CN101294956B - 人视黄醇结合蛋白-4在代谢异常的检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了人视黄醇结合蛋白-4(RBP4)的用途，其可作为一种指标用于检测脂代谢紊乱相关疾病和/或糖代谢紊乱相关疾病。本发明还公开了一种可高精密度预测或诊断脂代谢紊乱相关疾病和/或糖代谢紊乱相关疾病的检测试剂或试剂盒。本发明首次证明RBP4是一个与C反应蛋白或脂联素平行的、判定脂代谢紊乱相关疾病或糖代谢紊乱相关疾病的独立指标，并且可作为预防或治疗脂代谢紊乱或糖代谢紊乱的潜在靶点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和免疫学领域，具体涉及人视黄醇结合蛋白-4在临床预测或早期诊断代谢异常等疾病中的应用，以及人视黄醇结合蛋白-4的检测系统。
背景技术
目前，随着肥胖症和胰岛素抵抗的发生率迅猛攀升，2型糖尿病和代谢综合症在世界范围内迅速蔓延。由于这些慢性代谢紊乱是直接导致心脑血管疾病的主要因素，所以在人口众多的中国，更是成为日益威胁国民健康水平的重大问题。然而，以糖尿病为例，由于缺少直接针对糖尿病本身的有效药物和干预措施，一旦高血糖发生，胰岛素和其它降糖药物已是无力回天，不能阻止各种并发症的恶性演化。所以，如何在2型糖尿病和代谢综合症发生之前进行精准的临床预测和早期诊断，从而能够采取积极有效的干预手段进行预防或延缓糖代谢紊乱的恶化进程，是减缓2型糖尿病和代谢综合症的流行之势、降低国家与个人医疗沉重负担方面至关重要的一环。
胰岛素抵抗(Insulin Resistance)与糖耐量受损(Impaired GlucoseTolerance)是2型糖尿病病发之前的基本生理学特征，直接反映机体清除葡萄糖能力的水平下降，标志着糖尿病前(Pre-diabetic)向糖尿病演进的高危指数。然而，临床上因为缺乏直接精确标示这一糖代谢紊乱状况的简便检测系统和方法，大大阻碍了进行早期预测、临床诊断和实施早期预防措施的可行性。此外，脂代谢紊乱的检测方面也缺乏精确、可靠的指标。因而，建立糖代谢紊乱状况或脂代谢紊乱状况的精确评估技术和检测系统，成为解决这一科学瓶颈问题的关键所在。
综上，本领域需要进一步研究可良好地表征脂代谢紊乱与糖代谢紊乱相关疾病的指标以及开发相关的检测系统，从而更精确地早期预测或诊断脂代谢紊乱和/或糖代谢紊乱相关疾病，及时预防或治疗疾病。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人视黄醇结合蛋白-4的用途，所述的人视黄醇结合蛋白-4可作为一种指标用于检测脂代谢紊乱相关疾病和/或糖代谢紊乱相关疾病。
本发明的另一目的在于提供一种可高精密度预测或诊断脂代谢紊乱相关疾病和/或糖代谢紊乱相关疾病的检测试剂或试剂盒。
在本发明的第一方面，提供一种人视黄醇结合蛋白-4的用途，用于制备检测脂代谢紊乱相关疾病或评估脂代谢紊乱相关疾病疗效的检测试剂或试剂盒。
在另一优选例中，所述的视黄醇结合蛋白-4作为独立指标。
在另一优选例中，所述的脂代谢紊乱相关疾病包括(但不限于)：血脂异常(如高血脂)、血压异常(如高血压)或胆固醇异常。
在另一优选例中，所述的胆固醇异常包括：总胆固醇显著高于正常值；低密度脂蛋白胆固醇(LDL)显著高于正常值；或高密度胆固醇(HDL)显著低于正常值。
在另一优选例中，所述的人视黄醇结合蛋白-4还用于制备检测糖代谢紊乱相关疾病或评估糖代谢紊乱相关疾病疗效的检测试剂或试剂盒。
在另一优选例中，所述的糖代谢紊乱相关疾病包括(但不限于)：胰岛素抵抗、糖尿病(优选的为2型糖尿病)、糖耐量受损或肥胖。
在另一优选例中，所述的检测试剂或试剂盒用于检测亚洲人群脂代谢紊乱相关疾病或糖代谢紊乱相关疾病。
在另一优选例中，所述的人视黄醇结合蛋白-4用于制备检测中国人群脂代谢紊乱相关疾病(或糖代谢紊乱相关疾病)的检测试剂或试剂盒。
在另一优选例中，所述的人视黄醇结合蛋白-4作为独立指标，独立于体重指数(BMI)、C反应蛋白(CRP)、脂联素、和/或胰岛素抵抗指标。
也即：所述的人视黄醇结合蛋白-4在用于检测脂代谢紊乱相关疾病和/或糖代谢相关疾病时，与C反应蛋白、脂联素和/或胰岛素抵抗指标无交互作用。
在本发明的第二方面，提供一种检测脂代谢紊乱相关疾病或糖代谢紊乱相关疾病的检测试剂盒，所述的试剂盒包括：容器a以及位于所述容器a的第一抗体，所述的第一抗体是单克隆抗体，具有以下特性：
(a)特异性结合人视黄醇结合蛋白-4；和
(b)不结合于人视黄醇结合蛋白-4以外的其它蛋白。
在另一优选例中，所述的第一抗体由杂交瘤细胞系CCTCC C200641产生。
在另一优选例中，所述的第一抗体被包被在固相载体上，所述的固相载体装载于所述试剂盒中。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有容器b以及装于所述的容器b中的第二抗体，所述第二抗体可与人视黄醇结合蛋白-4结合，且所述第二抗体不同于所述的第一抗体。
在另一优选例中，所述的第二抗体是抗人视黄醇结合蛋白-4的多克隆抗体。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有：
容器c，所述的容器c中装有携带标记物的、可与所述抗人视黄醇结合蛋白-4的多克隆抗体结合的抗体；
容器d，所述的容器d中装有人视黄醇结合蛋白-4的标准品；和/或
容器e，所述的容器e中装有人视黄醇结合蛋白-4的质控品。
在本发明的第三方面，提供一种单克隆抗体，所述的单克隆抗体具有以下特性：
(a)特异性结合人视黄醇结合蛋白-4；和
(b)不结合于人视黄醇结合蛋白-4以外的其它蛋白。
在另一优选例中，所述的单克隆抗体由杂交瘤细胞系CCTCC C200641产生。
此外，还提供一种产生所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞，它是杂交瘤细胞系CCTCC C200641。
此外，还提供所述的单克隆抗体的用途，用于制备检测脂代谢紊乱相关疾病或糖代谢紊乱相关疾病的检测试剂盒。
在本发明的第四方面，提供一种人视黄醇结合蛋白-4的用途，用于作为独立指标：
检测脂代谢紊乱相关疾病和/或糖代谢紊乱相关疾病；或
评估脂代谢紊乱相关疾病和/或糖代谢紊乱相关疾病的疗效。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1显示了血清RBP4水平与代谢综合症指标(Metabolic SyndromeComponents)的数目之间的相关关系。数据为经年龄、性别、地区、居住地、饮酒、吸烟、教育程度、体力活动、心血管疾病史和家族慢性疾病史进行调整后计算得出的平均值。P<0.0001。
图2显示了四分位数分析中，在RBP4与C反应蛋白(CRP)对比(A)、RBP4与脂联素(adiponectin)对比(B)、及RBP4与胰岛素抵抗指标(HOMA-IR)对比(C)情况下，代谢综合症的比值比(odds ratios)。比值比经年龄、性别、地区、居住地、饮酒、吸烟、教育程度、体力活动、心血管疾病史和家族慢性疾病史调整后计算得出。RBP4和CRP、脂联素及HOMA-IR都无交互作用(P值分别为0.6182，0.910和0.0923)。
图3A显示了利用本发明的RBP4单克隆抗体进行Western印迹试验；其中，不同泳道代表如下：
M：分子量标准，1：His标记的RBP4标准蛋白，
2：人血清样品1号，0.25μl，3：人血清样品2号，0.25μl，
4：人血清样品3号，0.25μl，5：人血清样品3号，0.5μl。
图3B显示了RBP4多克隆抗体进行Western印迹试验；其中，不同泳道代表如下：
M：分子量标准，1：人血清样品1号，0.5μl，
2：人血清样品2号，0.5μl，3：人血清样品2号，0.25μl，
4：鼠血清样品，5：His标记的RBP4标准蛋白。
图4显示了在制作标准曲线时，用稀释缓冲液将标准蛋白稀释为表4所示浓度的步骤。
图5显示了利用不同浓度的标准蛋白的检测结果绘制的标准曲线。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次建立了针对人视黄醇结合蛋白-4(RBP4)的酶联免疫反应(ELISA)灵敏检测系统，并在收集的大量人群健康状况评估研究的样本和临床病人干预样本中进行了检测分析。通过本发明人的分析首次发现，RBP4是一个独立地可用于判定脂代谢紊乱或糖代谢紊乱的指标。RBP4的上升与体重指数(Body Mass Index，BMI)、腰臀比和空腹胰岛素水平显著相关；并且甘油三酯、胆固醇和血压异常与RBP4的上升也是密切相关的。此外，本发明人还意外地发现，RBP4是一个与C反应蛋白(CRP)或脂联素(Adiponectin)平行的、判定脂代谢紊乱相关疾病或糖代谢紊乱相关疾病的独立指标。在此基础上完成了本发明。
人视黄醇结合蛋白-4(RBP4)
以往的研究表明，RBP4蛋白的主要功能是将维生素A运送至靶组织。还有研究表明，肝脏和脂肪组织分泌于血清中视黄醇结合蛋白-4(ret inolbindingprotein4，RBP4)的水平与胰岛素抵抗等存在相关性。然而，在已有研究中对于RBP4与其它糖代谢或脂代谢相关因子(如C反应蛋白、脂联素)的关系阐述得不够清楚。另一方面，已有人群研究的样本量都比较小，样本量受限直接导致研究结果不确定性强、偏差大，对于RBP4是否能够真正作为临床实际可用的检测指标还不清楚(目前还没有将之作为临床上实际应用的脂代谢紊乱或糖代谢紊乱相关指标)。此外，已有研究绝大部分的研究对象是针对白人的，至今还没有针对亚洲人群(特别是中国人群)的大样本量研究的报导。本发明人的研究表明，RBP4的水平与脂代谢紊乱和/或糖代谢紊乱密切相关，其可作为判断脂代谢紊乱和/或糖代谢紊乱的独立指标。并且，所述的研究以亚洲人群作为基础进行分析，样本量大。
RBP4蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列是本领域已知的，其氨基酸序列例如可参见GenBank登录号NM_006744所示。
人视黄醇结合蛋白-4的应用
本发明人利用基于人群并具有中国地域代表性的“2005年北京和上海中老年人群营养健康状况调查”的流行病学研究，通过统计分析发现，RBP4水平的上升不仅与肥胖和胰岛素抵抗紧密相关，而且更重要的是在中老年人群中与代谢综合症的几个重要的指标相关。
本发明人使用所述的RBP4检测试剂盒，测定了50至70岁、1458份男性和1831份女性血浆中RBP4的含量。结果显示，男性RBP4的含量比女性高、城市居民比农村居民高、上海居民比北京居民高。在四分位数法分析中发现，RBP4的上升与体重指数、腰臀比和空腹胰岛素水平显著相关，但与空腹血糖水平无关。令人惊异的是，甘油三酯、胆固醇和血压异常与RBP4的上升也是密切相关的。在血浆RBP4水平最高的四分位群体中，代谢综合症的发病率显著提高。此外，RBP4上升的程度与代谢综合症五个指标中占据的数目直接相关，而且这种相关性在对CRP(体内CRP水平与代谢综合症呈正相关)水平或脂联素(体内脂联素水平与代谢综合症呈负相关)水平、胰岛素抵抗自我平衡模型的评估、以及最著名的体重指数进行调整分析后依然存在。
因此可见，血浆中的RBP4水平与脂代谢紊乱和/或糖代谢紊乱具有很好的正相关性。而且这种相关性更是独立于体重指数、C反应蛋白、脂联素和/或胰岛素抵抗指标而存在的。
如本发明所用，“独立于指标a”是指，RBP4水平不受指标a正常或不正常的影响，若指标a正常，而RBP4水平偏高，则仍然存在患脂代谢紊乱和/或糖代谢紊乱的情况(或风险)。其中指标a选自：体重指数、C反应蛋白、脂联素、胰岛素抵抗指标。以指标a为BMI而言，即BMI比较低的人群中，若RBP4较高，仍存在一定的患脂代谢紊乱和/或糖代谢紊乱的风险。
本发明人的结果证明，RBP4是一个与CRP或脂联素平行的、判定代谢综合症发病率的独立指标，可以用于衡量胰岛素抵抗、高血脂、高血压、高胆固醇的异常程度，有对发生糖尿病与心脑血管疾病可能性进行患病风险预测的临床应用潜力。
因此，基于本发明人的上述新发现，可以利用RBP4作为指标来衡量、预测或诊断：
(i)脂代谢紊乱，包括但不限于：血脂异常(如高血脂)、血压异常(如高血压)、胆固醇异常(如总胆固醇显著高于正常值；低密度脂蛋白胆固醇显著高于正常值；或高密度胆固醇显著低于正常值)；
(ii)糖代谢紊乱，包括但不限于：胰岛素抵抗、糖尿病(优选的为2型糖尿病)、糖耐量受损或肥胖。
此外，在得知了RBP4水平与脂代谢紊乱以及糖代谢紊乱的相关性以后，还可将RBP4作为预防和/或治疗脂代谢紊乱或糖代谢紊乱的潜在靶点。例如，可利用所述的RBP4作为筛选药物的靶点，筛选可抑制RBP4的药物(例如抑制剂、下调剂、拮抗剂)，从而通过抑制体内RBP4的表达或活性而达到预防或治疗脂代谢紊乱或糖代谢紊乱的目的。
RBP4检测系统
为了准确地测定样本中RBP4的含量，本发明人建立了针对人视黄醇结合蛋白-4(RBP4)的酶联免疫反应(ELISA)灵敏检测系统，所述系统可方便、快捷地用于临床检测RBP4。作为本发明的优选方式，所述的RBP4检测系统是一种基于双抗夹心法原理而制备的试剂盒，所述的试剂盒中含有特异性结合RBP4的抗体。
1.单克隆抗体
为了建立所述的RBP4检测试剂盒，本发明提供了一种特异性非常高的抗RBP4蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体可特异性结合RBP4抗原，不结合于人视黄醇结合蛋白-4以外的任何其它蛋白。当用于检测血样中的RBP4抗原时，不与血样中其它蛋白发生交叉反应，并具有高的准确性和灵敏度。
在本领域人员的实践中经常发现，由于RBP4蛋白抗原决定簇大多被包埋在内部，因此难以找到一种特异性高的单克隆抗体。即使开发出一些抗RBP4单克隆抗体，然而当将这些抗体用于临床实际检测时，仍然遭遇到与RBP4蛋白结合特性差的问题，这是由于临床样品中RBP4蛋白的抗原决定簇被包埋在内部，无法接触到抗体造成的。当用这种单克隆抗体检测样品时，需要将样品进行处理(如加热变性)，使被包埋的抗原决定簇暴露出来，这一方面造成临床检测程序的复杂化，使得检测时间过长；另一方面，由于加热变性会导致待测样品中其它各种蛋白的变性，从而大大提高非特异性结合的发生率，造成干扰，降低检测的准确性。针对上述技术难题，本发明人制备了许多种针对RBP4蛋白的单克隆抗体，经过大量的、反复的研究试验，最终找到了本发明的抗RBP4单克隆抗体(由杂交瘤细胞系CCTCC C200641(HRBP4单抗杂交瘤细胞株2A6)产生)，该单克隆抗体对于RBP4蛋白具有很高的特异性，不结合于RBP4蛋白以外的其它蛋白。并且，当用于临床检测时，无需对待测样品进行过多的处理即可方便地获得精确的检测结果。
本领域技术人员均了解，一种抗原可能含有多个抗原表位(抗原决定簇)，因此，针对同一个抗原可以获得不止一个抗体，这些抗体对抗原的结合特性(如特异性等)均可能是不同的。因此，针对同一个抗原，本领域人员需要进行大量的反复比较、筛选和鉴定，才能找到适合于特异性结合的单抗。本发明的抗RBP4单克隆抗体(由杂交瘤细胞系CCTCC C200641产生)具有高特异性结合RBP4蛋白的能力，可见其结合的是RBP4蛋白空间结构上被暴露于表面的抗原决定簇(表位)。且经试验论证与RBP4蛋白以外的其它蛋白没有任何交叉反应。
制备抗RBP4蛋白的抗体的技术是本领域中众所周知的。本发明的抗体是对人RBP4具有特异性的单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人RBP4蛋白或其片段；更特别地，指那些能与人RBP4蛋白或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。
本发明的单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and TCell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的单克隆抗体可以利用RBP4基因产物或片段或功能区，通过免疫技术获得。此外，还可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。
本领域人员均了解，在得到了所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系或通过测序等手段得知所述的单克隆抗体后，本领域人员可以采用多种方法方便地获得所述的抗体。
作为本发明的一种实施方式，所述的单克隆抗体可以由下列制备方法所制备，所述方法包括步骤：(1)提供佐剂预处理的小鼠；(2)在小鼠腹腔内接种所述的杂交瘤细胞并分泌单克隆抗体；(3)抽取腹水，分离获得所述的单克隆抗体。作为一种优选方式，从腹水中分离单克隆抗体的方法是：收集腹水，用经硫酸铵、辛酸沉淀，接着用Protein G预装层析柱纯化，获得高纯度的抗RBP4单克隆抗体。
此外，也可按照常规的动物细胞培养方法，体外培养扩增所述的杂交瘤细胞，从而使之分泌所述的单克隆抗体。
在获得了本发明的抗RBP4单克隆抗体后，本领域人员可通过多种途径来灵敏地检测样品中RBP4蛋白的水平，采用的技术可以是免疫学领域中常用的技术。
2.检测试剂盒
作为本发明的优选方式，所述的RBP4检测系统是一种可精确检测样品中RBP4含量的检测试剂盒。所述试剂盒解决的技术问题一：灵敏检测血清内RBP4含量，且样品消耗量少；所述试剂盒解决的技术问题二：检测条件简单，方便快捷。
本发明提供了一种用于检测样品中RBP4含量的检测试剂盒，该试剂盒中含有本发明的抗RBP4单克隆抗体(由杂交瘤细胞系CCTCC C200641产生)。
在获得了本发明提供的抗RBP4单克隆抗体后，可以方便地制备出用于特异性检测RBP4蛋白的检测试剂盒。所述试剂盒中除了含有本发明的抗RBP4单克隆抗体以外，还可以包含其它检测试剂或辅剂，如显色剂、标记物、二抗、抗抗体、增敏剂等。本领域人员应理解，各种变化形式的检测试剂盒均是包含在本发明中的，只要其中利用了本发明的抗RBP4单克隆抗体作为与RBP4特异性结合的试剂。
作为本发明的一种优选方式，本发明人根据双抗夹心法的原理，制备了一种用于检测RBP4蛋白水平的试剂盒。双抗夹心法常规的做法是将一抗固定于载体，然后一抗与抗原反应，洗涤后再与二抗反应(所述的二抗携带可检测信号，或可与携带可检测信号的物质结合)，最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。双抗夹心法特别适用于具有两个或两个以上表位的抗原的检测。
本发明人发现，采用本发明的抗RBP4单克隆抗体与另一种抗体(优选的为一种抗RBP4多克隆抗体)来将目标抗原RBP4吸附及定位，其定位和放大效果更好，从而进一步提高特异性和精密度。相对于单抗体的竞争法来说，双抗体夹心法的测定效果更为优良，因而测定时只需很少的样品量(如可对样品进行1000倍稀释，这样不仅节约了样品，而且通过稀释后更能有效的降低血清中其它高浓度蛋白的干扰)。所以采用双抗体夹心法无论在灵敏度、精确度、准确度、特异性及稳定性上更具有优势。
如本文所用，所述的“样品”是指分离自人体的物质，包括但不限于：血清、血浆、尿液、或其它组织提取液。
如本文所用，所述的“捕获抗体”、“包被抗体”、“第一单克隆抗体”、“第一抗体”与“一抗”可互换使用，都是指本发明的抗视黄醇结合蛋白-4单克隆抗体。
所述的第一抗体被包被在固相载体上。本发明对所采用的固相载体没有特别的限制，只要其能够与第一单克隆抗体相偶联(连接)即可。例如，所述的固相载体选自：微量滴定板(如96孔板)、或微球等。
在本发明的一个实例中，采用的固相载体是微量滴定板，所述的微量滴定板例如是一种聚苯乙烯板。
如本文所用，所述的“检测抗体”、“第二抗体”与“二抗”可互换使用，都是指特异性地抗RBP4且对应于所述试剂盒中相应的第一抗体的抗体。对于抗原RBP4而言，相应的第一抗体和第二抗体是不同的，并且可同时结合于所述的RBP4的不同表位(抗原决定簇)。
所述的第二抗体可以是不同于本发明的抗RBP4单克隆抗体的另一种可特异性结合RBP4蛋白的单克隆抗体(即其与本发明的抗RBP4单克隆抗体所结合的RBP4表位是不相同的)；或者，所述的第二抗体可以是一种多克隆抗体。在本发明的优选实例中，采用了一种抗RBP4多克隆抗体作为第二抗体。
所述的多克隆抗体可通过常规的方法来制备，例如，可通过将所述的RBP4蛋白导入动物中来获得，优选地将RBP4蛋白与弗氏佐剂按照适当比例(如1:1)混合后免疫动物。免疫方法可使用动物皮下注射。所述动物可选自兔、羊、牛等。作为本发明的优选方式，采用兔来生产所述的第二抗体：兔免疫2-3个月后，从其静脉血中收获抗血清并纯化，获得抗RBP4多克隆抗体。
如本文所用，所述的“标记物”是指用于确定待检测样品中RBP4的存在与否以及存在的量的标志物。在确定了本发明的试剂盒所采用的包被抗体和/或检测抗体后，可以采用本领域常规用于与检测抗体结合来进行检测的各种标记物。本发明对所采用的标记物没有特别的限制，只要是能够与所述的检测抗体结合，且在适当处理后能够准确地指示待检测样品中RBP4蛋白的存在与否以及存在量的标记物均是可用的。所述的标记物可直接被设置于第二抗体上；或者，所述的标记物也可被设置于特异性抗第二抗体的抗抗体上，本领域人员可根据所采用的抗体的种类和特性，选择适宜的标记物。例如，所述的标记物可以选自：辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶或葡萄糖淀粉酶。
当采用如上所示的一些酶标记物时，还需要采用一些与相应的酶结合的底物，从而可通过显色等方式来报导标记物的存在情况或者存在量。如本文所用，所述的“与标记物相对应的底物”是指可被标记物所催化显色，用于显示第二抗体与RBP4发生结合的识别信号。所述的底物例如：用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS；用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate，p-NPP)；等等。本领域人员可根据所采用的标记物的种类和特性，选择适宜的底物。
为了获得定量结果，可以在检测过程中设置含已知浓度的多个RBP4蛋白的标准品。对于标准品的设置方法可采用常规的方法。
在本发明的一个实例中，用于制备所述的标准品的RBP4蛋白纯品是通过常规的DNA重组技术生产的重组RBP4蛋白。此外，所述的RBP4蛋白也可以是天然存在的，比如可分离自哺乳动物(如人)。RBP4蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列是本领域已知的，例如可参见GenBank登录号NM_006744所示。因此，生产RBP4的方法也是本领域已知的。例如，通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用RBP4的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的RBP4蛋白。一般来说有以下步骤：
(1).用编码人RBP4蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；和
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
上述获得的重组RBP4蛋白可被加工成具有一定纯度的蛋白。可采用许多蛋白纯化技术来纯化上述表达的RBP4蛋白，包括(但不限于)：亲和层析、分子筛、柱层析、或细胞超声。
在本发明的优选方式中，为了便于蛋白纯化，将所述的RBP4蛋白的编码基因克隆于携带His标签的表达载体中，在表达后，所述的RBP4蛋白的一端携带His标签，因此可通过亲和层析的方法来纯化所述的RBP4蛋白。在更优选的方式中，可将得到的蛋白初提物用分子筛进行进一步的纯化，获得所需的纯化的蛋白。
利用所述的标准品，标准曲线如下设置：用标准品的OD值检测结果为纵坐标(Y轴)，标准品浓度为横坐标(X轴)绘制成用于定量标准曲线。从而，根据待测样品检测获得的OD值，利用标准曲线可计算出待测样品中RBP4蛋白的浓度。
为了消除假阳性和假阴性，也可在检测过程中设置质控(对照)。
此外，为了使本发明的试剂盒在检测时更方便，所述的试剂盒中优选的还包含其它一些辅助试剂，所述的辅助试剂是ELISA试剂盒中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的。所述的试剂例如(但不限于)：显色剂、洗涤液、终止液、增敏稀释液。
此外，在所述试剂盒中还可包含使用说明书，用于说明其中装载的试剂的使用方法。
3.检测方法
在获得了本发明提供的抗RBP4单克隆抗体和/或试剂盒后，可以利用多种免疫学相关方法来检测样品中RBP4蛋白的含量，这些方法均被包含在本发明中。
作为一种优选方式，本发明提供一种利用本发明的试剂盒体外检测RBP4蛋白的方法，包括以下步骤：
(a)将待测样品加样于包被有第一单克隆抗体的固相载体，从而使待测样品中的RBP4蛋白与固相载体上的第一单克隆抗体结合，形成带有“RBP4蛋白-第一单克隆抗体”二元复合物的固相载体；
(b)将第二单克隆抗体加样于(a)获得的固相载体，从而形成带有“第二单克隆抗体-RBP4蛋白-第一单克隆抗体”三元复合物的固相载体；且所述的第二单克隆抗体携带一标记物(或所述的第二单克隆抗体可与携带标记物的抗体(即抗第二单克隆抗体的抗体)结合，从而形成带有“携带标记物的抗第二单克隆抗体的抗体-第二单克隆抗体-RBP4蛋白-第一单克隆抗体”四元复合物的固相载体)；
(c)检测三元(或四元)复合物中的标记物，从而确定待检测样品中RBP4蛋白的存在与否以及存在的量。
作为本发明的一种优选方式，定量检测RBP4蛋白的方法具体如下：
(i)抗原抗体反应：将本发明的抗RBP4蛋白包被在多孔板上，之后在多孔板的微孔内分别加入不同浓度的标准品、质控品(可选)，或待测血清样品；
(ii)酶联反应：将第二抗体(其上设置有标记物或可与携带标记物的抗体结合)溶液加入各孔，振荡、孵育；洗涤；
(iii)显色反应：每孔加入对应于标记物的底物、显色剂，孵育，每孔加入反应终止液，结束反应；
(iv)酶标仪测定OD值；
(v)结果计算：A)制作标准曲线：以标准品浓度为横坐标，标准品测定OD值为纵坐标，作出标准曲线；B)评判质控品浓度(可选)：根据质控品的OD值，从标准曲线上读出相应的浓度值；质控品测定浓度值处于给定范围时，该次测定有效；C)计算待测血清样品浓度：当标准曲线和质控品均被判定有效时，根据待测样本的OD值从标准曲线计算出待测血清样品的RBP4蛋白浓度。
在本发明的实施例中，本发明人利用所述试剂盒对一批人血清进行RBP4水平的检测，发现检测结果准确，并且对同一样品的多次检测结果都基本一致，误差小，精密度高，同次试验(Intra-Assay)的变异系数要小于5％，不同次实验(Inter-Assay)的变异系数也在10％以下，结果稳定可信。调整样品的稀释度后，检测结果也符合线性关系。样品为血清或者血浆的检测结果基本一致，也未发现与血清中其它蛋白存在交叉反应。
本发明的主要优点在于：
(1)首次发现RBP4是一个与CRP或脂联素平行的、判定脂代谢紊乱或糖代谢紊乱的独立指标。此外，本发明还提示，RBP4可作为预防和治疗脂代谢紊乱或糖代谢紊乱的潜在靶点。
(2)本发明提供了针对RBP4的酶联免疫反应灵敏检测系统(试剂盒)，为脂代谢紊乱或糖代谢紊乱的临床早期诊断和预测提供了基于生物高新技术、精准而又简便的手段。
(3)本发明提供了一种新的针对RBP4的特异性单克隆抗体，其对于RBP4具有很高的特异性，当用于临床检测时，无需对待测样品进行过多的处理(如使样品中RBP4发生加热变性)即可方便地检测出样品中RBP4的含量，且与样品中RBP4以外的其它蛋白无交叉反应。
实施例1RBP4与代谢综合症的相关性
本发明人借助基于人群并具有中国地域代表性的“2005年北京和上海中老年人群营养健康状况调查”的流行病学研究，分析血浆中RBP4水平与代谢综合症之间是否存在联系。
受试人数为3289人，年龄均在50至70岁，其中男性1458人、女性1831人。利用如后续实施例2建立的RBP4检测试剂盒来检测受试者血浆中RBP4水平，并采用四分位法对这些受试人的RBP4水平以及身体基本参数和相关代谢指标进行统计分析。
结果显示，男性RBP4的含量比女性高、城市居民比农村居民高、上海居民比北京居民高。在四分位数法分析中发现，RBP4的上升与体重指数、腰臀比和空腹胰岛素水平显著相关，但与空腹血糖水平无关(表1-表2)。令人惊异的是，甘油三酯、胆固醇和血压异常与RBP4的上升也是密切相关的。
在血浆RBP4水平最高的四分位群体中，代谢综合症的发病率显著提高。此外，RBP4上升的程度与代谢综合症五个指标(向心性肥胖、高甘油三酯，高血糖，高血压、低高密度脂蛋白)中占据的数目直接相关(表3)。而且这种相关性在对C反应蛋白(CRP)水平或脂联素水平、胰岛素抵抗自我平衡模型的评估、以及最著名的体重指数进行调整分析后依然存在(图2)。
表1受试对象基本参数和相关代谢指标在RBP4四分位数下的比较
该表中，所有的P值都经过年龄、性别、地区和居住地调整后计算，P<0.05时认为有统计学差异。
表2RBP4和相关代谢指标的局部斯皮尔曼(Spearman)相关系数
该表中，所有的相关系数经年龄、性别、地区和居住地调整后计算，P<0.05时认为有统计学上的相关性。
表3代谢综合症的相关指标在RBP4四分位数分析中的
比值比(odds ratio)及其95％置信区间(CI)
该表中，*模型1经年龄、性别、地区和居住地进行了调整；
§模型4经体质指数BMI作进一步调整；
P<0.05时认为有统计学差异。
本发明人还统计了受试者的血浆RBP4水平与代谢综合症指标的数目之间的关系，结果如图1所示，可见血浆RBP4水平越高，代谢综合症指标的数目也越高，两者密切相关。
上述结果证明，RBP4是一个与CRP或脂联素平行的、判定代谢综合症发病率的独立指标，可以用于衡量胰岛素抵抗、高血脂、高血压、高胆固醇的异常程度，有对发生糖尿病与心脑血管疾病的可能性进行患病风险预测的临床应用潜力。
因此，RBP4水平的上升不仅与肥胖和胰岛素抵抗紧密相关，而且与代谢综合症的几个重要的指标相关。
实施例2RBP4检测试剂盒的制备
一.单克隆抗体的制备
1.杂交瘤的制备
将骨髓瘤细胞SP2/0，P653与小鼠脾细胞按1：5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1200rpm8min；弃上清，用吸管吸净残留液体。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。90s内加入37℃预温的1ml45％PEG(分子量4000)溶液，边加边轻微摇动。37℃水浴作用90s。加37℃预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。离心，800rpm6min。弃上清，用含20％小牛血清HAT选择培养液重悬。将上述细胞加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl。一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。将培养板置37℃、5％CO2培养箱中培养。
脾细胞和骨髓瘤细胞经处理后，用选择性培养基培养1～2天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，选择培养液维持7～10天后换用HA培养液，再维持2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，每2～3天换一半培养液。
最后，用酶联免疫吸附试验(ELISA)对抗体进行检测。对于检测抗体阳性的杂交克隆进行有限稀释法克隆，并重新检测，反复3-4次。最后选择出分泌的抗体特异性最高的杂交瘤细胞系，即是HRBP4单抗杂交瘤细胞株2A6，保藏号为CCTCC C200641的杂交瘤细胞系。
2.抗体的制备
用佐剂预处理的小鼠；在小鼠腹腔内接种前述的杂交瘤细胞2A6，使之分泌单克隆抗体；抽取小鼠的腹水，分离获得所述的单克隆抗体。
以本发明的抗RBP4单克隆抗体为抗体，以His标记的RBP4标准蛋白以及各种人血清样品为抗原，进行Western印迹试验的结果。结果见图3A，呈现的均是单一条带。其中，不同泳道代表如下：
M：分子量标准，1：His标记的RBP4标准蛋白，
2：人血清样品1号，0.25ul，3：人血清样品2号，0.25ul，
4：人血清样品3号，0.25ul，5：人血清样品3号，0.5ul。
二.多克隆抗体的制备
通过将RBP4蛋白导入动物中免疫获得。将RBP4蛋白(GenBank登录号NM_006744)与弗氏佐剂按照1:1的比例混合后免疫新西兰大耳兔。兔免疫2-3个月后，从其静脉血中收获抗血清并进行常规的Protein G柱纯化，获得抗RBP4多克隆抗体。
通过常规的Western印迹法检测所获得的多克隆抗体。结果见图3B；其中，不同泳道代表如下：
M：分子量标准，1：人血清样品1号，0.5ul，
2：人血清样品2号，0.5ul，3：人血清样品2号，0.25ul，
4：鼠血清样品，5：His标记的RBP4标准蛋白。
三.试剂盒的制备和使用
1.试剂盒的制备材料
(1)RBP4单克隆抗体
如前述“一”制备(小鼠IgG)，调节浓度为0.25mg/ml。
(2)RBP4多克隆抗体
如前述“二”制备(兔IgG)，调节浓度为0.2mg/ml。
(3)标准蛋白
采用RBP4重组蛋白，制备方法采用常规的DNA重组技术，主要如下：根据GenBank登录号NM_006744所提供的RBP4蛋白的氨基酸序列合成RBP4蛋白的基因，并将之克隆入pET28a载体的多克隆位点中，获得pET28a-RBP4重组质粒；将该重组质粒转化大肠杆菌DH5α细胞；在LB培养基中培养的宿主细胞；从培养基或细胞中分离、纯化RBP4蛋白。调节浓度为0.15mg/mL。
(4)酶标抗兔IgG抗体
购自Bio-rad，Cat#172-1079。
(5)底物A和底物B
底物A是Solution A(Cat#DY999)；底物B具体是Solution B(Cat#DY999)；均购自R&D。
(6)铺板固定缓冲液
采用PBS缓冲液。
(7)稀释缓冲液
采用PBST(PBS+0.5％Tween20)+0.1％BSA。
(8)封闭缓冲液
采用PBST+1％BSA。
(9)洗涤缓冲液
采用PBST。
(10)终止反应液
采用1MH2SO4。
(11)固相载体
采用96孔酶标板作为固相载体。
2.稀释步骤
A.试剂准备
1)将单克隆抗体用铺板缓冲液(PBS)1:50稀释。
2)将多克隆抗体用稀释缓冲液1:600稀释。
3)酶标抗体用稀释缓冲液1:2500稀释。
以上试剂稀释后最好在1小时内使用。
4)底物A和底物B按1:1混合，混合后立即使用。
B.样品稀释
样品的稀释度最终为1:1000，可采用两步稀释。
稀释1：10ul样品+90ul稀释缓冲液＝1:10
稀释2：10ul稀释1+990ul稀释缓冲液＝1：100
稀释2即为最终的稀释了1000倍的样品。
C.标准曲线准备
用稀释缓冲液将标准蛋白稀释为表4所示浓度：
表4
| 管号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 浓度ng/ml | 500 | 250 | 100 | 50 | 25 | 10 | 1 |
稀释步骤如图4所示，其中已稀释标准蛋白为：10ul0.15mg/ml标准蛋白+140ul稀释缓冲液。
3.测定步骤
第一单克隆抗体固定
1)将稀释好的第一单克隆抗体加入96孔板中，每孔100ul。
2)用保鲜膜包好，4℃过夜(约16小时至20小时)。
测定
1)第二天将96孔板中第一单克隆抗体余液倒掉，每孔加入250ul封闭缓冲液，在37℃孵育1小时。孵育后弃余液，每孔加入250ul洗涤缓冲液，在摇床上摇晃30秒洗涤，共3次，最后拍干备用。
2)将标准蛋白和稀释好的样品(无需事先加热变性)加入到预先处理好的96孔板中，每孔加样100ul，推荐复孔测定。
3)加样后，将板用薄膜包好(保鲜膜即可)，放入50-60rpm的摇床中，37℃孵育1小时。
4)弃去板中溶液，用洗涤缓冲液清洗，每孔250ul，摇晃30秒后，弃去洗涤液，拍干，共洗3次。
5)用排枪每孔加入100ul已稀释好的RBP4多克隆抗体，将板用薄膜包好，放入50-60rpm的摇床中，37℃孵育1小时。
6)弃去板中溶液，清洗3次。
7)用排枪每孔加入100ul已稀释好的酶标抗兔IgG抗体，将板用薄膜包好，放入50-60rpm的摇床中，37℃孵育1小时。
8)弃去板中溶液，清洗3次。同时将底物A和底物B按1：1配好备用。
9)用排枪每孔加入100ul底物，置于暗处，显色20分钟。
10)用排枪每孔加入100ul终止反应液，终止反应。
11)振荡均匀后，在酶标仪450nm下读数。
实施例3RBP4检测试剂盒的检测性能验证
收集人血液样品，从各血液样品中分别提取获得血清，采用实施例2中“3”所述的方法检测人血清中RBP4的浓度，并比较测定结果的精度、特异性、线性情况。
1.标准曲线
获得的标准曲线见图5，可见该标准曲线的有效测定范围是1ng/ml-500ng/ml，即最高检测上限值为500ng/ml，最低检测下限值为1ng/ml。因此，本发明的试剂盒的可检测范围宽(1ng/ml-500ng/ml)，且灵敏度好(可检测低至1ng/ml RBP4蛋白)。
2.精度
A.同一块板中的检测精度(Intra-Assay)
3个样品在同一块板中测定了4次，获得的平均值、标准差(SD)、变差系数(CV)结果如表5所示。
表5
| 样品 | 平均值(μg/ml) | SD(μg/ml) | CV(％) |
| 1 | 21.58 | 0.54 | 2.5 |
| 2 | 31.40 | 0.44 | 1.4 |
| 3 | 46.17 | 1.54 | 3.3 |
因此可见，变差系数(CV)<5％，说明本发明的试剂盒具有良好的批内精度。
B.不同次实验中的检测精度(Inter-Assay)
5个样品在不同板中分别测定了3次，获得的平均值、标准差(SD)、变差系数(CV)结果如表6所示。
表6
| 样品 | 平均值(μg/ml) | SD(μg/ml) | CV(％) |
| 1 | 21.16 | 0.47 | 2.2 |
| 2 | 32.04 | 1.59 | 5.0 |
| 3 | 36.76 | 1.90 | 5.2 |
| 4 | 46.15 | 1.61 | 3.5 |
| 5 | 52.32 | 1.58 | 3.0 |
因此可见，变差系数(CV)<6％，说明本发明的试剂盒具有良好的批间精度。
3.特异性
本发明人还检测了本发明的试剂盒的特异性，检测本发明的试剂盒中的抗体与人RBP4以及其它蛋白的交叉反应情况。
结果如表7所示，可见利用所述试剂盒进行检测，除了与人RBP4特异性结合以外，与人血清中其它代表性蛋白无交叉反应；并且与小鼠及大鼠血清也无交叉反应，可见本发明的试剂盒具有很高的特异性。
表7
| 被分析物 | 最大浓度(μg/ml) | 交叉反应(％) |
| 人RBP4人抵抗素(Resistin)人脂联素(Adiponect in)人瘦素(Lept in)人胰岛素人TNF-α人MCP-1大鼠血清小鼠血清 | 0.10.020.061110.07 | 100N.R.N.R.N.R.N.R.N.R.N.R.N.R.N.R. |
N.R.：无交叉反应。
4线性(血清稀释度的影响)
将从血样中分离获得的血清分别稀释1000、2000、4000倍，采用前述制备的试剂盒进行检测，将获得的测量值与预期值比较，结果如表8所示。
表8
预期值的百分数(％)＝测量值/预期值。
由表5结果可见，由于预期值的百分数值很高，基本都能接近100％，所述试剂盒的灵敏度很高。
5血清样品和血浆样品的比较
采用前述制备的试剂盒，分别检测血液样品和从血液样品中分离出的相应的血清样品中RBP4的含量，并进行对比，结果如表9所示。
表9
| 样品 | 血清(μg/ml) | 血浆(EDTA)(μg/ml) |
| 1 | 27.84 | 27.80 |
| 2 | 33.19 | 29.34 |
| 3 | 49.80 | 48.04 |
可见，本发明的试剂盒对于血液样品与血清样品均具有良好的检测灵敏度。
实施例4本发明的试剂盒与商购试剂盒的比较
本实施例中，采用以下试剂盒检测一批血清样品中RBP4的含量：(1)实施例2制备的试剂盒；(2)商购的ELISA试剂盒(R&D公司)，其基于抗体竞争结合原理而制备，其中采用的抗体是一种抗RBP4多克隆抗体。
结果发现，利用本发明的单克隆抗体制备的试剂盒在无需对样品进行加热的情况下就可精确地获得RBP4蛋白的含量，且不同次实验精度高；而商购试剂盒在不对样品进行加热时，捕获RBP4蛋白较少，获得的结果低于正常值。
菌种保藏
本发明制备的RBP4单抗杂交瘤细胞株2A6(HRBP4单抗杂交瘤细胞株2A6)保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉)，保藏号为：CCTCC C200641，保藏日为2006年12月24日。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (3)
1.一种检测脂代谢紊乱相关疾病或糖代谢紊乱相关疾病的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：容器a以及位于所述容器a的第一抗体，所述的第一抗体是单克隆抗体，由杂交瘤细胞系CCTCC C200641产生，具有以下特性：
(a)特异性结合人视黄醇结合蛋白-4；和
(b)不结合于人视黄醇结合蛋白-4以外的其它蛋白。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还含有容器b以及装于所述的容器b中的第二抗体，所述第二抗体可与人视黄醇结合蛋白-4结合，且所述第二抗体不同于所述的第一抗体。
3.一种单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体由杂交瘤细胞系CCTCCC200641产生，具有以下特性：
(a)特异性结合人视黄醇结合蛋白-4；和
(b)不结合于人视黄醇结合蛋白-4以外的其它蛋白。
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