CN101328473B - E1-永生化的细胞培养物及培养所述细胞以提高从中获取的产物产量的方法 - Google Patents

E1-永生化的细胞培养物及培养所述细胞以提高从中获取的产物产量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了培养衍生自胚胎成视网膜细胞并通过腺病毒E1序列永生化的细胞的方法以改良得自这些细胞的产物的产量，所述细胞优选地是PER.C6TM细胞。本发明提供了用于这些细胞及具有很高细胞密度的培养物的补料策略，从而获得产物例如重组抗体的高产量。

Description

E1-永生化的细胞培养物及培养所述细胞以提高从中获取的产物产量的方法
本申请是申请日为2004年5月6日、申请号为200480012604.2、发明名称为“E1-永生化的细胞培养物及培养所述细胞以提高从中获取的产物产量的方法”的发明专利申请的分案申请。 
技术领域
本发明涉及细胞培养领域。特别地，本发明涉及培养从已用来自腺病毒的E1序列永生化的细胞衍生的细胞的领域。更特别地，本发明涉及培养这些细胞以从这些细胞中获取高水平的产物。 
背景技术
美国专利5,994,128公开了人PER.C6
Figure 2008100838691_0
细胞系，所述细胞系通过用腺病毒(Ad5)E1a和E1b基因永生化而衍生自视网膜细胞，并举例示出了保藏在ECACC、保藏号为96022940的细胞。除了能作为缺失E1的腺病毒载体的包装细胞(packaging cell)(美国专利5,994,128；WO01/005945)及作为产生其他病毒的包装细胞(WO 01/38362)外，E1永生化的细胞如PER.C6细胞还可用于产生重组蛋白如抗体(WO00/63403)。 
Xie等人(2002)公开了一种用于E1永生化的细胞的无血清悬浮培养方法。然而，用本领域已公开的用于E1永生化的细胞的培养方法所获得的产物产量还可以提高。本发明的目的之一是提供可提高从此类细胞中获得的产物产量的新方法。 
附图简述 
图1.在摇瓶中以两种不同的起始细胞浓度(0.3和1.0×106ml-1)生长的PER.C6克隆(克隆1)的生长及抗体生产的曲线图。左纵轴：活细胞数(Nv)。右纵轴：抗体(Ab)浓度。横坐标轴：时间(小时)。 
图2.示出产生抗体的PER.C6克隆(克隆1)中随着活细胞数上升细胞对谷氨酰胺特异利用下降。N：细胞数。 
图3.PER.C6克隆1的分批培养分布图。A：代谢物。Glc，葡萄糖；Lac，乳酸盐；Gln，谷氨酰胺；NH3，氨；P，磷酸盐。B-E：氨基酸(AA)。 
图4.含有葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸、磷酸盐、钙和生长因子的补料成分混和物对于PER.C6克隆1的效应曲线图。A：活细胞数(Nv)。B；抗体(Ab)浓度。圆圈：分批培养。方块：补料分批培养。 
图5.PER.C6克隆的活细胞数(Nv)和抗体(Ab)产量的曲线图，其中培养基每天彻底更换一次(每一个都是2次独立实验)。A：克隆1。B：克隆2。 
图6.对克隆1的改良补料的结果(实施例4)。A：活细胞数(Nv)。B：抗体(Ab)浓度。空心圆圈：分批培养。实心圆圈：补料分批培养。 
图7.使用了不同的第一次及后续补料添加的对克隆1的进一步改良的补料的结果(实施例4，表2)。A：活细胞数(Nv)。B；抗体(Ab)浓度。圆圈：分批培养。方块：补料分批培养。箭头：最后一次补料。 
图8.使用了不同的第一次及后续补料添加的对克隆2的进一步改良的补料的结果(实施例4，表2)。Nv：活细胞数。Ab：抗体浓度。 
图9.根据本发明方法生产的IgG的半乳糖基化水平。 
图10.使用了不同的第一次及后续补料添加的对克隆3的进一步改良的补料的结果(实施例4，表2)。Nv：活细胞数。Ab：抗体浓度。 
发明概述 
本发明的一个方面提供了用于通过腺病毒E1序列永生化的细胞的补料分批培养(fed-batch culture)或补料灌流培养(fed-perfusionculture)的补料策略(feed strategy)。在其中的一个实施方案中，本发明提供了一种用于培养此类细胞的方法，所述细胞能够悬浮生长，所述 方法包括下述步骤：在培养所述细胞的过程中至少确定一次选自如下一组的至少一种培养基成分的浓度：葡萄糖、谷氨酰胺、磷酸盐、亮氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苏氨酸和甘氨酸；在培养所述细胞的过程中，在至少一种其浓度在上一步中被确定的成分在耗尽时或耗尽之前向培养基中加入成分，其中所加入的成分至少包括葡萄糖、谷氨酰胺、磷酸盐、亮氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸和胱氨酸。其他有益成分可根据本发明加入，本文下面将会提供这些成分的加入量及加入时间，这些信息同样会出现在权利要求中。 
本发明的另一方面提供了一种衍生自通过腺病毒E1序列永生化的细胞的细胞培养物，其特征是所述培养物包括至少10×106细胞/ml。优选地所述培养物包括至少12×106细胞/ml，更优选地至少15×106细胞/ml。在特定优选的实施方案中，本发明的培养物包括多于20×106、25×106、30×106、或40×106细胞/ml。本文同样提供了获得这样的培养物的方法。 
另一方面，本发明还提供了提高通过腺病毒E1序列永生化的细胞培养物的细胞密度及提高从中得到的产物产量的一种方法。关于这点，一个实施方案提供了一种用于培养此类细胞的方法，其特征是所述方法包括在接种浓度介于0.8×106至2.0×106活细胞/ml之间，优选地介于0.9×106至1.5×106活细胞/ml之间的条件下传代培养所述细胞的步骤。 
优选地，所述用于本发明的方法的细胞衍生自视网膜细胞，更优选地衍生自人胚胎视网膜(human embryonic retina，HER)细胞，这样的细胞保藏于ECACC，保藏号96022940。在特定的实施方案中，所述细胞是PER.C6细胞。 
在特定的实施方案中，所述细胞可以产生高产量的重组蛋白，优选地是抗体。在另外的实施方案中，所述细胞包括在E1区域具有缺 失的重组腺病毒载体或其他能够通过本发明的方法用所述细胞以高产量产生的病毒。在优选的实施方案中，所述细胞至少在一段时间内在无血清培养基中培养。 
发明详述 
任何细胞系的生产率主要由三个基本参数确定：所述细胞系的比生产率、可达到的最大活细胞浓度、及可能的生产过程时长。这些变量任何一个的增加都可以引起终产物浓度的增加并且其在很大程度上依赖于细胞系。在直接分批培养(straight batch culture)中，细胞系如CHO和SP2/0的细胞密度可以达到4×106/ml。在补料分批或灌流方法中，活细胞浓度会增加，典型的杂交瘤细胞如SP2/0可以培养至多达10×106细胞/ml，CHO可以培养至多达6-10×106细胞/ml。本发明描述了可以提高由腺病毒E1序列永生化的细胞的培养物的活细胞密度的方法以获得超过本领域已报道的细胞密度，所述细胞优选地衍生自胚胎视网膜细胞。另外，本发明的方法可用于从本发明的细胞的培养物中获得更高的产物产量。 
本发明公开了如何使E1永生化的细胞(如PER.C6细胞)能够有利地用于产生高产量的单克隆抗体方面的改良。本发明公开了这些细胞可以在直接分批培养方法中培养至很高的活细胞浓度(多至14×106活细胞/ml)。 
进一步地，E1永生化的细胞(如PER.C6细胞)非常适合补料分批培养方法，因为这些细胞的培养物出乎意料地消耗乳酸盐和氨，并且在营养限制条件下能够维持长时间的生存力。本文提供了通过在培养中的补料策略提高所述细胞中的产物产量的方法。 
本文所用术语“补料策略(feed strategy)”是指将特定的经鉴定的成分包括但不限于养分如糖、氨基酸、及此类物质加入到培养基中。优选地在特定时间加入特定量的所述经鉴定的成分，如在如本文所提 供的需要它们提高得自细胞的产物产量时。 
E1永生化的细胞(如PER.C6细胞)还非常适合灌流方法，因为它们可以长时间维持在很高的活细胞浓度(多至50×106细胞/ml，并且存活率至少为85％)并且具有很好的终产物浓度。 
培养基 
与用本领域的方法从同样细胞获得的产量相比，本发明的方法普遍提高了得自细胞的产物产量。优选地，本发明的方法至少在部分时间内使用了无血清的培养基。优选地，所述培养基仅包含非源自动物的重组产生的蛋白质。这些培养基可由各种渠道商购。在本发明的一个实施方案中，VPRO培养基(JRH Biosciences)被用于补料分批或(补料)灌流方法。 
产物 
本发明的方法优选地用于在本发明的细胞中产生产物。本发明的方法可用于改良抗体和其他蛋白质的产生(WO 00/63403)。对于蛋白质生产，本发明的细胞适当地含有编码所述蛋白质的核酸，并与能够驱动所述蛋白质表达的元件可操控地相联系。进一步地，所述方法可用于改良在E1区域具有缺失的重组腺病毒载体的生产，在此情况下所述细胞被用作补充细胞(complementing cell)，其本身基于已有方法学(例如美国专利5,994,128；WO 01/005945)为本领域技术人员所知。 
另外，本发明的方法可用于改良用于其他(非腺病毒)病毒在细胞中繁殖的方法(WO 01/38362)。因而，本发明的产物可以是重组蛋白质如抗体、促红细胞生成素等，还可以是在E1区域具有缺失的重组腺病毒载体或其他病毒。 
细胞 
本发明的细胞是被来自腺病毒的E1序列永生化的细胞，其在本文中也称为E1永生化的细胞。这些细胞至少表达腺病毒E1A区域的一个功能性部分，并优选地还至少表达E1B区域的一个功能性部分。E1A蛋白具有转化活性，E1B蛋白具有抗细胞凋亡活性。本发明的细胞可衍生自任何细胞，包括肺细胞、肾细胞、羊水细胞，但是优选地衍生自视网膜细胞。其可衍生自胚胎视网膜细胞。优选地本发明的细胞是人细胞。本领域已经描述了用于胚胎视网膜细胞永生化的方法(美国专利5,994,128)。因此，用来自腺病毒的E1序列永生化的视网膜细胞可通过此方法获得。在特定的优选的实施方案中，本发明的细胞衍生自E1永生化的HER细胞，如PER.C6细胞。用于本发明目的的PER.C6细胞是指得自保藏于ECACC、编号为96022940的细胞的上游或下游传代细胞或其上游或下游传代细胞的后代。另外，所述细胞还可含有具有ts125突变的E2A区域(参见例如美国专利6,395,519)。衍生自PER.C6细胞的细胞可以是感染了重组腺病毒或其他病毒的PER.C6细胞，还可以是被导入了重组核酸的PER.C6细胞，例如包含一个表达盒(expression cassette)，其中编码感兴趣的蛋白质的核酸与能够驱动其表达的序列(例如一个启动子和polyA信号)可操控的连接，其中所述细胞优选地来自一个可被本领域技术人员所熟知的标准程序选择的稳定的克隆。此类克隆的培养物能够生产被所述重组核酸编码的蛋白质。 
补料策略的成分 
一方面，本发明提供了用于培养本发明的细胞的方法，其中通过本发明的补料策略，特定氨基酸在培养过程中被加入以补充浓度已经限制或即将限制最适过程和产物产量的氨基酸。氨基酸是指所有以其D及L立体异构体形式存在的天然存在的α氨基酸及其衍生物。衍生物是指一个氨基酸，其具有附加其上的另一个分子或原子。衍生物包 括例如氨基的乙酰化、羧基的胺化、两个半胱氨酸含硫残基氧化以形成胱氨酸。另外，氨基酸衍生物还包括酯、盐(如氯化物、硫酸盐等)、及水合物。本领域技术人员应理解，若本文提到某个特异氨基酸，其衍生物也同样可以应用并被包含在本发明的范围之内。其他成分如糖、生长因子、维生素等等也可被加入以改良本发明的方法。 
补料策略 
一方面，本发明提供了一种用于在培养基中在通过腺病毒E1序列永生化的细胞中生产一种产物的方法，其中所述产物选自包括重组蛋白、病毒、及在E1区域具有缺失的重组腺病毒的一组。所述方法的特征是所述方法包括一个步骤，其中培养基中至少加入了亮氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸和胱氨酸。一方面，本发明提供了一种用于培养通过腺病毒E1序列永生化的细胞的方法，所述细胞能够悬浮生长，所述方法包括如下步骤：在培养所述细胞的过程中至少确定一次选自如下一组的至少一种培养基成分的浓度：葡萄糖、谷氨酰胺、磷酸盐、亮氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苏氨酸和甘氨酸；在培养所述细胞的过程中，在至少一种其浓度在上一步中被确定的成分在耗尽时或耗尽之前向培养基中加入成分，其中所加入的成分至少包括葡萄糖、谷氨酰胺、磷酸盐、亮氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸和胱氨酸。本文所用“耗尽(depletion)”是指培养基中一种成分浓度为起始浓度的30％或更低的时候。在这些方面，测定选自包括葡萄糖、谷氨酰胺、磷酸盐、亮氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸或胱氨酸的一组的至少一种培养基成分的浓度相对于测定仅选自包括缬氨酸、赖氨酸、苏氨酸和甘氨酸一组的成分的浓度是优选的。在特定实施方案中，本发明的至少两种培养基成分的浓度在第一步中确定。在特定实施方案中，所加入的成分进一步包括缬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、 甘氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、钙、LongR3IGF-1、Long EGF和胰岛素中一种或多种。在特别的实施方案中，加入所述成分至终浓度(每10×106细胞/ml中新鲜加入的成分，以毫摩尔/l表示)为：葡萄糖6.0、谷氨酰胺2.60(第一次补料)及1.75(后续补料)、磷酸盐0.70、亮氨酸0.66、丝氨酸1.10(第一次补料)及0.55(后续补料)、异亮氨酸0.50、精氨酸0.46、甲硫氨酸0.23、及胱氨酸0.25。在进一步的实施方案中，进一步加入下列成分至终浓度(每10×106细胞/ml中新鲜加入的成分，以毫摩尔/l表示)为：缬氨酸0.45、赖氨酸0.44、苏氨酸0.30。在进一步的实施方案中，进一步加入下列成分至终浓度(每10×106细胞/ml中新鲜加入的成分，以毫摩尔/l表示)为：天冬酰胺0.10、酪氨酸0.13、组氨酸0.10、苯丙氨酸0.02、色氨酸0.06。进一步地，可加入钙至终浓度(每10×106细胞/ml中新鲜加入的成分，以毫摩尔/l表示)为0.02。生长因子如IGF、EGF、及胰岛素或它们的衍生物也可以适当地在生长培养基中存在。上述成分的加入量的误差区间可以在每种成分33％或以下，优选地20％或以下，更优选地10％或以下，更优选地5％或以下。所述数量为每10×106细胞/ml中存在的量，并且其线性依赖于细胞/ml的数值。在优选的实施方案中，所述成分在48小时和至少一种培养基成分耗尽的时刻之间加入，所述成分的浓度在前面的步骤中确定。在特定的实施方案中，所述加入是在24小时和恰好耗尽之前的时刻之间进行。在特定方面，本发明提供了一种本发明的方法，其中所述细胞表达重组免疫球蛋白，并分泌至培养基中达到至少每升500mg的水平，优选地至少700mg/l，更优选地至少850mg/l，更优选地至少1000mg/l，还是更优选地至少1250mg/l，更优选地至少1500mg/l，更优选地至少1750mg/l，更优选地至少2000mg/l。一般说来，相比于没有成分被加入的方法(即分批培养方法)，本发明的培养基成分的加入(即在例如补料分批培养方法中)引起所生产的产物产量增加到至少1.5倍，优选地至少2倍，更优 选地至少2.5倍，还是更优选地大约3倍或甚至更高。 
除了用于补料分批培养方法，本发明的补料策略还可有益地用于最优化的分批方法，如在实施例5中所展示的。 
灌流 
或者，在本发明的另一方面，培养基可以被完全更换。已经显示当这一点被应用于衍生自通过腺病毒E1序列永生化的视网膜细胞时可以获得未曾预料到的高活细胞密度。更换培养基可以通过任何本领域技术人员所熟知的手段进行，包括但不限于通过离心、过滤和类似手段进行细胞收集，然后将所述细胞在新鲜培养基中重悬。或者可以使用灌流系统，其中培养基通过细胞分离装置如centritech离心机或通过穿过中空纤维柱体或此类装置被持续或间断更换。因此本发明的另一方面提供了用于培养衍生自通过腺病毒E1序列永生化的胚胎视网膜细胞的方法，其特征是培养基以每天(24小时)更换0.2-3，优选地是0.5-3培养物体积的速度进行更换。用此方法获得的培养物优选地具有大于20×106细胞/ml的活细胞密度，更优选地大于30×106细胞/ml。在特定方面，此类培养物具有大于40×106细胞/ml的细胞密度。在特定方面，此类培养物用于生产重组抗体，其产量至少150mg/l/天，优选地至少200mg/l/天，更优选地至少300、400、或500mg/l/天。当然本发明的其他产物也可以通过这些方法生产。本文显示每天一次培养基全部体积的更换可以达到至少30×106活细胞/ml，其中抗体产量大于500mg/l/天(多至750mg/l/天)(图5)。每天一次培养基全部体积的更换相应于每天3体积的持续灌流速率，意味着持续灌流系统可以收获大约至少150-200mg/l/天。降低此灌流速率并由此增加抗体产量(通过降低接纳抗体分泌的容量)的一种方法是补充含有必要成分的新鲜培养基(称为补料灌流(fed-perfusion))。这些用于产生抗体的E1永生化的细胞(如PER.C6细胞)克隆的成分在本文中被鉴别(见实 施例2)，因此本发明的另一方面是提供这样一种补料灌流系统，其中利用了所述本发明的补料策略。补料灌流方法常见缺点是有毒代谢物副产物(如乳酸盐和氨)的积聚，其可导致低细胞存活力和产物产量。通常在高细胞浓度需要高灌流速率以清除这些副产物。本发明的E1永生化的细胞(如PER.C6细胞)克隆的一个已证明的优点是它们可以利用乳酸盐和氨，从而乳酸盐和氨的浓度不再成为问题(见图3A)。因而可以通过每天一次或两次更换培养基获得至少为500mg/l/天的抗体产量。或者可以通过使用例如每天1体积的持续灌流速率同时补充含有补料浓缩物的培养基(补料灌流)来达到此结果。这可以有益地结合细胞溢流(cell bleed)(清除所述细胞群的特定百分比)共同使用。 
具有高细胞密度的培养物对于获得高产物产量是有益的。因而本发明的另一方面提供了一种衍生自通过腺病毒E1序列永生化的细胞的细胞培养物，所述培养物包括至少10×106细胞/ml。培养物中的存活率至少是80％。优选地，所述存活率至少是90％，更优选地至少是95％。本发明的培养物优选地是悬浮培养物，意味着所述培养物中的细胞在培养基中呈悬浮状态，如在摇瓶中、滚瓶中、生物反应器包括搅拌釜反应器、气升式反应器及诸如此类中。本文公开的策略还可用于在中空纤维反应器中的细胞培养物，如Tanase等人(1997)所描述的；还可用于贴壁培养，如微载体上的细胞。在一个实施方案中，所述培养物包含至少12×106细胞/ml。本文公开了通过直接分批培养可获得多至14×106细胞/ml。 
还进一步证明了使用培养基灌流可以获得甚至更高的细胞密度，可多至50×106细胞/ml。目前本领域未提供任何提示显示可以获得如此预料之外的高细胞密度。因此在其他优选的实施方案中，本发明提供了一种衍生自E1永生化的细胞(优选地衍生自视网膜细胞)的细胞培养物，所述培养物包含至少15×106细胞/ml，优选地至少20×106细胞/ml，更优选地至少25×106细胞/ml。在特别的实施方案中，所述培 养物包含至少30×106细胞/ml，或者甚至至少40×106细胞/ml。本发明的具有至少15×106细胞/ml的培养物显示可以通过灌流方法获得，意味着此培养基在培养过程中被更换。本发明的培养物存活率至少是80％，优选地至少是85％，更优选地至少是90％，更优选地至少是95％。所述培养物是悬浮培养物。所述培养物进一步包括生长培养基。所述生长培养基优选地无血清。所述培养物中的细胞可以包含处于可表达形式的编码免疫球蛋白的核酸分子或其一部分或衍生物。这些细胞能够以高产量产生免疫球蛋白。特别地，本文显示本发明的细胞培养物，其中所述培养基每天更换并且其中存在多于30×106细胞/ml，可以提供至少500mg/l/天的重组抗体产量。所述培养物中的细胞优选地产生至少10pg蛋白质/细胞/天。 
本发明的方法，特别是用于生产重组蛋白质的方法，还可以结合本领域已描述的在一些情况下可以改良产物产量的其他措施共同使用产量。因此，在本发明特定的实施方案中，在生产阶段之前或之中可以对所述培养基进行温度改变，所述温度改变例如通过在生产阶段在较低温度(例如30℃和35℃之间)进行所述过程(参见例如美国专利6,506,598及其引用的文献，其描述了降低所述细胞培养物温度对几个用于生产重组蛋白质的参数的影响)，或通过在所述细胞被传代培养时或在培养过程中的晚一些时候向培养物中加入冷的培养基(其中“冷”是指低于细胞培养物的温度，优选地所述冷培养基温度在2℃和8℃之间)进行。在其他的实施方案中，可以加入特异的生长因子以改良本发明的关于产物产量的方法。在另一些关于生产蛋白质的实施方案中，本发明的方法可以通过在整个培养阶段期间或仅在生产阶段加入链烷酸或它们的盐(如丁酸钠)来改良(参见例如美国专利6,413,746及其引用的文献，其描述了加入丁酸盐对在细胞培养物中的蛋白质生产的影响)。在一些关于生产蛋白质的实施方案中，对所述培养基进行温度或pH改变(Weidemann et al.，1994；Sauer et al.， 2000)。 
本领域技术人员应当清楚本发明的一些方面和/或实施方案可以结合起来以提供用于培养细胞的方法，其可以产生特别好的产物产量。作为非限制性的实例，可以例如以0.8×106细胞/ml至2.0×106细胞/ml接种E1永生化的细胞的培养物，并在培养过程中使用补料策略和/或更换生长培养基以改良最终产物产量。 
下面将结合一些实施例说明本发明，但这不是为了限制本发明的范围。 
实验简述 
用于对细胞和/或细胞系进行基因工程操作以表达感兴趣的蛋白质的方法和载体是本领域技术人员所共知的；例如，各种技术在Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel et al.，eds.(Wiley &Sons，New York，1988，及每季更新)和Sambrook et al.，MolecularCloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Laboratory Press，1989)中都有阐述。一般的及标准的细胞培养技术是本领域技术人员所共知的，例如R.I.Freshney，Culture of animal cells：A manual of basictechnique，Fourth edition(Wiley-Liss Inc.，2000，ISSN 0-471-34889-9)中所描述的。本文依照这些标准技术，除非另外说明。 
细胞培养方案
在实施例中进行PER.C6细胞培养。细胞从含有10％FBS(Invitrogen)的DMEM中的贴壁培养通过直接转移移入无血清的培养基并适应生长。简短而言，亚汇合的、对数期的细胞被胰蛋白酶消化，用无血清的培养基漂洗一次并直接接种于具有0.2μ滤器的250ml锥形瓶(Corning)，瓶中含有25ml ExCell-525无血清培养基(JRHBiosciences)，起始细胞浓度0.3-0.5×106ml-1，除非另外说明。培养物 通过在锥形瓶中每2-3天传代一次维持在对数生长。锥形瓶在潮湿温箱中处于37℃及5％CO2环境下的磁力摇动平台(Infors)上以100rpm摇动。培养物通过在1000rpm离心5分钟传代。清除上清液并在剩下的培养基中重悬沉淀。加入新鲜的冷培养基(4℃)并以适当的细胞浓度接种于新的锥形瓶中。在转移至无血清培养基后，培养物传代2-4周以达到完全适应，之后建立一个无血清细胞库。全部实验都始自取自这个细胞库的细胞。 
生物反应器
生物反应器培养在具有2L工作容积的3L反应器(Applikon)中进行。温度通过一个加热毯维持在37℃。通过调节经过顶部空间的入口气体组成和经过一个微孔喷射器的间歇喷射将溶解氧(dO2)浓度控制在空气饱和的50％。起始培养物pH通过经所述微孔喷射器加入CO2而控制在7.3。培养物pH低限设置在6.7，从而所述培养物pH可以向下移动(未达到低限)。培养物用两个螺旋桨在75rpm搅动。过程中的数据通过BioExpert软件(Applicon)获得。 
分析方案
细胞计数和存活力测量用CASY自动细胞计数器(Sch
Figure 2008100838691_1
rfeSystems)进行。葡萄糖、乳酸盐、氨和磷酸盐浓度用没有细胞的培养物上清液通过Ektachem II分析仪(Kodak)确定。氨基酸浓度用如vanWandelen和Cohen(1997)所描述的改良的AccuTag HPLC方法(Waters)确定。经过离心的培养物上清液等份(200μl)在1ml冷冻管(Nalgene)中储存于-20℃直至需要。得自每一个实验的样品同时进行分析以避免实验偏差。重量摩尔渗透压浓度(osmolality)通过冰点降低渗透压计(freezing point depression osmometer)(Osmomat 030-d，Gonotec)测量。抗体浓度通过夹心型(sandwich-type)ELISA确定。简短而言，平板用 2μg ml-1针对κ轻链的鼠抗人IgG(Pharmingen)包被并在4℃温育过夜。针对重链的HRP缀合鼠抗人IgG(Pharmingen；1∶500)被用作检测抗体(37℃，1hr)，OPD(Sigma)作为底物。温育步骤之间的漂洗用含有0.05％Tween20的PBS进行。样品稀释于补充了0.1％BSA的漂洗缓冲液中。相对于使用10至400ng ml-1校准范围的IgG1的参考标准进行量化。通过A蛋白(protein A)纯化的抗体样品被应用于通过等电聚焦(isoelectric focusing，IEF)和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行的定性分析。为进行多糖分析，用PNGase F处理20mM磷酸钠(pH7.2)中的IgG样品以清除N联聚糖(N-linked glycan)，并在AppliedBiosystems Voyager DE Pro质谱仪上用处于反射体模式(reflectormode)的MALDI-MS分析。基质是50/50/0.1的乙腈/水/三氟乙酸中的2，5-二羟基苯甲酸(10mg ml-1)。谱在正离子模式下获得，多糖以钠加合物([M+Na]+)形式被检测到。 
细胞比代谢速率的计算
在分批培养和补料分批培养中，细胞利用和产生代谢物的比速率用细胞浓度的对数平均值计算，如下列方程所示： 
qs＝(C2-C1)/(t2-t1)x[(X2-X1)/ln(X2-X1)] 
在此方程中，C是代谢物浓度(微摩尔/l)，t是时间(天)，X是活细胞浓度。谷氨酰胺的自发分解速率常数没有包括在其中，因为分解在计算速率的时间点并不显著(数据未列出)。每葡萄糖产生的乳酸盐的产量系数(Ylac/glc)、每谷氨酰胺产生的氨的产量系数(Yamm/gln)和每谷氨酰胺产生的丙氨酸的产量系数(Yala/gln)由下列方程计算并表示为摩尔/摩尔： 
Ylac/glc＝qlac/qglc
Yamm/gln＝qamm/qgln
Yala/gln＝qala/qgln
实施例 
实施例1：在PER.C6细胞的分批培养中增加最大终细胞产量
最简单的生产方法是分批培养。然而，这在活细胞浓度及由此引起的可获得的产物产量方面受到限制，很大程度上是因为营养限制。下面提供了一个方法以增加PER.C6细胞或衍生自PER.C6的亚克隆的分批培养中的最大终细胞浓度，其通过计算在不同细胞浓度下细胞利用关键养料的比速率并在针对细胞生长来说具有对养料的最佳利用率的细胞浓度时开始进行分批培养而完成。 
编码识别上皮细胞粘附分子(EpCAM)的抗体的抗原结合区域的DNA首先分离自scFv噬菌体展示文库(Huls et al.，1999)。编码识别CD46的抗体的抗原结合区域的DNA如WO 02/018948中所描述的分离。基本如Boel et al.，2000所描述加入IgG1类型的前导序列和恒定区。接下来编码轻链和重链的DNA被克隆进表达载体pcDNA3002(Neo)。表达载体pcDNA3002(Neo)于2001年12月13日被保藏于欧洲动物细胞保藏中心(European Collection of Cell Cultures，ECACC)，保藏号为01121318，其已被描述于国际专利公开PCT/NL02/00841。将所得到的分别编码识别EpCAM或CD46的IgG1并由CMV启动子调节的表达载体根据标准方法引入PER.C6细胞。 
衍生自PER.C6细胞系的亲代群的重组抗体表达克隆被用于这些实验。表达抗EpCAM的克隆在本文中进一步称为克隆1，表达抗CD46的克隆在本文中进一步称为克隆2。 
细胞维持在ExCellTM 525培养基(JRH Biosciences)中(也可维持在GTM-3培养基(Sigma)中)，分批生产在ExCellTM VPRO培养基(JRHBiosciences，Cat.No.14560)中实现。对于分批生产，细胞直接从ExCellTM 525转移到ExCellTM VPRO。 
图1显示起始于1×106细胞/ml的培养物的最大终活细胞浓度在6 天后几乎达到14×106细胞/ml(大约比CHO和Sp2/0的分批培养高3倍)，相比之下起始于0.3×106细胞/ml的培养物，最大终活细胞浓度在9天后达到10×106细胞/ml。两种培养物的终抗体滴度几乎没有差别，然而在起始于1×106细胞/ml的培养物中，6天后就达到了大约600mg/L，相应的起始于0.3×106细胞/ml的培养物中需要9天。 
相对于起始于0.3×106细胞/ml的培养物，在起始于1×106细胞/ml的培养物中观察到的较高细胞浓度是由于在较高细胞浓度，养料利用的细胞比速率较低。杂交瘤细胞的呼吸速率已经显示随着细胞密度增加而降低(Wohlpart et al.，1990)。相似地，利用一种养料的细胞比速率也已经显示随着细胞密度增加而降低(Portner et al.，1994；Yallop和Svendsen，2001)。我们现在以一种新颖的并且具有创造性的方式利用这些信息以建立一种用于在培养物中增加可获得的细胞密度的构思。 
通过计算细胞在分批培养中每天利用关键养料的比速率并将这些数值相对细胞浓度作图，可获得的关于谷氨酰胺的曲线图显示于图2。图2显示了谷氨酰胺利用的细胞比速率(qGln)和细胞浓度之间的关系。从这个曲线图中，可以基于可用养料的最适应用选择最适起始细胞浓度。例如起始于0.3×106细胞/ml的培养物在24小时内可达到大约0.5×106细胞/ml(此克隆的平均群体倍增时间(pdt)是32小时)。在0.5×106细胞/ml的qGln值是大约2.5微摩尔106/细胞/24小时，因此在此24小时中消耗的谷氨酰胺总量大约是1.25微摩尔ml-1(0.5×2.5)。然而，起始于1×106细胞/ml的培养物在24小时内可达到大约1.5×106 细胞/ml。在此细胞浓度的qGln值是大约0.75微摩尔106/细胞/24小时。因此消耗的谷氨酰胺总量大约是1.125微摩尔ml-1。因此所述两种培养物在最初24小时中利用大约相同量的谷氨酰胺。 
因此本发明的另一个目的是提供一种培养细胞的方法，包括在特异养料利用水平接近最低平台水平的细胞浓度起始细胞培养。这相当于对E1永生化的视网膜细胞，特别是PER.C6衍生细胞来说大约是 0.8-2.0×106细胞/ml，优选地0.9-1.5×106细胞/ml。因此在0.8-2.0×106 细胞/ml，优选地0.9-1.5×106细胞/ml，更优选地0.95-1.25×106细胞/ml的接种浓度进行细胞传代培养是本发明的一个实施方案。 
本发明这一方面的优点是在这个较高接种浓度可获得的活细胞数较高，并且在此过程中可以更快达到较高细胞数。因此本发明的这一方面对于分批培养非常有用，但是其还可以有益地用于补料分批培养或(补料)灌流培养，例如本发明的那些。 
实施例2：用于改善PER.C6衍生亚克隆中的抗体产量的补料策略
补料分批培养目的是通过增加活细胞浓度来增加产物产量或通过加入养料浓缩物以补充被消耗的来延长生产期。这里我们介绍一种用于改善PER.C6衍生亚克隆中的抗体产量的补料策略。所述补料策略可以与更高的起始细胞密度合并使用以在养料补料开始获得更高的终细胞密度和更短的生产全程。 
由葡萄糖、磷酸盐、谷氨酰胺和15种其他氨基酸组成的基本养料补料浓缩物基于六个一式二份的克隆1在摇瓶中的分批培养物的养料利用分布图制备(见例如图3)。还观察到了克隆2的相似的利用分布图，因此预期用于克隆1的下述补料策略同样可以改良得自其他克隆的产量，因此提供了用于E1永生化的细胞(优选地是视网膜细胞、优选地衍生自PER.C6细胞的细胞)的补料分批培养或补料灌流培养的更一般化的策略。所述浓缩物列于表1。任选地，钙和三种重组生长因子：LongR3IGF-1、Long EGF和胰岛素也被加入到补料中。在这点上，加入钙和所述生长因子并未显著影响所获得的结果。甘氨酸似乎对于补料不是必需的，所以在后面的实验中没有继续加入。胰岛素购自Sigma，LongR3IGF-1和Long EGF购自GroPep。全部氨基酸购自Sigma。加入补料浓缩物的时间和频率是可变的。第一批补料的时间测试于养料彻底耗尽之前0、1和2天。葡萄糖和磷酸盐用作 补料起始的指示。基于预期的活细胞浓度，每两天进行一次大丸添加。通常进行6次补料。如表1所列的被加入的成分的浓度不考虑在加入前消耗的培养基中剩下的成分(即向培养基中补料后，一种成分的浓度会高于表中所列的，因为在补料之前培养基中仍然含有一些这种成分，即本发明的补料是在所述成分被细胞彻底用尽前进行)。 
图4显示了将浓缩混和物加入到PER.C6一个表达重组抗体的亚克隆(克隆1)中的作用效果。在第3天开始补料(养料彻底耗尽前2天并此后继续每两天进行一次补料)使终抗体产量为大约800mg/L，大约增加到分批培养的1.6倍，分批培养产量是500mg/L。在第5天开始补料并此后继续每两天进行一次补料使终抗体产量产生近似的增加。 
分批培养中(实施例1)重量摩尔渗透压浓度从280mOsm/Kg降至240mOsm/Kg，但是在补料培养中，其是上升的，最终升至300-310mOsm/Kg。 
实施例3：实现活细胞数高于30×106细胞/ml及抗体产量高于500mg/L/天 
补料分批方法可能导致有毒代谢物如乳酸盐和氨的积聚和培养基摩尔渗透压浓度(osmolarity)上升，这最终会限制活细胞浓度和过程的时长，从而影响产物产量。补料分批方法一种可能的替代方法是灌流方法，高浓度的细胞浓度可以通过持续培养基更换和细胞溢流(移除一定百分比的细胞)维持。用这样一种方法一个可能的缺点是由于所需要的较大的培养基体积而导致的相对较低的产物浓度、经常遇到的相对较低的细胞存活力和操作这样一个系统相对较高的复杂性。因此仅在可以维持非常高的活细胞浓度和/或比生产力的情况下采用灌流方法才是有益的。 
这里我们介绍在每天更换1培养基体积的情况下在摇瓶培养中 获得高于30×106细胞/ml的活细胞浓度和高于600mg/L/24小时的抗体产量。将在摇瓶中的ExCellTM 525培养的生产抗体的PER.C6细胞的对数培养物转移进含有ExCellTM VPRO的摇瓶中，起始细胞数1×106细胞/ml(其他起始细胞浓度得到相似结果)。在第3-5天开始通过离心进行培养基更换(每天1体积)。不进行细胞溢流。每天取用于代谢物分析、抗体量化和细胞计数的样品并储存于-20℃。 
图5显示对于两个独立的抗体生产细胞克隆，多至50×106细胞/ml的活细胞数和500-750mg/L/24小时的抗体产量可以在没有细胞溢流的情况下维持至少5天。细胞存活率大约是80％-90％。这些高细胞密度大约比通常情况下用其他细胞系如CHO和Sp2/0可获得的高3倍，因此通过腺病毒E1序列永生化的视网膜细胞如PER.C6细胞非常适于灌流方法。细胞溢流可以改良此过程时长，因此最优化的系统可以包括一或多个细胞溢流步骤。 
多至50×106细胞/ml及大约为80％-90％的细胞存活率可以在每两天一次彻底更换培养基的情况下维持至少5天。使用此策略，很多养料在第二天耗尽，因此培养基优选地每天更换。在灌流方法中，这可以改为大约每天更换1-3体积。这接近标准灌流系统的典型范围，即培养基每天更换0.5-2体积。对于本发明的细胞稍高一点的更换体积数值是由于在灌流系统中本发明细胞的非常高的细胞浓度。当优选本发明的细胞浓度为大于30×106细胞/ml时，所述培养基更换应至少为每天0.5培养物体积，优选地至少每天1培养物体积。未能补充足够浓度的养料(这里是通过培养基)会导致细胞死亡。每天一次培养基更换会产生更高的活细胞密度(每天更换培养基可多至50×106细胞/ml，相比之下未每天更换培养基这一密度为10×106细胞/ml，参见图1和4)。进一步地，进行每天一次培养基更换，细胞可以在一天中产生与分批培养方法中8-13天产生的近似的产物产量。 
实施例4：用于在PER.C6衍生的亚克隆中进一步改良抗体产量的补料策略
平衡的养料补料还可以包括其他组分如维生素、微量元素和脂。ExCell VPRO维生素、无机盐、微量元素、生长因子、脂和植物水解产物的浓缩物(10x或50x都可以)得自JRH Biosciences并与实施例2中描述的基本补料浓缩物(不含钙和生长因子)一起加入。加入所述ExCell VPRO浓缩物以使终浓度为0.25x。 
图6显示此修改过的补料对在摇瓶中的克隆1的生长(图6A)和抗体产量(图6B)方面产生的结果，对照为分批培养。结果通过在第3天(养料耗尽前48小时)开始补料获得。在第5天(养料耗尽当天)开始补料可以产生相似结果。活细胞数比分批培养对照维持了显著更长的时间，抗体产量从分批培养对照的0.5g/L增加到了补料分批培养的1.0g/L，增长到2倍。 
这些补料实验的已用的培养基分析鉴别出了细胞对一些氨基酸的利用的比速率方面的变化，其似乎是由于加入了VPRO浓缩物所致。因此列于实施例2的氨基酸浓缩物经过了修改，显示于表2。补料起始于养料耗尽前48小时，每两天进行一次补料，通常进行6次。同样地，表中所介绍的加入的成分的浓度不考虑在补料之前已用的培养基中残留的成分。 
对于第一次补料，谷氨酰胺和丝氨酸增加的浓度被用于与后续补料对比(见表2)。磷酸盐和葡萄糖被用作标记物以确定补料的开始。本实验中应用了克隆1和克隆2。 
实验在摇瓶和生物反应器中进行。摇瓶实验如所描述的进行。生物反应器实验通过在一个3L的生物反应器(Applikon，2L工作容积)中接种生长在摇瓶中的对数预培养的细胞起始。所述预培养和生物反应器实验在ExCell VPRO(JRH Biosciences)中进行。用于接种到生物反应器的分裂比至少是1∶6，接种的细胞浓度大约是0.3×106细胞/ml。 
结果 
图7显示了修改过的补料对在生物反应器中的克隆1产生的结果，对照为分批培养。最高活细胞数可达10-12×106细胞/ml，并且活细胞数可维持在8-10×106细胞/ml之间直至在第19天结束培养(图7A)。抗体产量从分批培养对照的0.4g/L增加到了补料分批培养的1.3g/L，增长到3倍(图7B)。 
在这些补料培养中，重量摩尔渗透压浓度和氨可分别达到430mOsm/Kg和16毫摩尔/L，这是已经报道过的对培养表现和产物质量有负影响的水平。因此观察到的在接近此过程终点时活细胞数的降低至少是由于这些因素而部分导致的。 
图8显示了此补料策略对在2L生物反应器中的克隆2产生的结果。最高活细胞数可达10-11×106细胞/ml，并且活细胞数可维持在7-9×106细胞/ml之间直至在第19天结束培养。抗体产量从0.5g/L增加到1.5g/L，增长到3倍。 
第3个克隆表达另一个不相关的抗体，此克隆通过同样的补料策略被用于同样的分批培养过程和补料分批培养过程。图10显示此补料策略对在摇瓶中的克隆3产生的结果。最高活细胞数可达14×106 细胞/ml，并且活细胞数可维持在10-12×106细胞/ml直至在第17天结束培养。抗体产量从0.7g/L增加到2.1g/L，增长到3倍。 
因此所述补料策略改良了对于每一个表达不同抗体的不同克隆的产量，提示本发明的方法是可一般应用的。 
因此本发明的一个方面是提供一种方法，其包含本发明的补料策略，其中生产的蛋白质的产量至少增加到在分批培养中的产量的1.5x，优选地至少2x，更优选地至少2.5x，还是更优选地至少3x。 
本发明所用细胞的比生产力(qAb)大约在12-18pg抗体/细胞/天之间。在一些实例中所述qAb大约是10pg抗体/细胞/天，在另一些实例 中用本发明的细胞和方法此数值可观察到高达大约25pg抗体/细胞/天。在分批培养中这会在达到最高细胞数之前就显著下降，同时发生养料耗尽(在大约7天后)；但是在补料分批培养中这个比生产力可保持在这个水平直到最后一次补料后的2-3天，即本发明的过程的大约第16-18天。 
产物质量 
在前面所描述的实验中，产物质量通过各种方法检测，包括等电聚焦、SDS-PAGE、MALDI-TOF质谱和HPAEC-PAD。不管应用哪种方法，在所有的情况下所述生产出的抗体基本上显示人类型的糖基化并且所述生产出的抗体的结构完整性非常的好。并且所得到的结果与Jones et al，2003报道的非常相似，但所报道的细胞数和产物产量都较低。因此，通过本发明的方法可获得的增加的产量并不是以产物质量显著下降为代价获得的。 
A蛋白纯化的由分批培养和补料分批培养生产的IgG通过MALDI-MS分析。来自分批培养的PER.C6细胞产生的物质显示与从人血清纯化的IgG显示的相似的半乳糖基化分布，并且在产自分批培养或补料分批培养的物质中没有鉴别出杂交或高甘露糖结构。在检测的全部分批培养物中终止于0、1或2个半乳糖残基(G0∶G1∶G2)的聚糖的平均百分比分别为29、54和17％。这通常主要为G0形式的CHO和杂交瘤生产的抗体。例如Hills et al(1999)报道了在NS0和CHO细胞中产生的抗体的半乳糖基化分布(G0∶G1∶G2)。 
补料分批培养过程中产生的抗体相比于分批培养显示了半乳糖基化水平的下降(图9)。G0糖基化形式的百分比从29％上升到49％，G1和G2糖基化形式分别从54％下降到17％和从42％下降到9％。半乳糖基化的下降很可能是由于在补料分批培养结束时的氨的高浓度(可达16mM)所致。然而，PER.C6细胞通过补料分批培养过程产生 的抗体的半乳糖基化水平还是高于得自例如CHO的分批产生的抗体中所典型见到的(Hills et al(1999))。等电聚焦(IEF)和SDS-PAGE揭示了通过分批培养或补料分批培养产生的物质之间没有显著差别(数据未列出)，并且在全部情况下，聚集(aggregation)低于3％。 
尽管有相对较低的Yamm/gln值，但是高活细胞浓度导致补料中的谷氨酰胺供给，从而氨累积可达16毫摩尔/L。尽管这不会导致活细胞浓度的下降，但是NH4Cl存在下起始的分批培养显示浓度大于9毫摩尔/L就会负面影响生长速率和最高细胞浓度。进一步地，糖基化也会在一定程度上被影响(见图9)。因此降低氨的积累可能是有益的，例如根据下面所描述的一种方法。 
前面所描述的方法的两个值得注意的方面是高水平的氨和重量摩尔渗透压浓度。导致重量摩尔渗透压浓度上升的一个重要因素来自VPRO(培养基)浓缩物。因此一种降低此重量摩尔渗透压浓度的方法是鉴别培养基成分组(维生素、微量元素、无机盐、生长因子等)中的哪一个对于培养表现是重要的并清除那些不重要的。这将不仅通过降低所述补料的重量摩尔渗透压浓度，而且还通过清除任何潜在的有害成分并通过使加入最重要的成分最优化而有益于所述过程。这还将降低补料的成本。氨积累的降低可通过更严格的控制谷氨酰胺的加入达到。这可基于计算如上所述的比消耗率和细胞数而完成。这可以通过持续地以适当的速率(相配于活细胞浓度和细胞利用的比速率)泵入谷氨酰胺实现，从而培养基中的残余谷氨酰胺浓度维持在一个稳定的低水平，如在0.2和1.5mM之间，优选地在0.5和1.0mM之间。可用于本发明的细胞的另一种方法是当氨浓度达到一定点时从补料中清除谷氨酰胺，例如在第一次补料后的后续一次或多次补料中，从而所述细胞被强制转换为利用氨和谷氨酸的谷氨酰胺合成及谷氨酰胺合成酶途径。此方法不是对细胞类型如BHK和CHO都普遍可行的，因为谷氨酰胺耗尽通常会导致迅速而且广泛的细胞死亡，并且转移至 无谷氨酰胺的条件通常需要一段时间的适应。然而，在本发明的细胞的分批培养中，在谷氨酰胺耗尽后活细胞浓度持续上升两天，并且培养物存活力不被显著影响，这提示了可能有通过谷氨酰胺合成酶途径的足够流量，至少可以维持培养。 
最优化补料分批培养的已用培养基分析(图7和8中的实施例)显示在此过程中只有胱氨酸被耗尽。因此本发明的对氨基酸补料的进一步修改是增加胱氨酸浓度，例如对每10×106细胞/ml增至0.3-0.35毫摩尔/L或甚至多至0.6毫摩尔/L。 
实施例5：改良的(补料)分批培养方法
为补料分批培养方法开发的补料浓缩物也可用于补充用于改良的分批培养方法的培养基中。其他人已经证明用含有来自补料分批培养方法的补料添加物的至少一种补充培养基可以改良分批产量。一种用补料浓缩物补充培养基的近似方法也可用来降低在补料分批培养方法中补料添加的次数，从而简化过程，这也已被其他人所证明。 
本发明公开了用于通过腺病毒E1序列永生化的细胞如PER.C6细胞的补料策略。本文显示了在补料分批培养方法中哪些成分成为限制性的，并且本文公开了可被加入以改良补料分批培养方法中的产量的成分之间的量和比例。此信息用在本实施例中以提供改良的分批培养方法。设想这样的培养物含有大约10×106细胞/ml，这大约是在本发明的分批培养和补料分批培养中观察到的细胞数。在补料分批培养实验中，进行6次补料，其中成分的浓度如在表1或2中所示。加入总补料(即全部6次补料总计)的10％-60％，优选地总补料的20％-40％，可产生改良的分批培养方法，因为养料以后会在培养过程中耗尽，因此由于相比于前面公开的直接分批培养方法延长的生产力，产量会上升；在直接分批培养方法中没有任何成分加入到培养基中。所述成分可以在培养基中的养料耗尽之前的任何阶段被直接加入到培养基 中，但是优选地在培养开始之前加入，从而在所述过程(改良的分批培养方法)中不需要进行任何其他的添加，这可以使过程非常简单。当然，这可以与以后在所述过程(补料分批培养方法)中另外加入特定成分联合使用，这样可以进行较少次数的添加以使所述过程比在前面公开的补料分批培养方法更简单，从而提供一种更简单的补料分批培养方法。因此本发明的另一个实施方案提供了一种用于在通过腺病毒E1序列永生化的细胞中生产一种产品的方法，其中所述细胞被培养于一种培养基中，其特征是下列成分以下列量加入到培养基中：葡萄糖(3.6-21.6毫摩尔/l，优选地7.2-14.4毫摩尔/l)，谷氨酰胺(6.8-40.9毫摩尔/l，优选地13.6-27.2毫摩尔/l)，亮氨酸(0.40-2.4毫摩尔/l，优选地0.79-1.6毫摩尔/l)，丝氨酸(2.31-13.9毫摩尔/l，优选地4.62-9.24毫摩尔/l)，异亮氨酸(0.3-1.8毫摩尔/l，优选地0.6-1.2毫摩尔/l)，精氨酸(0.28-1.66毫摩尔/l，优选地0.55-1.10毫摩尔/l)，甲硫氨酸(0.14-0.83毫摩尔/l，优选地0.28-0.55毫摩尔/l)，胱氨酸(0.15-0.9毫摩尔/l，优选地0.3-0.6毫摩尔/l)，缬氨酸(0.27-1.62毫摩尔/l，优选地0.54-1.08毫摩尔/l)，赖氨酸(0.26-1.58毫摩尔/l，优选地0.53-1.06毫摩尔/l)，苏氨酸(0.18-1.08毫摩尔/l，优选地0.36-0.72毫摩尔/l)，天冬酰胺(0.06-0.36毫摩尔/l，优选地0.12-0.24毫摩尔/l)，酪氨酸(0.078-0.47毫摩尔/l，优选地0.16-0.31毫摩尔/l)，组氨酸(0.06-0.36毫摩尔/l，优选地0.12-0.24毫摩尔/l)，苯丙氨酸(0.012-0.072毫摩尔/l，优选地0.024-0.048毫摩尔/l)，色氨酸(0.036-0.22毫摩尔/l，优选地0.072-0.14毫摩尔/l)和磷酸盐(0.45-2.7毫摩尔/l，优选地0.9-1.8毫摩尔/l)。括号内的数量是表2中补料数量的6x的10％-60％，优选地20％-40％。优选地，培养基浓缩物(可用10x、50x、或其他合适浓度)也被加入到终浓度为0.15x-0.9x之间，优选地0.3x-0.6x之间。优选地这些实施方案中的培养基是ExCell VPRO培养基。0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5或4个单一补料(一个单一补料是如表1或2中公开的量)被加入 到培养基中，用于在大约10×106细胞/ml培养细胞和根据本发明生产产物(例如抗体)的简单分批培养方法用如此加强的培养基进行，以确定加入成分的最适量。当本发明的补料分批培养方法的全部补料的大约20％-40％(即1-2.5个单一补料之间的某个量)在培养之前被提供给培养基时可以期望产生最高产物产量的改良的分批培养方法。当然，一旦加入成分的有益范围被通过这些实验确定，所述量的更加准确的微调便成为可能。当然，当细胞数不同时成分的加入可以再次被调整。例如，如果所述细胞在仅仅5×106细胞/ml的密度培养，则要求仅仅加入上述量的一半，这对于本领域技术人员是很清楚的。 
                           表1 
  成分   终浓度(补料之后)(每10×106细胞/ml)(毫摩尔/L)
  葡萄糖   6.00
  谷氨酰胺   1.75
  亮氨酸   0.60
  丝氨酸   0.55
  异亮氨酸   0.45
  精氨酸   0.42
  甲硫氨酸   0.23
  胱氨酸   0.14
  缬氨酸   0.45
  赖氨酸   0.40
  苏氨酸   0.33
  甘氨酸   0.33
  天冬酰胺   0.15
  酪氨酸   0.14
  组氨酸   0.11
[0109] 
  苯丙氨酸   0.10
  色氨酸   0.02
  磷酸盐   0.70
  钙   0.02*
  LongR3IGF-1   50μg/L*
  Long EGF   50μg/L*
  胰岛素   20μg/L*
*任选地存在 
                                   表2 
  成分   终浓度(补料之后)(每  10×106细胞/ml)(毫摩尔/L)   终浓度(补料之后)(每  10×106细胞/ml)(毫摩尔/L)
  第一次补料   后续补料  
  葡萄糖   6.00   6.00
  谷氨酰胺   2.60   1.75
  亮氨酸   0.66   0.66
  丝氨酸   1.10   0.55
  异亮氨酸   0.50   0.50
  精氨酸   0.46   0.46
  甲硫氨酸   0.23   0.23
  胱氨酸   0.25   0.23
  缬氨酸   0.45   0.45
  赖氨酸   0.44   0.44
  苏氨酸   0.30   0.30
  天冬酰胺   0.10   0.10
  酪氨酸   0.13   0.13
  组氨酸   0.10   0.10
[0113] 
  苯丙氨酸   0.02   0.02
  色氨酸   0.06   0.06
  磷酸盐   0.75   0.75
  10X VPRO  浓缩物   0.25x   0.25x
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Claims (6)

1.PER.C6细胞的无血清悬浮细胞培养物，其特征是所述培养物包含至少20×106细胞/ml，且其中所述细胞的至少80％是存活的，并且可通过包括如下步骤的方法获得：
a)在培养所述细胞的过程中至少确定一次选自如下一组的至少一种培养基成分的浓度：葡萄糖、谷氨酰胺、磷酸盐、亮氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苏氨酸和甘氨酸，
b)在培养所述细胞的过程中，在至少一种其浓度在步骤a)中被确定的成分耗尽时或耗尽之前向培养基中加入成分，其中所加入的成分至少包括葡萄糖、谷氨酰胺、磷酸盐、亮氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸和胱氨酸，
其中在步骤b)中所述成分被加至终浓度为：以每10×106个细胞/ml中新鲜加入的成分的毫摩尔/l表示，葡萄糖4.0和8.0之间、亮氨酸0.44和0.88之间、丝氨酸0.37和1.47之间、异亮氨酸0.33和0.67之间、精氨酸0.31和0.61之间、甲硫氨酸0.15和0.31之间、胱氨酸0.1和0.6之间。
2.权利要求1的细胞培养物，其特征是所述培养物包含至少30×106细胞/ml。
3.权利要求1的细胞培养物，其特征是所述培养物包含至少40×106细胞/ml。
4.权利要求1-3中任一项的细胞培养物，其中培养基以大约0.5-3培养物体积/天的速度更换。
5.权利要求1-4中任一项的细胞培养物，其中所述培养物中的细胞表达重组蛋白质。
6.权利要求5的细胞培养物，其中所述细胞产生至少10pg蛋白质/细胞/天。
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