CN101137662A - 寡核苷酸及其衍生物的脱保护和纯化 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于核酸分子的合成、脱保护和/或纯化的方法，所述核酸分子例如包含一个或多个核糖核苷酸的寡核苷酸。这种核酸分子包括siRNA、dsRNA、核酶、反义和衔接头。

Description

寡核苷酸及其衍生物的脱保护和纯化
本申请是2003年7月14日提交的国际申请号PCT/US03/21775的部分继续申请，而国际申请号PCT/US03/21775是2002年7月12日提交的美国专利申请序列号10/194,875的部分继续申请。在此将这些申请通过参考文献以其完整的包括附图的形式并入本文。
发明背景
本发明涉及包含一个或多个核糖核苷酸的分子的合成、脱保护和纯化。
以下的讨论涉及含有一个或多个核糖核苷酸的寡核苷酸的合成、脱保护和纯化。本讨论不意味着全部，并且提供仅用于理解以下发明。本概述并非承认任何以下所述的工作是要求保护的本发明的现有技术。
在过去，对核糖核酸许多作用的研究受到有限的产生这些生物学相关分子的方法的阻碍(Cech，1992，Nucleic Acids Research，17，7381-7393；Francklynand Schimmel，1989，Nature，337，478-481；Cook等，1991，Nucleic AcidsResearch，19，1577-1583；Gold，1988，Annu.Rev.Biochemistry，57，199-233)。尽管存在酶促方法，允许探查结构功能关系的规程是受限的。仅仅可以使用均一的合成后化学修饰(Karaoglu and Thurlow，1991，Nucleic Acids Research，19，5293-5300)或定位诱变(Johnson and Benkovic，1990，The Enzymes，Vol.19，Sigman and Boyer，eds.，159-211)。在后者的情况下，研究者们受到天然碱基选择的限制。幸运的是，将用于DNA合成的亚磷酰胺规程适用于RNA合成大大促进了我们对RNA的理解。将修饰的核苷酸位点特异性引入到给定RNA的任何位置如今已经成为常规做法。此外，不限于单一的修饰，而能够在每个分子中包括许多变异。
一种小小的结构修饰能够引起这样的难题看起来是不合情理的。然而，呋喃核糖环的2’-位置上单一羟基的存在已成为RNA领域的研究远远落后于可相比的DNA研究的主要原因。在改进DNA合成方法方面已经取得了进步，使得用于结构和治疗应用的反义脱氧寡核苷酸的大量产生成为可能。仅仅在最近才对于核糖核苷酸也取得了相似的成果(Wincott等，1995，Nulceic AcidsResearch，23，2677-2684；Sproat等，1995，Nucleosides and Nucleotides，14，255-273；Vargeese等，1998，Nucleic Acids Research，26，1046-1050)。
DNA与RNA合成之间的巨大差别是由于难以鉴定5’-和2’-羟基的正交的保护基团(orthogonal protecting group)。在历史上，科学家们采取了两种标准方法试图解决RNA合成问题；开发与DNA合成技术发展水平相一致的方法，或设计特异地适合于RNA的方法。尽管DNA方法的修改(adaptation)提供了更加通用的流程，其中能够将非RNA亚磷酰胺容易地并入RNA寡聚体，但是第二种方法的优势在于能够开发出对于RNA合成最佳的方法，结果能够实现更好的产率。然而，在两种情况下都需要面对相似的问题，例如鉴定与合成条件相容的保护基团，而能够在合适的接合点(juncture)将其移除。这个问题不仅涉及2’-和5’-OH基团，而且还包括碱基和磷酸保护基团。因此，除了辅助剂(ancillary agent)的选择之外，伴随的脱保护步骤也是受影响的。另外的共有问题是对单体构件(monomer building block)有效合成的需求。
寡核糖核苷酸的固相合成与DNA合成遵循同样的途径。使具有相连的(attached)核苷的固形支持物(solid support)经历5’-羟基上保护基团的去除。在激活剂的存在下，将引入的亚磷酰胺偶联至生长链(growing chain)。将任何未反应的5’-羟基加帽，然后将亚磷酸三酯氧化以提供期望的磷酸三酯键。之后重复所述过程直到产生期望长度的寡聚体。根据5’-和2’-保护基团，实际所用的试剂可能不同。其它辅助的试剂同样可以有所差别。
一旦将寡核糖核苷酸合成，随后必需将其脱保护。这通常是两步过程，需要从支持物切割寡聚体以及将碱基和磷酸封闭基团(phosphate blockinggroup)脱保护，之后去除2’-保护基团。有些情况下需要不同的反应顺序或单独将磷酸基团脱保护。在所有情况下，有必要的是不发生对保护基团不加选择的去除，这在第一步是碱基介导的典型情况下是显著的问题。在这种情况中，如果将2’-羟基在这些条件下暴露，由于对邻近的磷酸骨架(phosphatebackbone)上邻位羟基基团的攻击(attack)，将产生链断裂(strand scission)。在RNA合成中普遍而在DNA中不存在的其它两件引起关注的事情是：3’-2’磷酸二酯迁移以提供不期望的2’-5’键的倾向(propensity)，和寡核糖核苷酸对核糖核酸酶降解的敏感性。第二个事实使得许多研究者开发2’-保护基团，其能够保留在适当位置直到期望的实验需要所述的寡聚体。
在过去，将含有2’-O-TBDMS(叔丁基二甲基甲硅烷)基团的寡核糖核苷酸脱保护是两部过程，首先需要类似于脱保护DNA的基本步骤，其中从支持物切割寡聚体，并将碱基和磷酸基团去除。最初的步骤在1-4小时中于55 ℃使用3/1 NH4OH/EtOH完成。由于不将寡聚体更长时间地暴露在剧烈的脱保护条件下，产生较高产率的较高质量的产物。最近报道了需要使用含水甲胺(aqueous methylamine)的更快的两步脱保护规程(Usman等，美国专利号5,804,683；Wincott等，1995，见上文；Reddy等，1995，Tetrahedron Lett.，36，8929-8932)用于RNA。将温育时间缩短到65℃10分钟。与其它RNA脱保护方法相比，使用这种试剂与使用3/1 NH4OH/EtOH的标准规程(Wincott等，1995，见上文)相比给出了更多的全长产物。唯一的要求是必需将乙酰基用作胞苷的N-保护基团，因为由文献充分证明的转氨基反应(Reddy等，1994，Tetrahedron Lett.，35，4311-4314)。如早前所述，通过使用甲胺将此步骤缩短至10分钟。第二步是从寡核苷酸去除2’-甲硅烷基保护基团。在过去这步在室温使用THF中的1 M氟化正四丁基铵(n-tetrabutyl ammonium fluoride)(TBAF)经过24小时完成(Usman等，1987，J. Am.Chem.Soc.，109，7845-7854；Scaringe等，1990，Nucleic Acids Research，18，5433-5341)。不幸的是这种脱保护剂的使用产生了必须在分析和纯化之前去除的盐。此外，保护基团完全去除需要长时间的暴露，加上试剂对外来的(adventitious)水的敏感性(Hogrefe等，1994，Nucleic Acids Research，21，4739-4741)，使其成为不太理想的试剂。尽管某些报道已经公开了关于使用纯三乙胺三氢氟化物(triethylamine trihydrofluoride)(TEA·3HF)(Duplaa等，美国专利号5,552,539，Gasparutto等，1992，NucleicAcids Research，20，5159-5166；Westman等，1994，Nucleic Acids Research，22，2430-2431)作为脱硅烷基试剂，但是结果是混合的。同样已经描述了TEA·3HF连同N-甲基吡咯烷酮N-methyl pyrrolidinone(NMP)(Usman和Wincott，美国专利号5,831,071；Wincott等，1995，见上文)或DMF(Sproat等，1995，见上文)的混合物(cocktail)，其中完全脱保护能够在65℃ 30-90分钟内完成，或在室温4-8小时完成。作为增加的优势，由于无盐产生，能够将产物从脱硅烷基试剂直接沉淀。
Tracz，美国专利号5,977,343；Tracz，美国专利号5,686,599描述了使用无水甲胺和三乙胺三氢氟化物用于核糖核苷酸脱保护的一锅规程(one-potprotocol)。此方法涉及使用无水甲胺，接着使用纯三乙胺三氢氟化物，从而以一锅的方式有效地脱保护寡核糖核苷酸。然而这种规程对于脱保护在平板形式例如96孔平板上合成的寡核苷酸可能难以处理，因为在2’-羟基脱保护之前可需要将固形支持物从部分脱保护的寡核苷酸分离。同样，由于使用的甲胺溶液是无水的，可能难以溶解在碱性处理(basic treatment)之后获得的带负电荷的寡核糖核苷酸。最近已经报道了这种方法，其中使用无水甲胺在乙醇中的混合物，之后添加TEA·3HF可将碱脱保护(basic deprotection)和脱硅烷基两种反应均能够在一锅中完成(Bellon，1999，Current protocols in Nucleic AcidChemistry，Beaucage，Bergstrom，Glick and Jones，eds.，in press)。这种规程使得寡核糖核苷酸的完全脱保护少于2小时，无3’-2’迁移的任何证据。
2’-脱保护的参数通过相应的保护基团支配，所述保护基团用于区别存在于给定寡核苷酸内的2’-化学性质(2’chemistries)。在相同的寡核苷酸分子内使用交替的(alternate)2’-核糖呋喃基(2’-ribofuranosyl)碳环功能可能出现关于这些分子的合成、脱保护和纯化的潜在问题。有效合成经化学修饰以增加核酸酶抗性同时保持催化活性的核酸对于新治疗剂的潜在发展是重要的。目前，Beaudry等，2000，Chemistry and Biology，7，in press描述了体外选择新核酸酶抗性RNA磷酸二酯酶。这种酶促核酸分子能够含有核糖(2’-羟基)和氨基(2’-脱氧-2’-氨基)二者的功能。同时具有核糖和氨基功能的寡核苷酸的大规模合成存在实际的应用问题，所述问题有关相伴的去除叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMSi)和N-邻苯二甲酰基保护基团，而在同时保留核糖核苷酸键的完整性。在寡核苷酸合成期间使用2’-氨基的N-邻苯二甲酰基保护基团提供的好处是与三氟乙酰(TFA)和FMOC基团相比改进的合成产率(Usman等，美国专利号5,631,360；Beigelman等，1995，Nucleic Acids Research，23(21)，4434-4442)。用含水甲胺在65℃容易地切割邻苯二甲酰基并且用氟离子源容易地切割TBDMSi基团，所述氟离子源例如氟化四丁铵(tetrabutylammoniumfluoride)(TBAF)或三乙铵三氢氟化物(TEA·3HF)。如上所述的“一锅”脱保护方法的应用产生N-邻苯二甲酰基保护的不完全脱保护。两步的脱保护方法能够用于完全脱保护含有核糖(2’-TBDMS)和氨基(N-邻苯二甲酰基)两种保护基团的寡核苷酸，然而，这种方法不容易经受大规模寡核苷酸合成或多孔平板寡核苷酸合成的检验。
因而存在是对于快速有效方法的未满足的需求，所述方法使得含有氨基和核糖糖两部分的分子能够完全脱保护。这样的方法将使得大规模合成这样的分子用作治疗剂和小规模合成这样的分子用于组合筛选(combinatorialscreening)成为可能。
发明概述
目前用于包含一个或多个核糖核苷酸的寡核苷酸的寡核苷酸脱保护方法受到完全脱保护所需时间长度和一些保护基团(例如N-邻苯二甲酰基)的不完全脱保护二者的限制。使用无水甲胺和三乙胺三氢氟化物作为“一锅”脱保护混合物利用DMSO以在无水条件下溶解部分脱保护的寡核苷酸(Tracz，美国专利号5,977,343)。由于作为碱水解的结果，在这些条件下核糖核苷酸键对于降解的推测的敏感性，避免将含水甲胺的使用与三乙胺三氢氟化物组合(例如，参见本文描述的实施例3)(Brown等，1952，J. Chem.Soc.，London，2708)。这通过如下方法来克服：利用在去除2’-羟基保护基团之前去除含水甲胺试剂的中间干燥步骤，将三乙胺三氢氟化物处理与含水甲胺处理分开，从而排除核糖核苷酸键的碱水解。这种两步方法经不起大规模寡核苷酸合成和在多孔平板上进行的高通量形式的寡核苷酸合成的检验。“一锅”脱保护方法包括在DMSO作为共溶剂存在下使用无水甲胺和三乙胺三氢氟化物的处理，这种方法的使用对于核糖核苷酸键是有利的(benign)，然而这种方法可能在完全脱保护时间和所得的寡核苷酸质量方面需要额外的优化。此外，“一锅”无水方法对于一些保护基团(例如N-邻苯二甲酰基)的完全去除不是非常有效。本发明的脱保护方法提供快速的“一锅”方法用于完全脱保护包含一个或多个核糖核苷酸的寡核苷酸，并且还能够完全脱保护多种寡核苷酸保护基团，包括N-邻苯二甲酰基。
本发明涉及用于包含一个或多个核糖核苷酸的分子的脱保护和纯化的方法。具体而言，本发明主要描述(feature)用于从核酸碱基、磷酸和2’-羟基(2’-OH)和/或2’-脱氧-2’-氨基(2’-NH2)基团去除保护基团的方法，其使得包含一个或多个核糖核苷酸的分子的脱保护和后续的纯化能够以大规模和高通量的方式进行。
在优选的实施方案中，本发明主要描述用于快速脱保护包含一个或多个核糖核苷酸分子的一锅方法。在另外的实施方案中，本发明主要描述用于快速脱保护包含核糖核苷酸和/或2’-脱氧-2’-氨基呋喃核糖部分的分子，其分别受到烷基甲硅烷基(alkylsilyl)和/或基于邻苯二甲酰基的保护基团的保护。具体而言，本发明提供用于快速脱保护包含核糖核苷酸和/或2’-脱氧-2’-氨基呋喃核糖部分的分子，其分别受到叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMSi)、2＇-O-(三异丙基)甲硅烷氧基甲基(2＇-O-(Triisopropyl)silyloxymethyl)(TOM)和/或N-邻苯二甲酰基保护基团的保护。
在优选的实施方案中，本发明主要描述使用含水甲胺溶液以部分脱保护包含一个或多个核糖核苷酸的分子，接着使用三乙铵三氢氟化物处理用于分子的完全脱保护。在另外的实施方案中，使用三乙铵三氢氟化物的处理在共溶剂(例如，DMSO)的存在下进行。
在一个实施方案中，本发明主要描述用于包含一个或多个核糖核苷酸分子合成、脱保护和纯化的方法，其包括如下步骤：(a)固相、溶液相和/或混合相(hybrid phase)(例如；基于亚磷酰胺的或基于H-膦酸酯的)寡核苷酸合成，以任何合适的顺序包括脱三苯甲基、活化、偶联、加帽和氧化或其相等步骤，随后是(b)脱保护，包括将具有一个或多个核糖核苷酸的核酸分子与含水烷基胺(其中烷基可以是乙基、丙基或丁基并且优选是甲基，例如；甲胺，例如40％含水甲胺)和/或三烷基胺(其中烷基可以是甲基、丙基或丁基并且优选是乙基，例如；三乙胺)在大约10至大约100℃，或大约20℃至大约80℃，或大约30℃至大约65℃，对于包含N-邻苯二甲酰基保护基团的分子优选大约35℃或大约65℃，在适合于部分脱保护寡核苷酸的条件下接触大约5至大约240分钟，大约20至大约100分钟，优选大约60分钟；和在溶剂(例如DMSO、DMF、HMPA、乙醇、甲醇、异丙醇、N-甲基吡咯烷酮等)存在下将部分脱保护的包含一个或多个核糖核苷酸的分子与三乙胺·三氢氟化物(triethylamine·trihydrofluoride)(TEA·3HF)接触，并且在大约10至大约100 ℃，优选在大约65 ℃加热大约5至240分钟，优选大约60分钟，以去除2’-羟基保护基团(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基)，随后使用含水乙酸钠、碳酸氢铵和/或三乙基碳酸氢铵(triethylammonium bjcarbonate)或其相等物，优选50mM含水乙酸钠猝灭(quench)脱保护反应，随后(c)纯化包含一个或多个核糖核苷酸的分子，包括将加样缓冲液中的脱保护的产物加样到介质上，所述介质包含Pharmacia Source Q15和Biorad Macroprep 25Q介质或其相等物，例如Pharmacia Q-sepharose、Perceptive POROS HQ、TOSOHAAS Q-5PW-HR、Q-5PW或超级Q-5PW，所述介质使用包含大约20mM磷酸钠和大约0.1MNaCl中的20％乙醇或乙腈的缓冲液平衡，所述加样缓冲液包含水或大约20mM磷酸钠和大约0.1M NaCl中20％乙醇或乙腈，并且应用大约1.0M NaCl的合适梯度作为洗脱缓冲液，随后通过合适的技术分析级分并使纯级分汇集，使用包含例如选自Sartorius或Pall Filtron PES 1K膜的膜通过切向流过滤或其相等技术脱盐，随后冻干浓缩材料。
在一个实施方案中，本发明主要描述用于包含一个或多个核糖核苷酸和一个或多个化学修饰的核酸分子的合成、脱保护和纯化的方法，其包括步骤：(a)固相、溶液相和/或混合相(例如；基于亚磷酰胺的或基于H-膦酸酯的)寡核苷酸合成，以任何合适的顺序包含脱三苯甲基、活化、偶联、加帽和氧化或其相等步骤，随后是(b)脱保护，包括将核酸分子与含水烷基胺(其中烷基可以是乙基、丙基或丁基并且优选是甲基，例如；甲胺，例如40％含水甲胺)和/或三烷基胺(其中烷基可以是甲基、丙基或丁基并且优选是乙基，例如；三乙胺)在大约10至大约100℃，或大约20℃至大约80℃，或大约30℃至大约65℃，对于包含N-邻苯二甲酰基保护基团的分子优选大约35℃或大约65℃，在适合于部分脱保护核酸分子的条件下接触大约5至大约240分钟，大约20至大约100分钟，优选大约60分钟；并在溶剂(例如DMSO、DMF、HMPA、乙醇、甲醇、异丙醇、N-甲基吡咯烷酮等)存在下将部分脱保护的包含一个或多个核糖核苷酸的分子与三乙胺·三氢氟化物(TEA·3HF)接触，并且在大约10至大约100℃，优选在大约65℃加热大约5至240分钟，优选大约60分钟，以去除2’-羟基保护基团(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基)，随后使用含水乙酸钠、碳酸氢铵和/或三乙基碳酸氢铵或其相等物，优选50mM含水乙酸钠猝灭脱保护反应，随后(c)纯化核酸分子，包括将加样缓冲液中的脱保护的产物加样到介质上，所述介质包含Pharmacia Source Q15和Biorad Macroprep 25Q介质或其相等物，例如Pharmacia Q-sepharose、Perceptive POROS HQ、TOSOHAAS Q-5PW-HR、Q-5PW或超级Q-5PW，所述介质使用包含大约20mM磷酸钠和大约0.1M NaCl中的20％乙醇或乙腈的缓冲液平衡，所述加样缓冲液包含水或大约20mM磷酸钠和大约0.1M NaCl中的20％乙醇或乙腈，并且应用大约1.0M NaCl的合适梯度作为洗脱缓冲液，随后通过合适的技术分析级分并使纯级分汇集，使用包含例如选自Sartorius或Pall Filtron PES 1K膜的膜通过切向流过滤或其相等技术脱盐，随后冻干浓缩材料。在另外的实施方案中，可相同或不同的化学修饰独立地包括糖修饰，如2’-脱氧-2’-氟、2’-O-甲基、2’-C-烷基、2’-脱氧、2’-脱氧-2’-氨基或LNA(锁定核酸(lockednucleic acid))核苷。在另外的实施方案中，核酸分子中可相同或不同的化学修饰包括一个或多个硫代磷酸核苷酸间键(phosphorothioate internucleotidelinkage)。在另外的实施方案中，核酸分子中可相同或不同的化学修饰包含使用一种或多种脱碱基部分(abasic moiety)修饰末端位置。在另外的实施方案中，化学修饰的核酸分子在寡核苷酸的3’-端、5’-端或在3’和5’两端包含末端帽部分。
在另外的实施方案中，根据本发明合成、脱保护和/或纯化的核酸分子包含糖、磷酸骨架、碱基和/或末端修饰的组合。
在另外的实施方案中，本发明主要描述用于脱保护和后续纯化具有保护基团的包含一个或多个核糖核苷酸的核酸分子的方法，其包括步骤：(a)脱保护，包括将核酸分子与含水烷基胺(其中烷基可以是乙基、丙基或丁基并且优选是甲基，例如；甲胺，例如40％含水甲胺)和/或三烷基胺(其中烷基可以是甲基、丙基或丁基并且优选是乙基，例如；三乙胺)在大约10至大约100℃，或大约20℃至大约80℃，或大约30℃至大约65℃，对于包含N-邻苯二甲酰基保护基团的分子优选大约35℃或大约65℃在适合于部分脱保护寡核苷酸的条件下，接触大约5至大约240分钟，或大约20至大约100分钟，优选大约60分钟；和在溶剂(例如DMSO、DMF、HMPA、乙醇、甲醇、异丙醇、N-甲基吡咯烷酮等)存在下将部分脱保护的分子与三乙胺·三氢氟化物(TEA·3HF)接触，并且在大约10至大约100℃，优选在大约65℃加热大约5至240分钟，优选大约60分钟，以去除2’-羟基保护基团(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基)，随后使用含水乙酸钠、碳酸氢铵和/或三乙基碳酸氢铵或其相等物，优选50mM含水乙酸钠猝灭脱保护反应，随后(b)纯化包含一个或多个核糖核苷酸的分子，包括将加样缓冲液中的脱保护的产物加样到介质上，所述介质包含Pharmacia Source Q15和Biorad Macroprep 25Q介质或其相等物，例如Pharmacia Q-sepharose、Perceptive POROS HQ、TOSOHAAS Q-5PW-HR、Q-5PW或超级Q-5PW，所述介质使用包含大约20mM磷酸钠和大约0.1MNaCl中的20％乙醇或乙腈的缓冲液平衡，所述加样缓冲液包含水或大约20mM磷酸钠和大约0.1M NaCl中的20％乙醇或乙腈，并且应用大约1.0M NaCl的合适梯度作为洗脱缓冲液，随后通过合适的技术分析级分并使纯级分汇集，使用包含例如选自Sartorius或Pall Filtron PES 1K膜的膜通过切向流过滤或其相等技术脱盐，随后冻干浓缩材料。
在一个实施方案中，本发明主要描述用于脱保护和后续纯化具有一个或多个核糖核苷酸、一种或多种化学修饰并且具有保护基团的核酸分子的方法，其包括步骤：(a)脱保护，包含将核酸分子与含水烷基胺(其中烷基可以是乙基、丙基或丁基并且优选是甲基，例如；甲胺，例如40％含水甲胺)和/或三烷基胺(其中烷基可以是甲基、丙基或丁基并且优选是乙基，例如；三乙胺)在大约10至大约100℃，或大约20℃至大约80℃，或大约30℃至大约65℃，对于包含N-邻苯二甲酰基保护基团的核酸分子优选大约35℃或大约65℃，在适合于部分脱保护核酸分子的条件下接触大约5至大约240分钟，或大约20至大约100分钟，优选大约60分钟；和在溶剂(例如DMSO、DMF、HMPA、乙醇、甲醇、异丙醇、N-甲基吡咯烷酮等)存在下将部分脱保护的分子与三乙胺·三氢氟化物(TEA·3HF)接触，并且在大约10至大约100 ℃，优选在大约65℃加热大约5至240分钟，优选大约60分钟，以去除2’-羟基保护基团(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基)，随后使用含水乙酸钠、碳酸氢铵和/或三乙基碳酸氢铵或其相等物，优选50mM含水乙酸钠猝灭脱保护反应，随后(b)纯化核酸分子，包括将加样缓冲液中的脱保护的产物加样到介质上，所述介质包含Pharmacia Source Q15和Biorad Macroprep 25Q介质或其相等物，例如Pharmacia Q-sepharose、Perceptive POROS HQ、TOSOHAAS Q-5PW-HR、Q-5PW或超级Q-5PW，所述介质使用包含大约20mM磷酸钠和大约0.1MNaCl中的20％乙醇或乙腈的缓冲液平衡，所述加样缓冲液包含水或大约20mM磷酸钠和大约0.1M NaCl中的20％乙醇或乙腈，并且应用大约1.0M NaCl的合适梯度作为洗脱缓冲液，随后通过合适的技术分析级分并使纯级分汇集，使用包含例如选自Sartorius或Pall Filtron PES 1K膜的膜通过切向流过滤或其相等技术脱盐，随后冻干浓缩材料。在另外的实施方案中，化学修饰的核酸分子独立地包含一种或多种2’-脱氧-2’-氟、2’-O-甲基、2’-C-烷基、2’-脱氧、2’-脱氧-2’-氨基或LNA(锁定核酸)核苷。在另外的实施方案中，化学修饰的核酸分子包含一种或多种硫代磷酸核苷酸间键。在另外的实施方案中，化学修饰的核酸分子包含一种或多种脱碱基部分。在另外的实施方案中，化学修饰的核酸分子在寡核苷酸的3’-端、5’-端或在3’和5’两端包含末端帽部分。
在另外优选的实施方案中，本发明主要描述用于一锅脱保护具有一个或多个核糖核苷酸的具有保护基团的核酸分子的方法，其包括步骤：(a)将核酸分子与含水烷基胺(其中烷基可以是乙基、丙基或丁基并且优选是甲基，例如；甲胺，例如40％含水甲胺)和/或三烷基胺(其中烷基可以是甲基、丙基或丁基并且优选是乙基，例如；三乙胺)在大约10至大约100℃，或大约20℃至大约80℃，或大约30℃至大约65℃，对于包含N-邻苯二甲酰基保护基团的分子优选大约35℃或大约65℃，在适合于部分脱保护寡核苷酸的条件下接触大约5至大约240分钟，或大约20至大约100分钟，优选大约60分钟，和(b)在溶剂(例如DMSO、DMF、HMPA、乙醇、甲醇、异丙醇、N-甲基吡咯烷酮等)存在下将部分脱保护的分子与三乙胺·三氢氟化物(TEA·3HF)接触，并且在大约10至大约100 ℃，优选在大约65 ℃加热大约5至240分钟，优选大约60分钟，以去除2’-羟基保护基团(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基)。在另外的实施方案中，在适合于完全脱保护分子的条件下也可以使用其它烷基胺·HF复合物，(例如三甲胺三氢氟化物和/或二异丙基乙胺三氢氟化物)。
在另外优选的实施方案中，本发明主要描述用于一锅脱保护具有一个或多个核糖核苷酸、一种或多种化学修饰并且具有保护基团的核酸分子，包含步骤：(a)将核酸分子与含水烷基胺(其中烷基可以是乙基、丙基或丁基并且优选是甲基，例如；甲胺，例如40％含水甲胺)和/或三烷基胺(其中烷基可以是甲基、丙基或丁基并且优选是乙基，例如；三乙胺)在大约10至大约100℃，或大约20℃至大约80℃，或大约30℃至大约65℃，对于包含N-邻苯二甲酰基保护基团的分子优选大约35℃或大约65℃，在适合于部分脱保护核酸分子的条件下接触大约5至大约240分钟，或大约20至大约100分钟，优选大约60分钟，和(b)在溶剂(例如DMSO、DMF、HMPA、乙醇、甲醇、异丙醇、N-甲基吡咯烷酮等)存在下将部分脱保护的分子与三乙胺·三氢氟化物(TEA·3HF)接触，并且在大约10至大约100℃，优选在大约65℃加热大约5至240分钟，优选大约60分钟，以去除2’-羟基保护基团(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基)。在另外的实施方案中，在适合于完全脱保护分子的条件下也可以使用其它烷基胺·HF复合体，(例如三甲胺三氢氟化物和/或二异丙基乙胺三氢氟化物)。在另外的实施方案中，化学修饰的核酸分子独立地包含一个或多个2’-脱氧-2’-氟、2’-O-甲基、2’-C-烷基、2’-脱氧、2’-脱氧-2’-氨基或LNA(锁定核酸)核苷。在另外的实施方案中，化学修饰的核酸分子包含一个或多个硫代磷酸核苷酸间键。在另外的实施方案中，化学修饰的核酸分子包含一个或多个脱碱基部分。在另外的实施方案中，化学修饰的核酸分子在寡核苷酸的3’-端、5’-端或在3’和5’两端包含末端帽部分。
在优选的实施方案中，本发明主要描述用于纯化核酸分子的方法，其包括步骤：(a)将加样缓冲液中的粗脱保护的分子加样到介质上，所述介质包含Pharmacia Source Q15和Biorad Macroprep 25Q介质或其相等物，例如Pharmacia Q-sepharose、Perceptive POROS HQ、TOSOHAAS Q-5PW-HR、Q-5PW或超级Q-5PW，所述介质使用包含大约20mM磷酸钠和大约0.1MNaCl中的20％乙醇或乙腈的缓冲液平衡，所述加样缓冲液包含水或大约20mM磷酸钠和大约0.1M NaCl中20％乙醇或乙腈，和(b)应用大约1.0M NaCl的合适梯度作为洗脱缓冲液，随后通过合适的技术分析级分并使纯级分汇集，使用包含例如选自Sartorius或Pall Filtron PES 1K膜的膜通过切向流过滤或其相等技术脱盐。
在优选的实施方案中，本发明主要描述用于纯化化学修饰的核酸分子的方法，其包括步骤：(a)将加样缓冲液中的粗脱保护的分子加样到介质上，所述介质包含Pharmacia Source Q15和Biorad Macroprep 25Q介质或其相等物，例如Pharmacia Q-sepharose、Perceptive POROS HQ、TOSOHAAS Q-5PW-HR、Q-5PW或超级Q-5PW，所述介质使用包含大约20mM磷酸钠和大约0.1MNaCl中的20％乙醇或乙腈的缓冲液平衡，所述加样缓冲液包含水或大约20mM磷酸钠和大约0.1M NaCl中的20％乙醇或乙腈，和(b)应用大约1.0MNaCl的合适梯度作为洗脱缓冲液，随后通过合适的技术分析级分并使纯级分汇集，使用包含例如选自Sartorius或Pall Filtron PES 1K膜的膜通过切向流过滤或其相等技术脱盐。在另外的实施方案中，化学修饰的核酸分子独立地包含一个或多个2’-脱氧-2’-氟、2’-O-甲基、2’-C-烷基、2’-脱氧、2’-脱氧-2’-氨基或LNA(锁定核酸)核苷。在另外的实施方案中，化学修饰的核酸分子包含一个或多个硫代磷酸核苷酸间键。在另外的实施方案中，化学修饰的核酸分子包含一个或多个脱碱基部分。在另外的实施方案中，化学修饰的核酸分子在寡核苷酸的3’-端、5’-端或在3’和5’两端包含末端帽部分。
在一个实施方案中，在本文任何方法中，使用含水甲胺将包含2’-脱氧-2’-氟核苷酸的寡核苷酸在大约35℃脱保护大约30分钟。如果含有2’-脱氧-2’-氟的寡核苷酸还包含核糖核苷酸，在使用含水甲胺在大约35℃脱保护大约30分钟之后，添加TEA-HF并且将反应在大约65℃保持额外的15分钟以完全脱保护寡核苷酸。
在另外的优选实施方案中，将核酸分子或化学修饰的核酸分子在纯化之后冻干。
在优选的实施方案中，可以通过使用含水乙酸钠、碳酸氢铵和/或三乙基碳酸氢铵或其相等物，优选50mM含水乙酸钠来猝灭脱保护反应。
在另外的优选实施方案中，本发明主要描述用于脱保护包含具有2’-N-邻苯二甲酰基和2’-O-甲硅烷基保护的寡核苷酸的核酸分子的方法，其包括步骤：(a)将核酸分子与含水烷基胺(其中烷基可以是乙基、丙基或丁基并且优选是甲基，例如；甲胺，例如40％含水甲胺)和/或三烷基胺(其中烷基可以是甲基、丙基或丁基并且优选是乙基，例如；三乙胺)在大约10至100℃，或大约20℃至大约80℃，或大约30℃至大约65℃，对于包含N-邻苯二甲酰基保护基团的分子优选大约35℃或大约65℃，在适合于部分脱保护寡核苷酸的条件下接触大约5至大约240分钟，或大约20至大约100分钟，优选大约60分钟，和(b)在溶剂(例如DMSO、DMF、HMPA、乙醇、甲醇、异丙醇、N-甲基吡咯烷酮等)存在下将部分脱保护的分子与三乙胺·三氢氟化物(TEA·3HF)接触，并且在大约10至大约100℃，优选在大约65℃加热大约5至240分钟，优选大约60分钟，以去除2’-羟基保护基团(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基)。在另外的实施方案中，在适合于完全脱保护分子的条件下也可以使用其它烷基胺·HF复合体，(例如三甲胺三氢氟化物和/或二异丙基乙胺三氢氟化物)。核酸分子可以还包含化学修饰，例如一种或多种2’-脱氧-2’-氟、2’-O-甲基、2’-C-烷基、2’-脱氧、2’-脱氧-2’-氨基或LNA(锁定核酸)核苷；一种或多种硫代磷酸核苷酸间键；一种或多种脱碱基部分；在寡核苷酸的3’-端、5’-端或在3’和5’两端的末端帽部分。
在优选的实施方案中，将部分脱保护的分子使用合适的过滤介质例如烧结玻璃过滤，并且在用TEA·3HF试剂处理之前用极性溶剂(例如DMSO、DMF、乙醇、甲醇、异丙醇和/或N-甲基吡咯烷酮)洗涤。在另外的实施方案中，在用TEA·3HF试剂处理之前将滤液冷却，优选冷却至大约0℃和-78℃之间。
在另外的方面，本发明主要描述用于寡核苷酸脱保护的方法，其中用含水甲胺溶液，在大约0℃至120℃范围的温度，进行脱保护反应大约500分钟至大约5分钟的时间。
在一个实施方案中，本发明主要描述用于脱保护包括一个或多个2’-脱氧-2’-氟核苷酸的寡核苷酸的方法，其包括：将寡核苷酸与含水甲胺的溶液(例如40％含水甲胺)在大约25℃至大约45℃接触大约30分钟。在另外的实施方案中，将寡核苷酸与含水甲胺的溶液在大约35℃接触大约30分钟。
在一个实施方案中，本发明主要描述用于脱保护包括一个或多个2’-脱氧-2’-氟核苷酸和一个或多个核糖核苷酸的寡核苷酸的方法，其包括：(a)将寡核苷酸与含水甲胺的溶液(例如40％含水甲胺)在大约25℃至大约45℃接触大约30分钟，和(b)在溶剂(例如DMSO、DMF、HMPA、乙醇、甲醇、异丙醇、N-甲基吡咯烷酮等)存在下将(a)的部分脱保护的分子与三乙胺·三氢氟化物(TEA·3HF)接触，并且在大约10至100℃，优选在大约65℃加热额外的5至60分钟，优选约15分钟，以去除2’-羟基保护基团(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基)。在另外的实施方案中，在适合于完全脱保护分子的条件下也可以使用其它烷基胺·HF复合体，(例如三甲胺三氢氟化物和/或二异丙基乙胺三氢氟化物)。在另外的实施方案中，将(a)中的寡核苷酸与含水甲胺的溶液在大约35℃接触大约30分钟。
在一个实施方案中，将本发明的用于脱保护包含一个或多个核糖核苷酸的分子的方法用来脱保护使用柱形式(column format)合成的寡核苷酸。
在一个实施方案中，将本发明用于脱保护包含一个或多个核糖核苷酸的分子的方法用来脱保护根据Usman等，美国专利号5,804,683；5,831,071；5,998,203；6,117,657；6,353,098；6,362,323；6,437,117；6,469,158和/或Vargeese等，USSN 10/190,359中描述的方法合成的寡核苷酸，将所有上述文献以其完整的包括附图的形式并入本文作为参考。
在一个实施方案中，本发明主要描述方法，其包括：(a)合成具有一个或多个核糖核苷酸的寡核苷酸分子，(b)将寡核苷酸与含水烷基胺(其中烷基可以是乙基、丙基或丁基并且优选是甲基，例如；甲胺，例如40％含水甲胺)和/或三烷基胺(其中烷基可以是甲基、丙基或丁基并且优选是乙基，例如；三乙胺)在大约10至大约100℃，或大约20℃至大约80℃，或大约30℃至大约65℃，优选35℃或65℃，在适合于部分脱保护寡核苷酸的条件下接触大约15至240分钟，优选大约30至大约60分钟，和(c)在溶剂(例如DMSO、DMF、HMPA、乙醇、甲醇、异丙醇、N-甲基吡咯烷酮等)存在下将部分脱保护的分子与三乙胺·三氢氟化物(TEA·3HF)接触，并且在大约10至大约100℃，优选在大约65℃加热大约15至240分钟，优选大约30至大约60分钟，以去除2’-羟基保护基团(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基)。在另外的实施方案中，在适合于完全脱保护分子的条件下也可以使用其它烷基胺·HF复合体，(例如三甲胺三氢氟化物和/或二异丙基乙胺三氢氟化物)。
在一个实施方案中，本发明主要描述方法，其包括：(a)合成具有一个或多个核糖核苷酸的寡核苷酸分子，(b)将寡核苷酸与含水烷基胺(其中烷基可以是乙基、丙基或丁基并且优选是甲基，例如；甲胺，例如40％含水甲胺)在大约35℃至大约65℃，在适合于部分脱保护寡核苷酸的条件下接触大约15至大约240分钟(例如大约30至大约60分钟)，和(c)在溶剂(例如DMSO、DMF、HMPA、乙醇、甲醇、异丙醇、N-甲基吡咯烷酮等)存在下将部分脱保护的分子与三乙胺·三氢氟化物(TEA·3HF)接触，并且在大约10至100℃，优选在大约65℃加热大约15至240分钟，优选大约60分钟，以去除2’-羟基保护基团(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基)。在另外的实施方案中，在适合于完全脱保护分子的条件下也可以使用其它烷基胺·HF复合体，(例如三甲胺三氢氟化物和/或二异丙基乙胺三氢氟化物)。
在一个实施方案中，本发明主要描述方法，其包括：(a)合成具有一个或多个2’-脱氧-2’-氟核苷酸和一个或多个核糖核苷酸的寡核苷酸分子，(b)将寡核苷酸与含水烷基胺(其中烷基可以是乙基、丙基或丁基并且优选是甲基，例如；甲胺，例如40％含水甲胺)和/或三烷基胺(其中烷基可以是甲基、丙基或丁基并且优选是乙基，例如；三乙胺)在大约10至大约100℃，或大约20℃至大约80℃，或大约30℃至大约65℃，优选35℃，在适合于部分脱保护寡核苷酸的条件下接触大约15至240分钟，优选大约30分钟，和(c)在溶剂(例如DMSO、DMF、HMPA、乙醇、甲醇、异丙醇、N-甲基吡咯烷酮等)存在下将部分脱保护的分子与三乙胺·三氢氟化物(TEA·3HF)接触，并且在大约10至大约100℃，优选在大约65℃加热大约15至240分钟，优选大约15至大约30分钟，以去除2’-羟基保护基团(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基)。在另外的实施方案中，在适合于完全脱保护分子的条件下也可以使用其它烷基胺·HF复合体，(例如三甲胺三氢氟化物和/或二异丙基乙胺三氢氟化物)。
在一个实施方案中，本发明主要描述方法，其包括：(a)合成具有一个或多个2’-脱氧-2’-氟核苷酸和一个或多个核糖核苷酸的寡核苷酸分子，(b)将寡核苷酸与含水烷基胺(其中烷基可以是乙基、丙基或丁基并且优选是甲基，例如；甲胺，例如40％含水甲胺)在大约30℃至大约65℃，优选大约35℃，在适合于部分脱保护寡核苷酸的条件下接触大约15至240分钟，(例如大约30至大约60分钟)，和(c)在溶剂(例如DMSO、DMF、HMPA、乙醇、甲醇、异丙醇、N-甲基吡咯烷酮等)存在下将部分脱保护的分子与三乙胺·三氢氟化物(TEA·3HF)接触，并且在大约10至大约100℃，优选在大约65℃加热大约15至240分钟，优选大约15至大约30分钟，以去除2’-羟基保护基团(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基)。在另外的实施方案中，在适合于完全脱保护分子的条件下也可以使用其它烷基胺·HF复合体，(例如三甲胺三氢氟化物和/或二异丙基乙胺三氢氟化物)。
在一个实施方案中，本发明主要描述方法，其包括：(a)合成具有一个或多个核糖核苷酸的寡核苷酸分子，(b)将寡核苷酸与含水烷基胺(其中烷基可以是乙基、丙基或丁基并且优选是甲基，例如；甲胺，例如40％含水甲胺)和/或三烷基胺(其中烷基可以是甲基、丙基或丁基并且优选是乙基，例如；三乙胺)在大约10至大约100℃，或大约20℃至大约80℃，或大约30℃至大约65℃，优选大约35℃或65℃，在适合于部分脱保护寡核苷酸的条件下接触大约15至大约240分钟，优选大约30至大约60分钟，(c)在溶剂(例如DMSO、DMF、HMPA、乙醇、甲醇、异丙醇、N-甲基吡咯烷酮等)存在下将部分脱保护的分子与三乙胺·三氢氟化物(TEA·3HF)接触，并且在大约10至大约100℃，优选在大约65℃加热大约15至240分钟，优选大约30至大约60分钟，以去除2’-羟基保护基团(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基)，和(d)在适合于分离寡核苷酸的条件下纯化脱保护的寡核苷酸。
在一个实施方案中，本发明主要描述方法，其包括：(a)合成具有一个或多个核糖核苷酸的寡核苷酸，(b)将寡核苷酸与含水烷基胺(其中烷基可以是乙基、丙基或丁基并且优选是甲基，例如；甲胺，例如40％含水甲胺)在大约35℃至大约65℃，在适合于部分脱保护寡核苷酸的条件下接触大约15至大约240分钟，(例如大约30至大约60分钟)，和(c)在溶剂(例如DMSO、DMF、HMPA、乙醇、甲醇、异丙醇、N-甲基吡咯烷酮等)存在下将部分脱保护的分子与三乙胺·三氢氟化物(TEA·3HF)接触，并且在大约10至大约100℃，优选在大约65℃加热大约15至240分钟，优选大约60分钟，以去除2’-羟基保护基团(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基)，和(d)在适合于分离寡核苷酸的条件下纯化脱保护的寡核苷酸。
在一个实施方案中，本发明主要描述方法，其包括：(a)合成具有一个或多个2’-脱氧-2’-氟核苷酸和一个或多个核糖核苷酸的寡核苷酸分子，(b)将寡核苷酸与含水烷基胺(其中烷基可以是乙基、丙基或丁基并且优选是甲基，例如；甲胺，例如40％含水甲胺)和/或三烷基胺(其中烷基可以是甲基、丙基或丁基并且优选是乙基，例如；三乙胺)在大约10至大约100℃，或大约20℃至大约80℃，或大约30℃至大约65℃，优选35℃，在适合于部分脱保护寡核苷酸的条件下接触大约15至240分钟，优选大约30分钟，和(c)在溶剂(例如DMSO、DMF、HMPA、乙醇、甲醇、异丙醇、N-甲基吡咯烷酮等)存在下将部分脱保护的分子与三乙胺·三氢氟化物(TEA·3HF)接触，并且在大约10至大约100℃，优选在大约65℃加热大约15至240分钟，优选大约15至大约30分钟，以去除2’-羟基保护基团(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基)。在另外的实施方案中，在适合于完全脱保护分子的条件下也可以使用其它烷基胺·HF复合体，(例如三甲胺三氢氟化物和/或二异丙基乙胺三氢氟化物)，和(d)在适合于分离寡核苷酸的条件下纯化脱保护的寡核苷酸。
在一个实施方案中，本发明主要描述方法，其包括：(a)合成具有一个或多个2’-脱氧-2’-氟核苷酸和一个或多个核糖核苷酸的寡核苷酸分子，(b)将寡核苷酸与含水烷基胺(其中烷基可以是乙基、丙基或丁基并且优选是甲基，例如；甲胺，例如40％含水甲胺)在大约30℃至大约65℃，优选大约35℃，在适合于部分脱保护寡核苷酸的条件下接触大约15至240分钟，(例如大约30至大约60分钟)，和(c)在溶剂(例如DMSO、DMF、HMPA、乙醇、甲醇、异丙醇、N-甲基吡咯烷酮等)存在下将部分脱保护的分子与三乙胺·三氢氟化物(TEA·3HF)接触，并且在大约10至100℃，优选在大约65℃加热大约15至240分钟，优选大约15至大约30分钟，以去除2’-羟基保护基团(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基)。在另外的实施方案中，在适合于完全脱保护分子的条件下也可以使用其它烷基胺·HF复合体，(例如三甲胺三氢氟化物和/或二异丙基乙胺三氢氟化物)，和(d)在适合于分离寡核苷酸的条件下纯化脱保护的寡核苷酸。
在一个实施方案中，将本发明的寡核苷酸化学修饰。化学修饰的非限制性实例包括2’-脱氧-2’-氟、2’-O-甲基、2’-C-烷基、2’-脱氧、2’-脱氧-2’-氨基或LNA(锁定核酸)核苷；硫代磷酸酯核苷酸间键；脱碱基部分；或在寡核苷酸的3’-端、5’-端或在3’和5’两端的末端帽部分。化学修饰的siRNA或siNA分子的非限制性实例描述于本文表III和Beigelman等，USSN 10/444,853，和Vargeese等，USSN 11/299,254中，二者均以其包括附图的完整形式并入本文作为参考。
“柱形式”的意思是固相合成，其中将固形支持物(例如，CPG、聚苯乙烯)加样到保持设备(retaining device)中，所述保持设备包括柱(column)、筒(cartridge)或相等物，其使得固形支持物顺序地暴露于试剂，所述试剂适于合成聚合物分子，例如，寡核苷酸及其衍生物。
在另外优选的实施方案中，将本发明的用于脱保护包含一个或多个核糖核苷酸的分子的方法用来脱保护使用多孔平板形式合成的分子。具体而言，本发明提供在多孔平板形式(例如，96孔平板或256孔平板)中寡核苷酸的高通量脱保护。更具体而言主要描述了大于微克量的具有高生物活性的酶促核酸分子的快速脱保护。已经测定酶活性核酸分子以高产率和数量的回收依赖于它的脱保护期间使用的一些关键步骤。
在另外的实施方案中，将本发明的用于脱保护包含一个或多个核糖核苷酸的分子的方法用来脱保护以三苯甲基开启(trityl-on)和三苯甲基关闭(trityl-off)两种方式合成的分子。
“三苯甲基开启”的意思是以完整保留5’-末端二甲氧基三苯甲基保护基团或相等保护基团的方式合成的分子，例如寡核苷酸。
“三苯甲基关闭”的意思是以去除5’-末端二甲氧基三苯甲基保护基团或相等保护基团的方式合成的分子，例如寡核苷酸。
“固相”的意思是包含固形支持物(例如，聚苯乙烯或可控孔度玻璃(controlled pore glass))的合成，将所述固形支持物用作在聚合物分子例如寡核苷酸的合成中顺序添加亚基的支架。可将固形支持物顺序地暴露于溶液中的试剂，由此消除合成期间对重复的纯化和分离步骤的需求。可将接头分子用作固形支持物和生长聚合体之间的界面。可以将固相合成用于亚磷酰胺和H-膦酸酯两种方法的寡核苷酸合成。
“溶液相”的意思是包括在溶液中，例如在提供均质混合物(homogeniousmixture)的溶剂中组合反应物和试剂的合成。考虑到较低的成本、较有效的试剂反应性和工程因素，溶液相合成可以是用于大量合成分子的优选方法。
“混合相”的意思是包含固相和溶液相两种合成元件的合成。
本发明还主要描述包含一个或多个核糖核苷酸的分子的大规模脱保护方法(例如，3mmol合成规模或更大)。更具体而言主要描述大于几克或千克量的具有高生物活性的包含一个或多个核糖核苷酸的分子的快速脱保护。本领域技术人员将认识到的是，能够将有关时间和温度参数的修改用于优化脱保护条件，所述条件用于不同规模的反应和/或不同组成的分子。因此根据改变的分子含量和/或不同反应规模的应用，使用不同的时间和温度参数也在本发明的范围之内。
在优选的实施方案中，本发明主要描述用于纯化本发明的核酸分子的方法。具体而言，本发明主要描述在使用阴离子交换层析的寡核苷酸纯化中使用乙醇或乙腈，优选乙醇作为有机调节物(organic modifier)。在另外的方面，本发明主要描述将乙醇作为有机调节物用于寡核苷酸分子纯化中的用途，所述寡核苷酸分子包括但不限于短干扰RNA(siRNA)、酶促核酸(enzymaticnucleic acid)、反义核酸和/或衔接头(adaptor)。在另外的实施方案中，在大规模纯化期间不采用有机调节物以避免使用有机溶剂，并使用大约20mM磷酸钠和大约0.1M NaCl的溶液代替。
在另外的实施方案中，用于本发明的核酸分子纯化的介质包含PharmaciaSource Q15和Biorad Macroprep 25Q型介质或其相等物，例如PharmaciaQ-sepharose、Perceptive POROS HQ、TOSOHAAS Q-5PW-HR、Q-5PW或超级Q-5PW。在另外的实施方案中，将纯化介质用包含大约20mM磷酸钠和大约0.1M NaCl的缓冲液平衡。而在另外的实施方案中，将纯化介质用包含在大约20mM磷酸钠和大约0.1M NaCl中的20％乙醇或乙腈的缓冲液平衡。
在一个实施方案中，本发明主要描述用于寡核苷酸纯化的加样缓冲液，包含大约20mM磷酸钠和大约0.1M NaCl。在另外的实施方案中，本发明主要描述用于寡核苷酸纯化的加样缓冲液，包含在大约20mM磷酸钠和大约0.1M NaCl中的20％乙醇或乙腈。在一个方面，本发明涉及应用大约1.0M NaCl的合适梯度作为本发明的核酸分子纯化的洗脱缓冲液。在另外的实施方案中，本发明主要描述通过合适的技术(例如，UV、HPLC和/或CGE)分析从本文所述的纯化方法产生的级分，并使纯级分汇集，使用包含例如选自Sartorius或Pall Filtron PES 1K膜的膜通过切向流过滤或其相等技术脱盐。而在另外优选的实施方案中，本发明主要描述了使用冻干法作为浓缩纯化材料的手段。
在一个实施方案中，本发明的siRNA寡核苷酸的纯化方法还包含将两条纯化的寡核苷酸链杂交到一起以形成siRNA双链体的步骤。
“RNA”的意思是包含至少一种核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”的意思是在β-D-呋喃核糖部分的2’位置具有羟基的核苷酸。所述术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA例如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA(essentially pure RNA)、合成的RNA、重组产生的RNA，以及变更的RNA(altered RNA)，其由于添加、缺失、取代和/或变更一个或多个核苷酸而不同于天然存在的RNA。这样的变更可以包括添加非核苷酸材料，例如向siNA的末端或内部添加，例如在RNA的一个或多个核苷酸处添加。本发明的RNA分子中的核苷酸也可以包含非标准核苷酸，例如非天然存在核苷酸或化学合成核苷酸或脱氧核苷酸。可将这些变更的RNA归类为类似物或天然存在的RNA的类似物。RNA可以是siRNA、酶促核酸、反义核酸、诱杀型RNA(decoyRNA)、衔接头RNA、形成三链的寡核苷酸、嵌合RNA、2-5A反义嵌合体、激动剂RNA(agonist RNA)、拮抗剂RNA(antagonist RNA)或任何其它RNA种类。可将RNA用于包括但不限于用作治疗剂、诊断试剂和研究试剂的目的。
如本文中使用的“核酸”、“核酸分子”或“寡核苷酸”的意思是具有两个或两个以上核苷酸的分子。所述核酸可以是单链、双链或多链的，并且可以包含修饰的或未修饰的核苷酸或非核苷酸或其各种混合物和组合。
在一个实施方案中，将本发明的方法用于酶促核酸分子的合成、脱保护和纯化，优选在锤头(hammerhead)、AH核酶、NCH(Inozyme)、G-切割剂(G-cleaver)、amberzyme和/或zinzyme基序(zinzyme motif)中进行。
在一个实施方案中，将本发明的方法用于siRNA分子的合成、脱保护和纯化。
在一个实施方案中，本发明的双链siRNA分子的合成能够包括一个或多个化学修饰，所述合成包含：(a)siRNA分子两条互补链的合成；(b)在适合于获得双链siRNA分子的条件下将两条互补链退火到一起。在另外的实施方案中，siRNA分子两条互补链的合成通过固相寡核苷酸合成进行。而在另外的实施方案中，siRNA分子两条互补链的合成通过固相串联寡核苷酸合成(solidphase tandem oligonucleotide synthesis)进行。
在一个实施方案中，本发明主要描述用于合成双链siRNA双链体分子的方法，其包括：(a)合成siRNA分子的第一寡核苷酸序列链，其中第一寡核苷酸序列链包含可切割的接头分子，能将所述可切割接头分子用作合成siRNA的第二寡核苷酸序列链的支架；(b)在第一寡核苷酸序列链的支架上合成siRNA的第二寡核苷酸序列链，其中第二寡核苷酸序列链还包含能够用于纯化siRNA双链体的化学部分；(c)在适合于两条siRNA寡核苷酸链杂交和形成稳定双链体的条件下切割(a)的接头分子；和(d)使用第二寡核苷酸序列链的化学部分纯化siRNA双链体。在一个实施方案中，以上的(c)中接头分子的切割在寡核苷酸的脱保护期间发生，例如在使用烷基胺碱(alkylamine base)例如甲胺的水解条件下发生。在一个实施方案中，合成方法包括在固形支持物例如可控孔度玻璃(CPG)或聚苯乙烯上的固相合成，其中使用固形支持物作为支架将(a)的第一序列合成在可切割的接头上，例如琥珀酰接头。作为合成第二链的支架使用的(a)中的可切割接头可包含与固形支持物衍生化接头相似的反应性，因此固形支持物衍生化接头和(a)的可切割接头的切割相伴地发生。在另外的实施方案中，能够用于分离连接的寡核苷酸序列的(b)的化学部分包含三苯甲基，例如二甲氧基三苯甲基，其能够用在如本文所述的三苯甲基开启的合成策略中。而另外的实施方案中，将化学部分例如二甲氧基三苯甲基例如，使用酸性条件在纯化期间去除。
在另外的实施方案中，用于双链siRNA合成的方法是溶液相合成或混合相合成，其中使用连接于第一序列可切割接头将siRNA双链体的两条链顺序地(in tandem)合成，所述可切割接头起到合成第二序列的支架的作用。在适合于单独siRNA序列链杂交的条件下接头的切割导致双链siRNA分子的形成。
在另外的实施方案中，本发明主要描述用于合成双链siRNA双链体分子的方法，其包括：(a)合成siRNA分子的一条寡核苷酸序列链，其中所述序列包含可切割接头分子，其能够用作合成另一条寡核苷酸序列的支架；(b)在(a)的支架上合成与第一序列链具有互补性的第二寡核苷酸序列，其中第二序列包含双链siRNA分子的另一条链，并且其中所述第二序列还包含能够用于分离连接的寡核苷酸序列的化学部分；(c)在适合于分离包含通过可切割接头连接的两条siRNA寡核苷酸链的全长序列的条件下，并且在适合于两条siRNA寡核苷酸链杂交并形成稳定双链体的条件下，使用第二寡核苷酸序列链的化学部分纯化(b)的产物。在一个实施方案中，以上的(c)中接头分子的切割在寡核苷酸脱保护期间，例如在水解条件下发生。在另外的实施方案中，以上的(c)中接头分子的切割在寡核苷酸脱保护之后发生。在另外的实施方案中，合成的方法包含在固形支持物例如可控孔度玻璃(CPG)或聚苯乙烯上的固相合成，其中使用固形支持物作为支架将(a)的第一序列合成在可切割的接头，例如琥珀酰接头上。用作合成第二链的支架的(a)中的可切割接头可以包含与固形支持物衍生化接头相似的反应性或不同的反应性，因此固形支持物衍生化接头和(a)的可切割接头的切割相伴地或相继地发生。在一个实施方案中，能够用于分离连接的寡核苷酸序列的(b)的化学部分包含三苯甲基，例如二甲氧基三苯甲基。
在另外的实施方案中，本发明主要描述用于在单一合成过程(singlesynthetic process)中制备双链siRNA分子的方法，其包括：(a)合成具有第一和第二序列的寡核苷酸，其中第一序列与第二序列互补，并且第一寡核苷酸序列通过可切割接头与第二序列连接，并且其中末端5′-保护基团，例如，5′-O-二甲氧基三苯甲基(5′-O-DMT)保留在具有第二序列的寡核苷酸上；(b)脱保护寡核苷酸，由此脱保护导致连接两条寡核苷酸序列的接头的切割；和(c)在适合于分离双链siRNA分子的条件下，例如使用如本文所述的三苯甲基开启的合成策略来纯化(b)的产物。
如本文使用的术语“短干扰核酸”、“siNA”、“短干扰RNA”、“siRNA”、“短干扰核酸分子”、“短干扰寡核苷酸分子”或“化学修饰的短干扰核酸分子”指能够通过介导RNA干扰“RNAi”或序列特异性方式的基因沉默而抑制或负调节基因表达或病毒复制的任何核酸分子。例如siNA可以是包含自身互补的(self-complementary)有义和反义区的双链核酸分子，其中反义区包含与目标核酸分子或其部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，而有义区具有相应于目标核酸序列或其部分的核苷酸序列。siNA可以从两种单独的寡核苷酸装配，其中一条链是有义链而另一条是反义链，其中反义和有义链是自身互补的(即，每条链包含与另一条链中的核苷酸序列互补的核苷酸序列；例如其中反义链和有义链形成双链体或双链结构，例如其中双链区是大约15至大约30，例如，大约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或
Figure A20068000802300241
个碱基对；反义链包含与目标核酸分子或其部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，而有义链包含相应于目标核酸序列或其部分的核苷酸序列(例如，siNA分子的大约15至大约25或更多的核苷酸与目标核酸或其部分互补)。可供选择的是，siNA从单寡核苷酸装配，其中siNA自身互补的有义和反义区依靠基于核酸或不基于核酸的接头连接。siNA可以是多核苷酸，其具有双链体、不对称双链体、发夹或不对称发夹二级结构，具有自身互补有义和反义区，其中反义区包含与单独的目标核酸分子或其部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，而有义区具有相应于目标核酸序列或其部分的核苷酸序列。siNA可以是环状单链多核苷酸，其具有两个或两个以上环结构和包含自身互补的有义和反义区的茎，其中反义区包含与目标核酸分子或其部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，而有义区具有相应于目标核酸序列或其部分的核苷酸序列，并且其中能够将环状多核苷酸体内或体外加工以产生能够介导RNAi的活性siNA分子。siNA也可包含单链多核苷酸，其具有与目标核酸分子或其部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列(例如，其中这种siNA分子不需要在所述siNA分子内存在相应于目标核酸序列或其部分的核苷酸序列)，其中单链多核苷酸可还包含末端磷酸基团，例如5’-磷酸(参见例如Martinez等，2002，Cell.，110，563-574 and Schwarz等，2002，Molecular Cell，10，537-568)或5’，3’-二磷酸。在一些实施方案中，本发明的siNA分子包含单独的有义和反义序列或区，其中有义和反义区通过本领域内已知的核苷酸或非核苷酸接头分子共价连接，或可供选择地通过离子相互作用、氢键、范德瓦尔斯相互作用、疏水
Figure A20068000802300251
和/或堆积相互作用而非共价连接。在一些实施方案中，本发明的siNA分子包含与目标基因的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在另外的实施方案中，本发明的siNA分子与目标基因的核苷酸序列以引起目标基因表达抑制的方式相互作用。如本文中使用的，siNA分子不需局限于那些仅含有RNA的分子，而还包含化学修饰的核苷酸和非核苷酸。在一些实施方案中，本发明的短干扰核酸分子缺乏含有2’-羟基(2′-OH)的核苷酸。申请人在一些实施方案中描述了短干扰核酸不需要存在具有用于介导RNAi的2’-羟基的核苷酸，并且同样地(as such)，本发明的短干扰核酸分子任选地不包括任何核糖核苷酸(例如，具有2′-OH的核苷酸)。这样的siNA分子不需要在siNA分子内存在核糖核苷酸以支持RNAi，然而这样的siNA分子可以具有连接的一个或多个接头或其它连接的或关联的基团、部分或链，其含有一个或多个具有2’-OH基团的核苷酸。任选地，siNA分子能够在大约5、10、20、30、40、或50％的核苷酸位置包含核糖核苷酸。本发明的修饰的短干扰核酸分子也可以指短干扰修饰的寡核苷酸“siMON”。如本文中使用的，术语siNA的意思与用于描述能够介导序列特异性RNAi的核酸分子的其它术语相等，所述其它术语例如短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短干扰寡核苷酸、短干扰核酸、短干扰修饰的寡核苷酸、化学修饰的siRNA、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)等。本发明的siNA分子的非限制性实例在Vargeese等，USSN 11/299,254中描述，将其并入作为参考。这些siNA分子不同于本领域内已知的介导基因表达抑制的其它核酸技术，例如核酶、反义、三链形成、衔接头、2，5-A嵌合体或诱杀型寡核苷酸。
“RNA干扰”或“RNAi”的意思是本领域内公知的抑制或负调节细胞中基因表达生物学方法，并且所述方法由短干扰核酸分子介导，参见例如Zamore and Haley，2005，Science，309，1519-1524；Vaughn and Martienssen，2005，Science，309，1525-1526；Zamore等，2000，Cell，101，25-33；Bass，2001，Nature，411，428-429；Elbashir等，2001，Nature，411，494-498；和Kreutzer等，国际PCT公开号WO 00/44895；Zernicka-Goetz等，国际PCT公开号WO 01/36646；Fire，国际PCT公开号WO 99/32619；Plaetinck等，国际PCT公开号WO 00/01846；Mello和Fire，国际PCT公开号WO 01/29058；Deschamps-Depaillette，国际PCT公开号WO 99/07409；和Li等，国际PCT公开号WO 00/44914；Allshire，2002，Science，297，1818-1819；Volpe等，2002，Science，297，1833-1837；Jenuwein，2002，Science，297，2215-2218；and Hall等，2002，Science，297，2232-2237；Hutvagner and Zamore，2002，Science，297，2056-60；McManus等，2002，RNA，8，842-850；Reinhart等，2002，Gene&Dev.，16，1616-1626；和Reinhart&Bartel，2002，Science，297，1831)。此外，如本文中使用的，术语RNAi的意思与用于描述序列特异性RNA干扰的其它术语相等，所述术语例如转录后基因沉默、翻译抑制、转录抑制或发育遗传学(epigenetics)。例如，能够将本发明的siNA分子用于在转录后水平或转录前水平的后天地(epigenetically)沉默基因。在非限制性实例中，本发明的siNA分子后天调节基因表达可由siNA介导的染色质结构或甲基化模式的修饰而产生，以改变基因表达(参见，例如，Verdel等，2004，Science，303，672-676；Pal-Bhadra等，2004，Science，303，669-672；Allshire，2002，Science，297，1818-1819；Volpe等，2002，Science，297，1833-1837；Jenuwein，2002，Science，297，2215-2218；和Hall等，2002，Science，297，2232-2237)。在另外的非限制性实例中，本发明的siNA分子调节基因表达可由siNA介导的通过RISC的RNA(编码或非编码RNA)切割或可供选择的本领域已知的翻译抑制而产生。在另外的实施方案中，本发明的siNA分子调节基因表达可由转录抑制产生(参见例如Janowski等，2005,Nature ChemicalBiology，1，216-222)。
“不对称发夹”用在本文中的意思是包含反义区、环部分和有义区的线性siNA分子，所述环部分可以包含核苷酸或非核苷酸，在具有足够的互补核苷酸与反义区碱基配对并且形成具有环的双链体的范围内，所述有义区包含少于反义区的核苷酸。例如，本发明的不对称发夹siNA分子可以包含反义区、环区和有义区，所述反义区具有的长度足以介导细胞或体外系统中的RNAi(例如大约19至大约22，例如大约19、20、21或22个核苷酸)，所述环区包含大约4至大约8个核苷酸，所述有义区具有大约3至大约18(例如，大约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个)与反义区互补的核苷酸。不对称发夹siNA分子还可以包含可被化学修饰的5’-末端磷酸基团。不对称发夹siNA分子的环部分可以包含如本文所述的核苷酸、非核苷酸、接头分子或接合分子(conjugate molecule)。
“不对称双链体”用在本文中的意思是具有两条单独的链的siNA分子，所述两条单独的链包含有义区和反义区，其中有义区在具有足够的互补核苷酸与反义区碱基配对并且形成双链体的范围内，所述有义区包含少于反义区的核苷酸。例如，本发明的不对称双链体siNA分子可以包含反义区和有义区，所述反义区具有的长度足以介导细胞或体外系统中的RNAi (例如大约19至大约22个核苷酸)，而有义区具有大约3至大约18个与反义区互补的核苷酸。
“酶促核酸分子”的意思是在底物结合区具有与特异基因目标的互补性并且也具有特异性切割目标RNA的酶活性的核酸分子。即，酶促核酸分子能够分子间切割RNA并且由此失活目标RNA分子。这些互补区使酶促核酸分子与目标RNA充分杂交并且由此允许切割。百分之百的互补性是优选的，但是低如50-75％的互补性在本发明中也可以是有用的。可以将核酸在碱基、糖和/或磷酸基团处修饰。术语酶促核酸与例如下列短语可互换使用：核酶、催化RNA、酶促RNA、催化DNA、aptazyme或结合衔接头的核酶、可调控的核酶、催化寡核苷酸、nucleozyme、DNAzyme、RNA酶、内切核糖核酸酶、核酸内切酶、minizyme、leadzyme、oligozyme或DNA酶。所有这些术语描述具有酶活性的核酸分子。本发明中所述的具体酶促核酸分子不是限制性的，并且本领域技术人员将认识到本发明的酶促核酸分子的重要在于其具有与一个或多个目标核酸区互补的特异的底物结合位点，并且其在底物结合位点之内或周围具有赋予该分子核酸切割活性的核苷酸序列(Cech等，美国专利号4,987,071；Cech等，1988，JAMA)。
“反义核酸”的意思是非酶促核酸分子，所述非酶促核酸分子以RNA-RNA、RNA-DNA或RNA-PNA(蛋白质核酸；Egholm等，1993 Nature 365，566)相互作用的方式结合至目标RNA并且改变目标RNA的活性(综述参见Stein and Cheng，1993 Science 261，1004)。通常，反义分子将与目标序列沿着反义分子的单一邻接序列(single contiguous sequence)互补。然而，在一些实施方案中，反义分子可结合至底物，因而底物分子形成环，和/或反义分子可结合因而反义分子形成环。因此，反义分子可以与两种(或甚至两种以上)非邻接底物序列互补，或反义分子的两种(或甚至两种以上)非邻接序列部分可以与目标序列互补，或二者皆有。
“AH核酶”基序的意思是包含如Kore等，1998，Nucleic Acids Research，26(18)，4116-4120中所述的基序的酶促核酸分子。
“NCH”或“Inozyme”基序的意思是包含如以下文献中所述的基序的酶促核酸分子：Ludwig等，USSN No.09/406,643，1999年9月27日提交，题为“COMPOSITIONS HAVING RNA CLEAVING ACTIVITY”和国际PCT公开号WO 98/58058和WO 98/58057，所有上述文献以其包括附图的完整形式并入本文作为参考。
“G-切割剂”基序的意思是包含如Eckstein等，国际PCT公开号WO99/16871中所述基序的酶促核酸分子，所述文献以其包括附图的完整形式并入本文作为参考。
“zinzyme”基序的意思是包含如Beigelman等，国际PCT公开号WO99/55857中所述基序的II类酶促核酸分子，所述文献以其包括附图的完整形式并入本文作为参考。zinzyme代表在其自身核酸序列内不必为了活性而需要核糖核苷酸(2’-OH)基团的酶促核酸分子的非限制性实例。
“amberzyme”基序的意思是包含如Beigelman等，国际PCT公开号WO99/55857中所述基序的I类酶促核酸分子，所述文献以其包括附图的完整形式并入本文作为参考。amberzyme代表在其自身核酸序列内不必为了活性而需要核糖核苷酸(2’-OH)基团的酶促核酸分子的非限制性实例。
“2-5A反义嵌合体”的意思是含有5’磷酸化的2’-5’-连接的腺苷酸残基的反义寡核苷酸。这些嵌合体以序列特异性方式结合于目标RNA并且活化细胞的2-5A-依赖性核糖核酸酶，其依次切割目标RNA(Torrence等，1993 Proc.Natl.Acad. Sci.USA 90，1300)。
“形成三链的寡核苷酸”的意思是能够以序列特异性方式结合于双链DNA以形成三链螺旋的寡核苷酸。已显示这种三螺旋结构的形成抑制目标基因的转录(Duval-Valentin等，1992 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，504)。
“诱杀型RNA”的意思是模仿配体的天然结合域的RNA分子。因此诱杀型RNA与天然结合靶物竞争与特异性配体的结合。例如，已经证明过量表达HIV反式激活应答(TAR)RNA能够充当“诱杀剂”，并且有效地结合HIV tat蛋白，由此防止其结合至HIV RNA中编码的TAR序列(Sullenger等，1990，Cell，63，601-608)。这意味着一种具体实例。本领域的人员将认识到这不仅是一个实例，并且能够使用本领域公知的技术容易地产生其它实施方案。
“激动剂RNA”的意思是能够结合至具有高亲和性的蛋白质受体并且引起特异性细胞途径的刺激作用的RNA分子。
“拮抗剂RNA”的意思是能够结合至细胞蛋白并且防止其进行正常生物学功能的RNA分子(例如，参见Tsai等，1992 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，8864-8868)。
“衔接头”或“核酸衔接头”用在本文中的意思是特异性结合于目标分子的核酸分子，其中所述核酸分子具有包含由目标分子以其天然配置(naturalsetting)识别的序列的序列。可供选择的是，衔接头可以是结合于目标分子的核酸分子，其中目标分子不天然结合于核酸。目标分子可以是感兴趣的任何分子。例如，可以将衔接头用于结合于蛋白质的配体结合域，由此防止天然存在的配体与蛋白质的相互作用。这是一种非限制性实例，并且本领域的人员认识到可以使用本领域内公知的技术容易地产生其它实施方案。(参见，例如，Gold等，1995，Annu.Rev.Biochem.，64，763；Brody and Gold，2000，J.Biotechnol.，74，5；Sun，2000，Curr.Opin.Mol.Ther.，2，100；Kusser，2000，J.Biotechnol.，74，27；Hermann and Patel，2000，Science，287，820；和Jayasena，1999，Clinical Chemistry，45，1628)。
“化学修饰”用在本文中的意思是核苷酸化学结构的任何修饰，所述核苷酸不同于天然siRNA或RNA的核苷酸。术语“化学修饰”包含如本文所述或本领域以其它方式已知的添加、取代或修饰天然siRNA或RNA核苷和具有修饰的核苷的核苷酸和修饰的核苷酸。这些化学修饰的非限制性实例包括但不限于硫代磷酸酯核苷酸间键、2′-脱氧核糖核苷酸、2′-O-甲基核糖核苷酸、2′-脱氧-2′-氟核糖核苷酸、4’-硫代核糖核苷酸、2’-O-三氟甲基核苷酸、2’-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2’-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸(参加例如USSN10/981，966，2004年11月5日提交，其并入本文作为参考)、“通用碱基(universal base)”核苷酸、“无环”核苷酸、5-C-甲基核苷酸、末端甘油和/或反向脱氧脱碱基残基掺入或具有任何本文中式I-VII的修饰。
“包含(comprising)”的意思包括但不限于在词语“包含”之后的任何事物。因此，术语“包含”的使用说明所列元件是必需的或强制的，但其它元件是任选的并且可以存在或可以不存在。“由......组成(consisting of)”的意思包括并且限于短语“由......组成”省略号部分的(consisting of之后的)任何事物。因此，短语“由......组成”说明所列元件是必需的或强制的，并且无其它元件可以存在。“基本上由......组成(consisting essentially of)”的意思是包括省略号部分(consisting essentially of之后)所列的任何元件，和限定于不干扰或贡献于所列元件在本公开中指明的活性或作用的其它元件。因此，短语“基本上由......组成”说明所列元件是必需的或强制的，但其它元件是任选的并且依赖于它们是否影响所列元件的活性而可以存在或可以不存在。
通过以下对本发明优选实施方案和权利要求的描述，本发明的其它特征和优势将显而易见。
附图简述
首先简要描述附图。
附图
图1是一锅脱保护使用亚磷酰胺方法合成的包含一个或多个核糖核苷酸的核酸分子的图示。
图2是不完全N-邻苯二甲酰基脱保护产物的图示。化合物A代表完整的N-邻苯二甲酰基保护，化合物B代表部分切割的N-邻苯二甲酰基保护，和化合物C代表N-邻苯二甲酰基保护完全切割之后的游离2’-氨基。
图3显示基于电喷射质谱学(ESMS)数据的不同一锅脱保护方法的比较。图3A显示在使用无水甲胺/DMSO/TEA·3HF的脱保护方法之后纯化的全长寡核苷酸的ESMS色谱图，所述全长寡核苷酸含有核糖核苷酸官能(function)(TBDMS保护)和两个2’-氨基官能(N-邻苯二甲酰基保护)。图3B显示在使用含水甲胺/DMSO/TEA·3HF的脱保护方法之后纯化的全长寡核苷酸的ESMS色谱图，所述寡核苷酸含有核糖核苷酸官能(TBDMS保护)和两个2’-氨基官能(N-邻苯二甲酰基保护)。图3A中所见的三个峰代表完全脱保护的寡聚物(oligo)、具有一个完整的部分脱保护的邻苯二甲酰基的脱保护的寡聚物和具有两个完整的部分脱保护的邻苯二甲酰基的脱保护的寡聚物的质量。图3B中所示的单一峰仅代表完全脱保护的寡聚物的质量。
图4显示基于毛细管凝胶电泳数据的不同一锅脱保护方法的比较。图4A显示图3A中所示纯化的全长寡核苷酸的CE色谱图，其由于部分切割的邻苯二甲酰基污染物而产生宽峰。图4B显示图3B所示纯化的全长寡核苷酸的CE色谱图，其产生与同源(homogenous)寡核苷酸种类一致的单一窄峰。
图5显示双链siNA分子合成方案的非限制性实例。将互补的siNA序列链(链1和链2)顺序地合成并且通过可切割连接(cleavable linkage)相连，所述可切割连接例如核苷酸琥珀酸(nucleotide succinate)或脱碱基琥珀酸(abasicsuccinate)，其可以与固形支持物上用于固相合成的可切割接头相同或不同。合成可以是固相或溶液相的任一种，在所示实例中，合成是固相合成。进行合成以将串联寡核苷酸的末端核苷酸上保护基团，例如二甲氧基三苯甲基基团保持完整。在寡核苷酸的切割和脱保护之后，两种siNA链自发杂交以形成siNA双链体，其允许通过使用末端保护基团的性质，例如通过应用三苯甲基开启的纯化方法来纯化双链体，在所述纯化方法中仅将具有末端保护基团的双链体/寡核苷酸分离。
图6显示通过本发明方法合成的纯化的双链siNA双链体的MALDI-TOF质谱。所示的两个峰对应于分离的siNA序列链的预测质量。此结果证明使用简单的三苯甲基开启的纯化方法可将由串接合成(tandem synthesis)产生的siNA双链体纯化为单一整体。
图7显示能够使用的不同稳定化学(1-10)的非限制性实例，例如，以稳定本发明的siNA序列的3’-端，其包括(1)[3-3′]-反向脱氧核糖([3-3′]-inverteddeoxyribose)；(2)脱氧核糖核苷酸；(3)[5′-3′]-3′-脱氧核糖核苷酸；(4)[5′-3′]-核糖核苷酸；(5)[5′-3′]-3′-O-甲基核糖核苷酸；(6)3′-甘油基；(7)[3′-5′]-3′-脱氧核糖核苷酸；(8)[3′-3′]-脱氧核糖核苷酸；(9)[5′-2′]-脱氧核糖核苷酸；和(10)[5-3′]-双脱氧核糖核苷酸。除图中所示的修饰和未修饰的骨架化学之外，这些化学可与如本文所述的不同骨架修饰组合，例如，具有通式1的骨架修饰。此外，在所示末端修饰5′显示的2′-脱氧核苷酸可以是另外的修饰或未修饰的核苷酸或非核苷酸。
发明详述
介导RNA干扰(RNAi)的核酸分子
RNA干扰指在动物中由短干扰RNAs(siRNAs)介导的序列特异性转录后基因沉默方法(Fire等，1998，Nature，391，806)。在植物中相应的方法通常指转录后基因沉默或RNA沉默，同样也指在真菌中的压抑(quelling)。将转录后基因沉默方法认为是进化上保守的细胞防御机制，其用于防止通常由多个区系和门(flora and phyla)共有的外源基因的表达(Fire等，1999，Trends Genet.，15，358)。这种防止外源基因表达的保护可使对双链RNAs(dsRNAs)产生的应答得到发展，所述双链RNAs源自病毒感染或将转座子元件通过细胞应答串联整合至宿主基因组，所述应答特异性破坏同源单链RNA或病毒基因组RNA。细胞中dsRNA的存在通过有待于完全表征的机制触发RNAi应答。这种机制看起来有别于干扰素应答，所述干扰素应答由dsRNA介导的蛋白激酶PKR和2′，5′-寡腺苷酸合成酶的活化作用产生，其导致mRNA通过核糖核酸酶L的非特异性切割。
细胞中长dsRNA的存在刺激被称为切酶(Dicer)的核糖核酸酶III酶的活性。切酶涉及将dsRNA加工成称为短干扰RNAs(siRNAs)的dsRNA短片段(Berstein等，2001，Nature，409，363)。源自切酶活性的短干扰RNAs长度通常是大约21至大约23个核苷酸并且包含大约19个碱基对的双链体。切酶同样涉及将21-和22-核苷酸的小时序(small temporal)RNAs(stRNAs)从涉及翻译控制的保守结构的前体RNA切除(Hutvagner等，2001，Science，293，834)。RNAi应答的特点还在于含有siRNA的内切核酸酶复合体，通常称为RNA-诱导的沉默复合物(RISC)，其介导具有与siRNA同源的序列的单链RNA的切割。目标RNA的切割发生在与siRNA双链体指导序列(guide sequence)互补的区域的中间(Elbashir等，2001，Genes Dev.，15，188)。此外，RNA干扰也可以涉及推测通过调节染色质结构的细胞机制的小RNA(例如，微-RNA(micro-RNA)或miRNA)介导的基因沉默，并由此阻止目标基因序列的转录(参见例如Allshire，2002，Science，297，1818-1819；Volpe等，2002，Science，297，1833-1837；Jenuwein，2002，Science，297，2215-2218；and Hall等，2002，Science，297，2232-2237)。同样，本发明的siNA分子能够用于通过与RNA转录物的相互作用或可选地通过与具体基因序列的相互作用来介导基因沉默，其中这种相互作用导致在转录水平或转录后水平的基因沉默。
已经在多个体系中对RNAi进行了研究。Fire等，1998，Nature，391，806，首次在线虫(C. elegans)中观察到RNAi。Wianny and Goetz，1999，Nature CellBiol.，2，70，描述了在小鼠胚胎中由dsRNA介导的RNAi。Hammond等，2000，Nature，404，293，描述了用dsRNA转染的果蝇(Drosophila)细胞中的RNAi。Elbashir等，2001，Nature，411，494，描述了通过在培养的哺乳动物细胞中引入合成的21-核苷酸RNA的双链体诱导的RNAi，所述哺乳动物细胞包括人胚肾(human embryonic kidney)细胞和HeLa细胞。最近在果蝇胚胎溶胞产物的工作中揭示了对于介导有效RNAi活性至关重要的siRNA长度、结构、化学组成和序列的特定要求。这些研究显示当含有两种2-核苷酸3′-末端核苷酸突出端(overhang)时，21核苷酸siRNA双链体是最有活性的。此外，用2′-脱氧或2′-O-甲基核苷酸取代一条或两条siRNA链彻底破坏RNAi活性，而显示使用脱氧核苷酸取代3′-末端siRNA核苷酸是耐受性的。还显示siRNA双链体中央的错配序列彻底破坏RNAi活性。此外，这些研究也指出在目标RNA中切割位点的位置通过siRNA指导序列的5′-端，而非3′-端限定(Elbashir等，2001，EMBO J.，20，6877)。其它研究已经指出在siRNA双链体目标互补链上的5′-磷酸是siRNA活性所必需的，并且将ATP用于保持siRNA上的5′-磷酸部分(Nykanen等，2001，Cell，107，309)；然而，当外源引入时，缺乏5′-磷酸的siRNA分子是活性的，这说明siRNA构建体的5′-磷酸化可发生在体内。可以将术语短干扰RNA(siRNA)与术语短干扰核酸(siNA)、双链RNA(dsRNA)、微-RNA(miRNA)和短发夹RNA(shRNA)互换使用，其均为能够介导RNA干扰(RNAi)的分子。
酶促核酸分子：
酶促RNA分子是包含一个或多个核糖核苷酸的核酸分子。酶促RNA分子能够以分子内或分子间方式切割RNA或DNA并由此使目标RNA或DNA分子失活。酶促RNA酸分子(enzymatic RNA acid molecule)在底物结合区与特定的基因靶物具有互补性，同样具有特异性切割该靶物中RNA或DNA的酶活性。这种互补性发挥功能以使得酶促RNA分子与目标RNA或DNA充分杂交，从而使切割发生。100％互补性是优选的，然而低如50-75％的互补性在本发明中也可为有用的。可以在碱基、糖和/或磷酸基团处修饰核酸。
将术语酶促RNA酸与短语例如核酶、酶促核酸、催化RNA、酶促RNA、nucleozyme、RNA酶、内切核糖核酸酶、minizyme、leadzyme、oligozyme等互换使用。
“互补性”的意思是通过传统的Watson-Crick或其它非传统类型(例如，Hoogsteen型)碱基配对相互作用，能够与其它RNA序列形成氢键的核酸。
具有内切核酸酶酶活性的RNA分子能够以核苷酸碱基序列特异性的方式重复切割其它分离的RNA分子。这种酶促RNA分子实质上能够靶向至任何RNA转录物，并且在体外实现有效的切割(Zaug等，324，Nature 429 1986；Kim等，84 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8788，1987；Haseloff and Gerlach，334Nature 585，1988；Cech，260 JAMA 3030，1988；and Jefferies等，17 Nucleic AcidsResearch 1371，1989)。
由于它们的序列特异性，反式切割核酶有望作为人类疾病的治疗剂(Usman&McSwiggen，1995 Ann.Rep.Med.Chem. 30，285-294；Christoffersenand Marr，1995 J.Med.Chem.38，2023-2037)。能够将核酶设计为在细胞RNA的背景内切割特定的RNA靶物。这种切割事件致使mRNA成为非功能性的，并且消除来自该RNA的蛋白质表达。以此方式，能够选择性地抑制与疾病状态有关的蛋白质合成。
目前已知七种基本类型的天然存在的酶促RNAs。在生理条件下，每种均能够催化反式(in trans)RNA磷酸二酯键的水解(并且因此能够切割其它RNA分子)。通常，酶促RNA通过首先与目标RNA结合来起作用。这种结合通过酶促核酸的目标结合部分发生，所述目标结合部分被保持与该分子的酶促部分靠得很近，所述酶促部分发挥切割目标RNA的功能。因此，酶促核酸首先识别，随后通过互补碱基配对结合目标RNA，并且一旦结合于正确位点，即发挥酶促功能以切割目标RNA。策略性切割这种目标RNA将破坏其指导合成编码蛋白质的能力。在酶促核酸结合并且切割它的RNA靶物之后，所述酶促核酸从该RNA释放从而搜索另一个靶物并且能够重复地结合和切割新靶物。此外，已将几种体外选择(进化)策略(Orgel，1979，Proc.R.Soc.London，B 205，435)用于发展能够催化磷酸二酯键的切割和连接的新核酸催化剂(Joyce，1989，Gene，82，83-87；Beaudry等，1992，Science 257，635-641；Joyce，1992，Scientific American 267，90-97；Breaker等，1994，TIBTECH 12，268；Bartel等，1993，Science 261：1411-1418；Szostak，1993，TIBS 17，89-93；Kumar等，1995，FASEB J.，9，1183；Breaker，1996，Curr.Op.Biotech.，7，442；Santoro等，1997，Proc.Natl.Acad Sci.，94，4262；Tang等，1997，RNA 3，914；Nakamaye&Eckstein，1994，见上；Long&Uhlenbeck，1994，见上；Ishizaka等，1995，见上；Vaish等，1997，Biochemistry 36，6495；将所有这些文献并入本文作为参考)。每种均能够在生理条件下催化包括反式磷酸二酯键水解的系列反应(并且因此能够切割其它RNA分子)。
核酶的酶促性质具有显著的优势，例如影响治疗处理所必需的核酶浓度较低。此优势反映出核酶发挥酶促作用的能力。因此，单一的核酶分子能够切割许多目标RNA的分子。此外，核酶是高特异性的抑制剂，具有的抑制特异性不仅依赖于结合于目标RNA的碱基配对机制，同样依赖于目标RNA切割的机制。能够选择切割位点附近的单一错配或碱基取代以完全消除核酶的催化活性。
具有内切核酸酶酶活性的核酸分子能够以核苷酸碱基序列特异性的方式重复地切割其它分离的RNA分子。这种酶促核酸分子实际上能够靶向任何RNA转录物并且在体外实现有效的切割(Zaug等，324，Nature 429 1986；Uhlenbeck，1987 Nature 328，596；Kim等，84 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8788，1987；Dreyfus，1988，Einstein Quart.J. Bio.Med.，6，92；Haseloff and Gerlach，334 Nature 585，1988；Cech,260 JAMA 3030，1988；and Jefferies等，17 NucleicAcids Research 1371，1989；Santoro等，1997见上)。
由于它们的序列特异性，反式切割核酶有望作为人类疾病的治疗剂(Usman&McSwiggen，1995 Ann.Rep.Med.Chem.30，285-294；Christoffersenand Marr，1995 J. Med.Chem.38，2023-2037)。能够将核酶设计为在细胞RNA的背景内切割特定的RNA靶物。这种切割事件致使RNA成为非功能性的，并且消除来自该RNA的蛋白质表达。以此方式，能够选择性地抑制与疾病状态有关的蛋白质合成(Warashina等，1999，Chemistry and Biology，6，237-250)。
在一个方面，酶促核酸分子在锤头或发夹基序中形成，但是也可能在丁型肝炎病毒(HDV)、I组内含子、RNaseP RNA(与外部指导序列有关)或脉孢菌属VS RNA(Neurospora VS RNA)的基序中形成。这种锤头基序的实例由Rossi等，1992，Aids Research and Human Retroviruses 8，183；Usman等，1996,Curr.Op.Struct.Biol.,，1，527描述；发夹基序的实例由Hampel等，EP 0360257；Hampel and Tritz，1989 Biochemistry 28，4929；and Hampel等，1990 NucleicAcids Res.18，299；Chowrira等，美国专利号5,631,359描述；丁型肝炎病毒基序的实例由Perrotta and Been，1992 Biochemistry 31，16；Been等，美国专利号5,625,047描述；RNaseP基序的实例由Guerrier-Takada等，1983 Cell 35，849；Forster and Altman，1990 Science 249，783描述；脉孢菌属VS RNA核酶基序由Collins(Saville and Collins，1990 Cell 61，685-696；Saville and Collins，1991Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，8826-8830；Guo and Collins，1995 EMBO J. 14，368)描述；而I组内含子的实例由Zaug等，1986，Nature，324，429；Cech等，美国专利4,987,071描述。本发明中这些具体的基序是非限定性的，并且本领域技术人员将认识到本发明具有内切核酸酶活性的酶促核酸分子的重要在于，其具有与一个或多个目标基因RNA互补的特异性底物结合位点，并且其在该底物结合位点内或周围具有核酸序列，其赋予该分子RNA切割活性。结合位点的长度根据不同的核酶基序而变化，并且本领域内技术人员将认识到为了达到最佳的核酶活性，结合臂的长度应为足够与目标核酸序列形成稳定相互作用的长度。
能够将本发明所述核酶的催化活性如Draper等，见上，所述进行优化。详细内容在此不作重复，但是包括改变核酶结合臂的长度，或化学合成具有修饰(碱基、糖和/或磷酸)的核酶，所述修饰阻止血清核糖核酸酶将其降解和/或增强其酶活性(参见例如，Eckstein等，国际公开号WO 92/07065；Perrault等，1990 Nature 344，565；Pieken等，1991 Science 253，314；Usman andCedergren，1992 Trends in Biochem.Sci.17，334；Usman等，国际公开号WO 93/15187；和Rossi等，国际公开号No.WO 91/03162；Sproat，美国专利号5,334,711；和Burgin等，见上；所有这些描述了能够对酶促RNA分子的碱基、磷酸和/或糖部分进行的不同化学修饰)。增强其细胞中功效的修饰，和从茎环结构去除碱基以缩短RNA合成时间并减少化学的需求是理想的。(将所有这些公开文献并入本文以作参考)。
衔接头：
能够选择核酸衔接头从而特异性结合于感兴趣的具体配体(参见例如Gold等，美国5,567,588和美国5,475,096，Gold等，1995，Annu.Rev.Biochem.，64，763；Brody and Gold，2000，J. Biotechnol.，74，5；Sun，2000，Curr.Opin.Mol.Ther.，2，100；Kusser，2000，J. Biotechnol.，74，27；Hermann and Patel，2000，Science，287，820；和Jayasena，1999，Clinical Chemistry，45，1628)。例如，能够将体外选择的用途应用于发展对于HIV包膜糖蛋白gp41、gp120或破坏病毒融合活性的HIV任何其它部分具有结合特异性的核酸衔接头。核酸衔接头可以包括如本文所述的化学修饰和接头。本发明的核酸衔接头(nucleic aptamer)可以是双链或单链并且可以包含一个独特的核酸序列或彼此复合的(complexed with one another)多于一个核酸序列。本发明的衔接头分子，其结合于HIV包膜糖蛋白，例如gp41，能够调节HIV的融合活性并且因此调节细胞侵入(cell entry)和病毒的感染性。
反义：
反义分子可以是修饰或未修饰的RNA、DNA或混合的聚合体寡核苷酸，并且主要通过特异性结合于匹配的序列导致肽合成的调节而发挥功能(Wu-Pong，Nov 1994，BioPharm，20-33)。反义寡核苷酸通过Watson Crick碱基配对结合于目标RNA，并且通过空间阻断或通过活化RNase H酶阻止所结合序列的核糖体翻译从而阻断基因表达。反义分子也可以通过干扰RNA加工或从核到细胞质中的转运而改变蛋白质合成(Mukhopadhyay&Roth，1996，Crit.Rev.in Oncogenesis 7，151-190)。
此外，单链DNA结合于RNA可以导致异源双链体的核酸酶降解(Wu-Pong,见上文；Crooke，见上)。迄今为止，将充当RNase H底物的仅骨架修饰的DNA化学为硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和硼三氟化物(borontrifluoridates)。最近，已经报导含有2’-阿糖基(2’-arabino)和2’-氟代阿糖基(2’-fluoro arabino)的寡聚物也能够活化RNase H活性。
已经描述了许多反义分子使用化学修饰的核苷酸、二级结构和/或RNaseH底物结构域的新构型(Woolf等，美国5,989,912；Thompson等，USSN60/082,404，于1998年4月20日提交；Hartmann等，USSN 60/101,174，于1998年9月21日提交)，所有这些以其完整方式并入本文以作参考。
能够将反义DNA通过DNA-RNA相互作用用于靶向RNA，由此将消化双链体中目标RNA的RNase H活化。反义DNA能够以化学方法合成，或能够通过使用单链DNA胞内表达载体或其相等物表达。
化学合成具有修饰(碱基、糖和/或磷酸)的核酸分子，所述修饰防止血清核糖核酸酶将核酸分子降解，能够增加该核酸分子的效力(potency)(参见例如Eckstein等；国际公开号WO 92/07065；Perrault等，1990 Nature 344，565；Pieken等，1991，Science 253，314；Usman and Cedergren，1992，Trends inBiochem.Sci.17，334；Usman等；国际公开号WO 93/15187；Rossi等；国际公开号WO 91/03162；Sproat，美国专利号5,334,711；和Burgin等，见上；所有这些描述能够对本文所述核酸分子的碱基、磷酸和/或糖部分进行的不同化学修饰)。将所有这些参考文献通过引用并入本文。在细胞内增强其功效的修饰和从核酸分子去除碱基以缩短寡核苷酸合成时间和减少化学需求是期望的。
本领域存在描述糖、碱基和磷酸修饰的几种实例，可将所述修饰引入核酸分子而显著增强其核酸酶稳定性和功效。例如，修饰寡核苷酸以增强稳定性和/或增强生物活性，通过使用核酸酶抗性基团的修饰，例如，2′-氨基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2′-O-甲基、2′-H、核苷酸碱基修饰(综述参见Usman andCedergren，1992，TIBS.17，34；Usman等，1994，Nucleic Acids Symp.Ser.31，163；Burgin等，1996，Biochemistry，35，14090)。核酸分子的糖修饰在本领域已经广泛地描述(参见Eckstein等，国际公开PCT号WO 92/07065；Perrault等Nature，1990，344，565-568；Pieken等Science，1991，253，314-317；Usman andCedergren，Trends in Biochem.Sci.，1992，17，334-339；Usman等，国际公开PCT号WO 93/15187；Sproat，美国专利号5,334,711和Beigelman等，1995，J.Biol.Chem.，270，25702；Beigelman等，国际PCT公开号WO 97/26270；Beigelman等，美国专利号5,716,824；Usman等，美国专利号5,627,053；Woolf等，国际PCT公开号WO 98/13526；Thompson等，USSN 60/082,404，于1998年4月20日提交；Karpeisky等，1998，Tetrahedron Lett.，39，1131；Earnshaw andGait，1998，Biopolymers(NucleicAcidSciences)，48，39-55；Verma and Eckstein，1998，Annu.Rev.Biochem.，67，99-134；和Burlina等，1997，Bioorg.Med.Chem.，5，1999-2010；将所有参考文献在此以其完整形式并入本文作为参考)。这些公开文献描述一般方法和策略，用来确定糖、碱基和/或磷酸修饰等并入核酶中而不抑制催化的位置。由于这些教导，能够如本文所述使用相似的修饰来修饰本发明的核酸分子。
尽管具有硫代磷酸酯的寡核苷酸核苷酸间键、硫代磷酸酯和/或5’-甲基膦酸酯键的化学修饰改进稳定性，太多这些修饰可能引起一些毒性。因此当设计核酸分子时，应该将这些核苷酸间键的量最小化。这些键浓度的减少应该降低毒性而产生增加的功效和对于这些分子更高的特异性。
提供具有保持或增强活性的化学修饰的核酸分子。这种核酸与未修饰的核酸相比，通常对于核酸酶更具抗性。因此，在细胞中和/或在体内活性可能不会显著降低。外源递送的治疗核酸分子最好必须在细胞内是稳定的，直到将目标RNA的翻译抑制足够久以减少不需要的蛋白质的水平。这段时间依据疾病状态在数小时和数天之间变化。显然的是，核酸分子必须对核酸酶有抗性以作为有效的胞内治疗剂发挥功能。RNA和DNA的化学合成中的改进(Wincott等，1995 Nucleic Acids Res.23，2677；Caruthers等，1992，Methods inEnzymology 211，3-19，通过引用并入本文)扩大了通过引入核苷酸修饰来修饰核酸分子以增强它们的核酸酶稳定性的能力，如上所述。
通过提供组合治疗的可能性(例如，靶向至不同基因的多个反义或酶促核酸分子、与已知小分子抑制剂偶联的核酸分子或用分子(包括不同的基序)和/或其它化学或生物分子的组合的间歇处理)，使用本发明的这些基于核酸的分子将导致对疾病进展更好的治疗。用核酸分子治疗患者也可以包括不同类型核酸分子的组合。
外源递送的治疗核酸分子(例如，酶促核酸分子和反义核酸分子)必须最好在细胞内是稳定的，直到将目标RNA的翻译抑制足够久以减少不需要的蛋白质的水平。这段时间依据疾病状态在数小时到数天之间变化。显然的是，这些核酸分子必须对核酸酶有抗性以作为有效的胞内治疗剂发挥功能。本发明和本领域中所述核酸分子化学合成中的改进扩大了通过引入核苷酸修饰来修饰核酸分子以增强它们的核酸酶稳定性的能力，如上所述。
“增强的酶活性”的意思包括在细胞内和/或体内测量的活性，其中所述活性是催化活性和核酶稳定性二者的反映。在本发明中，与所有RNA核酶或所有DNA酶相比，这些性质的产物在体内增加或不显著地(少于10倍)减少。
而另外的优选实施方案中，提供具有保持或提高酶活性的化学修饰的核酸催化剂。这种核酸与未修饰的核酸相比通常也对核酸酶更有抗性。因此，在细胞中和/或体内活性可不会显著地降低。如本文所例示的，这种核酸分子在细胞中和/或体内是有用的，即使将全部活性减少10倍(参见例如Burgin等，1996，Biochemistry，35，14090)。将本文的这样的核酸称为“保持”全RNA核酸分子，例如核酶或siRNA的活性。
在另外的方面，核酸分子包含5’和/或3’-帽结构。
“帽结构”的意思是化学修饰，将所述化学修饰并入寡核苷酸的任一末端(参见，例如，Wincott等，WO 97/26270，通过引用并入本文)。这些末端修饰保护核酸分子免于外切核酸酶的降解，并且可以辅助递送和/或细胞内的定位。帽可能存在于5’-末端(5’-帽)或于3’-末端(3’-帽)或可以存在与两个末端。在非限制性实例中，5’-帽选自下组：反向脱碱基残基(部分)、4′，5′-亚甲基核苷酸；1-(β-D-红呋喃糖基)核苷酸(1-(β-D-erythrofuranosyl)nucleotide)、4′-硫代核苷酸、碳环核苷酸；1，5-失水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；修饰碱基核苷酸(modified base nucleotide)；二硫代磷酸酯键；苏式-戊糖呋喃糖基核苷酸(threo-pentofuranosyl nucleotide)；无环3′，4′-开环核苷酸；无环3，4-二羟基丁基核苷酸；无环3，5-二羟基戊基核苷酸、3′-3′-反向核苷酸部分；3′-3′-反向脱碱基部分；3′-2′-反向核苷酸部分；3′-2′-反向脱碱基部分；磷酸-1，4-丁二酯(1，4-butanediol phosphate)；3′-氨基磷酸酯(3′-phosphoramidate)；磷酸己酯(hexylphosphate)；氨基磷酸己酯(aminohexyl phosphate)；3′-磷酸酯；3′-硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；或桥联或非桥联甲基膦酸酯部分(更多详细资料参见Wincott等，国际PCT公开号WO 97/26270，并入本文作为参考)。
而在另外的优选实施方案中，3’-帽选自下组：4′，5′-亚甲基核苷酸；1-(β-D-红呋喃糖基)核苷酸；4′-硫代核苷酸、碳环核苷酸；5′-氨基-烷基磷酸酯；1，3-二氨基-2-丙基磷酸酯、3-氨基磷酸丙酯；6-氨基磷酸己酯；1，2-氨基十二烷基磷酸酯；磷酸羟丙酯；1，5-失水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；修饰碱基核苷酸；二硫代磷酸酯；苏式-戊糖呋喃糖基核苷酸；无环3′，4′-开环核苷酸；3，4-二羟基丁基核苷酸；3，5-二羟基戊基核苷酸、5′-5′-反向核苷酸部分；5′-5′-反向脱碱基部分；5′-氨基磷酸酯；5′-硫代磷酸酯；磷酸-1，4-丁二酯；5′-氨基；桥联或非桥联的5′-氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯、桥联或非桥联的甲基磷酸酯和5′-巯基部分(更多详细资料，参见Beaucage and Iyer，1993，Tetrahedron 49，1925；并入本文作为参考)。
术语“非核苷酸”的意思是能够并入核酸链中代替一个或多个核苷酸单位(包括糖和/或磷酸取代)，并且使剩余的碱基能够呈现它们的酶活性的任何基团或化合物。将所述基团或化合物脱碱基，因为其不含通常公认的核苷酸碱基，例如腺苷(adenosine)、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶。
“烷基”指饱和脂族烃，包括直链、支链和环状烷基。优选烷基具有1至12个碳原子。更优选其为1至7个碳原子，更优选1至4个碳原子的低级烷基。烷基可以是取代或未取代的。当是取代的时，取代基优选是羟基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、NO2或N(CH3)2、氨基或SH。该术语还包括烯基，其是含有至少一个碳-碳双键的不饱和烃基，包括直链、支链和环状基团。优选烯基具有1至12个碳原子。更优选其为1至7个碳原子，更优选1至4个碳原子的低级烯基。烯基可以是取代或未取代的。当是取代的时，取代基优选是羟基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、NO2、卤素、N(CH3)2、氨基或SH。术语“烷基”还包括炔基，其具有包含至少一个碳-碳三键的不饱和烃基，包括直链、支链和环状基团。优选炔基具有1至12个碳原子。更优选其为1至7个碳原子，更优选1至4个碳原子的低级炔基。炔基可以是取代或未取代的。当是取代的时，取代基优选是羟基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、NO2或N(CH3)2、氨基或SH。
这些烷基还可以包括芳基、烷基芳基、碳环芳基、杂环芳基、酰胺和酯基。“芳基”指芳族基团，其具有至少一个具有共轭π电子体系的环并且包括碳环芳基、杂环芳基和联芳基(biaryl)，其全部均可被任选地取代。优选的芳基的取代基是卤素、三卤甲基(trihalomethyl)、羟基、SH、OH、氰基、烷氧基、烷基、烯基、炔基和氨基。“烷基芳基”指烷基(如上所述)与芳基(如上所述)共价结合。碳环芳基是其中芳香环上的环原子(ring atom)均为碳原子的基团。碳原子是任选取代的。杂环芳基是具有1至3个杂原子作为芳香环中环原子而剩余环原子是碳原子的基团。合适的杂原子包括氧、硫和氮，还包括呋喃基(furanyl)、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-低级烷基吡咯并、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基等，均为任选取代的。“酰胺”指-C(O)-NH-R，其中R是烷基、芳基、烷基芳基或氢。“酯”指-C(O)-OR＇，其中R是烷基、芳基、烷基芳基或氢。
“核苷酸”用在本文中与本领域公认的一样，包括天然碱基(标准)和本领域公知的修饰的碱基。这样的碱基通常位于核苷酸糖部分的1′位置。核苷酸通常包括碱基、糖和磷酸基团。核苷酸在糖、磷酸和/或碱基部分可以是未修饰的或修饰的，(同样可互换地称为核苷酸类似物、化学修饰的核苷酸、修饰的核苷酸、非天然核苷酸、非标准核苷酸等；参见例如，Usman andMcSwiggen，见上文；Eckstein等，国际PCT公开号WO 92/07065；Usman等，国际PCT公开号WO 93/15187；Uhlman&Peyman，见上，所有均并入本文作为参考)。存在本领域内已知的修饰的核酸碱基的几个实例，如Limbach等，1994，Nucleic Acids Res，22，2183所概述的。能够引入核酸分子的碱基修饰的一些非限制性实例包括肌苷、嘌呤、pyridin-4-one、pyridin-2-one、苯基、假尿嘧啶(pseudouracil)、2，4，6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如，5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如，胸腺嘧啶核糖核苷)、5-卤尿苷(例如，5-溴尿苷)或6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶(例如6-甲基尿苷)、丙炔等(Burgin等，1996，Biochemistry，35，14090；Uhlman&Peyman，见上文)。“修饰的碱基”在本方面的意思是除了在1′位置的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶之外的核苷酸碱基或它们的相等物；可将这样的碱基用在任何位置，例如，在酶促核酸分子的催化核心内和/或在核酸分子的底物结合区中。
在优选的实施方案中，本发明主要描述修饰的核酶，其带有磷酸骨架修饰，所述修饰包含一个或多个硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、吗啉代(morpholino)、酰胺化氨基甲酸酯(amidate carbamate)、羧甲基、乙酰胺化物(acetamidate)、聚酰胺、磺酸酯、氨磺酰(sulfonamide)、氨基磺酸酯、甲缩醛(formacetal)、硫代甲缩醛(thioformacetal)和/或烷基甲硅烷基取代。关于寡核苷酸骨架修饰的综述参见Hunziker and Leumann，1995，Nucleic AcidAnalogues：Synthesis and Properties，in Modern Synthetic Methods，VCH，331-417，和Mesmaeker等，1994，Novel Backbone Replacements forOligonucleotides，in Carbohydrate Modifications in Antisense Research，ACS，24-39。这些参考文献在此通过引用并入本文。
“脱碱基”的意思是糖部分缺乏碱基或具有其它化学基团代替在1′位置的碱基，(更多详细资料，参见Wincott等，国际PCT公开号WO 97/26270)。
“修饰的核苷”或“化学修饰的”的意思是在未修饰或天然存在的核苷酸碱基、糖和/或磷酸部分的化学结构中含有修饰的任何核苷酸。
与本发明所述的2’-修饰的核苷酸有关，“氨基”的意思是2’-NH2或2’-O-NH2，其可以是修饰的或未修饰的。这些修饰的基团分别在例如Eckstein等，美国专利5,672,695和Matulic-Adamic等，WO 98/28317中描述，二者均以其完整形式通过引用并入本文。
可以对核酸(例如，反义和核酶)结构进行各种修饰以增强这些分子的效用。这些修饰将增强保存期限(shelflife)、体外半衰期、稳定性和将这些寡核苷酸引入靶位点的简易性，例如，增强细胞膜的透过率(penetration)，和赋予识别和结合于靶定细胞(targeted cell)的能力。
这些分子的使用将导致通过提供组合治疗的可能性(例如，靶向不同的基因的多种核酶，与已知小分子抑制剂偶联的核酶，或使用核酶(包括不同的核酶基序)和/或其它化学或生物学分子组合的间歇处理)来较好地治疗疾病进展。使用核酸分子治疗患者还可包括不同类型核酸分子的组合。可以将治疗设计成包括针对一个或多个靶物的核酶(包括不同的核酶基序)、反义和/或2-5A嵌合体分子的混合物以减轻疾病的症状。
包含一个或多个核糖核苷酸的寡核苷酸的合成和纯化
使用自动化方法合成长度大于100个核苷酸的核酸是困难的，这些分子的治疗成本高得惊人(prohibitive)。在本发明中，小核酸基序(例如，独立siNA寡核苷酸序列或顺序合成的(synthesized in tandem)siNA序列)优选用于外源递送，其中“小”指核酸基序的长度不多于100个核苷酸，优选不多于80个核苷酸，并且最优选不多于50个核苷酸。这些分子的简单结构增加核酸入侵蛋白质和/或RNA结构的靶定区的能力。本发明例示的分子是化学合成的，而其它能够类似地合成。
使用本领域内已知的规程合成寡核苷酸(例如，一些修饰的寡核苷酸或缺乏核糖核苷酸的寡核苷酸的部分)，例如以下文献中所述：Caruthers等，1992,Methods in Enzymology 211，3-19，Thompson等，国际PCT公开号WO99/54459，Wincott等，1995，Nucleic Acids Res. 23，2677-2684，Wincott等，1997，Methods Mol.Bio.，74，59，Brennan等，1998，Biotechnol Bioeng.，61，33-45和Brennan，美国专利号6,001,311。将所有这些参考文献通过引用并入本文。寡核苷酸的合成使用普通的核酸保护和偶联基团，例如在5′-端的二甲氧基三苯甲基和在3′-端的亚磷酰胺。在非限定实例中，小规模合成在394 AppliedBiosystems，Inc.合成仪上使用0.2μmol规模规程进行，所述规程具有对于2′-O-甲基化核苷酸的2.5分钟偶联步骤，和对于2′-脱氧核苷酸或2′-脱氧-2′-氟核苷酸的45秒偶联步骤。表I概括了合成循环中所用试剂的量和接触时间。可选择地，可将0.2μmol规模的合成在96孔平板合成器，例如由Protogene(Palo Alto，CA)生产的仪器上进行，其对循环具有最小的修饰。可将33倍过量(0.11M的60μL＝6.6μmol)的2′-O-甲基亚磷酰胺和105倍过量的S-乙基四唑(0.25M的60μL＝15μmol)用在2′-O-甲基残基相对于与多聚体结合的5′-羟基的各偶联循环中。可将22倍过量(0.11M的40μL＝4.4μmol)的脱氧亚磷酰胺和70倍过量的S-乙基四唑(0.25M的40μL＝10μmol)用在脱氧残基相对于与多聚体结合的5′-羟基的各偶联循环中。在394 Applied Biosystems，Inc.合成仪上通过三苯甲基级分的比色定量测定的平均偶联产率通常是97.5-99％。用于394 Applied Biosystems，Inc.合成仪的其它寡核苷酸合成试剂包括以下：脱三苯甲基溶液是二氯甲烷中3％的TCA(ABI)；用THF中的16％N-甲基咪唑(ABI)和THF中的10％乙酸酐/10％2，6-二甲基吡啶(ABI)进行加帽；并且氧化溶液是THF中的16.9mM I2、49mM吡啶(pyridine)、9％水(PERSEPTIVETM)。直接从试剂瓶使用Burdick&Jackson Synthesis Grade乙腈。将S-乙基四唑溶液(0.25M在乙腈中)从获得自American International Chemical，Inc的固体制备。可选择地，对于硫代磷酸酯键的引入，使用Beaucage试剂(3H-1，2-苯并二巯基-3-酮1，1-二氧化物(3H-1，2-Benzodithiol-3-one 1，1-dioxide)，0.05M在乙腈中)。
将基于DNA的寡核苷酸的脱保护如下进行：将与多聚体结合的三苯甲基开启的寡核糖核苷酸转移至4mL玻璃螺旋盖小瓶，在40％含水甲胺(1mL)溶液中于65℃悬浮10分钟。冷却至-20℃之后，将上清液从聚合体支持物去除。将支持物使用1.0mL EtOH∶MeCN∶H2O/3∶1∶1洗涤三次，涡旋振动(vortex)并且随后将上清液添加到最初的上清液中。将含有寡核糖核苷酸的组合的上清液干燥成白色粉末。
用于合成包括本发明的一些siNA分子的RNA的方法遵循如Usman等，1987，J. Am.Chem.Soc.，109，7845；Scaringe等，1990，NuclaicAcidsRes.，18，5433；和Wincott等，1995，Nucleic AcidsRes.  23，2677-2684 Wincott等，1997，Methods Mol.Bio.，74，59所述的方法，并且使用普通的核酸保护和偶联基团，例如在5′-端的二甲氧基三苯甲基，和在3′-端的亚磷酰胺。在非限定性实施例中，小规模合成在394 Applied Biosystems，Inc.合成仪上使用0.2μmol规模规程进行，所述规程具有对于烷基甲硅烷基保护核苷酸的7.5分钟偶联步骤，和对于2′-O-甲基化核苷酸的2.5分钟偶联步骤。表I概括了合成循环中所用试剂的量和接触时间。可选择地，可将0.2μmol规模的合成在96孔平板合成器上，例如由Protogene(Palo Alto，CA)生产的仪器进行，其对循环具有最小的修饰。可将33倍过量(0.11M的60μL＝6.6μmol)的2′-O-甲基亚磷酰胺和75倍过量的S-乙基四唑(0.25M的60μL＝15μmol)用在2′-O-甲基残基相对于与多聚体结合的5′-羟基的各偶联循环中。可将66倍过量(0.11M的120μL＝13.2μmol)的烷基甲硅烷基(核糖)保护的亚磷酰胺和150倍过量的S-乙基四唑(0.25M的120μL＝30μmol)用在核糖残基相对于与多聚体结合的5′-羟基的各偶联循环中。在394 Applied Biosystems，Inc.合成仪上通过三苯甲基级分的比色定量测定的平均偶联产率通常是97.5-99％。用于394 Applied Biosystems，Inc.合成仪的其它寡核苷酸合成试剂包括以下：脱三苯甲基溶液是二氯甲烷中的3％TCA(ABI)；用THF中的16％N-甲基咪唑(ABI)和THF中的10％乙酸酐/10％2，6-二甲基吡啶(ABI)进行加帽；氧化溶液是THF中的16.9 mM I2、49mM吡啶、9％水(PERSEPTIVETM)。直接从试剂瓶使用Burdick&JacksonSynthesis Grade乙腈。S-乙基四唑溶液(0.25 M在乙腈中)从获得自AmericanInternational Chemical，Inc的固体制备。可选择地，对于硫代磷酸酯键的引入，使用Beaucage试剂(3H-1，2-苯并二巯基-3-酮1，1-二氧化物，0.05M在乙腈中)。
将包含一个或多个核糖核苷酸的寡核苷酸的脱保护根据本发明进行。将寡核苷酸根据本发明，和/或使用一般方法通过凝胶电泳纯化，或通过高压液相色谱(HPLC；参见Stinchcomb等，国际PCT公开号WO 95/23225，其全部在此并入本文作为参考)纯化并且在水中重悬。对于三苯甲基开启的寡聚体的纯化，将猝灭的NH4HCO3溶液加样到已经先后使用乙腈和50mM TEAA预洗涤过的含C-18的柱子上。在用水洗涤加样的柱子后，将RNA用0.5％TFA脱三苯甲基(detritylate)13分钟。随后再次使用水洗涤柱子，用1M NaCl盐交换，并且再次用水洗涤。随后将寡核苷酸使用30％乙腈洗脱(elute)。
平均分步偶联产率通常>98％(Wincott等，1995 Nucleic Acids Res. 23，2677-2684)。本领域的普通技术人员将认识到可将合成的规模变为与上述实例相比更大或更小，包括但不限于96孔形式。
可选择地，本发明的核酸分子能够独立合成并且在合成后结合到一起，例如，通过连接(Moore等，1992，Science 256，9923；Draper等，国际PCT公开号WO 93/23569；Shabarova等，1991，Nucleic Acids Research 19，4247；Bellon等，1997，Nucleosides&Nucleotides，16，951；Bellon等，1997，BioconjugateChem.8，204)，或通过在合成和/或脱保护之后杂交进行。
本发明的核酸分子(例如siNA分子)也能够通过顺序合成方法合成，其中将两条siNA链均作为由可切割接头分隔的单独的邻接寡核苷酸片段或链来合成，之后将所述接头切割以提供分离的siNA片段或链，所述片段或链杂交并且允许siNA双链体的纯化(参见McSwiggen等，USSN(10/444,853)，2003年5月23日提交)。接头可以是多核苷酸接头或非核苷酸接头。能够容易地将本文所述的siNA顺序合成改变成多孔/多板两种合成平台例如96孔或相似的更大的多孔平台。还能够容易地将本文所述的siNA顺序合成改变成采用分批反应器、合成柱等的大规模合成平台。
也可以从两个截然不同的核酸链或片段装配核酸分子(例如siNA分子)，其中一个片段包括RNA分子的有义区而另一个片段包括反义区。
可通过用核酸酶抗性基团的修饰来广泛地修饰本发明的核酸分子以增强稳定性，所述核酸酶抗性基团例如2′-氨基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2′-O-甲基、2′-H(综述参见Usman and Cedergren，1992，TIBS 17，34；Usman等，1994，Nucleic Acids Symp.Ser.31，163)。能够将siNA构建体通过使用一般方法的凝胶电泳纯化，或能够通过高压液相色谱(HPLC；参见Wincott等，见上，其全部在此通过引用并入本文)纯化，并且在水中重悬。
包含一个或多个核糖核苷酸的寡核苷酸的脱保护
对于寡核糖核苷酸大规模和高通量的化学合成，重要的是将涉及寡核糖核苷酸脱保护两个主要步骤(即去除氨基保护基团和磷酸保护基团的碱处理(basic treatment)，和去除2’-OH烷基甲硅烷基保护基团例如叔丁基二甲基甲硅烷基的氟化物处理)进行精简(condense)。
Stinchcomb等，见上描述了基于无水甲胺和三乙胺三氢氟化物的时间上高效的(time-efficient)(大约2小时)一锅脱保护规程。由于已经报导了氟化物处理期间的水污染可能对脱硅烷基反应的效率有害(Hogrefeetal，1993，Nucleic Acids Res.，21，4739-4741)，也因为含水甲胺与TEA·3HF的组合使用导致核糖核苷酸降解(参见实施例3)，之前一直认为有必要使用碱的无水溶液例如无水乙醇中的33％甲胺，接着是纯的三乙胺三氢氟化物，以有效地以一锅方式脱保护寡核糖核苷酸。然而，通过不完全脱保护产物结果(参见图2，化合物B)，已经证明这些条件对于2’-N-邻苯二甲酰基保护基团的完全脱保护较不重要，所述2’-N-邻苯二甲酰基保护基团用于保护含2’-脱氧-2’-氨基核苷的核酸分子的2’-氨基官能。尝试为了邻苯二甲酰基的完全去除而施加较长时间和/或较高温度的无水脱保护反应条件导致核糖核苷酸种类的显著降解。因此，申请人研究了使用含水甲胺连同TEA·3HF和DMSO作为一锅方法用于寡核苷酸脱保护。令人惊讶地，当在DMSO存在下使用这种方法时不引起预期的核糖核苷酸键的碱水解。无DMSO方法的应用导致全长核酸的较低产率，推测这来自核糖核苷酸键的碱水解(参见实施例3)。与现有的两锅含水和一锅无水方法相比，本文所述的一锅含水方法提供了用于寡核苷酸脱保护的显著较短的时间，并且提供了产率和纯度增加的材料。
实施例
以下是说明寡核苷酸脱保护的非限定性实施例。
实施例1使用一锅无水脱保护方法小规模脱保护包含带有2’-O-TBDMS/N-邻苯二甲酰基保护的一个或多个核糖核苷酸的寡核苷酸
将含有两个N-邻苯二甲酰基保护的2’-氨基核苷的核酶序列(表II)(200mol)在CPG支持物上使用Pharmacia OPII合成仪如本文所述合成。合成之后，将支持物干燥15至30分钟。将大约20mg支持物转移至5ml螺旋盖小瓶。将33％甲胺/乙醇(800μl)和干燥DMSO(800μl)的1∶1混合物添加到支持物并且将混合物使用加热块(heating block)在65℃加热15分钟。将溶液冷却至室温(rt)，随后通过0.5微米滤器过滤到另外的5ml螺旋盖小瓶中。将TEA·3HF(600μl)添加到反应混合物中，之后在65℃加热15分钟。随后将混合物冷却，并且使用50mM NaOAc(2ml)猝灭。将相应的脱保护的、纯化的全长寡核苷酸通过Capillary Gel Electrophoresis和ES Mass Spec分析。质谱揭示了三个峰，其质量相应于完全脱保护的寡核苷酸、具有完整的一个部分切割的邻苯二甲酰基的寡核苷酸，和具有完整的两个部分切割的邻苯二甲酰基的寡核苷酸(图3A)。CGE色谱显示单一的宽峰(图4A)。可将相似的方法用于脱保护其它寡核苷酸，例如siRNA、反义和衔接头寡核苷酸。
实施例2使用一锅含水脱保护方法小规模脱保护包含带有2’-O-TBDMS/N-邻苯二甲酰基保护的一个或多个核糖核苷酸的寡核苷酸
将核酶序列(表II)(200μmole)如本文所述在CPG支持物上使用Pharmacia OPII合成仪合成。合成之后，将支持物干燥15至30分钟。将大约20mg支持物转移至5ml螺旋盖小瓶并且将支持物与含水甲胺(1ml)一起在65℃使用加热块加热15分钟。将溶液冷却至室温，随后通过0.5微米滤器过滤到另外的5ml螺旋盖小瓶中。将DMSO(1.6ml)和TEA·3HF(600μl)添加到反应混合物，接着在65℃加热15分钟。随后将混合物冷却，并且使用50mM NaOAc(2ml)猝灭。将相应的脱保护、纯化的全长寡核苷酸通过CapillaryGel Electrophoresis和ES Mass Spec分析。质谱揭示了一个峰，其质量相应于完全脱保护的寡核苷酸(图3B)。CGE色谱显示单一的窄峰(图4B)。可将相似的方法用于脱保护其它寡核苷酸，例如siRNA、反义和衔接头寡核苷酸，其含有核糖核苷酸和/或具有化学修饰。此外，可将脱保护条件改变以提供寡核苷酸构建体最佳的可能产率和纯度。例如，申请人观察到包含2’-脱氧-2’-氟核苷酸的寡核苷酸能够在不合适的脱保护条件下降解。将这些寡核苷酸使用含水甲胺在大约35℃脱保护30分钟。如果含2’-脱氧-2’-氟的寡核苷酸还包含核糖核苷酸，在使用含水甲胺在大约35℃脱保护30分钟之后，添加TEA-HF并且将反应在大约65℃保持额外的15分钟。
实施例3使用无DMSO的一锅含水脱保护方法小规模脱保护包含带有2’-O-TBDMS/N-邻苯二甲酰基保护的一个或多个核糖核苷酸的寡核苷酸
将核酶序列(表II)(200μmole)如本文所述在CPG支持物上使用Pharmacia OPII合成仪合成。合成之后，将支持物干燥15至30分钟。将大约20mg支持物转移至5ml螺旋盖小瓶并且将支持物与含水甲胺(1ml)一起在65℃使用加热块加热15分钟。将溶液冷却至室温，随后通过0.5微米滤器过滤到另外的5ml螺旋盖小瓶中。将TEA·3HF(600μl)添加到反应混合物，接着在65℃加热15分钟。随后将混合物冷却，并且使用50mM NaOAc(2ml)猝灭。将相应的脱保护、纯化的全长寡核苷酸通过离子交换HPLC分析。HPLC示踪(trace)揭示了与来自将DMSO用在脱保护中的实施例2的材料相比，相应于寡核苷酸内核糖核酸键切割的显著降解。可将相似的方法用于脱保护其它寡核苷酸，例如siRNA、反义和衔接头寡核苷酸，其含有核糖核苷酸和/或化学修饰。此外，可将脱保护条件改变以提供寡核苷酸构建体最佳的可能产率和纯度。例如，申请人观察到包含2’-脱氧-2’-氟核苷酸的寡核苷酸能够在不合适的脱保护条件下降解。将这些寡核苷酸使用含水甲胺在大约35℃脱保护30分钟。如果含2’-脱氧-2’-氟的寡核苷酸还包含核糖核苷酸，在使用含水甲胺在大约35℃脱保护30分钟之后，添加TEA-HF并且将反应在大约65℃保持额外的15分钟。
实施例4使用一锅无水脱保护方法大规模脱保护包含带有2’-O-TBDMS保护的一个或多个核糖核苷酸的寡核苷酸
将核酶序列(表II)(200μmole)如本文所述在CPG支持物上使用Pharmacia OPII合成仪合成。合成之后，将支持物干燥15至30分钟并且转移至500ml Schott瓶。将33％甲胺/乙醇(75ml)和干燥DMSO(75ml)的1∶1混合物添加到支持物并且将混合物在温育摇床中于35℃加热4小时。将溶液冷却至室温(15分钟)，随后通过烧结玻璃漏斗过滤。将支持物使用DMSO(4x15ml)洗涤，并且将结合的滤液在冰浴中冷却30分钟。将TEA·3HF(30ml)添加到反应混合物中，之后在65℃加热1小时。随后将混合物在-78℃冷却30分钟，并且使用50mM NaOAc(200ml)猝灭。可将相似的方法用于脱保护其它寡核苷酸，例如siRNA、反义和衔接头(apatmer)寡核苷酸。
实施例5使用一锅含水脱保护方法大规模脱保护包含带有2’-O-TBDMS保护的一个或多个核糖核苷酸的寡核苷酸
将核酶序列(表II)(200μmole)如本文所述在CPG支持物上使用Pharmacia OPII合成仪合成。合成之后，将支持物干燥15至30分钟并且转移至250ml Schott瓶。将40％含水甲胺(75ml)添加到支持物并且将混合物在温育摇床中于35℃加热1小时。将溶液冷却至室温(15分钟)，随后通过烧结玻璃漏斗过滤。将支持物使用DMSO(4x18.75ml)洗涤，并且将组合的滤液在冰浴中冷却30分钟。将TEA·3HF(45ml)添加到反应混合物中，之后在65℃加热1小时。随后将混合物在-78℃冷却30分钟，并且使用50mM NaOAc(195ml)猝灭。可将相似的方法用于脱保护其它寡核苷酸，例如siRNA、反义和衔接头寡核苷酸，其含有核糖核苷酸和/或化学修饰。此外，可将脱保护条件改变以提供寡核苷酸构建体最佳的可能产率和纯度。例如，申请人观察到包含2’-脱氧-2’-氟核苷酸的寡核苷酸能够在不合适的脱保护条件下降解。将这些寡核苷酸使用含水甲胺在大约35℃脱保护30分钟。如果含2’-脱氧-2’-氟的寡核苷酸还包含核糖核苷酸，在使用含水甲胺在大约35℃脱保护30分钟之后，添加TEA-HF并且将反应在大约65℃保持额外的15分钟。
实施例6使用一锅含水脱保护方法大规模脱保护包含带有2’-O-TBDMS/N-邻苯二甲酰基保护的一个或多个核糖核苷酸的寡核苷酸
将核酶序列(表II)(200μmole)如本文所述在CPG支持物上使用Pharmacia OPII合成仪合成。合成之后，将支持物干燥15至30分钟并且转移至250ml Schott瓶。将40％含水甲胺(75ml)添加到支持物并且将混合物在温育摇床中于65℃加热1小时。将溶液冷却至室温(15分钟)，随后通过烧结玻璃漏斗过滤。将支持物使用DMSO(4x18.75ml)洗涤，并且将组合的滤液在-78℃冷却30分钟。将TEA·3HF 45ml)添加到反应混合物中，之后在65℃加热1小时。随后将混合物在冰浴中冷却30分钟，并且使用50mM NaOAc(195ml)猝灭。可将相似的方法用于脱保护其它寡核苷酸，例如siRNA、反义和衔接头寡核苷酸，其含有核糖核苷酸和/或具有化学修饰。此外，可将脱保护条件改变以提供寡核苷酸构建体最佳的可能产率和纯度。例如，申请人观察到包含2’-脱氧-2’-氟核苷酸的寡核苷酸能够在不合适的脱保护条件下降解。将这种寡核苷酸使用含水甲胺在大约35℃脱保护30分钟。如果含2’-脱氧-2’-氟的寡核苷酸还包含核糖核苷酸，在使用含水甲胺在大约35℃脱保护30分钟之后，添加TEA-HF并且将反应在大约65℃保持额外的15分钟。
实施例7包含一个或多个核糖核苷酸的寡核苷酸的大规模离子交换纯化
将包含一个或多个核糖核苷酸的寡核苷酸(例如，siRNA、反义或衔接头寡核苷酸)在脱保护之后通过离子交换层析纯化。离子交换纯化方法能够在Pharmacia Source Q15和Biorad Macroprep 25Q型两种介质上进行。用于平衡纯化介质的缓冲液是0-20％乙醇(200 proof USP级)或乙腈，在20毫摩尔(mmolar)磷酸钠和0.1M NaCl中。可将相同的缓冲液用于将核酸分子加样到纯化介质上，或可选择地，可使用水。将粗寡核苷酸材料以至多10mg/mL的浓度加样到柱上。可将合适梯度的洗脱缓冲液的应用例如1.0M NaCl用于分离级分。纯化之后，通过合适的方法(例如UV、HPLC和/或CGE)分析级分的纯度。将纯级分汇集，并且使用例如Sartorius或Pall Filtron PES 1K膜的膜通过切向流过滤进行脱盐。随后将浓缩的材料冻干。可将相似的方法用于纯化本发明的siRNA构建体，例如单链、发夹(haipin)和双链体siRNA。对于双链体siRNA，将各链分别合成、脱保护和纯化，随后在适合于双链体形成的条件下杂交。在非限制性实例中，将siRNA链在100mM乙酸钾、30mMHEPES-KOH，pH7.4、2mM乙酸镁中以每种链各20μM退火。将退火的混合物首先加热至90℃持续1分钟，并且随后转移至37℃持续60分钟。将退火通过非变性PAGE确认。可选择地，可将双链体siRNA使用顺序合成方法如以下实施例8中所述合成。
实施例8siRNA构建体的顺序合成
将本发明例示的siRNA分子使用可切割接头，例如基于琥珀酰的接头顺序合成。如本文所述的顺序合成之后是一步纯化方法，其以高产率提供RNAi分子。这种方法非常能够接受siNA合成的考验，支持高通量RNAi筛选，并且能够容易地改变成多柱或多孔合成平台。
在完成siNA寡聚物及其互补体(complement)的顺序合成之后，将寡核苷酸如上所述，例如如实施例2中所述脱保护，所述补体中的5′-末端二甲氧基三苯甲基(5′-O-DMT)基团保持完整(三苯甲基开启的合成)。脱保护之后，siNA序列链能够自发杂交。这种杂交产生双链体，其中一条链保留了5′-O-DMT基团而互补链包含末端5′-羟基。新形成的双链体在常规固相提取纯化(三苯甲基开启的纯化)中表现为单一分子，虽然仅有一个分子具有二甲氧基三苯甲基基团(even though only one molecule has a dimethoxytrityl group)。因为链形成稳定的双链体，仅需这种二甲氧基三苯甲基基团(或相等基团，例如其它三苯甲基基团或其它疏水部分)就能纯化寡聚物对，例如，通过使用C18柱。
使用标准亚磷酰胺合成化学直到引入顺序接头(tandem linker)的点，所述接头例如反向脱氧脱碱基琥珀酸酯或甘油琥珀酸酯接头(参见图5)或相等的可切割接头。能够使用的接头偶联条件的非限制性实例包括受阻碱基(hindered base)例如二异丙基乙胺(DIPA)和/或DMAP在激活剂试剂如溴三吡咯烷基磷鎓六氟磷酸酯(Bromotripyrrolidinophosphoniumhexaflurorophosphate)(PyBrOP)的存在下。将接头偶联之后，使用标准合成化学以完全合成保留末端5′-O-DMT完整的第二序列。在合成之后，将所得寡核苷酸根据本发明所述方法脱保护，并且使用合适的缓冲液猝灭，例如使用50mM NaOAc或1.5MNH4HCO3。
siRNA双链体的纯化能够容易地使用固相提取完成，例如使用Waters C18SepPak 1g柱体，条件为1柱床体积(CV)乙腈、2CV H2O和2CV 50mMNaOAc。加样样品并且随后使用1CV H2O或50mM NaOAc洗涤。用1CV 14％ACN(含有50mM NaOAc和50mM NaCl的水溶液)洗脱失败的序列。随后将柱洗涤，例如使用1CV H2O之后是柱上脱三苯甲基，例如通过将1CV 1％含水三氟乙酸(TFA)经过柱，随后向柱添加第二CV的1％含水TFA并且使其静置大约10分钟。去除保持的TFA溶液，使用H2O洗涤柱之后用1CV 1M NaCl并再用H2O洗涤。随后洗脱siNA双链体产物，例如，使用1CV 20％含水CAN。
图6提供纯化的siNA构建体MALDI-TOF质谱分析的实例，其中每个峰相应于siNA双链体的独立siNA链的计算质量。当使用毛细管凝胶电泳(CGE)时，同样的纯化siNA提供三个峰，推测一个峰相应于双链体siNA，而推测两个峰相应于分离的siNA序列链。相同siNA构建体(contract)的离子交换HPLC分析仅显示单一的峰。如下描述的使用荧光素酶报告分子检测纯化siNA构建体的试验证明，与产生自分别合成的寡核苷酸序列链的siNA构建体相比具有相同的RNAi活性。
其它用途
可将本发明的核酸分子(例如，核酶)用作治疗剂以治疗广谱的疾病和症状。核酶是具有酶活性的RNA分子，其能够以核苷酸碱基序列特异性方式重复切割其它分离的RNA分子。这种酶促RNA分子能够靶向事实上任何RNA转录物，并且在体外完成有效的切割。Kim等，1987，Proc.Nat.Acad.of Sci.USA，84，8788，Hazeloff等，1988 Nature，234，585，Cech，1988，JAMA，260，3030和Jefferies等，1989，Nucleic Acid Research，17，1371。核酶首先通过结合于目标RNA作用。这种结合通过核酶的目标RNA结合部分发生，所述部分与发挥切割目标RNA功能的RNA酶促部分紧密相邻。因此，核酶首先识别并且随后通过互补碱基配对结合目标RNA，并且一旦结合于正确的位点，即发挥酶促功能切割目标RNA。对这种目标RNA的策略性切割将破坏其指导合成编码蛋白质的能力。在核酶结合和切割它的RNA靶物之后，其会从该RNA释放以搜索另外的靶物并且能够重复地结合和切割新靶物。
可将本发明的核酸分子用作诊断工具以检查患病细胞内的遗传漂变(genetic drift)和突变或检测细胞中特定RNA的存在。核酶活性和目标RNA结构之间的紧密联系允许检测能改变目标RNA的碱基配对和三维结构的分子的任何区域中突变。通过使用本发明中所述的多种核酶，可以描绘(map)核苷酸改变，所述改变对于RNA结构和体外以及细胞和组织中的功能是重要的。可将用核酶切割目标RNA用于抑制基因表达和定义特定的基因产物在疾病进展中的(本质上)作用。以这种方式，可将其它遗传靶物定义为疾病的重要介导物(mediator)。这些实验通过提供组合治疗的可能性(例如，靶向不同基因的多个核酶、与已知小分子抑制剂偶联的核酶，或用核酶和/或其它化学或生物学分子组合的间歇处理)将导致对疾病进展更好的治疗。本发明的核酶的其它体外用途在本领域内是熟知的，并包括检测与RNA相关病症(RNA-relatedcondition)有关的mRNA存在。这种RNA通过用核酶处理之后使用标准方法测定切割产物的存在而检测。
在具体实例中，将仅能够切割野生型或突变体形式的目标RNA的核酶用于检测。将第一种核酶用于鉴定存在于样品中的野生型RNA，而第二种核酶将用于鉴定样品中的突变RNA。作为反应对照，将野生型和突变RNA二者的合成底物均通过两种核酶切割以证明反应中相对的核酶效率和对“非目标”RNA种类不存在切割。来自合成底物的切割产物将同样用来产生用于分析样本群体中的野生型和突变RNA的大小标记物。因此，每种分析可需要两种核酶、两种底物和一种未知样品，其将组合出六种反应。将使用RNAse保护试验测定切割产物的存在，因而能够将每种RNA的全长和切割片段在聚丙烯酰胺凝胶的一个泳道中分析。量化结果以了解突变RNA的表达和靶细胞中所需表型改变的推定风险不是绝对必需的。其蛋白质产物涉及表型发育的mRNA的表达足以承受风险。如果对两种转录物使用相当的比活性的探针，则RNA水平的定性比较将是足够的并且将减少最初诊断的成本。较高的突变型和野生型的比率将与较高的风险相关联，而无论将RNA水平定性或定量比较。
本说明书中提及的所有专利和出版物表明本发明所属领域的技术人员的技术水平。将在本公开内容中引用的所有参考文献通过引用并入，其程度如同将各参考文献以其完整形式独立地并入作为参考。
本领域技术人员将容易地理解，本发明很好地适合于完成本发明的目的并且获得提到的以及其中固有的那些结果和优势。本文所述的目前作为优选实施方案代表的方法和组合物是示例性的，而不意欲作为本发明范围的限制。所附权利要求书的范围限定了本领域的技术人员可进行的改变和发现的其它用途包含在本发明精神之内。
对于本领域技术人员显而易见的是，在不背离本发明范围和宗旨的前提下可对本文公开的本发明进行各种替换和修改。因此，这种额外的实施方案在本发明和如下权利要求的范围之内。
可将本文示例性描述的本发明适宜地在不存在本文未具体公开的任何一个或多个元件、任何一个或多个限定的情况下实施。因此，例如，在本文各种情况下，术语“包含”、“基本上由......组成”和“由......组成”的任何一个均可使用另外两个术语中的任一个取代。将采用的术语和表述用作描述性而非限定性的术语，而使用这些术语和表述的目的并非将所显示和描述的特征的相等物或其部分排除在外，但须认识到各种改变可能仍在本发明要求保护的范围之内。因此，应该理解的是尽管本发明通过优选实施方案和任选特征进行具体的公开，本领域技术人员可采取对本文所公开概念的更改和变异，并且这些更改和变异被认为是在由说明书和所附权利要求所限定的本发明范围之内。
此外，本发明的特征或方面是根据Markush组或可选择的其它分组描述的，本领域技术人员将认识到本发明因此同样根据Markush组或其它组的任何独立成员或成员的亚组描述。
因此，额外的实施方案在本发明的范围内并在如下权利要求之内。
其它实施方案在如下权利要求的范围内。
表I
A.2.5μmol合成循环ABI394仪器
试剂 当量(equivalent) 量 等待时间*DNA 等待时间*2’-O-甲基 等待时间*RNA
亚磷酰胺 6.5 163μL 45秒 2.5分钟 7.5分钟
S-乙基四唑 23.8 238μL 45秒 2.5分钟 7.5分钟
乙酸酐 100 233μL 5秒 5秒 5秒
N-甲基咪唑 186 233μL 5秒 5秒 5秒
TCA 176 2.3mL 21秒 21秒 21秒
碘 11.2 1.7mL 45秒 45秒 45秒
Beaucage 12.9 645μL 100秒 300秒 300秒
乙腈 NA 6.67mL NA NA NA
B.0.2μmol合成循环ABI394仪器
试剂 当量 量 等待时间*DNA 等待时间*2’-O-甲基 等待时间*RNA
亚磷酰胺 15 31μL 45秒 233秒 465秒
S-乙基四唑 38.7 31μL 45秒 233分钟 465秒
乙酸酐 655 124μL 5秒 5秒 5秒
N-甲基咪唑 1245 124μL 5秒 5秒 5秒
TCA 700 732μL 10秒 10秒 10秒
碘 20.6 244μL 15秒 15秒 15秒
Beaucage 7.7 232μL 100秒 300秒 300秒
乙腈 NA 2.64mL NA NA NA
C.0.2μmol合成循环96孔仪器
试剂 当量：DNA/2’-O-甲基/核糖 量：DNA/2’-O-甲基/核糖 等待时间*DNA 等待时间*2’-O-甲基 等待时间*核糖
亚磷酰胺 22/33/66 40/60/120μL 60秒 180秒 360秒
S-乙基四唑 70/105/210 40/60/120μL 60秒 180分钟 360秒
乙酸酐 265/265/265 50/50/50μL 10秒 10秒 10秒
N-甲基咪唑 502/502/502 50/50/50μL 10秒 10秒 10秒
TCA 238/475/475 250/500/500μL 15秒 15秒 15秒
碘 6.8/6.8/6.8 80/80/80μL 30秒 30秒 30秒
Beaucage 34/51/51 80/120/120 100秒 200秒 200秒
乙腈 NA 1150/1150/1150μL NA NA NA
*等待时间不包括递送过程中的接触时间。
表II用于脱保护研究的核酸序列
  序列   化合物号   Seq ID No.
  gscsasgsug GccgaaagGCGaGuGaGGuCu agcuca B   19292   1
小写字母＝2’-O-甲基
大写字母＝核糖核苷酸
C＝2’-脱氧-2’-氨基胞苷
s＝硫代磷酸酯核苷酸间键
B＝反向脱氧脱碱基部分
表III
用于化学修饰的siNA构建体的稳定化学的非限定实例
    化学     嘧啶     嘌呤     帽     p＝S     链
    “Stab 00”     核糖     核糖     TT在3’-端     S/AS
    “Stab 1”     核糖     核糖     5’-端5个3’-端1个     S/AS
    “Stab 2”     核糖     核糖     所有键     通常是AS
    “Stab 3”     2’-氟     核糖     5’-端4个3’-端4个     通常是S
    “Stab 4”     2’-氟     核糖     5’和3’-端     通常是S
    “Stab 5”     2’-氟     核糖     3’-端1个      通常是AS
    “Stab 6”     2’-O-甲基     核糖     5’和3’-端     通常是S
    “Stab 7”     2’-氟     2’-脱氧     5’和3’-端     通常是S
    “Stab 8”     2’-氟     2’-O-甲基     3’-端1个     S/AS
    “Stab 9”     核糖     核糖     5’和3’-端     通常是S
    “Stab 10”     核糖     核糖     3’-端1个     通常是AS
    “Stab 11”     2’-氟     2’-脱氧     3’-端1个     通常是AS
    “Stab 12”     2’-氟     LNA     5’和3’-端     通常是S
    “Stab 13”     2’-氟     LNA      3’-端1个     通常是AS
    “Stab 14”     2’-氟     2’-脱氧     5’-端2个3’-端1个     通常是AS
    “Stab 15”     2’-脱氧     2’-脱氧     5’-端2个3’-端1个     通常是AS
    “Stab 16”     核糖     2’-O-甲基     5’和3’-端     通常是S
    “Stab 17”     2’-O-甲基     2’-O-甲基     5’和3’-端     通常是S
    “Stab 18”     2’-氟     2’-O-甲基     5’和3’-端     通常是S
    “Stab 19”     2’-氟     2’-O-甲基     3’-端     S/AS
    “Stab 20”     2’-氟     2’-脱氧     3’-端     通常是AS
    “Stab 21”     2’-氟     核糖     3’-端     通常是AS
    “Stab 22”     核糖     核糖     3’-端     通常是AS
    “Stab 23”     2’-氟*     2’-脱氧*     5’和3’-端     通常是S
    “Stab 24”     2’-氟*     2’-O-甲基*     3’-端1个     S/AS
    “Stab 25”     2’-氟*     2’-O-甲基*     3’-端1个     S/AS
    “Stab 26”     2’-氟*     2’-O-甲基*     S/AS
    “Stab 27”     2’-氟*     2’-O-甲基*     3’-端     S/AS
    “Stab 28”     2’-氟*     2’-O-甲基*     3’-端     S/AS
    “Stab 29”     2’-氟*     2’-O-甲基*     3’-端1个     S/AS
    “Stab 30”     2’-氟*     2’-O-甲基*     S/AS
    “Stab 31”     2’-氟*     2’-O-甲基*     3’-端     S/AS
    “Stab 32”     2’-氟     2’-O-甲基     S/AS
    “Stab 33”     2’-氟     2’-脱氧*     5’和3’-端     通常是S
    “Stab 34”     2’-氟     2’-O-甲基*     5’和3’-端     通常是S
    “Stab 3F”     2’-OCF3     核糖     5’-端4个3’-端4个     通常是S
    “Stab 4F”     2’-OCF3     核糖     5’和3’-端     通常是S
    “Stab 5F”     2’-OCF3     核糖     3’-端1个     通常是AS
    “Stab 7F”     2’-OCF3     2’-脱氧     5’和3’-端     通常是S
    “Stab 8F”     2’-OCF3     2’-O-甲基     3’-端1个     S/AS
    “Stab 11F”     2’-OCF3     2’-脱氧     3’-端1个     通常是AS
    “Stab 12F”     2’-OCF3     LNA     5’和3’-端     通常是S
    “Stab 13F”     2’-OCF3     LNA     3’-端1个     通常是AS
    “Stab 14F”     2’-OCF3     2’-脱氧     5’-端2个3’-端1个     通常是AS
    “Stab 15F”     2’-OCF3     2’-脱氧     5’-端2个3’-端1个     通常是AS
    “Stab 18F”     2’-OCF3     2’-O-甲基     5’和3’-端     通常是S
    “Stab 19F”     2’-OCF3     2’-O-甲基     3’-端     S/AS
  “Stab 20F”   2’-OCF3   2’-脱氧   3’-端   通常是AS
  “Stab 21F”   2’-OCF3   核糖   3’-端   通常是AS
  “Stab 23F”   2’-OCF3*   2’-脱氧*   5’和3’-端   通常是S
  “Stab 24F”   2’-OCF3*   2’-O-甲基*   3’-端1个   S/AS
  “Stab 25F”   2’-OCF3*   2’-O-甲基*   3’-端1个   S/AS
  “Stab 26F”   2’-OCF3*   2’-O-甲基*   S/AS
  “Stab 27F”   2’-OCF3*   2’-O-甲基*   3’-端   S/AS
  “Stab 28F”   2’-OCF3*   2’-O-甲基*   3’-端   S/AS
  “Stab 29F”   2’-OCF3*   2’-O-甲基*   3’-端1个   S/AS
  “Stab 30F”   2’-OCF3*   2’-O-甲基*   S/AS
  “Stab 31F”   2’-OCF3*   2’-O-甲基*   3’-端   S/AS
  “Stab 32F”   2’-OCF3   2’-O-甲基   S/AS
  “Stab 33F”   2’-OCF3   2’-脱氧*   5’和3’-端   通常是S
  “Stab 34F”   2’-OCF3   2’-O-甲基*   5’和3’-端   通常是S
CAP＝任何末端帽，参见例如图7。
全部Stab 00-34化学能够包含3’-末端胸苷(TT)残基全部Stab 00-34化学通常包含约21个核苷酸，但是能够如本文所述变化。
全部Stab 00-34化学还能够在有义或过客链(passenger strand)中，在从有义或指导链的5’-端测定的双链核酸双链体第11个碱基配对位置包括单一核糖核苷酸。
S＝有义链
AS＝反义链
*Stab 23具有与3’-帽相邻的单一核糖核苷酸
*Stab 24和Stab 28在5’-末端具有单一核糖核苷酸
*Stab 25、Stab 26和Stab 27在5’-末端具有3个核糖核苷酸
*Stab 29、Stab 30、Stab 31、Stab 33和Stab 34从5’-末端起在最初三个核苷酸位置的任何嘌呤都是核糖核苷酸。
p＝硫代磷酸键

Claims (25)

1.一种方法，其包括步骤：
a)合成包含一个或多个核糖核苷酸的核酸分子，使用选自下组的方法：基于固相亚磷酰胺、溶液相亚磷酰胺、固相H-膦酸酯、溶液相H-膦酸酯、混合相亚磷酰胺和混合相H-膦酸酯的合成方法；
b)在适合于从所述分子去除任何2’-氨基保护基团、环外氨基(碱基)保护基团和/或磷酸保护基团的条件下，将来自步骤(a)所述核酸分子与含水烷基胺、三烷基胺或烷基胺和三烷基胺接触，所述保护基团可以独立地存在或不存在。
c)将具有来自步骤(b)的核酸分子的反应混合物与极性溶剂和三烷基胺·氢氟化物在适合于去除2’-OH保护基团的条件下接触；
d)将具有所述核酸分子的来自步骤(c)的反应混合物加样到在合适的缓冲液中的选自下组的介质上：Pharmacia Source Q15、Biorad Macroprep 25Q、Pharmacia Q-sepharose、Perceptive POROS HQ、TOSOHAAS Q-5PW-HR、Q-5PW和超级Q-5PW介质，所述缓冲液包含选自下组的缓冲液：水、大约20mM磷酸钠和大约0.1M NaCl中的20％乙醇和大约20mM磷酸钠和大约0.1M NaCl中的乙腈；
e)使用合适的洗脱缓冲液施加纯化梯度，分析级分并且使得纯级分能够汇集和脱盐。
2.权利要求1的方法，其中包含一个或多个核糖核苷酸的所述核酸分子是siRNA分子。
3.权利要求2的方法，其中所述siRNA分子还包含一种或多种2’-脱氧-2’-氟核苷酸。
4.权利要求1的方法，其中所述含水烷基胺是含水甲胺。
5.权利要求1的方法，其中所述含水烷基胺是40％的含水甲胺。
6.权利要求1的方法，其中所述三烷基胺·三氢氟化物是三乙胺·三氢氟化物(TEA·3HF)。
7.权利要求1的方法，其中所述2’-OH保护基团包含叔丁基二甲基甲硅烷(TBDMSi)保护基团及其衍生物。
8.权利要求1的方法，其中所述核酸分子包含一种或多种化学修饰。
9.一种纯化核酸分子的方法，其包括步骤：
a)将所述核酸分子加样到加样缓冲液中的介质上，所述介质选自下组：Pharmacia Source Q15、Biorad Macroprep 25Q、Pharmacia Q-sepharose、Perceptive POROS HQ、TOSOHAAS Q-5PW-HR、Q-5PW和超级Q-5PW介质，所述加样缓冲液包含选自下组的缓冲液：水、大约20mM磷酸钠和大约0.1MNaCl中的20％乙醇和大约20mM磷酸钠和大约0.1M NaCl中的乙腈；
b)使用合适的洗脱缓冲液施加纯化梯度，分析级分并且使得纯级分能够汇集和脱盐。
10.权利要求9的方法，其中所述核酸分子包含一个或多个核糖核苷酸。
11.权利要求10的方法，其中所述核酸分子包含一种或多种化学修饰。
12.权利要求1或10的方法，其中所述核酸分子是单链核酸分子。
13.权利要求1或10的方法，其中所述核酸分子是双链核酸分子。
14.权利要求13的方法，其中所述双链核酸分子包含一种或多种化学修饰。
15.权利要求13的方法，其中所述双链核酸分子各链的长度在19和23个核苷酸之间。
16.权利要求12的方法，其中所述双链核酸分子各链的长度在19和23个核苷酸之间。
17.权利要求8或11的方法，其中所述化学修饰是糖修饰。
18.权利要求17的方法，其中所述糖修饰是2’-糖修饰。
19.权利要求8或11的方法，其中所述化学修饰是碱基修饰。
20.权利要求8或11的方法，其中所述化学修饰是磷酸酯骨架修饰。
21.权利要求20的方法，其中所述磷酸酯骨架修饰是硫代磷酸酯。
22.权利要求8或11的方法，其中所述化学修饰是末端修饰。
23.权利要求22的方法，其中所述末端修饰是在所述核酸分子的5’-端。
24.权利要求22的方法，其中所述末端修饰是在所述核酸分子的3’-端。
25.权利要求22的方法，其中所述末端修饰同时在所述核酸分子的5’-和3’-端。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104837996A (zh) * 2012-11-15 2015-08-12 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 抗apob反义缀合物化合物
CN112771062A (zh) * 2018-10-24 2021-05-07 豪夫迈·罗氏有限公司 用于纯化寡核苷酸的方法
CN114051499A (zh) * 2019-07-09 2022-02-15 豪夫迈·罗氏有限公司 用于寡核苷酸的脱保护的方法
CN114728995A (zh) * 2019-10-07 2022-07-08 斯特尔纳生物制品有限公司 制备具有改善的活性的催化活性dna分子的方法及其用于治疗哮喘的方法中的用途

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7655790B2 (en) * 2002-07-12 2010-02-02 Sirna Therapeutics, Inc. Deprotection and purification of oligonucleotides and their derivatives
US20050267300A1 (en) * 2004-04-05 2005-12-01 Muthiah Manoharan Processes and reagents for oligonucleotide synthesis and purification
WO2006078278A2 (en) 2004-04-27 2006-07-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Single-stranded and double-stranded oligonucleotides comprising a 2-arylpropyl moiety
AU2005323437B2 (en) 2004-04-30 2011-10-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a C5-modified pyrimidine
JP2008504840A (ja) 2004-06-30 2008-02-21 アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド 非リン酸骨格結合を含むオリゴヌクレオチド
CA2574088C (en) 2004-07-21 2013-09-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a modified or non-natural nucleobase
EP1913011B1 (en) 2004-08-04 2016-11-02 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Oligonucleotides comprising a ligand tethered to a modified or non-natural nucleobase
DE102006061015A1 (de) * 2006-12-22 2008-06-26 Curevac Gmbh Verfahren zur Reinigung von RNA im präparativen Maßstab mittels HPLC
US9429547B1 (en) * 2012-06-15 2016-08-30 Emerald Therapeutics, Inc. Systems and methods for automated preparation of nucleic acids
US9840703B2 (en) * 2013-01-11 2017-12-12 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions for the production of siRNAs
WO2016180430A1 (en) 2015-05-08 2016-11-17 Curevac Ag Method for producing rna
PL4108769T3 (pl) 2015-05-29 2024-02-05 CureVac Manufacturing GmbH Sposób wytwarzania i oczyszczania rna obejmujący co najmniej jeden etap filtracji o przepływie stycznym
WO2018055577A1 (en) 2016-09-23 2018-03-29 Synthena Ag Mixed tricyclo-dna, 2'-modified rna oligonucleotide compositions and uses thereof

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
CA1340323C (en) 1988-09-20 1999-01-19 Arnold E. Hampel Rna catalyst for cleaving specific rna sequences
JP3058686B2 (ja) 1989-08-31 2000-07-04 シティ・オブ・ホープ キメラｄｎａ―ｒｎａ触媒活性配列
US5567588A (en) 1990-06-11 1996-10-22 University Research Corporation Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Solution SELEX
WO1991019813A1 (en) 1990-06-11 1991-12-26 The University Of Colorado Foundation, Inc. Nucleic acid ligands
AU649074B2 (en) 1990-10-12 1994-05-12 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Modified ribozymes
DE4216134A1 (de) 1991-06-20 1992-12-24 Europ Lab Molekularbiolog Synthetische katalytische oligonukleotidstrukturen
FR2682112B1 (fr) 1991-10-08 1993-12-10 Commissariat A Energie Atomique Procede de synthese d'acide ribonucleique (arn) utilisant un nouveau reactif de deprotection.
WO1993014218A1 (en) 1992-01-13 1993-07-22 Duke University Enzymatic rna molecules
US5652094A (en) 1992-01-31 1997-07-29 University Of Montreal Nucleozymes
US6469158B1 (en) 1992-05-14 2002-10-22 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribozymes
JPH08500481A (ja) 1992-05-11 1996-01-23 リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド ウイルスの複製を阻害するための方法および薬剤
US5977343A (en) 1992-05-14 1999-11-02 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribozymes
US5804683A (en) 1992-05-14 1998-09-08 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Deprotection of RNA with alkylamine
US5686599A (en) * 1992-05-14 1997-11-11 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribozymes
EP0748382B1 (en) 1993-09-02 2002-11-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Non-nucleotide containing enzymatic nucleic acid
AU706417B2 (en) 1994-02-23 1998-06-17 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for inhibiting the expression of disease related genes
US5631359A (en) 1994-10-11 1997-05-20 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Hairpin ribozymes
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5716824A (en) 1995-04-20 1998-02-10 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-alkylthioalkyl and 2-C-alkylthioalkyl-containing enzymatic nucleic acids (ribozymes)
US5998203A (en) 1996-04-16 1999-12-07 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic nucleic acids containing 5'-and/or 3'-cap structures
AU1430097A (en) 1996-01-16 1997-08-11 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of methoxy nucleosides and enzymatic nucleic acid molecules
US5849902A (en) 1996-09-26 1998-12-15 Oligos Etc. Inc. Three component chimeric antisense oligonucleotides
US6958239B2 (en) 1996-11-21 2005-10-25 Oligos Etc Inc. Three component chimeric antisense oligonucleotides
EP0948511B1 (en) 1996-12-24 2006-10-18 Sirna Therapeutics, Inc. Chemical synthesis of nucleosides analogs and their incorporation into polynucleotides
US6001311A (en) 1997-02-05 1999-12-14 Protogene Laboratories, Inc. Apparatus for diverse chemical synthesis using two-dimensional array
EP1019497A1 (en) 1997-06-19 2000-07-19 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Hammerhead ribozymes with extended cleavage rule
US6300483B1 (en) 1997-06-19 2001-10-09 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Compositions inducing cleavage of RNA motifs
TW589189B (en) 1997-08-04 2004-06-01 Scras Kit containing at least one double-stranded RNA combined with at least one anti-viral agent for therapeutic use in the treatment of a viral disease, notably of viral hepatitis
AU750947C (en) 1997-09-22 2003-05-22 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Nucleic acid catalysts with endonuclease activity
US6054576A (en) * 1997-10-02 2000-04-25 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Deprotection of RNA
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
JP2003525017A (ja) 1998-04-20 2003-08-26 リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド 遺伝子発現を調節しうる新規な化学組成を有する核酸分子
CA2330574A1 (en) 1998-04-29 1999-11-04 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleoside triphosphates and their incorporation into ribozymes
GB9827152D0 (en) 1998-07-03 1999-02-03 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
AU776150B2 (en) 1999-01-28 2004-08-26 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for (in vivo) and (in vitro) attenuation of gene expression using double stranded RNA
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
AU1086501A (en) 1999-10-15 2001-04-30 Carnegie Institution Of Washington Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
GB9927444D0 (en) 1999-11-19 2000-01-19 Cancer Res Campaign Tech Inhibiting gene expression
US6989442B2 (en) 2002-07-12 2006-01-24 Sirna Therapeutics, Inc. Deprotection and purification of oligonucleotides and their derivatives
US7655790B2 (en) * 2002-07-12 2010-02-02 Sirna Therapeutics, Inc. Deprotection and purification of oligonucleotides and their derivatives

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104837996A (zh) * 2012-11-15 2015-08-12 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 抗apob反义缀合物化合物
CN112771062A (zh) * 2018-10-24 2021-05-07 豪夫迈·罗氏有限公司 用于纯化寡核苷酸的方法
CN112771062B (zh) * 2018-10-24 2024-01-16 豪夫迈·罗氏有限公司 用于纯化寡核苷酸的方法
CN114051499A (zh) * 2019-07-09 2022-02-15 豪夫迈·罗氏有限公司 用于寡核苷酸的脱保护的方法
CN114728995A (zh) * 2019-10-07 2022-07-08 斯特尔纳生物制品有限公司 制备具有改善的活性的催化活性dna分子的方法及其用于治疗哮喘的方法中的用途

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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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