CN101238207A - 可旋转的灌注式随时间变化电磁力生物反应器及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供可旋转的灌注式随时间变化电磁力生物反应器，其具有可旋转灌注式培养腔室以及与所述可旋转灌注式培养腔室有效连接的随时间变化电磁力源。使用时，所述可旋转的灌注式随时间变化电磁力生物反应器为可旋转的灌注式随时间变化电磁力生物反应器中可旋转的灌注式培养腔室提供随时间变化的电磁力，以扩增其中含有的细胞。

Description

可旋转的灌注式随时间变化电磁力生物反应器及其使用方法
技术领域
本发明一般地涉及可旋转的灌注式随时间变化电磁力生物反应器及其使用方法，更具体地涉及在可旋转的灌注式随时间变化电磁力生物反应器中扩增细胞的方法，其中在扩增的同时使其受到随时间变化电磁力。
背景技术
已开发了用于培养对环境胁迫具有抗性或由坚固的细胞壁包围的单细胞细菌、酵母和霉菌的细胞培养方法。然而，哺乳动物细胞培养要复杂的多，这是因为哺乳动物细胞更加脆弱，并且具有更复杂的营养及其它环境需求来维持活力和细胞生长。细菌型细胞的大规模培养高度发达，这样的培养方法是需求较少，且不像哺乳动物细胞培养那样困难。细菌细胞可在大体积的液体培养基中培养，并且可剧烈搅动而不产生任何显著的损伤。另一方面，哺乳动物细胞无法经受过多的湍流作用而不对细胞产生损伤，并且通常需要供给复杂的营养培养基以支持生长。
另外，哺乳动物细胞具有其它的特殊需求；特别是大多数动物细胞通常偏好于将自身附着在某种基质表面上以保持活力和复制。小规模情况下，在带有小孔的容器中培养哺乳动物细胞，以为细胞提供锚定表面。然而，在这样的小孔容器中培养哺乳动物细胞的方法通常不能提供用于许多商业或研究应用而在足够大规模的基础上培养哺乳动物细胞的足够的表面积。为提供更大的表面积，开发了微载体珠以提供用于附着培养细胞的提高的表面积。带有粘附的培养细胞的微载体珠需要在传统生物反应器腔室中搅动以提供细胞的悬浮、新鲜养分的分布、以及代谢废物的除去。为实现搅动，这样的生物反应器腔室使用了由电动机驱动的内部螺旋桨或活动机械搅动装置，使得腔室内的活动部分引起流体培养基的搅动，以悬浮微载体珠和所附着的细胞。搅动流体培养基也可搅动其中的哺乳动物细胞，但使其受到高度的流体剪切应力，所述流体剪切应力可损伤细胞，并限制这些细胞根据细胞来源的能量进行有序组装。例如，当流体培养基相对于腔室壁、内部螺旋桨或活动机械搅动装置或者其它腔室组件具有明显的相对运动时，就会产生这样的流体剪切应力。如果细胞或者带有附着细胞的珠子彼此之间或者与腔室组件发生碰撞，细胞也可在具有内部活动组件的生物反应器腔室中受到损伤。
除了细胞损伤的缺点之外，在提供允许细胞装配成模拟完整器官中实际组织的空间三维形式的组织、并同时允许细胞以七天内至少七倍的速率倍增的条件方面，生物反应器和其它培养哺乳动物细胞的方法能力也非常有限。由于类似原因，常规的组织培养方法限制了例如所培养的组织发育成高度功能性特化或分化状态的能力，这被认为对哺乳动物细胞的分化以及分泌研究和药用目的的特化生物活性分子至关重要。与微生物不同，高等生物(例如哺乳动物)的细胞自身形成高度有序的多细胞组织。尽管这一自组装的确切机制尚不清楚，但在迄今为止所研究的情况中，已经发现细胞发育成组织依赖于细胞相对于彼此(相同或者不同类型的细胞)或其它锚定基质的取向和/或某些物质(因子)例如激素的存在与否。总之，常规培养方法不能同时实现足够低的流体剪切应力、充分的三维空间自由以及发生关键的细胞相互作用(彼此之间或者与基质之间)的足够时间，以允许很好的模拟体内的细胞和组织结构，而同时又提供加速的扩增、组织大小和/或组织构建体的生长和/或细胞数的增长，而保持所述细胞或组织的三维几何结构以及细胞-细胞几何结构和支持。
例如，Wolf等的美国专利5,155,035提供了使用灌注式生物反应器培养组织、组织构建体和细胞的方法，这解决了之前的问题并且不使组织和/或细胞受到破坏量的剪切应力。但是，Wolf等的公开内容提供的产率非常低。事实上，Wolf等的装置及其使用方法提供的低产率不足以使其具有实际的商业价值。
因此，非常需要一种可旋转的灌注式随时间变化电磁力生物反应器，其具有可旋转的灌注式培养腔室和与所述可旋转的灌注式培养腔室有效连接的随时间变化电磁力(“TVEMF”)源。也非常需要一种使用可旋转的灌注式TVEMF生物反应器扩增细胞的方法，其在应用时不但实现足够低的流体剪切应力、足够的三维空间自由和发生关键的细胞相互作用(彼此之间或者与基质之间)的足够时间，而且同时提供加速的扩增并保持所述细胞或组织的三维几何结构、和细胞-细胞几何结构和支持。
发明内容
本发明涉及可旋转的灌注式TVEMF生物反应器，其包含可旋转灌注式培养腔室和与可旋转灌注式培养腔室有效连接的TVEMF源。
本发明还涉及在可旋转的灌注式TVEMF生物反应器中扩增细胞的方法，其包括以下步骤：将培养基充入可旋转的灌注式TVEMF生物反应器的可旋转灌注式培养腔室中、将细胞置于可旋转灌注式培养腔室以起始三维TVEMF培养、使可旋转灌注式培养腔室绕轴以一定的转速旋转、通过调整转速来控制可旋转灌注式培养腔室的旋转以保持三维TVEMF培养以及使细胞暴露于TVEMF。所述TVEMF优选是δ波，更优选是微分方波、最优选是方波(遵循傅立叶曲线)形式。优选本发明的方法具有以下特性：共定位培养基和细胞，培养基与可旋转灌注式培养腔室之间基本上没有相对运动；所述细胞的三维空间取向自由，而同时基本上保持与所述细胞在体内时相同的三维几何结构以及细胞-细胞支持和几何结构。
在下述用于公开目的的本发明优选实施方案描述中，本发明的其它方面、特征和优点将是很明显的。本发明通过下述的优选实施方案可更完整地进行描述，但是并不旨在仅限于此。
附图简述
在附图中，
图1以示意图展示了培养基流动回路的一个优选实施方案；
图2是可旋转的灌注式TVEMF生物反应器一个优选实施方案的垂直截面图；
图3是沿图2中3-3线的截面图；
图4是可旋转的灌注式TVEMF生物反应器一个优选实施方案的垂直截面图；
图5是可旋转的灌注式TVEMF生物反应器的垂直截面图；
图6是在非旋转的参照系中典型细胞的轨迹。
图7是每旋转一周时细胞偏移量的图。
图8是在培养基的旋转参照系中代表性的细胞轨迹。
图9是TVEMF装置的侧视图。
图10是图9中所示的TVEMF装置的前视图。
图11也是图9和图10中所示的TVEMF装置的前视图，还显示位于其附近的可旋转的灌注式TVEMF生物反应器。
附图详述
在最简单的实施方案中，可旋转的灌注式TVEMF生物反应器包含可旋转灌注式培养腔室和与所述可旋转灌注式培养腔室有效连接的随时间变化电磁力源(“TVEMF(time varying electromagneticforce)-源”)。本文描述了优选的可旋转的灌注式TVEMF生物反应器。图2和3展示了具有相邻的TVEMF源(未显示)的可旋转的灌注式TVEMF生物反应器10的优选实施方案。图4是以带有集成TVEMF源的优选形式用于本发明的可旋转的灌注式TVEMF生物反应器10的截面图。图5展示了带有集成TVEMF源的可旋转的灌注式TVEMF生物反应器10。图9-11显示可旋转的灌注式TVEMF生物反应器的相邻TVEMF源。
当使用时，本发明通过对可旋转灌注式培养腔室灌注培养基在三维TVEMF培养中提供以下支持：呼吸气体的交换、养分的供给、代谢废物的除去。术语“灌注式”以及类似术语旨在指培养基可被倒在、分散在或充满可旋转的灌注式TVEMF生物反应器中可旋转灌注式培养腔室中的细胞上。所述灌注优选地可通过如图1所示的培养基流动回路，更优选通过直接注入，最优选透过扩散膜进行交换。在附图中，现在参看图1，所展示的是可旋转的灌注式TVEMF生物反应器的培养基流动回路1的一个优选实施方案，所述生物反应器具有可旋转的灌注式培养腔室19，充氧器21，促使培养基定向流动的装置(优选通过使用主泵15)，以及用于选择性输入培养基需求的供应歧管17，所述需求为例如但不限于养分6、缓冲剂5、新鲜培养基7、细胞因子9、生长因子11和激素13。在此优选实施方案中，主泵15将来自供应歧管17的新鲜培养基提供到充氧器21，所述培养基在此处充氧然后经过可旋转灌注式培养腔室19。移去来自可旋转灌注式培养腔室19中用过的培养基中的废物(优选通过主泵15移去)，并传递到废物18，剩余未被移到废物18的细胞培养基返回歧管17，在此处，它可优选接受新补充的培养基需求，其后由泵15通过充氧器21再循环至可旋转灌注式培养腔室19。
在运行时，培养基通过可旋转灌注式培养腔室19中的三维TVEMF培养物循环，并优选绕如图1所示的培养基流动回路1循环。在培养基流动回路1的此优选实施方案中，可响应化学传感器(未显示)作出调整，以保持可旋转灌注式培养腔室19中的恒定条件。控制二氧化碳压力和导入酸或碱以修正pH。将氧气、氮气和二氧化碳溶解在气体交换系统(未显示)中以支持细胞呼吸。培养基流动回路1在循环气体容量中添加氧并移去二氧化碳。尽管图1是可用于本发明的培养基流动回路的一个优选实施方案，但本发明不限于此。将培养基需求(例如但不限于氧、养分、缓冲剂、新鲜培养基、细胞因子、生长因子和激素)输入到可旋转的灌注式TVEMF生物反应器中也可手动、自动或通过其它控制手段进行，废物和二氧化碳的控制与移去同样如此。
图2是与相邻TVEMF源(未显示)有效连接的可旋转灌注式TVEMF生物反应器10的一个优选实施方案的截面侧视图，所述TVEMF源具有输入端12和输出端14。在图2中，外部管状外壳20可旋转地支持绕水平中轴21(除虚线外未显示)以及绕位于中轴21上输入轴23和输出轴25进行旋转。外部管状外壳20具有内壁27(优选为圆柱形)、输出横向端壁28和输入横向端壁29，其通常限定可旋转的灌注式培养腔室30，优选为圆柱形，优选为长形的。直齿轮32与外部管状外壳20的一个末端相连，并由电动机33驱动以使外壳20绕其水平中轴21旋转。
内部滤器装置35绕中轴21共轴放置，所述内部滤器装置35优选为管状，其可旋转地嵌入在输入轴23并与输出轴25(如虚线36所示)相连。输出轴25继而可旋转地安装在输出固定外壳40中，并且输出轴25具有位于外部的输出直齿轮41，其与第一独立驱动电动机42相连，以使输出轴25和内部滤器装置35独立于外部外壳20进行旋转。内部滤器装置35与外部管状外壳20的内壁27之间的环形空间限定了位于水平轴21上的可旋转灌注式培养腔室30。内部滤器装置35的外壁43与外部外壳20的内壁27之间是中间叶片构件系统50，其优选包含两个纵向延伸的叶片构件50a和50b，其优选绕中轴21彼此成等角间隔。叶片构件50a和50b中的每一个在第一纵向末端51具有第二径向臂52，其可旋转地安装在外部轴25上，在第二纵向末端54具有第二径向臂55，其与输入轴23(由虚线56表示)相连。输入轴23继而可旋转地嵌入输入固定外壳60中，输入轴23具有输入直齿轮61，其由第二独立驱动电动机62所驱动，以使叶片构件系统50独立于外部外壳20的旋转而进行旋转。
如图3所示，三个组件20、35和50(即内部滤器装置或构件35、外部外壳20、和中间叶片构件系统50)的角转动可优选以相同的角速度并且以相同方向绕水平旋转轴转动，优选基本上以相同的方向绕水平轴转动，使得三个组件之间基本上没有相对运动。这种运行条件使微载体珠在可旋转的灌注式TVEMF生物反应器10中可旋转灌注式培养腔室30内的流体培养基中回转悬浮，而不产生湍流。
滤器35的旋转优选可开始和停止，例如用于加入培养基，其将在滤器35的表面引起湍流并保持表面清洁。叶片构件50a和50b协助细胞在其生长时保持在旋转培养基中的空间位置。这对于较高密度的细胞、组织和组织样结构(例如骨细胞)特别有帮助。通过旋转流体和外部外壳20，几乎消除了壁边界层处的速度梯度。
图2的可旋转的灌注式TVEMF生物反应器10在运行时使培养基(优选含有新鲜养分和气体)输入到输入固定外壳60中的输入通路66，并通过密封的输入旋转接头70连接到输入轴23中的输入纵向通路67。输入轴23中的输入通路67通过密封的输入旋转接头75与外部外壳20末端帽中的径向供应通路72偶联。径向供应通路72继而连接到分隔外部外壳20中的径向定向输入端输入通道78与输出端输入通道79之间的空间，在此处输入端输入通道78和输出端输入通道79位于可旋转灌注式培养腔室30的相反两端。如箭头所示，当培养基在可旋转灌注式培养腔室30的两端输入时，培养基朝着外部外壳20的内壁27向外侧径向移动，接着朝着一般由垂直虚线80表示的中央平面在水平方向上纵向移动，接着朝着内部滤器装置35的外壁43向内侧径向移动。因此腔室30中的培养基一般具有在外部外壳20的中央平面80任一侧的径向平面中的环形运动。内部滤器装置35具有沿长度方向上的孔82，用于从可旋转灌注式培养腔室30输出培养基到内部，并且(尽管未在图2中展示)优选具有位于穿过孔82的纵向延伸的滤器织物，以防止腔室30中的微载体珠构件穿过孔82而离开。这样，可旋转灌注式培养腔室30中用过的培养基穿过内部滤器装置35的内部85然后通过输出轴25中的输出纵向通路86而输出到输出固定外壳40中的输出旋转接头输出88，然后到输出通路89，优选返回到培养基流动回路以再次补充(未显示)。
现在参见可旋转的灌注式TVEMF生物反应器10的优选实施方案，所述生物反应器10包含可旋转灌注式培养腔室230和与所述可旋转灌注式培养腔室230有效连接的TVEMF源，其中TVEMF源是环形线加热器296。环形线加热器296与可旋转灌注式培养腔室230集成在一起。可旋转灌注式培养腔室230优选是透明的，其还包含外部外壳220，所述外壳包含第一和第二横向末端帽构件290和291(优选为圆柱形)，其具有相对设置的用于容纳内部构件293(优选为圆柱形，优选是透明的，更优选是玻璃的)以及外部管状组件294(优选是透明的，且优选是玻璃的)的第一和第二末端表面228和229。合适的压力密封是本领域公知的，并优选已提供。内部和外部管状构件293和294之间是环形线加热器296，其优选可用于获得TVEMF扩增的合适孵育温度。线加热器296还优选可用作TVEMF源，其在使用时提供TVEMF给可旋转灌注式培养腔室230。第一末端帽构件290和第二末端帽构件291具有内部曲线形表面，其毗邻末端表面228、229以促进培养腔室230中的混合物更平滑的流动。第一末端帽构件290，和第二末端帽构件291分别具有第一中心流体转移轴颈构件292和第二中心流体转移轴颈构件295，其分别可旋转地安装在输入轴223和输出轴225上。每个转移轴颈构件294、295具有法兰以装入末端帽构件290、291中凹陷的沉孔中，并且附有第一锁紧垫圈环297和第二锁紧垫圈环298以防止相对于轴223、225的纵向移动。每个轴颈构件294、295具有中间环形凹陷，其连接到纵向延伸的沿圆周设置的通道。轴颈构件292、295中的每个环形凹陷通过末端帽构件290和291中的第一径向布置通道278和第二径向布置通道279与第一输入接头203和第二输入接头204分别偶联。在运行中，径向通道278或279中的培养基流过第一环形凹陷和轴颈构件292或295中的径向通道以使得培养基通过轴颈构件292、295进入到轴颈构件292、295的每个末端，其中优选所述凹陷是围绕轴223、225沿圆周设置的。
附带在末端帽构件290和291上的是第一管状轴承外壳205和第二管状轴承外壳206，其含有相对支撑输入轴223和输出轴225上的外部外壳220的球状轴承。第一轴承外壳205上附带第一链轮210，以为外部外壳220提供绕输入轴223和输出轴225以及纵向轴221沿旋转方向的旋转驱动。第一轴承外壳205和第二轴承外壳206也优选能以电动方式取出环状线加热器296和优选任何其它传感器，例如检测细胞位置变化的传感器，优选和/或检测三维TVEMF培养物的pH和/或温度变化的传感器。
内部滤器装置235包括内部管状构件215和外部管状构件216，它们沿其长度方向具有洞和/或孔，并具有带孔的第一和第二内部滤器装置末端帽构件217和218。内部管状构件215优选构建成两部分，其两部分带有咬合的位于中央的偶合部分，其每一部分分别附连于末端帽217或218。外部管状构件216优选设置在第一217和第二内部滤器装置末端帽构件之间。
所述末端帽构件217、218分别可旋转地支撑在输入轴223和输出轴225之上。内部构件215可旋转地附连至输出轴225，优选是通过销钉和与其配合的(interfitting)凹槽219。将带有织法(优选十微米织法)的织物224(优选尼龙)布置在外部构件216的外表面之上，并且附连在任一末端，优选通过O型圈。因为内部构件215附连在输出驱动轴225上的槽中，优选通过偶合销钉附连，所以输出驱动轴225可旋转内部构件215。内部构件215与支撑外部构件216的第一和第二末端帽217和218相偶合。输出轴225延伸通过第一固定外壳240中的轴承，并与第一链轮241相偶合。如所示，输出轴225具有管状孔222，其从位于密封件之间的第一固定外壳240中的第一通道289延伸至内部构件215，使得在使用时培养基可从内部构件215中流出通过固定外壳240。
内部构件235的第一和第二末端帽217和218与外部外壳220中轴颈292、295之间是叶片构件250a和250b的第一和第二毂227和226。在输入轴223上的第二毂226通过销钉231偶合至输入轴223，使得第二毂226优选随输入轴223旋转。每个毂227、226具有轴向延伸的通路，用于传送培养基使之穿过毂。
输入轴223延伸穿过第二固定外壳260中的轴承，该外壳用于可旋转地支撑输入轴223。第二纵向通路267延伸穿过输入轴223到保持垫圈环的中间位置，所述垫圈环放置在面板与外壳260之间的第二环状凹陷232中。第二末端帽构件291中的第三径向通路272允许凹陷中的培养基从第二末端帽构件291中退出。尽管没有显示，第三通路272连接至通道278和279中的每一个，优选通过管线和Y型接头进行连接。
图4中显示样品端口，其中沿第一轴延伸的第一孔237与室230的角233相交，形成受限的开口234。优选地，孔237在一端带有沉孔和带螺纹的环，以容纳圆柱形阀构件236，优选为螺纹方式。阀构件236稍微突出到室230的内部，并且阀构件236具有互补成形的顶端以接合开口234。优选地，阀构件236上的O型圈243提供密封。沿第二轴的第二孔244与第一孔237在O型圈243与开口234之间的位置相交。优选地，弹性体或塑料终止器245封闭第二孔244，可用注射器进入用以取出样品。为了取出样品，阀构件236向后移，以使得开口234和孔244打开。然后可使用注射器抽取样品，开口234可被重新封闭，因此外部污染不会到达TVEMF生物反应器10的内部。
在运行中，培养基输入到第二端口或通路266，而后到轴通路，由此通过第三径向通路272到达第一径向设置的通路278和第二径向设置的通路279。在运行中，当培养基通过轴颈292、294中的纵向通道进入室230时，培养基撞击在毂227、226的末端表面228、229上，并径向以及轴向分散而通过毂227、226中的通道。通过毂227、226的培养基撞击在末端帽构件217、218上，并且径向分散开来。进入的培养基流因此径向向外离开纵向轴221，并以环形形式流动，通过聚酯布224以及滤器装置235中的开口从每个末端退出，以经过通道266和289退出。通过控制外部外壳220、腔室230和内部滤器装置235的旋转速度和旋转方向，可获得任何期望类型的培养基动作。优选地，可以在连续供应培养基的同时获得基本为回转形式的运行。
图5是可旋转的灌注式TVEMF生物反应器10的优选实施方案的截面侧视图。图5中展示的可旋转的灌注式TVEMF生物反应器10的优选实施方案显示了TVEMF源线圈144，它与可旋转的灌注式TVEMF生物反应器10集成在一起，但是与环状线加热器296分开，它们两者都可用作TVEMF源。图5中展示的可旋转的灌注式TVEMF生物反应器10优选实施方案不同于图4中展示的可旋转的灌注式TVEMF生物反应器优选实施方案，因为图4仅公开了可优选用作TVEMF源的环状线加热器296。
如果不使用集成的TVEMF源(例如图4的环状线加热器296，或者例如图5的线圈144)施加TVEMF，可通过另一个优选的TVEMF源施加。例如图9-11展示了另一个TVEMF源的优选实施方案，TVEMF装置140，其可优选提供TVEMF给可旋转的灌注式TVEMF生物反应器中的三维TVEMF培养物，所述生物反应器不带有集成的TVEMF源，例如为图2中展示的可旋转的灌注式TVEMF生物反应器。具体地，图9是可与可旋转的灌注式培养腔室有效连接的TVEMF装置140的一个优选实施方案。图9是TVEMF装置140的侧面投影图，其中包含支撑座145，支撑在底座145上的线圈支架146，其中支架146上缠绕有线圈147。图10是图9中展示的TVEMF装置140的前投影图。图11展示与可旋转的灌注式TVEMF生物反应器148(例如图2中的)有效连接的TVEMF装置，使得图11中可旋转的灌注式TVEMF生物反应器148具有相邻的TVEMF源。使用时，可旋转的灌注式TVEMF生物反应器148可优选地插入线圈支架146中，支架146由支撑座145支撑，并缠绕有线圈147。由于TVEMF装置140与可旋转的灌注式TVEMF生物反应器148相邻，因此TVEMF装置140可再用作TVEMF源。另外，因为TVEMF装置140与可旋转的灌注式TVEMF生物反应器148相邻，TVEMF装置140可用于在所有类型(优选可旋转的)TVEMF生物反应器中产生TVEMF。
如本发明中所预期的，可以对经受随时间变化的电磁力的可旋转的灌注式TVEMF生物反应器作出多种改变，而不背离本发明的范围，因此本文含有的所有内容均应解释为用于说明而非限制。
发明详述
下文的定义意在辅助描述和理解本发明内容中所定义的术语。这些定义并不意味将这些术语限制在本申请全文所描述的内容以内。另外，关于TVEMF包括几种定义，在此方面的所有定义应被理解为互相补充，而不应理解为互相抵触。
本申请全篇中使用的术语“TVEMF”指“随时间变化的电磁力”。正如以上讨论的，本发明的TVEMF是δ波，更优选是微分方波，最优选是方波(遵循傅立叶曲线)。优选地，方波频率为约2-25周/秒，更优选约5-20周/秒，例如约10周/秒，TVEMF源的RMS值优选为约0.1mA到约1000mA，更优选为约1到10mA，例如6mA。施加到可旋转的灌注式TVEMF生物反应器的TVEMF优选在约0.05到约6.0高斯的范围内，更优选约0.05到约0.5高斯，最优选约0.5高斯。但是，这些参数并不意在限制本发明的TVEMF，因为它们可基于本发明的其它方面而变化。例如，可通过标准设备比如EN131 Cell Sensor Gauss Meter测量TVEMF。
本申请全篇中使用的术语“可旋转的灌注式TVEMF生物反应器”指包含与可旋转灌注式培养腔室有效连接的TVEMF源。在使用时，可旋转的灌注式TVEMF生物反应器指施加TVEMF的生物反应器，其可旋转并提供通过灌注保持三维TVEMF培养的方法，如上文附图说明中所述。运行时，TVEMF以合适的高斯水平传递到可旋转灌注式培养腔室的内部。可旋转灌注式培养腔室的容积优选为约100ml到约3升。本发明可旋转的灌注式TVEMF生物反应器的实例参见本文的图2、3、4和5(不意为限制)。优选地，可旋转的灌注式TVEMF生物反应器允许三维TVEMF培养物交换生长培养基(优选带有添加物)和氧气。不限于理论地，可旋转的灌注式TVEMF生物反应器提供数天或更长时间的细胞TVEMF扩增。
本申请全篇中使用的术语“三维TVEMF培养物”及类似术语，指细胞与允许细胞扩增的培养基的混合物，用于在可旋转灌注式培养腔室中TVEMF扩增所述细胞。在置于可旋转的灌注式TVEMF生物反应器中的可旋转灌注式培养腔室中时和/或向其施加了TVEMF之后，培养基和与其组合的细胞、组织或组织样结构称为三维TVEMF培养物。所述三维TVEMF培养物优选由可旋转的灌注式TVEMF生物反应器中的TVEMF扩增提供支持，其中细胞保持它们的三维几何结构以及细胞-细胞支持和几何结构。三维组织和/或组织样结构也可从细胞发育而来，并且在三维TVEMF培养物中维持并进一步扩增。
本申请全篇中使用的术语“有效连接”及类似术语旨在指TVEMF源可与可旋转的灌注式培养腔室连接，其连接方式使得在运行中TVEMF源可对可旋转的灌注式培养腔室和其中所含的细胞、组织或组织样结构传递TVEMF。如果TVEMF源与可旋转的灌注式培养腔室集成在一起，则它可以是有效连接的；如果TVEMF源与可旋转灌注式培养腔室相邻设置，则它也可以是有效连接的。如果TVEMF源能对可旋转灌注式培养腔室的内部传递TVEMF，那么所述TVEMF源是有效连接的。
本申请全篇中使用的术语“暴露于”及类似术语指对可旋转灌注式培养腔室中所含细胞提供TVEMF的过程。在运行中，本发明提供将TVEMF源打开并设置为优选的高斯范围和优选的波形，使得通过TVEMF源传递TVEMF，所述TVEMF源优选为线圈，更优选环状线加热器，最优选TVEMF装置。接着通过TVEMF源对可旋转灌注式培养腔室中的细胞传递TVEMF，从而使所述细胞暴露于TVEMF。
本申请全篇中使用的术语“细胞”指任何形式的细胞，例如，单个细胞、组织、细胞聚集体、预先附着到细胞附着基质(例如微载体珠)上的细胞、组织样结构或完整的组织切除物。所述细胞可来自于(但不限于)以下来源：哺乳动物、爬行动物、鸟类、鱼类、酵母和细菌。
本申请全篇中使用的术语“培养基”及类似术语，指包含但不仅限于培养介质和养分的液体，它对细胞随时间的生存非常重要。培养基可富含下述任意物质，但不限于此：培养介质、缓冲剂、生长因子、激素和细胞因子。培养基使细胞在其中悬浮并支持TVEMF扩增。培养基可优选地在加入到可旋转的灌注式TVEMF生物反应器的可旋转灌注式培养腔室之前与细胞混合，或者可优选在细胞加入到可旋转灌注式培养腔室之前加入，由此在可旋转灌注式培养腔室中混合所述培养基和细胞。在置于可旋转的灌注式TVEMF生物反应器中时和/或向其施加了TVEMF之后，所述培养基和所述细胞的组合称为三维TVEMF培养物。培氧基在TVEMF扩增期间可按照需要优选地富集和/或更新。培养基中所含的废物以及培养基自身可按照需要从三维TVEMF培养物中移出。用过的培养基中所含的废物可以是(但不限于)代谢废物、死细胞和其它有毒碎片。培养基可优选地富含氧，并且优选地具有氧、二氧化碳和氮携带能力。
本申请全篇中使用的术语“置于”及类似术语，指将细胞和培养基组合加入可旋转的灌注式TVEMF生物反应器的可旋转灌注式培养腔室之前，将细胞悬浮在培养基中的过程。术语“置于”也可指将细胞加入到已经存在于可旋转灌注式培养腔室中的培养基中。所述细胞可悬浮于其他的优选液体中，其包含如PBS和/或血浆。在置于可旋转的灌注式TVEMF生物反应器中时，向其施加TVEMF期间和之后，所述培养基和所述细胞的组合称为三维TVEMF培养物。细胞可与细胞附着基质一起置于可旋转灌注式培养腔室中。
本申请全篇中使用的术语“TVEMF扩增”及类似术语指通过使细胞经受约0.05至约6.0高斯的TVEMF而提高可旋转的灌注式TVEMF生物反应器中的细胞数的过程。优选地，所述细胞TVEMF扩增到是最初数量的七倍以上。细胞在本发明的可旋转的灌注式TVEMF生物反应器中的扩增提供了这样的细胞，其维持或具有与TVEMF扩增之前的细胞相同或者基本上相同的三维几何结构(three-dimensional geometry)和细胞-细胞支持(cell-to-cellsupport)及细胞-细胞几何结构(cell-to-cell geometry)。TVEMF扩增的其它方面也可提供本发明细胞的特殊特征。不限于理论地，TVEMF扩增不只提供高浓度的维持三维几何结构和细胞-细胞支持的细胞，还支持和维持三维组织和组织样结构的生长。
本申请全篇中使用的术语″细胞-细胞几何结构″指细胞的几何结构，包括细胞彼此之间相对的间距、距离和物理关系。例如，本发明的TVEMF扩增细胞(包括组织、细胞聚集体、和组织样结构)通常彼此保持与在体内相同的关系。所述扩增的细胞处于细胞之间自然间距的范围内，这与例如无法随时间和TVEMF扩增保持这种距离的二维扩增室相反。
本申请全篇中使用的术语“细胞-细胞支持”指一个细胞对相邻细胞提供的支持。例如，组织、细胞聚集体、组织样结构和细胞与体内其它细胞保持相互作用，例如化学的、激素的、神经的(可用/合适时)相互作用。在本发明中，这些相互作用通常维持在正常的功能参数范围内，例如，这意味着它们不会开始对其它细胞传送有毒或损伤信号(除非这是天然细胞和组织环境中存在的)。
本申请全篇中使用的术语“三维几何结构”指细胞在三维状态下的几何结构(与其天然状态相同或非常近似)，这与例如在培养皿中生长的细胞的二维几何结构相反，在培养皿中所述细胞变得扁平和/或伸展。不限于理论地，所述细胞的三维几何结构在可旋转的灌注式TVEMF生物反应器的三维TVEMF培养物中维持、支持和保持，使得所述细胞可发育成三维细胞聚集体、组织和/或组织样结构。另外，组织也可培养在可旋转的灌注式TVEMF生物反应器中，而同时维持三维几何结构和细胞-细胞支持及细胞-细胞几何结构。
对于上述三个定义中的每一个而言，涉及维持本发明细胞的“细胞-细胞支持”和“细胞-细胞几何结构”以及“三维几何结构”时，术语“基本相同”指在TVEMF扩增中提供天然的几何结构和支持，使得所述细胞不以例如失去功能、或者对其它细胞有毒或有害的方式发生改变。
在运行中，细胞置于可旋转的灌注式TVEMF生物反应器的可旋转灌注式培养腔室中。所述可旋转灌注式培养腔室在一个时期内旋转，在此期间通过TVEMF源在可旋转灌注式培养腔室中产生TVEMF。“在此期间”意为传递TVEMF的起始可以在可旋转灌注式培养腔室开始旋转之前、中间或之后。所述时期完成之后，TVEMF扩增的细胞从可旋转灌注式培养腔室中移出。在更复杂的可旋转的灌注式TVEMF生物反应器中，可周期性地更新和移出富含培养基需求的培养基，所述需求优选地包括但不限于细胞培养介质、缓冲剂、养分、激素、细胞因子和生长因子，其为细胞的生存提供支持。
在使用中，本发明提供稳定的培养环境，在所述环境中细胞可被导入、悬浮、组织、生长、维持，并通过同时使得流体剪切应力最小、为细胞和基质的空间定向提供三维自由以及在培养期间使细胞在特定空间区域内的定位增加而更好地保留脆弱的三维结构完整性。在使用中，本发明提供这三个标准(下文称之为“上述三个标准”)，并同时具有TVEMF源，所述TVEMF源使细胞暴露于由TVEMF源产生的TVEMF(优选以方波形式，更优选微分方波，最优选δ波)，以增强所述细胞的TVEMF扩增。本发明特别相关的是可旋转灌注式培养腔室的大小、所述细胞的沉降速率、转速、外部重力场以及TVEMF。
在本发明的运行中，稳定的培养环境指在细胞导入之前培养基中的条件，特别是流体速度梯度，其将支持细胞在导入后近乎均一的悬浮，由此产生加入细胞后的三维TVEMF培养物。在一个优选实施方案中，培养基最初稳定成近似为绕着在同样转动的可旋转灌注式TVEMF生物反应器的腔室壁内限定的轴作固体水平转动。所述腔室壁设置为相对于培养基和内部腔室组件而运动，使得最开始基本上不在其中引入流体剪切应力场。细胞被引入并通过稳定培养环境中的培养基，对其施加TVEMF，从而产生三维TVEMF培养物。所述细胞在重力、离心力和科里奥利力的影响下运动，三维TVEMF培养物的培养基中细胞的存在对培养基诱导产生了次级效应。培养基相对于可旋转灌注式培养腔室壁的显著运动、显著的流体剪切应力和其它流体运动，是由于所述培养基中这些细胞的存在产生的。
在大多数情况下，接触稳定培养环境的细胞以缓慢的速率沉降，优选低于0.1厘米/秒。因此，在三维TVEMF培养的早期阶段，有可能选择大范围的转速(优选约5到约120RPM)和腔室直径(优选约0.5到约36英寸)。优选地，最慢的转速是有利的，因为它使设备磨损以及使其它与处理三维TVEMF培养物有关的物流最小。
不限于理论地，相对于外部重力矢量以一定角速度绕基本水平的轴进行旋转优化了三维TVEMF培养物中悬浮的细胞的轨迹。在运行中，所述细胞扩增以形成大量细胞聚集体、三维组织和/或组织样结构，其大小随着三维TVEMF培养物的进展而增加。优选通过视觉、手动或自动地测定三维TVEMF培养物中三维组织块直径的增加来评估三维TVEMF培养物的进展。三维TVEMF培养物中细胞聚集体、组织或组织样结构大小的增加可能需要对转速进行合适的调整以优化特定的路径。可旋转灌注式培养腔室的旋转最佳地控制细胞相对于其它细胞以及相对于可旋转灌注式培养腔室的限定边界的碰撞频率、碰撞强度和定位。如果观察到所述细胞在向下侧过度向内变形，以及在向上侧过度向外变形，那么优选可提高RPM。如果观察到所述细胞过度的朝向外壁离心，那么优选可降低RPM。不限于理论地，由于就高细胞沉降速率或者高重力而言达到了操作的限制，操作者可能无法同时满足这些条件，并可能被迫在上述三个标准上接受性能上的降低。
细胞沉降速率和外部重力场对流体剪切应力设置了下限，甚至在本发明的操作范围之内也是这样，因为重力诱导细胞漂移通过三维TVEMF培养物的培养基。计算和测量证明，这一最小流体剪切应力非常接近于从细胞对于外部重力场强度的沉降(穿过培养基)终速度得到的流体剪切应力。离心力和科里奥利力导致的运动[经典角运动学提供下述将科里奥利力与物体质量(m)、它在旋转参照系中的速度(vr)和旋转参照系的角速度(□)相关联的方程：F科里奥利＝-2m(w×vr)]与由于细胞和培养基相互作用引起的次级效应一起发挥作用，以随着细胞、细胞聚集体、组织和组织样结构大小的增加而进一步降低流体剪切应力水平。
不限于理论地，随着外部重力场的降低，可获得更致密更大的三维结构。为了获得最小的流体剪切应力水平，优选所述腔室壁和内部组件以基本上与所述培养基相同的速率旋转。不限于理论地，这使得在三维TVEMF培养物上导致的流体速度梯度最小。优选地，所选择的流体剪切应力水平可以通过腔室组件的差异旋转来引入三维TVEMF培养物中。控制组织形成的速率和尺寸以将细胞尺寸(以及相关沉降速率)维持在能够满足上述三个标准的范围内是有利的。然而，优选地，可有意导入和控制速度梯度和所引起的流体剪切应力，以用于特定的研究目的，例如研究剪切应力对三维组织的影响。另外，在最初系统装填、样品获取、系统维持和培养终止过程中，出于物流等方面的目的而短暂破坏稳定的培养环境是允许而且可以接受的。
绕基本上垂直于重力的轴旋转细胞可产生多种沉降速率，根据本发明，它们均在从几秒(当沉降特征大时)到几个小时(当沉降差异小时)的长时间内保持空间定位于特定区域。不限于理论地，这允许这些细胞、细胞聚集体、组织和组织样结构有充分的时间进行在三维TVEMF培养物中形成多细胞结构并彼此相关所需的相互作用。优选地，细胞经历TVEMF扩增优选至少4天，更优选从约7天到约14天，最优选从约7天到约10天，甚至更优选约7天。优选地，TVEMF扩增可在本发明的可旋转的灌注式TVEMF生物反应器中持续最多160天，或者优选有约1000倍于原始细胞浓度的扩增率。
可旋转的灌注式培养腔室尺寸也影响本发明的三维TVEMF培养物中细胞的路径。优选选择这样的可旋转灌注式培养腔室的直径：其对于想要的三维TVEMF培养物具有合适的容积，优选从约100ml到约3L，并且其将允许足够的细胞接种密度。不限于理论地，由于离心力而产生的向外细胞漂移在较大的可旋转灌注式培养腔室半径下以及快速沉降的细胞中提高。从而将可旋转灌注式培养腔室的最大半径限定为最终的三维TVEMF培养阶段中(当已形成具有高沉降速率的大组织时)所预期的组织沉降特性的函数。
合并了重力、离心力、和科里奥利力导致的细胞运动而对三维TVEMF培养物中细胞的路径进行了分析计算。对这些控制方程的计算机模拟允许操作者对过程进行建模并选择对特定计划的三维TVEMF培养物来说可接受的(或最优的)参数。图6显示如从外部(非旋转)参照系所观察的细胞轨道的典型形状。图7是细胞距理想圆形流线的径向偏移作为RPM的函数的曲线图(对于以0.5cm/秒终速度沉降的典型细胞)。此图(图7)显示重力沉降诱导的正弦变化径向细胞偏移幅度的减小。图7还显示随着RPM提高，离心力导致径向细胞偏移(每次旋转)增加。这些相反的约束精细地影响选择最优的RPM以优选减少细胞与腔室壁的碰撞，或在腔室壁上的积累。随着外部重力场强度的增加或者细胞沉降速率的提高，就可用RPM的选择而言产生了限制性逐渐提高的一族曲线。优选地，使用该族曲线或者优选地解出这些控制轨道方程的计算机模型来选择给定的外部重力场强度下用于TVEMF扩增给定沉积速率的细胞的最优RPM和腔室尺寸。不限于理论地，随着典型三维TVEMF培养物的TVEMF扩增，所述组织、细胞聚集体和组织样结构的大小和沉降速率增加，因此可优选调节转速以对其进行优化。
在三维TVEMF培养物中，可见培养基旋转参照系的细胞轨道(图6)在旋转重力矢量的影响下以近似圆形的轨迹运动(图8)。不限于理论地，两种假想力——科里奥利力和离心力——是由于旋转(加速)的参照系而产生的，并使近乎圆形的轨迹变形。较高的重力水平和较高的细胞沉降速率产生较大半径的圆形轨迹，其对应于距非旋转参照系中所见的理想圆形轨道较大的轨道偏移。不限于理论地，认为与重力矢量不旋转的情况相比，在旋转参照系中具有不同沉降速率的细胞将长期保持彼此间接近的空间定位并极大地降低净累积分离；所述细胞沉降，但是以小圆沉降(如在旋转的参照系中观察到的)。因此，在运行中，本发明为不同沉降特性的细胞提供足够的时间进行机械相互作用和通过可溶化学信号进行相互作用。运行中，本发明提供优选约0cm/秒高至10cm/秒的沉降速率。
另外，在运行中，本发明使新鲜或再循环的培养基可在可旋转灌注式培养腔室中移动，优选以足以支持代谢气体交换、养分递送、和代谢废物移出的速率移动。这可略微降低否则将静止的三维TVEMF培养物的品质。在一个优选实施方案中，以约0.5cm/秒沉降的细胞和约5ml/分钟灌注通过500ml可旋转灌注式培养腔室的培养基，预期得到约0.001cm/秒的平均流速。有利地，这相比于重力或离心力引起的细胞运动要慢的多。优选的，灌注速率可随细胞代谢需求的增加而提高，在灌注产生显著的流体剪切应力之前有很宽的裕度。因此，优选引入支持优选组分的机制，包括但不限于递送到三维TVEMF培养物的培养基中的呼吸气体交换、养分递送、生长因子，还优选引入用于移出代谢废物的机制，这用于提供能够支持数小时到数月的大代谢负荷的长期三维TVEMF培养。
在运行中，本发明不只提供保持三维几何结构以及细胞-细胞支持的高浓度细胞，而且还在TVEMF扩增中为三维TVEMF培养物中的细胞提供可影响一些细胞特性的TVEMF。不限于理论地，例如上调促进生长的基因或者下调阻碍生长的基因。在使用中，本发明使三维TVEMF培养物中的细胞在TVEMF扩增中暴露于TVEMF，优选为约0.05到约6.0高斯，更优选约0.05到约0.5高斯，最优选约0.5高斯。通过TVEMF源产生电磁场。在运行中，可旋转的灌注式TVEMF生物反应器的TVEMF源可优选随可旋转灌注式培养腔室旋转，意味着与可旋转灌注式培养腔室绕相同的轴并优选以相同方向旋转。在另一个方面中，优选可旋转灌注式培养腔室可以以与TVEMF源相反的方向旋转。同样的，TVEMF源可优选相对可旋转的灌注式TVEMF生物反应器中可旋转灌注式培养腔室固定。所述TVEMF源可优选集成到(意为固定在)可旋转的灌注式TVEMF生物反应器的可旋转灌注式培养腔室上，或者可优选临近、优选高度接近、更优选可移去地接触可旋转灌注式TVEMF生物反应器的可旋转灌注式培养腔室。
通过变化的电势产生随时间变化的电磁场，优选为δ波的形式，更优选为微分方波，最优选为方波(遵循傅立叶曲线)，优选具有约10周/秒的频率。优选地，约0.1mA到约1000mA，更优选约10mA的电流产生从导电材料延伸至少数厘米的TVEMF。通常，频率和振荡电磁场强度的范围是参数，可对其进行选择，以用于实现特定细胞所需的刺激，并且用于为基因提供合适量的上调/下调，最终促进细胞的TVEMF扩增。
不限于理论地，除了通过本发明的运行产生的独特性质的细胞之外，由于所实现的基本上均一的同质悬浮，在应用可旋转灌注式培养腔室总容积培养细胞和组织方面可获得效果的增加。因此，有利地，本发明在运行中用较少的人力资源在相同的可旋转灌注式TVEMF生物反应器中提供数量增加的细胞或总的组织或组织样结构。许多细胞类型可用于此方法，包括但不限于哺乳动物、爬行动物、鱼类、酵母和细菌。本发明及其使用方法可对需要体内细胞行为的精确体外模型的细胞和组织生物学基础研究以及临床的应用提供帮助，这是因为，如上文和本申请全文中所指出的，本发明的TVEMF扩增的细胞和组织具有与天然存在的非TVEMF扩增细胞和组织基本上相同的三维几何结构以及细胞-细胞支持和细胞-细胞几何结构。
本发明的方法以迄今为止尚未得到的方式提供了上述这三个标准并优化三维TVEMF培养，同时提供TVEMF扩增，使得在足够量的时间内检测到足够的扩增率(每单位体积中数量的增加、对于组织是直径增加，或者浓度增加)。本发明很好的适应于实现该目的并获得本文所提到的以及其中固有的结果和优点。在不脱离本发明范围的情况下，本文所含的所有内容意在解释为说明而不是限制。
运行方法
在运行中，可旋转的灌注式TVEMF生物反应器优选具有100ml到3L的可旋转灌注式培养腔室，并优选首先连接到培养基流动回路，包括气体交换膜、泵和开口，然后灭菌，优选使用环氧乙烷气体灭菌，然后用无菌磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤，充水，充气。可旋转灌注式培养腔室完全充满适于待培养细胞的培养基，仅剩余预期用于培养基、细胞和/或预期的三维TVEMF培养物培养基的其它优选成分的空间。优选地，环境受控的培养箱完全围绕可旋转的灌注式TVEMF生物反应器，并且优选设置为约5％CO2和约21％氧气，温度优选为约26℃到约41℃，更优选约37℃±2℃。
在一个优选实施方案中，培养基流动回路设置的速率足以允许定时使用外部受控孵育环境平衡溶解的气体。首先，在培养基中建立稳定培养环境。旋转可优选以约10转/分钟(RPM)开始，这是产生使珠不通过重力导致的沉降或者通过转动导致的离心作用而在腔室壁上明显积累的微载体珠轨道的最慢速率。可旋转的灌注式TVEMF生物反应器中所有的可调节旋转部件也设置为相同旋转(优选10RPM)以使得三维TVEMF培养物相对于腔室内部表面基本上没有相对运动。这样，所述可旋转的灌注式TVEMF生物反应器在三维TVEMF培养物中产生最小流体速度梯度和流体剪切应力。
将细胞附着基质与细胞或组织同时或先后引入可旋转灌注式培养腔室，以给出合适的密度，优选5mg细胞附着基质/ml培养基，优选地，用于锚着依赖性细胞的细胞附着基质是微载体珠。所述细胞优选注入稳定培养环境，优选在短时间内注入，优选2分钟，使得在穿过递送系统时细胞的损伤最小化。所述细胞可优选使用注射器注入可旋转灌注式培养腔室，优选进入注入口，如图4和5所示。然后使培养基绕水平轴转动。
在细胞注入完成之后，腔室外壁很快(优选在1分钟以内)回复到最初的转动，优选匹配系统其它部分的角转动速率，更优选为10RPM，由此使剪切应力回复到对于细胞来说可获得的最小水平。在最初装入和附着期间，允许细胞在短的时间内进行平衡，优选2小时到4小时，更优选足够消除瞬时流动的时间。
在一个优选实施方案中，在细胞或组织装入和最初附着(细胞附着到附着基质，优选微载体珠)的过程中，培养基灌注速率设置为0，以保持所述细胞在可旋转灌注式培养腔室中，而不是使它们通过可发生严重的细胞损伤的滤器和培养基流动回路。由于最初细胞代谢总量小和该条件很短暂，所以在此期间，由灌注引起的混合、养分和其它培养基优选组分的递送、废物移去和呼吸气体交换的缺乏是完全可以容忍的。三维TVEMF培养物的破坏可来自于干扰近乎固体的三维TVEMF培养物的上浮气体。因此，优选地消除所有游离气泡，优选通过开口消除，以使得对三维TVEMF培养物的破坏最小。
优选地，在最初装入和附着期(优选2到4小时)后培养基流动回路设置为不干扰最初的三维组装过程的低流速(优选4.5ml/分钟)。随着三维TVEMF培养物中TVEMF扩增的进展，所装配组织的尺寸和沉降速率提高，可以提高系统转速(优选从10-30RPM或更多开始以约1-2RPM的增量提高)，以减少重力引起的直径逐渐增加的组织块的轨道变形(偏离理想的圆形流线)。
在TVEMF扩增中，可评估并调节可旋转灌注式培养腔室中三维TVEMF培养物的转速，使得细胞混合物保持基本在水平轴上或在水平轴周围。提高转速可保证防止碰壁，这对于脆弱结构的进一步三维生长是有害的。例如，如果三维TVEMF培养物中的细胞、组织或组织样结构在旋转循环的向下侧过度向内向和向下下落，在旋转循环的向上侧过度向外而向上不足，则优选提高旋转。最优地，建议使用者优选选择使得壁碰撞频率和强度最小化的转速，以维持所述细胞、组织或组织样结构的三维几何结构以及细胞-细胞几何结构和细胞-细胞支持。本发明的优选速度为约5到约120RPM，更优选约10到约30RPM。
三维TVEMF培养物可通过优选为透明的可旋转灌注式培养腔室进行视觉评估，并手动进行调节。所述细胞混合物的评估和调节也可通过监控TVEMF生物反应器中细胞位置的传感器(例如激光)自动进行。指示细胞移动过多的传感器读数将自动引起调节转速的机制。
另外，优选的，在最初装入和附着阶段(2到4个小时)之后，打开TVEMF源并调节，使得TVEMF输出在可旋转灌注式培养腔室的三维TVEMF培养物中产生所需的电磁场，优选为0.05高斯到6高斯，更优选从0.05高斯到约0.5高斯，最优选0.5高斯。TVEMF也可以在最初装入和附着阶段中施加到三维TVEMF培养物。优选在整个培养时间中对三维TVEMF培养物施加TVEMF直至培养终止。不限于理论地，TVEMF扩增不仅提供维持三维几何结构以及细胞-细胞支持的高浓度细胞，而且TVEMF在TVEMF扩增过程中可影响细胞的一些特性，例如上调促进生长的基因，或者下调阻碍生长的基因。
TVEMF源的线圈(或者优选环状线加热器)的尺寸以及它缠绕的圈数使得当TVEMF(优选为方波形式，优选从约0.1mA到约1000mA，更优选从约1mA到约10mA，例如10mA)施加给线圈时，在可旋转的灌注式TVEMF生物反应器的可旋转灌注式培养腔室内的三维TVEMF培养物中产生TVEMF(优选为从0.05高斯到6高斯，更优选从0.05高斯到约0.5高斯，最优选0.5高斯)。优选地，方波具有约2到约25周/秒的频率，更优选约5到约20周/秒，例如约10周/秒。但是，这些参数不意味着限制本发明的TVEMF，它们可根据本发明的其它方面有所改变。例如，可通过标准设备比如EN131 Cell Sensor Gauss Meter测量TVEMF。
细胞和组织的迅速扩增以及增加的总代谢需求可能需要额外间断性地将优选成分加入到三维TVEMF培养物的培养基中，所述成分包括但不限于养分、新鲜培养基、生长因子、激素和细胞因子。优选根据维持葡萄糖和其它养分水平的需要增加这种加入。在细胞和组织的迅速扩增过程中，可优选移去包含废物的用过的培养基。三维TVEMF培养物可被允许发展超过有可能选择良好细胞轨道的点；至重力引入降低了低剪切三维TVEMF培养物性能的点。
在本发明的一个优选实施方案中，在总培养过程中优选每15分钟以15秒间隔停止然后开始内部滤器装置，优选进行1分钟，至少为了使细胞从内部滤器装置表面清除。这防止基质、细胞和碎片积累在滤器上。另外，可根据需要收集三维TVEMF培养物中的细胞样品。如果所述样品通过注射器收集，腔室外壁可暂时停止以允许实际操作。
实施例1-三维大鼠骨细胞培养
准备
通过用去垢剂和杀菌消毒液(Roccal II)以用于消毒和清洗的推荐浓度进行清洗来准备图4优选实施方案中展示的100ml的可旋转的灌注式TVEMF生物反应器，清洗之后用高质量去离子水充分清洗和浸泡。通过高温灭菌对可旋转的灌注式TVEMF生物反应器灭菌，然后用培养基洗涤一次。
接种
将由基本必需培养基(MEM)和Earle盐、生长添加物、抗生素和10％胎牛血清组成的培养基充入可旋转的灌注式TVEMF生物反应器。在CO2培养箱中5％CO2，37℃的环境下平衡一小时之后，将包被了胶原蛋白的葡聚糖聚合物组成的基质Cytodex 3微载体珠(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)悬于少量培养基中并装入可旋转的灌注式TVEMF生物反应器的可旋转灌注式培养腔室中。附连在样品口之一的空注射器作为接种过程中的柔性体积储库以接受转移的介质。最终的珠浓度为5mg/ml腔室容积。
注入一定体积的培养基以完全充满所述腔室。使用附连在所述腔室的样品口的注射器除去所有气泡。将含有悬浮珠的可旋转灌注式TVEMF生物反应器中的可旋转灌注式培养腔室平衡约30分钟。
将单个分散的原代大鼠成骨细胞颅顶骨细胞悬浮在少量与可旋转灌注式培养腔室中所存在的相同培养基中，浓度为5×105个细胞/ml。然后通过样品开口注入将浓度为5×105个细胞/ml的50ml细胞接种在可旋转的灌注式培养腔室中。细胞接种密度约为10个细胞/珠。第二注射器附连在另一开口，作为所述腔室的柔性体积储库。打开电动机并且使可旋转的灌注式TVEMF生物反应器以约16RPM的速率旋转。也打开TVEMF源至方波形式(遵循傅立叶曲线)0.05高斯的高斯水平。
细胞附着和三维生长
在第24小时，使可旋转的灌注式TVEMF生物反应器停止旋转，通过注射器收集样品，然后转速再次提高到收集之前应用的速率，约16RPM。在显微镜下(400×放大率)分析样品。显微镜观察显示所述细胞良好附着在所述珠的表面上并变平。所述珠和细胞在此时没有关联形成高度有序结构。很少观察到轨迹畸变或离心。通过同时用注射器移去培养基和用另一个注射器添加相同体积的培养基来更换培养基，以移去无活力的漂浮细胞。在第三天，再次如上所述更换培养基，以确保对细胞的养分供应。在第四天细胞处于良好的状态。为了更新养分但是保留细胞分泌的生长因子，通过使用两个注射器如上所述同时移去四分之三的培养基并添加相同体积的新鲜培养基。在第五天重复相同的操作。
在第5天，再次收集三维TVEMF培养物的样品，样品的显微镜观察显示比先前所见更大的圆形珠群落。也注意到了珠之间的细胞跨越空间。开大进入装置的空气流以提供更多的氧气给快速生长的培养物。此时，观察到在“下”侧所述群落径向向内落，而在“上侧”向外落。
在第6天，将所述培养物转移到较大的250ml可旋转的灌注式TVEMF生物反应器，如图5中所示。在第8天，珠的有序群落很大(1-2mm)，在组装物中有8到15个珠，并注意到更多三维结构。此时更换培养基。此时，在外腔室壁上发生一些组织群落的积累。这一离心效应是很温和的。
所述细胞保持三维结构17天，其中在第9、10和12天再更换培养基，在第11、15和16天加入葡萄糖。通过双眼裸视来评估结果，也通过显微镜(400×放大率)进行评估。没有迹象表明存在机械损伤，并且细胞/珠群落的尺寸不超过装置能够悬浮细胞的能力。群落尺寸为1-2mm，由混合形态的细胞组成，这可能是开始分化的标记。根据研究者的选择终止运行。在TVEMF扩增之前，样品为5×105细胞/ml。在TVEMF扩增之后，样品为4.2×106细胞/ml。
实施例2-在悬液中形成人工组织
准备
组装由500ml细胞可旋转灌注式培养腔室、空心纤维充氧器、原形隔膜泵、线上pH传感器、样品口和用于灌输新鲜培养基的蠕动泵组成的500ml可旋转的灌注式TVEMF生物反应器，通过环氧乙烷(ETO)灭菌并充气两天。然后将磷酸缓冲盐水(PBS)装入所述腔室，用于洗涤和除去残余的ETO。在此步骤中，在充氧器中发现了泄漏，并使用无菌技术更换单元。接着在该系统中装入培养基并置于5％CO2和37℃的环境下的CO2培养箱中，所述培养基包含基本必需培养基(MEM)和Earle盐、生长添加物、抗生素和10％胎牛血清。在至少两天的剩余灭菌之后，如下所述将细胞和基质装入可旋转灌注式培养腔室。
接种
根据标准实验室方法重建Cytodex 3微载体珠(Pharmacia FineChemicals，Uppsala，Sweden)，悬浮在含有20％胎牛血清、100单位青霉素/ml和100ug链霉素/ml的微载体培养基(MicrocarrierMedium，MM)中，装入50ml注射器并注入腔室中。腔室中的珠密度为5mg/ml腔室容积。
接着将56次传代的幼仓鼠肾(Baby Hamster Kidney，BHK21)细胞装入系统中。为达上述目的，使装有冷冻的原液BHK21细胞的安瓿解冻。所述细胞以0.75×106个细胞/ml的浓度悬浮在50ml微载体(MM)中，然后将所有50ml都通过20ml注射器(2.5次注射)注入可旋转灌注式培养腔室。最终细胞接种浓度为约6个细胞/珠。于9:30AM将细胞装入所述腔室。
系统参数如下。恒定容积隔膜泵设置为以4.5ml/分钟的速度循环培养基。在加入细胞和珠四天之后，提高泵速率到20ml/分钟，以增加递送到反应器腔室中的氧。泵系统每两秒递送0.7ml。腔室和叶片构件的转速设置为15到20RPM并且在测试过程中保持不变。滤器装置转速是25到30RPM。这产生了极低湍流的环境，使得在细胞导入之后产生细胞/珠悬液。也打开TVEMF源至方波形式(遵循傅立叶曲线)0.05高斯的高斯水平。
细胞附着和三维生长
为了评估细胞附着到基质珠的速率，在将细胞最初装入腔室之后2、4、和6小时，通过注射器移出含有细胞-珠群落的三维TVEMF培养物样品用于细胞计数和显微镜观察。许多细胞在两个小时内附着于珠，并在所述珠表面变平，这是细胞生长之前的必要状态。在此实验中的早期，显微镜观察显示一些单个分散的细胞以10到30个细胞的组成簇。在第4小时，这些细胞簇附着在珠上并在其表面变平。此时，没有可见的轨道扰动或离心效应。
在第24个小时，一些珠被细胞所覆盖，但是还有许多漂浮的细胞。在此时，新鲜培养基通过开口或通道灌注进所述腔室中。四个小时之后收集样品，在视觉显微镜观察下，似乎几乎所有的细胞都附着在珠上，并且没有见到如之前所见的细胞-细胞聚集体。在第24小时的不佳表现可能是由于用于替代安装过程中发生泄漏的原有充氧器的新充氧器的毒性。
在第48小时，通过可旋转灌注式培养腔室视觉评估所述细胞，确定细胞的生长速率已经迅速提高。在第四天加入葡萄糖、谷氨酰胺(养分)和控制pH的氢氧化钠，以补偿细胞代谢和养分损耗。
在第五天，细胞和珠的聚集体为目力可见，将培养基更换为含Earle盐、生长添加物、抗生素并含有2％胎牛血清的基本必需培养基(MEM)，以减缓细胞代谢和生长。细胞继续生长，但在第7天达到148个细胞/珠的最大密度。形成了约1到2mm的非常大的均一群落，并且在所述测试的剩余期间内不发生解体。在三维阵列中形成了8到10个珠的有序均一群落，细胞在其上生长形成伸长的成纤维细胞形态的光滑膜样构造。在珠表面和珠间空间中，通过显微镜检查可以明显看见多层这些细胞。所述细胞位于有序的层中，细胞膜彼此紧密相邻。测试在第10天终止。珠上的多数组织样细胞聚集体的尺寸不超过可旋转的灌注式TVEMF生物反应器的可旋转灌注式培养腔室中在静止的三维TVEMF培养物中自由悬浮所述聚集体而不受内部边界限制的界限。观察到了一些3到8mm的非常大的组装物。观察到这些快速沉降的组织表现出变形严重的轨迹并且离心到外部腔室壁。观察到高能量的碰撞和剧烈的“翻滚”效应。认为这些超过了该方法保持静止、低剪切、三维TVEMF培养的能力。在TVEMF扩增之前，所述样品为0.75×106个细胞/ml。在TVEMF扩增之后，所述样品有5.4×106个细胞/ml。

Claims (25)

1.一种可旋转的灌注式随时间变化电磁力生物反应器，其包含：
-可旋转的灌注式培养腔室；和
-与所述可旋转的灌注式培养腔室有效连接的随时间变化电磁力源。
2.根据权利要求1的可旋转的灌注式随时间变化电磁力生物反应器，其中所述随时间变化电磁力源与可旋转的灌注式随时间变化电磁力生物反应器集成在一起。
3.根据权利要求1的可旋转的灌注式随时间变化电磁力生物反应器，其中所述随时间变化电磁力源临近可旋转的灌注式随时间变化电磁力生物反应器。
4.一种在可旋转的灌注式随时间变化电磁力生物反应器中产生以随时间变化电磁力扩增的细胞的方法，所述生物反应器具有可旋转的灌注式培养腔室和随时间变化电磁力源，所述方法包括以下步骤：
a.将培养基充入所述可旋转的灌注式培养腔室；
b.将细胞置于可旋转的灌注式培养腔室中并起始三维随时间变化电磁力培养；
c.使所述可旋转的灌注式培养腔室以一定转速绕轴旋转；
d.通过调节所述转速来控制可旋转的灌注式培养腔室的旋转，同时维持所述三维随时间变化电磁力培养；和
e.使所述细胞暴露于随时间变化电磁力以扩增所述细胞。
5.权利要求4的方法，其中所述随时间变化电磁力为方波形式。
6.权利要求5的方法，其中所述随时间变化电磁力为约0.05高斯至约6高斯。
7.权利要求5的方法，其中所述随时间变化电磁力为约0.05高斯至约0.5高斯。
8.权利要求5的方法，其中所述方波的频率为约2至约25周/秒。
9.权利要求5的方法，其中所述方波的频率为约5到约20周/秒。
10.权利要求5的方法，其中所述方波的频率为10周/秒。
11.权利要求4的方法，其中所述三维随时间变化电磁力培养具有以下特性：共定位培养基和细胞，培养基与可旋转灌注式培养腔室之间基本上没有相对运动；所述细胞的三维空间取向自由。
12.权利要求4的方法，其中通过灌注维持所述三维随时间变化电磁力培养。
13.权利要求4的方法，其中通过培养基流动回路补充所述培养基，所述培养基流动回路包含供应歧管、泵、充氧器、可旋转的灌注式培养腔室以及废物。
14.权利要求4的方法，其中步骤c之前打开所述培养基流动回路。
15.权利要求13的方法，其中在培养基进入所述可旋转灌注式培养腔室之前，所述培养基流动回路向所述培养基中补充选自下列物质中的至少一种：生长因子、细胞因子、激素、氧、养分、酸、碱、缓冲剂和新鲜培养基。
16.权利要求4的方法，其中所述可旋转的灌注式随时间变化电磁力生物反应器位于单位重力中。
17.权利要求4的方法，其中所述可旋转的灌注式随时间变化电磁力生物反应器位于微重力中。
18.权利要求4的方法，其中所述可旋转的灌注式随时间变化电磁力生物反应器位于单位重力以下中。
19.权利要求4的方法，其中所述培养基还包含至少一种细胞附着基质。
20.权利要求4的方法，其中所述转速为约5至约120RPM。
21.权利要求4的方法，其中所述转速为10RPM。
22.权利要求4的方法，其中所述细胞保持与所述细胞在体内时基本上相同的三维几何结构以及细胞-细胞支持和几何结构。
23.权利要求4的方法，其中所述随时间变化电磁力为微分方波形式。
24.权利要求4的方法，其中所述随时间变化电磁力为δ波形式。
25.权利要求4的方法，其中所述细胞扩增为原始数目的七倍以上。
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