CN101360997B - 改性心磷脂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了用于检测抗类脂抗体和诊断疾病例如梅毒的组合物、方法和装置。尤其是描述了氧化心磷脂，其可以与各种各样的连接分子如BSA、KLH、生物素、合成蛋白质MAPS、IgY、链霉亲和素或亲和素偶联。这种氧化心磷脂，单独或与一种或多种连接分子复合，在例如，用于侧流装置时，可用来检测对象的抗类脂抗体。还描述了可以检测抗类脂抗体和可以共同检测生物样品中的非密螺旋体和密螺旋体抗体的侧流装置。

Description

改性心磷脂及其应用
相关申请的交互参考
本申请要求2005年11月18日提交的美国临时申请No.60/737,901的利益，其以全文引入本文作为参考。
政府支持的确认
本发明由美国政府机构，国立HIV、STD和TB预防中心(National Center for HIV，STD，and TB Prevention)，AIDS、STD和TB实验室研究处(Division of AIDS，STD，and TB LaboratoryResearch)，实验室资料研究部门(Laboratory Reference and ResearchBranch)的疾病控制预防中心(Centers for Disease Control andPrevention)完成。
发明领域
本公开内容涉及改性心磷脂组合物及其用途；尤其涉及将改性心磷脂固定至固体支持物上的方法，以及相关的免疫分析(如ELISA)和免疫分析装置(如测试条，流通装置或侧流装置)，所述分析和装置可以用于，例如，抗类脂抗体的检测和/或疾病(如梅毒)的诊断。
背景技术
梅毒是由螺旋体细菌梅毒密螺旋体(Treponema pallidum)引起的性传播疾病(STD)。据报道，全世界每年有超过100,000例的成人梅毒。此外，该疾病每年还先天性传播并感染3000名以上的婴儿。梅毒感染的过程跨越许多年，并可能导致各种各样的临床表现，其特征在于四个阶段。
梅毒感染的初始阶段发生在细菌感染后10-100天，其特征在于一个或多个下疳(直径通常小于1cm的红色无血无痛性溃疡)的出现。下疳可以出现在生殖器或身体其它部位。下疳持续3-6周，无需治疗即痊愈，留下小的瘢痕。此阶段的感染者具有传染性。
梅毒感染的第二阶段的特征在于可以覆盖部分或全部身体的皮疹样皮肤损伤。该皮肤病变通常无痛，并在初期下疳发作后1-6个月出现。所述皮肤病变可以与疣、脓疱或溃疡相似。不用治疗，其在2-12周内痊愈，不留疤。在此感染阶段中，还可能发生发热，咽喉痛，虚弱，体重减轻，淋巴结肿胀以及睫毛和/或部分眉毛脱落。此外，这些症状可以发展为脑膜血管型梅毒，其特征在于脑和脊髓的覆盖物的炎症和/或脑血管系统的变化。第二阶段的感染者也具有传染性。
该疾病的下一个阶段是潜伏梅毒或隐藏阶段。在此阶段，感染者感染者似乎已痊愈，并无症状。此阶段在约三分之二未治疗梅毒的人中持续终生。在潜伏期的第一年，可能出现第二阶段症状的复发。除了复发期间，感染者在此潜伏阶段不具有传染性；然而，在初期下疳出现的4年内，潜伏感染的母亲所生的孩子可能感染先天性梅毒。
四期或晚期梅毒是未治疗感染的终末阶段。此阶段早可能发生在感染后一年，或者之后的任何时间，最常见在10-20年内。良性梅毒，特征在于被称作梅毒瘤的病变，可以出现在骨、皮肤和内脏器官中。罕见死亡，但可以发生严重毁容和疼痛。心血管梅毒的特征在于主动脉瘤和其它心血管问题，并常导致死亡。累及神经可能发生在梅毒的早期阶段，也可能表现为晚期症状。在此晚期疾病中，神经梅毒可能无症状，或者患者可能有严重神经问题，如可能的痴呆，精神错乱，活动损害，失明，耳聋甚至死亡。
梅毒的免疫反应包括产生(i)密螺旋体抗体，这是梅毒密螺旋体抗原特异性的，和(ii)抗类脂抗体，其识别由受害宿主细胞释放的脂质物质，脂蛋白样物质及可能的由密螺旋体释放的心磷脂。梅毒筛查和诊断的主要依据是针对这两类抗体之一或两者的血清学检测。
抗类脂抗体试验(通常称作“非密螺旋体试验”)通常基于由天然存在的心磷脂、胆固醇和卵磷脂组成的抗原。被广泛应用的非密螺旋体试验(例如，性病研究实验室(VDRL)试验和快速血浆反应素(RPR)试验)或者通过显微镜(例如，VDRL试验)或者通过肉眼(例如，RPR试验)监测由抗原-抗体复合物构成的絮凝形成。非密螺旋体试验具有广泛可得、价廉和方便对大量样本执行的优点。此外，由于抗类脂抗体的滴度随着梅毒的成功治疗而降低，最后在大多数患者中消失，而密螺旋体抗体的滴度仍然保持数年甚至终身都高，因此，非密螺旋体试验被认为是监测治疗或检测再感染的更佳选择。
密螺旋体试验以来自梅毒密螺旋体的抗原为基础，包括梅毒密螺旋体颗粒凝集(TP-PA)、荧光密螺旋体抗体吸附试验(FTA-ABS)和酶免疫分析。密螺旋体试验主要用来验证非密螺旋体试验中的反应性。密螺旋体试验还可以用来证实在非密螺旋体试验中无反应的梅毒的临床印象。密螺旋体试验的实施在技术上更难，费时且昂贵，并且由于该试验在约85％成功治疗梅毒的人中将保持数年或者终生反应性，因而不能用于监测治疗。
上述每种抗体试验均采用在临床环境中获得并送至分析实验室的血清样品进行。因此，通常在样品收集后数天得不到试验结果。由于追踪性传播疾病患者常有困难，因此需要开发出快速、护理现场(point-of-care)的试验来帮助临床医生作出判断，优选在检测的当天。
提供快速、当场结果的免疫分析装置(例如，测试条，流通装置或侧流装置)是现有的，以定性测定血清密螺旋体抗体水平(例如，DiaSys Corporation；ACON Laboratories，Inc.；Biokit，S.A.；GenixTechnology；Standard Diagnostics；Cortez Diagnostics，Inc.；和PhoenixBio-Tech Corp)。然而，类似的抗类脂抗体试验至少部分因为抗类脂抗体(例如，心磷脂)的疏水性抗原抗拒连接在免疫分析装置的一种元件——固体支持物上，因此更难以开发。
根据一些专家，为了筛查和诊断的目的，非密螺旋体试验和密螺旋体试验的组合将进一步帮助梅毒检测。这是世界卫生组织(World Health Organization)提倡的方法，密螺旋体感染(TreponemalInfections)，技术报告丛书(Technical Report Series)674，日内瓦：WHO，1982。使用方便、快速、护理现场的检验，其能同时检测非密螺旋体和密螺旋体抗体，将有助于解决这一长期存在的需求。
发明概述
开发检测非密螺旋体(或联合检测非密螺旋体和密螺旋体)的非溶液免疫分析法的努力由于将抗类脂抗体特异性识别的抗原如心磷脂连接至固体基体如硝化纤维素条上的难度而受挫。心磷脂分子的尺寸非常小，导致了该分子在基体上的定位差。心磷脂的脂肪酸侧链的非极性性质也赋予了该分子高度的疏水性，这使得难以使心磷脂结合至极性表面，如硝化纤维素上。尽管分子的大小可以通过将心磷脂与较大分子(如蛋白质)偶联来增加，但这种接合导致了心磷脂抗原性的丧失。
本公开内容提供了保留抗原对抗类脂抗体的抗原性和特异性的同时将心磷脂(或脂质抗原，包括本文所述改性心磷脂，磷脂酰胆碱(也称“卵磷脂”)和胆固醇)与固体基体(如微孔膜或多孔板)可靠连接的方法。使用本文所示方法，现在可能产生心磷脂连接分子复合物，其可以连接在多种固体支持物上。以这种方式连接免疫原性心磷脂复合物的能力使其可以用于基于非溶液的免疫分析，如ELISA，以及免疫分析装置，用于快速、当场检测非密螺旋体抗体。在某些实施方案中，所公开的免疫分析装置还加入了由梅毒密螺旋体识别的密螺旋体抗原，这样，该装置便于同时检测非密螺旋体和密螺旋体抗体。
在一个特定实施例中，心磷脂的脂肪酸侧链被氧化，以提供至少一个末端羧基，然后该末端羧基与容易连接(或已连接)至固体支持物(如侧流条的可渗透性基体或多孔板)上的多肽(如BSA)交联。
根据以下参照附图进行的对数个实施方案的详细说明，前述及其它特征和优点将变得更加明显。
附图简述
图1显示了心磷脂氧化步骤的数字图像。(A)正丁醇中的未改性心磷脂；(B)加入偏高碘酸钠和高锰酸钾后的心磷脂反应混合物；(C)加入亚硫酸氢钠后的心磷脂反应混合物；和(D)混合物(C)离心后得到的两相溶液，其中心磷脂的数种氧化形式主要发现于上层正丁醇相中。
图2显示了心磷脂制品的薄层色谱的数字图像。(A)正丁醇中的未改性心磷脂(见图1A)；(B)氧化的心磷脂制品；(D1)心磷脂氧化反应后的上层正丁醇相(见图1D)；和(D2)心磷脂氧化反应后的下层水相(见图1D)。各样品的迁移方向用箭头表示。
图3显示了含有4条十八碳双不饱和脂肪酸链的例示性心磷脂分子的示意性氧化反应。图示的心磷脂反应产物具有1条或4条氧化的脂肪酸侧链。实际上，氧化反应产物还包括氧化的心磷脂种类，其中任何两条或三条脂肪酸链被氧化成羧基。
图4显示了用于将氧化的心磷脂与含胺连接分子，如蛋白质共价结合的示意性反应。在图示的例子中，连接分子是BSA。
图5显示了用来测定氧化的心磷脂-BSA偶联物(表2中的“制品5”)抗原性的斑点印迹分析的数字图像。
图6显示了可以使用本公开方法的侧流装置的5种不同形式实施方案的数字图像。(A)、(B)和(E)中所示的装置实施方案装配得使其各自可以浸入或部分浸没在样品或含有样品的溶液中。(C)和(D)中所示的装置实施方案装配成接纳一定体积的滴入进样口的样品(或含有样品的溶液)。
图7是侧流装置的一种形式实施方案的透视图，其中去掉了部分外壳，以显示该装置的基本组件及其相互关系。
图8显示了氧化的心磷脂-卵磷脂混合物的薄层色谱的数字图像。(A)未改性心磷脂和未改性卵磷脂在正丁醇中的混合物；(B)氧化的心磷脂/卵磷脂混合物；(C)心磷脂/卵磷脂混合物氧化过后的上层正丁醇相；和(D)心磷脂/卵磷脂混合物氧化过后的下层水相。各样品的迁移方向用箭头表示。
图9显示了4种代表性天然存在的磷脂酰胆碱(卵磷脂)分子的化学结构。L-α-磷脂酰胆碱(牛心)，分子式是C42H80NO8P，分子量为758.07，分子量(同位素)为757.562157，百分组成为C 66.55％H 10.64％N 1.85％O 16.88％P 4.09％。L-α-磷脂酰胆碱，缩醛磷脂(牛心)，分子式是C42H80NO7P，分子量为742.07，分子量(同位素)为741.567242，百分组成为C 67.98％H 10.87％N 1.89％O 15.09％P4.17％。L-α-磷脂酰胆碱，醚(牛心)，分子式是C42H82NO7P，分子量为744.09，分子量(同位素)为743.582893，百分组成为C 67.80％H11.11％N 1.88％O 15.05％P 4.16％。
图10显示了用来测定6种氧化心磷脂/卵磷脂-BSA或-KLH偶联物的抗原性的斑点印迹分析的数字图像。分析中各斑点所施用的各个抗原的量在印迹下方的表中给出。
发明详述
I.引言
如图3所示，心磷脂包括带有氨基酸侧链的中心免疫原性甘油部分。本说明书公开了在保留中心甘油部分与抗类脂抗体的免疫反应性的能力的条件下，制备能与多肽结合以连接到基体上的氧化心磷脂的方法。在公开的实施方案中，心磷脂与高碘酸盐(如偏高碘酸钠)和高锰酸盐(如高锰酸钾)反应，使心磷脂的至少一条脂肪酸侧链氧化，从而在一条或多条侧链上提供末端羧基，然后加入还原剂(如亚硫酸氢盐)淬灭心磷脂的氧化，并将中心甘油部分中形成的β-酮还原成β-羟基，以保留中心甘油部分的免疫原性。在公开的实施方案中，心磷脂与高锰酸盐反应之前，心磷脂先与高碘酸盐反应。在特定实施方案中，与心磷脂的氧化反应发生在醇溶剂中，氩气氛下。适宜的醇溶剂的例子有正丁醇，乙醇，丙醇或甲醇中的一种或多种。偏高碘酸钠与心磷脂的摩尔比为约4∶1至约5∶1，高锰酸钾与心磷脂的摩尔比为约0.5∶1至约1∶1。在一些实施例中，亚硫酸氢盐是亚硫酸氢钠。
氧化心磷脂的羧基可以活化，把它们制备用于将多肽载体共价连接至至少一个羧基上。在特定实施例中，羧基的活化通过氧化的心磷脂与碳二亚胺如1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和琥珀酰亚胺如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应来完成。然后将多肽(如，牛血清白蛋白(BSA)，匙孔血蓝蛋白(KLH)或亲和素)或生物素共价连接至至少一个活化羧基上。
本文还公开了制备与抗类脂抗体具有免疫反应性并能结合多肽以连接至基体上的氧化心磷脂的方法。该方法包括心磷脂与偏高碘酸钠和高锰酸钾在正丁醇溶剂中于氩气气氛下反应，使心磷脂氧化，并在一条或多条侧链上提供末端羧基。然后向心磷脂悬浮液中加入亚硫酸氢钠水溶液，淬灭心磷脂的氧化，并将中心甘油部分中形成的β-酮还原成β-羟基，以保留中心甘油部分的免疫原性。接着，通过氧化的心磷脂先与EDC、然后再与NHS反应来活化氧化心磷脂的末端羧基，随后使蛋白质载体与至少一个羧基共价偶联。
在一种应用中，与多肽载体偶联的氧化心磷脂可以用来通过将心磷脂-多肽偶联物连接至侧流基体如硝化纤维素条来制造侧流色谱装置。提供多肽偶联的心磷脂的能力使得心磷脂可靠地连接在固体基体上。该基体还可以包括与梅毒密螺旋体抗体反应的密螺旋体抗原。同一固体支持物上(或中)心磷脂-多肽偶联物和密螺旋体抗原的存在方便地可以在临床上快速测试同一生物样本中的抗脂质和抗密螺旋体抗体。
本文还公开了用于测定流体样品中抗类脂抗体的存在和/或量的免疫分析装置(如侧流或流通装置)。这些装置通常包括加样区和其中提供了固定的心磷脂-多肽偶联物的独立的心磷脂俘获区，所述偶联物对流动相抗类脂抗体具有特异性结合亲和力。加在加样区中的任何液体(如流体生物样品)沿着流径从加样区流向心磷脂俘获区。流径可以延伸至下游的与免疫分析装置连接的吸收垫，其至少部分起到贮液器的作用。可以检测抗类脂抗体和固定的氧化心磷脂之间复合物的形成，以测定流体样品中抗类脂抗体的存在和/或量。
在侧流装置的一些实施方案中，偶联物垫被放置在加样区至心磷脂俘获区的流径中。该偶联物垫包括抗类脂抗体的流动性或可活动的检测试剂，这样，流过该垫的液体便将该检测试剂移向了心磷脂俘获区。包括检测试剂，抗类脂抗体(分析物)和固定的心磷脂的复合物的形成提供了可见的或可以以其它方式检测的生物样本中存在抗类脂抗体的指示剂。在替代实施方案(包括侧流或流通装置)中，检测试剂不在偶联物垫中供应，而代之以从例如显色剂瓶施用于基体或样品。
检测试剂的例子包括标记的氧化心磷脂或标记的抗人抗体，其中标记是酶、胶体金颗粒、有色乳胶颗粒、吸附蛋白质的银颗粒、吸附蛋白质的铁颗粒、吸附蛋白质的铜颗粒、吸附蛋白质的硒颗粒、吸附蛋白质的硫颗粒、吸附蛋白质的碲颗粒、吸附蛋白质的碳颗粒或蛋白偶联的染料囊(dye sac)中的一种或多种。
免疫分析装置的某些实施方案(如侧流或流通装置)还包括在始自加样区的流径中的密螺旋体俘获区。该密螺旋体俘获区可以包括，例如，对流动相抗梅毒密螺旋体抗体具有特异性结合亲和力的固定的密螺旋体抗原或对流动相的梅毒密螺旋体生物或梅毒密螺旋体抗原具有特异性结合亲和力的固定的抗梅毒密螺旋体抗体。侧流装置还可以在偶联物垫中含有对密螺旋体抗体或抗原具有特异性的流动性或可活动的检测试剂。密螺旋体抗体或抗原的检测试剂可以与抗类脂抗体的检测试剂在同一或不同垫中。在特定实施方案中，抗梅毒密螺旋体抗体的特异性检测试剂包括标记(例如，金-偶联的)蛋白A、标记(例如，金-偶联的)蛋白G或标记(例如，金-偶联的)抗人抗体。在其它实施方案中，流动性密螺旋体抗原的检测试剂可以是标记的(例如，金-偶联的)抗密螺旋体抗原抗体。
通过将生物样品加入所公开的免疫分析装置，并在俘获区中检测抗类脂抗体、氧化心磷脂和检测试剂间复合物的形成，分析来自对象的生物样品，所述装置可以用于诊断对象的梅毒的方法。对俘获区中复合物形成的检测检测了与梅毒感染相关的抗类脂抗体。在其中装置在加样区至心磷脂俘获区的流径中含有偶联物垫的那些实施方案中，所检测的复合物包含流动性或可活动的检测试剂。在其中检测试剂从外源加入装置的其它实施方案中，所检测的复合物包含外加检测剂。
在本方法的特别有利的实施方案中，侧流装置既能检测抗类脂抗体(活动性感染的指示剂)，又能检测抗密螺旋体抗体(其证实非密螺旋体试验的反应性)。在那些包括密螺旋体抗原的装置的实施方案中，本方法包括在俘获区中检测抗梅毒密螺旋体抗体、固定的密螺旋体抗原和检测试剂间的复合物的形成。与用于心磷脂的检测试剂一样，密螺旋体抗原的检测试剂可以在装置上提供，或者从外源施加。
本文还公开了用于梅毒诊断的试剂盒。这些试剂盒包括所公开的免疫分析装置和关于将生物样品加入加样区或装置的说明书。试剂盒还可以包括关于解释试验结果的说明书。
通过将生物样品加入装置，并在俘获区中检测抗类脂抗体、氧化的心磷脂和检测试剂间复合物的形成，分析来自对象的生物样品，所公开的免疫分析装置还可以用于诊断对象的狼疮的方法。对俘获区中复合物形成的检测检测了与狼疮相关的抗类脂抗体。在一些情况下，为检测狼疮，存在着(如加入到样品中)一种或多种辅因子(如β2-糖蛋白I)。II.缩写和术语BSA    牛血清白蛋白EDC    1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺ELISA  酶联免疫吸附分析HPLC   高压液相色谱KLH    匙孔血蓝蛋白LFD    侧流装置MES    N-吗啉代乙磺酸NHS    N-羟基磺基琥珀酰亚胺NMR    核磁共振PEG    聚乙二醇PVA    聚乙烯醇PVP    聚乙烯吡咯烷酮SDS    十二烷基硫酸钠TLC    薄层色谱
除非另有说明，技术术语均根据常规用法使用。分子生物学中的常用术语的定义可以在牛津大学出版社(Oxford UniversityPress)出版的Benjamin Lewin的《基因五》(Genes V)，1994(ISBN0-19-854287-9)；Blackwell Science Ltd.出版的Kendrew等人(编辑)的《分子生物学全编》(The Encyclopedia of Molecular Biology)，1994(ISBN 0-632-02182-9)；和VCH Publishers，Inc.出版的Robert A.Meyers(编辑)的《分子生物学与生物技术：综合案头参考》(MolecularBiology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference)，1995(ISBN 1-56081-569-8)中找到。
为方便对本发明的各种实施方案的评阅，提供了以下具体术语的解释：
活化羧基：羧基的活化是指羧基与试剂，如碳二亚胺(例如，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺)反应，形成亲核反应性衍生物，如O-脲衍生物。亲核反应性衍生物容易与亲核试剂反应，并可以用来(i)与醇基形成醚键，(ii)与酸和醇或酚形成醚键，和(iii)与酸和胺形成肽键。
催化辅助性亲核试剂，如1-羟基苯并三唑、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基磺基琥珀酰亚胺和N-羟基-5-降冰片烯-内-2，3-二羧酰胺(5-norbene-endo-2，3-dicarboxamide)可以用来协助碳二亚胺介导的羧基的活化，以减少可能的副反应，包括外消旋化，并在使用活性酯时提高反应速率。
例如，氧化心磷脂的一条或多条脂肪酸侧链的末端羧基可以通过与1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺反应，在一些情况下，然后与催化辅助性亲核试剂，如N-羟基琥珀酰亚胺反应来活化。
分析物：要检测或测量的能与本文所述心磷脂实施方案特异性结合的原子、分子、分子的基团或天然或合成来源的化合物(例如，药物，激素，酶，生长因子，抗原，抗体，半抗原，凝集素，脱辅基蛋白质，辅因子)。分析物包括但不限于抗体，药物，激素，抗原，半抗原，凝集素，脱辅基蛋白质或辅因子。在一些实施方案中，分析物包括抗体，如响应梅毒密螺旋体感染而产生的抗脂质或抗心磷脂抗体。在其它实施方案中，分析物包括响应(i)自身免疫性疾病，如狼疮，(ii)各种静脉和动脉血栓性病症，包括脑梗塞，(iii)深静脉血栓形成，(iv)血小板减少症，(v)肺栓塞或(vi)伴有胎盘梗死的重复性流产中的任何一种而产生的抗类脂抗体。
抗体：由基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的一种或多种多肽组成的蛋白质。已识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，其依次分别定义免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgD和IgE类。
基本的免疫球蛋白(抗体)结构单元通常为四聚体。各四聚体由两对相同的多肽链组成，各对多肽链具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。各链的N端定义约100至110个或更多的氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语“可变轻链”(VL)和“可变重链”(VH)分别指这些轻链和重链。
抗体是植物和动物响应呈递至免疫系统的抗原而自然产生的。自然产生的抗体可见于例如，动物血清中。例如，感染梅毒密螺旋体的人将产生至少对抗梅毒密螺旋体抗原的抗体和对抗由密螺旋体感染导致的、例如来自因感染而受损的宿主细胞的脂质物质的抗体(即，抗类脂抗体)。
抗体可以作为完整的免疫球蛋白或者作为通过各种肽酶消化或通过重组DNA方法产生的许多特征明确的片段存在。例如，胃蛋白酶在铰链区的二硫键下方消化抗体，产生Fab的二聚体F(ab)’2，其本身是通过二硫键与VH--CH 1连接的轻链。F(ab)’2可以在温和条件下还原，使铰链区的二硫键断裂，从而将F(ab)’2二聚体转化为Fab’单体。Fab’单体基本上是具有部分铰链区的Fab(见基础免疫学(Fundamental Imunology)，W.E.Paul编辑，Raven Press，N.Y.，1993)。尽管某些抗体片段根据完整抗体的消化来定义，但应该了解的是，Fab’片段或其它抗体片段可以以化学方法或者通过采用重组DNA方法从头合成。因此，本文所用术语抗体还包括通过修饰全抗体或用重组DNA方法从头合成产生的抗体片段。
用于本文所公开的方法和装置的一些实施方案的抗类脂抗体可以是任何起源，但最经常发现于对象的血清。
抗体可以是单克隆或多克隆的。只作为举例，单克隆抗体可以根据Kohler和Milstein的经典方法(Nature 256：495-497，1975)或其衍生方法从鼠杂交瘤制备。简而言之，小鼠在几周时间内重复接种几微克的所选分析化合物(或其片段)。在一些情况下，使用佐剂或载体分子对增加分析物在动物系统中的免疫原性和/或稳定性有益。然后处死小鼠，分离产生抗体的脾细胞。用聚乙二醇使脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，过量未融合的细胞通过使系统在包含氨基蝶呤的选择性培养基(HAT培养基)上生长来破坏。将成功融合的细胞稀释，取等份稀释液置于微量滴定板的孔中，继续培养物的生长。产生抗体的克隆通过用免疫分析程序，如最初由Engvall描述的ELISA(Meth.Enzymol.70：419-439，1980)及其衍生方法检测孔的上清液中的抗体来鉴别。所选的阳性克隆可以扩增，收集其单克隆抗体产物待用。Harlow和Lane(抗体，实验室手册(Antibodies，A Laboratory Manual)，CSHL，New York，1988)中描述了单克隆抗体产生的详细程序。
抗原：可以刺激动物中抗体产生或T细胞反应的化学或生物化学化合物、组合物、结构、决定簇、抗原或其部分，包括注射或吸收进入动物的组合物。抗原与特异性体液或细胞免疫的产物，包括由异种免疫原诱导的那些反应。术语“抗原”包括所有相关的抗原表位。
抗类脂抗体：由对象(如人)的免疫系统响应疾病状态如感染下存在的脂质抗原而产生的抗体(如IgM或IgG)。例如，该术语包括响应作为梅毒密螺旋体感染后果、从宿主细胞释放的脂质物质、以及脂蛋白样物质和可能的由密螺旋体释放的心磷脂而产生的抗类脂抗体。抗类脂抗体还可以响应其中也存在脂质抗原的非密螺旋体疾病而产生，包括，例如(i)自身免疫性疾病，如狼疮(Harris等人，Clin.Rheum.Dis.，11：591-609，1985)，(ii)各种静脉和动脉血栓性病症，包括脑梗塞(Harris等人，Clin.Exp.Rheumatol.，2：47-51，1984)，(iii)深静脉血栓形成(Mueh等人，Ann.Intern.Med.，92：156-159，1980)，(iv)血小板减少症(Harris等人，Clin.Rheum.Dis.，11：591-609，1985)，(v)肺栓塞(Anderson和Ali，Ann.Rheum.Dis.，43：760-763，1984)或(vi)伴有胎盘梗死的复发性流产(Derue等人，J.Obstet.Gynaecol.，5：207-209，1985)。
心磷脂是响应疾病状态如梅毒密螺旋体感染而形成的抗类脂抗体的一种通常已知的特异性结合配偶体。天然存在的心磷脂已经常规用于联合胆固醇和卵磷脂使用，用于絮凝试验，以检测例如，梅毒密螺旋体感染患者血清中的抗类脂抗体。
氩气氛：为了进行化学反应而产生的充分包含氩气的气氛。通过使氩气流入反应容器，以置换当时存在于容器内的气氛，之后维持足以使反应容器内的气氛充分包含氩气的氩气流，可以在任何用于进行化学反应的密闭容器中产生氩气氛。当气氛含有至少约25％的氩，至少约30％的氩，至少约40％的氩，至少约50％的氩，至少约60％的氩，至少约70％的氩，至少约75％的氩，至少约80％的氩，至少约85％的氩，至少约90％的氩，至少约92％的氩，至少约95％的氩，至少约98％的氩或至少约99％的氩时，该气氛充分包含氩气。
连接分子或蛋白质：可以直接或间接地与本文所述心磷脂结合以易化心磷脂与固体支持物连接的任何多肽或其它分子(例如，原子，分子，分子基团，蛋白质，聚合物或天然或合成来源的化合物)。在一些实施方案中，连接分子-心磷脂键通过氧化心磷脂的羧基和/或任选地采用结合基团形成。
适宜的连接分子包括但不限于多肽、蛋白质或肽，如白蛋白、血蓝蛋白、甲状腺球蛋白及其衍生物，尤其牛血清白蛋白(BSA)，合成蛋白MAPS，IgY，链霉亲和素，亲和素和匙孔血蓝蛋白(KLH)。其它多肽衍生或非蛋白衍生的物质是本领域技术人员已知的。连接分子通常具有至少50,000道尔顿、优选大于60,000道尔顿的分子量。连接分子常含有反应性基团以易化与氧化的心磷脂的共价偶联。氨基酸的胺基常以该方式使用。缺乏这些基团的连接分子常常可以与适当的化学品反应，产生这些基团。
结合亲和力：指一个分子与另一个在该分子的位点上结合的强度的术语。如果一个特定分子将与另一个特定分子结合或特异性缔合，则认为这两个分子表现出相互的结合亲和力。结合亲和力与一对分子的缔合常数和解离常数有关，但对本发明而言，这些常数的测量或测定不是关键的。更确切地说，本文用来描述所述方法和装置的分子间相互作用的亲和力通常为实证研究中可观察到的表观亲和力(除非另有说明)，其可以用来比较一个分子(例如，抗体或其它特异性结合配偶体)与另外两个分子(例如，分析物和分析物-示踪剂偶联物)结合的相对强度。结合亲和力、缔合常数和离解常数的概念是众所周知的。
结合域：与受体的配体结合部分缔合的分子结构。更具体的是，结合域指天然或合成多肽，或编码这样的多肽的核酸，其氨基酸序列代表蛋白质的特异性(结合域)区域，该区域单独或与其它域组合，表现出与预期的配体/受体结合对相同或相似的结合特征。这些域的特异性序列或特异性边界都不是关键的，只要表现出结合活性即可。同样，用于本文，结合特征必然包括一定范围的亲和力、亲合力和特异性及其组合，只要表现出结合活性即可。
生物样品：直接或间接获自对象的任何样品，包括全血，血浆，血清，泪液，粘液，唾液，尿液，胸水，脊髓液，胃液，汗液，精液，阴道分泌物，痰液，来自溃疡和/或其它表面疹、水疱、脓肿的液体和/或组织、细胞或器官的提取物。生物样品还可以是实验室研究样品，如细胞培养上清液。样品用本领域技术人员公知的方法收集或获得。
碳二亚胺：结构为R1-N＝C＝N-R2的化合物，其中R1和R2独立地为氢或烃基。具体例子包括HN＝C＝NH，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺；N，N’-二环己基-碳二亚胺；和二异丙基碳二亚胺。
心磷脂：包括天然心磷脂和任何与天然存在的心磷脂结构相似的改性心磷脂，且其能与抗类脂抗体特异性结合。
心磷脂俘获区：其中心磷脂被作为俘获试剂固定的俘获区。
俘获试剂：对以下物质具有特异性的未标记的特异性结合配偶体：(i)分析物，如在三明治分析中，或(ii)检测试剂或分析物，如在竞争性分析中，或(iii)辅助特异性结合配偶体，其本身对分析物具有特异性，如在间接分析中。本文所用的“辅助特异性结合配偶体”是与分析物的特异性结合配偶体结合的特异性结合配偶体。例如，辅助特异性结合配偶体可以包括对另一个抗体特异的抗体，例如，山羊抗人抗体。“俘获区”是侧流装置中俘获试剂被固定的区域。侧流装置可以具有一个以上的俘获区，例如，“第一俘获区”，“第二俘获区”等。通常，第一、第二或其它俘获区中将固定不同的俘获试剂。侧流基体上的多个俘获区可以彼此具有任何取向；例如，第一俘获区可以在第二(或其它)俘获区的远端或近端，反之亦然。或者，第一俘获区和第二(或其它)俘获区可以彼此垂直取向，这样，这两个(或更多个)俘获区便形成了交叉或加号或其它符号。
偶联(物)：当用于动词形式时，术语“偶联”的意思是一个分子(例如，氧化的心磷脂)与另一个分子(例如，蛋白质)的共价偶联。这种偶联可以通过化学方法、用或不用连接基团完成。当用于名词形式时，术语“偶联物”的意思是通过偶联形成的偶联分子络合物。
检测：是指定量或定量测定研究中分析物的存在(例如，抗类脂抗体和/或抗梅毒密螺旋体抗体)。“检测复合物的形成”指的是通过任何适合观察与检测试剂缔合的特定标记的方法，检测包含检测试剂的复合物；例如，目测有色(或以其它方式可见的)标记，测量或视觉检测荧光，化学发光或放射性标记。
检测试剂：与标记偶联的特异性结合配偶体。检测试剂包括，例如，标记分析物特异性结合成分(如金偶联的氧化心磷脂-连接分子复合物)或标记的辅助特异性结合成分(如酶偶联物，羊抗人抗体)。
表位(抗原决定簇)：单个抗体分子与之结合的抗原分子表面的位点；通常抗原具有数个或许多不同抗原决定簇，并与具有许多特异性不同的抗体反应。
免疫原性：能引起生物体内的免疫反应的特性。例如，抗类脂抗体具有与氧化的心磷脂中存在的表位结合的能力时，氧化的心磷脂保留了免疫原性。
标记：与分析物、分析物类似物、检测试剂或结合配偶体结合的任何分子或组合物，其可以通过分光镜，光化学，生物化学，免疫化学，电学，光学或化学方法检测。标记的例子包括现已公开的酶、胶体金颗粒、有色乳胶颗粒(美国专利No.4,275,149；4,313,734；4,373,932；和4,954,452，其各自引入本文作为参考)。可用标记的其它例子包括但不限于放射性同位素，辅因子，配体，化学发光或荧光剂，吸附蛋白质的银颗粒，吸附蛋白质的铁颗粒，吸附蛋白质的铜颗粒，吸附蛋白质的硒颗粒，吸附蛋白质的硫颗粒，吸附蛋白质的碲颗粒，吸附蛋白质的碳颗粒和蛋白偶联的染料囊。化合物(例如，检测试剂)与标记的连接可以通过共价键、吸附过程、疏水和/或静电键，如螯合物等中那样，或这些键和相互作用的组合，和/或可以包含连接基团。
侧流装置：用于侧流色谱的测试条形式的分析装置，在其中，被怀疑含有分析物的供试样品流体流过(例如，通过毛细管作用)测试条(常由吸水材料，如纸、硝化纤维素和纤维素制成)。供试流体和任何混悬的分析物可以沿测试条流向检测区，在检测区中，分析物(如果存在)与检测剂相互作用，以显示分析物的存在、不存在和/或量。
很多侧流分析装置已公开，包括美国专利No.4,313,734；4,435,504；4,775,636；4,703,017；4,740,468；4,806,311；4,806,312；4,861,711；4,855,240；4,857,453；4,943,522；4,945,042；4,496,654；5,001,049；5,075,078；5,126,241；5,451,504；5,424,193；5,712,172；6,555,390；和6,368,876；EP 0810436；以及WO 92/12428；WO 94/01775；WO 95/16207；和WO 97/06439中所示的那些，其各自被引入作为参考。
许多侧流装置是一步侧流分析，其中将生物流体置于吸水测试条(不过，可以使用非吸水材料，通过向该材料中加入表面活性剂来提供吸水性)上的样品区，然后使其沿测试条移行，直至液体接触与该液体中的分析物相互作用的特异性结合配偶体。一旦分析物与结合配偶体相互作用，信号(如荧光或可以以其它的可见染料)显示发生了相互作用。测试条上可以放置多种分离的结合配偶体(例如，按平行线放置)，以检测液体中的多种分析物。测试条中还可以加入对照指示剂，其提供测试已充分进行的信号，即便测试条上未见指示分析物存在(或不存在)的阳性信号。
卵磷脂(又名，磷脂酰胆碱)：卵磷脂是磷脂酰胆碱的通用名称。磷脂酰胆碱是甘油磷酸，其通常是动物和植物中最丰富的磷脂。它是膜的双层的关键构造材料，也是在血浆中循环的主要磷脂。在强酸性至强碱性的pH范围内，磷脂酰胆碱为中性或两性离子的磷脂。磷脂酰胆碱含有两条脂肪酸侧链，在自然中和合成修饰时其可具有可变的化学结构。图9中显示了四种代表性天然存在的磷脂酰胆碱分子的化学结构。
本文所用术语“卵磷脂”包括天然存在的卵磷脂和任何与天然存在的卵磷脂具有结构相似性的改性合成卵磷脂。例如，合成卵磷脂的脂肪酸可以包括下列：
  碳数   1-酰基   2-酰基
  14:0-16:0   肉豆蔻酰   棕榈酰
  14:0-18:0   肉豆蔻酰   硬脂酰
  16:0-14:0   棕榈酰   肉豆蔻酰
  16:0-18:0   棕榈酰   硬脂酰
  16:0-18:1   棕榈酰   油酰
  16:0-18:2   棕榈酰   亚油酰
  16:0-20:4   棕榈酰   花生四烯酰
  16:0-22:6   棕榈酰   二十二碳六烯酰
  18:0-14:0   硬脂酰   肉豆蔻酰
  18:0-16:0   硬脂酰   棕榈酰
  18:0-18:1   硬脂酰   油酰
  18:0-18:2   硬脂酰   亚油酰
  18:0-20:4   硬脂酰   花生四烯酰
  碳数  1-酰基   2-酰基
  18:0-22:6  硬脂酰   二十二碳六烯酰
  18:1-14:0  油酰   肉豆蔻酰
  18:1-16:0  油酰   棕榈酰
  18:1-18:0  油酰   硬脂酰
  14:1-14:1  肉豆蔻油酰   肉豆蔻油酰
  14:1-14:1  肉豆蔻反油酰   肉豆蔻反油酰
  16:1-16:1  棕榈油酰   棕榈油酰
  16:1-16:1  棕榈反油酰   棕榈反油酰
  18:1-18:1  岩芹酰(Petroselinoyl)   岩芹酰
  18:1-18:1  油酰   油酰
  18:1-18:1  反油酰   反油酰
  18:2-18:2  亚油酰   亚油酰
  18:3-18:3  亚麻酰   亚麻酰
20:1-20:1  二十碳烯酰(Eicosenoyl) 二十碳烯酰
  20:4-20:4  花生四烯酰   花生四烯酰
  22:1-22:1  芥酰(Erucoyl)   芥酰
  22:6-22:6  DHA   DHA
  24:1-24:1  神经酰(Nervonoyl)   神经酰
连接基团：两个化合物如化合物和标记(例如，分析物和标记)之间的化学臂(chemical arm)。为达到必要的化学结构，各反应物必须含有反应基团。这些基团的代表性组合有形成酰胺键的氨基和羧基；形成酯键的羧基和羟基，或形成烷基氨基键的氨基和烷基卤；形成二硫化物的硫醇和硫醇；或形成硫醚的硫醇和马来酰亚胺或烷基卤。不存在于天然化合物中的羟基、羧基、氨基和其它官能团可以通过已知方法引入。
同样，可以使用很多种连接基团。键的结构应该是为使两个化合物(例如，标记与分析物)彼此相连而形成的稳定共价键。在一些情况下，为了增强所需的结合特征，例如改性配体与其关联受体，连接基团可以设计成亲水或疏水的。该共价键应相对于被连接化合物所处的溶液条件稳定。连接基团的例子将有1-20个碳和0-10个杂原子(NH，O，S)，并且可以是支链或直链。在不限制前述内容的条件下，应该显而易见的是，仅化学相容的原子的结合包括连接基团。例如，与碳碳键结合的酰胺，酯，硫醚，硫酯，酮，羟基，羧基，醚基是化学相容连接基团的具体例子。
可操作性或毗邻接触(contiguous contact)：当两个固体组分以含水液体可以通过毛细管作用或其它方式从这两个组分之一基本上不间断地流向另一个组分的方式直接或间接接触时，则这两个组分处于可操作性接触中。直接或毗邻接触的意思是两种成分物理接触，如边缘与边缘或前与后。当两个组分直接接触时，其可以以约0.5至约3mm的重叠部分重叠。然而，组分可以放置得具有对接边。“间接接触”的意思是两种成分没有物理接触，但通过一个或多个导体桥接。可操作性接触还可称作“流体传递性”或“液体连续性”接触。
氧化心磷脂(或改性心磷脂)：本文所述已化学改性的心磷脂。例如，氧化心磷脂是未氧化心磷脂的四条脂肪酸链中的至少一条已氧化裂解以产生末端羧基的化学相关分子的混合物。在一些实施方案中，氧化心磷脂具有图3所示的化学结构。
还原剂：任何将来自心磷脂氧化的β-酮基还原成相应的β-羟基而不引起其它氧化心磷脂官能团如脂肪酸酯基和/或磷酸酯的大量降解的还原剂。本领域技术人员可以从，例如，Larock，ComprehensiveOrganic Transformations(综合有机转化)，第二版，New York：JohnWiley & Sons，1999的教示中选择合适的还原剂。还原剂的具体例子包括亚硫酸氢钠，硫酸二甲酯，氰基硼氢化钠(NaBH3CN)，硼氢化钠(NaBH4)，三乙酰氧基硼氢化钠(NaBH(OAc)3)，吗啉硼烷，三异丙氧基硼氢化钾，叔丁胺硼烷，二甲胺硼烷，吡啶硼烷，三乙胺硼烷，三甲胺硼烷。
加样区：流体样品被引入免疫色谱测试条、如存在于侧流装置中的免疫色谱测试条中的区域。在一个实施例中，样品用滴管或其它施加器通过外加引入加样区。在另一个实施例中，加样区可以直接浸入样品中，例如，当测试条被浸入装有样品的容器中时。在另一个实施例中，样品可以倒或挤在加样区上。
固体支持物(或基体)：任何不溶或可以通过后来的反应使之不溶的材料。有很多各种各样的固体支持物是本领域技术人员已知的，包括但不限于硝化纤维素，反应盘的孔壁，多孔板，试管，聚苯乙烯珠，磁珠，膜，微粒(如乳胶颗粒)和羊(或其它动物)红血细胞。任何适宜的具有允许检测试剂进入的充分孔隙率和用以固定俘获试剂(例如，氧化心磷脂或氧化心磷脂-连接分子复合物)的适当表面亲合力的多孔材料都被该术语包含在内。例如，硝化纤维素的多孔结构对很多种试剂，例如，俘获试剂具有极好的吸附和吸附性质。尼龙具有相似特性，也是适宜的。微孔结构是可用的，如水合状态时具有凝胶结构的材料。
可用的固体支持物的其它例子包括：天然的聚合碳水化合物及其合成改性、交联或取代的衍生物，如琼脂，琼脂糖，交联海藻酸，取代和交联的瓜尔胶，纤维素酯，特别是与硝酸和羧酸的纤维素酯，混合的纤维素酯以及纤维素醚；天然含氮聚合物，如蛋白质和衍生物，包括交联或改性明胶；天然烃聚合物，如胶乳和橡胶；可制备成具有适当多孔结构的合成聚合物，如乙烯基聚合物，包括聚乙烯，聚丙烯，聚苯乙烯，聚氯乙烯，聚乙烯乙酸酯及其部分水解的衍生物，聚丙烯酰胺，聚甲基丙烯酸酯，上述缩聚物的共聚物和三元共聚物，如聚酯，聚酰胺，以及其它聚合物如聚氨酯或聚环氧化合物；多孔无机材料，如碱土金属和镁的硫酸盐或碳酸盐，包括硫酸钡，硫酸钙，碳酸钙，碱和碱土金属、铝及镁的硅酸盐；以及铝或硅的氧化物或水合物，如粘土，氧化铝，滑石，高岭土，沸石，硅胶或玻璃(这些材料可以与上述聚合材料一起用作过滤器)；以及上述种类的混合物或共聚物，如通过在事先存在的天然聚合物上启动合成聚合物的聚合而获得的接枝共聚物。
计划上文所述的多孔固体支持物，如硝化纤维素，优选为片或条的形式。这种片或条的厚度可以在宽限度内变动，例如，约0.01至0.5mm，约0.02至0.45mm，约0.05至0.3mm，约0.075至0.25mm，约0.1至0.2mm或约0.11至0.15mm。这种片或条的孔径同样可以在宽限度内变动，例如，约0.025至15μm，或更尤其是约0.1至3μm；然而，不希望孔径成为选择固体支持物的限制因素。固体支持物在适用之处的流速也可以在宽限度内变动，例如，约12.5至90秒/cm(即，50至300秒/4cm)，约22.5至62.5秒/cm(即，90至250秒/4cm)，约25至62.5秒/cm(即，100至250秒/4cm)，约37.5至62.5秒/cm(即，150至250秒/4cm)，或约50至62.5秒/cm(即，200至250秒/4cm)。在本文所述装置的具体实施方案中，流速为约62.5秒/cm(即，250秒/4cm)。在本文所述装置的其它具体实施方案中，流速为约37.5秒/cm(即，150秒/4cm)。
固体支持物的表面可以通过使试剂(例如，俘获试剂)与该支持物产生共价键的化学方法活化。然而，任何其它适宜的方法都可以用于将试剂(例如，俘获试剂)固定在固体支持物上，包括但不限于离子相互作用，疏水相互作用，共价相互作用等。引起试剂固定在固相上的具体的力对本文所述的方法和装置而言并不重要。
固相可以就其固有的吸引和固定试剂如俘获试剂的能力进行选择。或者，固相可以具备某种因素，该因素具有吸引和固定试剂如俘获试剂的能力。该因素可以包括荷电物质，其相对于例如，俘获试剂本身或俘获试剂偶联的荷电物质带有相反的电荷。在另一个实施方案中，特异性结合成分可以被固定在固相上，以使其结合配偶体(例如，俘获试剂)固定化。因此，在该实施例中，特异性结合成分使俘获试剂能够间接地与固相材料结合。
除另有物理限制外，固体支持物可以以任何适宜的形状使用，如薄膜、片、条或板，或者，其可以涂覆或结合或层压在适当的惰性载体如纸、玻璃、塑料薄膜或织物上。
“侧流基体”是任何可用于侧流装置的固体支持物或基体。
特异性结合配偶体(或结合配偶体)：通过依赖于相关分子的三维结构的特异性非共价相互作用而相互作用的分子对的一员。典型的特异性结合配偶体对包括抗原/抗体，半抗原/抗体，激素/受体，核酸链/互补核酸链，底物/酶，抑制剂/酶，碳水化合物/凝集素，生物素/(链霉)亲和素和病毒/细胞受体。
当短语“与分析物特异性结合”或“与……具有特异性免疫反应性”当指代抗体时，指的是在分子如蛋白质和其它生物分子的异质群体存在下，决定分析物存在的结合反应。因此，在所指免疫分析条件下，指定抗体与特定分析物结合，而不与样品中存在的其它分析物大量结合。多种免疫分析形式可以用来选择与特定分析物具有特异性免疫反应性的抗体。例如，固相ELISA免疫分析常规用来选择与蛋白质具有特异性免疫反应性的单克隆抗体。关于可以用来测定特异性免疫反应性的免疫分析形式和条件的说明，请参见Harlow和Lane，抗体，实验室手册(Antibodies，A Laboratory Manual)，CSHP，New York(1988)。
对象：活的多细胞生物，包括脊椎生物，是包括人和非人哺乳动物的类别。
密螺旋体抗原：含有至少一种特异性结合抗梅毒密螺旋体抗体的抗原决定簇的抗原。本领域已记载了很多密螺旋体抗原；参见，例如，美国专利No.6,479,248；6,248,331；5,681,934；5,578,456；4,868,118；和4,740,467，其各自引入本文作为参考。例如，至少以下表观分子量的多肽已记载为梅毒密螺旋体抗原：16-20kDa，18kDa，18-23kDa，25kDa，35kDa，37kDa，37-46kDa，38kDa，39kDa，41kDa，43kDa，44kDa，46kDa，47kDa，58kDa，150kDa；和180kDa(更详细的细节请参见美国专利No.4,846,118)。
除非另有说明，本文所用所有技术和科学术语的含义均与本发明所属领域技术人员通常理解的相同。除非上下文另有明确指示，单数术语和“该”包括复数的指示物。类似地，除非上下文另有明确指示，单词“或”旨在包括“和”。因此，“包括A或B”意味着包括A或B，或者A和B。另外还应了解的是，对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小，以及所有的分子量或分子质量的值都是近似值，其提供是为了说明。尽管与本文所述方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于本发明的实施或测试，但下文描述了适宜的方法和材料。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都以其全文引入本文。万一有冲突，本说明书，包括术语的解释将起控制作用。此外，材料、方法和实施例都只是说明性的，而不旨在被限制。
III.心磷脂
心磷脂是双磷脂酰甘油(具体为1，3-双磷脂酰甘油)，如下图所示，其具有由两个磷酸二酯桥连接的三个甘油分子组成的主链：
Figure S200680051254XD00261
心磷脂的外部甘油部分的四个羟基各自与饱和或不饱和脂肪酸链(长度通常为14-18个碳)酯化。本文所用术语“心磷脂”包括具有任何脂肪酸侧链分布的1，3-双磷脂酰甘油；条件是至少一条脂肪酸侧链含有至少一个C＝C双键。因此，心磷脂的四条脂肪酸侧链的长度(例如，约14至约25个碳，约14至约22个碳，约14至约20个碳，约14至约18个碳或约14至约16个碳)和/或饱和度(例如，完全饱和至含有约6个双键，完全饱和至含有约4个双键，或完全饱和至含有约2个双键)可以独立地变化。心磷脂的例示性脂肪酸侧链独立地包括肉豆蔻酰(14:0)；棕榈酰(16:0)；硬脂酰(18:0)；油酰(18:1)；肉豆蔻油酰(14:1)；棕榈油酰(16:1)；岩芹酰(18:1)；亚油酰(18:2)；亚麻酰(18:3)；二十碳烯酰(20:1)；花生四烯酰(20:4)；芥酰(22:1)；DHA(22:6)；或神经酰(24:1)。
在一些实施方案中，心磷脂是天然存在的形式。天然存在的心磷脂可以购自许多来源，例如，Sigma Aldrich，Avanti Polar Lipids(Alabaster，AL)和Lee Laboratories(Grayson，GA)。其也可以通过例如，牛心肌组织的溶剂萃取、沉淀法或高压柱色谱得到。天然存在的心磷脂的脂肪酸组成通常根据多种多样的天然存在的脂肪酸，如棕榈酰(16:0)；硬脂酰(18:0)；油酰(18:1)；和亚油酰(18:2)进行分布。天然存在形式的心磷脂中最丰富的脂肪酸分子种类是亚油酸90％，接着是油酸5％，和棕榈酸1％。
在其它实施方案中，心磷脂为非天然存在的形式(也称作“合成心磷脂”)。合成心磷脂的非限制性例子包括，例如，四油酰心磷脂，双(二棕榈酰-D，L-α-甘油磷酰)-1，3-甘油苄基醚二钠盐，双(二棕榈酰-D，L-α-甘油磷酰)-1，5-戊二醇二钠盐，双(二棕榈酰-D，L-α-甘油磷酰)-1，3-丙二醇二钠盐，双(二棕榈酰-D，L-α-甘油磷酰)-1，4-丁二醇二钠盐，双(二棕榈酰-D，L-α-甘油磷酰)-1，2-乙二醇二钠盐，双(二棕榈酰-D，L-α-甘油磷酰)-甲二醇二钠盐，双(二棕榈酰-D，L-α-甘油磷酰)-1，3-甘油二钠盐，双(苄基磷酰)-1，3-丙二醇二钠盐或D，L-α-二棕榈酰双磷脂酸。
心磷脂的抗原表位被认为包括中心甘油部分的两个磷酸酯基团和β-羟基。该抗原表位存在于天然存在和合成心磷脂二者中。天然存在的心磷脂或合成心磷脂之一或两者可以如本文所述进行氧化，只要抗类脂抗体与氧化形式特异性结合即可。
IV.心磷脂的氧化
A.概述
本领域普通技术人员将了解，心磷脂的脂肪酸侧链的氧化裂解将发生在氧化剂如NaIO4和KMnO4、或NaIO4和四氧化钌、或HIO4和KMnO4存在下(参见，例如，March，高等有机化学：反应，机理和结构(Advanced Organic Chemistry：Reactions，Mechanisms andStructure)，第二版，New York：McGraw Hill Book Company，1977，第1095页)。即，存在于脂肪酸侧链的双键将最终氧化成羧基，从而释放出烷基羧化物，如丙二酸和/或己酸(如图3所示)。在完全氧化的心磷脂分子中，所有四条脂肪酸侧链都将在第一个(最近的)双键位置上断裂，产生各自具有末端羧基的脂肪酸链(如图3所示)。由于天然存在的心磷脂就其脂肪酸侧链组成而言可以是异质的，因此，完全氧化的心磷脂制品将将是反映未氧化分子的脂肪酸侧链异质性的氧化种类的混合物。如果心磷脂氧化不完全，可以出现另外的异质性。在这种情况下，将产生其中1、2或3条脂肪酸侧链被氧化成羧酸的氧化心磷脂种类的混合物(参见，例如，图3，用于说明不完全氧化的具有一个末端羧基的氧化心磷脂分子的例子，和经过完全氧化的氧化心磷脂的另一个例子)。该图中所述任何或所有的氧化心磷脂种类由于可用于所述组合物、方法和装置，因此都包含在本发明中。
B.用NaIO4和KMnO4氧化心磷脂
一种可用于氧化心磷脂的方法采用了高碘酸根(IO4 -)和/或高锰酸根(MnO4 -)作为氧化剂。这些氧化剂的盐包含任何提供电中性化合物的反离子。高碘酸根通常为高碘酸盐，如NaIO4或HIO4(高碘酸)的形式，高锰酸根通常为盐的形式(如钠或钾盐)，例如KMnO4。在一个具体实施方案中，NaIO4和KMnO4被用作氧化剂。为实施该氧化方法，将获自任何来源的心磷脂加入到将基本溶解心磷脂的任何溶剂中。鉴于心磷脂的疏水性，优选使用极性有机溶剂，如正丁醇，乙醇，甲醇，丙醇，丙酮，二甲基甲酰胺或乙醚。其它非极性有机溶剂可以用于使心磷脂混悬，如氯仿；然而，这些非极性有机溶剂较少使用，因为氧化反应的其它组分(如下文所述)在这些溶剂中不如例如极性有机溶剂或含水溶剂可溶。
心磷脂溶液的浓度可以是任何可用浓度，该可用浓度的上限仍允许心磷脂溶解在所选溶剂中。本领域技术人员可以容易地确定心磷脂在任何特定溶剂中的饱和点。在所选溶剂为正丁醇的实施例中，心磷脂的浓度在约10mg/ml至250mg/ml的范围内，如约10mg/ml，约25mg/ml，约50mg/ml，约75mg/ml，约100mg/ml，约125mg/ml，约150mg/ml，约200mg/ml和约250mg/ml。如果心磷脂溶解于所选溶剂后出现颗粒，则溶液可以任选通过任何本领域已知技术，如离心或过滤来使之澄清。
在一些实施方案中，心磷脂的氧化可以发生在缺氧下，例如在氩、氦气或氮气氛中。心磷脂氧化反应将发生在含氧气氛，如空气或其它气氛中；然而，其中所包含的氧化分子，如碳酸盐可以降低反应效率。但是，将发生心磷脂氧化反应的所有气氛不管反应效率如何，都包括在本公开内容中。
然后在不断搅拌下向悬浮的心磷脂中加入足以氧化裂解至少一条心磷脂脂肪酸侧链的量的氧化剂，如NaIO4和KMnO4。在一些实施例中，高碘酸盐和高锰酸盐(如NaIO4和KMnO4)被联合用于氧化心磷脂。在这些实施例的某些中，高碘酸盐(如NaIO4)先被加入到心磷脂溶液中，然后再加入高锰酸盐(如KMnO4)。氧化剂可以溶解在溶解它们并且将与心磷脂溶液混合的任何溶剂中。例如，NaIO4和KMnO4可以溶解在水中。
当NaIO4被用于氧化心磷脂的方法时，反应中所用的NaIO4的量不是关键的。最少地，该量是使反应在特定环境下于合理时间内发生的量。范围的另一端，可以在氧化反应中使用明显摩尔过量的NaIO4。例如，高碘酸盐(如NaIO4)与心磷脂的摩尔比可以是约0.1∶1至约100∶1，约0.5∶1至约50∶1，约1∶1至约25∶1，约2∶1至约15∶1，约2.5∶1至约10∶1，约3∶1至约7.5∶1，或约4∶1至约5∶1。在具体实施方案中，偏高碘酸钠与心磷脂的摩尔比为约4∶1至5∶1，或更尤其是约4.2∶1。
当高锰酸盐(如KMnO4)被用于氧化心磷脂的方法时，反应中所用高锰酸盐的量不是关键的。最少地，该量是使反应在特定环境下于合理时间内发生的量。范围的另一端，可以在氧化反应中使用明显摩尔过量的高锰酸盐。例如，高锰酸盐(如KMnO4)与心磷脂的摩尔比可以是约0.01∶1至约100∶1，约0.02∶1至约50∶1，约0.1∶1至约25∶1，约0.25∶1至约15∶1，约0.3∶1至约10∶1，约0.4∶1至约7.5∶1，约0.5∶1至约5∶1，约0.6∶1至约2∶1，或约0.7∶1至约1∶1。在具体实施方案中，高锰酸盐(如KMnO4)与心磷脂的摩尔比为约0.5∶1至1∶1，或更尤其是约0.75∶1。
氧化反应混合物可以在任何不阻止反应发生的温度下发生。类似地，反应可以进行足以导致心磷脂的至少一条脂肪酸侧链氧化降解的任何时间量。如本领域技术人员将了解的那样，反应时间将取决于数种变量，包括反应温度，溶剂类型和反应物及产物浓度，这些变量每个都可以通过常规实验容易地进行优化。在一个实施例中，氧化反应发生在室温，并进行了至少24-48小时。
心磷脂氧化反应可以用任何能中和反应物中存在的氧化剂、并且能将中心甘油部分的β-碳上形成的任何酮还原成相应的β-羟基的还原剂中止。还原剂，如亚硫酸氢盐(如，亚硫酸氢钠)，二甲基硫，氰基硼氢化钠(NaBH3CN)，硼氢化钠(NaBH4)，三乙酰氧基硼氢化钠(NaBH(OAc)3)，吗啉硼烷，三异丙氧基硼氢化钾，叔丁胺硼烷，二甲胺硼烷，吡啶硼烷，三乙胺硼烷或三甲胺硼烷可用于此目的。在一些具体实施例中，还原剂是亚硫酸氢盐，在更特定的实施例中，还原剂是亚硫酸氢钠。
加入反应物中的还原剂的量不是关键的，只要氧化剂淬灭即可。如果氧化心磷脂的免疫原性受到心磷脂中心甘油部分的β-羟基氧化成酮的不利影响，则还原剂的量也是为了氧化心磷脂的充分免疫原性而恢复β-羟基的量。例如，向含有NaIO4和KMnO4氧化剂的心磷脂氧化反应中可以加入足以导致反应混合物变成基本上无色的亚硫酸氢钠量。
如果存在，心磷脂氧化反应中的水和有机相可以通过任何本领域已知方法分离，例如，离心。在一个实施方案中，主要含有氧化心磷脂的叔丁醇相和主要含有烷基羧化物的水相可以通过离心分离。氧化心磷脂是充分疏水的，可以预期其分离进入有机相。然而，如果必要，普通技术人员可以通过本领域已知方法，如TLC，HPLC，NMR或气相色谱来确定水相或有机相中哪一相(或两相)含有氧化心磷脂。
任选地，溶液中的氧化心磷脂可以透析入可用的缓冲液，如10mM pH 8.0的磷酸盐缓冲液中，并用本领域公知方法冷冻干燥。
C.氧化心磷脂的抗原性
已经显示，氧化改变一些磷脂的抗原特性(参见，例如，美国6,177,282)。据认为，梅毒患者的抗类脂抗体与中心甘油部分的两个磷酸酯基团和β-羟基结合(参见，例如，Castro等人，Clin.Diagn.Lab.Immunol.，7(4)：658-661，2000)。因此，为了保留心磷脂的抗原性，以检测例如梅毒血清中的抗类脂抗体，维持中心甘油部分的构型是有益的。氧化心磷脂的抗原性可以通过任何被广泛应用的多种技术(包括，例如，ELISA，斑点印迹，酶免疫分析，荧光免疫分析)和/或本文所述技术(参见，例如，实施例4)来测试。如实施例4(见下文)所述，本文所述氧化心磷脂的方法保留了心磷脂的抗原性。
D.心磷脂/卵磷脂混合物
心磷脂和卵磷脂的混合物可以通过与上文所述单独的心磷脂相同的方法氧化；唯一的不同之处在于起始原料为心磷脂和卵磷脂的混合物。在氧化反应开始时，心磷脂和卵磷脂以约20∶1至约1∶1，或约1∶1至约1∶10，或约10∶1至约1∶10，或约5∶1至约1∶5，或约1∶1至约1∶5的重量比(心磷脂∶卵磷脂)混合在一起。在特定实施例中，心磷脂∶卵磷脂的重量比包括约20∶1，约10∶1，约5∶1，约2∶1，约1∶1，约1∶2，约1∶3，约1∶5或约1∶10。
V.氧化心磷脂-连接分子复合物
氧化心磷脂是相对小的分子。因此，将氧化心磷脂连接到较大的分子(如多肽)上，以易化心磷脂连接到固体表面，对用于本文所述方法和装置是有益的。在某些实施例中，较大的分子更容易连接到基体，如被用于侧流或流通技术的吸水基体类型上。衍生的氧化心磷脂比非常小的心磷脂或氧化心磷脂分子本身更容易吸附和定位于多孔基体(如硝化纤维素多孔基体)。通过将多肽部分与其连接而进行的氧化心磷脂的衍生化，大大增强了其在基于固体表面的免疫分析，如ELISA，侧流诊断条和/或装置，和/或流通装置中的通用性和有用性。
适宜的连接分子包括蛋白质，多肽或肽，如白蛋白，血蓝蛋白，甲状腺球蛋白及其衍生物，尤其是牛血清白蛋白(BSA)和匙孔血蓝蛋白(KLH)，亲和素，链霉亲和素以及生物素。其它多肽衍生或非多肽衍生的物质是本领域技术人员已知的。
连接分子常常含有促进与氧化心磷脂共价偶联的反应性基团。氨基酸的胺基可以以这种方式使用。缺乏这些基团的连接分子常常可以与适当的化学品反应，产生反应性基团。可以用来在连接分子中产生可用的反应性基团的举例说明性化学品包括但不限于1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基磺基琥珀酰亚胺(NHS)。
本文中氧化心磷脂的供应提供了至少一个以其它方式在天然存在或合成心磷脂中不能得到的反应性羧基。因此，氧化心磷脂可以通过本领域已知和/或本文所述的任何方法，经氧化产生的反应性基团与连接分子相连。这种连接可以用或不用其它连接基团。有许多不同方法可以用于产生氧化心磷脂与连接分子间的连接。
图4示意性显示了用于连接氧化心磷脂和含胺连接分子(例如，蛋白质，如BSA，合成蛋白质MAPS，IgY，链霉亲和素，亲和素或KLH)的一个例示性方法。图4中的反应说明，如本文所述通过心磷脂的脂肪酸侧链的氧化裂解产生的羧基可以用EDC联合NHS(或Sulfo-NHS，如图4所示)修饰成胺反应性NHS酯。氧化心磷脂NHS酯然后与连接分子如图4中所示BSA中存在的胺基反应，在氧化心磷脂与连接分子间形成酰胺键。
本文中的方法和装置的一些实施方案采用了固定在固相上的氧化心磷脂或氧化心磷脂-连接分子复合物。任何将物质固定在固体表面上的常规方法均考虑在本公开内容中。
将氧化心磷脂或氧化心磷脂-连接分子复合物固定在固相上的适宜方法包括离子、疏水、共价相互作用等。固相(参见，例如，章节II)可以就其固有的吸引和固定氧化心磷脂或氧化心磷脂-连接分子复合物的能力进行选择。或者，固相可以具备某种因素，该因素具有吸引和固定氧化心磷脂或氧化心磷脂-连接分子复合物的能力。该因素可以包括，例如，相对于氧化心磷脂或氧化心磷脂-连接分子复合物带有相反电荷的荷电物质，或者，例如，相对于和氧化心磷脂或氧化心磷脂-连接分子复合物偶联的荷电物质带有相反电荷的荷电物质。再或者，该因素可以是任何特异性结合配偶体，例如，亲和素或链霉亲和素，其固定在固相上，并且通过特异性结合反应具有固定氧化心磷脂或氧化心磷脂-连接分子复合物例如生物素化氧化心磷脂的能力。
在本文中方法和装置的一些实施方案中，氧化心磷脂或氧化心磷脂-连接分子复合物可以作检测试剂用，因此将与标记偶联。可以通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方法检测的任何分子或组合物都可以作为标记使用。标记的例子，包括酶、胶体金颗粒、有色乳胶颗粒现已公开(美国专利No.4,275,149；4,313,734；4,373,932；和4,954,452，其各自引入本文作为参考)。可用标记的其它例子包括但不限于辅因子，配体，化学发光或荧光剂，吸附蛋白质的银颗粒，吸附蛋白质的铁颗粒，吸附蛋白质的铜颗粒，吸附蛋白质的硒颗粒，吸附蛋白质的硫颗粒，吸附蛋白质的碲颗粒，吸附蛋白质的碳颗粒和蛋白偶联染料囊。
化合物与标记的连接可以通过共价键、吸附过程、疏水和/或静电键，如螯合物等中那样，或这些键和相互作用的组合进行，和/或可以包含连接基团。加标记的方法和关于选择适合不同目的的标记的指导在例如，Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(MolecularCloning：A Laboratory Manual)，CSHL，New York，1989和Ausubel等人，当前分子生物学规程(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene Publ.Assoc.and Wiley-Intersciences，1998中有讨论。
在方法和装置的一些实施方案中，设想了氧化心磷脂的胶体金偶联物或氧化心磷脂-连接分子复合物的胶体金偶联物。
VI.免疫分析装置
本文中关于氧化心磷脂和制备可以固定在固体支持物(如微孔膜，如硝化纤维素，尼龙或PVDF)上的心磷脂-连接分子偶联物的方法的发现使基于固体表面的免疫分析(如，EIA，ELISA，流通装置，浸渍条(dipsticks)和侧流装置)能够用于检测与心磷脂结合的分析物(如来自梅毒密螺旋体感染对象的生物样品中的抗类脂抗体)。在一些实施例中，所公开的免疫分析法可以检测生物样品中抗类脂抗体的存在(或不存在)，用于诊断梅毒。
A.代表性免疫分析装置的形式和相关信息
免疫分析装置可以实行相对廉价的、一次性的、基于膜的分析，用于视觉识别液体样品中分析物的存在(或不存在)。这种装置通常的形式为独立式的浸渍条(例如，测试条)或具有某种外壳的装置。通常，免疫分析装置可以使用少至约200μl的液体样品，并且样品中分析物的检测可以(但不必须)在2-5分钟内完成。在临床分析中，样品可以是尿，血液，血清，唾液或其它体液。在非临床测试中，样品可以是制备自土壤、灰尘、植物或食品的小体积的溶，并且同样直接加在膜测试条上。在大多数情况下，不需要辅助仪器来完成这些测试，并且这些装置甚至可以由无经验的人很容易地应用于临床，实验室，野外和家庭。
已经开发出了免疫分析装置，用于使用不同生物样品(例如，尿，血清，血浆，血液，唾液)常规鉴别或监测生理和病理状况(例如，感染性疾病，妊娠，癌症，内分泌病症)，以及用于分析环境样品(例如，天然流体和工业化工厂流出物)，以分析例如污染。这些检验中的许多都是基于特异性结合对之间的高度特异性的相互作用。这些结合对的例子包括抗原/抗体，半抗原/抗体，凝集素/碳水化合物，脱辅基蛋白质/辅因子和生物素/(链霉)亲和素。此外，这些检验中的许多都包括具有与流动或固定的固相材料如乳胶珠、玻璃纤维、玻璃珠、纤维素条或硝化纤维素膜连接的结合对的一个或多个成员的装置(例如，固相，侧流测试条，流通试验)(美国专利No.4,703,017；4,743,560；5,073,484)。
免疫色谱分析法的一个主要类别是“三明治”测分析。一般而言，三明治免疫色谱程序需要将可能含有待分析的分析物，例如，抗类脂抗体的样品，与该分析物识别的抗原，例如，氧化心磷脂混合。抗原，即，检测试剂是流动的，并通常与标记或另一种信号试剂，如染色乳胶、胶态金属溶胶或放射性同位素连接。然后将该混合物施加到含有被所关注的分析物抗体识别的固定化抗原带或区的色谱介质中。色谱介质常常为类似于浸渍条的条的形式。当待分析的分子与检测试剂的复合物到达色谱介质上的固定抗原区时，发生了结合，并且检测试剂复合物被定位在该区。这表明了待分析分子的存在。该技术可以用来获得定量或半定量结果。
或者，三明治免疫分析需要将可能含有被关注的分析物，例如，抗类脂抗体的样品与识别该分析物的抗体，例如，蛋白A或山羊抗人二抗混合。该混合物中的二抗将是可流动的、标记的(用例如，酶，胶体金或其它)，并且起检测试剂的作用。如前述三明治免疫分析的实施例中所述，将该混合物施加到含有由被分析物识别的固定化抗原带或区的色谱介质时，可以检测被分析的分析物(如果存在)。
在测试条上进行的三明治免疫分析的例子在美国专利No.4,168,146和4,366,241中有描述，其各自引入本文作为参考。
固相免疫分析装置提供了对生物流体样品中分析物的敏感检测。固相免疫分析装置结合了固体支持物，配体-受体对中的一个成员，通常为抗体、抗原或半抗原与其结合。固体支持物的早期常见形式为放射免疫分析和酶免疫分析领域已知的聚苯乙烯板、管或珠。近来，许多多孔材料，如尼龙、硝化纤维素、醋酸纤维素、玻璃纤维和其它多孔聚合物已被用作固体支持物。在以一些家用妊娠和排卵检测试剂盒为代表的基于膜的免疫分析的其它常见形式中，测试条(或浸渍条)被“浸入”到怀疑含有主体分析物的样品中。然后同时或在孵育期过后加入酶标记的检测试剂。接着洗涤装置，然后插入到含有酶底物的第二溶液中。酶标记如果存在，与基体相互作用，导致有色产物的形成，该有色物质作为沉淀物沉积在固相上，或者在底物溶液中产生可见的颜色变化。EP-A 0 125 118描述了这样一种三明治型浸渍条免疫分析。EP-A 0 282 192描述了用于竞争型分析的浸渍条装置。
流通型免疫分析装置的设计部分避免了牵涉浸渍条分析的孵育和洗涤步骤的需要。流通免疫分析装置包括与多孔膜或滤器结合的俘获试剂(如氧化心磷脂-连接分子复合物)，液体样品被加入到该多孔膜或滤器中。当液体流经该膜时，靶分析物(如，抗类脂抗体)与俘获试剂结合。加入样品之后(或同时)加入检测试剂(如，金偶联的心磷脂，标记(例如，金偶联)蛋白A或标记(例如，金偶联)抗人IgG)。或者，检测试剂可以以允许检测剂与样品混合，从而标记分析物的方式置于膜上。检测试剂的视觉检测提供了关于样品中存在靶分析物的指示。美国专利No.4,246,339；4,277,560；4,632,901；4,812,293；4,920,046；和5,279,935；以及美国专利申请公布No.20030049857和20040241876中描述了代表性流通免疫测定装置。
迁移分析装置通常在其中合并了已连接有色标记的试剂，从而允许在不加入其它物质的条件下对分析结果进行视觉检测。参见，例如，美国专利No.4,770,853；PCT出版物No.WO 88/08534和欧洲专利No.EP-A 0 299 428。
现有许多市场上可买到的侧流型检验和专利公开方法，用于大分析物(MW大于1,000道尔顿)的检测。美国专利No.5,229,073描述了用于测量血浆脂蛋白水平的半定量竞争性侧流免疫分析法。该方法采用多个含有固定抗体的俘获区或线，以结合标记和游离脂蛋白，给出半定量结果。
美国专利No.5,591,645提供了具有至少两个部分的色谱测试条。第一部分包括可移动的示踪剂，第二部分包括能结合分析物的固定结合剂。用于大分析物的侧流检验的其它例子在以下专利文献中公开：美国专利No.4,168,146；4,366,241；4,855,240；4,861,711；和5,120,643；欧洲专利No.0296724；WO 97/06439；以及WO 98/36278。
还有用于检测小分析物(MW 100-1,000道尔顿)的侧流型检验。通常，这些小分析物的检验包括“典型”竞争性抑制，以产生阴性或间接报告的结果(即，随着分析物浓度的增加，信号减弱)，以美国专利No.4,703,017为例。然而，已为小分析物开发出数种方法，使用的是产生阳性或直接报告的结果(即，随着分析物浓度的增加，信号增强)的侧流试验检验。这些包括，例如，美国专利No.5,451,504；5,451,507；5,798,273；和6,001,658。
美国专利No.5,451,504提供了一种方法，具有三个各自含有不同胶乳偶联物的专门区(活动化，捕捉和检测)，以产生阳性信号。活动化区含有标记抗体，以结合样品中的分析物。在捕捉区中，未结合的标记抗体然后被固定化分析物的类似物捕捉。检测区俘获标记分析物-抗体复合物。
美国专利No.5,451,507描述了两区不连贯免疫检验法。第一区具有非扩散性结合的试剂，该试剂与组分，例如，结合或能变得结合信号产生系统成员的分析物类似物结合。第二区仅当待测试分析物存在时与组分结合。组分移行入第二区的距离与分析物的浓度直接相关。
美国专利No.5,798,273公开了包括带有固定化分析物类似物的俘获区和一个或多个结合标记分析物-类似物的读出区的侧流装置。
美国专利No.6,001,658公开了具有与分析物结合的可扩散的标记结合配偶体、固定化分析物和含有固定抗体的检测区域的测试条装置。
本文所述装置通常包括吸收性材料(如微孔膜)的条，在一些情况下，其可以由邻接和/或重叠的各区之间可以彼此连结的不同物质制成。在一些实施例中，例如，为了给吸收条提供增强的刚性，可以将吸收条固定在无相互作用的支持材料(如无纺聚酯)上。各吸收条内的区可以差异地含有特异性结合配偶体和/或为检测和/或量化被测试的特定分析物，例如，抗类脂抗体所需要的其它试剂。因此，这些区可以视为检验装置内的功能扇区或功能区。
一般而言，流体样品(或悬浮在流体中的样品)通过例如，浸渍或点样在测试条的近端被引入测试条。样品用本领域技术人员公知的方法收集或获得。含有待检测抗类脂抗体的样品可以获自任何生物源。生物源的例子包括人或动物的血清，血浆，尿，脊髓液，唾液，发酵液，淋巴液，组织培养液和腹水。样品在免疫分析前可以稀释，纯化，浓缩，过滤，溶解，悬浮或以其它方式处理，以优化免疫分析结果。流体经过测试条的所有功能区移向远端。流体在各个功能区的最终分布取决于所用材料的吸附容量和尺寸。
在一些实施方案中，上文所述的多孔固体支持物，如硝化纤维素，优选为片或条的形式。这种片或条的厚度可以在宽限度内变动，例如，约0.01至0.5mm，约0.02至0.45mm，约0.05至0.3mm，约0.075至0.25mm，约0.1至0.2mm或约0.11至0.15mm。这种片或条的孔径同样可以在宽限度内变动，例如，约0.025至15μm，或更尤其是约0.1至3μm；然而，并非要让孔径成为选择固体支持物的限制因素。固体支持物在适用之处的流速也可以在宽限度内变动，例如，约12.5至90秒/cm(即，50至300秒/4cm)，约22.5至62.5秒/cm(即，90至250秒/4cm)，约25至62.5秒/cm(即，100至250秒/4cm)，约37.5至62.5秒/cm(即，150至250秒/4cm)，或约50至62.5秒/cm(即，200至250秒/4cm)。在本文所述装置的具体实施方案中，流速为约62.5秒/cm(即，250秒/4cm)。在本文所述装置的其它具体实施方案中，流速为约37.5秒/cm(即，150秒/4cm)。
在免疫分析装置的应用中要考虑的另一个共同特征是检测分析物(如抗类脂抗体)与俘获试剂(如氧化心磷脂-连接分子复合物)间复合物的形成的方法。检测剂(也称作检测试剂)为该目的服务。检测剂可以整合入免疫分析装置(例如，如下文所述包括在偶联垫中)，或者可以从外源加入到装置中。
检测剂可以是单一试剂或共同为检测目的服务的系列试剂。在一些情况下，检测试剂是分析物特异性的标记结合配偶体(如，用于抗体分析物的金偶联蛋白A，或用于人抗体分析物的金-标记抗人Ab(Fc)，或用于抗类脂抗体分析物的金-标记氧化心磷脂)。在其它情况下，检测试剂共同包括分析物特异性的未标记第一结合配偶体和所述第一结合配偶体特异性的标记第二结合配偶体等。在各种情况下，检测试剂特异性检测分析物-俘获试剂复合物的结合分析物，因此，检测试剂优选基本上不与俘获试剂或位于分析物俘获区的其它组分结合或反应。这种检测剂的非特异性结合或反应可以提供假阳性结果。任选地，检测试剂可以特异性识别存在于第二俘获区的阳性对照分子(如标记蛋白A检测剂、或标记蛋白G检测剂、或标记抗人Ab(Fc)的非特异性人IgG)。
B.流通装置的构造和设计
流通装置包括固定在固体支持物，通常为微量滴定板或膜(如，硝化纤维素，尼龙或PVDF)上的俘获试剂(如氧化心磷脂-连接分子复合物)。先前已描述过可用膜的特征；然而，值得注意的是，在流通分析中，由于样品垂直移动通过膜而不是如侧流分析中那样横越过膜，因此毛细上升不是膜的特别重要的特征。在简单的代表性形式中，流通装置的膜被安排与吸收层(参见，例如，下文关于“吸收垫”的描述)功能或物理接触，所述吸收层起到贮器的作用，牵引流体样品通过膜。任选地，在固定俘获试剂后，可以封阻膜上任何剩余的蛋白结合位点(在给样之前或同时)，以使非特异性相互作用最小化。
在流通装置的操作中，将流体样品(如体液样品)置于与膜接触。通常，流通装置还包括接收和暂时保留所需体积的流体样品的加样区(或贮器)。样品通过膜基质。在该过程中，样品中的分析物(如抗类脂抗体)可以特异性地结合固定的俘获试剂(如氧化心磷脂-连接分子复合物)。当需要检测分析物-俘获试剂复合物时，可以加入检测试剂(如标记蛋白A，标记蛋白G，标记抗人IgG或标记心磷脂)和样品，或者可以在加样后加入含有检测试剂的溶液。如果分析物被俘获试剂特异性结合，则在膜表面上可以观察到可归因于特定检测试剂的视觉表现。在该过程的任何时间，例如，在加样后和/或在加入检测试剂后，都可以加入任选的洗涤步骤。
C.侧流装置的构造和设计
侧流装置是本领域常见的。简而言之，侧流装置是以测试条为其本质的分析装置，被怀疑含有感兴趣的分析物的供试流体样品流动通过该测试条。供试流体和任何混悬的分析物都可以沿测试条流向检测区，在检测区中，分析物(如果存在)与俘获剂和检测剂相互作用，以显示分析物的存在、不存在和/或量。
已公开了很多侧流分析装置，包括美国专利No.4,313,734；4,435,504；4,775,636；4,703,017；4,740,468；4,806,311；4,806,312；4,861,711；4,855,240；4,857,453；4,943,522；4,945,042；4,496,654；5,001,049；5,075,078；5,126,241；5,451,504；5,424,193；5,712,172；6,555,390；和6,368,876；EP 0810436；以及WO 92/12428；WO 94/01775；WO 95/16207；和WO 97/06439中所示侧流分析装置，其各自引入本文作为参考。
许多侧流装置是一步侧流分析，其中将生物流体置于吸水条(不过，可以使用非吸水材料，并且，例如，通过向该材料中加入表面活性剂来提供吸水性)上的样品区，并使其沿测试条移行，直至液体接触与该液体中的分析物相互作用的特异性结合配偶体。一旦分析物与结合配偶体相互作用，就有信号(如荧光或可以以其它可见的染料)显示发生了相互作用。测试条上可以放置多种分立的结合配偶体(例如，平行线)，以检测液体中的多种分析物。测试条中还可以结合对照指示剂，即使测试条上看不到显示分析物存在(或不存在)的阳性信号，也提供试验已充分完成的信号。
侧流装置的构造和设计是本领域公知的，如例如下文所述，Millipore Corporation，开发免疫色谱测试条的简介(A Short GuideDeveloping Immunochromatographic Test Strips)，第二版，第1-40页，1999，可通过(800)645-5476索取可得；以及Schleicher和Schuell，2003生物科学，产物和规范的简易操作(Easy to Work with BioScience，Products and Protocols 2003)，第73-98页，2003，2003可向Schleicher& Schuell BioScience，Inc.，10 Optical Avenue，Keene，NH 03431，(603)352-3810索取，这二者均引入本文作为参考。
侧流装置具有很多种同样为本领域所公知的物理形式。支持和/或容纳功能关系正确的侧流装置的基本组件的任何物理形式均包括在本公开内容中。图7显示了侧流装置的几个实施例。这些实施例表现了一些可用于侧流装置的构造的物理实施方案。
侧流装置的特定实施方案的基本组件在图8中说明，其显示的特定实施方案中，细长的外壳10装有基本延伸了该外壳10的全长的吸水侧流测试条12。侧流测试条12被分成位于进样口15下方的近端加样垫14、中间测试结果膜16和远端吸收垫18。侧流测试条12被含有标记偶联物(如金-偶联蛋白A，金-偶联蛋白G，金-偶联抗人Ab)的偶联物垫20中断。流动通道沿测试条12从近端垫14通过偶联物垫20进入测试结果膜16，最后收集在吸收垫18中。选择性结合剂(如锚抗体-脂质抗原复合物)定位在测试结果膜16的近端测试线22上。对照线24提供在测试结果膜16中稍微远于测试线22的位置。
在图8所示侧流装置的特定实施方案的操作中，含有感兴趣的分析物，如抗类脂抗体的流体样品通过进样口15加入到样品垫14中。在一些实施例中，样品可以逐滴加入进样口15，或者次优选通过将该装置的含有进样口15的一端浸入样品中。在样品为全血的其它实施例中，向血样中加入任选的显色液，以导致红细胞溶血，以及，在一些情况下，适当稀释全血样品。样品通过例如，毛细作用从样品垫14行进至偶联物垫20。在偶联物垫20中，感兴趣的分析物可以结合(或被结合)活动或可活动化的检测试剂。例如，抗类脂抗体分析物可以与包含在偶联物垫内的标记(例如，金-偶联)蛋白A或金-偶联心磷脂检测试剂结合。与检测试剂复合的分析物随后流向测试结果膜16，在那里，复合物进一步与固定在近端测试线22处的分析物-特异性结合配偶体(如氧化心磷脂-连接分子复合物)相互作用。在一些实施例中，与检测试剂(如，金-偶联心磷脂，标记(例如，金-偶联)蛋白A，标记(例如，金-偶联)蛋白G，标记(例如，金-偶联)抗人Ab)复合的抗类脂抗体可以进一步与固定在近端测试线22处的未标记的氧化心磷脂-连接分子复合物结合。抗类脂抗体、标记(例如，金-偶联)检测试剂和固定的氧化心磷脂-连接分子复合物间的免疫复合物的形成可以通过近端测试线22处出现可见的线条来检测，该可见线条来自标记(例如，金)在近端测试线22的局部区域累积的结果。对照线24包含可以在分析物存在或不存在的条件下结合检测试剂的固定的检测剂-试剂-特异性结合配偶体。对照线24处的这种结合即便在感兴趣的分析物不存在时也表明了检验的彻底完成。
在侧流装置的另一个实施方案中，测试结果膜16中可以有与测试线22平行或垂直(或以任何其它空间关系)设置的第二测试线。该特定实施方案的操作与前一段的所述相似，额外要考虑的是(i)对第二分析物如抗梅毒密螺旋体抗体或梅毒密螺旋体生物或抗原特异的第二检测试剂也可包含在偶联物垫中，以及(ii)第二测试线将包含对样品中的第二分析物具有亲和力的第二特异性结合配偶体。例如，第二测试线可以含有将特异性结合样品中存在的抗梅毒密螺旋体抗体的固定的密螺旋体抗原，或者含有将特异性结合样品中存在的梅毒密螺旋体抗原或生物的固定的抗梅毒密螺旋体抗体。
表1中显示了可用于侧流装置组件的一些材料。然而，本领域技术人员将了解，用于具体侧流装置的具体材料将取决于多种变量，包括，例如，待检测分析物，样品体积，所需流速及其它，因此，可以按常规选择可用材料。表1.
  部件   可用材料
样品垫   玻璃纤维织造纤维筛网无纺纤维纤维素滤纸纸
表1.
  部件   可用材料
偶联物垫   玻璃纤维聚酯纸表面改性的聚丙烯
膜   硝化纤维素(包括纯硝化纤维素和改性硝化纤维素)直接浇注在聚酯支持物上的硝化纤维素聚偏氟乙烯尼龙
吸收垫   纤维素滤纸纸
1.样品垫
样品垫(如图8中的样品垫14)是侧流装置的任选部件，其最初接收样品，并起到从样品中除去微粒的作用。在可用来构建样品垫的各种材料(见表1)中，如果较大的床体积(例如，250μl/cm2)是特定应用的因素，则纤维素样品垫是有益的。样品垫可以用一种或多种释放剂处理，如缓冲剂、盐、蛋白质、洗涤剂和表面活性剂。这些释放剂对例如，促进偶联物垫成分的再溶解，以及阻断侧流装置的其它组件如硝化纤维素膜中的非特异性结合位点有用。代表性释放剂包括，例如，海藻糖或葡萄糖(1％-5％)，PVP或PVA(0.5％-2％)，吐温20或Triton X-100(0.1％-1％)，酪蛋白(1％-2％)，SDS(0.02％-5％)和PEG(0.02％-5％)。
2.膜和施加溶液：
前面已经讨论过了可用于侧流装置的膜的类型(如硝化纤维素，尼龙和PVDF)以及对将俘获试剂加入这些膜的考虑。
3.偶联物垫
偶联物垫(如图8中的偶联物垫20)尤其起到容纳检测试剂的作用。在一些实施方案中，检测试剂可以从例如，显色剂瓶外加，在这种情况下，侧流装置不需要包含偶联物垫(参见，例如，美国专利No.4,740,468)。
偶联物垫中包含的检测试剂通常在供试样品加样后释放入溶液。偶联物垫可以用各种物质处理，以影响检测试剂释放进入溶液。例如，偶联物垫可以用PVA或PVP(0.5％-2％)和/或Triton X-100(0.5％)处理。其它释放剂包括但不限于羟丙甲基纤维素，SDS，Brij和β-乳糖。两种以上释放剂的混合物可以在任何指定应用中使用。在具体公开的实施方案中，偶联物垫20中的检测试剂是金-偶联的氧化心磷脂、标记蛋白A、标记蛋白G或标记抗人IgG。
4.吸收垫
侧流装置中吸收垫18的使用是任选的。吸收垫起增加进入装置的样品的总体积的作用。这种体积的增加对例如，从膜上洗去未结合的分析物有用。多种材料都可以用来制备吸收垫，参见，例如，表1。在一些装置的实施方案中，吸收垫可以是纸(即，纤维素纤维)。本领域技术人员可以根据，例如，厚度、可压性、可制造性和床体积的均一性选择纸吸收垫。制成的吸收剂的吸收体积可以通过改变吸收垫的尺寸(通常为长度)来进行调整。
D.抗原包被的微量滴定板
其它常见的基于固体表面的免疫分析是各种形式的免疫吸附分析，如酶联免疫吸附分析(或ELISA)。这些分析通常包括加在微量滴定板的孔中的抗原(例如，氧化心磷脂-连接分子复合物)。在该分析中，可能含有感兴趣的分析物(例如，抗类脂抗体)的供试样品(例如，血清或血液)被置于微量滴定板的孔中，所述孔中含有对主体分析物特异的固定的结合配偶体(例如，氧化心磷脂-连接分子复合物)。分析物特异性结合固定抗原；然后，洗去未结合的材料，主要留下已结合至板上的分析物-抗原复合物。如上文已详细描述的那样，该复合物可以通过多种方式检测。微量滴定板形式的一个优势是多个样品可以各自在同一个板的一个或多个不同孔中同时(与对照一起)进行测试；因此，可以对许多样品进行高通量分析。
E.抗原组合
在一些实施方案中，本文所讨论的各个免疫分析法和/或免疫分析装置(例如，ELISA，浸渍条，流通装置或侧流装置)可以通过添加对感兴趣的其它分析物(例如，密螺旋体抗原)特异的俘获试剂设计成检测多个分析物的形式。例如，微量滴定板的某些孔可以包括对感兴趣的其它分析物特异的俘获试剂。一些免疫分析装置的实施方案可以包括含有对感兴趣的其它分析物特异的俘获试剂的第二、第三或更多的俘获区。
特定实施方案包括同时检测流体样品(如，人血清)中的抗类脂抗体和密螺旋体或抗密螺旋体抗体的免疫分析装置。这种组合装置进一步包括密螺旋体俘获区，该俘获区含有(a)能被抗梅毒密螺旋体抗体特异性结合的固定密螺旋体抗原，或(b)特异性结合活动的密螺旋体抗原的固定抗梅毒密螺旋体抗体。本文用到的“密螺旋体抗原”是含有至少一个特异性结合抗梅毒密螺旋体抗体的抗原决定簇的抗原。本领域已公开了许多密螺旋体抗原；参见，例如，美国专利No.6,479,248；6,248,331；5,681,934；5,578,456；4,868,118；和4,740,467。例如，具有至少以下表观分子量的多肽已被描述为梅毒密螺旋体抗原：16-20kDa，18kDa，18-23kDa，25kDa，35kDa，37kDa，37-46kDa，38kDa，39kDa，41kDa，43kDa，44kDa，46kDa，47kDa，58kDa，150kDa；和180kDa(更多具体细节请参见美国专利No.4,846,118)。
密螺旋体抗原和抗梅毒密螺旋体抗体是多肽；因此，当用作俘获试剂时，这些分子可以直接粘附于固体支持物(如，硝化纤维素，尼龙或PVDF)。但是，预期密螺旋体抗原或抗梅毒密螺旋体抗体可以通过任何可用方法固定(直接或间接)在固体支持物上。
检测试剂可以用来检测密螺旋体俘获试剂和密螺旋体-特异性分析物(如，密螺旋体，密螺旋体抗原或抗密螺旋体抗体)间复合物的形成。在一些实施方案中，检测试剂(如抗人Ab)可以特异性检测结合的密螺旋体-特异性分析物(例如，人抗密螺旋体抗体)和结合的抗类脂抗体分析物(例如，人抗类脂抗体)。在其它情况下，设想了用于特异性检测结合的密螺旋体-特异性分析物(例如，抗密螺旋体抗体或密螺旋体抗原)或结合的抗类脂抗体分析物的两种独立的检测试剂。
用于同时进行密螺旋体和非密螺旋体检验的免疫分析装置的操作基本上与本说明书中别处所述的装置相似。组合装置的一个具体特征是加入加样区的流体样品能接触(例如，流向或流经)各个抗类脂抗体俘获区和密螺旋体俘获区。
其它免疫分析和免疫分析装置的实施方案包括含氧化心磷脂的抗原(例如，氧化心磷脂-连接分子复合物)与其它对抗类脂抗体特异的抗原的组合物；例如，包括心磷脂、卵磷脂和胆固醇的固定化脂质抗原。脂质抗原的固定在PCT/US2006/024117中详细描述，其以全文引入本文作为参考。在一个实施例中，包含心磷脂(例如，天然或合成心磷脂)、卵磷脂和胆固醇的脂质抗原与对该脂质抗原特异的Fab片段类群接触，以提供脂质抗原-Fab复合物，该复合物与含氧化心磷脂的抗原组合，可以容易地与固体支持物连接。
VII.试剂盒
本文公开了用于检测样品(如，生物样品)中的抗类脂抗体的试剂盒。这种试剂盒还可以用于例如，诊断抗类脂抗体的存在是疾病(如，梅毒或狼疮)的症状的疾病。所公开试剂盒的某些实施方案通常为便携式的，并且提供了简单、快速和/或有成本效益的方式，在不需要实验室设备的条件下，如在护理现场设备中检测抗类脂抗体和/或诊断疾病(如梅毒)。
试剂盒包括一种或多种本文所公开的免疫分析装置(和/或抗原包被的微量滴定板)和载体工具，如盒，袋，包，塑料盒(如模制塑料或其它透明包装)，包装纸(如，封口或可封口塑料，纸或金属包装纸)或其它容器。在一些实施例中，试剂盒的组件封装在单个包装单元，如盒或其它容器中，该包装单元可以具有可以放置该试剂盒的一个或多个组件的格。在其它实施例中，试剂盒包括一个或多个容器，例如小瓶、试管等，其可以保留，例如，一个或多个待测试生物样品、阳性和/或阴性对照样品或溶液(如，含有抗脂质或密螺旋体抗体的阳性对照血清)、稀释剂(如，磷酸盐缓冲液或盐水缓冲液)、检测试剂(例如，用于外加至试剂盒装置)，为使检测试剂酶可视化的底物试剂(如，5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐，氮蓝四唑的二甲基甲酰胺)和/或洗涤液(如，Tris缓冲液，盐水缓冲液或蒸馏水)的瓶，管等。
其它试剂盒的实施方案包括注射器，扎手指装置，酒精拭子，纱布块，棉球，绷带，乳胶手套，具有不定数量的槽的孵育盘，胶粘性板密封材料，数据报告单，其可用于处理、收集和/或加工生物样品。试剂盒还任选含有用于将样品引入免疫分析装置的样品室的工具，包括，例如，滴管，Dispo吸量管，毛细管，橡胶球(例如，供毛细管用的)等。其它试剂盒的实施方案可以包括供丢弃用过的免疫分析装置和/或其它与该装置一起使用的物品(如患者的样品等)的弃置工具。这些弃置工具可以包括但不限于能容纳被弃材料的渗漏的容器，如塑料、金属或其它不渗透的袋子、盒或容器。
在一些实施例中，所公开的试剂盒包括使用免疫分析装置或抗原包被板的说明书。该说明书可以提供如何将样品加入试验装置或板的指导，等待结果显现所必需或可取的时间量，以及如何读取和解释试验结果的细节。这些说明书还可以包含标准，如用于比较检验结果的标准表、图或照片。这些标准任选包括用该检验装置定量分析物的所必需的信息，如信号强度或信号线数量与因此存在于样品中的分析物的量的关系的标准曲线。
实施例
为说明某些具体特征和/或实施方案，提供了以下实施例。这些实施例不应被解释为将本发明限制于所述具体特征和/或实施方案。
实施例1
心磷脂的氧化
本实施例描述了未改性心磷脂的不饱和脂肪酸中的双键氧化成羧基。
在氩气氛下，将约100mg冻干的心磷脂(Avanti PolarLipids(Alabaster，AL))溶解在2ml正丁醇中，并置于小瓶中。将60mg偏高碘酸钠(NaIO4)溶解在600μl蒸馏水中，并在不断搅棒下逐滴加入到心磷脂悬浮液中。之后迅速在不断搅棒下将8mg溶解在400μl蒸馏水中的高锰酸钾(KMnO4)逐滴加入到NaIO4反应混合物中。混合物变色(图1B)，让其室温混合24-48h。
通过薄层色谱(TLC)定性测定心磷脂氧化的程度。将约10ml氯仿∶甲醇∶氢氧化铵溶液(61.9∶30.9∶7.1，体积比)置于100ml烧杯中。将折叠的滤纸置于烧杯内，使其变得浸透溶剂。
将1μl NaIO4/KMnO4反应混合物和1μl 20mg/ml的心磷脂正丁醇(对照)溶液置于距7.5cm×2.5cm的TLC硅胶测试条的末端1cm处。该测试条靠着烧杯内的滤纸放置，使溶剂移行至测试条顶端。
从溶剂中取出测试条，使其蒸发至干。之后通过短暂浸没于含有至少10ml钼蓝(Spray Reagent；Alltech；产品号18213)的50ml 5％乙醇中，使测试条湿润。用电吹风帮助将测试条加热干燥，以使色斑显现。
完成心磷脂氧化后，在不断搅棒下通过加入80mg亚硫酸氢钠的200μl蒸馏水，停止NaIO4/KMnO4反应混合物反应。然后有色混合物变成无色(比较图1B和图1C)。停止反应的混合物以1000×g离心5min。离心后，可见两相(图1D)。
任选地，将上清正丁醇相置于蒸发圆底烧瓶中，并在真空下干燥。或者，正丁醇相用10mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)或其它缓冲液透析，将醇溶剂置换成适于其中含有氧化心磷脂的下一个计划应用的溶液，例如，在免疫色谱分析中使用，或者，例如，与连接分子偶联。
如图2所示，正如泳道A中距离原点最远的黑斑所表明的那样，未改性心磷脂主要迁移至TLC测试条的顶端。如章节IV中所述，心磷脂天然包括分子的异质群体。由于亚油酸占心磷脂的脂肪酸侧链的约90％，因此图2泳道A中的黑斑可能代表主要含亚油酸的心磷脂分子(以及密切相关的心磷脂形式)。较少表现的心磷脂形式很可能具有不同迁移率，并可以解释在迁移的方向上泳道A中观察到的轻微污迹。
如前所示，心磷脂的氧化氧化了烯烃，裂解了脂肪酸侧链，并向一条或多条脂肪酸侧链中引入了羧基。氧化心磷脂中存在的羧基与TLC测试条的氧化硅基质的相互作用更强，这阻碍了氧化心磷脂形式沿测试条的迁移。因此，在氧化心磷脂制品(见图2，泳道B和D1)中，迁移方向上的污迹变得更显著(比较泳道A与泳道B和D1)。此外，脂肪酸侧链的氧化裂解产生了烷基羧化物，其在这些条件下在TLC测试条上具有的迁移率很小。如图2的泳道B和D2所示，认为与原点同延的白斑(由于染料排斥)代表羧化物。如本实施例中所述进行心磷脂氧化后，心磷脂的氧化形式主要存在于正丁醇相(在图2，泳道D1中显示)中，而烷基羧化物则主要存在于水相(见图2，泳道D2)。
如通过与梅毒血清的反应性(参见，例如，实施例4)判断的那样，上层正丁醇相(“醇相”)(见图2，泳道D1)含有氧化心磷脂种类，而下层水相(见图2，泳道D2)根据TLC结果，被认为主要含有丙二酸和己酸副产物的混合物。
实施例2
氧化心磷脂的活化和与连接分子的偶联
本实施例说明了用EDC和NHS使氧化心磷脂与BSA或KLH偶联的几种方法。
A.方法一
实施例1中所述正丁醇相完全蒸发后，将干燥的氧化心磷脂制品悬浮在2ml N，N-甲酰胺中，使浓度约为25mg/ml。10mg EDC和10mg NHS溶解在1ml蒸馏水。然后向含氧化心磷脂的甲酰胺溶液中加入EDC/NHS溶液。所得混合物室温搅棒1h。如本领域技术人员了解的那样，EDC和NHS将使氧化心磷脂中的羧基转化为胺反应性NHS酯。
向EDC/NHS/氧化心磷脂混合物中加入高至40倍摩尔过量的BSA或KLH，混合物室温搅棒1h。优选加入约1ml 5mg/ml的KLH或BSA溶液。随着反应混合物中BSA或KLH的量的增加(例如，至10mg/ml或更高)，蛋白质组分更有可能出现自身交联，这将导致沉淀的出现。在这件事件中，必须将沉淀离心分离并丢弃。
需要时，使反应混合物澄清，然后用1L 10mM的磷酸盐缓冲液(pH 8.0)两次更替(two，one-liter changes)透析。制品通过膜过滤(Centricon filter；Millipore)浓缩至氧化心磷脂为约10mg/ml。氧化心磷脂溶液可在2-8℃或-20℃储存至需要时。
B.方法二
实施例1中所述的正丁醇相完全蒸发后，将干燥的氧化心磷脂制品悬浮于2ml N，N-甲酰胺，使浓度为约25mg/ml。然后该甲酰胺混合物用1L的10mM的磷酸盐缓冲液(pH 8.0)两次更替透析，接着如本实施例的方法一中所述加入EDC/NHS溶液。加入EDC/NHS溶液后的步骤与方法一中所述相同。
C.方法三
实施例1中所述正丁醇相用10mM的磷酸盐缓冲液(pH8.0)透析，然后冷冻干燥，制得氧化心磷脂制品。为了用于后来的反应，冻干的氧化心磷脂用水复溶至约25mg/ml。然后向氧化心磷脂溶液中加入用1ml蒸馏水溶解的10mg EDC和10mg NHS，同时室温搅棒1h。加入EDC/NHS溶液后的步骤与方法一中所述相同。
实施例3
氧化心磷脂的生物素化
本实施例描述了氧化心磷脂的生物素化。
将10mg氧化心磷脂(见实施例1)溶解在1ml 100mM的N-吗啉代乙磺酸(MES)中。向氧化心磷脂溶液中加入100μl 20mg/ml的生物素-PEO-胺。之后立即向生物素/心磷脂混合物中加入25μl新制的1mg/ml EDC溶液，所得溶液室温混合2h。然后反应混合物用10mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)两次更替透析。生物素化产物通过冷冻干燥浓缩，之后可以用蒸馏水复溶至所需浓度，例如，10mg/ml。
实施例4
心磷脂制品的抗原性
本实施例证明了如实施例1制备的氧化心磷脂在用两种免疫分析测试梅毒血清时保留了抗原性。
A.RPR抑制试验
将100μl梅毒血清(Lot 50L)与50μl表2中所述的氧化心磷脂-BSA或-KLH制品(约2.5-5mg/ml)混合。如果氧化心磷脂制品保留了抗原性，则血清中存在的抗类脂抗体将与氧化心磷脂制品特异性结合，这将起到减少可用的抗类脂抗体结合位点的数量的作用。换言之，血清将被“剥夺”部分或所有抗类脂抗体结合位点。已被剥夺抗类脂抗体结合位点的血清在常规RPR试验中测试时反应性将较小。表2.氧化心磷脂制品
Figure S200680051254XD00531
根据梅毒试验手册(Manual of Tests for Syphilis)，第9版，Washington，DC：American Public Health Association，1998的第10章，用RPR试验对被剥夺(和对照)血清进行测试。
如表3所示，其中加入了50μl 5mg/ml的未偶联BSA的对照梅毒血清，与RPR试验抗原以1∶8的血清稀释度反应。梅毒血清与各心磷脂制品1-12(在表2中描述)的孵育抑制了该血清与RPR试验抗原的反应性至少2倍。该结果表明，各心磷脂制品均与试验梅毒血清中存在的抗类脂抗体发生了一定程度的反应，从而抑制了被剥夺的血清与RPT试验抗原的反应。例如，梅毒试验血清与心磷脂制品2、11和12的预孵育完全抑制了该血清在RPR试验中的反应性。表3.RPR抑制试验结果
Figure S200680051254XD00541
*见表2对心磷脂制品的描述R＝强阳性反应R(-)＝阳性反应Rm＝弱反应Rm(-)＝非常弱的反应N＝阴性反应
B.免疫印迹试验
用带有山羊抗人IgG碱性磷酸酶偶联物的Immun-Blot
Figure S200680051254XD00551
分析试剂盒(BioRad)，按照制造商的说明书，进行斑点印迹分析。如图5所示，氧化心磷脂-BSA制品5(见表2)与梅毒血清(Lot 00)在宽范围的抗原(7.5-120μg)和抗体(1∶10-1∶640稀释)浓度内反应。相比之下，制品5在同样的抗原和抗体浓度范围内一点也不与正常人血清(即，非梅毒血清)反应。
图5还显示血清Lot 00(1∶640稀释)与全细胞梅毒密螺旋体制品发生了反应，这证实血清供体已感染了梅毒密螺旋体。
实施例5
氧化心磷脂金偶联物制品
本实施例说明了氧化心磷脂-BSA或-KLH与胶体金的偶联，以及这种金偶联物制品的可用条件的确定。该胶体金制品可以在侧流条，如结合图7描述的侧流条中用作偶联物。
A.氧化心磷脂/胶体金偶联反应的有效pH的测定
将约25ml 10mM的磷酸盐缓冲液置于50ml烧杯中，用0.2M磷酸调节至pH 5.0。将2份0.5ml该pH 5.0的缓冲液转移至2支12×75mm的试管中，一支标记“试验”，另一支标记“对照”。然后，用0.2M碳酸钾依次将烧杯中剩下的磷酸盐缓冲液的pH调节至5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5和10.0。如对pH 5.0的样品所述那样，将2份0.5ml的各pH的缓冲液转移至“试验”和“对照”管中。
向各“试验”和“对照”管中加入按实施例2所述制备的6μL 5mg/ml的心磷脂-BSA制品或5mg/ml的心磷脂-KLH制品(30μg)，混匀。
将约25ml 40nm的胶体金(1％溶液)(British BiocellInternational，伦敦，英国)置于单独的50ml烧杯中，如上文所述产生一系列pH为5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5和10.0的“对照”和“试验”胶体金样品。
将1ml各pH的胶体金加入到具有相应pH的“试验”和“对照”心磷脂溶液中。将金/心磷脂溶液混匀，室温孵育20min。然后，向标记有“试验”的一组管中加入200μL 2M NaCl，向标记有“对照”的一组管中加入200μL蒸馏水。将两组管的内容物室温孵育30min。
在580nm处读取各“试验”样品对相应“对照”样品的光密度(OD580)。具有最低OD580的样品的pH确定为适合形成氧化心磷脂-BSA或-KLH制品的金偶联物的pH。
胶体金颗粒由于制造过程中被吸附到金颗粒表面上的阴离子层而具有带负电荷的表面。蛋白质，如氧化心磷脂-BSA或-KLH制品中的BSA或KLH，将通过离子、疏水和配价(dative)相互作用吸引至带负电荷的金颗粒上。这些相互作用成为胶体金-蛋白质偶联物形成的基础。在与金颗粒偶联的蛋白质的pI(即，蛋白质具有净零电荷时的pH)时，偶联物将是最稳定的。
向未偶联胶体金颗粒中加入NaCl将破坏吸附在金表面的带负电荷的离子层。结果，金颗粒将离解，并最后向溶液中释放金离子(即，Au+)。游离金离子可以在OD580处测量。相反，蛋白质-金偶联物(例如，氧化心磷脂-BSA-金偶联物或氧化心磷脂-KLH-金偶联物)在偶联物的蛋白组分的pI(例如，氧化心磷脂-BSA的pI或氧化心磷脂-KLH的pI)处能抵抗NaCl的破坏。因此，在本实施例中，选择具有最低OD580的样品的pH。
由于各氧化心磷脂-连接分子(例如，氧化心磷脂-BSA或氧化心磷脂-KLH)制品中心磷脂与连接分子的摩尔比可能不同，因此各个所述制品的pI也可能不同。因此，如本实施例中所述，测定制备的各氧化心磷脂-连接分子制品的有效pH是有益的。
B.可用于与胶体金偶联反应的心磷脂-BSA或心磷脂-KLH浓度的测定
向一个系列的11支12×75mm的试管中加入100μl蒸馏水。然后将1μl，2μl，5μl，7μl，10μl，15μl，25μl，50μl，75μl或100μl的1mg/ml心磷脂-BSA或心磷脂-KLH溶液加入到系列的相应管中。系列的第11管作为对照。将各管混匀，并室温孵育5min。此时，各管中的溶液为红色。然后向各管中加入500μl 10％的NaCl溶液，同时振摇，试管再次在室温孵育5min。用眼睛观察各管溶液的颜色，加入NaCl后有一些从红色变成了蓝色。对稳定金偶联物有用的心磷脂-连接分子的最小量确定为加入NaCl后蓝色溶液中心磷脂-连接分子的最低浓度。
更高浓度的氧化心磷脂-连接分子复合物虽然可用，但却是不优选的，因为过量的氧化心磷脂-连接分子复合物可能通过例如，在先前与金颗粒缔合的心磷脂-连接分子复合物层上形成层，与金颗粒形成弱缔合。
类似地，更低浓度的氧化心磷脂-连接分子复合物可用，但却不是优选的，因为在金-偶联心磷脂-连接复合物的其它应用中，未偶联的金颗粒可能提供背景“噪声”。或者，可以用本领域公知方法，如离心或过滤，可以将未偶联的金颗粒从金-偶联的心磷脂-连接分子复合物中分离出来。
C.心磷脂-BSA或心磷脂-KLH金偶联物的少量制备
对具体的氧化心磷脂-BSA或-KLH制品，可如上文所述，确定有效pH和有效的氧化心磷脂-BSA或氧化心磷脂-KLH浓度。如果有效pH是pH 8.0或更高，则向达到有效浓度所必需的量的冻干氧化心磷脂-连接分子复合物中加入5ml 10mM的硼酸盐缓冲液；然后，调节pH至有效pH。如果有效pH是pH 8.0或更低，则向达到有效浓度所必需的量的冻干氧化心磷脂-连接分子复合物中加入5ml 10mM的磷酸盐缓冲液；然后，调节pH至有效pH。接着加入10ml 40nm的胶体金(调节至有效pH的1％溶液)，混匀。混合物室温孵育20min。然后加入1.6ml 10％BSA，使BSA最终浓度为1％，并另外室温孵育20min。反应混合物在6500×g离心10min，除去上清液。将沉淀重新悬浮在0.5ml重悬浮缓冲液(150mM NaCl，20mM Trizma base，10％蔗糖，5％海藻糖，0.1％BSA，0.05％叠氮化纳)中。重悬浮后的含有金偶联的氧化心磷脂-BSA或-KLH的沉淀可用于多种目的，包括但不限于在侧流装置中作为抗类脂抗体的检测试剂。
实施例6
心磷脂-连接分子复合物与硝化纤维素的连接
本实施例描述了用于将心磷脂-蛋白质复合物与固体表面，在本情况下为硝化纤维素，连接的代表性方法。
对具体的氧化心磷脂-BSA或-KLH制品，如之前所述测定有效pH。将冻干的氧化心磷脂-BSA或-KLH复合物重悬浮于10mM醋酸钠缓冲液(有效pH的值为4.0-5.6)或10mM磷酸盐缓冲液(有效pH的值在7.0-9.0之间)中。调节溶液至有效pH，2M醋酸用于pH值4.0-5.6之间，或1M磷酸二氢钠或磷酸氢二钠用于pH值7.0-9.0之间。可以向氧化心磷脂溶液中任选加入乙醇(0.5％)，以通过降低溶液粘度来改善试剂的应用。然后，按照制造商的指导，用Matrix 1600试剂分配模块(reagent dispensing module)(Kinematic Automation，Twain Harte，CA)，将氧化心磷脂-BSA或-KLH溶液施加于硝化纤维素。
将氧化心磷脂-BSA或-KLH制品施加于硝化纤维素后，该膜应在37℃干燥30min，然后在用于例如在侧流装置中之前，在真空干燥器中2h。
实施例7
用氧化心磷脂-蛋白质偶联物俘获试剂检测人血清中的抗类脂抗体
本实施例证明了梅毒血清中的抗类脂抗体可以用固定在硝化纤维素膜上的氧化心磷脂-蛋白质偶联物俘获试剂配合活动的氧化心磷脂-蛋白质-金偶联物检测试剂进行检测。
将1μl制品1-17(如表2所述)各施加到单独的实施例6中所述的硝化纤维素膜中，待用。如实施例5所述用氧化心磷脂制品6(见表2)制备胶体金偶联物。
将梅毒血清(Lot 00)或非反应性(正常人)血清按1∶10稀释，置于40孔微量滴定板的适当数量的单独的孔中。然后向各孔中加入3μl金-偶联制品6(用作检测试剂)。接着将含有各固定化制品1-17(见表2)的硝化纤维素条放入含有抗体和检测试剂溶液的孔中。孔中的溶液通过毛细作用流上测试条。各固定化的氧化心磷脂制品对梅毒和非反应性(即，对照)血清进行测试。
如表4所示，许多固定在硝化纤维素内或上的氧化心磷脂制品显示了阳性反应，这表明了固定化的氧化心磷脂俘获试剂、至少一种抗类脂抗体和氧化心磷脂金偶联物检测试剂间的“三明治”复合物。以0(阴性)-4+的等级测量反应性，4+表示在硝化纤维素条上观察到的最强信号。表4.
心磷脂制品   反应性血清Lot 00 非反应性血清
  1   2+   阴性
  2   +/-   +/-
  3   1+   阴性
  4   1+   阴性
  5   4+   阴性
  6   2+   阴性
  7   1+   +/-
  8   1+   阴性
  9   +/-   +/-
  10   +/-   +/-
  11   2+   阴性
  12   1+   阴性
实施例8
心磷脂和卵磷脂的混合物的氧化
本实施例描述了心磷脂和卵磷脂的混合物的氧化，并证明了氧化的心磷脂和卵磷脂混合物与实施例4-7所述分析中表现得至少与单独的氧化心磷脂一样出色。
将心磷脂和卵磷脂以重量计1∶1、1∶3和1∶5的心磷脂对卵磷脂的比例混合在一起。然后如实施例1所述将混合物氧化。如图8的泳道A所示，未改性的心磷脂和未改性的卵磷脂的混合物在TLC条上分成两个斑点。如距离原点最远的黑斑表明的那样(见图2，泳道A)，未改性的心磷脂迁移至TLC条的顶端。未改性的卵磷脂在TLC上迁移较慢，显示为约在心磷脂和原点中间的黑斑。
如前所述，在实施例1的条件下进行的氧化氧化了烯烃，裂解了脂肪酸侧链，并向心磷脂和卵磷脂的一条或多条脂肪酸侧链中引入了羧基。氧化的分子中存在的羧基与TLC条的氧化硅基体的相互作用更强，这阻碍了氧化形式沿条的迁移。因此，在心磷脂和卵磷脂的氧化混合物中，观察到了迁移方向上的显著污迹(见图8，泳道B和C)。此外，脂肪酸侧链的氧化裂解产生了烷基羧化物，其在这些条件下在TLC条上的迁移率很小。如图8的泳道D明显看出，羧化物被认为由与原点同延的白斑(由于染料排斥)所代表。如本实施例中所述心磷脂/卵磷脂混合物氧化后，心磷脂的氧化形式主要存在于正丁醇相(在图8，泳道C中显示)中，而烷基羧化物则主要存在于水相(见图8，泳道D)。
A.氧化心磷脂/卵磷脂混合物的BSA和KLH偶联物
如实施例2的方法3所述，将心磷脂和卵磷脂的氧化混合物与BSA或KLH偶联。表5中描述了BSA-或KLH-偶联的心磷脂/卵磷脂制品。表5.心磷脂/卵磷脂混合物
  心磷脂(CL)卵磷脂(L)制品号   CL∶L比率(重量)   连接分子   每次反应的连接分子的量(mg)
  C/L1   1∶1   BSA   5
  C/L2   1∶1   BSA   2
  C/L3   1∶1   KLH   2
  C/L4   1∶1   KLH   1
  C/L5   1∶3   BSA   5
  C/L6   1∶3   BSA   2
  C/L7   1∶3   KLH   2
  C/L8   1∶3   KLH   1
表5.心磷脂/卵磷脂混合物
  心磷脂(CL)卵磷脂(L)制品号   CL∶L比率(重量) 连接分子   每次反应的连接分子的量(mg)
  C/L9   1∶5   BSA   5
  C/L10   1∶5   BSA   2
  C/L11   1∶5   KLH   2
  C/L12   1∶5   KLH   1
B.氧化的心磷脂/卵磷脂混合物的RPR抑制试验
如实施例3中所述，用RPR抑制试验测试表5中所述心磷脂/卵磷脂制品的抗原性。如表6所示，各心磷脂/卵磷脂制品完全抑制了传统RPR试验中梅毒血清的反应性。表6.心磷脂/卵磷脂混合物的RPR抑制试验结果R＝强阳性反应R(-)＝阳性反应Rm＝弱反应Rm(-)＝非常弱的反应N＝阴性反应
此结果证明，氧化心磷脂/卵磷脂混合物非常有效地从梅毒血清中剥夺(即，除去)了抗类脂抗体，以致该血清在传统RPR试验中无反应性。
C.氧化的心磷脂/卵磷脂混合物的免疫斑点测试
用带有山羊抗人IgG碱性磷酸酶偶联物的Immun-Blot
Figure S200680051254XD00631
分析试剂盒(BioRad)，按照制造商的说明书进行斑点印迹分析。如图10所示，氧化的心磷脂/卵磷脂混合物在375ng-21μg/斑点的范围内与梅毒血清(Lot 94265；1∶50稀释)反应。相比之下，测试量的氧化心磷脂/卵磷脂制品无一显示与正常人血清(即，非梅毒血清)有任何明显的反应。
心磷脂和卵磷脂以1∶1的比例(按重量计)氧化并然后与BSA或KLH偶联的制品(即，1∶1BSA和1∶1KLH)与梅毒血清的反应性最强。本分析中，少至375ng的1∶1BSA制品和656ng的1∶1KLH制品与梅毒血清中存在的人抗体结合。
实施例9
用蛋白A或抗人抗体俘获试剂检测人血清中的抗类脂抗体
本实施例证明了存在于人血清中的抗类脂抗体可以用固定在硝化纤维素膜上的蛋白A或抗人抗体俘获试剂配合活动的氧化心磷脂-蛋白质-金偶联物检测试剂进行检测。
从被认为处于产生血清水平的抗类脂抗体的病症风险下的人类对象收集全血。这些病症包括，例如，梅毒密螺旋体感染(即，梅毒)或狼疮。通过本领域公知方法，从全血分离血清。用例如，生理盐水或其它不使其变性或以其它方式影响血清中存在的抗类脂抗体的特异性结合或以其它方式干扰所述方法的溶液稀释血清。
将血清样品加到含有移动或可移动的标记的氧化心磷脂-蛋白质偶联物检测试剂的硝化纤维素条上。该偶联物可以是，例如，金标记的氧化心磷脂-BSA，或金标记的氧化心磷脂-KLH偶联物，或氧化心磷脂和氧化卵磷脂的金标记的BSA偶联混合物，或氧化心磷脂和氧化卵磷脂的金标记的KLH偶联混合物。
血清样品中存在的抗类脂抗体将与检测试剂的心磷脂结合，并流向(如通过毛细作用，或通过侧流力)硝化纤维素条中固定了蛋白A或抗人抗体俘获试剂的部分。与心磷脂检测试剂复合的抗类脂抗体将被蛋白A或抗人抗体俘获试剂俘获。以这种方式累积检测试剂复合物将导致硝化纤维素上在固定了俘获试剂的区域中出现可检测的信号(例如，可见信号)。
所述可检测信号的出现表明血清样品中存在抗类脂抗体，并可用于某些病症如梅毒或狼疮的诊断。
实施例10
用酶联免疫分析检测人血清中的抗类脂抗体
本实施例证明了人血清中存在的抗类脂抗体可以用固定在用于进行酶联免疫分析的微量滴定板中的、与BSA或KLH偶联的氧化心磷脂作为俘获试剂进行检测。BSA和KLH的替代物包括合成蛋白MAPS，IgY，链霉亲和素和亲和素。将96孔微量滴定板的孔用100μl(10μg/ml)含有10μg/ml氧化心磷脂-BSA或氧化心磷脂-KLH复合物的溶液包被。令溶液在37℃干燥过夜。然后各孔用至少200μl 1％酪蛋白的Tris磷酸盐缓冲盐水(TPBS)溶液(pH 7.2)在室温下阻断2h。各孔用200μl TPBS洗涤一次。然后，将100μl用1％酪蛋白TPBS1∶20、1∶40、1∶80或1∶160稀释的人血清(对照或来自梅毒感染个体)加入各孔。微量滴定板在室温孵育60min；然后用200μl TBST洗涤3次。在室温下向各孔中加入100μl用1％酪蛋白TPBS以1∶3000稀释的、与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗人抗体45min。用TPBS洗涤微量滴定板3次，然后每孔加入100μl TMB底物。在HRP存在下，TMB底物变色。加入2M硫酸，停止HRP酶-底物反应。分光光度法在450nm处读出各孔中溶液。
如表7和8所示，人梅毒血清(“反应性”)中存在的抗类脂抗体与固定在微量滴定板的孔中的氧化心磷脂-BSA或-KLH复合物结合。然而，对照(“非反应性”)血清与同样的固定抗原却无明显结合。表7.用氧化心磷脂-BSA抗原进行酶联免疫分析Table 8.用氧化心磷脂-BSA抗原进行酶联免疫分析
  血清稀释度   反应性   反应性   非反应性   非反应性
  1∶20   1.970   1.700   0.071   0.062
  1∶40   0.825   0.842   0.045   0.039
  1∶80   0.552   0.479   0.031   0.027
  1∶160   0.281   0.245   0.022   0.022
  无血清   0.046   0.034   0.021   0.019
Table 8.用氧化心磷脂-BSA抗原进行酶联免疫分析
 各数据点进行重复试验(结果已显示)。RPR试验测得该数据组所用梅毒血清具有1∶128的滴度。
尽管本公开内容已重点对特定实施方案进行了描述，但对本领域普通技术人员而言，显而易见的是可以使用特定实施方案的变体，并打算本公开内容可以以本文具体描述之外的方式实施。与本发明的具体方面、实施方案或实施例结合进行描述的特征、特性、化合物、化学部分或例子应理解为适用于本发明的任何其它方面、实施方案或实施例。因此，本公开内容包括所附权利要求书限定的本公开内容的精神和范围内涵盖的所有修改。

Claims (5)

1.与抗类脂抗体具有免疫反应性、并且能结合蛋白质以连接至基体上的氧化心磷脂的制备方法，其中心磷脂包括中心甘油部分和脂肪酸侧链，该方法包括：
使心磷脂与偏高碘酸钠和高锰酸钾在正丁醇溶剂中于氩气氛下反应，以氧化心磷脂，并在一条或多条脂肪酸侧链上提供末端羧基；
在心磷脂与偏高碘酸钠和高锰酸钾反应后，向心磷脂悬浮液中加入亚硫酸氢钠水溶液，以淬灭心磷脂的氧化和将中心甘油部分中形成的β-酮还原成β-羟基，从而保留中心甘油部分的免疫原性，其中偏高碘酸钠与心磷脂的摩尔比为4∶1至5∶1，高锰酸钾与心磷脂的摩尔比为0.5∶1至1∶1，以及在加入亚硫酸氢钠后分离水相和醇相，从正丁醇相中回收氧化的心磷脂；以及
活化氧化心磷脂的末端羧基，使蛋白质载体与至少一个羧基共价连接，其中活化羧基包括使氧化心磷脂与1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和然后与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应；和
使蛋白质与一个或多个活化羧基偶联。
2.权利要求1的方法，其中蛋白质包括牛血清白蛋白(BSA)，匙孔血蓝蛋白(KLH)或抗生物素蛋白。
3.制造侧流装置的方法，包括用权利要求1的方法制备偶联蛋白质，以及向侧流基体连接通过权利要求1的方法制备的偶联蛋白质。
4.权利要求3的方法，进一步包括向侧流基体连接与梅毒螺旋体抗体反应的密螺旋体抗原。
5.权利要求3或4的方法，其中基体是硝化纤维素基体，微量滴定板，聚苯乙烯珠，磁珠，乳胶颗粒，尼龙或聚偏氟乙烯(PVDF)。
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