CN101149377B

CN101149377B - 用于检测曲霉的抗体

Info

Publication number: CN101149377B
Application number: CN2007100311091A
Authority: CN
Inventors: 车小燕; 郝卫; 潘玉先; 王艳芳
Original assignee: Southern Medical University Zhujiang Hospital
Current assignee: Southern Medical University Zhujiang Hospital
Priority date: 2007-10-29
Filing date: 2007-10-29
Publication date: 2012-05-23
Anticipated expiration: 2027-10-29
Also published as: CN101149377A

Abstract

本发明提供了用于检测曲霉的捕获抗体和检测抗体，这两种抗体分别是由杂交瘤细胞CCTCC NO.C200731和CCTCC NO.C200730产生的单克隆抗体，能特异性结合曲霉属真菌细胞壁分子量为25～100kDa的糖蛋白，与常见的其他真菌，如马尔尼菲氏青霉菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌等的反应均为阴性。本发明所述的抗体可制备成常用的检测曲霉的免疫试剂。

Description

用于检测曲霉的抗体

技术领域

本发明涉及生物化学领域，具体涉及一种新的用于检测曲霉的抗体。

背景技术

曲霉是自然界中最常见的腐生菌，有100多种，其中至少10种曲霉是条件致病菌，常污染粮食食品、环境并能感染免疫抑制人群，严重威胁人类健康。由曲霉引发的侵袭性曲霉病(Invasive Aspergillosis，IA)由于缺乏早期有效的诊治手段，死亡率很高，达95％。IA主要由烟曲霉、黄曲霉引起，少部分由土曲霉、黑曲霉、构巢曲霉引起，其中，烟曲霉是主要的致病菌，约占曲霉类真菌所致人类感染的80％～90％。

在食品检测方面，国内外现行的检测食品中曲霉污染的方法是检测曲霉毒素，主要包括薄层层析法、高效液相色谱法、免疫学分析法等。其中薄层层析法不需要特殊的仪器设备，一般实验室都可以进行，但是对实验人员和环境的污染危害较大，不适合现场快速检测，而且操作繁琐、易受其它组分干扰，因其灵敏度差，无法满足当今日益严格的真菌毒素限量标准。这种方法在发展中国家和我国应用仍较多，而在发达国家逐渐被高效液相色谱法以及免疫学分析法代替。高效液相色谱法，其灵敏度高，准确度好，但仪器昂贵，要求样品纯化程度高，样品前处理过程繁琐，耗时长，要求有专业人员操作，因需要价格昂贵的仪器，检测成本高，在我国难以推广应用，从而影响了我国粮油食品中真菌毒素的有效监测。而且上述方法每次仅能检测一种曲霉毒素，不适合对粮食食品中有害曲霉污染的大规模筛查，从而进一步切断污染环节。因此，目前缺乏快速、特异、广谱检测粮油食品中各种有害曲霉的方法。

在临床诊断方面检测曲霉的方法主要是应用ELISA夹心法对循环抗原半乳甘露聚糖(galactomannan，GM)的检测，GM是研究学者在感染动物模型和侵袭性烟曲霉病者血清中发现的烟曲霉抗原，也是一种已被鉴定的烟曲霉来源的多糖抗原，这是一种能够早期检测IA抗原血症的有效标志。法国巴斯德Sanofi诊断中心用大鼠抗GM的单抗EB-A2作为捕捉抗体和检测抗体，建立双抗体夹心ELISA一步法，即Platelia Aspergillus，检测血液和尿标本，是目前唯一的一种用于早期诊断IA的商品化试剂盒。虽然这种试剂盒对抗原检测非常敏感，但大量研究发现在检测可疑曲霉病人的血清以及尿标本时，以及使用过青霉素类抗生素，如哌拉西林-三唑巴坦的病人血清有很高的假阳性率，高达74％。另外，假阳性的问题同样也存在于儿科人群中，高达83％，这可能是由于EB-A2识别曲霉GM的β(1，5)-呋喃半乳糖苷侧链残基的同时，但也识别位于其他真菌(如青霉属)细胞壁多糖、新生儿肠道中的双岐杆菌属脂胞壁酸质及其他微生物和食品的交叉表位有关。因此，这种试剂盒的推广应用受到限制。

发明内容

本发明的目的在于提供新的抗体。

本发明的再一目的在于提供所述抗体的应用。

本发明新的单克隆抗体是：

一种用于检测曲霉的捕获抗体，该抗体是由杂交瘤细胞系CCTCC NO.C200731产生的单克隆抗体。

一种用于检测曲霉的检测抗体，该抗体是由杂交瘤细胞系CCTCC NO.C200730产生的单克隆抗体。所述的检测抗体可以标记酶、生物素或发光物质等能产生可检测信号差异的化学试剂。

本发明所述的捕获抗体和检测抗体都是用烟曲霉菌丝体抗原免疫小鼠获得，并用细胞融合技术获得两株分别产生这两种抗体的杂交瘤细胞系9D47A1和杂交瘤细胞系7E11A1，这两株杂交瘤细胞均为IgG1阳性。

杂交瘤细胞系9D47A1和杂交瘤细胞系7E11A1于2007年10月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号分别为C200731和C200730。

为了方便表述，上述由杂交瘤细胞系CCTCC NO.C200731产生单克隆抗体命名为单抗9D47A1，由杂交瘤细胞系CCTCC NO.C200730产生单克隆抗体命名为单抗7E11A1。

本发明所述单抗9D47A1和单抗7E11A1能特异性结合曲霉细胞壁分子量为25～100kDa且与ConA结合的糖蛋白，和临床及环境中各种曲霉反应为阳性，如烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、杂色曲霉、棒曲霉、亮白曲霉、聚多曲霉、黄柄曲霉、焦曲霉、赭曲霉、米曲霉等曲霉；但与其他常见真菌的反应均为阴性，如马尔尼菲氏青霉菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌等。

本发明所述的两个单抗配对用于检测曲霉，主要是结合双抗体夹心方法的检测，如双抗体夹心ELISA方法、胶体金免疫层析或免疫化学发光方法的检测，其中单抗9D47A1作为捕获抗体，单抗7E11A1单独或者结合各种能发出可检测信号的物质作为检测抗体。基于上述原理，本发明所述的单抗用于制备成可产业化的检测曲霉的试剂，这些试剂可以是试剂盒的形式，也可以是试纸的形式。所述的试剂盒可以是双抗体夹心ELISA试剂盒、免疫化学放光试剂盒等，所述的试纸可以是胶体金快速免疫层析检测试纸等。

本发明所述的检测曲霉的双抗体夹心ELISA试剂盒，该试剂盒由以下试剂组成：包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、酶结合物、阳性对照、阴性对照、浓缩洗液、显色液、终止液，其特征在于捕获抗体为单抗9D47A1，酶结合物是将单抗7E11A1用酶标记制备得到，所述的酶是氧化酶或碱性磷酸酶，如辣根过氧化酶标记。

本发明所述的检测曲霉的胶体金快速免疫层析检测试纸，该试纸由样品垫，聚酯纤维素垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次部分重叠组成，其特征为聚酯纤维素膜上喷涂有一层胶体金-单抗9D47A1复合物；硝酸纤维素膜上分布有检测带和质控带，其中检测带是在硝酸纤维素膜上喷涂单抗7E11A1形成，质控带是在硝酸纤维素膜上喷涂羊抗小鼠IgG1抗体形成；其中所述的胶体金-单抗9D47A1复合物由纯化的9D47A1包被在由氯金酸制成的胶体金颗粒上制得，其颗粒大小为18～20nm，呈深红色。

本发明所述的免疫化学发光试剂盒，该试剂盒的组成与双抗体夹心ELISA试剂盒相似，只是其中的单抗7E11A1标记的是荧光素等化学发光物质。

本发明所说的检测曲霉的试纸/试剂盒操作简单，快速，特异性高，与其它真菌无交叉反应，既可用于粮食或食品的质量控制中曲霉的检测，又可用于环境中如空气、木头、衣物等曲霉污染的检测，还可以为IA病人的早期诊断提供依据。本发明试纸/试剂盒与现有检测曲霉的技术相比有以下优点：

1、用于食品质量控制，与现有检测曲霉毒素技术相比，可利用本发明酶联免疫技术试剂盒或者胶体金试纸条技术，对可疑受到曲霉的污染样本进行大规模的初步筛查，可简易、快速、准确地检测出样本中曲霉抗原；

2、用于环境曲霉污染监控，可利用本发明酶联免疫技术试剂盒或者胶体金试纸条技术，对可疑受到曲霉的污染木头、衣物等进行大规模的初步筛查，可简易、快速、准确地检测出样本中曲霉抗原；

3、与目前用于诊断IA的早期诊断试剂盒相比，具有相似的灵敏度，但特异性更高，与青霉菌、念珠菌等其他真菌无假阳性反应，成本低，适合国内基层单位使用。

附图说明

图1是本发明单抗9D47A1和单抗7E11A1对经ConA结合柱纯化的曲霉细胞壁糖蛋白进行免疫印迹的结果，其结合条带的分子量为25-100kDa；其中条带1是Marker，条带2是单抗7E11A1，条带5是单抗9D47A1，条带3，4为无关单抗。

图2是本发明胶体金快速免疫层析试纸的结构示意图，其中1是样品垫，2是聚酯纤维素垫、3是硝酸纤维素膜、4是吸水垫、5是检测带、6是质控带。

图3是本发明检测曲霉的胶体金快速免疫层析试纸对19种真菌的检测结果，其中1是土曲霉，2是黄柄曲霉，3是黄曲霉，4是构巢曲霉，5是黑曲霉(ATCC 10864)，6是黑曲霉，7是焦曲霉，8是杂色曲霉，9是棒曲霉，10是亮白曲霉，11是聚多曲霉，12是赭曲霉，13是米曲霉，14是烟曲霉，15是白色念珠菌，16是热带念珠菌，17是光滑念珠菌，18是近平滑念珠菌，19是克柔念珠菌，20是马尔尼菲氏青霉菌。

具体实施方式

例1 本发明单克隆抗体的制备和鉴定

1、单抗9D47A1和单抗7E11A1的制备

1)烟曲霉菌丝体抗原制备：

烟曲霉菌株在沙氏平板上37℃生长数天至形成单菌落。将典型的单菌落收获，加至含有50ml RPMI-1640的500ml锥形瓶中，37℃摇菌3-7天，过滤分离菌丝体及过滤液。将收集的菌丝体重悬于PBS中，超声裂解，离心后收集上清，并储存于-80℃备用。

2)免疫小鼠

取4-6周龄雌性BALB/c小鼠，第一次采用弗氏完全佐剂与等体积烟曲霉菌丝体抗原混匀乳化，皮下注射100μg/只小鼠，以后每10天以弗氏不完全佐剂与50μg抗原等体积乳化，腹腔和皮下多点注射，小鼠免疫4次后，于融合前3天静脉加强100μg/只抗原。

3)免疫血清效价测定

采用间接ELISA法测定免疫血清效价。配制10μg/ml烟曲霉菌丝体抗原的50mMpH9.6碳酸盐缓冲液，包被聚苯乙烯微96孔板，100μl/孔，4℃过夜。次日，含0.25％酪蛋白(Sigma)的封闭液300μl/孔4℃过夜，甩干包被板条，真空干燥12～24h，用铝膜袋真空包装4℃保存，用于鼠免疫血清效价测定。于第三次免疫后10天眼眶采血，鼠免疫血清用含1％BSA 10mM PBS以10³～10⁶倍稀释，加入96孔板，100μl/孔37℃30min，10mM PBS含0.1％Tween-20洗涤液洗板四次后，加入1∶1000倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(Sigma，INC.)，100μl/孔37℃30min，同上洗板后，加入含有0.05％(W/V)TMB和0.06％(W/V)双氧pH5.0柠檬酸缓冲液，100μl/孔，室温避光10min，加100μl/孔1M H₂SO₂终止反应，测450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值得比≥2.1为阳性来判断免疫血清的效价。

4)杂交瘤制备

选择血清抗体效价达1×10⁵的小鼠，于融合前3天尾静脉注射100μg烟曲霉菌丝体抗原。无菌取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株NS-1按10∶1的比例混合，用45％聚乙二醇(PEG，MW4000，Sigma)作用下进行融合。按下述步骤将聚乙二醇溶液加入细胞。在37℃水浴中，在1-2min内缓慢加入1.0ml PEG，边加边轻轻摇匀，分别于1min、2min、3min、4min、5min内加1ml、2ml、3ml、4ml、5ml无血清RPMI-1640培养基终止融合，最后加入10ml含15％FBS的二合一培养基，室温1000rpm离心5min，弃上清，用36ml含15％胎牛血清的培养基轻轻悬起细胞。将此细胞悬液加入6块96孔培养板上，在二氧化碳培养箱中温度为37℃、5％CO2的培养箱中。一天以后，于每孔加入100μl含次黄嘌呤、氨基喋呤-胸腺嘧啶脱氧核苷(HAT，Sigma)筛选培养基。以后每3天用此筛选培养基给培养物换液一次，直到克隆细胞形成。

4)筛选分泌曲霉抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞

间接ELISA法筛选细胞培养上清，选择强阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化，并用有限稀释法连续克隆化2-3次，得到2株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。将克隆化后阳性率达100％的细胞扩增培养后液氮冻存。

小鼠体内接种阳性杂交瘤细胞，制备腹水，并采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水中的抗体。

2、本发明单克隆抗体的特异性鉴定

(1)实验材料：烟曲霉株(购自北京大学医学真菌研究中心)

(2)抗原制备：

(3)抗体亚类鉴定

Ig亚类鉴定采用间接ELISA，包被烟曲霉菌丝体抗原，封闭后与杂交瘤细胞培养上清孵育，再分别与为1∶1000倍稀释HRP标记的兔抗小鼠不同亚类特异性免疫球蛋白，这些抗体包括兔抗小鼠IgG1(Sigma，Inc)，兔抗小鼠IgG2a(Sigma，Inc)，兔抗小鼠IgG2b(Sigma，Inc)，兔抗小鼠IgG3(Sigma，Inc)，兔抗小鼠IgM(Sigma，Inc)。检测结果两株杂交瘤细胞株均为IgG1阳性

(4)间接ELISA法进行单克隆抗体特异性分析：

用烟曲霉菌丝体抗原包被微孔板，按照常规的间接ELISA法进行检测。在包被的微孔板中加入本专利发明的杂交瘤细胞培养上清液，37℃再孵育1h，加入1∶1000稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(Sigma，Inc)，100μl/孔37℃ 30min，加TMB显色液室温避光10min，加1M H₂SO₂终止反应，测450nm吸收值(A₄₅₀)。表1结果显示本专利发明的单克隆抗体与曲霉抗原产生很强的特异性的免疫反应。

表1：曲霉单克隆抗体与曲霉抗原反应间接ELISA结果

A₄₅₀	曲霉单克隆抗体		无关抗体
				9D47A1	7E11A1
	1.842	1.934	0.082

(5)间接免疫荧光法鉴定本发明单克隆抗体的特异性

1)实验材料：烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和土曲霉，白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、马尔尼菲氏青霉菌。

2)实验方法：

曲霉菌株在沙氏平板上37℃生长数天至形成单菌落，收集典型的单菌落，用预冷的1 ×PBS收集、洗细胞二遍并调整浓度为1×10⁶个细胞/ml，然后将细胞滴于无菌干燥的玻片上，干燥后，制备成涂片，充分干燥，用预冷固定液(丙酮∶甲醇体积比为3∶7)固定20min，吹干，将单克隆抗体调整浓度为10μg/ml，加至不同曲霉菌株的荧光涂片孔中，同时设阴性和阳性对照血清，置37℃水浴60min后，取出将抗原片放于染色缸中用0.01mM pH7.2 PBS清洗3次，吹干，加入荧光标记羊抗小鼠IgG抗体，37℃水浴30min后，同上方法洗涤5次，吹干后，0.25％伊文氏蓝对照染色，荧光显微镜下观察荧光图像，以荧光的强度和染色形态进行结果判定，检测抗体强度以(+～++++)计为阳性，抗体强度(±)和(-)计为阴性。

3)实验结果：

结果如表2所示，本发明单抗特异性结合烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和土曲霉，且有很强的结合能力，而与其它真菌不结合。

表2间接免疫荧光检测抗曲霉抗原的单克隆抗体对4株不同曲霉的特异性

本发明单克隆抗体			单抗7E11A1	单抗9D47A1
					抗体亚类			IgG1	IgG1
免疫荧光试验(IFA)	烟曲霉	孢子	+	+
					菌丝	++++	++++
		黄曲霉	孢子	++				+
	菌丝				+++	+++
			黑曲霉	孢子			++	+
	菌丝	++++			++
				土曲霉		孢子	+++	+++
	菌丝	++++	++++
					白色念珠菌		-	-
	克柔念珠菌		-	-
					光滑念珠菌		-	-
	热带念珠菌		-	-
					近平滑念珠菌		-	-
	马尔尼菲氏青霉菌		-	-

(6)免疫印迹法分析本发明单抗的特异性

烟曲霉菌株(购自北京大学医学真菌研究中心)在沙氏平板上37℃生长数天至形成单菌落，收集典型的单菌落，加至含有50ml RPMI-1640的500ml锥形瓶中，37℃摇菌3-7天，过滤，将滤液经经ConA结合柱纯化其中的糖蛋白。经8％SDS-PAGE电泳分离的蛋白条带转印至硝酸纤维素膜上，封闭液封闭后，纤维素膜于7E11A1-HRP中37℃孵育1h，用含有0.5％(v/v)Tween-20的洗液清洗数次，DAB(Amresco Inc，Solon，OH)显色。本发明中的2种单克隆抗体结合糖蛋白分子量条带位于25-100kDa处(图1)，说明这2组单抗识别抗原为经ConA结合柱纯化的分子量为25-100kDa的糖蛋白。

(7)、本发明单克隆抗体识别位点的分析

1)抗原制备：烟曲霉菌株在沙氏平板上37℃生长数天至形成单菌落，收集典型的单菌落，加至含有50ml RPMI-1640的500ml锥形瓶中，37℃摇菌3-7天，过滤分离菌丝体及过滤液。将收集的菌丝体重悬于PBS中，超声裂解，离心后收集上清，并储存于-80℃备用。

2)方法和结果：用50mM pH9.6碳酸盐缓冲液稀释上述抗原至30μg/ml，包被聚苯乙烯微96孔板，0.1ml/孔，4℃过夜。次日，含0.25％酪蛋白(Sigma)的封闭液0.3ml/孔，4℃过夜后，先加单抗10μg/ml 50μl/孔及后加系列稀释HRP标记单抗1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶2000 50μl/孔，37℃，孵育1h；PBST洗涤五次后加TMB(AmrescoInc)100μl/孔，10min后，1M H₂SO₄终止反应，测定450nm吸收值。以单抗对同一HRP标记的单抗抑制率为100％，以已知无关单抗对标记单抗的抑制为阴性对照，计算各单抗间的抑制率。即抑制率为(1-测定值A450/阴性对照值A450)×100。抑制率＞75％为相关，＞50％为不完全相关，＜50％为不相关，＜25％为完全不相关。结果发现，两株单抗之间的抑制率均为0，说明2株单抗识别2个完全不同的抗原位点。

3、双抗体夹心ELISA法单克隆抗体最佳配对的筛选和ELISA参数的优化

将腹水纯化的2株单克隆抗体用于进行一组矩阵格式实验以选出最适合于建立夹心ELISA法中用作捕获和标记的单克隆抗体对。简单地说，用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化的2株杂交瘤细胞(编号为9D47A1、7E11A1)衍生而来的腹水包被96孔板，以前述制备的烟曲霉CA抗原作为抗原筛选抗体对。辣根过氧化物酶标记2株单克隆抗体，采用矩阵格式，也就是上述2株单克隆抗体将每株进行包被作为捕获或混合包被作为捕获，分别与每一株酶标记单克隆抗体进行配对，以快速筛选夹心ELISA中捕获和标记的单克隆抗体对。初步实验显示单克隆抗体9D47A1作为捕获抗体，与酶标记7E11A1单克隆抗体配对时，可产生较强的信号。而在此基础上，分别组合上述2株单克隆抗体进行捕获的抗体和标记的抗体的配对，以信号强度和特异性而言，用9D47A1作为捕获的单克隆抗体，用7E11A1抗体作为标记的单克隆抗体，产生最强的信号。

例2 本发明检测曲霉的双抗体夹心ELISA试剂盒

1、检测曲霉的双抗体夹心ELISA试剂盒由以下试剂组成：

包被单抗9D47A1的微孔反应板

样品处理液：4％乙二胺四乙酸(PH 7.0)，即称取乙二胺四乙酸40g，溶于1L蒸馏水中，NaOH调PH值至7.0，保存于4℃；

酶结合物：辣根过氧化物酶标记的单抗7E11A1；

浓缩洗液：含有2％Tween-20的20×PBS，即1L溶液中含有4.56g NaH₂PO₄，58.02gNa₂HPO₄.12H₂O，175.3g NaCl，15磅20min高压灭菌后，加入20ml Tween-20搅匀，使用时20倍稀释；

阳性对照：烟曲霉培养过滤液1∶1000稀释，

阴性对照：含0.1％Tween-20的10mM PH7.4 PBS，即1L溶液中含有4.56g NaH₂PO₄，58.02gNa₂HPO₄.12H₂O，175.3g NaCl，15磅20min高压灭菌，20倍稀释后加入0.1％Tween-20；

显色液：由显色液A和B组成，使用时取二者等量混匀使用。其中显色液A、B的组成成分如下：

显色液A：

将0.89g柠檬酸和0.16g EDTA二钠溶于1000ml水中，115℃30min后，降至90℃后加TMB 0.25g，摇匀于4℃闭光保存；

显色液B：

将9.33g柠檬酸和14.6g EDTA二钠溶于1000ml水中，115℃30min后，降至90℃后加0.75％过氧化氢尿素12.8ml，摇匀于4℃闭光保存；

终止液：1M H₂SO₄；

其中，

包被单抗9D47A1的微孔反应板的制备方法是：将本发明单抗9D47A1用50mM碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释至10μg/ml，用0.1ml/孔包被聚苯乙烯96微孔板，于4℃过夜。拍干后，每孔加入0.3ml的0.25％酪蛋白(Sigma)的封闭液，于4℃过夜以封闭非特异性结合位点。甩干板条，真空干燥12～24h，用铝膜袋真空包装4℃保存备用；

酶结合物的制备方法是：辣根过氧化物酶标记抗体制备采用改良过碘酸钠法，将5mg辣根过氧化物酶搅拌溶解于1ml蒸馏水中，加入0.2ml新配0.1M过碘酸钠30min，置1mM pH4.4醋酸钠缓冲液中，4℃透析过夜，次日加入20μl 0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液后加预先在0.01M碳酸盐缓冲液中pH 9.5透析平衡的10mg抗体，在室温避光轻轻搅拌2～3h，加入0.1ml新配4mg/ml硼氢化钠，4℃避光过夜，冰浴上避光搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵(硫酸铵用前先用氨水调pH至7.0-7.2)，置4℃ 6h。10000g，4℃离心30min，弃上清，沉淀溶于适量10mM磷酸盐缓冲液，用同样的液体，4℃透析过夜，换液三次。收集结合物加入2％BSAPBS50％甘油保护剂，最后用磷酸盐缓冲液稀释1000倍，即可。

2、使用方法：

样品处理液处理各种待测的样品后，加100μl于9D47A1包被的聚苯乙烯96孔微量测试板中，每份样品设复孔，同时设阴对照和阳性对照，37℃温育1h，浓缩洗涤液20倍稀释后洗涤板条，洗板四次后，加入酶结合物，100μl/孔，37℃ 30min，同上洗板八次后，加显色液(显色液A和B等量混合，现用现配)，100μl/孔，室温避光10min后，加入终止液，100μl/孔，终止反应。

3、结果判定：

以空白孔调零，于450nm波长测定A值。

CUT OFF值＝0.15+阴性对照平均值

如待测标本A450值≥CUT OFF值，则判为阳性，反之，如待测标本A450值＜CUT OFF值，则判为阴性。

当阳性对照A450值低于1.0或阴性对照A450值高于0.3，检测结果无效。

4、检测曲霉的双抗体夹心ELISA试剂盒对各种曲霉及其他常见真菌的特异性和灵敏度分析

将临床分离曲霉及其它常见真菌(马尔尼菲氏青霉菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌)在沙氏平板上37℃生长数天至形成单菌落，环境分离株曲霉于28℃培养7天后，收集单菌落并转接至RPMI-1640中生长至浓度为2×10⁶个细胞/ml时，收集培养液上清。样品稀释液稀释样本后，按照本实施例第2点的方法检测上述各种真菌培养液上清。结果如表3所示，本发明试剂盒对19株环境和临床分离曲霉株都有特异性反应，而与常见的其他真菌，如马尔尼菲氏青霉菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌无交叉反应。本发明试剂盒的检测下限为1∶1000～1∶10000的稀释倍数，因不同种类的霉菌而有所不同。

表3本发明试剂盒对各种曲霉及其他常见真菌的特异性

曲霉种类	培养物稀释倍数	结果
				阳性	阴性
		烟曲霉-临床	1∶10000			+	0
黄曲霉-临床	1∶10000			+	0
		构巢曲霉-临床	1∶1000			+	0
土曲霉-临床	1∶10000			+	0
		黑曲霉-临床	1∶1000			+	0
烟曲霉-环境	1∶10000			+	0
		黄曲霉-环境	1∶10000			+	0
构巢曲霉-环境	1∶1000			+	0
		土曲霉-环境	1∶1000			+	0
黑曲霉-环境	1∶100000			+	0
		黑曲霉ATCC10864	1∶1000			+	0
米曲霉-环境	1∶10000			+	0
		亮白曲霉-环境	1∶1000			+	0

棒曲霉-环境	1∶1000	+	0
				杂色曲霉-环境	1∶1000	+	0
黄柄曲霉-环境	1∶10000	+	0
				聚多曲霉-环境	1∶1000	+	0
焦曲霉-环境	1∶1000	+	0
				赭曲霉-环境	1∶10000	+	0
马尔尼菲氏青霉菌	培养原液	0	-
				白色念珠菌	培养原液	0	-
克柔念珠菌	培养原液	0	-
				光滑念珠菌	培养原液	0	-
热带念珠菌	培养原液	0	-
				近平滑念珠菌	培养原液	0	-

5、本发明试剂盒的可重复性分析

按照第4点的实验方法进行重复实验，10次重复实验的变异系数分别为1.85％(1∶500)，4.12％(1∶1000)，和2.27％(1∶5000)。以20天为一个周期，每天检测一次样本，变异系数分别为：7.96％(1∶500)，10.46％(1∶1000)，和8.03％(1∶5000)。

例3检测曲霉的胶体金快速免疫层析试纸

1、本发明所述的检测曲霉的胶体金快速免疫层析试纸构成如图2所示，该试纸由样品垫1，聚酯纤维素垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫4依次部分重叠组成，其中聚酯纤维素膜2上喷涂有一层胶体金-单抗9D47A1复合物，其颗粒大小为18～20nm，呈深红色；硝酸纤维素膜3上分布有检测带5和质控带6，其中检测带5是在硝酸纤维素膜3上喷涂单抗7E11A1形成、质控带6是在硝酸纤维素膜3上喷涂羊抗小鼠IgG1抗体形成。

本发明试纸的制备方法是：将浓度为1-1.5mg/ml的烟曲霉单克隆抗体7E11A1和羊抗小鼠IgG1以0.8-1.5μl/cm的喷布量喷附在硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和质控线，室温干燥后用1％牛血清白蛋白封闭，烘干后贴附于涂有双面胶的底板上，右侧与吸水垫重叠1-2mm聚酯纤维素膜上喷附540nm下吸光度为0.5-0.8的浓度的胶体金-单抗9D47A1复合物，并粘贴在底板上，与硝酸纤维素垫的左端重叠1-2mm；底板左端贴附样品垫，其右侧与聚酯纤维素垫重叠1-2mm将贴有硝酸纤维垫、吸水垫、样品垫、聚酯纤维素垫的底板切成4-6mm的长条。

上述胶体金-单抗9D47A1的制备方法是：采用常规的胶体金-单克隆抗体复合物的制备方法：取0.1克氯金酸钠并溶于1000ml的去离子水中，加热煮至60℃，放入50ml新配的1％柠檬酸钠溶液，其中含柠檬酸0.2％，含单宁酸0.2％，然后加热到95℃5min，呈现深红色，所形成的胶体金颗粒直径为18-20nm，将纯化的单克隆抗体经36000转/min离心30min，取其上清经0.2μm滤膜过滤，将其浓度调至0.6mg/ml.待混合液凉至15-30℃时，每100ml上述溶液中加1ml1％浓度的聚乙烯醇PEG以阻止非特异性凝集，以12000转/min离心30min，去除上清液，再以12000转/min离心1h，去除未吸附的蛋白质，将包被的胶体金稀释到在540nm波长下吸光度为0.5-0.8的浓度，用0.2μm滤膜过滤除菌，即纯化的胶体金-单抗9D47A1复合物。4℃保存备用。

2、本发明试纸对19种曲霉培养液进行检测。

取1∶100稀释的曲霉培养液0.5ml(曲霉来源和培养和例2相同)，离心片刻，垂直插入试纸条，插入深度不超过样品垫，在样本中停留约1-2min，使样本充分上行后，水平放置5-15min判读结果。

结果判断：

阴性：试纸条检测带5不显色，仅质控带6显色，出现1条红线；

阳性：若试纸条检测带和质控带均显色，出现2条红线；

无效：若试纸条检测带和质控带均不显色，无红线出现，则测试无效，表示试纸条已经失效。

结果如图3所示，本发明胶体金快速免疫层析试纸能检测到各种曲霉，但其他真菌均呈阴性反应。

Claims

1.由杂交瘤细胞系CCTCC NO.C200731产生的单克隆抗体和由杂交瘤细胞系CCTCCNO.C200730产生的单克隆抗体在配对制备检测曲霉的试剂、试剂盒或试纸中的应用，其特征为该应用的具体方式是，杂交瘤细胞系CCTCC NO.C200731产生的单克隆抗体用于检测曲霉的捕获抗体，杂交瘤细胞系CCTCC NO.C200730产生的单克隆抗体用于检测曲霉的检测抗体。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的试剂盒是双抗夹心ELISA试剂盒，该试剂盒由包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、酶结合物、阳性对照、阴性对照、浓缩洗液、显色液和终止液组成，所述的捕获抗体是杂交瘤细胞系CCTCC NO.C200731产生的单克隆抗体，酶结合物是将杂交瘤细胞系CCTCC NO.C200730产生的单克隆抗体用酶标记制得的，其中所述的酶是氧化酶或碱性磷酸酶。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的酶是辣根过氧化物酶。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的试纸是胶体金快速免疫层析检测试纸，该试纸由样品垫(1)，聚酯纤维素垫(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)依次部分重叠组成，聚酯纤维素膜(2)上喷涂有一层胶体金-单抗9D47A1复合物；硝酸纤维素膜(3)上分布有检测带(5)和质控带(6)，其中检测带(5)是在硝酸纤维素膜(3)上喷涂杂交瘤细胞系CCTCC NO.C200730产生的单克隆抗体形成，质控带(6)是在硝酸纤维素膜(3)上喷涂羊抗小鼠IgG1抗体形成；其中所述的胶体金-单抗9D47A1复合物由杂交瘤细胞系CCTCCNO.C200731产生的单克隆抗体包被在胶体金颗粒上制得。