CN101233147A

CN101233147A - 丙型肝炎病毒的大环抑制剂

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Publication number: CN101233147A
Application number: CNA2006800275421A
Authority: CN
Inventors: H·A·德科克; P·J·-M·B·拉博伊森; K·A·西门; M·S·林德斯特龙; P·C·卡恩伯格; D·安托诺夫; K·M·尼尔森; B·B·萨穆尔森; A·A·K·罗森奎斯特
Original assignee: Tibotec BVBA; Medivir AB
Current assignee: Janssen R&D Ireland ULC; Medivir AB
Priority date: 2005-07-29
Filing date: 2006-07-28
Publication date: 2008-07-30
Anticipated expiration: 2026-07-28
Also published as: RS51776B; NO20081074L; US20080200503A1; CA2616954A1; CY1112001T1; HRP20110289T1; PT1913014E; DE602006019879D1; DK1913014T3; GT200600340A; BRPI0614515A2; US8008251B2; ME01233B; HK1116503A1; TWI437993B; CA2616954C; KR101321392B1; EP1913014B1; MY139987A; ATE496934T1

Abstract

式(I)的HCV抑制剂，及其N－氧化物、盐和立体异构形式，其中虚线代表原子C7与C8之间的任选双键；R¹是氢或C_1－6烷基；R²是氢或C_1－6烷基；且n是3、4、5或6；包含化合物(I)的药物组合物，以及制备化合物(I)的方法。还提供了式(I)的HCV抑制剂与利托那韦的生物可利用的组合。

Description

丙型肝炎病毒的大环抑制剂

本发明涉及对于丙型肝炎病毒(hepatitis C virus)(HCV)的复制具有抑制活性的大环化合物。本发明还涉及包含这些化合物作为活性组分的组合物，以及制备这些化合物和组合物的方法。

在世界范围内，丙型肝炎病毒是慢性肝病的主要原因，并且已成为大量医疗研究的焦点。HCV是肝炎病毒属(hepacivirus)中的黄病毒科(Flaviviridae)的一员，与黄病毒属(flavivirus)关系密切，黄病毒属包括与人类疾病相关的多种病毒，例如登革热病毒和黄热病病毒，其与动物瘟病毒属(pestivirus)家族也很相近，瘟病毒属包括牛病毒性腹泻病毒(BVDV)。HCV是正义单链RNA病毒，具有大约9,600个碱基的基因组。该基因组包括5’和3’端未翻译区，其采用RNA二级结构和中央开放读框，所述中央开放读框编码一个具有大约3,010-3,030个氨基酸的多蛋白。该多蛋白编码十种基因产物，所述基因产物是通过协调结合系列的共翻译和翻译后内切蛋白酶解切割从前体多蛋白产生的，所述切割是由宿主和病毒蛋白酶所介导的。病毒结构蛋白包括核壳蛋白和两个包被糖蛋白E1和E2。非-结构(NS)蛋白编码一些必需病毒酶功能(解旋酶、聚合酶、蛋白酶)，以及具有未知功能的蛋白。病毒基因组的复制通过由非结构蛋白5b(NS5B)编码的RNA-依赖性RNA聚合酶介导。除了聚合酶以外，在双功能NS3蛋白中编码的病毒解旋酶功能和蛋白酶功能也已经显示出是HCV RNA复制所必需的。除了NS3丝氨酸蛋白酶，HCV还在NS2区域编码金属蛋白酶。

初始急性感染之后，大部分感染的个体发展成肝炎，因为HCV优先在肝细胞中复制，但不是直接细胞病变的。特别是，缺少强有力的T-淋巴细胞反应以及病毒对于突变的高倾向性，似乎促进了高比例的慢性感染。慢性肝炎可发展成肝纤维变性，导致肝硬化、晚期肝病和HCC(肝细胞癌)，从而使其成为肝移植的主要原因。

存在6个主要的HCV基因型以及50个以上的亚型，它们在地理上的分布不同。1型HCV是欧洲和美国主要的基因型。HCV的广泛遗传异质性具有重要的诊断和临床含义，也许解释了在疫苗开发和缺少治疗应答方面的困难。

HCV可通过接触被污染的血液或血液制品进行传播，例如在输血或者静脉内使用药物后。在血液筛查中使用的诊断试验的引入降低了输血后HCV的发病率。然而，鉴于对晚期肝病的缓慢进展，现存的感染在未来的数十年内仍将继续带来严重的医疗和经济负担。

目前HCV的治疗是基于(聚乙二醇化的(pegylated))α-干扰素(IFN-α)和利巴韦林的联合治疗。这种组合疗法在感染了基因型1病毒的患者中产生了超过40％的持续病毒学应答，在感染了基因型2和3病毒的患者中产生了大约80％的病毒学应答。除了对于1型HCV的有限效力，该组合疗法还具有显著的副作用，并且在很多患者中具有很差的耐受性。主要副作用包括流感样症状、血液异常和神经精神病症状。因此需要更有效、更方便和更好耐受性的疗法。

最近，两种肽模拟HCV蛋白酶抑制剂已经作为临床候选对象而引起了注意，即公开在WO00/59929中的BILN-2061和公开在WO03/87092中的VX-950。在学术和专利文献中已经公开了多种类似的HCV蛋白酶抑制剂。现已很明显，持续给予BILN-2061或VX-950选择了对于各自药物具有抗药性的HCV突变体，所谓的药物逃逸突变体。这些药物突变体在HCV蛋白酶基因组中具有特征性突变，尤其是D168V、D168A和/或A156S。因此，需要具有不同抗病毒模式的另外的药物来给治疗失败的患者提供治疗选择，并且具有多种药物的组合治疗在将来有可能成为标准，甚至是对于一线治疗。

用HIV药物和HIV蛋白酶抑制剂进行的实验已进一步表明，亚最佳药动学和复杂给药方案迅速导致非故意配合性失败。这是指，在HIV治疗方案中，对于各自的药物，24小时直达浓度(24 hour troughconcentration)(最小血浆浓度)经常落入有关该天大部分时间的IC₉₀或ED₉₀阈值之下。据考虑，至少IC的24小时直达水平，并且更现实地，IC₉₀或ED₉₀是减慢药物逃逸突变体发展所必需的。获得必需的药动学以及药物代谢以达到这样的直达水平对于药物设计提供了严格挑战。具有多个肽键的现有技术HCV蛋白酶抑制剂的强肽模拟性质给有效给药方案带来了药动学障碍。

需要这样的HCV抑制剂，其可以克服目前HCV治疗的缺点，例如副作用、有限的效力、出现抗药性以及配合性不好。

本发明涉及HCV抑制剂，所述抑制剂在一个或多个下列药理相关性质方面是优良的，即效力、降低的细胞毒性、改善的药动学性质、改善的抗药性、可接受的剂量以及给药负担(pill burden)。

本发明涉及可由式(I)代表的HCV复制抑制剂：

及其N-氧化物、盐和立体异构形式，其中

虚线代表原子C7与C8之间的任选双键；

R¹是氢或C_1-6烷基；

R²是氢或C_1-6烷基；且

n是3、4、5或6。

本发明涉及HCV复制抑制剂的两个亚组，其可由式(I-a)和(I-b)代表：

及其N-氧化物、盐和立体异构形式，其中

R¹、R²和n如本文所定义。

本发明还涉及制备式(I)化合物、其N-氧化物、加成盐、季胺、金属络合物以及立体化学异构形式的方法，其中间体，以及中间体在制备式(I)化合物中的应用。

本发明涉及用作药物的式(I)化合物本身、其N-氧化物、加成盐、季胺、金属络合物以及立体化学异构形式。本发明还涉及药物组合物，其含有载体和抗病毒有效量的本文说明的式(I)化合物。药物组合物可含有上述化合物与其它抗HCV药物的组合。本发明还涉及用于向患有HCV感染的个体给药上述药物组合物。

本发明涉及式(I)化合物、其N-氧化物、加成盐、季胺、金属络合物或立体化学异构形式在制备用于抑制HCV复制的药物中的应用。或者，本发明涉及在温血动物中抑制HCV复制的方法，所述方法包括施用式(I)化合物、其N-氧化物、加成盐、季胺、金属络合物或立体化学异构形式。

除非另有说明，如在上下文中使用的，应用下列定义。

作为基团或基团一部分的本文所用“C_1-6烷基”定义为具有1-6个碳原子的直链或支链饱和烃基，例如甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、1-丁基、2-丁基、2-甲基-1-丙基、1-戊基、2-戊基、3-戊基、1-己基、2-己基、2-甲基-1-丁基、2-甲基-1-戊基、2-乙基-1-丁基、3-甲基-2-戊基等。优选的C_1-6烷基是C_1-4烷基。

当在下文中使用时，术语“式(I)化合物”或“本发明化合物”或类似术语意欲包括式(I)化合物、其前药、N-氧化物、加成盐、季胺、金属络合物以及立体化学异构形式。一个实施方案包括式(I)化合物或本文中说明的式(I)化合物的任何亚组，及其N-氧化物、盐和可能的立体异构体形式。另一个实施方案包括式(I)化合物或本文中说明的式(I)化合物的任何亚组及其盐和可能的立体异构体形式。

式(I)化合物具有几个手性中心，并且以立体化学异构形式存在。本文所用术语“立体化学异构体形式”被定义为式(I)化合物可以具有的，由相同的原子通过相同的键合顺序组成但具有不同的三维结构且不可以互换的所有可能的化合物。

在提到其中使用(R)或(S)来指定取代基内手性原子的绝对构型的情况下，在进行指定来考虑整个化合物而不是孤立的取代基。

除非有其他描述或指示，一个化合物的化学命名包括所述化合物可具有的所有可能的立体异构形式的混合物。所述混合物可包括所述化合物基本分子结构的所有非对映体和/或对映体。无论是纯的形式还是彼此的混合物，本发明化合物的所有立体异构形式均包括在本发明的范围内。

本文所述的化合物及中间体的纯立体异构体形式定义为基本上不含有所述化合物或中间体的相同基本分子结构的其他对映体或非对映体形式的异构体。特别是，术语“立体异构体纯”是指立体异构过量为至少80％(即一种异构体至少为90％，而其它可能的异构体最多为10％)至立体异构过量为100％(即一种异构体为100％，而没有其它异构体)的化合物或中间体；更特别地，为立体异构过量90％至100％的化合物或中间体；更特别地为立体异构过量94％至100％的化合物或中间体；最特别地，为立体异构过量97％至100％的化合物或中间体。术语“对映体纯”和“非对映体纯”应当理解为相似的含义，不过应当分别表示为所述混合物中对映体过量和非对映体过量。

本发明化合物和中间体的纯立体异构体可通过应用现有技术已知的方法获得。例如，可以通过用旋光性酸或碱选择性地结晶其非对映体盐来分离出对映体。所述旋光性酸或碱的实例是酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、二甲苯甲酰基酒石酸和樟脑磺酸。或者，可利用手性固定相通过色谱技术来分离对映体。所述纯立体异构体形式还可以衍生自适当起始原料的相应纯立体异构体形式，条件是反应以立体特异性方式发生。优选地，如果特异性的立体异构体是希望的，所述化合物可通过立体特异性制备方法来合成得到。这些方法将有利地使用对映体纯的起始原料。

式(I)化合物的非对映体的外消旋体可通过常规方法获得。可以方便地应用的适当的物理分离方法是例如选择性结晶和色谱法，例如柱色谱法。

对于某些式(I)化合物、其N-氧化物、盐、溶剂化物、季胺或金属络合物以及用于其制备的中间体，没有通过实验确定绝对立体化学构型。本领域技术人员能够使用本领域已知的方法例如X-射线衍射方法来确定这样的化合物的绝对构型。

本发明还包括存在于本发明化合物上的原子的所有同位素。同位素包括具有相同原子序数但不同质量数的那些原子。举一个常规性的例子但不限于此，氢的同位素包括氚和氘。碳的同位素包括C-13和C-14。

本文中使用的术语“前药”是指药理学可接受的衍生物，例如酯、酰胺和磷酸酯，使得所得的这种衍生物在体内的生物转化产物是在本发明式(I)化合物中定义的活性药物。一般性地描述了前药的Goodman andGilman(The Pharmacological Basis of Therapeutics，8^th ed，McGraw-Hill，Int.Ed.1992，“Biotransformation of Drugs”，p13-15)所著的参考文献在此引用作为参考。前药优选具有优良的水溶解度，提高的生物利用度，并且易于在体内代谢成活性抑制剂。本发明化合物的前药是通过修饰化合物的官能团而制备得到的，修饰物可通过常规手段或者在体内裂解为母化合物。

优选的是可药用酯前药，其在体内可水解，并且衍生自具有羟基或羧基的式(I)化合物。体内可水解的酯这样的酯，其在人或动物体内水解，生成母酸或醇。对于羧基，合适的可药用酯包括C_1-6烷氧基甲基酯，例如甲氧基甲基酯，C_1-6链烷酰基氧基甲基酯，例如新戊酰基氧基甲基酯，2-苯并[c]呋喃酮基酯，C_3-8环烷氧基羰基氧基C_1-6烷基酯，例如1-环己基羰基氧基乙基酯；1，3-二氧杂环戊烯-2-酮基甲基酯，例如5-甲基-1，3-二氧杂环戊烯-2-酮基甲基酯；和C_1-6烷氧基羰基氧基乙基酯，例如1-甲氧基羰基氧基乙基酯，其可以在本发明化合物中的任何羧基上形成。

含有羟基的式(I)化合物的体内可水解酯包括无机酯，例如磷酸酯，和α-酰氧基烷基醚以及相关化合物，作为体内水解的结果，该酯裂解，生成母羟基。α-酰氧基烷基醚的实例包括乙酰氧基甲氧基醚和2，2-二甲基丙酰氧基-甲氧基醚。对于羟基，体内可水解酯形成基团的选择包括链烷酰基、苯甲酰基、苯基乙酰基和取代的苯甲酰基和苯基乙酰基、烷氧基羰基(以生成烷基碳酸酯)、二烷基氨基甲酰基和N-(二烷基氨基乙基)-N-烷基氨基甲酰基(以生成氨基甲酸酯)、二烷基氨基乙酰基和羧基乙酰基。苯甲酰基上的取代基的实例包括从环氮原子上经由亚甲基连接到苯甲酰基环的3-或4-位上的吗啉代和哌嗪子基。

对于治疗用途，式(I)化合物的盐是其中抗衡离子可药用的那些。然而，不可药用的酸和碱的盐也可以应用，例如，用于制备或纯化本发明可药用化合物。所有的盐，无论是可药用的还是不可药用的，都包括在本发明范围内。

上文提及的可药用酸和碱加成盐包括式(I)化合物能够形成的有治疗活性的无毒的酸和碱加成盐。可药用酸加成盐可以通过用合适的酸处理碱形式来方便地获得。合适的酸包括例如无机酸，如氢卤酸，例如盐酸或氢溴酸，硫酸，硝酸，磷酸等；或者有机酸例如乙酸、丙酸、羟乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸(乙二酸)、丙二酸、琥珀酸(即丁二酸)、马来酸、富马酸、苹果酸(即羟基丁二酸)、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环拉酸、水杨酸、对氨基水杨酸、双羟萘酸等。

反之，所述盐形式可以通过用合适的碱处理而转化成游离碱形式。

包含酸质子的式(I)化合物经由适当的有机或无机碱处理，还可以转换成其无毒金属或胺加成碱盐形式。适当的碱盐形式包括，例如铵盐，碱和碱土金属盐例如锂、钠、钾、镁、钙盐等，与有机碱例如苄星青霉素、N-甲基-D-葡萄糖胺、海巴明形成的盐，以及与氨基酸例如精氨酸、赖氨酸形成的盐等等。

术语加成盐还包括式(I)化合物及其盐能够形成的溶剂化物。这样的溶剂化物是例如水合物、醇化物等等。

上文中使用的术语“季胺”是定义式(I)化合物能够形成的季铵盐，是通过式(I)化合物的碱性氮与合适的季铵化剂的反应而形成的，所述季铵化剂是例如任选取代的烷基卤、芳基卤或芳基烷基卤，例如甲基碘或苄基碘。还可以使用具有良好离去基团的其他试剂，例如三氟甲磺酸烷基酯，甲磺酸烷基酯，和对甲苯磺酸烷基酯。季胺具有带正电荷的氮。可药用抗衡离子包括氯、溴、碘、三氟乙酸根和乙酸根。选择的抗衡离子可使用离子交换树脂来引入。

本发明化合物的N-氧化物形式包括式(I)化合物，其中一个或多个氮原子被氧化成所谓的N-氧化物。

应当理解，式(I)化合物可具有金属结合、螯合、络合物形成性质，因此可以作为金属络合物或金属螯合物存在。式(I)化合物的这样的金属衍生物包括在本发明范围内。

某些式(I)化合物还可以以其互变异构体形式存在。虽然在上面的结构式中没有明显指出这样的形式，但是其也包括在本发明范围内。

如上所述，式(I)化合物具有几个不对称中心。为了更有效地指出这些不对称中心中的每一个，使用如在下面的结构式中给出的编号系统。

不对称中心存在于大环的1、4和6位，以及在吡咯烷环的3’碳原子上。这些不对称中心的每一个都可以以R或S构型存在。

在1位的立体化学优选与L-氨基酸构型的立体化学，即L-脯氨酸的立体化学相对应。

式(I)化合物包括如在下面结构片段中显示的环丙基：

其中C₇代表在7位的碳，并且在4位和6位的碳是环丙烷环的不对称碳原子。

尽管本发明化合物的其他部分上有其他可能的不对称中心，存在这两个不对称中心意味着化合物可以作为非对映体混合物存在，例如作为式(I)化合物的非对映体的混合物存在，其中在7位的碳与羰基是顺式，或者与酰胺是顺式，如下所示。

C7与羰基呈顺式 C7与酰胺呈顺式

一个实施方案涉及式(I)化合物，其中7-位碳与羰基呈顺式构型。另一个实施方案涉及式(I)化合物，其中在4-位碳上的构型为R。式(I)化合物的一个具体亚组是这样的化合物，其中7-位碳与羰基呈顺式构型，并且其中在4-位碳上的构型为R。

式(I)化合物还包括脯氨酸残余物。优选的是这样的式(I)化合物，其中在1(或5’)位的取代基与在3’位的取代基呈反式构型。值得特别关注的是式(I)化合物，其中1位具有与L-脯氨酸相一致的构型，并且在3位的取代基与1位呈反式构型。优选地，式(I)化合物具有如下所示的式(I-c)结构所显示的立体化学：

优选地，在式(I)化合物、(I-c)或式(I)化合物的任何亚组中，在碳原子7与8之间的虚线是双键。更优选地，所述在碳原子7与8之间的双键是顺式构型。

应当理解，上面定义的式(I-b)化合物的亚组以及本文所定义的任何其他亚组，还包括这样的化合物的任何N-氧化物、加成盐、季胺、金属络合物和立体化学异构体形式。

当n是2时，通过“n”加括号的部分-CH₂-与式(I)化合物或式(I)化合物的任何亚组中的乙二基相对应。当n是3时，通过“n”加括号的部分-CH₂-与式(I)化合物或式(I)化合物的任何亚组中的丙二基相对应。当n是4时，通过“n”加括号的部分-CH₂-与式(I)化合物或式(I)化合物的任何亚组中的丁二基相对应。当n是5时，通过“n”加括号的部分-CH₂-与式(I)化合物或式(I)化合物的任何亚组中的戊二基相对应。当n是6时，通过“n”加括号的部分-CH₂-与式(I)化合物或式(I)化合物的任何亚组中的己二基相对应。式(I)化合物的特别亚组是其中n为4或5的那些化合物。

本发明的优选实施方案是式(I)化合物或式(I)化合物的任何亚组，其中R¹是氢或甲基。

本发明的实施方案是式(I)化合物或式(I)化合物的任何亚组，其中R²是氢或C_1-4烷基，即甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基或异丁基。

本发明化合物的一个亚组是式(I)化合物或式(I)化合物的任何亚组，其中R²是氢。

本发明化合物的另一个亚组是式(I)化合物或式(I)化合物的任何亚组，其中R²是甲基。

式(I)化合物由3个主要构件P1、P2和P3构成，每个构件通过弯曲的正弦样线划界。构件P1还含有P1’尾端基。用星号标记的羰基可以是构件P2或构件P3的一部分。构件P1与P2、P2与P3以及P1与P1’的连接涉及形成酰胺键。构件P1与P3的连接涉及形成双键。构件P1、P1’、P2和P3的连接以制备式(I)化合物可以以任何给定的顺序进行。最后一个步骤涉及环合，由此形成大环。

下文描述的合成方法意味着可适用于外消旋体、立体化学纯中间体或作为任何立体异构体混合物的终产物。外消旋体或立体化学混合物可在合成方法的任何阶段分离成立体异构体形式。在一个实施方案中，中间体和终产物具有在如上式(I-c)化合物中具体说明的立体化学。

在一个实施方案中，化合物(I)通过首先形成酰胺键，随后形成在P3和P1之间的双键连接，并伴随环化成大环来制备。

在优选的实施方案中，其中C₇和C₈之间的键是双键的式(I)化合物(其是如上所定义的式(I-a)化合物)可如以下反应方案所示来制备：

大环的形成可在合适的金属催化剂，例如由Miller，S.J.Blackwell，H.E.Grubbs，R.H.J.Am.Chem.Soc.118，(1996)，9606-9614；Kingsbury，J.S.Harrity，J.P.A.Bonitatebus，P.J.Hoveyda，A.H.J.Am.Chem.Soc.121，(1999)，791-799；and Huang等人，J.Am.Chem.Soc.121，(1999)，2674-2678报道的基于Ru的催化剂，例如Hoveyda-Grubbs催化剂存在下经烯烃复分解反应来进行。

可使用空气稳定的Ru催化剂，例如氯化二(三环己基膦)-3-苯基-1H-茚-1-亚基钌(Neolyst M1^)或二氯化二(三环己基膦)[(苯硫基)亚甲基]钌(IV)。可使用的其它催化剂是Grubbs第一和第二代催化剂，即分别亚苄基-二(三环己基膦)二氯化钌和(1，3-二-(2，4，6-三甲基苯基)-2-亚咪唑烷基)二氯化(苯基亚甲基)-(三环己基膦)钌。值得特别关注的是Hoveyda-Grubbs第一代和第二代催化剂，它们分别是二氯化(邻异丙氧基苯基亚甲基)(三环己基膦)-钌(II)和1，3-二-(2，4，6-三甲基苯基)-2-亚咪唑烷基)二氯化(邻异丙氧基苯基亚甲基)钌。含有其他过渡金属例如Mo的其他催化剂也可用于该反应。

复分解反应可在合适的溶剂中进行，所述溶剂是例如醚，例如THF、二氧杂环己烷；卤代烃，例如二氯甲烷、CHCl₃、1，2-二氯乙烷等。在优选的实施方案中，复分解反应在甲苯中进行。这些反应在氮气氛下于高温下进行。

其中大环中C7和C8之间的连接是单键的式(I)化合物，即式(I-b)化合物，可通过将在式(I-a)化合物中的C7-C8双键还原而由式(I-a)化合物制备。还原可用氢气在贵金属催化剂，例如Pt、Pd、Rh、Ru或阮内镍存在下通过催化氢化进行。值得关注的是以氧化铝为载体的Rh。氢化反应优选在溶剂，例如醇如甲醇、乙醇，或醚例如THF或其混合物中进行，也可在这些溶剂或溶剂混合物中加入水。

可以在合成的任何阶段，即在环合之前或之后，或者在环合与如上所述的还原之前或者之后，将尾端基P1’与P1构件连接。可通过在两个部分之间形成酰胺键而将P1’与P1连接。在一个实施方案中，如下面的反应方案所述，在合成化合物(I)的最后一个步骤引入P1’基团，其中G代表基团：

在该方法中，通过酰胺形成反应，例如下文描述的用于形成酰胺键的任何方法，将环丙基磺酰胺(IV)与中间体(III)反应。特别是，可将(III)用偶联剂例如N，N’-羰基二咪唑(CDI)、EEDQ、IIDQ、EDCI或苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷子基六氟磷酸盐(作为PyBOP商购获得)在溶剂例如THF中处理，然后与所需环丙基磺酰胺(IV)在碱例如三烷基胺如三乙胺或二异丙基乙胺，或1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)或二异丙基乙胺存在下反应。

如上面的反应中描述的(III)中的羧酸的活化可以导致内环合反应，生成下式的氮杂内酯

其中R¹和n如上面所定义，并且其中立体中心可具有如上面所指出的立体化学构型，例如在(I-c)中所指出的。可以使用常规方法从反应混合物中分离出中间体(III-a)，然后将分离的中间体(III-a)与(IV)反应，或者，可以将含有(III-a)的反应混合物与(IV)进一步反应，而不分离出(III-a)。在一个实施方案中，其中用偶联剂进行的反应是在水不可混溶的溶剂中进行的，可将含有(III-a)的反应混合物用水或弱碱性的水洗涤以除去所以水溶性副产物。然后可将由此获得的洗涤的溶液与(IV)反应，而没有另外的纯化步骤。另一方面，中间体(III-a)的分离可以提供一些优点，因为在任选的进一步纯化之后，将分离的产物与(IV)反应，能生成较少的副产物，并且反应更易于进行后处理。

式(I)化合物还可以如下面的反应方案所示，通过将中间体(V)用式(VI)的喹啉醚化而制得：

(VI)中的X表示羟基或离去基团，例如卤化物，例如溴化物或氯化物，或芳基磺酰基，例如甲磺酸酯、三氟甲磺酸酯或甲苯磺酸酯等。

在一个实施方案中，(V)与(VI)的反应是O-芳基化反应，X代表离去基团。该反应可根据E.M.Smith等人(J.Med.Chem.(1988)，31，875-885)描述的方法进行。该反应尤其在碱，优选强碱存在下在反应惰性溶剂例如上述用于酰胺键形成的溶剂之一中进行。

在一个实施方案中，原料(V)与喹啉(VI)在足够强以由羟基转移氢原子的碱，例如碱性碱金属氢化物，例如LiH或氢化钠或碱性碱金属醇盐，例如甲醇或乙醇钠或钾、叔丁醇钾存在下，在反应惰性溶剂，例如偶极非质子溶剂，例如DMA、DMF等中反应。将所生成的醇盐与芳基化试剂(VII)反应，其中X是如上所述合适的离去基团。用此类型O-芳基化反应将(V)转化为(I)不改变携带羟基或-O-喹啉基团的碳上的立体化学构型。

或者，(V)与(VI)的反应还可以经由Mitsunobu反应来进行(Mitsunobu，1981，Synthesis，January，1-28；Rano等人，TetrahedronLett.1995，36，22，3779-3792；Krchnak等人，Tetrahedron Lett.1995，36，5，6193-6196；Richter等人，Tetrahedron Lett.1994，35，27，4705-4706)。该反应包括用其中X是羟基的喹啉(VI)在三苯基膦和活化剂，例如偶氮二甲酸二烷基酯，例如偶氮二甲酸二乙酯(DEAD)、偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD)等存在下处理中间体(V)。Mitsunobu反应改变携带羟基或-O-喹啉基团的碳上的立体化学构型

其中R¹是氢的式(I)化合物，所述化合物还可以由(I-d)代表，还可以由其中PG代表氮保护基的相应的氮-保护的中间体(VII)制得。下文中描述了合适的N-保护基。在一个实施方案中，(VII)中的PG是苄基或取代的苄基，特别是4-甲氧基苄基。

在上面反应中的原料(VII)可以按照制备式(I)化合物所描述的方法，但是使用其中基团R¹是PG的中间体来制得。

或者，为了制备式(I)化合物，首先在构件P2与P1之间形成酰胺键，然后将P3构件与P1-P2中的P1部分偶联，随后在P3与P2-P1-P3中的P2部分之间形成酰胺键，伴随着闭环。同样，可以将P1’尾端基与P1构件在式(I)化合物合成的任何阶段键合，例如，在构件P2与P1偶联之前或者之后；在构件P3与P1偶联之前或者之后；或者在构件P3与P2偶联之前或者之后，伴随着闭环。

另一合成方法是，在构件P2与P3之间形成酰胺键，然后将构件P1与P3偶联，最后在P1与P2之间形成酰胺键，同时闭环。同样，可以将P1’尾端基与P1构件在式(I)化合物合成的任何阶段键合，在这种方法中，在构件P2与P3偶联之前或者之后；在构件P1与P3偶联之前或者之后；或者在构件P1与P2偶联之前或者之后，伴随着闭环。

构件P1与P3可通过在碳7与碳8之间形成双键来连接，如果需要的话，然后将C7-C8双键还原。可将由此形成的P1-P3构件与构件P2偶联，然后通过形成酰胺键来环合。在优选的实施方案中，不将构件P1-P3还原，并且以这样的形式与P2偶联，环合，生成化合物(I-1)。

在任一上述方法中，构件P1和P3可通过双键形成，例如通过下文描述的烯烃复分解反应或Wittig型反应来连接。

应当注意，在式(I)化合物中，构件P2与P3之间的酰胺键形成可以在脲部分的两个不同位置完成。第一个酰胺键形成包括将吡咯烷环的氮与作为P3构件一部分的相邻活化羰基(用星号表示的)反应。第二个酰胺键形成包括将作为P2构件一部分的用星号表示的活化羰基与NHRR¹基因反应，其中R¹如式(I)化合物或其亚组中所定义，并且其中R¹还可以是氮保护基；且R是P3烷基部分。活化的用星号表示的羰基可通过将吡咯烷或胺NHRR¹与光气或光气衍生物反应来引入。

可以首先制备各个构件，然后偶联在一起，或者，可以将构件的前体偶联在一起，并且在以后的步骤修饰，以得到所需的分子组成。

可以将在每一个构件中的官能团保护起来以避免副反应。

酰胺键的形成可以使用标准方法，例如在肽合成中用于偶联氨基酸的方法来进行。后一方法包括一个反应物的羧基与另一个反应物的氨基的脱水偶联，以形成酰胺键。酰胺键形成可以这样进行：在偶联剂存在下将原料反应，或者，将羧基官能团转化成活性形式例如活性酯或酰氯或酰溴。关于这样的偶联反应以及其中所使用的试剂的一般描述可以参见肽化学的一般教科书，例如M.Bodanszky，“PeptideChemistry”，2nd rev ed.Springer-Verlag，Berlin，Germany，(1993)，下文简称为Bodanszky，其内容引入本文以供参考。

形成酰胺键的偶联反应的实例包括叠氮化物方法，混合碳酸-羧酸酐(氯甲酸异丁酯)方法，碳二亚胺(二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺或水溶性碳二亚胺例如N-乙基-N′-[(3-二甲基氨基)丙基]碳二亚胺)方法，活性酯(对硝基苯基酯、N-羟基琥珀酰亚氨基酯)方法，Woodward试剂K-方法，羰基二咪唑方法，磷试剂或氧化-还原方法。这些方法当中的某一些可以通过加入合适的催化剂来促进，例如，在碳二亚胺方法中，通过加入1-羟基苯并三唑、DBU(1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯)或4-DMAP来促进反应。另外的偶联剂是(苯并三唑-1-基基)三-(二甲基氨基)六氟磷酸盐，单独使用或者在1-羟基苯并三唑或4-DMAP存在下；或者2-(1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸盐，或O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐。这些偶联反应可以在溶液(液相)或固相中进行。

优选的酰胺键形成方法采用N-乙基氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉(EEDQ)或N-异丁氧基-羰基-2-异丁氧基-1，2-二氢喹啉(IIDQ)来进行。与经典的酸酐方法不同，EEDQ和IIDQ不需要碱，也不用低反应温度。方法通常包括使等摩尔量的羧基与胺组分在有机溶剂(可使用多种不同溶剂)反应，随后加入过量EEDQ或IIDQ，并且将混合物在室温下搅拌。

偶联反应优选在惰性溶剂中进行，所述惰性溶剂是例如卤代烃，例如二氯甲烷、氯仿，偶极非质子溶剂例如乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、DMSO、HMPT，醚例如四氢呋喃(THF)。

在很多情况下，偶联反应是在合适的碱存在下进行，所述碱是例如叔胺，例如三乙胺、二异丙基乙胺(DIPEA)、N-甲基吗啉、N-甲基吡咯烷、4-DMAP或1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)。反应温度可以为0℃-50℃，并且反应时间可以为15分钟-24小时。

可以将可连接在一起的构件中的官能团保护以防止形成不需要的键。可使用的合适的保护基列在例如Greene，“Protective Groups inOrganic Chemistry”，John Wiley & Sons，New York(1999)和“ThePeptides：Analysis，Synthesis，Biology”，Vol.9，Academic Press，NewYork(1987)中。下文中简称为Greene。

羧基可以作为酯被保护，可以将酯裂解以给出羧酸。可使用的保护基包括1)烷基酯例如甲基、三甲基甲硅烷基和叔丁基酯；2)芳烷基酯例如苄基和取代的苄基酯；或3)可通过弱碱或弱还原手段裂解的酯，例如三氯乙基和苯甲酰甲基酯。

氨基可通过多种N-保护基保护，例如

1)酰基例如甲酰基、三氟乙酰基、邻苯二甲酰基和对甲苯磺酰基；

2)芳族氨基甲酸酯基团例如苄基氧基羰基(Cbz或Z)和取代的苄基氧基羰基，和9-芴基甲基氧基羰基(Fmoc)；

3)脂族氨基甲酸酯基团例如叔丁基氧基羰基(Boc)、乙氧基羰基、二异丙基甲氧基-羰基和烯丙氧基羰基；

4)环烷基氨基甲酸酯基团，例如环戊基氧基羰基和金刚烷基氧基羰基；

5)烷基如三苯基甲基，苄基或取代的苄基例如4-甲氧基苄基；

6)三烷基甲硅烷基例如三甲基甲硅烷基或叔丁基二甲基甲硅烷基；和

7)含有巯基的基团例如苯硫基羰基和二硫代琥珀酰基。优选的氨基保护基是Boc和Fmoc。

优选地，在下一个偶联步骤之前，将氨基保护基裂解。N-保护基可使用本领域已知方法来除去。当使用Boc基团时，选择的方法是三氟乙酸，单独使用或者在二氯甲烷中，或者HCl在二氧杂环己烷或乙酸乙酯中的溶液。然后将所得铵盐在偶联之前或者在原位用碱溶液中和，所述碱溶液是例如水缓冲液，或者叔胺在二氯甲烷或乙腈或二甲基-甲酰胺中的溶液。当使用Fmoc基团时，选择的试剂是在二甲基甲酰胺中的哌啶或取代的哌啶，但是可以使用任何仲胺。脱保护在0℃-室温，通常在15-25℃或20-22℃温度下进行。

会干扰构件的偶合反应的其他官能团也可以被保护。例如羟基可保护成苄基或取代的苄基醚，例如4-甲氧基苄基醚、苯甲酰基或取代的苯甲酰基酯，例如4-硝基苯甲酰基酯，或用三烷基甲硅烷基(例如三甲基甲硅烷基或叔丁基二甲基甲硅烷基)保护。

另外的氨基可以通过可选择性地裂解的保护基保护起来。例如，当Boc用作α-氨基保护基时，下列侧链保护基是合适的：对甲苯磺酰基(对甲苯磺酰基)部分可用于保护另外的氨基；苄基(Bn)醚可用于保护羟基；并且苄基酯可用于保护另外的羧基。或者，当选择Fmoc用于α-氨基保护，通常基于叔丁基的保护基是可接受的。例如，Boc可用于另外的氨基；叔丁基醚用于羟基；并且叔丁基酯用于另外的羧基。

任何保护基可以在合成操作的任何阶段除去，但是优选地，不参与反应步骤的任何官能团的保护基在大环构建完成之后被除去。保护基的除去可以通过保护基的选择所指示的方法来进行，所述方法是本领域技术人员已知的。

式(II)中间体可如下面的反应方案所示，通过将中间体(VIII)与烯胺(IX)在羰基引入剂存在下反应来制得。

L代表O-保护基PG¹或以下基团

O-保护基可以是本文提及的任何基团，特别是苯甲酰基或取代的苯甲酰基，例如4-硝基苯甲酰基。

所述羰基引入剂包括光气、光气衍生物例如羰基二咪唑(CDI)等。在一个实施方案中，将(VIII)与CO引入剂在合适的碱和溶剂存在下反应，所述碱和溶剂可以是在如上所述的酰胺形成反应中使用的碱和溶剂。在一个具体实施方案中，碱是碳酸氢盐例如NaHCO₃，或叔胺例如三乙胺等，并且溶剂是醚或卤代烃例如THF、CH₂Cl₂、CHCl₃等。然后，如上面的反应方案中所示，加入胺(IX)，由此获得中间体(XII)或(XII-a)。使用类似反应条件的另一方法包括，首先将CO引入剂与胺(IX)反应，然后将由此形成的中间体与(VIII)反应。

当L是PG¹时，(VIII)与(IX)的反应生成中间体(II-a)。可将这些中间体脱保护，例如当PG¹是苯甲酰基取代的苯甲酰基时，通过与碱金属氢氧化物(LiOH、NaOH、KOH)反应，特别是，当PG¹是4-硝基苯甲酰基时，与LiOH反应，所述反应在包含水与水溶性有机溶剂例如链烷醇(甲醇、乙醇)和THF的含水介质中进行。按照上述关于(V)与(VI)的反应所述，将所得醇(即其中L是氢的中间体(II-a))与中间体(VI)反应，该反应生成中间体(II)。

式(III)中间体可这样制得；如下所述，首先将酯中间体(X)环合生成大环酯(XI)，然后将其转化成相应的大环羧酸(III)：

L是PG¹(III-a)

L是基团(a)(III)

L如上所述，且PG²是羧基保护基，例如一个上述羧基保护基，特别是C_1-4烷基或苄基酯，例如甲基、乙基或叔丁基酯。PG¹基团可使用本领域已知方法来除去，甲基或乙基酯通过在含水介质中用碱金属氢氧化物处理来除去，叔丁基酯用弱酸除去，或者苄基酯通过催化氢化来除去。当L是基团(a)时，该反应生成中间体(III)。这些中间体可通过除去是O-保护基的L，并且将由此形成的醇用如上所述的中间体(VI)醚化来制得。

式(VII)中间体可这样制得：将其中PG是如上所述的氮保护基的中间体(XII)环合，生成在大环(VII-a)中具有双键的中间体(VII)，可将其还原，生成在大环(VII-b)中具有单键的相应的中间体(VII)：

(XII) L是PG¹(VII-a-1) L是PG¹(VII-b-1)

L是基团(a)(VII-a) L是基团(a)(VII-b)

L如上所定义。当L是基团(a)时，该反应生成中间体(VII-a)或(VII-b)。这些中间体可通过除去是O-保护基的L，并且将由此形成的醇用如上所述的中间体(VI)醚化来制得。在上述反应中的磺酰基酰胺基团可以是指(即如上所定义的-OPG²基团)，可将其除去，并且按照上文描述的方去与环丙基酰胺(IV)缩合。

环丙基磺酰胺基团可以在合成的任何阶段，作为如上所述的最后一个步骤，或者如下面的反应方案所示在大环形成之前引入。

L如上所定义，PG²代表如上所定义的羧基，且L¹是氮保护基(如上所定义的PG)，或者L¹是基团

其中R¹和n如上所定义，或者其中R¹还可以代表氮保护基(如上所定义的基团PG)。显然，当R¹代表氮保护基时，其可以在合成的所需阶段除去。其中L¹代表基团(b)的中间体(XIV)相当于中间体(II)或(II-a)，并且可以如上所述进一步处理。

P1和P2构件的偶联

按照上述方法，使用酰胺形成反应，将P1和P2构件连接。P1构件可具有羧基保护基PG2(如在(XVI-a)酯)，或者可以已经与P1’基团连接(如在(XVI-b)中)。L²是氢或如上所述的基团L。

在上述方案的方法中，使用酰胺形成反应例如上述标准肽偶联条件将环丙基氨基酸(XVI-a)或(XVI-b)与P2构件的酸官能团偶联。采用用于所用保护基的合适条件除去(XIII)中的酸保护基团，随后如上所述与环丙基磺酰胺(IV)偶联，同样得到中间体(XIV)。

在一个实施方案中，L¹是基团(b)，并且这些反应涉及P1与P2-P3的偶联，这生成上述中间体(X)或(II)。在另一个实施方案中，L¹是如上所述的N-保护基PG，并且偶联反应生成中间体(XV-a)，可使用如上所述的反应条件除去基团PG而由其获得中间体(XIII-a)：

在一个实施方案中，反应中的PG是BOC基团。此外，当L³是氢时，原料是Boc-L-羟基脯氨酸。

基团L²可以是O-保护基PG¹，其引入到原料(XV)中，其中L²是氢，其朝着基团PG而被选择性地裂解。

P3与P2构件的偶联

按照上述关于(VII)与(IX)偶联的方法，使用脲形成反应，来连接P3和P2构件。下面的反应方案中呈现了一种一般方法，其中L如上所定义，并且L³是基团-O_-PG ²或以下基团

在(XVIII)中，R¹如上所定义，但是也可以是氮保护基，其可以在合成的所需阶段用氮脱保护剂除去。当(XVIII)中的L³是基团-OPG²时，可除去PG²基团，并且将所得酸与环丙基氨基酸(XVI-a)或(XVI-b)偶联，生成其中L¹是基团(b)的中间体(XIII)或(XIV)。

用于制备式(I)化合物的构件P1、P1’、P2和P3可由已知的中间体制备，下文更详细说明了多种这样的合成。

合成P2构件

构件P2可以通过O-芳基化反应制得，例如按照上述方法，如下面的反应方案所示，其中L¹如上所定义，并且特别是N-保护基PG，X如上所定义，且L⁴是羟基、基团-OPG²，其中PG²是羧基保护基，例如上述任何羧基保护基；或者L⁴是P1基团，例如如上所定义的基团(c)或(d)。

将原料(XIX)与试剂(VI)按照上文关于由(V)和(VI)合成(I-d)的方法反应。类似地，该反应可以在保留(用作为离去基团的X芳基化)或反转(Mitsunobu反应)携带羟基的碳原子上的立体化学的情况下进行。在用作为离去基团的X进行的芳基化中，L⁴还可以是羟基，在Mitsunobu反应，L⁴是基团-OPG²。

在一个实施方案中，基团L¹是PG，其是Boc，并且原料(VIII)是商购获得的Boc-L-羟基脯氨酸，或者是其任何其他立体异构体形式。

当(XX)中的L⁴是-OPG²时，羧基保护基PG²可以使用如上所述的方法除去，获得了羟基脯氨酸衍生物(XVII)。在一个实施方案中，PG¹是Boc，且PG²是低级烷基酯，特别是甲基或乙基酯。可通过标准方法将所述酯水解成酸，例如使用HCl在甲醇或乙醇中的溶液进行酸水解，或者用碱金属氢氧化物，例如氢氧化钠，或优选氢氧化锂来水解。

中间体(VI)可以使用已知原料通过本领域已知方法制得。他们可如下所示制得：

在溶剂例如二氯甲烷中，在一种或多种路易斯酸例如三氯化硼和三氯化铝存在下，使用酰化剂例如乙酰氯等将商购获得或通过本领域已知方法制备的3-甲氧基苯胺(XXII)进行Friedel-Craft酰化，获得(XXIII)。将(XXIII)与4-异丙基-噻唑-2-甲酸(XXIV)在碱性条件下偶联，例如在吡啶中，在羧酸基团活化剂例如POCl₃存在下进行偶联，然后在碱性条件例如叔丁醇钾在叔丁醇中的溶液下进行闭环和脱水，获得喹啉衍生物(VI-a)。可将后者转化成其中LG是离去基团的(VI-b)，例如将(XII)与卤化剂如磷酰氯等反应，或者与芳基磺酰氯例如甲苯磺酰氯反应。

2-羧基-4-异丙基-噻唑(XXIV)是用本领域已知方法，特别是如下所示合成的：

将硫代草氨酸乙酯(XXVI)与β-溴酮(XXVII)反应以形成噻唑基甲酸酯(XXVIII)，将其水解成相应的酸(XXIV)。将在这些中间体中的乙酯用如上所定义的其他羧基保护基PG²替代。

中间体(XXIII)可按照Brown等人，J.Med.Chem.1989，32，807-826中描述的方法或在以下反应方案中描绘的方法制得。

将商购获得的原料乙酰乙酸乙酯和乙氧基亚甲基丙二腈在合适的碱例如乙醇钠以及溶剂例如乙醇等存在下反应。该反应获得了中间体(XXIX)。将该中间体水解，例如用碱如碱金属氢氧化物例如NaOH或LiOH在合适的溶剂例如乙醇/水中水解，以获得(XXX)。将中间体(XXX)脱羧形成中间体(XXXI)，该反应在高温下进行直至气体释放停止，优选在碱性溶剂例如喹啉中进行。在合适的溶剂(例如DMF等)中，在合适的碱(例如K₂CO₃)存在下，用特别是甲基化剂例如MeI将中间体(XXXI)甲基化，获得(XXXII)。可将中间体(XXXII)与格氏试剂例如MeMgBr在合适的溶剂(例如THF)中反应，然后水解，例如用盐酸水解，获得中间体(XXIII)。

合成P1构件

用于制备P1片段的环丙烷氨基酸可商购获得或者可以使用已知方法制得。

氨基-乙烯基-环丙基乙酯(XXI-a)可以按照WO 00/09543中描述的方法获得或者如下面的反应方案所示制得，其中PG²是如上所定义的羧基保护基：

将商购获得的或者易于获得的亚胺(XXXIII)用1，4-二卤代丁烯在碱存在下处理，生成(XXXIV)，将其水解后获得具有与羧基呈顺式的烯丙基取代基的环丙基氨基酸(XVI-a)。拆分对映体混合物(XVI-a)，获得(XVI-a-1)。所述拆分使用本领域已知方法进行，例如酶分离；用手性酸结晶；或化学衍生；或手性柱色谱。

磺酰胺衍生物(XVI-b)可按照下面的反应方案获得，其中R²和PG如上所定义。

(XVI-c)与磺酰胺(IV)的反应是酰胺形成方法，其可以按照上述方法来进行。该反应生成中间体(XVI-d)，通过标准方法例如上述方法将氨基保护基从所述中间体中除去。这导致形成所需中间体(XVI-b)。原料(XVI-c)可通过首先引入N-保护基PG以及随后除去基团PG³而由中间体(XVI-a)制得。

合成P3构件

P3构件(IX)可根据本领域已知方法制得。下面的反应方案显示了这些方法当中的一种，并且是由保护的胺(XXXVI)，特别是由单酰化胺，例如三氟乙酰胺，或由Boc-保护的胺的开始合成。

在该实施方案中，LG是如上所述的N-保护基，特别是BOC或三氟乙酰基；R¹和n如上所定义，并且其中R¹还可以是氮保护基，其可以朝着基团PG而被选择性地裂解。LG是如上所定义的离去基团，特别是，LG是氯或溴。当R¹代表氮保护基时，其可以通过用氮脱保护剂在合成的所需阶段除去。

将单酰化胺(XXXVI)用强碱例如氢化钠处理，然后与卤代C_3-8链烯基(XXXVII)反应，生成相应的保护的胺(XXXVIII)。将(XXXVIII)脱保护，获得(IX)。脱保护将取决于基团PG，因此如果PG是Boc，脱保护可用较弱酸例如三氟乙酸来完成，或者当PG是三氟乙酰基时，除去用碱例如氢氧化钠来进行。

其中R¹是氢的中间体(IX)可以经由链烯基胺的Gabriel合成来制得，这可以通过用碱例如氢氧化钾和(XXXX)处理邻苯二甲酰亚胺(XXXIX)来进行，然后水解以生成链烯基胺(IX-a)。

在上面的反应方案中，LG是卤素，且n如上所定义。

可按照本领域已知的用于将三价氮转化成其N-氧化物形式的方法将式(I)化合物转化成相应的N-氧化物形式。所述N-氧化反应一般通过将式(I)原料与合适的有机或无机过氧化物反应来进行。合适的无机过氧化物包括例如过氧化氢，碱金属或碱土金属过氧化物，例如过氧化钠、过氧化钾；合适的有机过氧化物可包括过氧酸，例如过苯甲酸或卤素取代的过苯甲酸如3-氯过苯甲酸，过氧链烷酸例如过乙酸，烷基过氧化氢，例如叔丁基过氧化氢。合适的溶剂是例如水，低级醇如乙醇等，烃例如甲苯，酮例如2-丁酮，卤代烃例如二氯甲烷，以及这样的溶剂的混合物。

式(I)化合物的纯的非对映体可通过使用本领域已知的方法来获得。非对映体可通过物理分离方法例如选择性结晶和色谱技术，例如逆流分布、液相色谱法等来分离。

式(I)化合物可作为对映体的对映体的外消旋混合物获得，其可通过本领域已知的拆分方法彼此分离开。通过分别与合适的手性酸或手性碱反应，可钾具有足够碱性或酸性的外消旋式(I)化合物转化成相应的非对映体盐形式。然后通过例如选择性或分步结晶将所述非对映体盐形式分离，并且通过碱或酸由其释放出对映体。分离式(I)化合物的对映体形式的另一方法涉及液体色谱法，特别是使用手性固定相的液相色谱法。所述纯立体化学对映体形式还可以衍生自适当起始原料的相应纯立体化学对映体形式，条件是反应以立体特异性方式发生。优选地，如果特异性的立体异构体是希望的，所述化合物可通过立体特异性制备方法来合成得到。这些方法将有利地使用对映体纯的起始原料。

在另一个方面，本发明涉及药物组合物，所述组合物包含治疗有效量的如本文所定义的式(I)化合物或任何亚组的如本文所定义的式(I)化合物与可药用载体。在上下文中，治疗有效量是指，在感染个体或者有感染危险的个体中，足以预防性地抵抗、稳定或减轻病毒感染，特别是HCV病毒感染的量。在另一个方面，本发明涉及制备如本文所述的药物组合物的方法，所述方法包括将可药用载体与治疗有效量的如本文所定义的式(I)化合物或任何亚组的如本文所定义的式(I)化合物充分混合。

因此，为了给药目的，可将本发明化合物或其任何亚组配制呈各种药物形式。作为合适的组合物，可提及的是通常用于全身施用药物的所有组合物。为了制备本发明药物组合物，将作为活性组分的任选呈加成盐形式或金属络合物形式的特定化合物与可药用载体充分混合，根据给药所需的制剂形式，所述载体可呈多种形式。理想起见，这些药物组合物呈适于口服、直肠、经皮或通过胃肠外注射给药的单位剂型。例如，为了制备口服剂型的组合物，可使用任何常用的药物介质，对于口服液体制剂例如悬浮液、糖浆剂、酏剂、乳剂和溶液，药物介质是例如水，二醇，油，醇等；或者，对于粉剂、丸剂、胶囊和片剂，药物介质是固体载体，例如淀粉、糖、陶土、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。由于其易于给药，片剂和胶囊是最有利的口服单位剂型，在这种情况下，显然采用固体药物载体。对于胃肠外给药用组合物，他们的载体通常包括无菌水，至少大部分无菌水，也可以加入其他组分来例如促进溶解。例如，可制备注射液，其中载体包括盐水溶液、葡萄糖溶液或盐水与葡萄糖溶液的混合物。还可以制得可注射悬浮液，在这种情况下，可采用合适的液体载体、悬浮剂等。还包括用于在临用之前转化成液体形式制剂的固体形式制剂。在适于经皮给药的组合物中，载体任选包含渗透促进剂和/或合适的润湿剂，任选与次要比例的合适的任何性质的添加剂联合使用，所述添加剂不对皮肤产生显著不利影响。

本发明化合物还可以通过经口吸入或吹入来给药，这是采用本领域用于经由该方式给药所使用的方法和制剂。因此，本发明化合物一般可以以溶液、悬浮液或干粉形式对肺给药，溶液是优选的。用于通过经口吸入或吹入来递送溶液、悬浮液或干粉的所开发的任何系统都适用于给药本发明化合物。

因此，本发明还提供了适于经由口通过吸入或吹入来给药的药物组合物，所述组合物包含式(I)化合物和可药用载体。优选地，本发明化合物在喷雾化或气雾化剂量中通过溶液的吸入来给药。

特别有利的是，将上述药物组合物配制成易于给药剂量一致性的单位剂型。本文使用的单位剂型是指适于用作单位剂量的物理上不连续的单位，每个单位含有经计算产生所需疗效的预定量的活性组分与所需药物载体。这样的单位剂型的实例有片剂(包括加刻痕或包衣的片剂)、胶囊、丸剂、栓剂、粉末小包、糯米纸囊剂、注射液或悬浮液等，及其被分隔的多个部分。

式(I)化合物表现出抗病毒性质。能够使用本发明化合物治疗的病毒感染及其相关疾病包括HCV和其他致病性黄病毒属带来的感染，例如是黄热病、登革热(类型1-4)、圣路易士脑炎、日本脑炎、摩累谷脑炎、西尼罗病毒和库京病毒。与HCV相关的疾病包括渐进性肝纤维化、导致肝硬化的炎症和坏死、末期肝病和HCC；与其他黄病毒属病毒相关的疾病包括黄热病、登革热、出血性发热和脑炎。此外，多种本发明化合物具有抗HCV的突变株的活性。另外，很多本发明化合物表现出有利的药动学性质，并且在生物利用度方面具有有吸引力的性质，包括可接受的半衰期、AUC(曲线下面积)和峰值，并且没有不利的现象，例如不足的快速释放和组织保留。

在基于Lohmann等人(1999)Science 285：110-113的细胞HCV复制子系统中，并且按照Krieger等人(2001)Journal of Virology 75：4614-4624(引入本文以供参考)的描述做进一步改进，测试式(I)化合物的抗HCV的体外抗病毒活性，在实施例部分中对此进一步举例说明。该模型虽然不是完全的HCV感染模型，但是已经被广泛接受为目前可使用的最有力和高效的自动HCV RNA复制模型。在该细胞模型中表现出抗-HCV活性的化合物视为候选物，来用于治疗哺乳动物中HCV感染的进一步开发。应当理解，区别开以下两类化合物是很重要的：特异性地干扰HCV功能的化合物，以及在HCV复制子模型中施加细胞毒性或细胞抑制作用，并且作为结果引起HCV RNA或相关报道基因酶浓度下降的化合物。在本领域中，用于评估细胞毒性的试验是已知的，其基于例如线粒体酶的活性，使用产生荧光的氧化还原染料例如刃天青。此外，有细胞计数筛选来评估相关报道基因活性，例如萤火虫荧光素酶的非选择性抑制。可通过其表达依赖于构成型活性基因启动子的荧光素酶报道基因稳定转染来装配合适的细胞类型，并且这样的细胞可用作计数筛选以消除非选择性抑制剂。

由于其抗病毒性质，特别是其抗-HCV性质，式(I)化合物或其亚组、其N-氧化物、加成盐、季胺、金属络合物和其立体化学异构体形式可用于治疗表现出病毒感染，特别是HCV感染的个体，以及用于预防这些感染。一般，本发明化合物可用于治疗被病毒，特别是黄病毒属病毒，例如HCV感染的温血动物。

因此，本发明化合物或其任意亚组可用作药物。所述用作药物或者治疗方法包括对感染病毒的个体全身给药有效量的化合物，以抵御与病毒感染，特别是HCV感染相关的病症。

本发明还涉及本发明化合物或其任何亚组在制备用于治疗或预防病毒感染，特别是HCV感染的药物中的应用。

此外，本发明还涉及治疗被病毒感染，或者有病毒，特别是HCV感染危险的温血动物的方法，所述方法包括施用抗病毒有效量的如本文所定义的式(I)化合物或如本文所定义的任何亚组的式(I)化合物。

同样地，已知抗-HCV化合物和式(I)化合物的组合也可以在联合治疗中作为药物使用，所述已知抗-HCV化合物例如是干扰素-α(IFN-α)、聚乙二醇化(pegylated)的干扰素-α和/或利巴韦林。术语“联合治疗”涉及必须包含下述成分的产品：(a)式(I)化合物，和(b)任选的其他抗-HCV化合物，其作为一种组合制品同时、分开或连续使用用于治疗HCV感染，特别是用于治疗HCV感染。

抗-HCV化合物包含选自HCV聚合酶抑制剂、HCV蛋白酶抑制剂、在HCV生命周期中的其它目标的抑制剂、免疫调节剂、抗病毒剂及其组合的活性剂。

HCV聚合酶抑制剂包括但不限于NM283(valopicitabine)、R803、JTK-109、JTK-003、HCV-371、HCV-086、HCV-796和R-1479。

HCV蛋白酶抑制剂(NS2-NS3抑制剂和NS3-NS4A抑制剂)包括但不限于WO02/18369的化合物(参见例如第273页第9-22行和第274页第4行至第276页第11行)；BILN-2061、VX-950、GS-9132(ACH-806)、SCH-503034和SCH-6。可使用的其他活性剂是在下列专利中公开的那些：WO 98/17679、WO-00/056331(Vertex)；WO 98/22496(Roche)；WO99/07734(Boehringer Ingelheim)、WO2005/073216、WO2005073195(Medivir)，和结构上类似的活性剂。

在HCV生命周期中其它目标的抑制剂，包括NS3解螺旋酶、金属蛋白酶抑制剂、反义寡核苷酸抑制剂，例如ISIS-14803、AVI-4065等。siRNA’s，例如SIRPLEX-140-N等，载体编码的短发夹RNA(shRNA)；DAN酶；HCV特异性核酶，例如heptazyme、RPI.13919等；进入抑制剂，例如HepeX-C、HuMax-HepC等；α-葡糖苷酶抑制剂，例如西戈斯韦、UT-231B等；KPE-02003002和BIVN 401。

免疫调节剂包括但不限于：天然和重组干扰素同种型化合物，包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、ω-干扰素等，例如Intron A、Roferon-A、Canferon-A300、Advaferon、Infergen、Humoferon、Sumiferon MP、Alfaferone、IFN-beta、Feron等；聚乙二醇衍生的(聚乙二醇化)干扰素化合物，例如PEG干扰素-α-2a(Pegasys)、PEG干扰素-α-2b(PEG-Intron)、聚乙二醇化IFN-α-conl等；干扰素化合物长效制剂和衍生物，例如白蛋白融合的干扰素albuferonα等；刺激干扰素在细胞内合成的化合物，例如雷西莫特等；白介素类；提高1型辅助T细胞反应的发展的化合物，例如SCV-07等；TOLL样受体激动剂，例如CpG-10101(actilon)、isatoribine等；胸腺素α-1；ANA-245；ANA-246；组胺二盐酸盐；propagermanium；tetrachlorodecaoxide；聚肌胞；IMP-321；KRN-7000；抗体，例如civacir、XTL-6865等；和预防和治疗疫苗，例如InnoVac C、HCVE1E2/MF59等。

其它抗病毒药剂包括但不限于利巴韦林、金刚胺、三唑核苷、硝唑尼特；汰比夫定；NOV-205；他立伟林(taribavirin)；内核糖体进入的抑制剂；广谱病毒抑制剂，例如IMPDH抑制剂(例如US5,807,876、US6,498,178、US6,344,465、US6,054,472、WO97/40028、WO98/40381、WO00/56331的化合物，和霉酚酸及其衍生物，包括但不限于VX-950、merimepodib(VX-497)、VX-148和/或VX-944)；或上述的任何组合。

因此，为了抵抗或治疗HCV感染，式(I)化合物可以和例如下列活性剂联合给药：干扰素-α(IFN-α)，聚乙二醇化的干扰素-α和/或利巴韦林以及基于抗体的治疗，所述抗体针对的是HCV抗原决定簇，小干扰性RNA(Si RNA)，核酶，DNA酶，反义RNA，例如NS3蛋白酶，NS3解螺旋酶和NS5B聚合酶的小分子拮抗剂。

因此，本发明涉及如上所定义的式(I)化合物或其任何亚组在制备用于在感染HCV病毒的哺乳动物中抑制HCV活性的药物中的应用，其中所述药物是在联合治疗中使用，所述联合治疗优选包含式(I)化合物和另一种HCV抑制化合物，例如(聚乙二醇化)IFN-α和/或利巴韦林。

在另一方面，提供了本文所定义的式(I)化合物与抗HIV化合物的组合。后者优选是具有对药物代谢和/或改善生物利用度的药物动学具有正面影响的HIV抑制剂。这样的HIV抑制剂的实例是利托那韦。

同样，本发明还提供了含有(a)式(I)的HCV NS3/4a蛋白酶抑制剂或其可药用盐与(b)利托那韦或其可药用盐的组合。

化合物利托那韦和其可药用的盐及其制备方法描述在WO94/14436中。对于利托那韦的优选剂型，参见US6,037,157和其中引用的文献：US5,484,801、US08/402,690和WO95/07696以及WO95/09614。利托那韦具有如下通式：

在其它实施方案中，包括(a)式(I)的HCV NS3/4a蛋白酶抑制剂或其可药用盐和(b)利托那韦或其可药用盐的组合还包括选自如本文所述化合物的另外的抗HCV化合物。

在本发明的一个实施方案中，其提供制备如上所述组合的方法，所述方法包括混合式(I)的HCV NS3/4a蛋白酶抑制剂或其可药用盐与利托那韦或其可药用盐。本发明的另一个实施方案提供了方法，其中所述组合包括一种或多种另外的如本文所述的活性剂。

本发明的组合还可用作药物，所述作为药物的用途或治疗方法包括向HCV感染的个体全身给药有效对抗与HCV和其它致病黄病毒和瘟病毒有关的病症的量。因此，本发明的组合可用于制备在哺乳动物中用于治疗、预防或对抗感染或与HCV感染有关的疾病，尤其是用于治疗与HCV和其它致病黄病毒和瘟病毒有关的病症的药物。

在本发明的一个实施方案中，获得了药物组合物，其含有本文所述任一个实施方案所定义的组合与可药用赋形剂。本发明尤其提供了药物组合物，其含有(a)治疗有效量的式(I)的HCV NS3/4a蛋白酶抑制剂或其可药用盐，(b)治疗有效量的利托那韦或其可药用盐，和(c)可药用赋形剂。药物组合物任选还含有另外的活性剂，其选自HCV聚合酶抑制剂、HCV蛋白酶抑制剂、HCV生命周期中的其他目标的抑制剂和免疫调节剂、抗病毒剂及其组合。

组合物可配制成合适的药物剂型，例如如上所述的剂型。每种活性成分可分别配制，制剂可以共同给药，或一种制剂含有两者，并且如果需要，还可以提供另外的活性成分。

用于本文的术语“组合物”是指包括产品，其含有特定的组分以及任何产物，其直接或间接产生自特定组分的组合。

在一个实施方案中，本文提供的组合还可配制成用于同时、分别或依次用于HIV治疗的联合制剂。在此情况下，通式(I)化合物或其任何亚组配制在含有其他可药用赋形剂的药物组合物中，并且利托那韦分别配制成含有其它可药用赋形剂的药物组合物中。方便的是，此两种单独的药物组合物可以是用于同时、分别或依次使用的药盒的部分。

因此，本发明组合的各个组分可在治疗过程中分别在不同时间给药或同时以分开或单一联合形式给药。因此，本发明应理解为包含同时或交替治疗的所有方案，从而解释了术语“给药”。在优选实施方案中，单独的剂型大致同时给药。

在一个实施方案中，本发明的组合包括一定量的利托那韦或其可药用盐，相对于式(I)的HCV NS3/4a蛋白酶抑制剂单独给药时的生物利用度，其足以在临床上改善所述式(I)的HCV NS3/4a蛋白酶抑制剂的生物利用度。

在另一个实施方案中，本发明的组合包含一定量的利托那韦或其可药用盐，相对于式(I)的HCV NS3/4a蛋白酶抑制剂单独给药时的至少一个药动学变量，其足以改善所述式(I)的HCV NS3/4a蛋白酶抑制剂的至少一个药动学变量，所述变量选自t_1/2、C_min、C_max、C_ss、在12小时的AUC或在24小时的AUC。

其它实施方案涉及提高HCV NS3/4a蛋白酶抑制剂的生物利用度的方法，所述方法包括向需要该提高的个体给药如上所定义的组合，所述组合含有治疗有效量的所述组合的每种组分。

在另一个实施方案中，本发明涉及利托那韦或其可药用盐作为式(I)的HCV NS3/4a蛋白酶抑制剂的至少一个药动学变量的改善剂的用途，所述变量选自t_1/2、C_min、C_max、C_ss、12小时的AUC或24小时的AUC，其前提是，所述用途不实施于人体或动物体。

用于本文的术语“个体”是指已成为治疗、观察或实验对象的动物，优选哺乳动物，最优选人体。

生物利用度定义为给药的剂量达到系统循环的分数，t_1/2表示半衰期或血浆浓度下降至原始值一半时所需的时间。C_ss是稳定状态浓度，即在药物输入速率等于排除速率时的浓度。C_min定义为在给药间隔中测量的最低(最小)浓度，C_max表示在给药间隔中测量的最高(最大)浓度。AUC定义为对确定的时间周期血浆浓度-时间曲线下的面积。

本发明的组合可以所述组合中所包含的每个组分特定的剂量范围向人体给药。包含在所述组合中的组分可一起或单独给药。式(I)的NS3/4a蛋白酶抑制剂或其任何亚组和利托那韦或其可药用盐或酯可以具有约每天0.02-5.0g的剂量水平。

当式(I)的HCV NS3/4a蛋白酶抑制剂与利托那韦联合给药时，式(I)的HCV NS3/4a蛋白酶抑制剂与利托那韦的重量比合适地是在约40∶1-约1∶15的范围，或约30∶1-约1∶15，或约15∶1-约1∶15，典型地为约10∶1-约1∶10，更典型地为约8∶1-约1∶8。同样有用的是，式(I)的HCV NS3/4a蛋白酶抑制剂与利托那韦的重量比范围为约6∶1-约1∶6，或约4∶1-约1∶4，或约3∶1-约1∶3，或约2∶1-约1∶2，或约1.5∶1-约1∶1.5。一方面，式(I)的HCV NS3/4a蛋白酶抑制剂的重量等于或大于利托那韦的重量，其中式(I)的HCV NS3/4a蛋白酶抑制剂与利托那韦的重量比合适地在约1∶1-约15∶1范围，典型地为约1∶1-约1 0∶1，更典型地为约1∶1-约8∶1。同样有用的是，式(I)的HCV NS3/4a蛋白酶抑制剂与利托那韦的重量比的范围为约1∶1-约6∶1，或约1∶1-约5∶1，或约1∶1-约4∶1，或约3∶2-约3∶1，或约1∶1-约2∶1或约1∶1-约1.5∶1。

用于本文的术语“治疗有效量”是指活性化合物或组分或药物活性剂的量，根据本发明，其在组织、系统、动物或人体中产生研究者、兽医、医师或其它临床医生寻求的生物学或医学反应，其包括减轻所治疗疾病的症状。由于本发明涉及包含两种或多种活性剂的联合，“治疗有效量”是指活性剂联合在一起的量，因而联合效果产生所需生物学或医学反应。例如，含有(a)式(I)化合物和(b)利托那韦的组合物的治疗有效量应是在一起给药时具有联合效果，即是治疗有效的式(I)化合物的量和利托那韦的量。

通常预期的是抗病毒有效日剂量将为0.01mg/kg-500mg/kg体重，更优选为0.1mg/kg-50mg/kg体重。合适的是所需剂量作为整天内以合适间隔的2、3、4或更多亚剂量。所述亚剂量可作为单位剂型配制，例如每个单位剂型含有1-1000mg，尤其是5-200mg活性成分。

给药的精确剂量和频率取决于所用的特定式(I)化合物，所治疗的严重程度，特定患者的年龄、体重、性别、病症和一般身体状况的程度，以及个体可采用的其他药物，这是本领域技术人员众所周知的。此外，根据治疗个体的反应和/或根据开本发明化合物处方的医生的评估，显然所述有效日剂量可以降低或增加。因此，上述有效日剂量仅是指导性的。

根据一个实施方案，式(I)的HCV NS3/4a蛋白酶抑制剂和利托那韦可一天一次或两次同时给药，优选口服，其中每剂量式(I)化合物的量为约1-约2500mg，每剂量利托那韦的量是1-约2500mg。在另一实施方案中，用于每天一次或两次共同给药的每剂量的量为约50-约1500mg式(I)化合物和约50-约1500mg利托那韦。在另一个实施方案中，用于每天一次或两次共同给药的每剂量的量为约100-约1000mg式(I)化合物和约100-约800mg利托那韦。在另一个实施方案中，用于每天一次或两次共同给药的每剂量的量为约150-约800mg式(I)化合物和约100-约600mg利托那韦。在另一个实施方案中，用于每天一次或两次共同给药的每剂量的量为约200-约600mg式(I)化合物和约100-约400mg利托那韦。在另一实施方案中，用于每天一次或两次共同给药的每剂量的量为约200-约600mg式(I)化合物和约20-约300mg利托那韦。在另一个实施方案中，用于每天一次或两次共同给药的每剂量的量为约100-约400mg式(I)化合物和约40-约100mg利托那韦。

用于一次或两次日剂量的式(I)化合物(mg)/利托那韦(mg)组合的实例包括50/100、100/100、150/100、200/100、250/100、300/100、350/100、400/100、450/100、50/133、100/133、150/133、200/133、250/133、300/133、50/150、100/150、150/150、200/150、250/150、50/200、100/200、150/200、200/200、250/200、300/200、50/300、80/300、150/300、200/300、250/300、300/300、200/600、400/600、600/600、800/600、1000/600、200/666、400/666、600/666、800/666、1000/666、1200/666、200/800、400/800、600/800、800/800、1000/800、1200/800、200/1200、400/1200、600/1200、800/1200、1000/1200和1200/1200。用于一次或两次日剂量的式(I)化合物(mg)/利托那韦(mg)组合的其他实例包括1200/400、800/400、600/400、400/200、600/200、600/100、500/100、400/50、300/50和200/50。

在本发明的一项实施方案中，其提供产品，其包括有效治疗HCV感染或抑制HCV的NS3蛋白酶的组合物和包装材料，包括说明组合物可用于治疗HCV感染的标签，其中组合物含有如上所述的式(I)化合物或其任何亚组，或如本文所述的组合。

本发明的另一实施方案涉及药盒或容器，其含有在确定潜在药物抑制HCV NS3/4a蛋白酶、HCV生长或两者的能力测试或试验中用作标准或试剂的有效量的式(I)化合物或其任何亚组或本发明的组合，所述组合包含式(I)的HCV NS3/4a蛋白酶抑制剂或其可药用盐和利托那韦或其可药用盐。本发明的此方面可发现其在药物研究程序中的用途。

本发明的化合物和组合可用于高通量目标分析物试验，例如用于测定所述组合在HCV治疗中的效力的那些物质。

实施例

下列实施例是为了举例说明本发明，而不是将本发明限制于此。

实施例1：制备N-[18-[2-(4-异丙基噻唑-2-基)-7-甲氧基喹啉-4-基-氧基]-2，15-二氧代-3，14，16-三氮杂三环[14.3.0.0^4，6]十九碳-7-烯-4-羰基](环丙基)磺酰胺，其具有如在下面化合物(9)中所示的具体立体化学

步骤A

将2-(4-异丙基噻唑-2-基)-7-甲氧基喹啉-4-醇(1，3.6g)在三氯氧化磷(20mL)中的溶液于100℃加热40分钟(通过LC-MS监测反应)。然后，将该反应冷却至室温，并且将过量三氯氧化磷蒸发。将残余油状物在与饱和NaHCO₃溶液之间分配，并用乙醚(3x70mL)萃取，将合并的有机萃取液用盐水洗涤，用MgSO₄干燥，通过旋转蒸发浓缩，并且过短的二氧化硅垫(己烷)，获得了3.6g(62％)所需产物2，为白色粉末。

步骤B

向Boc-4-羟基脯氨酸，其具有如在上式中所示的具体立体化学(2.6g，11.2mmo1)在DMSO(80mL)内的搅拌着的溶液中加入叔丁醇钾(3.8g，3eq)。搅拌大约1小时后，加入4-氯-2-(4-异丙基噻唑-2-基)-7-甲氧基喹啉(2，3.6g，11.2mmol)，并且将该反应混合物在室温搅拌过夜。

然后，将该反应混合物用水(350mL)稀释，并且用1N HCl中和。将所得悬浮液萃取到乙酸乙酯(3x100mL)内，用盐水洗涤，并用MgSO₄干燥。过滤并通过旋转蒸发浓缩，在高度真空下干燥过夜后，获得了3.6g(62％)所需产物3：通过HPLC测定的纯度＞95％，m/z＝514(M+H)⁺。

步骤C

将酸3(3.6g，7mmol)与1-氨基-2-乙烯基-环丙烷-甲酸乙酯盐酸盐，其具有如在上式中所示的具体立体化学(1.47g，7.6mmol)混合，然后溶解在DMF中。将该反应混合物用氩气吹扫，在在冰浴中冷却，并且一次性加入DIPEA(1.5mL)。然后，将该反应混合物在0℃搅拌10-15分钟，然后在0℃于氩气下一次性加入HATU(2.93g，7.7mmol)。在0℃保持40分钟后(通过LC-MS监测反应)，将该反应混合物通过旋转蒸发浓缩(不蒸发至完全干燥)，然后与饱和碳酸氢钠溶液干燥，并且萃取到EtOAc(3x100mL)内。将有机层用盐水洗涤，用MgSO₄干燥，并通过旋转蒸发浓缩。通过二氧化硅柱色谱纯化(DCM)，然后在YMC二氧化硅上通过柱色谱纯化(200g，己烷/EA 3∶2-2∶3梯度)，获得了3.81g(84％)目标产物4，为白色粉末。

步骤D

将4(3.81g，5.8mmol)在CH₂Cl₂(30mL)和三氟乙酸(30mL)中的溶液于室温搅拌约1.5小时。然后将溶剂蒸发，并且将残余物在饱和碳酸氢钠(100mL)与乙醚(3x100mL)之间分配。将乙醚层合并，用盐水洗涤，用MgSO₄干燥并蒸发，获得了3.13g(98.3％)目标产物5：m/z＝551(M+H)⁺。

步骤E

将NaHCO₃(1.0 g)加到5(14g，2.5mmol)在四氢呋喃(50mL)内的溶液中。然后，在0℃于氩气下加入光气(5mL，1.9M在甲苯中的溶液)。将所得悬浮液在室温搅拌40分钟(通过LC-MS监测)。然后，将该反应混合物过滤，并用THF(2x30mL)洗涤。将滤液通过旋转蒸发浓缩，并且再溶解在CH₂Cl₂(50mL)中。加入NaHCO₃(1.0g)和N-甲基庚-6-烯基胺(1.5g，13mmol)。将该反应混合物在室温搅拌过夜，然后过滤。通过硅胶色谱法纯化(乙醚)，获得了1.42g(84％)目标产物6：m/z＝690(M+H)⁺。

步骤F

向6(1.42g，2mmol)在无水二氯乙烷(900mL，0.0023M溶液)内的溶液中通入氩气大约15分钟。然后，加入Hoveyda-Grubbs第一代催化剂(120mg，12mol％)，并且将该反应混合物在搅拌以及慢氩气流下加热回流16小时。然后将该反应混合物冷却至室温，并且把MP-TMT钯清除剂(大约200mg)加到该混合物中。2.5小时后，将清除剂通过过滤除去，并用50mL CH₂Cl₂洗涤。将所获得的溶液通过旋转蒸发浓缩。将残余物通过在YMC二氧化硅上柱色谱纯化(100g，EtOAc/己烷1∶1)，获得了806mg(57％)目标产物7：m/z＝662(M+H)⁺。

步骤G

将氢氧化锂(300mg)在水(6mL)中的溶液加到大环酯7(806mg，2.1mmol)在四氢呋喃(12mL)和甲醇(6mL)内的溶液中。在50℃保持1小时后，通过蒸发将体积减少一半，加入水(30mL)。酸化(pH＝2)，然后用氯仿萃取，获得了760mg目标产物8，为白色粉末：m/z＝662(M+H)⁺。

步骤H

将酸8(760mg，1.2mmol)和CDI(389mg，2.4mmol，2eq)在无水THF(10mL)中的溶液于氮气下加热回流2小时。如果需要的话，可任选分离出氮杂内酯衍生物。将该反应混合物冷却至室温，并且加入磺酰胺(如WO03/053349中所述制备的)(436mg，3.6mmol，3eq)和DBU(0.5mL，3mmol)在无水THF(10mL)中的混合物。将所得溶液在55℃加热18小时(通过LC-MS监测)。然后，将该反应混合物冷却至室温，将溶剂蒸发，并且将残余物在EtOAc与水(用HCl将pH调节至3.0)之间分配。将粗产物通过柱色谱纯化(EtOAc/石油醚1∶1)，获得了380mg含有最高达20％原料磺酰胺(NMR测定)的目标产物。将该产物在预填充的柱(乙醚至乙醚/THF，3∶1梯度)上通过柱色谱纯化。再通过柱色谱纯化(YMC二氧化硅50g，乙醚，然后乙醚-甲醇9∶1)，获得了176mg本标题化合物，为浅黄色粉末，将其进一步通过制备HPLC纯化，获得了55mg本标题产物，为浅黄色粉末。m/z＝737，(M+H)⁺，NMR数据(125MHz，CDCl₃)：¹³C，δ6.3，6.5，6.9，22.0，22.7，22.8，25.4，26.7，28.6，29.1，29.7，31.3，32.7，34.7，38.4，45.3，51.8，55.8，60.1，77.0，96.7，107.5，114.7，116.5，119.4，123.2，125.8，136.4，151.4，153.1，157.7，160.2，161.8，165.5，168.2，168.7，178.2。

实施例2：合成N-[17-(2-(4-异丙基噻唑-2-基)-7-甲氧基喹啉-4-基-氧基)-13-甲基-2，14-二氧代-3，13，15-三氮杂三环[13.3.0.0^4，6]十八碳-7-烯-4-羰基](环丙基)磺酰胺，其具有如在下面化合物(16)中所示的具体立体化学

方法A：

步骤A

向BOC-4-羟基脯氨酸，其具有如在上式中所示的具体立体化学(2.59g，11.2mmol)在DMSO(80mL)内的搅拌着的溶液中加入叔丁醇钾(3.77g，33.6mmol)。在室温搅拌1小时后，加入喹啉氯化物2(3.57g，11.2mmol)，并且将该溶液在室温搅拌过夜。将该混合物用H₂O(350mL)稀释，用EtOAc(100mL)洗涤，并且用1M HCl酸化至约pH3。将所得悬浮液用EtOAc(3x100mL)萃取，用盐水洗涤，并用MgSO₄干燥。蒸发后，获得了化合物10(3.60g，62％)。

步骤B

将化合物10(3.60g，7.02mmol)溶解在DMF(20mL)中。然后加入1-氨基-2-乙烯基-环丙烷甲酸乙酯盐酸盐(1.47g，7.68mmol)，并且将该反应混合物用氩气吹扫，并且冷却至0℃。加入DIPEA(3.00mL，17.2mmol)和HATU(2.93g，7.66mmol)，并且将该反应混合物在0℃搅拌40分钟。将该溶液蒸发，与饱和NaHCO₃混合，并用EtOAc(3x100mL)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用MgSO₄干燥，并蒸发。通过快速柱色谱纯化(己烷/EtOAc 3∶2→己烷/EtOAc 2∶3)，获得了化合物11(3.81g，84％)，为白色粉末。

步骤C

将11(3.81g，5.86mmol)在CH₂Cl₂(30mL)和TFA(30mL)中的溶液于室温搅拌1.5小时。然后将挥发物蒸发。将饱和碳酸氢钠(100mL)加到所得油状物中，并且将该浆液用乙醚(3x100mL)萃取。将有机层合并，用盐水洗涤，用MgSO₄干燥，并蒸发，获得了化合物12(3.13g，98％)。

步骤D

向化合物12(1.41g，2.56mmol)在THF(40mL)内的溶液中加入NaHCO₃(4汤匙)和光气在甲苯中的溶液(1.93M，4.0mL，7.7mmol)。

将该混合物在室温剧烈搅拌1小时，然后将其过滤并蒸发。将残余物溶解在CH₂Cl₂(40mL)中，加入NaHCO₃(3汤匙)和己-5-烯基-甲基胺盐酸盐(770mg，5.15mmol)。在室温搅拌过夜后，将该反应混合物过滤，加入约3g二氧化硅，并且将该浆液蒸发至干。通过快速柱色谱纯化(乙醚→3％甲醇在乙醚中的混合物)，获得了化合物13(1.57g，89％)，为浅黄色粉末。

步骤E

将化合物13(1.53g，2.18mmol)溶解在1，2-二氯乙烷(1.50L)中，并将该溶液用氮气脱气。加入Hoveyda Grubbs第一代催化剂(95mg，0.16mmol)，并且将该混合物在氮气下回流过夜。将该溶液冷却至60℃，然后加入一汤匙清除剂MP-TMT。将该反应混合物搅拌3小时(同时冷却至室温)，过滤并蒸发。将残余物溶解在CH₂Cl₂中，加入约3g二氧化硅，并且将该浆液蒸发至干。通过快速柱色谱纯化后(乙醚→3％甲醇在乙醚中的混合物)化合物14(1.09g，74％)，获得了白色棱镜状物。

步骤F

将化合物14(1.00g，1.51mmol)溶解在THF/甲醇/H₂O 2∶1∶1(200mL)中。在室温用10分钟滴加LiOH水溶液(1M，15.1mL，15.1mmol)，并且将所得反应混合物在室温搅拌20小时。将该溶液用1MHCl酸化至约pH1，并浓缩直至几乎所有THF和甲醇已经被除去。将所得浆液用CH₂Cl₂萃取4次，并且将有机相合并，干燥(MgSO₄)并蒸发，获得了化合物15(960mg，100％)，为浅黄色粉末。

步骤G

将化合物15(960mg，1.51mmol)在THF(75mL)中的溶液置于氮气下，然后加入羰基二咪唑(CDI)(510mg，3.14mmol)。将该混合物在氮气下回流1小时，然后让其达到室温。可任选将氮杂内酯衍生物分离。加入环丙基-磺酰胺(550mg，4.54mmol)和DBU(530μL，540mg，3.54mmol)，并且将该溶液在55℃于氮气下搅拌过夜。将溶剂蒸发，并且把残余粗产物溶解在CH₂Cl₂中。加入约3g二氧化硅，并且将该浆液蒸发至干。通过快速柱色谱纯化(乙醚→5％甲醇在乙醚中的混合物)，获得了化合物16(960mg，86％)，为白色粉末。

方法B：合成酸15的另一方法

步骤A

将Boc-保护的4-羟基脯氨酸(10.2g，44.1mmol)、HATU(18.7g，49.2mmol)和环丙基酯(9.31g，48.6mmol)，二者具有如在上式中所示的具体立体化学，溶解在DMF(120mL)中，并且冷却至0℃。加入二异丙基乙胺(DIPEA)(30.0mL，172mmol)。将该溶液温热至室温并且搅拌过夜。加入CH₂Cl₂(～80mL)，并且将该反应混合物用饱和NaHCO₃水溶液、柠檬酸、H₂O和盐水洗涤，然后干燥(MgSO₄)。加入约30g二氧化硅，并且将该浆液蒸发至干。通过快速柱色谱纯化(乙醚→7％甲醇在乙醚中的混合物)，获得了化合物17(13.0g，80％)，为白色粉末。

步骤B

将化合物17(8.11g，22.0mmol)、对硝基苯甲酸(5.51g，33.0mmol)和Ph₃P(8.66g，33.0mmol)溶解在THF(100mL)中。将该溶液冷却至0℃，滴加DIAD (6.50mL，33.0mmol)。将该反应混合物温热至室温，并且搅拌过夜。加入饱和NaHCO₃水溶液(60mL)，并且将该混合物用CH₂Cl₂萃取几次。将有机相合并，干燥(MgSO₄)，然后加入约40g二氧化硅，并且将该浆液蒸发至干。通过快速柱色谱纯化(戊烷/乙醚2∶1→戊烷/乙醚1∶2→2％甲醇在乙醚中的混合物)，获得了Boc-保护的中间体(9.50g，83％)，为白色粉末。将该中间体(9.50g，18.4mmol)溶解在CH₂Cl₂(66mL)中，并将该溶液冷却至0℃。滴加TFA(33mL)，并且将该混合物在室温搅拌2小时，将挥发物蒸发，加入CH₂Cl₂(100mL)，加入Na₂CO₃水溶液(0.50M)直至达到pH约为8。分离后，将有机相干燥(MgSO₄)并蒸发，获得了化合物18(7.68g，83％)，为浅黄色粉末。

步骤C

向化合物18(6.90g，16.5mmol)在THF(240mL)内的溶液中加入NaHCO₃(15汤匙)和光气在甲苯中的溶液(1.93M，18.0mL，34.7mmol)。将该混合物在室温剧烈搅拌1小时，然后将其过滤并蒸发。将残余物溶解在CH₂Cl₂(250mL)中，加入NaHCO₃(15汤匙)和己-5-烯基-甲基胺盐酸盐(5.00g，33.4mmol)。在室温搅拌过夜后，将该反应混合物过滤，加入约17g二氧化硅，并且将该浆液蒸发至干。通过快速柱色谱纯化(乙醚→3％甲醇在乙醚中的混合物)，获得了化合物19(8.00g，87％)，为白色粉末。

步骤D

将化合物19(1.61g，2.90mmol)溶解在1，2-二氯乙烷(1.50L)中，并将该溶液用N₂脱气。加入Hoveyda Grubbs第一代催化剂(125mg，0.21mmol)，并且将该混合物在氮气下回流过夜。将该溶液冷却至60℃，然后加入一汤匙清除剂MP-TMT。将该反应混合物搅拌3小时(同时冷却至室温)，过滤，并蒸发。将残余物溶解在CH₂Cl₂中，加入约3g二氧化硅，并且将该浆液蒸发至干。通过快速柱色谱纯化(乙醚→3％甲醇在乙醚中的混合物)，获得了化合物20(1.13g，74％)，为浅灰色粉末。

步骤E

将化合物20(200mg，0.38mmol)溶解在THF/甲醇/水(2∶1∶1，20mL)中，并且在冰浴中冷却。缓慢地加入LiOH水溶液(1M，1.9ml，1.9mmol)。将该混合物在0℃搅拌4小时，然后用1M HCl中和，并用CH₂Cl₂萃取。将有机层用饱和NaHCO₃水溶液、H₂O和盐水洗涤。干燥(MgSO₄)和蒸发后，把剩余粗产物通过快速柱色谱纯化(2％甲醇在CH₂Cl₂中的混合物→4％甲醇在CH₂Cl₂中的混合物)，获得了化合物21(115mg，80％)，为浅灰色粉末。

步骤F

将化合物21(100mg，0.26mmol)、Ph₃P(100mg，0.38mmol)和2-(4-异丙基噻唑-2-基)-7-甲氧基喹啉-4-醇(1)(117mg，0.39mmol)在THF(10-15mL)中混合，将该浆液在冰浴中冷却至0℃。滴加DIAD(77μL，0.39mmol)。然后移去冰浴，并且将该混合物在室温搅拌12小时。将溶剂蒸发，并且将粗产物溶解在THF/甲醇/H₂O2∶1∶1(12mL)中。加入LiOH水溶液(1M，3.80mL，3.80mmol)，并且将该混合物在室温搅拌过夜。通过加入水把体积增加一倍，并且将该浆液用乙醚萃取。将水相用1M HCl酸化至pH约为1，并用CH₂Cl₂萃取。将CH₂Cl₂相干燥(MgSO₄)并蒸发。将所需产物通过快速柱色谱纯化(2％甲醇在乙醚中的混合物直至洗脱出过量喹啉1，然后用10％甲醇在CH₂Cl₂中的混合物洗脱)，获得了化合物15(71mg，42％)。

实施例3：制备环丙烷磺酸{17-[2-(4-异丙基噻唑-2-基)-7-甲氧基喹啉-4-基氧基]-2，14-二氧代-3，13，15-三氮杂-三环[13.3.0.0^4，6]-十八碳-7-烯-4-羰基}-酰胺，其具有如在下面化合物(26)中所示的具体立体化学

步骤A：制备1-({1-[己-5-烯基-(4-甲氧基苄基)-氨基甲酰基]-4-[2-(4-异丙基噻唑-2-基)-7-甲氧基喹啉-4-基氧基]-吡咯烷-2-羰基}-氨基)-2-乙烯基-环丙烷甲酸乙酯，其具有如在下面化合物(22)中所示的具体立体化学

将在实施例1步骤D中描述的化合物5(1.97g，3.58mmol)与约200mg NaHCO₃(2小匙)和THF(20ml)混合。将3ml1.9M光气在甲苯中的溶液加到将该反应混合物中，并且将该反应混合物在室温搅拌约1.5小时。将该反应通过LC-MS监测。原料消失，并且形成了氯羰基中间体的峰(＞90％，根据LC-MS数据)。将该反应混合物过滤，并通过旋转蒸发浓缩。然后将气溶解在CH₂Cl₂中，并且加入己-5-烯基-(对甲氧基-苄基)胺(0.9g)以及100-150mg(1匙)NaHCO₃。将该反应混合物在室温搅拌过夜，然后过滤并且通过二氧化硅柱色谱纯化(EtOAc/石油醚)，获得了纯的本标题化合物22(1.42g，84％)。MS(M⁺)797。

步骤B：制备17-[2-(4-异丙基噻唑-2-基)-7-甲氧基喹啉-4-基氧基]-13-(4-甲氧基苄基)-2，14-二氧代-3，13，15-三氮杂-三环[1 3.3.0.0^4，6]十八碳-7-烯-4-甲酸乙酯，其具有如在下面化合物(23)中所示的具体立体化学

将在步骤A中制备的化合物22(1.68g，2.1mmol)溶解在无水二氯乙烷(用CaH蒸馏的，约800ml)中，通入氩气约10分钟。然后将Hoveyda第一代催化剂(88mg，7mol％)加到将该溶液中，并且将该反应混合物在搅拌以及慢氩气流下于100℃加热16小时。然后将该反应混合物冷却至室温，加入MP-TMT钯清除剂(约100mg)，并且将该混合物搅拌2.5小时。将清除剂通过过滤除去，并用100ml CH₂Cl₂洗涤。将所获得的溶液通过旋转蒸发浓缩，并且在高度真空下干燥，获得了本标题化合物(m/z＝599，(M+H)⁺)，HPLC纯度79％(二极管阵列)，95％(ELSD)。产率63％。

步骤C：制备17-[2-(4-异丙基噻唑-2-基)-7-甲氧基喹啉-4-基氧基]-13-(4-甲氧基苄基)-2，14-二氧代-3，13，15-三氮杂-三环[13.3.0.0^4，6]十八碳-7-烯-4-甲酸，其具有如在下面化合物(24)中所示的具体立体化学

将在步骤B中制备的化合物23(910mg，1.2mmol)溶解在30mLTHF、15mL甲醇和15mL H₂O中。将1M LiOH溶液(10mL)加到该溶液中。将该反应在50℃搅拌2小时以让所有原料反应(通过LC-MS检查的)。将该反应混合物用柠檬酸酸化，用氯仿(3x75mL)萃取，并用盐水洗涤。将有机相用MgSO₄干燥。将粗产物通过快速色谱纯化(从乙酸乙酯/己烷梯度2∶1的梯度)，获得了化合物(24)，为浅黄色固体(864mg)。HPLC纯度96％。

步骤D：制备环丙烷磺酸[17-[2-(4-异丙基噻唑-2-基)-7-甲氧基喹啉-4-基氧基]-13-(4-甲氧基苄基)-2，14-二氧代-3，13，15-三氮杂-三环-[13.3.0.0^4，6]十八碳-7-烯-4-羰基]-酰胺，其具有如在下面化合物(25)中所示的具体立体化学

在2ml微波瓶中，将化合物24(50mg，0.068mmol，1eq)与溶解在THF(1.0mL)中的CDI(44mg，3eq)混合。附上盖子，并且用氩气吹扫。在微波炉中于100℃进行12分钟活化(标准；没有预先搅拌)。将该反应通过LC-MS检查(100％转化成活化中间体-质量小于底物：M⁺-16)。可任选将氮杂内酯衍生物分离。在单独的瓶中，将环丙基磺酰胺(49mg，4eq)与THF混合，并且加入DBU(60μl，4eq)。完全活化后，通过注射器将该混合物加到该反应瓶中。将该反应混合物在微波炉中于100℃加热1小时。将该反应混合物通过旋转蒸发浓缩，与EtOAc和水混合，并且加入一滴3M HCl。将水相用EtOAc(3x15ml)洗涤。将合并的有机萃取液用盐水洗涤，并用MgSO₄干燥。把干燥剂过滤之后，通过旋转蒸发浓缩，将粗产物在YMC二氧化硅上通过柱色谱纯化(～70mg，乙酸乙酯，R_f＝0.7，磺酰胺原料0.6)。将含有所需产物的级份合并，并通过旋转蒸发浓缩，获得了化合物25(83mg，产率98％)，具有86％纯度。该化合物不用另外的纯化直接用于下一步骤。

步骤E：制备环丙烷磺酸{17-[2-(4-异丙基噻唑-2-基)-7-甲氧基喹啉-4-基氧基]-2，14-二氧代-3，13，15-三氮杂-三环[13.3.0.0^4，6]十八碳-7-烯-4-羰基}-酰胺，其具有如在下面化合物(26)中所示的具体立体化学

将化合物25(65mg，0.077mmol)溶解在4mL DCM中。加入2mLTFA，并且将该溶液搅拌20分钟。将该反应混合物倒在含有NaHCO₃和CHCl₃的分液漏斗中。用CHCl₃(3x50mL)萃取，并且用NaHCO₃(2x50mL)和盐水洗涤。将有机相用MgSO₄干燥，并通过旋转蒸发浓缩。将粗产物在YMC二氧化硅上通过快速色谱纯化(20g，乙醚)，获得了产物26，为白色固体(25mg，产率45％)。

实施例4：制备1-甲基-环丙烷磺酸[17-[2-(4-异丙基噻唑-2-基)-7-甲氧基喹啉-4-基氧基]-2，14-二氧代-3，13，15-三氮杂-三环[13.3.0.0^4，6]十八碳-7-烯-4-羰基]-酰胺，其具有如在下面化合物(28)中所示的具体立体化学

步骤A：制备1-甲基-环丙烷磺酸[17-[2-(4-异丙基噻唑-2-基)-7-甲氧基喹啉-4-基氧基]-13-(4-甲氧基苄基)-2，14-二氧代-3，13，15-三氮杂-三环[13.3.0.0^4，6]十八碳-7-烯-4-羰基]-酰胺，其具有如在下面化合物(27)中所示的具体立体化学

按照实施例3步骤D中描述的方法，但是使用1-甲基环丙基磺酰胺来代替环丙基磺酰胺(如WO 2004/043339中所述制得的)，通过二氧化硅柱色谱纯化(洗脱剂为乙醚)后，获得了本标题化合物(27)(24.5mg，43％)，为白色固体。

步骤B：制备1-甲基-环丙烷磺酸[17-[2-(4-异丙基噻唑-2-基)-7-甲氧基喹啉-4-基氧基]-2，14-二氧代-3，13，15-三氮杂-三环[13.3.0.0^4，6]十八碳-7-烯-4-羰基]-酰胺，其具有如在下面化合物(28)中所示的具体立体化学

将化合物27(20mg，0.023mmol)溶解在3ml二氯甲烷中，加入1ml TFA，并且将该反应混合物在室温搅拌20分钟。HPLC表明不存在原料。将饱和碳酸氢钠溶液(5ml)加到将该反应混合物中，并且将所得混合物萃取到CH₂Cl₂内。将有机萃取液用盐水洗涤，用MgSO₄干燥，并通过旋转蒸发浓缩。将所得油状物在YMC二氧化硅上通过柱色谱纯化(20g，乙醚)，获得了本标题化合物(28)(14.7mg，85％)，为白色粉末。HPLC纯度＞95％。

实施例5：制备1-甲基-环丙烷磺酸[18-[2-(4-异丙基噻唑-2-基)-7-甲氧基喹啉-4-基氧基]-2，15-二氧代-3，14，16-三氮杂-三环[14.3.0.0^4，6]十九碳-7-烯-4-羰基]-酰胺，其具有如在下面化合物(33)中所示的具体立体化学

步骤A：制备1-[[1-[庚-6-烯基-(4-甲氧基苄基)-氨基甲酰基]-4-[2-(4-异丙基噻唑-2-基)-7-甲氧基喹啉-4-基氧基]-吡咯烷-2-羰基]-氨基]-2-乙烯基-环丙烷甲酸乙酯，其具有如在下面化合物(29)中所示的具体立体化学

本标题化合物29是按照实施例3步骤A中描述的方法，但是使用庚-6-烯基-(对甲氧基苄基)-胺代替己-5-烯基-(对甲氧基苄基)-胺制得的。

步骤B：制备18-[2-(4-异丙基噻唑-2-基)-7-甲氧基喹啉-4-基氧基]-14-(4-甲氧基苄基)-2，15-二氧代-3，14，16-三氮杂-三环[14.3.0.0^4，6]十九碳-7-烯-4-甲酸乙酯，其具有如在下面化合物(30)中所示的具体立体化学

根据实施例3步骤B中描述的方法处理在步骤A中获得的化合物(29)，获得了本标题化合物(30)。

步骤C：制备18-[2-(4-异丙基噻唑-2-基)-7-甲氧基喹啉-4-基氧基]-14-(4-甲氧基苄基)-2，15-二氧代-3，14，16-三氮杂-三环[14.3.0.0^4，6]十九碳-7-烯-4-甲酸，其具有如在下面化合物(31)中所示的具体立体化学

根据实施例3步骤C中描述的方法处理在步骤B中获得的化合物(30)，获得了本标题化合物(31)。

步骤D：制备1-甲基-环丙烷磺酸[18-[2-(4-异丙基噻唑-2-基)-7-甲氧基喹啉-4-基氧基]-14-(4-甲氧基苄基)-2，15-二氧代-3，14，16-三氮杂-三环[14.3.0.0^4，6]十九碳-7-烯-4-羰基]-酰胺，其具有如在下面化合物(32)中所示的具体立体化学

根据实施例3步骤D中描述的方法处理在步骤C中获得的化合物(31)，但是使用LiHMDS作为碱来代替DBU(4eq，1M在THF中的溶液)。在室温2小时后该反应完全。通过二氧化硅柱色谱纯化后，获得了本标题化合物(32)，为白色固体，其不用另外的纯化而直接用于下一步骤。

步骤E：制备1-甲基-环丙烷磺酸[18-[2-(4-异丙基-噻唑-2-基)-7-甲氧基喹啉-4-基氧基]-2，15-二氧代-3，14，16-三氮杂-三环-[14.3.0.0^4，6]十九碳-7-烯-4-羰基]-酰胺，其具有如在下面化合物(33)中所示的具体立体化学

按照实施例3步骤E中描述的方法处理在上面步骤D中获得的化合物(32)(100mg)，获得了本标题化合物(33)(55mg，73％)。

实施例6：式(I)化合物的活性

复制子试验

在细胞试验中测定式(I)化合物抑制HCV RNA复制的活性。本试验证明了式(I)化合物在细胞培养中具有抗HCV复制子功能的活性。细胞试验是基于双顺反表达构建体，如Lohmann等人(1999)Science vol.285pp.110-113，Krieger等人(2001)Journal of Virology 75：4614-4624在多靶筛选策略方面作了改进。该方法基本上如下文所述。

该试验利用了稳定转染的细胞系Huh-7 luc/neo (此后被称作Huh-Luc)。该细胞系包含用于编码双顺反表达构造的RNA，所述表达构建体包含HCV 1b型的野生型NS3-NS5B区域，由脑心肌炎病毒(EMCV)的内核糖体进入位点(IRES)翻译而来，其前面是报道分子部分(FfL-荧光素酶)和可选标记部分(neo^R、新霉素磷酸转移酶)之后。该构建体通过5′和3′NTRs(非翻译区)与HCV 1b型接壤。在G418(neo^R)的存在下，复制子细胞的连续培养依赖于HCV RNA的复制。表达HCVRNA的稳定转染的复制子细胞被用于筛选抗病毒化合物，所述HCVRNA自动复制并达到高水平，其尤其是编码荧光素酶。

将复制子细胞平铺在添加有不同浓度的试验和对照化合物的384孔板上。培养3天后，通过测定荧光素酶的活性(使用标准荧光素酶测定底物和试剂，Perkin Elmet ViewLux^Tm ultraHTS微量培养板图像仪)，来测定HCV的复制。在对照培养物中的复制子细胞在不存在任何抑制剂的情况下具有高的荧光素酶表达。在Huh-Luc细胞上监测化合物对于荧光素酶活性的抑制活性，对于每个测定化合物得到了剂量-反应曲线。然后计算EC₅₀值，该值代表了使被检测的荧光素酶的活性水平或者更特别是在遗传上相关联的HCV复制子RNA的复制能力降低50％所需要的化合物的量。

抑制试验

该试验的目的是测定本发明化合物对于HCV NS3/4A蛋白酶复合物的抑制作用。该试验提供了本发明化合物抑制HCV NS3/4A蛋白酶解活性的有效性。

基本上按照Poliakov，2002 Prot Expression & Purification 25 363371中描述的方法测定全长丙型肝炎病毒NS3蛋白酶的抑制。简言之，在肽辅因子KKGSVVIVGRIVLSGK(ke Engstrm，Department ofMedical Biochemistry and Microbiology，Uppsala University，Sweden).[Landro，1997#Biochem 36 9340-9348]存在下通过分光荧光法测定depsipeptide底物Ac-DED(Edans)EEAbuψ[COO]ASK(Dabcyl)-NH₂(AnaSpec，San José，USA)的水解。将该酶(1nM)在含有25μM NS4A辅因子和抑制剂的50mM HEPES，pH7.5，10mM DTT，40％甘油，0.1％正辛基-D-葡糖苷中于30℃培养10分钟，通过加入0.5μM底物来开始反应。将抑制剂溶解在DMSO中，超声处理30秒，并且涡旋。在测定之间，把溶液在-20℃贮存。

将DMSO在测定样本中的终浓度调节至3.3％。根据公开的方法[Liu，1999 Analytical Biochemistry 267 331-335]来校正水解速度的内滤器效应。使用竞争性抑制模型和固定的Km值(0.15μM)，通过非线性回归分析(GraFit，Erithacus Software，Staines，MX，UK)来估算Ki值。对于所有测定，都至少进行两个平行测定。

下表1列出了根据上面的实施例制备的化合物。所测定的化合物的活性也列在表1中。

表1

实施例序号	化合物序号	EC₅₀(μM)复制子试验	Ki(nM)酶试验
实施例序号	化合物序号	EC₅₀(μM)复制子试验	Ki(nM)酶试验	实施例1	9	7.0×10^-3	0.12
实施例2	16	5.5×10^-2	0.45	实施例1	9	7.0×10^-3	0.12
实施例2	16	5.5×10^-2	0.45	实施例3	26	6.4×10^-3	0.4
实施例4	28	2.3×10^-3	0.3	实施例3	26	6.4×10^-3	0.4
实施例4	28	2.3×10^-3	0.3	实施例5	33	3.6×10^-3	0.3

实施例7：式(I)化合物的渗透性

该实施例测定通过人胃肠管细胞(canal)的式(I)化合物的转运。该分析使用传代数为40-60的众所周知的Caco-2细胞。

顶端(A)至底侧(B)的运送

将每一种化合物在2-4个孔中进行试验。底侧与顶侧孔分别含有1.5mL及0.4mL转运缓冲液(TB)，且测试物质的标准浓度为10μM。此外，所有试验溶液及缓冲液均含有1％DMSO。于实验前将转运平板用含有10％血清的培养基预包被30分钟以避免非特异性结合至塑料物质上。于过滤器支架上培育21至28天后，细胞已准备好用于渗透实验。

1号转运平板包括3行，每行各有4个孔。第1行表示“洗涤”，第2行表示“30分钟”，且第3行表示“60分钟”。2号转运平板包括3行，每行各有4个孔。第4行代表“90分钟”，第5行代表“120分钟”，且剩余的行数未经指定。

将培养基从顶端孔中移除，且将插入物转移至2个平板当中不具有插入物的转运平板(第1平板)中的洗涤行(第1行)中，其已在第1至5行中用1.5mL转运缓冲液(HBSS，25mM HEPES，pH7.4)制备。在A→B筛选中，底侧孔中的TB还含有1％牛血清白蛋白。

将0.5 mL转运缓冲液(HBSS，25mM MES，pH6.5)加到插入物中，且将细胞单层在转运缓冲系统中于37℃在多混合震动器中平衡30分钟。在缓冲系统中平衡后，通过EVOM碎块棒仪器(chop stick instrument)在各孔中测量经上皮的电阻值(TEER)。每孔的TEER值通常为400-1000Ω(依所用的传代数而定)。

将转运缓冲液(TB，pH6.5)从顶端取出，且将插入物转移至30分钟的行列(第2行)中，且将包括测试物质的新鲜的425μL TB(pH6.5)添加至顶端(供给者)孔中。将平板在多混合震动器中于37℃以约150至300rpm的低震动速度培育。在第2行中培育30分钟后，每隔30分钟，将插入物转移到新的预-温热的底侧(接受者)孔中；第3行(60分钟)，第4行(90分钟)以及第5行(120分钟)。

在实验约2分钟以及结束时，从顶端溶液中取出25μL样品。这些样品代表从实验开始到结束的供给者样品。在安排的各个时间点上，从底侧(接受者)孔中取出300μL，并且在实验结束时测量TEER的后值。将乙腈加到所有收集的样品中至在样品中最终浓度为50％。将所收集的样品贮存在-20℃下直到通过HPLC或LC-MS进行分析。

底侧至顶端的转运

将每种化合物在2-4个孔中进行测试。底侧和顶端的孔分别含有1.55mL和0.4mL TB，且测试物质的标准浓度为10μM。此外，所有的试验溶液和缓冲液都含有1％DMSO。实验之前，将转运平板用含有10％血清的培养基预包被30分钟以避免非特异性结合到塑料物质上。

在滤器支架上培养21至28天后，细胞已准备好用在渗透实验。将培养基从顶端孔取出，并且将插入物转移到不含插入物的新平板(转运平板)中的洗涤行(第1行)。转运平板包括3行，每行有4个孔。第1行表示“洗涤”，且第3行为“实验行”。转运平板已在前面在洗涤行第1行中用1.5mLTB(pH7.4)和在实验行第3行(供给者侧)中用1.55mLTB(pH7.4)，包括测试物质制备。

将0.5mL转运缓冲液(HBSS，25mM MES，pH6.5)加到第1行的插入物中，且将细胞单层在转运缓冲系统中于37℃在多混合震动器中平衡30分钟。在缓冲系统中平衡后，通过EVOM碎块棒仪器(chop stickinstrument)在各孔中测量TEER值。将转运缓冲液(TB，pH6.5)从顶端侧取出，并且将插入物转移至第3行，且加入400μL新鲜的TB，pH6.5。30分钟后，从顶孔(接受者)中取出250μL，且用新鲜的转运缓冲液替代。然后，提取250μL样品，且每隔30分钟用新鲜的转运缓冲液替代直到120分钟实验结束，最后，在实验结束时测定TEER的后值。在约2分钟后且在实验结束时，从底侧(供给者)隔室中提取25μL样品。这些样品代表来自在实验开始和结束时的供给者样品。

将乙腈加到所有收集的样品中至在样品中最终浓度为50％。将所收集的样品贮存在-20℃下直到通过HPLC或LC-MS进行分析

测定所吸收的累积分数FA_cum对时间，通过以下公式计算计算FA_cum对时间：

F A_{cum} = Σ \frac{C_{RI}}{C_{DI}}

其中C_Ri是在间隔i结束时的接受者浓度，并且C_Di是在间隔i开始时的供给者浓度。应该获得线性关系。渗透系数(P_app，cm/s)是通过以下公式计算的：

P_{app} = \frac{(k \cdot V_{R})}{(A \cdot 60)}

其中k是转运速度(min^-1)，定义为通过将吸收的累积分数(FA_cum)作为时间(min)的函数进行线性回归而获得的斜率，V_R是接受室(mL)中的体积，和A是滤器的面积(cm²)。

表2：参照化合物

男人中的吸收种类	标己	男人中的吸收％
男人中的吸收种类	标己	男人中的吸收％	被动转运
低(0-20％)	甘露醇甲氨蝶呤	1620	被动转运
低(0-20％)	甘露醇甲氨蝶呤	1620	中等(21-75％)	阿昔洛韦	30
高(76-100％)	普萘洛尔咖啡因	90100	中等(21-75％)	阿昔洛韦	30
高(76-100％)	普萘洛尔咖啡因	90100	主动转运
氨基酸转运蛋白	L-苯丙氨酸	100	主动转运
氨基酸转运蛋白	L-苯丙氨酸	100	活性流量
PGP-MDR1	地高辛	30	活性流量

下表3显示了，当在上述渗透性试验中测定时，本发明化合物的渗透性结果(P_app)，以10^-6cm/s为单位表示。

表3

化合物序号	P_app_(10^-6cm/s)
化合物序号	P_app_(10^-6cm/s)	9	11
26	3.6	9	11
26	3.6	28	8.6
33	31	28	8.6

实施例8：利托那韦对于HCV NS3/4a蛋白酶抑制剂的体外代谢阻断

使用3μM受试化合物与作为加强剂化合物的10μM利托那韦，在代谢阻断实验中测试不同的HCV NS3/4a蛋白酶抑制剂。

将受试化合物和利托那韦加到悬浮在磷酸钾缓冲液(pH＝7.4)内的人肝脏微粒体(蛋白浓度1mg/ml)中，以在最终的反应混合物中达到3μM受试化合物和10μM利托那韦的浓度。在未加强的平行反应中，不加入利托那韦。使用人肝脏微粒体来用于空白实验。加入由β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐(β-NADP，0.5mg/ml，653.2μM)、D-葡萄糖-6-磷酸(2mg/ml，7.1mM)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(1.5U/ml)在2％NaHCO₃内组成的辅因子混合物(以1∶3的比例)之后，将该反应混合物在37℃培养30或120分钟，然后通过把温度提高至95℃来停止该反应。使用HPLC-MS测定受试化合物浓度。

结果总结在下表4中。值是在指定培养时间之后，与初始受试化合物浓度相比，测定的受试化合物的百分比。每个值是两个独立实验的结果的平均值。

表4

化合物序号	30’		120’
	30’		120’		％测定的化合物		％测定的化合物
	没有加强剂	利托那韦	没有加强剂	利托那韦	％测定的化合物		％测定的化合物
	没有加强剂	利托那韦	没有加强剂	利托那韦	16	71	93	20	102
9	44	88	0	100	16	71	93	20	102

实验表明，通过加入10μM利托那韦，受试化合物(3μM)的代谢几乎被完全阻断了。

实施例9：利托那韦对化合物9在狗中的药动学的体内影响

使用在50％PEG400/水中制剂，测定以10mg/kg单剂量给药后化合物9在雄性小猎狗(Beagle dogs)中的口服药动学和10mg/kg利托那韦的“加强”影响。

将6只雄性小猎狗(体重为8-10kg)随机分成分别每组由3只动物组成的2组(加强和未加强)。包括未治疗或载体治疗的对照动物。动物在给药之前禁食过夜(大约12h禁食期)，并且在给药之前不接受任何食物直至给药后6小时。整个实验期间保持随意获得饮水。

未加强组的狗接受单次口服10mg/kg剂量的化合物9，配制成5mg/ml 50％PEG400/水。在单次口服给予10mg/kg化合物9之前约30分钟，加强组的狗接受一粒Norvir软胶囊(利托那韦，100mg/胶囊)。使用胃管通过口服管饲法给予药物制剂。

在给药化合物9之后0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时和24小时收集3ml血样。使用HPLC-MS来测定血浆浓度。结果如下表5所示，以与未加强组相比，加强组的药动学参数改变倍数来表示。

表5

药动学参数	当用利托那韦加强时化合物9的增强倍数
药动学参数	当用利托那韦加强时化合物9的增强倍数	C_max	31
AUC	55	C_max	31

这些结果证实了，利托那韦显著提高了化合物9在狗中的药动学，整体表现为AUC提高了55倍。