CN101189504B - 用于分选细胞的方法和设备 - Google Patents

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Abstract

用于对精子细胞进行分选和定向的设备，包括：形成具有入口、下游出口和中间检测器区(338)的流室(312)的相面对的一对壁(314，316)。该入口接纳输入流体的第一和第二间隔开的流以及包含待被分选的细胞(330)的样品流体(328)的第三流。第一和第二流具有相应的相对于第三流的流速率，使得第三流被缩窄，从而形成相对窄的样品流，以使得细胞(330)平行于壁(314，316)而被定向。检测器(340)检测期望细胞(330)，且在检测器(340)下游的分选仪(356)从该流中分选期望细胞(330)。

Description

用于分选细胞的方法和设备
技术领域
本发明涉及一种采用多角度区别检测和成像系统的、用于分选细胞的流分选仪。本发明的另一方面涉及一种用于光学检测以及用于物体成像的方法和设备。 
背景技术
公知的成像系统趋向于是方位角对称(azimuthally symmetric)的，在由成像系统的数值孔径(NA)建立的特定角度范围内接受光。在没有过小的孔径或光学器件所产生的渐晕或像差的情况下，NA内的来自物平面的所有光被均匀地理想传输到成像平面。这种设计的理由是：具有合理高的光收集效率(即高NA)是所期望的，并且强度的角度变化常常不承载重要信息。 
一个示例性的成像系统是单个圆透镜或一对圆透镜。对于期望高收集效率的情形，如在暗的成像系统中，使用这样的光学元件来设计高NA系统，该光学元件与物体尺寸相比是大的并且与物体尺寸相比是近的。这样，透镜捕捉了大部分的光。高NA对于最大化分辨率和获得窄的焦深也是重要的。 
流细胞仪是使用光学散射和荧光来区别细胞或其它小物体如荧光珠并基于经区别的光学测量结果对它们进行分选的装置。当物体流过窄喷口时，输入激光散射，碰撞在物体上，并激发荧光。以变化的角度检测散射光和荧光信号，以特征化和区别具有不同特性的物体。 
性别分选精子的一个困难是精子、尤其是牛精子的非常扁平的形状。与DNA相对于水环境的较高折射率相结合，扁平形状造成包括源于精子头中的荧光的光的透镜化和内反射。此透镜化使得光优先地通过精子的边缘发出，而通过精子头的两个扁平面的发射则低得多。因此，精子的X或Y染色体内容的确定和光强度的检测依赖于精子的可靠对齐和从多角度查看精子荧光的能力。 
公知的对齐系统采用这样一种装置，其中精子细胞借助于诸如Rens等人的美国专利No.5,985,216中说明的喷嘴来被定向并喷射到检测带中。在这种装置中，分选喷嘴具有用于对扁平的细胞进行定向的椭圆截面。Rens的一个缺点是：如果流速率高于约5000精子细胞/秒，则所述细胞不能被可靠地成像和特征化。5000精子细胞/秒的精子流速率是低效且耗时的。用于精子分选的更为实用的速率约为100,000精子细胞/秒或更高。 
一种用于操纵小颗粒的成像系统在下列专利申请中进行了描述：2004年10月28日提交的标题为“SYSTEM AND METHOD FOR MANIPULATING AND PROCESSING NANOMATERIALS USING HOLOGRAPHIC OPTICAL TRAPPING”的美国专利申请No.10/974,976以及2004年9月3日提交的标题为“MULTIPLE LAMINAR FLOW-BASED PARTICLE AND CELLULAR SEPARATION WITH LASER STEERING”的美国专利申请No.10/934,597，这两个专利申请的教导通过引用结合于此。 
发明内容
本发明涉及一种采用多角度区别检测和成像系统、用于分选细胞的流分选仪。本发明的一个方面涉及一种用于光学检测和用于物体成像的方法和设备。特别而言，本发明涉及一种用于通过性别来特征化和分选牛精子的方法和设备。然而，应理解也可以使用本发明来分选其它类型的哺乳动物精子细胞等等。 
一种用于对细胞进行分选和定向的流装置设备，包括： 
相面对的一对壁，其形成具有形成流通道的入口、下游出口和中间检测器区的流室，所述入口用于接纳输入鞘液的第一和第二间隔开的鞘流以及在所述第一和第二鞘流之间的包含待被分选的细胞的样品流体的第三流，所述第一和第二鞘流在所述流室中具有相应的相对于所述第三流的流速率或压力的流速率或压力，使得所述第三流在其间被缩窄，从而至少在检测区中形成相对窄的样品流，由此所述细胞被定向在所选择的相对于所述壁的方向上； 
位于所述检测器区中的检测器，所述检测器包括利用输入光来光照所述检测区中的所述细胞的光源，所述细胞响应于所述输入光而产生输出光，所述检测器包括响应于由所述细胞产生的光的光检测器，所述检测器检测期望细胞并产生指示该期望细胞的输出，所述输出光包括从所述细胞散射的光和由所述细胞产生的荧光中的至少一种；以及 
用于从所述样品流中分选由所述检测器检测到的所述期望细胞的分选仪。 
本发明基于如下发现：一种用于对细胞进行分选和定向的流分选仪采具有入口、出口、中间检测带以及任选的分选区的流通道。入口接纳输入鞘液(sheath fluid)的交替间隔的流中的每一个以及在鞘流之间的包含待被分选的细胞的样品流。鞘流和样品流在流室中具有相应的流速率或压力，使得样品流被缩窄，从而在检测区中形成相对窄的样品流，由此细胞被定向在所选择的相对于输入光的方向上。采用多角度或K矢量成像设置的检测器被聚焦于检测带中，以便于区别期望细胞和非期望细胞。 
附图说明
图1是用于分选已染有荧光染料的细胞的步骤的流程图； 
图2是根据本发明的流装置或筒(cartridge)的透视示意性图示； 
图3是用于分选的单通道流装置的示意性图示； 
图4是用于分选的多通道流装置的侧视图； 
图4A是面向图4中所示的多通道系统的输入的俯视图(边视图)； 
图5是用于感测散射光的单通道传感器(即用于K矢量成像的光学系统)的示意性表示； 
图5A-5D图示了图5的布置中采用的可替选光学元件； 
图6是使用K矢量成像来检测荧光和散射光的单通道传感器的示意性表示； 
图7是利用散射光和荧光的激发和检测来进行K矢量成像的多通道通道装置。 
图8是调整用于分选细胞的通道或装置中的流速的外部激励器的示意性表示； 
图9是用于检测和分选细胞的多通道装置或筒的顶视图的示意性表示； 
图10A-10D示出了在M、W、F上使用三个激励器(图10A)，在S1、S2上使用两个激励器(图10B)，在S1上使用一个激励器(图10C)以及在M、F上使用两个激励器(图10D)来操纵细胞的各种可替选方式； 
图11A-11B示出了通过激光杀灭或激活(图11A)以及电杀灭或激活(图11B)来杀灭细胞的各种可替选方式。 
具体实施方式
图1图示了阐述用于特征化、分选并处理物体、特别是牛精子细胞以便低温保存的步骤的流程图。 
从收集100、延伸101到慢冷却102的第一阶段是各个工序的主题，这些工序中的一些是新颖的，而另一些是公知的。 
在提交于2005年2月1日的、标题为“Novel Method For In VivoStaining of Cells for Identification and Sorting”的未决美国专利申请序列号(待分配)中阐述了一种为了分选而对细胞进行准备的新颖系统，该申请的教导通过引用结合于此。 
所述步骤包括将样品装载到一次性片中200；过滤样品以去除大的粒料(aggregate material)如卵黄粒(yolk aggregate)201；采用如下文中阐述的基于流的对齐202；采用并行化的性别检测203、区别(即性别区别204)以及激励(即性别激励205)步骤；被动浓度平衡206，并递送到输出储器207。该方法还可以任选地省略某些步骤，而包括用于去除非期望的活精子的区别和杀灭步骤。 
包括上述内容的性别分选步骤103之后是：慢冷却到4℃并稳定104；最终延伸105；包装在茎管中106；稳定107和冷冻108步骤。 
图2-3以各种形式图示了根据本发明的流细胞仪300。该装置可以是单通道系统。然而，本发明也很适合于特别是必须在合理的时间量内分选大量精子细胞的精子细胞分选应用中的多通道应用。 
在图2-3中，装置300包括由一对相面对壁314和端壁316(图1中只示出其中的一个)、开放顶部或输入318以及开放底部或输出320构成的体或流室312。 
输入318分成三部分，包括外侧输入322以及中央或样品输入324。外侧输入322用于在其中接纳鞘液326，而中央输入324用于接纳样品流体328，样品流体328包含液体介质和分散于其中的细胞330。 
输出320具有外侧输出部分332以及中央样品收集通道，即左输出样品通道334L、中央输出样品通道334C和右输出样品通道334R。通道334L用于第一被分选样品，334C用于第二被分选样品，而334L用于又另一被分选样品。 
鞘液326以所选流速率在外侧输入322处输入。样本液326以所选择 的相对于鞘流速率或压力的流速率或压力在中央输入324中引入，使得鞘液将样品流压缩和缩窄为如所示的相对窄的样品流路径336。在示例性实施例中，样品流路径336的宽度是中央输入324处的样品流体的宽度的约10％或更小，例如约50微米。 
细胞330是圆形的，但是扁平的。因此，样品流体的缩窄导致细胞330对自身定向，使得其扁平面大致平行于相面对壁314。细胞所辐射的光的强度在不同取向是不同的。所以，为了比较两个或更多细胞的强度，它们必须具有相同的取向。这样，对齐的细胞降低了由具有随机取向的各向异性光发射器导致的噪声或系统误差。 
输入样品或物体溶液328和鞘液326(见图3)的交替输入进入系统，产生少量的缩窄(相对于正交方向上的缩窄)401，这导致切变，且切变流与细胞400对齐。此交替流模式在两个长输入鞘液流之间被更为严重地挤压，这实现了必要的对齐。在下文中，此布置可以与检测相结合来提供可探询多个流的并行系统。 
特定地，缩窄流将物体移入焦平面402，并加速运动穿过检测区403。系统中的曲线404示出液边界404，并且检测区405允许特征化。光锥406允许探询，并且可以在多个出口之间操纵缺省的流位置407。 
通过改变穿过三个输出通道409-411的流速率，溶液中的细胞或其它物体可以被分选到多个输出流中的一个中。激励可以以上面所列举的各种方式来完成。高速流切换可以由压电装置来执行，所述压电装置可以是机器所固有的或者是一次性流通道筒所固有的。流切换区408控制精密的流速率(其随时间变化)以在输出通道409-411之间切换(其中V2＜V1且V4～V2)。 
检测器340(图2)包括在处于输入和输出中间的检测带338中产生指向样品流路径336的输出束344的激光器342或其它适合的源。束344撞击检测带338中的细胞330并散射形成输出束346。该细胞包含荧光体并因此产生荧光，其同样被包含在输出束346中。输出束346的散射分量和荧光分量346S、346F被分别输入到包含光学系统348和电子检测器系统350的光检测器。该光学系统和电子检测器系统在下文中讨论。 
输出束346将信息运载到检测器340，检测器340区别细胞330并产生至分选仪356的输出354。分选仪356控制与输出通道334成可工作关系的驱动器358，以便改变相对流速率，使得每个细胞330被分选入适当 的通道。可替选地，可以按照想要或不想要来分选细胞，且可以收集想要的细胞，而可以破坏不想要的细胞。 
图3示出了仅具有两个鞘流326和一个样品流328的单通道系统。图4示出了具有4个样品流328和共享的鞘流326的多通道系统。图4A示出了流室和流路径的俯视图。 
图4-4A示出了将设计并行化为具有输入溶液的许多并行流500的一种可能方式。流可以在该平面和该平面的法向上缩窄。然而，对于细胞的对齐为必需的情况，如对于牛精子，沿入射光方向的切变必须大得多，以保证垂直于入射光的对齐。光学探查区502是激光散射和荧光发生的地方。 
在该实例中，每个鞘具有专用的透镜系统，多个PMT元件中的每一个被专用于对应的流。应理解，系统同样可以针对所有通道使用一个透镜检测器系统以及针对所有通道使用一个激光光学器件系统。针对每个流存在多个可能的输出通道503。 
图5示出了检测器640的光学系统的简化平面图。样品660处于物平面662上。在此图示中，输出束或光线646以小束646C、646L、646R从样品660发出。小束646C代表中心光轴C附近的群集在中心的束；而小束646L和646R群集在中心轴C的左方和右方。小束提供样品660的不同视图。收集透镜664(其可以是显微镜的物镜)被定位于距物平面662的一距离处，该距离等于透镜的有效焦距(EFL)。如果期望，透镜664可以是复合透镜，但为了简单起见，将其描述为具有EFL的单透镜。通过这样定位透镜664，来自物体的光646离开收集透镜664，被准直为小束666，小束666类似地分为如所示的666R、666C、666L。这产生了成像系统中的无限空间。尽管本发明不需要此无限空间，但它是方便的布置。每个准直光线的横向定位主要由其从物平面出射的角度来确定。小束666L、666R和666C分别跟随642L、642R和642C。 
中心光小束666C沿中心轴C离开透镜664到聚焦透镜676C，聚焦透镜676C将光聚焦在前像平面680C上。反射镜672L、672R使离开收集透镜664的离轴小束666L和666R分开。注意这还可以通过在此区中放置与此空间中的束尺寸相比较小的光纤674B(图5B)或检测器674A(图5A)来完成。还注意，附加光学元件如附加透镜674C(图5C)或针孔674D(图5D)可以被插入此空间中，以限制从收集透镜664出射的光的角度范围，或者控制(限制或扩展)如在共焦显微术测量中收集光 的焦距。在某些情况下，可以使用一对具有针孔的附加透镜。在其它情况下，可以使用具有可控尺寸、形状或位置的遮光板来控制到达给定检测器的光。 
来自小束666L的光被反射镜672L偏转到左聚焦透镜676L；而来自小束666R的光被反射镜672R引导到透镜676R和右像平面678R。光检测器680L、680R和680C可以定位于相应的像焦平面670L、670R和670C上，以检测相应的像。这些光检测器可以是CCD、光电二极管、光电倍增管、多阳极光电倍增管或其它传感器。 
在许多情况下，理想的是，收集散射光和荧光二者，其中，所作出的像或检测中的至少一个需要从样品发出的光线角度的范围被减小。图6图示了这可以怎样使用如上所述的K矢量成像设置、但必要时利用滤光器和附加的分束器来完成。类似的元件具有相同的标号。 
在图6中，照明和激发光800穿过收集透镜801，并分别被反射镜802、803反射，穿过发射滤光器688EL、688ER到聚焦透镜804、805并到形成左和右荧光像平面的光检测器690L、690R。 
分束器686C将中心场666C中的光重引导穿过发射滤光器688E到聚焦透镜676FC。发射滤光器688E的输出689E对应于来自细胞的荧光发射。中心光轴上的激光线滤器688L使到透镜676C和光检测器690C的散射激光滤过，在光检测器690C处形成前散射像平面。 
为了改进装置的吞吐量和总体能力，需要进行并行化。图7示出了这是如何完成的。激光器642产生输入激光束644(其激发荧光)，被分束器690(例如衍射光栅或全息图)分解成N个(多个)束。束692A和692N散开，并且每个被引导到对应样品鞘(见图4)的检测带。小束692A-692N被准直透镜694准直成平行束。准直透镜694的输出696被引导穿过柱透镜698，柱透镜698将各个束700A-700N聚焦到物平面701上的样品流上。如所示的那样(图4)，输入流被分解成许多流。来自样品流和所示实例中的一个或所有小束700A-700N的光进入收集透镜702K，并如上面在图6中所描绘的那样处理。然而，这里使用检测器阵列装置(如多阳极PMT)装置720(720C、720R、720L、720CF......)(针对每组检测束使用一个)。检测不是通过在每个成像位置放置单检测器、而是通过使用阵列检测器如32元件线性PMT阵列720来最好地完成的。 
对许多物体进行测量或成像的系统的吞吐量将部分地依赖于检测器 数目和它们的速度。对于许多应用来说，在每个像平面上使用单检测器如光电倍增管(PMT)。这适合于物体以一列(single-file line)穿过物平面的情况。 
下文中对分选仪856进行详细描述。单通道分选仪在图8中示出。分选仪856包括：结构构件812；由限定流通道820的槽818形成的通道限定层816；在通道限定层816顶上的挠性膜层822；以及完成该布置的结构构件824。压电的或另一类型的激励器826被耦合到控制器828。由激励器826驱动的活塞860与对着流通道820的挠性膜822接合，以根据到压电装置的电压供给来改变通道内的流模式。多个这样的结构可以被小型化，以便定位于激励器窗口中，由此可以分选多个样品流。 
一个或多个激励器826可以包括：压电变送器(piezo-electrictransducer)，用于将电信号转换成流速率的机械激励；热加热器，用于加热一个区以使流体、材料或泡快速膨胀；热泡生成，用于产生泡以减小溶液的流量；用于膜的电容性运动装置；光学装置，用于加热或移动材料、壁、膜、泡或其它材料或物体，以影响进入一个或多个输出通道934的流速。该激励可以是该装置所固有的或者可以外部施加。例如，激励器826和活塞860可以是与一次性流装置856(即具有非一次性/外部激励器的一次性片)分开的外部设备。 
图9图示了多通道的并行布置，其中输入通道900将鞘流馈送到流通道，并且输出通道901接纳各种被分选的精子细胞。窗口930被提供用于将探询光耦合到每个并行检测器样品通道。分选仪窗口932接纳多个激励器和一次性分选仪元件。装置100的片配准销以940标出。 
图10A-10R图示了在用于分选精子的流装置中采用各种激励器934来操纵细胞的可替选实施例。在每种情况下，使用一个或多个激励器，其中每个激励器可以基于压电装置(筒所固有的或外在的)、电容性激励器、热膨胀或现有公开中描述的其它技术。在大多数情况下，需要至少两个激励器934，且可能多于两个激励器，以控制特定细胞或物体进入哪个出口通道936。所述激励器允许控制和改变非常高速率的流。为使得流暂时地从一个出口移动到另一出口，只需要对流进行小的扰动。 
图11A-11B示出了不进行分选以便实现期望结果的杀灭或激活设置的实例。在图11A中，激光940碰撞物体/精子流942。此激光被控制为根据探询结果只将致命能量碰撞在特定精子或物体上。例如，此激光可以按需要杀灭特定的精子或其它细胞。例如，其可以杀灭给定或不确定性别 的所有精子。可替选地，该激光可以不直接杀灭细胞，而是可以“激活”它们。例如，其可以激活先前已引入到精子中的某化学物质，从而具有杀灭它们或损害受精的总体效果。在更为一般的应用中，激活可具有大得多的活性范围。 
图11B示出了使用通过电极944引入的致命电脉冲的杀灭或激活，其中电极944被插入流中以便位置上接近中央流942。与激光方案一样，电极可以根据探询结果来被快速脉冲接通或关断。 
操纵还可以光学地实现，其中细胞由光学捕获设备操纵。可替选地，激励过程可以是细胞的电穿孔，其可以是致命的或者对细胞产生其它影响。 
下面的技术使用挤压流来对齐精子细胞： 
使用蠕动泵(peristaltic pump)将三个流馈送到流片中。每个流被保持在层流状态(laminar regime)，以使得每个流彼此不混合。包含精子的流在为水的顶部和底部流之间流动。当通过改变顶部和底部流的速度与精子流的速度的比率而使顶部和底部流的速度保持相同时，我们可以看到精子流的挤压。 
Figure DEST_PATH_GSB00000133441400081
预期被挤压的流有助于精子被定向于流方向。 
流中的精子的像使用配备在我们的显微镜上的CCD相机来拍摄。 
上面的表格示出了流中的精子取向的度数，其中Re为雷诺数，其被定义为Dur/m，其中D为流通道的直径，U为速度，r为流体密度，m为粘滞度。 
Re指示流是否是层流的。尽管小于1000的Re被视为层流，但在某些应用中，需要很小的Re，如小于1。 
随着精子流的速度的增大，通道入口中的Re增大，但仍保持在层流区中，从而表明在我们的实验区中，流未被扰乱。 
通过根据精子头与流方向的度数对齐对精子进行编号，精子的取向被量化。 
在实验范围内，所成像的精子的约80％被定向为与流方向成小于15度。 
在较高速度处表现出与流方向较好的对齐，但是也发现了较多被扰乱的精子。 
结果表明，系统可以使用这种技术来对齐精子。 
应理解，可以使用鞘液和样品流体的温度控制来延长精子寿命。在示例性实施例中，流装置中的流体的温度可以维持在2-10℃左右，以便使精子细胞固定不动，从而延长其寿命。 

Claims (17)

1.一种用于对细胞进行分选和定向的流装置设备，包括：
相面对的一对壁，其形成具有形成流通道的入口、下游出口和中间检测器区的流室，所述入口用于接纳输入鞘液的第一和第二间隔开的鞘流以及在所述第一和第二鞘流之间的包含待被分选的细胞的样品流体的第三流，所述第一和第二鞘流在所述流室中具有相应的相对于所述第三流的流速率或压力的流速率或压力，使得所述第三流在其间被缩窄，从而至少在检测区中形成相对窄的样品流，由此所述细胞被定向在所选择的相对于所述壁的方向上；
位于所述检测器区中的检测器，所述检测器包括利用输入光来光照所述检测区中的所述细胞的光源，所述细胞响应于所述输入光而产生输出光，所述检测器包括响应于由所述细胞产生的光的光检测器，所述检测器检测期望细胞并产生指示该期望细胞的输出，所述输出光包括从所述细胞散射的光和由所述细胞产生的荧光中的至少一种；以及
用于从样品流中分选由所述检测器检测到的所述期望细胞的分选仪。
2.如权利要求1所述的设备，其中所述分选仪位于所述检测器的下游，用于从所述样品流中分选所述期望细胞。
3.如权利要求2所述的设备，其中所述分选仪包括由第一和第二间隔开的区形成的、在所述检测器下游的所述室的一部分，所述第一和第二间隔开的区中的至少一个接纳所述期望细胞。
4.如权利要求3所述的设备，其中所述分选仪包括响应于所述检测器、用于选择性地向一个或多个区施加压力以便操纵所述期望细胞进入第一区而非期望细胞进入第二区的压力变送器。
5.如权利要求1所述的设备，其中所述壁包括平面构件。
6.如权利要求1所述的设备，其中所述第一和第二鞘流包括液体介质，而所述第三流包括其中悬浮着细胞或颗粒的液体介质。
7.如权利要求6所述的设备，其中所述第一和第二鞘流相对于所述第三流的流速率或压力至少在所述检测区中将所述第三流缩窄，使得其宽度是所述第一和第二鞘流的宽度的约10％或更小，从而将进入所述检测区的细胞定向在彼此大致平行并且与所述壁大致平行的方向上。
8.如权利要求7所述的设备，其中所述检测区包括用于对输入光信号进行聚焦的相对窄的区。
9.如权利要求1所述的设备，其中所述出口由第一和第二间隔开的区构成，所述第一区用于接纳期望细胞，而所述第二区用于接纳非期望细胞。
10.如权利要求1所述的设备，其中所述检测器包括用于接收来自所述细胞的输出光的光具组，所述光具组包括用于收集所述输出光并产生所述输出光的经收集的光小束的第一光学元件，所述小束表示根据所述细胞与所述输入光的相互作用而产生的所述细胞的各种角度的像。
11.如权利要求10所述的设备，其中所述检测器还包括用于检测与所述光具组的中心光轴对齐的轴上小束的、与所述中心光轴对齐的光检测器。
12.如权利要求11所述的设备，其中所述检测器还包括用于检测具有从所述中心光轴离轴而定向的光路径的离轴小束的、具有对应的离轴光路径的至少一个离轴光检测器。
13.如权利要求11所述的设备，还包括将所选择的小束从所述收集的光小束引导到对应的离轴检测器的、在至少一个离轴光检测器的光路径中的分光器。
14.如权利要求11所述的设备，其中所述收集的光小束包括散射光和荧光，并且所述检测器还包括用于使来自所述收集的光小束的所述散射光和所述荧光中的至少一种滤过的滤光器。
15.如权利要求1所述的设备，其中所述分选仪包括用于每种类型的细胞的通道以及耦合到所述流通道的驱动构件，所述驱动构件用于修改所述样品流中所选位置的流体流动速率，以便操纵所述细胞到所述通道中所选的一个。
16.如权利要求15所述的设备，其中所述驱动构件包括用于改变施加于流通道的压力的压力变送器。
17.如权利要求15所述的设备，其中所述驱动构件包括压电变送器、热加热单元、电容性膜和光加热器中的至少一种。
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