CN101184778A - P-钙黏着蛋白抗体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗体，其包括人抗体及其抗原结合部分，其结合P－钙黏着蛋白，并且发挥抑制P－钙黏着蛋白的作用。本发明还涉及来自人P－钙黏着蛋白抗体的重链和轻链免疫球蛋白，以及编码这类免疫球蛋白的核酸分子。本发明还涉及制造人P－钙黏着蛋白抗体的方法、包含这些抗体的组合物和使用所述抗体和组合物的方法。本发明还涉及包含本发明核酸分子的转基因动物或植物。

Description

P-钙黏着蛋白抗体

本申请要求在2005年4月26日提交的美国临时申请No.60/675,311的优先权，其整体通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及结合P-钙黏着蛋白的抗体及其抗原结合部分。本发明还涉及编码这类抗体和抗原结合部分的核酸分子、制造P-钙黏着蛋白抗体和抗原结合部分的方法、包含这些抗体和抗原结合部分的组合物以及使用这些抗体、抗原结合部分和组合物的方法。

背景技术

钙黏着蛋白是在发育和组织稳态中调节细胞-细胞黏附的跨膜糖蛋白超家族(Gumbiner J.Cell.Biol.，148：399-404(2000)；Yagi，et al.，Genes Dev.，14：1169-1180(2000))。钙黏着蛋白的细胞内结构域与细胞质蛋白质(如链蛋白和p120)相互作用，这形成了钙黏着蛋白附着在肌动蛋白细胞骨架上的基础。钙黏着蛋白具有五个细胞外Ca²⁺结合结构域和一个在经典钙黏着蛋白中高度保守的小细胞质结构域。经典的钙黏着蛋白家族成员包括P-钙黏着蛋白、E-钙黏着蛋白和N-钙黏着蛋白。细胞黏附分子(如钙黏着蛋白)被认为在癌细胞和转移细胞的细胞联络中起重要作用(Furukawa，etal.，Microscopy Res.Technique 38(4)：343-352(1997))。正常成人组织中P-钙黏着蛋白低表达，并基本上限于肌上皮细胞和复层上皮的基底层(Shimoyama，et al.Cancer Res.49：2128-33(1989))。在炎性肠疾病如Crohn’s疾病和结肠炎中P-钙黏着蛋白被上调(Hardy，et al.，Gut 50：513-519(2002))。目前大量证据表明：异常的P-钙黏着蛋白表达与细胞增殖和结肠、胸、肺、甲状腺和子宫颈肿瘤相关(Gamallo，Modern Pathology，14：650-654，(2001)；和Stefansson，et al.，J.Clin.Oncol.22(7)：1242-1252(2004))。人P-钙黏着蛋白被报导为是能被NCC-CAD-299单克隆抗体识别的抗原，所述抗体是针对外阴表皮样癌产生的(Shimoyama，et al.，Cancer Res.，49：2128-2133(1989))。对P-钙黏着蛋白介导的粘附和细胞内信号转导的调节预期能导致体内肿瘤细胞的增殖和存活降低。因此，考虑到P-钙黏着蛋白看起来具有控制细胞增殖和实体瘤发展的关键作用，产生针对P-钙黏着蛋白的、能够给多种癌症患者提供治疗益处的抗体是人们需要的。

发明内容

在一个方面，本发明是P-钙黏着蛋白抗体或其抗原结合部分，其中抗体或其抗原结合部分具有下文A)到K)中所述的若干功能特征的至少一种。A)例如在一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分具有与E-钙黏着蛋白(K_D(E))相比对P-钙黏着蛋白(K_D(P))更大的结合亲和力。在一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合部分具有大于或等于1.5的K_D(E)/K_D(P)。在另一实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合部分具有大于或等于2、大于或等于3、大于或等于5、大于或等于10、大于或等于20、大于或等于50、大于或等于100、大于或等于200、大于或等于500或大于或等于1000的K_D(E)/K_D(P)。典型地，K_D(E)/K_D(P)值不存在上限，因为K_D(E)值可以非常小，例如是0。然而对于实践目的而言，K_D(E)/K_D(P)的上限可以是1×10⁶。对P-钙黏着蛋白和E-钙黏着蛋白而言，这类K_D值可通过本领域技术人员已知的任何技术测量，例如通过ELISA、RIA、流式细胞仪或表面等离振子共振，例如BIACORE^TM。

B)在另一实施方案中，通过表面等离振子共振测量，抗体或其部分以1000nM或更小的K_D与P-钙黏着蛋白结合。在另一实施方案中，通过表面等离振子共振测量，抗体或其部分以小于500nM、小于100nM、小于50nM、小于20nM、小于10nM、小于1nM、小于500pM或小于100pM的K_D与P-钙黏着蛋白结合。典型地，不存在K_D值的下限。然而对于实践目的而言，下限可假定为约1pM。

C)在另一实施方案中，如通过表面等离振子共振所测量的，抗体或其部分对P-钙黏着蛋白具有小于或等于0.01^s-1的清除率(k_off)。例如，在某些实施方案中抗体或其部分对P-钙黏着蛋白具有小于0.005^s-1、小于0.004^s-1、小于0.003^s-1、小于0.002^s-1或小于0.001^s-1的k_off。典型地，不存在k_off值的下限。然而对于实践的目的而言，下限可假定为约1×10^-7s-1。

D)在另一实施方案中，如通过P-钙黏着蛋白依赖性细胞粘附测定法所测量的，P-钙黏着蛋白抗体或其部分具有100nM或更小的IC₅₀。在另一实施方案中，如通过P-钙黏着蛋白依赖性细胞粘附测定法所测定的，所述IC₅₀小于50nM、小于40nM、小于20nM、小于10nM、小于1nM、小于500pM、小于200pM、小于100pM或小于10pM。典型地，如通过P-钙黏着蛋白依赖性细胞粘附测定法所测定的，不存在IC₅₀值的下限。然而对于实践的目的而言，下限可假定为约1pM。

E)在另一实施方案中，如通过P-钙黏着蛋白依赖性细胞聚集测定法所测量的，P-钙黏着蛋白抗体或其部分具有100nM或更小的IC₅₀。在另一实施方案中，如通过P-钙黏着蛋白依赖性细胞聚集测定法所测定的，所述IC₅₀小于50nM、小于40nM、小于20nM、小于10nM、小于1nM、小于500pM、小于200pM、小于100pM或小于1pM。典型地，如通过P-钙黏着蛋白依赖性细胞聚集测定法所测定的，不存在IC₅₀值的下限。然而对于实践的目的而言，下限可假定为约1pM。

F)在另一实施方案中，在P-钙黏着蛋白依赖性球状体破坏测定法中，与不存在IgG的对照样品相比，P-钙黏着蛋白抗体或其部分以至少2的因数提高球状体破坏。在另一实施方案中，在P-钙黏着蛋白依赖性球状体破坏测定法中，与不存在IgG的对照样品相比，P-钙黏着蛋白抗体或其部分以至少3、至少4、至少6、至少10或至少15的因数提高球状体破坏。

G)在另一实施方案中，P-钙黏着蛋白抗体或其部分与选自194-e06；194-a02；194-b09；195-e11；194-g09；196-h02；194-e01；196-d10；196-g03；196-e06；195-a09；198-a09；200-h06；g-194-b09；g-194-g09；g-196-g03；g-196-h02；g-194-e01；g-194-e06；129-1c4；和g-129-1c4的抗体竞争结合P-钙黏着蛋白。

H)在另一实施方案中，P-钙黏着蛋白抗体或其部分与选自194-e06；194-a02；194-b09；195-e11；194-g09；196-h02；194-e01；196-d10；196-g03；196-e06；195-a09；198-a09；200-h06；g-194-b09；g-194-g09；g-196-g03；g-196-h02；g-194-e01；g-194-e06129-1c4；和g-129-1c4的抗体交叉竞争结合P-钙黏着蛋白。

I)在另一实施方案中，P-钙黏着蛋白抗体或其部分与选自194-e06；194-a02；194-b09；195-e11；194-g09；196-h02；194-e01；196-d10；196-g03；196-e06；195-a09；198-a09；200-h06；g-194-b09；g-194-g09；g-196-g03；g-196-h02；g-194-e01；g-194-e06；129-1c4；和g-129-1c4的抗体结合P-钙黏着蛋白的相同表位。

J)在另一实施方案中，P-钙黏着蛋白抗体或其部分与选自194-e06；194-a02；194-b09；195-e11；194-g09；196-h02；194-e01；196-d10；196-g03；196-e06；195-a09；198-a09；200-h06；g-194-b09；g-194-g09；g-196-g03；g-196-h02；g-194-e01；g-194-e06；129-1c4；和g-129-1c4的抗体以基本上相同的K_D结合P-钙黏着蛋白。

K)在另一实施方案中，P-钙黏着蛋白抗体或其部分与选自194-e06；194-a02；194-b09；195-e11；194-g09；196-h02；194-e01；196-d10；196-g03；196-e06；195-a09；198-a09；200-h06；g-194-b09；g-194-g09；g-196-g03；g-196-h02；g-194-e01；g-194-e06；129-1c4；and g-129-1c4的抗体以基本上相同的k_off结合P-钙黏着蛋白。

本发明的另一方面是至少具有先前在A)到K)中描述的功能特征之一的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列与SEQ ID NOs：1到13和320到325之任一至少90％同一的V_H结构域。在一个实施方案中，所述V_H结构域氨基酸序列与SEQ ID NOs：1到12和320到325之任一至少91％、至少93％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一。

在另一实施方案中，抗体或其部分至少具有先前在A)到K)中描述的功能特征之一，其包含一个V_H结构域，所述V_H结构域是SEQ ID NOs：1到13和320到325之任一，或因具有至少一个保守的氨基酸取代而与SEQ ID NOs：1到13和320到325之任一不同。例如，V_H结构域因1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守的氨基酸取代而与SEQ ID NOs：1到13和320到325之任一不同。在另一实施方案中，任何这些保守的氨基酸取代可发生在CDR1、CDR2和/或CDR3区。

本发明的另一方面是至少具有先前在A)到K)中描述的功能特征之一的抗体或其抗原结合部分，其包含一个氨基酸序列与SEQ ID NOs：14到23和326到331之任一至少90％同一的V_L结构域。在一个实施方案中，所述V_L结构域氨基酸序列与SEQ ID NOs：14到23和326到331之任一至少91％、至少93％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一。

在另一实施方案中，抗体或其部分至少具有先前A)到K)中所述的功能特征之一，并包含一个V_L结构域，所述V_L结构域是SEQ ID NOs：14到23和326到331之任一，或因具有至少一个保守的氨基酸取代而与SEQID NOs：14到23和326到331之任一不同。例如V_L结构域因1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守的氨基酸取代而与SEQ ID NOs：14到23和326到331之任一不同。在另一实施方案中，任何这些保守的氨基酸取代可发生在CDR1、CDR2和/或CDR3区。

本发明的另一方面是至少具有先前A)到K)中所述功能特征之一的抗体或其抗原结合部分，其中V_L和V_H结构域分别与下述抗体的V_L和V_H结构域氨基酸序列至少90％同一，所述抗体选自194-e06；194-a02；194-b09；195-e11；194-g09；196-h02；194-e01；196-d10；196-g03；196-e06；195-a09；198-a09；200-h06；g-194-b09；g-194-g09；g-196-g03；g-196-h02；g-194-e01；g-194-e06；129-1c4；和g-129-1c4任一。例如，V_L和V_H结构域分别与下述抗体的V_L和V_H结构域氨基酸序列至少91％、93％、95％、97％、99％或100％同一，所述抗体选自194-e06；194-a02；194-b09；195-e11；194-g09；196-h02；194-e01；196-d10；196-g03；196-e06；195-a09；198-a09；200-h06；g-194-b09；g-194-g09；g-196-g03；g-196-h02；g-194-e01；g-194-e06；129-1c4；和g-129-1c4任一。

本发明的另一方面是选自以下的抗体或其抗原结合部分：a)包含如SEQ ID NO：1所公开的V_H结构域和如SEQ ID NO：14所公开的V_L结构域的抗体或其部分；b)包含如SEQ ID NO：2所公开的V_H结构域和如SEQ IDNO：14所公开的V_L结构域的抗体或其部分；c)包含如SEQ ID NO：2所公开的V_H结构域和如SEQ ID NO：15所公开的V_L结构域的抗体或其部分；d)包含如SEQ ID NO：3所公开的V_H结构域和如SEQ ID NO：16所公开的V_L结构域的抗体或其部分；e)包含如SEQ ID NO：4所公开的V_H结构域和如SEQ ID NO：17所公开的V_L结构域的抗体或其部分；f)包含如SEQ IDNO：4所公开的V_H结构域和如SEQ ID NO：23所公开的V_L结构域的抗体或其部分；g)包含如SEQ ID NO：5所公开的V_H结构域和如SEQ ID NO：18所公开的V_L结构域的抗体或其部分；h)包含如SEQ ID NO：6所公开的V_H结构域和如SEQ ID NO：23所公开的V_L结构域的抗体或其部分；i)包含如SEQ ID NO：7所公开的V_H结构域和如SEQ ID NO：23所公开的V_L结构域的抗体或其部分；j)包含如SEQ ID NO：8所公开的V_H结构域和如SEQ ID NO：23所公开的V_L结构域的抗体或其部分；k)包含如SEQ ID NO：9所公开的V_H结构域和如SEQ ID NO：23所公开的V_L结构域的抗体或其部分；l)包含如SEQ ID NO：10所公开的V_H结构域和如SEQ ID NO：19所公开的V_L结构域的抗体或其部分；m)包含如SEQ ID NO：11所公开的V_H结构域和如SEQ ID NO：20所公开的V_L结构域的抗体或其部分；n)包含如SEQ ID NO：12所公开的V_H结构域和如SEQ ID NO：21所公开的V_L结构域的抗体或其部分；o)包含如SEQ ID NO：13所公开的V_H结构域和如SEQ ID NO：22所公开的V_L结构域的抗体或其部分；p)包含如SEQ ID NO：320所公开的V_H结构域和如SEQ ID NO：326所公开的V_L结构域的抗体或其部分；q)包含如SEQ ID NO：321所公开的V_H结构域和如SEQ ID NO：327所公开的V_L结构域的抗体或其部分；r)包含如SEQ ID NO：322所公开的V_H结构域和如SEQ ID NO：328所公开的V_L结构域的抗体或其部分；s)包含如SEQ ID NO：323所公开的V_H结构域和如SEQ ID NO：329所公开的V_L结构域的抗体或其部分；t)包含如SEQ ID NO：324所公开的V_H结构域和如SEQ ID NO：330所公开的V_L结构域的抗体或其部分；和u)包含如SEQ ID NO：325所公开的V_H结构域和如SEQ ID NO：331所公开的V_L结构域的抗体或其部分。

在另一实施方案中，对如上文在组a)到u)中所述的任何抗体或其部分而言，V_H和/或V_L结构域可与本文所述的特定SEQ ID NOs因至少一个保守的氨基酸取代而不同。例如V_H和/或V_L结构域可与所述的SEQ ID NO因1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守的氨基酸取代而不同。在另一实施方案中，这些保守的氨基酸取代中任一可发生在CDR1、CDR2和/或CDR3区。

在另一实施方案中，本发明提供具有至少一种先前在A)到K)中所述功能特征的抗体或其抗原结合部分，其包含一个V_H结构域和一个V_L结构域，所述V_H结构域独立地选自SEQ ID NOs：1到13和320到325之任一，或是与SEQ ID NOs：1到13和320到325之任一因至少一个保守的氨基酸取代而不同的序列；所述V_L结构域独立地选自SEQ ID NOs：14到23和326到331之任一，或是与SEQ ID NOs：14到23和326到331之任一因至少一个保守的氨基酸取代而不同的序列。例如，V_H和V_L结构域可各自独立地与SEQ ID NOs：1到13、320到325、14到23和326到331之任一因1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守的氨基酸取代而不同。

在另一实施方案中，本发明提供具有至少一种先前在A)到K)中所述功能特征的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或部分包含选自SEQID NOs：26到37和91到256之任一的V_H CDR3，或与SEQ ID NOs：26到37和91到256之任一因至少一个保守的氨基酸取代而不同的序列。例如，V_H CDR3可与SEQ ID NOs：26到37和91到256之任一因1、2、3或4个保守的氨基酸取代而不同。

在另一实施方案中，本发明提供具有至少一种先前在A)到K)中所述功能特征的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或部分包含选自SEQID NOs：40到47和257到319之任一的V_L CDR3，或与SEQ ID NOs：40到47和257到319之任一因至少一个保守的氨基酸取代而不同的序列。例如，V_L CDR3可与SEQ ID NOs：40到47和257到319之任一因1、2、3或4个保守的氨基酸取代而不同。

在另一实施方案中，本发明提供抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分包含：如SEQ ID NO：24中公开的V_H CDR1，或与SEQID NO：24因至少一个保守的氨基酸取代而不同的序列；如SEQ ID NO：25中所公开的V_H CDR2，或与SEQ ID NO：25因至少一个保守的氨基酸取代而不同的序列；和独立地选自SEQ ID NOs：26到37和91到256之任一的V_H CDR3，或与SEQ ID NOs：26到37和91到256之任一因至少一个保守的氨基酸取代而不同的序列。例如上文提到的每个V_H CDR1、CDR2和CDR3序列可独立地与各自所述的SEQ ID NOs因1、2、3、4或5个保守的氨基酸取代而不同。

在另一实施方案中，本发明提供抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分包含：如SEQ ID NO：38中公开的V_L CDR1，或与SEQID NO：38因至少一个保守的氨基酸取代而不同的序列；如SEQ ID NO：39中所公开的V_LCDR2，或与SEQ ID NO：39因至少一个保守的氨基酸取代而不同的序列；和独立地选自SEQ ID NOs：40到47和257到319之任一的V_LCDR3，或与SEQ ID NOs：40到47和257到319之任一因至少一个保守的氨基酸取代而不同的序列。例如上文提到的每个V_L CDR1、CDR2和CDR3序列可独立地与各自所述的SEQ ID NOs因1、2、3、4或5个保守的氨基酸取代而不同。

本发明还提供了抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含：如SEQ ID NO：24中公开的V_H CDR1；如SEQ ID NO：25中所公开的V_H CDR2；选自SEQ ID NOs：26到37和91到256之任一的V_HCDR3；如SEQ ID NO：38中公开的V_L CDR1；如SEQ ID NO：39中公开的V_LCDR2；和选自SEQ ID NOs：40到47和257到319之任一的V_LCDR3。在另一实施方案中，所述每个V_H和V_L CDR1、CDR2和CDR3序列也可独立地与上文所述特定的SEQ ID NOs因至少一个保守的氨基酸取代而不同。例如每个CDR1、CDR2和CDR3序列可独立地与上文所述的特定SEQ ID NOs因1、2、3、4或5个保守的氨基酸取代而不同。

本发明还提供抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分包含如存在于194-e06；194-a02；194-b09；195-e11；194-g09；196-h02；194-e01；196-d10；196-g03；196-e06；195-a09；198-a09；200-h06；g-194-b09；g-194-g09；g-196-g03；g-196-h02；g-194-e01；g-194-e06；129-1c4；和g129-1c4的任何抗体中的V_H和V_L CDR1、V_H和V_L CDR2和V_H和V_L CDR3。

本发明还提供抗体或其抗原结合部分，其包含选自SEQ ID NOs：1到3和20到325之任一或与SEQ ID NOs：1到3和20到325之任一因1到10个保守的氨基酸取代而不同的V_H结构域。

本发明还提供抗体或其抗原结合部分，其包含选自SEQ ID NOs：14到23和326到331之任一或与SEQ ID NOs：14到23和326到331之任一因1到10个保守的氨基酸取代而不同的V_L构域。

本发明还提供抗体或其抗原结合部分，其包含一个V_H结构域和一个V_L结构域，所述V_H结构域独立地选自SEQ ID NOs：1到13和320到325之任一，或是与SEQ ID NOs：1到13和320到325之任一因1到10个保守的氨基酸取代而不同的序列；所述V_L结构域独立地选自SEQ ID NOs：14到23和326到331之任一，或是与SEQ ID NOs：14到23和326到331之任一因至1到10个保守的氨基酸取代而不同的序列。

本发明还提供抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分包含：如SEQ ID NO：24中公开的V_H CDR1，或与SEQ ID NO：24因1到4个保守的氨基酸取代而不同的序列；如SEQ ID NO：25中所公开的V_HCDR2，或与SEQ ID NO：25因1到4个保守的氨基酸取代而不同的序列；和选自SEQ ID NOs：26到37和91到256之任一的V_H CDR3，或与SEQID NOs：26到37和91到256之任一因1到4个保守的氨基酸取代而不同的序列。

本发明还提供抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分包含：如SEQ ID NO：38中公开的V_L CDR1，或与SEQ ID NO：38因1到4个保守的氨基酸取代而不同的序列；如SEQ ID NO：39中所公开的V_LCDR2，或与SEQ ID NO：39因1到4个保守的氨基酸取代而不同的序列；和选自SEQ ID NOs：40到47和257到319之任一的V_L CDR3，或与SEQID NOs：40到47和257到319之任一因1到4个保守的氨基酸取代而不同的序列。

本发明还提供至少具有先前在A)到K)中描述的功能特征之一的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分包含：如SEQ ID NO：48中公开的V_H FR1；如SEQ ID NO：49中公开的V_H FR2；选自SEQ IDNOs：50到55之任一的V_H FR3；选自SEQ ID NOs：56和57之任一的V_HFR4；选自SEQ ID NOs：58和59之任一的V_L FR1；选自SEQ ID NOs：60到62之任一的V_L FR2；选自SEQ ID NOs：63到66之任一的V_L FR3；和如SEQ ID NO：67中公开的V_L FR4。在另一实施方案中，每个所述V_H和V_L FR1、FR2、FR3和FR4序列也可独立地与上述特定的SEQ ID NOs因至少一个保守的氨基酸取代而不同。例如，每个所述FR1、FR2、FR3和FR4序列可独立地与上述各自特定的SEQ ID NOs因1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守的氨基酸取代而不同。还在另一实施方案中，每个FR1、FR2、FR3和FR4序列之任一可独立地被突变以匹配各自的种系框架序列(germline framework sequence)。

本发明的另一实施方案是本文所述的任何抗体，其中所述抗体为IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子，或来自其中。例如，抗体可以是IgG₁或IgG₂。例如在一个实施方案中，IgG是IgG₁，其中重链恒定区包含SEQID NO：344，其中轻链恒定区包含SEQ ID NO：345，并且SEQ ID NO：344的C-端任选地被切割。

另一实施方案提供上述任何抗体或抗原结合部分，其为Fab片段、F(ab’)₂片段、F_V片段、单链F_V片段、单链V_H片段、单链V_L片段、人源化抗体、嵌合抗体或双特异性抗体。

另一实施方案是衍生的抗体或抗原结合部分，其包含本文所述任何抗体或其部分和至少一个额外的分子实体。例如，所述至少一个额外的分子实体可以是另一抗体(例如双特异性抗体或双抗体)、检测剂、标签、细胞毒素剂、药剂和/或能够介导抗体或抗体部分与另一分子(例如链霉亲和素核心区或多组氨酸标签)联合的蛋白质或肽。例如，有用的检测剂(使用它可衍生本发明的抗体或抗原结合部分)包括荧光化合物，包括萤光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酸、藻红蛋白、镧系磷光体等。抗体还可以用适用于检测的酶标记，所述酶例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、葡糖氧化酶等。在另一实施方案中，本发明的抗体或其部分也可用生物素标记，或用被次级报告子识别的预先确定的多态表位(例如亮氨酸拉链对序列、次级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)来标记。还在本发明的另一实施方案中，任何抗体或其部分也可用化学基团来衍生，所述基团例如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基，或碳水化合物基团。

在一些实施方案中，本文公开的P-钙黏着蛋白抗体或抗原结合部分附着在固体载体上。

在一些实施方案中，任何本发明P-钙黏着蛋白抗体的重链C-端赖氨酸被切割。在本发明的多个实施方案中，P-钙黏着蛋白抗体的重链和轻链可任选地包括N-端信号序列。例如重链信号序列可以是SEQ ID NO：346，轻链信号序列可以是SEQ ID NO：347。

在另一实施方案中，本发明涉及本文所述任何抗体或其抗原结合部分，其中抗体或其抗原结合部分是人来源的。

本发明还提供药物组合物，其包含上述任何抗体或其抗原结合部分和药物可接受载体。

在另一实施方案中，本发明涉及分离的核酸分子，其包含编码本文所述任何抗体或其抗原结合部分的核苷酸序列。一个具体的实施方案是分离的核酸分子，其包含如SEQ ID NOs：68到90和332到343之任一所公开的核苷酸序列。本发明还涉及包含本文所述的任何核酸分子的载体，其中所述载体任选地包含与所述核酸分子可操作连接的表达调控序列。

另一实施方案提供宿主细胞，其包含本文所述任一载体，或包含本文所述任一核酸分子。本发明还提供分离的细胞系，其生产本文所述的任何抗体或抗原结合部分，或生产任何所述抗体或所述抗原结合部分的重链或轻链。

在另一实施方案中，本发明涉及用于生产P-钙黏着蛋白抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包含在合适条件下培养本文所述的任何宿主细胞或细胞系，并回收所述抗体或抗原结合部分。

本发明还涉及包含本文所述任何核酸的非人转基因动物或转基因植物，其中所述非人转基因动物或转基因植物表达所述核酸。

本发明还提供用于分离结合P-钙黏着蛋白的抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包含从本文所述的非人转基因动物或转基因植物中分离所述抗体的步骤。

本发明还提供用于在有需要的哺乳动物中治疗异常细胞生长的方法，所述方法包含向所述哺乳动物施用本文所述的任何抗体或其抗原结合部分，或任何药物组合物的步骤。本发明还提供使用结合P-钙黏着蛋白的抗体或其抗原结合部分用于在有需要的哺乳动物中治疗异常细胞生长的方法，所述方法包含在合适的条件下向所述哺乳动物施用有效数量的本文所述任何核酸分子的步骤，所述合适的条件允许所述核酸分子表达。在另一实施方案中，治疗异常细胞生长的方法还包含施用一定用量的一种或多种选自抗肿瘤剂、抗血管生成剂、信号转导抑制剂和抗增殖剂中的物质，所述用量一起能有效地治疗所述异常细胞生长。在具体的实施方案中，所述异常细胞生长是癌性的。

本发明还提供用于降低P-钙黏着蛋白依赖性细胞聚集的方法，所述方法包含将细胞与本文所述任何抗体或其抗原结合部分或本文所述任何药物组合物接触。

本发明的另一方面是抗体或其抗原结合部分，其包含利用人V_H-3家族基因的重链可变区氨基酸序列。例如在一个实施方案中，人V_H-3家族基因是V_H-3-23。

本发明的另一方面提供本文所述的任何抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分为人抗体。在另一方面，所述抗体或抗原结合部分是人重组抗体。

本发明还提供用于生产P-钙黏着蛋白抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包含步骤：在噬菌体上合成人抗体文库、用P-钙黏着蛋白或其抗原部分筛选所述文库、分离与P-钙黏着蛋白结合的噬菌体和从噬菌体获得所述抗体。

定义和一般技术

除非本文另有定义，涉及本发明使用的科学和技术术语应当具有本领域常规技术人员所普遍理解的含义。另外，除非上下文另有要求，单数术语应当包括复数，复数术语应当包括单数。一般地，涉及本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质与核酸化学和杂交而使用的术语或其技术是本领域所公知和普遍使用的。

除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域公知的传统方法进行，和如贯穿本说明书所列和所述的多种一般的和更特定的参考文献所述来进行。参阅例如Sambrook，et al.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2000)；Ausubel，et al.，Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，Wiley，John&S ons，Inc.(2002)；Harlow and Lane Using Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1998)；和Coligan，et al.，Short Protocols in Protein Science，Wiley，John & Sons，Inc.(2003)，其公开内容通过引用并入本文。如本领域所所普遍完成的或如本文所述，酶反应和纯化技术根据制造商的说明书进行。涉及本文所述分析化学、合成有机化学和医学及制药化学所使用的术语，或其实验步骤和技术是本领域所公知并普遍使用的。标准技术被用于化学合成，化学分析，药物制备、配制、递送和治疗患者。

已知基本的抗体结构单元包含四聚物。每个四聚物由两个同样的多态链对组成，每对具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。每个链的氨基端部分包括约100到120或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。每个链的羧基端定义恒定区，所述恒定区主要负责效应子作用。人轻链被分类为κ和λ轻链。重链被分类为μ、δ、γ、α或ε，并将抗体同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链中，可变区和恒定区通过约12或更多个氨基酸的“J”区而结合，重链还包括约3个或更多个氨基酸的“D”区。一般地参阅Fundamental Immunology，Ch.7(Paul，W.，ed.，2nd ed.Raven Press，N.Y.(1989))(就所有目的而言，以其整体通过引用并入本文)。每个重链/轻链对(V_H和V_L)形成抗体结合位点。因此，例如完整的IgG抗体具有两个结合位点。除在双功能或双特异性抗体中之外，两个结合位点是相同的。

重链和轻链的可变区显示相同的一般结构，所述结构为通过三个高度可变区结合的相对保守的框架区(FR)，也称为互补性决定区或CDR。术语“可变的”是指下述情况：抗体之中可变区的某些部分在序列上大为不同，并被用于每个具体的抗体与其具体的抗原的结合和特异性。然而，所述可变性并非均等地分布于抗体的整个可变结构域，而是集中在CDR中，所述CDR被更高度保守的FR隔开。来自每对两条链的CDR通过FR排列，使得能够与特定表位结合。从N-端到C-端，轻链和重链均包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4结构域。每个结构域的氨基酸分配是根据Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987 and 1991))或Chothia &Lesk J.，Mol.Biol.，196：901-917(1987)；Chothia，et al.，Nature 342：878-883(1989)的定义，其公开内容通过引用并入本文。

除非另有说明，以下的术语应当理解为具有以下的含义：

除非另有特别说明，术语“P-钙黏着蛋白”是指人P-钙黏着蛋白，其是一种膜内在蛋白和调节细胞-细胞粘附的跨膜糖蛋白的经典钙黏着蛋白家族成员。人P-钙黏着蛋白的克隆和序列已被报导，例如Shimoyama，et al.，J.Cell Biol.109(4 Pt 1)，1787-1794(1989)，其公开内容通过引用并入本文。术语P-钙黏着蛋白旨在包括重组的人P-钙黏着蛋白和P-钙黏着蛋白的重组嵌合体形式，其可通过标准的重组表达方法制备或商业购得(R&DSystems 861-PC-100)。

除非另有特别说明，本文使用术语“E-钙黏着蛋白”是指人E-钙黏着蛋白，其是一种膜内在蛋白和调节细胞-细胞粘附的跨膜糖蛋白的经典钙黏着蛋白家族成员。E-钙黏着蛋白描述于例如Takeichi，Science，251：1451-1455(1991)，其公开内容通过引用并入本文。术语E-钙黏着蛋白旨在包括重组的人E-钙黏着蛋白和E-钙黏着蛋白的重组嵌合体形式，其可通过标准的重组表达方法制备或商业购得(R&D Systems 861-EC-100)。

术语“多肽”包括天然或人造的蛋白质、蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物。多肽可以是单体的或多聚体的。

术语“经分离的蛋白质”、“经分离的多肽”或“经分离的抗体”是下述蛋白质、多肽或抗体，所述蛋白质、多肽或抗体由于其起源或衍生来源而(1)不带有在其天然状态下与之相随的天然结合的成分，(2)不含有来自相同种类的其他蛋白质，(3)由来自不同种类的细胞表达，或(4)天然不存在。因此，经化学合成的或在与下述多肽天然来源的细胞不同的细胞体系中合成的多肽应是从其天然结合的成分中“经分离的”。也可以使用本领域公知的蛋白质纯化技术通过分离使得蛋白质基本上不含天然结合的成分。

经分离的抗体实例包括已经使用P-钙黏着蛋白亲和纯化的P-钙黏着蛋白抗体，和通过细胞系体外合成的P-钙黏着蛋白抗体。

当样品的至少约60％到75％显示为单一种类的多肽时，蛋白质或多肽是“基本上纯净的”、“基本上均相的”或“基本上经纯化的”。多肽或蛋白质可以是单体的或多聚体的。基本上纯净的多肽或蛋白质可典型地包含约50％、60％、70％、80％或90％w/w的蛋白质样品，更经常为约95％，优选地可以大于99％的纯净。蛋白质纯净度可以通过大量本领域公知手段表明，如蛋白质样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳之后用本领域公知的染料将凝胶染色来显影单一的多肽条带。就某些目的而言，可通过使用HPLC或纯化领域公知的其他手段提供更高的分辨率。

术语本文使用术语“多肽片段”是指具有氨基端和/或羧基端删除、但是剩余的氨基酸序列与天然存在序列中相应的位置相同的多肽。在一些实施方案中，片段为至少5、6、8或10个氨基酸长。在其他实施方案中，所述片段为至少14个、至少20个、至少50个或至少70、80、90、100、150或200个氨基酸长。

本文使用术语“类似物”或“多肽类似物”是指包含下述片段的多肽，所述片段与一些参考氨基酸序列具有基本的同一性，并与参考氨基酸序列具有基本上相同的功能或活性。典型地，多肽类似物相对于参考序列包含保守的氨基酸取代(或插入或缺失)。类似物可以是至少20或25个氨基酸长，或可以是至少50、60、70、80、90、100、150或200个氨基酸长或更长，或经常可以与全长多肽一样长。本发明的一些实施方案包括与种系氨基酸序列相比带有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个取代的多肽片段或多肽类似物抗体。抗体的片段或类似物或免疫球蛋白分子可以由本领域常规技术人员依照本说明书的教导容易地制备。

在某些实施方案中，P-钙黏着蛋白抗体或其抗原结合部分的氨基酸取代为：(1)降低对蛋白酶解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变形成蛋白质络合物的亲合力，和(4)赋予或修饰这类类似物的其他物理化学特征或功能特征，但仍保留对P-钙黏着蛋白的特异结合。类似物可包括对天然存在的肽序列的多种取代。例如，可以在天然存在的序列中(例如在形成分子间接触的结构域之外的多肽部分中)制造单个或多个氨基酸取代(优选地保守氨基酸取代)。氨基酸取代还可以在形成分子间接触的结构域中制造，所述分子间接触可以促进多肽活性。保守的氨基酸取代不应当显著改变母体序列的结构性质；例如替换氨基酸不应改变母体序列中存在的组成免疫球蛋白结合结构域的反向平行的β-折叠，或破坏表征母体序列的其他类型二级结构。通常，甘氨酸或脯氨酸不应用于反向平行的β-折叠。本领域识别的多肽二级结构和三极结构的实例描述于Proteins，Structures and Molecular Principles(Creighton，Ed.，W.H.Freemanand Company，New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Brandenand J.Tooze，eds.，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))；和Thornton，et al.，Nature，354：105(1991)，其通过引用并入本文。

本文使用术语“抗体”与免疫球蛋白同义，应如本领域普遍已知地理解。具体地，术语抗体不受生产抗体的任何具体方法限制。例如术语抗体包括但不限于重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。

本文使用术语抗体的“抗原结合部分”(或简单地“抗体部分”)是指具有与抗原(例如P-钙黏着蛋白)特异结合能力的一个或多个抗体片段。已显示抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段完成。包括在术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)₂片段，包含两个Fab片段的二价片段，所述Fab片段在铰链区通过二硫键连接；(iii)由V_H和C_H1结构域组成的Fd片段；(iv)由单臂抗体的V_L and V_H结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward，et al.，Nature，(1989)341：544-546)，其由V_H结构域组成；和(vi)经分离的互补性决定区(CDR)。另外，尽管Fv片段的两个结构域V_L和V_H由独立的基因编码，但是它们可以使用重组方法通过合成的接头连接，所述接头允许它们作为单个蛋白质链产生，所述单链中V_L和V_H区对形成单价分子(已知为单链Fv(scFv))；参阅例如Bird，et al.，Science(1988)242：423-426和Huston，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：5879-5883(1988))。这类单链抗体也旨在被包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。其他形式的单链抗体如双抗体也包括在内。双抗体是二价的、双特异性的抗体，其中V_H和V_L结构域在单个多肽链上表达，但是使用太短而不允许相同链上两个结构域之间配对的接头，从而强迫所述结构域与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参阅例如Holliger，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)；Poljak，et al.Structure，2：1121-1123(1994))。

另外，抗体或其抗原结合部分可以是更大的免疫粘附分子的部分，其通过抗体或抗体部分与一个或多个其他蛋白质或肽的共价或非共价结合而形成。这类免疫粘附分子包括链霉亲和素核心区制造四聚体scFv分子的用途(Kipriyanov，et al.，Human Antibodies and Hybridomas，6：93-101(1995))和半胱氨酸残基、标记物肽和C-端多组氨酸标签制造二价的和生物素化的scFv分子的用途(Kipriyanov，et al.，Mol.Immunol.，31：1047-1058(1994))。其他实例包括来自抗体的一个或多个CDR被共价地或非共价地整合进分子中使其成为特异性结合目的抗原(如P-钙黏着蛋白)的免疫粘合素。在这类实施方案中，CDR可以作为更大的多肽链的一部分被整合，可以与另一多肽链共价连接或可以非共价地整合。抗体部分如Fab和F(ab′)₂片段可以使用传统技术(分别为例如整个抗体的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化)从整个抗体中制备。另外，抗体、抗体部分和免疫粘附分子可使用如本文所述的标准重组DNA技术获得。

当关于本发明涉及“抗体”时，应当理解也可使用其抗原结合部分。抗原结合部分与完整抗体竞争特异结合。一般地参阅Fundamental Immunology，Ch.7(Paul，W.，ed.，2nd ed.Raven Press，N.Y.(1989))(以其整体通过引用并入，用于所有目的)。抗原结合部分可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶切割或化学切割产生。在一些实施方案中，抗原结合部分包括Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fd、Fv、dAb和互补性决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双抗体和含有至少一个抗体部分的多肽，所述至少一个抗体部分足够赋予所述多肽特异的抗原结合。在具有一个或多个结合位点的实施方案中，结合位点可以彼此相同或不同。

本文使用术语“人抗体”是指其中可变结构域和恒定结构域的序列是人序列的任何抗体。该术语包括下述抗体，所述抗体带有来自人基因的序列，但是已被改变以降低可能的免疫原性、提高亲合力、消除可能引起不期望的折叠的半胱氨酸等。该术语还包括在非人细胞中重组产生的这类抗体，其可能赋予对人细胞非典型的糖基化。这些抗体可以以多种方式制备，如下所述。

本文使用术语“嵌合抗体”是指下述抗体，所述抗体包含来自两种或更多不同抗体(包括来自不同物种的抗体)的区域。例如，嵌合抗体的一个或多个CDR可以来自人P-钙黏着蛋白抗体。在一个实例中，来自人抗体的CDR可以与来自非人抗体(如小鼠或大鼠)的CDR结合。在另一实例中，所有的CDR可来自人P-钙黏着蛋白抗体。在另一实例中，来自多于一个人P-钙黏着蛋白抗体的CDR可以组合在一个嵌合抗体中。例如，嵌合抗体可包含来自第一个人P-钙黏着蛋白抗体轻链的CDR1、来自第二个人P-钙黏着蛋白抗体轻链的CDR2和来自第三个人P-钙黏着蛋白抗体轻链的CDR3，且重链的CDR可以来自一个或多个其他P-钙黏着蛋白抗体。另外，框架区可来自一个P-钙黏着蛋白抗体(一个或多个CDR来自其中)或来自一个或多个不同的人抗体。另外，术语“嵌合抗体”旨在包括任何上述组合，其中所述组合涉及人和非人抗体。

本文使用术语“人源化抗体”是指非人来源的抗体，其中属于非人物种抗体序列特征性的氨基酸残基被替换为存在于人抗体相应位置的残基。该“人源化”过程被认为降低所产生抗体在人中的免疫原性。应当知道非人来源的抗体可以使用本领域公知的技术被人源化。参阅例如Winter，etal.，Immunol.Today，14：43-46(1993)。目的抗体可以通过重组DNA技术被加工为用相应的人序列取代CH1、CH2、CH3、铰链结构域和/或框架结构域。参阅例如WO 92/02190和U.S.专利Nos.5,530,101、5,585,089、5,693,761、5,693,792、5,714,350和5,777,085。本文使用术语“人源化抗体”在其含义中包括嵌合的人抗体和CDR-嫁接的抗体。本发明的嵌合人抗体包括非人物种抗体的V_H和V_L以及人抗体的C_H和C_L结构域。本发明的CDR移植的抗体通过将人抗体V_H和V_L的CDR分别用非人动物抗体的V_H和V_L代替而得到。

本文使用术语“ELISA”是指酶联免疫吸附测定法。该测定法为本领域技术人员公知。该测定法的实例可见于Vaughan，T.J.，et al.，Nat.Biotech.，14：309-314(1996)以及本申请的实施例7。

本文使用的术语“表面等离振子共振”是指例如使用BIACORE^TM体系(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden and Piscataway，N.J.)，通过检测生物传感器基质中蛋白质浓度改变允许分析实时生物特异性相互作用的光学现象。进一步的描述参阅Jonsson et al.，Ann.Biol.Clin.，51：19-26(1993)；Jonsson，et al.，Biotechniques，11：620-627(1991)；Jonsson，et al.，J.Mol.Recognit.，8：125-131(1995)；和Johnsson，et al.，Anal.Biochem.，198：268-277(1991)。

术语“K_D”是指具体的抗体-抗原相互作用的亲合力平衡常数。当K_D≤1mM，优选地≤100nM和最优选地≤10nM时称抗体与抗原特异结合。K_D亲合力常数可通过表面等离振子共振测量，例如使用实施例6中所述的BIACORE^TM体系。

术语“k_off”是指具体的抗体-抗原相互作用的解离速率常数。k_off解离速率常数可通过表面等离离子共振测量，例如使用实施例6中所述的BIACORE^TM体系。

本文使用术语“P-钙黏着蛋白依赖性细胞粘附测定法”是指下述测定法，其用于测量P-钙黏着蛋白抗体阻断细胞与已固定在固体载体上的受体P-钙黏着蛋白粘附的能力。该类型的测定法可通过例如将P-钙黏着蛋白固定在固体载体(例如塑料)上来进行。然后允许过表达P-钙黏着蛋白的细胞通过P-钙黏着蛋白-P-钙黏着蛋白相互作用粘附在固体载体上。可使用或不使用P-钙黏着蛋白抗体来定量粘附水平。作为抗体浓度函数的粘附可随后被用于测定IC₅₀值。实施例3提供了用于测量P-钙黏着蛋白抗体IC₅₀值的P-钙黏着蛋白依赖性的细胞粘附测定法的其他细节。

本文使用术语“P-钙黏着蛋白依赖性细胞聚集测定法”是指下述测定法，其用于测量P-钙黏着蛋白抗体阻断其表面上表达P-钙黏着蛋白的细胞聚集的能力。例如，这种类型的测定法可使用过表达P-钙黏着蛋白的细胞系，其中所述细胞被置于悬浮液中，并允许其形成P-钙黏着蛋白依赖性的聚集体。然后使用聚集测定法，通过测量使用和不使用抗体得到的细胞聚集体的尺寸来定量P-钙黏着蛋白抗体阻止该聚集的能力。作为P-钙黏着蛋白抗体浓度函数的细胞聚集体的尺寸可随后被用于测定IC₅₀值。实施例4提供了用于测量若干P-钙黏着蛋白抗体IC₅₀值的P-钙黏着蛋白依赖性聚集测定法的其他细节。

本文使用术语“P-钙黏着蛋白依赖性球状体破坏测定法”是指下述测定法，其用于测量P-钙黏着蛋白抗体破坏预先形成的P-钙黏着蛋白依赖性的细胞聚集体的能力。通过测量作为抗体浓度函数的聚集体尺寸减小，可测定IC₅₀值。实施例5提供了用于测量P-钙黏着蛋白抗体IC₅₀值的P-钙黏着蛋白依赖性球状体破坏测定法的其他细节。

本文使用术语“分子选择性”是指抗体对特定抗原的亲合力大于对相关抗原的亲合力。例如，相对于E-钙黏着蛋白，本发明的抗体是选择P-钙黏着蛋白的，即所述抗体对P-钙黏着蛋白的亲合力比对E-钙黏着蛋白的亲合力至少大2倍，例如4倍、或10倍、或50倍、或100倍或更多。这类亲合力可使用本领域技术人员已知的标准技术来测量。

术语“表位”包括能够特异结合免疫球蛋白或T-细胞受体或以其他方式与分子相互作用的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面簇(例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链)组成，并通常具有特异的三维结构特性以及特异的电荷特性。表位可以是“线性的”或“构象的”。在线性表位中，蛋白质和相互作用的分子(例如抗体)之间所有的相互作用点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性地存在。在构象型表位中，相互作用点横穿蛋白质上彼此分离的氨基酸残基而存在。一旦抗原上的目的表位被确定，可能使用例如本发明所述的技术产生针对该表位的抗体。或者，在发现过程中，抗体的产生和表征可阐述关于目的表位的信息。根据该信息可能随后竞争性地筛选抗体对相同表位的结合。达到该目的的一个途径是构建交叉竞争研究以找出彼此竞争性结合的抗体，即所述抗体竞争结合抗原。以其交叉竞争为基础的用于“binning”抗体的高通量方法描述于国际专利公开No.WO 03/48731。

本文关于抗体使用术语“竞争”是指第一种抗体或其抗原结合部分与第二种抗体或其抗原结合部分竞争结合，其中与不存在第二种抗体时第一种抗体的结合相比，当存在第二种抗体时第一种抗体与其相关表位的结合可检测地降低。或者，情况可以是(但不必须是)第二种抗体与其表位的结合在存在第一种抗体时也可检测地降低。即，第一种抗体能够抑制第二种抗体与其表位的结合，而第二种抗体不能抑制第一种抗体与其各自表位的结合。然而，当每个抗体可检测地抑制另一抗体与其表位或配体的结合时，无论程度相同、更大或更小，称为抗体彼此“交叉竞争”地结合它们各自的表位。竞争和交叉竞争抗体均包括在本发明中。不考虑这类竞争或交叉竞争发生的机制(例如位阻、构象变化或与共同表位或其部分结合等)，熟练的技术人员应当知道，根据本文提供的教导，这类竞争和/或交叉竞争抗体包括在并适用于本文公开的方法中。

本文关于具体的基因使用术语“利用”是指抗体中具体区域的氨基酸序列在B-细胞成熟时根本地来源于该基因。例如，短语“利用人V_H-3家族基因的重链可变区氨基酸序列”是指下述取代：B-细胞成熟时抗体的V_H区域来自VH-3家族的基因片段。在人B细胞中存在多于30种不同的功能性重链可变基因，这些基因被用于产生抗体。因此，就结合抗原和功能活性的组合特征而言，具体的重链可变基因的使用指示优选的抗体-抗原相互作用的结合基序。应当知道，基因利用分析仅提供了有限的抗体结构概况。因为人B-细胞随机地产生V-D-J重链或V-Jκ轻链转录物，所以存在大量次级过程，所述次级过程包括但不限于体细胞高度突变、n-添加和CDR3扩展。参阅例如Mendez et al.Nature Genetics 15：146-156(1997)。

本文依照常规用法使用二十个常规氨基酸及其缩写。参阅Immunology-A Synthesis(2^nd Edition，E.S.Golub and D.R.Gren，Eds.，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.(1991))，其通过引用并入本文。

本文所涉及的术语“多核苷酸”是指至少10个碱基长度的多聚体形式核苷酸，其为核糖核苷酸或脱氧核苷酸或两种类型核苷酸的经修饰的形式。该术语包括单链和双链形式。

本文使用术语“经分离的多核苷酸”是指基因组、cDNA或合成来源的多核苷酸或其一些组合，因为所述“经分离的多核苷酸”的来源，其(1)不伴随有所述“经分离的多核苷酸”天然被发现时的所有或部分多核苷酸，(2)与多核苷酸可操作地连接，所述多核苷酸天然不与其连接，或(3)天然不作为更大序列的部分而存在。

本文使用的术语“天然存在的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文使用的术语“经修饰的核苷酸”包括带有经修饰的或经取代的糖基等的核苷酸。本文涉及的术语“寡核苷酸连接”包括例如硫代磷酸、二硫代磷酸、硒代磷酸、二硒代磷酸、苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phoshoraniladate)、磷酰胺酸(phosphoroamidate)等的寡核苷酸键。参阅例如LaPlanche，et al.，Nucl.Acids Res.，14：9081(1986)；Stec，et al.，J.Am.Chem.Soc.，106：6077(1984)；Stein，et al.，Nucl.Acids Res.，16：3209(1988)；Zon，et al.，Anti-Cancer DrugDesign，6：539(1991)；Zon，et al.，Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach，pp.87-108(F.Eckstein，Ed.，Oxford University Press，OxfordEngland(1991))；U.S.专利No.5,151,510；Uhlmann and Peyman，ChemicalReviews，90：543(1990)，其公开内容通过引用并入本文。需要时寡核苷酸可包括用于检测的标签。

“可操作地连接的”序列包括与目的基因相邻的表达调控序列和反向作用或在远处作用以调控目的基因的表达调控序列。

本文使用术语“表达调控序列”是指影响它们所连接的编码序列表达和加工所必须的多核苷酸序列。表达调控序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，例如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(例如Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；和需要时增强蛋白质分泌的序列。这类调控序列的本质取决于宿主生物而不同；在原核生物中，这类调控序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中这类调控序列通常包括启动子和转录终止序列。术语“调控序列”旨在至少包括其存在对于表达和加工是必需的的所有成分，并也可包括其存在是有利的的额外成分，例如前导序列和融合配偶体序列。

本文使用术语“载体”是指能够将转移其所连接的另一核酸的核酸分子。在一些实施方案中，载体是质粒，即额外的DNA片段可连接在其中的环状双链DNA部分。在一些实施方案中，载体是病毒载体，其中额外的DNA片段可被连接进病毒基因组中。在一些实施方案中，载体能够在其被引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加体哺乳动物载体)。在其他实施方案中，载体(例如非附加体哺乳动物载体)可以通过引入宿主细胞被整合进宿主细胞基因组中，从而与宿主基因组一起被复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。这类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简单地“表达载体”)。

本文使用的术语“重组宿主细胞”(或简单地“宿主细胞”)是指重组表达载体已被引入其中的细胞。应当理解“重组宿主细胞”和“宿主细胞”不但指具体的受试者细胞(subject cell)，也指该细胞的后代。因为某些修饰可由于突变或环境影响而在后继的世代中发生，因此这类后代事实上可与母细胞不相同，但是其仍然包括在本文所使用的术语“宿主细胞”的范围内。

本文使用术语“种系”是指抗体基因和基因片段的核苷酸序列，因为它们通过生殖细胞从亲代传递给后代。该种系序列与编码成熟B细胞中抗体的核苷酸不同，所述抗体在B细胞成熟的过程中已被重组和高突变事件改变。

在核酸序列语境中的术语“序列同一性百分比”是指针对最大对应进行比对时，两个序列中相同的残基。序列同一性比较的长度可以在至少约九个核苷酸，通常至少约18个核苷酸，更通常至少约24个核苷酸，典型地至少约28个核苷酸，更典型地至少约32个核苷酸和优选地至少约36、48或更多核苷酸的一段上。本领域存在可用于测量核苷酸序列同一性的大量不同的算法。例如，可使用FASTA、Gap或Bestfit(其为WisconsinPackage Version 10.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wisconsin中的程序)比较多核苷酸序列。包括例如程序FASTA2和FASTA3的FASTA提供查询序列和搜索序列之间最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比(Pearson，Methods Enzymol.，183：63-98(1990)；Pearson，Methods Mol.Biol.，132：185-219(2000)；Pearson，Methods Enzymol.，266：227-258(1996)；Pearson，J.Mol.Biol.276：71-84(1998)；通过引用并入本文)。除非另有说明，使用针对具体程序或算法的默认参数。例如，核酸序列间的序列同一性百分比可使用FASTA用其默认参数(字码尺寸为6，NOPAM因子用于积分矩阵)测定，或使用Gap用GCG Version 6.1中提供的默认参数测定，通过引用并入本文。

除非另有说明，提到核苷酸序列时包括其补体。因此，具有具体序列的核酸的含义应当被理解为包括其互补链及其互补序列。

当涉及核酸或其片段时，术语“显著相似性”或“显著序列相似性”是指与另一核酸(或其互补链)就适当的核苷酸插入或删除进行最佳比对时，通过任何公知的序列同一性算法(例如如上所述的FASTA、BLAST或Gap)测量得到：至少约85％，优选地至少约90％，和更优选地至少约95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基中存在核苷酸序列同一性。

在氨基酸语境中的术语“序列同一性百分比”是指针对最大对应进行比对时，两个序列中相同的残基。序列同一性比较的长度可以在至少约五个氨基酸，通常至少约20个氨基酸，更通常至少约30个氨基酸，典型地至少约50个氨基酸，更典型地至少约100个氨基酸和进一步更典型地约150、200或更多个氨基酸的一段上。存在大量不同的可用于测量氨基酸序列同一性的本领域已知算法。例如，可使用FASTA、Gap或Bestfit(其为Wisconsin Package Version 10.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wisconsin中的程序)比较氨基酸序列。

应用于多肽时，术语“显著同一性”或“显著相似性”是指例如通过程序GAP或BESTFIT使用程序提供的默认缺口权重进行最佳比对时，两个氨基酸序列共享至少70％、75％或80％的序列同一性，优选地至少90％或95％的序列同一性，更优选地至少97％、98％或99％的序列同一性。在某些实施方案中，不同的残基位置区别在于保守的氨基酸取代。

本文使用“保守的氨基酸取代”是指下述氨基酸取代：其中一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基所取代，所述另一个氨基酸残基带有有相似化学特征(例如电荷或疏水性)的侧链R基团的。一般地，保守的氨基酸残基不会显著改变蛋白质的功能特征。当两个或更多的氨基酸序列彼此因保守取代而不同时，可上调序列同一性百分比以纠正取代的的保守本质。进行该调节的手段为本领域技术人员所公知。参阅例如Pearson，Methods Mol.Biol.，243：307-31(1994)。具有有相似化学特征侧链的氨基酸基团的实例包括1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链；苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；和7)含硫的侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，保守的氨基酸取代基团可以是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。

或者，保守的替换是在Gonnet et al.，Science 256：1443-45(1992)(通过引用并入本文)中公开的PAM250 log-相似性矩阵中具有正值的任何改变。“适度保守的”替换是在PAM250 log-相似性矩阵中具有非负值的任何改变。

多肽的序列同一性典型地使用序列分析软件来测量。蛋白质分析软件使用对多种取代、缺失和其他修饰(包括保守的氨基酸取代)赋值的相似性手段来匹配序列。例如，GCG含有例如“Gap”和“Bestfit”的软件，其可使用程序指明的默认参数来测定密切相关的多肽(例如来自不同种类生物的同源多肽)之间或野生型蛋白质和其类似物之间的序列同源性或序列同一性。参阅例如GCG Version 6.1(University of Wisconsin，WI)。多肽序列还可使用FASTA用默认的或推荐的参数进行比较，参阅GCG Version 6.1.FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询和搜索序列之间最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比(Pearson，Methods Enzymol.，183：63-98(1990)；Pearson，Methods Mol.Biol.，132：185-219(2000))。将本发明的序列与包含来自不同生物的大量序列的数据库进行比较时，另一优选地算法是计算机程序BLAST，特别是blastp或tblastn，使用随程序提供的默认参数。参阅例如Altschul，et al.，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990)；Altschul，et al.，Nucleic Acids Res.，25：3389-402(1997)。

一般地，进行同源性比较的多肽序列的长度应为至少约16个氨基酸残基，通常至少约20个残基，更通常至少约24个残基，典型地至少约28个残基和优选地多于约35个残基。当在包含来自不同生物的大量序列的数据库中搜索时，优选比较氨基酸序列。

本文使用术语“标签”或“经标记的”是指抗体中整合了另一分子。在一个实施方案中，标签是可检测的标记，例如整合经放射性标记的氨基酸，或生物素基部分附着在多肽上，所述生物素基部分可由经标记的抗生物素蛋白(例如含有荧光标记物的链霉亲和素，或可通过光学或比色法检测的酶活性)检测。在另一实施方案中，标签或标记物可以是治疗性的，例如药物缀合物或毒素。标记多肽和糖蛋白的多种方法是本领域已知的并可被使用。用于多肽的标签包括但不限于以下的：放射性同位素或放射性核素(例如³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I)、荧光标签(例如FITC、罗丹明、镧系磷光体)、酶标签(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记物、生物素基、被次级报告子识别的、预先确定的多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、次级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)、磁性剂如钆螯合物、毒素如百日咳毒素、紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁(emetine)、丝裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷(etoposide)、鬼臼噻吩甙(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、盐酸米托蒽醌(mitoxantrone)、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾甾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。在一些实施方案中，标签通过多种长度的间隔臂连接以降低可能的位阻。

“治疗有效量”是指所施用的治疗剂的用量会在一定程度上减轻被治疗的疾病的一种或多种症状。就癌症治疗而言，治疗有效量是指具有至少一种以下效果的量：减小肿瘤的尺寸；抑制(即在一定程度上减缓，优选地停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制(即在一定程度上减缓，优选地停止)肿瘤生长和在一定程度上减轻(或优选地消除)癌症相关的一种或多种症状。

“治疗”是指减轻或消除生物学疾病和/或附带的症状。就癌症而言，这些术语简单地表示受癌症影响的个体的预期寿命会被延长，或疾病的一种或多种症状会被减轻。

“接触”是指以抗体能够影响P-钙黏着蛋白生物活性的方式，将本发明的抗体或其抗原结合部分和靶P-钙黏着蛋白或其表位集合在一起。这类“接触”可“体外”完成，即在试管、培养皿等中完成。在试管中，接触可仅涉及抗体或其抗原结合部分和P-钙黏着蛋白或其表位，或其可涉及整个细胞。细胞可维持或培养在细胞培养皿中，并在该环境中与抗体或其抗原结合部分接触。在该语境中，可在用更复杂的活体体内尝试抗体的用途之前测定具体抗体或其抗原结合部分影响P-钙黏着蛋白相关疾病的能力(即抗体的IC₅₀)。对生物外的细胞而言，将P-钙黏着蛋白与抗体或其抗原结合部分接触的多种方法存在并是本领域技术人员公知的。

除非另有说明，本文使用“异常细胞生长”是指不依赖于正常调节机制的细胞生长(例如缺失接触抑制)，包括正常细胞的异常生长和异常细胞的生长。这包括但不限于以下的异常生长：通过表达经突变的酪氨酸激酶或过表达受体酪氨酸激酶而增殖的肿瘤细胞(肿瘤)；其他增殖性疾病的良性或恶性细胞，其中发生异常的酪氨酸激酶激活；通过受体酪氨酸激酶增殖的任何肿瘤；通过异常的丝氨酸/苏氨酸激酶激活而增殖的任何肿瘤；其他增殖性疾病的良性和恶性细胞，其中发生异常的丝氨酸/苏氨酸激酶激活；表达经激活的Ras癌基因的良性和恶性肿瘤；良性或恶性的肿瘤细胞，其中Ras蛋白质作为另一基因中致癌突变的结果而被激活；其他增殖性疾病的良性或恶性细胞，其中发生异常的Ras激活。这类良性增殖疾病的实例是银屑病、良性前列腺肥大、人乳头状瘤病毒(HPV)和restinosis。“异常细胞生长”还涉及并包括由法呢基蛋白转移酶的酶活性导致的良性和恶性细胞的异常生长。

术语“异常细胞生长”和“高增殖性疾病”在本申请中可交换使用。

“体外”是指在人造环境中(例如但不限于试管或培养基中)进行的步骤。

“体内”是指在活体中(例如但不限于小鼠、大鼠或兔)中进行的步骤。

附图概述

图1显示SEQ ID NOs：1-347的氨基酸和核酸序列。

发明详述

人P-钙黏着蛋白抗体

本发明涉及与人P-钙黏着蛋白结合的、经分离的人抗体或其抗原结合部分。优选地，人抗体是重组的人P-钙黏着蛋白抗体，其对P-钙黏着蛋白具有比对E-钙黏着蛋白更大的亲和力。本发明的多个方面涉及这类抗体和抗原结合部分及其药物组合物，以及用于制造这类抗体和抗原结合部分的核酸、重组表达载体和宿主细胞。使用本发明抗体和抗原结合部分以体内或体外地检测人P-钙黏着蛋白或抑制人P-钙黏着蛋白活性的方法也包括在本发明中。

已知来自若干物种(包括人)的P-钙黏着蛋白氨基酸和核苷酸序列(参阅例如登录号No.NM_001793.3)。人P-钙黏着蛋白或其抗原部分可根据本领域技术人员公知的方法来制备，或可从商业卖主处购得(例如R&D Systems 861-PC-100)。

在某些实施方案中，本发明的抗体是如194-e06；194-a02；194-b09；195-e11；194-g09；196-h02；194-e01；196-d10；196-g03；196-e06；195-a09；198-a09；200-h06；g-194-b09；g-194-g09；g-196-g03；g-196-h02；g-194-e01；g-194-e06；129-1c4；和g-129-1c4所指的IgG。如实施例1中更详细讨论的，使用scFv噬菌体展示文库的高通量筛选来鉴定129-1c4scFv，其随后被转化为IgG。129-1c4代表了初期噬菌体展示筛选中鉴定的前导抗体，并且是一个谱系的亲本抗体，从其中派生出本发明的若干个其他抗体。若干个这类经派生的抗体被指定为194-e06；194-a02；194-b09；195-e11；194-g09；196-h02；194-e01；196-d10；196-g03；196-e06；195-a09；198-a09；和200-h06，并代表了129-1c4亲本谱系中经最优化的抗体。所述g-129-1c4抗体是129-1c4亲本抗体的种系版，其中V_H和V_L结构域的骨架区中某些氨基酸被突变以匹配种系骨架区中的氨基酸。上述任何抗体也可被种系化，使得骨架区序列与g-129-1c4中的种系骨架序列相同。例如在本发明的一个实施方案中，抗体g-194-b09、g-194-g09、g-196-g03、g-196-h02、g-194-e01、g-195-e11、g-200-h06和g-194-e06分别是194-b09、194-g09、196-g03、196-h02、194-e01、195-e11、200-h06和194-e06经种系化的版本。被突变以达到经种系化版本的特定氨基酸对本领域技术人员是显而易见的，可通过将经种系化的抗体与未种系化的抗体比较得到。如下所讨论的，本发明抗体的特定氨基酸序列描述于表1-3和图1中。

强烈倾向于利用重链可变区的V_H3基因家族生产本发明的抗体。具体地，129-1c4亲本抗体衍生自V_H3-23可变基因片段。在人B细胞中，存在多于30种不同的功能性重链可变基因，其被用于生产抗体。然而就结合抗原和功能活性的组合特征而言，倾向预示着抗体-抗原相互作用的优选的结合基序。

应当知道，基因利用分析仅提供有限的抗体结构概况。因为人B-细胞随机地产生V-D-J重链或V-Jκ轻链转录物，所以存在大量次级过程，所述次级过程包括但不限于体细胞高度突变、n-添加和CDR3扩展。参阅例如Mendez et al.Nature Genetics 15：146-156(1997)和在2002年二月19日提交的U.S.公开专利申请2003-0070185。因此，为了进一步检查本发明的抗体结构，从得自克隆的cDNA产生预知氨基酸序列的抗体。另外，N-端氨基酸序列通过蛋白质测序获得。图1提供若干个本发明抗体的重链和轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列。

如表1和2中所示，上述每个特定的抗体可通过它们重链(V_H)和轻链(V_L)的可变结构域序列来描述。这些SEQ ID NOs.所涉及的特定序列显示在图1中。如表1和表2所示，上述抗体相应的V_H和V_L的氨基酸和DNA序列由SEQID NOs：1-23、68-90和320-343描述。

表1

表2

本发明的额外抗体和抗原结合部分也可被描述为包含CDR和FR序列，所述CDR和FR序列构成表1和2中所示抗体的重链和轻链可变区。因此，对应于本发明抗体多种CDR和FR序列的SEQ ID NOs.在表3中显示。另外，也在129-1c4亲本抗体的重链和轻链CDR3区中进行了大量随机的突变，其产生经改进的P-钙黏着蛋白亲和力，所述亲和力通过表位竞争测定法测量改进10-到417-倍范围内(见实施例8)。这些经突变的V_H和V_L CDR3序列的SEQ ID NOs.(SEQ ID NOs：91-256和257-319)也包括在以下表3中。

表3

SEQ ID NOs：	描述
		24	VH CDR1
25	VH CDR2
		26-37，91-256	VH CDR3
38	VL CDR1
		39	VL CDR2
40-47，257-319	VL CDR3
		48	VH FR1
49	VH FR2
		50-55	VH FR3
56，57	VH FR4
		58，59	VL FR1
60-62	VL FR2
		63-66	VL FR3
67	VL FR4

生产抗体的方法

噬菌体展示文库

本发明的抗体或抗原结合部分可根据本领域已知的若干方法来制备。例如，可使用噬菌体展示技术提供含有一系列抗体的文库，所述抗体具有不同的对P-钙黏着蛋白的亲和力。然后可筛选这些文库以鉴定并分离对P-钙黏着蛋白具有所需亲和力的分离抗体。

例如，本发明的重组人P-钙黏着蛋白抗体可通过筛选重组的组合抗体文库来分离。优选地，所述文库为使用人V_L和V_H cDNA生产的scFv噬菌体展示文库，所述cDNA从分离自人B细胞的mRNA制备。用于制备和筛选这类文库的方法为本领域已知。用于生产噬菌体真实文库的试剂盒可商业购得(例如Pharmacia Recombinant Phage Antibody System，产品目录号no.27-9400-01；和the Stratagene SurfZAP^TM噬菌体展示试剂盒，产品目录号no.240612)。还存在其他方法和试剂可用于产生和筛选抗体展示文库(参阅例如U.S.专利No.5,223,409；PCT公开Nos.WO 92/18619、WO91/17271、WO 92/20791、WO 92/15679、WO 93/01288、WO 92/01047和WO 92/09690；Fuchs et al.，Bio/Technology 9：1370-1372(1991)；Hay，et al.，Hum.Antibod.Hybridomas，3：81-85(1992)；Huse，et al.，Science，246：1275-1281(1989)；McCafferty et al.，Nature，348：552-554(1990)；Griffiths，et al.，EMBO J.，12：725-734(1993)；Hawkins，et al.，J.Mol.Biol.，226：889-896(1992)；Clackson，et al.，Nature 352：624-628(1991)；Gram，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：3576-3580(1992)；Garrad，et al.，Bio/Technology，9：1373-1377(1991)；Hoogenboom，et al.，Nuc.Acid Res.，19：4133-4137(1991)；Barbas，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：7978-7982(1991)；和Griffiths，et al.，EMBO J.，13：3245-3260(1994)；其均通过引用并入本文)。

用于制备用于噬菌体展示技术的抗体文库的另一方法包含步骤：用P-钙黏着蛋白或其抗原部分免疫包含人免疫球蛋白基因座的非人动物，以产生免疫应答，从被免疫的动物中抽提产生抗体的细胞；从经抽提的细胞中分离编码本发明抗体重链和轻链的RNA；反转录该RNA产生cDNA，使用引物扩增该cDNA并将该cDNA插入噬菌体展示载体中，使得抗体在噬菌体上被表达。为了生产这类系列，不必须将来自被免疫动物的B细胞无限增殖化。另外，原始B细胞可直接用作DNA的来源。得自B细胞(例如来自脾)的cDNA混合物被用于制备表达文库，例如转染进E.coli的噬菌体展示文库。根本地，鉴定对抗原产生所需强度亲和力的来自文库的克隆，并将编码负责这类结合的产物的DNA回收并处理用于标准重组表达。噬菌体展示文库还可使用先前经处理的核苷酸序列构建并以相似方式筛选。一般地，编码重链和轻链的cDNA被独立地提供或被连接以形成Fv类似物，用于在噬菌体文库中生产。然后从噬菌体文库中筛选对P-钙黏着蛋白具有最高亲和力的抗体，并从适当的克隆中回收遗传材料。更多轮的筛选可提高所分离的原始抗体的亲和力。

在一个实施方案中，为了分离和生产具有所需特性的人P-钙黏着蛋白抗体，本文所述的人P-钙黏着蛋白抗体首先被用于使用PCT公开No.WO93/06213中所述的表位印记方法选择对P-钙黏着蛋白具有相似结合活性的人重链和轻链序列，所述资料通过引用并入本文。优选地，该方法中使用的抗体文库是如PCT公开No.WO 92/01047，McCafferty，et al.，Nature，348：552-554(1990)；和Griffiths，et al.，EMBO J.12：725-734(1993)，所述制备并筛选的scFv文库，所述资料均通过引用并入本文。所述scFv抗体文库可使用人P-钙黏着蛋白作为抗原来筛选。从噬菌体文库中筛选对P-钙黏着蛋白具有最高亲和力的抗体，并从适当的克隆中回收遗传材料。更多轮的筛选可提高所分离的原始抗体的亲和力。

一旦选择了初始的人V_L和V_H结构域，可然后进行“混合并匹配”实验，其中筛选初始选择的不同对V_L和V_H片段对P-钙黏着蛋白的结合，以选择优选的V_L/V_H对组合。这些混合并匹配实验也可在随机突变V_L和V_H片段后进行，用于下文所述的最佳化结合。另外，为了进一步提高抗体品质，优选的V_L/V_H对的V_L和V_H片段可以在下述方法中被随机突变(优选地在V_H和/或V_L的CDR3区中)，所述方法与天然免疫应答中负责抗体亲和力成熟的体内体细胞突变方法类似。该体外亲和力成熟可以例如通过使用分别与V_H CDR3或V_LCDR3互补的PCR引物扩增V_H或V_L结构域而完成，所述引物已用四种核苷酸碱基的随机混合物在某些位置上被“穿刺(spiked)”，使得产生的PCR产物编码下述V_H和V_L片段，所述V_H和V_L片段中随机突变被引入V_H和/或V_L CDR3区中。可在这些随机突变的V_H和V_L片段中再筛选对P-钙黏着蛋白的结合，对P-钙黏着蛋白显示高亲和力和低解离率(off rate)的序列可被选择。如先前所述，SEQ ID NOs：91-256和257-319指出被随机突变并显示经改进的亲和力的、本发明的若干V_H和V_L CDR3序列。

从重组的免疫球蛋白展示文库中筛选并分离本发明的P-钙黏着蛋白抗体之后，可从展示包(例如从噬菌体基因组中)中回收编码所选择抗体的核酸，并通过标准重组DNA技术亚克隆进其他表达载体中。需要时，核酸可被进一步加工以产生本发明的其他抗体形式，如下文所述。为了表达通过筛选组合文库而分离的重组人抗体，将编码所述抗体的DNA克隆进重组表达载体中并引入宿主细胞中，如下文所述。

免疫

在另一实施方案中，人P-钙黏着蛋白抗体可以通过免疫非人的、转基因的动物来产生，所述动物的基因组中包含带有P-钙黏着蛋白抗原的一些或所有的人免疫球蛋白重链和轻链基因座。例如，非人动物可以是XENOMOUSE^TM动物。(Abgenix，Inc.，Fremont，CA)。

XENOMOUSE^TM小鼠被操作为包含大片段人免疫球蛋白重链和轻链基因座的、小鼠抗体生产不足的小鼠株系。参阅例如Green，et al.，NatureGenetics，7：13-21(1994)和U.S.专利Nos.5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598、6,130,364、6,162,963和6,150,584。还参阅WO 91/10741、WO 94/02602、WO96/34096、WO 96/33735、WO 98/16654、WO 98/24893、WO 98/50433、WO 99/45031、WO 99/53049、WO 00/09560和WO 00/037504。

这些文件中公开的方法可如U.S.专利No.5,994,619中所述被修饰，其通过引用并入本文。U.S.专利No.5,994,619描述用于制造新培养的内细胞团(CICM)细胞和细胞系(来自猪和牛)，以及其中被插入异源DNA的转基因CICM细胞。CICM转基因细胞可以用于制造克隆的转基因胚、胎和后代。所述‘619专利还描述了制造转基因动物的方法，所述转基因动物能够将异源DNA传递给其后代。可用于这些方法的非人动物实例包括大鼠、绵羊、猪、山羊、牛、鸡和马。

XENOMOUSE^TM小鼠生产成人样人系列的全人抗体并产生抗原特异性的人抗体。在一些实施方案中，XENOMOUSE^TM小鼠通过引入经测量的巨碱基(megabase sized)、人重链基因座的种系构型片段和酵母人工染色体(YAC)中κ轻链基因座而含有约80％的人抗体V基因系列。在另一实施方案中，XENOMOUSE^TM小鼠还含有约所有人λ轻链基因座。参阅Mendez，et al.，Nature Genetics，15：146-156(1997)，Green and Jakobovits，J.Exp.Med.，188：483-495(1998)和WO 98/24893，其公开内容通过引用并入本文。

在一些实施方案中，包含人免疫球蛋白基因的非人动物是具有人免疫球蛋白“小基因座(minilocus)”的动物。在小基因座途径中，外源Ig基因座通过包括来自Ig基因座的个体基因而被模拟。因此，一个或多个V_H基因、一个或多个D_H基因、一个或多个J_H基因、μ恒定结构域和另一恒定结构域(优选地，γ恒定结构域)形成一个构建体用于插入动物中。该途径描述于U.S.专利Nos.5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650、5,814,318、5,591,669、5,612,205、5,721,367、5,789,215和5,643,763中，通过引用并入本文。

上述非人动物可随后用如下所述的P-钙黏着蛋白抗原在允许抗体产生的条件下被免疫。从动物中分离产生抗体的细胞，从经分离的产生抗体的细胞中或从这类细胞所产生的无限增殖细胞系中分离编码目的P-钙黏着蛋白抗体的重链和轻链的核酸。这些核酸随后使用本领域技术人员已知的和如下文进一步描述的技术被加工，以降低非人序列的量，即人源化所述抗体以降低在人中的免疫应答。

在一些实施方案中，P-钙黏着蛋白抗原可被分离和/或是经纯化的P-钙黏着蛋白。在一些实施方案中，P-钙黏着蛋白是人P-钙黏着蛋白。在其他实施方案中，P-钙黏着蛋白抗原可以是表达或过表达P-钙黏着蛋白的细胞。在其他实施方案中，P-钙黏着蛋白抗原是由酵母、昆虫细胞、细菌如E.coli或其他来源通过重组技术所表达的重组蛋白质。动物免疫可以通过本领域已知的任何方法进行。参阅例如Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor Press(1990)。用于免疫非人动物如小鼠、大鼠、绵羊、山羊、猪、牛和马的方法为本领域公知。参阅例如Harlow and Lane，上文，和U.S.专利No.5,994,619。例如，P-钙黏着蛋白抗原可以与佐剂一起被施用以刺激免疫应答。示范性的佐剂包括完全或不完全Freund’s佐剂、RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激复合物)。这类佐剂可通过将多肽隔离在局部沉积物中而保护其免于快速分散，或它们可包含刺激宿主分泌下述因子的物质，所述因子对巨噬细胞和免疫系统中的其他成分是趋化性的(chemotactic)。优选地，如果多肽被施用，则免疫程序表会涉及多肽的两次或更多施用(遍布若干周中)。

例如，如上所述用P-钙黏着蛋白免疫转基因动物后，可从经免疫的转基因动物中分离原始细胞(例如脾或外周血B细胞)，并可鉴定产生下述抗体的个体细胞，所述抗体对目的抗原特异。然后分离来自每个个体细胞的经多腺苷酸化的mRNA，使用与可变区序列退火的有义引物(例如识别大部分或所有人重链和轻链可变区基因FR1区的简并引物，和与恒定区或连接区序列退火的反义引物)进行反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)。然后克隆重链和轻链可变区的cDNA并在任何合适的宿主细胞(例如骨髓瘤细胞)中表达为嵌合抗体，所述嵌合抗体带有各自的免疫球蛋白恒定区，例如重链和κ或λ恒定结构域。参阅Babcook，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：7843-48，(1996)，通过引用并入本文。然后可如本文所述鉴定并分离P-钙黏着蛋白。

生产抗体的重组方法

本发明的抗体或抗体部分可以通过免疫球蛋白轻链和重链基因在宿主细胞中的重组表达来制备。例如，为了重组地表达抗体，用带有编码抗体免疫球蛋白轻链和重链的DNA片段的一个或多个重组表达载体来转染宿主细胞，使得所述轻链和重链在宿主细胞中被表达，优选地被分泌进入培养宿主细胞的培养基中，从该培养基中可回收抗体。使用标准的重组DNA方法获得抗体重链和轻链基因，将这些基因整合进重组表达载体并将所述载体引入宿主细胞，所述方法例如Sambrook，Fritsch and Maniatis(eds)，Molecular Cloning；A LaboratoryManual，Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，Ausubel，F.M.，et al.(eds.)Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates，(1989)和U.S.专利No.4,816,397中所述的方法，这些资料的公开内容通过引用并入本文。

突变和修饰

为了表达本发明的P-钙黏着蛋白抗体，可使用如上所述的任何方法首先获得编码V_H和V_L区的DNA片段。也可使用本领域技术人员已知的标准方法向DNA序列中引入多种突变、缺失和/或添加。例如，可使用标准方法(例如PCR-介导的诱变)进行诱变，其中经突变的核苷酸被整合进PCR引物中，使得PCR产物含有所需的突变或定点诱变。例如，可以制造的一种类型的取代是改变抗体中一个或多个半胱氨酸，所述半胱氨酸对另一残基(例如但不限于丙氨酸或丝氨酸)可以是化学反应性的。例如，可以存在不规范半胱氨酸的取代。该取代可以在抗体的CDR中或可变结构域框架区中或恒定结构域中产生。在一些实施方案中，半胱氨酸是规范的。

抗体也可以在重链和/或轻链可变结构域中发生突变，例如以改变抗体的结合特征。例如，突变可以在一个或多个CDR区中发生以提高或降低抗体对P-钙黏着蛋白的K_D、提高或降低k_off或改变抗体的结合特异性。定点诱变技术为本领域公知。参阅例如Sambrook，et al.and Ausubel，et al.，上文，其通过引用并入本文。例如，如在实施例8中更详细描述的，根据上文所述步骤制造129-1c4亲本的大量可变的V_H和V_L CDR3序列，并在图1中被显示为SEQ ID NOs：91到256(V_H CDR3变体)和SEQ ID NOs：257到319(V_L CDR3变体)。

也可在框架区或恒定结构域中制造突变以提高P-钙黏着蛋白抗体的半衰期。参阅例如PCT公开No.WO 00/09560，通过引用并入本文。框架区或恒定结构域中的突变也可被制造以改变抗体的免疫原性、提供与另一分子共价或非共价结合的位点或改变如补体结合、FcR结合和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性之类的特征。根据本发明，单个抗体可在任何一个或多个CDR或可变结构域框架区或恒定区中具有突变。

在称作“种系化”的方法中，V_H和V_L序列中某些氨基酸可以被突变以匹配在种系V_H和V_L序列中天然存在的氨基酸。具体地，V_H和V_L序列中框架区的氨基酸序列可以被突变来匹配种系序列，以降低抗体被施用时的免疫原性风险。人V_H和V_L基因的种系DNA序列为本领域已知(参阅例如the″Vbase″human germline sequence database；还参阅Kabat，E.A.，et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242；Tomlinson，et al.(1992)J.Mol.Biol.227：776-798；和Cox，et al.Eur.J.Immunol.24：827-836(1994)；每个资料的内容通过引用明确并入本文)。

可以制造的另一类型的氨基酸取代是去除抗体中可能的蛋白水解位点。这类位点可存在于CDR中或可变结构域的框架区中或抗体的恒定结构域中。半胱氨酸残基的取代和蛋白水解位点的去除可降低抗体产物中的异质性风险从而提高其同质性。另一类型的氨基酸取代是通过改变天冬酰胺-甘氨酸对的一个或两个残基将其消除，所述天冬酰胺-甘氨酸对形成可能的脱酰胺位点。在另一实例中，本发明的P-钙黏着蛋白抗体重链的C-端赖氨酸可以被切割。在本发明的多种实施方案中，P-钙黏着蛋白抗体的重链和轻链可任选地包括N-端信号序列，如SEQ ID NOs：346和347所指的序列。

一旦获得编码本发明V_H和V_L片段的DNA片段，这些DNA片段可通过标准重组DNA技术被进一步地处理，以例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、转化为Fab片段基因或转化为scFv基因。在这些处理中，V_L-或V_H-编码DNA片段被可操作地与编码另一蛋白质的另一DNA片段连接，所述另一蛋白质为例如抗体恒定区或柔性接头(flexible linker)。该语境中使用术语“可操作地连接”旨在表示两个DNA片段被连接，使得由两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在读码框内(in-frame)。

经分离的编码V_H区的DNA可通过将V_H-编码DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子可操作地连接而被转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列为本领域已知(参阅例如Kabat，E.A.，et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Ed.，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)，包含这些区的DNA片段可通过标准的PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是最优选地是IgG1或IgG2恒定区。IgG1恒定区序列可以是任何已知在不同个体间存在的等位基因或同种异型，例如Gm(1)、Gm(2)、Gm(3)和Gm(17)。这些同种异型代表了IgG1恒定区中天然存在的氨基酸取代。例如，重链IgG1恒定区可以是SEQ ID NO：344。就Fab片段重链基因而言，V_H-编码DNA可以与仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子可操作地连接。CH1重链恒定区可以来自任何重链基因。

经分离的编码V_L区的DNA可以通过将V_L-编码DNA与编码轻链恒定区C_L的另一DNA分子可操作地连接而被转化为全长轻链基因(例如Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列为本领域已知(参阅例如Kabat，E.A.，et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Ed.，U.S.Department ofHealth and Human Services，NIH Publication No.91-3242)，包含这些区的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。κ恒定区可以是任何已知发生在不同个体间的多种等位基因，例如Inv(1)、Inv(2)和Inv(3)。λ恒定区可以来自三个λ基因之任一。例如，轻链IgG1恒定区可以是SEQ ID NO：347。

为了产生scFv基因，将V_H-和V_L-编码DNA片段与编码柔性接头(例如编码氨基酸序列(Gly₄-Ser)₃)的另一片段可操作地连接，使得V_H和V_L序列可以被表达为紧邻的单链蛋白质，其中V_H和V_L区通过柔性接头相连(参阅例如Bird et al.Science 242：423-426(1988)；Huston et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988)；McCafferty，et al.，Nature，348：552-554(1990))。单链抗体可以是单价的(如果仅使用单个V_H和V_L)、双价的(如果使用两个V_H和V_L)或多价的(如果使用多于两个V_H和V_L)。可产生与P-钙黏着蛋白和另一分子特异结合的双特异性抗体或多价抗体。

在另一实施方案中，可以制造融合抗体或免疫粘附素，其包含与另一多肽连接的本发明P-钙黏着蛋白抗体的全部或部分。在另一实施方案中，仅P-钙黏着蛋白抗体的可变区与多肽连接。在另一实施方案中，P-钙黏着蛋白抗体的V_H结构域与第一个多肽连接，而P-钙黏着蛋白抗体的V_L结构域与第二个多肽连接，所述第二个多肽以下述方式与第一个多肽相连：V_H和V_L结构域能够彼此相互作用，形成抗原结合位点。在另一优选的实施方案中，V_H结构域与V_L结构域通过接头分离，使得V_H和V_L结构域可以彼此相互作用。然后将V_H-接头-V_L抗体与目的多肽连接。另外可产生融合蛋白质，其中两个(或更多)单链抗体被彼此连接。这适用于想要在单一多肽链上产生二价或多价抗体，或想要产生双特异性抗体时。

在其他实施方案中，可使用编码P-钙黏着蛋白抗体的核酸分子制备其他的经修饰的抗体。例如可使用标准分子生物学技术依照本说明书的教导制备“κ抗体(Kappa bodies)”(Ill，et al.，Protein Eng.10：949-57(1997))，“小抗体(Minibodies)”(Martin，et al.，EMBO J.，13：5303-9(1994))，“双抗体”(Holliger，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993))或“Janusins”(Traunecker，et al.，EMBO J.，10：3655-3659(1991)和Traunecker，et al.，Int.J. Cancer，(Suppl.)7：51-52(1992))。

可通过大量方法(包括融合杂交瘤或连接Fab’片段)生产双特异性抗体或抗原结合片段。参阅例如Songsivilai & Lachmann，Clin.Exp.Immunol.，79：315-321(1990)，Kostelny，et al.，J.Immunol.，148：1547-1553(1992)。另外，双特异性抗体可以形成为“双抗体”或“Janusins”。在一些实施方案中，双特异性抗体与P-钙黏着蛋白两个不同的表位结合。在一些实施方案中，使用来自本文提供的人P-钙黏着蛋白抗体的一个或多个可变结构域或CDR区制备如上所述的经修饰的抗体。

载体和宿主细胞

为了表达本发明的抗体和抗原结合部分，将如上所述获得的、编码部分或全长的轻链和重链的DNA插入表达载体中，使得基因与转录和翻译调控序列可操作地连接。在该语境中，术语“可操作地连接”旨在表示抗体基因被连接进载体，使得载体内的转录和翻译调控序列提供它们预期的调节抗体基因转录和翻译的功能。选择与所使用的表达宿主细胞相容的表达载体和表达调控序列。表达载体包括质粒，反转录病毒，腺病毒，腺伴随病毒(AAV)，植物病毒如花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒，粘粒，YAC，EBV衍生的附加体等。抗体基因被连接进载体，使得载体内的转录和翻译调控序列提供它们预期的调节抗体基因转录和翻译的功能。选择与所使用的表达宿主细胞相容的表达载体和表达调控序列。抗体轻链基因和抗体重链基因可以被插入分离的载体中。在优选的实施方案中，两个基因被插入同一表达载体中。抗体基因通过标准方法(例如连接抗体基因片段和载体上互补的限制性位点，或不存在限制性位点时连接平末端)被插入表达载体中。

便利的载体是下述载体，其编码功能完整的人C_H或C_L免疫球蛋白序列，带有被设计的适当的限制性位点，使得任何V_H或V_L序列可以被容易地插入和表达，如上所述。在这类载体中，剪接通常发生在被插入的J区中剪接供体位点和人C结构域之前的剪接受体位点之间，还发生在存在于人C_H外显子中的剪接区中。多腺苷酸化和转录终止存在于编码区下游的天然染色体位点中。重组表达载体还可编码信号肽，所述信号肽有助于抗体链从宿主细胞中分泌。抗体链基因可以被克隆进载体中，使得信号肽与免疫球蛋白链氨基端按照读码框连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。

除抗体链基因外，本发明的重组表达载体带有调控抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。本领域技术人员应当知道表达载体的设计，包括调节序列的选择可取决于下述因子：用于被转化的宿主细胞的选择、所需的蛋白质表达水平等等。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选的调节序列包括指导哺乳动物细胞中蛋白质高水平表达的病毒元件，例如来自逆转录病毒LTR的启动子和/或增强子、来自巨细胞病毒(CMV)的启动子和/或增强子(例如CMV启动子/增强子)、来自猿猴病毒40(SV40)的启动子和/或增强子(例如SV40启动子/增强子)、来自腺病毒的启动子和/或增强子(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))、多瘤启动子和强哺乳动物启动子如天然免疫球蛋白启动子和肌动蛋白启动子。病毒调节元件的进一步描述及其序列参阅例如U.S.专利No.5,168,062、U.S.专利No.4,510,245和U.S.专利No.4,968,615。用于在植物中表达抗体的方法(包括启动子和载体的描述)以及植物转化的方法为本领域已知。参阅例如U.S.专利No.6,517,529，通过引用并入本文。在细菌细胞或真菌细胞(例如酵母细胞)中表达多肽的方法也是本领域公知的。

除抗体链基因和调节序列外，本发明的重组表达载体可带有额外的序列，例如调节载体在宿主细胞中复制的序列(如复制起点)和可选择的标记基因。可选择的标记基因有助于选择其中已被引入载体的宿主细胞(参阅例如U.S.专利Nos.4,399,216、4,634,665和5,179,017，通过引用并入本文)。例如典型地，可选择的标记基因给其中已被引入载体的宿主细胞赋予了对药物(如G418、潮霉素或甲氨喋呤)的抗性。优选的可选择的标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于用甲氨喋呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞)、新霉素磷酸转移酶基因(用于G418选择)和谷氨酸合成酶基因。

编码P-钙黏着蛋白抗体的核酸分子和包含这些核酸分子的载体可以用于转染合适的哺乳动物、植物、细菌或酵母宿主细胞。转化可以通过用于将多核苷酸引入宿主细胞的任何已知方法进行。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞的方法为本领域公知，其包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、polybrene(1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物)介导的转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体包裹多核苷酸和将DNA直接显微注射进细胞核中。另外，可通过病毒载体将核酸分子引入哺乳动物细胞中。转化细胞的方法为本领域公知。参阅例如U.S.专利Nos.4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455，通过引用并入本文。转化植物细胞的方法为本领域公知，包括例如土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化、生物射弹转化(biolistic transformation)、直接注射、电穿孔和病毒转化。转化细菌和酵母细胞的方法也是本领域公知的。

可获得的作为宿主用于表达的哺乳动物细胞系是本领域公知的，其包括可得自American Type Culture Collection(ATCC).的许多无限增殖细胞系。这些包括例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO细胞、SP2细胞、HEK-293T细胞、NIH-3T3细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、非洲绿猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、A549细胞和大量其他细胞系。具体优选的细胞系通过确定具有高表达水平的细胞系来选择。可使用的其他细胞系是昆虫细胞系，如Sf9或Sf21细胞。当编码抗体基因的重组表达载体被引入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养下述时间段来生产抗体，所述时间段足够允许抗体在宿主细胞中表达，或更优选地，允许抗体被分泌进培养宿主细胞的培养基中。可使用标准的蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。植物宿主细胞包括例如烟草、拟南芥、浮萍、玉米、小麦、马铃薯等等。细菌宿主细胞包括E.coli和Streptomyces种。酵母宿主细胞包括Schizosaccharomyces pombe、Saccharomycescerevisiae和Pichia pastoris。

另外，生产细胞系对本发明抗体的表达可使用大量已知技术来增强。例如，谷氨酰胺合成酶(GS体系)和DHFR基因表达体系是用于在某些条件下增强表达的普遍途径。高表达细胞克隆可以使用常规技术(例如有限稀释克隆法和微滴技术)来鉴定。GS体系描述于欧洲专利Nos.0 216846、0 256 055、0 32 3997和0 338 841。

很可能由不同细胞系或转基因动物表达的抗体会具有彼此不同的糖基化作用。然而，由本文提供的核酸分子编码的所有抗体，或包含本文提供的氨基酸序列的所有抗体都属于本发明，无论抗体是否糖基化。

转基因动物和植物

本发明的P-钙黏着蛋白抗体也可通过产生下述哺乳动物或植物而转基因地生产，所述哺乳动物或植物被转入目的免疫球蛋白重链和轻链序列的基因并生产可回收形式的抗体。就哺乳动物中的转基因生产而言，P-钙黏着蛋白抗体可以在山羊、牛或其他哺乳动物的乳中产生，并从其中回收。参阅例如U.S.专利Nos.5,827,690、5,756,687、5,750,172和5,741,957，通过引用并入本文。

在一些实施方案中，包含人免疫球蛋白基因座的非人转基因动物使用P-钙黏着蛋白或其免疫原性部分被免疫，如上所述。用于在植物中制造抗体的方法描述于例如U.S.专利6,046,037和5,959,177中，通过引用并入本文。

在一些实施方案中，非人转基因动物或植物通过将一个或多个本发明的核酸分子(其编码P-钙黏着蛋白抗体或其抗原结合部分)通过标准的转基因技术引入动物或植物中来生产。参阅Hogan和United States专利6,417,429，如上文。用于制造转基因动物的转基因细胞可以是胚胎干细胞或体细胞或受精卵。转基因非人生物可以是嵌合体的、非嵌合体的杂合子和非嵌合体的纯合子。参阅例如Hogan et al.，Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual，2^nd ed.，Cold Spring Harbor Press(1999)；Jackson，et al.，Mouse Genetics and Transgenics：A Practical Approach，OxfordUniversity Press(2000)；和Pinkert，Transgenic Animal Technology：A Laboratory Handbook，Academic Press(1999)，其均通过引用并入本文。在一些实施方案中，转基因非人动物具有靶向构建体的定向破坏和替换，所述靶向构建体编码目的重链和/或轻链。P-钙黏着蛋白可在任何转基因动物中产生。在优选的实施方案中，非人动物是小鼠、大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马。非人转基因动物在血、乳、尿、唾液、泪水、粘液和其他体液中表达所述被编码的多肽。

种类转换

P-钙黏着蛋白的种类(例如IgG、IgM、IgE、IgA或IgD)和亚类(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)可以通过本领域已知的任何方法确定。一般地，抗体的种类和亚类可以使用对具体的抗体种类和亚类特异的抗体来确定。这类抗体是可商业购得的。可通过ELISA或Western印迹以及其他技术确定种类和亚类。或者，可如下确定种类和亚类：通过测序抗体重链和/或轻链的全部或部分恒定区，将它们的氨基酸序列与多种免疫球蛋白种类和亚类的已知氨基酸序列比较，并确定抗体的种类和亚类。本发明的P-钙黏着蛋白抗体可以是IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子。例如，P-钙黏着蛋白抗体可以是IgG，所述IgG是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类。在一个实施方案中，P-钙黏着蛋白抗体可具有SEQ ID NO：344所示的重链恒定区和SEQ ID NO：345所示的轻链恒定区。

本发明的一方面提供用于将P-钙黏着蛋白抗体的种类或亚类转化为另一种类或亚类的方法。在一些实施方案中，使用本领域公知的方法分离编码V_L或V_H的核酸分子，其不包括编码C_L或C_H的序列。然后将所述核酸分子与来自目的免疫球蛋白种类或亚类的、编码C_L或C_H的核酸序列可操作地连接。这可使用载体或包含C_L或C_H链的核酸分子完成，如上所述。例如，最初是IgM的P-钙黏着蛋白抗体可以被种类转换为IgG。另外，可使用种类转换将一个IgG亚类转换为另一个，例如从IgG1转换为IgG2。生产包含目的同种型的本发明抗体的另一种方法包括以下步骤：分离编码P-钙黏着蛋白抗体重链的核酸和编码P-钙黏着蛋白抗体轻链的核酸，分离编码V_H区的序列，将V_H序列与编码目的同种型重链恒定结构域的序列连接，在细胞中表达轻链基因和重链构建体，和收集带有目的同种型的P-钙黏着蛋白抗体。

脱免疫化的抗体

在本发明的另一方面，可使用例如PCT公开Nos.WO98/52976和WO00/34317(通过引用并入本文)中描述的技术脱免疫化抗体或其抗原结合部分以降低其免疫原性。

经衍生的和经标记的抗体

本发明的P-钙黏着蛋白或其抗原结合部分可以被衍生或连接至另一分子(例如另一肽或蛋白质)。一般地，抗体或其部分被衍生使得P-钙黏着蛋白结合不受衍生或标记的不利影响。因此，本发明的抗体和抗体部分旨在包括本文所述的完整的和经修饰形式的人P-钙黏着蛋白。例如，本发明的抗体或抗体部分可以被功能性地连接(通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或以其他方式)至一个或多个其他分子部分，例如另一抗体(例如双特异性抗体或双抗体)、检测剂、标签、细胞毒素剂、药剂和/或蛋白质或肽，所述一个或多个其他分子部分能够介导抗体或抗体部分与另一分子(例如链霉亲和素核区或多组氨酸标签)的结合。

一种类型的衍生抗体是通过将两个或更多个抗体(相同或不同类型的，例如产生双特异性抗体)交联而生产的。合适的交联剂包括异双功能剂(例如m-maleimidobenzoyl-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同双功能剂(例如disuccinimidyl suberate)，所述异双功能剂具有被适当隔离区分隔开的两个不同的反应基团。这类接头可得自Pierce Chemical Company，Rockford，IL。

另一种类型的衍生抗体是经标记的抗体。可以用来衍生本发明抗体或抗原结合部分的检测剂包括荧光化合物(包括荧光黄、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白、镧系磷光体等)。抗体还可用适用于检测的酶标记，例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。抗体使用可检测的酶标记时，其可通过添加额外的试剂检测，酶使用所述额外的试剂产生可以辨别的反应产物。例如党存在辣根过氧化物酶时，添加过氧化氢酶和二氨基联苯导致有色的反应产物，其是可检测的。抗体还可用生物素标记，并通过间接测量抗生物素蛋白或链霉亲和素结合来检测。抗体还可用预先确定的、被二级报告基因(例如亮氨酸拉链对序列、用于二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)识别的多肽表位来标记。在一些实施方案种，标签通过多种长度的间隔臂结合以降低可能的位阻。P-钙黏着蛋白还可以用化学基团衍生，所述化学基团例如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基或碳水化合物基团。这些基团适用于促进抗体的生物学特性，例如提高血清的半衰期。

P-钙黏着蛋白抗体对P-钙黏着蛋白的亲合力

P-钙黏着蛋白抗体或其抗原结合部分对P-钙黏着蛋白的亲合力(K_D)和离解速率(k_off)可通过本领域已知方法测量。可通过ELISA、RIA、流式细胞仪或表面等离振子共振，例如BIACORE^TM来测量亲合力。离解速率可以通过表面等离振子共振来测量。优选地，通过表面等离振子共振测量亲合力和离解速率。更优选地，使用BIACORE^TM测量亲合力和离解速率。可使用本领域已知方法测定抗体是否与P-钙黏着蛋白抗体具有基本相同的K_D。这类测定K_D和k_off的方法可用于初始的筛选阶段，以及随后的优化阶段。

鉴定被P-钙黏着蛋白识别的P-钙黏着蛋白表位

本发明提供下述人P-钙黏着蛋白抗体，所述人P-钙黏着蛋白抗体与P-钙黏着蛋白结合，并与表1或2中所述的任何抗体竞争或交叉竞争和/或结合相同表位。可使用本领域已知方法测定抗体是否与本发明的P-钙黏着蛋白抗体结合相同的表位，或针对结合而交叉竞争。在一个实施方案中，允许本发明的P-钙黏着蛋白抗体在饱和条件下与P-钙黏着蛋白结合，然后测量测试抗体与P-钙黏着蛋白结合的能力。如果测试抗体能够和P-钙黏着蛋白抗体同时与P-钙黏着蛋白结合，则测试抗体和P-钙黏着蛋白抗体结合不同的表位。然而，如果测试抗体不能同时结合P-钙黏着蛋白，则测试抗体结合相同的表位或重叠表位，或与人P-钙黏着蛋白抗体所结合的表位密切近似的表位结合。该实验可使用ELISA、RIA、BIACORE^TM或流式细胞仪进行。在优选的实施方案中，实验使用ELISA进行。

通过p-钙黏着蛋白抗体抑制P-钙黏着蛋白活性

可使用大量测定法鉴定抑制P-钙黏着蛋白活性的P-钙黏着蛋白抗体。例如，细胞聚集测定法提供了测量P-钙黏着蛋白-依赖性的细胞聚集的方法。该类型的测定法使用过表达P-钙黏着蛋白的细胞系，其中细胞被置于悬浮液中并被允许形成P-钙黏着蛋白-依赖性聚集体。然后使用聚集测试，通过测量使用和不使用抗体导致的细胞聚集体的尺寸来定量P-钙黏着蛋白抗体阻止该聚集的能力。作为P-钙黏着蛋白抗体浓度的函数，细胞聚集体的尺寸可随后被用于测定IC₅₀值。实施例3提供了用于测量若干P-钙黏着蛋白抗体IC₅₀值的P-钙黏着蛋白-依赖性聚集体测定法的其他细节。

细胞粘附测定法还可用于测量P-钙黏着蛋白阻断细胞与受体P-钙黏着蛋白粘附的能力，所述受体P-钙黏着蛋白已被固定在固体载体上。该类型的测定法可通过例如将P-钙黏着蛋白固定在固体载体如塑料上来进行。然后允许过表达P-钙黏着蛋白的细胞通过P-钙黏着蛋白-P-钙黏着蛋白相互作用附着在固体载体上。然后可以使用或不使用P-钙黏着蛋白抗体定量附着的水平。作为抗体浓度的函数，附着可随后用于测定IC₅₀值。实施例3提供用于测量P-钙黏着蛋白抗体IC₅₀值的P-钙黏着蛋白-依赖性细胞附着测定法的其他细节。

P-钙黏着蛋白活性的抑制也可使用P-钙黏着蛋白依赖性球状体破坏测定法来测量。该类型的测定法测量P-钙黏着蛋白抗体破坏预先形成的P-钙黏着蛋白-依赖性细胞聚集的能力。通过测量聚集体的尺寸减小(作为抗体浓度的函数)，可测定IC₅₀值。实施例5提供用于测量P-钙黏着蛋白抗体IC₅₀值的P-钙黏着蛋白-依赖性球状体破坏测定法的其他细节。上述通过多种抗体或其抗原结合部分用于测定P-钙黏着蛋白活性抑制的方法和测定法，可在初始的筛选阶段以及随后的优化阶段使用。

分子选择性

本发明P-钙黏着蛋白抗体对其他钙黏着蛋白(例如E-钙黏着蛋白)的选择性可使用本领域公知方法测定。例如，可使用Western印迹、流式细胞仪、ELISA、免疫沉淀或RIA测定选择性。实施例7提供ELISA测定法的其他细节，所述ELISA测定法用于测量特定抗体对P-钙黏着蛋白超出E-钙黏着蛋白的选择性。上述用于测定多种抗体或其抗原结合部分对P-钙黏着蛋白选择性的方法和测定法，可在初始的筛选阶段以及随后的优化阶段使用。

药物组合物和施用

本发明还涉及用于在哺乳动物(包括人)中治疗异常细胞生长的药物组合物，所述药物组合物包含一定量的本文所述P-钙黏着蛋白抗体或其抗原结合部分以及药物可接受载体，所述量有效治疗异常细胞生长。

本发明的抗体和抗原结合部分可被整合进适用于施用给受试者的药物组合物中。典型地，药物组合物包含本发明的抗体或抗原结合部分和药物可接受载体。本文使用“药物可接受载体”是指生理学适用的任何和所有的溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药物可接受载体的一些实例是水、盐水、磷酸盐缓冲的盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。在许多情况下，组合物中优选包括等渗剂例如糖，多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。药物可接受物质的其他实例是湿润剂或少量辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液，其延长抗体的储藏寿命或提高其效力。

本发明的组合物可以是多种形式，例如液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液(例如可注射的和可输注的溶液)、分散液或悬浮液、药片、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。优选的形式取决于将采用的施用和治疗应用模式。典型的优选的组合物是可注射或可输注的溶液，例如与用于被动免疫人的组合物类似的组合物。优选的施用模式是肠胃外的(例如静脉、皮下、腹膜内、肌内)。在优选的实施方案中，通过静脉输注或注射施用抗体。在另一优选的实施方案中，通过肌内或皮下注射施用抗体。用于注射的配方可以以单位剂型存在于例如安瓿或多剂容器中，添加或不添加防腐剂。组合物可在油性或水性运载体中带有如悬浮液、溶液或乳剂之类的形式，并可含有配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是用于在使用前与合适运载体(例如灭菌的无热原水)组合的粉末形式。

典型地，治疗组合物在制造和储存的条件下必须是无菌和稳定的。组合物可被配制为溶液、微乳剂、分散剂、脂质体或适用于高药物浓度的其他有序结构。可通过将所需用量的P-钙黏着蛋白抗体整合进带有所需的上文所列成分之一或其组合的适当溶剂中，然后过滤灭菌来制备无菌的可注射溶液。一般地，通过将活性化合物整合进无菌运载体中制备分散剂，所述无菌运载体含有基础分散介质和来自上文所列的需要的其他成分。在用于配制无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的配制方法是真空干燥和冷冻干燥，其从先前经无菌过滤的溶液中得到活性成分加上任何额外所需成分的粉末。可例如通过使用涂层如卵磷脂，通过维持所需的颗粒尺寸(在分散剂的情况下)和通过使用表面活性剂来维持溶液的适当流动性。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来实现。

本发明的抗体或抗体部分可通过本领域已知的多种方法施用，尽管对于许多治疗应用而言，优选的施用途径/方式是皮下、肌内或静脉输注。本领域技术人员应当知道，施用途径和/或方式会取决于所需结果而变化。

在某些实施方案中，本发明的抗体组合物可以用下述载体制备，所述载体会保护抗体免于快速释放，例如受控释放成分，包括埋植剂、透皮贴剂和微囊包埋递送体系。可使用生物可降解的、生物相容的多聚体，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚正酯和聚乳酸。用于制备这类配方的许多方法是本领域技术人员普遍已知的。参阅例如Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems，J.R.Robinson，ed.，MarcelDekker，Inc.，New York，1978，其通过引用并入本文。

额外的活性化合物也可被整合进组合物中。在某些实施方案中，本发明的异质性P-钙黏着蛋白抗体与一种或多种额外的治疗剂共同配制和/或共同施用。这些剂包括但不限于结合其他靶标的抗体、抗肿瘤剂、抗血管生成剂、信号转导抑制剂、抗增殖剂、化学治疗剂或抑制P-钙黏着蛋白的肽类似物。这类组合治疗可需要低剂量的抑制性P-钙黏着蛋白以及共同施用的剂，从而避免伴随着多种单一治疗的可能的毒性或并发症。

本发明的组合物可包括“治疗上有效量”或“预防上有效量”的本发明抗体或抗原结合部分。“治疗上有效量”是指按剂量或对必需的时间段而言，有效达到所需治疗结果的量。抗体或抗原结合部分的治疗上有效量可根据例如疾病阶段、年龄、性别和个体体重的因子以及抗体或抗体部分在个体中因其所需应答的能力而变化。治疗上有效量也是下述量，其中治疗上有益的效应胜过抗体或抗原结合部分的任何有毒效应或有害效应。“预防上有效量”是指按剂量或对必需的时间段而言，有效达到所需预防结果的量。典型地，因为预防剂量被用于患疾病之前的或处于疾病早期阶段的受试者中，所以预防上有效量可少于治疗上有效量。

可调节给药方案以提供最佳的期望应答(例如治疗的或预防的应答)。例如，可以施用单次大丸剂(bolus)，可以随时间进展施用若干被分开的剂量或所述剂量可根据治疗情况所要求的按比例降低或提高。特别有利的是以单位剂型配制肠胃外组合物，以简化施用和剂量均一性。本文使用单位剂型是指物理上分离的单位，其适合作为单一剂量用于被治疗的哺乳动物受试者；每个单位含有与所需药物载体结合的、经计算以产生所需治疗效果的预定数量的活性成分。本发明单位剂型的规格由以下规定并直接取决于(a)P-钙黏着蛋白抗体或其部分的独特特性和所要达到的具体治疗或预防效应；和(b)调剂领域中这类抗体用于治疗个体中敏感性的固有限制。

本发明抗体或抗体部分的治疗上或预防上有效量的示范性的、非限制的范围是0.025到50mg/kg，更优选地0.1到50mg/kg，更优选地0.1-25、0.1到10或0.1到3mg/kg。在一些实施方案中，配方在20mM柠檬酸钠(pH5.5)、140mM NaCl和0.2mg/mL聚山梨酯80的缓冲液中含有5mg/mL的抗体。应当注意剂量值可随着待减轻的病症类型和严重性而变化。还应当理解对任何具体的受试者，应当根据个体需要和施用组合物或管理组合物施用的人的专业判断，随着时间调整特定的给药方案，本文公开的剂量范围仅是示范性的，并不旨在限制所要求的组合物的范围或实践。

本发明的另一方面提供包含本发明P-钙黏着蛋白抗体或抗原结合部分的试剂盒，或包含这类抗体或部分的组合物。除抗体或组合物外，试剂盒可包括诊断剂或治疗剂。试剂盒可包括针对诊断方法或治疗方法使用的说明书。在优选的实施方案中，试剂盒包括抗体或包含抗体的组合物，以及可用于下述方法中的诊断剂。在另一优选的实施方案中，试剂盒包括抗体或包含抗体的组合物，以及可用于下述方法中的一种或多种治疗剂。

使用的诊断方法

P-钙黏着蛋白或其抗体结合部分可用于诊断方法以检测体外或体内生物样品中的P-钙黏着蛋白。例如，P-钙黏着蛋白可用于常规免疫测定法，包括但不限于ELISA、RIA、流式细胞仪、组织免疫组织化学、Western印迹或免疫沉淀。本发明的P-钙黏着蛋白可用于检测来自人的P-钙黏着蛋白。P-钙黏着蛋白也可用于检测来自小鼠、大鼠和短尾猴的P-钙黏着蛋白。

本发明提供用于检测生物样品中P-钙黏着蛋白的方法，包含将生物样品与本发明的P-钙黏着蛋白接触并检测结合的抗体。在一个实施方案中，P-钙黏着蛋白抗体用可检测的标签直接标记。在另一实施方案中，P-钙黏着蛋白抗体(第一抗体)未被标记，能够结合P-钙黏着蛋白抗体的第二抗体或其他分子被标记。如本领域技术人员所公知的，选择能够与具体种类和类别的第一抗体特异结合的第二抗体。例如，如果P-钙黏着蛋白抗体是人IgG，则第二抗体可以是抗-人-IgG。能够结合抗体的其他分子包括但不限于A蛋白和G蛋白，其均可从例如Pierce Chemical Co.商业获得。

用于抗体或二级抗体的合适标签先前已讨论，其包括多种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基络合物实例包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料实例包括伞形酮、荧光黄、异硫氰酸荧光素、罗丹明、dichlorotriazinylamine荧光黄、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；合适的放射性材料的实例包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或³H。

在其他实施方案中，可使用经可检测物质标记的P-钙黏着蛋白标准和未标记的P-钙黏着蛋白抗体，通过竞争免疫测定法在生物样品中测定P-钙黏着蛋白。在该测定法中，将生物样品、经标记的P-钙黏着蛋白标准和P-钙黏着蛋白抗体组合，并测定与未标记抗体结合的经标记的P-钙黏着蛋白标准的量。生物样品中P-钙黏着蛋白的量和结合了P-钙黏着蛋白抗体的经标记的P-钙黏着蛋白标准的量成反比。

上述免疫测定法可被用于大量目的。例如，P-钙黏着蛋白抗体可被用于在经培养的细胞中检测P-钙黏着蛋白。在优选的实施方案中，P-钙黏着蛋白抗体被用于检测细胞产生的P-钙黏着蛋白的量，所述细胞已用多种化合物处理。该方法可用于鉴定调节P-钙黏着蛋白水平的化合物。根据该方法，用一种测试化合物处理一种细胞一段时间，同时另一样品不被处理。如果要测量总P-钙黏着蛋白水平，则将细胞裂解并使用上述免疫测定法之一测量总P-钙黏着蛋白水平。比较处理细胞与未处理细胞相对的总P-钙黏着蛋白水平以测定测试化合物的效应。

用于测量总P-钙黏着蛋白水平的优选免疫测定法是流式细胞仪或免疫组织化学。例如ELISA、RIA、流式细胞仪、Western印迹、免疫组织化学、细胞表面标记膜内在蛋白质和免疫沉淀为本领域公知。参阅例如Harlow and Lane，上文。另外，免疫测定法可以提高为高通量筛选，从而检测大量化合物的活性或对P-钙黏着蛋白的抑制。

本发明的P-钙黏着蛋白抗体也可用于检测组织中或来自该组织的细胞中P-钙黏着蛋白水平。在一些实施方案中，该组织是患病组织。在该方法的一些实施方案中，组织或其组织活检从患者切离。然后将组织或组织活检用于免疫测定法，以通过上文所述方法测定例如总P-钙黏着蛋白水平或定位P-钙黏着蛋白。

本发明的抗体还可体内用于鉴定表达P-钙黏着蛋白的组织和器官。使用本发明的人P-钙黏着蛋白抗体的一个优点在于：与非人来源的抗体或人源化抗体或嵌合抗体不同，它们可被安全地体内使用而不因为施用引起对抗体的显著免疫应答。

该方法包含步骤：向需要这类诊断测试的患者施用经可检测地标记的P-钙黏着蛋白抗体或包含它们的组合物，对患者进行图像分析以确定表达P-钙黏着蛋白的组织定位。图像分析为医学领域所公知，包括但不限于x射线分析、磁共振成像(MRI)或计算机断层摄影术(CT)。抗体可用适用于体内成像的任何剂标记，例如造影剂如钡(其可被用于x射线分析)，或磁造影剂如钆螯合物(其可用于MRI或CT)。其他标记剂包括但不限于放射性同位素，例如⁹⁹Tc。在另一实施方案中，P-钙黏着蛋白抗体可以是未标记的，并可通过施用可检测并能结合P-钙黏着蛋白抗体的第二抗体或其它分子而被成像。在一个实施方案中，从患者获得组织活检以确定目的组织是否表达P-钙黏着蛋白。

使用的治疗方法

在另一实施方案中，本发明提供通过向需要的患者施用P-钙黏着蛋白抗体而用于抑制P-钙黏着蛋白活性的方法。本文所述任何抗体或其抗原结合部分可治疗性地使用。在优选的实施方案中，P-钙黏着蛋白抗体是人抗体、嵌合抗体或人源化的抗体。在另一优选的实施方案中，P-钙黏着蛋白是人的，患者是人患者。或者，患者可以是表达与所述P-钙黏着蛋白抗体交叉反应的P-钙黏着蛋白的哺乳动物。可以向表达(与所述抗体交叉反应的)P-钙黏着蛋白的非人哺乳动物(例如大鼠、小鼠或短尾猴)施用抗体，用于兽医的目的或用作人疾病的动物模型。这类动物模型可适用于评价本发明抗体的治疗效力。

在另一实施方案中，P-钙黏着蛋白抗体或其抗体部分可被施用给表达异常高水平P-钙黏着蛋白的患者。该抗体可被施用一次，但更优选被施用多次。抗体可被施用为一天三次到每六个月或更久一次。施用可以按照如下的日程表：一天三次、一天两次、一天一次、两天一次、三天一次、一周一次、两周一次、一个月一次、两个月一次、三个月一次和六个月一次。抗体还可通过微泵被连续地施用。抗体可以通过粘膜、颊、鼻内、吸入、静脉、皮下、肌内、肠胃外或瘤内途径被施用。抗体可被施用一次、至少两次或至少施用一段之间直到病症被治疗、减轻或治愈。一般地，只要病症存在，抗体就被施用。一般地，抗体会作为上文所述药物组合物的一部分被施用。一般地，抗体剂量会在0.1到100mg/kg，更优选地0.5到50mg/kg，更优选地1到20mg/kg和进一步更优选地1到10mg/kg的范围内。血清抗体浓度可通过本领域已知的任何方法测量。

本发明还涉及用于治疗哺乳动物(包括人)中异常细胞生长的方法，包含向所述哺乳动物施用治疗上有效量的P-钙黏着蛋白或其抗原结合部分，如上所述，其有效治疗异常细胞生长。

在该方法的一个实施方案中，异常细胞生长是癌症，包括但不限于间皮瘤、肝胆管(肝和胆管)的癌症、原发性或继发性的CNS肿瘤、原发性或继发性的脑肿瘤、肺癌(NSCLC和SCLC)、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头与颈癌、表皮或眼内黑色素瘤、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、肠胃(胃的、结肠直肠的和十二指肠的)的癌症、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴门癌、Hodgkin’s疾病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、睾丸癌、慢性或急性白血病、慢性髓细胞样白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)新生物、原发性CNS淋巴瘤、非hodgkins’s淋巴瘤、脊髓性枢椎肿瘤(spinal axis tumors)、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、肾上腺皮质癌、单囊癌、多发性骨髓瘤、胆管癌、纤维肉瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤，或一种或多种上述癌症的组合。

在本发明优选的实施方案中，癌症选自肺癌(NSCLC和SCLC)、头与颈癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、乳腺癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)新生物、原发性CNS淋巴瘤、非hodgkins’s淋巴瘤、脊髓枢椎肿瘤或一种或多种上述癌症的组合。

在本发明优选的实施方案中，癌症选自肺癌(NSCLC和SCLC)、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、肛区癌或一种或多种上述癌症的组合。

在所述方法的另一实施方案中，所述异常细胞生长是良性的增生疾病，包括但不限于银屑病、良性前列腺肥大或组织增生(restinosis)。

本发明还涉及用于治疗哺乳动物中异常细胞生长的方法，其包含向所述哺乳动物施用一定量的P-钙黏着蛋白抗体或其抗原结合部分(如本文所述，所述量有效治疗异常细胞生长)以及选自以下的抗肿瘤剂：核分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢物、嵌入抗生素、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、生物应答修饰剂、抗体、细胞毒素、抗激素和抗雄激素。

本发明还涉及用于治疗哺乳动物(包括人)中异常细胞生长的药物组合物，其包含一定量(如本文所述，所述量有效治疗异常细胞生长)的P-钙黏着蛋白或其抗原结合部分与药物可接受载体和选自以下的抗肿瘤剂：核分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢物、嵌入抗生素、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、生物应答修饰剂、抗激素和抗雄激素。

本发明还涉及用于治疗哺乳动物中高增生性疾病的方法，其包含向所述哺乳动物施用治疗上有效量的P-钙黏着蛋白抗体或其抗原结合部分(如本文所述)以及选自以下的抗肿瘤剂：抗增殖剂、激酶抑制剂、血管生成抑制剂、生长因子抑制剂、cox-I抑制剂、cox-II抑制剂、核分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢物、嵌入抗生素、生长因子抑制剂、辐射、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、生物应答修饰剂、抗体、细胞毒素、抗激素、statins和抗雄激素。

在本发明的一个实施方案中，与本文所述P-钙黏着蛋白抗体或其抗原结合部分和药物组合物组合使用的抗肿瘤剂是抗血管生成剂、激酶抑制剂、pan激酶抑制剂或生长因子抑制剂。优选的pan激酶抑制剂包括U.S.专利No.6,573,293(Pfizer，Inc，NY，USA)中描述的SU-11248。

抗血管生成剂，包括但不限于以下剂，例如EGF抑制剂、EGFR抑制剂、VEGF抑制剂、VEGFR抑制剂、TIE2抑制剂、IGFIR抑制剂、COX-II(环氧合酶II)抑制剂、MMP-2(基质-金属蛋白酶2)抑制剂和MMP-9(基质-金属蛋白酶9)抑制剂。优选的VEGF抑制剂包括例如Avastin(贝伐单抗bevacizumab)和Genentech，Inc.of South San Francisco，California的抗VEGF单克隆抗体。

其它的VEGF抑制剂包括CP-547,632(Pfizer Inc.，NY，USA)、AG13736(Pfizer Inc.)、ZD-6474(AstraZeneca)、AEE788(Novartis)、AZD-2171)、VEGF Trap(Regeneron，/Aventis)、Vatalanib(也称为PTK-787、ZK-222584：Novartis & Schering AG)、Macugen(pegaptanib octasodium，NX-1838，EYE-001，Pfizer Inc./Gilead/Eyetech)、IM862(Cytran Inc.ofKirkland，Washington，USA)；和angiozyme--来自Ribozyme(Boulder，Colorado)和Chiron(Emeryville，California)的合成性合酶，及其组合。在本发明实践中有用的VEGF抑制剂公开于US专利No.6,534,524和6,235,764中，所述资料的整体内容均并入本文用于所有目的。具体优选的VEGF抑制剂包括CP-547,632、AG13736、Vatalanib、Macugen及其组合。

其它的VEGF抑制剂描述于例如WO 99/24440(1999年五月20日公开)、PCT国际申请PCT/IB99/00797(1999年五月3日提交)、WO95/21613(1995年八月17日公开)、WO 99/61422(1999年十二月2日公开)、美国专利6,534,524(公开AG13736)、美国专利5,834,504(1998年十一月10日出版)、WO 98/50356(1998年十一月12日公开)、美国专利5,883,113(1999年三月16日出版)、美国专利5,886,020(1999年三月23日出版)、美国专利5,792,783(1998年八月11日出版)、U.S.专利No.US 6,653,308(2003年十一月25日出版)、WO 99/10349(1999年三月4日公开)、WO 97/32856(1997年十二月12日公开)、WO 97/22596(1997年六月26日公开)、WO 98/54093(1998年十二月3日公开)、WO 98/02438(1998年一月22日公开)、WO 99/16755(1999年四月8日公开)和WO 98/02437(1998年一月22日公开)，其整体内容均通过引用并入本文。

可以与本发明抗体或其抗原结合部分使用的其它抗增殖剂包括法呢基蛋白质转移酶的酶抑制剂和受体酪氨酸激酶PDGFr的抑制剂，包括以下美国专利申请中所公开并要求的化合物：09/221946(1998年十二月28日提交)；09/454058(1999年十二月2日提交)；09/501163(2000年二月9日提交)；09/539930(2000年三月31日提交)；09/202796(1997年五月22日提交)；09/384339(1999年八月26日提交)和09/383755(1999年八月26日提交)；和以下的美国临时专利申请中公开并要求的化合物：60/168207(1999年十一月30日提交)；60/170119(1999年十二月10日提交)；60/177718(2000年一月21日提交)；60/168217(1999年十一月30日提交)和60/200834(2000年五月1日提交)。每个上述专利申请和临时专利申请的整体内容被引入本文。

PDGRr抑制剂包括但不限于公开于以下的那些：2001年七月7日公开的WO01/40217和2004年三月11日公开的WO2004/020431，就一切目的而言其内容整体并入本文。优选的PDGFr抑制剂包括Pfizer’s CP-673,451和CP-868,596及其可药用盐。

优选的GARF抑制剂包括Pfizer’s AG-2037(pelitrexol及其可药用盐)。适用于本发明实践的GARF抑制剂公开于U.S.专利No.5,608,082，就一切目的而言其被整体引入。

可与本文所述P-钙黏着蛋白抗体或其抗原结合部分和本文所述药物组合物组合使用的、有用的COX-II抑制剂的实例包括：CELEBREX^TM(塞来考昔)、帕瑞考昔、地拉考昔、ABT-963、MK-663(艾托考昔)、COX-189(Lumiracoxib)、BMS 347070、RS 57067、NS-398、Bextra(伐地考昔)、paracoxib、Vioxx(罗非考昔)、SD-8381、4-甲基-2-(3，4-二甲基苯基)-1-(4-氨磺酰基-苯基)-1H-吡咯、2-(4-乙氧苯基)-4-甲基-1-(4-氨磺酰基苯基)-1H-吡咯、T-614、JTE-522、S-2474、SVT-2016、CT-3、SC-58125和Arcoxia(艾托考昔)。另外，COX-II抑制剂公开于U.S.专利申请Nos.10/801,446和10/801,429，就一切目的而言其内容被整体并入。

在一个优选的实施方案中，抗肿瘤剂是如U.S.专利No.5,466,823中公开的塞来考昔，就一切目的而言其内容通过引用被整体并入。塞来考昔的结构如下所示：

在一个优选的实施方案中，抗肿瘤剂是如U.S.专利No.5,633,272中所公开的法利考昔(valecoxib)，就一切目的而言其内容通过引用被整体并入。法利考昔的结构如下所示：

在一个优选的实施方案中，抗肿瘤剂是如U.S.专利No.5,932,598中所公开的帕瑞考昔，就一切目的而言其内容通过引用被整体并入。帕瑞考昔的结构如下所示：

在一个实施方案中，抗肿瘤剂是如U.S.专利No.5,521,207所述的地拉考昔，就一切目的而言其内容通过引用被整体并入。地拉考昔的结构如下所示：

在一个优选的实施方案中，抗肿瘤剂是如U.S.专利No.6,034,256中公开的SD-8381，就一切目的而言其内容通过引用被整体并入。SD-8381的结构如下所示：

在一个优选的实施方案中，抗肿瘤剂是如国际公开号WO 2002/24719中公开的ABT-963，就一切目的而言其内容通过引用被整体并入。ABT-963的结构如下所示：

在优选的实施方案中，抗肿瘤剂是如下所示的罗非考昔：

在一个优选的实施方案中，抗肿瘤剂是如国际公开号WO 1998/03484中所公开的MK-663(艾托考昔)，就一切目的而言其内容通过引用被整体并入。艾托考昔的结构如下所示：

在一个优选的实施方案中，抗肿瘤剂是如国际公开号WO 1999/11605中所述的COX-189(Lumiracoxib)，就一切目的而言其内容通过引用被整体并入。Lumiracoxib的结构如下所示：

在一个优选的实施方案中，抗肿瘤剂是如美国专利No.6,180,651中所公开的BMS-347070，就一切目的而言其内容通过引用被整体并入。BMS-347070的结构如下所示：

在一个优选的实施方案中，抗肿瘤剂是NS-398(CAS 123653-11-2)。NS-398(CAS 123653-11-2)的结构如下所示：

在一个优选的实施方案中，抗肿瘤剂是RS 57067(CAS 17932-91-3)。RS 57067(CAS 17932-91-3)的结构如下所示：

在一个优选的实施方案中，抗肿瘤剂是4-甲基-2-(3，4-二甲基苯基)-1-(4-氨磺酰基-苯基)-1H-吡咯。4-甲基-2-(3，4-二甲基苯基)-1-(4-氨磺酰基-苯基)-1H-吡咯的结构如下所示：

在一个优选的实施方案中，抗肿瘤剂是2-(4-乙氧苯基)-4-甲基-1-(4-氨磺酰基苯基)-1H-吡咯。2-(4-乙氧苯基)-4-甲基-1-(4-氨磺酰基苯基)-1H-吡咯的结构如下所示：

在一个优选的实施方案中，抗肿瘤剂是美洛昔康(meloxicam)。美洛昔康的结构如下所示：

与本发明抗体和本文所述的药物组合物一起用作抗肿瘤剂的其它有用抑制剂包括阿司匹林和非载体抗炎药(NSAID)，它们抑制制造前列腺素的酶(环氧合酶I和II)，导致更低的前列腺素水平，其包括但不限于以下的：双水杨酸酯(Salsalate)(Amigesic)、氟苯水杨酸(Diflunisal)(Dolobid)、布洛芬(Ibuprofen)(Motrin)、酮洛芬(Ketoprofen)(Orudis)、萘丁美酮(Nabumetone)(Relafen)、皮洛西康(Piroxicam)(Feldene)、萘普生(Naproxen)(Aleve，Naprosyn)、双氯芬酸(Diclofenac)(Voltaren)、吲哚美辛(Indomethacin)(Indocin)、舒林酸(Sulindac)(Clinoril)、痛灭定(Tolmetin)(Tolectin)、依托度酸(Etodolac)(Lodine)、酮咯酸(Ketorolac)(Toradol)、恶丙嗪(Oxaprozin)(Daypro)及其组合。优选的COX-I抑制剂包括布洛芬(Motrin)、磺胺二甲噁唑、萘普生(Aleve)、吲哚美辛(Indocin)、萘丁美酮(Relafen)及其组合。

与本文所述P-钙黏着蛋白抗体或其抗原结合部分以及本文所述药物组合物组合使用的定向剂包括EGFr抑制剂，例如易瑞沙(Iressa)(吉非替尼(gefitinib)、阿斯利康(AstraZeneca))、得舒缓(Tarceva)(埃罗替尼(erlotinib)或OSI-774，OSI Pharmaceuticals Inc.)、而必得舒(Erbitux)(西妥昔单抗，Imclone Pharmaceuticals，Inc.)、EMD-7200(Merck AG)、ABX-EGF(Amgen Inc.和Abgenix Inc.)、HR3(Cuban Government)、IgA抗体(University of Erlangen-Nuremberg)、TP-38(IVAX)、EGFR融合蛋白、EGF-疫苗、抗-EGFr免疫脂质体(Hermes Biosciences Inc.)及其组合。

优选的EGFr抑制剂包括易瑞沙、而必得舒、得舒缓及其组合。本发明还涉及选自pan erb受体抑制剂或ErbB2受体抑制剂的抗肿瘤剂，例如CP-724,714(Pfizer，Inc.)、CI-1033(坎呢替尼(canertinib)，Pfizer，Inc.)、贺癌平(Herceptin)(曲妥单抗，Genentech Inc.)、奥米他(Omitarg)(2C4，派特资哌(pertuzumab)，Genentech Inc.)、TAK-165(Takeda)、GW-572016(龙呢法尼(lonafarnib)，GlaxoSmithKline)、GW-282974(GlaxoSmithKline)、EKB-569(Wyeth)、PKI-166(Novartis)、dHER2(HER2Vaccine，Corixa and GlaxoSmithKline)、APC8024(HER2Vaccine，Dendreon)、抗HER2/神经鞘双特异性抗体(Decof Cancer Center)、B7.her2.IgG3(Agensys)、AS HER2(Research Institute for Rad Biology &Medicine)、三功能双特异性抗体(University of Munich)和mAB AR-209(Aronex Pharmaceuticals Inc)和mAB 2B-1(Chiron)及其组合。优选的erb选择性抗肿瘤剂包括Herceptin、TAK-165、CP-724,714、ABX-EGF、HER3及其组合。优选的pan erbb受体抑制剂包括GW572016、CI-1033、EKB-569和奥米他及其组合。

其它的erbB2抑制剂包括描述于以下的那些：WO 98/02434(1998年一月22日公开)、WO 99/35146(1999年七月15日公开)、WO99/35132(1999年七月15日公开)、WO 98/02437(1998年一月22日公开)、WO 97/13760(1997年四月17日公开)、WO 95/19970(1995年七月27日公开)、美国专利5,587,458(1996年十二月24日出版)和美国专利5,877,305(1999年三月2日出版)，每个资料通过引用被整体并入本文。适用于本发明的ErbB2受体抑制剂也描述于美国专利Nos.6,465,449和6,284,764和国际申请No.WO 2001/98277中，每个资料通过引用被整体并入本文。

另外，其它的抗肿瘤剂可选自以下剂：BAY-43-9006(OnyxPharmaceuticals Inc.)、根纳三思(Genasense)(奥格莫森(augmerosen)，Genta)、盘尼图姆(Panitumumab)(Abgenix/Amgen)、泽娃灵(Zevalin)(Schering)、托西莫(Bexxar)(Corixa/GlaxoSmithKline)、阿巴瑞克(Abarelix)、力比泰(Alimta)、EPO 906(Novartis)、迪斯德莫来(discodermolide)(XAA-296)、ABT-510(Abbott)、癌立消(Neovastat)(Aeterna)、恩泽特林(enzastaurin)(Eli Lilly)、风车子阻生素(Combrestatin)A4P(Oxigene)、ZD-6126(AstraZeneca)、氟拉皮雷多(flavopiridol)(Aventis)、CYC-202(Cyclacel)、AVE-8062(Aventis)、DMXAA(Roche/Antisoma)、诺拉曲特(Thymitaq)(Eximias)、硝卡芥(Temodar)(替莫唑胺，Schering Plough)和雷维里德(Revilimd)(Celegene)及其组合。

其它抗肿瘤剂可选自以下剂：西皮特(CyPat)(醋酸环丙孕酮)、组胺瑞林(Histerelin，醋酸组氨瑞林)、皮雷恩思(Plenaixis)(abarelixdepot)、阿曲生坦(Atrasentan)(ABT-627)、萨特铂(Satraplatin)(JM-216)、沙利度胺(thalomid)、塞拉特(Theratope)、替米利芬(Temilifene)(DPPE)、ABI-007(紫杉醇)、易维特(Evista)(雷洛昔芬)、阿他美坦(Atamestane)(Biomed-777)、聚壳氨酸紫杉醇(Xyotax，polyglutamate paclitaxel)、他格停(Targetin)(bexarotine)及其组合。

另外，其它抗肿瘤剂可选自以下剂：特塞酮(Trizaone)(替拉扎明)、依昔舒林(Aposyn，exisulind)、萘瓦特(Nevastat)(AE-941)、色谱林(Ceplene)(二盐酸组胺)、卢比替康(Orathecin，rubitecan)、维如利金(Virulizin)、胰腺癌疫苗(Gastrimmune)(G17DT)、DX-8951f(依喜替康甲磺酸盐(exatecan mesylate))、Onconase(豹蛙酶)、BEC2(米妥莫单抗)、莫特沙芬钆(Xcytrin，motexafin gadolinium)及其组合。

其它的抗肿瘤剂可选自以下剂：昔瓦(CeaVac)(CEA)、新特瑞辛(NeuTrexin)(三切葡糖醛酸酯(trimetresate glucuronate))及其组合。额外的抗肿瘤剂可选自以下剂：奥雷瑞(OvaRex)(oregovomab)、奥昔地(Osidem)(IDM-1)及其组合。额外的抗肿瘤剂可选自以下剂：阿德维辛(Advexin)(ING 201)、替拉兹明(Tirazone)(tirapazamine)及其组合。额外的抗肿瘤剂可以选自以下剂：RSR13(乙丙昔罗(efaproxiral))、克他拉(Cotara)(131I chTNT 1/b)、NBI-3001(IL-4)及其组合。额外的抗肿瘤剂可选自以下剂：Canvaxin、GMK疫苗、PEG Interon A、泰克派新(Taxoprexin)(DHA/派昔泰克(paciltaxel))及其组合。其它优选的抗肿瘤剂包括Pfizer的MEK1/2抑制剂PD325901、Array Biopharm的MEK抑制剂ARRY-142886、Bristol Myers的CDK2抑制剂BMS-387,032、Pfizer的CDK抑制剂PD0332991和AstraZeneca的AXD-5438及其组合。额外地，mTOR抑制剂也可利用，例如CCI-779(Wyeth)和雷怕霉素衍生物RAD001(Novartis)和AP-23573(Ariad)、HDAC抑制剂SAHA(Merck Inc./AtonPharmaceuticals)及其组合。额外的抗肿瘤剂包括aurora 2抑制剂VX-680(Vertex)、Chk1/2抑制剂XL844(Exilixis)。

以下的细胞毒素剂，例如选自表柔比星(Ellence)、多西紫杉醇(Taxotere)、紫杉醇、右雷佐生(Zinecard，dexrazoxane)、美罗华(Rituxan)、甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)(Gleevec)的一种或多种及其组合可与本文所述的P-钙黏着蛋白抗体或其抗原结合部分和本文所述的药物组合物组合使用。

本发明还关注本发明抗体及其抗原结合部分与激素疗法一起的用途，所述激素疗法包括但不限于依西美坦(Aromasin，Pfizer Inc.)、亮丙瑞林(Lupron或Leuplin，TAP/Abbott/Takeda)、阿那曲唑(Arimidex，Astrazeneca)、gosrelin(Zoladex，AstraZeneca)、度骨化醇、法倔唑、福美坦、柠檬酸他莫昔芬(他莫昔芬，Nolvadex，AstraZeneca)、康士得(Casodex)(AstraZeneca)、阿巴瑞克(Abarelix)(Praecis)、普托雷林(Trelstar)及其组合。

本发明还涉及激素治疗剂例如抗抗雌激素，包括但不限于氟维司群、托瑞米芬、雷洛昔芬、拉索昔芬、来曲唑(Femara，Novartis)；抗雄激素，例如比卡鲁胺、氟他胺、米非司酮、尼鲁米特、Casodex

(4′-氰基-3-(4-氟苯基磺酰)-2-羟基-2-甲基-3′-(三氟甲基)丙酰苯胺，比卡鲁胺)及其组合。

另外，本发明提供单独的或与一种或多种支持性医护产品组合的本发明的抗体，所述支持性医护产品例如选自沙格莫丁(Filgrastim)(Neupogen)、昂丹司琼(Zofran)、法玛西亚(Fragmin)、促红细胞生长素(Procrit)、阿乐喜(Aloxi)、止敏吐(Emend)的产品或其组合。

具体地优选的细胞毒素剂包括伊立替康(Camptosar)、而必得舒、易瑞沙、格列卫(Gleevec)、泰素帝(Taxotere)及其组合。

以下的拓扑异构酶I抑制剂可以作为抗肿瘤剂使用：喜树碱、盐酸伊立替康(irinotecan HCl，伊立替康(Camptosar))、艾替卡辛(edotecarin)、卢比替康(orathecin)(Supergen)、依沙替康(exatecan，Daiichi)、BN-80915(Roche)及其组合。具体地优选的拓扑异构酶II包括表柔比星(Ellence)。

本发明的抗体可以与抗肿瘤剂、烷化剂、抗代谢物、抗生素、来自植物的抗肿瘤剂、喜树碱衍生物、酪氨酸激酶抑制剂、其它抗体、干扰素和/或生物应答修饰剂一起使用。

烷化剂包括但不限于氮芥N-氧化物、环磷酰胺、异磷酰胺、美法仑、白消安、二溴甘露醇、卡波醌、塞替派、雷莫司汀、尼莫司汀、替莫唑胺、AMD-473、六甲蜜胺、AP-5280、阿帕兹酮(apaziquone)、布罗他辛(brostallicin)、苯达莫司汀、卡莫司汀、雌莫司汀、福莫司汀、葡磷酰胺、异磷酰胺、KW-2170、马磷酰胺和二溴卫矛醇；铂配合的烷化化合物包括但不限于顺铂、必治妥(Paraplatin)(卡铂)、依它铂、洛铂、奈达铂、奥沙利铂(Eloxatin，oxaliplatin，Sanofi)或塞特铂(satrplatin)及其组合。具体地优选的烷化剂包括奥沙利铂(Eloxatin)。

抗代谢物包括但不限于甲氨喋呤、6-巯嘌呤苷、巯嘌呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)单独或与亚叶酸(leucovorin)、替加氟、UFT、去氧氟尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷(cytarabine)、阿糖胞苷(cytarabine ocfosfate)、依诺他滨、S-1，力比泰(Alimta，premetrexed二钠，LY231514，MTA)、健泽(Gemzar)(吉西他滨，Eli Lilly)、氟达拉滨、5-阿扎胞苷、卡培他滨、克拉屈滨、氯法拉滨(clofarabine)、地西他滨、依氟鸟氨酸、乙炔基胞核(ethynylcytidine)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、羟基脲、TS-1、美法仑、奈拉滨、诺拉曲塞、奥佛思特(ocfosfate)、力比泰(disodium premetrexed)、喷司他丁、派利特克(pelitrexol)、雷替曲塞、特阿平(triapine)、曲美沙特、阿糖腺苷、长春新碱、长春瑞滨组合；或例如优选的抗代谢物之一公开于欧洲专利申请No.239362，例如N-(5-[N-(3，4-二氢-2-甲基-4-氧喹唑啉-6-基甲基)-N-甲氨基]-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸及其组合。

抗生素包括嵌入抗生素但不限于：阿柔比星(aclarubicin)、放线菌素D(actinomycin D)、安柔比星(amrubicin)、脂质体蒽环霉素(annamycin)、阿霉素(adriamycin)、博来霉素(bleomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、依沙芦星(elsamitrucin)、表柔比星(epirubicin)、加柔比星(galarubicin)、伊达比星(idarubicin)、丝裂霉素C、奈莫柔比星(nemorubicin)、新制癌菌素(neocarzinostatin)、培洛霉素(peplomycin)、吡柔比星(pirarubicin)、蝴蝶霉素(rebeccamycin)、司丁拉米(stimalamer)、链佐星(streptozocin)、戊柔比星(valrubicin)、净司他丁(zinostatin)及其组合。

来自植物的抗肿瘤物质包括例如选自核分裂抑制剂的物质，例如长春碱(vinblastine)、多西紫杉醇(Taxotere)、紫杉醇(paclitaxel)及其组合。

细胞毒拓扑异构酶抑制剂包括一种或多种选自以下的剂：阿拉柔比星(aclarubicn)、氨萘非特(amonafide)、白龙替康(belotecan)、喜树碱(camptothecin)、10-羟基喜树碱(10-hydroxycamptothecin)、9-氨基喜树碱(9-aminocamptothecin)、达佛莫替康(diflomotecan)、盐酸伊立替康(Camptosar)、edotecarin、表柔比星(Ellence)、表鬼臼毒吡喃葡糖苷(etoposide)、依沙替康(exatecan)、基哌替康(gimatecan)、勒托替康(lurtotecan)、米托蒽醌(mitoxantrone)、吡柔比星(pirarubicin)、皮可特酮(pixantrone)、卢比替康(rubitecan)、索布佐生(sobuzoxane)、SN-38、泰鲁泼昔(tafluposide)、托泊替康(topotecan)及其组合。

优选的细胞毒拓扑异构酶抑制剂包括选自以下的一种或多种剂：喜树碱、10-羟基喜树碱、9-氨基喜树碱、盐酸伊立替康(Camptosar)、艾替卡辛(edotecarin)、表柔比星(Ellence)、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、SN-38、托泊替康及其组合。

免疫剂包括干扰素和大量其它免疫增强剂。干扰素包括干扰素α、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素β、干扰素γ-1a、干扰素γ-1b(Actimmune)或干扰素γ-n1及其组合。其它剂包括非格司亭(filgrastim)、香菇多糖(lentinan)、裂裥多糖(sizofilan)、TheraCys、乌苯美司(ubenimex)、WF-10、阿地白介素(aldesleukin)、阿仑单抗(alemtuzumab)、BAM-002、达卡巴嗪(dacarbazine)、达珠单抗(daclizumab)、地尼白介素(denileukin)、吉姆单抗(gemtuzumab)奥佐米星(ozogamicin)、伊莫单抗(ibritumomab)、咪喹莫特(imiquimod)、来格司亭(lenograstim)、香菇多糖(lentinan)、黑瘤疫苗(melanoma vaccine)(Corixa)、莫拉司亭(molgramostim)、OncoVAX-CL、沙格司亭(sargramostim)、他索纳明(tasonermin)、泰克白介素(tecleukin)、司哌拉辛(thymalasin)、托西莫单抗(tositumomab)、维如利金(Virulizin)、Z-100、依帕珠单抗(epratuzumab)、米妥莫单抗(mitumomab)、奥雷瑞(oregovomab)、派图莫(pemtumomab)(Y-muHMFG1)、普拉维格(Provenge)(Dendreon)及其组合。

生物应答修饰剂是修饰活体防御机制或生物应答(例如存活、生长或组织细胞分化)使得它们具有抗肿瘤活性的剂。这类剂包括云芝多糖(krestin)、香菇多糖(lentinan)、西佐喃(sizofiran)、溶链菌(picibanil)、乌苯美司(ubenimex)及其组合。

其它抗癌剂包括阿利维A酸(alitretinoin)、聚肌胞(ampligen)、阿曲生坦(atrasentan)贝沙罗汀(bexarotene)、硼替佐米(bortezomib)、伯森坦(Bosentan)、骨化三醇(calcitriol)、依昔舒林(exisulind)、非那雄胺(finasteride)、福莫司汀(fotemustine)、伊班膦酸(ibandronicacid)、米替福新(miltefosine)、米托蒽醌(mitoxantrone)、1-门冬酰胺酶、丙卡巴阱(procarbazine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、羟基脲(hydroxycarbamide)、培门冬酶(pegaspargase)、喷司他丁(pentostatin)、泰紫罗尼(tazarotne)、泰司特(Telcyta)(TLK-286，Telik Inc.)、万珂(Velcade)(bortemazib，Millenium)、维甲酸(tretinoin)及其组合。

其它抗血管生成化合物包括阿西曲丁(acitretin)、芬维A胺(fenretinide)、沙利度胺(thalidomide)、唑来膦酸(zoledronic acid)、制管张素(angiostatin)、脱氢膜海鞘素B(aplidine)、昔冷特(cilengtide)、考布他汀A-4(combretastatin A-4)、内皮抑制素(endostatin)、卤夫酮(halofuginone)、雷必玛特(rebimastat)、雷莫氟(removab)、来那度胺(Revlimid)、角鲨胺(squalamine)、乌克兰(ukrain)、单抗LM609(Vitaxin)及其组合。

与铂配合的化合物包括但不限于顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂及其组合。

喜树碱衍生物包括但不限于喜树碱、10-羟基喜树碱、9-氨基喜树碱、伊立替康、SN-38、艾替卡辛(edotecarin)、托泊替康及其组合。

其它抗肿瘤剂包括米托蒽醌、1-门冬酰胺酶、丙卡巴阱、达卡巴嗪、羟基脲、喷司他丁、维甲酸及其组合。

能够增强抗肿瘤免疫应答的抗肿瘤剂如CTLA4(细胞毒性淋巴细胞抗原4)和能够阻断CTLA4的其它剂也可被利用，例如MDX-010(Medarex)和美国专利No.6,682,736中公开的CTLA4化合物；和抗增殖剂如其它法呢基蛋白转移酶抑制剂，例如法呢基蛋白转移酶抑制剂。另外，可用于本发明的特定CTLA4抗体包括描述于美国临时申请60/113,647(1998年十二月23日提交)、美国专利No.6,682,736中的那些，所述两个资料均通过引用整体并入本文。

可用于本发明的特定IGF1R抗体包括描述于国际专利申请No.WO2002/053596中的那些，其通过引用整体并入本文。

可用于本发明的特定CD40抗体包括描述于国际专利申请No.WO2003/040170中的那些，其通过引用整体并入本文。

基因治疗剂也可用作抗肿瘤剂，例如TNFerade(GeneVec)，其响应放射性治疗而表达TNFα。

在本发明的一个实施方案中，他汀类(statins)可与本文所述的P-钙黏着蛋白抗体或其抗体结合部分及其药物组合物组合使用。他汀类(HMG-CoA还原酶抑制剂)可以选自阿托伐他汀(Atorvastatin，Lipitor，Pfizer Inc.)、普法他汀(Provastatin，Pravachol，Bristol-Myers Squibb)、洛伐他汀(Lovastatin，Mevacor，Merck Inc.)、辛伐他汀(Simvastatin，Zocor，Merck Inc.)、氟伐他汀(Fluvastatin，Lescol，Novartis)、薛利伐史达汀(Cerivastatin，Baycol，Bayer)、瑞舒伐他汀(Rosuvastatin，Crestor，AstraZeneca)、洛伐他汀(Lovostatin)和烟碱酸(Niacin，Advicor，KosPharmaceuticals)其衍生物或其组合。

在优选的实施方案中，他汀类选自阿托伐他汀和洛伐他汀、其衍生物或其组合。

适用于抗肿瘤剂的其它剂包括苯磺酸氨氯地平/阿伐他汀钙(Caduet)。

就治疗本文所述的高增生性疾病或异常细胞生长的任何方法而言(所述方法使用P-钙黏着蛋白抗体或抗原结合部分与至少一种额外的治疗剂的组合)，P-钙黏着蛋白抗体可以与额外的治疗剂缀合，或衍生化。所述至少一种额外的治疗剂也可以单独地施用，或以非衍生化的或非缀合的方式施用。当所述至少一种额外的治疗剂不是经衍生化的或与抗体缀合，其可以在与抗体相同的药物配方中施用，或其可以在单独的配方中施用。

基因疗法

编码本发明抗体和抗体部分的核酸分子可以通过基因疗法施用给需要的患者。该疗法可以是体内的或离体的。在优选的实施方案中，编码重链和轻链二者的核酸分子被施用给患者。在更优选的实施方案中，核酸分子被施用，使得它们被稳定的整合进B细胞的染色体中，因为这些细胞是专门用于生产抗体的。在优选的实施方案中，转染或离体感染前体B细胞，并再移植进需要的患者中。在另一实施方案中，使用已知感染目的细胞类型的病毒体内感染前体B细胞或其它细胞。用于基因疗法的典型载体包括脂质体、质粒和病毒载体。示范性的病毒载体是逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒。体内或离体感染后，通过从被治疗的患者中采样并使用本领域已知的或本文所述的任何免疫测定法监控抗体表达水平。

在优选的实施方案中，基因治疗方法包含步骤：施用编码P-钙黏着蛋白抗体重链或其抗原结合部分的、经分离的核酸分子，和表达所述核酸分子。在另一实施方案中，基因治疗方法包含步骤：施用编码P-钙黏着蛋白抗体轻链或其抗原结合部分的、经分离的核酸分子，和表达所述核酸分子。在更优选的实施方案中，基因治疗方法包含步骤：施用编码P-钙黏着蛋白抗体重链或其抗原结合部分的、经分离的核酸分子和编码P-钙黏着蛋白抗体轻链或其抗原结合部分的、经分离的核酸分子，和表达所述核酸分子。基因治疗方法还可包含施用另一治疗剂(例如先前所述的与组合疗法相关的任何剂)的步骤。

为了使本发明更好地被理解，公开以下实施例。这些实施例仅用于阐述的目的而不应理解为以任何方式限制本发明的范围。

实施例

在以下的实施例和制剂中，“BSA″是指牛血清白蛋白；“EDTA”是指乙二胺四乙酸；“DMSO”是指二甲基亚砜；“MOPS”是指3-(N-吗啉代)丙磺酸；“MES”是指2-(N-吗啉代)甲磺酸；“PBS”是指磷酸盐缓冲的盐水；“dPBS”是指Dulbecco’s磷酸盐缓冲的盐水；“HEMA”是指2-羟基-乙基异丁烯酸；“DMEM”是指Dulbecco’s改良的小鹰培养基(eagle’s medium)；“FBS”是指胎牛血清；“NEAA”是指非必需的氨基酸；“HEPES”是指N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸；“DMF”是指二甲基甲酰胺。

实施例1：筛选scFv噬菌体展示文库

重组的人P-钙黏着蛋白(R&D Systems 861-PC-100)被用作抗原以筛选scFv噬菌体展示文库。克隆进噬菌粒载体中的大scFv人抗体文库被用于选择(Vaughan，T.J.et al.，Nat.Biotech.14：309-314(1996))。识别P-钙黏着蛋白的scFv在对重组人P-钙黏着蛋白和表达P-钙黏着蛋白的HCT116细胞融合单细胞层所采取的一系列重复选择循环中从噬菌体展示文库中被分离。简言之，与文库孵育之后，从P-钙黏着蛋白回收结合的噬菌体，未结合的噬菌体被洗掉。然后如Vaughan，T.J.et al.，Nat.Biotech.14：309-314(1996)中所述复苏结合的噬菌体，并重复选择过程。来自选择周期输出的代表性比例的克隆进行噬菌体酶联免疫吸附测定法(ELISA)以检测对P-钙黏着蛋白的结合，基本上如Vaughan，T.J.et al.，Nat.Biotech.14：309-314(1996)中所述。ELISA中使用两个不同的抗原：重组的人P-钙黏着蛋白(R&D Systems)和表达P-钙黏着蛋白的A431细胞的融合单细胞层。对ELISA-阳性克隆进行如Vaughan，T.J.et al.，Nat.Biotech.14：309-314(1996)和Osbourn，J.K.et al.，Immunotechnology 3：293-302(1998)中所述的DNA测序。独特的ELISA-阳性克隆被转化为完整IgG分子并检测它们在实施例4中描述的P-钙黏着蛋白依赖性粘附测定法中中和P-钙黏着蛋白的能力。根据该筛选的结果，抗体129-1c4(在A431粘附测定法中IC50为1-3μM)被选择为先导亲本谱系用于进一步的优化。

实施例2：先导物优化

通过寡核苷酸指导诱变抗体可变重链(V_H)和可变轻链(V_L)CD3区构建来自129-1c4的噬菌体展示文库。使用如Clackson and Lowman，Phage Display-A Practical Approach(Oxford University Press 2004)中所述的标准分子生物学技术构建该文库。由此进行基于亲和力的选择；与文库孵育后，重组人P-钙黏着蛋白(R&D Systems)被G蛋白包被的顺磁珠(Dynal 100.03)捕获，结合的噬菌体通过磁分离被回收，同时未结合的复合物被洗掉。重复选择过程，选择时存在的重组人P-钙黏着蛋白浓度递减(4轮中25nM到10pM)。另外，来自V_H CDR3和V_L CDR3文库的选择输出被重组进另一噬菌体展示文库，并在另外两轮基于亲和力的选择中被选择。来自选择周期输出的代表性比例的克隆进行筛选，如实施例8中所述129-1c4表位竞争测定法中的scFv。

实施例3：P-钙黏着蛋白依赖性的粘附测定法

使用以下的方案在P-钙黏着蛋白依赖性的粘附测定法中使用若干个经最佳化的scFv测定IC₅₀值，所述经最佳化的scFv在如实施例2中上述的抗体回收最佳化阶段中被转化为IgG。这些抗体的平均测量IC₅₀值显示在下表4中。

使用前24小时时，用2mM CaCl₂的MilliQ水溶液将重组人P-钙黏着蛋白Fc(R&D Cat.861-PC)重建为1mg/mL的浓度并储存于4℃。如下培养并制备A431细胞。常规地，将A431细胞(ECACC No.85090402)在最小必需培养基(MEM)(Invitrogen Cat 31095)中培养于Nunc三元烧瓶(3×175cm²面积)中，所述最小必需培养基含有10％胎牛血清(Invitrogen Cat.10100-147)和1％的非必需氨基酸(Invitrogen Cat.11140-035)。在收集用于测定时，经培养的细胞约80％融合。为了防止可能的传代相关小鹰，常规地使用第4代和第8代之间、在培养48或72小时后收集的细胞。用0.25％胰蛋白酶/1mM EDTA(Gibco Cat 25200-056)经恰好足够细胞分离的时间(7-10分钟)收集A431细胞，然后立刻在组织培养培养基中稀释为约2×10⁶细胞/mL的密度。然后将A431细胞离心(1200rpm)、重悬进测定缓冲液中(Hanks平衡盐溶液(不含Mg²⁺和Ca²⁺，不含酚磺酞)(Invitrogen Cat.14175-053)，补充为1mM的终CaCl₂终浓度)、再离心并再次以2×10⁶细胞/mL的终浓度再重悬进测定缓冲液中。

如下进行IgG系列稀释液的制备和与A431细胞的预孵育。180μL的每种检测IgG或其部分被补充以20μL含10％BSA(Sigma Cat.A-9576)的测定缓冲液，将BSA浓度标准化为1％。最初将抗鼠/人P-钙黏着蛋白参考多克隆抗体(R&D Cat.AF-761)重悬进MilliQ水中得到1mg/mL的储液。然后将40μL该储存液进一步稀释进140μL测定缓冲液中。然后加入20μL含10％BSA的测定缓冲液，得到200μL溶液(0.2mg/mL抗体和0.1％BSA)。通过首先向Greiner 96孔聚丙烯稀释板(Greiner Cat.780271)的第一列添加2×90μL的AF-761多克隆抗体或检测IgG来制备双份系列稀释。然后向第2-11列加入60μL测定缓冲液。然后在平板上从左到右从第1-11列制备30μL到60μL(1∶3)的稀释。然后向孔12A-D中单独加入60μL测定缓冲液以定义最大粘附。通过向孔12E-H中添加60μL的25mM EDTA(测定缓冲液中)来定义最小粘附。然后向所有孔中加入60μL的A431细胞悬浮液(测定缓冲液中2×10⁶细胞/mL——如上文下划线的制备)，搅动后将平板在37℃预孵育1小时。

制备测试IgG系列稀释和与A431细胞预孵育的同时，如下制备P-钙黏着蛋白包被的测定平板。将重组人P-钙黏着蛋白Fc在包被缓冲液(不含Mg²⁺和Ca²⁺的PBS-Invitrogen Cat.14190-094)中稀释至10μg/mL的浓度并分散在Fluoronunc 96(Nunc Cat.437958)孔测定平板(100μL/孔)上。然后将平板在室温下孵育1到30分钟。然后使用Tecan 96平板洗涤器用PBS洗涤平板3次。然后加入200μL/孔的测定缓冲液用于封闭，并将平板在室温下孵育额外的1小时。然后如前所述将平板用PBS洗涤3次。

然后将100μL/孔经预孵育的IgG/A431材料从Greiner 96孔稀释平板转移至P-钙黏着蛋白包被的测定平板中。转移时通过吸打混合IgG/A431材料，以保证细胞是均相的。然后通过将测定板在37℃孵育30-45分钟允许粘附过程发生。孵育结束时，通过将培养基从平板中轻柔抽吸去除未粘附的细胞，并用细胞洗涤缓冲液(补充至1mM CaCl₂终浓度的Hanks平衡盐溶液(不含Mg²⁺和Ca²⁺并且不含酚磺酞-Invitrogen Cat.14175-053)再充填孔。然后将平板倒置于细胞洗涤缓冲液浴中15分钟以去除残留的未粘附细胞。该孵育结束时，轻柔抽吸孔的内含物。

如下进行粘附细胞的定量。通过添加100μL/孔的组合溶解/碱性磷酸酶检测试剂(用水1∶5稀释的二乙醇胺底物缓冲液5X浓缩物(Pierce Cat.34064)，之后每25mL的1X溶液中溶解一个15mg的PNPP药片(SigmaCat.N-2640))然后再37℃孵育30-60分钟来检测粘附细胞。然后通过添加1M NaOH(50μL/孔)终止反应，以得到不存在抑制时约0.8的最大OD值。然后使用标准平板读数器测量405nm处的吸光度。

然后如下分析结果。第12列、孔A-D作为100％粘附，第12列、孔E-H作为0％粘附，如下将原始数据首先转化为％粘附值：

％粘附＝{(粘附值-最小粘附值)/(最大粘附-最小粘附)}*100

然后使用Prism软件计算％粘附比IgG抑制剂浓度，测定IC₅₀值。当观察到部分抑制时，IC₅₀引用为与曲线中点相比产生真实的50％抑制的IgG浓度。IC₅₀值报告于表4中。

表4

IgG	A431粘附测定平均IC50(nM)(n＝3)
		194-e06	0.162
194-a02	0.217
		194-b09	0.229
195-e11	0.114
		194-g09	0.158
196-h02	0.148
		194-e01	0.147
196-d10	0.080
		196-g03	0.149
196-e06	0.117
		195-a09	0.114
198-a09	0.097
		200-h06	0.168

进行两个独立的A431粘附测定，与其未种系化的等价物相比，研究若干个来自129-1c4谱系的经种系化、最优化的IgG。就这些实验而言，必须改变为一批新的P-钙黏着蛋白(CFR-134041)，其显示和比其它数据轻微提高的IC₅₀值相关。来自这两个实验的针对若干个经种系化的IgG的平均数据显示于表5中。如前所述，g-194-b09是指194-b09的经种系化版本，等等。

表5

IgG	A431粘附测定平均IC50(nM)(n＝2)
		g-194-b09	0.77

194-b09	2.10
		g-194-g09	1.00
194-g09	0.73
		g-196-g03	1.05
196-g03	0.39
		g-194-e06	0.77
194-e06	0.46
		g-195-e11	0.87
195-e11	0.97
		g-200-h06	1.31
200-h06	0.63

实施例4：P-钙黏着蛋白依赖性的细胞聚集测定法

使用以下方案用于在P-钙黏着蛋白依赖性的聚集测定法中测定IC₅₀值，所述方法使用若干在如上文实施例2所述的抗体回收最佳化阶段中被转化为IgG的经最佳化的scFv。因为置于悬液生长中时，过表达P-钙黏着蛋白的细胞系形成紧密的多细胞聚集体，因此细胞聚集可以在影响细胞聚集的P-钙黏着蛋白抗体存在时被测量。若干抗体的平均测量IC₅₀显示于下表6中。

如下制备平板。每个96孔测定板用50μL多聚HEMA(12mg/mL溶于90％乙醇、10％甲醇中)包被，然后蒸发6小时过夜，之后在使用前用3×100μL无菌H2O洗涤。然后如下培养细胞。来自人细胞系SW480(稳定表达P-钙黏着蛋白G418^r)的细胞在完全生长培养基(qs DMEM(inVitrogen 11995-065)、10％FBS(Omega Scientific FB-02)、1∶100NEAA(InVitrogen 11140-050)、1∶100丙酮酸钠(InVitrogen 11360-070)、1∶100谷氨酰胺(InVitrogen 25030-051)、1∶100青霉素/链球菌溶血素(InVitrogen 15070-063)、1∶100、遗传霉素50mg/mL(Invitrogen 10131-035))+G418(500μg/mL)中传代，然后1∶3-4每周分传两次。然后将培养物冷冻于生长培养基+10％DMSO中。

第1天以5×10⁶细胞/100mm平皿、不大于1∶3的稀释度接种SW480∶pCAD细胞和对照SW480∶pCLNX(稳定的对照载体)。细胞然后在培养基中生长48小时。每个100mm平皿提供约10×10⁶的或足够2×96孔板的细胞。

第3天，去除培养基后用dPBS(Dulbecco’s PBS(InVitrogen 14040-133))洗涤，之后在3mL/100mm平皿中使细胞受胰蛋白酶作用。用两体积(6mL)完全生长培养基释放后进行中和。然后使用10mL的吸量管将平板洗涤三次以破坏聚簇。然后计数细胞并使用Beckman离心机在1000rpm 5分钟获得沉淀。吸去培养基，通过手指涡旋随后p1000吸量管吸打将沉淀首先重悬于＜1mL的完全生长培养基中，然后将细胞浓度标准化至1.3M/mL。通过显微镜确保单个细胞分散。

然后通过用dPBS和5％PBS封闭96孔板30分钟来制备试剂平板。然后用1×100μL dPBS洗涤平板，随后抽吸并轻弹至干燥。使用4x[IgG]浓度，用dPBS制备测试IgG的稀释系列，其足够96孔中一个孔中处理板的3个孔。30μL/孔中的40000个细胞被等分至96孔的、经洗涤的、多聚HEMA包被的Costar3590非组织培养平板(Coming 3590)中。然后向96孔板的每个孔转移10μL试剂。使用8通道吸量管进行每处理三份样品。然后在250rpm摇动下在潮湿的37℃、5％CO₂培养箱中培养过夜(16-18小时)。

第4天，将40μL经摇动的细胞转移至聚赖氨酸包被的96孔板(BioCoat聚赖氨酸包被的96孔板：BD 356516)。然后用60L完全生长培养基冲洗孔，通过敲打摇动平板，并转移至涂布有聚赖氨酸的平板。需要时进行额外的50L洗涤。随后在潮湿的37℃，5％CO₂培养箱中孵育60分钟。在该步骤小心地在数量上转移所有的细胞，尽可能轻柔，不要过度吸打。然后通过在通风橱中添加100μL固定液(7.4％甲醛(37％wt/vol.-Sigma F15587))，之后在室温下孵育＞30分钟来固定细胞。

为了洗涤细胞，随后将液体倾析进收集杯中或碟中并轻弹以去除残余液体，轻柔地倒在纸巾上。然后添加100μL每孔的dPBS以洗涤，随后孵育15分钟。然后通过如上倾析并使用100μL Hoescht(dPBS中1g/mLHoescht-Hoescht 10mg/mL Molecular Probes 33342)，随后孵育30分钟将细胞染色。然后洗涤细胞两次，孔中剩余100μL dPBS用于显微镜检查。

然后测量每孔中聚集的物体数量(Cellomics)，将平均物体计数(测试IgG)与IgG(例如Gt-抗-P-钙黏着蛋白R&D Systems AF761)的或只有培养基的对照相比。然后计算物体计数比IgG抑制剂的浓度，并测定IC₅₀值。本发明若干抗体的IC₅₀值报告于表6中。

表6

IgG	SW480聚集测定平均IC50(nM))
		194-e06	0.7
194-a02	1.1
		g-194-b09	0.9
g-195-e11	2.2
		g-194-g09	2.6
196-h02	3.2
		194-e01	1.3
196-d10	1.5
		g-196-g03	0.9
196-e06	1.9
		195-a09	1.7
198-a09	2.9
		g-200-h06	4.7
129-1c4	35

实施例5：P-钙黏着蛋白依赖性的球形体破坏测定法

以下的球形体破坏测定法是聚集测定法(描述于实施例4)的变体，其中在添加P-钙黏着蛋白和对照抗体之前过夜形成细胞聚集体。然后在分析前额外的24小时加入测试试剂。

如下制备平板。每个96孔测定板用50μL多聚HEMA(90％乙醇、10％甲醇中12mg/mL)包被，然后蒸发6小时过夜，之后在使用前用3×100μL无菌H₂O洗涤。然后如下培养细胞。来自人细胞系SW480(稳定表达P-钙黏着蛋白G418^r)的细胞在完全生长培养基(qs DMEM(inVitrogen 11995-065)、10％FBS(Omega Scientific FB-02)、1∶100NEAA(InVitrogen 11140-050)、1∶100丙酮酸钠(InVitrogen 11360-070)、1∶100谷氨酰胺(InVitrogen 25030-051)、1∶100青霉素/链球菌溶血素(InVitrogen 15070-063)、1∶100、遗传霉素50mg/mL(Invitrogen 10131-035))+G418(500μg/mL)中传代，然后1∶3-4每周分传两次。然后将培养物冷冻于生长培养基+10％DMSO中。

第1天以5×10⁶细胞/100mm平皿、不大于1∶3的稀释度接种SW480∶pCAD细胞和对照SW480∶pCLNX(稳定的对照载体)。细胞然后在培养基中生长48小时。每个100mm平皿提供约10×10⁶的或足够2×96孔板的细胞。

第3天，去除培养基后用dPBS(Dulbecco’s PBS(InVitrogen 14040-133))洗涤，之后在3mL/100mm平皿中使细胞受胰蛋白酶作用。用两体积(6mL)完全生长培养基释放后进行中和。然后使用10mL的吸量管将平板洗涤三次以破坏聚簇。然后计数细胞并使用Beckman离心机在1000rpm 5分钟获得沉淀。吸去培养基，通过手指涡旋随后p1000吸量管吸打将沉淀首先重悬于＜1mL的完全生长培养基中，然后将细胞浓度标准化至1.0×10⁶/mL。通过显微镜确保单个细胞分散。

40μL/孔中的40000个细胞被等分至96孔的、经洗涤的、多聚HEMA包被的Costar3590非组织培养平板(Coming 3590)中。然后在250rpm摇动下在潮湿的37℃、5％CO₂培养箱中培养过夜(16-18小时)。

第4天，通过用dPBS和5％PBS封闭96孔板30分钟来制备试剂平板。然后用1×100μL dPBS洗涤平板，随后抽吸并轻弹至干燥。使用5x[IgG]浓度，用dPBS制备测试IgG的稀释系列，其足够96孔中一个孔中处理板的3个孔。使用8通道吸量管进行每处理三份样品。然后在250rpm摇动下在潮湿的37℃、5％CO₂培养箱中培养(20-24小时)。

第5天，将50μL经摇动的细胞转移至聚赖氨酸包被的96孔板(BioCoat聚赖氨酸包被的96孔板：BD 356516)。然后用50μL完全生长培养基冲洗孔，通过敲打摇动平板，并转移至涂布有聚赖氨酸的平板。需要时进行额外的50μL洗涤。随后在潮湿的37℃，5％CO₂培养箱中孵育60分钟。在该步骤小心地在数量上转移所有的细胞，尽可能轻柔，不要过度吸打。然后通过在通风橱中添加100μL固定液(7.4％甲醛(37％wt/vol.-Sigma F15587))，之后在室温下孵育＞30分钟来固定细胞。

为了洗涤细胞，随后将液体倾析进收集杯中或碟中并轻弹以去除残余液体，轻柔地倒在纸巾上。然后添加100μL每孔的dPBS以洗涤，随后孵育15分钟。然后通过如上倾析并使用100μL Hoescht(dPBS中1g/mLHoescht-Hoescht 10mg/mL Molecular Probes 33342)，随后孵育30分钟将细胞染色。然后洗涤细胞两次，孔中剩余100μL dPBS用于显微镜检查。然后测量每孔中聚集的物体数量(Cellomics)，将平均物体计数(测试IgG)与IgG(例如Gt-抗-P-钙黏着蛋白R&D Systems AF761)的或只有培养基的对照相比。然后计算物体计数比IgG抑制剂的浓度以测定IC₅₀值。或者，物体计数被表达为在表7所示的一个确定的浓度下与对照相比的破坏倍数。

表7

IgG	SW480球形体破坏测定法5nM处与对照相比提高的破坏倍数
		194-e06	10
194-a02	10
		g-194-b09	10
g-195-e11	7
		g-194-g09	14
196-h02	10
		194-e01	16
196-d10	10
		g-196-g03	13
196-e06	10
		195-a09	10
198-a09	13
		g-200-h06	7
129-1c4	4

实施例6：测量P-钙黏着蛋白抗体的K _D 和k _off

如下使用制造商的方案，使用BIACORE^TM3000设备通过表面等离振子共振进行P-钙黏着蛋白scFv单链抗体的亲和力测量(K_D和k_off)。

为了进行动力学分析，使用常规的胺偶合将重组的人P-钙黏着蛋白/Fc融合蛋白(hCad/Fc)和小鼠P-钙黏着蛋白/Fc融合蛋白(mCad/Fc)固定在CM5BIACORE^TM传感器芯片的分离流动单元上。使用含有2.0mM CaCl₂的10mM乙酸盐缓冲液pH4.5作为固定缓冲液制备表面，并达到hCad/Fc和mCad/Fc融合蛋白分别为5800和1600RU的蛋白质密度。使用1M盐酸乙醇胺，pH8.5进行未反应N-羟基琥珀酰亚胺酯的失活。使用激活的/灭活的空白表面作为对照表面。在电泳缓冲液中制备浓度从200nM到0.78nM(包括作为零参考的、只包含电泳缓冲液的0nM溶液)的scFv抗体样品。将样品随机化，并使用HBS-P(10mM HEPES pH7.4，150mMNaCl，0.005％Surfactant P20)一式三份穿过流动单元注射1分钟，使用2.0mM CaCl₂作为电泳缓冲液。使用25μL/分钟的流速测定亲和常数。抗体离解被检测5分钟，表面通过12秒注射10mM甘氨酸-HCl pH1.5(25μL/min)来再生。原始数据使用Scrubber(

BioLogic Software)软件包加工，使用CLAMP(

BioLogic Software)软件包分析。数据整体上符合1∶1的Langmuir结合模型。

表8列出本发明单链抗P-钙黏着蛋白抗体的亲和常数：

表8

scFv	hCad/FcKD(nM)	hCad/Fckoff(1/s)	mCad/FcKD(nM)	mCad/Fckoff(1/s)
					194-b09	4.0	1.9×10-03	11	3.6×10-3
194-g09	2.6	1.6×10-03	1.8	8.1×10-4
					196-g03	1.1	7.0×10-04	0.76	4.7×10-4

实施例7：测定P-钙黏着蛋白抗体的选择性

使用以下方案测定多种抗体对P-钙黏着蛋白超出E-钙黏着蛋白的选择性。

将重组人P-钙黏着蛋白(R&D Systems 861-PC-100)和重组人E-钙黏着蛋白(R&D Systems 648-EC-100)以1μg/mL在PBS+0.5mM CaCl₂中涂布于Exiqon蛋白质固定平板(VWR International)的孔上。在从50nM(7.5μg/mL)滴定至0.64nM(0.096μg/mL)前将样品IgG在3％Marvel/PBS+0.5mM CaCl₂中封闭1小时，双份加入用两种不同抗原包被的孔中。在4℃过夜平衡后，将平板用1x PBS/0.1％Tween+0.5mM CaCl₂洗涤三次，随后用1x PBS+0.5mM CaCl₂洗涤三次。然后向每个孔中加入50μL1∶5000稀释于3％Marvel/PBS+0.5mM CaCl₂中的抗人Fab过氧化物酶缀合物，使其在室温下平衡1小时。将平板用1x PBS/0.1％Tween+0.5mM CaCl₂洗涤三次，用1x PBS+0.5mM CaCl₂洗涤三次。向每个孔中加入50μl 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB；Sigma)，允许反应进行20分钟，之后通过加入25μL/well 0.5M H₂SO₄终止反应。在450nm处读吸光度数值后，使用Graphpad Prism软件分析数据以计算每个抗体结合P-钙黏着蛋白和E-钙黏着蛋白的相对K_D值。得到的数据概括在表9中。

表9

IgG	P-钙黏着蛋白KD(pM)	E-钙黏着蛋白KD(pM)	KD(E)/KD/(P)
				194-a02	116	682	6
g-194-b09	788	2156	3
				g-194-g09	2602	不结合	＞100
194-e01	112	20511	183
				g-194-e06	191	794	4
195-a09	120	11516	96
				194-e06	56	264	5
196-d10	45	63	1.4
				196-e06	62	187	3
g-196-g03	449	7513	17
				196-h02	102	33212	326
198-a09	78	19396	249

实施例8：表位竞争测定法

使用以下的方案在表位竞争测定法中测量IC₅₀值以测量亲本谱系中变体scFv用亲本IgG代替A431细胞表面上天然P-钙黏着蛋白的能力。用铕链霉亲和素(europium streptavidin)和DELFIA定量来检测存在抑制性scFv时结合的、经生物素化的亲本IgG的数量。若干scFv的经测量的IC₅₀值显示在表10中。

使用前一天，将根据标准方法培养的、随后在约80％融合时收集的A431细胞(ECACC No.85090402)以2.5×10⁴细胞每孔接种在96孔BecktonDickenson(BD Cat.6407)胶原包被的平板上。然后通过浸入PBS缓冲液(Gibco Cat.14190-094，不含钙、镁和碳酸氢钠)容器中，之后添加200μL每孔的封闭缓冲液(PBS Gibco Cat.14190-094，加3％Marvel(PremierInternational Foods Ltd.))并在室温下孵育2小时。然后将平板用如上的PBS洗涤3次。

对高通量筛选和IC₅₀绘图而言，首先在Greiner稀释平板(Greiner 96孔聚丙烯平板(Greiner Cat.780271))中60μL总体积的测定缓冲液中制备scFv/IgG材料。然后将50μL从被控的Greiner平板直接转移至测定平板，允许结合反应在室温下进行2小时30分钟。结合反应结束时，将平板在PBS中洗涤三次，之后添加铕标记的链霉亲和素(Perkin Elmer Cat.1244-360，1∶1000稀释于DELFIA测定缓冲液(Perkin Elmer Cat.4002-0010)中)，在室温下再孵育1小时。

然后通过重复地将平板浸入缓冲液容器中，用DELFIA洗涤缓冲液(Perkin Elmer Cat.4010-0010)洗涤平板7次。最后，添加DELFIA增强因子(Perkin Elmer Cat.4001-0010-100μL/孔)后，使用标准DELFIA方案在适合的读数器(例如Wallac或Envision)上读数平板。

Greiner稀释平板装配-HTS

高通量筛选(HTS)条件根据最佳化的阶段而不同地设置。对来自个体V_H和V_L链最佳化的输出HTS而言，最终[peri-prep]被设定为12.5％，使得亲本scFv给出部分抑制。对来自V_H:V_L重组文库输出的后期HTS而言，最终peri-prep浓度降至1.7％，在这些条件下经V_H优化的基准scFv(TOP-108-C01)给出部分抑制。最优化peri-prep浓度使得相关的基准scFv产生部分抑制，这建立了一个鉴定经改良克隆的窗口。

为了达到这些最终scFv peri-prep浓度，采取以下步骤：

i)使用Cybiwell设备，将所需体积(见下文)的peri-prep样品材料从深孔样品平板中转移至Greiner稀释平板的第1-11列。

[最终peri-prep]           转移体积

[12.5％]          ＝      7.5uL

[1.7％]           ＝      10.0uL(的1∶10稀释的peri-prep)

(通过将10μL纯peri-prep从样品平板转移进含90L测定缓冲液的Greiner稀释平板(使用Cybiwell)来制备1∶10预稀释的peri-prep)

ii)然后通过添加合适体积的测定缓冲液将第1-11列的体积补足30μL。

iii)然后向第12列(A-D)(完全结合孔)中添加30μL测定缓冲液。

iv)向第12列(E-H)添加30μL测定缓冲液中过量的未标记的亲本IgG(129-1c4)以定义非特异性的结合。以1000nM的浓度添加以得到500nM的终浓度。

v)使用水溶性试剂EZ-link-NHS-LC-Biotin(Perbio/Pierce product no.21336)生物素化129-1c4 IgG。通过添加1/10体积的1M NaHCO₃和1/10体积的二甲基酰胺补充IgG溶液。将EZ-link-NHS-LC-Biotin试剂溶解在DMF中，然后以超出IgG五倍的摩尔数添加，允许反应在室温下进行20分钟。然后通过添加BSA(0.1％)来稳定经生物素化的IgG。然后向所有孔中添加30μL的、测定缓冲液中的、经生物素化的亲本129-1c4 IgG，得到最终60μL体积中1.5nM的终浓度(即以2x终浓度添加铕标记的IgG)。

vi)通过搅动混合Greiner平板内含物后，将50μL直接转移至测定平板，允许结合反应在室温下进行2小时30分钟(如前文所述)。

Greiner稀释平板装配-IC₅₀绘图

i)将30μL/孔测定缓冲液添加至标准Greiner稀释平板的第2-11列和孔12A到12D。

ii)将30μL的、测定缓冲液中的、过量的未标记的129-1c4亲本IgG添加至第12列(E-H)中以定义非特异性结合。这应当以1000nM浓度添加以得到500nM的终浓度。

iii)向第1列中加入2×45μL每种未稀释的scFv His-prep，使得每个96孔测定平板能够进行4个双份11点IC₅₀滴定。然后通过从第1列取出15μL与第2列混合、之后从第2列取出15μL混合进第3列等等，进行1∶3的双份系列稀释。混合进第11列后，去除15μL(即剩余30μL的终体积)。

iv)然后向所有孔中加入30μL的、测定缓冲液中的、经生物素化的129-1c4亲本IgG，得到最终60μL体积中1.5nM的终浓度(即以2x终浓度添加铕标记的IgG)。

v)通过搅动混合Greiner平板内含物后，将50μL直接转移至测定平板，如前文所述允许结合反应在室温下进行2小时30分钟。

对HTS而言，scFv在96孔板中被表达为来自含MOPS/EDTA/Sorbitol pH7.4(MES pH7.4)的基础缓冲液中的细菌周质膜(scFv peri-prep)的粗提物。就IC₅₀绘图而言，使用基础缓冲液中用于亲和纯化的scFv His-tag(scFv His-prep)PBS将scFv表达较低通量的经纯化的形式。

对HTS和IC₅₀分析二者而言，原始数据首先根据以下等式转化为％结合数据：

％结合＝{(结合值-非特异结合)/(总结合-非特异结合)}*100

然后使用标准Excel模板进一步分析HTS数据，以鉴定与相关基准scFv相比给出更大抑制(更低％结合)的提示。对IC₅₀分析而言，使用Prism 4.0版曲线拟合软件分析％结合数据。ScFv是129-1c4亲本IgG的变体，其中V_H和V_L CDR3区被随机突变，如实施例2中所述。V_H CDR3变体序列在图1中显示为SEQ ID NOs：91到256。V_LCDR3变体序列在图1中显示为SEQ ID NOs：257到319。显示超出亲本129-1c4IgG的经改进的结合的若干scFv的IC₅₀值显示在表10中。129-1c4亲本的每种scFv变体通过两个序列SEQ ID NOs：V_H CDR3和V_L CDR3鉴定。作为参考，亲本129-1c4IgG的IC₅₀是108.3nM。

表10

SEQ ID NO：VH CDR3	SEQ ID NO：VL CDR3	IC50(nM)
			37	40	2.49
37	261	1.78
			37	43	5.67
37	274	8.73
			37	277	2.20
37	287	10.50

37	288	6.67
			37	295	0.80
37	297	2.49
			37	299	1.97
37	303	1.47
			37	304	1.10
37	305	2.19
			95	47	2.36
97	47	1.33
			113	47	2.06
125	47	0.26
			131	47	0.35
31	47	2.05
			147	47	1.16
165	47	5.11
			167	47	0.60
180	47	0.43
			181	47	2.46
27	47	0.54
			195	47	1.29
187	43	1.58
			27	296	1.16
163	43	2.45
			26	40	0.76
26	43	0.93
			27	309	1.36
199	310	2.54
			201	310	2.26
207	291	2.73

240

313

2.98

本说明书所列的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，好像每个单独的出版物或专利申请被明确地、单独地指出是通过引用并入本文一样。尽管已经就明确理解的目的通过阐述和举例比较详细地描述了前述发明，但是根据本发明的教导，本领域常规技术人员应当容易地明白：可以对其进行某些改变和变更，而不偏离所附带的权利要求书的思想或范围。

序列表

<110>辉瑞有限公司

<120>P-钙黏着蛋白抗体

<130>PC32778A

<160>347

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>117

<212>PRT

<213>人

<400>1

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Ser Trp Gly Thr Gly Thr Leu Trp Pro Trp Gly Gln Gly Lys Met

            100                 105                 110

Val Thr Val Ser Ser

        115

<210>2

<211>117

<212>PRT

<213>人

<400>2

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Ser Trp Gly Asp Gly Thr Leu Asn Pro Trp Gly Gln Gly Lys Met

            100                 105                 110

Val Thr Val Ser Ser

        115

<210>3

<211>117

<212>PRT

<213>人

<400>3

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Ser Trp Gly Leu Gly Ser Asn Glu Asn Trp Gly Gln Gly Thr Met

            100                 105                 110

Val Thr Val Ser Ser

        115

<210>4

<211>117

<212>PRT

<213>人

<400>4

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Asp Thr Asn Ser Ala Lys Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Met

            100                 105                 110

Val Thr Val Ser Ser

        115

<210>5

<211>117

<212>PRT

<213>人

<400>5

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Gly Thr Gly Tyr Pro Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Met

            100                 105                 110

Val Thr Val Ser Ser

        115

<210>6

<211>117

<212>PRT

<213>人

<400>6

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Gly Thr Ala Lys Pro Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Met

            100                 105                 110

Val Thr Val Ser Ser

        115

<210>7

<211>117

<212>PRT

<213>人

<400>7

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Gly Asn Glu Arg Pro Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Met

            100                 105                 110

Val Thr Val Ser Ser

        115

<210>8

<211>117

<212>PRT

<213>人

<400>8

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Gly Ser Arg Thr Val Gln Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Met

            100                 105                 110

Val Thr Val Ser Ser

        115

<210>9

<211>117

<212>PRT

<213>人

<400>9

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Thr Asn Ser Pro Gly Thr Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Met

            100                 105                 110

Val Thr Val Ser Ser

        115

<210>10

<211>117

<212>PRT

<213>人

<400>10

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Thr Ile Ala Pro Gly Arg Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Met

            100                 105                 110

Val Thr Val Ser Ser

        115

<210>11

<211>117

<212>PRT

<213>人

<400>11

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Gly Leu Asp Arg Val Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Met

            100                 105                 110

Val Thr Val Ser Ser

        115

<210>12

<211>117

<212>PRT

<213>人

<400>12

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Ser Trp Gly Gly Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Met

            100                 105                 110

Val Thr Val Ser Ser

        115

<210>13

<211>117

<212>PRT

<213>人

<400>13

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Trp Gly Gly Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Met

            100                 105                 110

Val Thr Val Ser Ser

        115

<210>14

<211>111

<212>PRT

<213>人

<400>14

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1               5                   10                  15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr

            20                  25                  30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

        35                  40                  45

Ile Leu Ser Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Ser Ile Ser Gly Leu

65                  70                  75                  80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Phe Thr Ser Gly

                85                  90                  95

Leu Pro Trp Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

            100                 105                 110

<210>15

<211>111

<212>PRT

<213>人

<400>15

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1               5                   10                  15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr

            20                  25                  30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

        35                  40                  45

Ile Leu Ser Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Ser Ile Ser Gly Leu

65                  70                  75                  80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Phe Thr Ser Gly

                85                  90                  95

Leu Pro Trp Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

            100                 105                 110

<210>16

<211>111

<212>PRT

<213>人

<400>16

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1               5                   10                  15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr

            20                  25                  30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

        35                  40                  45

Ile Leu Ser Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Ser Ile Ser Gly Leu

65                  70                  75                  80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Phe Thr Ser Gly

                85                  90                  95

Ile Val Phe Asn Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

            100                 105                 110

<210>17

<211>111

<212>PRT

<213>人

<400>17

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1               5                   10                  15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr

            20                  25                  30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Arg His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

        35                  40                  45

Ile Leu Ser Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Ser Ile Ser Gly Leu

65                  70                  75                  80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Met Gly

                85                  90                  95

Ser Thr Phe Met Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

            100                 105                 110

<210>18

<211>111

<212>PRT

<213>人

<400>18

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1               5                   10                  15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr

            20                  25                  30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

        35                  40                  45

Ile Leu Ser Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Ser Ile Ser Gly Leu

65                  70                  75                  80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Gly Tyr Tyr Cys Thr Ser Tyr Arg Ala Gly

                85                  90                  95

Ser Thr Phe Met Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

            100                 105                 110

<210>19

<211>111

<212>PRT

<213>人

<400>19

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Pro Pro Gly Gln

1               5                   10                  15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr

            20                  25                  30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

        35                  40                  45

Ile Leu Ser Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Ser Ile Ser Gly Leu

65                  70                  75                  80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ser Tyr Thr Met Gly

                85                  90                  95

Ser Thr Phe Met Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

            100                 105                 110

<210>20

<211>111

<212>PRT

<213>人

<400>20

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1               5                   10                  15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr

            20                  25                  30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

        35                  40                  45

Ile Leu Ser Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Ser Ile Ser Gly Leu

65                  70                  75                  80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ser Tyr Arg Met Asp

                85                  90                  95

Ser Thr Phe Met Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

            100                 105                 110

<210>21

<211>111

<212>PRT

<213>人

<400>21

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1               5                   10                  15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr

            20                  25                  30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

        35                  40                  45

Ile Leu Ser Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Ser Ile Ser Gly Leu

65                  70                  75                  80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Phe Thr Ser Gly

                85                  90                  95

Ser Thr Phe Met Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

            100                 105                 110

<210>22

<211>111

<212>PRT

<213>人

<400>22

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1               5                   10                  15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr

            20                  25                  30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

        35                  40                  45

Met Ile Tyr Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65                  70                  75                  80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Phe Thr Ser Gly

                85                  90                  95

Ser Thr Phe Met Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

            100                 105                 110

<210>23

<211>111

<212>PRT

<213>人

<400>23

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1               5                   10                  15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr

            20                  25                  30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

        35                  40                  45

Ile Leu Ser Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Ser Ile Ser Gly Leu

65                  70                  75                  80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ser Tyr Thr Met Gly

                85                  90                  95

Ser Thr Phe Met Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

            100                 105                 110

<210>24

<211>5

<212>PRT

<213>人

<400>24

Ser Tyr Ala Met Ser

1               5

<210>25

<211>17

<212>PRT

<213>人

<400>25

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1               5                   10                  15

Gly

<210>26

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>26

Trp Gly Thr Gly Thr Leu Trp Pro

1               5

<210>27

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>27

Trp Gly Asp Gly Thr Leu Asn Pro

1               5

<210>28

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>28

Trp Gly Leu Gly Ser Asn Glu Asn

1               5

<210>29

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>29

Thr Asn Ser Ala Lys Phe Asp Pro

1               5

<210>30

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>30

Thr Gly Tyr Pro Ser Phe Asp Pro

1               5

<210>31

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>31

Thr Ala Lys Pro Ser Phe Asp Pro

1               5

<210>32

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>32

Asn Glu Arg Pro Ser Phe Asp Pro

1               5

<210>33

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>33

Ser Arg Thr Val Gln Phe Asp Pro

1               5

<210>34

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>34

Asn Ser Pro Gly Thr Phe Asp Pro

1               5

<210>35

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>35

Ile Ala Pro Gly Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>36

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>36

Leu Asp Arg Val Trp Phe Asp Pro

1               5

<210>37

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>37

Trp Gly Gly Gly Trp Phe Asp Pro

1               5

<210>38

<211>14

<212>PRT

<213>人

<400>38

Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr Asn Tyr Val Ser

1               5                   10

<210>39

<211>7

<212>PRT

<213>人

<400>39

Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser

1               5

<210>40

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>40

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Leu Pro Trp Val Leu

1               5                   10

<210>41

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>41

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Leu Pro Trp Val Val

1               5                   10

<210>42

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>42

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Ile Val Phe Asn Leu

1               5                   10

<210>43

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>43

Thr Ser Tyr Thr Met Gly Ser Thr Phe Met Leu

1               5                   10

<210>44

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>44

Ser Ser Tyr Thr Met Gly Ser Thr Phe Met Leu

1               5                   10

<210>45

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>45

Thr Ser Tyr Arg Met Asp Ser Thr Phe Met Leu

1               5                   10

<210>46

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>46

Thr Ser Tyr Arg Ala Gly Ser Thr Phe Met Leu

1               5                   10

<210>47

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>47

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Ser Thr Phe Met Leu

1               5                   10

<210>48

<211>30

<212>PRT

<213>人

<400>48

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

            20                  25                  30

<210>49

<211>14

<212>PRT

<213>人

<400>49

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1               5                   10

<210>50

<211>32

<212>PRT

<213>人

<400>50

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1               5                   10                  15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser

            20                  25                  30

<210>51

<211>32

<212>PRT

<213>人

<400>51

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1               5                   10                  15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Asp

            20                  25                  30

<210>52

<211>32

<212>PRT

<213>人

<400>52

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1               5                   10                  15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gly

            20                  25                  30

<210>53

<211>32

<212>PRT

<213>人

<400>53

Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1               5                   10                  15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gly

            20                  25                  30

<210>54

<211>32

<212>PRT

<213>人

<400>54

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1               5                   10                  15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr

            20                  25                  30

<210>55

<211>32

<212>PRT

<213>人

<400>55

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1               5                   10                  15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys

            20                  25                  30

<210>56

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>56

Trp Gly Gln Gly Lys Met Val Thr Val Ser Ser

1               5                   10

<210>57

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>57

Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

1               5                   10

<210>58

<211>22

<212>PRT

<213>人

<400>58

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Pro Pro Gly Gln

1               5                   10                  15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys

            20

<210>59

<211>22

<212>PRT

<213>人

<400>59

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro A1a Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1               5                   10                  15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys

            20

<210>60

<211>15

<212>PRT

<213>人

<400>60

Trp Tyr Gln Arg His Pro Gly Lys A1a Pro Lys Leu Ile Leu Ser

1               5                   10                  15

<210>61

<211>15

<212>PRT

<213>人

<400>61

Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr

1               5                   10                  15

<210>62

<211>15

<212>PRT

<213>人

<400>62

Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Ile Leu Ser

1               5                   10                  15

<210>63

<211>32

<212>PRT

<213>人

<400>63

Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser

1               5                   10                  15

Leu Ser Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys

            20                  25                  30

<210>64

<211>32

1<212>PRT

<213>人

<400>64

Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser

1               5                   10                  15

Leu Ser Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Gly Tyr Tyr Cys

            20                  25                  30

<210>65

<211>32

<212>PRT

<213>人

<400>65

Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser

1               5                   10                  15

Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys

            20                  25                  30

<210>66

<211>32

<212>PRT

<213>人

<400>66

Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser

1               5                   10                  15

Leu Ser Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys

            20                  25                  30

<210>67

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>67

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

1               5                   10

<210>68

<211>351

<212>DNA

<213>人

<400>68

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc     60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct    120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac    180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat    240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagttgggga    300

acggggacct tgtggccctg gggccaaggg aaaatggtca ccgtctcgag t            351

<210>69

<211>351

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>misc_feature

<222>(330)..(330)

<223>n是a、c、g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(348)..(348)

<223>n是a、c、g或t

<400>69

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc     60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct    120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac    180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat    240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagttgggga    300

gacgggacct tgaacccgtg gggccaaggn aaaatggtca ccgtctcnag t             351

<210>70

<211>351

<212>DNA

<213>人

<400>70

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc     60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct    120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac    180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat    240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagttgggga    300

ctggggagca acgaaaactg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcgag t             351

<210>71

<211>351

<212>DNA

<213>人

<400>71

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc     60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct    120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac    180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat    240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc ggacacgaac    300

tccgccaagt tcgacccctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcgag t             351

<210>72

<211>351

<212>DNA

<213>人

<400>72

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc     60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct    120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac    180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat    240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gggcacgggg    300

tacccctcct tcgacccctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcgag t             351

<210>73

<211>351

<212>DNA

<213>人

<400>73

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc     60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct    120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac    180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat    240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gggcacggcc    300

aagccgagct tcgacccctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcgag t             351

<210>74

<211>351

<212>DNA

<213>人

<400>74

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc     60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct    120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac    180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat    240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc ggggaacgag    300

aggccgtcgt tcgacccctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcgag t             351

<210>75

<211>351

<212>DNA

<213>人

<400>75

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc     60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct    120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac    180

gcagactccg tgaagggccg gttcgccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat    240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gggcagccgc    300

acggtgcagt tcgacccctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcgag t             351

<210>76

<211>351

<212>DNA

<213>人

<400>76

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc     60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct    120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac    180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat    240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gacgaactcg    300

ccggggacgt tcgacccctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcgag t             351

<210>77

<211>351

<212>DNA

<213>人

<400>77

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc     60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct    120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac    180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat    240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaccatcgcg    300

cccggccggt tcgacccctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcgag t             351

<210>78

<211>351

<212>DNA

<213>人

<400>78

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc     60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct    120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac    180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat    240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc ggggctcgac    300

cgggtgtggt tcgacccctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcgag t             351

<210>79

<211>351

<212>DNA

<213>人

<400>79

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc     60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct    120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac    180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat    240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagttgggga    300

ggaggctggt tcgacccctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcctc a             351

<210>80

<211>351

<212>DNA

<213>人

<400>80

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc     60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct    120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac    180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat    240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaatgggga    300

ggaggctggt tcgacccctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcctc a             351

<210>81

<211>333

<212>DNA

<213>人

<400>81

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc     60

tcctgcactg gaaccagtaa tgacgttggt gcttataatt atgtctcctg gtaccaacaa    120

cacccaggca aagcccccaa actcattctt tctgaggtca ataaacggcc ctcaggggtt    180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ctctgagcat ctctgggctc    240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcattta caagcggcct cccctgggtc    300

ctcttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta                                 333

<210>82

<211>333

<212>DNA

<213>人

<400>82

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc     60

tcctgcactg gaaccagtaa tgacgttggt gcttataatt atgtctcctg gtaccaacaa    120

cacccaggca aagcccccaa actcattctt tctgaggtca ataaacggcc ctcaggggtt    180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggctt ctctgagcat ctctgggctc    240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcattta caagcgggct cccctgggtc    300

gtcttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta                                 333

<210>83

<211>333

<212>DNA

<213>人

<400>83

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc     60

tcctgcactg gaaccagtaa tgacgttggt gcttataatt atgtctcctg gtaccaacaa    120

cacccaggca aagcccccaa actcattctt tctgaggtca ataaacggcc ctcaggggtt    180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ctctgagcat ctctgggctc    240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcattta caagcggcat cgtgttcaac    300

ctgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta                                 333

<210>84

<211>333

<212>DNA

<213>人

<400>84

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc     60

tcctgcactg gaaccagtaa tgacgttggt gcttataatt atgtctcctg gtaccaacga    120

cacccaggca aagcccccaa actcattctt tctgaggtca ataaacggcc ctcaggggtt    180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ctctgagcat ctctgggctc    240

caggctgagg acgaggctga gtattactgc agcagctaca cgatggggag cacttttatg    300

ctattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta                                 333

<210>85

<211>333

<212>DNA

<213>人

<400>85

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc     60

tcctgcactg gaaccagtaa tgacgttggt gcttataatt atgtctcctg gtaccaacaa    120

cacccaggca aagcccccaa actcattctt tctgaggtca ataaacggcc ctcaggggtt    180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ctctgagcat ctctgggctc    240

caggctgagg acgaggctgg ttattactgc acgagctacc gggccgggag cacttttatg    300

ctattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta                                 333

<210>86

<211>333

<212>DNA

<213>人

<400>86

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggcctc ctggacagtc gatcaccatc     60

tcctgcactg gaaccagtaa tgacgttggt gcttataatt atgtctcctg gtaccaacaa    120

cacccaggca aagcccccaa actcattctt tctgaggtca ataaacggcc ctcaggggtt    180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ctctgagcat ctctgggctc    240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc acctcgtaca ccatgggcag cacttttatg    300

ctattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta                                 333

<210>87

<211>333

<212>DNA

<213>人

<400>87

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc     60

tcctgcactg gaaccagtaa tgacgttggt gcttataatt atgtctcctg gtaccaacaa    120

cacccaggca aagcccccaa actcattctt tctgaggtca ataaacggcc ctcaggggtt    180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ctctgagcat ctctgggctc    240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc acctcgtacc gcatggacag cacttttatg    300

ctattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta                                 333

<210>88

<211>333

<212>DNA

<213>人

<400>88

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc     60

tcctgcactg gaaccagtaa tgacgttggt gcttataatt atgtctcctg gtaccaacaa    120

cacccaggca aagcccccaa actcattctt tctgaggtca ataaacggcc ctcaggggtt    180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ctctgagcat ctctgggctc    240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcattta caagcggcag cacttttatg    300

ctattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta                                 333

<210>89

<211>333

<212>DNA

<213>人

<400>89

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc     60

tcctgcactg gaaccagtaa tgacgttggt gcttataatt atgtctcctg gtaccaacaa    120

cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgaggtca ataaacggcc ctcaggggtt    180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ctctgaccat ctctgggctc    240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcattta caagcggcag cacttttatg    300

ctattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta                                 333

<210>90

<211>333

<212>DNA

<213>人

<400>90

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc     60

tcctgcactg gaaccagtaa tgacgttggt gcttataatt atgtctcctg gtaccaacaa    120

cacccaggca aagcccccaa actcattctt tctgaggtca ataaacggcc ctcaggggtt    180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ctctgagcat ctctgggctc    240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc acctcgtaca ccatgggcag cacttttatg    300

ctattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc  cta                                333

<210>91

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>91

Asn Pro Lys Gly Gln Phe Asp Pro

1               5

<210>92

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>92

Asn Ser Ala Gly Ser Phe Asp Pro

1               5

<210>93

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>93

Ser Asn Gly Gly Leu Phe Asp Pro

1               5

<210>94

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>94

Ser Asn Gly Gly Phe Phe Asp Pro

1               5

<210>95

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>95

Ser Asp Leu Gly Glu Phe Asp Pro

1               5

<210>96

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>96

Thr Asn Thr Gly Gln Phe Asp Pro

1               5

<210>97

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>97

Thr Pro Arg Gly Leu Phe Asp Pro

1               5

<210>98

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>98

Ser Asn Thr Gly Asn Phe Asp Pro

1               5

<210>99

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>99

Ser Arg Thr Val Gln Phe Asp Pro

1               5

<210>100

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>100

Leu Gly Val Pro Gln Phe Asp Pro

1               5

<210>101

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>101

Ser Asp Asn Gly Thr Phe Asp Pro

1               5

<210>102

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>102

Ile Ala Pro Gly Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>103

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>103

Asn Thr Thr Gly Thr Phe Asp Pro

1               5

<210>104

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>104

Ser Asp Ala Gly Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>105

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>105

Ile Asn Glu Gly Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>106

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>106

Asn Ser Asn Gly Val Phe Asp Pro

1               5

<210>107

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>107

Ser His Ser Gly Lys Phe Asp Pro

1               5

<210>108

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>108

Asn Lys Lys Pro Pro Phe Asp Pro

1               5

<210>109

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>109

Ser Asp Asn Gly Leu Phe Asp Pro

1               5

<210>110

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>110

Trp Gly Ala Gly Glu Leu Asp His

1               5

<210>111

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>111

Trp Gly Thr Gly Ala His Glu Asn

1               5

<210>112

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>112

Asn Asn Val Gly Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>113

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>113

Thr Asp Arg Pro Val Phe Asp Pro

1               5

<210>114

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>114

Ile Arg Ser Gly Met Phe Asp Pro

1               5

<210>115

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>115

Thr Glu Gly Ala Leu Phe Asp Pro

1               5

<210>116

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>116

Ser Asp Phe Gly Lys Phe Asp Pro

1               5

<210>117

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>117

Asn Glu Leu Gly Ser Phe Asp Pro

1               5

<210>118

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>118

Gln Glu Leu Pro Val Phe Asp Pro

1               5

<210>119

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>119

Phe Arg Asp Thr Ala Phe Asp Pro

1               5

<210>120

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>120

Ala Asp Met Gly Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>121

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>121

Leu Gly Val Pro Val Phe Asp Pro

1               5

<210>122

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>122

Thr His Ala Gly Met Phe Asp Pro

1               5

<210>123

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>123

Val Tyr Ala Gly Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>124

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>124

Asn Thr Gln Gly Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>125

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>125

Thr Asn Gly Gly Leu Phe Asp Pro

1               5

<210>126

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>126

Ile Thr Thr Val Lys Phe Asp Pro

1               5

<210>127

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>127

Arg Leu Val His Gly Phe Asp Pro

1               5

<210>128

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>128

Ile Arg Leu Gly Thr Phe Asp Pro

1               5

<210>129

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>129

Ser Glu Arg Pro Gln Phe Asp Pro

1               5

<210>130

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>130

Thr Ser Arg Pro Leu Phe Asp Pro

1               5

<210>131

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>131

Val Glu Ser Gly Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>132

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>132

Ser Glu Met Pro Met Phe Asp Pro

1               5

<210>133

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>133

Val Asn Pro Gly Tyr Phe Asp Pro

1               5

<210>134

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>134

Asn Asp Ile Ala Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>135

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>135

Val Gly Val Gly Gln Phe Asp Pro

1               5

<210>136

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>136

Thr Arg Tyr Pro Thr Phe Asp Pro

1               5

<210>137

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>137

Asn Ser Ala Gly Thr Phe Asp Pro

1               5

<210>138

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>138

Val Asn Glu Gly Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>139

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>139

Asn Arg Thr Gly Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>140

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>140

Asn Ala Ser Ala Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>141

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>141

Ile Asn Thr Gly Met Phe Asp Pro

1               5

<210>142

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>142

Asn Asp Asn Gly Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>143

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>143

Val Asp Gln Pro Ser Phe Asp Pro

1               5

<210>144

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>144

Val Asp Arg Gly Gln Phe Asp Pro

1               5

<210>145

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>145

Asn His Thr Gly Lys Phe Asp Pro

1               5

<210>146

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>146

Thr Asn Thr Gly Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>147

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>147

Ser Asp Ser Gly Leu Phe Asp Pro

1               5

<210>148

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>148

Asn Val Leu Ala Leu Phe Asp Pro

1               5

<210>149

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>149

Asn Tyr Glu Ala Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>150

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>150

Pro Asp Asn Gly Thr Phe Asp Pro

1               5

<210>151

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>151

Asn Arg Asn Gly Asn Phe Asp Pro

1               5

<210>152

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>152

Thr Thr Gly Gly Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>153

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>153

Thr Gly Tyr Pro Ser Phe Asp Pro

1               5

<210>154

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>154

Asn Asn Glu Gly Gln Phe Asp Pro

1               5

<210>155

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>155

Asn Ser Lys Gly Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>156

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>156

Thr Glu Asn Pro Thr Phe Asp Pro

1               5

<210>157

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>157

Thr Asn Gly Gly Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>158

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>158

Asn Ser Tyr Gly Ser Phe Asp Pro

1               5

<210>159

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>159

Leu Glu Asn Val Val Phe Asp Pro

1               5

<210>160

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>160

Ala Asn His Gly Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>161

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>161

Ala Asn Gly Gly Gln Phe Asp Pro

1               5

<210>162

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>162

Trp Gly Asn Asp Ala Ser Leu Gly

1               5

<210>163

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>163

Trp Gly Pro Thr Ala Ser Leu Asp

1               5

<210>164

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>164

Trp Gly Arg Gly Thr Asn Glu Tyr

1               5

<210>165

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>165

Trp Gly Gly Gly Gly His Tyr Asp

1               5

<210>166

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>166

Trp Gly Ala Asp Ala Thr Leu Asp

1               5

<210>167

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>167

Thr Glu Phe Gly Thr Phe Asp Pro

1               5

<210>168

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>168

Asn Ala Thr Gly Thr Phe Asp Pro

1               5

<210>169

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>169

Thr Asn Ser Ala Lys Phe Asp Pro

1               5

<210>170

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>170

Val Asn Ser Gly Lys Phe Asp Pro

1               5

<210>171

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>171

Ser Leu Arg Val Glu Phe Asp Pro

1               5

<210>172

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>172

Asn Asp Arg Gly Met Phe Asp Pro

1               5

<210>173

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>173

Asn Ser Pro Gly Thr Phe Asp Pro

1               5

<210>174

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>174

Asn Thr Ala Gly Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>175

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>175

Val Asn Arg Gly Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>176

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>176

Thr Glu Lys Pro Met Phe Asp Pro

1               5

<210>177

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>177

Trp Ser Val Ser Leu Phe Asp Pro

1               5

<210>178

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>178

Met Glu Val Val Glu Phe Asp Pro

1               5

<210>179

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>179

Val Asn His Gly Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>180

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>180

Thr Glu Val Gly Thr Phe Asp Pro

1               5

<210>181

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>181

Thr Asp Lys Pro Val Phe Asp Pro

1               5

<210>182

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>182

Leu Glu Leu Pro Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>183

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>183

Thr Asn His Ala Met Phe Asp Pro

1               5

<210>184

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>184

Thr His Ser Gly Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>185

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>185

Asn Asp Arg Gly Gly Phe Asp Pro

1               5

<210>186

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>186

Pro His Arg Gly Thr Phe Asp Pro

1               5

<210>187

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>187

Thr Glu Leu Gly Gln Phe Asp Pro

1               5

<210>188

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>188

Trp Gly Leu Gly Ser Asn Glu Asn

1               5

<210>189

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>189

Trp Gly Asn Asp Ala Thr Trp Asn

1               5

<210>190

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>190

Trp Gly Ser Thr Ala Ser Leu Asp

1               5

<210>191

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>191

Trp Gly Gly Gly Gly His Gln Asp

1               5

<210>192

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>192

Trp Gly Arg Gly Asp Trp Arg Ser

1               5

<210>193

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>193

Trp Gly Ser Thr Ala Ser Leu Ser

1               5

<210>194

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>194

Trp Gly His Gly Gly His Asp Thr

1               5

<210>195

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>195

Trp Gly Pro Arg Ala Thr Leu Asp

1               5

<210>196

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>196

Trp Gly Asn Gly Ala Phe Val Pro

1               5

<210>197

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>197

Trp Gly Asn Asp Ala Thr Leu Ala

1               5

<210>198

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>198

Trp Gly Ser Gly Asn Leu Asp Pro

1               5

<210>199

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>199

Asn Glu Leu Pro Lys Phe Asp Pro

1               5

<210>200

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>200

Ser Asp Gly Gly Thr Phe Asp Pro

1               5

<210>201

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>201

Leu Asp Met Val Met Phe Asp Pro

1               5

<210>202

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>202

Trp Gly Ser Gly Thr Met Asp Pro

1               5

<210>203

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>203

Pro Asp Arg Gly Lys Phe Asp Pro

1               5

<210>204

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>204

Thr His Asn Pro Val Phe Asp Pro

1               5

<210>205

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>205

Asn Ser Ala Gly Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>206

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>206

Leu Asp Ser Val Val Phe Asp Pro

1               5

<210>207

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>207

Trp Gly Thr Gly Gln His Glu Asn

1               5

<210>208

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>208

Trp Gly Thr Gly His His Asp Pro

1               5

<210>209

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>209

Asn Phe Lys Pro Ser Phe Asp Pro

1               5

<210>210

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>210

Ala Asn Gly Gly Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>211

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>211

Trp Gly Thr Gly His Leu Glu Pro

1               5

<210>212

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>212

Thr Gly Leu Pro Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>213

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>213

Ser Asn Val Gly Lys Phe Asp Pro

1               5

<210>214

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>214

Asn Ala Val Ala Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>215

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>215

Thr Asp Arg Pro Gln Phe Asp Pro

1               5

<210>216

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>216

Ser Leu Thr Val Asp Phe Asp Pro

1               5

<210>217

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>217

Thr Glu Met Ala Gln Phe Asp Pro

1               5

<210>218

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>218

Trp Gly Glu Gly His Leu Glu Tyr

1               5

<210>219

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>219

Gln Lys Lys Val Glu Phe Asp Pro

1               5

<210>220

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>220

Thr Gly Tyr Pro Val Phe Asn Pro

1               5

<210>221

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>221

Ala Asn Ser Ala Lys Phe Asp Pro

1               5

<210>222

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>222

Val Gly Arg Pro Gln Phe Asp Pro

1               5

<210>223

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>223

Thr Tyr Asn Pro Met Phe Asp Pro

1               5

<210>224

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>224

Thr Glu Arg Pro Val Phe Asp Pro

1               5

<210>225

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>225

Leu Asp Leu Pro Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>226

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>226

Trp Gly Ser Gly Ser Ile Asp His

1               5

<210>227

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>227

Leu Asp Arg Val Cys Ser Arg Trp

1               5

<210>228

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>228

Asn Thr Leu Pro Val Phe Asp Pro

1               5

<210>229

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>229

Ile Lys Pro Gly Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>230

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>230

Thr Gly Tyr Pro Val Phe Asp Pro

1               5

<210>231

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>231

Ile Lys Pro Gly Met Phe Asp Pro

1               5

<210>232

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>232

Asn Met Thr Pro Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>233

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>233

Thr Glu Arg Pro Ser Phe Asp Pro

1               5

<210>234

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>234

Thr Asn Tyr Gly Thr Phe Asp Pro

1               5

<210>235

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>235

Thr Ser Arg Pro Ser Phe Asp Pro

1               5

<210>236

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>236

Thr Tyr Trp Pro Ala Phe Asp Pro

1               5

<210>237

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>237

Ile Asp Met Pro Trp Phe Asp Pro

1               5

<210>238

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>238

Trp Gly Thr Gly His His Asp Pro

1               5

<210>239

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>239

Asn Ala Arg Pro Ser Phe Asp Pro

1               5

<210>240

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>240

Asn Gln Ile Val His Phe Asp Pro

1               5

<210>241

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>241

Asn Val Met Gly Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>242

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>242

Thr Asp Thr Pro Val Phe Asp Pro

1               5

<210>243

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>243

Asn Arg Thr Val Trp Phe Asp Pro

1               5

<210>244

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>244

Asn Arg Met Gly Ser Phe Asp Pro

1               5

<210>245

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>245

Val Lys Pro Gly Phe Phe Asp Pro

1               5

<210>246

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>246

Ile Asp Gln Gly Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>247

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>247

Gln Ser Leu Pro Gln Phe Asp Pro

1               5

<210>248

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>248

Asn Glu Leu Gly Thr Phe Asp Pro

1               5

<210>249

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>249

Gln Lys Lys Val Glu Phe Asp Pro

1               5

<210>250

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>250

Ile Asp Thr Pro Thr Phe Asp Pro

1               5

<210>251

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>251

Trp Gly Tyr Asp Ala Thr Leu Glu

1               5

<210>252

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>252

Ser Asp Gly Gly Lys Phe Asp Pro

1               5

<210>253

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>253

Leu Asp Leu Val Arg Phe Asp Pro

1               5

<210>254

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>254

Ala Asn Ala Gly Leu Phe Asp Pro

1               5

<210>255

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>255

Trp Gly Thr Gly Ser Asn Arg Asp

1               5

<210>256

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>256

Ser Glu Thr Ile Asn Phe Asp Pro

1               5

<210>257

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>257

Gly Ser Tyr Thr His Gly Ser Thr Phe Met Leu

1               5                   10

<210>258

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>258

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Ile Pro Trp Ala Val

1               5                   10

<210>259

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>259

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Val Pro Trp Ala Met

1               5                   10

<210>260

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>260

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Leu Gln Trp Val Val

1               5                   10

<210>261

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>261

Ser Ser Phe Thr Ser Gln Ile Pro Trp Ala Leu

1               5                   10

<210>262

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>262

Ser Ser Phe Thr Ser Ala Glu Gln Trp Val Met

1               5                   10

<210>263

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>263

Ser Ser Phe Thr Ser Gln Pro Gln Phe Asn Leu

1               5                   10

<210>264

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>264

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Ser Thr Trp Val Leu

1               5                   10

<210>265

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>265

Ser Ser Phe Thr Ser Ala Val Pro Trp Ala Ile

1               5                   10

<210>266

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>266

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Ala Val Phe Val Leu

1               5                   10

<210>267

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>267

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Ile Val Phe Asn Leu

1               5                   10

<210>268

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>268

Ala Ser Tyr Arg Asp Gly Ser Thr Phe Met Leu

1               5                   10

<210>269

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>269

Ala Ser Phe Gln Ser Gly Ser Thr Phe Met Leu

1               5                   10

<210>270

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>270

Ala Ser Tyr Gln Ser Ala Ser Thr Phe Met Leu

1               5                   10

<210>271

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>271

Thr Ser Tyr Thr Ala Ser Ser Thr Phe Met Leu

1               5                   10

<210>272

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>272

Ser Ala Phe Gln Gln Ser Ser Thr Phe Met Leu

1               5                   10

<210>273

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>273

Gly Ser Tyr Ser Gln Gln Ser Thr Phe Met Leu

1               5                   10

<210>274

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>274

Gly Ala Tyr Ser Ala Gly Ser Thr Phe Met Leu

1               5                   10

<210>275

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>275

Thr Ser Tyr Thr Gln Gly Ser Thr Phe Met Leu

1               5                   10

<210>276

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>276

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Arg Ala Phe Thr Cys

1               5                   10

<210>277

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>277

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Asp His Trp Val Leu

1               5                   10

<210>278

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>278

Ser Ser Phe Thr Ser Arg Ile Pro Trp Ala Val

1               5                   10

<210>279

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>279

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Lys Ala Trp Val Ile

1               5                   10

<210>280

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>280

Ser Ser Phe Thr Ser Ala Glu Ala Trp Ala Pro

1               5                   10

<210>281

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>281

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Asp Arg Phe Asn Leu

1               5                   10

<210>282

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>282

Ser Ser Phe Thr Ser Tyr Lys Pro His Met Val

1               5                   10

<210>283

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>283

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Ile Gln Phe Asn Leu

1               5                   10

<210>284

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>284

Ser Ser Phe Thr Ser Ala Ala Arg Phe Ala Leu

1               5                   10

<210>285

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>285

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Ser Arg Phe Val Leu

1               5                   10

<210>286

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>286

Ser Ser Phe Thr Ser Ser Leu Pro Trp Ala Leu

1               5                   10

<210>287

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>287

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Ile Lys Phe Thr Leu

1               5                   10

<210>288

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>288

Ser Ser Phe Thr Ser Ala Ile Pro Trp Ser Leu

1               5                   10

<210>289

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>289

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Glu Gln Phe Leu Leu

1               5                   10

<210>290

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>290

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Pro Arg Trp Asn Leu

1               5                   10

<210>291

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>29L

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Ser Thr Phe Asn Leu

1               5                   10

<210>292

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>292

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Arg Arg Phe Val Leu

1               5                   10

<210>293

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>293

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Asn Val Trp Val Leu

1               5                   10

<210>294

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>294

Ser Ser Phe Thr Ser Ala Pro Ala Phe Val Val

1               5                   10

<210>295

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>295

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Lys Thr Phe Val Leu

1               5                   10

<210>296

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>296

Ser Ser Phe Thr Ser Asn Ile Pro Trp Ala Ile

1               5                   10

<210>297

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>297

Ser Ser Phe Thr Ser Ser Ala His Phe Val Leu

1               5                   10

<210>298

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>298

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Pro Val Phe Asn Ile

1               5                   10

<210>299

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>299

Ser Ser Phe Thr Ser Asp Arg Ala Phe Asn Leu

1               5                   10

<210>300

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>300

Ser Ser Phe Thr Ser Glu Trp Leu Trp Val Leu

1               5                   10

<210>301

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>301

Ser Ser Phe Thr Ser Gln Pro Arg Trp Ala Pro

1               5                   10

<210>302

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>302

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Ile Arg Phe Asn Leu

1               5                   10

<210>303

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>303

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Arg Ala Phe Asn Leu

1               5                   10

<210>304

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>304

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Pro Val Phe Asn Leu

1               5                   10

<210>305

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>305

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Gln Gln Trp Val Leu

1               5                   10

<210>306

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>306

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Ile Arg Phe Asn Val

1               5                   10

<210>307

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>307

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Val Thr Trp Leu Leu

1               5                   10

<210>308

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>308

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Arg Ile Phe Asn Leu

1               5                   10

<210>309

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>309

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Ile Pro Trp Ile Val

1               5                   10

<210>310

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>310

Thr Ser Tyr Thr Leu Gly Ser Thr Phe Met Leu

1               5                   10

<210>311

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>311

Thr Ser Tyr Thr His Gly Ser Thr Phe Met Leu

1               5                   10

<210>312

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>312

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Tyr Ala Trp Leu Leu

1               5                   10

<210>313

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>313

Thr Ser Tyr Val Met Gly Ser Thr Phe Met Leu

1               5                   10

<210>314

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>314

Ser Ser Phe Thr Ser Gly Ser Thr Phe Thr Leu

1               5                   10

<210>315

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>315

Thr Ser Phe Thr Ser Gly Ser Thr Phe Met Lau

1               5                   10

<210>316

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>316

Thr Ser Ser Thr Leu Gly Ser Thr Phe Met Leu

1               5                   10

<210>317

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>317

Thr Arg Tyr Val Met Gly Ser Thr Phe Met Leu

1               5                   10

<210>318

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>318

Thr Ser Tyr Arg Glu Gly Ser Thr Phe Met Leu

1               5                   10

<210>319

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>319

Ala Ser Tyr Gln Ala Ser Ser Thr Phe Met Leu

1               5                   10

<210>320

<211>117

<212>PRT

<213>人

<400>320

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Trp Gly Asp Gly Thr Leu Asn Pro Trp Gly Gln Gly Thr Met

            100                 105                 110

Val Thr Val Ser Ser

        115

<210>321

<211>117

<212>PRT

<213>人

<400>321

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

A1a Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser LysAsn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Thr Asn Ser Ala Lys Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Met

            100                 105                 110

Val Thr Val Ser Ser

        115

<210>322

<211>117

<212>PRT

<213>人

<400>322

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

A1a Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Asn Glu Arg Pro Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Met

            100                 105                 110

Val Thr Val Ser Ser

        115

<210>323

<211>117

<212>PRT

<213>人

<400>323

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Thr Asn Ser Ala Lys Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Met

            100                 105                 110

Val Thr Val Ser Ser

        115

<210>324

<211>117

<212>PRT

<213>人

<400>324

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Thr Gly Tyr Pro Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Met

            100                 105                 110

Val Thr Val Ser Ser

        115

<210>325

<211>117

<212>PRT

<213>人

<400>325

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Trp Gly Thr Gly Thr Leu Trp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Met

            100                 105                 110

Val Thr Val Ser Ser

        115

<210>326

<211>111

<212>PRT

<213>人

<400>326

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1               5                   10                  15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr

            20                  25                  30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

        35                  40                  45

Met Ile Ser Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65                  70                  75                  80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Phe Thr Ser Gly

                85                  90                  95

Leu Pro Trp Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

            100                 105                 110

<210>327

<211>111

<212>PRT

<213>人

<400>327

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1               5                   10                  15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr

            20                  25                  30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

        35                  40                  45

Met Ile Ser Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65                  70                  75                  80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Met Gly

                85                  90                  95

Ser Thr Phe Met Leu Phe Gly Gly Gly ThrLysLeu Thr Val Leu

            100                 105                 110

<210>328

<211>111

<212>PRT

<213>人

<400>328

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1               5                   10                  15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr

            20                  25                  30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

        35                  40                  45

Met Ile Ser Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65                  70                  75                  80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ser Tyr Thr Met Gly

                85                  90                  95

Ser Thr Phe Met Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

            100                 105                 110

<210>329

<211>111

<212>PRT

<213>人

<400>329

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1               5                   10                  15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr

            20                  25                  30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

        35                  40                  45

Met Ile Ser Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65                  70                  75                  80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ser Tyr Thr Met Gly

                85                  90                  95

Ser Thr Phe Met Leu Phe Gly Gly Gly Thr LysLeu Thr Val Leu

            100                 105                 110

<210>330

<211>111

<212>PRT

<213>人

<400>330

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1               5                   10                  15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr

            20                  25                  30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

        35                  40                  45

Met Ile Ser Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65                  70                  75                  80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ser Tyr Arg Ala Gly

                85                  90                  95

Ser Thr Phe Met Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

            100                 105                 110

<210>331

<211>111

<212>PRT

<213>人

<400>331

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1               5                   10                  15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr

            20                  25                  30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

        35                  40                  45

Met Ile Ser Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65                  70                  75                  80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Phe Thr Ser Gly

                85                  90                  95

Leu Pro Trp Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100                 105                 110

<210>332

<211>351

<212>DNA

<213>人

<400>332

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc     60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct    120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac    180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat    240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaatgggga    300

gacgggacct tgaacccgtg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcctc a             351

<210>333

<211>351

<212>DNA

<213>人

<400>333

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc     60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct    120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac    180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat    240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaacgaac    300

tccgccaagt tcgacccctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcctc a             351

<210>334

<211>351

<212>DNA

<213>人

<400>334

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc     60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct    120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac    180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat    240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaaacgag    300

aggccgtcgt tcgacccctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcctc a             351

<210>335

<211>351

<212>DNA

<213>人

<400>335

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc     60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct    120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac    180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat    240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaatgggga    300

gacgggacct tgaacccgtg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcctc a             351

<210>336

<211>351

<212>DNA

<213>人

<400>336

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc     60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct    120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac    180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat    240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaacgggg    300

tacccctcct tcgacccctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcctc a             351

<210>337

<211>351

<212>DNA

<213>人

<400>337

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc     60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct    120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac    180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat    240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaatgggga    300

acggggacct tgtggccctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcctc a             351

<210>338

<211>333

<212>DNA

<213>人

<400>338

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc     60

tcctgcactg gaaccagtaa tgacgttggt gcttataatt atgtctcctg gtaccaacaa    120

cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tctgaggtca ataaacggcc ctcaggggtt    180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ctctgaccat ctctgggctc    240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcattta caagcgggct cccctgggtc    300

gtcttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta                                 333

<210>339

<211>333

<212>DNA

<213>人

<400>339

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc     60

tcctgcactg gaaccagtaa tgacgttggt gcttataatt atgtctcctg gtaccaacaa    120

cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tctgaggtca ataaacggcc ctcaggggtt    180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ctctgaccat ctctgggctc    240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc agcagctaca cgatggggag cacttttatg    300

ctattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta                                 333

<210>340

<211>333

<212>DNA

<213>人

<400>340

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc     60

tcctgcactg gaaccagtaa tgacgttggt gcttataatt atgtctcctg gtaccaacaa    120

cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tctgaggtca ataaacggcc ctcaggggtt    180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ctctgaccat ctctgggctc    240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc acctcgtaca ccatgggcag cacttttatg    300

ctattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta                                 333

<210>341

<211>333

<212>DNA

<213>人

<400>341

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc     60

tcctgcactg gaaccagtaa tgacgttggt gcttataatt atgtctcctg gtaccaacaa    120

cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tctgaggtca ataaacggcc ctcaggggtt    180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ctctgaccat ctctgggctc    240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc acctcgtaca ccatgggcag cacttttatg    300

ctattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta                                 333

<210>342

<211>333

<212>DNA

<213>人

<400>342

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc     60

tcctgcactg gaaccagtaa tgacgttggt gcttataatt atgtctcctg gtaccaacaa    120

cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tctgaggtca ataaacggcc ctcaggggtt    180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ctctgaccat ctctgggctc    240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc acctcgtaca ccatgggcag cacttttatg    300

ctattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta                                 333

<210>343

<211>333

<212>DNA

<213>人

<400>343

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc     60

tcctgcactg gaaccagtaa tgacgttggt gcttataatt atgtctcctg gtaccaacaa    120

cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tctgaggtca ataaacggcc ctcaggggtt    180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ctctgaccat ctctgggctc    240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcattta caagcgggtt gccgtgggtg    300

ctcttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta                                 333

<210>344

<211>330

<212>PRT

<213>人

<400>344

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1               5                   10                  15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

            20                  25                  30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

        35                  40                  45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

    50                  55                  60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65                  70                  75                  80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

                85                  90                  95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

            100                 105                 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

        115                 120                 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

    130                 135                 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145                 150                 155                 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

                165                 170                 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

            180                 185                 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

        195                 200                 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

    210                 215                 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225                 230                 235                 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

                245                 250                 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

            260                 265                 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

        275                 280                 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

    290                 295                 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305                 310                 315                 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

                325                 330

<210>345

<211>106

<212>PRT

<213>人

<400>345

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1               5                   10                  15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

            20                  25                  30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

        35                  40                  45

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

    50                  55                  60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65                  70                  75                  80

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

                85                  90                  95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

            100                 105

<210>346

<211>19

<212>PRT

<213>人

<400>346

Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly

1               5                   10                  15

Val His Ser

<210>347

<211>20

<212>PRT

<213>人

<400>347

Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr

1               5                   10                  15

Asp Ala Arg Cys

            20

Claims (15)

1.具有至少一个选自以下组的特征的抗体或其抗原结合部分，所述组由：

a)具有大于或等于1.5的K_D(E)/K_D(P)；

b)通过表面等离振子共振测量以50nM或更小的K_D与P-钙黏着蛋白结合；

c)对P-钙黏着蛋白而言，通过表面等离振子共振测量的k_off小于或等于0.01^s-1；

d)通过P-钙黏着蛋白依赖性细胞黏着测定法测量的IC₅₀为50nM或更小；

e)通过P-钙黏着蛋白依赖性细胞聚集测定法测量的IC₅₀为50nM或更小；

f)在P-钙黏着蛋白依赖性球状体破坏测定法中，与无IgG的对照样品相比球状体破坏增加因数为2或更多；

g)与选自194-e06；194-a02；194-b09；195-e11；194-g09；196-h02；194-e01；196-d10；196-g03；196-e06；195-a09；198-a09；200-h06；g-194-b09；g-194-g09；g-196-g03；g-196-h02；g-194-e01；g-194-e06；129-1c4；和g-129-1c4的抗体竞争结合P-钙黏着蛋白；

h)与选自194-e06；194-a02；194-b09；195-e11；194-g09；196-h02；194-e01；196-d10；196-g03；196-e06；195-a09；198-a09；200-h06；g-194-b09；g-194-g09；g-196-g03；g-196-h02；g-194-e01；g-194-e06129-1c4；和g-129-1c4的抗体交叉竞争结合P-钙黏着蛋白；

i)与选自194-e06；194-a02；194-b09；195-e11；194-g09；196-h02；194-e01；196-d10；196-g03；196-e06；195-a09；198-a09；200-h06；g-194-b09；g-194-g09；g-196-g03；g-196-h02；g-194-e01；g-194-e06；129-1c4；和g-129-1c4的抗体结合在P-钙黏着蛋白上相同的表位；

j)与选自194-e06；194-a02；194-b09；195-e11；194-g09；196-h02；194-e01；196-d10；196-g03；196-e06；195-a09；198-a09；200-h06；g-194-b09；g-194-g09；g-196-g03；g-196-h02；g-194-e01；g-194-e06；129-1c4；和g-129-1c4的抗体以基本上相同的K_D结合P-钙黏着蛋白；和

k)与选自194-e06；194-a02；194-b09；195-e11；194-g09；196-h02；194-e01；196-d10；196-g03；196-e06；195-a09；198-a09；200-h06；g-194-b09；g-194-g09；g-196-g03；g-196-h02；g-194-e01；g-194-e06；129-1c4；和g-129-1c4的抗体以基本上相同的k_off结合P-钙黏着蛋白构成。

2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列与SEQ ID NOs：13、320、321和322中任一至少90％同一的V_H结构域。

3.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列与SEQ ID NOs：22、326、327和328中任一至少90％同一的V_L结构域。

4.选自以下组的如权利要求1所述的抗体或抗原结合部分，所述组由：

a)抗体或其抗原结合部分，其包含如SEQ ID NO：13中公开的V_H结构域或因1到10个保守氨基酸取代而与SEQ ID NO：13不同的V_H结构域，和如SEQ ID NO：22中公开的V_L结构域或因1到10个保守氨基酸取代而与SEQ ID NO：22不同的V_L结构域；

b)抗体或其抗原结合部分，其包含如SEQ ID NO：320中公开的V_H结构域或因1到10个保守氨基酸取代而与SEQ ID NO：320不同的V_H结构域，和如SEQ ID NO：326中公开的V_L结构域或因1到10个保守氨基酸取代而与SEQ ID NO：326不同的V_L结构域；

c)抗体或其抗原结合部分，其包含如SEQ ID NO：321中公开的V_H结构域或因1到10个保守氨基酸取代而与SEQ ID NO：321不同的V_H结构域，和如SEQ ID NO：327中公开的V_L结构域或因1到10个保守氨基酸取代而与SEQ ID NO：327不同的V_L结构域；和

d)抗体或其抗原结合部分，其包含如SEQ ID NO：322中公开的V_H结构域或因1到10个保守氨基酸取代而与SEQ ID NO：322不同的V_H结构域，和如SEQ ID NO：328中公开的V_L结构域或因1到10个保守氨基酸取代而与SEQ ID NO：328不同的V_L结构域构成。

5.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其包含独立地选自SEQ ID NOs：1到13和320到325之任一的V_H结构域或因1到10个保守氨基酸取代而与SEQ ID NOs：1到13和320到325之任一不同的序列；并还包含独立地选自SEQ ID NOs：14到23和326到331之任一的V_L结构域或因1到10个保守氨基酸取代而与SEQ ID NOs：14到23和326到331之任一不同的序列。

6.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分包含选自SEQ ID NOs：26到37和91到256之任一的V_H CDR3，或因1个或2个保守的氨基酸取代而与SEQ ID NOs：26到37和91到256之任一不同的序列。

7.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分包含选自SEQ ID NOs：40到47和257到319之任一的V_LCDR3，或因1个或2个保守的氨基酸取代而与SEQ ID NOs：40到47和257到319之任一不同的序列。

8.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分包含：

a)如SEQ ID NO：24所公开的V_H CDR1，或因1个或2个保守的氨基酸取代而与SEQ ID NO：24不同的序列；

b)如SEQ ID NO：25所公开的V_H CDR2，或因1个或2个保守的氨基酸取代而与SEQ ID NO：25不同的序列；和

c)选自SEQ ID NOs：26到37和91到256之任一的V_H CDR3，或因1个或2个保守的氨基酸取代而与SEQ ID NOs：26到37和91到256之任一不同的序列。

9.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分包含：

a)如SEQ ID NO：38所公开的V_L CDR1，或因1个或2个保守的氨基酸取代而与SEQ ID NO：38不同的序列；

b)如SEQ ID NO：39所公开的V_L CDR2，或因1个或2个保守的氨基酸取代而与SEQ ID NO：39不同的序列；和

c)选自SEQ ID NOs：40到47和257到319之任一的V_LCDR3，或因1个或2个保守的氨基酸取代而与SEQ ID NOs：40到47和257到319之任一不同的序列。

10.抗体或其抗原结合部分，其中V_H结构域包含SEQ ID NOs：13、320、321和322之任一，或因1到10个保守的氨基酸取代而与SEQ IDNOs：13、320、321和322之任一不同的序列；和V_L结构域包含SEQ IDNOs：22、326、327和328之任一，或因1到10个保守的氨基酸取代而与SEQ ID NOs：22、326、327和328之任一不同的序列。

11.如权利要求1到10任一项所述的抗体，其为IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子，或由这些获得。

12.如权利要求11所述的抗体，其中IgG为IgG₁，其中重链恒定区包含SEQ ID NO：344，其中轻链恒定区包含SEQ ID NO：345，并且SEQ IDNO：344的C-端赖氨酸残基任选地被切割。

13.药物组合物，其包含如权利要求1到12任一项所述的抗体或抗原结合部分和药物可接受载体。

14.经分离的核酸分子，其包含如SEQ ID NOs：80、89、332、333、334、338、339和340中任一所公开的核苷酸序列。

15.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其包含利用人V_H-3家族基因的重链可变区氨基酸序列。

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