CN101044213A - 形成染色的微球体和染色的微球体群的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了各种用来形成染色的微球体的方法。一种方法包括通过在微球体存在条件下进行加热或光照，使与染料偶联的化学结构活化，形成反应中间体。所述反应中间体与微球体的聚合物共价相连，从而使所述染料与聚合物偶联，形成染色的微球体。提供了另外的用来形成与分子偶联的染色的微球体的方法。这些方法包括如上所述对微球体进行染色，另外还在染色的微球体的外表面上合成所述分子。还提供了染色的微球体群。群中各个染色的微球体包括经由化学结构与各个所述染色的微球体的聚合物相连的染料。所述染色的微球体群中由于染料造成的染料特征的变化系数约小于10％。

Description

形成染色的微球体和染色的微球体群的方法
                          发明背景
1.发明领域
本发明一般涉及形成染色的微球体和染色的微球体群(population)的方法。某些实施方式包括在微球体存在条件下通过加热或光照对与染料相连的化学结构进行活化，形成反应中间体，使得所述反应中间体与微球体的聚合物共价连接，从而将染料与聚合物偶联。
2.相关领域描述
并不能因为以下的描述和例子被包括在本章节中而将其看作是现有技术。
分光光谱技术被广泛地应用于化学体系和生物体系分析当中。最通常的情况下，这些技术包括由相关材料吸收或发射电磁辐射。一种这样的应用是用于微阵列领域，这是一种通过包括组合化学和生物学检测工业在内的大量学科实现的技术。美国得克萨斯州，Austin的Luminex Corporation开发出了这样一种系统，其中在各种有色的荧光微球体的表面上进行生物检测。Chandler等人的美国专利第5,981,180号中揭示了这种系统的一个例子，该专利全文参考结合入本文中。通过当单独的微球体以较高的速度通过检测区的时候，对其进行激光激发和荧光检测，从而在流体流动器件中对其进行研究(interrogate)。这些数值可以很容易地输出到数据库用于进一步的分析。
在上述系统中，荧光染料被吸收入微球体中并/或结合在微球体表面上。通常基于这些染料在所选检测波长范围内发光的能力对其进行选择。另外，这些检测范围通常以一定的波长数隔开，通常将所述染料设定为使得相邻范围内染料的荧光信号重叠减至最小。在一个实施例中，通过使用两个检测范围和两种染料(每种染料具有十种不同的浓度)，将会有100组荧光可识别的微球体。
通过共价反应和非共价反应对微球体进行染色的常规方法可总结如下。例如，染色的微球体可通过一些方法分散聚合而制备。可以如Hovak，D.等人在J.Polym.Sci.，Part A，Polym.Chem.，33，2961-2968，1995中所述，在聚合之前将染料溶解在单体中，所述文献全文参考结合入本文中。还可在聚合之后使用有机溶剂溶胀微粒，并将染料输送到微粒中，从而对微球体进行染色。这种染色方法的例子可参见以下文献：Ober的美国专利第4,613,559号，Chandler等人的第6,514,295号，Chandler等人的第6,528,165号，Chandler等人的第6,599,331号，Chandler等人的第6,632,526号和Chandler等人的第6,649,414号，这些文献全文参考结合入本文中。
可使用活性染料的共聚来制得包含化学结合的染料的微粒。Winnik，F.M.等人在Eur.Polym.J.，23，617-622，1987中描述了这些方法的例子，该文献全文参考结合入本文中。或者，可以使用与微粒或微载体表面共价键合的荧光染料(或较小的染色的微粒)对所述微粒或微载体任选进行光学编码。这些方法的例子可参见Sebestyen F.等人的J.Pept.Science，4，294-299，1998；Egner，B.J.等人的J.Chem.Soc.Chem.Commun.，8，735-736，1977；Manthakumar，A.等人的Bioconj.Chem.，11，282-292，2000和Chandler等人的美国专利第6,268,222号，所有这些文献都全文参考结合入本文中。
如Breslow，R.，Scriven(编辑)在Azides and Nitrenes，Chapter 10，AP，NewYork，1984中所述，通过卡宾或氮宾部分进行C-H键插入是一种用来在两个有机分子之间形成稳定的共价键的理想方法，所述文献全文参考结合入本文中。根据Autrey，R.等人在J.Am.Chem.Soc.，109，5814，1987中所述，使用氮宾作为活性中间体具有激发作用，能够形成可有效进行C-H插入的新试剂，所述文献全文参考结合入本文中。全氟化苯基叠氮化物(PFPA)已表现出优于其非氟化同类物的优异的C-H插入效率。这些叠氮化物的例子参见Keana等人的美国专利第5,580,697号，Keana等人的美国专利第5,582,955号，Keana等人的美国专利第5,587,273号和Keana等人的美国专利第6,022,597号以及Rajagopalan等人的美国专利公开第US 2003/0017164号，所有这些专利都全文参考结合入本文中。
但是上述方法具有许多缺点。例如，在聚合之前将染料溶解在单体中通常会由于染料在聚合过程中的自由基链终止作用而造成转化率降低和形成多分散的微粒(不同粒度的微粒的混合物)。另外，缺少在自由基聚合条件下稳定的染料，这一点也限制了活性染料共聚的实用性。具体来说，如Yates，M.Z.等人在Langmuir，16(11)，4757-4760，2000中所述，活性染料会在聚合过程中变色，该文献全文参考结合入本文中。
因此，根据目前染料与微球体共价偶联以形成耐溶剂性(solvent-fast)或耐有机性珠粒的领域的现状，人们仍需要合适的对微球体进行共价染色的方法。
各种包含多个叠氮基的分子已经被用于交联聚合物。人们通过加热和光照将叠氮部分转化为活性氮宾基团。例如，Urbain等人在美国专利第3,278,306号中描述了通过光照对羰基叠氮进行转化，该文献全文参考结合入本文中。Bostick等人在美国专利第3,507,829号中描述了在175℃使磺酰叠氮(sulfonyl azide)发生转化，该文献全文参考结合入本文中。Clecak等人在美国专利第3,887,379号中描述了通过光照使芳族叠氮发生转化，该文献全文参考结合入本文中。Cai等人在Chem.Mater.，2，631，1990中描述了通过光照使PFPA发生转化，该文献全文参考结合入本文中。
在二十世纪七十年代早期，Kodak受让了一系列使用各种具有附加的磺酰叠氮部分的染料(例如偶氮染料或醌类染料)对疏水性聚合物进行永久性染色的专利。使用磺酰叠氮部分，通过加热或光照生成的中间体氮宾，将染料分子与聚合物基材共价相连。未反应的染料分子可以随后洗去。具体来说，Holstead等人的英国专利第1344991号和第1344992号描述了与各种染料和荧光增白剂的芳环直接相连的磺酰叠氮部分的应用。在对嵌入了染料的聚合物(膜或纤维的形式)进行加热或辐照之后，染料与聚合物形成新的键。Holstead等人在英国专利第1344993号中描述了使用类似的活性染料作为照相材料的一部分。Shuttleworth在英国专利第1406996号中描述了通过连接基团，将苯磺酰叠氮与各种染料分子相连，从而制备活性染料。Pullan在英国专利第1412963号中描述了在织物或膜上进行转印的时候使用具有各种活性基团(包括磺酰叠氮)。上面所有的英国专利都全文参考结合入本文中。
其它公司也有相关的专利，Kuroki等人在美国专利第3,695,821号中描述了使用包含磺酰叠氮的染料对纤维和成形制品进行快速染色，Kampfer等人在美国专利第3,674,480号中描述了使用包含磺酰叠氮的染料进行照相法干式复印，这两个专利都全文参考结合入本文中。Armstrong World Industries，Inc.，Lancaster，Pennsylvania在二十世纪八十年代早期获得了一些专利，这些专利是关于使用包含磺酰叠氮的化合物使制品具有永久性的黄色和棕色，参见Hoyle等人的美国专利第4,322,211号，Hoyle等人的美国专利第4,415,334号和Lenox等人的美国专利第4,556,625号，所有这些专利都全文参考结合入本文中。另外，如以下文献所述，一些科研小组探索了使用磺酰叠氮基团对聚合物纤维进行快速染色，例如参见Ayyangar，N.R.等人的Journal of the Society of Dyers andColorists(JSDC)，第13-19页和第55-57页，1979；Griffiths，J.等人的JSDC，第455-458页，1977；Griffiths，J.等人的JSDC，第65-70页，1978；Milligan，B.等人的JSDC，第352-356页，1978和Desai，K.R.等人的Dyes and Pigments，23，第25-32页，1993，这些文献全文参考结合入本文中。
以下文献中研究了取代基对磺酰叠氮热分解生成氮宾的影响：Katamancheva，I.等人的Dyes and Pigments，13，第155-160页，1990；Ayyangar，N.R.等人的Indian J.of Chemistry，3OB，第42-45页，1991；以及Leffler，J.E.等人的J.Org.Chem.，28，第902-906页，1963，这些文献全文参考结合入本文中。以下的文献中还报道了关于磺酰叠氮反应的基本机理的研究：Abramovitch，R.A.等人的J.Org.Chem.，40，第883-889页，1975；Abramovitch，R.A.等人的J.Org.Chem.，42，第2920-2936页，1997和Ulrich，J.的J.Org.Chem.，40，第802-804页，1975，这些文献都全文参考结合入本文中。
某些生物检验需要结合化学合成的生物分子(例如寡核苷酸、肽或寡糖)。这些生物分子可以在有机溶剂中，在微球体树脂(未染色的)上通过自动合成来制备。合成之后，生物分子从载体上解离，然后通过湿法将其连接到染色的微球体上。如果可以直接在染色的微球体上进行合成，该方法将会更简单且更廉价。然而，目前使用的微球体如果与合成中所用的有机溶剂相接触，将会造成染料的损失。因此，人们需要“耐有机性”微球体，即，即使与有机溶剂接触仍可保持其荧光特性的微球体。
人们已开发出了使不具有耐有机性的微球体具有耐有机性的方法。例如，Chandler在美国专利第6,528,165号(该专利全文参考结合入本文中)中描述了硅和糖基的涂层，当这些涂层在染色的微球体上形成的时候，能够使染色的微球体具有耐有机性。另外，如果在水中或水性溶剂中的溶解度相对较小的其它分子(例如抗原或候选药物)在醇溶剂或二甲亚砜(DMSO)溶剂中能与微球体进行偶联，则该偶联更容易进行。
发明内容
下述的各种方法和实施方式并不对所附权利要求书的主旨构成任何限制。
一个实施方式涉及一种形成染色的微球体的方法。该方法包括在微球体存在条件下通过加热或光照使与染料相偶联的化学结构活化，形成反应中间体。所述反应中间体与微球体的聚合物共价连接，从而使所述染料与聚合物偶联，形成染色的微球体。尽管本文所述是关于一种微球体，但是应理解可以使用该方法同时对多种微球体进行染色。
在一个实施方式中，使化学结构活化包括将与染料偶联的化学结构加热至大约110℃的温度。在另一个实施方式中，使化学结构活化包括将所述与染料偶联的化学结构加热至大约50-80℃。较佳的是，使所述化学结构活化包括将所述与染料偶联的化学结构加热至低于该聚合物玻璃化转变温度的温度。在使所述化学结构活化之前和之后，所述微球体优选具有基本相同的形状。另外，在对所述化学结构进行活化之前和之后，所述染料优选具有相同的结构和基本相同的组成。
较佳的是，当所述染色的微球体被置于有机溶剂中的时候，所述化学结构和染料不会从聚合物解离。在一个实施方式中，所述聚合物主要由与二乙烯基苯交联的聚苯乙烯组成。换而言之，所述聚合物可主要由与二乙烯基苯交联的聚苯乙烯形成。所述微球体在其表面上还可包含羧基或其它合适的基团，例如氨基。可通过在微球体聚合过程中加入丙烯酸或甲基丙烯酸作为单体来产生这些基团。在一个例子中，聚合反应中所含的大约1-10％的单体可以是与表面基团相关的单体。因此，在一个实施方式中，所述染色的微球体包含一种或多种与聚合物相连或合成于该聚合物之上的官能团(例如羧基、氨基等)，使得一种或多种分子可通过所述一种或多种官能团与染色的微球体连接。
在一些实施方式中，所述化学结构包括芳族磺酰叠氮。在另一个实施方式中，所述化学结构包括1，5-乙基-二氨基-萘磺酰叠氮。在另一个实施方式中，所述反应中间体包含磺酰氮宾基团。或者所述反应中间体可包含碳宾基团或三重态二苯甲酮。
在另一个实施方式中，所述反应中间体包含被化学结构的非活化部分将其与染料隔开的官能团。在一个这样的实施方式中，所述反应中间体包括位于该化学结构非活化部分一侧的官能团，所述染料位于该非活化部分基本上与之相对的另一侧。
在一些实施方式中，所述方法包括在微球体存在条件下，通过加热或光照使与另外的不同染料偶联的其它化学结构活化，形成不同的反应中间体。所述不同的反应中间体与与所述微球体的聚合物共价连接，使得所述另外的不同染料与聚合物偶联。在一个这样的实施方式中，在对所述另外的化学结构进行活化之前和之后，所述不同的染料基本上具有相同的结构和组成。这种染料可以在化学结构、激发特征、发射特征等方面不同于化学结构中的其它染料。所述用来将不同的染料与聚合物相偶联的另外的化学结构可以与用来将其它染料与聚合物相偶联的化学结构相同或不同。这两种不同的染料可以同时或依次与聚合物偶联。另外，这两种不同的染料可以以不同的用量、比例或浓度与不同的群中的微球体的聚合物偶联。上文所述的方法的各实施方式可包括本文所述的任意其它步骤。
另一个实施方式涉及一种形成与分子偶联的染色的微球体的方法。该方法包括在微球体存在条件下，通过加热或光照使与染料偶联的化学结构活化，形成反应中间体。该反应中间体与所述微球体的聚合物共价连接，从而使所述染料和聚合物偶联，形成染色的微球体。该方法还包括在所述染色的微球体的表面上合成分子。尽管本文所述的方法是关于一种微球体，但是应当理解可以使用该方法同时形成多种染色的微球体，每种微球体与至少一种分子偶联。另外，尽管本发明所述的是关于一种分子，但是应当理解该方法可包括使一种以上的不同分子(例如多种不同的生物分子)与每一种染色的微球体偶联。
在一个实施方式中，合成分子的步骤包括将染色的微球体置于有机溶剂中。较佳的是，在合成之前和之后，所述染色的微球体具有基本相同的染料特征。在一个实施方式中，所述在染色的微球体的外表面上合成的分子是生物分子。在另一个实施方式中，所述分子包括寡核苷酸、肽或寡糖。在其它实施方式中，所述在染色的微球体的外表面上合成的分子是有机分子(例如候选药物)。在一些实施方式中，所述分子基本不溶于水性溶剂。在不同的实施方式中，合成所述分子包括将染色的微球体置于水性溶剂中。
在一些实施方式中，使所述化学结构活化包括将所述与染料偶联的化学结构加热至约110℃。在另一个实施方式中，使所述化学结构活化包括将所述与染料偶联的化学结构加热至大约50-80℃。较佳的是，使所述化学结构活化包括将所述与染料偶联的化学结构加热至低于该聚合物的玻璃化转变温度的温度。在使所述化学结构活化之前和之后，所述微球体的形状优选基本相同。另外，在使所述化学结构活化之前和之后，所述染料优选具有相同的结构和基本相同的组成。
较佳的是，当将所述染色的微球体置于有机溶剂中的时候，所述化学结构和染料不会从聚合物上解离。在一个实施方式中，所述聚合物主要由与二乙烯基苯交联的聚苯乙烯组成。换而言之，所述聚合物可主要由与二乙烯基苯交联的聚苯乙烯形成。在一个实施方式中，所述染色的微球体包括一种或多种与聚合物相连的官能团(例如羧基、氨基等)，使得一种或多种分子可以通过所述一种或多种官能团与染色的微球体相连，或者在染色的微球体上合成。
在一些实施方式中，所述化学结构包括芳族磺酰叠氮。在另一个实施方式中，所述化学结构包括1，5-乙基-二-氨基-萘磺酰叠氮。在另一个实施方式中，所述反应中间体包含磺酰氮宾基团。或者所述反应中间体可包含碳宾基团或三重态二苯甲酮。
在另一个实施方式中，所述反应中间体包含被化学结构的非活化部分将其与染料隔开的官能团。在一个这样的实施方式中，所述反应中间体包含位于该化学结构非活化部分一侧的官能团，染料位于所述非活化部分上基本与之相对的另一侧。
在一些实施方式中，所述方法包括在微球体存在条件下，通过加热或光照使与另外的不同染料偶联的另外的化学结构活化，形成不同的反应中间体。所述不同的反应中间体与所述微球体的聚合物共价连接，从而使另外的不同染料与聚合物偶联。在一个这样的实施方式中，在使所述另外的化学结构活化之前和之后，所述不同的染料具有基本相同的结构和组成。该染料可以在化学结构、激发特征、发射特征等方面不同于其它的染料。所述用来使另外的不同染料与聚合物偶联的另外的化学结构可以与用来使其它染料与聚合物偶联的化学结构相同或不同。所述两种或更多种不同的染料可以同时或依次地与聚合物偶联。另外，所述两种或更多种不同的染料可以以不同的用量、比例或浓度与不同的群中的微球体的聚合物偶联。上述方法的各实施方式可包括本文所述的任意的其它步骤。
另外的实施方式涉及染色的微球体群。群中各染色的微球体都包括通过化学结构与该染色的微球体的聚合物相连的染料。染色的微球体群中由于染料造成的染料特征的变化系数约小于10％。在一个实施方式中，所述变化系数是各染色的微球体在被激发的时候发射的信号的变化系数。在另一个实施方式中，与各染色的微球体的聚合物相连的染料的量基本相等。
在一些实施方式中，所述群中的各染色的微球体包含通过另外的化学结构与各染色的微球体的聚合物相连的另外的不同染料。在一个这样的实施方式中，所述染色的微球体群中由于另外的不同染料造成的染料特征的变化系数约小于10％。两种不同的染料可以以不同的用量、比例或浓度与不同的群中的微球体的聚合物偶联。在另一个实施方式中，所述群的各染色的微球体包含在各染色的微球体的外表面上合成的生物分子。在一个不同的实施方式中，所述群的各染色的微球体包含在各染色的微球体的外表面上合成的有机分子。
在一个另外的实施方式中，在染料与聚合物连接之前和之后，各染色的微球体的形状基本相同。在另一个实施方式中，在染料与聚合物连接之前和之后，所述染料基本具有相同的结构和相同的组成。在另一个实施方式中，当将所述染色的微球体群置于有机溶剂中的时候，所述化学结构和染料不会从聚合物上解离。
在一个实施方式中，所述聚合物主要由与二乙烯基苯交联的聚苯乙烯组成。另外，各染色的微球体还可包含一种或多种与聚合物相连的官能团，使得一种或多种分子可以通过所述一种或多种官能团与各染色的微球体连接。在一些实施方式中，所述化学结构包括芳族磺酰叠氮。在另一个实施方式中，所述化学结构包括1，5-乙基-二-氨基-萘磺酰叠氮。染色的微球体群的各实施方式还可如本文所述进一步配置、构成和/或形成。另外，在一套用于对样品中的多种分析物进行多重分析的装置中，可以包括多个如上所述配置的群，但是这些群包含不同含量、比例或浓度的一种或多种染料，使得不同的群之间可通过荧光特征(例如荧光波长、荧光强度或荧光强度比)区别开来。
                          附图简述
通过参照附图阅读以下详述，本发明的其它目标和优点将是显而易见的，图中：
图1是由Luminex100系统的鉴别通道1(CL1)/鉴别通道2(CL2)得到的根据本文所述的方法实施方式染色的微球体的信号的曲线图；
图2是可以使用根据本文所述的方法实施方式形成的微球体和微球体群进行试验的示例性测量系统的示意图。
在附图和下文的详述中显示了本发明的具体实施方式，但是可以对本发明进行各种改变和替代。应当理解，附图和详述不对本发明构成具体的限制，相反，本发明包括所附权利要求书所限定的本发明精神和范围内的全部改变、等价内容和修改。
                      优选实施方式详述
尽管本文中是关于荧光染料描述了方法和群的实施方式，但是应当理解本文所述的方法和群可用于或包括本领域已知的任意其它的可用来使微球体具有一种或多种可测量的不同特征的分子(例如荧光团)。另外，许多不同的荧光染料是本领域已知的，在本文中，术语“荧光染料”包括本领域中已知的所有荧光染料。
尽管本文所述的实施方式是关于微球体，但是应理解这些实施方式可以用于或包括本领域已知的任意离散的物质(例如微球体、珠粒、微粒等)，这些物质由能够与本文所述的反应中间体共价结合的材料形成。
一般来说，本文描述了用来制备耐有机性的染色的微球体的方法。微球体通常用荧光染料染色，使得微球体在购自美国得克萨斯州，Austin，LuminexCorporation的Luminex100设备中或本领域已知的其它测量设备中，曝光于激发源(例如激光辐射)的时候，能够表现出选定的荧光特性(例如荧光波长、荧光强度、荧光强度比等)。在本文所述的方法中，所述染料与化学结构偶联，该化学结构通过光照或加热活化，产生能够使化学结构与微球体的聚合物(例如聚合物基质)共价连接的反应中间体，从而使所述染料与微球体的聚合物连接。
这种方法的一个实施方式包括在微球体存在条件下，通过加热或光照使与染料偶联的化学结构活化，形成反应中间体。在使所述化学结构活化的过程中，所述与染料偶联的化学结构可位于微球体内。可以在使所述化学结构活化之前，使用本领域已知的任何合适的方法将所述化学结构和与之偶联的染料结合入微球体中。所述反应中间体与微球体的聚合物共价相连，从而使得染料与聚合物(通过所述化学结构)偶联，形成染色的微球体。通过这种方式，所述染色的微球体可包含位于微球体内的染料(例如位于微球体的聚合物基质内)，而不是使染料位于染色的微球体的表面上。
因此，本文所述的方法实施方式包括使用不同于目前所用的染料结构和染色步骤。例如，该方法实施方式包括向溶胀的微球体加入与一种或多种化学结构偶联的一种或多种染料，然后通过固化(例如通过使化学结构活化，形成反应中间体，该反应中间体与微球体的聚合物共价反应)将其永久性地包封在微球体中。可以依照以下专利所述在使化学结构活化之前溶胀微球体，以便将化学结构和与之偶联的染料结合在微球体中：Chandler等人的美国专利第6,514,295号、第6,599,331号和第6,632,526号，这些专利全文参考结合入本文中。
如上所述，磺酰叠氮已被用来将各种染料与天然聚合物和合成聚合物(膜或纤维)共价连接。但是已经发现这些化学结构可以用来使微球体群所发射的荧光信号具有严密的(即低的)变化系数(％CV)，当使用本发明所述的方法实施方式进行化学结构活化和与聚合物反应之后，低的％CV得以保持。这种严密的荧光％CV对于一些用途是特别有效的，例如对样品中的多种分析物进行多重分析的应用，在这些分析中，微球体所发射的荧光的％CV对该微球体所归属的群的精确性具有直接影响，从而可以影响微球体上的反应物的鉴别(例如随着％CV减小，微球体鉴别的精确度提高)。另外，减小微球体的荧光％CV通常会使得能够在单独的化验或试验中使用更多的微球体群，这是由于此时对应于任意的群的鉴别间隔(classification space)更小，因此在鉴别间隔中可包括更多的微球体群。
可以使与染料偶联的磺酰叠氮活化，使得活化的磺酰叠氮能够与微球体的聚合物反应，从而形成耐有机性的珠粒组(bead set)(即当该珠粒组与有机溶剂或包含有机溶剂的混合物相接触之后，其荧光特征(例如荧光强度)不会发生变化)，该珠粒组与Luminex100系统和市售可得的其它可用来测量或被设计成测量微球体的流动细胞计量器系统相容。因此，本文所述的发明实施方式的一个优点是，通过所述方法实施方式染色的微球体在与一种或多种有机溶剂相接触之后，其荧光特性不会发生变化(例如荧光强度减小)。换而言之，当所述染色的微球体被置于有机溶剂中、或者与包含有机溶剂的溶剂混合物相接触时，所述化学结构和与之偶联的染料不会从所述聚合物上解离和迁移出微球体外。
本文所述的方法实施方式也可使用磺酰叠氮和其它能够活化生成其它和/或另外的活性基团(例如其它的氮宾、卡宾等)的化学结构、以及能够通过加热活化和/或光化学活化来进行活化的化学结构来实施。本文所述的乙基-二氨基-萘磺酸(EDANS)基团也可用其它的芳族结构来补充或代替，这可改变所述化学结构的活化温度。通过这种方式，本文所述的方法中所用的化学结构可包括芳族磺酰叠氮、1，5-乙基-二氨基萘磺酰叠氮或本领域已知的任意其它合适的化学结构。换而言之，本文所述的方法可以使用除了包含EDANS基团的化学结构以外的化学结构。本文所述的方法实施方式还可与其它的珠粒染色法结合使用。
为了对微球体进行染色，可通过以下的一般性准则来选择化学结构和所述染色法的参数或条件。例如，为了获得选定的微球体的荧光特性，所述与微球体的聚合物相连的染料的百分率优选基本恒定，而且优选具有高百分率。为了获得严密的％CV，以便对相同群的微球体发射的荧光信号(例如使微球体具有有区别的可测量特征的荧光信号，该信号使得可将一群微球体与另一群微球体区别开)进行鉴别，各化学结构优选以基本相同的程度活化，使得共价连接之后，群中的各微球体被基本均匀地染色。
还可对化学结构进行选择，使得在活化步骤中，所有结合入微球体中的不同的化学结构将在基本相同的条件下以基本相同的程度与微球体的聚合物反应。通过这种方式，可以比较容易而准确地对染色的微球体的特征(例如它们的荧光信号)进行控制。所选择用于本文所述方法实施方式的染料生色团优选在活化条件下是稳定的(例如紫外(UV)光可以过量地或不同程度地使一些生色团发生光褪色)。所述微球体也优选在选择用于本文所述的方法实施方式中的活化条件下是稳定的(例如过热会造成该微球体熔化并丧失其球形形状)。
所述微球体的内部可以主要由聚合物组成，例如与二乙烯基苯交联的聚苯乙烯，这种聚合物是对共价偶联具有相当惰性的基材。因此，可以对化学结构进行选择，使得该反应中间体的活性足以将所述化学结构和与之偶联的染料插入微球体的这种和其它聚合物的C-H或C-C键内。另外，优选的是在对微球体进行染色之后，微球体表面上的羧酸酯基(carboxylate)和/或其它官能团被保留下来，可以与生物分子或其它分子(例如有机分子、候选药物等)偶联。
本文所述的染色法可以使用例如下图所示的1，5-EDANS磺酰叠氮形式的化学结构来实施。
Figure A20058003441900171
如以上反应的第一步所示，用1，5-EDANS叠氮上的自由氨基使1，5-EDANS叠氮与染料分子偶联。所述染料分子可包括本领域已知的任何合适的染料分子。在一个这样的例子中，所述染料包含能够与1，5-EDANS叠氮上的自由氨基偶联的胺活性基团，例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯基、异氰酸酯基等。尽管上图显示一个染料分子与一个化学结构分子相偶联，但是应当理解在本文所述的实施方式中，可以使用能够使每个化学结构分子与一个以上染料分子结合的化学结构，或者使每个染料分子与一个以上化学结构相偶联的化学结构。
如图所示在该反应的第二步中，可以将与染料偶联的1，5-EDANS叠氮结合入微球体的聚合物中(即位于微球体的聚合物基质中)。如第二步进一步显示，将结合入聚合物中的化学结构加热至约110℃的温度引发了氮挤出反应，该反应在1，5-EDANS叠氮上形成活性磺酰氮宾基团，该基团可以与微球体的聚合物形成共价键合。因此，对所述化学结构的活化可包括将与染料偶联的化学结构加热至大约110℃的温度。
仅有活性足够高的中间体能够与脂族C-H键(例如聚合微球体的C-H键)反应。这种高活性的中间体的例子包括卡宾、氮宾和三重态二苯甲酮。(例如参见R.P.Haugland编的《荧光探针和研究产品分子探针手册(Molecular ProbesHandbook of Fluorescent Probes and Research Products)》，第九版，第5.3章，该文献全文参考结合入本文中)。因此，在所述方法过程中形成的反应中间体可包括氮宾基团、卡宾基团、三重态二苯甲酮或本领域已知的任意其它合适的官能团。应当注意二苯甲酮仅能用紫外光活化。
大部分氮宾和卡宾发生较快的单分子重排反应，生成活性小于对应的氮宾和卡宾的物质。因此，这些反应中间体优选在待染色的微球体存在条件下形成(例如在结合入微球体中之后形成)，使得这些基团可以在发生单分子反应之前与微球体的聚合物反应。但是磺酰叠氮不会发生单分子重排反应，因此基本上是在磺酰叠氮存在条件下“迫使”其与微球体的聚合物之类的分子反应。
使用本文所述方法实施方式的这些化学结构具有大量的优于目前所用的染色法和染料的优点。例如，在本文所述的实施方式中通过活化在化学结构上产生的活性基团不是染料生色团的一部分。因此，所述活性基团的活性可不受所附加的染料结构的影响，从而增加了可用来形成耐有机性的染色的微球体的荧光染料的数量和种类。另外，可以将所述活性基团结合入化学结构中，该化学结构可以与许多不同的染料偶联，而无需针对每种染料设计新的合成。另外，所述1，5取代的萘芯使得活性磺酰氮宾的位置远离染料分子(即与之隔开)，从而减小了氮宾与附加的染料反应而非与微球体的聚合物链反应的机会(可能是将此机会减至最小)。通过这种方式，所述反应中间体可包含被化学结构的非活化部分将其与染料隔开的官能团。在一些实施方式中，所述反应中间体包含位于化学结构非活化部分一侧的官能团。染料可位于该非活化部分上基本与之相对的另一侧。
另外，可通过将化学结构加热至约等于或高于110℃来产生中间体氮宾，该温度远低于目前所用的微球体的聚合物的玻璃化转变温度以及目前所用染料的分解温度。因此，在一个实施方式中，使化学结构活化包括将所述与染料偶联的化学结构加热至低于聚合物玻璃化转变温度的温度。这时，在化学结构活化之前和之后，被染色的微球体的形状基本相同(例如球形)。
可以对结构-活性关系以及它们对共价染色的影响进行研究，以开发理想的活性染料(即与染料偶联的化学结构)。例如，改变磺酰叠氮芳环可以制得能够在较低温度下反应，而且在对被染色的微球体的测量中具有最小的光谱干扰的化学结构。在一个特殊的例子中，对萘环进行另外的取代可以将反应温度降至本文所述实施方式的理想温度(例如反应温度约为50-80℃)。通过这种方式，对化学结构的活化可包括将与染料偶联的化学结构加热至大约50-80℃。另外，可以对反应进行模拟，以确定磺酰叠氮的反应方式(并非所有的反应都可造成共价连接)。例如，可以在甲苯溶液(聚苯乙烯的简单模拟)中加热叠氮化物的溶液，产物可进行分离和表征。
以下流程大致列出了用来合成可用于本文所述方法的与染料偶联的化学结构的合成方法。
Figure A20058003441900191
上图所示的反应制得了与染料偶联的磺酰叠氮。该例子中的染料分子在激发的时候能够发射Luminex100系统的鉴别通道1(CL1)的检测窗口之内的波长。然而，可以将本领域中已知的任何合适的染料与上图所示的化学结构偶联。尽管在上文所述的例子中，一个染料分子与一个化学结构分子偶联，但是应当理解在本文所述的实施方式中，每个化学结构分子与一个以上染料分子偶联、或者每个染料分子与一个以上化学结构分子偶联也是允许的。
如上文所述，使用上述反应制备的磺酰叠氮偶联的染料对微球体进行染色。加热之后，用四氢呋喃(THF)和甲醇将未反应的染料从微球体中洗去。微球体的洗涤可以使用本领域已知的任意合适的方法来进行。所得的用Luminex100系统测量的染色的微球体的CL1/鉴别通道2(CL2)散点图列于图1。如图1所示，该试验的结果证明，可通过使用芳族磺酰叠氮，简单地对其中已结合有与芳族磺酰叠氮偶联的染料的干燥微球体进行加热，使荧光染料与聚苯乙烯聚合物连接。测得的珠粒群的％CV为CL1＝8％。
在一些实施方式中，上述染色方法包括在微球体存在条件下，通过加热或光照使与另外的不同染料偶联的另外的化学结构活化，形成不同的反应中间体。所述不同的反应中间体与微球体的聚合物共价连接，从而使另外的不同的染料与聚合物偶联。所述另外的化学结构可以与所述与其它染料偶联的化学结构相同或不同。例如，这两种染料都可以与1，5-乙基-二氨基萘磺酸叠氮分子偶联。或者不同的染料可以与不同的芳族磺酰叠氮偶联。在所述化学结构活化之前和之后，所述另外的不同染料优选具有基本相同的结构和组成。通过这种方式，化学结构的活化以及化学结构与微球体的连接将不会改变染料。这两种不同的染料可以同时或依次与聚合物偶联。另外，这两种不同的染料可以以不同的用量、比例或浓度与不同的群中的微球体的聚合物偶联。另外，可以使用本文所述的方法使两种以上的不同染料与微球体偶联。
通过本文所述的方法实施方式制备的耐有机性珠粒具有与微球体表面共价偶联的寡序列(oligosequence)，其对于诸如多重杂交检验的许多应用具有非常巨大的价值。具体来说，所述寡核苷酸可以在耐有机性的染色的微球体上直接合成(可以自动化地合成)。在荧光微球体上直接(任选自动化地)寡合成(oligo-synthesis)将会相对于目前使用的制备这种微球体的方法降低制造偶联有核苷酸的微球体的成本，目前的方法包括在DNA合成树脂上合成寡核苷酸，使所述寡核苷酸与DNA合成树脂“分离”，然后将所述寡核苷酸与荧光染色的微球体“连接”。可以使用本领域任意合适的已知寡核苷酸合成法在根据本文所述的方法实施方式形成的微球体表面上合成寡核苷酸(例如通过微球体表面上的官能团合成)。
因此，在一个实施方式中，所述方法包括在如上所述对微球体进行染色之后，在微球体的外表面上合成分子。在一些实施方式中，所述分子合成包括将所述染色的微球体置于有机溶剂或包含有机溶剂的溶剂混合物中。不同于其它的染色的微球体，本文所述的微球体在被置于有机溶剂中的时候，其染料特征不会损失。关于这一点，在合成前后，所述染色的微球体可具有基本相同的染料特征。所述在微球体上合成的分子可以是生物分子。例如，所述生物分子可以是本领域已知的任何具有较低水溶性的生物分子，如果连接反应能够在有机溶剂中进行，该生物分子将更容易被连接到荧光微球体上。另外，所述分子可包括寡核苷酸、肽或寡糖。在所述微球体上合成的寡核苷酸、肽和寡糖可包括本领域已知的任何合适的这些分子。
在另一个实施方式中，所述分子可包括有机分子(例如候选药物)。因此，可以使用本文所述的共价染色的微球体产生用于基于染色体组的药物研发的成功的药剂。在一些实施方式中，所述分子包括任何基本不溶于水性溶剂中的分子。
或者所述分子合成可包括将染色的微球体置于水性溶剂中。通过这种方式，可以在水性溶剂和有机溶剂中，在根据本文所述的染色的微球体上合成分子，从而显著提高微球体的实用性。很显然，也可使用本领域已知的任何合适的方法将预先合成的分子与本文所述的染色的微球体相结合。
另一个实施方式涉及染色的微球体群。所述群中各染色的微球体包含通过化学结构与该染色的微球体的聚合物相连的染料。所述染料和化学结构可包括本文所述的任意染料和化学结构。所述染色的微球体群中由于染料造成的染料特征的变化系数约小于10％。所述变化系数可以是群中各染色的微球体在受激的时候发射的信号(例如荧光强度)的变化系数。通过这种方式，所述变化系数可以是染色的微球体的鉴别信号的变化系数。所述染料可以以不同的用量或浓度与不同的群中的微球体的聚合物偶联。
在一个实施方式中，与各染色的微球体的聚合物连接的染料的量基本相等。在一些实施方式中，所述群中的各染色的微球体还可包含通过另外的化学结构与各染色的微球体连接的另外的不同染料。在一个这样的实施方式中，染色的微球体群中由于所述另外的不同染料造成的染料特征的变化系数约小于10％。这两种不同的染料可以以不同的用量、比例或浓度与不同群中的微球体的聚合物偶联。另外，两种以上不同的染料可以以不同的用量、比例或浓度与不同的群中的微球体的聚合物偶联。
优选的是，当所述染料与聚合物连接之前和之后，各染色的微球体的形状基本相同。另外，在所述染料与聚合物连接之前和之后，染料具有基本相同的结构和基本相同的组成。较佳的是，当将所述染色的微球体群置于有机溶剂中的时候，所述化学结构和染料不会从聚合物上解离。所述化学结构可包括芳族磺酰叠氮。在一个实施方式中，所述化学结构包括1，5-乙基-二氨基-萘磺酰叠氮。然而，所述化学结构可包括任意其它本文所述的化学结构。
所述聚合物可以主要由与二乙烯基苯交联的聚苯乙烯组成。在满足或不满足以上前提的条件下，所述微球体的聚合物还可包含本领域已知的任何其它合适的聚合物。所述微球体还可包含位于微球体表面上的羧基或其它合适的基团，例如氨基。这些基团可以通过在微球体聚合的时候加入丙烯酸或甲基丙烯酸作为单体而形成于微球体的表面上，在一个例子中，所述聚合反应中大约1-10％的单体可以是与表面基团相关的单体。因此，在一个实施方式中，所述染色的微球体包含一种或多种与聚合物相连的官能团(例如羧基、氨基等)，使得一种或多种分子可以通过所述一种或多种官能团与所述染色的微球体连接。
在一些实施方式中，所述群的各染色的微球体包含在各染色的微球体的外表面上合成的生物分子。所述生物分子可包括本文所述的任意生物分子。在其它实施方式中，所述群的各染色的微球体包含在各染色的微球体的外表面上合成的有机分子。所述有机分子可包括本文所述的任意有机分子。本文所述的染色的微球体群的各实施方式可以如本文所述进一步配置、构成和/或形成。另外，上述染色的微球体群的实施方式具有本文所述方法实施方式的所有优点。
以下实施例仅是用作举例的目的，不会对本发明的实施方式构成限制。以下实施例中所述的所有试剂都购自Sigma-Aldrich(除非另外说明)，不经纯化直接使用。
实施例1：碘化N-(ζ-羧己基)-2，3，3-三甲基吲哚(indolinium)
向溶于20毫升乙腈的2.45克2，3，3-三甲基假吲哚(15.4毫摩)中加入3.00克6-溴己酸(15.4毫摩)，该溶液回流加热14小时。真空浓缩之后，残余物用100毫升去离子水和25毫升乙酸乙酯萃取。水相部分再用25毫升乙酸乙酯洗涤两次。水相部分进行真空浓缩，然后向残余物中加入50毫升无水乙醚。置于4℃2天之后，过滤回收得到1.62克(30％)的碘化N-(ζ-羧己基)-2，3，3-三甲基吲哚紫色固体。
实施例2：2，4-二[N-(ζ-羧己基)-1，3，3-三甲基-2-二氢亚吲哚基-甲基]cylclobutenediylium-1，3-diolate
使用迪安-斯塔克分水器对溶解于25毫升甲苯和25毫升丁醇中的0.80克(2.25毫摩)碘化N-(ζ-羧己基)-2，3，3-三甲基吲哚(实施例1中制备)和0.13克(1.12毫摩尔)3，4-二羟基-3-环丁烯-1，2-二酮的溶液回流15小时。该溶液真空浓缩，残余物在装填有氯仿的硅胶柱上用包含0-5％甲醇的氯仿分馏。真空浓缩蓝色馏分，制得蓝色油状物。该蓝色油状物溶解在10毫升无水乙醇中，真空浓缩制得0.44克(31％)金色-金属色泽的固体。
实施例3：叔丁氧基羰基(t-BOC)保护的1，5-EDANS
向溶于50毫升甲醇的1.98克5-(2-氨乙基氨基)-1-萘磺酸(1，5-EDANS，7.42毫摩)和2.78克碳酸氢钠(33.0毫摩)加入3.59克二叔丁基碳酸氢盐(di-tert-butyldicarbonate)(16.4毫摩)，用浴式超声波仪混合5小时。过滤之后，该溶液真空浓缩，残余物用20毫升己烷研碎，过滤后制得2.92克t-BOC保护的1，5-EDANS褐色固体。
实施例4：t-BOC保护的1，5-EDANS叠氮
向10毫升去离子水中加入1.55克(4.0毫摩)t-BOC保护的1，5-EDANS(实施例3中制备)。当所有固体溶解之后，加入2.7毫升(4.1毫摩)40％的氢氧化四丁基铵溶液。该混合物用氯仿萃取，用无水硫酸镁干燥，真空浓缩形成结晶泡沫。向溶解于100毫升氯仿的这种泡沫中加入120微升二甲基甲酰胺和4毫升亚硫酰二氯。回流3.5小时之后，将该溶液倒入20克冰水和10毫升饱和氯化铵溶液中。所得的溶液快速地萃取入氯仿，用无水硫酸镁干燥，真空浓缩制得2.67克粗制t-BOC保护的氯化1，5-EDANS深黄色油状物，该产物不经进一步纯化直接使用。
在5分钟内向溶解于22毫升二甲基甲酰胺的所述黄色油状物中滴加由0.38克(5.8毫摩)叠氮化钠和1毫升去离子水制成的溶液。在室温搅拌21.5小时之后，该溶液在真空中浓缩，用50毫升氯仿萃取，用去离子水洗涤，用无水硫酸镁干燥，真空浓缩制得0.68克(43％)t-BOC保护的1，5-EDANS叠氮。
实施例5：1，5-EDANS叠氮
在0℃下，在5分钟内向溶于10毫升二氯甲烷的0.2克(0.51毫摩)t-BOC保护的1，5-EDANS叠氮(在实施例4中制备)滴加溶于1毫升二氯甲烷的65微升三氟乙酸。所述搅拌的溶液升温至室温，处于此温度下16小时，然后回流处理1小时。该溶液用40毫升二氯甲烷稀释，用10毫升饱和碳酸氢钠溶液洗涤四次，真空浓缩制得0.16克1，5-EDANS叠氮黄色油状物。
实施例6
向溶于2毫升氯仿的12毫克(0.04毫摩)1，5-EDANS叠氮(实施例5中制备)和13毫克(0.02毫摩)2，4-二[N-(ζ-羧己基)-1，3，3-三甲基-2-二氢亚吲哚基-甲基]cylclobetenediylium-1，3-diolate(实施例2中制备)加入18毫克(0.09毫摩)二环己基碳二亚胺和3.5毫克1-羟基苯并三唑。搅拌15小时之后，对溶液进行过滤，滤液真空浓缩生成蓝色残余物，该残余物不经进一步纯化直接使用。
实施例7：耐有机性的微球体
使用Chandler等人在美国专利第6,514,295号、第6,599,331号和第6,632,526号中所述的步骤，用实施例6制得的蓝色残余物对羧酸酯化的、交联的聚苯乙烯微球体(直径5.6微米，可购自英国，Shropshire的Polymer Laboratories，Ltd.，或者美国印第安纳州，Fishers的Bangs Laboratories，Inc.)进行浸渍，所述专利文献都全文参考结合入本文中。
将染色的微球体在甲醇中的分散液置于5毫升的锥形烧瓶中，真空浓缩。这些微球体在氮气气氛下，在110℃的油浴中加热13小时。所述微球体用四氢呋喃清洗三次，用甲醇清洗一次，用去离子水清洗一次。洗涤溶剂通过离心和倾滗除去。最后将微球体分散在去离子水中用于储存和测试。
图2显示了一种可使用本文所述的染色的微球体进行试验的测量系统的例子。应注意图2不是按比例绘制的。具体来说，图中一些部分的比例极度放大了，以便着重显示这些部分的特征。为了清楚显示，图中不包括该测量系统的一些部分，例如数字信号处理器(DSP)。
在图2中，沿着有微球体10流经的比色管12的横截面的平面显示了测量系统。微球体10是根据本发明所述的实施方式染色的微球体。在一个例子中，所述比色管可以是标准的石英比色管，例如标准的流动式细胞计中所用的比色管。但是也可使用任意其它合适种类的观察室或输送室来输送用于分析的样品。
所述测量系统包括光源14。光源14可包括本领域中已知的任意合适的光源，例如激光器。所述光源可以设计成用来发生具有一种或多种波长的光，例如蓝光或绿光。光源14可以设计成当微球体流过比色管的时候对微球体进行辐照。辐照可造成微球体发射具有一种或多种波长或者一个或多个波长带的荧光。在一些实施方式中，所述系统可包括一个或多个透镜(图中未显示)，用来将光线从光源汇聚到微球体上或流动路径上。所述系统还可包括一个以上的光源(未显示)。在一个实施方式中，光源可以设计成用具有不同波长的光(例如蓝光和绿光)对微球体进行辐照。在一些实施方式中，所述光源可以设计成从不同的方向对微球体进行辐照。
可以使用折叠式反射镜18或其它的这样的光导向部件，将从微球体向前散射的光导向检测系统。或者可以将检测系统16直接置于向前散射的光的光路中。通过这种方式，系统中可不包括折叠式反射镜或其它的光导向部件。在一个实施方式中，如图2所示，所述向前散射的光可以是沿着与光源14的辐照方向呈大约180度角被微球体散射的光。所述向前散射的光的角度可以并不是与光源辐照方向精确地呈180度角，因此光源发出的入射光不会照射在该检测系统的光敏性表面上。例如，所述向前散射的光可以是沿着与辐照方向呈小于或大于180度角的方向被微球体散射的光(例如在大约170°、175°、185°或190°散射的光)。
也可收集微球体散射和/或发射的与辐照方向呈大约90°夹角的光。在一个实施方式中，可使用一个或多个分光器或二色镜将散射光分成一束以上的光。例如，可以使用分光器20将与辐照方向呈大约90°夹角的散射光分成两束不同的光。这两束不同的光可以再一次通过分光器22和24分成四束不同的光。每束光可以导向不同的检测系统，所述检测系统可包括一种或多种检测器。例如，可将四束光中的一束导向检测系统26。检测系统26可用来检测微球体散射的光。
可将另外的三束光导向检测系统28、30和32。检测系统28、30和32可以用来检测微球体发射的荧光。各检测系统可用来检测具有不同波长或者不同波长范围的荧光。例如其中一个检测系统可用来检测绿色荧光。另一个检测系统可用来检测橙黄色荧光，其它的检测系统可用来检测红色荧光。
在一些实施方式中，可将滤光器34、36和38分别与检测系统28、30和32偶联。所述滤光器可用来阻挡检测系统能检测的波长范围以外的荧光。另外，可以将一个或多个透镜(未显示)与各检测系统光学偶联。这些透镜可设计用来将散射光或发射的荧光汇聚在检测器的光敏性表面上。
所述检测器的输出电流与照射在其上的荧光成比例，产生电流脉冲。所述电流脉冲可以转化为电压脉冲，低通滤波，然后用A/D转化器数字化。DSP对脉冲下的面积取积分，提供表示荧光大小的数值。
在一些实施方式中，可以对微球体发射的荧光产生的输出信号进行处理，以确定微球体的种类和微球体表面上发生的反应的信息。例如可以使用两种输出信号确定微球体的种类，用另外的输出信号确定在微球体表面上发生的反应。
尽管图2所示的系统包括两个检测系统，这两个检测系统具有两种不同的检测范围，用来区分具有不同染料特征的微球体，但是应当理解所述系统可包括两种以上的这样的检测范围(即三种检测范围、四种检测范围等)。在这样的实施方式中，所述系统可包括另外的分光器和具有其它检测范围的另外的检测系统。另外，可以将滤光器和/或透镜与各个另外的检测系统偶联。
在另一实施方式中，所述系统可包括两个或更多个检测系统，用来区分在微球体表面上反应的不同材料。所述不同的反应材料的染料特征优选不同于微球体的染料特征。
可用于在本文所述的染色的微球体上进行测量的测量系统的其它例子可参见以下专利文献：Chandler等人的美国专利第5,981,180号、第6,046,807号、第6,139,800号、第6,366,354 B1号、第6,411,904 B1号、第6,449,562 B1号和第6,524,793 B1号，这些专利都全文参考结合入本文中。本文所述的测量系统还可如这些专利所述进行进一步设置。另外，可使用本文所述的染色的微球体和微球体群实施方式的检验和试验包括这些专利中所述的任意检验和试验，以及本领域中已知的任意检验和试验。
通过本文，本领域技术人员应当理解，本发明可以提供用来形成染色的微球体和染色的微球体群的方法。通过该描述，对本发明的各方面的进一步修改和各种实施方式对本领域技术人员将是显而易见的。因此，这些描述仅仅是说明性的，用来为本领域技术人员揭示实施本发明的一般方式。应当理解，本文中附图和描述所示的本发明的形式表示优选的实施方式。可以对本文所列举和描述的组成和材料进行替代，可以对部件和工艺进行颠倒，本发明的某些特征可以独立地应用，通过阅读本发明，所有这些对本领域技术人员将是显而易见的。可以在不背离所附权利要求书所限定的本发明精神和范围的前提下对本文所述的部分进行改变。
 权利要求书
(按照条约第19条的修改)
1.用来形成染色的微球体的方法，该方法包括在微球体存在条件下，通过加热或光照使与染料偶联的化学结构活化，形成反应中间体，所述反应中间体与所述微球体内的聚合物共价连接，从而使所述染料与聚合物偶联，形成染色的微球体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化包括将所述与染料偶联的化学结构加热至大约110℃。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化包括将所述与染料偶联的化学结构加热至大约50-80℃。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化包括将所述与染料偶联的化学结构加热至低于所述聚合物的玻璃化转变温度的温度。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在进行所述活化之前和之后，所述微球体的形状基本相同。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在进行所述活化之前和之后，所述染料具有基本相同的结构和组成。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当将所述染色的微球体置于有机溶剂中的时候，所述化学结构和染料不会从聚合物上解离。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚合物主要由与二乙烯基苯交联的聚苯乙烯组成。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述染色的微球体包含一种或多种与聚合物相连的官能团，使得一种或多种分子可以通过所述一种或多种官能团与染色的微球体连接。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述化学结构包含芳族磺酰叠氮。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述化学结构包含1，5-乙基二氨基萘磺酰叠氮。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应中间体包含磺酰氮宾基团。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应中间体包含卡宾基团或三重态二苯甲酮。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应中间体包含处于以下状态的官能团：该官能团被所述化学结构的非活化部分将其与所述染料分隔开。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应中间体包含位于所述化学结构非活化部分一侧上的官能团，所述染料位于所述非活化部分上基本上与前述一侧相对的另一侧。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括在微球体存在条件下通过加热或光照对与另外的不同染料偶联的另外的化学结构进行活化，形成不同的反应中间体，使得所述不同的反应中间体与所述微球体的聚合物共价连接，从而使所述另外的不同染料与所述聚合物偶联。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，在进行所述活化之前和之后，所述另外的不同染料具有基本相同的结构和组成。
18.一种用来形成与分子偶联的染色的微球体的方法，该方法包括：
在微球体存在条件下通过加热或光照使与染料偶联的化学结构活化，形成反应中间体，所述反应中间体与所述微球体内的聚合物共价连接，从而使所述染料与聚合物偶联，形成染色的微球体；
在所述染色的微球体的外表面上合成所述分子。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述合成包括将所述染色的微球体置于有机溶剂中。
20.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述合成包括将所述染色的微球体置于有机溶剂中，在所述合成之前和之后，所述染色的微球体的染料特征基本相同。
21.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述分子包括生物分子。
22.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述分子包括寡核苷酸、肽或寡糖。
23.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述分子包括有机分子。
24.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述分子基本不溶于水性溶剂。
25.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述合成包括将所述染色的微球体置于水性溶剂中。
26.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述活化包括将所述与染料偶联的化学结构加热至约110℃。
27.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述活化包括将所述与染料偶联的化学结构加热至大约50-80℃。
28.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述活化包括将所述与染料偶联的化学结构加热至低于所述聚合物的玻璃化转变温度的温度。
29.如权利要求18所述的方法，其特征在于，在所述活化之前和之后，所述微球体的形状基本相同。
30.如权利要求18所述的方法，其特征在于，在所述活化之前和之后，所述染料具有基本相同的结构和组成。
31.如权利要求18所述的方法，其特征在于，当将所述染色的微球体置于有机溶剂中的时候，所述化学结构和染料不会从所述聚合物上解离。
32.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述聚合物主要由与二乙烯基苯交联的聚苯乙烯组成。
33.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述染色的微球体包含一种或多种与聚合物相连的官能团，使得所述分子可以通过所述一种或多种官能团在所述染色的微球体的外表面上合成。
34.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述化学结构包含芳族磺酰叠氮。
35.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述化学结构包含1，5-乙基-二氨基萘磺酰叠氮。
36.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述反应中间体包含磺酰氮宾基。
37.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述反应中间体包含卡宾基或三重态二苯甲酮。
38.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述反应中间体包含处于以下状态的官能团：该官能团被所述化学结构的非活化部分将其与染料隔开。
39.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述反应中间体包含位于所述化学结构的非活化部分一侧的官能团，所述染料位于所述非活化部分上基本与前述一侧相对的另一侧。
40.如权利要求18所述的方法，其特征在于，该方法还包括通过在微球体存在条件下，通过加热或光照使所述与另外的不同染料偶联的另外的化学结构活化，形成不同的反应中间体，所述不同的反应中间体与所述微球体的聚合物共价连接，从而使所述另外的不同染料与所述聚合物偶联。
41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，在所述活化之前和之后，所述另外的不同染料的结构和组成基本相同。
42.染色的微球体的群，其特征在于，所述群中各染色的微球体包含通过化学结构与所述各染色的微球体内的聚合物连接的染料，所述染色的微球体群由于染料造成的染料特征的变化系数约小于10％。
43.如权利要求42所述的群，其特征在于，所述变化系数是指各染色的微球体在被激发的时候发射的信号的变化系数。
44.如权利要求42所述的群，其特征在于，与所述各染色的微球体的聚合物相连的染料的量基本相等。
45.如权利要求42所述的群，其特征在于，所述群的各染色的微球体还包含通过另外的化学结构与所述各染色的微球体的聚合物相连的另外的不同染料。
46.如权利要求45所述的群，其特征在于，所述染色的微球体群由于所述另外的不同染料造成的染料特征的变化系数约小于10％。
47.如权利要求42所述的群，其特征在于，所述群中的各染色的微球体还包含在所述各染色的微球体的外表面上合成的生物分子。
48.如权利要求42所述的群，其特征在于，所述群中的各染色的微球体还包含在所述各染色的微球体的外表面上合成的有机分子。
49.如权利要求42所述的群，其特征在于，在所述染料与所述聚合物连接之前和之后，所述各染色的微球体的形状基本相同。
50.如权利要求42所述的群，其特征在于，在所述染料与所述聚合物连接之前或之后，该染料的结构和组成基本相同。
51.如权利要求42所述的群，其特征在于，当将所述染色的微球体群置于有机溶剂中的时候，所述化学结构和染料不会从所述聚合物上解离。
52.如权利要求42所述的群，其特征在于，所述聚合物主要由与二乙烯基苯交联的苯乙烯组成。
53.如权利要求42所述的群，其特征在于，所述各染色的微球体还包含一种或多种与该染色的微球体的聚合物相连的官能团，使得一种或多种分子可以通过这一种或多种官能团与所述各染色的微球体相连。
54.如权利要求42所述的群，其特征在于，所述化学结构包含芳族磺酰叠氮。
55.如权利要求42所述的群，其特征在于，所述化学结构包含1，5-乙基-二氨基-萘磺叠氮。

Claims (55)

1.用来形成染色的微球体的方法，该方法包括在微球体存在条件下，通过加热或光照使与染料偶联的化学结构活化，形成反应中间体，所述反应中间体与所述微球体的聚合物共价连接，从而使所述染料与聚合物偶联，形成染色的微球体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化包括将所述与染料偶联的化学结构加热至大约110℃。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化包括将所述与染料偶联的化学结构加热至大约50-80℃。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化包括将所述与染料偶联的化学结构加热至低于所述聚合物的玻璃化转变温度的温度。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在进行所述活化之前和之后，所述微球体的形状基本相同。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在进行所述活化之前和之后，所述染料具有基本相同的结构和组成。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当将所述染色的微球体置于有机溶剂中的时候，所述化学结构和染料不会从聚合物上解离。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚合物主要由与二乙烯基苯交联的聚苯乙烯组成。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述染色的微球体包含一种或多种与聚合物相连的官能团，使得一种或多种分子可以通过所述一种或多种官能团与染色的微球体连接。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述化学结构包含芳族磺酰叠氮。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述化学结构包含1，5-乙基二氨基萘磺酰叠氮。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应中间体包含磺酰氮宾基团。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应中间体包含卡宾基团或三重态二苯甲酮。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应中间体包含处于以下状态的官能团：该官能团被所述化学结构的非活化部分将其与所述染料分隔开。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应中间体包含位于所述化学结构非活化部分一侧上的官能团，所述染料位于所述非活化部分上基本上与前述一侧相对的另一侧。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括在微球体存在条件下通过加热或光照对与另外的不同染料偶联的另外的化学结构进行活化，形成不同的反应中间体，使得所述不同的反应中间体与所述微球体的聚合物共价连接，从而使所述另外的不同染料与所述聚合物偶联。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，在进行所述活化之前和之后，所述另外的不同染料具有基本相同的结构和组成。
18.一种用来形成与分子偶联的染色的微球体的方法，该方法包括：
在微球体存在条件下通过加热或光照使与染料偶联的化学结构活化，形成反应中间体，所述反应中间体与所述微球体的聚合物共价连接，从而使所述染料与聚合物偶联，形成染色的微球体；
在所述染色的微球体的外表面上合成所述分子。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述合成包括将所述染色的微球体置于有机溶剂中。
20.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述合成包括将所述染色的微球体置于有机溶剂中，在所述合成之前和之后，所述染色的微球体的染料特征基本相同。
21.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述分子包括生物分子。
22.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述分子包括寡核苷酸、肽或寡糖。
23.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述分子包括有机分子。
24.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述分子基本不溶于水性溶剂。
25.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述合成包括将所述染色的微球体置于水性溶剂中。
26.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述活化包括将所述与染料偶联的化学结构加热至约110℃。
27.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述活化包括将所述与染料偶联的化学结构加热至大约50-80℃。
28.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述活化包括将所述与染料偶联的化学结构加热至低于所述聚合物的玻璃化转变温度的温度。
29.如权利要求18所述的方法，其特征在于，在所述活化之前和之后，所述微球体的形状基本相同。
30.如权利要求18所述的方法，其特征在于，在所述活化之前和之后，所述染料具有基本相同的结构和组成。
31.如权利要求18所述的方法，其特征在于，当将所述染色的微球体置于有机溶剂中的时候，所述化学结构和染料不会从所述聚合物上解离。
32.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述聚合物主要由与二乙烯基苯交联的聚苯乙烯组成。
33.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述染色的微球体包含一种或多种与聚合物相连的官能团，使得所述分子可以通过所述一种或多种官能团在所述染色的微球体的外表面上合成。
34.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述化学结构包含芳族磺酰叠氮。
35.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述化学结构包含1，5-乙基-二氨基萘磺酰叠氮。
36.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述反应中间体包含磺酰氮宾基。
37.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述反应中间体包含卡宾基或三重态二苯甲酮。
38.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述反应中间体包含处于以下状态的官能团：该官能团被所述化学结构的非活化部分将其与染料隔开。
39.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述反应中间体包含位于所述化学结构的非活化部分一侧的官能团，所述染料位于所述非活化部分上基本与前述一侧相对的另一侧。
40.如权利要求18所述的方法，其特征在于，该方法还包括通过在微球体存在条件下，通过加热或光照使所述与另外的不同染料偶联的另外的化学结构活化，形成不同的反应中间体，所述不同的反应中间体与所述微球体的聚合物共价连接，从而使所述另外的不同染料与所述聚合物偶联。
41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，在所述活化之前和之后，所述另外的不同染料的结构和组成基本相同。
42.染色的微球体的群，其特征在于，所述群中各染色的微球体包含通过化学结构与所述各染色的微球体的聚合物连接的染料，所述染色的微球体群由于染料造成的染料特征的变化系数约小于10％。
43.如权利要求42所述的群，其特征在于，所述变化系数是指各染色的微球体在被激发的时候发射的信号的变化系数。
44.如权利要求42所述的群，其特征在于，与所述各染色的微球体的聚合物相连的染料的量基本相等。
45.如权利要求42所述的群，其特征在于，所述群的各染色的微球体还包含通过另外的化学结构与所述各染色的微球体的聚合物相连的另外的不同染料。
46.如权利要求45所述的群，其特征在于，所述染色的微球体群由于所述另外的不同染料造成的染料特征的变化系数约小于10％。
47.如权利要求42所述的群，其特征在于，所述群中的各染色的微球体还包含在所述各染色的微球体的外表面上合成的生物分子。
48.如权利要求42所述的群，其特征在于，所述群中的各染色的微球体还包含在所述各染色的微球体的外表面上合成的有机分子。
49.如权利要求42所述的群，其特征在于，在所述染料与所述聚合物连接之前和之后，所述各染色的微球体的形状基本相同。
50.如权利要求42所述的群，其特征在于，在所述染料与所述聚合物连接之前或之后，该染料的结构和组成基本相同。
51.如权利要求42所述的群，其特征在于，当将所述染色的微球体群置于有机溶剂中的时候，所述化学结构和染料不会从所述聚合物上解离。
52.如权利要求42所述的群，其特征在于，所述聚合物主要由与二乙烯基苯交联的苯乙烯组成。
53.如权利要求42所述的群，其特征在于，所述各染色的微球体还包含一种或多种与该染色的微球体的聚合物相连的官能团，使得一种或多种分子可以通过这一种或多种官能团与所述各染色的微球体相连。
54.如权利要求42所述的群，其特征在于，所述化学结构包含芳族磺酰叠氮。
55.如权利要求42所述的群，其特征在于，所述化学结构包含1，5-乙基-二氨基-萘磺叠氮。
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