CN101040188A

CN101040188A - 确定蛋白溶解性的方法

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Publication number: CN101040188A
Application number: CNA2005800353356A
Authority: CN
Inventors: 达瑞恩·詹姆斯·哈特
Original assignee: Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
Current assignee: Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
Priority date: 2004-09-03
Filing date: 2005-09-05
Publication date: 2007-09-19
Anticipated expiration: 2025-09-05
Also published as: AU2005279000B2; US7790420B2; WO2006024875A3; AU2005279000A1; US20080132425A1; GB0419628D0; JP2008511310A; US20070224618A1; EP1784648A2; CN101040188B; WO2006024875A2; EP2402760A1; CA2578546A1; US8754012B2

Abstract

本发明涉及在候选蛋白的表达文库中筛选可溶候选蛋白表达的方法。所述方法包括将文库中的每种候选蛋白融合到肽底物上，并且通过检测所述肽底物的酶促修饰而鉴定表达可溶候选蛋白的细胞。

Description

确定蛋白溶解性的方法

本文引用的所有出版物、专利和专利申请通过参考完全结合于此。

发明背景

最近几年来结构基因组已经引起了逐渐增加的兴趣。蛋白结构的阐明对于增加对蛋白功能的理解并且由此促进药物开发是重要的。

蛋白表达和纯化是这样的研究的主要步骤，并且通常受到产生正确折叠的重组蛋白的能力的限制。应用大肠杆菌(Escherichia coli(E.coli))表达系统进行结构和功能分析的蛋白制备通常受到形成不溶的细胞内蛋白聚集物(包涵体)、蛋白酶降解或缺少表达的干扰。

大肠杆菌是一种常见的表达宿主，当迫使其过量产生非自身的基因产物时，其常常形成错误折叠的蛋白。这严重地限制了蛋白在诸如通过结晶学和NMR进行结构分析的领域内的应用，并且限制了目前结构基因组工程的综合成功率。用于不溶表达蛋白难题的常规方法包括低温表达，应用具有不同强度的启动子、各种增强溶解度的融合标记(Kapust RB & WaughDS.‘Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective atpromoting the solubility of polypeptides to which it is fused’.Protein Sci.1999 Aug；8(8)：1668-74)，并且改进生长培养基(Makrides SC‘Strategies forachieving high-level expression of genes in Escherichia coli’.Microbiol Rev.1996 Sep；60(3)：512-38.综述)。

另一种克服这一难题的方法是通过从目的蛋白的氨基酸序列进行结构预测。将诸如同源性比对和二级结构预测的信息用于预测稳定的、可溶的结构域的位置。首先构建目标蛋白的剪截体或突变体，然后表达并且检测溶解性。尽管持续地进展，但是完全‘推理性地’设计具有理想的特性诸如稳定性或可溶性表达的蛋白，至少到目前为止通常是不可行的。即使存在大量的结构和机械论信息，也很难预测所需要的必要的序列剪截体。关于氨基酸序列怎样影响蛋白结构的每一方面，从其在异源宿主中表达的稳定性到其在非自身环境中折叠的能力，仍然只有很少的信息。实验已经证明，蛋白特性的变化由许多小调整的累积效应引起，许多这些小调整沿着蛋白分子内的显著距离分布或者扩散，并且目前生物信息程序不能准确地预测哪些剪截或突变将增加蛋白的可溶性。

在常规结构工程中，可以构建几十种克隆并且检测可溶蛋白的表达。在这样的工程中，可能的多样性远远没有得到充分地取样，并且通常找不到解决方案。另外，由于许多蛋白从基因组序列预测而来，没有已知的同源性，并且这限制了生物信息方法的作用。当标准方法不起作用时，可以证明高通量的筛选策略能有效地发现可溶的构建体。这些需要对大量的表达克隆进行准确的分析，以鉴定适宜的构建体用于结构确定。如果完整的蛋白不表达或结晶，下一步骤是产生剪截体或随机突变体并且重新检测。

尽管(i)现有的方法允许产生非常大的表达文库；和(ii)文库含有可溶蛋白的机会随着文库的大小而增加，但是，由现有的筛选表达文库的方法强加的应用局限限制了这一应用。希望表达可溶的或结晶形式的目的蛋白的实验者的最终目的是合成目的蛋白的所有可能的变体，并且筛选它们的可溶表达。表达可溶蛋白的克隆可以直接应用，或者可以用于接种下一轮的文库构建和筛选。这样的实验将产生大量的克隆，然后其必须进行可溶目的蛋白表达的筛选。

已经描述了一些具有鉴定目的候选蛋白的可溶变体(通过随机诱变或剪截而产生)目的的系统。在融合报道分子方法中，候选蛋白和具有易于检测特征或生物活性的报道蛋白作为遗传融合体进行表达。关于所述蛋白折叠状态的信息可以来源于所述融合报道结构域的筛选或选择活性。

融合报道分子方法通常包括C端伴侣“可溶性报道分子”(例如，绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)或β半乳糖酐酶)的融合。在GFP融合报道分子方法中，GFP的荧光产量提供关于其融合伴侣的折叠状态的信息。表达融合到很差折叠的不溶蛋白上的GFP的细胞发出的荧光不如表达融合到很好折叠的可溶蛋白上的GFP的那些细胞亮。GFP监测检测蛋白的折叠产量，其随后进行没有GFP标记的表达(Waldo GS‘Genetic screens and directed evolution for protein solubility’.Curr OpinChem Biol.2003 Feb；7(1)：33-8.综述)。

本发明人先前已经研发了一种融合报道分子系统，其基于生物素羧基载体蛋白(BCCP)作为蛋白-折叠标记的应用。在这一系统中，将来自大肠杆菌BCCP的生物素化结构域融合到检测蛋白上。这一结构域正确折叠的二级和三级结构由内源宿主细胞生物蛋白连接酶识别，其将所述结构域生物素化。对于生物素基团的存在，表达正确折叠的检测蛋白和BCCP结构域的宿主细胞将检测为阳性(WO03/064656‘Protein tag comprising abiotinylation domain and method for increasing solubility and determiningfolding state’)。

然而，存在与这些系统相关的问题，这限制了它们的适用性。

自动折叠报道分子蛋白的应用(例如，GFP，CAT，β-gal或BCCP结构域)，由于它们的巨大和可溶的性质，可以产生有疑问的假阳性率。由于所述报道分子可以耐受另外不溶的蛋白X片段或全长蛋白的融合，而其自身没有变得不溶，所以这可以产生大量的假阳性率。当标记可以位于适当的位置，例如，当通过标记固定蛋白或者在纯化的蛋白上进行生物化学分析时，这可以不是问题，但是，许多应用，例如，蛋白结晶学，需要通过蛋白酶分解或遗传删除而去除所述标记；通过处理一旦标记去除随后就将聚集或降解的克隆而失去了许多时间和花费，并且因此是不可用的。对于融合蛋白，也可以在体内表达过程中通过蛋白水解而降解，其留下产生假阳性结果的可溶荧光报道分子。对于融合蛋白，诸如那些含有麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、GFP、硫氧还蛋白的融合蛋白，这些作用是非常常见的，并且大概是一种普遍作用。因此，高度可溶的融合伴侣作为可溶性报道分子的存在强烈地扰乱了与之融合的蛋白的可溶性。

此外，先前公开的大多数融合蛋白是大蛋白。例如，GFP融合增加了蛋白的大小约37kDa。在大肠杆菌中表达大融合蛋白是有困难的，其具有约100kDa的应用限制。

当与实验和序列/结构数据库分析组合时，模拟研究可以帮助描述负责蛋白定型的主要进化因素。然而，这样的研究的潜力还没有得到充分地开发。

因此，在本领域中，存在这样的主要需求，即，研发一种在从克隆到结构确定的全过程中尽可能早的快速的、高通量的和可靠的筛选表达蛋白的方法，其允许选择可溶表达的蛋白。适宜的方法应该允许大量含有不同变体序列的分子的高通量筛选，选择步骤允许容易地鉴定具有提高的溶解度的分子。这样的方法对个体蛋白变体表达文库的高通量分析的服从性，特别当与突变或剪截方法策略组合应用以能够鉴定并且分离不溶蛋白的可溶变体时，将使得有问题的蛋白的高水平表达的最优化更能够获得并且更不费力。另外，所述方法应该寻求i)将任何融合伴侣的干扰作用(pertubatory effects)减到最小，并且ii)应该将结构分析所需要的下游步骤诸如移除融合的标记的步骤减到最少；蛋白通常与小肽一起结晶，但是很少作为二结构域融合体结晶。

发明概述

本发明包括可以选择不溶蛋白的可溶变体的机制。在这些机制中，可以操作、翻译和表达不溶蛋白的编码区，以确定特殊的操作是否产生可溶变体。因此，影响不溶蛋白的溶解的因素可以通过对其编码核酸分子测序而确定。因此，所述机制还给出影响溶解性的蛋白特征的重要理解。

按照本发明的一方面，提供了在多种变体候选蛋白中筛选可溶候选蛋白的方法，其中将每种候选蛋白融合到肽底物上，以致可溶的候选蛋白通过检测所述肽底物的酶促修饰而得到鉴定。

这种新颖的方法不依赖于展现出某种可检测活性的肽底物本身，诸如在GFP情形中的内在荧光，或者在氯霉素乙酰基转移酶情形中的酶促周转。将这样的肽用作溶解性报道分子的潜在原理是，只有可溶的分子是酶的有效底物。因此，只有当肽融合到可溶的候选蛋白上时，它才可以作为酶的直接底物，而不需要肽本身的折叠。然而，如果它被融合到不溶的蛋白上，那么它与肽-修饰的酶活性位点的相互作用由于空间和扩散原因而被严重地限制，并且将发生可以忽略的酶促修饰，这导致阴性的、未修饰的表型。另外，如果肽在大肠杆菌中独立地表达(如果融合到基因或基因片段的阅读框之外，这将发生)，它们通常是不稳定的、易蛋白水解的，并且因此从细胞中去除，这又导致默认的阴性表型。所述方法适用于表达文库的高通量分析，例如，当与蛋白剪截策略组合应用时。由于制备并且在单一步骤中检测大量的变体，这极大地增加了成功鉴定可溶并且理想地高度表达的候选蛋白的机会。

所述肽底物是小的并且惰性的，并且因此不能显著地改变它与之融合的候选蛋白的物理特征。在这种情形中，术语“不显著”，或者其变体，与物理特征的改变的关系意指在+/-50％之间或更少的物理特征的变化，例如，+/-45％或更少，+/-40％或更少，+/-35％或更少，+/-30％或更少，+/-25％或更少，+/-20％或更少，+/-15％或更少，+/-13％或更少，+/-10％或更少，或者更少。优选地，所述肽底物没有改变与之融合的候选蛋白的物理特征。这样的物理特征包括候选蛋白的溶解性、大小、电荷、折叠和组装机制。特别的优点是候选蛋白的溶解性既不被干扰也不被增强。这限制了假阳性结果的发生，假阳性结果是现有技术方法中常见的并且与耐受另外不溶的蛋白片段的融合的大的、折叠的、可溶报道分子的应用相关。

本发明的另一个优点是所述方法允许要制备的候选蛋白的产量和溶解性的定量分析以及定性分析。这允许使用者选择编码特别可溶的候选蛋白的克隆用于分析和/或操作和筛选的其它步骤。

当用于本文时，术语“候选蛋白”可以是任何蛋白或肽，合成的或天然存在的，包括蛋白片段、多肽、多聚体蛋白、重组蛋白、融合体和杂交蛋白、抗体等。

按照本发明，“肽底物”包括任何肽的短区域，其包括通过肽键和修饰的肽键彼此连接的氨基酸，即，肽等构物。这一术语是指5和20个氨基酸之间的短肽链，以及20和50个氨基酸之间的更长的肽链。这样的肽可以融合到候选蛋白上，并且必须能够作用为酶的底物，以致当可溶时，所述肽底物被酶促作用修饰。

优选地，所述肽底物相对于与之融合的候选蛋白是小的。例如，在大的候选蛋白的情形中，肽底物的大小应该逐渐变小就不是那么重要，并且可以耐受稍微更大的肽底物，其不会干扰候选蛋白结构干扰并且因此引起假阳性结果。相反，在小的候选蛋白的情形中，所述肽底物理想地应该尽可能小。优选地，所述肽底物的长度不超过候选蛋白长度的20％；更优选地，不超过候选蛋白长度的15％；甚至更优选地，不超过候选蛋白长度的10％；并且甚至更优选地，不超过候选蛋白长度的5％。

优选地，所述肽底物是短的，长度为50个氨基酸或更小，例如，45个或更少、40个或更少、35个或更少、30个或更少、25个或更少、20个或更少、15个或更少、13个或更少、10个或更少氨基酸、或更小。

优选地，所述肽底物是线性的，并且没有三级结构。这意味着，所述肽不能折叠成二级结构基序的有结构的、三维排列。

优选的肽底物包括作为生物素蛋白连接酶的底物的肽。这样的肽底物的一个实例是由Schatz(1993)和Beckett等.(1999)描述的15个氨基酸的肽[Schatz PJ(1993)Use of peptide libraries to map substrate specificity of apeptide-modifying enzyme：a 13 residue consensus peptide specifiesbiotinylation in Escherichia coli Biotechnology，11 138-1143；Becket等.(1999)A minimal peptide substrate in biotin holoenzyme synthetase-catalysedbiotinylation Protein Science 8 921-929]。这一肽的序列是GLNDIFEAQ KIEWHE，并且还存在一些相近的变体。当与可溶蛋白融合时，所述肽作为生物素蛋白连接酶的底物，所述生物素蛋白连接酶是一种将生物素-AMP的生物素分子转移到所述序列下划线标记的赖氨酸残基上的酶。当不融合，或者融合到不溶伴侣上时，它是效率很低的底物。用于生物素蛋白连接酶底物的肽底物的应用允许蛋白通过使用链霉抗生物素蛋白缀合物检测而筛选溶解性。例如，可以应用蛋白质印迹类型或点印迹，其中链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶缀合物可以用化学发光进行检测，或者直接使用荧光标记的链霉抗生物素和荧光成像仪器例如AmershamTyphoon进行检测。能够与生物素结合的其它化合物包括中性抗生物素蛋白(neutravidin)、抗生物素蛋白和单聚体抗生物素蛋白。

优选的肽底物还包括作用为共表达的激酶诸如例如酪蛋白激酶II(一种在真核细胞中普遍存在的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)的底物的肽。当与可溶蛋白融合时，肽(例如，RRRDDD SDDD)作用为所述激酶的底物，并且在特异性残基(S)被磷酸化。如先前所述，当不融合，或者融合到不溶的伴侣上时，肽的有效的磷酸化不会发生。使用特异性的抗磷酸抗体检测磷酸化的肽底物。抗磷酸抗体与磷酸肽的结合可以直接检测，例如，使用荧光标记的抗磷酸抗体缀合物。

正如有经验的读者应该理解的那样，存在许多方法，其中所述肽底物可以被融合到候选蛋白上。例如，所述肽底物可以通过非共价键融合到候选蛋白上。所述肽底物可以在翻译后融合到候选蛋白上，例如，通过内含肽生物学。优选地，所述肽底物可以通过共价键融合到候选蛋白上，例如，通过肽键，通过化学连接等。优选地，所述肽底物作为遗传融合体，与候选蛋白形成重组融合蛋白而表达。在这样的遗传融合体的情形中，所述肽底物与候选蛋白成分的附着可以优选地使用编码融合蛋白氨基酸序列的重组DNA构建体而获得，所述重组DNA构建体使得编码所述肽底物的DNA在编码候选蛋白的DNA的相同的阅读框内。

所述肽底物可以位于候选蛋白的氨基或羧基末端，或者可以在蛋白内部，例如，作为位于候选蛋白结构外的环。优选地，将所述肽底物融合到候选蛋白的氨基或羧基末端。

按照本发明，‘酶促修饰’包括肽底物的任何可被检测到的修饰，例如，通过与标记或标签结合，从肽上添加或者删除化学部分，化学状态的改变，诸如磷酸化、甲基化、乙酰化、遍在蛋白化、苏素化、豆蔻酰化或糖基化而实现。例如，由于肽底物的适当设计，由修饰酶赋予的变化可以激活抗生素抗性基因的表达，这允许用抗生素选择成功的候选子，或者激活表型标记基因的表达，诸如编码绿色荧光蛋白或β-半乳糖酐酶的基因，这允许一种物理富集方法，诸如FACS(fluorescent activated cell sorting，荧光活化的细胞分类)。优选地，所述肽底物通过酶促反应而被生物素化。其它适当类型的修饰对于有经验的读者是显而易见的。

在一个备选实施方案中，所述肽底物可以以某种方式影响底物修饰蛋白的活性，例如，通过作用为酶促反应的辅因子，以致底物修饰蛋白的活性作为候选蛋白的溶解性的结果而被特异性地升高或者降低。在这种方法中，如果表达的候选分子是可溶的，那么可以基于底物修饰蛋白的活性或无活性，例如，用携带减轻突变的作用的肽的蛋白来互补(complementation)无活性的突变酶，而将编码候选分子的具体的细胞分离出来。

在按照本发明应用的优选的肽的情形中，所述肽为生物素蛋白连接酶的底物，所述酶促修饰是肽的生物素化状态的改变。

为了发生酶促修饰，需要存在一种能够进行需要的修饰反应的酶。所述酶可以独立地添加到反应混合物中，或者它可以内在包含在反应系统中，例如，在其中进行筛选方法的宿主细胞中天然表达。例如，所述细胞可以组成型地表达具有作为修饰底物-修饰酶的底物活性的蛋白。在一个备选实施方案中，所述宿主细胞转化染色体外的元件，诸如质粒、附加体、人造染色体等，它们含有编码肽底物修饰酶的多聚核苷酸序列。

按照本发明，‘检测’是指允许已经进行肽底物酶促修饰鉴定的任何适宜的方法。一旦被酶改变，肽标记必须在某些方面不同，以允许其与未改变的肽底物的区分。在这种方式中，可溶的候选蛋白可以与不溶的候选蛋白区分开来。检测修饰的肽底物的适当方法对于本领域的技术人员是显而易见的，并且当然，取决于要应用的修饰酶的特性。检测可以是关于改变的肽底物或者未改变的肽底物。优选地，检测是改变的肽底物的阳性检测。例如，在本发明应用其生物素化状态被改变的肽底物的优选实施方案中，选择可以是关于生物素状态的改变，并且可以利用由抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白表现出的对于生物素的高结合亲和力，以允许基于这一结合对的高结合亲和力进行检测。备选地，质谱可以通过监测质量变化而提供一种检测标记修饰的方法。使用这种检测方法，不需要结合伴侣。

本发明候选蛋白的筛选可以在体外进行，例如，使用没有细胞的翻译系统，在其中候选蛋白被转录和翻译而不是在细胞中表达。在这种情形中，在基因型和表型之间必须存在某种联系，以致可溶的候选蛋白的选择允许编码核酸的伴随选择。这允许所述方法的重叠合法(deconvolution)，以致引起可溶蛋白产生的有利序列特征可以得到评估。本领域已知适当的方法。例如，最近在国际专利申请WO99/02671中发表的一种体外系统报道了用水-在-油乳状液制备的微胶囊的应用，以区分并且因此分离翻译系统的成分。

优选地，候选蛋白在宿主细胞中表达。正如有经验的读者应该理解的那样，候选蛋白在其中表达的任何宿主细胞系统都应该是适宜的，包括原核表达系统，诸如链球菌(streptococci)、葡萄球菌(staphylococci)、大肠杆菌、链霉菌(Streptomyces)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞，和真核系统，诸如酵母菌(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)和曲霉菌(Aspergillus)细胞)、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞培养物。大肠杆菌是按照本发明应用的一种优选的宿主细胞，部分是由于它表达内源性生物素蛋白连接酶，其这样允许在宿主细胞自身内进行与候选蛋白融合的肽底物的修饰。这一机制的一种优点是基因型和表型之间需要的联系维持在每个细胞内，并且因此所述方法允许对发现是可溶的候选蛋白的DNA序列进行分析。然而，通过在筛选之前将酶的编码序列引入所述细胞，还可以应用与这种具体的肽相容的不表达生物素蛋白连接酶的其它宿主细胞。

对于在宿主细胞中的表达，编码候选蛋白的核酸序列，任选地作为具有肽底物的融合蛋白，应该被克隆到一种或多种适当的载体上。宿主细胞可以用这样的载体转化、转染或转导，以影响要筛选的候选蛋白的表达。适当的表达方法对于本领域的技术人员是公知的，并且许多方法由Sambrook等(如前所述)和Fernandez与Hoeffler(1998，eds.″Geneexpression systems.Using nature for the art of expression″.Academic Press，San Diego，London，Boston，New York，Sydney，Tokyo，Toronto)详细地描述。一般地，将编码基因置于控制元件的控制下，诸如启动子、核糖体结合位点(用于细菌表达)和，任选地，操纵子，以致编码需要的多肽的DNA序列在转化的宿主细胞中转录成RNA。所述编码核酸分子可以包括编码控制序列的序列，诸如信号肽和前导序列，当需要时，例如，用于将翻译的多肽分泌到内质网腔内，分泌到壁膜间隙中或者分泌到胞外环境中。这些信号对于多肽可以是内源的，或者它们可以是异源信号。前导序列可以通过细菌宿主在翻译后加工中被去除。优选地，候选蛋白存在于同底物-修饰酶相同的细胞区室中。例如，生物素蛋白连接酶是一种细胞质蛋白，并且因此，潜在地用作这种酶的底物的候选蛋白应该保留在细胞质中。除了控制序列，可以必要地添加调控序列，其相对于宿主细胞的生长，允许调控多肽的表达。

所述候选蛋白可以从重组细胞回收和纯化以用于分析，例如，使用公知的方法，诸如硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取和层析。然而，为了保持表型和基因型之间的联系，必须应用某种方法来允许跟踪所回收的蛋白的来源。更简单的，可以将表达候选蛋白的宿主细胞裂解，并且分析所述肽底物的修饰。通过记录可溶的候选蛋白来源的克隆的历史(history)而保留基因型和表型之间的必要的联系。例如，在本发明筛选可溶的候选蛋白在宿主细胞中表达的实施方案中，所述宿主细胞可以简单地在硝化-纤维素膜上原位裂解，并且检测所述肽底物的修饰，例如，通过用抗体、链霉抗生物素蛋白或其它识别所修饰的肽底物的检测试剂进行印迹检测。

还可以使用专门的载体构建来促进蛋白纯化，当需要时，通过将编码本发明的多肽的序列与编码促进可溶蛋白纯化的多肽结构域的核苷酸序列连接而实现。这样的纯化-促进结构域的实例包括金属螯合肽，诸如允许在固定的金属上纯化的六组氨酸标记和组氨酸-色氨酸组件，允许在固定的免疫球蛋白上纯化的蛋白质A结构域，和用于FLAGS延伸/亲和力纯化系统(Immunex Corp.，Seattle，WA)的结构域。在纯化结构域和候选蛋白之间包含的可分解连接序列，诸如对于因子XA或肠激酶特异性的那些序列(Invitrogen，San Diego，CA)，可以用来促进纯化。由生物素蛋白连接酶产生的生物素化的蛋白也可以使用抗生物素蛋白-衍生的琼脂糖进行纯化。

所述载体还可以包括功能性选择标记。所述功能性选择标记可以是，例如，抗性基因，诸如卡那霉素、氨苄青霉素、杀稻瘟素、羧苄青霉素、四环素或氯霉素。所述载体还可以包括缺少关键元件的双功能选择标记，并且其中当用所述元件成功转化细胞时，所述关键元件由核酸元件提供。所述双功能选择标记可以是，例如，抗性基因或报道分子基因，诸如lacZ基因等。

当然，这些可能的排列可以混合，以致反应系统的一些成分从生物体的基因组表达，并且一些从染色体外的元件诸如表达载体表达。

为了提高成功选择可溶的候选蛋白的机会，所述反应系统应该在适于所述肽底物-修饰蛋白的活性的条件下温育。例如，在当将外源底物修饰蛋白添加到反应介质中的情形中，应该将这一介质放置于适于所添加蛋白的活性的条件下。在当底物-修饰蛋白在本筛选方法所用的宿主细胞中表达的情形中，宿主细胞应该在适于它们健康生长和适于所表达的蛋白的活性的条件下生长。在这样的情形中，应该在所述系统中存在适当的转录和翻译机制(machinery)，以允许底物修饰蛋白从其编码基因表达。在大多数情形中，这一机制应该来源于细胞自身。

所述方法允许筛选多种候选蛋白变体。实际上，所述方法的一个长处是它允许非常大量的不同变体平行地进行活性筛选。这意味着，如果需要，由于所述方法适于高通量的分析，所以，可能对于一种或多种具体的蛋白的全部或非常大量的可能变体进行穷尽的筛选。

制备文库的方法在本领域内是公知的。例如，剪截基因的文库可以通过核酸外切酶III消化进行构建(Ostermeir & Lutz，“The creation of ITCHYhybrid protein libraries”，在Methods in Molecular Biology第231卷第129-141页)。

例如，为了鉴定已经证明很难溶解的蛋白的具体的可溶变体，可以制备剪截体的文库。这样的文库可以含有，例如，在所述蛋白N端和C端任一端或者两端的渐进的单个或多个氨基酸剪截。

在一个优选的实施方案中，制备并且检测了蛋白的所有可能的剪截。为了合理地确定已经进行了穷尽筛选，有必要将每种剪截体过量采样至少3倍，优选地至少5倍，更优选地至少10倍。

剪截体文库可以是增加的剪截体文库，其中候选蛋白的一端固定，并且另一端可变。例如，可以将C端固定，并且N端可变，或者将N端固定，并且C端可变。作为这样的策略的一个实例，对于一种770个氨基酸的蛋白，存在670种剪截体，其产生长度大于100个氨基酸的蛋白(对于在大肠杆菌中表达和筛选的蛋白的近似实践更低的大小限制)。在DNA水平上，这对应2010个核苷酸。10倍的过量取样将需要构建并且筛选20,100个克隆。这些克隆的三分之一将在阅读框内，而三分之二将含有移码，并且因此不表达有用的肽-标记的蛋白。

剪截体文库可以是内部片段文库，其中所述候选多肽已经在两端被剪截。这避免了这种情形，即，其中具体固定的末端引起一些出乎意料的和不可预知的问题，例如，表达问题，其因而导致有偏倚的或无用的结果，例如，易于细胞蛋白水解或与细胞毒性相互作用。对于“N”个残基的一种具体的蛋白，存在大约N²/2个片段。为了确保蛋白编码序列在两端处于正确的方向并且在阅读框内，需要18倍的过量取样。以编码500个氨基酸的蛋白的基因为例，这产生两百万个可能的连接产物；因此，10倍的过量取样意指必须取样200,000,000个克隆的文库。

剪截的方法是本领域的技术人员已知的。影响这种类型剪截的最简单的方法是使用各种遗传工程的公知技术，以在任一端或两端选择性地删除编码核酸序列，并且然后将所需要的编码序列插入到选择的载体中。优选地，使用3’和/或5’核酸外切酶策略分别选择性地去除编码核酸的3’和/或5’端，而产生候选蛋白的剪截体。用于产生剪截体文库的一种优选技术是使用核酸的可控的或随机的核酸外切酶III消化，优选地与限制性内切酶消化的应用组合。例如，某些限制性酶在产生3’突出端的位点切割(例如，NsiI)。其它的在产生5’突出端的位点切割(例如，Not1)。通过在这些位点的其余的一个位点切割，并且使用3’和/或5’核酸外切酶，并且将反应温育可控的时间阶段，可以获得消化的选择程度和方向。适于应用本发明的方法的适宜载体构建的实例在本文包含的实施例中描述。备选地，使用随机引物对目标基因进行PCR扩增可以用来产生在两端剪截的基因片段(Kawasaki等，Random PCR-based screening for soluble proteinsusing green fluorescent protein，Biochem.& Biophys.Res.Comm.2001第280卷第842-844页)。其它等价方法包括DNAseI消化、超声和点沉式片段化(point sink fragmentation)。

可以制备其中已经制备了突变变的变体文库。诱变可以是随机的诱变，或者可以是合理的、定点诱变。适宜的操作方法应该时本领域的技术人员已知的，并且包括点诱变(错误倾向的PCR、化学诱变、特异性突变宿主株系的应用)、循环全体诱变(recursive ensemble mutagenesis)(Delagrave和Youvan(1993)Bio-Technology，11：1548-1552)、组合盒式诱变(Black等.，1996)、DNA改组(Stemmer等.，1994)或者通过密码子置换诱变而实现。对于最近在体外重组方法中的改善的综述，参见Giver和Arnold，1998(Current Opinion in Chemical Biology，2(3)：335-338)。例如，一种或多种具体的氨基酸可以选择性地从野生型序列突变到另一种氨基酸。这样的突变体可以包括变体候选蛋白，其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守的氨基酸残基取代(优选地保守氨基酸残基)。例如，高构象挠性的残基诸如Arg或Lys可以与低熵的那些残基诸如Ala交换，目的是提高结晶的均一性，以便获得更好质量的蛋白晶体用于X-射线分析。这样取代的氨基酸残基可以或者可以不是由遗传密码编码的氨基酸。典型的这样的取代在Ala、Val、Leu和Ile之间；在Ser和Thr之间；在酸性残基Asp和Glu之间；在Asn和Gln之间；在碱性残基Lys和Arg之间；或者在芳香残基Phe和Tyr之间。特别优选的是这样的变体，其中一些，即，在5和10之间，1和5之间，1和3之间，1和2之间或者只有1个氨基酸被取代、删除或以任何组合添加。特别优选的是不改变蛋白的功能性特性或活性的取代、添加和删除。在这一点上还特别优选的是保守的取代。这样的突变体还包括其中一个或多个氨基酸残基包括取代基团的多肽。

可以制备变体文库，其中插入片段已经被加入到序列中，例如，一个或多个氨基酸的序列，或者一段氨基酸序列以便，例如，在所述候选蛋白中形成或者删除环。特别地，如果包含亲水氨基酸，那么可以导致候选蛋白的溶解性的增加。

然后筛选这些候选蛋白文库的表现出最大程度溶解性的具体的变体。

按照本发明的这一方面，候选蛋白的文库可以含有多于10³个不同的克隆，，多于10⁵个不同的克隆，多于10⁶个不同的克隆，多于10⁷个不同的克隆，多于10⁸个不同的克隆或者甚至更多。优选地，所述文库含有表达候选蛋白的每一种可能的剪截体和变体的克隆。由于所有可能的剪截体的产生和检测极大地增加了成功的机会，并且允许分析大量的数据，所述数据可以将溶解性变化与蛋白序列特征联系起来，所以这是有利的。此外，所有位置的全面筛选允许一种确定要放弃的实验应该只获得阴性结果。

克隆的文库可以包括多种转化的细胞，其每个细胞表达不同的候选蛋白。这样的文库可以通过用适当载体的文库转化细胞制备物而产生。在适当的条件下，用这样的载体的转化可以这样进行，以确保基本上在文库的每个细胞中只有一种类型的候选蛋白表达。这将从所述核酸表达的蛋白限制在相同的细胞内，并且促进编码目的分子的核酸的选择；如果每个细胞包括多个核酸分子，那么当分离所述细胞时，将不会清楚是哪一种核酸分子编码了引起所需作用的蛋白。

形成本发明的部分的改进的选择技术允许简单应用反复分子进化循环，以致可以通过一系列的重复携带大容量的潜在的候选子。优选地，表达高度可溶候选蛋白的克隆应该从克隆的文库获得，无需任何其它操作。然而，为了最优化已经通过本发明方法鉴定为可溶的候选蛋白的溶解性，可以必要地或理想地进行反复的序列改变和筛选步骤。例如，初始文库筛选可以选择许多具有增加的溶解性的候选子，尽管这一文库将显著地受到表达不溶的或不稳定表达的蛋白的克隆的污染。然而，使将在第一轮筛选后选择的可溶的候选子用作下一代候选子的亲本，反复循环允许所述过程被重复；通过进行额外的序列改变和筛选步骤，可以将这些可溶的候选子进一步向可溶性进化。库的含量将愈加被更多的可溶(“更适合的”)候选子占据。在一系列的反复循环后，可以采用成功的候选子库并且操作以产生新的文库，用来在更严谨的选择标准下开始新的系列的反复循环。优选地，只进行操作和筛选步骤的一次反复，更优选地3次，更优选地4次或更多次。自动化操作的可能性可以允许应用更多的循环，如果需要，可能超过100、500或1000次。

为了将本发明的方法用到其在高通量筛选方法中的完全的潜力，必要地所述筛选可以在与文库大小相称的规模上起作用。为了充分利用这种类型的技术的潜力，克隆挑选器和阵列机器人的应用应该用来将平板化的转化转换成有秩序的文库，并且筛选这些的阳性克隆。理想地，每个克隆给予一个与在平板中具体的孔相对应的“地址”。条形码的应用可能使这容易。任选地，所述文库可以准确地安全地复制。优选地，使用与96腿(pin)挑选头等组合的视频技术，克隆的筛选和选择是自动化的。384孔平板可以通过允许更多的克隆进行筛选而促进这一过程。使用这一技术，每小时大约2500个克隆的挑选速度是很容易获得的。

在将本发明方法付诸应用的优选的方法中，将转化子文库作为接种子排列在覆盖LB琼脂的硝化纤维素膜上，形成集落点阵(colony array)(Buessow等，1998 Nucleic Acids Research第26卷，第5007-5008页)。诱导蛋白的表达，例如，通过将所述膜转移到含有IPTG和生物素的琼脂上，并且使细胞在适宜的温度生长3小时。然后将细胞在原位裂解。然后对于蛋白和/或DNA内容物，进行大规模的点印迹分析。以这种方式，每22×22cm的膜上，可以排列并且检测60,000个克隆。由于克隆本身作为表达容器，并且表达和检测这样多的克隆的管理(logistics)极大地被简化，所以，应用这样的检测形式在将克隆表达在微量滴定平板上具有优点。如果排列在容易去卷积的(deconvolutable)几何点阵中，表达水平和溶解度水平的定量通过应用点阵分析软件而更容易；克隆可以相对表达水平排列并且按先后次序排列。所述方法允许容易的、平行的处理大量的检测点并且简单的将检测点追溯回到物理的初始克隆。这样的处理优选地是受软件控制的。

在这种类型的方法中，通过将具有克隆的膜置于浸透氢氧化钠的衬垫上将细胞原位裂解后，将来自排列克隆的细胞蛋白保存在膜上。蛋白可以通过针对标记的抗体检测，所述抗体对翻译后修饰(例如，生物素化)不敏感，并且这允许对蛋白产量进行评估，尽管没有显示蛋白的溶解性状况。更重要地，可以使用对克隆的溶解性状况敏感的检测方法，例如，在指示溶解性的蛋白翻译后生物素化作用的情形中，链霉抗生物素蛋白结合提供了关于所述标记是否已被修饰的读出结果，而检测所述蛋白。另外，关于表达条件的有用信息可以通过比较抗体和链霉抗生物素蛋白信号，例如，在XY分散图表中，由此允许评估可溶的总蛋白的分数而获得。如果将链霉抗生物素蛋白缀合到过氧化物酶或碱性磷酸酶上，检测可以通过化学发光进行，或者缀合到荧光染料上，显现可以通过荧光成像进行。然后，可以将鉴定为生物素阳性的克隆从文库分离，并且在常规方法中检测，以验证可溶表达。可以将表现出生物素阳性表型的这样的克隆生长在液体培养基中，通过加入IPTG诱导蛋白表达，并且通过裂解证实溶解性状况，并且随后将裂解物分成不溶的和可溶的制备物，例如，通过离心或过滤。然后可以对蛋白进行分析和特征性描述，诸如通过SDS-PAGE和蛋白质印迹。

因此，用抗体和链霉抗生物素蛋白探针复制膜的比较允许具体的变体例如剪截体的溶解性状况的读出结果，表达或者没有表达，可溶的或者不溶的。在这种方式中，可以产生“表达图谱”，其允许测定单一氨基酸剪截体的溶解作用。当设计用于蛋白表达的构建体时，这是结构生物学家需要的信息类型，并且可以导致对影响蛋白表达的因子的更深的理解。

更详细地，克隆可以测序，以鉴定剪截体的确切身份，并且鉴定连接和复制。使用这些数据，可以将克隆按照从在可溶表达图谱(图6)中获得的信息的表达水平和大小进行先后顺序排列，其与针对编码基因序列中的剪截点的构建体的溶解性相关。如可从图6看出那样，在描述按照编码基因序列排列的各种克隆的溶解性程度中明显地存在一定程度的次序。相似的溶解度水平在具有连续剪截的构建体中是明显的(参见通过标记点所画的直线)，并且据信，这些与溶剂暴露接头中的连续残基区域相对应。相反，低溶解度的缺口在属于蛋白结构区域(参见图11中标记为“结合结构域”的区域)的剪截界线是明显的。在本文中假设，这种类型的分析允许对蛋白剪截变体的溶解性进行穷尽分析，以揭示关于蛋白结构诸如结构域边界的信息，和蛋白一级结构中的残基的溶剂暴露程度。因此，在另一方面，本发明提供用于获得关于蛋白结构信息的方法，所述方法包括进行按照上述本发明的任一实施方案筛选的方法，并且将关于每种构建体的溶解性的信息与蛋白序列的剪截点相联系。优选地，通过将构建体的溶解性针对编码基因序列中的剪截点作图，将从本发明的任一实施方案获得的数据用来产生可溶表达图谱。溶剂暴露接头区域被鉴定为具有显著可溶性的连续残基区域。在溶剂暴露接头区域之间的缺口被鉴定为蛋白序列中的结构区域。溶剂暴露残基和结构区域之间的拐点被鉴定为蛋白序列内的结构域边界。

在进行上述点阵形式的表达检测之前，应该通过分析基因片段大小的分布而测定所述基因剪截文库的质量。这样的特征性描述应该典型地包括使用侧连插入片段的引物进行的PCR筛选。这样得到关于插入片段大小的概念。然后，通过使用在其识别位点中包含ATG的限制性酶(例如，NdeI)消化PCR产物，而证实起始密码子。在点阵形式的表达检测并且从所述文库分离阳性子后，可以将克隆测序，以鉴定所述剪截体的确切身份。

当与上述方法联合时，应该优选地使用适当的对照，以确保考虑到假阳性和假阴性结果。例如，阳性对照应该使用一种已知在筛选所用的条件下是可溶的蛋白。阳性对照的一个实例可以是肽底物与之融合的麦芽糖-结合蛋白(MBP)。这种蛋白可溶地表达，并且因此经历通过底物修饰蛋白进行的肽底物修饰。在本发明应用融合到候选蛋白上的生物素化肽的实施方案中，因此，阳性对照克隆将是融合到生物素化肽上的MBP。阴性对照可以是，例如，在肽编码序列中含有移码的克隆，以致所述肽不被表达或者表达但不会融合到可溶蛋白上。一种备选的、并且任选地互补的阴性对照克隆可以编码一种符合所述肽的读框(in frame)的不溶蛋白。由于是不溶的，所述肽将不能作为底物修饰蛋白的有效底物。

本发明的其它方面涉及按照上述方法应用的试剂盒。例如，一种用于鉴定候选蛋白的可溶变体的适宜的试剂盒可以包括：

a)一种表达载体，用于在宿主细胞中表达变体候选蛋白；其中所述载体含有允许编码候选蛋白的目的基因插入的限制性位点，以致编码生物素化肽的序列遗传性地融合到所述目的基因上；

b)一种阳性对照载体，其表达遗传性融合到编码生物素化肽的核酸上的麦芽糖结合蛋白；

c)一种如同b)中的阴性对照载体，但是其包括在生物素化肽编码序列中的移码，因此麦芽糖结合蛋白没有被生物素化；和

d)另一种阴性对照载体，其表达符合生物素化肽的读框的不溶蛋白。

所述试剂盒还可以包含关于产生编码目的候选蛋白的基因的剪截体文库和克隆所述剪截体以致它们融合到编码肽底物的序列上的用法说明。

现在将通过实例的方式更详细地描述本发明的各个方面和实施方案。应该理解，在不背离本发明范围的条件下可以进行细节的改进。

附图简述

图1：质粒pHAR1111，其编码在3’末端符合读框地与编码生物素化肽的DNA融合的候选基因，并且所述基因5’末端的限制性位点设计成允许构成所述蛋白的N端剪截体系列。

图2：质粒pHAR1112，其编码在3’末端符合读框地与编码生物素化肽的DNA融合的人NF-κB基因，并且所述基因5’末端的限制性位点设计成允许构成所述蛋白的N端剪截体系列。

图3：质粒pMAS106，其编码在5’末端与相邻物符合读框，但是在3’末端不与在编码生物素化肽的DNA符合读框的人NF-κB基因，并且所述基因3’末端的限制性位点设计成允许构成所述蛋白的C端剪截体系列。

图4：表达分析。照片1a显示在立即裂解后使用针对肽标记的抗体探针的全部点阵。全表达(非溶解溶表达)是明显的。

图5：显示指示可溶性的生物素化蛋白的鉴定的表达分析。在图5a和5b中显示6个中的1个视野，并且包括5×5点阵(每个视野24个平板)。通过链霉抗生物素蛋白-辣根缀合物结合而鉴定蛋白。结果从在细胞裂解前没有诱导的(图5a)和用IPTG诱导的(图5b)复制点阵获得。可以从第二张膜上看出IPTG-诱导蛋白表达的证据。使用成像分析软件(VisualGrid；GPC Biotech)，定量地分析幻灯片(5c)。

图6：通过PCR，剪截的NF-κB剪截插入片段的大小显示出随机大小分布。

图7：使用侧连寡核苷酸引物，通过PCR衡量表达质粒的DNA片段大小。表达可溶的剪截NFκB蛋白的克隆可以组成2群，指示两个结构域构建体的一种(大约25kDa和40kDa的预测大小)。

图8：NF-κB蛋白的结构，显示当从C端剪截时，两个结构域蛋白片段之一的大小。

图9：通过蛋白质印迹进行的48种最好的表达NF-κB的克隆的蛋白表达筛选。对于每一克隆，在总(T)和可溶(S)级分之间没有显著的差异，这表明通过所述筛选鉴定的克隆是可溶的。由于它是细胞中唯一另一种生物素化的蛋白，大肠杆菌内源BCCP蛋白的微弱表达也是可见的。

图10：通过将在剪截的3’末端DNA测序数据的最后18个碱基对与全长基因序列相比对，确定准确的剪截末端。

图11：编码先前不表达的蛋白的基因的可溶表达图谱，其使得溶解性与遗传剪截点相关。在构建N端剪截体文库的过程中产生的新的起始密码子位置针对全长基因序列进行比对。在2400个位置中，61个显示可溶蛋白表达。本图显示二元输出(在阈值界限上的表达对不表达)，然而，一些克隆比另一些表达得好得多(显示了低和高表达克隆的实例)。

图12：通过随机筛选鉴定的可溶地表达NF-κB的构建体与预先确定的、全长蛋白结构的比对。结构域边界的高分辨率定义(high-resolutiondefinition)从用点标记的克隆而显而易见。存在1-和2-结构域构建体的最紧凑的形式。

图13：使用蛋白质印迹分析确定的蛋白表达。将在质粒pHAR1111中的基因的剪截体文库的96种阳性克隆生长在LB中。将细胞裂解，分离，并且将可溶级分通过用Str-HRP进行蛋白质印迹而分析。显示了一些代表性的克隆。来自蛋白质印迹分析群的重组蛋白依照3种大小范围(大约10，20，30kDa)，如从图11的可溶表达图谱中可见。也显示了内源宿主蛋白BCCP。

图14：由质粒消化揭示的质粒pHAR1111(见图1)的基因插入片段的大小分布。明显地，这里进行的核酸外切酶剪截过程产生基因片段大小的线性和相对没有偏倚的分布，这允许所有大小的目标基因的随机剪截体的筛选。

图15：质粒pHAR1111的随机剪截基因的PCR分析结果，显示在可溶性筛选前文库中克隆样品的大小分布。

图16：由质粒pHAR1111中基因的随机剪截体文库克隆表达的蛋白的可溶性筛选。这里，点阵使用Alexa488荧光团缀合的链霉抗生物素蛋白探测，并且通过Typhoon荧光扫描仪(Amersham)捕获图像。表达可溶蛋白的克隆以一式两份的形式显示。

图17：质粒pHAR1111的随机剪截的基因的PCR分析结果，显示表达可溶蛋白的剪截体的非随机大小分布。

图18：使用溶解性筛选鉴定的可溶蛋白片段的纯化图表。首先，将所述基因片段亚克隆到一种大肠杆菌表达载体中，以添加N端六组氨酸标记促进纯化(图19)。

图19：pTriEX载体(Novagen)的衍生物，其用来亚克隆基因片段，以用于蛋白表达的按比例扩大。将TEV蛋白酶切割的六组氨酸标记添加到构建体的N末端，以允许亲和性纯化。

图20：在将剪截的基因融合到麦芽糖结合蛋白上以辅助表达和纯化后，获得的从pHAR1111表达的蛋白的多结构域30kDa片段。

图21：¹⁵N标记的蛋白的HQSC NMR谱分析结果，其证实从随机文库筛选鉴定的纯化结构域除了高度可溶之外也是很好地折叠的。

结果和方法

实施例-用于下列各项的方法的概念证据：1)编码先前不表达的蛋白的候选基因，和2)编码已知结构的蛋白的人NF-κB基因，用于验证目的构建允许分析由目的插入基因编码的蛋白N端剪截体的载体

在溶解性筛选中通用的质粒最初通过将含有目的基因的载体与赋予剪截处理的相关特征的一起组装而构建。这一初始构建体用于分析候选基因，但是还用作质粒的来源，用于通过将候选阅读框直接、简单置换成另一种而克隆任何其它目的基因。描述了含有候选基因的构建体的构建，之后描述了含有不同的、不相关基因，NF-κB的衍生构建体的构建。

a)候选基因的PCR

候选基因通过从含有开放阅读框的先前的质粒进行PCR而克隆。按照提供的用法说明，PCR反应在50μl反应液中进行，使用PWO聚合酶(Roche)。在一种策略中，PCR构建使用了4种寡核苷酸引物，其中小的外部引物扩增由大的寡核苷酸引发而产生的初始扩增子(以增加反应效率)：

[5’GATCCTAGCATATGAAATGCATGGATCCGCGGCCGCTGAXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3’]60nM for1其中X表示与省略ATG起始密码子的候选基因序列互补的碱基，600nM for2[5’-GATCCTAGCATATGAAATGCATGG-3’]，60nM Fse1rev1[5’-GATCCTAGGGCCGGCCXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3’]和600nM Fse1rev2[5’-GATCCTAGGGCCGGCCXXXXX-3’]。

PCR条件是94℃，2min，然后25个循环的94℃，30 sec；45℃，30 sec；72℃，2min。

PCR在1％ TBE琼脂糖上电泳，切下条带，并且使用QIAEXII试剂盒(Qiagen)纯化DNA产物。为了产生克隆的插入片段，将1μg PCR产物用NdeI和FseI消化完全，然后通过QIAEXII凝胶纯化2230bp的DNA片段。

b)构建含有编码生物素化肽的DNA和用于克隆候选PCR产物的适宜限制性位点的载体

通过将2种寡核苷酸biot-1_for

[5’-AGCTTGCTTGGTGGCGGTCTGAACGACATCTTCGAGGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAATAATGAG-3’]和biot-1_rev

[5’-AGCTCTCATTATTCGTGCCATTCGATTTTCTGAGCCTCGAAGATGTCGTTCAGACCGCCACCAAGCA-3’]退火而产生寡核苷酸盒。这被连接到pMAL-c2g[New England Biolabs]的HindIII位点，形成中间质粒pMAS103，然后将其用NdeI和FseI消化。将5521碱基对的片段(载体骨架)按上述进行凝胶纯化，并且用Shrimp碱式磷酸酶(Amersham)去磷酸化。

c)将PCR产物克隆到大肠杆菌表达载体中

然后使用T4 DNA连接酶(Rapid Ligation Kit，Roche)将2230碱基对的候选基因连接到5521碱基对的pMAS103-源性的骨架上，并且随后使用PCR Quick柱将反应物脱盐，并且洗脱在35μl 10mM Tris Cl pH 8.0中。将大肠杆菌菌株DH5α用2μl的脱盐连接反应物通过电穿孔转化，在SOC培养基中复苏1小时，并且接种到补充氨苄青霉素到70μg/ml的LB琼脂上。从一些克隆分离质粒，并且通过限制性消化和DNA测序进行特征性描述，以证实构建的正确性：pHAR1111(见图1)。

质粒pHAR1111用于候选基因的基因剪截体实验。它还用作分析其它基因的起始载体：通过用NotI和FseI进行质粒消化而将候选基因切下，并且通过使用具有由PCR引入的兼容NotI和FseI位点的连接基因，将备用基因插入到相对于开放阅读框起始和终止密码子的相同位置。

例如，最初将人NF-κB基因突变，以沉默移除内部的NsiI位点。然后，将其使用寡核苷酸引物NFκBfor1[5’-GGATCCGCGGCCGCTGAGCAGATGGCCCATACCTTCAAATATTAGAGC-3’]和NfκBFseRev1[5’-GGGATCCGGCCGGCCCCTTCTGACGTTTCCTCTGCACTTCTTC-3’]通过PCR扩增，形成其中初始的起始密码子已被移除的基因。将PCR产物用NotI和FseI消化，并且连接到源于NotI和FseI消化的pHAR1111的载体骨架中。这样，以与由所述基因编码的蛋白的N端删除兼容的形式产生了NF-κB基因(载体pHAR1112；图2)。

概括来说，产生了2种相似的载体，其允许制备5’删除的文库：pHAR1111，其含有先前不表达的候选基因；pHAR1112，其含有转录因子NF-κB基因，NF-κB是一种已知结构的蛋白，可以用于验证目的。

d)构建允许分析由插入的目的基因编码的蛋白的C端剪截体的载体

载体pMAS103(上文所述)形成能够在目的基因3’末端进行消化的第二种构建体的基础。这里，候选基因作为DNA片段全长克隆，其中起始密码子(ATG)位于NdeI位点(CATATG)中，并且其中终止密码子后接着与pMAS103载体的BamHI、XbaI、SalI或HindIII位点兼容的任何形式的末端(作为兼容性突出端或通过平端连接)。

为了示例其，将人NF-κB基因通过NdeI和BamHI消化从另一质粒(pHAR307)上切下，所述质粒pHAR307含有融合到编码C端六组氨酸标记(所述标记在本实验中没有意义)的DNA上的基因。将这一片段连接到通过NdeI和BamHI消化制备的pMAS103载体骨架上。

概括来说，质粒pMAS106(图3)含有与由所述基因编码的蛋白的C端删除兼容的形式的NF-κB插入片段。由于NF-κB的蛋白结构是充分特征性描述的，所以这随后用于验证目的。

剪截流程(描述含有先前不表达的蛋白的基因的载体pHAR1111)

剪截流程按照ITCHY方法(参见The Creation ITCHY Hybrid ProteinLibraries in Methods in Molecular Biology by Ostermeier，M.& Lutz，S.，第231卷，第129-141页)进行。简要地，为了酶促剪截目的基因，将10微克质粒pHAR1111用NotI和NsiI消化完全。将4微克纯化的、线性的载体稀释在1×缓冲液1(New England Biolabs)，80mM NaCl(除了在缓冲液中的NaCl之外)中，并且终体积是120微升。立即，将30微升移到150微升的PB缓冲液(Qiagen)中，形成t＝0sec对照。向在22℃的剩余的90微升中加入150单位的核酸外切酶III，并且混合。在30秒的时间间隔，移出0.5微升的酶-DNA反应物，并且加入到在冰上的含有300微升PB缓冲液的单一“猝灭管”中。这总共持续1h，直到90微升的反应混合物被转移。剩余的30微升形成t＝1h对照，并且也加入150微升的PB缓冲液。使用PCR净化(cleanup)离心柱(Qiagen)，将3种反应物(t＝0，t＝1h和所述文库)净化，并且分别洗脱在30微升、30微升和50微升的EB缓冲液中。对照样品在凝胶上分析，以验证核酸外切酶反应(数据未显示)。

为了去除核酸外切酶消化后留下的单链突出端，将50微升的文库混合物稀释在1×绿豆核酸酶(MBN)缓冲液(New England Biolabs)中，并且加入3单位的MBN酶，终体积大约55微升。然后，将反应物在37℃温育30min。将反应物使用PCR净化离心柱净化，并且洗脱在65微升EB中。

在连接之前，为了使载体的末端光滑，将48微升文库DNA稀释在1×T4 DNA聚合酶缓冲液(New England Biolabs)中，具有2.5mM dNTPs和1单位T4 DNA聚合酶，终体积100微升。将反应物在12℃温育20min，然后通过加入EDTA至10mM终浓度并且加热到75℃持续20min而进行猝灭。

将反应混合物上样到0.5％TBE琼脂糖凝胶上，并且进行电泳，以通过大小分离DNA片段。将目的大小范围的DNA(＞5.5kb)从凝胶上切下，用QIAEXII树脂(Qiagen)纯化，并且洗脱在60微升的EB中。

与含有剪截基因片段的线性载体相对应的选择大小的DNA通过用T4 DNA连接酶连接而重新环化，按照制造者的用法说明，将8微升的QIAEXII纯化DNA溶液与Roche应用科学连接试剂盒(Roche AppliedScience Ligation Kit)的试剂一起温育而实现。使用PCR净化离心柱将连接混合物脱盐，并且将2微升用于通过电穿孔转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。将转化混合物在SOC培养基中复苏后，将文库接种到22cm方形琼脂平板(Genetix，UK)上。在37℃过夜生长后，从琼脂上刮下大约24,000个克隆，将克隆重悬在PBS中，并且使用miniprep试剂盒(Qiagen)从少量等分的细胞制备质粒。将这一质粒用于转化大肠杆菌蛋白表达菌株，BL21密码子+RIL(Stratagene)。通过用侧面引物进行96个克隆的克隆PCR筛选和琼脂糖凝胶电泳，而证实剪截体的平均大小分布。

文库的机器人操作.

克隆挑选

将转化了质粒文库的BL21密码子+RIL以每平板大约4,000个克隆的密度接种到22cm方形LB琼脂平板上(氨苄青霉素70mg/l；氯霉素30mg/l)，在30℃生长。使用Kbiosystems gridder-picker机器人，将26,880个克隆机械性地挑选到384孔平板中，所述平板每孔装满70微升的LB-HBFM培养基(补充了氨苄青霉素和氯霉素)。将液体培养物在30℃HiGro摇动培养箱中过夜生长达到饱和。

网格到膜上

剪切方形的硝化纤维素膜(Amersham)，并且置于22cm LB琼脂平板(补充了氨苄青霉素和氯霉素)顶部。使用网格钉工具和排列机器人，将培养物以高密度印到膜上。然后将平板在25℃培养过夜，直到克隆刚好肉眼可见。将膜从琼脂上揭起，并且放到新鲜LB琼脂平板(补充了氨苄青霉素和氯霉素)上，所述平板补充了终浓度为0.1mM的IPTG，以诱导克隆内的重组蛋白表达。在这一点上的立即裂解并且用针对生物素化肽的抗体检测全部点阵，导致检测到表达蛋白的克隆(可溶的或不可溶的；图4)。将膜在30℃温育4.5h，从诱导琼脂上揭起，并且置于-80℃。在进行分析前，将膜温育至室温，并且在室温下放到浸透了0.5M NaOH，1.5MNaCl的滤纸上持续10mins。然后，将膜在1M Tris HCl，pH7.5；1.5M NaCl中中和2×5min，然后在2×SSC缓冲液中持续15min。然后，将膜用Superblock(Pierce)封闭过夜。

用链霉抗生物素蛋白和针对肽标记的抗体杂交

表达蛋白的检测

将小鼠单克隆抗-生物素标记抗体(Avidity)1∶7,500稀释在40mlPBS-T中，并且添加到膜上，在Roller Blot杂交烘箱(Techne)中在室温持续2h。然后，将膜用PBS-T缓冲液洗涤，更换3次缓冲液，每次5min。将抗小鼠过氧化物酶缀合物1∶25,000稀释在40ml PBS-T中，并且添加到膜上，在Roller Blot杂交烘箱(Techne)中在室温持续1h。然后，将膜用PBS-T缓冲液洗涤，更换3次缓冲液，每次5min。使用辣根过氧化物酶的化学发光底物(Amersham ECL reagent)和放射自显影法进行蛋白检测(图4)。信号通过密度计量学进行定量。

膜的剥离

通过将膜在室温下在剥离缓冲液(PBS；2％ SDS w/v；100mMβ巯基乙醇)中温育30min，而将抗体去除。然后将膜在PBS-T中洗涤30min，然后用Superblock封闭。

生物素化蛋白的检测

通过在PBS-T洗涤5min而将过量的封闭试剂去除。将链霉抗生物素-辣根过氧化物酶1∶25,000稀释在40ml PBS-T中，并且添加到膜上，在Roller Blot杂交烘箱(Techne)中在室温持续1h。然后，将膜用PBS-T缓冲液洗涤，更换3次缓冲液，每次5min。使用辣根过氧化物酶的化学发光底物(Amersham ECL reagent)和放射自显影法进行蛋白检测。图5显示了可溶蛋白链霉抗生物素蛋白筛选的结果。显示了从没有诱导的和在细胞裂解前用IPTG诱导的一式两份点阵获得的结果(分别为图5a和5b)。IPTG-诱导的蛋白表达的证据可以在第二张膜上看出(5b)。

除了上述化学发光方法外，一种检测的备选的、更能定量的方法使用荧光，并且得到描述：将候选基因的相同的文库按上文制备成点阵，然后使用荧光Alexa488-链霉抗生物素缀合物(Molecular Probes)检测生物素化的蛋白。然后，使用Typhoon成像仪(Amersham)扫描膜，并且使用软件VisualGrid(GPC Biotech)分析图像(Figure 16)。

数据分析

将来自点阵的信号通过密度计量法定量，并且使用图像分析软件将克隆按表达水平排列(5c)，并且按先后顺序排列以备将来研究。在分析的27000个克隆中，由于数据表明可溶蛋白的表达，有大约300个选作将来分析。

未选择和选择的克隆的分析

使用gridder-picker机器人的重排列功能，将来自pHAR1111先前不表达的候选基因的文库的克隆机械性地从冷冻库提取，所述文库从点阵数据被鉴定为表达可溶的、稳定的蛋白。使用两侧引物对96个克隆进行PCR筛选和琼脂糖凝胶电泳，而筛选插入片段的大小。为了确定文库的质量，在从文库中随机选择的克隆上也进行相同的分析用来比较。随机挑取的克隆的PCR结果在图15中显示。显示这一PCR数据分析的图表在图14中显示，并且它可以观察到存在剪截长度的线性的并且相对无偏倚的分布。将PCR产物用NdeI消化，以确定起始密码子。对于从荧光分析被鉴定为最好的可溶表达子的克隆的PCR分析显示在图17中，并且很清楚地，剪截体大小的分布不再是随机的，而是大约相似大小的一群。

第一批96个最好的表达子(相同的文库但是来自更早的化学发光检测方法)的蛋白表达通过蛋白质印迹进行验证，并且通过表达裂解物基于过滤的分离(图13)证实蛋白是可溶的，并且与预计插入片段大小相匹配。

然后，使用载体特异性引物对先前不表达候选基因的可溶表达克隆进行测序，使用沿着剪截基因读取的序列来鉴定剪截体边界的确切身份(identity)和重复(这里相同的克隆被发现多次)。后者的发生是由于，平均起来，蛋白的每个位置被检测7倍。使用这些数据，将实验确定的克隆针对全长基因进行序列比对，形成可溶表达图谱(图11)。这样的图谱是独特的，并且先前对于蛋白从未产生过。它阐明了蛋白中可以被剪截并且产生可溶蛋白的位置。鉴定了多个克隆，并且这些克隆可以通过下述各项而进一步按先后顺序排列：a)当用链霉抗生物素蛋白探测时，选择在膜点阵上给出高信号即，很好地表达的那些克隆；b)当连续的氨基酸被鉴定为剪截点时，选择最小的那些克隆。由于具有有序末端的紧密蛋白通常比具有附加的、无序肽的蛋白更有效地结晶，所以，当克隆用于X-射线结晶学时，后者是有利的。只有由于所述筛选方法的高通量性质使得可以进行实验的过量取样，这一信息的确定才是可能的。

可以看出，在描述按照编码基因序列排列的各种克隆的溶解性程度中明显地存在一定程度的次序。在具有连续剪截的构建体中，相似水平的溶解度是明显的(参见通过标记点所画的直线)，并且据信，这些与溶剂暴露接头中连续残基区域相对应。相反，低溶解度的缺口在属于蛋白结构区域(参见图11中标记为“结合结构域”的区域)的剪截界线是明显的。

在本文中假设，这种类型的分析允许对蛋白剪截变体的溶解性进行穷尽分析，以揭示关于蛋白结构诸如结构域边界的信息，和蛋白一级结构中的残基的溶剂暴露程度。这构成了本发明的另一方面。

蛋白表达：集落vs液体

图13显示阳性克隆的蛋白质印迹分析，阳性克隆在LB培养基中生长，裂解并且分离成可溶级分。尽管可以区分出10kDa、20kDa和30kDa的3簇，这在可溶表达图谱上也是明显的(图11)，但是宽范围的表达水平是明显的。全长蛋白是86kDa，并且认为没有更大的构建体是这种特殊目标物的结构的结果。这一结果还表明，在集落中测定的蛋白表达很好地与更标准的液体培养物形式相关联。

蛋白表达的规模化和进一步描述

将上述鉴定为表达纯化蛋白的一种遗传构建体亚克隆到pTriEX衍生载体(Novagen)中(图19)，以便通过应用基于T7的更强的启动子提高蛋白表达，并且通过添加可以通过TEV蛋白酶切割而被去除的N端六组氨酸标记而辅助纯化。这一具体的构建体的表达良好，每升大约40mg，并且形成容易纯化的物质。这通过纯化级分的SDS-PAGE分析得到证明(图18)。使用NMR，这里显示的纯化蛋白得到关于折叠性的进一步特征性描述，N¹⁵标记物质的HQSC谱在图21中显示。将这种具体的蛋白通过NMR进行全面结构解析，这表明它确实包括来自先前从未成功地过量表达的蛋白的折叠的、可溶的和球状的结构域，因此证明本发明的有用性。这一克隆已经用于结晶学研究。

另外，使用来自可溶表达图谱的信息指导克隆选择(图11)，已经产生了这一目标物的第二大的30kDa蛋白，并且其包括上述更小的结构域加另一种20kDa的物质。预计这包括至少2个结构域。这种蛋白有效地从pTriEX系统(图19)和pMAL载体(New England Biolabs)表达，pMAL载体产生一种容易纯化的麦芽糖结合蛋白融合体，这里所述融合体在图20中显示。

分析NF-κB：本发明应用已知结构的蛋白作为验证目的的另一个实例

上文详细显示的第一个实例是一种先前很难处理的蛋白，原因在于在本工作之前是不可能表达这种蛋白的。然而，为了进一步验证本方法，考虑到还有必要在已知结构的蛋白上进行相同的处理方法。由于它具有非常确定的结构域结构，所以选择了蛋白NF-κB。将pHAR1112用于N端剪截体(图2)，将pMAS106(图3)用于C端剪截体，构建了2个文库。除了在核酸外切酶剪截步骤之前，将pMAS106用FseI和XbaI消化以外，文库按照上述实例进行构建。

如上文那样，通过用两侧引物对基因片段插入物进行PCR，而测定pMAS106 C端剪截体文库的质量，并且结果显示在图6中。使用上文所述Alexa488-链霉抗生物素蛋白缀合物的荧光方法分析集落点阵。使用gridder-picker机器人的cherrypicking功能，将阳性克隆从主文库分离，并且将最强的96个克隆用PCR进行分析。结果(图7)显示2种大小的DNA簇，预测其编码大约25kDa和40kDa的蛋白。这些预测的大小很好地与NF-κB的结构域结构(图8)相关。将第一批48个克隆在LB液体培养物中表达，并且制备全部和可溶的裂解物。蛋白质印迹分析(图9)表明所有的蛋白都是完全可溶的，并且观察到的蛋白大小与通过PCR筛选(图7)预测的大小紧密相匹配。将所有可溶的克隆测序，并且将通过剪截产生的新的C端针对蛋白序列进行序列比对，形成NF-κB的可溶表达图谱(图10)。清楚地揭示了所述蛋白的结构域结构，并且通过选择最小的、最紧凑形式的每种结构域，而将结构域的边缘定位到单个氨基酸分辨率(图12)。2个40kDa结构域和1个25kDa结构域的构建体先前在科学文献中被特征性描述为具有DNA结合的功能。因此，通过筛选随机剪截的NF-κB基因的可溶表达而鉴定的结构域是可溶的和有功能的。

Claims

1.一种在多种变体候选蛋白中筛选可溶候选蛋白的方法，其中将每种候选蛋白融合到肽底物上，以致可溶的候选蛋白通过检测所述肽底物的酶促修饰而得到鉴定。

2.按照权利要求1的方法，当可溶时，其中所述肽底物通过酶促作用而被修饰。

3.按照权利要求1或权利要求2的方法，其中所述肽底物没有显著地干扰与之融合的候选蛋白的物理特征。

4.按照权利要求3的方法，其中所述肽底物没有显著地干扰与之融合的候选蛋白的溶解性。

5.按照前述权利要求任一项的方法，其中所述肽底物长度在5和20个氨基酸之间。

6.按照前述权利要求任一项的方法，其中所述肽底物是生物素蛋白连接酶的底物。

7.按照权利要求6的方法，其中所述肽底物是BCCP的15个氨基酸的肽模拟物，具有序列GLNDIFEAQKIEWHE。

8.按照前述权利要求任一项的方法，其中所述肽底物通过肽键融合到每种候选蛋白上。

9.按照前述权利要求任一项的方法，其中所述肽底物融合在候选蛋白的羧基端。

10.按照前述权利要求任一项的方法，其中所述肽底物融合在候选蛋白的氨基端。

11.按照前述权利要求任一项的方法，其中多种变体候选蛋白从包含在宿主细胞文库内的载体表达。

12.按照权利要求11的方法，其中文库中的每种宿主细胞表达一种能够修饰所述肽底物的底物-修饰酶。

13.按照权利要求11的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)细胞。

14.按照权利要求13的方法，其中所述大肠杆菌细胞表达生物素蛋白连接酶。

15.按照前述权利要求任一项的方法，其中所述多种变体候选蛋白包括候选蛋白的剪截体文库。

16.按照权利要求15的方法，其中所述文库通过用核酸外切酶消化编码所述蛋白的核酸而产生。

17.按照前述权利要求任一项的方法，其中所述多种变体候选蛋白通过使用集落点阵进行溶解性筛选。

18.按照权利要求17的方法，其中通过使用修饰肽选择性的抗体或其它检测试剂(例如，链霉抗生物素蛋白)检测修饰的肽底物，从而筛选由点阵中的集落表达的候选蛋白的溶解性。

19.按照权利要求15-17中任一项的方法，其还包括使得关于文库内多种候选蛋白的溶解性的信息与蛋白序列中的剪截点相关联的步骤。

20.一种用于获得关于蛋白结构的信息的方法，所述方法包括按照权利要求15-17中任一项的筛选方法，还包括使得关于文库内多种候选蛋白的溶解性的信息与蛋白序列中的剪截点相关联的步骤。

21.一种用于鉴定候选蛋白的可溶变体的试剂盒，所述试剂盒包括：

a)一种表达载体，用于在宿主细胞中表达变体候选蛋白；其中所述载体含有允许编码候选蛋白的目的基因插入的限制性位点，以致编码生物素化肽的序列遗传性地融合到所述目的基因；