CN101274098A - 利用抗-vegf抗体的治疗 - Google Patents

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cancer
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格温德林·法伊夫
埃里克·霍姆格伦
罗伯特·D·马斯
威廉·诺沃特尼
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Abstract

本发明总体涉及利用抗－VEGF抗体治疗疾病以及病理状况。更具体地，本发明涉及治疗利用抗－VEGF抗体易患或诊断为患有癌症的患者，优选与一或多种其它抗肿瘤治疗剂联用。

Description

利用抗-VEGF抗体的治疗
本申请是申请日为2004年05月28日、中国申请号为200480021966.8、发明名称为“利用抗-VEGF抗体的治疗”的发明申请的分案申请。
本申请要求2003年3月30日提交的美国临时申请60/474,480的优先权，其内容包含在此作为参考。
技术领域
本发明涉及人疾病以及病理状态的治疗。更具体地，本发明涉及癌症的抗血管生成疗法，其单独使用或与其它抗癌疗法联用。
背景技术
癌症仍然是导致人类死亡的头号威胁之一。在美国，癌症的每年新发患者为近1,300,000，并且是仅次于心脏病的第二号致死原因，在所有死亡中约占1/4。还预测，癌症会在5年内超过心血管疾病称为头号致死原因。实体瘤导致大部分死亡。尽管在具体癌症的医学治疗中有明显的进展，所有癌症的总体5年生存率在过去的20年中仅仅提高了约10％。癌症，或恶性肿瘤，以不受控制的方式转移并快速生长，导致及时检出和治疗非常困难。此外，癌症可通过自体内的几乎任何组织中一个或一些正常细胞的恶性转化而在体内的任何组织中形成，每种具有特定组织来源的癌症都彼此不同。
目前治疗癌症的方法的选择性相对较低。手术取出疾病组织；放疗导致实体瘤体积减小；化疗杀死快速分裂的细胞。具体地，化疗导致多种副作用，一些情况下非常严重以至于限制了给予的剂量，并因此使得可能有效的药物不能得以应用。此外，癌症通常对化疗药物产生抵抗。
因此，非常需要特异性且更为有效的癌症疗法。
血管生成是重要的细胞事件，其中血管内皮细胞增殖，去除多余细胞，并重组而从现存血管网络形成新血管。存在有力的证据表明血供的发展对于正常和病理增生过程是必不可少的(Folkman and Klagsbrun(1987)Science 235：442-447)。氧气和养料的递送，以及分解产物的去除，代表多细胞有机体中出现的大多数生长过程中的限速步骤。因此，通常推定血管间隔(vascularcompartment)是必须的，其不仅对于胚胎形成中的器官发育和分化如此，对于成人伤口愈合以及生殖功能而言也是。
血管生成也见于多种疾病的发病机理，包括但不限于，肿瘤，增生性视网膜疾病，老年性黄斑退变，类风湿性关节炎(RA)，和银屑病。血管生成对于大多数原发肿瘤以及其随后的转移而言是必不可少的。肿瘤可通过简单扩散到1-2mm的大小而吸收足够的养分和氧气，在这样的情况下，它们的进一步生长需要血供的建立。该过程被认为涉及邻近宿主成熟脉管系统的募集以启动新生血管毛细管的出芽，其向肿瘤基质生长并随后穿透到其中。此外，肿瘤血管生成涉及循环内皮细胞前体细胞从骨髓的募集以促进新生血管化Kerbel(2000)Carcinogenesis 21：505-515；Lynden et al.(2001)Nat.Med.7：1194-1201。
尽管新生血管的诱导被认为是肿瘤血管生成的主要方式，最近的数据表明一些肿瘤可通过共选择(co-opt)现存宿主血管而生长。共选择的脉管系统随后退化，导致肿瘤退化，其最终可被低氧诱导的肿瘤边缘血管生成逆转。Holash et al.(1999)Science 284：1994-1998。
考虑到血管生成的明显生理和病理重要性，进行了许多工作以说明能调节该过程的因素。据提示血管生成过程由促血管生成分子和抗血管生成分子之间的平衡调节，并在多种疾病具体是癌症中所述平衡可移动。Carmeliet andJain(2000)Nature 407：249-257。
血管内皮细胞生长因子(VEGF)(也称为VEGF-A或血管通透性因子(vascular permeability factor)(VPF)，已经被报道为正常和异常血管生成中的关键调节物。Ferrara and Davis-Smyth(1997)Endocrine Rev.18：4-25；Ferrara(1999)J.Mol.Med.77：527-543。与其它导致血管形成过程的生长因子相比，VEGF的独特性在于其对血管系统中内皮细胞的高特异性。Carmelietet al.(1996)Nature 380：435-439；Ferrara et al.(1996)Nature 380：439-442。此外，VEGF是雌性生殖道中周期性(cyclical)血管增殖以及骨生长和软骨形成中所需的。Ferrara et al.(1998)Nature Med.4：336-340；Gerber etal.(1999)Nature Med.5：623-628。
除了是血管生成和脉管形成中的血管生成因子，VEGF作为多效生长因子，显示在其它生理过程中的多种生物效应，诸如内皮细胞存活，血管通透性和血管舒张，单核细胞趋化以及钙内流。Ferrara and Davis-Smyth(1997)，supra。此外，最近的研究报道VEGF对一些非内皮细胞类型具有促有丝分裂效应，诸如对视网膜色素细胞，胰腺导管细胞以及雪旺细胞(Schwann cell)。Guerrin et al.(1995)J.Cell Physiol.164：385-394；Oberg-Welsh et al.(1997)Mol.Cell.Ehdocrinol.126：125-132；Sondell et al.(1999)J.Neurosci.19：5731-5740。
实质性证据还表明VEGF在涉及病理性血管增生的疾病或病症的进展中的重要作用。VEGF mRNA由所检测的大多数人肿瘤细胞过表达(Berkmanet al.J Clin Invest 91：153-159(1993)；Brownet dl.Human Pathol..26：86-91(1995)；Brownet al.Cancer Res.53：4727-4735(1993)；Mattern etal.Brit.J.Cancer.73：931-934(1996)；和Dvorak et al.Am J.Pat101.146：1029-1039(1995))。此外，眼液体中VEGF的浓度与糖尿病以及其它缺血相关性视网膜病患者中血管的活跃增殖的存在高度相关(Aiello etal.N.Engl.J.Med.331：1480-1487(1994))。此外，最近的研究证实了AMD患者中脉络膜新生血管膜中VEGF的定位(Lopez etal.Invest.Ophtalmo.Vis.Sci.37：855-868(1996))。
由于其在促进肿瘤生长中的重要作用，VEGF提供了治疗介入的有吸引力的靶。实际上，多种治疗靶的目的在于阻断VEGF或其受体信号系统，所述治疗靶目前正被开发用于治疗肿瘤疾病。Rosen(2000)Oncologist 5：20-27；Ellis et al.(2000)Oncologist 5：11-15；Kerbel(2001)J.Clin.Oncol.19：45S-51S。目前，单克隆抗体的VEGF/VEGF受体阻断作用以及酪氨酸激酶抑制剂对受体信号的抑制作用是最好的研究方法。VEGFR-1核酶，VEGF毒素偶联物以及可溶性VEGF受体也正被研究。
抗-VEGF抗体″Bevacizumab(BV)″，也称为″rhuMAb VEGF″或″AvastinTM″，是重组人源化抗-VEGF单克隆抗体，其根据Presta et al.(1997)Cancer Res.57：4593-4599所述制备。其包含突变的人IgG1框架区以及鼠抗-hVEGF单克隆抗体A.4.6.1的抗原结合互补决定区，后者可阻断人VEGF与其受体的结合。Bevacizumab的大约93％的氨基酸序列，包括大部分框架区，源自人IgG1，该序列的大约7％源自鼠抗体A4.6.1。Bevacizumab的分子量约149,000道尔顿并且是糖基化的。Bevacizumab正在临床研究用于治疗各种癌症，一些早期试验已经显示有希望的结果。Kerbel(2001)J.Clin.Oncol.19：45S-51S；De Vore et al.(2000)Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.19：485a；Johnson et al.(2001)Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.20：315a；Kabbinavar et al.(2003)J.Clin.Oncol.21：60-65。
发明内容
本发明涉及利用抗-VEGF抗体治疗疾病和病理状态的方法。具体地，本发明提供了治疗癌症的有效方法，其部分基于将抗VEGF抗体加入标准化疗导致癌症患者的统计学显著性以及临床有意义的改善这一出人意料的结果。
因此，一方面，本发明提供治疗人类患者中的癌症的方法，包括给药患者有效量的抗VEGF抗体以及抗肿瘤组合物，其中所述抗肿瘤组合物包含至少一种化疗剂。
可通过本发明治疗的癌症包括，但不限于，癌症，淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤，白血病或淋巴组织恶性疾病。癌症的更具体的例子包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)，肺癌(包括小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌以及肺鳞癌)，腹膜癌，肝细胞癌，胃的或胃癌(包括胃肠癌)，胰腺癌，神经母细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾或肾的癌，肝癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝的癌以及各种头和颈的癌症，以及B淋巴细胞瘤(包括低级/滤泡样非何杰金氏淋巴瘤(low grade/follicular non-Hodgkin’slymphoma)(NHL)；小淋巴细胞性(SL)NHL；中级/滤泡样NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL(high grade immunoblastic NHL)；高级淋巴母细胞NHL；高级小无裂细胞NHL(high grade small non-cleaved cell NHL)；bulky disease NHL；外套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)；AIDS-相关的淋巴瘤；和Waldenstrom′s巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴母细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病(Hairy cell leukemia)；慢性成髓细胞白血病(chronic myeloblastic leukemia)；和移植后淋巴组织增生疾病(PTLD)，以及母斑细胞病相关性异常血管增生(abnormal vascular proliferation associatedwith phakomatoses)，水肿(诸如与脑肿瘤相关的)，和Meigs综合症(Meigs′syndrome)。优选，所述癌症选自以下疾病：乳腺癌，结肠直肠癌，直肠癌，非小细胞肺癌，非何杰金氏淋巴瘤(NHL)，肾细胞癌，前列腺癌，肝癌，胰腺癌，软组织肉瘤，卡波奇肉瘤(kaposi’s sarcoma)，类癌样癌(carcinoidcarcinoma)，头和颈部癌，黑素瘤，卵巢癌，间皮瘤(mesothelioma)以及多发性骨髓瘤。更优选，所述癌症为结肠直肠癌。可由本发明治疗的癌性疾病包括转移癌。本发明的方法具体适于治疗血管化的肿瘤。
任何具有抗癌活性的化疗剂可根据本发明使用。优选，所述化疗剂选自以下物质组成的组：烷化剂，抗代谢物，叶酸类似物，嘧啶类似物，嘌呤类似物以及相关抑制剂，长春花碱类，epipodopyyllotoxins，抗生素，L-天冬酰胺酶，拓扑异构酶抑制剂，干扰素，铂配位复合物(platinum cooridnationcomplexes)，大黄素(anthracenedione)取代的脲，甲基肼衍生物，肾上腺皮质抑制剂，肾上腺皮质类固醇，孕激素，雌激素，抗雌激素，雄激素，抗雄激素，和促性腺激素-释放激素类似物。更优选，所述化疗剂选自以下物质组成的组：5-氟尿嘧啶(5-FU)，甲酰四氢叶酸(leucovorin)(LV)，伊立替康(irenotecan)，奥沙利铂(oxaliplatin)，卡培他滨(capecitabine)，紫杉醇(paclitaxel)和多西紫杉醇(doxetaxel)。两种或更多抗癌剂可以以鸡尾酒方式同抗-VEGF抗体联用给药。一种优选的联合化疗是基于5-氟尿嘧啶，包含5-FU和一或多种其它化疗剂。适宜的联用化疗剂量方案是本领域已知的并在例如Saltz et al.(1999)Proc ASCO 18：233a and Douillard et al.(2000)Lancet355：1041-7中描述。
一方面，本发明提供了延长患有癌症的人类患者的生存期的方法，包括给药所述患者有效量的抗-VEGF抗体组合物和抗肿瘤组合物，其中所述抗肿瘤组合物包含至少一种化疗剂，由此所述抗-VEGF抗体和所述抗肿瘤组合物的联合给药有效延长所述生存期。
另一方面，本发明提供延长人类癌症患者的无进展生存期(progressionfree survival)的方法，包括给药所述患者有效量的抗-VEGF抗体组合物和抗肿瘤组合物，其中所述抗肿瘤组合物包含至少一种化疗剂，由此所述抗-VEGF抗体和所述抗肿瘤组合物的联合给药有效延长人类患者的无进展生存期。
此外，本发明提供治疗一组人类癌症患者的方法，包括给药所述患者有效量的抗-VEGF抗体组合物和抗肿瘤组合物，其中所述抗肿瘤组合物包含至少一种化疗剂，由此所述抗-VEGF抗体和所述抗肿瘤组合物的联合给药有效增加所述患者组中的反应率。
另一方面，本发明提供延长人类癌症患者的反应时间(duration ofresponse)的方法，包括给药所述患者有效量的抗-VEGF抗体组合物和抗肿瘤组合物，其中所述抗肿瘤组合物包含至少一种化疗剂，由此所述抗-VEGF抗体和所述抗肿瘤组合物的联合给药有效延长反应时间。
本发明还提供治疗易患或诊断为患有结肠直肠癌的人类患者的方法，包括给药所述患者有效量的抗-VEGF抗体。所述结肠直肠癌是转移癌。所述抗-VEGF抗体可进一步与标准结肠直肠癌化疗诸如Saltz et al.(1999)所述的Saltz(5-FU/LV/伊立替康(irinotecan))方案联合。
一个优选实施方案中，本发明提供治疗患有转移性结肠直肠癌的人类患者或人类患者的组的方法，包括给药所述患者有效量的抗-VEGF抗体组合物和抗肿瘤组合物，其中所述抗肿瘤组合物包含至少一种化疗剂，由此所述抗-VEGF抗体和所述抗肿瘤组合物的联合给药导致被治疗患者的统计学显著且临床有意义的改善，所述改善通过生存期(duration of survival)，无进展生存期，反应率(response rate)或反应时间来测定。优选，所述抗肿瘤组合物是基于5-氟尿嘧啶的组合方案。更优选，所述组合方案包含5-FU+甲酰四氢叶酸，5-FU+甲酰四氢叶酸+伊立替康(IFL)，或5-FU+甲酰四氢叶酸+奥沙利铂(FOLFOX)。
本发明提供制品，其包含容器、组合物以及包装插页，所述组合物包含在容器内，该组合物含有抗-VEGF抗体，所述包装插页指示该组合物的使用者将所述抗-VEGF抗体组合物和包含至少一种化疗剂的抗肿瘤组合物给药癌症患者。
本发明还提供用于治疗人类患者中的癌症的试剂盒，其包含含有抗-VEGF抗体组合物的药物包，以及利用所述抗-VEGF抗体组合物和包含至少一种化疗剂的抗肿瘤组合物治疗患者中的癌症的说明。
本发明涉及下列各项：
1.治疗人患者中的癌症的方法，包括将有效量的抗-VEGF抗体以及抗肿瘤组合物给予患者，所述抗肿瘤组合物包含至少一种化疗剂。
2.项1的方法，其中所述癌症选自乳腺癌，结肠直肠癌，直肠癌，非小细胞肺癌，非何杰金淋巴瘤(NHL)，肾细胞癌，前列腺癌，肝癌，胰腺癌，软组织肉瘤，卡波奇肉瘤，类癌样癌，头和颈部癌症，黑素瘤，卵巢癌，间皮瘤以及多发性骨髓瘤组成的组。
3.项1的方法，其中所述癌症是转移的。
4.项1的方法，其中所述患者以前未接受治疗。
5.项1的方法，其中所述化疗剂选自以下物质组成的组：烷化剂，抗代谢物，叶酸类似物，嘧啶类似物，嘌呤类似物以及相关抑制剂，长春花碱类，epipodopyyllotoxins，抗生素，L-天冬酰胺酶，拓扑异构酶抑制剂，干扰素，铂配位复合物，大黄素取代的脲，甲基肼衍生物，肾上腺皮质抑制剂，肾上腺皮质类固醇，孕激素，雌激素，抗雌激素，雄激素，抗雄激素，以及促性腺激素-释放激素类似物。
6.项5的方法，其中所述化疗剂选自以下物质组成的组；5-氟尿嘧啶(5-FU)，甲酰四氢叶酸，伊立替康，奥沙利铂，卡培他滨，紫杉醇和多西紫杉醇。
7.项1的方法，其中所述抗肿瘤组合物包含至少两种化疗剂的组合。
8.项7的方法，其中所述抗肿瘤组合物包含5-FU和甲酰四氢叶酸.
9.项7的方法，其中所述抗肿瘤组合物包含5-FU，甲酰四氢叶酸和伊立替康.
10.项1的方法，其中一旦完成利用抗-VEGF抗体和所述抗肿瘤组合物的治疗，所述患者接受利用至少一种化疗剂的进一步化疗。
11.项10的方法，其中用于进一步化疗的化疗剂选自5-FU，甲酰四氢叶酸，伊立替康，奥沙利铂，卡培他滨，紫杉醇和多西紫杉醇组成的组。
12.项11的方法，其中所述化疗剂是奥沙利铂。
13.项1的方法，其中所述抗-VEGF抗体与单克隆抗-VEGF抗体A4.6.1结合同一表位，所述A4.6.1由杂交瘤ATCC HB 10709产生。
14.项1的方法，其中所述抗-VEGF抗体是人抗体。
15.项1的方法，其中所述抗-VEGF抗体是人源化抗体。
16.项15的方法，其中所述抗-VEGF抗体是人源化A4.6.1抗体或其片段。
17.项1的方法，其中所述抗-VEGF抗体经静脉输注给药。
18.项1的方法，其中所述抗-VEGF抗体以大约5mg/kg每2-3周给药患者。
19.项1的方法，由此所述抗-VEGF抗体和所述抗肿瘤组合物的联合给药有效延长人类患者的生存期。
20.项19的方法，其中与单用所述抗肿瘤组合物治疗的患者相比，所述人类患者的生存期增加至少约2个月。
21.项1的方法，由此所述抗-VEGF抗体和所述抗肿瘤组合物的联合给药有效延长人类患者的无进展生存期。
22.项21的方法，其中与单用所述抗肿瘤组合物治疗的患者相比，所述患者的无进展生存期增加至少约2个月。
23.项1的方法，由此所述抗-VEGF抗体和所述抗肿瘤组合物的联合给药有效提高人类患者组中的反应率。
24.项23的方法，其中与单用所述抗肿瘤组合物治疗的患者相比，所述人类患者组中的反应率明显增加，其Chi-square p-值小于0.005。
25.项1的方法，由此所述抗-VEGF抗体和所述抗肿瘤组合物的联合给药有效延长所述人类患者的反应时间。
26.项25的方法，其中与单用所述抗肿瘤组合物治疗的患者相比，所述患者的反应时间增加至少约2个月。
27.治疗易患或诊断为患有结肠直肠癌的人类患者的方法，包括给药所述患者治疗有效量的抗-VEGF抗体。
28.项27的方法，其中所述结肠直肠癌是转移癌。
29.项27的方法，其中所述抗-VEGF抗体与单克隆抗-VEGF抗体A4.6.1结合同一表位，所述A4.6.1由杂交瘤ATCC HB 10709产生。
30.项27的方法，其中所述抗-VEGF抗体是人抗体。
31.项27的方法，其中所述抗-VEGF抗体是人源化抗体。
32.项31的方法，其中所述抗-VEGF抗体是人源化A4.6.1抗体或其片段。
33.项27的方法，其中所述抗-VEGF抗体经静脉输注给药。
34.项27的方法，其中所述抗-VEGF抗体以大约5mg/kg每2-3周给药患者。
35.项27的方法，还包括给药所述患者一或多种化疗剂。
36.项35的方法，其中所述化疗剂选自以下物质组成的组：烷化剂，抗代谢物，叶酸类似物，嘧啶类似物，嘌呤类似物以及相关抑制剂，长春花碱类，epipodopyyllotoxins，抗生素，L-天冬酰胺酶，拓扑异构酶抑制剂，干扰素，铂配位复合体，大黄素取代的脲，甲基肼衍生物，肾上腺皮质抑制剂，肾上腺皮质类固醇，孕激素，雌激素，抗雌激素，雄激素，抗雄激素，和促性腺激素-释放激素类似物.
37.项35的方法，其中所述化疗剂选自以下物质组成的组：5-氟尿嘧啶，甲酰四氢叶酸，伊立替康，奥沙利铂，卡培他滨，紫杉醇和多西紫杉醇。
38.治疗患有转移性结肠直肠癌的人类患者或人类患者的组的方法，包括给药所述患者有效量的抗-VEGF抗体组合物和抗肿瘤组合物，其中所述抗肿瘤组合物包含基于氟尿嘧啶的化疗剂组合，由此联合给药所述抗-VEGF抗体和所述抗肿瘤组合物导致被治疗患者中统计学显著性以及临床有意义的改善，所述改善通过生存期，无进展生存期，反应率或反应时间测定。
39.项38的方法，其中所述抗肿瘤组合物包含5-FU，甲酰四氢叶酸和伊立替康。
40.项39的方法，其中所述抗肿瘤组合物包含具有500mg/m2 5-FU，20mg/m2甲酰四氢叶酸和125mg/m2伊立替康的方案，并以每周给药持续4周然后停止给药2周的为期6周的反复性循环来给药患者，并且其中所述抗-VEGF抗体以5mg/kg每隔一周给药患者。
41.项38的方法，其中所述抗肿瘤组合物包含5-FU和甲酰四氢叶酸。
42.项41的方法，其中5-FU和甲酰四氢叶酸以为期8周的反复循环、每个循环500mg/m2给药患者，所述循环包括每周给药持续4周然后停止给药2周，并且其中所述抗-VEGF抗体以5mg/kg每隔一周给药患者。
43.项41的方法，其用于被认为不是一线伊立替康治疗的最佳候选患者的人类患者。
44.项38的方法，其中所述抗肿瘤组合物包含5-FU，甲酰四氢叶酸和奥沙利铂。
45.制品，其包含容器，所述容器内包含含有抗-VEGF抗体的组合物以及包装插页，所述包装插页指示该组合物的使用者将所述抗-VEGF抗体组合物和包含至少一种化疗剂的抗肿瘤组合物给药癌症患者。
46.治疗人类患者中的癌症的试剂盒，其包含含有抗-VEGF抗体组合物的药物包，以及利用所述抗-VEGF抗体组合物和包含至少一种化疗剂的抗肿瘤组合物治疗患者中的癌症的说明。
附图简述
图1显示生存的Kaplan-Meier评估。存活时间中值(median duration ofsurvial)(由点状虚线表示)在给予伊立替康，氟尿嘧啶，和甲酰四氢叶酸(IFL)加上bevacizumab的组中为20.3月，而给予IFL+安慰剂的组中为15.6月，相应的死亡危险率为0.66(P＜0.001)。
图2显示无进展生存的Kaplan-Meier评估。无进展存活时间中值(由点状虚线表示)在给予伊立替康，氟尿嘧啶，和甲酰四氢叶酸(IFL)加上bevacizumab的组中为10.6月，而给予IFL+安慰剂的组中为6.2月，相应的死亡危险率为0.54(P＜0.001)。
图3A-3C提供了利用基线特征对不同患者亚组存活时间的分析。
图4显示生存的Kaplan-Meier评估，其比较了给药5-FU/LV+安慰剂的组相对于给药5-FU/LV+bevacizumab(BV)的组。
图5显示无进展生存的Kaplan-Meier评估，其比较了给药5-FU/LV+安慰剂的组相对于给药5-FU/LV+bevacizumab(BV)的组。
具体实施方案
1.定义
术语″VEGF″和″VEGF-A″可互换使用，指165个氨基酸的血管内皮生长因子，以及相关的121-，189-，和206-氨基酸的血管内皮细胞生长因子(其由Leung et al.Science，246：1306(1989)，和Houck et al.Mol.Endocrin.，5：1806(1991)描述)，以及其天然等位基因变体和加工的形式。术语″VEGF″也用于指含有165氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸8-109或1-109的多肽的截短形式。对任何这样形式的VEGF可在本文中鉴定，例如通过″VEGF(8-109)，″″VEGF(1-109)″或″VEGF165″。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置根据天然VEGF序列中所示编号。例如，截短的天然VEGF中的氨基酸位置17也是天然VEGF中的位置17(蛋氨酸)。截短的天然VEGF与天然VEGF相比具有对KDR以及Flt-1受体的结合亲合力。
″抗-VEGF抗体″是与VEGF以足够的亲和力以及特异性结合的抗体。优选，本发明的抗-VEGF抗体可用作治疗剂靶向并干扰其中涉及VEGF活性的疾病或病症。抗-VEGF抗体通常不与其它VEGF同系物诸如VEGF-B或VEGF-C结合，也不与其它生长因子诸如P1GF，PDGF或bFGF结合。优选的抗-VEGF抗体是单克隆抗体，其与杂交瘤ATCC HB 10709产生的单克隆抗-VEGF抗体A4.6.1结合相同的表位。更优选，所述抗-VEGF抗体是重组人源化抗-VEGF单克隆抗体，其根据Presta et al.(1997)Cancer Res.57：4593-4599制备，包括但不限于已知为bevacizumab(BV；AvastinTM)的抗体。
术语“VEGF拮抗剂”是指任何能中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性包括其与一或多种VEGF受体的结合的分子。VEGF拮抗剂包括抗-VEGF抗体和其抗原结合片段，受体分子以及衍生物，该VEGF拮抗剂与VEGF特异性结合，由此隔离了(sequestering)其与一或多种受体、抗-VEGF受体抗体和VEGF受体拮抗剂诸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制剂的结合。
在本说明书以及权利要求中，免疫球蛋白重链中残基的编号根据Kabatetal.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)所述的EU index进行，所述文献包含在本文作为参考。“Kabat中的EU index”指人IgG1 EU抗体的残基编号。
“天然序列”包括具有与自然界衍生的多肽相同的氨基酸序列的多肽。所述天然序列多肽可以从自然界分离或者通过重组和/或合成手段制备。术语“天然序列”多肽具体包括所述多肽的天然截短形式或分泌形式(如，胞外区序列)，天然变体形式(如，旁路剪接形式)以及天然存在的等位变体。
多肽“变体”指生物活性分子，其与天然序列多肽具有至少约80％的氨基酸序列同一性。所述变体包括，例如在所述多肽N或C末端加入、缺失了一或多个氨基酸残基的多肽。通常，变体与天然序列多肽具有至少约80％氨基酸序列同一性，更优选至少约90％氨基酸序列同一性，更优选至少约95％氨基酸序列同一性。
术语“抗体”是指最广意义上的抗体，具体包括人、非-人(例如鼠)和人源化的单克隆抗体(包括全长或完整单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体(multivalent antibody)多特异性抗体(如双特异性抗体)和抗体片段(参照以下说明)，只要它们显示所需的生物学活性。
除非另有说明，本文术语“多价抗体”表示含有三个或更多抗原结合位点的抗体。所述多价抗体优选被改造成包含三个或更多抗原结合位点并通常不是天然序列IgM或IgA抗体。
″抗体片段″包括完整抗体的仅仅一部分，通常包括完整抗体的抗原结合位点并由此保持与抗原结合的能力。本发明抗体片段的实例包括：(i)Fab片段，其具有VL，CL，VH和CH1区；(ii)Fab′片段，其为在CH1区C末端具有一或多个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)Fd片段，其具有VH和CH1区；(iv)Fd′片段，其具有VH和CH1区以及位于CH1区C末端的一或多个半胱氨酸残基；(v)Fv片段，其具有抗体单个臂的VL和VH区；(vi)dAb片段(Wardet al.，Nature 341，544-546(1989))，其由VH区组成；(vii)分离的CDR区；(viii)F(ab′)2片段，其为包含两个由铰链区二硫桥连接的两个Fab′片段的二价片段(例如单链Fv；scFv)(Bird etal.，Science 242：423-426(1988)；和Huston etal.，PNAS(USA)85：5879-5883(1988))；(x)具有两个抗原结合位点的″二价抗体(diabodies)″，包括在相同多肽链中与轻链可变区(VL)连接的重链可变区(VH)(见，例如，EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger etal.，PYOC.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993))；(xi)″线性抗体″，其包含一对串联的Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，其与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata et al.Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995)；和US Patent No.5,641,870)。
本文术语“单克隆抗体”是指自一群基本同质的(homogeneous)抗体群获得的抗体，即除了少量可能天然存在的突变以外，包含在该群中的各个抗体完全相同。单克隆抗体针对单个抗原高度特异。而且，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原的单个决定簇。修饰词“单克隆”不解释为需通过任何特殊方法产生抗体。例如，根据本发明应用的单克隆抗体可通过Kohler等(Nature，256：495(1975))首先描述的杂交瘤法，或者重组DNA法制备(例如见美国专利4816567)。还可用例如Clackson等(Nature，352：624-628(1991))和Marks等(J.Mol.Biol.，222：581-597(1991))所述的技术从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。
本文中单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其重链和/或轻链的一部分与源自具体物种或属于具体抗体种类或亚类的抗体的相应序列相同或同源，但所述链的剩余部分的序列与源自另一个物种或属于另一个抗体种类或亚类的抗体(以及此抗体的片段，只要它们显示所需的生物学活性)的相应序列相同或同源(美国专利4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。
“人源化”非人(例如鼠)抗体是包含非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。大多数场合，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，但其中受体的超变区残基被具有所需特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类等非人源物种抗体(供体抗体)的超变区残基所取代。在一些实例中，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基由相应的非人类残基所取代。而且，人源化抗体可包括在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。这些修饰旨在进一步改善抗体的性能。通常，人源化抗体基本上包括至少一个(通常包括两个)可变区的全部，其中超变环的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的相应部分，而FR的全部或基本上全部是人免疫球蛋白的序列。人源化抗体还任选包括至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人的免疫球蛋白恒定区。详见Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
“人抗体”是具有相应于人产生的抗体的氨基酸序列的抗体和/或使用本文公开的任何一种制备人抗体的技术制备的抗体。人抗体的定义明确排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。使用各种本领域已知的技术可产生人抗体。在一个实施方案中，人抗体选自噬菌体文库，该噬菌体文库表达人抗体(Vaughan等Nature Biotechnology 14：309-314(1996)：Sheets等PNAS(USA)95：6157-6162(1998))；Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222：581(1991))。也可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物制造人抗体，该转基因动物可以是例如内源性免疫球蛋白基因被部分或完全灭活的小鼠。攻击后观察人抗体的产生，其与在人中所见的情形在各方面均十分相似，包括基因重排，组装，和抗体库。该方法在例如美国专利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016和以下科学出版物中描述：Marks等，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg等，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology 14：845-51(1996)；Neuberger，NatureBiotechnology 14：826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。可选地，可通过将产生针对目的抗原的抗体的人B淋巴细胞(此种B淋巴细胞可自个体回收或在体外被免疫)永生化制备人抗体。见例如，Cole等，单克隆抗体和癌症治疗，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerner等，J.Immunol.，147(1)：86-95(1991)；和美国专利5,750,373。
“亲和力成熟”的抗体是其中的一个或多个CDRs发生一种或多种改变并导致较不具有这些改变的亲本抗体该抗体对抗原的亲和力提高。优选亲和性成熟的抗体对目的抗原具有纳摩尔甚至皮摩尔的亲和力。亲和力成熟抗体可由已知的方法产生。Marks等，Bio/Technology，10：779-783(1992)通过VH和VL区域改组描述了亲和力成熟。CDR和/或框架残基的随机突变的描述见：Barbas等，Proc Nat.Acad.Sci，美国，91：3809-3813(1994)；Schier等，Gene，169：147-155(1995)；Jackson等，J.Immunol.，154(7)：3310-9(1995)；和Hawkins等，J.Mol.Biol.，226：889-896(1992)。
“分离的”抗体是指从其天然环境成份中鉴定和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染成份是可能干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，且可能包括酶，激素，和其它蛋白类或非蛋白类溶质。在优选的实施方案中，该多肽可纯化成(1)按劳里(Lowry)方法测定的抗体重量超过95％，且最优选重量超过99％，(2)其纯化程度足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列，或(3)在还原型或非还原型条件下进行SDS-PAGE并使用考马斯蓝或者，优选银染测定具有同质性。分离的抗体包括在重组细胞内的原位多肽，因为该抗体天然环境中的至少一种成份不存在。然而，一般来说，分离的抗体由至少一个纯化步骤制备。
抗体的″功能性抗原结合位点″是能够结合靶抗原的位点。所速抗原结合位点的抗原结合亲和力不必与所述抗原结合位点所来源的亲代抗体一样强，但结合抗原的能力必须可利用多种已知评价抗体与抗原的结合的方法中的任意一种来测定。此外，本文所述多价抗体的每个抗原结合位点的抗原结合亲和力在量上不必相同。对于本文的多聚体抗体，功能性抗原结合位点的数目可利用以下实施例2所述的超速离心分析来评估。根据该分析法，靶抗原与多聚体抗体的以不同比例组合，并且所述复合体的平均分子量在推定存在不同数目的功能性结合位点存在的条件下测定。这些理论值与所得实际试验值相比以评估功能性结合位点的数目。
具有指定抗体的“生物性质”的抗体是具有使得所指定的抗体与结合相同抗原的其它抗体区别开来的一或多种生物性质的抗体。
为筛选结合与位于目的抗体结合的抗原上的表位的抗体，可进行常规交叉-阻断(cross-blocking)试验，诸如Antibodies，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，Ed Harlow和David Lane(1988)中所述。
“激动剂抗体″是结合并活化受体的抗体。通常拮抗剂抗体的受体活化能力在质上至少与所述受体的天然激动剂配体相似(并且可以在量上基本相似)。激动剂抗体的实例是与TNF受体超家族中的受体结合并诱导表达TNF受体的细胞的凋亡的激动剂抗体。测定凋亡的诱导的试验的描述见WO98/51793和WO99/37684，均包含在此作为参考。
“疾病”是可从利用所述抗体的治疗中受益的任何疾病。这包括慢性和急性疾病和病症，包括使得哺乳动物易患所述疾病的病理性状态。本发明治疗的疾病的非限制性实例包括良性和恶性肿瘤；白血病和淋巴组织恶性疾病；神经元，神经胶质，星形细胞，下丘脑以及其它腺体，巨噬细胞，上皮细胞，基质以及囊胚腔(blastocoelic)的疾病；以及炎性，血管生成性以及免疫性疾病。
术语“治疗有效量”指可有效治疗哺乳动物中的疾病或病症的药物量。对于癌症，药物有效量可减少癌细胞数量；减小肿瘤体积；抑制(即减慢到一定程度并优选停止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即减慢到一定程度并优选停止)肿瘤转移；在一定程度抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解一或多种与癌症相关的症状。药物可以阻止已存在的肿瘤细胞的生长或杀死这些肿瘤细胞，所述药物可以是细胞抑制剂或细胞毒性剂。对于癌症治疗，体内效力可例如通过评估生存期，疾病进展时间(time to disease progression，TTP)，反应率(RR)，反应时间，和/或生活质量来测定。
“治疗”指治疗性疗法和防病或预防措施。需要治疗的包括那些已患该病或那些需预防该病的人。
术语“癌症”和“癌性”是指或者描述哺乳动物中一般特征在于细胞生长不受调控的生理学状态。癌症的例子包括，但不限于，癌，淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤，白血病或淋巴组织恶性疾病。癌症的更具体的例子包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)，肺癌(包括小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌以及肺鳞癌)，腹膜癌，肝细胞癌，胃的或胃癌(包括胃肠癌)，胰腺癌，神经母细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜或子宫癌，唾液腺癌，肾或肾的癌，肝癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝的癌，各种类型的头和颈癌，以及B-细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡样非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞性(SL)NHL；中级/滤泡样NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高级小无裂细胞NHL；bulky disease NHL；外套细胞淋巴瘤；AIDS-相关的淋巴瘤；和Waldenstrom′s巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴母细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞白血病；移植后淋巴组织增生疾病(PTLD)，母斑细胞病相关性异常血管增生，水肿(诸如与脑肿瘤相关的)，以及Meigs综合征。
本文术语“哺乳动物宿主”指任何相容的移植物的受体。“相容”是指将接受供出的移植物的哺乳动物宿主。优选，所述宿主是人。如果移植物供体和所述受体都是人，优选他们的II型HLA抗原匹配以改善组织相容性。
本文所用术语“细胞毒作用制剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意在包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)，化疗剂和毒素例如小分子毒素或细菌，真菌，植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体。
术语″抗肿瘤组合物″指用于治疗癌症的组合物，其包含至少一种能够抑制或预防肿瘤生长或功能，和/或导致肿瘤细胞破坏的活性治疗剂。适合包含在用来治疗癌症的抗肿瘤组合物中的治疗剂包括，但不限于，化疗剂、放射活性同位素，毒素，细胞因子诸如干扰素，以及靶向细胞因子的拮抗剂，与肿瘤细胞相关的细胞因子受体或抗原。例如，用于本发明的治疗剂可以是诸如抗-HER2抗体和抗-CD20抗体，或小分子酪氨酸激酶抑制剂诸如VEGF受体抑制剂和EGF受体抑制剂。优选所述治疗剂是化疗剂。
“化疗剂”是在癌的治疗中使用的化学化合物。化疗制剂实例包括烷化剂，如噻替哌(thiotepa)和CYTOXANTM环膦酰胺(cyclosphamide)；烷基磺酸酯如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶如benaodopa，卡波醌(carboquone)，美妥替哌(meturedopa)和尿烷亚胺(uredopa)；氮丙啶(ethylenimine)和methylamelamine包括六甲蜜胺(altretamine)，三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine)，三亚乙基磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(acetogenins)(具体是bullatacin和bullatacinone)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)，卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；cryptophycins(具体是cryptophycin 1和cryptophycin 8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；eleutherobin；pancratistatin；sarcodictyin；spongistatin；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥，萘氮芥，胆磷酰胺(cholophosphamide)，雌氮芥(estramustine)，异环磷酰胺(ifosfamide)，氮芥(mechlorethamine)，盐酸氧氮芥；美法仑(melphalan)，新氮芥(novembichin)，胆甾醇苯乙酸氮芥(phenesterine)，松龙苯芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥；亚硝基脲(nitrosureas)如亚硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)，雷莫司汀(ranimustine)；抗生素诸如enediyne抗生素(例如calicheamicin，具体是calicheamicin gammalI和calicheamicin omegaIl(见，例如，Agnew，Chem Intl.Ed.Engl.，33：183-186(1994))；dynemicin，包括dynemicin A；二膦酸盐(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；esperamicin；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)生色团和相关色素蛋白enediyne抗生素生色团)，aclacinomysins，放射菌素(actinomycin)，authramycin，氮丝氨酸(azaserine)，博莱霉素(bleomycin)，放线菌素C(cactinomycin)，carabicin，去甲柔红霉素(carminomycin)，嗜癌霉素(carzinophilin)，chromomycinis，更生霉素(dactinomycin)，柔红霉素，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，ADRIAMYCIN多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代-多柔比星，氰基吗啉代-多柔比星，2-pyrrolino-多柔比星和去氧多柔比星)，表阿霉素(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊达比星(idarubicin)，发波霉素(marcellomycin)，丝裂霉素诸如丝裂霉素C，霉酚酸，诺加霉素(nogalamycin)，橄榄霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，potfiromycin，嘌呤霉素，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星(rodorubicin)，链黑菌素(streptonigrin)；链脲霉素(streptozocin)，杀结核菌素(tubercidin)，乌苯美司(ubenimex)，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代谢药如氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸(denopterin)，氨甲蝶呤，丁蝶翼素(pteropterin)，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物氟达拉滨(fludarabine)，6-巯基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷，双脱氧尿苷，doxifluridine，依诺他滨(enocitabine)，氟尿苷；雄激素类如卡普睾酮(calusterone)，丙酸甲雄烷酮(dromostanolong propionate)，环硫雄醇(epitiostanol)，美雄氨(mepitiostane)，睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类如氨鲁米特(aminoglutethimide)，邻氯苯对氯苯二氯乙烷(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂如frolinic acid；醋葡内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(biasntrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；elliptinium acetate；epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登素类(maytansinoids)诸如美登素(maytansine)和柄型菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；nitracrine；喷司他丁(pintostatin)；phenamet；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼树酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK
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；多糖复合体(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine)；单端孢霉烯(trichothecene)(具体是T-2毒素，verracurin A，杆孢菌素(roridin)A和anguidine)；乌拉坦(urethan)；长春碱酰胺；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；溴丙哌嗪(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；三胺硫磷(thiotepa)；紫杉烷(taxoid)，如TAXOL
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紫杉醇(Bristol-Myers SquibbOncology，Princeton，NJ)，ABRAXANETM无克列莫佛(Cremophor-free)，紫杉醇的白蛋白改造的纳米颗粒配制剂(albumin-engineered nanoparticleformulation of paclitaxel)(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)，和TAXOTERE
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多西紫杉醇(
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-Poulenc Rorer，Antony，France)；chloranbucil；GEMZAR吉西他滨(gemcitabine)；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂配位复合物(platinum coordination complexes)如顺铂、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin)；长春花碱；铂；鬼臼乙叉甙(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱；NAVELBINE
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长春瑞宾(vinorelbine)；novantrone；替尼泊甙(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；xeloda；伊拜膦酸盐(ibandronate)；irinotecan(例如CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲酸类(retinoids)诸如维甲酸；capecitabine；以及上述任何物质的可药用盐，酸或衍生物。
此定义还包括能调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素制剂，如抗雌激素制剂和选择性雌激素受体调节物(SERM)，包括，例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX
Figure A20081009168100221
他莫昔芬)，雷洛昔芬(raloxifene)，屈洛昔芬(droloxifene)，4-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，keoxifene，LY117018，奥那司酮(onapristone)，和FARESTON·托瑞米芬(FARESTON·toremifene)；芳香酶抑制物(aromatase inhibitor)，其抑制芳香酶，该酶调节肾上腺中的雌激素生成，诸如，例如4(5)-咪唑，氨鲁米特(aminoglutethimide)，MEGASE
Figure A20081009168100222
醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)，AROMASIN
Figure A20081009168100223
依西美坦(exemestane)，formestanie，法倔唑(fadrozole)，RIVISOR
Figure A20081009168100224
伏氯唑(vorozole)，FEMARA来曲唑(letrozole)，和ARIMIDEX
Figure A20081009168100226
阿那曲唑(anastrozole)；和抗雄激素制剂如氟他氨(flutamide)，尼鲁米特(nilutamide)，比卡鲁胺(bicalutamide)，亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，具体是抑制异常细胞增生所涉及的信号途径中的基因表达的那些反义寡核苷酸，诸如，例如，PKC-α，Ralf和H-Ras；核糖酶诸如VEGF表达抑制剂(例如，ANGIOZYME
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核糖酶)和HER2表达抑制剂；疫苗诸如基因治疗疫苗，例如，ALLOVECTIN
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疫苗，LEUVECTIN
Figure A20081009168100229
疫苗，和VAXID
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疫苗；PROLEUKIN
Figure A200810091681002211
rIL-2；LURTOTECAN
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拓扑异构酶1抑制物；ABARELIX
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rmRH；和上述任何物质的可药用盐，酸或衍生物。
本文中“生长抑制剂”是指在体内或体外抑制细胞(例如癌症细胞)生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低S期恶性细胞百分比的药物。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期(在除S期以外的阶段)进展的药物，例如诱导G1停滞和M期停滞的药物。经典的M期阻断剂包括长春花类(长春新碱和长春花碱)，TAXOL
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美登木素生物碱和topo II抑制剂如阿霉素、柔红菌素、依托泊甙和博来霉素等。那些使G1期停滞的药物还连带使S期停滞，例如DNA烷化剂象他莫昔芬、强的松、达卡巴嗪、氮芥(mechlorethamine)、顺铂、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷等。详见“癌症的分子基础”Mendelsohn和Israel编，第一章，Murakami等的题为“细胞周期调节，肿瘤和抗肿瘤药物”的文章(WB Saunders：Philadephia，1995)，尤其见第13页。
术语“细胞因子”是一般性术语，指由一个细胞群释放的对另一个细胞群起细胞间介质作用的蛋白。此种细胞因子的实例是淋巴细胞因子，单核细胞因子和传统的多肽激素。这些细胞因子包括生长激素，如人生长激素，N-甲二磺酰人生长激素，和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；前胰岛素；松驰素；前松驰素；糖蛋白激素如卵泡刺激素(FSH)，甲状腺刺激素(TSH)，促黄体(生成)激素(LH)；上皮生长因子，肝细胞生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳激素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和β；苗勒氏管抑制物质(mullerian-inhibiting substance)；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；苯丙酸诺龙；血管内皮细胞生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductivefactors)；干扰素如干扰素-α，-β，-γ；集落刺激因子(CSF)如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL)如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12；肿瘤坏死因子如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子包括LIF和kit配体(KL)。本文中术语细胞因子包括天然蛋白或来自重组细胞培养物的蛋白以及天然序列细胞因子的生物活性等效物。
本文所用术语“前体药物”指药物学活性物质的前体或衍生物形式，其较亲本药物对癌细胞的细胞毒作用小并能被酶活化或转化成更具活性的亲本形式。见例如Wilman“Prodrugs in Cancer Chemotherapy”Biochemical SocietyTransanctions，14，pp.357-382，615th Meeting Belfast(1986)和Stella等，“Prodrugs：A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery，”Directed DrugDelivery，Borchardt等，(ed.)，pp.247-267，人a Press(1985)。本发明的前体药物包括但不限于，含磷酸盐前体药物，含硫代磷酸脂前体药物，含硫酸盐前体药物，含肽前体药物，D氨基酸修饰的前体药物，糖基化前体药物，含β内酰胺的前体药物，任选取代的含苯氧基乙酰胺的前体药物或任选取代的含苯基乙酰胺的前体药物，可被转化成更具活性的细胞毒性游离药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前体药物。可被衍生为本发明所用前提药物形式的细胞毒作用药物的实例包括，但不限于，上述那些化疗剂。
术语“静脉内输注”指将在长于大约5分钟的时间，优选大约30-90分钟内将药物导入动物或人类患者的静脉，但根据本发明，静脉内输注给药可选持续10小时或10小时以下。
“静脉内药团(intravenous bolus)”或“静脉内推注(intravenous push)”指给药到动物或人类的静脉，使得机体在大约15分钟或以下，优选5分钟或以下的时间内接受到所述药物。
“皮下给药”指通过自药物容器的相对缓慢、持续的释放，将药物导入动物或人类患者的皮肤下，优选在皮肤和皮下组织之间的囊袋(pocket)中。所述囊袋可通过将皮肤捏起或拉开使其离开皮下组织而产生。
术语“皮下输注”指通过自药物容器的相对缓慢、持续的释放，将药物导入动物或人类患者的皮肤下，优选在皮肤和皮下组织之间的囊袋(pocket)中，所述释放持续一段时间，包括但不限于30分钟或以下，或90分钟或以下。可选，所述输注可通过将药物递送泵植入所述动物或人类患者的皮下来进行，其中所述泵递送预定量的药物一段预定的时间，诸如30分钟，90分钟，或治疗方案长度所跨越的时间。
术语“皮下药团(subcutaneous bolus)”指在动物或人类患者的皮肤下给药，其中所述药团递送优选小于约15分钟，更优选小于5分钟，最优选小于60秒。给药优选在皮肤和皮下组织之间的囊袋中，所述囊袋可通过将皮肤捏起或拉开使其离开皮下组织而产生。
“血管生成因子“是刺激血管发育的生长因子。本文优选的血管生成因子是血管内皮生长因子(VEGF)。
本文术语“标记”指可检测的化合物或组合物，其与所述多肽直接或间接偶联。所述标记自身是可检测的(例如放射同位素标记或荧光标记)或，对于酶标记，可催化可检测底物化合物或组合物的化学改变。
“分离的”核酸分子是一种从通常与该多肽核酸天然来源相关的至少一种混合核酸分子中鉴定并分离的核酸分子。分离的核酸分子不同于其天然发现的形式。因此分离的核酸分子可从天然细胞中的该核酸分子区别出来。然而，分离的核酸分子包括包含于通常表达该多肽的细胞中的核酸分子，在该细胞中核酸分子位于与天然细胞不同的染色体位置。
术语“调控序列”指特定宿主有机体中可操作地连接的编码序列的表达所需的DNA序列。适合原核生物的调控序列，例如，包括启动子，可选地包括操纵子序列，和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子，多腺苷化信号和增强子。
当与另一核酸序列发生功能关联时，核酸是“可操作地连接的”。例如，前序列或分泌性前导序列如果被表达为参与多肽分泌的前蛋白，其可操作地连接该多肽的DNA；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，其可操作地连接于该序列；或如果核糖体结合位点位于可促进翻译的位置，其可操作地连接编码序列。通常，“可操作地连接于”的意思是被连接的DNA序列是相邻的，并且如果是分泌性前导序列，应是相邻的并且处于阅读框中。然而，增强子则不一定是相邻的。通过在方便的限制位点接合而实现连接。如果此种位点不存在，合成的寡核苷酸连接物或连头的使用符合常规的作法。
本文术语“细胞”，“细胞系”，和“细胞培养”可互换使用并且所有此种名称包括其子代。因此，术语“转化体”和“转化后细胞”包括原代处理细胞及其衍生的培养物，而不考虑传代的次数。由于有意和无意的突变，也可理解所有子代的DNA含量均不是恰好相同的。具有与原始转化后细胞中筛选到的功能或生物活性相同的功能或生物活性的突变体子代也包括在内。尽管命名截然不同，从上下文来看这一点是清楚的。
II.抗-VEGF抗体的制备
抗体制备
(i)VEGF抗原
制备并鉴定抗体的方法是本领域已知的。下文描述了制备本发明所用抗-VEGF抗体的示例性技术。用于制备抗体的VEGF抗原可以是，例如VEGF165分子以及VEGF的其它同种型或者其含有所需表位的片段。用于生成本发明抗-VEGF抗体的其它VEGF的形式对于本领域技术人员而言是显而易见的。
人VEGF通过首先利用牛VEGF cDNA作为杂交探针筛选自人细胞制备的cDNA文库来获得。Leung et al.(1989)Science，246：1306。由此鉴定的一种cDNA编码与牛VEGF具有超过95％同源性的165个氨基酸的蛋白质；该165个氨基酸的蛋白质通常称为人VEGF(hVEGF)或VEGF165。人VEGF的有丝分裂原活性通过在哺乳动物宿主细胞中表达人VEGF cDNA得以证实。通过由人VEGF cDNA转染的细胞调节的培养基促进毛细血管内皮细胞的增殖，而对照细胞不能。Leung et al.(1989)Science，supra。
尽管血管内皮细胞生长因子可以从自然界分离并纯化用于进一步的治疗用途，滤泡细胞中相对低的蛋白浓度以及回收VEGF的高成本(就人力以及花费而言)在商业上没有应用价值。因此，需要进行其它努力以通过重组DNA技术克隆并表达VEGF。(见例如，Ferrara(1995)LaboratoryInvestigation 72：615-618，所述参考文献包含在此作为参考)。
VEGF在多种组织中作为多元同二聚体形式表达(每单体121，145，165，189，和206个氨基酸)，其是可选RNA剪接的结果。VEGF121是可溶有丝分裂原，并不结合肝素；较长形式的VEGF而渐离的亲合力结合肝素。较长形式的VEGF可通过纤溶酶裂解其羧基末端以释放VEGF的可扩散形式。纤溶酶裂解后鉴定的羧基末端肽的氨基酸序列是Arg110-Ala111。氨基末端“核心”蛋白VEGF(1-110)作为同源二聚体分离，与完整VEGF165同源二聚体相比，其与中和型单克隆抗体(诸如称为4.6.1和3.2E3.1.1的抗体)以及VEGF受体的可溶形式以相似的亲和力结合。
数种在结构上与VEGF相关的分子最近已经被鉴定，包括胎盘生长因子(PIGF)，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D和VEGF-E。Ferrara and Davis-Smyth(1987)Endocr.Rev.，supra；Ogawa et al.(1998)J.Biological Chem.273：31273-31281；Meyer etal.(1999)EMBO J.，18：363-374。受体酪氨酸激酶，Flt-4(VEGFR-3)，已经被鉴定为VEGF-C和VEGF-D的受体。Joukov et al.(1996)EMBO.J.15：1751；Lee et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：1988-1992；Achen et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：548-553。最近显示VEGF-C参与淋巴血管生成的调节。Jeltsch et al.(1997)Science 276：1423-1425。
已经鉴定了两种VEGF受体，Flt-1(也称为VEGFR-1)和KDR(也称为VEGFR-2)。Shibuya et al.(1990)Oncogene 8：519-527；de Vries et al.(1992)Science 255：989-991；Terman et al.(1992)Biochem.Biophys.Res.Commun.187：1579-1586。Neuropilin-1为选择性VEGF受体，其能够结合肝素结合型VEGF同种型(Soker et al.(1998)Cell 92：735-45)。Flt-I和KDR都属于受体酪氨酸激酶(RTK)家族。RTK包括跨膜受体大家族，具有多种生物活性。目前，至少19种不同的PTK亚家族已经得以鉴定。酪氨酸激酶(RTK)家族包括对于多种细胞类型的生长以及分化而言重要的受体(Yarden and Ullrich(1988)Ann.Rev.Biochem.57：433-478；Ullrich and Schlessinger(1990)Cell 61：243-254)。RTK的内在功能在与配体结合时被活化，其导致受体以及多种细胞基质的磷酸化，由此产生多种细胞反应(Ullrich & Schlessinger(1990)Cell61：203-212)。因此，受体酪氨酸激酶介导的信号转导由与特定生长因子(配体)的细胞外相互作用而启动，通常随后导致受体二聚体化，刺激内在蛋白酪氨酸激酶活性以及受体的反式磷酸化。细胞内信号转导分子的结合位点由此产生，并导致形成具有胞浆信号分子谱的复合体，其可促进适当的细胞反应(例如细胞分裂，分化，代谢效应，细胞外微环境中的改变)。见Schlessingerand Ullrich(1992)Neuron 9：1-20。结构上，Flt-1和KDR在细胞外结构域中有7个免疫球蛋白样结构域，一个跨膜结构域，被激酶插入区中断的共有酪氨酸激酶序列。Matthews et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：9026-9030；Terman et al.(1991)Oncogene 6：1677-1683。
(ii)多克隆抗体
多克隆抗体优选通过多次给动物皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂而产生。将所述相关抗原与针对所免疫的物种具有免疫原性的蛋白(如匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)用双功能试剂或衍生试剂，如马来酰亚氨苯甲酰基硫代琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基结合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR(R和R1是不同烷基)，进行偶联是有效的。
用所述抗原、免疫原性偶联物或衍生物免疫动物，方法是，将100μg或5μg蛋白或偶联物(分别针对兔或鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混合，在多位点皮内注射该溶液。1个月后，多位点皮内注射起始量的1/5-1/10的肽或偶联物与弗氏完全佐剂来加强免疫。7-14天后，对动物采血，测定血清中的抗体效价。对动物的加强免疫直到效价达到平台期为止。优选给动物加强注射相同抗原的偶联物，但也可以是偶联至不同蛋白和/或通过不同的交联剂偶联的偶联物。偶联物还可以是重组细胞培养物产生的融合蛋白。此外，可用明矾等聚集剂(aggregating agent)增强免疫反应。
(iii)单克隆抗体
单克隆抗体可用Kohler和Milstein，Nature，256：495(1975)首先描述的杂交瘤法制备或通过重组DNA法(美国专利4,816,567)制备。
在杂交瘤方法中，如上述免疫小鼠或其它适宜的宿主动物，例如仓鼠，来激发产生或能产生特异结合免疫所用蛋白的抗体的淋巴细胞。可选地，所述淋巴细胞可被体外免疫。免疫后，淋巴细胞可被分离并随后使用适宜的融合剂例如聚乙二醇与骨髓瘤细胞系融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，单克隆抗体：Principles and Practice，59-103页(Academic Press，1986))。
由此制备的杂交瘤细胞被接种于适宜的培养基并在其中生长，该培养基优选包含一种或多种抑制未融合亲代骨髓瘤细胞的生长或存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的选择培养基通常包括次黄嘌呤，氨基蝶呤，和胸腺嘧啶(HAT培养基)这些抑制HGPRT-缺陷细胞生长的物质。
优选骨髓瘤细胞为那些能有效融合、支持所选抗体生成细胞以稳定的高水平产生抗体、并对如HAT培养基敏感的骨髓瘤细胞系。在众多这样的细胞系中，优选的骨髓瘤细胞系是小鼠骨髓瘤系，如由Salk Institute CellDistreibution Center，San Diego，California USA提供的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤，和由美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland USA提供的SP-2或其衍生物，如X63-Ag8-653细胞。也描述了人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系可用于产生人单克隆抗体[Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；和Brodeur等，单克隆抗体的制备技术和应用(Marcel Dekker，Inc.，New York纽约，(1987))51-63页]。
可在含有生长的杂交瘤细胞的培养基中分析抗所述抗原的单克隆抗体的产生。优选地，杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合试验，如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)来分析。
一旦鉴定出产生具有所需特异性、亲合力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞，这些细胞克隆可通过有限稀释进行亚克隆，并通过标准方法(Goding，单克隆抗体：Principles and Practice，59-103页(Academic Press，1986))使其生长。适合此目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，通过例如将细胞注射入小鼠中，可以使杂交瘤细胞以动物腹水肿瘤的形式在体内生长。
上述亚克隆所分泌的单克隆抗体可用经典抗体纯化方法如，例如蛋白A-Sepharose，羟基磷灰石层析，凝胶电泳，透析或亲和层析等从培养基，腹水或血清中分离。
使用传统方法(例如通过使用能与编码小鼠抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)可轻易分离并测序编码单克隆抗体的DNA。杂交瘤细胞是此DNA的优选来源。一旦分离出该DNA，可以将它置入表达载体中，该载体随后被转染至宿主细胞中例如大肠杆菌细胞，猴COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，或不另外生成抗体蛋白的骨髓瘤细胞，从而在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。抗体的重组生产将在下文详述。
在进一步的实施方案中，可从使用McCafferty等，Nature，348：552-554(1990)描述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离单克隆抗体或抗体片段。Clackson等，Nature，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离小鼠和人抗体。随后的文章描述了通过链改组产生高亲和性(纳米级)人抗体(Marks等，Bio/Technology，10：779-783(1992))，以及将组合感染(combinational infection)和体内重组作为策略构建非常大的噬菌体文库(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.，21：2265-2266(1993))。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行选择。
也可采用以下方法对DNA进行修饰：例如，以人重链和轻链恒定区的编码序列代替同源小鼠序列(美国专利4,816,567；Morrison等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，81：6851(1984))，或将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽(异源多肽)的完整或部分编码序列共价结合。
通常，上述非免疫球蛋白多肽序列可取代抗体的恒定区，或它们可取代抗体的一个抗原结合位点的可变区以产生嵌合二价抗体，该抗体包含两个特异于不同抗原的抗原结合位点。
(iv)人源化抗体和人抗体
人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入它的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常称为“引进的”残基，它们通常来自“引进的”可变区。人源化过程基本是按照Winter及其同事(Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988))的方法，通过用啮齿类CDRs或CDR序列替换人抗体的对应序列来进行。因此，这样的“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中完整人类可变区的很少一部分被非人物种的相应序列取代。实践中，人源化抗体通常是人的抗体，其中一些CDR残基且可能有部分FR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。
选择人源化抗体制备所用的人轻链和重链可变区，对于降低抗原性非常重要。根据所谓的“最适”方法，针对已知人可变区序列的整个文库筛选啮齿类抗体的可变区序列。随后将与啮齿类最接近的人序列作为人框架区(FR)用于人源化抗体(Sims等，J.Immunol.，151：2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.，196：901(1987))。另一种方法是使用从轻链或重链特定亚群的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区。同样的框架区可被用于几种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta等，J.Immunol.，151：2623(1993))。
更重要的是，将抗体人源化后保留了对抗原的高亲合力和其它有利的生物特性。为达到此目的，根据优选方法，通过用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性(conceptual)人源化产物来制备人源化抗体。免疫球蛋白三维模型已有商品，是本领域技术人员所熟悉的。还有用于描述和展示所选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构的计算机程序。通过观察这些展示结果可分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能发挥的作用，即分析能影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。通过这种方法，可从受体序列和引进序列中选出FR残基并组合，从而得到所需抗体性质，如对靶抗原的亲合力增加。总之，超变区残基直接并且最主要涉及对抗原结合的影响。
可选的，可以制备转基因动物(如小鼠)，它经过免疫能在缺乏内源性免疫球蛋白生成的情况下产生全套人抗体。例如，已指出在嵌合和胚系(germ-line)突变小鼠中，抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源性抗体生成的完全抑制。将人胚系免疫球蛋白基因阵列(array)转移到此胚系突变小鼠中，将导致在抗原攻击的情况下产生人抗体。见例如，Jakobovits等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature，362：255-258(1993)；Bruggemann等，Year in Immuno.，7：33(1993)；和Duchosal等，Nature355：258(1992)。人抗体也可来自噬菌体展示文库(Hoogenboom等，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)；Vaughan等，Nature Biotech 14：309(1996))。
(v)抗体片段
已开发了生成抗体片段的多种技术。传统上，这些片段通过对完整抗体的蛋白水解性消化获得(见Morimoto等，生物化学和生物物理学方法杂志(Journal of Biochemical and Biophysical Methods)24：107-117(1992))和Brennan等，科学，229：81(1985))。但现在可直接通过重组宿主细胞产生这些片段。例如，可从上述抗体噬菌体库分离抗体片段。另外，可从大肠杆菌直接回收Fab’-SH片段，并经化学连接形成F(ab’)2片段(Carter等，生物/技术10：163-167(1992))。依据另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养中分离F(ab’)2片段。其它产生抗体片段的技术对本领域技术人员是显而易见的。在其它实施方案中，所选抗体是单链Fv片段(scFv)。见WO 93/16185。
(v)多特异抗体
多特异抗体对至少两种不同的抗原具有结合特异性。尽管此种分子通常只结合两种抗原(即双特异抗体，BsAbs)，具有附加特异性的抗体例如三特异抗体也包含在文中所用的术语中。BsAbs的实例包括具有针对肿瘤抗原的一条臂和针对细胞毒作用触发分子(cytotoxic trigger molecule)的另一条臂的那些抗体，例如抗-FcγRI/抗-CD15，抗-p185HER2/FcγRIII(CD16)，抗-CD3/抗-恶性B-细胞(1D10)，抗-CD3/抗-p185HER2，抗-CD3/抗-p97，抗-CD3/抗-肾细胞癌，抗-CD3/抗-OVCAR-3，抗-CD3/L-D1(抗-结肠癌)，抗-CD3/抗-黑色素细胞刺激激素类似物，抗-EGF受体/抗-CD3，抗-CD3/抗-CAMA1，抗-CD3/抗-CD19，抗-CD3/MoV18，抗-神经细胞粘附分子(NCAM)/抗-CD3，抗-叶酸结合蛋白(FBP)/抗-CD3，抗-泛癌相关抗原(AMOC-31)/抗-CD3；一条臂特异地结合肿瘤抗原而另一条臂结合毒素的BsAbs例如抗-皂草素(saporin)/抗-Id-1，抗-CD22/抗-皂草素，抗-CD7/抗-皂草素，抗-CD38/抗-皂草素，抗-CEA/抗-蓖麻毒素A链，抗-干扰素-α(IFN-α)/抗-杂交瘤独特型，抗-CEA/抗-长春花碱；转化酶活化的前体药物的BsAbs例如抗-CD30/抗-碱性磷酸酶(催化磷酸丝裂霉素前药物向丝裂霉素醇的转化)；可用作纤维蛋白溶解剂的例如抗-纤维蛋白/抗-组织纤溶酶原激活物(tPA)，抗-纤维蛋白/抗-尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)；将免疫复合物靶向细胞表面受体的BsAbs例如抗-低密度脂蛋白(LDL)/抗-Fc受体(例如FcγRI，FcγRII或FcγRIII)；用于治疗感染性疾病的BsAbs例如抗-CD3/抗-单纯疱疹病毒(HSV)，抗-T-cell受体：CD3复合物/抗-流感病毒，抗-FcγR/抗-HIV；体外或体内检测肿瘤的BsAbs例如抗-CEA/抗-EOTUBE，抗-CEA/抗-DPTA，抗-p185HER2/抗-hapten；作为疫苗佐剂的BsAbs；和作为诊断工具的BsAbs例如抗-兔IgG/抗-铁蛋白，抗-辣根过氧化物酶(HRP)/抗-激素，抗-生长抑素/抗-物质P，抗-HRP/抗-FITC，抗-CEA/抗-β-半乳糖苷酶。三特异抗体的实例包括抗-CD3/抗-CD4/抗-CD37，抗-CD3/抗-CD5/抗-CD37和抗-CD3/抗-CD8/抗-CD37。双特异抗体可被制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab’)2双特异性抗体)。双特异性抗体的综述见Segal等J.Immunol.Methods 248：1-6(2001)。
制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，全长双特异性抗体的重组制备是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中这两条链具有不同特异性(Millstein and Cuello，Nature，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链轻链随机搭配，这些杂交瘤(quadroma)产生10种不同抗体分子的潜在的混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。对正确分子的纯化(通常通过亲和层析步骤来进行)非常复杂，且产量很低。类似的方法见WO93/08829(1993年5月13日公开)和Traunecker等，EMBO J，10：3655-3659(1991)。
依据不同的方法，可将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。该融合优选与至少包含铰链区、CH2及CH3区部分的免疫球蛋白重链恒定区融合。优选使含有轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)出现在至少在一种融合中。可将编码免疫球蛋白重链融合体，以及必要时，编码免疫球蛋白轻链的DNA插入不同表达载体，共转染至适当宿主生物。这使得在使用非等比的三种多肽链进行构建的实施方案中，能够较灵活地调整三种多肽片段的相互比例，以获得最佳产量。但也可在至少两种多肽链以等比例表达而获得高产时或所述比例无特别意义时，将两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一表达载体。
在该方法的一个优选实施方案中，所述双特异性抗体由一条臂上的具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一条臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。已发现这种不对称结构有利于从非必要免疫球蛋白链的组合中分离出所需双特异性化合物，因为只在该双特异性分子的一半中存在免疫球蛋白轻链，这使得分离更加容易。此方法公开于1994年3月3日公开的WO94/04690中。制备双特异性抗体的进一步细节可以参见，例如Suresh等，Methods in Enzymology，121：210(1986)。根据WO96/27011所述的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，使得从重组细胞培养中获得的异二聚体的百分比最大。优选的界面包括抗体恒定区CH3结构域的至少一部分。在该方法中，源于第一抗体分子界面上的一条或多条小的氨基酸侧链被较大侧链(如酪氨酸或色氨酸)取代。与所述大侧链大小相同或相近的互补“沟”可通过将氨基酸大侧链用小侧链(如丙氨酸或苏氨酸)取代而在第二抗体分子的界面上形成。这提供了一种机制，其使异二聚体的产量比不想要的终产物如同二聚体高。
双特异性抗体包括交联抗体或“异源偶联的”抗体。例如，可使异源偶联物中的抗体之一与抗生物素蛋白偶联，使另一抗体与生物素偶联。有观点认为，这类抗体可用于将免疫细胞导向不想要的细胞(美国专利4676980)，也可用于治疗HIV感染(WO91/00360，WO92/200373和EP03089)。异源偶联抗体可通过任何适当的交联方法制备。适当的交联制剂和多种交联技术为本领域已知，可在美国专利4676980号中获得。
从抗体片段制备双特异性抗体的技术已有文献。例如，双特异性抗体可利用化学连接制备。Brennan等，科学229：81(1985)中描述了将完整抗体经蛋白水解制备F(ab′)2片段的方法。这些片段在二巯基复合剂亚砷酸钠存在时被还原，从而稳定相邻的巯基，并阻止分子间二硫键的形成。生成的Fab′片段被转化为硫硝基苯甲酸盐(TNB)衍生物。其中一种Fab′-TNB衍生物经巯基乙胺还原成Fab′-硫醇，再与等分子量的其它Fab′-TNB衍生物混合形成双特异性抗体。如此产生的双特异性抗体可作为酶的选择性固相化中所用的试剂。
近期的进展促进了Fab′-SH片段从大肠杆菌的直接回收，该片段可经化学偶联形成双特异性抗体。Shalaby等，实验医学杂志，175：217-225(1992)中描述了完全人源化双特异性抗体F(ab′)2分子的产生。每一Fab′片段分别从大肠杆菌中分泌出来，体外直接化学偶联形成双特异性抗体。如此制备的双特异性抗体能与过表达VEGF受体的细胞和正常人T细胞结合，还能引发人类细胞毒淋巴细胞对人乳腺肿瘤细胞的裂解活性。
直接从重组细胞培养中制备并分离双特异性抗体片段的多种技术也已有描述。例如，可用亮氨酸拉链制备双特异性抗体。Kostelny等，免疫学杂志，148(5)：1547-1553(1992))。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽与两种不同抗体的Fab′部分通过基因融合而连接。使抗体的同型二聚体在铰链区被还原成单体，然后被再氧化形成抗体的异二聚体。该方法也可用于制备抗体同型二聚体。由Hollinger等，美国国家科学院学报，90：6444-6448(1993))描述的“二价抗体”技术提供了另一种制备双特异性抗体片段的方法。所述片段中含有重链可变区(VH)，其通过接头与轻链可变区(VL)相连，该接头非常短，使得同一链的两个结构域之间无法配对。因此，同一片段上的VH和VL结构域被迫与另一片段上的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。此外还报道了另一种用单链Fv(sFv)二聚体来制备双特异性抗体的策略。见Gruber等，免疫学杂志，152：5368(1994)。
还考虑了二价以上的抗体。如可制备三特异性抗体。Tutt等，免疫学杂志，147：60(1991)。
(vii)效应物功能改造
也可预期修饰拮抗剂的效应物功能(effector function)，如以此增强拮抗剂的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和/或补体依赖的细胞毒作用(CDC)。这可以通过在抗体拮抗剂FC区引入一或多个氨基酸取代而获得。此外，可在FC区引入半胱氨酸残基，使得在此区形成链间二硫键。由此产生的同型二聚体抗体可提高内在化能力和/或增强补体介导的细胞杀伤作用和ADCC。见Caron等，实验医学杂志176：1191-1195(1992)和Shopes，B.免疫学杂志148：2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同型二聚体抗体也可用Wolffe等，癌症研究53：2560-2565(1993)所述异源双功能交联剂制备。或者，可通过工程改造产生具有双FC区并因此具有增强的补体裂解效应及ADCC能力的抗体。见Stevenson等，抗癌药物的设计(抗-Cancer drug design)3：219-230(1989)。
(viii)免疫偶联物
本发明还涉及包含偶联于细胞毒药剂的本文所述抗体的免疫偶联物，所述细胞毒药剂诸如化疗剂，毒素(例如细菌，真菌，植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即，放射偶联物)。
可用于产生所述免疫偶联物的化疗剂已经在上文描述。可以应用的酶活性毒素及其片段包括：白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲毒素、油桐(Aleutites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca Americana)蛋白(PAPI，PAPII，PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制因子、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂，白树毒素，米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌毒素(tricothecenes)。多种放射性核素可用于制备放射偶联物抗体。实例包括212Bi，131I，131In，90Y和186Re。
抗体和细胞毒作用制剂的偶联物可通过多种双功能蛋白偶联剂来连接，所述双功能蛋白偶联剂如：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯，亚胺基硫烷(IT)，亚胺酸酯的双功能衍生物(如盐酸二甲基己二酸亚氨酯)，活性酯类(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)，醛类(如戊二醛)，双-叠氮化合物(如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)，双-重氮衍生物(如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)，二异氰酸酯(如亚甲代苯基2，6-二异氰酸酯)，和双-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等，Science 238：1098(1987)所述制备。C14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二乙烯三氨五乙酸(MX-DTPA)是将放射性核苷酸偶联至抗体的偶联剂之一。见WO94/11026。
在另一实施方案中，抗体可与肿瘤预靶向中应用的“受体”(如链霉亲和素)偶联，将该抗体-受体偶联物给予患者，之后用清除剂(clearing agent)除去循环中未结合的偶联物，再给予已偶联了细胞毒作用制剂(如放射性核苷酸)的“配体”(如抗生物素蛋白)。
(ix)免疫脂质体
本发明公开的抗体也被配制成免疫脂质体。含有所述抗体的脂质体通过本领域已知方法制备，诸如Epstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688(1985)；Hwang etal.，Proc.Natl Acad.Sci.USA，77：4030(1980)；以及美国专利4,485,045和4,544,545中所述。具有延长的循环时间的脂质体在美国专利5,013,556中公开。
特别有用的脂质体可利用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物经反相蒸发法产生。通过使脂质体在挤压之下穿过指定孔径大小的滤膜，可获得具有所需直径的脂质体。本发明抗体的Fab’片段可如Martin等，J.Biol.Chem.，257：286-288(1982)所述，经二硫键交换反应与脂质体偶联。可任选在所述脂质体中包含一种化疗药物。见Gabizon等，J.National Cancer Inst，81(19)1484(1989)。
(x)抗体依赖酶介导的前体药物的治疗(ADEPT)
通过将抗体偶联于前体药物活化酶，本发明的抗体也可用于ADEPT，该酶将前体药物(例如肽基化疗剂，见WO81/01145)转化成活性抗癌药物。参见，例如，WO 88/和美国专利4,975,278。
用于ADEPT的免疫结合物的酶组分包括任何能够对前体药物起作用，将它转化成更加有活性的细胞毒作用形式的酶。
可用于本发明的方法的酶包括，但不限于，碱性磷酸酶，用于将含有磷酸盐的前体药物转化成游离药物；芳香硫酸酯酶，用于将含有硫酸盐的前体药物转化成游离药物；胞嘧啶脱氨酶，用于将含有无毒的5-氟胞嘧啶转化成抗癌药物5-氟尿嘧啶；蛋白酶，例如沙雷氏菌属蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，羧肽酶和组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B和L)，用于将含肽的前体药物转化成游离药物；D-丙酰胺羧肽酶，用于转化含有D-氨基酸取代物的前体药物；碳水化合物-切割酶，例如β-半乳糖苷酶和神经酰氨酶，用于将糖基化的前体药物转化成游离药物；β-内酰胺酶，用于将β-内酰胺衍生的药物转化为游离药物；和青霉素酰胺酶，例如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶，用于将由苯氧乙酰基或苯乙酰基自其氨氮衍生的药物分别转化成游离药物。可选地，具有酶活性的抗体(本领域也称“抗体酶(abzyme)”)可用将本发明的前体药物转化成游离活性药物(参见，例如，Massey，Nature 328：457-458(1987))。可如本文所述方法制备抗体-抗体酶偶联物，从而将抗体酶递送到肿瘤细胞群。
通过本领域已知的技术，本发明的酶可与抗体共价偶联，例如使用上述的异双功能交联剂。可选地，使用本领域技术人员熟悉的重组DNA技术构建融合蛋白，该融合蛋白至少包含本文抗体的抗原结合区，并连接于本发明的酶的至少一个功能活化部分。(见，例如，Neuberger等，Nature，312：604-608(1984))。
(xi)抗体-拯救受体结合表位融合物
在本发明具体实施方案中，例如需要利用抗体片段而不是完整抗体来促进肿瘤穿透。在这种情况下，需要修饰所述抗体片段以增加其血清半寿期。这可通过例如将拯救受体结合表位掺入所述抗体片段(例如通过突变抗体片段中的适宜区域或将所述表位掺入将融合于所述抗体任意末端或中间的肽标记中，例如通过DNA或肽合成)来实现
拯救受体结合表位优选构成这样的区域，其中任何来自Fc区的一或两个环的一个或多个残基被转移到抗体片段的类似的位置。甚至更优选，来自Fc区的一或两个环的3个或多个残基被转移。更优选，所述表位从Fc区(例如IgG的Fc区)的CH2区取出，并转移到CH1，CH3，或VH区，或超过一个所述的抗体的所述区。可选，所述表位从Fc区的CH2区取出，并转移到所述抗体片段的CL区和/或VL区。
(xii)抗体的其它共价修饰
抗体的共价修饰包含在本发明范围内。如果可能，它们可通过化学合成或对所述抗体的酶促或化学裂解来制备。对所述抗体的其它类型的共价修饰通过使被靶向的抗体氨基酸残基与有机衍生反应剂反应来导入分子，所述有机衍生化剂可与选定的侧链或N或C末端残基反应。
半胱氨酰残基最经常与α-卤代乙酸盐(酯)(以及相应的胺)诸如氯代乙酸或氯代乙酰胺反应，以产生羧甲基或羧基氨基甲基衍生物。半胱氨酰残基也通过与溴三氟丙酮，α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸，氯乙酰基磷酸酯，N-烷基马来酰亚胺，3-硝基-2-吡啶基二硫化物，甲基2-吡啶基二硫化物，对氯汞基苯甲酸，2-氯汞基-4-硝基酚，或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑反应衍生化。
组氨酰残基经过与焦碳酸二乙酯在pH 5.5-7.0下反应衍生化，因为该试剂对组氨酸侧链具有相对特异性。对溴苯甲酰甲基溴化物也是有用的；反应优选在0.1M二甲胂酸钠中在pH 6.0进行。
赖氨酰和氨基末端残基与琥珀酸或其他羧酸酐反应。与这些试剂的衍生化具有使赖氨酰残基的电荷逆转的效应。衍生含α-氨基的残基的其他合适试剂包括亚氨酸酯(imidoesters)，例如甲基吡啶亚酰胺(methyl picolinimidate)；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯代硼氢化物(chloroborohydride)；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2，4-戊二酮；和转氨酶催化的与乙醛酸的反应。
精氨酰残基通过与苯基乙二醛，2，3-丁二酮，1，2-环己二酮和茚三酮的一种或几种常规试剂反应进行修饰。精氨酸残基的衍生化需要在碱性条件下进行反应，因为胍官能团具有高pKa。另外，这些试剂可与赖氨酸以及精氨酸ε-氨基反应。
酪氨酰残基的具体修饰可通过通过与芳香重氮基化合物或四硝基甲烷反应而将光谱标记导入酪氨酰残基来进行。最常见，N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷分别用于形成O-乙酰基酪氨酰种类以及3-硝基衍生物。酪氨酰残基利用125I或131I来碘化，从而制备标记的蛋白质用于放射免疫分析。
通过与碳二亚胺(R-N＝C＝N-R′)反应可选择性修饰羧基侧链基团(天冬氨酰或谷氨酰)，其中R和R′是不同的烷基基团，例如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。另外，天冬氨酰和谷氨酰残基通过与铵离子反应转变成天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基。
谷氨酰胺酰基以及天冬酰胺酰基通常被脱去酰胺基分别形成相应的谷氨酰残基以及天冬胺酰残基。这些残基在中性或碱性条件下脱去酰胺基。这些残基脱去酰胺基后的形式在本发明的范围内。
其它修饰包括脯氨酸以及赖氨酸的羟化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸以及组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，SanFrancisco，pp.79-86(1983))，N末端胺的酰化，以及任何C末端羧基的酰胺化。
其它共价修饰类型包括将配糖以化学或酶促方式偶联于抗体。这些方法的优势在于它们不需要在宿主细胞中产生抗体，所述宿主细胞具有对N-或O-连接的糖基化的糖基化能力。根据所用的偶联模式，所述糖可连接于(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基诸如半胱氨酸的游离巯基，(d)游离羟基，诸如丝氨酸、苏氨酸和羟脯氨酸的游离羟基，(e)芳香残基，诸如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的芳香残基，和(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法在1987年9月11日公开的WO 87/05330，以及Aplin and Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，pp.259-306(1981)中描述。
去除任何存在于抗体上的碳水化合物部分可通过化学和酶方法实现。化学去糖基化需要将所述抗体暴露于化合物三氟甲磺酸或等价化合物。该处理导致除连接糖(N-乙酰葡糖胺和N-乙酰半乳糖胺)之外的大多数或所有糖的裂解，而保持所述抗体完整。化学去糖化由Hakimuddin，etal.Arch.Biochem.Biopliys.259：52(1987)和Edge et al.Anal.Biochem.，118：131(1981)描述。抗体上碳水化合物部分的酶促裂解可通过利用多种内糖苷酶以及外糖苷酶进行，如Thotakuraet al.Metla.Enzymol.138：350(1987)所述。
另一种抗体共价修饰类型包括将所述抗体连接于多种非蛋白质聚合物之一，例如聚乙二醇，聚丙二醇或聚氧化烯，如美国专利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337所述。
B.载体，宿主细胞和重组方法
本发明所述抗-VEGF抗体可利用轻易可得的技术和材料重组制备。
为进行糖蛋白的重组生产，分离编码它的核酸并把核酸插入可复制的载体中进一步克隆(DNA扩增)或表达。编码糖蛋白的DNA易于利用传统方法分离和测序(例如，通过使用能够与编码糖蛋白的基因特异结合的寡核苷酸探针)。可利用许多载体。载体的组分通常包括，但不限于，以下物质中的一种或多种：信号序列，复制起点，一个或多个标记基因，增强子，启动子，和转录终止序列。
(i)信号序列成分
本发明的糖蛋白不仅可直接被重组生产，也可以作为与异源多肽的融合蛋白被生产，该异源多肽优选是信号序列或在成熟蛋白或多肽的N末端具有特定切割位点的其它多肽。选定的异源信号序列优选是可由宿主细胞识别和加工(即，由信号肽酶切割)的序列。对于不识别和加工天然多肽信号序列的原核细胞，信号序列由以下原核信号序列取代，例如选自碱性磷酸酶，青霉素酶，lpp，或热稳定肠毒素II前导序列。对于酵母分泌物，天然信号序列可由例如酵母转化酶前导序列，α因子前导序列(包括糖酵母(Saccharomyces)和克鲁维酵母(Kluyveromyces)α-因子前导序列)，或酸性磷酸酶前导序列，白色念珠菌(C.albicans)葡糖淀粉酶前导序列，或WO 90/13646中所述的信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌性前导序列，例如，单纯疱疹gD信号。
在阅读框架中，此种前体区的DNA连接于编码所述抗体的DNA。
(ii)复制成分的起点
表达载体和克隆载体都包含能使该载体在一或多种选定的宿主细胞中复制的核酸序列。一般情况下，在克隆载体中，这种序列是能使该载体独立于宿主染色体DNA而复制的序列，包括复制起点或自我复制序列。这样的序列在各种细菌、酵母和病毒中都是众所周知的。质粒pBR322的复制起点适合大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合酵母菌，多种病毒起点(SV40，多瘤病毒(Polyoma)，腺病毒，VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。复制组分的起点一般不是哺乳动物表达载体所必需的(SV40起点的使用通常仅仅是由于其包含早期启动子)。
(iii)选择基因成分
表达载体和克隆载体应该包含选择基因，也称选择标记。该基因编码使经过转化的宿主细胞在选择性培养基中存活或生长所必需的蛋白。没有被包含该选择基因的载体转化的宿主细胞在所述选择性培养基中不能存活。典型的选择基因编码具有以下性质的蛋白：(a)赋予对抗生素或其它毒素(如氨苄青霉素，新霉素，氨甲蝶呤或四环素)的抗性，(b)弥补营养缺陷，或(c)提供复合培养基不能供给的关键营养物，例如编码芽孢杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个实例是利用药物限制宿主细胞的生长。那些被异源基因成功转化的细胞产生一种赋予药物抗性的蛋白，从而在该选择环境中存活。这种显性选择可以采用的药物有新霉素，霉酚酸和潮霉素。
适合于哺乳动物细胞的另一例选择标记是允许鉴定能摄取多肽核酸的细胞的那些标记，如DHFR或胸苷激酶，金属硫蛋白-I和-II，优选灵长类金属硫蛋白基因，腺苷脱氨酶，鸟氨酸脱羧酶等。
例如，用DHFR选择基因转化的细胞首先通过将所有转化体培养在包含氨甲蝶呤(Mtx，为DHFR的一种竞争型拮抗剂)的培养基中来进行鉴定。当采用野生型DHFR时，合适的宿主细胞包括DHFR活性有缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
或者，宿主细胞(尤其包含内源DHFR的野生型宿主)被编码Bv8的DNA序列，野生型DHFR蛋白，以及另一种选择标记如氨基糖苷3’-磷酸转移酶(APH)转化或共转化以后，可以通过在含有针对该选择标记的选择试剂如氨基糖苷类抗生素(如卡那霉素，新霉素或G418)的培养基中培养细胞来进行选择。参见美国专利4,965,199。
适用于酵母的合适选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb等，Nature，282：39(1979))。Trp1基因为不能在色氨酸中生长的酵母突变株(例如ATCC 44076或PEP4-1)提供了选择标记(Jones，Genetics，85：12(1977))。此后，酵母宿主细胞基因组中trp1损伤的存在提供了通过在缺乏色氨酸的条件中生长而检测转化的有效环境。类似地，Leu2-缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)可以由携带Leu2基因的已知质粒来补充。
此外，源自1.6μm环状质粒pKD1的载体可以用于转化克鲁维酵母(Kluyveromyces)。Bianchi等，Curr.Genet.，12：185(1987)。可选地，Van den Berg，Bio/Technology，8：135(1990)报道了一种用于在乳克鲁维酵母(K.lactis)中大规模制备重组小牛凝乳酶的表达系统。已公开由克鲁维酵母的工业生产菌株产生分泌重组人血清白蛋白的稳定的多拷贝表达载体。Fleer等，Bio/Technology，9：968-975(1991)。
(iv)启动子成分
表达载体和克隆载体通常包含能被宿主生物识别的启动子，它与多肽核酸可操作相连。适用于原核宿主的启动子，包括phoA启动子，β-内酰胺酶和乳糖启动子系统，碱性磷酸酶，色氨酸(trp)启动子系统，和杂化启动子如tac启动子。然而，也可以使用其它已知的细菌启动子。适用于细菌系统的启动子还包含与编码多肽的DNA可操作相连的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
真核生物的启动子序列也是已知的。几乎所有的真核基因在转录起始点上游约25-30个碱基处具有AT-富集区。很多基因在其转录起始点上游70-80个碱基处有另一种序列：CNCAAT，其中X可以是任何核苷酸。大多数真核基因的3’端是AATAAA序列，它可以作为一种信号用于将poly-A尾添加到编码序列3’端。所有这些序列都适合于插入真核表达载体中。
适用于酵母宿主的启动序列的实例包括：3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等，J.Biol.Chem.，255：2073(1980))或其它糖酵解酶(Hess等，J.Adv.EnzymeReg.，7：149(1968)；Holland，Biochemistry，17：4900(1978))的启动子，所述其它糖酵解酶如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6磷酸异构酶，3-磷酸甘油变位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖异构酶，磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶。
其它的酵母启动子，即那些还具有由生长条件控制转录的优点的诱导型启动子，是下述基因的启动子区：醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。在EP 73,657中进一步描述了适用于酵母表达系统的载体和启动子。酵母增强子与酵母启动子联合使用也是有利的。
在哺乳动物宿主细胞中，从载体转录抗体可以受启动子调控，所述启动子例如来自病毒基因组，如多形瘤病毒、鸡痘病毒(1989年7月5日公布的UK 2211504)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒40(SV40)的启动子，或者来自异源哺乳动物的启动子，如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子等，来自热休克蛋白的启动子，前提是这些启动子与宿主细胞系统相容。
SV40病毒的早期和晚期启动子可以作为还包含SV40病毒复制起点的SV40限制性片段而方便地获得。人巨细胞病毒的立即早期启动子可以作为Hind III E限制性片段方便地获得。美国专利4,419,446中公开了在哺乳动物宿主中用牛乳头瘤病毒作为载体来表达DNA的系统。美国专利4,601,978中叙述了对这个系统的改进。另见Reyes等，Nature，297：598-601(1982)中关于在单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子控制下在小鼠细胞中表达人β干扰素cDNA。可选地，可将劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。
(v)增强子成分
编码本发明多肽的DNA在高等真核生物中的转录常常通过将增强子序列插入载体中来增加。目前已知很多哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的增强子序列。但通常使用真核细胞病毒的增强子。实例包括在其复制起始点晚期侧(late side)的SV40增强子(bp100-270)，巨细胞病毒早期启动子增强子，在其复制起始点晚期侧的多形瘤增强子，和腺病毒增强子。也可参见Yaniv，Nature，297：17-18(1982)所述用于活化真核启动子的增强元件。所述增强子可以剪接插入载体中抗体编码序列的5’或3’位置，但优选位于启动子的5’位置。
(vi)转录终止成分
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物的有核细胞)的表达载体，还包括对转录终止和稳定mRNA所必需的序列。这些序列通常来自真核或病毒DNA或cDNA的5’(偶尔为3’)非翻译区。这些区域包含转录为编码抗体的mRNA的非翻译区中聚腺苷酸化片段的核苷酸片段。一种有用的转录终止元件是牛生长激素多腺苷化区。见WO94/11026和其中公开的表达载体。
(vii)宿主细胞的选择和转化
克隆或表达本文所述载体中DNA的适宜宿主细胞，包括原核生物、酵母或高等真核细胞。适于此目的的原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)，例如，大肠杆菌(E.coli)，肠杆菌属(Enterobacter)，欧文菌属(Erwinia)，克雷白菌属(Klebsiella)，变形菌杆属(Proteus)，沙门菌属(Salmonella)(如鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium))，沙雷菌属(Serratia)(如粘质沙雷菌(Serratia marcescans))和志贺菌属(Shigella)等，以及芽孢杆菌属(Bacilli)如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日出版的DD 266,710中所述地衣芽孢杆菌41P)等，假单胞菌属(Pseudomonas)如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，及链霉菌(Streptomyces)。优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，但其它菌株，如大肠杆菌B，大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是合适的。这些实例是用于说明，并非限制。
除了原核生物，真核微生物如丝状真菌或酵母也是适合于抗体编码载体的克隆或表达的宿主。酿酒酵母或常见的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。还有多个其它属、种和株已有商品供应，并且可以用于本发明，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，例如乳克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克曼氏克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维氏酵母(K.marxianus)等；yarrowia(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)(EP 183,070；Sreekrishna等，J.Basic Microbiol.，28：265-278(1988))；念珠菌属；Trichoderma reesia(EP 244,234)；粗糙链孢霉；许旺氏酵母属(schwanniomyces)如西方许旺氏酵母(schwanniomycesoccidentalis)等；和丝状真菌，例如链孢霉属、青霉属、Tolypocladium以及曲霉属宿主如构巢曲霉和黑曲霉。
适合于表达糖基化多肽的宿主细胞来自多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。目前已经从下述宿主中鉴定了大量的杆状病毒株和变体以及相应的许可型昆虫宿主细胞：草地夜蛾(Spodoptera Frugiperda，毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti，蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus，蚊子)、Drosophila melanogaster(果蝇)和家蚕蛾(Bombyx mori)等。用于转染的各种病毒株公众可以获得，例如加利福尼亚Y级夜蛾(Autographa california)NPV的L-1变体和家蚕蛾NPV的Bm-5株，并且这些病毒可以在此用作本发明的病毒，尤其是用于转染草地夜蛾细胞。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牵牛、西红柿和烟草等的植物细胞培养物也可以用作宿主。
然而，关注最多的是脊椎动物细胞，而且在培养(组织培养)中繁殖脊椎动物细胞已经成为常规方法。有效哺乳动物宿主细胞系的实例是用SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(293细胞或经过再克隆以便能在悬浮培养物中生长的293细胞，Graham等，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77：4216(1980))；小鼠足细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCCCCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK ATCC CCL 34)；布法罗(buffalo)大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；小鼠骨髓瘤细胞，例如NSO(如RCB0213，Bebbington等，Bio/Technology 10：169(1992))和SP2/0细胞(例如SP2/0-Ag14细胞，ATCCCRL 1581)；大鼠骨髓瘤细胞，例如YB2/0细胞(例如YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞，ATCC CRL 1662)；和人肝癌细胞系(HepG2)。
利用上述表达或克隆载体转化宿主细胞以进行抗体制备并培养在经改进的常规营养培养基中，所述培养基适于诱导启动子，选择转化体，或扩增编码所需序列的基因。
(viii)培养宿主细胞
可在多种培养基中培养用于生产本发明多肽的宿主细胞。作为商品提供的培养基例如Ham’s F10(Sigma)，Minimal Essential Medium((MEM)，(Sigma)，RPMI-1640(Sigma)，和Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium((DMEM)，Sigma)适宜培养宿主细胞。此外，Ham等，Meth.Enzym.58：44(1979)，Barnes等，Anal.Biochem.102：255(1980)，美国专利4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985中所述的任何培养基可用作宿主细胞的培养基。在需要时均可向这些培养基的任何一种补充激素和/或其它生长因子(例如胰岛素，转铁蛋白，或表皮生长因子)，盐(例如氯化钠，钙，镁，和磷酸盐)，缓冲液(例如HEPES)，核苷酸(例如腺苷酸和胸腺嘧啶)，抗生素(例如GENTAMYCINTM药物)，微量元素(定义为无机化合物，通常终浓度在微摩尔范围内)，和葡萄糖或对等的能源。也可包括本领域熟练技术人员所知的适当浓度的任何其它必需添加剂。培养条件，例如温度，pH，等是此前选择用于表达的宿主细胞的条件，并且是本领域普通熟练技术人员显而易见的。培养条件诸如温度，pH等，是被选用于表达的宿主细胞的那些条件，并且是本领域技术人员所已知的。
(ix)抗体的纯化
使用重组技术时，抗体可在细胞内，壁膜间隙产生，或直接分泌到培养基中。如果抗体在细胞内产生，第一步需要去除宿主细胞或裂解片段的粒状残骸，例如，通过离心或超滤作用。Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992)描述了分离抗体的方法，该抗体被分泌到大肠杆菌的壁膜间隙。简言之，细胞悬浊液(paste)在乙酸钠(pH 3.5)，EDTA，和苯基甲基磺酰氟化物(phenylmethylsulfonylfluoride)(PMSF)存在下，经过约30分钟解冻。通过离心可去除细胞碎片。如果抗体被分泌到培养基中，通常首先使用作为商品提供的蛋白浓缩滤纸(例如，Amicon或Millipore Pellicon ultrafiltration unit)浓缩来自该表达系统的上清液。在此前的任何步骤中，可使用蛋白酶抑制物例如PMSF抑制蛋白溶解，以及使用抗生素防止外来污染物的生长。
由细胞制备的糖蛋白组合物可使用如下方法纯化：例如，羟磷灰石层析，凝胶电泳，透析和亲和层析，优选亲和层析。蛋白A作为亲和配体的适宜性有赖于存在于糖蛋白中的任何免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人(γ1，γ2，或γ4重链的糖蛋白(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白G用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等，EMBO J.5：15671575(1986))。亲和配体附着的基质通常是琼脂糖，但也可用其它基质。物理稳定的基质例如孔径被控制的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯(poly(styrenedivinyl)benzene)比使用琼脂糖获得更快的流率而且加工时间更短。对于含有CH3区的抗体，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)可用于纯化。根据待回收的抗体，也可利用其它蛋白纯化技术例如；在离子-交换柱上分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅石(silica)上层析，在肝素SEPHAROSETM上层析，在阳离子或阴离子-交换树脂(例如聚天冬氨酸柱)上层析；聚焦层析；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀。
任何初步纯化步骤后，包含抗-VEGF抗体以及污染物的混合物可接受利用洗脱缓冲液在pH约2.5-4.5的条件下的低pH疏水反应层析，其优选在低盐浓度(例如约0-0.25M盐)条件下进行。
Ill.药物配制剂
可以通过将具有所需纯度的抗体与可选的药用载体，赋形剂，或稳定剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences，16版，Osol，A.ed.(1980))混合形成冻干制剂或水溶液制备治疗配制剂。可接受的载体、赋形剂、稳定剂在所用剂量及浓度下对受者无毒性，并包括缓冲剂例如磷酸盐，柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化己烷双胺；氯化苄烷铵(benzalkonium chloride)，苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量多肽(少于约10个残基)；蛋白质如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖类如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨醇；成盐反离子如钠；金属复合物(例如锌-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。优选冻干的抗-VEGF抗体配制剂在WO 97/04801中描述，其包含在本文中作为参考。
本发明的配制剂也可含有被治疗具体指征所需的一种以上的活性化合物，优选活性互补并且相互之间没有副作用的那些。例如，合意地进一步在一种配制剂中包含与EGFR，VEGF(例如，与VEGF上不同表位结合的抗体)，BEGFR或ErbB2结合的抗体(例如Herceptin
Figure A20081009168100461
)。可选或此外，所述组合物包含细胞毒剂，细胞因子，生长抑制剂和/或小分子VEGFR拮抗剂。所述分子是与以有效用于目的意图的量组合存在。
该活性成分也可包裹在通过诸如凝聚技术或界面聚合而制备的微胶囊中，例如，分别在胶质药物传送系统(例如，脂质体，白蛋白微球，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗滴乳状液中的羟甲基纤维素或凝胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。这些技术公开于Remington′s PharmaceuticalSciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980)。
用于体内给药的本发明化合物必需是无菌的。这可以通过在冷冻干燥和重新配制之前或之后通过除菌滤膜过滤而轻易实现。
可制备缓释制剂。缓释制剂的适当实例包括具有一定形状且含有糖蛋白的固体疏水聚合物半通透基质，例如膜或微胶囊。缓释基质实例包括聚酯、水凝胶(如聚(2-羟基乙基-异丁烯酸酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.，15：167-277(1981)；Langer，Chem.Tech.，12：98-105(1982))或聚(乙烯醇)，聚交酯(美国专利3773919，EP 58,481)，L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，等，Biopolymers 22：547(1983))，不可降解的乙烯-乙烯乙酸酯(ethylene-vinyl acetate)(Langer，等，出处同上)，或可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯组成的可注射的微球体)，以及聚D-(-)-3-羟丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸能持续释放分子100天以上，而一些水凝胶释放蛋白的时间却较短。当胶囊化抗体长时间停留在体内时，它们可能由于暴露在37℃潮湿环境中而变性或凝聚，导致损失生物活性，且免疫原性可能会改变。可以根据相关机理来设计使蛋白稳定的合理策略。例如，如果发现凝聚的机理是通过硫代二硫键互换而形成分子间S-S键，则可通过修饰巯基残基、从酸性溶液中冻干、控制湿度、采用合适的添加剂、和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定。
IV.抗-VEGF抗体的治疗用途
根据本发明，抗-VEGF抗体可用于治疗各种以病理性血管生成为特征的肿瘤和非肿瘤疾病。可接受治疗的非肿瘤疾病包括类风湿性关节炎，银屑病，动脉粥样硬化，糖尿病以及其它增生性视网膜病，包括早产儿视网膜病，晶状体后纤维组织形成，新生血管性青光眼，与年龄相关的黄斑退行性改变，甲状腺增生(包括Grave病)，角膜以及其它组织移植，慢性炎症，肺炎症，肾病综合征，先兆子痫，腹水，心包积液(诸如与心包炎相关的心包积液)，以及胸膜积液。
本发明的抗体优选用于治疗其中血管生成在肿瘤生长中起重要作用的肿瘤，包括癌症和良性肿瘤。将被治疗的癌症的实例包括，但不限于，癌，淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤和白血病。癌症的更具体的例子包括鳞状细胞癌，肺癌(包括小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌以及肺鳞癌)，腹膜癌，肝细胞癌，胃的或胃癌(包括胃肠癌)，胰腺癌，神经母细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾或肾的癌，肝癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝的癌以及各种头和颈的癌症，以及B淋巴细胞瘤(包括低级/滤泡样非何杰金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞性(SL)NHL；中级/滤泡样NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高级小无裂细胞NHL；bulkydisease NHL；外套细胞淋巴瘤；AIDS-相关的淋巴瘤；和Waldenstrom′s巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴母细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞白血病；和移植后淋巴组织增生疾病(PTLD)以及母斑细胞病相关性异常血管增生，水肿(诸如与脑肿瘤相关的水肿)，和Meigs综合症。优选，可用本发明抗体治疗的癌症选自以下疾病组成的组：乳腺癌，结肠直肠癌，直肠癌，非小细胞肺癌，非何杰金氏淋巴瘤(NHL)，肾细胞癌，前列腺癌，肝癌，胰腺癌，软组织肉瘤，卡波奇肉瘤，类癌样癌，头和颈部癌，黑素瘤，卵巢癌，间皮瘤以及多发性骨髓瘤。更优选，本发明的方法用于治疗人类患者的结肠直肠癌。
本发明包括抗血管生成治疗，新癌症治疗策略，其目标在于抑制提供养料支持肿瘤生长的肿瘤血管的发育。因为血管生成参与原发性肿瘤生长以及转移，本发明提供的抗血管生成疗法能够抑制原发位点的肿瘤生长以及防止肿瘤向继发位点的转移，由此允许通过其它疗法攻击肿瘤。
联合疗法
当用于治疗诸如肿瘤的各种疾病时，本发明的抗体可与其它适于相同或类似疾病的治疗剂联用。当用于治疗癌症时，本发明的抗体可与常规癌症疗法诸如手术、放疗、化疗或其组合联用。
在一些方面中，用于与本发明抗体联用的癌症治疗的其它治疗剂包括其它抗血管生成药剂。许多抗血管生成药剂已经被鉴定并且是本领域已知的，包括Carmeliet和Jain(2000)所述的。优选，本发明的抗-VEGF抗体与其它VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂联用，诸如VEGF变体，可溶性VEGF受体片段，能够阻断VEGF或VEGFR的适体(aptamer)，中和型抗-VEGFR抗体，VEGFR酪氨酸激酶的低分子量抑制剂以及其任意组合。可选或此外，两或多种抗-VEGF抗体可共同给药患者。
一些其它方面中，用于与本发明抗体联用的肿瘤疗法的其它治疗剂包括其它参与肿瘤生长的因子的拮抗剂，所述因子诸如EGFR，ErbB2(也已知为Her2)ErbB3，ErbB4，或TNF。有时，将一或多种细胞因子给药所述患者也是有益的。在优选实施方案中，VEGF抗体与生长抑制剂联合给药。例如，所述生长抑制剂可先给药，然后给药VEGF抗体。然而，也考虑同时给药或首先给药VEGF抗体。生长抑制剂的适宜剂量是目前所用的那些，并且可由于生长抑制剂与抗VEGF抗体的联合作用(协同作用)而用量减少。
化疗剂
在具体的方面，本发明提供通过将有效量的抗VEGF抗体以及一或多种化疗剂给药易患或被诊断患有癌症的患者来治疗癌症的方法。多种化疗剂可与本发明的方法联用。所涉及化疗剂的示例性以及非限制性列表在本发明的“定义”这一标题下提供。
本领域技术人员应理解，化疗剂的适宜剂量通常大致为临床治疗中所用的剂量，其中所述化疗剂单独给药或与其它化疗剂联用给药。剂量的变化很可能根据被治疗的疾病而出现。给予所述治疗的医师将能够确定个体患者的适宜剂量。
仅作为举例，本发明给出了用于转移性结肠直肠癌的标准化疗。
一个优选实施方案中，本发明的方法用于治疗结肠直肠癌包括转移性结肠直肠癌。结肠直肠癌是美国癌症死亡率中的第三位的常见原因。估计在美国，1999年诊断大约129,000的新发结肠直肠癌病例，并且结肠直肠癌导致56,000人死亡，Landis et al.，Cancer J Clin.49：8-31(1999)。大约70％的结肠直肠癌患者显示可通过手术切除治愈的疾病，August et al.，Cancer MetastasisRev 3：303-24(1984)。然而，占30％的进展期或转移癌症的患者以及占20％的切除后复发患者的预后较差。转移疾病患者的中值存活期为12-14个月，Advanced Colorectal Cancer Meta-Analysis Project，J Clin Oncol 10：896-903(1992)。
美国的转移性结肠直肠癌标准疗法目前是利用5-氟尿嘧啶(5-FU)加5-FU的生化调节物甲酰四氢叶酸，Advanced Colorectal Cancer Meta-AnalysisProject，J Clin Oncol 10：896-903(1992)；Moertel N Engl J Med 330：1136-42(1994)。5-FU/甲酰四氢叶酸的组合使得结肠直肠肿瘤偶然的暂时缩小，但与单独的5-FU相比没有显示延长生存期(Advanced Colorectal CancerMeta-Analysis Project，J Clin Oncol 10：896-903(1992))，而且5-FU与无效治疗加上最佳的支持性看护相比没有显示延长生存期，Ansfield et al.Cancer39：34-40(1977)。5-FU/甲酰四氢叶酸对于生存期益处的缺乏可能部分由于不适当的临床试验范围。在大型随机化试验中，患者接受辅助化疗来治疗可切除的结肠直肠癌，5-FU/甲酰四氢叶酸与lomustine(MeCCNU)，长春新碱，和5-FU相比显示可延长生存期(MOF；Wolmark et al.J Clin Oncol 11：1879-87(1993)。
在美国，5-FU/甲酰四氢叶酸化疗通常根据两种方案之一给药：MayoClinic和Roswell Park方案。Mayo Clinic方案由长期(intensive course)5-FU加低剂量甲酰四氢叶酸(425mg/m2 5-FU加20mg/m2甲酰四氢叶酸，每天经静脉[IV]推注给药持续5天，每隔4到5周重复所述治疗)组成，Buroker et al.J Clin Oncol 12：14-20(1994)。Roswell Park方案每周5-FU加高剂量甲酰四氢叶酸(500-600mg/m2 5-FU通过IV推注给药加上500mg/m2甲酰四氢叶酸，后者每周一次输液2小时给药并持续6周，上述治疗每8周重复一次)，Petrelli et al.，J Clin Oncol 7：1419-26(1989)。临床试验比较了Mayo Clinic和Roswell Park方案，没有显示其效力有差异，但是效力不足，Buroker et al.，JClin Oncol 12：14-20(1994)；Poon et al.，J Clin Oncol 7：1407-18(1989)。两种方案的毒性图谱不同，Mayo Clinic方案导致更多的白细胞减少而Roswell Park方案导致更频繁的腹泻。接受任意方案的新近被诊断为转移性结肠直肠癌的患者可预期4-5个月的疾病进展中值时间以及12-14个月的中值生存期，Petrelli et al.，J Clin Oncol 7：1419-26(1989)；Advanced Colorectal CancerMeta-Analysis Project，J Clin Oncol 10：896-903(1992)；Buroker et al.，J ClinOncol 12：14-20(1994)；Cocconi et al.，J Clin Oncol 16：2943-52(1998)。
最近，转移性结肠直肠癌的新第一线疗法出现。两个随机化临床疗法，每个均使用近400名患者，评估了伊立替康与5-FU/甲酰四氢叶酸的联用，Saltz et al.，Proc ASCO 18：233a(1999)；Douillard et al.，Lancet 355：1041-7(2000)。在两项研究中都显示，与单独的5-FU或甲酰四氢叶酸相比，伊立替康/5-FU/甲酰四氢叶酸的联用导致统计学显著的生存期延长(分别为2.2和3.3月)，疾病进展时间延长以及反应率增加。伊立替康的益处的代价在于毒性增加：将伊立替康加入5-FU/甲酰四氢叶酸与单独的5-FU或甲酰四氢叶酸相比，National Cancer Institute Common Toxicity Criteria(NCI-CTC)3级/4腹泻，3级/4呕吐，4级白细胞减少，以及无力的发病率增加。还有证据显示单剂伊立替康在二线背景中延长存活期，Cunningham et al.，Lancet352：1413-18(1998)；Rougier et al.，Lancet 352：1407-12(1998)。两项随机研究证实伊立替康延长在5-FU治疗后进展的患者的生存期。一项研究将伊立替康与最佳支持性护理比较，并显示存活期延长2.8-月；另一项研究将伊立替康与输注的5-FU比较，并显示生存期延长2.2-月。伊立替康在一线和二线背景中对生存期是否有更多影响没有以良好控制的方式研究。
剂量和给药
本发明的抗体和化疗剂可根据已知方法给药人类患者，诸如作为药团(bolus)经静脉内给药，或通过一段时间内的连续输注给药，经肌内、腹膜内、脑脊液内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径。静脉内或皮下给药所述抗体是优选的。
一个实施方案中，本发明的治疗涉及联合给药抗VEGF抗体以及一或多种化疗剂。本发明涉及给药不同化疗剂的组合。联合给药包括利用不同配制剂或单一药物配制剂的联合给药，以及以任何顺序的连续给药，其中优选存在两种(或所有)活性药剂同时显示它们的生物活性的一段时间。所述化疗剂的制备和配制方案可根据生产商说明进行或由有经验的医师根据经验确定。化疗的制备和剂量方案也在Chemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams& Wilkins，Baltimore，MD(1992)中描述。所述化疗剂可在所述抗体给药之前或以后，或可同时给药。
为预防或治疗疾病，抗体的适宜剂量将有赖于将要治疗的疾病类型，如上所述，疾病的严重度以及病程，所述抗体是否为预防或治疗目的给药，以前的治疗，患者的临床病史以及对抗体的反应，以及主治医师的判断。所述抗体一次性或在一系列治疗中适宜地给药患者。在联合治疗方案中，本发明的组合物以治疗有效量或协同作用量给药。如本文所用，治疗有效量使得抗VEGF抗体以及一或多种其它治疗剂的联合给药或本发明的组合物的给药导致靶疾病或病症的缓解或抑制。治疗协同作用量为抗VEGF抗体与一或多种其它治疗剂协同作用或显著降低或消除与具体疾病相关的病症或症状所必须的量。
根据疾病的类型以及严重度，约1μg/kg到50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)抗体是给药患者的初始候选剂量，其可例如通过一或多次分开的给药或连续输注来给予。常规日剂量范围为约1μg/kg到约100mg/kg或更高，依上述因素而不同。对于在数天或更长时间内的重复给药，根据病情，所述治疗持续直到出现对疾病症状的所需的抑制。然而，其它剂量方案也可使用。在一个优选方面，本发明的抗体每2-3周给药，剂量范围为约5mg/kg到约15mg/kg。更优选，所述剂量方案与化疗方案联用作为转移的结肠直肠癌的一线疗法。在一些方面，所述化疗方案涉及常规高剂量间歇给药。在一些其它方面，所述化疗剂以较小且更为频繁的剂量而没有预定的间隔来给药(“节拍化疗(metronomic chemotherapy)”)。本发明治疗的进展容易通过常规技术和实验来监测。
适宜剂量的其它信息在以下实施例中提供。
治疗效力
本发明治疗的主要优势是在人患者中产生明显的抗癌效果但不导致明显的毒性或副作用的能力，使得所述患者从整体治疗获益。本发明治疗的效力可通过通常用于评估癌症治疗的各个终点(endpoint)来测定，包括但不限于，肿瘤退化，肿瘤重量或大小减小，进展时间，生存期，无进展生存期，总体反应率，反应时间以及生活质量。由于本发明的抗血管生成剂靶向肿瘤血管系统而不必要是肿瘤细胞本身，它们代表抗癌药物的独特类型，并因此可需要独特的方法以及对药物的临床反应的定义。例如，2维分析中超过50％的肿瘤缩小是宣布反应的标准分离点(cut-off)。然而，测定抗血管生成疗法的效力的新方法应采用，包括例如，测定血管生成的血浆或尿标志物以及通过放射显像测定反应。
一个实施方案中，本发明可用于延长易患或被诊断患有癌症的人类患者的生存期。生存期定义为首次给予药物到死亡的时间。一个优选方面，本发明的抗VEGF抗体与一或多种化疗剂联合给药人类患者，由此该患者的生存期与单独给药化疗相比得以有效延长。例如，用抗VEGF抗体联合至少两种，优选三种化疗剂的化疗剂组合治疗的患者组的中值生存期为至少约2个月，优选约2-5个月，超过单独用相同的化疗剂组合治疗的患者组，所述延长在统计学上具有显著性。生存期可通过治疗组相对于对照组的分层危险率(stratified hazard ratio)(HR)来测定，其代表治疗过程中患者死亡的危险性。优选，当与单独的化疗剂相比时，抗VEGF抗体与一或多种化疗剂的联用治疗明显降低死亡率至少约30％(即分层HR(stratified HR)约0.70)，优选至少约35％(即分层HR约0.65)。
一个实施方案中，本发明提供增加易患或被诊断患有癌症的人类患者的无进展生存期的方法。疾病进展的时间定义为给予药物到疾病进展的时间。一个优选实施方案中，与单独的化疗治疗相比，本发明利用抗VEGF抗体以及一或多种化疗剂的联合治疗明显增加无进展存活期至少约2个月，优选至少约2-约5个月。
另一实施方案中，本发明的治疗显著增加易患或被诊断患有癌症的人类患者组中的反应率，所述患者用多种疗法治疗。反应率定义为对所述治疗有反应的被治疗患者的百分比。一方面，与单独的化疗治疗相比，本发明利用抗VEGF抗体以及一或多种化疗剂的联合治疗显著增加被治疗患者组中的反应率，所述增加具有低于0.005的Chi-square p-值。
一方面，本发明提供增加易患或被诊断患有癌症的人类患者或人类患者组中的反应时间(duration of response)。反应时间定义为初次反应到疾病进展的时间。在本发明利用抗VEGF抗体以及一或多种化疗剂的联合治疗中，获得并优选反应时间增加至少2个月，所述增加具有统计学显著性。
治疗安全性
本发明提供有效治疗癌症而对被治疗人类受试者没有明显副作用的方法。本发明治疗的临床效果在一定程度上是出人意料的，被认为与抗血管生成疗法相关的数个不利事件在根据本发明的治疗过程中没有观察到。例如，以前的临床研究提示利用抗VEGF抗体的治疗可导致血栓(一些情况中会致死)，高血压，蛋白尿和鼻衄(出血)。然而，与单独的化疗相比，本发明利用抗VEGF抗体以及包含至少两种优选三种化疗剂的化疗剂组合的联合治疗不显著增加这些不利事件的发生率。因此，本发明的治疗出人意料地包含可接受水平的副反应，同时具有明显提高的抗癌效力。
V.制品
本发明另一实施方案涉及一种制品，其包含可用于治疗上述疾病的材料。所述制品优选包括一个容器，标签或包装插页。适当的容器有瓶子，小瓶，注射器等。容器可由各种材料如玻璃或塑料制成。所述容器含有组合物，所述组合物可有效治疗所述疾病并具有无菌入口(例如所述容器可为静脉内溶液包或小瓶，其含有可被皮下注射针穿透的塞子的)。所述组合物中至少一种活性剂是抗VEGF抗体。所述容器上或所附的标签说明所述组合物用于治疗所选的疾病。所述制品可进一步包含含有可药用缓冲液的第二容器，诸如磷酸盐缓冲的盐水，林格氏溶液以及葡萄糖溶液。其可进一步包含从商业和使用者角度来看所需的其它物质，包括其它缓冲液，稀释剂，过滤物，针和注射器。此外，所述制品包含带有使用说明的包装插页，包括例如警告所述组合物不与蒽环类抗生素类型的化疗剂例如阿霉素，或表柔比星联用，或指示所述组合物的使用者将抗VEGF抗体组合物以及抗肿瘤组合物给药患者。
保藏材料
以下杂交瘤细胞系已经根据布达佩斯条约保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)，Manassas，VA，USA：
抗体名称    ATCC No.         保藏日期
A4.6.1      ATCC HB-10709    1991-3-29
以下实施例仅仅意在举例说明本发明的实践而不是限制。本发明所引用的所有专利以及科学文献的全文都包含在本文作为参考。
VI.实施例
实施例1.在一线转移性结肠直肠癌中将抗-VEGF抗体加入药团伊立替康/氟尿嘧啶/甲酰四氢叶酸(IFL)
进行多中心、III期、随机化、主动控制的试验(multicenter，Phase III，randomized，active-controlled trial)以评估将bevacizumab加入转移性结肠直肠癌的标准一线化学疗法的情况下，bevacizumab的有效性和安全性。该试验收入900多名组织学确定的、之前没有进行治疗的、二维可检测的转移结肠直肠癌患者。
方法和材料
抗-VEGF抗体bevacizumab
抗-VEGF抗体“Bevacizumab(BV)”也已知为“rhuMAb VEGF”或“AvastinTM”，是重组人源化抗-VEGF单克隆抗体，其根据Presta et al.(1997)Cancer Res.57：4593-4599制备。它包含突变的人IgG1框架区以及小鼠抗-hVEGF单克隆抗体A.4.6.1的抗原结合性互补决定区，所述抗体阻断人VEGF与其受体的结合。美国专利6,582,959；WO 98/45331。bevacizumab大约93％的氨基酸序列(包括大部分框架区)来自人IgG1，并且该序列的约7％来自鼠抗体A4.6.1。Bevacizumab的分子量约为149,000道尔顿并且是糖基化的。
多肽的特性以及糖基化位点可从氨基酸组成以及肽图谱推定。所述分子的大小以及电荷特性和临床所用批次(lot)的纯度通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳非凝胶筛选(capillary electrophoresis non-gelsieving)，等电聚焦，以及离子交换和大小排阻层析证明。bevacizumab的活性通过结合酶联免疫吸附测定或重组人VEGF的激酶受体实验来定量。
Bevacizumab利用遗传改造的中国仓鼠卵巢细胞系通过重组DNA技术制备。所述蛋白通过常规柱层析和过滤方法从细胞培养基纯化。根据美国药品和食品监督条例，检测最终产物的质量，特性，安全性，纯度，效力，强度以及赋形剂/化学组成。Bevacizumab的纯度＞95％。Bevacizumab呈清至轻度乳白色，无菌液体，可用于胃肠外给药。
患者选择
符合条件的患者患有组织学上证实的转移性结肠直肠癌，以及二维可测定的疾病。其它包含标准包括至少18岁，美国东部肿瘤协作组EasternCooperative Oncology Group(ECOG)体力状态(performance status)为0或1(Oken et al.(1982)Am.J.Clin.Oncol.5：649-55)，预期寿命超过3个月，以及书面告知的同意。适当的血液、肝以及肾功能(包括不超过500mg蛋白每天的尿排除率)也是所需的。
排除标准包括以前对转移疾病的化疗或生物治疗(在进入研究前辅助使用或使对放射敏感而使用氟代嘧啶(fluoropyrimidine)加或不加甲酰四氢叶酸或左旋咪唑(levamizole)12个月以上是允许的)，研究治疗开始前14天内接受放疗，研究治疗开始前28天内的进行大手术，临床明显的心血管疾病，临床可检测的腹水，妊娠或泌乳，阿司匹林的规律使用(超过每天325mg)或其它非类固醇抗炎药的规律使用，先前存在的出血因素或凝血病(coagulopathy)或需要全剂抗凝，以及已知的中枢神经系统转移。
研究设计
符合条件的患者接受治疗，所述治疗利用被涉及用于实现组间总体平衡的动态随机化算法；随机化根据研究中心、基线ECOG体力状态(0vs.1)，原发疾病位点(结肠vs.直肠)，以及转移病灶数目(一个vs.一个以上)进行分层(stratify)。开始，患者以1∶1∶1的比例随机分配来接受IFL加安慰剂，IFL加bevacizumab，或氟尿嘧啶和甲酰四氢叶酸加bevacizumab(表1)，每种治疗持续直到疾病进展或不可接受的副作用出现或持续最长96周。
               表1.一线治疗方案*
  治疗   起始剂量  方案
  伊立替康氟尿嘧啶甲酰四氢叶酸安慰剂   125mg/m2体表面积500mg/m220mg/m2  每周一次持续4周；每6周重复循环每2周
  伊立替康氟尿嘧啶甲酰四氢叶酸Bevacizumab   125mg/m2500mg/m220mg/m25mg/kg体重  每周一次持续4周；每6周重复循环每2周
  氟尿嘧啶甲酰四氢叶酸Bevacizumab   500mg/m2500mg/m25mg/kg  每周一次持续4周；每8周重复循环每2周
*在bevacizumab加入伊立替康，氟尿嘧啶和甲酰四氢叶酸的方案的安全性得到证实后，利用氟尿嘧啶，甲酰四氢叶酸和bevacizumab的治疗停止。313名患者随机化之后进行证实。所有药物经静脉内给药。
300名患者随机化后，进行中期分析(interim analysis)，此时非盲性、独立数据监测委员会来评价IFL加bevacizumab的安全性，所述评价基于所有可得的安全性信息，包括每组的死亡数，但缺乏与肿瘤反应相关的信息。如果数据监测委员会发现没有由于将bevacizumab加入IFL导致的不适当的不利事件，停止将患者加入将接受氟尿嘧啶以及甲酰四氢叶酸加bevacizumab的组，其它患者以1∶1随机分组以接受IFL加安慰剂或IFL加bevacizumab。然而，如果数据监测委员会的结论是IFL加bevacizumab的安全性状况不能被接受，该治疗停止，患者以1∶1随机分组来接受氟尿嘧啶和甲酰四氢叶酸加bevacizumab的组合或IFL加安慰剂。
肿瘤反应和进展利用Response Evaluation Criteria in Solid Tumors.Therasse et al.(2000)J.Natl.Cancer Inst.92：205-16确定。在疾病进展时间，所述治疗分组公开并对患者提供二线治疗。接受含bevacizumab的治疗的组中的患者可选择在该二线治疗中继续接受bevacizumab。在给予IFL加安慰剂的组中不允许交叉。接受含bevacizumab治疗并且在96周的研究期末没有进展性疾病的征兆的患者可继续在分开的延期研究中接受bevacizumab。接受bevacizumab的组中，具有证实的完全反应或不可接受的化疗副反应的患者将停止化疗并接受单独的bevacizumab。
Bevacizumab(或安慰剂)与化疗同时给药。如果患者体重在研究过程中改变至少10％，Bevacizumab以及化疗的剂量可重新计算。伊立替康和氟尿嘧啶(根据包装插页)′°的标准循环内和循环间剂量改变在具有治疗相关不利事件的患者中是允许的。甲酰四氢叶酸和bevacizumab的剂量没有改变。
在生存和随后的治疗的分析中，所有患者均被随诊直至死亡，失去随诊或研究终止。
评估
在基线评估以后，肿瘤状况在研究的前24周每6周评估一次，然后在治疗余下的时间内每12周评估一次。所有完全和部分反应(complete andpartial responses)需要在它们首次被注意后的至少4周得到证实。
安全性基于不利事件的报告、实验室检测结果，以及生命体征测定来评估。不利事件根据Common Toxicity Criteria of the National Cancer Institute，version 2分类，其中1级表示轻微不利事件，2级为中度不利事件，3级为严重不利事件，4级为威胁生命的不利事件。预先规定的安全性衡量标准包括以下事件的发生率：所有不利事件，所有严重不利事件，以及与bevacizumab相关的不利事件-高血压，血栓形成，3级或4级的出血，以及蛋白尿-以及3级或4级的腹泻，以及不同实验值与生命体征自基线的改变。
为监测IFL加安慰剂以及IFL加bevacizumab方案的安全性，监测研究过程中的死亡、严重副反应、3级或4级的腹泻、自任何来源的3级或4级的出血，以及血栓形成的发生率，所述监测通过非盲性方式由数据安全性监测委员会进行，持续到募集完成或效力的中期分析时间(time of the interimanalysis of efficacy)，以先到的那个为准。
统计学分析
主要结果检测指标(primary outcome measure)是总体生存期；生存的测定不涉及随后的治疗。然而，组间没有交叉。采用生存分析技术诸如Kaplan-Meier方法，对数-秩检验，以及Cox正比危害模型(Cox proportionalhazards model)。次要结果检测指标(secondary autcome measure)是无进展生存期，目标反应率(objective response rate)(完全和部分反应)，反应时间以及生活质量。
对于在分析时存活的患者，生存时的数据在最后的接触时间得以检查。无进展生存期(progression-free survival)定义为在研究过程中，从随机化到进展或死亡的时间，在研究中死亡定义为最后剂量的bevacizumab或化疗之后30天之内出现的任何死亡。对于在最后分析时没有疾病进展的患者，无进展生存的数据在肿瘤状况的最后评估或如果在基线以后没有进行其它评估的情况下于第0天接受审查。没有适当随诊数据的患者被分类为没有反应。
为检测到与对照相比，给予IFL加bevacizumab的组中的死亡危险率为0.75，需要大约385例死亡。所有计算利用对数秩检验进行并涉及对效力的双侧P值，α值0.05，统计强度(statistical power)为80％，以及一次效力中期分析(interim analysis of efficacy)。
中期分析可以以非盲性方式进行。安全性的中期分析在将大约100名患者随机分配到各组之后进行。安全性和效力的第二中期分析在出现193例死亡(所需事件一半的数目)之后进行。
效力分析根据意图-治疗(intention-to-treat)原则进行。安全性分析包括所有接受至少一个剂量的研究药物的患者。
结果
患者的特征
在约20个月的时间中，923名患者在美国、澳大利亚和新西兰的164个位置接受随机化。在313名患者被随机分配到三个组之一中(100名分配到IFL加安慰剂组，103名分配到IFL加bevacizumab组，110名分配到氟尿嘧啶，甲酰四氢叶酸，和bevacizumab)之后，停止向给予氟尿嘧啶，甲酰四氢叶酸和bevacizumab的组的分配(该组中的结果没有报道)。该步骤是对安全性的首次正式中期分析之后，所述方案所需的，所述分析的结果是IFL加bevacizumab的方案具有可接受的安全性以及向该组的分配可以继续。
总体生存的主要终点的意图-治疗分析在给予IFL加安慰剂的组中包括411名患者，在IFL加bevacizumab的组中包括402名患者。表2显示所选的人口统计学以及基线特征，其在组间很好地平衡。每个组中相似数目的患者以前经过结肠直肠癌的手术或接受放疗或辅助化疗。
治疗
治疗的中值时程(median duration)在IFL加安慰剂的组中为27.6周，在给予IFL加bevacizumab的组中为40.4周。计划的给予伊立替康剂量的百分比在两组中类似(在给予IFL加安慰剂的组中为78％，在给予IFL加bevacizumab的组中为73％)。
在数据停止的当天，IFL加安慰剂组中的33名患者以及IFL加bevacizumab组中的71名患者仍然接受分配给他们的初始治疗。可影响生存的二线疗法诸如奥沙利铂或转移切除术的利用比率在两个组之间很好地平衡。在两个组中，大约50％的患者接受一些二线疗法形式；所有患者的25％接受奥沙利铂以及少于2％的患者接受转移切除术。
表2.所选人口统计学以及基线特征*
特征           IFL加安慰剂  IFL加Bevacizumab
性别(％)       (N＝411)     (N＝402)
男性          60           59
女性          40           41
平均年龄(YR)  59.2         59.5
                                         
种族(％)
白人            80        79
黑人            11        12
其它            9         9
中心位置(％)
美国            99        99
澳大利亚或新西兰＜1       ＜1
ECOG体力状态(％)
0               55        58
1               44        41
2               ＜1       ＜1
中心类型(％)
结肠                81    77
直肠                19    23
转移位点数目(％)
1                   39    37
＞1                 61    63
以前的癌症治疗(％)
辅助化疗            28    24
放疗                14    15
转移性疾病的
中值持续时间(mo)    4     4
*组间没有明显差异。IFL表示伊立替康，氟尿嘧啶，和甲酰四氢叶酸，ECOG表示美国东部肿瘤协作组。
效力
给予IFL加bevacizumab的组的总体生存持续时间中值(median durationof everall duration)以及主要终点(primary endpoint)明显长于IFL加安慰剂组(20.3月vs.15.6月)，其对应死亡风险率为0.66(P＜0.001)(表3和图1)，或在bevacizumab组死亡风险降低34％。IFL加bevacizumab组的一年生存率为74.3％，IFL加安慰剂组中为63.4％(P＜0.001)。接受奥沙利铂二线治疗的患者亚组中，IFL加bevacizumab组的总体生存中值持续时间为25.1个月而IFL加安慰剂组的为22.2个月。
将bevacizumab加入IFL与无进展生存持续时间中值的增加相关(10.6月vs.6.2月；与IFL加安慰剂组相比，进展危险率0.54；P＜0.001)；反应率(44.8％vs.34.8％；P＝0.004)；反应持续时间中值(10.4月vs.7.1月；进展危险率，0.62；P＝0.001)(表3)。图2显示无进展生存的Kaplan-Meier估计值。治疗效果在预先规定的亚组之间是一致的，包括根据以下因素定义的那些：年龄，性别，种族，ECOG体力状态，原发肿瘤位置，以前有或无的辅助治疗，转移性疾病持续时间，转移病灶数目，自诊断结肠直肠癌起的年数，以前有或无放疗，基线肿瘤负荷，血清白蛋白浓度，碱性磷酸酶以及乳酸脱氢酶。
                         表3.效力分析*
终点                     IFL加安慰剂  IFL加Bevacizumab    P值
生存时间中值(mo)         15.6         20.3                ＜0.001
死亡危险率                            0.66
一年生存率(％)           63.4         74.3                ＜0.001
无进展生存(mo)           6.2          10.6                ＜0.001
进展危险率                            0.54
总体反应率(％)           34.8         44.8                0.004
完全反应                 2.2          3.7
部分反应                 32.6         41.0
反应持续时间中值(mo)     7.1          10.4                0.001
复发危险率                            0.62
*IFL表示伊立替康，氟尿嘧啶和甲酰四氢叶酸。
安全性
表4表示所规定治疗过程中所选3或4级的不利事件的发生率，而没有对中值治疗持续时间的调整(IFL加安慰剂组中为27.6周，IFL加bevacizumab组中为40.4周)。任何3或4级不利事件的发生率在接受IFL加bevacizumab的患者中比接受IFL加安慰剂的患者中高大约10个百分点，主要是由于3级高血压(需要治疗)的发生率增加，以及4级腹泻和白细胞减少的发生率少量增加。然而，导致住院或研究治疗停止或60天中任何原因导致的死亡率的不利事件的发生率没有明显变化。
                     表4.所选不利事件*
不利事件                   IFL加安慰剂        IFL加Bevacizumab
                           (N＝397)           (N＝393)
                                        百分比
任何3或4级不利事件         74.0               84.9**
导致住院的不利事件         39.6               44.9
导致治疗停止的不利事件     7.1                8.4
导致死亡的不利事件         2.8                2.6
60内的死亡                 4.9                3.0
3级或4级白细胞减少         31.1               37.0
高血压
任何级别                   8.3                22.4**
3级                        2.3                11.0**
任何血栓形成事件           16.2               19.4
深血栓静脉炎               6.3                8.9
肺栓塞                     5.1                3.6
3级或4级出血               2.5                3.1
蛋白尿
任何级别                   21.7               26.5
2级                        5.8                3.1
3级                        0.8                0.8
胃肠穿孔                   0.0                1.5
*没有为伊立替康，氟尿嘧啶，和甲酰四氢叶酸(IFL)加安慰剂组与IFL加bevacizumab组的治疗中值持续时间的差异(27.6周vs.40.4周)而校准数据。
**P＜0.01。仅仅接受至少一次研究-药物治疗的患者包含在内。
阶段1和2的试验鉴定了出血，血栓栓塞，蛋白尿以及高血压作为可能的bevacizumab相关的副作用。然而，在本研究中，与IFL加安慰剂组相比，IFL加bevacizumab组中仅有高血压的发病率明确增加。所有高血压发作都可利用标准口服抗高血压药剂(例如钙通道阻断剂，血管紧张素转化酶抑制剂以及利尿剂)控制。在bevacizumab组中，没有与高血压相关的bevacizumab疗法中止、高血压危象或死亡。
在两组中，2级或3蛋白尿(没有4级蛋白尿的发作或肾炎综合征)以及任何原因导致的3级或4级出血发生率是相似的，尽管所有3例4级出血都在IFL加bevacizumab组中。所有静脉以及动脉血栓形成事件的发生率在IFL加bevacizumab组中为19.4％，在IFL加安慰剂中为16.2％(P＝0.26)。
胃肠穿孔出现在6例接受IFL加bevacizumab的患者中(1.5％)。一名患者直接死于该事件，而其它5名恢复(其中3名能够重新开始治疗而没有随后的并发症)。患有穿孔的6名患者中，3名被证实对IFL加bevacizumab有完全或部分反应。除外研究治疗以外可能与胃肠穿孔相关的因素是在两名患者中前两个月当中的结肠手术以及一名患者中的消化性溃疡疾病。
该阶段III研究的结果直接支持抗血管生成药可广泛适用于癌症治疗的结论。将bevacizumab这种抗-VEGF抗体加入IFL化疗显示有临床意义以及统计学显著的癌症患者中的改善，所述改善通过例如总体生存率，无进展生存，反应率以及反应持续时间来测定。bevacizumab导致的生存中值持续时间4.7月的延长与在结肠直肠癌治疗的其它任何3阶段试验中观察到的一样多或更多。Goldberg et al.(2004)J.Clin.Oncol.22：23-30。尽管该试验过程中，奥沙利铂二线疗法的可用性(availability)有限，Bevacizumab治疗的人群中20.3月的中值生存期还是出现了。
与单独的IFL相比，IFL加bevacizumab的方案使得无进展生存时间从中值6.2月增加到10.6月，总体反应率从34.8％增加到44.8％，反应中值持续时间从7.1月增加到10.4月。这些改善在临床上有意义。不能预测利用IFL加bevacizumab导致的反应率绝对增加10％与该数量级的存活的增长相关。该观察提示，bevacizumab的主要机制是抑制肿瘤生长，而不是细胞减少。
该临床益处伴随治疗副反应的相对适度的增加，其可轻易控制。在3级和4级不利效应的总体发生率中大约10％的绝对增加，主要由于需要治疗的高血压，腹泻以及白细胞减少所致。将bevacizumab加入IFL没有明显增加任何原因所致的60天死亡率，住院以及治疗的中止。
以前的阶段1和2临床实验提示，利用单独的bevacizumab或联用化疗导致血栓形成、出血、蛋白尿以及高血压发病率增加。Kabbinavar et al.(2003)J.Clin.Oncol.21：60-65；Yang et al.(2003)New Engl.J.Med.349：427-34。除了高血压以外，与IFL加安慰剂组中这些副反应的发生率相比，没有发现所述副反应的增加，因此，显示了随机化的、安慰剂对照研究对安全性以及效力评估的重要性。一种新出现的潜在副反应是胃肠穿孔。该并发症并不常见并且有各种临床表现。严重肠道并发症，具体是在患有中性粒细胞减少的患者中的严重肠道并发症，在IFL以及其它结肠直肠癌化疗方案中有报道，并且在一个系列中，在超过2％用基于氟尿嘧啶的方案治疗的患者中有瘘的报道。Saltz et al.(2000)New Engl.J.Med.343：905-914；Rothenberg et al.(2001)J.Clin.Oncol.19：3801-7；Tebbutt et al.(2003)Gut 52：568-73。在给予IFL加安慰剂的组中没有所述事件出现，而在IFL加bevacizumab组中观察到6个病例(1.5％)，有时在整体肿瘤反应的背景中。尽管这6名患者中有3名能够重新开始治疗而没有随后的并发症，一名患者死亡，两名由于该并发症而永远停止所述治疗。
虽然以前的动物研究和早期阶段的临床试验提示利用抗血管生成治疗来治疗癌症，本研究首次显示利用抗血管生成抑制剂，诸如抗-VEGF抗体，确实能产生对癌症患者统计学显著且临床有意义的益处。
实施例2.在一线转移结肠直肠癌中将Bevacizumab加入药团5-FU/甲酰四氢叶酸
该随机的，阶段II试验比较了bevacizumab加5-氟尿嘧啶与甲酰四氢叶酸(5-FU/LV)相对于安慰剂加5-FU/LV在患者中作为一线治疗的情况，所述患者被认为是一线伊立替康的非最佳候选者。
患者和方法
患者合格条件
组织学上被确认的、以前未被治疗的、可测定转移结肠直肠癌患者是合格的，条件是，如果研究人员判断他们不是一线含伊立替康疗法的最佳候选人并具有以下特征中至少一个：年龄超过65，ECOG PS 1或2，血清白蛋白等于或低于3.5g/dL，或之前对腹部或骨盆的放疗。如果患者经过大手术(major surgical procedures)或开放性活检，或在研究开始前28天之内经历过明显的外伤性损伤；研究过程中预期需要大手术；目前正使用或最近使用过治疗性抗凝剂(除非导管开放所需)，溶栓治疗或利用阿司匹林的长期每日治疗(≥325mg/天)或非类固醇抗-炎药物治疗；具有严重的，非愈合伤口，溃疡，或骨折；具有CNS转移病史或证据；怀孕或哺乳；或在基线时具有蛋白尿或临床明显的肾功能障碍，则该患者被排除。所有患者提供其参与的书面同意书。
研究设计和治疗
相互作用性声音反应系统用于随机将合格的患者分配到2个治疗组中1个中：5-FU/LV加安慰剂或5-FU/LV加bevacizumab。利用动态随机算法实现总体以及以下类别中每个组内的平衡：研究中心，基线ECOG体力状态(baseline ECOG performance status)(0vs.≥1)，原发疾病位点(结肠vs.直肠)，以及转移病灶数目(1vs.＞1)。5-FU/LV疗法，包括LV 500mg/m2、超过2小时以及5-FU 500mg/m2作为药团(bolus)中途通过LV输注(Roswell Parkregimen；Petrelli et al.(1989)J.Clin.Oncol.7：1419-1426)，在每个8周的循环中在前6周每周给药一次。化疗持续到研究结束(96周)或疾病进展。Bevacizumab 5mg/kg或安慰剂每2周给药。Bevacizumab组中被证实完全反应或经历不可接受的化疗毒性的患者被允许停止5-FU/LV并持续接受单独的bevacizumab作为一线疗法。疾病进展时，患者对其接受的治疗并非盲性，并可接受研究人员慎重决定的任何二线治疗。只有被随机分配到bevacizumab组的患者可接受bevacizumab作为二线治疗的成分。结束该研究后，每4个月随诊患者任何随后的治疗以及存活情况，直到死亡，失随诊，或研究终止。
研究评估
在基线以及每个8周的循环完成时，利用适宜的放射显像技术(通常为螺旋CT扫描)评估患者的肿瘤状态。肿瘤反应或进展通过研究人员以及独立放射设备(independent radiology facility)(IRF)测定，利用实体瘤反应评估标准(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors)。Therasse et al.(2000)。IRF评估在不了解治疗方案或研究人员的评估的情况下进行。此外，患者完成结肠直肠癌患者中的结肠直肠癌症治疗的功能评估(Functional Assessment ofCancer Therapy-Colorectal)(FACT-C)，4版，一种评估生活质量(quality oflife)(QOL)的可信方案，在基线以及每次治疗循环以前直到疾病进展。Wardet al.(1999)Qual.Life Res.8：181-195。
安全性从不利事件，实验室检验结果，以及生命体征测定的报告评估。不利事件以及异常实验室结果利用National Cancer Institute Common ToxicityCriteria(NCI-CTC)，Version 2分类。预先规定的安全性测定包括四项特别感兴趣的不利事件(高血压，蛋白尿，血栓形成以及出血)，其基于对bevacizumab的以前的临床试验的发现。
统计学分析
主要结果指标(primary outcome measure)是总体生存期。次要结果指标包括无进展生存，目标反应率(完全和部分)，反应持续时间，以及FACT-C QOL评分的变化。生存期定义为从随机化开始到死亡的时间。对于在分析时存活的患者，生存期在最后接触那一天接受审查。无进展生存定义为从随机化到疾病进展较早期或在研究中死亡的时间，所谓研究中的死亡定义为在最后剂量的研究药物或化疗的30天内任何原因所致的死亡。对于在分析时没有疾病进展的存活患者，无进展生存在其最后的肿瘤评估中检查，或如果没有进行基线后评估(postbaseline assessment)，在第1天(研究治疗的第一天)接受检查。在目的反应分析中，没有肿瘤评估的患者分类为无反应者。疾病进展和反应分析基于IRF评估。生活质量改变作为QOL达到恶化的时间(TDQ)来分析，定义为从随机(randomization)化到结肠癌特异性FACT-C辅助(subscale)得分(colon-cancer specific FACT-C subscale score)(CCS)最早出现自基线降低≥3个点，疾病进展或研究中的死亡的时间。也测定TOI-C(CCS总和，身体和功能健康)以及总FACT-C的TDQ，其分别为相对于基线下降7和9个点。
为检测到5-FU/LV/bevacizumab组相对于5-FU/LV/安慰剂组的死亡危险率为0.61，需要大约133例死亡。双尾对数秩和检验的0.05显著性水平80％置信区间以及两次中期分析(interim analyses)在计算中推定。中期分析通过非盲性独立Data Monitoring Committee(DMC)进行。安全性中期分析在44例死亡之后进行，并在89例死亡之后进行第二次安全和效力中期分析。所述中间效力分析由正式组顺序停止规则(formal group sequential stoppingrule)基于O’Brien-Fleming耗费函数(spending function)来控制。Kaplan-Meier法用于估计每个治疗组的中值生存，无进展生存，以及反应持续时间。Bevacizumab组相对于安慰剂组的危险率利用分层Cox成比例危险模型(stratified Cox proportional hazards model)测定。双侧分层对数秩和检验(stratified log rank test)用于比较这两组。分层分析(Stratified analyses)包括基线ECOG体力状态(base line ECOG performance status)，原发疾病位点，以及转移位点数目。目的反应率通过Chi-squared检验来检验。作为解释性分析，Cox正比危险模型用于估计危险因素对治疗效果在生存与无进展生存期的影响。效力分析对于意欲-治疗人群(intent-to-treat population)进行，该人群定义为所有被随机化的患者。安全性分析包括所有接受至少一剂研究药物的患者。
结果
患者特征
在23月中，209名患者在美国和澳大利亚/新西兰的60个位置随机化。为对主要终点(primary endpoint)(总体生存)的意图-治疗分析，在5-FU/LV/安慰剂组有105名患者，在5-FU/LV/bevacizumab组有104名患者。所选人口统计学以及基线特征类似于实施例1中所述，并在治疗组间合理平衡。基线低血清白蛋白(≤3.5g/dL)在bevacizumab组中比在安慰剂组中少见。
治疗
治疗的中值持续时间在5-FU/LV/安慰剂组为23周，在5-FU/LV/bevacizumab组为31周，在治疗过程中5-FU剂量强度(计划5-FU剂量与实际接受量的百分比)在两组中相似(92％vs.84％)。至截止日(the dateof date cut-off)，5-FU/LV/安慰剂组中的1名患者以及5-FU/LV/bevacizumab组中的7名患者保持所给予的初始治疗。随后的治疗(其影响生存)用于两组中大约50％的患者，但5-FU/LV/安慰剂组中更多患者用活性剂伊立替康和奥沙利铂。
效力
总体生存，主要终点，在5-FU/LV/bevacizumab组(中值，16.6月)中长于5-FU/LV/安慰剂组(中值，12.9月)，表明显著性的趋势。死亡危险率估计为0.79(95％CI，0.56至1.10；P＝0.16；表5和图4)。将bevacizumab加入5-FU/LV与中值无进展生存(9.2vs.5.5月；危险率＝0.50；95％CI，0.34至0.73；P＝0.0002，表5和图4)，反应率(26.0％vs.15.2％，P＝0.055)，和反应期中值(9.2月vs.6.8月；危险率＝0.42；95％CI，0.15至1.17；P＝0.088)的增加相关。对于对治疗的总体生存效果的进一步分析通过基线特征显示具有低基线血清白蛋白(≤3.5g/dL)的患者显示产生明显的生存益处(危险率＝0.46；95％CI，0.29至0.74；P＝0.001)。
                      表5.效力分析总结
Figure A20081009168100691
5-FU/LV＝5-氟尿嘧啶/甲酰四氢叶酸
Bevacizumab治疗对生活质量没有有害影响，TDQ结果提示可能的有益效果。CCS得分测定的中值TDQ在5-FU/LV/安慰剂组中为3.0月，在5-FU/LV/bevacizumab组中为3.1月(危险率＝0.79，P＝0.188)。安慰剂治疗和bevacizumab治疗的患者的中值TDQ如第二(secondary)TDQ所测定的为2.3和3.2个月(TOI-C；危险率＝0.71，P＝0.048)以及2.6和3.6个月(总FACT-C；危险率＝0.66，P＝0.016)。
安全性
共204名接受至少一种研究药物剂量的患者(104名患者5-FU/LV/安慰剂和100名患者5-FU/LV/bevacizumab)包含安全性人群。观察到接受bevacizumab的患者的总体3级和4级毒性的16％增加(71％相对于87％)。导致死亡或研究中止的不利事件在两组中相似，所述不利事件已知与5-FU/LV相关(具体地，腹泻和白细胞减少)。两名患者，都在5-FU/LV/bevacizumab组，经历的肠穿孔事件。这些事件在治疗110天以及338天出现，均被认为与手术探查的结肠憩室相关。一名患者死于该并发症。以前的临床试验提示出血，血栓性拴塞，蛋白尿，以及高血压作为可能的bevacizumab相关的毒性；然而，在该研究中，在静脉血栓形成，大于或等于3级的出血，或临床显著的(大于或等于3级)的蛋白尿没有增加。动脉血栓形成事件(心肌梗塞，卒中，或外周动脉血栓形成事件)在5-FU/LV/bevacizumab组中出现在10名患者中，而在5-FU/LV/安慰剂组中出现在5名患者中。
5-FU/LV/安慰剂组的60天所有原因导致的死亡率比5-FU/LV/bevacizumab组高(13.5％vs.5.0％)。两组中由于疾病进展导致的死亡在第一个60天之内是相似的(5.8％vs.4.0％)。在5-FU/LV/安慰剂组，第一个60天内不是由于疾病进展导致的死亡是由于以下原因：心力衰竭(1)，脓毒症(3)，腹泻(2)，呼吸衰竭(1)，以及肺栓塞(1)。在5-FU/LV/bevacizumab组，不归因于疾病进展的单个早期死亡归因于心肌梗塞。
该临床研究的结果进一步证实，人源化抗VEGF单克隆抗体bevacizumab，在加入转移性结肠直肠癌的一线化疗时提供重要的临床益处。当于单独的5-FU/LV比较时，加入bevacizumab延长中值生存期3.7个月，延长无进展生存3.7个月，延长反应持续时间2.4个月，增加反应率11％。
这些结果应当在研究人群的背景下来看。具体选出的是对一线含伊立替康疗法反应不良的候选患者，其反应不良可能是低获益或高治疗相关毒性可能性的结果。对关键性(pivotal)伊立替康试验的仔细分析显示，该试剂的临床益处限于这样的患者，其具有正常ECOG体力状态(PS＝0).21，22。高龄，以前接受过骨盆放疗，体力状态受损，以及低血清白蛋白均被报道增加伊立替康相关毒性。23-27名具有这些特征的患者需要其它治疗选择。以前进行了对较小的随机化II期试验的回顾性子集分析，在CRC中评估bevacizumab和5-FU/LV，并发现bevacizumab对具有基线PS 1或2(中值生存，6.3个月vs.15.2个月)的患者亚组，年龄≥65的亚组(11.2个月vs.17.7个月)，以及血清白蛋白＜3.5的亚组(8.1个月对14.1个月)提供了实质上的治疗效果。这些结果鼓励我们设计目前的试验，具体包括预后不良研究人群以及利用所述试验来检测对生存的显著治疗效果。我们非常成功地录入了与同时进行的关键性IFL/安慰剂相对于IFL/bevacizumab试验的人群不同的人群。与该关键性试验相比，目前的试验中的患者具有更高的中值年龄(72vs.61岁)并且基本上更多的患者具有＞0的体力状态(72％vs.43％)和≤3.5mg/dL的白蛋白(46％vs.33％)。
尽管是这样的高危险研究人群，却显示对5-FU/LV/bevacizumab方案的很好的耐受。所述bevacizumab相关的不利事件3级高血压在5-FU/LV/bevacizumab组占16％，在5-FU/LV/安慰剂组中占3％。没有出现4级高血压。任何级的蛋白尿在5-FU/LV/bevacizumab组38％相对于5-FU/LV/安慰剂组的19％；然而，bevacizumab组中仅有一名患者出现3级蛋白尿，而没有4级蛋白尿的病例。在bevacizumab治疗的患者中，没有3和4级出血或静脉血栓事件增加。动脉血栓事件发病率不平衡：10％见于5-FU/LV/bevacizumab组，而4.8％见于5-FU-/LV安慰剂组。类似的不平衡见于关键性(pivotal)bevacizumab试验中(1.0％见于IFL/安慰剂组，3.3％见于IFL/bevacizumab组)。本研究中所包含人群的年龄越大，导致该不利事件总体发生率越高，然而两项研究中的不平衡值得注意。需要大的、观察性安全试验进一步确定这些以及与bevacizumab治疗相关的其它不常出现的不利事件的发生率以及潜在危险因素。
总之，这些数据证实，bevacizumab与药团5-FU/LV联用为患有以前未经治疗的转移性结肠直肠癌的患者提供了实质性临床益处，所述患者是含伊立替康疗法的不佳候选者。与关键性试验(pivotal trial)结果相结合，这些数据加强了基于bevacizumab的，含5-FU/LV-疗法应当被认为是转移性结肠直肠癌初始治疗的标准选择的证据。

Claims (10)

1.治疗人患者中的癌症的方法，包括将有效量的抗-VEGF抗体以及抗肿瘤组合物给予患者，所述抗肿瘤组合物包含至少一种化疗剂。
2.权利要求1的方法，其中所述癌症选自乳腺癌，结肠直肠癌，直肠癌，非小细胞肺癌，非何杰金淋巴瘤(NHL)，肾细胞癌，前列腺癌，肝癌，胰腺癌，软组织肉瘤，卡波奇肉瘤，类癌样癌，头和颈部癌症，黑素瘤，卵巢癌，间皮瘤以及多发性骨髓瘤组成的组。
3.权利要求1的方法，其中所述癌症是转移的。
4.权利要求1的方法，其中所述患者以前未接受治疗。
5.权利要求1的方法，其中所述化疗剂选自以下物质组成的组：烷化剂，抗代谢物，叶酸类似物，嘧啶类似物，嘌呤类似物以及相关抑制剂，长春花碱类，epipodopyyllotoxins，抗生素，L-天冬酰胺酶，拓扑异构酶抑制剂，干扰素，铂配位复合物，大黄素取代的脲，甲基肼衍生物，肾上腺皮质抑制剂，肾上腺皮质类固醇，孕激素，雌激素，抗雌激素，雄激素，抗雄激素，以及促性腺激素-释放激素类似物。
6.权利要求5的方法，其中所述化疗剂选自以下物质组成的组；5-氟尿嘧啶(5-FU)，甲酰四氢叶酸，伊立替康，奥沙利铂，卡培他滨，紫杉醇和多西紫杉醇。
7.权利要求1的方法，其中所述抗肿瘤组合物包含至少两种化疗剂的组合。
8.治疗患有转移性结肠直肠癌的人类患者或人类患者的组的方法，包括给药所述患者有效量的抗-VEGF抗体组合物和抗肿瘤组合物，其中所述抗肿瘤组合物包含基于氟尿嘧啶的化疗剂组合，由此联合给药所述抗-VEGF抗体和所述抗肿瘤组合物导致被治疗患者中统计学显著性以及临床有意义的改善，所述改善通过生存期，无进展生存期，反应率或反应时间测定。
9.制品，其包含容器，所述容器内包含含有抗-VEGF抗体的组合物以及包装插页，所述包装插页指示该组合物的使用者将所述抗-VEGF抗体组合物和包含至少一种化疗剂的抗肿瘤组合物给药癌症患者。
10.治疗人类患者中的癌症的试剂盒，其包含含有抗-VEGF抗体组合物的药物包，以及利用所述抗-VEGF抗体组合物和包含至少一种化疗剂的抗肿瘤组合物治疗患者中的癌症的说明。
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