CN101088014B - 在实验动物中检测治疗性抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及治疗性抗体领域。其特别涉及在实验动物中研究治疗性抗体。本发明公开了在从实验动物获得的样品中检测治疗性抗体的方法,其包括步骤:a)提供待分析的样品;b)将所述样品与结合治疗性抗体且不结合所述实验动物免疫球蛋白的抗体温育;c)任选地将所述样品与适于选择性检测总的、有活性的或结合抗原的治疗性抗体的试剂温育;d)建立(b)或(c)中形成的复合体与所述治疗性抗体浓度的关系。使用针对某一表位的单克隆抗体(MAB-M-R10Z8E9),所述表位在人的G类免疫球蛋白的所有类别中存在,但是不在除了黑猩猩之外的任何实验动物的免疫球蛋白上存在。
Description
本发明涉及治疗性抗体领域。其特别涉及在实验动物中研究治疗性抗体。本发明公开了在从实验动物获得的样品中检测治疗性抗体的方法,其包括步骤:a)提供待分析的样品;b)将所述样品与结合治疗性抗体且不结合所述实验动物免疫球蛋白的抗体温育;c)任选地将所述样品与适于选择性检测总的、有活性的或结合抗原的治疗性抗体的试剂温育;d)建立(b)或(c)中形成的复合体与所述治疗性抗体浓度的关系。其还涉及结合治疗性抗体且不结合实验动物免疫球蛋白的抗体用于在从实验动物获得的样品中测量总的、有活性的或结合抗原的治疗性抗体的浓度的用途。
自从1974年Koehler和Milstein开发了第一种单克隆抗体以来,人们付出很大努力开发适于在人类中治疗的抗体。第一种可用的单克隆抗体是在小鼠和大鼠中开发的。由于是抗啮齿动物抗体,这些抗体在用于人类治疗时造成不必要的副作用。人们已经付出很大努力来降低或者甚至消除此类不必要的副作用。
人们正在研究非常大量的人或人源化单克隆抗体并且在考虑进行首次试验进入人类之前需要在实验动物中研究。
需要在实验动物的帮助下研究重要的标准,仅提及其中两种,像生物利用率和抗体清除率。许多这样的研究需要定量宿主自身抗体背景中的治疗性抗体。哺乳动物在大多数情况下用作实验动物。最初经常在像小鼠或大鼠的啮齿类动物中评价毒理。在药物开发的更晚期阶段,特别是药物进入人类之前甚至需要在此类临床前研究中包括猴类。
哺乳动物通常在循环系统中具有大约10-30毫克每毫升的免疫球蛋白。
一般需要以大约每毫升1纳克到大约每毫升100毫克的血清水平检测治疗性单克隆抗体。治疗性抗体因此需要对过量大约100倍到10,000,000倍的宿主抗体背景检测。在宿主免疫球蛋白背景中检测人或人源化治疗性抗体代表了药理学家非常重要的任务。此外应理解到不同的治疗性抗体可能需要不同的试剂和测定形式。试验动物与人关系越近,人或人源化抗体的检测就越困难。
本发明的任务是研究是否可以改进在从实验动物获得的样品中检测治疗性抗体的方法。也研究是否可以在猴类的血清,特别是在小类人猿的血清中研究人或人源化治疗性抗体。这项任务已经通过本发明如下文和实施例部分所述并且如所附的权利要求所要求的完成。
在第一个实施方案中,本发明涉及在从实验动物获得的样品中检测治疗性抗体的方法,其包括以下步骤:a)提供待分析的样品;b)将所述样品与结合治疗性抗体且不结合所述实验动物免疫球蛋白的抗体温育;c)任选地将所述样品与适于选择性检测总的、有活性的或结合抗原的治疗性抗体的试剂温育;d)建立(b)或(c)中形成的复合体与所述治疗性抗体浓度的关系。
术语“治疗性抗体”涉及任何意在用于人类的抗体制品.优选地,此治疗性抗体为单克隆抗体。更优选的此单克隆抗体从大类人猿获得或者为人单克隆抗体。优选地,其为人单克隆抗体。同样优选的此治疗性单克隆抗体为人源化单克隆抗体。
如本文所用的术语“单克隆抗体”指从基本同型的抗体群体中获得的抗体,即群体中包含的单个抗体除少量出现的可能天然存在的突变外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的,直接针对单一的抗原性位点。此外,与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同,每一种单克隆抗体针对抗原上的一个决定簇。除了它们的特异性之外,单克隆抗体可无其它抗体污染地合成方面是有利的。修饰语“单克隆”表明抗体的特性为从基本同型的抗体群体中获得,并且不解释为需要通过任何具体方法产生抗体。例如,根据本发明使用的单克隆抗体可通过首先由Koehler,G.等人,Nature256(1975)495-497所述的杂交瘤方法产生,或者可通过重组DNA方法产生(见例如美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”也可用例如Clackson,T.等人,Nature352(1991)624-628和Marks,J.D.等人,J.Mol.Biol.222(1991)581-597中所述的技术从噬菌体抗体文库中分离。
非人(例如啮齿类动物)抗体的“人源化”形式为含有来自非人免疫球蛋白和人免疫球蛋白的部分序列的嵌合抗体。对大部分抗体来说,人源化抗体来自人免疫球蛋白(受体抗体),其中受体高变区的残基由具有所需特异性和亲和力的非人类物种(如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类)(供体抗体)的高变区的残基替代。在一些情况中,人免疫球蛋白构架区(FR)残基由相应的非人类残基替代。此外,人源化抗体可包含其他修饰,例如,受体抗体或供体抗体中没有的氨基酸残基。此类修饰造成此受体或供体抗体的变体,其是同源的但是与相应的亲本序列不相同。进行这些修饰来进一步改进抗体性能。总之,人源化抗体基本包含全部至少一个,一般地两个可变结构域,其中对应于非人类供体抗体的所有高变环或者基本上所有的高变环和所有FR或者基本所有的FR为人类受体抗体的。人源化抗体也任选地包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分,一般地包含人免疫球蛋白恒定区的一部分。
人源化非人类抗体的方法已经在本领域中描述。优选地,人源化抗体具有从非人类来源引入其中的一个或更多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基经常称为“输入”残基,其通常取自“输入”可变结构域。人源化可基本按照Winter和同事的方法通过将高变区序列替换为非人类抗体的相应序列进行(Jones,P.T.等人,Nature321(1986)522-525;Riechmann,L.等人,Nature,332(1988)323-327;Verhoeyen,M.等人,Science,239(1988)1534-1536和Presta,L.G.,Curr.Op.Struct.Biol.,2(1992)593-596)。因此,此类“人源化”抗体为嵌合抗体(美国专利号4,816,567),其中不足一个完整的人可变结构域基本上由非人类物种的相应序列取代。在实际中,人源化抗体一般为一些高变区残基和可能情况下一些FR残基由啮齿类动物抗体类似位点的残基取代的人类抗体。
选择用于生产人源化抗体的人重链和轻链可变结构域对降低抗原性非常重要。根据所谓的“最适”方法,在已知的人可变结构域序列的完全文库中筛选啮齿类动物抗体的可变结构域序列。然后与啮齿类动物序列最接近的人类序列认为是人源化抗体的人类构架区(FR)(Sims,M.J.等人,J.Immunol.,151(1993)2296-2308;Chothia,C.等人,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)。另一种方法使用特殊的构架区,其来自重链或轻链特殊亚组的所有人类抗体的共有序列。相同的构架可用于多种不同的人源化抗体(Carter,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89(1992)4285-4289;Presta,L.G.等人,J.Immunol.151(1993)2623-2632)。
熟知的人源化治疗性抗体实例为包括huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-44、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7和huMAb4D5-8(HERCEPTIN)的所谓的抗ErbB2抗体(其在美国专利5,821,337的表3中描述并在本文明确引入作为参考)以及人源化的520C9(WO93/21319中所述)和PCT/US03/21590中所述的人源化2C4抗体。
术语“变体”指具有与天然多肽序列某种程度不同的氨基酸序列的多肽。通常,变体氨基酸序列与相应的亲本抗体序列具有至少大约80%的同源性,优选地,它们与此亲本抗体序列具有至少大约90%的同源性,更优选地,与此亲本抗体序列具有至少大约95%的同源性。氨基酸序列变体在天然氨基酸序列的氨基酸序列的特定位置具有替代、缺失和/或插入。
“同源性”定义为比对序列并如果必需的话引入缺口以获得最大同源性百分比之后氨基酸序列变体中相同的残基的百分比.用于比对的方法和计算机程序为本领域所熟知。一种这样的计算机程序为Genentech,Inc.出品的“Align2”,其与用户文件一起于1991年12月10日提交至美国版权局(the United States Copyright Office),Washington,DC20559。
如本文所用的术语“实验动物”指灵长目家族成员,其包含狨猴和小绢猴(狨猴科)、新世纪猴(悬猴科)、旧世纪猴(猕猴科)、侏儒狐猴和小嘴狐猴(mouse lemur)(鼠狐猴科)、指猴(指猴科)、婴猴和丛猴(婴猴科)、长臂猿和小类人猿(长臂猿科)、大狐猴、原狐猴和近亲(大狐猴科)、真狐猴(狐猴科)、懒猴(懒猴科)、鼬狐猴(鼬狐猴科)、跗猴(眼睛猴科)以及其杂交品种。
根据本发明的方法优选地在选自狨猴和小绢猴家族成员、旧世纪猴、侏儒狐猴和小嘴狐猴、长臂猿和小类人猿、真狐猴以及其杂交品种的实验动物中展开。在这个优选的实施方案中不包括与人类最接近的近亲大类人猿,尤其不包括黑猩猩、倭黑猩猩、大猩猩和猩猩。
根据本发明的“样品”可为从实验动物取出的任何组织和液体样品。样品优选地为液体样品,像唾液、尿、全血、血浆或血清。样品优选地为全血、血浆或血清。
“结合治疗性抗体且不结合实验动物免疫球蛋白的抗体”以至少10-9mol/L的解离常数(=KDiss.)结合治疗性抗体,更优选地以至少10-10mol/L的KDiss.结合治疗性抗体。同时不结合实验动物的免疫球蛋白的性质通过10-8mol/L或更低的KDiss.保证。同样优选的是,结合治疗性抗体且不结合实验动物免疫球蛋白的抗体在其分别与实验动物IgG和人IgG的反应性间具有至少100倍的KDiss.间隙。
优选地通过仪器评价抗体的结合特性,尤其是KDiss.。在这种方法中通过表面等离子体共振(SPR)的变化估计结合特性。可以方便地将所研究的抗体结合到固相上(所谓的芯片上)并且评价单克隆抗体、多克隆抗体或者甚至是含IgG的血清与此包被的芯片的结合.
所研究的结合治疗性抗体且不结合实验动物免疫球蛋白的抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、此类抗体的片段以及包含此抗体结合结构域的遗传构建体。可以使用保留上述结合治疗性抗体且不结合所述实验动物免疫球蛋白标准的任何抗体片段。抗体以及抗体片段通过现有技术产生,例如,如Tijssen所述(Tijssen,P.,Practice and theory of enzymeimmunoassays11(1990),全书,尤其是43-78页,Elsevier,阿姆斯特丹)产生。
如还在上文所示,在实验动物中应用治疗性抗体相关的多个方面需要在临床前研究中评价。在某些情况下,这与分析存在的治疗性抗体的总量有关,或者分析治疗性抗体的某个片段、治疗性抗体的某些修饰、结合抗原的治疗性抗体的浓度或者仍能结合抗原的治疗性抗体的级分是重要的。根据本发明的方法优选地分别用于检测总的、有活性的或结合抗原的治疗性抗体。
术语“总的”治疗性抗体指不考虑抗体是否有活性(即仍能与其抗原反应)、无活性和/或结合抗原,检测到的任何抗体。
术语“有活性的”治疗性抗体涉及实验动物中存在的仍能结合其抗原的治疗性抗体。例如此类抗体在其抗原结合位点未与其抗原或者任何其他分子结合。
术语“结合抗原的”治疗性抗体用来指实验动物的循环系统中存在的结合其抗原的治疗性抗体。
上文定义的总的、有活性的或结合抗原的治疗性抗体可在根据本发明的方法中直接检测。
此外,也可能间接评价任何“无活性的”治疗性抗体。此无活性的治疗性抗体可以是例如结合其抗原的治疗性抗体、结合交叉反应抗原的治疗性抗体或者被针对治疗性抗体的自身抗体阻断的治疗性抗体。如技术人员将明白,可能通过本公开的帮助评价无活性抗体级分。如果总的抗体超过有活性的抗体和结合抗原的抗体的总和,那么将存在含不结合其相应抗原的无活性抗体的额外抗体级分.
现有各种测定系统分析例如总的、有活性的或结合抗原的治疗性抗体。
例如可在所谓的竞争性免疫测定系统中或所谓的夹层型测定系统中检测总的抗体。
此测定可不经洗涤步骤(均相免疫测定)或经洗涤步骤(多相免疫测定)进行。
优选地在夹层型免疫测定中检测总的治疗性抗体,其中在此夹层测定的两侧都使用结合治疗性抗体且不结合实验动物免疫球蛋白的抗体。用在此夹层一侧的抗体结合或者能够结合固相(称为捕捉抗体),其中此夹层另一侧的抗体以便于直接或间接检测的方式标记(所谓的检测抗体)。此夹层测定方法中结合的检测抗体的数量与所研究样品中的治疗性抗体数量直接相关。
本领域(例如,US 2003/0068664)已知允许检测有活性治疗性抗体的测定系统。此类系统需要抗原与固相结合,治疗性抗体与此结合的抗原结合和检测通过抗原结合固相的治疗性抗体。
样品中的有活性的治疗性抗体的检测可通过本领域的便利方法实现。然而,总的治疗性抗体的检测或结合其抗原的治疗性抗体级分的检测是相当复杂的并且需要非常不同的测定设置且每一种不同测定法尤其需要匹配的试剂。用根据本发明的结合治疗性抗体且不结合实验动物免疫球蛋白的抗体,可能在互相类似的检测系统中评价有活性的治疗性抗体级分、总的治疗性抗体或结合抗原的治疗性抗体。从其真正的本质来说,一旦在这些治疗性抗体的不同级分间进行定量比较,这种总的、有活性的或结合抗原的治疗性抗体的比较性评价具有很大优势。
优选地,也建立了夹层型测定形式来检测有活性的治疗性抗体。结合治疗性抗体且不结合实验动物免疫球蛋白的抗体优选地用作捕捉抗体并且此夹层测定的检测侧面使用标记形式的抗原或者在抗原结合后使用不结合治疗性抗体识别的表位或与其竞争的第二抗体,其中所述的第二抗体可特异地检测和/或以便于直接或间接检测的方式标记。
优选地再次在夹层型测定形式中检测结合抗原的治疗性抗体,其中优选地使用结合治疗性抗体且不结合实验动物免疫球蛋白的抗体作为捕捉试剂。在检测中优选地使用在不与治疗性抗体表位竞争的表位结合抗原的第二抗体。所述第二抗体优选地以便于直接或间接检测的方式标记。
为进行直接检测,标记基团可选自任何已知的可检测标记基团,如染料;发光标记基团,如化学发光基团,例如吖啶酯或1,2-二氧环丁烷;或者荧光染料,例如荧光素、香豆素、罗丹明、噁嗪、试卤灵、花青和其衍生物。其他标记基团的实例为发光金属络合物,如钌或铕络合物、酶(例如用于ELISA或CEDIA(克隆酶供体免疫测定,例如EP-A-0 061 888)的酶)和放射性同位素。
间接检测系统包含例如检测试剂,例如检测抗体用生物亲和(bioaffine)结合对的第一配偶体标记。适当结合对的实例为半抗原或抗原/抗体、生物素或生物素类似物(如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素/抗生物素蛋白或链霉抗生物素)、糖/凝集素、核酸或核酸类似物/互补核酸和受体/配基(例如甾类激素受体/甾类激素)。优选的第一结合对成员包含半抗原、抗原和激素。尤其优选的是半抗原,像地高辛和生物素及其类似物。通常标记此结合对的第二配偶体(例如抗体、链霉抗生物素等等)以允许例如通过上面提到的标记直接检测。
免疫测定为技术人员所熟知。进行此类测定法的方法以及实际的应用和步骤概括于相关的教科书中。相关教科书的实例为Tijssen,P.,Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromoleculeconjugates(《Practice and theory of enzyme immunoassays》(1990),221-278页,R.H.Burdon和v.P.H.Knippenberg编辑,Elsevier,阿姆斯特丹)和《Methods in Enzymology》的不同卷册(S.P.Colowick,N.O.Caplan编辑,Academic Press),尤其在70、73、74、84、92和121卷中涉及免疫检测方法.
在所有上述免疫检测方法中,选择允许所用试剂结合的试剂条件,例如选择允许抗体与其相应抗原结合的试剂条件。技术人员通过使用属于复合体谈及此结合事件的结果.在根据本发明的测定法中通过现有技术步骤建立形成的复合体与相应的所述治疗性抗体浓度的关系。取决于所用的检测试剂,此关联步骤会得到总的、有活性的或结合抗原的治疗性抗体的浓度。
如技术人员将理解的,根据本发明的方法不仅揭示总的、结合抗原的、有活性的或甚至无活性的治疗性抗体的浓度。由于在不同测定法中优选使用一种且相同的试剂:结合治疗性抗体且不结合所述实验动物免疫球蛋白的抗体,所获得的数值可容易地互相比较甚至评价其比例。在其他优选的实施方案中,本发明涉及有活性的治疗性抗体与总的治疗性抗体的比例。这个比例可很好地作为治疗性抗体效力的指示。
导致本发明的实验过程中发现G类人免疫球蛋白所有类别上存在的一个表位,其除黑猩猩IgG外似乎不存在任何实验动物免疫球蛋白上。这个表位的特征在于其结合MAB<H-Fcγpan>M-R10Z8E9,其也称为MAB<h-Fcγ>M-R10Z8E9,或简称为MAB M-R10Z8E9。在根据本发明的优选实施方案中,结合治疗性抗体且不结合实验动物免疫球蛋白的抗体的特征还在于所述抗体为结合与MAB M-R10Z8E9相同的表位的抗体。MABM-R10Z8E9于2004年12月22日保藏于DSMZ中,保藏号为DSMACC2708。
优选地,本发明涉及结合治疗抗体的单克隆抗体,该单克隆抗体具有竞争性抑制单克隆抗体MAB M-R10Z8E9(如通过保藏于DSMZ的该杂交瘤所产生)的结合的抗原结合位点。术语“竞争性抑制”是指能识别并结合单克隆抗体M-R10Z8E9所识别的表位。此结合可用常规的交互抗体竞争测定法容易地评价。
简言之,在交互竞争实验中研究两种(或更多种)特异结合剂是否抑制彼此与相同抗原或表位的结合。或者研究抗体A和B对相同表位的结合。如果这两种抗体结合相同的表位,那么它们将竞争结合。如果等摩尔浓度的抗体A降低B的结合至少20%并且反之亦然,那么它们结合相同的表位。
如技术人员所理解,可在不同的测定设置中评价竞争.
优选地使用系统,见上文。如果等摩尔浓度的所研究抗体降低MAB M-R10Z8E9与人IgG的结合20%或更高并且如果MABM-R10Z8E9降低所述抗体与人IgG的结合20%或更高,那么所研究抗体与MABM-R10Z8E9结合相同表位。
还在其他优选的实施方案中,MAB M-R10Z8E9用作根据本发明的方法中结合治疗性抗体且不结合实验动物免疫球蛋白的抗体。
如上文提到的,在根据本发明的方法中检测的治疗性抗体优选地为人或人源化单克隆抗体。用于根据本发明的方法中的治疗性抗体优选地包含MAB M-R10Z8E9结合的表位。
在其他优选的实施方案中,本发明涉及结合治疗性抗体且不结合实验动物免疫球蛋白的抗体用于测量从实验动物获得的样品中总的、有活性的或结合抗原的治疗性抗体的浓度的用途。用于此方法的抗体优选地为结合MAB M-R10Z8E9所识别的表位的抗体。
提供下列实施例、参考文献和附图来帮助理解本发明,本发明的真正范围在权利要求书中给出。应理解到可在步骤中进行修饰而不偏离本发明的精神。
附图描述
图1检测总的治疗性抗体
生物素化单克隆抗体(MAB<H-Fcγpan>-M-R10Z8E9-Bi)与链霉抗生物素包被的微量滴定板(SA-MTP)结合。治疗性抗体MAB<IGF-1R>被结合并通过洋地黄毒苷标记的MAB<H-Fcγpan>M-R10Z8E9-DIG和抗洋地黄毒苷辣根过氧化物酶缀合物(PAB<DIG>HRP)间接检测。
图2:检测稀释于缓冲液中的总的治疗性抗体
给出了稀释于PBS-T、0.5%BSA(w/v)中的多种浓度治疗性抗体的光密度值(ODs)。
图3:检测稀释于还含有5%(v/v)猕猴血清的缓冲液的总的治疗性抗体
给出了稀释于含5%(v/v)猕猴血清的PBS-T、0.5%BSA(w/v)中的多种浓度治疗性抗体的光密度值(ODs)。
图4:通过固相抗原检测有活性的治疗性抗体
这幅图显示了通过结合固相的抗原检测有活性的治疗性抗体的试剂。在特定的实施例中,给定的生物素化可溶性白细胞介素1受体(s-IL-IR-Bi)与链霉抗生物素包被的微量滴定板(SA-MTP)结合。有活性的治疗性抗体与抗原结合并通过洋地黄毒苷化抗人抗体(MAB<H-Fcγpan>M-R10Z8E9-DIG)和抗DIG-HRP抗体(PAB<DIG>HRP)间接检测。
图5:检测稀释于缓冲液中的有活性的治疗性抗体给出了稀释于PBS-T、0.5%BSA(w/v)中的多种浓度治疗性抗体的光密度值(ODs)。
图6:检测稀释于还含有5%(v/v)猕猴血清的缓冲液中的有活性的治疗性抗体
给出了稀释于含5%(v/v)猕猴血清的PBS-T、0.5%BSA(w/v)中的多种浓度治疗性抗体的光密度值(ODs)。
图7:在夹层测定形式中检测有活性的治疗性抗体
生物素化的单克隆抗体(MAB<H-Fcγpan>-M-R10Z8E9-Bi)与链霉抗生物素包被的微量滴定板(SA-MTP)结合。检测间接地利用洋地黄毒苷标记的抗原(s-IL-1R-DIG)和抗洋地黄毒苷辣根过氧化物酶缀合物抗体(PAB<DIG>HR)。
图8:通过夹层测定检测稀释于缓冲液中的有活性的治疗性抗体
给出了稀释于PBS-T、0.5%BSA中的多种浓度治疗性抗体的光密度值(ODs)。
图9:通过夹层测定检测稀释于还含有5%猕猴血清的缓冲液中的有活性的治疗性抗体
给出了稀释于含5%(v/v)猕猴血清的PBS-T、0.5%BSA中的多种浓度治疗性抗体的光密度值(ODs)。
缩写
ABTS 2,2’-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸(6)]二铵盐
BSA 牛血清白蛋白
ELISA 酶联免疫吸附测定
Fcγ =Fcy=Fcg=Fcγ=免疫球蛋白的Fcγ片段
POD(=HRP) 辣根过氧化物酶
IgG 免疫球蛋白G
DIG(Dig) 洋地黄毒苷
MTP 微量滴定板
OD 光密度
PBS 磷酸缓冲盐溶液
SDS 十二烷基硫酸钠
MAK(=Mab) 单克隆抗体
PAK(=Pab) 多克隆抗体
RT 室温
SA 链霉抗生物素
<人IgG> 针对人IgG的抗体
实施例1评价特异性
a)各种抗人IgG抗体用于MTP-ELISA中
分别用在碳酸盐缓冲液(pH9.6)中稀释到20%的猴(例如猕猴)和人血清在室温(RT)包被微量滴定板(MTP)(Nunc)1小时。用PBS-20洗涤3次之后,在室温用PBS/3%BSA封闭MTP的所有孔1小时。然后将MTP的孔与不同的抗人IgG抗体(未缀合的或抗人IgG抗体辣根过氧化物酶(POD)缀合物(见表1))温育(1小时;室温)。多种抗人抗体如相应制造商推荐的使用。
如上所述洗涤孔3次.直接处理与POD缀合物温育的孔以进行酶促反应/检测结合的抗人免疫球蛋白抗体。其它的孔适当地与抗Dig、抗小鼠IgG或链霉抗生物素-POD缀合物(所有试剂购自Roche Diagnostics,德国)温育(1小时;室温)然后进行洗涤步骤。POD缀合物中包含的POD催化ABTS底物的显色反应。通过ELISA读出器在405nm的波长测量信号(参考波长:490nm)。对每一种抗人IgG抗体来说,计算人抗体信号与猕猴血清信号的比例。这些数值用于评价抗人IgG抗体的特异性。高的比例意思是与人免疫球蛋白的强反应性并且同时与猴免疫球蛋白的低(交叉)反应性。
表1:
抗人抗体与人和猕猴血清的反应性
(*)=用<小鼠>-HRP检测
(**)=用SA-HRP检测
(***)=用<Dig>-HRP检测
对MAB<H-Fcγpan>M-R10Z8E9观察到的人血清与猕猴血清相比的高信号比表明了MAB<H-Fcγpan>M-R10Z8E9高的人类特异性。与MAB<H-Fcγpan>M-R10Z8E9不同,所有其他检测的抗体显示高的交叉反应性。
基于上述令人激动的数据,研究了MAB<H-Fcγpan>M-R10Z8E9与来自其他相关实验动物的其他免疫球蛋白的交叉反应性。
用各种实验动物的血清包被微量滴定板的孔。用MAB<H-Fcγpan>M-R10Z8E9作为特异的抗人IgG检测试剂如上所述进行测定。
如可从表2看到的,MAB<H-Fcγpan>M-R10Z8E9分别专一地与人血清的免疫球蛋白、人IgG或黑猩猩血清反应。
MAB<H-Fcγpan>M-R10Z8E9与小鼠、大鼠、狗、猴和人血清的反应性分别示于表2a和b。
表2a:用MAB<H-Fcγpan>M-R10Z8E9-Dig//<Dig>-POD检测
血清(10%(v/v)) | 信号 | 信号比人/动物 |
狗 | 0.096 | 19.24 |
大鼠 | 0.034 | 5432 |
CD1-小鼠 | 0.028 | 65.96 |
NMRI-小鼠 | 0.065 | 28.42 |
猕猴 | 0.032 | 58.63 |
狒狒 | 0.029 | 63.69 |
恒河猴 | 0.031 | 60.56 |
狨猴 | 0.128 | 14.43 |
黑猩猩 | 1.865 | 0.99 |
人 | 1.847 | 1.00 |
人IgG(5μg/ml) | 1.821 | 1.01 |
表2b:用抗小鼠IgG POD缀合物检测
血清(10%(v/v)) | 信号 | 信号比人/动物 |
猕猴 | 0.199 | 8.96 |
狒狒 | 0.131 | 13.63 |
恒河猴 | 0.186 | 9.59 |
狨猴 | 0.239 | 7.46 |
黑猩猩 | 1.893 | 0.94 |
人 | 1.779 | 1.00 |
人IgG(5μg/ml) | 2.105 | 0.85 |
有意思的注意到在上述间接检测系统中,用于间接检测的最终试剂<DIG>-POD或<小鼠>-POD的质量也影响信噪比。技术人员会选择与实验动物IgG很少结合或不结合的检测试剂。
将饱和数量的MAB<H-Fcγpan>M-R10Z8E9和多克隆抗人Fcγ抗体(Dianova)分别通过胺偶联固定于同一CM5芯片的不同通道上。所有的动物血清在含1毫克/毫升CM葡聚糖的HBS缓冲液中稀释到1%的终浓度。通过注入1/100稀释的血清并温育60秒分析结合。通过用HBS缓冲液洗涤芯片表面180秒测量解离。使用的Biaevaluation Software用1:1Langmuir拟合模型计算解离常数值(=KDiss.)。对所有动物血清来说,此计算基于假定IgG水平为15毫克/毫升。选择注入检测抗体80秒后的信号值比较结合的IgG的量(表2c和2d中的RU)。
表2c:动物血清与MAB<H-Fcγpan>M-R10Z8E9和多克隆抗人Fcγ抗血清的结合信号[RU]
表2d:不同的猴血清与MAB<H-Fcγpan>M-R10Z8E9和多克隆抗人Fcγ抗血清的结合信号[RU]
(不同猴血清)的SPR分析证实了MTP ELISA中见到的结果。MAB<H-Fcγpan>M-R10Z8E9不与任何猴类交叉反应。只检测到了人和黑猩猩(大类人猿)血清中含有的IgG。与MTP ELISA不同,狗血清与MAB<H-Fcγpan>M-R10Z8E9有一定的结合。与具有高于100倍KDiss.间隙的人IgG相比狗IgG相对高的KDiss.(与弱结合相关)表明这种低程度相互作用在免疫测定中没有显著干扰。这就是实施例1a)的MTP ELISA中实际发现的。
与MAB<H-Fcγpan>M-R10Z8E9不同,多克隆抗人Fc抗体显示与狗血清和所有检测的猴类血清的高交叉反应性。
实施例2:MAB<H-Fcγpan>M-R10Z8E9用于定量总的治疗性抗体的用途
将生物素化MAB<H-Fcγpan>M-R10Z8E9或针对人Fc的多克隆抗体结合于第一步中链霉抗生物素包被的微量滴定板(SA-MTP)上。通过洗涤去除过量的未结合抗体。将样品/标准品(例如掺加于猕猴血清中的MAB<IGF-1R>)同时与洋地黄毒苷化的MAB<H-Fcγpan>M-R10Z8E9-DIG)预温育1小时。之后将混合物加到生物素化的<人IgG>抗体包被的SA-MTP的孔中并温育1小时。洗涤之后用抗洋地黄毒苷抗体检测结合的洋地黄毒苷化的MAB<H-Fcγpan>M-R10Z8E9。抗体-酶缀合物的POD催化ABTS底物的显色反应。在405nm的波长(参考波长:490nm)通过ELISA读出器测量信号。一式三份测定每一种血清样品的吸光度。
表3:比较缓冲液中(PBS-T,0.5%BSA)的标准曲线
如可在表3和图2中见到的,如果掺加到缓冲液中,那么两种抗人Fc-γ的抗体都适于定量人抗体(MAB<IGF-1R>)。然而,在存在猴IgG′s(5%猕猴血清)的条件下,多克隆AB<H-Fcγ>的ELISA性能变得相当差(表4和图3)。
表4:比较5%猕猴血清中的标准曲线
PAB<H-Fcγ>(Dianova)与猴IgG的交叉反应性造成在猴血清中真实或正确定量人IgG是不可能的。
实施例3:用MAB<H-Fcγpan>M-R10Z8E9定量有活性的人抗体
MAB<IL-1R>
将生物素化的可溶的人IL-1受体(h-IL-1R-Bi)结合于第一步中链霉抗生物素包被的微量滴定板(SA-MTP)上。通过洗涤去除过量的未结合受体。之后将掺加于猕猴血清中的MAB<IL-1R>与固定的人IL-1受体结合。洗去未结合物质后a)用洋地黄毒苷化的针对人IgG链的单克隆抗体(MAB<H-Fcγpan>M-R10Z8E9-DIG),然后与辣根过氧化物酶标记的抗洋地黄毒苷抗体温育来检测结合的MAB<IL-1R>;或者b)用多克隆抗人Fc抗体(Dianova)然后进行洗涤步骤来检测结合的MAB<IL-1R>。抗体-酶缀合物中含有的POD催化ABTS底物的显色反应。在405nm的波长(参考波长:490nm)通过ELISA读出器测量信号。一式三份测定每一种血清样品的吸光度。
表5:检测总的治疗性抗体
表6:检测猕猴血清中的总的治疗性抗体
表5和表6给出的以及图5和图6中所示的数据表明两种抗人Fc-γ的抗体都适于定量掺加于缓冲液中的有活性的人抗体(MAB<IL-1R>)。然而在存在猴IgG(5%(v/v),猕猴血清)的条件下,多克隆AB<H-Fcγ>的ELISA性能变得相当差。与猴IgG的交叉反应性造成灵敏度降低和可变性增加。
实施例4:MAB<H-Fcγpan>M-R10Z8E9用于定量猴血清中有活性的
MAB<IL-1R>的用途
将生物素化的MAB<H-Fcγpan>M-R10Z8E9或生物素化的针对人Fc(b)的多克隆抗人IgG抗体结合于第一步链霉抗生物素包被的微量滴定板(SA-MTP)的孔中。通过洗涤去除过量的未结合抗体。之后掺加于猕猴血清中的MAB<IL-1R>与固定的抗人抗体结合。洗去未结合物质之后用洋地黄毒苷化的可溶性人IL-1受体(h-IL-1R-Dig)检测结合的MAB<IL-1R>然后与辣根过氧化物酶标记的抗洋地黄毒苷抗体温育.抗体-酶缀合物催化ABTS底物的显色反应。此信号在405nm波长(参考波长:490nm)通过ELISA读出器测量。一式三份测定每一种血清样品的吸光度。
示例此检测系统的图示于图7.
表7:比较缓冲液中(PBS-T,0.5%BSA)的标准曲线
表8:比较5%猕猴血清中的标准曲线
如果将治疗性抗体稀释于含5%BSA的PBS-T中,两种人抗体都发挥作用(参见表7和图8)。然而,在存在猴IgG(5%,猕猴血清)的条件下,使用多克隆AB<H-Fcγ>的ELISA性能很差。尽管存在相同数量的治疗性抗体,信号输出仍很低,如表8和图9所示。与猴IgG的交叉反应性造成测定性能取决于猴IgG的总量和成分,其在动物与动物之间和时间点与时间点之间变化。
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Claims (6)
1.在从实验动物获得的样品中检测治疗性抗体的方法,其包括以下步骤:
a)提供待分析的样品;
b)将所述样品与结合所述治疗性抗体且不结合所述实验动物的免疫球蛋白的单克隆抗体温育;
c)任选地将所述样品与适于选择性检测总的、有活性的或结合抗原的治疗性抗体的试剂温育;
d)建立(b)或(c)中形成的复合体与所述治疗性抗体浓度的关系,
其中所述实验动物选自狨猴和小绢猴家族、旧世纪猴、侏儒狐猴和小嘴狐猴、长臂猿和小类人猿、真狐猴以及其杂交品种,所述治疗性抗体为人或人源化抗体,
其中结合治疗性抗体且不结合实验动物免疫球蛋白的所述单克隆抗体为以DSM ACC2708保藏的抗体。
2.根据权利要求1的方法,其特征还在于所述人或人源化抗体为单克隆抗体。
3.根据权利要求1-2之一的方法,其中检测总的治疗性抗体。
4.根据权利要求1-2之一的方法,其中检测有活性的治疗性抗体。
5.根据权利要求1-2之一的方法,其中检测结合其抗原的治疗性抗体。
6.结合治疗性抗体且不结合实验动物免疫球蛋白的单克隆抗体的用途,用于测量从实验动物获得的样品中总的、有活性的或结合抗原的治疗性抗体的浓度,其中所述实验动物选自狨猴和小绢猴家族、旧世纪猴、侏儒狐猴和小嘴狐猴、长臂猿和小类人猿、真狐猴以及其杂交品种,所述治疗性抗体为人或人源化抗体,其中结合治疗性抗体且不结合实验动物免疫球蛋白的所述单克隆抗体为以DSM ACC2708保藏的抗体。
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