CN101076595A - 构建具有美伐他汀羟化能力的菌株的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于微生物制备普伐他汀的方法和组合物。本发明的组合物包括能够有效地使美伐他汀(ML－236B)羟化制备普伐他汀的微生物新菌株。特别是，本发明的微生物经过基因工程，表达细胞色素P－450和fdxshe或fdxshe－样蛋白。本发明还涉及这种微生物在设计用于制备普伐他汀的方法中的用途，普伐他汀用于治疗例如高胆固醇血症和高脂血症的疾病。

Description

构建具有美伐他汀羟化能力的菌株的方法
                    相关申请
本申请要求2004年12月3日提交的美国临时申请第60/633,011号的权益，所述临时申请通过引用结合到本文中。
                    发明领域
本发明涉及与编码P-450细胞色素及其活性所必需的基因有关的新蛋白质fdxshe或fdxshe-样蛋白。本发明涉及基于微生物制备普伐他汀的方法和组合物。本发明的组合物包括含该基因的载体、这种载体在表达系统中的应用和能够有效地使美伐他汀(ML-236B)羟化制备普伐他汀的微生物新菌株。特别是，本发明的微生物经过基因工程，表达细胞色素P-450和新发现的fdxshe或fdxshe-样蛋白两者。本发明还涉及这种微生物在设计用于制备普伐他汀的方法中的用途，普伐他汀用于治疗例如高胆固醇血症和高脂血症的疾病。
                    发明背景
普伐他汀是HMG-CoA还原酶(3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶)抑制剂，HMG-CoA还原酶是胆固醇生物合成的关键酶。该酶显著降低血浆胆固醇和脂质水平，因此在治疗高胆固醇血症和高脂血症中具有非常重要的药理学作用。[Serizawa等，J.Antibiot，36：887-891(1983)；Serizawa等，J.Antibiot，36：918-920(1983)；Serizawa等，J.Antibiot，36：604-607(1983)；Tsujita等，Biochim.Biophys.Acta，877：50-60(1986)；Arai等，Ann.Rep.Sankyo Res.Lab.，40：1-38(1988)；和Koga等，Biochim.Biophys.Acta，1045：115-120(1990)。]
通过ML-236B(美伐他汀)钠的微生物羟化作用获得普伐他汀，ML-236B(美伐他汀)是由丝状真菌桔青霉(Penicillium citrinum)制备的物质。许多不同属的真菌例如根毛霉属(Mucor Rhizopus)、共头霉属(Syncephalastrum)、小克银汉霉属(Cunninghamella)、被孢霉属(Mortierella)和细菌例如诺卡氏菌属(Nocardia)、马杜拉放线菌属(Actinomadura)和链霉菌属(Streptomyces)可以有不同程度的这种羟化作用，如各专利所述。[美国专利第5,179,013；4,448,979；4,346,227；4,537,859；6,566,120；6,750,366号；加拿大专利第1,150,170；1,186,647号；日本专利第58-10572号；和欧洲专利第0605230号]
所述羟化发生在ML-236B的6-位，由发现于嗜碳链霉菌(Streptomyces carbophilus)的细胞色素P-450sca单加氧酶系统催化[Matsuoka等，Eur.J.Biochem，184：707-713(1989)；和Serizawa等，Biochimica et Biophysica Acta，1084：35-40(1991)]。细胞色素P-450sca的特征在于存在三种形式：P-450sca-1、P-450sca-2和P-450sca-3，根据美国专利第5,179,013号，其适用于羟化方法。
Serizawa等从嗜碳链霉菌(Streptomyces carbophilus)克隆编码P-450sca-2的DNA[日本专利特许公开第6-70780号；和Watanabe等，Gene，163：81-85(1995)]。该基因具有1233bp的可读框，编码410个氨基酸的蛋白质[Watanabe等，Gene，163：81-85(1995)]。将2.8kbDNA插入片段连同P-450sca-2基因的5′-非编码区的1kbp部分一起克隆到多拷贝质粒pIJ702内，用于转化浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)TK21。已转化的浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)TK21甚至比嗜碳链霉菌(S.carbophilus)更快地将ML-236B转化成普伐他汀。见Watanabe，I.等，Gene，163：81-85(1995)。
Watanabe等公开：P-450sca的表达经过底物诱导转录，即发现ML-236B和苯巴比妥提高P-450的表达高达30倍。这已由RNA印迹法确定，在没有ML-236B存在时没发现转录，但是当有ML-236B存在时发现三种转录物。当底物存在时，经过6小时的时间转录水平增加到最大比率。公布了5′区域的DNA序列，所述DNA序列编码调节蛋白样蛋白和启动子序列[Watanabe等，Gene 210：109-116(1998)]。
在嗜碳链霉菌(Streptomyces carbophilus)中编码细胞色素P-450sca-2的基因的1kbp长的5′-非编码区域具有转录启动子的活性，该活性可由底物诱导。当1kbp区域被缩短时，所述转录启动子在适当的表达系统内，不必诱导就允许蛋白质的显著表达。[美国专利第5,830,695号]
Serizawa和Matsuoka从嗜碳链霉菌(S.carbophilus)纯化了NADH-细胞色素-P-450-还原酶。他们用已纯化的P-450sca蛋白质，来证明在纯化的黄素蛋白(NADH-细胞色素-P-450-还原酶)、NADH和O2存在时的体外羟化活性。他们公开：P-450sca和NADH-细胞色素-P-450还原酶重建了体外的羟化活性，并没获得在嗜碳链霉菌(S.carbophilus)中存在铁硫蛋白的任何证据。基于这些发现，Serizawa和Matsuoka将P-450sca细胞色素系统归类为双组分系统，类似于在不需要铁硫蛋白的真核生物微粒体细胞色素系统中所发现的那些系统。[Serizawa和Matsuoka，Biochem et Biophysica Acta，1084：35-40(1991)]
本发明基于以下发现：编码fdxshe或fdxshe-样蛋白的基因位于细胞色素P-450基因的下游，为P-450sca细胞色素的功能所必需。因此，与Serizawa和Matsuoka提出的双组分系统不同，P-450sca细胞色素系统为三组分系统，如图4所描述。
                    发明概述
本发明的目的是提供有效和有效率的将美伐他汀转化为普伐他汀的方法。
本发明的另一目的是使用细胞色素P-450和铁氧化还原蛋白或铁氧化还原蛋白-样蛋白的共表达，将美伐他汀转化为普伐他汀。
本发明包括能使美伐他汀(ML-236B)羟化的新微生物，并因此制备普伐他汀。本发明的微生物经过基因工程，表达细胞色素P-450和铁氧化还原蛋白或铁氧化还原蛋白-样蛋白。本发明基于以下发现：细胞色素P-450与铁氧化还原蛋白或铁氧化还原蛋白-样蛋白一起共表达，导致普伐他汀的制备。
本发明还包括构建具有美伐他汀羟化能力的基因修饰微生物的方法，所述方法包括用一种或多种质粒构建体转化宿主细胞，所述质粒构建体包含启动子和编码细胞色素P-450和铁氧化还原蛋白或铁氧化还原蛋白-样蛋白的核酸序列。
本发明的另一实施方案包括利用本领域已知的发酵技术制备普伐他汀的方法，所述方法包括在其中表达细胞色素P-450和铁氧化还原蛋白或铁氧化还原蛋白-样蛋白，导致ML-236B催化转化成普伐他汀的条件下，在含ML-236B的培养基中培养本发明的基因修饰微生物。
在本发明的还另一方面，所述方法可还包括从培养培养基中回收普伐他汀，和普伐他汀在胆固醇生物合成相关疾病例如高胆固醇血症和高脂血症治疗中的用途。
本发明也包括编码fdxshe的新核酸分子。
本发明也包括含所述核酸分子的载体。
本发明也包括由fdxshe编码的新蛋白质及其用所述载体制备的方法。
根据以下说明书，将更好地理解本发明的上述和其它目的、特征和优势。
                    附图简述
图1举例说明fdxshe(SEQ.ID.NO.1)的核酸和氨基酸序列。
图2举例说明普伐他汀和美伐他汀的定量测定：柱状图表示由包含不同质粒构建体的浅青紫链霉菌(S.lividans)菌株或由淡蜡黄链霉菌(S.helvaticus)温育过夜后，美伐他汀(美伐他汀-OH)的残留溶解形式和产生的普伐他汀。
图3举例说明有和无pWHM-cytP450she-fdxshe质粒的淡蜡黄链霉菌(S.helvaticus)菌落的普伐他汀产率。
图4举例说明没有铁氧化还原蛋白的美伐他汀羟化的双组分模型，和有铁氧化还原蛋白的本发明美伐他汀羟化的新三组分模型。
                    发明详述
本文描述了以下发现：细胞色素P-450和铁氧化还原蛋白或铁氧化还原蛋白-样蛋白在基因工程微生物中共表达，导致ML-236B(美伐他汀)羟化，形成普伐他汀。详述如下的本发明涉及这样的微生物，及其在制备用于治疗胆固醇生物合成相关疾病的普伐他汀中的用途。这些疾病包括但不限于高胆固醇血症或高脂血症。
如本文使用，铁氧化还原蛋白或铁氧化还原蛋白-样蛋白是淡蜡黄链霉菌(Streptomyces helvaticus)的fdxshe基因。发现核酸分子对应于188碱基对序列[见SEQ ID NO：1，图1]，位于细胞色素P-450可读框的下游。
如本文使用，ML-236B包括ML-236及其盐。在优选的实施方案中，ML-236是ML-236钠。如本文使用，普伐他汀指的是普伐他汀及其盐。在优选的实施方案中，普伐他汀是普伐他汀钠。
优选，通过提供以下的物质提供ML-236B(美伐他汀)：例如产美伐他汀的微生物，例如真菌或细菌；或产美伐他汀微生物的无细胞提取物；或来自产美伐他汀微生物预生长培养物的无细胞培养基；或含美伐他汀的溶液；或半纯化的美伐他汀；或基本上纯化的美伐他汀或其盐。在一定的条件下进行培养，其中表达细胞色素P-450和铁氧化还原蛋白或铁氧化还原蛋白-样蛋白，因此通过细胞色素P-450的催化作用，允许ML-236B转化成普伐他汀，然后从培养物中回收普伐他汀。
本发明包括用一种或多种能编码细胞色素P-450和铁氧化还原蛋白或铁氧化还原蛋白-样蛋白的表达载体转化的微生物。用于实施本发明的表达载体的选择将取决于被转化微生物的类型。例如，复制所需的表达载体序列、转录调节、翻译控制等与转化所选的微生物相容是必要的。细菌表达载体包括但不限于那些基于噬菌体DNA或质粒DNA的载体，和包括那些适合转化原核生物如放线菌、大肠埃希杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(仅列举几个)的载体。在本发明的优选实施方案中，使用与放线菌相容的表达载体例如质粒pWHM-3。
尽管本发明的表达载体不需要有比那些在给定宿主中表达必需的载体更进一步的特征，但应认识到固定选择标准可能是有用的。这样的标准包括质粒赋予宿主此类特性如表达和转化的选择性以便修饰表型的那些标准。适当的选择性标记(即赋予宿主特别表型的那些标记)包括抗药性标记基因，例如赋予硫链丝菌素(thiostreptone)、氨苄西林、四环素或氯霉素抗性的那些基因；然而，应认识到可以使用许多其它的选择性标记。
可使用本领域技术人员熟知的方法，来构建含细胞色素P-450编码序列、和/或铁氧化还原蛋白或铁氧化还原蛋白-样蛋白编码序列以及适当的转录和翻译控制序列的表达载体。为了构建所述表达载体，将包含编码细胞色素P-450和铁氧化还原蛋白或铁氧化还原蛋白-样蛋白的核酸的DNA片段，与适当的转录和翻译控制序列一起插入表达载体中。这样的转录控制序列包括例如启动子序列。这样的翻译控制序列包括例如核糖体结合序列。在本发明的实施方案中，将细胞色素P-450和/或编码序列以及铁氧化还原蛋白或铁氧化还原蛋白-样蛋白编码序列插入单一载体中。或者，可将编码序列插入分开的载体中，然后将这些载体共转化到宿主细胞内。可用本领域通常已知的重组DNA技术方法，将核酸分子克隆到表达载体内，并于Ausubel等(编辑)，1993，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，纽约；和Kriegler，1990，Gene Transfer and Expression，ALaboratory Manual，Stockton Press，纽约中描述。
关于编码细胞色素P-450的序列，可以用本领域技术人员已知的各种不同方法，从各种不同的微生物得到此类序列。例如，可以用标记的细胞色素P-450探针筛选基因组DNA库。对于杂交条件方面的指导建议见：例如Ausubel等，同上。此外，通过用两个寡核苷酸引物进行PCR，可得到细胞色素P-450核酸序列，在本文公开的已知细胞色素P-450核苷酸序列基础上设计所述引物。在本发明优选的实施方案中，从菌株中分离细胞色素P-450编码序列，所述菌株不能与放线菌(actinomycete)清楚地区分，优选不能与链霉菌属(Streptomyces)清楚区分的菌株，更优选不能与嗜碳链霉菌(S.carbophilus)或淡蜡黄链霉菌(S.helvaticus)清楚区分的菌株。见Watanabe等，Gene，163：81-85(1995)。
关于铁氧化还原蛋白或铁氧化还原蛋白样蛋白编码序列，也可以使用上述分离细胞色素P-450编码序列的方法，从各种不同的微生物得到此类序列。已知几种形式的铁氧化还原蛋白，诸如浅灰链霉菌(S.griseolus)的3Fe-4S、纳塔尔链霉菌(S.natalensis)的PimF蛋白和淀粉酶链霉菌(S.diastaticus)的RimH蛋白，可用于表达载体的构建。另外，下述新铁氧化还原蛋白或铁氧化还原蛋白样蛋白编码序列可用于表达载体的构建。
本发明提供得自淡蜡黄链霉菌(S.helvaticus)的新铁氧化还原蛋白基因。所述新基因已经过鉴定，从淡蜡黄链霉菌(S.helvaticus)的细胞色素P-450基因下游克隆，称为fdxshe。本发明的克隆fdxshe基因长188bp，与浅灰链霉菌(S.griseolus SauC)的铁氧化还原蛋白具有超过80％的同源性，与纳塔尔链霉菌(S.natalensis)的铁氧化还原蛋白(PimF)或淀粉酶链霉菌(S.diastaticus)的铁氧化还原蛋白(RimH)具有超过70％的同源性。Fdxshe的核苷酸序列及其推定的氨基酸序列见图1所示。本发明的fdxshe核苷酸序列包括：(a)图1所示的DNA序列；(b)编码图1所示氨基酸序列的核苷酸序列；(c)(i)在严格的条件下，与(a)或(b)所述核苷酸序列杂交的任何核苷酸序列，例如，在0.5MNaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM EDTA中，在65℃和滤膜结合的DNA杂交，用0.1X SSC/0.1％SDS在68℃洗涤(Ausubel F.M.等编著，1989，Current Protocols in Molecular Biology，Vol I GreenPublishing Associates，Inc.和John Wiley & sons Inc.，纽约，p2.10.3)和(ii)编码功能等同的基因产物的任何核苷酸序列。
本发明也包括可以编码或起fdxshe反义分子作用的核酸分子，所述反义分子用于例如fdxshe基因调节(在fdxshe基因核酸序列的扩增反应中，用于和/或作为反义引物)。本发明也包括编码突变fdxshe的核苷酸序列、fdxshe的肽片段、截短的fdxshe和fdxshe融合蛋白。
本发明也包括(a)DNA载体，所述DNA载体包含任何前述fdxshe序列和/或它们的补体(例如反义RNAi)；(b)DNA表达载体，所述DNA表达载体包含任何前述与调节元件一起操作的fdxshe序列，而所述调节元件引导fdxshe编码序列的表达；和(c)基因工程的宿主细胞，所述宿主细胞包含任何前述与调节元件一起操作的fdxshe序列，而所述调节元件在宿主细胞内引导fdxshe编码序列的表达。如本文使用，调节元件包括但不限于可诱导和不可诱导的启动子、操纵基因和本领域技术人员已知的驱动和调节基因表达的其它元件。
图1显示fdxshe蛋白推定的氨基酸序列。本发明的fdxshe氨基酸序列包括图1显示的氨基酸序列。本发明也包括与图1描述的核苷酸序列编码的fdxshe功能等同的蛋白质，如通过许多标准中的任一标准来判断，包括但不限于与细胞色素P-450联合催化将ML-236B转化成普伐他汀的能力。此类功能等同的fdxshe蛋白包括但不限于以下的蛋白质：在由上述fdxshe核苷酸序列编码的氨基酸序列内，具有增加或替代的氨基酸残基，但这导致沉默的变化，因而产生功能等同的基因产物。
可通过本领域已知的任何调节启动子，调节编码细胞色素P-450和铁氧化还原蛋白或铁氧化还原蛋白样蛋白的序列的表达，以便在特别微生物的选择方面发挥功能。此类启动子可被诱导或构建。一般优选使用具有显著较高活性的启动子，而不使用较低活性的启动子，以便可获得最大的转录。此类启动子包括但不限于lac、tac、cat、xyl、ptipA、tsr或pkg启动子。
在本发明的实施方案中，可使用位于紧靠近放线菌(actinomycete)，优选链霉菌属(Streptomyces)，更优选嗜碳链霉菌(S.carbophilus)或淡蜡黄链霉菌(S.helvaticus)的细胞色素P-450 ORF并与其结合的启动子。5′区域和靠近P-450 ORF的约1千碱基不必包含该基因的整个启动子区域，根据美国专利第5,830,695号(“′695专利”)，启动子区域的DNA可大大地短于约1Kb，优选大于约160bp，更优选大于约300bp。本发明的启动子可以和所期望一样多地不同于原始5′启动子，条件是所得到的启动子还显示必要的启动子活性。′695专利通过引用结合到本文中，其中公开了各种大小的启动子，此类启动子可以用于表达细胞色素P-450和/或铁氧化还原蛋白或铁氧化还原蛋白样蛋白。
另外，下列方法可用于鉴定具有插入本发明的表达载体的启动子活性的DNA序列。为了鉴定或测试DNA序列的转录启动子活性：(i)构建重组表达载体，其中将编码适当蛋白质的DNA和推定的启动子DNA有效连接，插入适当的载体内，例如放线菌质粒pIJ702或pWHM-3[Katz，E.等，(1983)，J.Gen.Microbiol，129，2703-2714]，然后(ii)当使用载体pIJ702或pWHM-3时，用该载体转化允许载体稳定复制的适当的宿主细胞，例如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)。
当转化体是例如链霉菌(streptomycete)时，可按照Hopwood等，[参见Hopwood，D.A.等，(1985)，″Genetic Manipulation of Streptomyces：A Laboratory Manual″，The John Innes Foundation，Norwich，UK]进行转化。应认识到在转化前，用于测定启动子活性的基因通常不应该在宿主中存在或表达。
例如，可通过RNA印迹法或RNA-PCR容易地确定转录水平[Polymerase Chain Reaction，参见Innis，M.A.等，(1990)，″PCRPROTOCOLS″，Academic Press，纽约]。可通过测定所制备蛋白质的生理活性，确定产物的表达水平。因此，可制备例如重组DNA载体，其中编码具有给定活性的蛋白质如酶的DNA，例如通过连接作用有效连接至推定的启动子3′-端。然后可以适合表达产物的方式，测定连接到推定启动子的ORF的表达水平。
应认识到可建立对相关的产物具有特异性的测定表达产物的方法。例如，可将推定的启动子有效连接至耐药性基因，如氯霉素乙酰转移酶基因[参见Gorman，C.M.等，(1982)，Mol.Cell.Biol.，2，1044-1051]，或连接到荧光素酶基因[参见de Wet，J.R.等，(1987)，Mol.Cell.Biol.，7，725-7371]，这可用本领域熟知的方法检测。也可用通过表达产物的活性来测定表达的其它方法。
测量表达的另一种方法是例如通过使用适当的抗体识别产物。根据期望如何测定相互作用和根据抗体或抗原是否以任何方式标记，适当的测量技术包括放射免疫测定法[参见Berson，R.S.等，(1973)，″Methods in Investigative and Diagnostic Endocrinology″，Vol 2A、2B，North-Holland Publishing Co.，阿姆斯特丹]、酶免疫测定法[参见Engvall，E.，(1980)，Methods in Enzymology，70(A)，419-439]、蛋白质印迹法[参见Harlow，E.等，(1988)，″Antibodies-A LaboratoryManual″，p.471，Cold Spring Harbor Laboratory，纽约]和免疫沉淀法[参见Kessler，S.W.等，(1981)，″Methods in Enzymology″，73(B)，442-459]。无论如何，应认识到现在这些技术的讨论并非穷尽性的，对本领域的技术人员而言，其它方法是显而易见的。
在其中该表达载体编码细胞色素P-450和铁氧化还原蛋白或铁氧化还原蛋白样蛋白，和质粒与浅青紫链霉菌(S.lividans)相容的情况中，然后可将质粒引入不产生细胞色素P-450或铁氧化还原蛋白的浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)的菌株中，然后可在ML-236B存在下培养转化体。普伐他汀的产量然后指示由推定的启动子促进的细胞色素P-450和/或铁氧化还原蛋白和铁氧化还原蛋白-样启动子的表达水平。
一旦已经确定将用作本发明启动子的DNA具有作为启动子的必需活性，那末就可使用它构建用于表达细胞色素P-450和/或铁氧化还原蛋白或铁氧化还原蛋白样蛋白的表达载体。如前该，细胞色素P-450sca-2是优选的表达产物，适当的载体是pSCA1013-DELTA(1013/428)，该载体可从浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)TK-21中分离。
对于启动子序列，例如编码铁氧化还原蛋白或铁氧化还原蛋白样蛋白的序列即fdxshe，或者编码细胞色素P-450的序列的修饰一般可通过转化过程发生，或者如通过引入限制酶切位点而便利的进行。因此，本发明设想通过删除、翻转、插入和替换可发生变化的启动子、铁氧化还原蛋白或细胞色素P-450。优选，本发明的启动子、铁氧化还原蛋白和细胞色素P-450具有非常多的序列同源性，具有它们相关分子的有关部分。
对于本领域的技术人员而言，序列中的其它差异和变更及其实现方法是显而易见的，本发明设想所有这些。通过自然变异以外的方式变化的本发明的启动子、铁氧化还原蛋白和细胞色素P-450在本文中也称为突变体，因此设想突变体和变体，只要它们共同作用，导致产生能够将ML-236B(美伐他汀)羟化形成普伐他汀的微生物。
如需要，通过例如Maxam-Gilbert化学修饰法[Maxam，A.M.，和Gilbert，W.，(1980)，Methods in Enzymology，65，499-599]或使用M13噬菌体的双脱氧链终止法[Messing，J.和Vieira，J.，(1982)，Gene，19，269-276]，可测定任何克隆DNA的核苷酸序列。
此外，应认识到术语“表达产物”、“蛋白”和“多肽”一般可互换使用，并以这样的含义用于本文中。在某些情况中，从原始DNA翻译的多肽不是最终产物，而是最终产物的中间体形式，需要进行翻译后的修饰以获得所需的产物。在P-450sca-2的情况，需要将铁结合至蛋白质中的血红素环中，以产生最终表达产物。因此，尽管术语“表达产物”、“蛋白”和“多肽”在本文中作为同义词使用，但是在相关的上下文中，本领域的技术人员会认识到这些术语之间的差异。
在构建设计用于表达细胞色素P-450和铁氧化还原蛋白或铁氧化还原蛋白样蛋白的适当表达载体后，将所述载体转化入适当的宿主中。优选宿主包括放线菌和子囊菌(ascomycota)，然而也可利用其它原核生物和真核生物，例如大肠埃希杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。在本发明的具体实施方案中，转化浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)TK 21和桔青霉(Penicilliumcitrinum)。
用于放线菌的适当转化方法包括使用溶菌酶将放线菌培养物形成原生质球。为了将表达载体引入宿主细胞，例如通过使用Thompson或Hopwood的任一方法[参见Thompson，C.J.等，(1982)，J.Bacteriol.，151，668-677或Hopwood，D.A.等，(1985)，″Genetic Manipulation ofStreptomyces：A Laboratory Manual″，The John Innes Foundation，Norwich]，然后加入含重组DNA载体和聚乙二醇的缓冲液。在本发明的非限定性实施方案中，将硫链丝菌素-抗性基因用作表达载体质粒中的选择性标记[参见Hopwood，D.A.等，(1987)，″Methods inEnzymology″153，116，Academic Press，纽约]。
如果期望转化大肠杆菌(E.coli)，为了在本发明启动子的控制下表达产物，然后适当的一般方法是将有关的重组DNA载体加到感受态细胞中。一般在盐如氯化钙、氯化镁和氯化铷存在下制备感受态细胞[参见Hanahan，D.，(1983)，J.Mol.Biol.166，557-580]。替代方法包括电穿孔法，该电穿孔法涉及高压脉冲的使用，将高压脉冲施加至含宿主大肠杆菌(E.coli)和表达载体的悬浮液，因此导致将载体结合至细胞内[Electroporation：Dower，W.J.等，(1988)，Nucleic Acid Res.，16，6127和Calvin，N.M.等，(1988)，J.Bacteriol，170，2796]。
如果打算将枯草芽孢杆菌(B.subtilis)作为宿主细胞，那么适当的方法是用溶菌酶将宿主细胞制备成原生质球。然后将含重组DNA载体和聚乙二醇的缓冲液加到原生质球中，接着通过电穿孔法将载体结合至宿主细胞内(同上)[Cheng，S.等，(1979)，Mol.Gen.Genet.，168，111]。在优选的实施方案中，将抗药性标记如对氯霉素产生抗性的标记用作转化细胞系的选择性标记，但应认识到可使用许多其它的选择性标记。
不管宿主，使用本领域技术人员熟知的方法可培养期望的转化体，通过培养，在胞内或胞外或两者产生期望的多肽。培养所用的培养基可适当地选自通常用于有关宿主细胞的各种类型的培养基。一般而言，特定的宿主作为标准接受的那些培养条件也可用于期望多肽的表达，例如进行多肽的性质要求的任何修饰。另外，如果表达载体包含诱导型启动子，可能必需添加能够诱导克隆基因的表达的化合物。
所用的特定培养技术不是本发明的关键，通常用于培养的任何技术可同样的用于本发明。一般而言，选择使用的技术要考虑工业效率。用作可同化碳源的典型放线菌营养素包括用作碳源的葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘油、淀粉糖浆、糖蜜和大豆油。可同化氮源的实例包括大豆粉、小麦胚、肉提取物、蛋白胨、玉米浸液、干酵母和硫酸铵。除上述外，无机盐如氯化钠、氯化钾、碳酸钙或磷酸钙，和帮助微生物生长或促进期望多肽产生的添加剂在需要时也可适当地组合使用。
另一方面，一般适合所讨论宿主的培养技术也适用于已转化的微生物，包括例如适用于工业化制备的液体培养和深层培养的方法。除非其它通常禁忌或本文具体说明的，培养条件包括20℃-37℃，优选26℃-28℃的温度。在本发明启动子的控制下，一般在胞内或胞外，有时在两者产生表达产物，即细胞色素P-450和铁氧化还原蛋白或铁氧化还原蛋白样蛋白。
在本发明的还另一个实施方案中，可通过如本领域技术人员熟知的各种方法，特别是那些根据多肽的物理或化学性质的方法来分离、纯化和回收细胞色素P-450和铁氧化还原蛋白。在多肽被表面表达的情况，例如可通过离心培养基以去除细胞，从得到的上清液中分离、纯化和回收多肽。
为了分离和纯化聚集在胞内的细胞色素P-450和铁氧化还原蛋白，首先将细胞悬浮在含蛋白酶抑制剂的溶液中，然后使用如本领域技术人员通常已知的手段例如超声匀化器匀化。
虽然通常不需要阐明本发明，但应认识到分离、纯化和收集所期望多肽的具体方法的实例包括例如蛋白质沉淀法、超滤法、分子筛色谱法(凝胶过滤法)、吸附色谱法、离子交换色谱法、亲合色谱法、各种合适类型的液相色谱包括高效液相色谱(HPLC)法、透析法及其组合的技术。
无论如何，应认识到使用本发明，可容易地以高产率、高纯度工业化制备所期望的多肽。也应认识到，可以使用采用未纯化或部分纯化的制备样品，通过本发明的转化宿主细胞产生的细胞色素P-450和铁氧化还原蛋白或铁氧化还原蛋白样蛋白。例如，可按上述方法，从重组浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)得到细胞色素P-450和铁氧化还原蛋白或铁氧化还原蛋白样蛋白，并直接用于普伐他汀的制备。
采用Serizawa等[参见Serizawa，N.等，(1983)，J.Antibiotics，36，608]的方法，可回收由本发明的任一方法制备的普伐他汀。在具体的实施方案中，可以这样的方式使用浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)TK-21。
本发明还提供药物组合物，该组合物含用本发明的方法和组合物制备的普伐他汀或其片段和药学上可接受的载体。
如本文使用，载体包括在所用剂量和浓度下，对暴露于其中的细胞或哺乳动物无毒的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。生理上可接受的载体通常是pH缓冲水溶液。生理上可接受的载体的实例包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；包括抗坏血酸的抗氧化剂；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成盐的抗衡离子如钠；和/或非离子型表面活性剂如TWEEN、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS。
也可以将活性成分包埋在例如由界面聚合制备的微囊中，例如分别在胶体药物释放系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米囊)或在粗乳液中进行界面聚合制备的羟甲基纤维素或明胶-微囊和聚甲基丙烯酸甲酯微囊。用于体内给药的制剂必须是无菌的。这可通过无菌过滤膜过滤容易地实现。可以制备缓释制剂。缓释制剂合适的实例包括含抗体的固体疏水性聚合物半透性骨架，该骨架为成形制品的形式，例如膜或微囊。缓释骨架的实例包括：聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟基乙基-异丁烯酸酯)或聚乙烯醇)、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如LUPRON DEPOT(由乳酸-羟基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管聚合物如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸能够使分子释放持续超过100天，但是某些水凝胶仅使蛋白质释放持续较短的时间。
治疗表示对动物疾病的任何治疗，包括：(1)预防哺乳动物发生疾病，该哺乳动物可易患疾病但尚未发病或出现疾病症状；例如，预防临床症状的爆发；(2)抑制疾病，例如阻止疾病的发展；或(3)缓解疾病，例如引起疾病症状的消退。
在本发明的具体实施方案中，用本发明的方法和组合物制备的普伐他汀用于治疗与胆固醇生物合成相关的疾病。此类疾病包括但不限于高胆固醇血症和高脂血症。
疾病的治疗有效量表示：当给予有需要的哺乳动物时，足以实现疾病如上定义的治疗的量。
无论如何，应认识到使用本发明，可容易地以高产率和高纯度工业化制备所期望的普伐他汀。
已结合某些优选的实施方案描述了本发明，考虑本说明书后，对本领域的技术人员而言其它实施方案将是显而易见的。不具体限定的任何方法、制剂、溶液等见″Molecular Cloning--A LaboratoryHandbook″(同上)，该文献通过引用整体结合到本文中。通过结合下列详述本发明化合物制备的实施例来进一步定义本发明。对本领域的技术人员而言显而易见的是：可以实施材料和方法的许多修改，而没有偏离本发明的范围。
                    实施例
实施例1：比较实施例
该实施例举例说明：在无fdxshe或fdxshe-样基因的情况下，将细胞色素P450基因转化到浅青紫链霉菌(S.lividans)TK-21中，不足以诱导美伐他汀羟化成普伐他汀。
pWHM-CytP450she质粒的构建：
使用修饰酵母和革兰氏阳性菌的PUREGENE DNA分离试剂盒，从淡蜡黄链霉菌(S.helvaticus)中提取总DNA。根据Genbank序列：E06907和E13579，使用合成寡核苷酸引物5′TAT AAG CTT TGCGGT AGA CCG CCG CCT TTC 3′和5′TTT CTA GAC CAG GTG ACCGGG AGT TCG TTG3′，PCR扩增cytP450she基因。PCR片段由PCR混合物(V-基因PCR纯化试剂盒)纯化，并使用生产商(MBI Fermentas)推荐的缓冲液和酶，用HindIII和EcoRI限制性内切酶，在37℃消化2小时。
在1％w/v琼脂糖凝胶上，在含TAE溶液的水下-型(submarine-type)电泳槽中，100V下运行3小时，通过琼脂糖凝胶电泳分离消化反应的产物。从凝胶中切除含相关1.2kb片段的琼脂糖薄片，用V-基因DNA凝胶提取试剂盒从凝胶中提取DNA。将纯化和消化的PCR片段连接到PWHM-3(Vara等，1989)载体(用HindIII和EcoRI切割，用类似于PCR片段纯化的方法纯化)。
用BIO-RAD微脉冲发生器电穿孔仪，将连接混合物经电穿孔进入大肠杆菌(E.coli)XL1-蓝细胞内，并接种到含氨苄西林的LB培养基中。分离抗氨苄西林的菌落，并在含100ug/ml氨苄西林的LB培养基中生长过夜。用V-基因快速质粒DNA日常小量制备试剂盒，从过夜的培养物中提取质粒DNA。提取的质粒DNA用EcoRI和HindIII消化，并在1％琼脂糖凝胶上，在TAE缓冲液中运行。在后续工作(pWHM-CytP450she)中，选择、测序和使用含所需大小插入片段的质粒构建体。
将pWHM-CytP450she构建体转化至浅青紫链霉菌(S.lividans)TK-21中：
如Hopwood(1985)所述，将质粒构建体转化至浅青紫链霉菌(S.lividans)TK-21的原生质球中，并选择在含硫链丝菌素的R2YE培养基上。将抗硫链丝菌素菌落转移到各个含硫链丝菌素的R2YE培养皿中，并允许在28℃下形成孢子。分别用10％甘油从各培养皿中洗涤孢子，-20℃下贮藏待用。从各孢子悬浮液中取0.5mL接种到含25μg/g硫链丝菌素的100mL YEME培养基中(Hopwood等，1985)，并允许生长3天。
将质粒DNA纯化，并用EcoRI和HindIII消化，在琼脂糖凝胶上分离。所有测试的质粒构建体显示出期望的限制图谱。在后续工作中选择和使用已测试的孢子悬浮液之一。
测试携带pWHM-cytP450she构建体的浅青紫链霉菌(S.lividans)TK-21的美伐他汀羟化作用：
用先前所选的孢子悬浮液接种到50mL PSI培养基(2％葡萄糖、0.5％大豆粉、0.5％大豆蛋白胨、0.01％KH2PO4和0.1％CaCO3)中，在28℃、300rpm连续定轨振荡下，温育2天。使用10％的接种物，将该预培养物接种到50mL PSF-2培养基(1.8％葡萄糖、5％大豆粉、0.4％CSL和0.3％CaCO3，pH＝7.2)。使培养物生长30-40小时，将1mL 40mg/ml美伐他汀-Na溶液加到发酵液中。发酵再进行24-48小时。然后收集样品，用高效液相色谱法分析样品。普伐他汀的产量为0-3μg/g。
实施例2：
该实施例举例说明：将细胞色素P450基因和fdxshe或fdxshe-样基因一起转化到浅青紫链霉菌(S./ividans)TK-21中，足以诱导美伐他汀羟化形成普伐他汀。
通过反向PCR分离fdxshe基因：
使用修饰酵母和革兰氏阳性菌的PUREGENE DNA分离试剂盒，从淡蜡黄链霉菌(S.helvaticus)中提取总DNA。该基因组DNA用BamHI消化，稀释十倍，并自身连接。使用引物：5′CGA ACT CCC GGTCAC CTG GTG ACC G3′和5′GTC ATG CGG CGA CGC GTC CCGTGC T3′，用连接混合物进行PCR。在0.7％琼脂糖凝胶上分离PCR产物，看见一种PCR产物。对该PCR产物测序：见图1(SEQ.ID.NO.1)。
ORF鉴定为来自cytP450she基因的下游，其显示与浅灰链霉菌(S.griseolus)铁氧化还原蛋白-1(suaB)基因具有70％的同源性，并且将它称为fdxshe。
pWHM-cytP450she-fdxshe构建体的构建：
根据序列信息设计新引物，将该引物放置在fdxshe终止密码子的下游。采用5′TAT AAG CTT TGC GGT AGA CCG CCG CCT TTC 3′和新设计的5′AAA GAA TTC GTG ACC GAT CCG CTG TGA CGC C3′引物，从淡蜡黄链霉菌(S.helvaticus)基因组DNA共同扩增cytP450she和新鉴定的fdxshe。按实施例1，将所需大小的PCR片段克隆到pWHM-3载体内。
将pWHM-CytP450she-fdxshe构建体转化至浅青紫链霉菌(S.lividans)TK-21中：
按与实施例1中所述的同样方法，将质粒构建体转化至浅青紫链霉菌(S.lividans)TK-21。制备孢子，按与实施例1中进行的同样方法选择所需大小的插入片段。
测试携带pWHM-cytP450she-fdxshe构建体的浅青紫链霉菌(S.lividans)TK-21的美伐他汀羟化作用：
用先前所选的孢子悬浮液接种到PSI和PSF-2培养基中。按实施例1所述进行发酵。携带pWHM-cytP450she-fdxshe质粒的浅青紫链霉菌(S.lividans)菌落的普伐他汀产量为478-502μg/g。
实施例3：
该实施例举例说明：将细胞色素P450基因和fdxshe或fdxshe-样基因一起转化到浅青紫链霉菌(S.lividans)TK-21中，足以诱导美伐他汀羟化形成普伐他汀。
将pWHM-CytP450she-fdxshe构建体转化至淡蜡黄链霉菌(S.helvaticus)中：
采用电穿孔法，将pWHM-CytP450she-fdxshe质粒构建体(实施例2所述)转化至淡蜡黄链霉菌(S.helvaticus)的原生质球中。除细胞在代替YEME的ISP-2培养基中，在28℃生长48小时外，按照Bibb等，1978所述方法制备原生质球。在电穿孔前，将原生质球洗入10％蔗糖溶液中。在2mm缝隙电穿孔室(BIO-RAD)内，在Bio-Rad的微脉冲发生器电穿孔仪上按下列参数设置进行电穿孔：1.5kV、600Ω和10μF。将已转化的原生质球在ISP-2培养基+10％蔗糖中在28℃再生24小时，然后用含15μl 50mg/ml硫链丝菌素溶液的5ml SNA培养基覆盖。琼脂覆盖物固化后继续在28℃温育。5-7天后出现再生的转化体菌落。将生长的菌落转移到IPS-2培养基+25μg/ml硫链丝菌素中，再生长5-7天。将还在生长的菌落用于后续步骤。使选择的菌落在ISP-2培养基+25μg/ml硫链丝菌素中生长，从菌丝体纯化质粒DNA，进行限制性内切酶酶切消化试验。分离的质粒DNA显示和原始pWHM-CytP450she-fdxshe构建体相似的限制图谱。
测试携带pWHM-cytP450she-fdxshe构建体的淡蜡黄链霉菌(S.helvaticus)的美伐他汀羟化作用：
用两种先前选择的菌落接种到PSI和PSF-2培养基中。按实施例1所述进行发酵。与普伐他汀产率仅为114-116μg/g/2h的未携带cytP450sca-fdxshe构建体的原始菌株相比，携带pWHM-cytP450she-fdxshe质粒的淡蜡黄链霉菌(S.helvaticus)菌落的普伐他汀产率为212-263μg/g/2h。
实施例4：
从起始密码子(ATG)到终止密码子(TGA)，CytP450she ORF进行PCR扩增，并在pgk启动子和trpC终止子之间克隆至pBC-Hygro载体的MCS中(Silar，FGN 42：73)。从起始密码子(ATG)到终止密码子(TGA)，fdxshe ORF进行PCR扩增，并在pgk启动子和trpC终止子之间克隆至pBC-Phleo载体的MCS中(Silar，FGN 42：73)。通过限制性内切酶消化测试构建体，显示所期望片段大小的合适克隆进一步通过测序来测试。在后续步骤中选择和使用具有期望DNA序列的克隆。
分别选择200ug/ml潮霉素和500ug/ml腐草霉素，将两种构建体依次转化到桔青霉(Penicillium citrinum)的原生质球中。选择显示潮霉素和腐草霉素两者抗性的分离菌，给予一个剂量的美伐他汀-Na后，测试美伐他汀向普伐他汀转化的转化率。进一步测试能够将美伐他汀转化为普伐他汀的分离菌。
                            序列表
                            序列表
<110>Teva Gyogyszergyar Zartkoruen Mukodo Reszvenytarsasag
<120>构建具有美伐他汀羟化能力的菌株的方法
<130>2664/83802
<140>11/295,142
<141>2005-12-05
<150>60/633,011
<151>2004-12-03
<160>2
<170>PatentIn Version 3.3
<210>1
<211>230
<212>DNA
<213>浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)
<220>
<221>CDS
<222>(21)..(209)
<220>
<221>misc_feature
<222>(213)..(213)
<223>n is a，c，g，or t
<400>1
ccgagcggaa aggaggaccc atg cgg gtc tca gcg gac cgg gac gtc tgt gtc      53
                      Met Arg Val Ser Ala Asp Arg Asp Val Cys Val
                      1               5                   10
ggc gcc ggc ctg tgc gcg ctg acc gcg ccc gac gtc ttt gac cag gac        101
Gly Ala Gly Leu Cys Ala Leu Thr Ala Pro Asp Val Phe Asp Gln Asp
            15                  20                  25
gac gac ggc ctt gtt gac gtg gtc acc ccc gat ccc ggc cag gcg cag        149
Asp Asp Gly Leu Val Asp Val Val Thr Pro Asp Pro Gly Gln Ala Gln
        30                  35                  40
cag gcc gcg gcc cgc cag gcc ggc aac ctc tgt ccg tcg ggg gcg gtc        197
Gln Ala Ala Ala Arg Gln Ala Gly Asn Leu Cys Pro Ser Gly Ala Val
    45                  50                  55
cgc atc acc gaa tgangcgacc gtcccgcggc c                                230
Arg Ile Thr Glu
60
<210>2
<211>63
<212>PRT
<213>浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)
<400>2
Met Arg Val Ser Ala Asp Arg Asp Val Cys Val Gly Ala Gly Leu Cys
1               5                   10                  15
Ala Leu Thr Ala Pro Asp Val Phe Asp Gln Asp Asp Asp Gly Leu Val
            20                  25                  30
Asp Val Val Thr Pro Asp Pro Gly Gln Ala Gln Gln Ala Ala Ala Arg
        35                  40                  45
Gln Ala Gly Asn Leu Cys Pro Ser Gly Ala Val Arg Ile Thr Glu
    50                  55                  60

Claims (39)

1.一种核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
2.权利要求1的核酸分子，所述核酸分子与SEQ ID NO：1具有至少85％的序列同源性。
3.权利要求1的核酸分子，所述核酸分子与SEQ ID NO：1具有至少90％的序列同源性。
4.权利要求1的核酸分子，所述核酸分子与SEQ ID NO：1具有至少95％的序列同源性。
5.核酸分子，所述核酸分子为权利要求1-4中任一项的核酸分子编码或对其起反义核酸分子作用。
6.核酸分子，所述核酸分子与权利要求1-4中任一项的核苷酸序列杂交。
7.一种载体，所述载体包含权利要求1-4中任一项的多核苷酸。
8.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求7的载体。
9.一种制备多肽的方法，所述方法包括：在体外条件下培养权利要求8的宿主细胞，其中表达所述核酸分子编码的蛋白质；和从培养物中回收所述蛋白质。
10.一种多肽分子，所述多肽分子与SEQ.ID NO.1的氨基酸序列具有至少85％的序列同源性。
11.一种多肽分子，所述多肽分子与SEQ.ID NO.1的氨基酸序列具有至少90％的序列同源性。
12.一种多肽分子，所述多肽分子与SEQ.ID NO.1的氨基酸序列具有至少95％的序列同源性。
13.一种构建基因修饰菌株的方法，所述方法通过用含有启动子DNA序列、细胞色素P-450编码基因和fdxshe编码基因的质粒构建体转化宿主，使所述基因修饰菌株具有使美伐他汀羟化的能力。
14.权利要求13的方法，其中所述宿主选自原核生物宿主和真核生物宿主。
15.权利要求14的方法，其中所述原核生物为放线菌。
16.权利要求15的方法，其中所述放线菌为链霉菌属(Streptomyces)。
17.权利要求16的方法，其中所述链霉菌属(Streptomyces)选自浅青紫链霉菌(S.lividans)、嗜碳链霉菌(S.carbophilus)和淡蜡黄链霉菌(S.helvaticus)。
18.权利要求14的方法，其中所述原核生物宿主选自大肠埃希氏菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
19.权利要求14的方法，其中所述真核生物宿主为真菌。
20.权利要求19的方法，其中所述真菌为桔青霉(Penicilliumcitrinum)。
21.权利要求20的方法，其中所述桔青霉(Penicillium citrinum)宿主为产生ML-236B(美伐他汀)的菌株。
22.权利要求13的方法，其中所述质粒选自pWHM-3和pSCA。
23.权利要求13的方法，其中所述质粒为多拷贝质粒。
24.权利要求23的方法，其中所述多拷贝质粒为PIJ702。
25.权利要求13的方法，其中所述细胞色素P-450编码基因得自放线菌。
26.权利要求13的方法，其中所述细胞色素P-450编码基因得自链霉菌属(Streptomyces)。
27.权利要求26的方法，其中所述细胞色素P-450编码基因选自浅青紫链霉菌(S.lividans)、嗜碳链霉菌(S.carbophilus)和淡蜡黄链霉菌(S.helvaticus)。
28.权利要求27的方法，其中所述得自嗜碳链霉菌(S.carbophilus)的细胞色素P-450选自cytP-450sca-1、cytP450sca-2和cytP-450sca-3。
29.权利要求13的方法，其中所述启动子DNA序列与所述细胞色素P-450编码基因有效连接。
30.权利要求13的方法，其中所述fdxshe基因具有SEQ.ID NO.1的核苷酸序列。
31.权利要求13的方法，其中所述fdxshe基因与SEQ ID NO：1核苷酸序列具有80％的序列同源性。
32.权利要求13的方法，其中所述fdxshe基因与SEQ ID NO：1核苷酸序列具有85％的序列同源性。
33.权利要求13的方法，其中所述fdxshe基因与SEQ ID NO：1核苷酸序列具有90％的序列同源性。
34.权利要求13的方法，其中所述fdxshe基因与SEQ ID NO：1核苷酸序列具有95％的序列同源性。
35.权利要求13的方法，其中所述fdxshe基因编码SEQ.ID NO.1的氨基酸序列。
36.一种制备普伐他汀的方法，所述方法包括：在其中将ML-236B羟化形成普伐他汀的条件下，培养由权利要求13-35的方法制备的基因修饰菌株；和回收普伐他汀。
37.权利要求36的方法，其中所述ML-236B在培养基中提供。
38.权利要求36的方法，其中所述ML-236B由桔青霉(Penicilliumcitrinum)产生，所述桔青霉(Penicillium citrinum)与所述宿主共培养。
39.权利要求36的方法，其中所述基因修饰菌株为产生ML-236B的桔青霉(Penicillium citrinum)。
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