实施方式中缓冲液垫与偶联物垫一样大。在又一实施方式中，缓冲液垫比偶联物垫小。
在图3A和图4A所示的装置的该另选方式中，第一个吸收垫(15a)置于层析条(9a)的第二端(10a)上，在远离偶联物垫(13a)或者缓冲液垫(14a)的一侧靠近样本过滤器(12a)。在图3A所述的装置中，吸收垫与样本过滤器(12a)交迭，但在图4A所述的装置中没有。还可设置与第一吸收垫(15a)有毛细作用接触的第二吸收垫(16a)。在一实施方式中，可任选的第二吸收垫(16a)直接置于第一个吸收垫(15a)的上方。第一个吸收垫(15a)与层析条(9a)的第一端(10a)交迭，交迭的距离足以使流体从层析条(9a)向第一吸收垫毛细流动。该距离为大约0.5mm到大约10mm之间，或大约1mm到大约8mm，或大约2mm到大约5mm，或大约4mm到5mm。此外，可任选地使用第三吸收垫。
即使某些层析条已经设置有衬垫部分，也可任选地使用衬垫(17a)来支撑层析条(9a)。
在本发明的另一个实施方式中(如图3B和图4B所示)，没有使用偶联物垫，而当使用偶联物垫时，通常存在于偶联物垫中的可检测试剂被掺入层析条(9b)的第二端(11b)。在该实施方式中，缓冲液垫(14b)置于层析条(9b)的上方。在一个另选方式中，缓冲液垫(14b)与层析条(9b)的第二端(11b)交迭，交迭的距离足以供加到缓冲液垫(14b)上的液体通过毛细作用流到层析条(9b)上，以溶解存在于层析条(9b)的第二端(11b)的可检测试剂。在该图3B和图4B的另选配置中，缓冲液垫(14b)可直接位于层析条(9b)的第二端(11)上方，例如在层析条(9b)的第二端(11b)中的可检测试剂上方。在该实施方式中，加到缓冲液垫(14b)上的液体可溶解可检测试剂，并将可检测试剂从层析条(9b)的第二端(11b)以第二流动方向朝层析条(9b)的第一端(10b)移动。如果缓冲液垫(14b)与层析条(9b)交迭，交迭的距离可以是大约0.5mm到大约10mm之间，或大约1mm到大约8mm，大约2mm到大约5mm，或大约2mm到3mm。
在本发明的一个实施方式中，如图3所示，至少一个吸收垫(15)与第一样本过滤器(12)有毛细作用接触。可任选地，在第一吸收垫(15)的上方设置第二吸收垫(16)。在一个实施方式(图3)中，这两个吸收垫(15，16)都置于第一样本过滤器(12)的上方，但并不会阻挡向第一样本过滤器(12)加样本或者其他试剂。可任选地，还可使用第三吸收垫。
在本发明的另一实施方式中，如图4所示，吸收垫(15，16)放置成在层析条(9)的第一端(10)靠近第一样本过滤器(12)，在第一样本过滤器(12)的与样本过滤器(18)相反的一端。如上所述，第一样本过滤器(12)通常是包含凝集剂的全血过滤器。但是，如以下所述，如果向窗口1添加缓冲液，则可用样本垫来取代第一个样本过滤器(12)。该样本垫可如上所述是亲水性的，也无需如上所述必须用抗红血球抗体或者其他凝集剂进行预处理。
或者，如果第一样本过滤器(12)被样本垫所取代，则该样本垫在本发明一个实施方式中为如Cytosep(Ahlstrom Filtration，Inc)这样的亲水性元件，诸如图3所示，样本垫可用来添加试剂，诸如向图1的盒(1)的窗口-1(2)添加缓冲液。在向样本过滤器(18)添加样本之前，样本垫例如可用来添加缓冲液以预湿层析条(9)。
在如图4所例示的本发明的另一实施方式中，当用样本垫来取代第一样本过滤器(12)时，样本垫可以像样本过滤器(18)的疏水性元件一样也是疏水性元件。在该实施方式中，样本垫中也可含有凝集剂。或者，样本垫也可如上所述是亲水性的，可含有也可不含有凝集剂。
图4的配置尤其适用于执行免疫夹心测定，例如对前列腺特异性抗原(PSA)或者促甲状腺激素(TSH)的测定。
如图3或图4的装置可用几种模式操作。在那些模式之一中，向窗口1和窗口2加入(全血)样本。当全血作为样本加入窗口1和窗口2时，第一样本过滤器(12)和第二样本过滤器(18)最好都是全血过滤器以阻止红细胞(尤其是红血球)进入层析条。或者，向窗口1加缓冲液，窗口2加作为样本的全血。在这种可选方案中，第一样本过滤器(12)就无需是全血过滤器，即它不必含有凝集剂。但是一般情况下，最好第一样本过滤器(12)和第二个样本过滤器(18)都是全血过滤器，而不管在进行测定时向窗口1加的是样本还是缓冲液。
在使用图3和图4的形式进行测定时，向图1的窗口1和窗口2填加含全血的样本。在这种形式下，第一样本过滤器(12)和第二样本过滤器(18)最好都是可以过滤红细胞的全血过滤器。图7示出了用图4的实施方式进行夹心测定的操作。向层析条(9)的第一端(10)使的第一样本过滤器(12)上添加含红细胞的样本。来自样本的液体沿第一侧流方向从第一端(10)向第二端(12)流动，途经捕获带(5)和对照带(6，7)。分析物(如果存在)将在捕获带(5)上被捕获，分析物-抗体在捕获带(5)上形成了第一免疫复合物。向窗口2(3)上的第二样本过滤器(18)添加同一样本的第二试样。来自第二样本过滤器(18)的液体经过液体收集垫(图4的19)和偶联物垫(13)到达第二端(11)，然后再沿第二侧流方向从第二端(11)再流到第一端(10)，途经捕获带(5)和对照带(6，7)。分析物(如果存在)在捕获带(5)上被检测试剂(例如抗体)捕获，从而分析物-抗体的复合物形成夹心。在这种形式下，添加到窗口2(3)的分析物(例如乙肝表面抗原)将首先与来自偶联物垫的例如带标记的抗乙肝表面抗原抗体(例如偶联于胶态金的的抗乙肝表面抗原抗体)的偶联物结合，以形成分析物-偶联物的复合物。然后该复合物向捕获区流动，并与固定在捕获区上的抗乙肝表面抗原抗体反应，此时也已经从加到窗口1(2)的分析物中捕获了乙肝表面抗原。
在图3和图4形式的一变体中，可省略向第一端(10)上的样本过滤器(12)添加样本的步骤，而直接将样本添加到窗口2(3)的第二样本过滤器(18)上。在这种形式下，先向窗口1添加缓冲液以预湿测试条，缓冲液沿第一侧流方向(21)从第一端(10)向第二端(11)流动。然后向窗口2(3)加样。来自样本的液体沿第二侧流方向(22)经过液体收集器(19)和偶联物垫(13)流向第二端(11)，并从第二端(11)沿第二侧流方向(22)流过捕获带(5)和对照带(6，7)。样本中的分析物与偶联物组合以形成复合物，该复合物再流向捕获带和对照带。分析物-偶联物复合物将在捕获带(5)上被捕获，并形成夹心。
值得注意的是，当如图3或图4中的测试条配置用于测定诸如血清或者血浆样本的非全血样本中的分析物时，图3中的样本过滤器(18)或者图4中的样本过滤器(18或12)不包含凝集剂。这种配置既可用于夹心测定也可用于间接测定。
在图3和图4中所例示的实施方式中，第二样本过滤器(18)通常是疏水性元件，例如玻璃纤维元件(Ahlstrom Filtration，Inc)。在本实施方式的一方面中，该第二样本过滤器(18)包含凝集剂。在本发明的另一方面中，在加入凝集剂之前，用非离子清洁剂例如用浓度为大约0.002％的吐温20(TWEEN20)处理该疏水性元件。第二样本过滤器可用于向图1中盒(1)的窗口2(3)加样。
在如图4所示的本发明的另一个实施方式中，当第一样本过滤器(12)被样本垫替换时，样本垫可以是疏水元件，就如样本过滤器(18)的疏水元件一样。在该实施方式中，样本垫可以含有凝集剂。另外，样本垫可以是亲水的，含或不含凝集剂，如上所述。
C.图8
图8一般性地示出了根据本发明的测试条的另一实施方式。一般而言，图8是在图3中示出的测试条的一个变体，但在该变体中样本，至少是那些被加在偶联物垫上(通常通过窗口2加入)的样本，在接触到样本过滤器之前与偶联物反应。在该实施方式中，层析条(9’)有第一端(10’)和第二端(11’)、样本过滤器(18’)、液体收集器(19’)以及偶联物垫，都置于层析条(9’)的第二端(11’)。同时还有第一样本过滤器(12’)、至少一个吸收垫(15’)、以及可任选的与第一个吸收垫(15’)毛细作用接触的第二吸收垫(16’)，都置于层析条(9’)的第一端(10’)。另外，可能还会可任选地使用第三吸收垫。图8的测试条与图3中一样具有捕获带和对照带(图8未示出)。样品可加到偶联物垫(13)、也可加到第一样本过滤器(12)。样本过滤器(18’)和液体收集器(19’)都可以由同样的大孔径的材料组成，但不是必须的。样本过滤器(18’)最好与偶联物垫(13’)的孔径大小一样，而液体收集器(19’)的孔径则较小一些。因此，由于与层析条(9’)的接触，毛细梯度就这样形成了，(19’)>(18’)>(13’)。当如图8的装置被用于执行双向测定时，可向偶联物垫(13’)和第一个样本过滤器(12’)加样。通常情况下，通过窗口1(2)向第一个过滤器(12’)加样，并通过窗口2(3)向偶联物垫(13’)加样。
D.图9
图9一般性地示出了根据本发明的测试条的另一实施方式。一般而言，图9是在图4中示出的根据本发明的测试条的一个变体。在该变体中样本，至少是如以上图8所示的通常通过窗口2加在偶联物垫上的样本，在接触到样本过滤器之前与偶联物反应。图9的测试条也与图4的一样具有捕获带和对照带(图9中未示出)。图9中的测试条的结构和图8的相类似，区别在于，样本垫(12’)与层析条(9’)直接接触，而且比吸收垫(15’)和(16’)更远离层析条(9’)的第一端(10’)。相比之下，在图8的测试条中，吸收垫(15’)和(16’)被堆叠在样本垫(12’)的上面，从而样本垫(12’)的表面部分地被吸收垫(15’)和(16’)所覆盖。另外，还可任选地使用第三吸收垫。可向偶联物垫(13’)加样，也可向第一样本过滤器(12’)加样。第一样本过滤器(18’)和液体收集器(19’)可由同样的大孔径材料组成，但不是必须的。样本过滤器(18’)最好与偶联物垫(13’)的孔径大小相同，而液体收集器(19’)的孔径则较小一些。因此，由于与层析条(9’)的接触，毛细梯度就这样形成了，(19’)>(18’)>(13’)。当图9的设置用于进行双向测定时，样品可加在偶联物垫(13’)上，也可加在第一样本过滤器(12’)上。通常情况下，通过窗口1向第一个过滤器(12’)加样，并通过窗口2(3)向偶联物垫(13’)加样。
E.图10
图10一般性地示出了根据本发明的测试条的另一实施方式。一般而言，图10是图3所示的根据本发明的测试条的一个变体。在该变体中，在层析条的第二端上依次叠加液体收集器、样本过滤器、偶联物垫。通常情况下，液体收集器和样本过滤器排成一条直线，而偶联物垫则偏置成它部分地与样本过滤器交迭。在该实施方式中，层析条(9”)有第一端(10”)和第二端(11”)、样本过滤器(18”)、可任选地还有液体收集器(19”)和偶联物垫(13”)，都置于层析条(9”)的第二端(11”)；同时还有一个缓冲液垫(12”)，和至少一个吸收垫(15”)，可任选地还有与第一吸收垫有毛细作用接触的第二吸收垫(16”)，都置于层析条(9”)的第一端(10”)。另外，可任选地还使用第三吸收垫。图10的测试条还包含如图3中所示的捕获带和对照带(图10中未示出)。可向偶联物垫(13”)加样本。样本过滤器(18”)和液体收集器(19”)可以由同样的大孔径材料组成，但不是必须的。样本过滤器(18”)最好比偶联物垫(13”)的孔径小一些，而液体收集器(19”)的孔径则比样本过滤器(18”)小一些。因此，由于与层析条(9”)的接触，毛细梯度就这样形成了，(11”)>(18”，19”)>(13”)。在操作中，遵从以下的顺序；(1)可任选地由缓冲液垫(12”)在第一端预湿层析条(9”)；(2)向样本过滤垫(18”)加样本，允许液体从偶联物垫流到样本过滤器(18”)上，允许液体从样本过滤器流到可任选的液体收集器(19＂)上，或直接向第二端(11”)流上层析条(9＂)，流过捕获带和对照带，允许在捕获带上捕获分析物。
F.图11
相似地，图11示出了一个与图10总体上相似的实施方式，不同之处在于，缓冲液垫(12”)、吸收垫(15”，16”)、以及层析条(9”)的第一端(10”)之间的关系如图4或者图9所示。图11的装置的操作和图10的基本相似。
G.图12
图12一般性地示出了与图4相似的实施方式，除了双面粘胶带(24a)被置于样本过滤器(12a)和层析条(9a)之间。双面粘胶带(24a)是为了控制从样本过滤器(12a)开始的液流，并为了确保从样本过滤器(12a)开始的液流朝层析条(9a)的第二端(11a)前进，并暂时延迟其向层析条(9a)的第一端(10a)前进。在图12的装置中，层析条(9a)有第一端(10a)和第二端(11a)，缓冲液垫(14a)和偶联物垫(13a)都位于层析条(9a)的第二端(11a)，样本过滤器(12a)、至少一个吸收垫(15a)、和可任选的第二吸收垫(16a)都位于层析条(9a)的第一端(10a)，该第二吸收垫(16a)与第一吸收垫(15a)毛细作用接触。另外，还可任选使用第三块吸收垫。图12的测试条具有如图3所示的捕获和对照带(未显示)。样本可加在样本过滤器(12a)上。层析条(9a)可用衬垫(17a)支撑。
在图12的装置中，加在样本过滤器(12a)上的样本进入层析条(9a)，向层析条(9a)的第二端(11a)流动。这是如上所述的双向测定中的第一向。粘胶带(24a)确保从样本过滤器(12a)流出的样本不朝层析条(9a)的第一端(10a)流动，直到足量的液体已朝第二端流动。在双向测定的第二向，缓冲液被加到缓冲液垫(14a)上。然后缓冲液流过偶联物垫(13a)，以重新溶解偶联物，然后偶联物通过层析条(9a)从第二端(11a)向第一端(10a)流动，吸收垫(15a，16a)驱动流动。
图12装置的其它任选方式也是可能的。例如，缓冲液而不是样本可加在层析条(9a)的第一端(10a)。在该另选方式中，样本加在层析条(9a)的第二端(11a)；偶联物垫(13a)的位置使其能接受样本过滤器的液流，代替如上所述的缓冲液垫(14a)。在另一个另选方式中，偶联物可分别加入，例如溶于缓冲液，或本身可靠近层析条(9a)第二端(11a)。在该另选方式中，样本被加到层析条(9a)的第二端(11a)，样本过滤器(12a)通常被缓冲液垫替换。
双面粘胶带(24a)可完全位于样本过滤器(12a)下方，或另选的，可朝层析条(9a)的第一端(10a)的方向延伸。当双面粘胶带(24a)完全位于样本过滤器(12a)下方时，它的通常表面尺寸为5mm×5mm；其通常厚度约为0.001英寸(0.0025cm)。当双面粘胶带(24a)向层析条(9a)的第一端(10a)方向延伸时，其通常的表面尺寸为5mm×7.5mm或5mm×10mm(对于全血测定)；其通常厚度约为0.001英寸(0.0025cm)。双面粘胶带(24a)的合适材料是聚酯；合适的聚酯是Adhesives Research制造的，具有如下所述的粘合剂层；另选的材料可以是其它粘合剂厂商制造的。双面粘胶带(24a)在两面都涂覆有粘合剂。特别合适的粘合剂是惰性的非迁移性丙烯酸粘合剂。也可对胶带使用其它合成或天然的材料，如果它们不吸收液体。任何使用的粘合剂应没有导致与样本或缓冲液中的任何成分相互作用的任何化学或生物化学活性。每面粘合剂层的厚度通常为约0.001英寸(0.0025cm)。
如下为根据图12构建的装置尺寸的第一个例子。这些尺寸特别适合用于血浆或血清中分析物测定的装置。双面粘胶带(24a)的尺寸是5mm宽(条带宽)×5mm长。图12中窗口-1缓冲液垫(12a)(5mm×7.5mm)向层析条(9a)的第二端(11a)伸过双面粘胶带(24a)一端3.5mm。双面粘胶带(24a)朝向层析条(9a)的第一端(10a)伸过窗口-1缓冲液垫(12a)的一端1mm。这确保液体不会从窗口-1缓冲液垫(12a)流过层析条(9a)，进入吸收垫(15a、16a)，而必定在胶带下流动，到达吸收垫。
如下为根据图12构建的装置尺寸的第二个例子。这些尺寸特别适合用于全血样本的分析物测定的装置。装置具有类似构造，除了窗口-1样本垫(12a)为5×10mm，因此双面粘胶带(24a)的尺寸是5mm宽×10mm长。窗口-1缓冲液垫(12a)向层析条(9a)的第二端(11a)伸过双面粘胶带(24a)一端2mm。双面粘胶带(24a)朝向层析条(9a)的第一端(10a)伸过窗口-1缓冲液垫(12a)的一端2mm。
用于图12装置的双面粘胶带也可用于图2、4、9和11的装置，例如以图12装置的相同可选方向使用。
因此，本发明的另一方面是用于侧向流测定的测试条，以检测样本中的至少一种分析物，该测试条包括：
(1)层析条，包括第一端和第二端，以及至少一个捕获带和至少一条对照带，捕获带包括用于捕获至少一种分析物的固定捕获试剂，而对照带包括固定对照试剂；
(2)偶联物垫，其中该偶联物垫与层析条的第二端有毛细作用接触，并且其中偶联物垫包括可结合到至少一种分析物上，或者在捕获分析物之后结合到捕获试剂的可移动的可检测试剂；
(3)直接与层析条的第一端接触的液体不可渗透的屏障；
(4)样本过滤器，该样本过滤器与层析条的第一端毛细作用接触，并与液体不可渗透的屏障直接接触，从而能显著延迟从样本过滤器流向层析条第一端的液流，其中样本过滤器可任选的含有凝集剂；
(5)可任选地，缓冲液垫，置于层析条的第二端，并与偶联物垫直接接触；
(6)第一吸收垫，置于层析条的第一端并与层析条直接接触；和
(7)可任选地，第二吸收垫，与第一吸收垫直接接触(如果存在)；其中测试条允许对含全细胞的样本中的分析物进行检测(定量或非定量)。
因此，本发明的另一方面是用于侧向流测定的测试条，以检测样本中的至少一种分析物，该测试条包括：
(1)层析条，包括第一端和第二端，以及至少一个捕获带和至少一条对照带，捕获带包括用于捕获至少一种分析物的固定捕获试剂，而对照带包括固定对照试剂；
(2)偶联物垫，其中该偶联物垫与层析条的第二端有直接毛细作用接触，并且其中偶联物垫包括可结合到至少一种分析物上，或者在捕获分析物之后结合到捕获试剂的可移动的可检测试剂；
(3)第一和第二样本过滤器，其中第一和第二样本过滤器分别可任选的含有凝集剂，第一和第二样本过滤器各自与层析条毛细作用接触，第一样本过滤器位于或靠近层析条第一端，第二样本过滤器与层析条第二端相邻；
(4)位于第二样本过滤器和偶联物垫之间的液体收集器，从而使它与第二样本过滤器和偶联物垫直接接触；
(5)与层析条的第一端接触的液体不可渗透的屏障，它与第一样本过滤器直接接触，从而显著延迟从第一样本过滤器流向层析条第一端的液流；
(6)第一吸收垫，置于层析条的第一端并与层析条直接接触，第一吸收垫比第一样本过滤器离层析条的第一端更近；和
(7)可任选地，第二吸收垫，与第一吸收垫直接接触(如果存在)；其中测试条允许对含全细胞的样本中的分析物进行检测(定量或非定量)。
因此，本发明的另一个方面是用于侧向流测定的测试条，以检测样本中的至少一种分析物，该测试条包括：
(1)层析条，包括第一端和第二端，以及至少一个捕获带和至少一条对照带，捕获带包括用于捕获至少一种分析物的固定捕获试剂，而对照带包括固定对照试剂；
(2)第一和第二样本过滤器，其中第一和第二样本过滤器分别可任选的含有凝集剂，第一和第二样本过滤器各自与层析条毛细作用接触，第一样本过滤器位于或靠近层析条第一端，第二样本过滤器与层析条第二端相邻；
(3)位于第二样本过滤器和层析条之间的液体收集器，从而使它与第二样本过滤器和层析条直接接触；
(4)位于层析条第二端的偶联物垫，与第二样本过滤器直接接触，与液体收集器间接接触，其中偶联物垫包括可结合到至少一种分析物上，或者在捕获分析物之后结合到捕获试剂的可移动的可检测试剂；
(5)与层析条的第一端直接接触的液体不可渗透的屏障，它与第一样本过滤器直接接触，从而显著延迟从第一样本过滤器流向层析条第一端的液流；
(6)位于层析条第一端的第一吸收垫，它与层析条直接接触，第一吸收垫比第一样本过滤器离层析条第一端更近；和
(7)可任选地，第二吸收垫，与第一吸收垫直接接触(如果存在)；其中测试条允许对含全细胞的样本中的分析物进行检测(定量或非定量)。
在该特定的配置中，偶联物垫、第二样本过滤器和液体收集器可分别偏移，从而使偶联物垫与第二样本过滤器部分交迭，第二样本过滤器与液体收集器部分交迭，如图9所示。另外，偶联物垫可以部分与第二样本过滤器交迭，而第二样本过滤器可以基本上完全与液体收集器交迭，如图11所示。其它配置也是可以的。
H.图13
图13一般性地示出了与图3相似的实施方式，除了双面粘胶带(24b)被置于样本过滤器(12b)和层析条(9b)之间。双面粘胶带(24b)是为了控制从样本过滤器(12b)开始的液流，并为了确保从样本过滤器(12b)开始的液流朝层析条(9b)的第二端(11b)前进，并延迟其向层析条(9b)的第一端(10b)前进。在图13的装置中，层析条(9b)有第一端(10b)和第二端(11b)、偶联物垫(13b)、第二样本过滤器(18b)和液体收集器(19b)都位于层析条(9b)的第二端(11b)，而第一样本过滤器(12b)、至少一个吸收垫(15b)、和可任选的第二吸收垫(16b)都位于层析条(9b)的第一端(10b)，该第二吸收垫(16b)与第一吸收垫(15b)毛细作用接触。另外，还可任选使用第三块吸收垫。图13的测试条具有如图3所示的捕获和对照带(未显示)。样本可加在第一样本过滤器(12b)和/或第二样本过滤器(18b)上。层析条(9b)可用衬垫(17b)支撑。
在图13的装置中，加在第一样本过滤器(12b)上的样本进入层析条(9b)，向层析条(9b)的第二端(11b)流动。这是如上所述的双向测定中的第一向。粘胶带(24b)确保从样本过滤器(12b)流出的样本不朝层析条(9b)的第一端(10b)流动。在双向测定的第二向，样品被加到偶联物垫(13b)上。然后样本流过第二样本过滤器(18b)和液体收集器(19b)到达层析条(9b)，从第二端(11b)向第一端(10b)流动，吸收垫(15b，16b)驱动流动。
图13装置的其它任选方式也是可能的。例如，缓冲液而不是样本可加在层析条(9b)的第二端(11b)。在该另选方式中，样本加在层析条(9b)的第一端(10b)。然而，通常优选将样本而不是缓冲液加到层析条(9b)的第二端(11b)，因为在大多数应用中这可以提高灵敏度。这是由于如果样品仅仅加在窗口-1，即层析条(9b)的第一端(10b)，从窗口-1流过捕获和对照带的样本体积仅仅为从窗口-2流过捕获和样本带的样本体积1/100。因此，如果缓冲液而不是样本被加到窗口-2，则有效样本体积就缩小了大约100倍，因此灵敏度也相应缩小了100倍。在另一个另选方式中，偶联物可以可在溶解形式位于样本过滤器内，或可单独加入，例如溶于缓冲液，或本身可靠近层析条(9b)第二端(11b)。
双面粘胶带(24b)可完全位于样本过滤器(12b)下方，或另选的，可朝层析条(9b)的第一端(10b)的方向延伸。当双面粘胶带(24b)完全位于样本过滤器(12b)下方时，它的通常表面尺寸为5mm×5mm；其通常厚度约为0.001英寸(0.0025cm)。当双面粘胶带(24b)向层析条(9b)的第一端(10b)方向延伸时，其通常的表面尺寸为5mm×7.5mm或5mm×10mm，如上所述。双面粘胶带(24b)的合适材料是聚酯；合适的聚酯是Bdhesives Resebrch制造的，具有如下所述的粘合剂层；另选的材料可以是其它粘合剂厂商制造的。双面粘胶带(24b)在两面都涂覆有粘合剂。特别合适的粘合剂是惰性的非迁移性丙烯酸粘合剂。每面粘合剂层的厚度通常为约0.001英寸(0.0025cm)。
用于图13装置的双面粘胶带也可用于图3、3A、3B、8、和10的装置。
因此，本发明的另一方面是用于侧向流测定的测试条，以检测样本中的至少一种分析物，该测试条包括：
(1)层析条，包括第一端和第二端，以及至少一个捕获带和至少一条对照带，捕获带包括用于捕获至少一种分析物的固定捕获试剂，而对照带包括固定对照试剂；
(2)偶联物垫，其中该偶联物垫与层析条的第二端有直接毛细作用接触，并且其中偶联物垫包括可结合到至少一种分析物上，或者在捕获分析物之后结合到捕获试剂的可移动的可检测试剂；
(3)第一和第二样本过滤器，其中第一和第二样本过滤器分别可任选的含有凝集剂，第一和第二样本过滤器各自与层析条毛细作用接触，第一样本过滤器位于或靠近层析条第一端，第二样本过滤器与层析条第二端相邻；
(4)位于第二样本过滤器和偶联物垫之间的液体收集器，从而使它与第二样本过滤器和偶联物垫直接接触；
(5)直接与层析条的第一端接触的液体不可渗透的屏障，该屏障还与第一样本过滤器直接接触，从而使从第一样本过滤器向层析条第一端流动的液体被显著延迟；
(6)第一吸收垫，置于层析条的第一端并与第一样本过滤器直接接触，与层析条间接接触；和
(7)可任选地，第二吸收垫，与第一吸收垫直接接触(如果存在)；其中测试条允许对含全细胞的样本中的分析物进行检测(定量或非定量)。
因此，本发明的另一个实施方式是用于侧向流测定的测试条，以检测样本中的至少一种分析物，该测试条包括：
(1)层析条，包括第一端和第二端，以及至少一个捕获带和至少一条对照带，捕获带包括用于捕获至少一种分析物的固定捕获试剂，而对照带包括固定对照试剂；
(2)第一和第二样本过滤器，其中第一和第二样本过滤器分别可任选的含有凝集剂，第一和第二样本过滤器各自与层析条毛细作用接触，第一样本过滤器位于或靠近层析条第一端，第二样本过滤器与层析条第二端相邻；
(3)位于第二样本过滤器和层析条之间的液体收集器，从而使它与第二样本过滤器和层析条直接接触；
(4)偶联物垫，其中该偶联物垫位于层析条的第二端，与第二样本过滤器直接接触，与液体收集器间接接触，其中偶联物垫包括可结合到至少一种分析物上，或者在捕获分析物之后结合到捕获试剂的可移动的可检测试剂；
(5)与层析条的第一端接触的液体不可渗透的屏障，它与第一样本过滤器直接接触，从而使从第一样本过滤器向层析条第一端流动的液体被显著(substantially)延迟；
(6)位于层析条第一端的第一吸收垫，它与第一样本过滤器直接接触，与层析条间接接触；和
(7)可任选地，第二吸收垫，与第一吸收垫直接接触(如果存在)；其中测试条允许对含全细胞的样本中的分析物进行检测(定量或非定量)。
在该特定的配置中，偶联物垫、第二样本过滤器和液体收集器分别偏移，从而使偶联物垫与第二样本过滤器部分交迭，第二样本过滤器与液体收集器部分交迭，如图8所示。或者，偶联物垫可以部分与第二样本过滤器交迭，而第二样本过滤器可以基本上完全与液体收集器交迭，如图10所示。其它配置也是可以的。
I.图14-19的具体实施方式
图14-19中示出了根据本发明的测试条的具体实施方式。图14-19的设备都是使用羊抗DNP抗体和DNP-BSA抗体作为对照，并以双向模式运行。图14是能对人类丙肝病毒(HCV)进行间接测定的一测试条实施方式的详细侧视图。图15是能对前列腺特异性抗原(PSA)进行夹心测定的一测试条实施方式的详细侧视图。图16是能对人体艾滋病病毒的特异性抗体进行夹心测定的一测试条实施方式的详细侧视图。图17是能对人体艾滋病病毒的特异性抗体进行间接测定的一测试条实施方式的详细侧视图。图18是能在同一样本里同时对人体艾滋病病毒特异性抗体和丙肝病毒特异性抗体进行间接测定的一测试条实施方式的详细侧视图。图19是能在同一样本里同时对乙肝表面抗原(HbsAg)和梅毒衣原体的抗体进行夹心测定的一测试条实施方式的详细侧视图。
I.其它一般实施方式：
因此，本发明的测试条的另一个实施方式通常是用于侧向流测定的测试条，以检测样本中的至少一种分析物，包含：
(1)层析条，包括第一端和第二端，以及至少一个捕获带和至少一条对照带，捕获带包括用于捕获至少一种分析物的固定捕获试剂，而对照带包括固定对照试剂；
(2)偶联物垫，其中偶联物垫与层析条的第二端毛细作用接触，且其中偶联物垫包含固定的可检测试剂，该可检测试剂能够结合所述至少一种分析物或在捕获分析物后结合捕获试剂；
(3)样本过滤器，它与偶联物垫与第二端更靠近的一侧相邻，其中样本过滤器可任选的含有凝集剂，样本过滤器与层析条毛细作用接触；
(4)可任选的液体收集器，如存在，位于样本过滤器和层析条之间；
(5)可任选的缓冲液垫，位于层析条第一端并与层析条毛细作用接触；
(6)位于层析条第一端的第一吸收垫，它与层析条直接或间接毛细作用接触；和
(7)可任选地，第二吸收垫，如果存在，与第一吸收垫毛细作用接触；其中测试条允许对含全细胞的样本中的分析物进行检测(定量或非定量)。
更一般的，本发明的测试条的另一个实施方式是用于侧向流测定的测试条，以检测样本中的至少一种分析物，包含：
(1)层析条，包括第一端和第二端，以及至少一个捕获带和至少一条对照带，捕获带包括用于捕获至少一种分析物的固定捕获试剂，而对照带包括固定对照试剂；
(2)样本过滤器，它与层析条的第一端毛细作用接触；
(3)与层析条的第一端直接接触的液体不可渗透的屏障，它与样本过滤器直接接触，从而使从样本过滤器向层析条第一端的液体流动被显著延迟；
(4)用于提供可移动的可检测试剂的工具，该试剂能够与所述至少一种分析物结合，或在捕获分析物至层析条后结合捕获试剂，从而可移动的可检测试剂通过层析条迁移，并与通过样本过滤器而且也迁移通过层析条的样本接触；
其中该测试条能检测(定量或非定量)含有全细胞的样本中的分析物。
本发明中组合的物质和测试条组分的排列赋予本发明独特的优点，能使用小体积的样本，足够过滤包括红血细胞的细胞，并能充分溶解可检测的试剂，在测定分析物存在和数量时得到稳定的结果。
虽然本发明提供了优点，例如从样本的液体中充分分离红血细胞，和不依赖于细胞体积，本发明还可用于检测和定量不含细胞或存在的细胞不是红血细胞的样本中的一种或多种分析物。因此，测试的样本可包括血清、血浆和全血。
VI.测试条和盒之间的相互作用
本发明的测试条通常与盒(例如图1所示)，并通常尺寸适合置于图1的盒内，因此图1盒的开口可用于向测试条加试剂，而且图1的盒可以与其中的测试条一起置于读数仪中，以获得定性或定量的结果。然而，本发明的测试条不限于与盒(例如图1所示)一起使用；用于加试剂和读取结果的其它配置也是可以的，并且在本发明的范围内。
如图5，图5显示了本发明测试条和可与其一起使用的盒(例如图1所示的盒)的俯视平面图直接的关联。在该实施方式中，可检测试剂可在第二端掺入层析条，或可存在于偶联物垫中。当该条的构造是用于夹心测定法时，要分析的样本可同时加在窗口-1(2)和窗口-2(3)；或另选的，样本可加在窗口-2(3)，但试剂(如缓冲液)而不是样本可加在窗口-1(2)。当用于间接测定时，样本可加在窗口-1(2)；缓冲液可加在窗口-2(3)。
用于从插入盒中的本发明测试条(如图5所示)产生结果的装置是Polito等的美国专利6,136,610所述的装置，在此引入以供参考，更具体的是在美国专利号6,136,610的图1、2、3、4、5、6、7、7A和8中。该装置特别适用于通过测定反射强度(反射密度或Dr)和将该测量值转换成相对强度(RI)来检测分析物。该装置可包含控制测定计时的工具和加热测试条的加热元件，以及以数据形式储藏和传输结果的工具。该装置可确定基线，并矫正测试条中可能存在的误差。虽然Polito等的美国专利号6,136,610的装置特别适用于通过反射强度来测量分析物浓度，该装置也可适应其它测量，例如荧光、辐射、或磁通量。例如，Polito等的美国专利号6,136,610的装置中使用的光学传感器可用其它类型的传感器代替。传感器编码可以以其它模式通信，而不使用条形码阅读器的条形码读数，如RFID标签。可对美国专利号6,136,610的装置进行其它改变；例如，通讯出口可通过拨号调制解调器连接或宽带连接与互联网相连接，如本领域已知的。在另一个实施方式中，可提供给计算机系统的信息包括重新配置存贮器资源的测定表(assay tables)的参数以及通过置换性记忆芯片(例如可插入存贮芯片、闪存、存贮棒、或其它存贮装置)提供的参数。其它变化形式也是可能的。
在本发明的另一个实施方式中，可将含有本发明测试条的盒或其它容器插入可同时进行许多测试，例如2个测试、3个测试、4个测试、5个测试、6个测试或更多测试的仪器。仪器可具有多个舱，用于插入多个盒或其它容器，以进行多个测试。仪器还可包含多个传感器，以自动检测在盒的窗口-1和窗口-2中液体，如样本或缓冲液的加入。如本文所用的，术语“传感器”被广义的定义为包括可以检测在窗口-1和窗口-2中液体的加入的任何装置。仪器还包括控制装在舱内的盒温的工具。这可以使用控制温度的任何常规工具，例如恒温器。这可包括例如，照相机或光谱接收器，不限于通过电学性质，例如电导或电容改变检测窗口-1和窗口-2中液体加入的装置。在一个另选方式中，仪器可以具有不同类型的检测组件，从而人们能在同一仪器上用胶态金标记、化学发光标记和荧光标记同时进行测试。虽然该仪器被描述成具有许多舱的仪器，但仅具有一个舱和其它所述特征的仪器也是本发明的一部分，并可与本发明的测试条一起使用。
因此，本发明的另一个实施方式是一种进行检测或测定测试条上的分析物的测定法的仪器，该仪器包含：
(1)至少两个舱，每个舱装有本发明的盒；
(2)用于检测在插入每个舱中的盒的窗口-1和窗口-2中有液体加入的传感器；
(3)用于控制舱中的盒温的工具；和
(4)用于检测或测定每个盒中各测试条上被检测或测定的分析物，并报告分析物的每次检测或测定的工具。
本发明的还有一个实施方式是一种进行检测或测定测试条上的分析物的测定法的仪器，该仪器包含：
(1)装有本发明的盒的舱；
(2)用于检测在插入该舱中的盒的窗口-1和窗口-2中有液体加入的传感器；
(3)用于控制舱中的盒温的工具；和
(4)用于检测或测定盒中每个测试条上被检测或测定的分析物，并报告分析物的每次检测或测定的工具。
VII.本发明测试条进行的测定的详述
使用本发明的测试条进行侧向流试验可参照图6进行说明。图6示出了本发明一实施方式的平面俯视图，显示了在试验中样本和试剂的双向侧向流，如图2的实施方式所示。在这种实施方式中，向样本过滤器(12)加样本。液体从样本过滤器(12)流向层析条(9)的第一端(10)，并在第一侧流方向(21)流向层析条(9)的第二端(11)，途经捕获带(5)和对照带(6，7)。在对照带(7)和偶联物垫(13)之间，来自样本的液体在第一流动方向上停止流动；如果在第一次流动后剩余有足够的液体，则在第二次加样到窗口2(3)后，第一次流动时的剩余液体将回流、并在第二流动方向(22)上流回层析条(9)的第一端(10)。样本中的分析物(如果存在)将主要在液体在第一流动方向(21)流动的过程中在捕获带(5)上被捕获，其次则在液体在第二流动方向(22)流动的过程中被捕获。双向侧向流有利于预湿层析条，从而在带标记的试剂流入该区域之前，层析条表面的化学物质可以溶解并均匀地分布；双向侧向流同样有利于冲洗走捕获和对照带上的杂质，从而减少试验中的背景噪声。一种试剂，比如适合于试验的缓冲液或者偶联物释放缓冲液，可由窗口(2)添加到缓冲液垫(14)上，缓冲液的用量应足以溶解或者是释放偶联物。合适的偶联物释放缓冲液为1X PBS，含有0.1％的吐温20(TWEEN20)，0.01％的酪蛋白，0.3％的SDS，0.2mM EDTA以及0.1％的叠氮化钠。所释放的偶联物在第二流动方向(22)从层析条(9)的第二端(11)向层析条(9)的第一端(10)流动，并在捕获带(5)上与分析物发生反应。偶联物被制成相关于分析物。例如，为了检测人类血样中的人类抗体时，偶联物可以是抗人IgG(或在人类IgM检测时是IgM)，诸如但不限于，偶联于胶态金的羊抗人IgG、兔抗人IgG、鼠抗人IgG。
在进行双向侧向流的试验中样本过滤器(12)中没有凝集剂时，存在于样本中的红细胞将有可能泄漏到层析条(9)上，从而产生高背景噪声，因此导致降低了信噪比。发明人发现，如果偶联物释放缓冲液中含有较高浓度(如0.1％)的某种清洁剂，诸如非离子清洁剂，比如TWEEN20，则将能大大减小背景问题。清洁剂与偶联物释放缓冲液的混合将有利于从捕获和对照带上冲洗走红细胞或者溶血的红细胞，从而降低分析物和样本过滤器的非特异性结合。
如果样本过滤器(12)中使用诸如抗红细胞抗体的凝集剂，以去除样本中的红细胞，则样本过滤器(12)用诸如非离子清洁剂的清洁剂，例如吐温20(TWEEN20)，进行预处理。较低浓度的例如约0.002％的清洁剂被用于此目的。非离子清洁剂的添加有利于使样本过滤器的疏水性表面变得具有微弱亲水性，从而凝集剂就可更紧密地与样本过滤器结合。
图7示出了如图4所示的本发明一实施方式进行夹心法试验。比如含红细胞样本的试样在层析条(9)的第一端(10)上被添加到第一样本过滤器(12)。来自这份试样的液体在第一流动方向(21)上从层析条(9)的第一端(10)流向第二端(11)，流经捕获带(5)和对照带(6，7)。分析物(如果存在)将在捕获带(5)上被捕获。然后向层析条(9)的第二端(11)的窗口2(3)将同一样本的第二试样添加到第二样本过滤器(18)上。第二样本过滤器(18)中的液体流经液体收集器(未示出)和偶联物垫(13)到达层析条(9)的第二端(11)，然后再在第二流动方向(22)上从层析条(9)的第二端(11)流向第一端，流经捕获带(5)和对照带(6，7)。分析物(如果存在)将在捕获带(5)上被捕获，并且分析物与捕获带上的检测试剂一起形成夹心。
或者，可略去样本向层析条(9)的第一端(10)上的样本垫的初始添加，而在层析条(9)的第二端(11)上直接将样本添加到窗口2(3)的第二样本过滤器(18)。样本过滤器(18)中的液体流经液体收集器(未示出)和偶联物垫(13)到达层析条(9)的第二端(11)；然后在第二流动方向从层析条(9)的第二端(11)流向第一端，流经捕获带(5)和对照带(6，7)。分析物(如果存在)将在捕获带(5)上被捕获，并且分析物将与捕获带上的检测试剂一起形成夹心。通常，在这种操作模式中，要向第一样本过滤器(12)添加缓冲液，从而缓冲液也就可在第一流动方向上从测试条的第一端流向第二端以预湿该测试条。
用图3所示的装置可进行类似顺序的操作。
如上所述，可使用根据本发明的测试条在单一的测定中检测多种分析物。例如，样本可含有两种分析物，而层析条可由两条独立的捕获带组成，每条捕获带上包含有一种固定的捕获试剂，分别针对捕获特定的一种分析物而不是另一种。或者，如果样本含有三种分析物，而层析条可由三条独立的捕获带组成，每条捕获带上包含有一种固定的捕获试剂，分别只针对捕获特定的一种分析物，而不是其他两种。本领域技术人员可针对单次测定所要测定的分析物的组合，根据分析物的性质和捕获试剂的特点来选择对分析物混合物合适的捕获试剂，例如抗体。
如美国专利No.6,136,610所述，在捕获带上被捕获的分析物可被量化的。然而，其他量化方法也是可能的。根据本发明的测试条还可以用于定性或半定量的测定。
实施例中使用的组件包括吸收垫，样本过滤器，缓冲液垫，层析条以及偶联物垫，具有由各生产厂家指定的特性，分别列在表1里。但是，可使用其它替换组件，并且在本领域中是众所周知的。
VIII.分析物、检测试剂和缓冲液
A.分析物
合适的分析物包括但不限于：抗原、抗体、激素、药物、细胞蛋白、DNA、心肌标记物、肿瘤或癌症标记物、自身免疫性疾病标记物、或者其它可培育抗体的大分子。当分析物为抗原时，该抗原可以是与传染原相关联的抗原。该传染原可以是病毒、细菌、真菌、或者蛋白感染素。当该传染原为病毒时，病毒可从以下构成的组中选择：艾滋病病毒、甲肝、乙肝、丙肝、丁肝病毒、单纯疱疹性病毒、巨细胞病毒、乳突淋瘤病毒、埃博拉病毒、非典病毒、鼻病毒、疫苗病毒，但不仅限于这些病毒。当该传染原为细菌时，该细菌可以是革兰氏(染色)阳性或者革兰氏(染色)阴性细菌。细菌可从以下构成的组中选择：炭疽杆菌、大肠杆菌、哈比特属幽门菌、淋病奈瑟球菌、沙门氏菌、志贺氏杆菌，但并不仅限于这些细菌。当该传染原为真菌时，该真菌可以是霉菌或者曲霉菌，但不仅限于这些菌类。
当分析物为激素时，通常情况下可从以下构成的组中选择：人绒毛膜促性腺激素、甲状腺素、促甲状腺激素、胰高血糖素、胰岛素、耻骨松弛激素、泌乳刺激素、黄体素、促黑细胞激素、生长激素、促卵泡激素、胃泌激素、缓激肽、抗利尿激素或其他释放因素；然而，其他一些生理学或者病理学上的感兴趣的激素都可作为分析物。
当分析物为癌症或者肿瘤标记物时，它一般从以下构成的组中选择：前列腺特异性抗原(PSA)、癌胚抗原(CEA)和胎蛋白。然而，其他的癌症或者肿瘤标记物也可以作为分析物。
当分析物为心肌标记物时，该心肌标记物一般从以下构成的组中选择：肌钙蛋白-I、肌钙蛋白-T、肌酸激酶同功酶(CK-MB)、肌血球素、c反应蛋白(CRP)、脂肪酸结合蛋白(FABP)、糖原磷酸化酶BB型同功酶(GPBB)、B型钠尿肽(BNP)、前脑排钠利尿胜肽(pro-BNP)。然而，分析物还可以是其他心肌标记物。
根据本发明的测试条和方法还可测定其他一些分析物。例如，可测定组织特异性细胞表面标记物。通过使用以下物质，可基于标记物来分离细胞群：植物凝集素(Reisner和Sharon，Trends in Biochem Sci(TIBS)29，1980)、白血球表面糖蛋白(Gahmberg和Anderssen，NYAS(1978)312，Fibroblast Surface Proteins eds.Vahery，Ruslahti和Mosher)、雌激素类固醇受体(Thompson，癌症治疗报告，(1978)63(2)180)、红血球胰岛素受体(Bhathena等人，Horm Metab Res(1981)13：179)、或者淋巴细胞情形中的多种标记物。在T淋巴细胞的情形中，还有可能基于用特定细胞功能标识的标记物进一步分离亚群(Reinberg和Schlossman，N Eng J med(1980)303：1153)。
类似地，也可测定共用组织的细胞表面标记物。一些细胞表面标记物存在于多个细胞类型里。其一个示例为：主要组织相容性复合物人淋巴细胞抗原(HLA)系统、LETS蛋白、P糖蛋白(Kartner等人，Science(1983)221：1285)和铁传递蛋白受体(Omary等人，Nature(London)(1980)286：888)。
其他分析物包括与病毒相关联的细胞表面标记物。细胞膜表面抗原也可因感染了病毒而产生。通过放射免疫测定(RIA)、免疫荧光法检测、红血球凝集抑制可检测到的腮腺炎H-N糖蛋白代表了被感染细胞上的病毒标记物(Sever等人，Infect&Immun(1982)35(1)：179)。类似地，因单纯疱疹病毒1型和2型的感染而产生的标记物也可通过免疫荧光法在宿主细胞的表面上识别出来(Stewart和Herrmann，临床免疫手册中的“Herpes Simplex Virus”(单纯疱疹病毒)一文，第二版，编者为N.R.Rose和H.Friedman，美国微生物学会，华盛顿，1980年出版)。
还有些分析物包括肿瘤特异性细胞表面标记物。致瘤性转化和致癌性转化导致了如在细胞表面蛋白质中所表达的细胞表型的改变。这些可观察到以下几种变化：在细胞表面正常表达的细胞表面抗原的出现、“改变了的自体抗原”的出现、胚胎细胞表面抗原的出现、以及肿瘤特异性分子的出现等等。Felsted等人(CancRes(1983)43：2754)描述了在白血病早幼粒细胞的分化过程中细胞膜的变化。Poste的评论(Cancer Invasion and Metastasis：Biologic Mechanisms and Therapy，由S.B.Day等人编辑，Raven Press1977年在纽约出版)中综述了细胞表型中因致瘤性转化引起的改变。类似的评论文章描述了以下的表型：白血病细胞(Greaves等人：Procof International Symposium on Human Lymphocyte Differentiation：Its Application toCancer，Seron和Rosenfeld编辑，North Holland Publishing1978年在阿姆斯特丹出版)、B淋巴细胞(Thorsky等人，出处同上)、急性淋巴细胞性白血病细胞(Greaves等人，Science234，1986)。鉴定肿瘤特异性抗原或标志物、以及它们与特定组织肿瘤之间的关联可允许更清晰的诊断和随后在治疗中的监视。许多肿瘤表面蛋白质已被鉴定。若干示例包括：突变了的大白鼠p21肿瘤淋巴细胞蛋白(Bos等人，Nature(伦敦)(1985)315：726，和Clark等人PNAS(美国)(1985 82：5280)；急性淋巴细胞性白血病相关联的GP100Ph1抗原(Greaves等人，Blood(1983)61：628)；人T细胞白血病相关联抗原(HTLA)(Seon等人，J of Immunol(1981)127(6)：2580)；人肺肿瘤相关联抗原(Braatz等人，J Nat Cancer Inst(1978)61(4)：1035)、雌激素24,000分子量人乳房癌标志物(Adams等人，CancerRes(1983)43：4297)；人平滑肌肉瘤抗原(Deng等人，Lancet，1981年2月21日，403页)；以及人乳腺癌抗原(Schlom等人，PNAS(1980)77(11)：6841)。进一步关于肿瘤标志物，由Edelman提出的“改变了的自体抗原”概念(Science(1976)197：218)描述了正常情况下为某一细胞类型固有的细胞表面抗原因致瘤性转化而发生了变化。免疫监督系统将这些异常细胞视为不正常，并且它们能产生免疫响应(Bumet，Brit Med J(1957)1：179，Nature(1970)226：123)。细胞的致瘤性转化后还观察到胚胎细胞抗原的重新出现。致癌胚胎细胞抗原(CEA)、胎儿胚胎抗原(FEA)和肿瘤特异性移植抗原(TSTA)都在癌瘤和肉瘤的血液检测中起了作用(Mitchison，“Immune Surveillance”in B and TCells in Immune Recognition(在免疫识别中B和T细胞的“免疫监督”)，F.Loors和G.E.Roelants编辑，Wiley and Sons1977年在纽约出版)。
其他分析物包括脂蛋白、酶、免疫球蛋白、淋巴因子、细胞活素和药物，包括在半抗原化的过程中可针对其来制备抗体的任何药物。在半抗原化过程中，在注射进可产生抗体的动物体内时因太小而不能产生抗体的分子可耦合到诸如蛋白质分子的较大的载体分子，比如钥孔虫戚血蓝素，再以这种形式注入以产生抗体。
其他蛋白质分析物包括皮质(激)素传递蛋白、红细胞沉淀素、铁传递蛋白、各种球蛋白、甲状腺激素结合球蛋白、A，B，C，D，E，M等各型的免疫球蛋白，各种补体因子、例如纤维蛋白原的血栓因子、第八因子、组织凝血激酶和凝血酶。
其他分析物还包括药物，既包括治疗药物或者滥用和可能被滥用的药物。在授予Ullman等人的美国专利3,996,345中公开的很多药物可被视为分析物，此专利通过引用结合在此。这些药物包括但不限于，生物碱、生物碱的代谢物(包括吗啡、可卡因、酶斯卡灵、麦角酸)、以及合成鸦片。还有其它药物包括，美沙酮、杜冷丁、安非他明、脱氧麻黄碱、苯乙哌啶酮、苯妥英和所有属于苯并二氮杂环庚烷(benzdiazocycloheptane)、吩噻嗪、巴比妥酸盐类别的药物。其他药物包括肾上腺素、麻黄素、左旋多巴和降肾上腺素。其他药物还包括安定药氨甲丙二酯、Tergitol、例如Ethoxsumide的琥珀酰亚胺。其他药物还包括四氢大麻酚、大麻醇和相关的衍生物，主要为由大麻、其合成修饰物和代谢物衍生的复合物。其他药物还包括类固醇的药物，例如雌激素、助孕素、男性激素、肾上腺皮质激素、胆酸、强心苷、糖苷配基、皂角苷、皂角苷配基。通常情况下，如以上提到的，为了产生抗体，需要对例如类固醇、类固醇、缩氨酸等的一些小分子半抗原化。
尽管上面的讨论集中在可根据抗原抗体反应确定为分析物的物质，但术语“分析物”并不视为将用根据本发明的设备和方法来测定的物质的范围限制于只能根据抗原抗体反应来测定的物质。例如，如果存在可与分析物结合的特异性很好的特异性结合蛋白，则可用该合适的特异性结合蛋白来取代固定在层析条上的抗体、或者是用偶联物标记的抗体。这些特异性结合蛋白包括但不限于：作为用来测定维他命B12的一对特异结合蛋白中的一员的内在因子蛋白；用来检测叶酸的叶酸结合蛋白、作为用来测定碳水化合物的一对特异性蛋白中的一员的血凝素；或用来检测相对应的细胞分裂素、淋巴激活素、生长因子的细胞分裂素受体、淋巴激活素受体、生长因子受体(例如Interleukin-1受体)。
另外，术语“分析物”还包括核酸，例如DNA或者RNA，只要有适合它们的特异性结合大分子即可。这些合适的特异性结合大分子可以是以序列特异性方式与核酸结合的蛋白，也可以是按照Waston-Crick碱基配对理论与要检测的序列结合的核酸分子或者是核酸分子的相似物。如果要检测的核酸有足够的长度，那么要检测的核酸可与固定的互补核酸在核酸分子内的一段序列上杂交，然后可在核酸分子内的另一段序列上与带标记的核酸再进行杂交。该过程一般被称为“夹心法杂交”，并在授予Manoharan等人的美国专利No.6,825,331中有更详细的描述，此专利通过引用结合于此。
B.检测试剂
如上所述了合适的检测试剂。通常，可检测试剂包括例如，对分析物特异性的抗体或抗原，它们与可检测物质，例如着色物质、荧光物质、或化学发光物质偶联。着色物质的一个例子是胶态金。也可使用其它胶态金属标记或胶态非金属标记。标记可以是颗粒、着色物质、荧光标记、化学发光标记、氧化还原标记(如亚铁氰化物)、放射标记、射频标记、酶标记、生物发光标记，并可包括一种以上的物质。如果使用一种以上的物质，可使用可能物质的任意组合。例如，如果测定法要检测一种以上的分析物，要使用的可检测物质可以是在不同波长发荧光的荧光物质。颗粒可以是胶态金颗粒、胶态硫颗粒、胶态硒颗粒、胶态硫化钡颗粒、胶态硫酸铁颗粒、胶态金属硫化物颗粒、胶态硒化铅颗粒、胶态硒化镉颗粒、胶态金属碘化物颗粒、胶态金属磷酸盐颗粒、胶态金属铁酸盐颗粒、胶态卤化银颗粒、胶态二氧化硅颗粒、胶态金属(含水)氧化物颗粒等，如美国专利号6,136,610所述，该颗粒可以带有或不带有有机或无机涂层、蛋白或肽分子、脂质体或有机聚合物乳胶颗粒(例如聚苯乙烯乳胶珠)。颗粒的大小可与层析条的多孔性相关；在一个另选方式中，颗粒足够小，从而能通过液体的毛细作用通过元件。可使用其它本领域已知的标记。例如，适用于本发明的装置和方法的标记可包括但不限于：发光标记、比色标记(如染料)、荧光标记、化学标记(如电活化试剂，例如亚铁氰化物等)、酶、放射标记、或射频标记。在使用除了胶态金属或非金属颗粒以外的标记的实施方式中，标记是荧光标记，例如量子(quantum dot)偶联物。量子偶联物如Bawendi等的美国专利号6,855,551所述，在此引入以供参考。测试条中存在的颗粒数量可变，视颗粒的大小和组成、测试条的组成和元件条、以及测定的灵敏度水平而定。
可用任何常规方法，例如G.Frens，1973Nature Physical Science，241：20(1973)的方法制备胶态金。其它方法可如美国专利号5,578,577、5,141,850、4,755,636、4,853,335、4,859,612、5,079,172、5,202,267、5,514,602、5,616,467、和5,681,775所述，这些全部在此引入以供参考。
颗粒粒径的选择可影响一些因素，例如本体溶液(bulk sol)试剂的及其偶联物的稳定性、从测试条释放颗粒的效率和完整性、反应的速度和完全性。另外，颗粒的表面积可能影响结合基团之间的立体位阻。
分析物非特异性试剂也可能与检测试剂偶联。选择该试剂是由于其与除了感兴趣的分析物以外的其它物质结合的能力。例如，如果感兴趣的分析物是针对幽门螺杆菌(H.pylori)的抗体，则分析物非特异性试剂可以是在针对幽门螺杆菌的抗体中很少发现、或未发现的针对抗原的抗体。该结合可以对于除了感兴趣的分析物以外的物质是特异性的，或对于该物质是非特异性的。
分析物非特异性试剂可以是抗体，更优选兔IgG。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。本文所用的术语“抗体”也可指能够足够与感兴趣的分析物结合的抗体片段。另外，也可使用工程改造的蛋白质等分子，它们具有对感兴趣的分析物无特异性的非特异性结合位点。在另一个实施方式中，也可使用对感兴趣的分析物以外的配体非特异性结合的受体，反之亦然。最后，分析物非特异性试剂可以是抗原、另一种有机分子、或与对于感兴趣的分析物无特异性的蛋白偶联的半抗原。其它合适的分析物非特异性试剂可在美国专利号5,096,837中找到，包括IgG、BSA、其它清蛋白、酪蛋白、球蛋白、和免疫球蛋白。
分析物非特异性试剂可包括对照结合试剂。选择对照结合试剂，使其与除了与感兴趣的分析物特异性结合的分子以外的分子特异性结合。由此，这些对照结合试剂可以结合在对照结合区域中，如下所述。可用作对照结合试剂的物质包括那些如上所述可用作第一分析物结合试剂的物质。在一优选例中，对照结合试剂包含家兔抗-二硝基酚(抗-DNP)抗体。对照结合试剂的其它有益的特征包括但不限于批料(bulk)的稳定性、对感兴趣的分析物无特异性、测试性能的可再现性和可预测性、分子大小、以及与对照试剂结合的亲和力。
C.缓冲液
当在进行双向测定时向窗口1加样本，并且向窗口2加缓冲液以在第二方向上流动时，合适的缓冲液与添加到样本里的样本或任何试剂在pH值和离子强度方面相兼容。缓冲液不能与样本中的任何分析物或大分子发生反应。合适的缓冲液包括但不限于：磷酸盐缓冲液、林格液(Ringer’s solution)、汉克液(Hank’s solution)或者(三)羟甲基氨基甲烷(TrisTM)缓冲液。合适的缓冲液是含有0.1％的Tween20、0.01％酪蛋白、0.3％SDS、0.2mM EDTA和0.1％叠氮化钠的1×PBS；也可使用其它另选的缓冲液。在向窗口1加缓冲液时可使用同一类型的缓冲液来预湿层析条，并向窗口2加样本。
表1：窗口2中元件的选择的一览表
 
上层 化学特性 疏水性/亲水性  孔径(微米) 流速(毫升/分钟) 毛细引力(毫米/分钟) 下层 是否能过滤红细胞(能/不能)
#111 纤维素 亲水 1 130 51 偶联物垫 不能
#141 玻璃纤维 疏水 3 350 79 偶联物垫 不能
#142 玻璃纤维 疏水 6 300 55 偶联物垫 能
#1660 合成纤维(CytoSep) 亲水 3 100 52 偶联物垫 不能
 
#1661 合成纤维(CytoSep) 亲水 5 260 41 偶联物垫 不能
#1662 合成纤维(CytoSep) 亲水 3 35 46 偶联物垫 不能
#1663 合成纤维(CytoSep) 亲水 2 35 46 偶联物垫 不能
#319 合成纤维(CytoSep) 亲水 19 375 54 偶联物垫 不能
偶联物垫 玻璃纤维 疏水 42 250 46 偶联物垫 不能
工业实用性
本发明可有利地应用于包括床边检测(POC)设备的诊断设备方面，例如医生办公室、诊所或者是战场，用来测定样本中包含或者不包含细胞(比如红细胞、白细胞或者其他细胞类型)的分析物的存在和量。本发明的材料和方法在检测一些疾病因子或者抗体中有用途，包括HIV、HAV、HBV、HSV、CMV、SARS、疫苗病毒和其他一些分子，包括例如deoxypyrodinoline(一种骨骼吸收标记物)、人血清蛋白、乱用药物、违禁药物、蛋白标记物(例如前列腺特异性抗原(PSA)、例如L-乳酸脱氢酶的肾脏疾病蛋白、例如人体绒(毛)膜促性腺激素(HCG)的怀孕或者生育能力相关的激素、以及尿道感染标记物。血液携带的分析物的测定特别适于本发明，例如治疗药物、激素、诸如前列腺特异性抗原(PSA)的癌症标记物、心肌标记物(包括肌钙蛋白-I、肌钙蛋白-T、肌酸激酶同功酶(CK-MB)、α胎蛋白)。另外，样本可以是全血样本。因此，虽然本发明的设备和方法适于测定各种体液，包括尿液、唾液、汗液或者其他黏液，但它特别适于测定那些含有红细胞的测试液和测定只有很少量的样本，例如采自手指的血。
实施例
旨在仅仅例示本发明，因此不应视为以任何方式来限制本发明的示例说明和详述了本发明的上述详细方面和实施例。这些示例并不代表以下试验是所有或者唯一操作过的试验。我们已经努力保证试验数据的准确性(例如：数量、大小等等)，但是应该考虑到一些试验的误差和偏差。
尽管已参照具体实施例描述了本发明，但那些本领域技术人员应该明白：在不背离本发明的真实精神和范围的情况下，可进行各种各样的改动并可替代等效方案。另外，可进行许多修改以使具体情况、原料、实物组成、过程、过程步骤适于本发明的目的、精神或范围。但所有这些修改旨在处于本发明权利要求的范围之内。
为了找到最好的材料和条件以进行对包含细胞的样本(比如含有红细胞的全血样本)中的分析物作出测定或定量的侧向流测定，包括确定用来过滤样本中细胞或液体(例如血浆)的元件和元件的组合，使用在美国专利NO.6,136,610和美国专利No.6,528,323中描述的和并如在本文中做了改进的仪器(“ReLIA”)和检测盒进行以下实验。
实施例1：在没有凝集剂的情况下元件的过滤性能
如图2所示的测试条采用不同元件作为样本过滤器。所有测试的过滤元件都从美国Ahlstrom Filtration公司购买并包括：111级纤维素吸收剂，#141级和#142级玻璃纤维，1660、1661、1662和1663级Cytosep。如图1所示，含全血的样本被加到窗口1。血浆在硝基纤维素层析条上的流动速度可被观察记录。结果如表2所列。
表2：没有人红细胞抗体的滤血元件
Figure S05832908X20070403D000521
实施例2：用抗-红细胞抗体预处理后的元件的滤血能力
将1克TWEEN20加到9ml的去离子水中，将溶液混匀，在室温下存储大概一周，可配制成10％的TWEEN20溶液。
在1.35升的去离子水里加入9.0825克的三(羟甲基)氨基甲烷(Trizma Base)(最终浓度为6.055克/升)，1.7625ml的HCL(最终浓度为1.7625毫升/升)以及1.8克的乙二胺四乙酸二钠(EDTA.Na2)(最终浓度为1.2克/升)，可配制成兔抗人红细胞抗体溶液。缓慢地搅拌混合物大约一个小时直到所有加入的化学试剂都完全溶解。配制好的溶液放在室温下储存4个小时，或者在4℃下过夜。向溶液里添加盐酸将溶液pH值调节到pH8.5±0.1。在溶液里加兔抗人红细胞抗体(anti-hRBC)直到最终浓度为大约0.25毫克/毫升。将0.3毫升的10％浓度的TWEEN20加入到anti-hRBC直到最终浓度为0.002％。将最终配制好的溶液在4℃存放24小时。用anti-hRBC处理每种可能用作样本过滤器的不同元件，并以图2所示的配置来测试它们过滤加到窗口1的新鲜的人全血样本的能力。结果记录在表3A和表3B中。
表3A：经抗人红细胞抗体预处理后的滤血元件
Figure S05832908X20070403D000531
Figure S05832908X20070403D000541
表3B
Figure S05832908X20070403D000542
实验结果显示：不同的元件在结合诸如抗-hRBC抗体的凝集剂一起使用时，可用来过滤红细胞，并且50μl的样本量足以检测。
实施例3：使用全血和使用血浆之间的对比
准备如实施例2的测试条，并将全血或血浆样本加入窗口1的样本过滤器，且比较结果，如表4所示。
表4 全血和血浆的测试结果的比较
Figure S05832908X20070403D000551
实验结果显示：无论是全血还是血浆样本都可使用本发明的测试条，两者都可得到基本上一致的定量结果。
实施例4：不同的元件作为样本过滤器用于在窗口2加样的比较
在这个实施例中，构建了如图2所示的测试条，但是用从以下元件中选择的一种或两种样本过滤器替换了图2的缓冲液垫：美国Ahlstrom Filtration公司的1661级Cytosep(“1661”)、1660级Cytosep(“1660”)、#142级玻璃纤维(“142”)、#141级玻璃纤维(“141”)、或者111级纤维素(“111”)。这些样本过滤器都已经测试过它们过滤红细胞的能力。同样还使用了Millpore公司生产的偶联物垫以及硝基纤维素元件，如图2所示。向窗口2加入一定量的血液样本。表5上示出的结果显示：Cytosep1661、#141级玻璃纤维、#142级玻璃纤维都能过滤样本，以允许血浆渗透到硝基纤维素元件上，同时发现#141级玻璃纤维、#142级玻璃纤维所需的过滤时间最短。
表5 不同元件单独用作样本过滤器的比较
 
元件型号 加样量(微升) 血浆滤出时间(秒)         红细胞泄漏时间(秒)   血浆迁移速率(毫米/分钟)  30分后残留在过滤器上的红细胞    
1661 200 240 290 1.8 有
1660 200 - - -
141 200 90 280 16.8 有
142 200 98 395 16.1
111 200 - - - 有
注：“-”是指没有血浆滤出和迁移到硝基纤维素元件。
表6双层过滤样本的不同元件的比较
 
元件型号 加样量(微升) 血浆滤出时间(秒)         红细胞泄漏时间(秒)   血浆迁移速率(毫米/分钟) 
142+142 200 457 582 5.87
141+141 200 135 1015 1.95
141+142 200 113 238 2.93
142+141 200 640 686 2.26
141+1661 200 111 236 5.74
142+1660 200 247 409 3.41
142+1661 200 112 253 2.83
141+1660 200 440 582 5.71
表6中示出的结果显示：所测试的所有的元件组合都允许血浆以不同的速度从组合的样本过滤器里滤出。
实施例5：在窗口2加样时#141级和#142级玻璃纤维作为样本过滤器的测试
在这个示例中，构建了如图2所示的测试条，不同之处在于图2中示出的缓冲液垫被样本过滤器所替代，用于加样。本实验中所使用的样本过滤器是单层玻璃纤维元件，使用之前用0.5毫克/毫升的兔抗人红细胞抗体(中国安康生物生产，简称anti-hRBC)或者鼠抗人红细胞抗体预处理(由星号*标志)的#141级或者#142级元件。而且，偶联物垫(CP)和玻璃纤维元件一起测试。CP预先用0.5毫克/毫升的兔抗人红细胞抗体(“anti-hRBC”)、或鼠抗人红细胞抗体预处理，或不作预处理。硝基纤维素元件(“NC”)如前所述地使用。向窗口2加特定量的全血样本(200微升)。实验结果如表7所示。
实验结果显示：所测试的所有元件，不管是单独的CP垫(偶联物垫，下同)还是#141或者#142与CP垫的组合，无论是否用人抗红细胞预处理过或没有预处理过，都能允许血浆滤出到NC元件(硝基纤维素，下同)上。血浆渗透到NC的时间过程，对于#141*+CP垫*的组合为大约124秒，对于#142*+CP垫*的组合为大约126秒，对于#141*+CP垫的组合为大约130秒，对于#142*+CP垫的组合为大约140秒。从单一的CP垫滤出的时间为大约138秒。最好的过滤/迁移结果为#142+CP垫的组合。
如果只有CP垫，则红细胞可相对比较快地从CP垫里泄漏，约需159秒，并且在实验开始30分钟之后可很明显地在NC元件上观察到。相反，在对#142*+CP垫组合的实验过程中，宏观上红细胞的泄漏不明显；在30分钟的时间点，在NC元件上宏观上红细胞的泄漏不明显。相比较而言，#141*+CP垫*的组合的效果略差，红细胞泄漏大约需要1350秒(22.5分钟)，并且在30分钟的时间点宏观上一些红细胞可在NC元件上明显观察到。
再作进一步的比较，#142*+CP垫的组合效果也较差，其中CP垫未用抗红细胞抗体作预处理。对于这种组合，在约1150秒(19.2分钟)红细胞开始从这些过滤器中滤出，实验开始之后的30分钟点可在NC元件上看到一些红细胞。对于#141元件*+CP垫的组合，在680秒(11.3分钟)上可观察到有红细胞漏出，并且可在NC元件上看到一些红细胞。在这个实验中，血浆在所测试的所有元件上的流动速度都大于16毫米/分钟。
表7：元件的组合在过滤红细胞中的比较
 
元件型号 加样量(微升) 血浆滤出时间(秒)         红细胞漏出时间(秒)           血浆迁移速率(毫米/分钟)  30分钟后NC上显示红细胞
142*+CP 200 140 1150 >16 一些
142*+CP* 200 126 - >16 没有
141*+CP 200 130 680 >16 一些
141*+CP* 200 124 1350 >16 少量
只有CP 200 138 159 >16 完全滤出
注：“*”表示用0.5毫克/毫升的兔抗人红细胞抗体(鼠抗人红细胞抗体)预处理。
“-”表示加血样后30分钟内无红细胞泄漏到测试窗口
实施例1-5的实验结果表明：当把样本加到窗口2时，单层元件的孔径不能够预测该元件是否适合作为分析物的样本过滤器。在所测试的元件中，纤维素111的孔径最小为1微米(见表1)，并且能使红细胞不漏出(表5)。然而，如表5所示，血浆不能从元件中滤出。CytoSep1660元件和玻璃纤维元件#141的孔径均为3微米(见表1)，但是血浆从玻璃纤维元件#141中滤出、但却不能从CytoSep1660元件中滤出。区别在于，玻璃纤维元件是疏水性的，而CytoSep1660的疏水性则较弱而亲水性较强。
类似地，与上面的假设一致，即孔径并不是决定某种元件是否可作为过滤器的决定因素，玻璃纤维元件#141的孔径为3微米，小于玻璃纤维元件#142的孔径为6微米，然而血浆从较小孔径元件#141中滤出的速度更快，即为90秒，而相比之下对于较大孔径元件#142则为98秒(表5)。红细胞从#141元件滤出得比#142元件快，即280秒对395秒。血浆的迁移速度对#141元件(16.8毫米/分)而言比#142(16.1毫米/分)元件快。
使用两个不含抗红血细胞抗体的样本过滤器而不是一个，可减缓血浆在玻璃纤维元件中的迁移速度，从约16毫米/分(表5)降低到约1.95毫米/分到约5.87毫米/分的范围(表6)。红细胞仍然可从这些双层过滤器中滤出(表6)。对于#141+#141的组合，红细胞需要1015秒(16.9分钟)滤出到NC元件上；血浆需要135秒(2.3分钟)滤出(表6)。对于#142+#141的组合，当#142元件在#141元件之上的时候，红细胞滤出需要686秒(11.4分钟)，但是血浆滤出则需要更长的时间，为640秒(10.7分钟)(表6)。对于#141+#142元件的组合，当#141元件在#142元件之上的时候，血浆更快地滤出，只需要113秒(1.9分钟)，红细胞滤出的速度也快得多，为238秒(约4分钟)(表6)。
当抗人红细胞抗-hRBC抗体与任一种所测试的样本过滤器元件(表3A和3B)一起使用时，所有所测试的元件都表现出良好的过滤红细胞的能力，因为在30分种内没有明显的红细胞泄漏。在NC元件上的背景噪声也低。血浆的迁移速度低于16毫米/分。对于CytoSep1663元件，血浆过滤不明显。这样就有可能采用用抗红细抗体胞预处理过的#142玻璃纤维元件去定量分析含有HIV抗体的血液(表3A和3B)。表3B也示出：50微升的样本大小足以从测定中获得定量结果。
#141*+CP垫的组合(表7)，其中#141元件用抗红细胞抗体进行了预处理，在滤出红细胞方面表现比单独使用没有预处理过的#141元件好(表5)。类似地，#142*+CP垫的组合在滤出红细胞方面表现比单独使用没有预处理过的#142元件好。当与抗-RBC处理过的CP一起使用时，抗RBC处理过的#141和#142表现更好。在这个实验里，#142*+CP垫的组合在滤出红细胞和血浆方面是最有效的。
实施例6：血液样本中存在抗凝剂时测试血浆和红细胞过滤的效率
在本实验里玻璃纤维元件#142用做样本过滤器。如前所述，用0.25毫克/毫升的兔抗人红细胞抗体对#142元件进行预处理。然后再用抗凝剂(1.5毫克/毫升的乙二胺四乙酸二钠、3.5毫克/毫升的柠檬酸三钠、或者0.1毫克/毫升的肝素钠)进行预处理该元件，或者不进行预处理也可以。血液样本在加样到样本过滤器前也同样用抗凝剂(1.5毫克/毫升的乙二胺四乙酸二钠、3.5毫克/毫升的柠檬酸三钠、或者0.1毫克/毫升的肝素钠)做预处理或者不进行预处理。血液样本如上所述地加到窗口2的样本过滤器上。实验结果如表8和表9所示。
表8 #142上没有抗凝剂时过滤血浆的效率
Figure S05832908X20070403D000591
表9 #142上有抗凝剂的过滤血浆的效率
Figure S05832908X20070403D000592
Figure S05832908X20070403D000601
实验结果显示：在双向流测定中，是在血液样本中还是在样本过滤器中填加抗凝剂并不影响血浆过滤效率。
实施例7定量测定中红细胞容积的影响
以下实验是为了确定红细胞容积对侧向停止流动测定是否有影响而进行的。乙肝表面抗原呈阳性、所测血细胞比容为44％的全血样本被分装为每管1毫升。把这些分装管的红细胞容积都看成是100％。同一个血液样本进行15分钟的800xg的旋压，通过取出或加入血浆后血细胞比容增加或减少40％。用0.5毫克/毫升的鼠抗人红细胞抗体对玻璃纤维元件#142进行预处理，并将其用做乙肝表面抗原检测盒的窗口2上的样本过滤器。向窗口2中的样本过滤器加样以进行侧向流测定。该侧向流测定如上所述地进行。在该配置中，测试条中样本过滤器的下面设置有一液体收集器，如图3所示，其中该液体收集器由一层类似偶联物垫的玻璃纤维元件组成，但是却没有偶联物垫的用胶态金标记的抗原或抗体。试验结果如表10所示。
表10 红细胞容积在HBsAg定量测定中的影响
Figure S05832908X20070403D000602
某一特定血浆容积的乙肝表面抗原浓度在4次独立测定中确定，并取其平均值以产生均值1。将所测试的不同血浆容积的每一个中乙肝表面抗原的平均浓度再取平均值，得到均值2。所观察到的变化系数(CV)值小于5％，表明不同红细胞容积对测定结果几乎没有影响。
类似地，来自促甲状腺激素(TSH)异常病人的全血样本，经放射性免疫测试时促甲状腺激素的浓度为28μlU/ml，测得血细胞比容为44％，将该全血样本分装成每管1毫升。视这个红细胞容积为100％。同一个血液样本进行15分钟800xg的旋压，通过取出或加入血浆后来红细胞容积增加或减少40％。用0.5毫克/毫升的鼠抗人红细胞抗体对玻璃纤维元件#142进行预处理，并将其用作促甲状腺激素盒中窗口1和窗口2上的样本过滤器。按照表11所指定的量，首先向窗口1加样，然后向窗口2加样。在这个例子里，每个样本用同批盒平行检测4次，并且如图3所示，在每条测试条的样品过滤器的下方设置有液体收集器，此液体收集器由一层类似偶联物垫的玻璃纤维元件组成，但是却没有偶联物垫的用胶态金标记的抗原或抗体。
表11 红细胞容积在促甲状腺定量测定中的影响
Figure S05832908X20070403D000621
Figure S05832908X20070403D000631
某一特定血浆容积的促甲状腺浓度在5次独立测定中确定，并取其平均值为均值1。将所测试的不同血浆容积的每一个的促甲状腺平均浓度再取平均值，得到均值2。所观察到的变化系数(CV)值小于8％，表明不同红细胞容积上对TSH测试结果几乎没有不同。
实施例8红细胞容积在定量测定中的影响
以下试验是为了验证红细胞的存在是否会影响双向侧向流测定中的定性检测的准确度而进行的。HIV阳性的全血样本分装成每管1毫升，样本的血细胞比容为45.3％。将该红细胞容积视为100％。同一个血液样本进行15分钟800xg的旋压，通过取出或加入血浆后红细胞容积增加或减少40％。用0.25毫克/毫升的兔抗人红细胞抗体对玻璃纤维元件#142进行预处理，将其用作HIV盒中窗口1上的样本过滤器。试验结果记录在表12中。
表12 红细胞容积对HIV测定的影响
Figure S05832908X20070403D000632
Figure S05832908X20070403D000641
对高浓度对照带、低浓度对照带和测试条报告的结果是反射密度(DR)。结果显示：红细胞的存在对信噪比没有明显影响(S指信号，CO指截止值)。在非定量测定，即定性测定中，信噪比>1意味着阳性，因为截止值(CO)是由大量阴性样本的平均值决定的。截留值代表了当在双向流测定中全血样本加到窗口1上用抗-hRBC预处理的#142元件时，HIV测试中的背景。测试条被测试为RI(相对强度或测试条Dr对HC或LC Dr的比值)，从而避免了同一批次产品的盒间的差。这提供了更好的重复性，这是因为测试条和高低对照带上的变化由RI来平衡。
实施例9：胶态金涂敷方法对测定精度的影响
为了确定将偶联物涂敷在偶联物垫上的不同涂敷方法的效果，下面的实验用清洗涂敷过程或者Bio-Jet喷射涂敷方法使用用胶态金标记的人抗IgG、或者胶态金标记的乙型肝炎表面抗体涂敷的偶联物垫进行。将0.25毫克/毫升的兔抗人红细胞预处理过的玻璃纤维元件#142用作样本过滤器，用清洗或者Bio-Jet喷射法将金标记的人抗IgG或乙肝表面抗体涂敷在玻璃偶联物垫(Pall Specialty Materials)上。实验在HIV盒中用HIV阳性全血来进行，并在乙肝表面抗原盒中用HBsAg全血来进行。对乙肝表面抗原测定(如实施例7所述)在窗口2上的样本过滤器上添加血液样本，对于HIV测定(如实施例3所述)在窗口1的样本过滤器上添加血液样本，测定操作如上所述地进行，实验结果在表13和14中示出。
表13：HIV测试(用清洗(Rinse)或者Bio-Jet喷射涂敷的偶联物)
Figure S05832908X20070403D000651
表14：HBsAg测试(用清洗或者Bio-Jet喷射涂敷的偶联物)
 
Jet 高对照带DR 低对照带DR HbsAg DR RI＝HbsAgDR/高对照带DR  ng/ml 清洗 高对照带DR 低对照带DR   HbsAgDR RI＝HbsAgDR/高对照带DR  ng/ml
0.2153 0.1433 0.0153 0.0711 3.9 0.23 0.25 0.011 0.0478 2.6
2 0.1879 0.1163 0.0144 0.0766 4.3 2 0.31 0.33 0.019 0.0613 3.4
3 0.1759 0.1245 0.0167 0.0949 5.5 3 0.34 0.34 0.017 0.0500 2.5
4 0.1419 0.0845 0.0135 0.0951 5.5 4 0.26 0.29 0.013 0.0500 2.6
5 0.1985 0.1242 0.0176 0.0887 5.1 5 0.36 0.35 0.02 0.0556 3
6 0.202 0.1267 0.014 0.0693 3.8 6 0.35 0.34 0.017 0.0486 2.6
7 0.1898 0.1291 0.0152 0.0801 4.5 7 0.34 0.33 0.019 0.0559 3
8 0.1764 0.1456 0.0143 0.0811 4.6 8 0.43 0.36 0.021 0.0488 2.5
9 0.2306 0.1917 0.0206 0.0893 5.1 9 0.36 0.36 0.18 0.0500 2.6
10 0.192 0.1168 0.0139 0.0724 4 10 0.35 0.34 0.019 0.0543 2.9
11 0.1895 0.1219 0.017 0.0897 5.2 11 0.27 0.28 0.016 0.0593 3.1
12 0.2355 0.1692 0.021 0.0892 5.1 12 0.39 0.36 0.02 0.0513 2.7
 
13 0.2369 0.1589 0.0156 0.0659 3.6 13 0.38 0.35 0.019 0.0500 2.7
14 0.2041 0.1543 0.015 0.0735 4.1 14 0.32 0.29 0.013 0.0406 2.1
15 0.2294 0.1633 0.0175 0.0763 4.3 15 0.37 0.33 0.019 0.0514 2.7
16 0.1611 0.0947 0.0146 0.0906 5.2 16 0.32 0.28 0.014 0.0438 2.3
17 0.2204 0.1518 0.0218 0.0989 5.8 17 0.2 0.22 0.013 0.0650 3.6
18 0.1785 0.1272 0.0151 0.0846 4.8 18 0.33 0.27 0.017 0.0515 2.7
19 0.2607 0.1911 0.0231 0.0886 5.1 19 0.32 0.26 0.019 0.0594 3.1
20 0.1884 0.1161 0.0162 0.0860 4.9 20 0.28 0.3 0.015 0.0536 2.9
AV 0.2007 0.1376 0.0166 0.0831 4.72 AV 0.3255 0.3115 0.0170 0.0524 2.780
SD 0.0289 0.0285 0.0028 0.0095 0.63 SD 0.0556 0.0417 0.0029 0.0058 0.3548
CV 11.5％ 13.0％ CV 11.2％ 12.8％
Dr代表的是反射密度，它和光密度值(OD)的计算方法一样，不同的是DR指的是光反射密度。DR值是由ReLIA仪器生成的原始数据。对于清洗或者Bio-jet喷射涂敷的偶联物的有关ng/ml的CV值都一样，所以测试精度也一样。
实施例10：样本量对测定的影响。
为了确定样本量对本测定的精度的影响，进行了以下实验。在窗口1上用0.25毫克/毫升的兔抗人红细胞预处理过的玻璃纤维元件#142被用作样本过滤器。血细胞容积为45.3％的HIV阳性全血样本被添加到HIV盒中。血细胞比容为44％的乙肝表面抗原阳性全血样本被添加到HBsAg盒中。向窗口2上的样本过滤器添加变化的样本量。测定如前所述地进行。简而言之，通过向窗口1加样来进行对全血的HIV测定。窗口1中的样本过滤器由用0.25毫克/毫升的兔抗人红细胞预处理过的玻璃纤维元件#142组成。当样本在测试条上往下流并停止时，向窗口2加缓冲液。实验结果记录在表15中。
表15：变化血样量的HIV测试的比较
Figure S05832908X20070403D000661
Figure S05832908X20070403D000671
在该HIV检测实验中，样本量的范围为30微升-70微升。30微升的样本量没有产生任何可读实验结果。超过30微升的样本量则可产生可读实验结果。40微升的样本量，无论实验是持续20分钟还是30分钟，都可获得可读结果。无论样本量为多少，Nc元件上的背景都是干净的。因此，40微升的样本量足够进行测定，而且实验结果与50、60或者70微升的样本量的结果没有明显的不同。
表16 HBsAg检测中不同测定时间内变化样本量的比较
Figure S05832908X20070403D000672
来自乙肝表面抗原HbsAg检测的结果显示：150微升的样本量产生了高的CV值。对于超过150微升的样本量，例如200微升、250微升、300微升，在20分钟的实验中CV值处于6％-9％的比较低的范围；在30分钟的实验中CV值为3％-9％；在40分钟的实验中CV值为4％到19％。对于250微升的样本量，无论实验时间是20、30、还是40分钟，CV值都低于处于4％到6％的比较低的范围。因此250微升的样本量足够进行实验，但是如果实验时间为20分钟或30分钟，则200微升、250微升、300微升的样本量的实验结果没有明显的差异。如果实验时间为40分钟而非20分钟或者30分钟，则200微升的实验CV值(19％)较高。
关于值的范围，本发明包含该范围上限和下限之间的每一中间值到下限单位的至少十分之一，除非上下文另外明确提示。而且，本发明包含任何其它规定的中间值以及包含范围上限和下限的两者之一或两者的范围，除非它们从规定的范围内被特别排除。
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语的意义是本发明所属领域技术人员通常理解的。本领域技术人员也将理解任何与本文中所描述相类似或等同的方法和材料也可用于实践或检测本发明。
本文所讨论的出版物或专利只是因为它们的公开先于本申请的提交日期而提供。此处决不能解释为承认本发明不会先于已有发明的出版物而授权。此外出版物提供的日期可能与实际出版日期不同，该实际出版日期可能需要单独确认。
所有引用的出版物通过引用全部结合于此，包含所有已公开专利、专利申请、文献参考以及已结合在那些公布文献中的那些出版物。然而，任何通过引用结合于此的出版物指即将公布的信息，申请人不承认本发明提交日期之后公布的信息是现有技术。
如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式包含复数形式。例如术语“一个”、“一种”和“这种”包含复数范围，除非上下文另外明确提示。因此，除非另外提示，“一样本过滤器”包含一个或多个样本过滤器。可任选地，缓冲液垫可置于任何样本过滤器或样本过滤器集合上。这应用于以下描述的所有实施例。
以上提到的一般形式的若干可选方案，例如吸收垫的放置、使用或者不使用样本过滤器或者其对样本垫的代替、使用或者不使用凝集剂、用亲水性元件取代疏水性元件、在偶联物垫或者测试条本身上涂敷可检测试剂、或者省略在测试条上涂敷可检测试剂、使用或略去缓冲液垫，或者偶联物垫的放置，都可以应用到特定形式中，如图2、3、3A、3B、4、4A、4B、8、9、10、11、12或13所示，只要这些可选方案的变化与这些特定形式的配置保持一致即可。另外，在一系列元件前的术语“至少”应被理解为涉及该系列的所有元件。本领域技术人员仅使用常规实验，就能认识到，或能确定所述发明的具体实施方式的许多等价方式。这些等价方式应包含在权利要求的范围内。
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Claims (40)

1.一种用于进行侧向流测定的测试条，所述侧向流测定用于检测样本中的至少一种分析物，所述测试条包含：
(a)具有第一端和第二端的层析条；
(b)至少一个捕获带，其中一条捕获带是第一捕获带，位于层析条上，其中第一捕获带包括用于捕获样本中第一种分析物的第一固定捕获试剂；
(c)可任选的，位于层析条上的第二捕获带，其中第二捕获带包括用于捕获样本中第二种分析物的第二固定捕获试剂；
(d)至少一种含有固定对照试剂的对照带；
(e)至少一个样本过滤器，其中一个样本过滤器是第一样本过滤器，其中该第一样本过滤器与层析条毛细作用接触，和可任选的含有凝集剂；
(f)液体不可渗透的屏障，其中所述屏障与至少第一样本过滤器和层析条可操作性接触，并延迟液体从第一样本过滤器流到层析条；
(g)至少一种可移动的可检测试剂，其中一种可移动的可检测试剂是第一可移动的可检测试剂，能与第一分析物或第一捕获试剂、或与通过第一分析物与第一捕获试剂组合形成的复合物结合，其中该第一可移动的可检测试剂在层析条上，或可以释放到层析条上；
(h)可任选的，支撑测试条的衬垫；
(i)第一吸收垫，其中该第一吸收垫与层析条毛细作用接触；
(j)可任选的，第二吸收垫，与第一吸收垫毛细作用接触；
其中测试条能检测和定量，或仅检测含有全细胞的样本中的分析物。
2.如权利要求1所述的测试条，其特征在于，所述可移动的可检测试剂在偶联物垫中，所述偶联物垫与层析条毛细作用接触。
3.如权利要求2所述的测试条，其特征在于，所述偶联物垫保留可移动的可检测试剂，直到在所述偶联物垫上加上液体以释放所述可移动的可检测试剂。
4.如权利要求1所述的测试条，其特征在于，该测试条还包含偶联物垫，所述偶联物垫与层析条毛细作用接触；第二样本过滤器，其与层析条毛细作用接触，并可任选的包含凝集剂；和液体收集器，其中所述液体收集器与(a)第二样本过滤器和偶联物垫，或(b)第二样本过滤器和层析条毛细作用接触或直接物理接触。
5.如权利要求1所述的测试条，其特征在于，还包含缓冲液垫，其中所述缓冲液垫位于或靠近层析条第二端。
6.如权利要求1所述的测试条，其特征在于，还包含第二样本过滤器，所述第二样本过滤器位于或靠近层析条的第二端。
7.如权利要求1所述的测试条，其特征在于，所述第一吸收垫位于或靠近层析条的第一端。
8.如权利要求1所述的测试条，其特征在于，还包含位于层析条第二端或靠近第二端的偶联物垫。
9.如权利要求1所述的测试条，其特征在于，所述液体不可渗透的屏障包括胶带。
10.如权利要求1所述的测试条，其特征在于，所述液体不可渗透的屏障包括双面胶带。
11.如权利要求1所述的测试条，其特征在于，所述液体不可渗透的屏障是(a)完全位于第一样本过滤器下方，或(b)部分位于第一样本过滤器下方，向第一端方向延伸。
12.如权利要求1所述的测试条，其特征在于，所述液体不可渗透的屏障是约5mm宽，约5mm或约7.5mm或约10mm长，约0.025mm厚。
13.如权利要求1所述的测试条，其特征在于，所述液体不可渗透的屏障是聚酯制成的双面胶带，并在两面涂覆有粘合剂。
14.如权利要求12所述的测试条，其特征在于，所述粘合剂是惰性的非迁移性丙烯酸粘合剂。
15.如权利要求1所述的测试条，其特征在于，还包含偶联物垫和缓冲液垫，其中所述偶联物垫和缓冲液垫都位于或靠近第二端；第一样本过滤器和第一吸收垫位于或靠近第一端；第二吸收垫，如存在，位于或靠近第一端。
16.如权利要求1所述的测试条，其特征在于，还包含第二样本过滤器、液体收集器和偶联物垫，其中：
(a)所述第一和第二样本过滤器每一个都可任选的含有所述凝集剂，所述第一和第二样本过滤器每一个都与所述层析条毛细作用接触，所述第一样本过滤器位于所述层析条的第一端或靠近第一端，所述第二样本过滤器靠近层析条的第二端；
(b)所述液体收集器位于所述第二样本过滤器和所述层析条之间，并且与所述第二样本过滤器和所述层析条均毛细作用接触；
(c)所述偶联物垫位于或靠近层析条的第二端，与所述第二样本过滤器和所述液体收集器毛细作用接触；
(d)所述液体不可渗透的屏障与所述层析条的第一端直接物理接触，位于所述第一样本过滤器下方，从而通过迫使来自所述第一样本过滤器的液体在所述不可渗透屏障下流动到所述层析条第一端，以显著延迟所述液体从所述第一样本过滤器向所述层析条第一端流动；和
(e)位于或靠近所述层析条第一端的第一吸收垫，所述第一吸收垫与所述层析条直接物理接触，其中所述第一吸收垫比所述第一样本过滤器更靠近所述层析条的第一端；和
(f)第二吸收垫，如存在，与所述第一吸收垫或所述层析条毛细作用接触。
17.如权利要求1所述的测试条，其特征在于，还包含与层析条毛细作用接触的第二样本过滤器、液体收集器和偶联物垫，其中：
(a)所述液体收集器位于所述第二样本过滤器和所述层析条之间，与所述第二样本过滤器和所述层析条均直接物理接触；
(b)所述偶联物垫位于所述层析条的第二端，与所述第二样本过滤器直接物理接触，与所述液体收集器间接接触；
(c)所述液体不可渗透的屏障与所述层析条的第一端和所述第一样本过滤器直接物理接触，所述液体不可渗透的屏障位于或靠近所述层析条的第一端，其中通过迫使来自所述第一样本过滤器的液体在所述不可渗透屏障下流动到所述层析条第一端，显著延迟液体从所述第一样本过滤器向层析条第一端流动。
18.如权利要求1所述的测试条，其特征在于，用于进行侧向流测定的测试条，以检测样本中的至少一种分析物，该测试条包含：
(a)层析条，包括第一端和第二端，以及至少一个捕获带和至少一条对照带，所述捕获带包括用于捕获至少一种分析物的固定捕获试剂，而所述对照带包括固定对照试剂；
(b)偶联物垫，其中所述偶联物垫与层析条的第二端有毛细作用接触，并且其中所述偶联物垫包括可结合到至少一种分析物上，或者在捕获分析物之后结合到捕获试剂的可移动的可检测试剂；
(c)直接与层析条的第一端接触的液体不可渗透的屏障；
(d)样本过滤器，所述样本过滤器与层析条的第一端毛细作用接触，并与所述液体不可渗透的屏障直接接触，从而能显著延迟从样本过滤器流向层析条第一端的液流，其中样本过滤器可任选的含有凝集剂；
(e)可任选地，缓冲液垫，置于层析条的第二端，并与所述偶联物垫直接接触；
(f)第一吸收垫，置于层析条的第一端并与层析条直接接触；和
(g)可任选地，第二吸收垫，与第一吸收垫直接接触；
其中测试条允许对含全细胞的样本中的分析物进行定量或非定量的检测。
19.一种用于进行侧向流测定的测试条，以检测样本中的至少一种分析物，该测试条包括：
(a)层析条，包括第一端和第二端，以及至少一个捕获带和至少一条对照带，所述捕获带包括用于捕获至少一种分析物的固定捕获试剂，而所述对照带包括固定对照试剂；
(b)偶联物垫，其中所述偶联物垫与层析条的第二端有直接毛细作用接触，并且其中所述偶联物垫包括可结合到至少一种分析物上，或者在捕获分析物之后结合到捕获试剂的可移动的可检测试剂；
(c)第一和第二样本过滤器，其中所述第一和第二样本过滤器分别可任选的含有凝集剂，所述第一和第二样本过滤器各自与层析条毛细作用接触，所述第一样本过滤器位于或靠近层析条第一端，所述第二样本过滤器与层析条第二端相邻；
(d)位于所述第二样本过滤器和所述偶联物垫之间的液体收集器，从而使它与所述第二样本过滤器和所述偶联物垫直接接触；
(e)与层析条的第一端接触的液体不可渗透的屏障，所述屏障与所述第一样本过滤器直接接触，从而显著延迟从所述第一样本过滤器流向层析条第一端的液流；
(f)第一吸收垫，置于层析条的第一端并与层析条直接接触，第一吸收垫比第一样本过滤器离层析条的第一端更近；和
(g)可任选地，第二吸收垫，与第一吸收垫直接接触；
其中所述测试条允许对含全细胞的样本中的分析物进行定量或非定量的检测。
20.一种用于进行侧向流测定的测试条，以检测样本中的至少一种分析物，该测试条包括：
(a)层析条，包括第一端和第二端，以及至少一个捕获带和至少一条对照带，所述捕获带包括用于捕获至少一种分析物的固定捕获试剂，而所述对照带包括固定对照试剂；
(b)第一和第二样本过滤器，其中所述第一和第二样本过滤器分别可任选的含有凝集剂，所述第一和第二样本过滤器各自与层析条毛细作用接触，所述第一样本过滤器位于或靠近层析条第一端，所述第二样本过滤器与层析条第二端相邻；
(c)位于第二样本过滤器和层析条之间的液体收集器，从而使它与第二样本过滤器和层析条直接接触；
(d)位于层析条第二端的偶联物垫，与第二样本过滤器直接接触，与液体收集器间接接触，其中所述偶联物垫包括可结合到至少一种分析物上，或者在捕获分析物之后结合到捕获试剂的可移动的可检测试剂；
(e)与第一样本过滤器直接接触的液体不可渗透的屏障，所述屏障位于或靠近第一端，从而显著延迟从第一样本过滤器流向层析条第一端的液流；
(f)位于层析条第一端的第一吸收垫，所述第一吸收垫与层析条直接接触，所述第一吸收垫比所述第一样本过滤器离层析条第一端更近；和
(g)可任选地，与第一吸收垫直接接触的第二吸收垫；
其中测试条允许对含全细胞的样本中的分析物进行定量或非定量的检测。
21.如权利要求19所述的测试条，其特征在于，所述偶联物垫、第二样本过滤器和液体收集器可分别偏移，从而使所述偶联物垫与第二样本过滤器部分交迭，所述第二样本过滤器与所述液体收集器部分交迭，或所述偶联物垫可以与所述第二样本过滤器部分交迭，所述第二样本过滤器与所述液体收集器交迭。
22.如权利要求1、17、18或19所述的测试条，其特征在于，所述可移动的可检测试剂包含抗体、抗原或标记。
23.如权利要求21所述的测试条，其特征在于，所述标记包括着色物质、颗粒标记、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记、氧化还原标记、射频标记、酶标记、放射标记或其组合。
24.如权利要求22所述的测试条，其特征在于，所述颗粒标记包括胶态金颗粒、胶态硫颗粒、胶态硒颗粒、胶态硫化钡颗粒、胶态硫酸铁颗粒、胶态金属碘化物颗粒、胶态卤化银颗粒、胶态二氧化硅颗粒、或胶态金属氧化物颗粒。
25.如权利要求22所述的测试条，其特征在于，所述颗粒标记包括胶态金标记。
26.如权利要求21所述的测试条，其特征在于，所述可移动的可检测试剂与分析物非特异性试剂，可任选的，对照结合试剂偶联。
27.如权利要求1、17、18或19所述的测试条，其特征在于，所述层析条包括硝基纤维素元件。
28.如权利要求1、17、18或19所述的测试条，其特征在于，第一分析物或如存在时第二分析物是抗原、抗体、激素、药物、细胞蛋白、DNA、心脏标记物、肿瘤标记物、配体、受体或自身免疫疾病标记物。
29.如权利要求1、17、18或19所述的测试条，其特征在于，所述层析条含有至少两个对照带。
30.如权利要求1、17、18或19所述的测试条，其特征在于，包含衬垫，其中所述衬垫是液体不可渗透材料。
31.如权利要求1、17、18或19所述的测试条，其特征在于，所述层析元件包括大容量蛋白结合元件。
32.如权利要求1、17、18或19所述的测试条，其特征在于，
(a)所述样本含有两种分析物，层析条含有两个捕获带，各捕获带含有特异性捕获一种分析物但不对另一种分析物具有特异性的固定捕获试剂；或
(b)所述样本含有三种分析物，所述层析条含有三个捕获带，各捕获带含有特异性捕获一种分析物但不对另两种分析物具有特异性的固定捕获试剂。
33.含有权利要求1-31任一所述的测试条的盒。
34.如权利要求32所述的盒，其特征在于，该盒适合在装置中读数，可任选的，在测定反射的装置中读数。
35.如权利要求32所述的盒，其特征在于，所述盒含有窗口-1和窗口-2，用于加样本和/或缓冲液。
36.一种用于实施侧向流测定的方法，所述侧向流测定用于检测含液体样本中的分析物，所述方法包括以下步骤：
(a)将样本的第一等分试样施加至权利要求1-31任一所述的测试条的所述样本过滤器上；
(b)允许液体从样本迁移到所述第一捕获带上；
(c)允许第一可检测试剂迁移到所述第一捕获带上；
(d)允许第一可检测试剂、来自第一等份的液体的分析物和第一捕获带相互作用；和
(e)检测或测定第一捕获带上的第一可检测试剂。
37.如权利要求38所述的方法，其特征在于，可检测试剂的检测或测定与分析物的量相关。
38.如权利要求38所述的方法，其特征在于，用光学反射测量、荧光或化学反光检测或测定第一可检测试剂。
39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述样本含有血细胞。
40.如权利要求38所述的方法，其特征在于，还包括步骤：检测或测定第二或第三捕获带处的第二或第三可检测试剂。
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