CN101365788A - △-9延伸酶及其在制备多不饱和脂肪酸中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及Δ9延伸酶，其具有将亚油酸[18:2，LA]转化为二十碳二烯酸[20:2，EDA]的能力。公开了包含编码Δ9延伸酶的核酸片段和包含所述片段的重组构建体，以及制备用这些Δ9延伸酶在植物和含油酵母中制备长链多不饱和脂肪酸(PUFAs)的方法。

Description

△-9延伸酶及其在制备多不饱和脂肪酸中的用途
本申请要求2005年11月23日提交的美国临时申请No.60/739,989的优先权，其完整内容在此导入作为参考。
发明领域
本发明属于生物技术领域。更具体地讲，本发明涉及编码Δ9脂肪酸延伸酶的核酸片段的鉴定，和这些延伸酶在制备长链不饱和脂肪酸(PUFAs)中的用途。
发明背景
PUFAs的重要性是毋庸置疑的。例如，某些PUFAs是健康细胞的重要生物成分，并且被认为是：“必需”脂肪酸，它们在哺乳动物中不能从头合成，而是必须在饮食中获得，或者通过亚油酸(LA；18:2ω-6)或α-亚麻酸(ALA；18:3 ω-3)的进一步去饱和及延伸而衍生；细胞质膜的组分，其中它们可以诸如磷脂或甘油三酯的形式存在；对于适当的发育(特别是发育中的婴儿脑)和组织形成和修复是必须的；并且，是一些在哺乳动物中具有重要性的生物活性类二十烷酸(如前列环素、类二十烷酸、白三烯、前列腺素)的前体。此外，摄取大量长链ω-3PUFAs具有心血管保护作用(Dyerberg，J.等，Amer.J.Clin.Nutr.，28：958-966(1975)；Dyerberg，J.等，Lancet，2(8081)：117-119(July 15，1978)；Shimokawa，H.，World Rev.Nutr.Diet，88：100-108(2001)；vonSchacky，C.和Dyerberg，J.，World Rev.Nutr.Diet，88：90-99(2001))。通过针对多种症状和疾病(如哮喘、牛皮癣、湿疹、糖尿病、癌症)施用ω-3和/或ω-6 PUFAs，赋予了许多其它研究文件记载的广泛健康益处。
目前，正在研究多种不同的宿主，包括植物、藻类、真菌和酵母作为商业化PUFA生产的手段。尽管宿主生物的天然PUFA生产能力有时对于特定方法是特异性的，基因工程已经证明了可以显著增强一些宿主(甚至是天然限于LA和ALA脂肪酸生产的那些)的天然能力，以生产高水平的各种长链ω-3/ω-6 PUFAs。不论该作用是天然能力还是重组技术的结果，生产花生四烯酸(ARA；20:4 ω-6)、二十碳五烯酸(EPA；20:5 ω-3)和二十二碳六烯酸(DHA；22:6 ω-3)都需要Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径(其在一些生物，例如眼虫类物种中起作用，并且特征在于生产二十碳二烯酸[EDA；20:2 ω-6]和/或二十碳三烯酸[ETrA；20:3 ω-3])或Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径(主要存在于藻类、苔藓、真菌、线虫和人类中，其特征在于生产γ-亚油酸[GLA；18:3 ω-6]和/或十八碳四烯酸[STA；18:4 ω-3])的表达(图1)。
对于本文的目的，本申请致力于采用Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径，更具体地，是采用Δ9延伸酶。目前鉴定的大多数Δ9延伸酶具有将LA转化为EDA和将ALA转化为ETrA的能力(其中在与Δ8去饱和酶反应后，随后分别从EDA和ETrA合成DGLA和ETA；在与Δ5去饱和酶反应后，随后分别从DGLA和ETA合成ARA和EPA；并且，DHA合成需要随后表达额外的C20/22延伸酶和Δ4去饱和酶)。
尽管需要用于生产ARA、EPA和DHA的新方法，只鉴定了很少的Δ9延伸酶。例如，在本申请人的发明之前，目前仅仅知道一种Δ9延伸酶。具体地，PCT公开No.WO 2002/077213，No.WO 2005/083093，No.WO 2005/012316和No.WO 2004/057001描述了来自球等鞭金藻(Isochrysis galbana)的Δ9延伸酶及其用途(也参见GenBank登录号AAL37626)。因此，需要鉴定和分离额外的编码Δ9延伸酶的基因，其适用于在多种宿主生物中异源表达，用于生产ω-3/ω-6脂肪酸。
过去鉴定的延伸酶在它们所作用的底物方面是不同的。它们存在于动物和植物中。动物中存在的那些可以作用于饱和的、单不饱和以及多不饱和脂肪。但是，植物中存在的那些对于饱和以及单不饱和脂肪酸是特异性的。因此，需要PUFA特异性延伸酶，用于在植物中生产PUFAs。
植物中的延伸过程涉及4步过程，该过程通过丙二酸和脂肪酸缩合的关键步骤起始，伴随释放二氧化碳分子。脂肪酸延伸中的底物是CoA-硫酯。缩合步骤由3-酮脂酰合酶介导，其对于四个反应的总体循环通常是限速的，并且提供一些底物特异性。一个延伸循环的产物再生了脂肪酸，所述脂肪酸延长了两个碳原子(Browse等，Trends inBiochemical Sciences，27(9)：467-473(2002年9月)；Napier，Trends inPlant Sciences，7(2)：51-54(2002年2月))。
基于与Δ8去饱和酶一起表达Δ9延伸酶的用途，也付出了相当多的努力，以便从多种来源鉴定和表征Δ8去饱和酶。迄今为止，大多数努力致力于从纤细眼虫(Euglena gracilis)分离和表征Δ8去饱和酶；已经报道了纤细眼虫Δ8去饱和酶的一些序列变异(参见例如Wallis等，Arch.Biochem.and Biophys.，365(2)：307-316(May 1999)；PCT公开No.WO 2000/34439；美国专利No.6,825,017；PCT公开No.WO2004/057001；2005年6月24日提交的美国申请No.11/166,003(PCT公开No.WO 2006/012325和No.WO 2006/012326；2006年2月2日公开))。最近，PCT公开No.WO 2005/103253(2005年4月22日公开)公开了来自盐生巴夫藻(Pavlova salina)的Δ8去饱和酶。Sayanova等(FEBS Lett.，580：1946-1952(2006))描述了从游离的存活土壤阿米巴-卡氏棘变形虫(Acanthamoeba castellanii)分离和表征cDNA，所述cDNA当在拟南芥中表达时，编码C20 Δ8去饱和酶。同样，共同未决的临时申请No.60/795810(2006年4月28日提交)公开了来自Pavlova lutheri(CCMP459)的Δ8去饱和酶的氨基酸和核酸序列，而2006年10月23日提交的共同拥有的、共同未决的申请，即美国临时申请No.60/853563公开了来自眼虫类，即Tetruetreptia pomquetensis CCMP 1491、双鞭藻虫种CCMP389和Eutreptiella cf_gymnastica CCMP1594的Δ8去饱和酶。
以下共同拥有的专利申请涉及在含油酵母(即解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica))中生产PUFAs，包括：PCT公开No.WO2004/101757和PCT公开No.WO 2004/101753(都公开于2004年11月25日)；美国申请No.11/265,761(2005年11月2日提交；相应于PCT公开No.WO 2006/052870)；美国申请No.11/264,784(2005年11月1日提交；相应于PCT公开No.WO 2006/055322)；和美国申请No.11/264,737(2005年11月1日提交；相应于PCT公开No.WO2006/052871)。
此外，PCT公开No.WO2004/071467(2004年8月26日公开)涉及在植物中生产PUFAs，而PCT公开No.WO2004/071178(2004年8月26日公开)涉及膜联蛋白启动子及其在植物中表达转基因中的用途；这两者都是共同拥有和共同未决的申请。
申请人通过分离来自纤细眼虫和双鞭藻虫种CCMP389的编码Δ9延伸酶的基因，解决了指出的问题。
发明概述
本发明涉及编码具有Δ9延伸酶活性的多肽的新遗传构建体，以及它们在植物、藻类、细菌、酵母和真菌中生产PUFAs的用途。
因此，本发明提供了选自下组的分离的多核苷酸：
(a)分离的核酸序列，包含编码具有Δ9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比对方法，所述多肽与SEQ ID NO：2或SEQID NO：5所示氨基酸序列相比，具有至少70％氨基酸同一性；
(b)分离的核酸序列，包含编码具有Δ9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于BLASTN比对方法，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示核苷酸序列相比，具有至少70％序列同一性；
(c)分离的核酸序列，包含编码具有Δ9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在以下严格杂交条件下与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示核苷酸序列杂交：0.1X SSC，0.1％ SDS，65℃，并且用2X SSC，0.1％ SDS洗涤，随后用0.1X SSC，0.1％ SDS洗涤；或
(d)上述(a)、(b)或(c)的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和所述核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成，并且是100％互补的。
此外，本发明提供了由本发明的分离的核酸序列编码的多肽。具体地，本发明提供了Δ9延伸酶多肽，其中所述多肽的氨基酸序列选自下组：
(a)SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；和
(b)通过至少一个保守氨基酸取代而与(a)的氨基酸序列不同的氨基酸序列。
在另一实施方案中，本发明提供了用本发明的分离的核酸序列转化的宿主细胞，其中优选的宿主细胞是诸如藻类、细菌、酵母、卵菌和真菌的微生物物种。
在另一实施方案中，本发明提供了生产二十碳二烯酸的方法，包括：
a)提供分离的转化的酵母宿主细胞，其包含：
i)分离的多核苷酸序列，编码具有Δ9延伸酶活性的多肽，所述多核苷酸序列选自：
(1)分离的核酸序列，包含编码具有Δ9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比对方法，所述多肽与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5所示氨基酸序列相比，具有至少70％氨基酸同一性；
(2)分离的核酸序列，包含编码具有Δ9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在以下严格条件下与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示核苷酸序列杂交：0.1X SSC，0.1％ SDS，65℃，并且用2X SSC，0.1％ SDS洗涤，随后用0.1X SSC，0.1％ SDS洗涤；和
(ii)亚油酸的来源；
b)在表达编码Δ9延伸酶多肽的核酸序列并且将亚油酸转化为二十碳二烯酸的条件下使步骤(a)的酵母宿主细胞生长；以及
c)任选回收步骤(b)的二十碳二烯酸。
在一种替代的实施方案中，本发明提供了生产二十碳三烯酸的方法，包括：
a)提供分离的转化的酵母宿主细胞，其包含：
i)分离的多核苷酸序列，编码具有Δ9延伸酶活性的多肽，所述多核苷酸序列选自：
(1)分离的核酸序列，包含编码具有Δ9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比对方法，所述多肽与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5所示氨基酸序列相比，具有至少70％氨基酸同一性；
(2)分离的核酸序列，包含编码具有Δ9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在以下严格杂交条件下与SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示核苷酸序列杂交：0.1X SSC，0.1％SDS，65℃，并且用2X SSC，0.1％ SDS洗涤，随后用0.1X SSC，0.1％ SDS洗涤；和
(ii)α-亚麻酸的来源；
b)在表达编码Δ9延伸酶多肽的核酸序列并且将α-亚麻酸转化为二十碳三烯酸的条件下使步骤(a)的宿主细胞生长；以及
c)任选回收步骤(b)的二十碳三烯酸。
在另一实施方案中，本发明提供了由本发明的转化的宿主生产的微生物油。
在一个分开的实施方案中，本发明提供了包含本发明的微生物油的食品。
在另一实施方案中，本发明提供了包含本发明的油的动物饲料。
生物保藏
以下质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，具有以下名称、保藏号和保藏日(表1)。
         表1
       ATCC保藏
 
生物材料 保藏号 保藏日
pKR72 PTA-6019 2004年5月28日
pKR275 PTA-4989 2003年1月30日
pKR585 PTA-6279 2004年11月4日
pKR578 PTA-6280 2004年11月4日
附图和序列表简述
图1描述了ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径，该途径提供了通过多种中间体将豆蔻酸转化为DHA。
图2显示了本发明的纤细眼虫Δ9延伸酶的氨基酸序列(SEQ IDNO：2)、本发明的双鞭藻虫种CCMP389(Eutreptiella sp.CCMP389)Δ9延伸酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：5))和来自球等鞭金藻的长链PUFA延伸酶的氨基酸序列(NCBI登录号AAL37626(GI 17226123))(SEQ ID NO：8)的Clustal V比对(采用默认参数)。
图3显示纤细眼虫细胞提取物的脂质谱的色谱(实施例1)。
图4显示本发明的纤细眼虫Δ9延伸酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)和来自球等鞭金藻的长链PUFA延伸酶的氨基酸序列(NCBI登录号AAL37626(GI 17226123))(SEQ ID NO：8)的Clustal V比对(采用默认参数)。
图5是质粒pY119的图谱。
图6是啤酒糖酵母中的纤细眼虫Δ9延伸酶(EgD9e)的功能分析。
图7A是质粒pY5-30的图谱；图7B是质粒pDMW263的图谱；图7C是pZUF17的质粒图。
图8是质粒pY115的图谱。
图9A是解脂耶氏酵母
Figure A200680051550D0011190635QIETU
目的载体pBY1的图谱；图9B是质粒pBY2的图谱；图9C是质粒pBY1-FAE的图谱。
图10显示纤细眼虫Δ9延伸酶基因的DNA序列(EgD9e；SEQ IDNO：1)和为在解脂耶氏酵母中表达而进行了密码子优化的合成基因(EgD9eS；SEQ ID NO：3)的比较。
图11A是质粒pY120的图谱，而图11B是质粒pKR912的图谱。
图12A是质粒pKR911的图谱，而图12B是质粒pKR913的图谱。
图13A是质粒pKR886的图谱，而图13B是质粒pKR886r的图谱。
图14A是质粒pKR669的图谱，而图14B是质粒pKR873的图谱。
图15A是pFBAIN-389Elo的质粒图，而图15B是pZUFE389S的质粒图。
图16显示双鞭藻虫种CCMP389Δ9延伸酶基因(E389D9e；SEQID NO：4)和为在解脂耶氏酵母中表达而进行了密码子优化的合成基因(E389D9eS；SEQ ID NO：6)的比较。
通过以下的详细说明以及附图和序列表能够更全面地理解本发明，这些内容构成了本发明的一部分。
下列序列遵循37C.F.R.§1.821-1.825(“对含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公开内容的专利申请的要求---序列规则”)，并符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(管理细则的规则5.2和49.5(a-bis)，以及第208节和附录C)。应用于核苷酸和氨基酸序列信息的符号和格式遵循37C.F.R.§1.822所述规则。
序列表说明
SEQ ID NOs：1-17，21，22，45-48，51-61，68-71，76-79，81-93，96-102和118-129是表2中鉴定的、编码基因或蛋白(或其部分)的ORFs或质粒。
                    表2
          核酸和蛋白序列编号的概括
 
说明和缩写 核酸SEQ ID NO. 蛋白SEQ ID NO.
纤细眼虫Δ9延伸酶(EgD9e；克隆eeg1c.pk001.n5.f))             1(777bp) 2(258AA)
合成的Δ9延伸酶，来源于纤细眼虫，为在解脂耶氏酵母中表达而进行了密码子优化(EgD9eS)         33(777bp) 2(258AA)
双鞭藻虫种CCMP389Δ9延伸酶(E389D9e)                  4(792bp) 5(263AA)
合成的Δ9延伸酶，来源于双鞭藻虫种CCMP389，为在解脂耶氏酵母中表达而进行了密码子优化(E389D9eS)                    6(792bp) 5(263AA)
球等鞭金藻Δ9延伸酶(IgD9e；NCBI登录号AAL37626[GI17226123]，基因座AAL37626，CDSAF390174；GenBank登录号AF390174)(CDS＝核苷酸2-793)    7(1064bp) 8(263AA)
合成的Δ9延伸酶，来源于球等鞭金藻，为在解脂耶氏酵母中表达而进行了密码子优化(IgD9eS)(等同于PCT公开No.WO 2006/052870中的SEQ ID NOs：51和50)           9(792bp) 8(263AA)
纤细眼虫EgD9e—来自克隆eeg1c.pk001.n5.f.的cDNA插入片段的5’序列                      10(757bp) --
纤细眼虫EgD9e--来自克隆eeg1c.pk001.n5.f.的cDNA插入片段的3’序列3’                   11(774bp) --
 
纤细眼虫EgD9e--从SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11比对的序列(排除聚腺苷酸尾的全cDNA序列) 12(1201bp) --
双鞭藻虫种CCMP389E389D9e—内部cDNA片段 13(200bp) --
双鞭藻虫种CCMP389E389D9e—5’cDNA片段#1 14(406bp) --
双鞭藻虫种CCMP389E389D9e—5’cDNA片段#2 15(197bp) --
双鞭藻虫种CCMP389E389D9e—3’cDNA片段 16(920bp) --
双鞭藻虫种CCMP389E389D9e—完整的组装重叠群 17(1504bp) --
质粒pY119 21(8306bp) --
质粒pDMW263 22(9472bp) --
质粒pY115 45(7783bp) --
质粒pDMW237 46(7879bp) --
质粒pBY1 47(8704bp) --
质粒pBY2 48(8145bp) --
质粒pBY1-FAE 51(7877bp) --
质粒pZuFmEgD9E 52(7771bp) --
质粒pZuFmEgD9ES 53(7769bp) --
 
质粒pY120 54(7769bp) --
质粒pKR72 55(7085bp) --
质粒pKR912 56(7873bp) --
质粒pKS102 57(2540bp) --
质粒pKR197 58(4359bp) --
质粒pKR911 59(5147bp) --
纤细眼虫Δ8去饱和酶(EgD8)(等同于PCT公开No.WO2006/012325和No.WO2006/012326[US2005-0287652-A1]的编码序列) 60(1266bp) 61(421AA)
合成的Δ8去饱和酶，来源于纤细眼虫，为在解脂耶氏酵母中表达而进行了密码子优化(EgD8S)(等同于PCT公开No.WO 2006/012326中的SEQ ID NOs：112和113) 68(1272bp) 69(422AA)
质粒pKS121 70(4826bp) --
质粒pKR457 71(5252bp) --
质粒pKR680 76(6559bp) --
质粒pKR913 77(9014bp) --
高山被孢霉Δ5去饱和酶 78(1482bp) 79(446AA)
 
质粒pKR767 81(5561bp) --
质粒pKR328 82(8671bp) --
质粒pKR886 83(9892bp) --
质粒pKR886r 84(9892bp) --
质粒pKR271 85(6021bp) --
质粒pKR226 86(6524bp) --
质粒pKR275 87(13,514bp) --
质粒pKR329 88(12,323bp) --
质粒pKR585 89(12,456bp) --
质粒pKR578 90(9088bp) --
质粒pKR667 91(10,309bp) --
质粒pKR873 92(12,403bp) --
质粒pKR132 93(3983bp) --
质粒pKR160 96(4268bp) --
质粒pKR124 97(4990bp) --
质粒pKR163 98(3982bp) --
 
质粒pY34 99(8878bp) --
质粒pKR863 100(5207bp) --
质粒pKR869 101(9035bp) --
质粒pKR270 102(5108bp) --
质粒pFBAIN-MOD-1 118(7222bp) --
质粒pFBAIN-389Elo 119(7779bp) --
质粒pE389S 120(3511bp) --
质粒pZUF17 121(8165bp) --
质粒pZUFE389S 122(7879bp) --
Δ9延伸酶基序#1 -- 123
Δ9延伸酶基序#2 -- 124
Δ9延伸酶基序#3 -- 125
Δ9延伸酶基序#4 -- 126
Δ9延伸酶基序#5 -- 127
Δ9延伸酶基序#6 -- 128
Δ9延伸酶基序#7 -- 129
SEQ ID NO：18是用于对纤细眼虫cDNA文库eeg1c进行测序的M13F通用引物。
SEQ ID NOs：19和20分别相应于用于从克隆eeg1c.pk001.n5.f扩增EgD9e的oEugEL1-1和oEugEL1-2。
SEQ ID NOs：23-38分别相应于用于扩增IgD9eS的引物IL3-1A，IL3-1B，IL3-2A，IL3-2B，IL3-3A，IL3-3B，IL3-4A，IL3-4B，IL3-5A，IL3-5B，IL3-6A，IL3-6B，IL3-7A，IL3-7B，IL3-8A和IL3-8B。
SEQ ID NOs：39-42分别相应于用于扩增IgD9eS的引物IL3-1F，IL3-4R，IL3-5F和IL3-8R。
SEQ ID NO：43是来自pT9(1-4)的417bp NcoI/PstI片段。
SEQ ID NO：44是来自pT9(5-8)的377bp PstI/Not1片段。
SEQ ID NOs：49和50分别相应于用于从载体pY115扩增IgD9eS的引物ig-s和ig-as。
SEQ ID NOs：62和63分别相应于用于从cDNA扩增EgD8的引物Eg5-1和Eg3-3。
SEQ ID NOs：64-67分别相应于用于对EgD8进行测序的引物T7，M13-28Rev，Eg3-2和Eg5-2。
SEQ ID NO：72是pKR457的KTi盒5′末端多克隆位点(MCS)的序列。
SEQ ID NO：73是pKR457的KTi盒3′末端多克隆位点(MCS)的序列，其中包括大豆白蛋白转录3’终止子。
SEQ ID NOs：74和75分别相应于用于从大豆基因组DNA扩增大豆白蛋白转录终止子的引物oSalb-12和oSalb-13。
SEQ ID NO：80相应于加入到pKR287中用于生产pKR767的限制位点。
SEQ ID NOs：94和95分别相应于用于在生产pKR160的过程中建立限制位点的引物oSA1b-9和oSA1b-2。
SEQ ID NOs：103-105分别相应于用于双鞭藻虫种CCMP389cDNA合成的SMARTTM IV寡核苷酸引物、CDSIII/3’PCR引物和5’-PCR引物。
SEQ ID NO：106是编码SEQ ID NO：107中所示肽的简并引物EuEF3的核苷酸序列。类似地，SEQ ID NO：108是简并引物EuER3的核苷酸序列，其编码SEQ ID NO：109所示的肽。
SEQ ID NOs：110-113分别相应于用于PCR扩增编码E389D9e的cDNA的5’末端的引物389Elo-5-1，389Elo-5-2，DNR CDS5′-2和389Elo-5-4。
SEQ ID NOs：114和115分别相应于用于PCR扩增编码E389D9e的cDNA的3’末端的引物389Elo-3-1和389Elo-3-2。
SEQ ID NOs：116和117分别相应于用于扩增编码E389D9e的全长cDNA的引物389ELO-F和389ELO-R1。
发明详述
在此全文导入本文引用的所有专利、专利申请和公开文献作为参考。这特别包括了以下共同拥有和共同未决的申请：美国专利申请No.10/840478，No.10/840579和No.10/840325(2004年5月6日提交)，美国专利申请No.10/869630(2004年6月16日提交)，美国专利申请No.10/882760(2004年7月1日提交)，美国专利申请No.10/985109和No.10/985691(2004年11月10日提交)，美国专利申请No.10/987548(2004年11月12日提交)，美国专利申请No.11/024545和No.11/024544(2004年12月29日提交)，美国专利申请No.11/166993(2005年6月24日提交)，美国专利申请No.11/183664(2005年7月18日提交)，美国专利申请No.11/185301(2005年7月20日提交)，美国专利申请No.11/190750(2005年7月27日提交)，美国专利申请No.11/198975(2005年8月8日提交)，美国专利申请No.11/225354(2005年9月13日提交)，美国专利申请No.11/251466(2005年10月14日提交)，美国专利申请No.11/254173和No.11/253882(2005年10月19日提交)，美国专利申请No.11/264784和No.11/264737(2005年11月1日提交)，美国专利申请No.11/265761(2005年11月2日提交)，美国专利申请No.60/739989(2005年11月23日提交)，美国专利申请No.60/795810(2006年4月28日提交)，美国专利申请No.60/793575(2006年4月20日提交)，美国专利申请No.60/796637(2006年5月2日提交)，美国专利申请No.60/801172(2006年5月17日提交)，美国专利申请No.60/801119(2006年5月17日提交)，美国专利申请No.60/853563(2006年10月23日提交)，美国专利申请No.60/855177(2006年10月30日提交)。这额外包括以下共同拥有和共同未决的申请：美国专利申请No.10/776311，其涉及在植物中生产PUFAs；和美国专利申请No.10/776889，其涉及膜联蛋白启动子以及它们在植物中表达转基因中的用途。
本发明提供了新的纤细眼虫和双鞭藻虫种CCMP389 Δ9延伸酶，以及编码所述酶的基因，它们可以用于操纵用于生产健康PUFAs的生化途径。
通过本文所公开的方法制备的PUFAs，或其衍生物可被用作饮食代用品，或补充物和婴儿配方，用于静脉内喂饲的患者或用于预防或治疗营养不良。另外，可以将纯化的PUFAs(或其衍生物)掺入烹饪油，脂肪，或配制的人造奶油中，以便在正常使用时，接受者能接受到所需数量的饮食补充。还可将PUFAs掺入婴儿配方，营养补充物或其他食品中，并且可以用作抗炎剂或降胆固醇剂。可任选将所述组合物用于药学用途(人或兽医)。
定义
在本说明书中，使用了多种术语和缩写。提供了以下定义。
＂读码框＂被缩写为ORF。
＂聚合酶链反应＂被缩写为PCR。
＂美国典型培养物保藏中心＂被缩写为ATCC。
＂多不饱和脂肪酸＂被缩写为PUFA(s)。
“三酰甘油”被缩写为TAGs。
术语“发明”或“本发明”不限于本发明的任何特定实施方案，而是通常可以适用于权利要求和说明书中描述的本发明的任何和所有实施方案。
术语＂脂肪酸＂表示具有各种链长的长链脂族酸(链烷酸)，从大约C12-C22(不过已知可以采用更长和更短链长的酸)。主要的链长为C16至C22。关于“饱和脂肪酸”与“不饱和脂肪酸”、“单不饱和脂肪酸”与“多不饱和脂肪酸”(或“PUFAs”)和“ω-6脂肪酸”(ω-6或n-6)与“ω-3脂肪酸”(ω-3或n-3)的差别的其它细节提供于PCT公开No.WO 2004/101757。
脂肪酸在本文中是通过简单的符号系统＂X：Y＂表示的，其中，X是在特定脂肪酸中的碳(C)原子的总数，而Y是双键的数量。脂肪酸命名后的数字表示从脂肪酸羧基末端开始的双键的位置，其中词缀“c”表示双键的顺式构型[例如棕榈酸(16:0)，硬脂酸(18:0)，油酸(18:1，9c)，岩芹酸(18:1，6c)，LA(18:2，9c，12c)，GLA(18:3，6c，9c，12c)和ALA(18:3，9c，12c，15c)]。除非特别指出，18:1、18:2和18:3是指油酸、LA和ALA脂肪酸。如果不特别指出相反的意思，认为双键是顺式构型。例如，18:2(9，12)中的双键将认为是顺式构型。
在本公开内容中用于描述PUFAs的术语示于下表3。在命名为“简化符号”的列中，用ω参照系统表明碳的数目、双键的数目和与ω碳距离最近的双键的位置，所述位置从ω碳(其为此目的而编号为1)开始计数。该表的其余部分概括了ω-3和ω-6脂肪酸及其前体的名称，将在说明书的其余部分中使用的缩写，以及每个化合物的化学名称。
                         表3
             多不饱和脂肪酸和前体的命名
 
通用名 缩写 化学名 简化符号
豆蔻酸 -- 十四烷酸 14:0
棕榈酸 棕榈酸 十六烷酸 16:0
棕榈油酸 -- 9-十六碳烯酸 16:1
硬脂酸 -- 十八烷酸 18:0
油酸 -- 顺式-9-十八碳烯酸 18:1
亚油酸 LA 顺式-9，12-十八碳二烯酸 18:2 ω-6
γ-亚麻酸 GLA 顺式-6，9，12-十八碳三烯酸 18:3 ω-6
二十碳二烯酸 EDA 顺式-11，14-二十碳二烯酸 20:2 ω-6
二高-γ-亚麻酸 DGLA 顺式-8，11，14-二十碳三烯酸 20:3 ω-6
金松酸(Sciadonic) SCI 顺式-5，11，14-二十碳三烯酸 20:3b ω-6
花生四烯酸 ARA 顺式-5，8，11，14-二十碳四烯酸 20:4 ω-6
α-亚麻酸 ALA 顺式-9，12，15-十八碳三烯酸 18:3 ω-3
十八碳四烯酸 STA 顺式-6，9，12，15-十八碳四烯酸 18:4 ω-3
 
二十碳三烯酸 ETrA 顺式-11，14，17-二十碳三烯酸             20:3 ω-3
二十碳四烯酸 ETA 顺式-8，11，14，17-二十碳四烯酸                20:4 ω-3
刺柏酸(Juniperonic) JUP 顺式-5，11，14，17-二十碳四烯酸                20:4b ω-3
二十碳五烯酸 EPA 顺式-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸               20:5 ω-3
二十二碳五烯酸 DPA 顺式-7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸              22:5 ω-3
二十二碳六烯酸 DHA 顺式-4，7，10，13，6，19-二十二碳六烯酸            22:6 ω-3
术语＂必需脂肪酸＂表示生物体为了生存必须摄入的特定PUFA，因为所述生物体不能从头合成所述特定必需脂肪酸。例如，哺乳动物不能合成必需脂肪酸LA。其他必需脂肪酸包括但不限于GLA，DGLA，ARA，EPA和DHA。
术语＂脂肪＂表示脂类物质，它在25℃下是固体，并且通常是饱和的。
术语＂油＂表示在25℃下是液体并且通常是多不饱和的脂类。PUFAs存在于某些藻类，含油酵母和丝状真菌的油中。＂微生物油＂或＂单细胞油＂是由微生物在生命过程中天然产生的油。
术语“三酰甘油”、“油”和“TAGs”是指中性脂质，包含酯化于甘油分子的三个脂肪酰基(所述术语在本发明中可互换使用)。所述油可以包括长链PUFAs、较短的饱和和不饱和脂肪酸，以及较长链的饱和脂肪酸。因此，“油生物合成”通常是指细胞中TAGs的合成。
“总脂质和油级分中的PUFAs百分比(％)”是指这些级分中PUFAs相对于总脂肪酸的百分比。术语“总脂质级分”或“脂质级分”都指含油生物内的所有脂质的总和(即中性和极性)，由此包括位于磷脂酰胆碱(PC)级分、磷脂酰乙醇胺(PE)级分和三酰甘油(TAG或油)级分中的脂质。但是，该术语“脂质”和“油”在说明书中可以互换使用。
术语“转化效率”和“底物转化百分比”表示特定的酶(例如，去饱和酶)可以将底物转化成产物的效率。转化效率是按照以下公式计算的：([产物]/[底物+产物])*100，其中‘产物’包括中间产物和衍生自中间产物的途径中的所有产物。
生物化学意义上的代谢途径或生物合成途径可以认为是细胞内发生的一系列化学反应，由酶催化，形成要被细胞使用或储存的代谢产物或开始另一种代谢途径(然后称作流通产生步骤)。这些途径中的很多都是精细的，涉及逐步修饰起始物质，将其塑造为具有需要的精确化学结构的产物。
术语“PUFA生物合成途径”是指将油酸转化为LA，EDA，GLA，DGLA，ARA，ALA，STA，ETrA，ETA，EPA，DPA和DHA的代谢过程。该过程详细描述于文献中(例如参见PCT公开No.WO2005/003322和No.WO 2006/052870)。类似地，该过程包括通过加入碳原子延伸碳链和通过加入双键使分子去饱和，这是通过内质网膜中存在的一系列的特定去饱和和延伸酶(即“PUFA生物合成途径酶”)进行的。更具体地，“PUFA生物合成途径酶”表示与PUFA的生物合成相关的以下任何酶(以及编码所述酶的基因)，包括：Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9延伸酶、C14/16延伸酶、C16/18延伸酶、C18/20延伸酶和/或C20/22延伸酶。
术语“ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径”表示一组基因，当它们在合适的条件下表达时，编码能催化ω-3和ω-6脂肪酸生产的酶。通常，参与ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径的基因编码PUFA生物合成途径酶。在图1中示出了典型的途径，它可以经各种中间体将豆蔻酸转化成DHA，并且证实了如何由共同来源生产ω-3和ω-6脂肪酸。该途径天然分成两个部分，其中一个部分产生ω-3脂肪酸，另一个部分仅仅产生ω-6脂肪酸。
在ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径的范围中使用的术语“功能性”表示途径中的一些(或所有)基因表达活性酶，导致体内催化或底物转化。应该理解，“ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径”或“功能性ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径”不表示需要所有PUFA生物合成途径酶基因，因为很多脂肪酸产物仅仅需要表达该途径的一个亚组的基因。
术语“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”是指用于生产长链PUFAs的生物合成途径。该途径最少包括Δ9延伸酶和Δ8去饱和酶，从而使得能够分别从LA和ALA生物合成DGLA和/或ETA。随着表达其它去饱和酶和延伸酶，也可以合成ARA，EPA，DPA和DHA。该途径在一些实施方案中可能是有利的，因为排除了GLA和/或STA的生物合成。
术语“中间脂肪酸”是指在脂肪酸代谢途径中产生的任何脂肪酸，其可以在该途径中通过其它代谢途径酶的作用进一步转化为目的产物脂肪酸。例如，当用Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径生产EPA时，可以产生EDA，ETrA，DGLA，ETA和ARA，并且被认为是“中间脂肪酸”，因为这些脂肪酸可以通过其它代谢途径酶的作用进一步转化为EPA。
术语“副产物脂肪酸”是指脂肪酸代谢途径中产生的不作为途径的目标脂肪酸产物，也不作为途径的“中间脂肪酸”的任何脂肪酸。例如，当用Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径生产EPA时，通过Δ5去饱和酶对EDA或ETrA的作用，也分别可以产生金松酸(SCI)和刺柏酸(JUP)。它们也被认为是“副产物脂肪酸”，因为它们都不能通过其它代谢途径酶的作用进一步转化为EPA。
“去饱和酶”表示能够对一种或多种脂肪酸去饱和，即，导入双键，以便产生脂肪酸或感兴趣的前体的多肽。尽管在本说明书中ω-参考系统被用于表示特定的脂肪酸，更方便的是，利用Δ-系统从底物的羧基末端开始计数以表示去饱和酶的活性。感兴趣的去饱和酶包括例如：1.)Δ8去饱和酶，它使脂肪酸的位于从该分子的羧基末端开始计数的第8和第9个碳原子之间去饱和，例如，催化EDA转化成DGLA和/或EtrA转化成ETA；2.)Δ5去饱和酶，它能催化DGLA转化成ARA和/或ETA转化成EPA；3.)Δ6去饱和酶，它能催化LA转化成GLA和/或ALA转化成STA；4.)Δ4去饱和酶，它能催化DPA转化成DHA；5.)Δ12去饱和酶，它能催化油酸转化成LA；6.)Δ15去饱和酶，它能催化LA转化成ALA和/或GLA转化成STA；7.)Δ17去饱和酶，它能催化ARA转化成EPA和/或DGLA转化成ETA；和8)Δ9去饱和酶，它能催化棕榈酸转化成棕榈油酸(16:1)和/或硬脂酸转化成油酸(18:1)。在本领域中，基于将ω-6脂肪酸转化为ω-3对应物(如分别将LA转化为ALA和ARA转化为EPA)的能力，有时也将Δ15和Δ17去饱和酶称作“omega-3去饱和酶”、“w-3去饱和酶”和/或“ω-3去饱和酶”。在一些实施方案中，最理想的是经验确定特定脂肪酸去饱和酶的特异性，这是通过用脂肪酸去饱和酶基因转化合适的宿主，并且确定其对宿主脂肪酸谱的作用而确定的。
对于本文的目的，术语“EgD8”是指分离自纤细眼虫的Δ8去饱和酶(SEQ ID NO：61)，由本文的SEQ ID NO：60编码。EgD8与PCT公开No.WO 2006/012325和No.WO 2006/012326描述的“Eg5”[美国公开No.2005-0287652-A1的SEQ ID NO：2]具有100％同一性并且是功能上等同的。
类似地，术语“EgD8S”是指本文中为在解脂耶氏酵母中表达而进行了密码子优化的来源于纤细眼虫的合成的Δ8去饱和酶(即SEQ IDNOs：68和69)。EgD8S与PCT公开No.WO 2006/012325和No.WO2006/012326描述的“D8SF”具有100％同一性并且是功能上等同的。
术语“延伸酶系统”表示负责延伸脂肪酸碳链，以便产生比延伸酶作用的脂肪酸底物长2个碳原子的脂肪酸的一组四种酶。更具体地，这种延伸过程是与脂肪酸合酶相关发生的，其中，CoA是酰基载体(Lassner等，The Plant Cell 8：281-292(1996))。在第一步中(其是底物特异性和限速的)，丙二酰-CoA与长链酰基-CoA缩合，产生二氧化碳(CO2)和β-酮酰基-CoA(其中，酰基部分延长了两个碳原子)。随后的反应包括还原成β-羟酰基-CoA，脱水形成烯酰基-CoA，并且第二次还原，产生延长的酰基-CoA。由延伸酶催化的反应的例子是将GLA转化成DGLA，STA转化成ETA和将EPA转化成DPA。
为了本发明的目的，催化第一个缩合反应(即丙二酰-CoA转化为β-酮酰基-CoA)的酶统称为“延伸酶”。概言之，延伸酶的底物选择性一定程度是宽范围的，但是由于链长度和不饱和化的程度而不同。因此，延伸酶可以具有不同的特异性。例如，C14/16延伸酶利用C14底物(如豆蔻酸)，C16/18延伸酶利用C16底物(如棕榈酸)，C18/20延伸酶(也称作Δ6延伸酶，因为所述术语可以互换使用)利用C18底物(如GLA、STA)，C20/22延伸酶利用C20底物(如EPA)。以相似的方式，本文特别感兴趣的是，“Δ9延伸酶”够催化LA和ALA分别转化为EDA和EtrA。重要的是注意，一些延伸酶具有广泛特异性，因此，单个酶可能能够催化一些延伸酶反应。因此，例如，Δ9延伸酶也可以作为C16/18延伸酶，C18/20延伸酶和/或C20/22延伸酶，并且可以分别对Δ5和Δ6脂肪酸，如EPA和/或GLA具有替代的但不是优选的特异性。在一种优选的实施方案中，理想的是经验确定脂肪酸延伸酶的特异性，该确定是通过用脂肪酸延伸酶的基因转化合适的宿主，并且确定其对宿主的脂肪酸谱的影响。
对于本文的目的，术语“EgD9e”是指分离自纤细眼虫的Δ9延伸酶(SEQ ID NO：2)，由本文的SEQ ID NO：1编码。相反，术语“EgD9eS”是指为在解脂耶氏酵母中表达而进行了密码子优化的来源于纤细眼虫的合成的Δ9延伸酶(即SEQ ID NOs：3和2)。
术语“E389D9e”是指分离自双鞭藻虫种CCMP389的Δ9延伸酶(SEQ ID NO：5)，由SEQ ID NO：4编码。相反，术语“E389D9eS”是指为在解脂耶氏酵母中表达而进行了密码子优化的来源于双鞭藻虫种CCMP389的合成的Δ9延伸酶(即SEQ ID NOs：6和5)。
术语“IgD9e”是指分离自球等鞭金藻的Δ9延伸酶(SEQ ID NO：8；NCBI登录号AAL37626[GI 17226123]，基因座AAL37626，CDSAF390174；GenBank登录号AF390174)，由SEQ ID NO：7编码。相反，术语“IgD9eS”是指为在解脂耶氏酵母中表达而进行了密码子优化的来源于球等鞭金藻的合成的Δ9延伸酶(即SEQ ID NOs：9和8)。IgD9eS的合成和功能分析描述于PCT公开No.WO 2006/052870(其中IgD9eS等同于其中的SEQ ID NOs：51和50)。
术语“氨基酸”是指蛋白或多肽的基本化学结构单位。氨基酸是通过与Nucleic Acids Research，13：3021-3030(1985)和BiochemicalJournal，219(2)：345-373(1984)中描述的IUPAC-IYUB标准一致的一字母代码或三字母代码表示的氨基酸，所述文献在此导入作为参考。
术语“保守氨基酸取代”是指用另一种氨基酸取代特定蛋白中的氨基酸残基，而不改变该蛋白的化学或功能性质。例如，本领域公知，该基因中导致特定位点产生化学等同氨基酸(但不影响编码的折叠蛋白的结构和功能性质)的基因改变是共有的。对于本发明的目的，“保守氨基酸取代”定义为以下5组之一内的交换：
1.小的脂族、非极性或微极性残基：Ala[A]，Ser[S]，Thr[T](Pro[P]，Gly[G])；
2.极性、带负电残基及其酰胺：Asp[D]，Asn[N]，Glu[E]，Gln[Q]；
3.极性、带正电残基：His[H]，Arg[R]，Lys[K]；
4.大的脂族、非极性残基：Met[M]，Leu[L]，Ile[I]，Val[V](Cys[C])；和
5.大的芳香族残基：Phe[F]，Tyr[Y]，Trp[W]。
保守氨基酸取代通常保持：1)取代区中多肽主链的结构；2)分子靶位点的电荷或疏水性；或3)侧链的容量。此外，在很多情况下，预期蛋白分子的N-末端和C-末端部分也不会改变蛋白的活性。
术语“非保守氨基酸取代”是指通常预期产生蛋白性质的最大改变的氨基酸取代。因此，例如，非保守氨基酸取代可以是：1)亲水残基取代疏水残基/被疏水残基取代(如Ser或Thr取代Leu，Ile，Val或被Leu，Ile，Val取代)；2)Cys或Pro取代另一残基/被另一残基取代；3)具有正电性侧链的残基取代负电性残基/被负电性残基取代(例如Lys，Arg或His取代Asp或Glu/被Asp或Glu取代)；或4)具有大侧链的残基取代不具有侧链的残基/被不具有侧链的残基取代(例如Phe取代Gly或被Phe被Gly取代)。有时，5组之中两组之间的非保守氨基酸取代将不影响编码的蛋白的活性。
术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸片段”和“分离的核酸片段”在本文中可以互换使用。这些术语包括核苷酸序列等。多核苷酸可以是单链或双链RNA或DNA的聚合物，其任选包含合成的、非天然或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的多核苷酸可以包含一个或多个cDNA片段、基因组DNA、合成DNA或其混合物。核苷酸(通常以它们的5’-单磷酸形式存在)由如下单字母符号表示：“A”表示腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别表示RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，“N”表示任何核苷酸。
术语“在功能上等同的亚片段”和“功能等同的亚片段”在本文中可互换使用。这些术语是指分离核酸片段的一部分或亚序列，其中无论该片段或亚片段是否编码活性酶，都保留了改变基因表达或产生某种表型的能力。例如，该片段或亚片段可以用于嵌合基因的设计中，用于在转化的植物中产生需要的表型。嵌合基因可以设计用于通过连接核酸片段或其亚片段而进行的阻抑中，无论其是否编码活性酶，其相对于植物启动子序列是有义或反义方向。
术语“保守结构域”或“基序”表示在沿着进行比对的进化上相关的蛋白的序列的特定位置上保守的一组氨基酸。尽管其它位置的氨基酸在同源蛋白之间可以不同，但在特定位置高度保守的氨基酸表明这些氨基酸是蛋白的结构、稳定性或活性必须的。由于它们是通过在比对的蛋白同源物家族的序列中的高保守程度鉴定的，它们可以用作标识物，或“信号”，来确定具有新确定的序列的蛋白是否属于以前鉴定的蛋白家族。为了本发明的目的，下表描述了本发明的基序，其作为具有Δ9延伸酶活性的蛋白的指示。
                     表4
              Δ9延伸酶基序的概括
 
说明 序列 蛋白SEQ IDNO.   
Δ9延伸酶基序#1 Y N X(L或F)X X X X S X X S F 123
Δ9延伸酶基序#2 F Y X S K X X(E或D)Y X D(T或S)X X L            124
Δ9延伸酶基序#3 L(Q或H)X F H H X G A 125
Δ9延伸酶基序#4 M Y X Y Y X X X X X X X(K或R或N)F           126
Δ9延伸酶基序#5 K X L(I或L或M)T X X Q 127
Δ9延伸酶基序#6 W X F N Y X Y 128
Δ9延伸酶基序#7 Y X G X V X X L F 129
术语“同源性”、“同源”、“基本相似”和“基本相应”在本文中可以互换使用。它们表示核酸片段，其中一个或多个核苷酸碱基的改变不影响核酸片段介导基因表达或产生某种表型的能力。这些术语也表示本发明的核酸片段的修饰，例如一个或多个核苷酸的缺失或插入，相对于最初未修饰的片段，其不显著改变得到的核酸片段的功能性质。因此可以理解，如本领域技术人员可以理解的，本发明包括除特定示例序列之外的序列。
此外，本领域技术人员可以理解，本发明包括的基本相似的核酸序列也通过它们与本文示例的序列杂交(在中等严格条件下，例如0.5XSSC，0.1％SDS，60℃)或与本文公开的核苷酸序列的任何部分(其在功能上等同于本文公开的任何核酸序列)杂交的能力而确定。可以调节严格条件，用于筛选中等相似的片段(例如来自远相关生物的同源序列)至高度相似的片段(例如从远相关生物复制功能酶的基因)。杂交后洗涤决定严格条件。
术语“选择性杂交”包括核酸序列与特定核酸靶序列在严格杂交条件下的杂交，与非靶核酸序列杂交相比，其达到可检测地更高程度(例如比背景高至少2倍)，并且基本排除非靶核酸序列。选择性杂交的序列典型地彼此具有大约至少80％的序列同一性，或90％的序列同一性，最高达并且包括100％的序列同一性(即完全互补)。
术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括探针将与其靶序列选择性杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的环境中将会不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可以调整严格条件，使序列之间能够存在一些错配，以便检测到更低的相似性程度(异源探测)。通常，探针的长度小于约1000个核苷酸，任选地，长度小于约500个核苷酸。典型地，严格条件是这样的条件：其中盐浓度小于约1.5M Na离子，典型地在pH 7.0-8.3是约0.01-1.0M Na离子浓度(对于其它盐)，温度对于短探针(如10-50个核苷酸)是至少约30℃，对于长探针(例如大于50个核苷酸)是至少约60℃。也可以通过加入去稳定剂如甲酰胺而实现严格条件。示例的低严格条件包括37℃下与30-35％甲酰胺，1M NaCl，1％ SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液杂交，并且50-55℃下在1X-2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例的中等严格条件包括37℃下在40-45％甲酰胺，1M NaCl，1％SDS中杂交，并且55-60℃下在0.5X-1X SSC中洗涤。示例的高严格条件包括37℃下在50％甲酰胺，1M NaCl，1％ SDS中杂交，并且60-65℃在0.1X SSC中洗涤。其它示例的严格杂交条件包括0.1XSSC，0.1％ SDS，65℃和用2X SSC，0.1％SDS洗涤，然后用0.1X SSC，0.1％ SDS洗涤。
特异性典型地是杂交后洗涤的函数，重要的因子是离子强度和最终洗涤溶液的温度。对于DNA-DNA杂交体，可以从Meinkoth等，Anal.Biochem.，138：267-284(1984)的公式：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L估算Tm，其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞苷核苷酸的百分比，％甲酰胺是杂交溶液中的甲酰胺百分比，L是以碱基对表示的杂交体长度。Tm是50％的互补靶序列与完美匹配的探针杂交的温度(在确定的离子强度和pH)。对于每1％的错配，Tm减少约1℃；因此，可以调整Tm、杂交和/或洗涤条件，以便与具有需要的同一性的序列杂交。例如，如果寻求≥90％同一性的序列，Tm可以减少10℃。通常，选择的严格条件比特定序列及其互补序列在确定的离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约5℃。但是，高严格条件可以利用比热解链温度(Tm)低1、2、3或4℃的温度下的杂交和/或洗涤，中等严格杂交条件可以利用比热解链温度(Tm)低6、7、8、9或10℃的温度下的杂交和/或洗涤；低严格杂交条件可以利用比热解链温度(Tm)低11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤。采用该公式、杂交和洗涤组合物，以及需要的Tm，本领域技术人员可以理解，固有描述了杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化。如果需要的错配程度导致Tm小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，优选增加SSC浓度，以便可以使用更高的温度。核酸杂交的全面指导参见Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology--Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分，第二章＂Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidprobe assays＂，Elsevier，New York(1993)；和Current Protocols inMolecular Biology，第2章，Ausubel等，Eds.，Greene Publishing andWiley-Interscience，New York(1995)。杂交和/或洗涤条件可以应用至少10，30，60，90，120或240分钟。
核酸或多肽序列内容中的“序列同一性”或“同一性”是指在指定比较窗中为最大对应而比对时，两个序列中相同的核酸碱基或氨基酸残基。
因此，“序列同一性百分比”是指通过在比较窗中比较两个最优比对的序列而确定的值，其中比较窗中多核苷酸或多肽序列的部分与用于进行两个序列的最优比对的参照序列(其不包含添加或缺失)相比，可以包含添加或缺失(即空位)。百分比是如下计算的：确定两个序列中存在相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数，得到匹配的位置数，用匹配的位置数除以比较窗中的位置总数，并且将结果乘以100，得到序列同一性百分比。有用的序列同一性百分比的实例包括但不限于50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％或95％，或50％-100％的任何整数百分比。这些同一性可以用本文描述的任何程序确定。
可以用设计用来检测同源序列的多种比较方法来确定序列比对和同一性百分比或相似性计算，所述方法包括但不限于，LASERGENE生物信息计算软件包(DNASTAR Inc.，Madison，WI)的MegAlignTM程序。在本申请的上下文中，可以理解，当用序列分析软件进行分析时，分析结果将基于提到的程序的“默认值”，除非特别指出相反的意思。本文用到的“默认值”表示第一次初始化时最初随软件加载的任何组的值或参数。
“Clustal V比对方法”相应于标记为Clustal V的比对方法(描述于Higgins和Sharp，CABIOS，5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等，Comput.Appl.Biosci.，8：189-191(1992))并且存在于LASERGENE生物信息计算软件包(参见上文)的MegAlignTM程序中。对于多重比对，默认参数相应于GAP PENALTY＝10和GAP LENGTH PENALTY＝10。采用Clustal方法的逐对比对和蛋白序列同一性百分比计算的默认参数是KTUPLE＝1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5和DIAGONALSSAVED＝5。对于核酸，这些参数是KTUPLE＝2，GAP PENALTY＝5，WINDOW＝4和DIAGONALS SAVED＝4。用Clustal V程序进行序列比对后，可以通过观察同一程序中的“序列距离”表，获得“同一性百分比”。
“BLASTN比对方法”是国家生物技术信息中心(NCBI)提供的一种算法，采用默认参数比较核苷酸序列。
本领域技术人员充分理解，很多序列同一性水平可以用于从其它物种鉴定多肽，其中所述多肽具有相同或相似的功能或活性。同一性百分比的有用实例包括但不限于50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％或95％，或50％-100％的任何整数百分比。实际上，从50％-100％的任何整数氨基酸同一性都可以用于描述本发明，如51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％。同样，感兴趣的是该分离的核苷酸片段的任何全长或部分互补序列。
当用于植物细胞时，术语“基因”不仅仅包括存在于细胞核中的染色体DNA，也包括存在于细胞的亚细胞成分(如线粒体、质体)中的细胞器DNA。
“基因”表示能表达特定蛋白的核酸片段，其包括位于编码序列前面(5’非编码序列)和后面(3’非编码序列)的调节序列。“天然基因”表示天然与它自身的调节序列一起存在的基因。“嵌合基因”表示不是天然基因的任何基因，包括不是天然一起存在的调节和编码序列。因此，嵌合基因可以包括来自不同来源的调节序列和编码序列，或来自相同的来源，但是以不同于天然存在的方式排列的调节序列和编码序列。正常情况下不存在于宿主生物中，但“外源”基因表示通过基因转移导入所述宿主生物的基因。外源基因可以包括插入非天然生物的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是业已通过转化方法导入基因组的基因。
“密码子优化的基因”是具有经过设计以便模拟宿主细胞的优选的密码子选择频率的密码子选择频率的基因。
“等位基因”是占据染色体上的特定基因座的基因的几种可选形式中的一种。当存在于染色体的给定基因座上的所有等位基因都相同时，植物在该基因座是纯合的。如果存在于染色体的给定基因座上的等位基因是不同的，植物在该基因座是杂合的。
“编码序列”表示编码特定氨基酸序列的DNA序列。“调节序列”表示位于编码序列上游(5’非编码序列)，序列内，或下游(3’非编码序列)的核苷酸序列，并且，它能影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。调节序列可以包括但不限于：启动子、翻译前导序列、内含子、聚腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应物结合位点和茎-环结构。
“启动子”表示能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。启动子序列由近端和更远端的上游元件组成，后一种元件通常称作增强子。因此，“增强子”是能够刺激启动子活性的DNA序列，并且可以是启动子的天然元件，或插入用于增强启动子的水平或组织同一性的异源元件。启动子可能完全来自天然基因，或者包括来自天然存在的不同启动子的不同元件，或者甚至包括合成的DNA片段。本领域技术人员可以理解的是，不同的启动子能够指导基因在不同的组织或细胞类型中的表达，或者在发育的不同阶段的表达，或者对不同的环境条件作出反应的表达。还应当理解的是，由于在大多数场合下，调节序列的确切边界未能完全确定，不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。能导致基因在大多数细胞类型中在大多数时间表达的启动子通常被称作“组成型启动子”。正在不断发现用于植物细胞中的各种类型的新启动子；许多实例可以参见Okamuro，J.K.，andGoldberg，R.B.Biochemistry of Plants，15：1-82(1989)中的编辑。
“翻译前导序列”是指位于基因的启动子序列和编码序列之间的多核苷酸序列。翻译前导序列存在于翻译起始序列上游的完全加工的mRNA中。翻译前导序列可以影响一级转录物加工为mRNA、mRNA稳定性或翻译效率。已经描述了翻译前导序列的实例(Turner，R.andFoster，G.D.，Mol.Biotechnol.，3：225-236(1995))。
术语＂3′非编码序列＂、＂转录终止子＂或＂终止序列＂表示位于编码序列下游的DNA序列，包括聚腺苷酸化识别序列以及编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其它序列。聚腺苷酸化信号通常以影响聚腺苷酸添加在mRNA前体的3′末端为特征。不同3’非编码序列的使用由Ingelbrecht，I.L.，等Plant Cell，1：671-680(1989)例举。
“RNA转录物”表示由RNA聚合酶催化的DNA序列转录而得到的产物。当RNA转录物是所述DNA序列的完全互补的拷贝时，它被称作初级转录物。当它是来自初级转录物的转录后加工的RNA序列时，RNA转录物被称作成熟RNA。“信使RNA”或“mRNA”表示没有内含子，并且能够由细胞翻译成蛋白的RNA。“cDNA”表示一种DNA，它是互补于mRNA模板并且用逆转录酶由mRNA合成的。CDNA可以是单链的，或用DNA聚合酶I的klenow片段转化为双链形式。“有义”RNA表示包括mRNA，并能够由细胞翻译成蛋白的RNA转录物。“反义RNA”表示互补于靶初级转录物或mRNA的全部或部分的RNA，并且它能阻断靶基因的表达(美国专利No.5,107,065)。反义RNA的互补性可以是与特定基因转录物的任何部分，即，在5’非编码序列、3’非编码序列、内含子或编码序列处互补的。“功能性RNA”表示反义RNA、核酶RNA、或不能翻译，但仍然能影响细胞加工的其他RNA。术语“互补序列”和“反向互补序列”在mRNA转录物方面在本文中可以互换使用，用于限定反义信使RNA。
术语“可操作性连接的”表示核酸序列缔合在单个核酸片段上，以便其中一个的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够调节编码序列的表达时，它就是与该编码序列可操作性连接的(即，所述编码序列受所述启动子的转录控制)。编码序列能够沿有义或反义方向可操作性与调节序列连接。在另一实例中，本发明的互补RNA区可以直接或间接连接在靶mRNA的5’，或靶mRNA的3’，或靶mRNA中，或第一互补区在靶mRNA的5’，其互补序列在靶mRNA的3’。
本文采用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域已知的，并且完整描述于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.MolecularCloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory：ColdSpring Harbor，NY(1989)。转化方法是本领域技术人员已知的，并且描述于下文。
“PCR”或“聚合酶链反应”是用于合成大量特定DNA片段的技术，由一系列重复的循环组成(Perkin Elmer Cetus Instruments，Norwalk，CT)。典型地，使双链DNA热变性，在低温下使两个与靶片段的3’边界互补的引物退火，然后在中等温度下延伸。一组上述三个连续步骤称作一个“循环”。
术语“重组的”是指两个原本分离的序列片段的人工重组，例如通过化学合成或通过基因工程技术操作核酸的分离片段。
术语“质粒”，“载体”和“盒”表示染色体外元件，它通常携带有不作为细胞的中心代谢部分的基因，并且通常是环状双链DNA片段形式的。所述元件可以是自主复制的序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列、线性或环状的单或双链DNA或RNA，可以来自任何来源，其中，多个核苷酸序列业已连接或重组成独特的结构，该结构能够将启动子片段和选定的基因产物的DNA序列，以及合适的3’非翻译序列导入细胞。＂转化盒＂表示包括外源基因，并且除了外源基因之外还具有能促进在特定宿主细胞中转化的元件的特定载体。“表达盒”表示包括外源基因，并且除了外源基因之外，还具有能够增强基因在外源宿主中表达的元件的特定载体(即离散的核酸片段，核酸序列或片段可以在其中移动)。
术语“重组构建体”、“表达构建体”、“嵌合构建体”、“构建体”和“重组DNA构建体”在本文中可以互换使用。重组构建体包含核酸片段，如天然不一起存在的调节和编码序列的人工组合。例如，嵌合构建体可以包含来源于不同来源的调节序列和编码序列，或来源于相同来源，但以不同于天然的方式排列的调节序列和编码序列。所述构建体可以单独使用或可以结合载体使用。如果使用载体，则载体的选择取决于本领域技术人员公知的用于转化宿主细胞的方法。例如，可以使用质粒载体。技术人员熟知为成功转化、选择和繁殖包含本发明的任何分离核酸片段而必须存在于载体上的遗传元件。本领域技术人员也可以认识到，不同的独立转化事件将导致不同的表达水平和模式(Jones等，EMBO J.，4：2411-2418(1985)；De Almeida等，Mol.Gen.Genetics，218：78-86(1989))，因此，为了获得展示需要的表达水平和模式的细胞系，筛选多个事件是优选的。所述筛选可以通过DNA的DNA印迹分析、mRNA表达的RNA印迹分析、蛋白表达的免疫印迹分析或表型分析等实现。
本文使用的术语“表达”是指产生功能性终产物(如mRNA或蛋白[前体或成熟])。
术语“导入”表示将核酸(如表达构建体)或蛋白提供到细胞中。导入包括将核酸掺入真核或原核细胞，其中核酸可以掺入细胞的基因组，并且包括给细胞瞬时提供核酸或蛋白。导入包括稳定或瞬时转化方法，以及有性杂交。因此，将核酸片段(如重组DNA构建体/表达构建体)插入细胞的上下文中的“导入”表示“转染”或“转化”或“转导”，并且包括将核酸片段掺入真核或原核细胞，其中核酸片段可以掺入细胞的基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，转化为自主复制子，或瞬时表达(如转染的mRNA)。
“成熟”蛋白表示翻译后加工的多肽(即，业已除去了存在于初级翻译产物中的所有前肽或原肽的蛋白)。“前体”蛋白表示mRNA翻译的初级产物(即，仍然存在前肽和原肽)。前肽和原肽可以是(但不局限于)细胞内定位信号。
“稳定转化”是指核酸片段转移到宿主生物的基因组，包括细胞核和细胞器基因组，导致遗传学稳定的遗传。相反，“瞬时转化”是指核酸片段转移到宿主生物的细胞核或含DNA的细胞器，导致基因表达而不导致整合或稳定遗传。含转化的核酸片段的宿主生物称作“转基因”生物。
本文用到的“转基因的”是指基因组中包含异源多核苷酸的植物或细胞。优选地，异源多核苷酸稳定整合到基因组中，使得多核苷酸传递到后续世代中。异源多核苷酸可以单独整合到基因组中或作为表达载体的一部分。“转基因的”在本文中包括通过异源核酸的存在而使基因型改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括最初如此改变或通过有性杂交或无性繁殖从最初的转基因生物得到的转基因生物。本文用到的术语“转基因的”不包括通过常规植物育种方法或通过天然发生的事件如随机交叉受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变导致的基因组(染色体或染色体外)改变。
“反义抑制”是指产生能够抑制靶蛋白表达的反义RNA转录物。“共抑制”是指产生能够抑制相同或基本相似的外来或内源基因表达的有义RNA转录物(美国专利No.5,231,020)。以前通过以有义方向超量表达与内源mRNA具有同源性的核酸序列设计了植物中的共抑制构建体，其导致所有与超量表达的序列具有同源性的RNA减少(Vaucheret等，Plant J.，16：651-659(1998)；Gura，Nature，404：804-808(2000))。该现象的总体效率低，RNA减少的程度广泛可变。更近的研究描述了“发夹”结构，其以互补方向掺入mRNA编码序列的全部或部分，导致表达的RNA的“茎-环”结构(PCT公开No.WO99/53050；PCT公开No.WO 02/00904)。这增加了回收的转基因植物中共抑制的频率。另一种变化形式描述了使用植物病毒序列指导近端mRNA编码序列的抑制或“沉默”(PCT公开No.WO 98/36083)。这些共抑制现象都没有从机理上阐述，但遗传证据解开了该复杂状况(Elmayan等，Plant Cell，10：1747-1757(1998))。
术语“含油的”表示倾向于以脂质形式储存它们的能源的生物(Weete：Fungal Lipid Biochemistry，2nd ed.，Plenum，1980)。鉴定为含油的一类植物通常称作“油籽”植物。油籽植物的实例包括但不限于大豆(Glycine and Soja sp.)、亚麻(Linum sp.)、油菜籽(Brassica sp.)、玉米、棉花、红花(Carthamus sp.)和向日葵(Helianthus sp.)。
一般，在含油微生物内，细胞油或TAG含量遵循S形曲线，其中，脂类的浓度增加，直到在后对数期或早期静止生长期的最大值，然后在晚期静止期和死亡期逐渐减少(Yongmanitchai和Ward，Appl.Environ，Microbiol.57：419-25(1991))。
术语“含油酵母”表示被分类为酵母的微生物，它们能够产生油。含油微生物积累占干细胞重量的大约25％以上的油并非是不常见的。含油酵母的例子包括，但不局限于以下属：耶氏酵母属，假丝酵母属，红酵母属，红冬孢属，隐球酵母属，丝孢酵母属和油脂酵母属。
术语“裸藻纲(Euglenophyceae)”是指在淡水、海水、土壤和寄生环境中存在的一组单细胞无色或光合鞭毛虫(“眼虫类(euglenoids)”)。该纲的特征在于单独的单细胞，其中大多数是自由游泳的，并且具有从称作储水池的前褶伸出的两个编毛(其中之一可以是不出现的)。光合眼虫类包含一个至多个叶绿体，其从小盘状到大盘或带状。已经描述了大约1000个物种，并且分类为大约40个属和6个目。裸藻纲的实例包括但不限于以下属：双鞭藻虫属(Eutreptiella)、眼虫属(Euglena)和Tetruetreptia。
术语“植物”是指完整的植物、植物器官、植物组织、种子、植物细胞、种子及其后代。植物细胞包括但不限于种子细胞、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
“后代”包括植物的任何后续世代。
概述：脂肪酸和甘油三酯的微生物生物合成
一般地，含油微生物中的脂质积累是反应于生长培养基中存在的总体碳氮比而引发的。导致游离棕榈酸(16:0)在含油微生物中从头合成的该过程详细描述于2004/101757。棕榈酸是长链饱和和不饱和脂肪酸衍生物的前体，其通过延伸酶和去饱和酶的作用形成(图1)。
通过一系列反应形成TAGs(脂肪酸的主要存储单位)，所述一系列反应包括：1.)一个分子的酰基-CoA通过酰基转移酶酯化为甘油-3-磷酸，以产生溶血磷脂酸；2.)第二个分子的酰基-CoA通过酰基转移酶酯化，产生1，2-二酰基甘油磷酸(通常鉴定为磷脂酸)；3.)由磷脂酸磷酸酶除去一个磷酸，产生1，2-二酰基甘油(DAG)；和4.)通过酰基转移酶的作用加入第三个脂肪酸，以形成TAG。可以将广泛的脂肪酸掺入TAGs，包括饱和和不饱和脂肪酸，以及短链和长链脂肪酸。
ω脂肪酸的生物合成
将油酸转化为长链ω-3/ω-6脂肪酸的代谢过程涉及通过加入碳原子而延伸碳链和通过加入双键使分子去饱和。这需要一系列存在于内质网膜中的特殊的去饱和和延伸酶。但是，如图1所示和下文的描述，通常存在多个替代途径用于生产特定的ω-3/ω-6脂肪酸。
具体地，所有途径都需要通过Δ12去饱和酶的作用最初将油酸转化为LA，即ω-6脂肪酸的第一个。然后，利用“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”，通过如下过程形成长链ω-6脂肪酸：(1)通过Δ9延伸酶的作用，LA转化为EDA；(2)通过Δ8去饱和酶的作用，EDA转化为DGLA；和(3)通过Δ5去饱和酶的作用，DGLA转化为ARA。或者，可以利用“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”，通过如下过程形成长链ω-3脂肪酸：(1)通过Δ15去饱和酶的作用，LA转化为ALA，即ω-3脂肪酸的第一个；(2)通过Δ9延伸酶的作用，ALA转化为ETrA；(3)通过Δ8去饱和酶的作用，ETrA转化为ETA，(4)通过Δ5去饱和酶的作用，ETA转化为EPA，(5)通过C20/22延伸酶的作用，EPA转化为DPA；和(6)通过Δ4去饱和酶的作用，DPA转化为DHA。任选地，ω-6脂肪酸可以转化为ω-3脂肪酸；例如，通过Δ17去饱和酶活性，分别从DGLA和ARA生产ETA和EPA。
用于生物合成ω-3/ω-6脂肪酸的替代途径利用Δ6去饱和酶和C18/20延伸酶(即“Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径”)。更具体地，通过Δ6去饱和酶的作用，LA和ALA可以分别转化为GLA和STA；然后，C18/20延伸酶将GLA转化为DGLA和/或STA转化为ETA。
考虑需要导入特定宿主生物以生产ω-3/ω-6脂肪酸的特定功能性将依赖于宿主细胞(及其天然PUFA谱和/或去饱和酶/延伸酶谱)、底物的可获得性和需要的终产物。例如，在一些实施方案中，与Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶的表达相比，Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径的表达可能是优选的，因为通过后一途径产生的PUFAs不含GLA。
本领域技术人员将能够鉴定编码ω-3/ω-6脂肪酸生物合成所需的每一种酶的多种候选基因。有用的去饱和酶和延伸酶序列可以来源于任何来源，如分离自天然来源(如细菌、藻类、真菌、植物、动物等)，通过半合成途径产生或从头合成。尽管导入宿主中的去饱和酶和延伸酶基因的特定来源对于本发明不是关键的，但用于选择具有去饱和酶或延伸酶活性的特定多肽的考虑包括：1)多肽的底物特异性；2)多肽或其成分是否是限速酶；3.)去饱和酶或延伸酶对于需要的PUFA的合成是否是必须的；和/或4.)多肽需要的辅因子。表达的多肽优选具有与其在宿主细胞中的位置的生化环境相容的参数(其它细节参见PCT公开No.WO 2004/101757)。
在其它实施方案中，考虑每种特定去饱和酶和/或延伸酶的转化效率也是有用的。更具体地，由于每种酶很少以100％的效率将底物转化为产物，在宿主细胞中生产的未纯化油的最终脂质谱将典型是多种PUFAs的混合物，其由需要的ω-3/ω-6脂肪酸以及多种上游中间PUFAs组成。因此，当对需要的脂肪酸的生物合成进行优化时，考虑每种酶的转化效率也是重要的，必须根据产物的最终需要的脂质谱进行考虑。
根据上述每一种考虑，可以根据公众可获得的文献(如GenBank)、专利文献和具有生产PUFAs的能力的微生物的实验分析，鉴定具有合适去饱和酶和延伸酶活性(例如Δ6去饱和酶，C18/20延伸酶，Δ5去饱和酶，Δ17去饱和酶，Δ15去饱和酶，Δ9去饱和酶，Δ12去饱和酶，C14/16延伸酶，C16/18延伸酶，Δ9延伸酶，Δ8去饱和酶，Δ4去饱和酶和C20/22延伸酶)的候选基因。这些基因适于导入特定宿主生物，以便能够增强生物的PUFAs合成。
新Δ9延伸酶的序列鉴定
在本发明中，从纤细眼虫(本文命名为“EgD9e＂)和双鞭藻虫种CCMP389(本文命名为“E389D9e”)分离了编码Δ9延伸酶的核苷酸序列。
采用Clustal V分析，与公共数据库比较EgD9e核苷酸碱基和推定的氨基酸序列，发现在258个氨基酸的长度上最相似的已知序列(即IgD9e)与EgD9e的氨基酸序列具有大约31.8％同一性。
采用Clustal V分析，与公共数据库比较E389D9e核苷酸碱基和推定的氨基酸序列，发现在263个氨基酸的长度上最相似的已知序列(即IgD9e)与本文报道的E389D9的氨基酸序列具有大约33.1％同一性。
作为参考，采用Clustal V分析，本文描述为SEQ ID NO：2和SEQID NO：5的新EgD9e和E389D9e蛋白序列具有65.1％同一性。
在本发明的上下文中，优选的氨基酸片段与本文的EgD9e和E389D9e序列具有至少约70％-85％同一性，其中具有至少约85％-90％同一性的那些序列是特别合适的，具有至少约90％-95％同一性的那些序列是最优选的。相应于本发明的ORFs的优选EgD9e和E389D9e编码核酸序列分别是编码活性蛋白的那些和与本文报道的EgD9e和E389D9e的核酸序列具有至少约70％-85％同一性的那些，其中具有至少85％-90％同一性的那些序列是特别合适的，具有至少约90％-95％同一性的那些序列是最优选的。
在替代实施方案中，本发明的EgD9e和E389D9e序列可以为在特定宿主生物中表达而进行密码子优化。如本领域公知的，在替代宿主中进一步优化酶的表达是有用的方法，因为宿主优选的密码子的使用可以显著增强编码多肽的外来基因的表达。一般地，通过检验蛋白(优选以最大量表达的那些)中的密码子选择和确定哪些密码子以最高的频率使用，可以在特定感兴趣的宿主物种中确定宿主优选的密码子。然后，可以用宿主物种中优选的密码子全部或部分地合成具有例如延伸酶活性的感兴趣多肽的编码序列。也可以合成DNA的全部(或部分)，以除去转录的mRNA中存在的任何二级结构去稳定序列或区域。也可以合成DNA的全部(或部分)，以将碱基组成改变成在需要的宿主细胞中更优选的组成。
在本发明的一种优选实施方案中，EgD9e和E389D9e为在解脂耶氏酵母中表达而进行了密码子优化。通过首先确定解脂耶氏酵母密码子选择谱(参见PCT公开No.WO 04/101757)然后鉴定优选的那些密码子，可以实现上述目的。通过确定“ATG”起始密码子附近的共有序列，实现解脂耶氏酵母中基因表达的进一步优化。
EgD9e的优化导致777bp编码区中117bp的修饰(15.1％)和106个密码子的优化。密码子优化的基因(“EgD9eS”；SEQ ID NO：3)中的修饰都没有改变编码的蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。如实施例8的描述，当在解脂耶氏酵母中表达时，密码子优化的基因在将LA延伸为EDA方面比野生型EgD9e基因的效率高约16.2％。
类似地，E389D9e的优化导致792编码区中128bp的修饰(16.2％)和113个密码子的优化。密码子优化的基因(“E389D9eS”；SEQ ID NO：6)中的修饰都没有改变编码的蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。如实施例24的描述，当在解脂耶氏酵母中表达时，密码子优化的基因在将LA延伸为EDA方面与野生型EgD9e基因的效率相似。
因此，本发明涉及编码具有Δ9延伸酶活性的多肽的多核苷酸序列，选自下组：
(a)分离的核酸序列，包含编码具有Δ9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比对方法，所述多肽与SEQ ID NO：2(EgD9e)或SEQ ID NO：5(E389D9e)所示氨基酸序列相比，具有至少70％氨基酸同一性；
(b)分离的核酸序列，包含编码具有Δ9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于BLASTN比对方法，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1(EgD9e)、SEQ ID NO：3(EgD9eS)、SEQ ID NO：4(E389D9e)或SEQ IDNO：6(E389D9eS)所示核苷酸序列相比，具有至少70％序列同一性；
(c)分离的核酸序列，包含编码具有Δ9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在以下严格杂交条件下与SEQ ID NO：1(EgD9e)、SEQ ID NO：3(EgD9eS)、SEQ ID NO：4(E389D9e)或SEQ IDNO：6(E389D9eS)所示核苷酸序列杂交：0.1X SSC，0.1％ SDS，65℃，并且用2X SSC，0.1％ SDS洗涤，随后用0.1X SSC，0.1％ SDS洗涤；和
(d)上述(a)、(b)或(c)的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和所述核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成，并且是100％互补的。
本领域技术人员能够采用本文的教导，基于野生型EgD9e和/或E389D9e序列，制备其它适于在替代的宿主(即除解脂耶氏酵母外)中最优表达的密码子优化的Δ9延伸酶蛋白。这种替代的宿主生物可以包括但不限于植物或植物部分。因此，本发明涉及来源于野生型EgD9e(即由SEQ ID NO：2编码)或野生型E389D9e(即由SEQ ID NO：5编码)的任何密码子优化的Δ9延伸酶蛋白。这包括但不限于：SEQ ID NO：3(其编码合成的Δ9延伸酶蛋白(即EgD9eS))和SEQ ID NO：6(其编码合成的Δ9延伸酶蛋白(即E389D9eS))所示的核苷酸序列，这两者都为在解脂耶氏酵母中表达而进行了密码子优化。
另一方面，本发明涉及分离的核酸片段，其包含编码Δ9延伸酶的核酸序列，排除SEQ ID NO：8(即“IgD9e”，来自球等鞭金藻的Δ9延伸酶(NCBI登录号AAL37626(GI17226123))，其中包含所述Δ9延伸酶的氨基酸序列包含至少一个选自下组的以下氨基酸序列基序：
a)Y N X(L或F)X X X X S X X S F(SEQ ID NO：123)；
b)F Y X S K X X(E或D)Y X D(T或S)X X L(SEQ ID NO：124)；
c)L(Q或H)X F H H X G A(SEQ ID NO：125)；
d)M Y X Y Y X X X X X X X(K或R或N)F(SEQ ID NO：126)；
e)K X L(I或L或M)T X X Q(SEQ ID NO：127)；
f)W X F N Y X Y(SEQ ID NO：128)；和
g)Y X G X V X X L F(SEQ ID NO：129)；
其中X可以是任何氨基酸。
加下划线的氨基酸可以是Δ9延伸酶特有的。图2显示了用ClustalV比对(采用默认参数)进行的本发明的Δ9延伸酶与来自球等鞭金藻的Δ9延伸酶的比较。具体地，比较了SEQ ID NO：2(EgD9e)，SEQ IDNO：5(E389D9e)和SEQ ID NO：8(IgD9e)。包含本发明的基序的区域在框中表示。
同源物的鉴定和分离
任何本发明的延伸酶序列(即EgD9e，EgD9eS，E389D9e，E389D9eS)或其部分都可以用于采用序列分析软件在相同或其它细菌、藻类、真菌、眼虫类或植物物种中检索Δ9延伸酶同源物。一般地，所述计算机软件通过将同源性程度赋予多个取代、缺失和其它修饰，匹配相似的序列。
或者，任何本发明的延伸酶序列或其部分也可以用作鉴定Δ9延伸酶同源物的杂交试剂。核酸杂交试验的基本组分包括探针，怀疑含有目标基因或基因片段的样品，和特定杂交方法。本发明的探针典型地是与待测核酸序列互补的单链核酸序列。探针与待测核酸序列“可杂交”。探针长度可以从5个碱基至数万碱基，但典型地，约15碱基至约30碱基的探针长度是合适的。仅仅探针分子的一部分需要与待测核酸序列互补。另外，探针和靶序列之间的互补性不需要是完全的。杂交会发生在非完全互补的分子之间，结果是，杂交区中的某些碱基部分未与适当的互补碱基配对。
杂交方法是非常确定的。典型地，必须在允许核酸杂交的条件下，混合探针和样品。这包含，在适当浓度和温度条件下，在有无机或有机盐存在下，使探针接触样品。探针和样品核酸必须接触足够长的时间，使探针和样品核酸之间可以发生任何可能的杂交。混合物中探针或靶的浓度，决定着发生杂交所需的时间。探针或靶浓度越高，所需的杂交温育时间越短。任选地，可以加入离液剂(例如氯化胍，硫氰酸胍，硫氰酸钠，四氯醋酸锂，高氯酸钠，四氯醋酸铷，碘化钾、三氟醋酸铯)。如果需要，可以向杂交混合物中加入甲酰胺，典型地，30-50％(v/v)。
可以使用多种杂交溶液。典型地，它们包含约20-60％体积(优选30％)的极性有机溶剂。常见的杂交溶液使用约30-50％v/v甲酰胺，约0.15-1M氯化钠，约0.05-0.1缓冲剂(例如，柠檬酸钠，Tris-HCl，PIPES或HEPES(pH范围约6-9))，约0.05-0.2％去污剂(例如，十二烷基硫酸钠)，或0.5-20mM EDTA，FICOLL(Pharmacia Inc.)(约300-500kdal)，聚乙烯吡咯酮(约250-500kdal)和血清白蛋白。在典型的杂交溶液中还包含约0.1-5mg/mL未标记的载体核酸，断裂的核酸DNA(例如，小牛胸腺或鲑精DNA，或酵母RNA)，和任选的约0.5-2％wt/vol甘氨酸。也可以包含其它添加剂，例如体积排阻剂，包括许多极性的水-溶的或可溶胀的试剂(例如，聚乙二醇)，阴离子聚合物(例如，聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯)和阴离子糖聚合物(例如，硫酸葡聚糖)。
核酸杂交适用于许多测定形式。最适当的形式之一是夹心测定形式。夹心测定特别适用于在非变性条件下的杂交。夹心型测定的基本组分是固体支持物。固体支持物具有吸附或共价结合到它上面的固定化的核酸探针，后者未被标记，且与序列的一部分互补。
在另外的实施方案中，任何本文描述的Δ9延伸酶核酸片段(或其任何鉴定的同源物)都可以用于从相同或其它细菌、藻类、真菌、眼虫类或植物物种中分离编码同源蛋白的基因。使用序列依赖性的方法分离同源基因，是本领域众所周知的。序列依赖性的方法的实例包括但不限于：1.)核酸杂交方法；2.)DNA和RNA扩增方法，如通过使用各种核酸扩增技术所例证的[例如，聚合酶链反应(PCR)，Mullis等，美国专利4,683,202；连接酶链反应(LCR)，Tabor，S.等，Proc.Acad.Sci.USA 82：1074(1985)；或链置换扩增(SDA)，Walker，等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89：392(1992)]；和3.)文库构建和筛选互补的方法。
例如，通过使用本领域技术人员熟知的方法，使用本发明的核酸片段的全部或一部分作为DNA杂交探针，来从例如任何目标酵母或真菌(其中生产EDA和/或ETrA的生物是优选的)筛选文库，可以直接分离编码与本文所述Δ9延伸酶类似的蛋白或多肽的基因。通过本领域已知的方法(Maniatis，同上)，可以设计和合成基于本发明的核酸序列的特异性寡核苷酸探针。此外，通过技术人员已知的方法(例如，随机引物DNA标记，切口平移或末端标记技术)，可以将完整序列直接用于合成DNA探针，或使用可得到的体外转录系统，合成RNA探针。另外，可以设计特异性的引物，并用于扩增本发明序列的一部分(或全长)。可以在扩增反应过程中直接标记得到的扩增产物，或在扩增反应后标记，并用作探针，来在适当严格性条件下分离全长DNA片段。
典型地，在PCR-型扩增技术中，引物具有不同的序列，且彼此不互补。根据希望的测试条件，引物的序列应当设计成能提供靶核酸的有效且可靠的复制。PCR引物设计方法是本领域常见的且众所周知的(Thein和Wallace，＂The use of oligonucleotides as specific hybridizationprobes in the Diagnosis of Genetic Disorders＂，in Human GeneticDiseases：A Practical Approach，K.E.Davis Ed.，(1986)pp 33-50，IRL：Herndon，VA；和Rychlik，W，In Methods in Molecular Biology，White，B.A.Ed.，(1993)Vol.15，pp 31-39，PCR Protocols：Current Methods andApplications.Humania：Totowa，NJ)。
通常，本发明序列的两个短片段可以用于聚合酶链反应方法中，以从DNA或RNA扩增编码同源基因的更长核酸片段。聚合酶链反应也可以在克隆的核酸片段文库上进行，其中一个引物的序列源自本发明的核酸片段，且另一个引物的序列利用聚腺苷酸束，其存在于编码微生物基因的mRNA前体的3′末端。
或者，第二个引物序列可以基于源自克隆载体的序列。例如，技术人员可以按照RACE方法(Frohman等，PNAS USA 85：8998(1988))，使用PCR扩增转录物中的单个点和3′或5′末端之间的区域的拷贝，产生cDNA。从本发明序列，可以设计朝向3′和5′方向的引物。使用可商业得到的3′RACE或5′RACE系统(例如，BRL，Gaithersburg，MD)，可以分离特异性的3′或5′cDNA片段(Ohara等，PNAS USA 86：5673(1989)；Loh等，Science 243：217(1989))。
在其它实施方案中，可以用本文描述的任何Δ9延伸酶核酸片段(或其任何鉴定的同源物)制备新的和改进的脂肪酸延伸酶。如本领域技术人员公知的，可以用体外诱变和选择、化学诱变、“基因改组”方法或其它方法获得天然延伸酶基因的突变(其中所述突变可以包括缺失、插入和点突变或其组合)。这使得能够在体内生产分别具有延伸酶活性的多肽，其具有在宿主细胞中起作用的更理想的物理和动力学参数(如更长的半衰期或生产需要的PUFA的更高速度)。或者，如果需要，可以通常规诱变、得到的突变多肽的表达和它们活性的确定，来测定对酶活性重要的感兴趣多肽(即Δ9延伸酶)的区域。这些技术的综述描述于PCT公开No.WO 2004/101757。来源于EgD9e，EgD9eS，E389D9e和E389D9eS的所有所述突变蛋白和编码它们的核苷酸序列都在本发明的范围内。
或者，可以通过结构域交换合成改进的脂肪酸，其中来自本文描述的任何Δ9延伸酶核酸片段的功能性结构域与替代的延伸酶基因中的功能性结构域交换，从而得到新的蛋白。
生产多种ω-3和/或ω-6脂肪酸的方法
合适的启动子控制下的本文描述的编码Δ9延伸酶(即EgD9e，EgD9eS，E389D9e，E389D9eS或其它突变酶、密码子优化的酶或其同源物)的嵌合基因的导入预期将分别导致转化的宿主生物中EDA和/或ETrA的生产增加。因此，本发明包括用于直接生产PUFAs的方法，包括将脂肪酸底物(即LA和/或ALA)暴露于本文描述的延伸酶(如EgD9e，EgD9eS，E389D9e，E389D9eS)，使得底物转化为需要的脂肪酸产物(即EDA和/或ETrA)。
更具体地，本发明的目的是提供在宿主细胞(如含油酵母、大豆)中生产EDA的方法，其中所述宿主细胞包含：
a)分离的多核苷酸序列，编码具有Δ9延伸酶活性的多肽，所述多核苷酸序列选自：
(1)分离的核酸序列，包含编码具有Δ9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比对方法，所述多肽与SEQ ID NO：2(EgD9e)或SEQ ID NO：5(E389D9e)所示氨基酸序列相比，具有至少70％氨基酸同一性；
(2)分离的核酸序列，包含编码具有Δ9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在以下严格条件下与SEQ ID NO：1(EgD9e)、SEQ ID NO：3(EgD9eS)、SEQ ID NO：4(E389D9e)或SEQ IDNO：6(E389D9eS)所示核苷酸序列杂交：0.1X SSC，0.1％ SDS，65℃，并且用2X SSC，0.1％ SDS洗涤，随后用0.1X SSC，0.1％ SDS洗涤；和
b)LA的来源；
其中在表达Δ9延伸酶并且将LA转化为EDA的条件下使宿主细胞生长；以及任选回收EDA。
在本发明的替代实施方案中，Δ9延伸酶可以用于将ALA转化为ETrA。因此，本发明提供了生产ETrA的方法，其中所述宿主细胞包含：
a)分离的多核苷酸序列，编码具有Δ9延伸酶活性的多肽，所述多核苷酸序列选自：
(1)分离的核酸序列，包含编码具有Δ9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比对方法，所述多肽与SEQ ID NO：2(EgD9e)或SEQ ID NO：5(E389D9e)所示氨基酸序列相比，具有至少70％氨基酸同一性；
(2)分离的核酸序列，包含编码具有Δ9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在以下严格条件下与SEQ ID NO：1(EgD9e)、SEQ ID NO：3(EgD9eS)、SEQ ID NO：4(E389D9e)或SEQ IDNO：6(E389D9eS)所示核苷酸序列杂交：0.1X SSC，0.1％ SDS，65℃，并且用2X SSC，0.1％ SDS洗涤，随后用0.1X SSC，0.1％ SDS洗涤；和
b)ALA的来源；
其中在表达Δ9延伸酶并且将ALA转化为ETrA的条件下使宿主细胞生长；以及任选回收ETrA。
或者，本文描述的每种Δ9延伸酶基因及其相应酶产物可以间接用于生产各种ω-6和ω-3PUFAs，包括例如DGLA，ETA，ARA，EPA，DPA和/或DHA(图1；参见PCT公开No.WO 2004/101757)。当脂肪酸底物通过中间步骤或中间途径间接转化为需要的脂肪酸产物时，发生ω-3/ω-6 PUFAs的间接生产。因此，考虑本文描述的Δ9延伸酶(例如EgD9e，EgD9eS，E389D9e，E389D9eS或其它突变酶，密码子优化的酶或其同源物)可以与编码PUFA生物合成途径的酶(例如Δ6去饱和酶，C18/20延伸酶，Δ17去饱和酶，Δ15去饱和酶，Δ9去饱和酶，Δ12去饱和酶，C14/16延伸酶，C16/18延伸酶，Δ5去饱和酶，Δ8去饱和酶，Δ4去饱和酶，C20/22延伸酶)的其它基因联合表达，导致更高水平的长链ω-3/ω-6脂肪酸(例如ARA，EPA，DPA和DHA)的生产。
在优选实施方案中，本发明的Δ9延伸酶将最少与Δ8去饱和酶(例如SEQ ID NO：61所示的Δ8去饱和酶[EgD8]或SEQ ID NO：69所示的密码子优化的Δ8去饱和酶[EgD8S])联合表达。但是，特定表达盒中包含的特定基因将取决于宿主细胞(及其PUFA谱和/或去饱和酶/延伸酶谱)、底物的可获得性和需要的终产物。
在替代的实施方案中，基于本文公开的完整序列、这些完整序列的互补序列、这些序列的主要部分、来源于它们的密码子优化的延伸酶和与其基本同源的序列，破坏宿主生物的天然Δ9延伸酶可能是有用的。
植物表达系统、盒和载体，以及转化
在一种实施方案中，本发明涉及重组构建体，其包含与至少一个适于在植物中表达的调节序列可操作性连接的本发明的任意一种Δ9延伸酶多核苷酸。
启动子是指导植物的细胞机制从而从启动子下游(3′)的连续编码序列产生RNA的DNA序列。启动子区影响产生基因的RNA转录物的速度、发育阶段和细胞类型。加工RNA转录物，产生mRNA，其作为用于将RNA序列翻译为所编码的多肽的氨基酸序列的模板。5’非翻译前导序列是蛋白编码区上游的mRNA区，其在mRNA的起始和翻译中起作用。3’转录终止/聚腺苷酸化信号是蛋白编码区下游的非翻译区，其在植物细胞中导致RNA转录物的终止和在RNA的3’末端添加聚腺苷酸。
选择用于驱动Δ9延伸酶编码序列表达的启动子的起点不是重要的，只要它具有足够的转录活性，从而通过在正确的时间在需要的宿主组织中表达需要的核酸片段的可翻译mRNA而实现本发明。可以用异源或非异源(即内源)启动子实施本发明。例如，合适的启动子包括，但不限于：β-大豆球蛋白(conglycinin)启动子的α-引发亚基、Kunitz胰蛋白酶抑制剂3启动子、膜联蛋白启动子、Gly1启动子、β-大豆球蛋白启动子的β亚基、P34/Gly Bd m 30K启动子、白蛋白启动子、Leg A1启动子和Leg A2启动子。
膜联蛋白或P34启动子描述于PCT公开No.WO 2004/071178(2004年8月26日公开)。膜联蛋白启动子的活性水平与很多已知的强启动子相似，例如：(1)CaMV 35S启动子(Atanassova等，Plant Mol.Biol.，37：275-285(1998)；Battraw和Hall，Plant Mol.Biol.，15：527-538(1990)；Holtorf等，Plant Mol.Biol.，29：637-646(1995)；Jefferson等，EMBOJ.，6：3901-3907(1987)；Wilmink等，Plant Mol.Biol.，28：949-955(1995))；(2)拟南芥油质蛋白启动子(Plant等，Plant Mol.Biol.，25：193-205(1994)；Li，Texas A&M University Ph.D.dissertation，pp.107-128(1997))；(3)拟南芥遍在蛋白延伸蛋白启动子(Callis等，J.Biol.Chem.，265(21)：12486-93(1990))；(4)番茄遍在蛋白基因启动子(Rollfinke等，Gene，211(2)：267-76(1998))；(5)大豆热激蛋白启动子(Schoffl等，Mol.Gen.Genet.，217(2-3)：246-53(1989))；和(6)玉米H3组蛋白基因启动子(Atanassova等，Plant Mol.Biol.，37(2)：275-85(1989))。
膜联蛋白启动子的另一个有用的特征是其在发育中的种子中的表达谱。膜联蛋白启动子在早期阶段(授粉后10天之前)的发育中的种子中活性最高，并且在晚期阶段是很大程度静止的。膜联蛋白启动子的表达谱与很多种子特异性启动子，如种子贮藏蛋白启动子不同，所述种子贮藏蛋白启动子通常在发育的较晚阶段提供最高活性(Chen等，Dev.Genet.，10：112-122(1989)；Ellerstrom等，Plant Mol.Biol.，32：1019-1027(1996)；Keddie等，Plant Mol.Biol.，24：327-340(1994)；Plant等，(同上)；Li，(同上))。膜联蛋白启动子具有更常规的表达谱，但保持与其它已知的种子特异性启动子不同。因此，当需要在早期发育阶段中在胚中超量表达或抑制基因时，膜联蛋白启动子将是非常有吸引力的候选物。例如，可能需要超量表达调节早期胚发育的基因或在种子成熟前参与代谢的基因。
鉴定适用于表达特定Δ9延伸酶编码序列的合适启动子后，随后用本领域技术人员公知的常规方法以有义方向可操作性连接启动子。
本文采用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域已知的，并且更完整描述于Sambrook，J.等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual；第二版；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，NewYork，1989(下文称作“Sambrook等，1989”)或Ausubel，F.M.，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.和Struhl，K.，Eds.；Current Protocols inMolecular Biology；John Wiley andSons：New York，1990(下文称作“Ausubel等，1990”)。
一旦制备了重组构建体，随后可以通过本领域技术人员公知的方法(例如转染、转化和电穿孔)将其导入选择的植物细胞。油籽植物细胞是优选的植物细胞。随后在合适的条件下培养和再生转化的植物细胞，从而使得能够表达长链PUFA，然后任选回收和纯化长链PUFA。
本发明的重组构建体可以导入植物细胞；或者，替代地，每种构建体可以导入分开的植物细胞。
按照上文的描述可以通过瞬时或稳定方式实现植物细胞的表达。
可以在种子中表达需要的长链PUFAs。从所述转化的植物获得的种子或植物部分也包含在本发明的范围内。
植物部分包括分化和未分化的组织，包括但不限于以下这些：根、茎、芽、叶、花粉、种子、瘤组织和多种形式的细胞和培养物(例如单细胞、原生质体、胚和愈伤组织)。植物组织可以在植物中或植物器官、组织或细胞培养物中。
术语“植物器官”是指植物组织或一组组织，其构成植物的形态和功能上不同的部分。术语“基因组”是指以下：1)在生物的每个细胞或病毒或细胞器中存在的遗传材料(基因和非编码序列)的完整互补物；和/或2)作为(单倍体)单位从一个亲本遗传的完整的一组染色体。
因此，本发明也涉及转化细胞的方法，包括用本发明的重组构建体转化细胞，并且选择用所述重组构建体转化的细胞。
也感兴趣的是用于生产转化的植物的方法，包括用本发明的Δ9延伸酶多核苷酸转化植物细胞，并且从转化的植物细胞再生植物。
公开了用于转化双子叶植物(主要通过使用根癌土壤杆菌)并且获得转基因植物的方法，其用于例如：棉花(美国专利No.5,004,863；美国专利No.5,159,135)；大豆(美国专利No.5,569,834；美国专利No.5,416,011)；芸苔(美国专利No.5,463,174)；花生(Cheng等，Plant CellRep.，15：653-657(1996)；McKently等，Plant Cell Rep.，14：699-703(1995))；木瓜(Ling，K.等，Bio/technology，9：752-758(1991))；和豌豆(Grant等，Plant Cell Rep.，15：254-258(1995))。关于其它常用植物转化方法的综述参见Newell，C.A.(Mol.Biotechnol.，16：53-65(2000))。这些转化方法之一采用发根土壤杆菌(Tepfler，M.and Casse-Delbart，F.，Microbiol.Sci.，4：24-28(1987))。公开了采用PEG融合(PCT公开No.WO 92/17598)，电穿孔(Chowrira，G.M.等，Mol.Biotechnol.，3：17-23(1995)；Christou，P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.Sci.USA，84：3962-3966(1987))，微注射，或粒子轰击(McCabe，D.E.等，Bio/Technology，6：923(1988)；Christou等，Plant Physiol.，87：671-674(1988))，通过直接送递DNA而转化大豆。
存在很多用于从植物组织再生植物的方法。特定再生方法将取决于起始的植物组织和要再生的特定植物物种。从单植物原生质体转化体或从多个转化的外植体再生、发育和培养植物的方法是本领域公知的(Weissbach和Weissbach，：Methods for Plant Molecular Biology，(Eds.)，Academic：San Diego，CA(1988))。这种再生和生长过程通常包括以下步骤：选择转化的细胞，培养所述单个细胞，经过通常的胚发育阶段到有根幼苗阶段。类似地再生转基因胚和种子。得到的转基因有根的芽随后种植在合适的植物生长培养基如土壤中。优选地，再生的植物是自授粉的，以提供纯合转基因植物。否则，从再生的植物获得的花粉与农业重要品系的种子生长的植物杂交。相反，来自这些重要品系的植物的花粉用于给再生植物授粉。用本领域技术人员公知的方法培养含需要的多肽的本发明的转基因植物。
除了上文讨论的程序，从业者熟知标准资源，其针对以下内容描述了特定条件和程序：大分子(如DNA分子、质粒等)的构建、操作和分离；重组DNA片段和重组表达构建体的制备；和克隆的筛选和分离。参见，例如：Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor：NY(1989)；Maliga等，Methods in Plant MolecularBiology，Cold Spring Harbor：NY(1995)；Birren等，Genome Analysis：Detecting Genes，Vol.1，Cold Spring Harbor：NY(1998)；Birren等，Genome Analysis：Analyzing DNA，Vol.2，Cold Spring Harbor：NY(1998)；Plant Molecular Biology：A Laboratory Manual，eds.Clark，Springer：NY(1997)。
油籽植物的实例包括但不限于大豆、芸苔物种、向日葵、玉米、棉花、亚麻和红花。
具有至少20个碳原子和5个或更多碳-碳双键的PUFAs的实例包括但不限于ω-3脂肪酸，例如EPA，DPA和DHA。从所述植物获得的种子以及从所述种子获得的油也属于本发明的范围。
因此，在本发明的一个实施方案中，涉及油籽植物，其包含：
a)第一重组DNA构建体，包含编码Δ9延伸酶多肽的分离的多核苷酸，所述多核苷酸与至少一个调节序列可操作性连接；和
b)至少一个另外的重组DNA构建体，包含编码多肽的分离的多核苷酸，所述多核苷酸与至少一个调节序列可操作性连接，所述多肽选自：Δ4去饱和酶，Δ5去饱和酶，Δ6去饱和酶，Δ8去饱和酶，Δ9去饱和酶，Δ12去饱和酶，Δ15去饱和酶，Δ17去饱和酶，C14/16延伸酶，C16/18延伸酶，C18/20延伸酶和C20/22延伸酶。
所述另外的去饱和酶讨论于例如美国专利No.6,075,183，No.5,968,809，No.6,136,574，No.5,972,664，No.6,051,754，No.6,410,288和PCT公开No.WO 98/46763，No.WO 98/46764，No.WO 00/12720和No.WO 00/40705。
使用的盒的组合的选自部分取决于要转化的油籽植物细胞的PUFA谱和/或去饱和酶/延伸酶谱，以及要表达的长链PUFA(s)。
另一方面，本发明涉及在植物细胞中制备长链PUFAs的方法，包括：
(a)用本发明的重组构建体转化细胞；和
(b)选择产生长链PUFAs的转化细胞。
另一方面，本发明涉及在大豆细胞中生产至少一种PUFA的方法，包括：
(a)用第一重组DNA构建体转化大豆细胞，所述构建体包含：
(i)编码Δ9延伸酶多肽的分离的多核苷酸，所述多核苷酸与至少一个调节序列可操作性连接；和
(ii)至少一个另外的重组DNA构建体，包含编码多肽的分离的多核苷酸，所述多核苷酸与至少一个调节序列可操作性连接，所述多肽选自：Δ4去饱和酶，Δ5去饱和酶，Δ6去饱和酶，Δ8去饱和酶，Δ9去饱和酶，Δ12去饱和酶，Δ15去饱和酶，Δ17去饱和酶，C14/16延伸酶，C16/18延伸酶，C18/20延伸酶和C20/22延伸酶；
(b)从步骤(a)的转化细胞再生大豆植物；和
(c)从步骤(b)的植物选择获得的种子，所述种子与从未转化的大豆植物获得的种子中PUFAs的水平相比，具有改变的PUFAs水平。
在特别优选的实施方案中，至少一种另外的重组DNA构建体编码具有Δ8去饱和酶活性的多肽，例如分离和/或来源于纤细眼虫，并且如SEQ ID NOs：61和69所示的Δ8去饱和酶。
微生物表达表达系统、盒和载体，以及转化
也可以在异源微生物宿主细胞，特别是含油酵母(如解脂耶氏酵母)的细胞中生产本文描述的Δ9延伸酶基因和基因产物(即EgD9e，EgD9eS，E389D9e，E389D9eS，或其它突变酶，密码子优化的酶或其同源物)。重组微生物宿主中的表达可以用于生产多种PUFA途径中间体，或用于调节已经存在于宿主中的PUFA途径，用于合成目前采用所述宿主尚不能合成的新产物。
含有指导外源蛋白的高水平表达的调节序列的微生物表达系统和表达载体是本领域技术人员公知的。上述任何载体都可以用于构建用于生产本发明序列的任何基因产物的嵌合基因。然后可以通过转化将这些嵌合基因导入合适的微生物中，以提供编码的酶的高水平表达。
用于转化合适的微生物宿主细胞的载体或DNA盒是本领域公知的。构建体中存在的序列的特定选择依赖于需要的表达产物(同上文)、宿主细胞的性质和提出的分离转化的细胞与未转化细胞的方法。但是，典型地，载体或盒含有指导相关基因转录和翻译的序列、选择标记和使得能够进行自主复制和染色体整合的序列。合适的载体包含控制转录起始的基因的5’的区域(如启动子)和控制转录终止的DNA片段3’的区域(即终止子)。当两个控制区都来自转化的微生物宿主细胞的基因时是最优选的，但是，应该理解，所述控制区不一定必须来自选作生产宿主的特定物种的天然基因。
可用于在需要的微生物宿主细胞中驱动本发明的Δ9延伸酶ORF的表达的起始控制区或启动子是多种多样的，并且为本领域技术人员所熟知。实际上，能够指导这些基因在选定的宿主细胞中表达的任何启动子都适合本发明。在微生物宿主细胞中的表达能够以瞬时或稳定的方式进行。瞬时表达可以通过诱导可操作地连接在目标基因上的可调控启动子的活性而实现。稳定表达可以通过使用可操作地与目标基因连接的组成型启动子而实现。例如，当宿主细胞是酵母时，提供能够在酵母细胞中起作用的转录和翻译区，特别是来自宿主物种的那些(例如，关于解脂耶氏酵母中的优选转录起始调节区，参见PCT公开No.WO 2004/101757[美国公开2005-0136519-A1]和PCT公开No.WO2006/052870[美国公开2006-0115881-A1])。可以使用多种调节序列中的任意一种，这取决于是需要组成型转录还是诱导型转录，启动子在表达目标ORF方面的效率，以及构建的方便性等。
已经发现翻译起始密码子‘ATG’附近的核苷酸序列影响酵母细胞中的表达。如果需要的多肽在酵母中的表达不良，可以修饰外源基因的核苷酸序列，以导入有效的酵母翻译起始序列，获得最优的基因表达。为了在酵母中表达，可以通过对效率不佳地表达的基因的定点诱变而实现，所述诱变是通过将其与内源酵母基因，优选高表达的基因符合读框地融合而实现的。或者，如此处对于解脂耶氏酵母所证明的，可以确定宿主中的共有翻译起始序列，并且将该序列工程化为异源序列，以便它们在感兴趣的宿主中最优表达。
终止区可源于基因的3’区(起始区是从该基因获得的)或者源于不同的基因。大量终止区是已知的，并且能在多种宿主(当在与产生它们的相同和不同的属和种中使用时)中发挥令人满意的作用。终止区通常在更大程度上是根据方便性选择的，而不是因为任何特殊特性。优选的是，当微生物宿主是酵母细胞时，终止区源于酵母基因(特别是糖酵母属、裂殖酵母属、假丝酵母属、耶氏酵母属或克鲁维酵母属)。同样已知编码γ-干扰素和α-2干扰素的哺乳动物基因的3’-区在酵母中起作用。终止控制区还可以来自优选宿主天然具有的各种基因。终止位点可以任选是必需的；不过，如果具有，则是最优选的。尽管不意欲限制，本发明公开中使用的终止区包括：解脂耶氏酵母胞外蛋白酶的3’区的约100bp(XPR；GenBank登录号M17741)；酰基-coA氧化酶(Aco3：GenBank登录号AJ001301和No.CAA04661；Pox3：GenBank登录号XP_503244)终止子；Pex20(GenBank登录号AF054613)终止子；Pex16(GenBank登录号U75433)终止子；Lip1(GenBank登录号Z50020)终止子；Lip2(GenBank登录号AJ012632)终止子；和3-氧酰基-coA硫解酶(OCT；GenBank登录号X69988)终止子。
正如技术人员所了解的，仅仅将基因插入克隆载体，不能确保它能够在需要的水平上成功地表达。根据对高表达速度的需要，业已通过操纵多种不同的遗传元件产生了多种特化的表达载体，这些遗传元件能控制来自微生物宿主细胞的转录、翻译、蛋白稳定性、含氧极限、以及分泌。更具体地讲，业已对某些分子特征进行了操纵，以控制基因表达，包括：1.)相关转录启动子和终止子序列的性质；2.)克隆基因的拷贝数量，以及所述基因是质粒携带的或者是整合到宿主细胞的基因组上的；3.)合成的外源蛋白的最终细胞定位；4.)宿主生物的翻译效率和蛋白的正确折叠；5.)克隆的基因的mRNA和蛋白在宿主细胞中的内在稳定性；和6.)克隆的基因内的密码子选择，使得它的频率达到宿主细胞优选的密码子选择的频率。上述每一种类型的修饰包括在本发明中，作为进一步优化本文描述的Δ9延伸酶的表达的手段。
一旦获得了适合在合适的微生物宿主细胞(如含油酵母)中表达的编码多肽的DNA(如包含启动子、ORF和终止子的嵌合基因)，将它放入能够在宿主细胞中自主复制的质粒载体上，或者将它直接整合到宿主细胞的基因组中。表达盒的整合可以在宿主基因组中随机地进行，或者可以通过使用含有与宿主基因组具有足够同源性以靶定宿主基因座内的重组的区域的构建体靶定。尽管本发明不完全基于此，当所述构建体被靶定于内源基因座时，转录和翻译调节区的全部或某些可以通过内源基因座提供。
在本发明中，在解脂耶氏酵母中表达基因的优选方法是通过将线性DNA整合到宿主的基因组中；并且，当需要基因的高水平表达时，整合到基因组中的多个位置是特别有用的。为此，需要鉴定基因组中以多个拷贝存在的序列。
Schmid-Berger等(J.Bact.176(9)：2477-2482(1994))发现了解脂耶氏酵母中的第一个反转录转座子样元件Ylt1。该反转录转座子的特征在于存在长的末端重复序列(LTRs；每一个的长度是大约700bp)，其称作ζ区。Ylt1和单独的ζ元件分别以至少35个拷贝/基因组和50-60个拷贝/基因组，以分散的方式存在于基因组中；确定这两个元件都作为同源重组位点起作用。此外，Juretzek等(Yeast 18：97-113(2001))的研究证明了通过将质粒靶定到酵母基因组的重复区中(用两端都具有LTR ζ区的线性DNA)，与用低拷贝质粒转化体获得的表达相比，可以显著增加基因表达。因此，定位于ζ的整合作为确保将多个质粒DNA整合到解脂耶氏酵母中的手段是理想的，从而允许高水平基因表达。然而，不幸的是，并不是解脂耶氏酵母的所有菌株都具有ζ区(如鉴定为ATCC保藏号20362的菌株)。当菌株缺乏所述区域时，也可以将包含表达盒的质粒DNA整合到替代的基因座中，以达到表达盒的需要的拷贝数。例如，优选的替代基因座包括：Ura3基因座(GenBank登录号AJ306421)、Leu2基因座(GenBank登录号AF260230)、Lys5基因(GenBank登录号M34929)、Aco2基因座(GenBank登录号AJ001300)、Pox3基因座(Pox3：GenBank登录号XP_503244；或Aco3：GenBank登录号AJ001301)、Δ12去饱和酶基因基因座(PCT公开No.WO 2004/104167)、Lip1基因座(GenBank登录号Z50020)和/或Lip2基因座(GenBank登录号AJ012632)。
有利的是，Ura3基因可以与5-氟乳清酸(即5-氟尿嘧啶-6-甲酸单水合物；“FOA”)选择组合，重复使用(参见下文)，从而容易地使基因修饰以容易的方式整合到耶氏酵母基因组中。
当从分开的复制载体表达两种或更多种基因时，理想的是每种载体具有不同的选择方法，并且应该缺乏与其它构建体的同源性，以维持稳定的表达并且防止构建体之间元件的重新分配。调节区的明智选择、选择方法和导入的构建体的增殖方法可以实验确定，由此以必须的水平表达所有导入的基因，并且提供需要的产物的合成。
可以通过任何标准技术将包含感兴趣的基因的构建体导入微生物宿主细胞。这些技术包括转化(如醋酸锂转化[Methods in Enzymology，194：186-187(1991)])、原生质体融合、生物射弹冲击(bolistic impact)、电穿孔、微注射或任何其它将感兴趣的基因导入宿主细胞的方法。适用于含油酵母(即解脂耶氏酵母)的更特别的教导包括美国专利No.4,880,741和No.5,071,764以及Chen，D.C.et al.(Appl MicrobiolBiotechnol.48(2)：232-235(1997))。
为了方便起见，业已通过任何方法操作以摄入DNA序列(例如，表达盒)的宿主细胞在本文中被称作“转化的”或“重组的”。转化的宿主具有至少一个拷贝的表达构建体，并且可以具有两个或两个以上拷贝，这取决于所述基因是整合在所述基因组上、扩增的、或者存在于具有多个拷贝的染色体外元件上。
可以通过多种选择技术鉴定转化的宿主细胞，如PCT公开No.WO2004/101757[美国公开2005-0136519-A1]和PCT公开No.WO2006/052870[美国公开2006-0115881-A1]中的描述。此处使用的优选选择方法是对卡那霉素、潮霉素和氨基糖苷G418的抗性以及在缺少尿嘧啶、亮氨酸、赖氨酸、色氨酸或组氨酸的培养基上生长的能力。在替代的实施方案中，为了选择酵母Ura-转化体，使用5-FOA。该化合物对具有起作用的编码乳清苷5’-一磷酸脱羧酶(OMP脱羧酶)的URA3基因的酵母细胞具有毒性；因此，基于该毒性，5-FOA对于Ura-突变酵母株的选择和鉴定特别有用(Bartel，P.L.and Fields，S.，Yeast2-Hybrid System，Oxford University：New York，v.7，pp 109-147，1997)。更具体地，可以首先敲除天然Ura3基因，生产具有Ura-表型的菌株，其中基于5-FOA抗性发生选择。然后，可以将一簇多个嵌合基因和新的Ura3基于整合到耶氏酵母的不同基因座，从而产生具有Ura+表型的新菌株。当敲除导入的Ura3基因时，随后的整合产生新的Ura3-菌株(再次用5-FOA选择鉴定)。因此，Ura3基因(与5-FOA选择组合)可以用作多轮转化中的选择标记。
转化后，可以天然或转基因地由宿主产生适于本发明的Δ9延伸酶(任选其它在宿主细胞中共表达的PUFA酶)的底物，或它们可以外源提供。
用于表达本发明的基因和核酸片段的微生物宿主细胞包括以下宿主，其在大范围的温度和pH值下，在多种饲料上生长，所述饲料包括简单的或复杂的碳水化合物，有机酸、油和醇，和/或烃。尽管在本发明中所披露的基因已经为在含油酵母(特别是解脂耶氏酵母)中的表达进行了分离，但是，考虑到到由于转录、翻译和蛋白生物合成工具是高度保守的，任何细菌、酵母、藻类和/或真菌都是适合表达本发明的核酸片段的宿主。
优选的微生物宿主是含油酵母。这些生物可天然地进行油类合成和积累，其中油可以占大于约25％细胞干重，更优选地大于约30％细胞干重，且最优选地大于约40％细胞干重。常鉴定为含油酵母的属包括但不限于：但不局限于：耶氏酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢属、隐球酵母属、丝孢酵母属和油脂酵母属。更具体地讲，典型的油合成酵母包括：类酵母红冬孢、斯达氏油脂酵母、产油油脂酵母、拉可夫氏假丝酵母、铁红假丝酵母、热带假丝酵母、产朊假丝酵母、茁芽丝孢酵母、皮状丝孢酵母、胶粘红酵母、禾木科红酵母和解脂耶氏酵母(以前被划分为解脂假丝酵母)。
最优选的是含油酵母解脂耶氏酵母；而在其它实施方案中，最优选的是解脂耶氏酵母菌株，被命名为ATCC#20362，ATCC#8862，ATCC#18944，ATCC#76982，ATCC#90812和/或LGAM S(7)1(PapanikolaouS.，和Aggelis G.，Bioresour.Technol.82(1)：43-9(2002))。
以前已经将解脂耶氏酵母的多种菌株用于制备和生产：异柠檬酸裂解酶；脂肪酶；多羟基链烷酸；柠檬酸；赤藓糖醇；2-氧戊二酸；γ-癸内酯；γ-十二内酯；和丙酮酸。用于在解脂耶氏酵母中对ARA，EPA和DHA的生产进行工程化的特定教导分别提供于美国专利申请No.11/264784(PCT公开No.WO 2006/055322)，No.11/265761(PCT公开No.WO 2006/052870)和No.11/264737(PCT公开No.WO2006/052871)。
其它优选的微生物宿主包括含油细菌、藻类和其它真菌；并且，在该广泛的一组微生物宿主中，特别感兴趣的是合成ω-3/ω-6脂肪酸的微生物(或可以为此目的而基因工程化的那些[例如，其它酵母，如啤酒糖酵母])。因此，例如，用诱导型或受调节的启动子控制下的任何本发明的Δ9延伸酶转化高山被孢霉(其在商业上用于生产ARA)，可以产生能够合成增加量的EDA的转化生物；如果共表达Δ8去饱和酶基因，EDA可以转化，增加DGLA的量。转化高山被孢霉的方法由Mackenzie等(Appl.Environ.Microbiol.，66：4655(2000))描述。类似地，转化破囊壶菌微生物的方法公开于美国专利No.7,001,772。
基于上文描述的教导，本发明的一个实施方案涉及分别生产EDA或ETrA的方法，包括：
a)提供包含以下成分的含油酵母：
(i)第一重组DNA构建体，所述构建体包含编码Δ9延伸酶多肽的分离的多核苷酸，所述多核苷酸与至少一个调节序列可操作性连接；和
(ii)分别由LA或ALA组成的延伸酶底物来源；以及
b)在合适的可发酵碳源存在下生长步骤(a)的酵母，其中表达编码Δ9延伸酶多肽的基因，并且分别由LA转化为EDA或由ALA转化为ETrA；以及
c)任选分别回收步骤(b)的EDA或ETrA。可能需要底物补料。
在一些优选实施方案中，编码Δ9延伸酶的基因的核苷酸序列选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4。在替代的优选实施方案中，编码Δ9延伸酶多肽的基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO：3(其中至少106个密码子为在耶氏酵母中表达而相对于SEQ ID NO：1进行了优化)。并且，在其它优选实施方案中，编码Δ9延伸酶多肽的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示(其中至少113个密码子为在耶氏酵母中表达而相对于SEQ ID NO：4进行了优化)。
当然，由于含油酵母中天然生产的PUFAs限于18:2脂肪酸(即LA)，并且较不常见地是18:3脂肪酸(即ALA)，在本发明的更优选实施方案中，含油酵母将基因工程化，用于表达长链PUFA生物合成所必须的多种酶(从而使得能够生产例如ARA，EPA，DPA和DHA)以及本文描述的Δ9延伸酶。
具体地，在一个实施方案中，本发明涉及含油酵母，其中包含：
a)第一重组DNA构建体，包含编码Δ9延伸酶多肽的分离的多核苷酸，所述多核苷酸与至少一个调节序列可操作性连接；和
b)至少一个另外的重组DNA构建体，包含编码多肽的分离的多核苷酸，所述多核苷酸与至少一个调节序列可操作性连接，所述多肽选自：Δ4去饱和酶，Δ5去饱和酶，Δ6去饱和酶，Δ8去饱和酶，Δ9去饱和酶，Δ12去饱和酶，Δ15去饱和酶，Δ17去饱和酶，C14/16延伸酶，C16/18延伸酶，C18/20延伸酶和C20/22延伸酶。
在特别优选的实施方案中，至少一种另外的重组DNA构建体编码具有Δ8去饱和酶活性的多肽，例如分离和/或来源于纤细眼虫，并且如SEQ ID NOs：61和69所示的Δ8去饱和酶。
微生物中ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成的代谢工程化
用于操作生物化学途径的方法是本领域技术人员公知的；因此，预期许多操作将能够使含油酵母，特别是解脂耶氏酵母中的ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成最大化。这可能需要直接于PUFA生物合成途径中的代谢工程化，或各种其它代谢途径的协调操作。
在PUFA生物合成途径内进行操作的情况下，可能需要增加LA的生产，使得能够增加ω-6和/或ω-3脂肪酸的生产。导入和/或扩增编码Δ9去饱和酶和/或Δ12去饱和酶的基因可能实现此目的。为了使ω-6不饱和脂肪酸的生产最大，本领域技术人员公知的是，所述生产在基本不含ALA的宿主微生物中是有利的；因此，优选地，通过除去或抑制使LA转化为ALA的Δ15或ω-3型去饱和酶活性，选择或获得宿主。可以通过例如以下方法减少或消除内源去饱和酶活性：(1)提供用于将反义序列转录为Δ15去饱和酶转录产物的盒；(2)通过插入、取代和/或缺失靶基因的全部或部分而破坏Δ15去饱和酶基因；或(3)使用天然具有很少或不具有[或经过突变而具有很少或不具有]Δ15去饱和酶活性的宿主细胞。也可以通过利用特定去饱和酶抑制剂(如U.S.4,778,630中描述的那些)实现不需要的去饱和酶途径的抑制。
或者，可能需要使ω-3脂肪酸的生产最大化(并且使ω-6脂肪酸的合成最小化)。在该实例中，可以利用宿主微生物，其中除去或抑制使油酸能够转化为LA的Δ12去饱和酶活性；随后，将合适的表达盒与合适的底物(如ALA)一起导入宿主，用于转化为ALA的ω-3脂肪酸衍生物(如STA，ETrA，ETA，EPA，DPA，DHA)。
在替代的实施方案中，可以通过基因破坏或其它方式(如反义mRNA)下调，消除与ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途径竞争能量或碳的生化途径或干扰特定PUFA终产物生产的天然PUFA生物合成途径酶。
关于PUFA生物合成途径内的操作，以及增加ARA，EPA或DHA的方法(及其相关技术)的详细讨论分别公开于PCT公开No.WO2006/055322[美国专利公开No.2006-0094092-A1]，PCT公开No.WO2006/052870[美国专利公开No.2006-0115881-A1]和PCT公开No.WO2006/052871[美国专利公开No.2006-0110806-A1]，所述文献也公开了TAG生物合成途径和TAG降解途径的所需操作(及其相关技术)。
在本发明的上下文中，可能有用的是通过上文描述的任一策略调节脂肪酸生物合成途径的表达。例如，本发明提供了方法，从而将编码Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶生物合成途径中的关键酶的基因导入含油酵母，用于生产ω-3和/或ω-6脂肪酸。特别有用的将是在天然不具有ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途径的含油酵母中表达本发明的Δ9延伸酶基因，并且协调这些基因的表达，从而用各种用于对宿主生物进行代谢工程化的方法使优选PUFA产物的生产最大化。
用于PUFA生产的微生物发酵方法
转化的微生物宿主细胞是在优化嵌合去饱和酶和延伸酶基因的表达，并且产生最大和最经济的所需PUFAs产率的条件下生长的。一般，可以优化的培养基条件包括碳源的类型和用量、氮源的类型和用量、碳氮比、氧水平、生长温度、pH、生物量生产期的长度、油积累期的长度，以及细胞收获时间和方法。感兴趣的微生物，如含油酵母(如解脂耶氏酵母)在复杂培养基(例如，酵母提取物-蛋白胨-右旋糖培养液(YPD))或缺少生长所必需的成分，以便强制选择需要的表达盒的限定基本培养基(例如，酵母氮基(DIFCO Laboratories，Detroit，MI))中生长。
本发明的发酵培养基必须包括合适的碳源。合适的碳源可以包括，但不局限于：单糖(例如，葡萄糖、果糖)、二糖(例如，乳糖、蔗糖)、寡糖、多糖(例如，淀粉、纤维素或它们的混合物)、糖醇(例如，甘油)或可更新饲料(例如，干酪乳清渗透物、玉米浆、甜菜糖浆、大麦芽)的混合物。另外，碳源可以包括链烷、脂肪酸、脂肪酸酯、甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂，和脂肪酸的各种商业来源，包括植物油(例如，大豆油)和动物脂肪。另外，碳源可以包括一碳源(例如，二氧化碳、甲醇、甲醛、甲酸和含碳的胺)，业已证实了其转化成关键生物化学中间体的代谢转化。因此，预计，用于本发明的碳源可以包括多种含碳的来源，并且仅仅受宿主生物的选择的限制。优选的碳源是糖、甘油和/或脂肪酸。最优选的是葡萄糖和/或含有10-22个碳的脂肪酸。
氮可以由无机(例如，(NH4)2SO4)或有机来源(例如，尿素或谷氨酸)提供。除了合适的碳和氮源之外，发酵培养基必须还包括合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲液、维生素，和本领域技术人员已知的适合含油生物生长，并且促进PUFA生产所需要的酶途径的其他成分。特别关注若干金属离子(例如，Mn+2、Co+2、Zn+2、Mg+2)，它们能促进脂质和PUFAs的合成(Nakahara，T.et al.，Ind.Appl.Single CellOils，D.J.Kyle and R.Colin，eds.pp 61-97(1992))。
本发明的优选的生长培养基是常见的商业制备的培养基，如酵母氮基(DIFCO Laboratories，Detroit，MI)。其他确定的或合成的生长培养基也可以使用，并且适合特定转化宿主细胞生长的培养基是微生物学或发酵科学领域的技术人员所公知的。用于发酵的合适的pH范围通常为大约pH4.0-pH8.0，其中pH5.5-pH7.5是起始生长条件的优选范围。发酵可以在需氧或厌氧条件下进行，其中，微需氧条件是优选的。
通常，高水平PUFAs在含油酵母细胞中的积累，需要两个阶段的过程，因为在脂肪的生长和合成/储存之间的代谢状态必须是“平衡的”。因此，最优选的是，需要两个阶段的发酵过程在含油酵母(如解脂耶氏酵母)中生产PUFAs。该方法描述于WO 2004/101757，在生长过程中具有多个合适的发酵过程设计(即分批、补料分批和连续)和考虑。
PUFA油的纯化和加工
PUFA可以作为游离脂肪酸形式出现在宿主微生物和植物中，或者以诸如酰基甘油、磷脂、硫脂或糖脂的脂化形式出现在宿主微生物和植物中，并且可以通过本领域所熟知的多种方法从宿主细胞中提取。酵母脂质的提取技术、品质分析和可接受性标准的一篇综述是：Z.Jacobs(Critical Reviews in Biotechnology 12(5/6)：463-491(1992))。有关下游加工的简单综述还可以参见A.Singh和O.Ward(Adv.Appl.Microbiol.45：271-312(1997))。
一般地，纯化PUFAs的方法可以包括用有机溶剂萃取、超声波处理、超临界流体萃取(例如，使用二氧化碳)、皂化和物理方法，如压力，或它们的组合。其它细节可参考PCT公开No.WO 2004/101757的教导。
分离种子油的方法是本领域公知的(Young等，Processing of Fatsand Oils，In The Lipid Handbook，Gunstone等，eds.，第5章，pp 253-257；Chapman & Hall：London(1994))。例如，用一系列步骤，包括从含油种子提取和纯化食用油产物，制备大豆油。用下表所示的概括的步骤生产大豆油和大豆副产物。
                     表5
       大豆油和副产物生产的概括步骤
 
加工步骤 加工 除去的杂质和/或获得的副产物
#1 大豆种子
#2 油提取 粗粉
#3 脱胶 卵磷脂
#4 碱或物理精制 胶，游离脂肪酸，色素
#5 水洗 皂
#6 漂白 涂料，皂，金属
#7 (氢化)
#8 (冷凝) 硬脂
#9 除臭 游离脂肪酸，生育酚，固醇，挥发物
#10 油产物
更具体地，清洗大豆种子、调和、去壳并且切成薄片，从而增加油提取的效率。通常通过溶剂(如己烷)提取完成油提取，但也可以通过物理压力和/或溶剂提取的组合实现。得到的油称作粗制油。可以通过水合磷脂和促进它们从非水合、甘油三酯级分(大豆油)分离的极性和中性脂质复合物，使粗制油脱胶。得到的卵磷脂胶可以进一步加工，以制备在多种食品和工业产品中用作乳化剂和释放(抗粘)剂的商业上重要的卵磷脂产品。脱胶的油可以进一步精制，以除去杂质(主要是游离脂肪酸、色素和残余胶)。通过加入与游离酸反应形成皂并且水合粗制油中的磷脂和蛋白的腐蚀剂，实现精制。精制过程中，用水洗去形成的痕量的皂。皂料副产物可以直接用于动物饲料中，或酸化以回收游离脂肪酸。通过用除去大多数叶绿素和类胡萝卜素化合物的漂白土吸附，除去颜色。精制的油可以氢化，从而得到具有多种熔解特性和质地的脂肪。冷滤(分级分离)可以用于通过在小心控制的冷却条件下结晶，从氢化油除去硬脂。除臭(主要通过真空下的蒸汽蒸馏)是最后一个步骤，设计用于除去给油带来臭味或味道的化合物。除臭过程中可以除去其它有价值的副产物，如生育酚和固醇。含有这些副产物的除臭的馏出物可以出售，用于生产天然维生素E和其它高价值的药用产品。精制的、漂白的、(氢化的、分级分离的)和除臭的油和脂肪可以包装并直接出售或进一步加工为更特化的产物。大豆种子加工、大豆油生产和副产物利用的更详细参考可以参见Erickson，Practical Handbook of Soybean Processing and Utilization，TheAmerican Oil Chemists’Society and United Soybean Board(1995)。大豆油在室温下是液体的，因为与诸如椰子油、棕榈油、棕榈仁油和可可油相比，其饱和脂肪酸的含量相对较低。
可以氢化已经精制和/或纯化的含PUFAs的植物和微生物油，从而得到具有多种熔解特性和质地的脂肪。很多经过加工的脂肪，(包括糊、甜食脂肪、硬质脂肪、人造黄油、烘烤起酥等)，需要室温下的各种程度的固化，并且仅仅可以通过改变原料油的物理特性而制备。这最常见是通过催化氢化实现的。
氢化是一种化学反应，其中在诸如镍的催化剂辅助下将氢加入不饱和脂肪酸双键。例如，高油酸大豆油含有不饱和油酸、LA和亚麻酸脂肪酸，其中每一种都氢化。氢化具有两个主要作用。首先，由于不饱和脂肪酸含量的减少，油的氧化稳定性增加。其次，油的物理性质改变，这是因为脂肪酸修饰增加了熔点，在室温下得到半液体或固体脂肪。
存在许多影响氢化反应的变量，其随后改变终产物的组成。包括压力、温度、催化剂类型和浓度、搅拌和反应器设计的操作条件是可以控制的较重要的参数中的一些。选择性氢化条件可以相对于较不饱和的脂肪酸而言优先用于氢化更饱和的脂肪酸。通常用非常轻的或刷洗氢化来增加液体油的稳定性。进一步的氢化将液体油转化为物理固体的脂肪。氢化的程度依赖于针对特定终产物设计的所需性能和熔解特征。液体起酥(用于制备烘烤产品、用于商业煎炸和烘烤操作的固体脂肪和起酥)，以及用于制造人造黄油的碱原料是通过氢化得到的多种可能的油和脂肪产品中的一些。氢化和氢化产物的更详细描述可以参见Patterson，H.B.W.，Hydrogenation of Fats and Oils：Theory andPractice.The American Oil Chemists’Society，(1994)。
氢化的油在某种程度上有争议，因为存在由氢化过程导致的反式脂肪酸异构体。摄入大量反式异构体与有害的健康作用相关，包括增加血浆中低密度脂蛋白与高密度脂蛋白的比例，和增加冠心病的风险。
用于食料中的含PUFA的油
目前的市场支持大量掺入ω-3和/或ω-6脂肪酸(特别是ARA、EPA和DHA)的食品和饲料产品。考虑本发明的植物/种子油、改变的种子和微生物油将在食品和饲料产品中起作用，赋予本发明的制剂的健康益处。与其它植物油相比，从物理观点，认为本发明的油与食物应用中的其它油功能上相似(例如，部分氢化的油，如大豆油，被广泛用作软糊、人造黄油和用于烘烤和煎炸的起酥的成分)。
此处描述的含ω-3和/或ω-6脂肪酸的植物/种子油、改变的种子和微生物油将适用于多种食品和饲料产品中，包括但不限于食物类似物、肉类产品、谷物产品、快餐食品、烘烤食品和乳制品。此外，本发明的植物/种子油、改变的种子和微生物油可以用于制剂中，在包括医学营养品、饮食补充物、婴儿配方和药品的医学食品中赋予健康益处。食品加工和食品制剂领域的技术人员将理解植物和微生物油的量和组成如何添加到食物或食品中。所述量在此称作“有效”量，并且依赖于食品或饲料产品、该产品意欲补充的饮食或该医学食品或医学营养品意欲矫正或治疗的医学状况。
可以用本领域技术人员公知的方法制备食物类似物。可以提到的是肉类似物、干酪类似物、乳类似物等。从大豆制备的肉类似物含大豆蛋白或豆腐和其它混合在一起的成分，以模拟各种肉类。这些肉替代品以冷冻、罐装或干燥食品出售。通常，它们可以以它们所替代的食品相同的方式使用。肉类似物的实例包括但不限于：火腿类似物、香肠类似物、咸肉类似物等。
根据功能和组成特征，可以将食物类似物分类为模拟物或替代物。例如，模拟干酪仅仅需要模拟其设计用于替代的干酪。然而，只有当一种产品在营养上等同于它所要替代的干酪和满足该干酪的最小组成需要，才能将其称作替代干酪。因此，替代干酪通常比模拟干酪具有更高的蛋白水平，并且可以用维生素和矿物质进行强化。
乳类似物或非乳制食品包括但不限于：模拟乳和非乳制冷冻甜点(如从大豆和/或大豆蛋白产品制备的那些)。
肉产品包括广泛的产品。在美国，“肉”包括从牛、狗和羊生产的“红肉”。除了红肉外，还有禽类，包括鸡、火鸡、鹅、珍珠鸡、鸭，以及鱼类和甲壳类动物。存在各种类型的调味和加工的肉类产品：新鲜的、熟化和煎炸的、以及熟化和蒸煮的。香肠和热狗是加工的肉产品的实例。因此，此处用到的“肉产品”包括但不限于加工的肉产品。
谷物食品是来源于谷物加工的食品。谷物包括来自产生可食用谷物(籽粒)的草本科植物的任何植物。最常见的谷物是大麦、玉米、小米、燕麦、奎藜、稻、黑麦、高粱、黑小麦、小麦和野生稻。谷物食品的实例包括但不限于：全谷、全谷粗粉、粗谷粉、面粉、麸、胚芽、早餐谷物、寄出食品、意大利面食等。
烘烤食品包括上文描述的任何谷物食品，并且以能够烘烤，即通过热干燥或硬化的方式烘烤或加工过。烘烤食品的实例包括但不限于：面包、蛋糕、炸面圈、面包条、意大利面食、面包屑、烘烤的快餐、小饼干、小薄脆饼干、小甜饼和小脆饼干。如上文提到的，本发明的油可以用作一种成分。
快餐食品包括上文或下文描述的任何食品。
煎炸食品包括经过煎炸的上文或下文描述的任何食品。
健康食品是任何赋予健康益处的食品。很多油籽来源的食品可以认为是健康食品。
饮料可以是液体或干粉形式。
例如，可以提到的是非碳酸饮料；果汁、新鲜的、冷冻的、罐装的或浓缩饮料；调味的或普通的乳饮料等。成人和婴儿营养配方是本领域公知的并且可以商购(如来自Ross Products Division，AbbottLaboratories的和
Figure A200680051550D00642
)。
婴儿配方是给婴儿或幼儿喂食的液体或重配粉末。此处将“婴儿配方”定义为肠道营养品，其可以在哺乳期婴儿中代替母乳，并且通常包含与在水溶液中与所需百分比的碳水化合物和蛋白混合的所需百分比的脂肪(例如参见U.S.4,670,285)。基于世界范围的组成研究以及专家组规定的水平，平均母乳典型地含约0.20％-0.40％的总脂肪酸(假定大约50％的热卡来自脂肪)；并且，DHA与ARA的比例通常是大约1:1-1:2(参见例如Enfamil LIPILTM[Mead Johnson & Company]和SimilacAdvanceTM[Ross Products Division，Abbott Laboratories]的配方)。婴儿配方在婴儿饮食中起作特殊作用，因为它们通常是婴儿营养物质的唯一来源；并且尽管母乳喂养是婴儿的最佳营养，但婴儿配方足够接近，因此婴儿不仅存活，还茁壮成长。
乳制品是来源于乳的产品。乳类似物或非乳制品来源于除乳以外的来源，例如，上文讨论的大豆乳。这些产品包括但不限于：全乳、脱脂乳、发酵乳产品如酸奶酪或酸奶、乳酪、黄油、炼乳、脱水乳、调咖啡用白油、咖啡伴侣、冰激凌、干酪等。
可以掺入本发明的含PUFA的油的其它食品包括，例如：口香糖、糖果和糖霜、明胶和布丁、硬糖和软糖、果酱和果冻、白砂糖、糖替代品、甜调料、糕点装饰物和糖浆，以及干粉混合物。
用于健康食品和药品中的含PUFA的油
健康食品是赋予健康益处的任何食品，包括功能性食品、医学食品、医学营养品和饮食补充物。此外，本发明的植物/种子油、改变的种子和微生物油可以用于标准药物组合物中。例如，本发明的油可以容易地掺入上述任何食品中，从而生产例如功能性或医学食品。包含PUFAs的更浓缩的制剂包括胶囊、粉末、片剂、软凝胶、凝胶帽、液体浓缩物和乳状液，它们可以用作人或人以外的其它动物的营养补充物。
用于动物饲料中的含PUFA的油
动物饲料在此一般定义为意欲用作除人之外的动物的饲料或混合于饲料中的产品。并且，如上文提到的，本发明的植物/种子油、改变的种子和微生物油可以用作各种动物饲料中的成分。
更具体地，尽管不进行限制，预计本发明的油可以用于宠物食品中、反刍动物和禽类动物食品中以及水产养殖食品中。宠物食品是意欲喂饲宠物[如狗、猫、鸟类、爬行动物、啮齿类动物]的产品；这些产品包括上文所述的谷物和健康食品，以及肉和肉副产品、大豆蛋白产品、草和干草产品(如紫花苜蓿、梯牧草、燕麦或雀麦草、蔬菜)。反刍动物和禽类动物食品是意欲喂饲给例如火鸡、鸡、牛和猪的食品。至于上文所述的宠物食品，这些食品包括谷物和上文列出的健康食品、大豆蛋白产品、肉和肉副产品、以及草和干草产品。水产养殖食品(或“水产养殖饲料”)是意欲用于水产养殖的产品，所述水产养殖涉及淡水或海水中水生生物和/或动物的繁殖、培养和饲养。
实施例
在以下实施例中进一步限定本发明，其中部分和百分比是基于重量，度是摄氏度，除非另外指出。应当理解的是，在这些实施方案中，尽管指明了是本发明的优选实施方案，但是，是以说明形式提供的。通过上文的讨论和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的实质性特征，并且，在不超出本发明的构思和范围的前提下，可以对本发明进行各种改变和改进，以便适应各种用途和条件。因此，除本文显示和描述的以外，本领域技术人员从前述说明书可以明白各种修饰。所述修饰异源包含在所述权利要求的范围内。
一般方法
用于实施例中的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域所熟知的，并且披露于以下文献中1.)Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring HarborLaboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)(Maniatis)；2.)T.J.Silhavy，M.L.Bennan，and L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions；ColdSpring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)；和3.)Ausubel，F.M.etal.，Current Protocols in Molecular Biology，由GreenePublishing Assoc.and Wiley-Interscience(1987)出版。
适合微生物培养物维持和生长的材料和方法为本领域所公知。适合在以下实施例中使用的技术可以参见以下文献：Manual of Methodsfor General Bacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg and G.BriggsPhillips，Eds)，American Society for Microbiology：Washington，D.C.(1994))；或参见Thomas D.Brock in Biotechnology：A Textbook ofIndustrial Microbiology，2nd ed.，Sinauer Associates：Sunderland，MA(1989)。用于生长和维持微生物细胞的所有试剂，限制酶和材料都是从Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)，DIFCO Laboratories(Detroit，MI)，GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)，或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)获得的，除非另有说明。大肠杆菌菌株通常是在37℃下在Luria Bertani(LB)平板上生长的。
按照标准方法(Sambrook等，同上)进行一般分子克隆。用载体和插入片段特异性引物的组合，采用染料终止子技术(U.S.5,366,860；EP 272,007)在ABI自动测序仪上产生DNA序列。在测序仪(Gene CodesCorporation，Ann Arbor，MI)上进行序列编辑。所有序列代表每个方向覆盖至少两次。用DNASTAR软件(DNASTAR Inc.，Madison，WI)完成基因序列的比较。
缩写的含义如下：“sec”表示秒，“min”表示分钟，“h”表示小时，“d”表示天，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“μM”表示微摩尔浓度，“mM”表示毫摩尔浓度，“M”表示摩尔浓度，“mmol”毫摩尔，“μmole”表示微摩尔，“g”表示克，“μg”表示微克，“ng”表示纳克，“U”表示单位，“bp”表示碱基对，而“kB”表示千碱基。
解脂耶氏酵母的转化和培养
从美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)购买解脂耶氏酵母菌株ATCC#20362、#76982和#90812。解脂耶氏酵母菌株在28℃下在YPD琼脂(1％酵母提取物，2％细菌用蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂)上生长。
根据Chen，D.C.等人(Appl.Microbiol Biotechnol.48(2)：232-235(1997))的方法进行解脂耶氏酵母的转化，除非另外指明。简言之，将耶氏酵母划线到YPD平板上，在30℃下生长大约18小时。从平板上刮下几个大满环的细胞，重悬于1ml转化缓冲液中，该缓冲液含有：2.25mL 50％ PEG，平均分子量3350；0.125mL 2M醋酸锂，pH6.0；0.125mL2M DTT；和50μg剪切的鲑鱼精子DNA。然后，将大约500ng线性化的质粒DNA在100μl重悬的细胞中温育，以15分钟间隔涡旋下在39℃维持1小时。将细胞铺板到选择培养基板上，在30℃下维持2-3天。
为了选择转化体，一般使用基本培养基(“MM”)；MM的组成如下：不含硫酸铵或氨基酸的0.17％酵母氮基(DIFCO Laboratories，Detroit，MI)、2％葡萄糖、0.1％脯氨酸，pH6.1。合适的情况下加入尿嘧啶补充物，达到0.01％的终浓度(从而得到“MMU”选择培养基，用20g/L琼脂制备)。
或者，在5-氟乳清酸(“FOA”；也称作5-氟尿嘧啶-6羧酸一水合物)选择培养基上选择转化体，该培养基包含：不含硫酸铵或氨基酸的0.17％酵母氮基(DIFCO Laboratories)、2％葡萄糖、0.1％脯氨酸、75mg/L尿嘧啶、75mg/L尿苷、900mg/L FOA(Zymo Research Corp.，Orange，CA)和20g/L琼脂。
解脂耶氏酵母的脂肪酸分析
为了进行脂肪酸分析，通过离心收集细胞，并且按照披露于以下文献中的方法提取脂质：Bligh，E.G.& Dyer，W.J.(Can.J.Biochem.Physiol.37：911-917(1959))。脂肪酸甲酯是通过脂质提取物与甲醇钠的酯交换反应制备的(Roughan，G.，and Nishida I.Arch Biochem Biophys.276(1)：38-46(1990))，并且随后用装有30-m X 0.25mm(内径)HP-INNOWAX(Hewlett-Packard)柱的Hewlett-Packard 6890 GC进行分析。烘箱温度以3.5℃/分钟的速度从170℃(25分钟保持时间)提高到185℃。
为了进行直接的碱酯交换，收获耶氏酵母培养物(3mL)，在蒸馏水中洗涤一次，在Speed-Vac中真空干燥5-10分钟。将甲醇钠(100μl，1％)加入样品，然后涡旋并摇动样品20分钟。加入3滴1M NaCl和400ul己烷后，涡旋和离心样品。取出上层，按照上文的描述通过GC进行分析。
实施例1
纤细眼虫生长条件、脂质谱和mRNA分离
本实施例描述了纤细眼虫的生长、培养液分析和mRNA分离。
生长和脂质分析
纤细眼虫获自密西根州立大学(East Lansing，MI)的RichardTriemer博士的实验室。从10mL活跃生长的培养物中将1mL等分物转移到500mL玻璃瓶中的250mL纤细眼虫(Eg)培养基中。Eg培养基是通过在970mL水中混合以下成分而制备的：1g醋酸钠、1g牛肉提取物(目录号U126-01，Difco Laboratories，Detroit，MI)、2g 胰蛋白胨(目录号0123-17-3，Difco Laboratories)和2g 酵母提取物(目录号0127-17-9，Difco Laboratories)。过滤灭菌后，无菌加入30mL土壤-水上清液(目录号15-3790，Carolina Biological SupplyCompany，Burlington，NC)，得到最终的Eg培养基。使纤细眼虫培养物在23℃，16小时光、8小时暗周期中无搅拌条件下生长2周。
2周后，取出10mL培养物进行脂质分析，并且在1,800xg离心5分钟。用水洗涤沉淀物一次，重新离心。真空中将得到的沉淀物干燥5分钟，重悬于100μL三甲基氢氧化锍(TMSH)，振荡下在室温中温育15分钟。此后，加入0.5mL己烷，振荡下将管形瓶室温下温育15分钟。分离脂肪酸甲酯(从己烷层注射的5μL)，用装有Omegawax 320熔融二氧化硅毛细管柱(目录号24152，Supelco Inc.)的Hewlett-Packard6890气相色谱进行定量。对烤箱温度进行程序化，在220℃保持2.7分钟，以20℃/min增加到240℃，然后再保持2.3分钟。通过Whatman氢发生器提供载体气体。将保留时间与商购的标准物(目录号U-99-A，Nu-Chek Prep，Inc.)的甲酯进行比较，得到的色谱图示于图3。
从纤细眼虫制备mRNA
通过1,800xg离心10分钟，沉淀剩余的2周培养物(240mL)，用水洗涤1次，再次离心。采用RNA STAT-60TM试剂(TEL-TEST，Inc.，Friendswood，TX)，根据提供的制造商的方案(采用5mL试剂，0.5mL水中的溶解的RNA)提取总RNA。以此方式，从沉淀物获得了1mg总RNA(2mg/mL)。用mRNA纯化试剂盒(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)，按照提供的制造商的方案从1mg总RNA分离mRNA。以此方式，获得了85μg mRNA。
实施例2
纤细眼虫cDNA合成、文库构建和测序
用CloneminerTM cDNA文库构建试剂盒(目录号18249-029，Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)并且按照所提供的制造商的方案(B版本，25-0608)制备cDNA文库。采用非放射性标记方法，用生物素-attB2-寡(dT)引物从3.2μgmRNA(实施例1)合成cDNA。合成第一和第二链后，加入attB1衔接子，连接，并且用柱层析对cDNA进行大小分级分离。浓缩来自级分7和8(大小是约800-1500bp)的DNA，重组到pDONRTM222中，并且转化到大肠杆菌ElectroMAXTM DH10BTMT1噬菌体抗性细胞(Invitrogen Corporation)中。纤细眼虫文库命名为“eeg1c”。
为了测序，首先从在384孔冷冻培养基平板中生长/冷冻的甘油培养物回收克隆，用无菌的384针复制器(Genetix，Boston，MA)在含有LB+75μg/mL卡那霉素的384孔微量滴定板(双份板)中复制。然后按照制造商的方案，用Templiphi DNA测序扩增试剂盒方法(AmershamBiosciences)分离质粒。简言之，Templiphi方法利用噬菌体φ29DNA聚合酶，通过等温滚环扩增来扩增环状单链或双链DNA(Dean等，Genome Res.，11：1095-1099(2001)；Nelson等，Biotechniques，32：S44-S47(2002))。37℃下生长20小时后，将来自双份板的细胞加入5μL稀释缓冲液中，95℃下变性3分钟，以便部分裂解细胞和释放变性的模板。然后，将Templiphi预混合物(5μL)加入每个样品，将得到的反应混合物在30℃下温育16小时，然后65℃下温育10分钟，以灭活φ29DNA聚合酶活性。在蒸馏水中将扩增的样品1:3稀释后，用
Figure A200680051550D00701
dsDNA定量试剂(Molecular Probes)进行DNA定量。
然后，95℃下使扩增的产物变性10分钟，用M13F通用引物(SEQID NO：18)和ABI BigDye3.1版Prism测序试剂盒在384孔板中进行终末测序。对于测序反应，使用100-200ng模板和6.4pmol引物，将以下反应条件重复25次：96℃下10秒，50℃下5秒，和60℃下4分钟。基于乙醇的清除后，分辨循环测序反应产物，并且在Perkin-ElmerABI3730xl自动化测序仪上检测。
实施例3
从纤细眼虫cDNA文库eeg1c鉴定Δ9延伸酶
进行BLAST(基本局部比对检索工具；Altschul，S.F.，等，J.Mol.Biol.215：403-410(1993)和Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997))检索，得到与包含在BLAST“nr”数据库中的序列(包括所有非冗余的GenBank CDS翻译、来源于三维结构Brookhaven蛋白数据库的序列、SWISS-PROT蛋白序列数据库、EMBL和DDBJ数据库的最新的主要发布)的相似性，从而鉴定编码长链多不饱和脂肪酸延伸酶同源物(即LC-PUFA ELO同源物或Δ9延伸酶)的cDNA克隆。采用国家生物技术信息中心(NCBI)提供的BLASTN算法，分析实施例2中获得的cDNA序列与“nr”数据库中包含的所有公众可获得的DNA序列的相似性。在所有读码框中翻译DNA序列，并且用NCBI提供的BLASTX算法(Gish和States，Nat.Genet.，3：266-272(1993))比较与“nr”数据库中包含的所有公众可获得的蛋白序列的相似性。为了方便，本文中将通过BLAST计算的、仅仅偶然观察到cDNA序列与检索的数据库中包含的序列的匹配的P-值(概率)报道为“pLog”值，其代表报道的P-值的负对数。因此，pLog值越大，cDNA序列和BLAST“命中”代表同源蛋白的可能性就越大。
利用来自克隆eeg1c.pk001.n5.f的核苷酸序列进行的BLASTX检索发现由cDNA编码的蛋白与IgD9e(即本文表示为SEQ ID NO：8的、来自球等鞭金藻的长链PUFA延伸酶；NCBI登录号AAL37626(GI17226123)，基因座AAL37626，CDS AF390174；Qi等，FEBSLett.510(3)：159-165(2002))的相似性。来自克隆eeg1c.pk001.n5.f的cDNA插入片段的一部分的序列示于SEQ ID NO：10(cDNA插入片段的5’末端)。
按照上文的描述，从eeg1c.pk001.n5.1的cDNA插入片段的3’末端获得额外的序列，但使用聚腺苷酸尾-引发的WobbleT寡核苷酸。简言之，WobbleT引物是21聚体聚(T)A，聚(T)C和聚(T)G的等摩尔混合物，用于对cDNA克隆的3’末端进行测序。3’末端序列示于SEQID NO：11。
用SequencherTM(4.2版，Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)对5’和3’序列进行比对，得到的cDNA序列示于SEQ ID NO：12。来自eeg1c.pk001.n5.f中的cDNA的编码序列的序列和相应的推导氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。在上文报道的同源性的基础上，推断eeg1c.pk001.n5.1的cDNA插入片段的纤细眼虫基因产物编码Δ9延伸酶，并因此命名为“EgD9e”。
通过BLASTP评估SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列(即EgD9e)，得到38.70(E值为2e-39)与IgD9e(SEQ ID NO：8)的pLog值。用LASERGENE生物信息计算程序组(DNASTAR Inc.，Madison，WI)的MegAlignTMv6.1程序，采用逐对比对的默认参数(KTUPLE＝2)，通过Jotun Hein法(Hein，J.J.，Meth.Enz.，183：626-645(1990))进行序列同一性百分比计算。采用Clustal V方法，EgD9e(SEQ ID NO：2)与IgD9e(SEQ ID NO：8)的同一性是31.8％(图4)。采用LASERGENE生物信息计算程序组的MegAlignTMv6.1程序，采用逐对比对的默认参数(KTUPLE＝1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5，DIAGONALSSAVED＝5和GAP LENGTH PENALTY＝10)，通过Clustal V法(Higgins，D.G.and Sharp，P.M.，Comput.Appl.Biosci.，5：151-153(1989)；Higgins等，Comput.Appl.Biosci.，8：189-191(1992))进行序列同一性百分比计算。
BLAST评分和概率表明，本发明的核酸片段(SEQ ID NO：12)编码完整的纤细眼虫Δ9延伸酶。
实施例4
纤细眼虫Δ9延伸酶(EgD9e)在啤酒糖酵母中的功能分析
本实施例描述了在啤酒糖酵母中进行的EgD9e的功能分析。这需要：(1)将EgD9e克隆到酵母表达载体pY-75中，产生pY119；(2)底物补料后，比较包含pY-75和pY119的转化生物中的脂质谱；和(3)不进行底物补料后，比较包含pY-75和pY119的转化生物中的脂质谱。
构建包含EgD9e的质粒pY-75(对照)和pY119
酵母附加型质粒(YEp)型载体pRS425(Christianson等，Gene，110：119-122(1992))含有来自啤酒糖酵母2μ内源质粒的序列、LEU2选择标记和基于多功能噬菌粒pBluescript II SK(+)的主链的序列。按照与Jia等(Physiological Genomics，3：83-92(2000))中描述的相同方法在pRS425的SacII和SpeI位点之间克隆啤酒糖酵母的强组成型甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD)启动子，以制备pGPD-425。将NotI位点导入pGPD-425的BamHI位点，由此产生侧翼于BamHI位点的NotI位点，该质粒称作pY-75。
根据制造商的方案，采用
Figure A200680051550D00721
 DNA聚合酶(目录号M0254S，New England Biolabs Inc.，Beverly，MA)，用寡核苷酸引物oEugEL1-1(SEQ ID NO：19)和oEugEL1-2(SEQ ID NO：20)从eeg1c.pk001.n5.f扩增EgD9e。按照制造商的方案，用Zero 
Figure A200680051550D00731
 PCR克隆试剂盒(Invitrogen Corporation)将得到的DNA片段克隆到
Figure A200680051550D00732
克隆载体中，以制备pKR906。通过用NotI消化，从pKR906释放EgD9e，并且克隆到pY-75的NotI位点，以制备pY119(SEQ ID NO：21；图5)。EgD9e在图5中标记为“eug el1”。
通过底物补料对EgD9e延伸酶活性进行的功能分析
用标准醋酸锂转化程序将质粒pY119和pY-75转化到啤酒糖酵母INVSC1(Invitrogen Corporation)中。在补加了CSM-leu(Qbiogene，Carlsbad，CA)的DOBA培养基上选择转化体。将来自每个平板的转化体接种到2mL补加了CSM-leu(Qbiogene)和2％tergitol的DOB培养基上。细胞在30℃下生长1天，此后将0.1mL转移到补加了LA[18:2(9，12)]，ALA[18:3(9，12，15)]，GLA[18:3(6，9，12)]，STA[18:4(6，9，12，15)]，ARA[20:4(5，8，11，14)]或EPA[20:5(5，8，11，14，17)]的3mL相同培养基中。将它们在30℃，250rpm温育16小时，通过离心获得沉淀物。用水洗涤细胞一次，通过离心沉淀，并且在空气中干燥。50℃下用500μL1％甲醇钠对沉淀物进行酯交换(Roughan，G.，and Nishida I.，ArchBiochemBiophys.，276(1)：38-46(1990))30分钟，然后加入500μL1M氯化钠和100μL庚烷。彻底混合和离心后，按照实施例1的描述通过GC分析脂肪酸甲酯(FAMEs)。
图6中显示了对含有pY75(载体对照)或pY119(3个独立的转化体，命名为pY119-5，pY119-6和pY119-8)的细胞进行补料的结果。脂肪酸鉴定为16:0(棕榈酸)，16:1(9)(棕榈油酸)，18:0，18:1(9)(油酸)，LA，GLA，ALA，STA，EDA，DGLA，ARA，ETrA，ETA，EPA，22:2(13，16)(二十二碳二烯酸)，22:4(7，10，13，16)(肾上腺酸)，DPA和24:1(神经酸)。对每种脂肪酸(“FA”)补料计算延伸效率(“％Elo”)为：[％FA产物/(％FA产物+％FA底物)*100]。
图6的数据证明，克隆的EgD9e有效地分别将LA和ALA延伸为EDA和ETrA。
不进行底物补料条件下EgD9e延伸酶活性的功能分析
此外，用略微不同的温度谱通过GC分析来自没有进行脂肪酸补料的细胞的FAMEs，以便实现油酸[OA-18:1(9)]和11-十八碳烯酸[VA-18:1(11)]的分离，11-十八碳烯酸是棕榈油酸[PA-16:1(9)]延伸的产物。用装配Omegawax 320熔凝二氧化硅毛细管柱(Supelco Inc.，目录号24152)的Hewlett-Packard 6890气相色谱进行脂肪酸甲酯(3μL，从己烷层注射)的分离和定量。烤箱温度通过程序控制在200℃下2.7分钟，以20℃/分钟增加到240℃，然后再保持额外的2.3分钟。结果示于表6。
                       表6
             不添加外源脂肪酸的脂质谱
 
样品名称 16:0 16:1(9) 18:0 18:1(9) 18:1(11) ％Elo16:0 ％Elo16:1
pY75 13.1 54.7 3.5 27.6 1.2 20.9 2.1
pY119-5 12.9 55.6 3.6 26.0 1.8 21.6 3.2
pY119-6 13.4 54.0 3.6 27.3 1.6 21.2 3.0
pY119-8 12.7 53.3 3.5 29.0 1.5 21.7 2.8
基于上述结果，除了作为能够催化LA和ALA分别延伸为EDA和EtrA的Δ9延伸酶的主要作用，EgD9e既可以作为C16/18延伸酶，也可以作为C18/20延伸酶。
实施例5
构建解脂耶氏酵母表达载体pY115，其包含为在解脂耶氏酵母中表达而进行了密码子优化的合成的Δ9延伸酶基因(IgD9eS)(来源于球等鞭金藻)
本实施例描述了解脂耶氏酵母表达载体pY115的构建，该载体包含嵌合FBAINm::IgD9eS::Pex20基因，其中IgD9eS是来源于球等鞭金藻的合成的Δ9延伸酶并且为在解脂耶氏酵母中表达而进行了密码子优化。如下文实施例6和7的描述，质粒pY115间接地使IgD9eS的Δ9延伸酶活性能够与EgD9e的Δ9延伸酶活性进行比较。
质粒pY115(SEQ ID NO：45；图8)的构建需要：(1)构建pDMW263；(2)合成IgD9eS并制备质粒pDMW237；和(3)连接来自质粒pDMW263和pDMW237的片段。
pDMW263的构建
质粒pY5-30(图7A；以前描述于PCT公开No.WO 05/003310[在此导入其内容作为参考])是一种穿梭质粒，其可以在大肠杆菌和解脂耶氏酵母中复制。质粒pY-30含有以下成分：耶氏酵母自主复制序列(ARS18)；ColE1质粒复制起点；氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，用于在大肠杆菌中选择；耶氏酵母LEU2基因，用于在耶氏酵母中选择；和嵌合TEF::GUS::XPR基因。
用本领域技术人员公知的技术用解脂耶氏酵母FBAINm启动子(PCT公开No.WO 05/049805)代替TEF启动子，从而从pY5-30制备质粒pDMW263(SEQ ID NO：22；图7B)。简言之，该启动子表示修饰的启动子，其位于果糖-二磷酸醛缩酶(E.C.4.1.2.13)的“ATG”翻译起始密码子前面的5’上游非翻译区，加上一部分具有内含子的5’编码区，所述酶由fba1基因编码，并且是表达所必须的，其中FBAINm具有位于ATG翻译起始密码子和FBAIN启动子的内含子之间的52bp缺失(从而仅仅包含N-末端的22个氨基酸)和内含子后的新的翻译共有基序。表7概括了pDMW263的成分。
                    表7
       质粒pDMW263的成分(SEQ ID NO：22)
 
SEQ IDNO：22内的RE位点和核苷酸    片段和嵌合基因成分的说明
4992-4296 ARS18序列(GenBank登录号A17608)
SalI/SacII(8505-2014) FBAINm::GUS::XPR，包含：·FBAINm：FBAINm启动子(PCT公开No.WO2005/049805；在图7B中标示为“Fba1+内含子”)·GUS：编码β-葡糖苷酸酶的大肠杆菌基因(Jefferson，R.A.Nature.14：342：837-838(1989)·XPR：耶氏酵母Xpr基因(GenBank登录号M17741)的3’区的约100bp              
6303-8505 耶氏酵母Leu2基因(GenBank登录号AF260230)                     
IgD9eS的体外合成
以类似于PCT公开No.WO 2004/101753(US-2004-0253621-A1)和PCT公开No.WO 2006/052870(US-2006-0115881-A1)描述的方式，对球等鞭金藻的Δ9延伸酶基因(IgD9e；SEQ ID NOs：7和8)的密码子选择进行优化，用于在解脂耶氏酵母中表达，所述每篇文献都在此全文导入作为参考。具体地，基于IgD9e(SEQ ID NO：7)的编码序列，根据耶氏酵母密码子选择模式和RNA稳定性的一般规则(Guhaniyogi，G.和J.Brewer，Gene，265(1-2)：11-23(2001))，设计密码子优化的Δ9延伸酶基因(命名为“IgD9eS”；SEQ ID NO：9)。除了修饰翻译起始位点，修饰了792bp编码区的127bp(16.0％)，优化了122个密码子。密码子优化基因中的修饰都没有改变编码的蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO：8)。
更具体地，设计了8对寡核苷酸来延伸全长IgD9eS(例如IL3-1A，IL3-1B，IL3-2A，IL3-2B，IL3-3A，IL3-3B，IL3-4A，IL3-4B，IL3-5A，IL3-5B，IL3-6A，IL3-6B，IL3-7A，IL3-7B，IL3-8A和IL3-8B，相应于SEQ ID NOs：23-38)。每对有义(A)和反义(B)寡核苷酸是互补的，每个5’-末端的4bp突出端除外。此外，分别给引物IL3-1F，IL3-4R，IL3-5F和IL3-8R(SEQ ID NOs：39-42)导入NcoI，PstI，PstI和Not1限制位点，用于随后的亚克隆。
37℃下在含有50mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、10mMDTT、0.5mM亚精胺、0.5mM ATP和10U T4多核苷酸激酶的20μl体积中对每种寡核苷酸(100ng)进行磷酸化1小时。混合每对有义和反义寡核苷酸，采用以下参数在热循环仪中退火：95℃(2min)，85℃(2min)，65℃(15min)，37℃(15min)，24℃(15min)和4℃(15min)。因此，将IL3-1A(SEQ ID NO：23)与IL3-1B(SEQ ID NO：24)退火，产生双链产物“IL3-1AB”。类似地，将IL3-2A(SEQ ID NO：25)与IL3-2B(SEQ ID NO：26)退火，产生双链产物“IL3-2AB”等。
然后将退火的双链寡核苷酸的两个独立的集合连接到一起，如下所示：集合1(包含IL3-1AB、IL3-2AB、IL3-3AB和IL3-4AB)；和集合2(包含IL3-5AB、IL3-6AB、IL3-7AB和IL3-8AB)。在20μl的体积中将每个退火的寡核苷酸的集合与10U的T4DNA连接酶混合，16℃下温育连接反应过夜。
然后将每个连接反应的产物用作模板，通过PCR扩增设计的DNA片段。具体地，采用连接的“集合1”混合物(即IL3-1AB、IL3-2AB、IL3-3AB和IL3-4AB)作为模板，寡核苷酸IL3-1F和IL3-4R(SEQ IDNOs：39和40)作为引物，通过PCR扩增IgD9eS的第一部分。将417bp PCR片段亚克隆到pGEM-T easy载体(Promega)中，得到pT9(1-4)(SEQ ID NO：43)。
采用连接的“集合2”混合物(即IL3-5AB、IL3-6AB、IL3-7AB和IL3-8AB)作为模板，寡核苷酸IL3-5F和IL3-8R(SEQ ID NOs：41和42)作为引物，通过PCR类似地扩增IgD9eS的第二部分，克隆到pGEM-T-easy载体中，得到pT9(5-8)(SEQ ID NO：44)。
分别用pT9(1-4)(SEQ ID NO：43)和pT9(5-8)(SEQ ID NO：44)转化大肠杆菌，从氨苄青霉素抗性转化体中分离质粒DNA。纯化质粒DNA，用合适的限制内切酶消化，以释放pT9(1-4)的417bp NcoI/PstI片段和pT9(5-8)的377bp PstI/Not1片段。然后混合这两个片段，按照方向与Nco1/Not1消化的pZUF17(SEQ ID NO：121；图7C)连接在一起，得到pDMW237(SEQ ID NO：46)。这样，合成产生的IgD9eS基因的侧翼是FBAIN启动子和表达载体pDMW237内的耶氏酵母Pex20终止子。
解脂耶氏酵母表达载体pY115的最终构建
将来自pDMW263(含有解脂耶氏酵母FBAINm启动子)的NcoI/SalI DNA片段克隆到pDMW237(含有IgD9eS)的NcoI/SalI DNA片段中，得到pY115(SEQ ID NO：45；图8)，其包含嵌合FBAINm::IgD9eS::Pex20基因。在图8中，FBAINm标示为“Fba1+内含子”，IgD9eS标示为“球等鞭金藻合成Δ9延伸酶”。
实施例6
构建解脂耶氏酵母表达载体pBY2(包含EgD9e)和pBY1-FAE(包含IgD9eS)
本发明描述了解脂耶氏酵母表达载体pBY2(包含嵌合FBAINm::EgD9e::Pex20基因)和pBY1-FAE(包含嵌合FBAINm::IgD9eS::Pex20基因)的合成。如实施例7(下文)的描述，当在解脂耶氏酵母中表达时，将IgD9eS的Δ9延伸酶活性与EgD9e的延伸酶活性进行比较。
构建解脂耶氏酵母表达载体pBY2
用NcoI/NotI消化质粒pY115(SEQ ID NO：45；实施例5)，用Klenow填充得到的DNA末端。填充形成平端后，用小牛肠碱性磷酸酶处理DNA片段，用琼脂糖凝胶电泳分离。从琼脂糖凝胶切下含解脂耶氏酵母FBAINm启动子的6989bp片段，用
Figure A200680051550D00781
凝胶提取试剂盒(Qiagen Inc.，Valencia，CA)按照制造商的方案纯化。采用Gateway载体转化系统(目录号11823-029，Invitrogen Corporation)，用盒rfA连接纯化的6989bp片段，形成解脂耶氏酵母
Figure A200680051550D00782
目的载体pBY1(SEQ ID NO：47；图9A)。
按照制造商的方案，用
Figure A200680051550D00791
旋转微量制备试剂盒(QiagenInc.，Valencia，CA)从纤细眼虫克隆eeg1c.pk001.n5.f(实施例2和3)纯化质粒。采用
Figure A200680051550D00792
LR ClonaseTM II酶混合物(目录号11791-020，Invitrogen Corporation)，并且按照制造商的方案，将来自eeg1c.pk001.n5.f的cDNA转移到pBY1，形成pBY2(SEQ ID NO：48；图9B)。由于采用WobbleT引物进行测序，eeg1c.pk001.n5.f的3’末端的完整序列(即含有聚腺苷酸尾)是未知的。基于限制性消化和琼脂糖凝胶分析，聚腺苷酸尾A的长度似乎小于100bp。
构建解脂耶氏酵母表达载体pBY1-FAE
按照制造商的方案，用AccuPrimeTMTaq高保真聚合酶(目录号12346-086，Invitrogen Corporation)，用寡核苷酸引物ig-s(SEQ ID NO：49)和ig-as(SEQ ID NO：50)从pY115(SEQ ID NO：45；实施例5)扩增IgD9eS。按照制造商的方案，用pENTRTM Directional 
Figure A200680051550D00793
克隆试剂盒(Invitrogen Corporation)将得到的DNA片段克隆到pENTRTM/D-TOPO
Figure A200680051550D0079130611QIETU
中，得到pENTR-FAE。如上文的描述，按照制造商的方案，用旋转微量制备试剂盒(Qiagen Inc.，Valencia，CA)纯化质粒pENTR-FAE。采用
Figure A200680051550D00796
LR ClonaseTM II酶混合物(目录号11791-020，Invitrogen Corporation)并且按照制造商的方案，将IgD9eS的CDS转移到pBY1，形成pBY1-FAE(SEQ ID NO：51；图9C)。
载体转化为大肠杆菌
制备pBY2和pBY1-FAE后，将每个载体转化到大肠杆菌DH10BTM(Invitrogen Corporation)细胞中。培养转化的细胞，用
Figure A200680051550D00797
旋转微量制备试剂盒(Qiagen Inc.，Valencia，CA)分离pBY2和pBY1-FAE。
实施例7
解脂耶氏酵母株Y2224中的EgD9e功能分析
本实施例描述了解脂耶氏酵母株Y2224中的EgD9e功能分析。这需要：(1)构建菌株Y2224(即来自野生型耶氏酵母株ATCC#20362的Ura3基因自主突变的FOA抗性突变体)；和(2)比较包含pBY2(表达EgD9e)或pBY1-FAE(表达IgD9eS)的解脂耶氏酵母株Y2224的转化生物体内的脂质谱。
制备解脂耶氏酵母株Y2224
按照以下方式分离菌株Y2224：将来自YPD琼脂板的解脂耶氏酵母ATCC#20362细胞划线到含有250mg/L5-FOA(Zymo Research)的基本培养基板(尿嘧啶和尿苷各75mg/L，6.7g/L含有硫酸铵的YNB，无氨基酸，20g/L葡萄糖)上。将板在28℃下温育，将得到的菌落中的4个斑点分离到含有200mg/mL5-FOA的基本培养基板和缺乏尿嘧啶和尿苷的基本培养基板上，以证实尿嘧啶Ura3营养缺陷。随后，使解脂耶氏酵母株Y2224于28℃在YPD琼脂上生长。
包含pBY1-FAE和pBY2的解脂耶氏酵母转化体的功能分析
按照一般方法的描述，将pBY1-FAE(包含嵌合FBAINm::IgD9eS::Pex20基因)和pBY2(包含嵌合FBAINm::EgD9e::Pex20基因)转化到解脂耶氏酵母株Y2224中。将细胞铺板到缺乏尿嘧啶的基本培养基上，并且在30℃下维持2-3天。
然后使转化体的单菌落30℃下在3mL缺乏尿嘧啶的基本培养基中生长至OD600为约1.0。作为对照，Y2224也在补加尿嘧啶的基本培养基中以相似的方式生长。随后用水洗涤细胞，通过离心收集，并且按照上文的描述进行酯交换。采用实施例4描述的方法(即，对于含pY119的啤酒糖酵母细胞的描述)通过GC分析来自含pBY1-FAE、pBY2或无表达载体的细胞的FAMEs进行分析。代表三次重复的平均值的结果示于表8。脂肪酸鉴定为16:0(棕榈酸)，16:1(9)(棕榈油酸)，17:1(9)，18:0，18:1(9)(油酸)，LA和EDA。按照实施例4的描述计算延伸效率(“％Elo LA”)。
                            表8
         表达EgD9e和IgD9eS的耶氏酵母的脂质谱的比较
 
样品名称 Δ9延伸酶 16:0 16:1(9) 17:1(9) 18:0 18:1(9) LA EDA ％EloLA
Y2224-1 无 13.4 12.6 0.8 2.8 43.1 27.2 0.1 0.2
Y2224-2 无 12.2 12.3 0.8 2.3 46.1 26.2 0.1 0.2
Y2224-3 无 11.7 10.8 1.1 2.8 48.4 25.0 0.1 0.2
pBY1-FAE-1 IgD9eS 11.9 11.9 0.8 3.1 50.6 20.2 1.6 7.5
pBY1-FAE-2 IgD9eS 12.9 11.4 0.9 3.6 46.7 23.0 1.4 5.9
pBY1-FAE-3 IgD9eS 12.1 12.5 0.8 3.2 50.0 19.8 1.6 7.4
pBY2-1 EgD9e 12.3 11.7 0.8 3.4 48.4 21.1 2.2 9.5
pBY2-2 EgD9e 12.1 12.5 0.8 3.2 50.1 19.1 2.3 10.6
pBY2-3 EgD9e 12.1 12.2 0.8 3.3 50.0 19.4 2.1 9.9
如表8所示，结果证明当将LA转化为EDA时，EgD9e以比IgD9eS更高的底物转化效率起作用。
实施例8
解脂耶氏酵母表达载体pZuFmEgD9ES的构建和功能分析，该载体包含为在解脂耶氏酵母中表达而进行了密码子优化的合成的Δ9延伸酶基因(EgD9eS)(来源于纤细眼虫)
本实施例描述了解脂耶氏酵母表达载体pZuFmEgD9ES的构建，该载体包含嵌合FBAINm::EgD9ES::Pex20基因，其中EgD9eS是来源于纤细眼虫的合成的Δ9延伸酶并且为在解脂耶氏酵母中表达而进行了密码子优化。因此，该分析需要：(1)合成EgD9eS；(2)将pZuFmEgD9ES构建和转化到解脂耶氏酵母株Y2224中；和(3)分析包含pZuFmEgD9ES(表达EgD9eS)的解脂耶氏酵母株Y2224的转化生物体中的脂质谱。
合成EgD9eS
以类似于实施例5和PCT公开No.WO 2004/10175中描述的方式，优化纤细眼虫Δ9延伸酶基因(EgD9e；SEQ ID NOs：1和2)的密码子选择。具体地，根据耶氏酵母密码子选择模式(PCT公开No.WO2004/101753)，基于EgD9e的编码序列(即来自克隆eeg1c.pk001.n5.f)、“ATG”翻译起始密码子附近的共有序列和RNA稳定性的一般规则(Guhaniyogi，G.和J.Brewer，Gene，265(1-2)：11-23(2001))设计密码子优化的Δ9延伸酶基因(命名为“EgD9eS”；SEQ ID NO：3)。除了修饰翻译起始位点，修饰了777bp编码区的117bp(15.1％)，并且优化了106个密码子。图10显示了EgD9e和EgD9eS的核苷酸序列的比较。密码子优化的基因中的修饰都没有改变编码的蛋白的氨基酸序列(SEQID NO：2)。由GenScript公司(Piscataway，NJ)合成设计的EgD9eS基因，并且克隆到pUC57(GenBank登录号Y14837)中，以制备pEgD9S。
制备构建体pZuFmEgD9E(包含EgD9E)和pZuFmEgD9ES(包含EgD9ES)
通过用来自包含EgD9eS的pEgD9S的Nco I/Not I片段取代pZUF17(图7C；SEQ ID NO：121)的Nco I/Not I片段，构建包含嵌合FBAINm::EgD9ES::Pex20基因的质粒pZuFmEgD9ES(SEQ ID NO：53)。该连接的产物是自主复制的表达载体pZuFmEgD9ES，其因此包含以下成分：
                        表9
        质粒pZuFmEgD9ES(SEQ ID NO：53)的成分
 
SEQ ID NO：53内的RE位点和核苷酸 片段和嵌合基因成分的说明
Swa I/BsiW I(6067-318) FBAINm::EgD9eS::Pex20，包含：·FBAINm：解脂耶氏酵母FBAINm启动子(PCT公开No.WO2005/049805)·EgD9eS：密码子优化的Δ9延伸酶(SEQ IDNO：3，本文描述为EgD9eS)，来源于纤细眼虫·Pex20：耶氏酵母Pex20基因的Pex20终止子序列(GenBank登录号AF054613)                
1354-474 ColE1质粒复制起点
2284-1424 用于在大肠杆菌中进行选择的氨苄青霉素抗性基因(AmpR)                                  
3183-4487 耶氏酵母自主复制序列(ARS18；GenBank登录号A17608)                                  
6020-4533 耶氏酵母Ura 3基因(GenBank登录号AJ306421)
以类似的方式，用pZUF17质粒主链合成包含嵌合FBAINm::EgD9E::Pex20基因的质粒pZuFmEgD9E(SEQ ID NO：52)。
包含pZuFmEgD9E和pZuFmEgD9ES的解脂耶氏酵母转化体的功能分析
按照一般方法中的描述，将质粒pZuFmEgD9E和pZuFmEgD9ES(分别包含嵌合FBAINm::EgD9e::Pex20基因和FBAINm::EgD9eS::Pex20基因)转化到菌株Y2224(来自野生型耶氏酵母株ATCC#20362的Ura3基因自主突变的FOA抗性突变体，实施例7)中。在MM板上选择转化体。30℃下生长2天后，挑选在MM板上生长的3个转化体，重新划线到新的MM板上。一旦生长，将这些菌株30℃下单个接种到3mL液体MM中，并且250rpm/min下振荡2天。通过离心收集细胞，提取脂质，通过酯交换制备脂肪酸甲酯，随后用Hewlett-Packard 6890 GC进行分析。
GC分析显示在所有7个含有pZuFmEgD9E的转化体中产生占总脂质3.2％的EDA(C20:2)，其中在这7个菌株中LA(C18:2)转化为EDA的平均转化效率确定为约18.3％(平均值；按照实施例4的描述计算)。
不同的是，GC分析显示在所有7个含有pZuFmEgD9ES的转化体中产生占总脂质3.6％的EDA(C20:2)，其中在这7个菌株中LA(C18:2)转化为EDA的平均转化效率确定为约20.1％(平均值)。因此，实验数据证明为在解脂耶氏酵母中表达而进行了密码子优化的合成的纤细眼虫Δ9延伸酶(即EgD9eS；SEQ ID NO：3)在将LA延伸为EDA方面比野生型EgD9e基因(即SEQ ID NO：1)的效率高约16.2％。
实施例9
构建用于表达纤细眼虫Δ9延伸酶(EgD9e)的解脂耶氏酵母表达载体pY120
本实施例描述了构建用于表达EgD9e的解脂耶氏酵母载体pY120。具体地，将来自pKR906(包含EgD9e；来自实施例4)的NcoI/NotI DNA片段克隆到来自pY115(图8；实施例5；包含解脂耶氏酵母FBAINm启动子)的NcoI/NotI DNA片段中，产生pY120(SEQ ID NO：54；图11A)。在该图中，EgD9e标示为“eug el1”。
实施例10
构建用于表达纤细眼虫Δ9延伸酶(EgD9e)的大豆表达载体pKR912
本实施例描述了构建用于表达EgD9e的大豆载体pKR912。
初始质粒pKR72(ATCC保藏号PTA-6019；SEQ ID NO：55)，即以前描述于PCT公开No.WO 02/008269(其内容在此导入作为参考)的pKS123衍生物，含有潮霉素B磷酸转移酶(HPT)(Gritz，L.和Davies，J.，Gene，25：179-188(1983))，其侧翼是T7启动子和转录终止子(T7prom/HPT/T7term终止子盒)和细菌复制起点(ori)，用于在细菌(如大肠杆菌)中进行选择和复制。此外，pKR72也含有HPT基因，其侧翼是35S启动子(Odell等，Nature，313：810-812(1985))和NOS3’转录终止子(Depicker等，J.Mol.Appl.Genet.，1：561-570(1982))(35S/HPT/NOS3’盒)，用于在植物，如大豆中进行选择。pKR72也含有NotI限制位点，侧翼是β-大豆球蛋白的α’亚基的启动子(“BCONPro”；Beachy等，EMBO J.，4：3047-3053(1985))和菜豆蛋白的3’转录终止区(Doyle等，J.Biol.Chem.，261：9228-9238(1986))，由此使得克隆到NotI位点的基因能够在大豆种子中进行组织特异性强表达。
通过用NotI消化，从pKR906释放EgD9e(实施例4)，并且克隆到pKR72的NotI位点，产生pKR912(SEQ ID NO：56)。pKR912的示意性描述示于图11B；EgD9e在其中标示为“eug el1”。
实施例11
构建用于表达纤细眼虫Δ9延伸酶(EgD9e)的大豆中间克隆载体pKR911
本实施例描述了构建用于表达EgD9e的大豆载体pKR911。
以前描述于PCT公开No.WO 02/00905(其内容在此导入作为参考)中的载体pKS102(SEQ ID NO：57)含有T7prom/HPT/T7term盒(描述于实施例10)和细菌复制起点(ori)，用于在细菌(如大肠杆菌)中进行选择和复制。
通过组合来自含有T7prom/HPT/T7term盒和细菌ori的质粒pKS102(SEQ ID NO：57)的AscI片段和来自含有βcon/NotI/Phas盒的质粒pKR72(描述于实施例10)的AscI片段，构建以前描述于PCT公开No.WO 04/071467(其内容在此导入作为参考)的载体pKR197(SEQ ID NO：58)。
通过用NotI消化，从pKR906(实施例4)释放EgD9e，并且克隆到pKR197的NotI位点中，产生中间克隆载体pKR911(SEQ ID NO：59)。pKR911的示意性描述示于图12A；EgD9e在其中标示为“eug el1”。
实施例12
纤细眼虫Δ8去饱和酶的cDNA合成
本实施例描述了按照美国专利申请No.11/166003和No.11/166993(相应于PCT公开No.WO 06/012325和No.WO 06/012326[其内容在此导入作为参考])公开的内容，从纤细眼虫分离Δ8去饱和酶(命名为“EgD8”)。该基因的分离是需要的，使得能够共表达EgD9e和EgD8，从而允许表达Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径，并且能够从LA和/或ALA积累DGLA和/或ETA。
根据制造商的方案，采用用于cDNA合成的SuperScriptTM选择系统(InvitrogenTM Life Technologies，Carlsbad，CA)，用提供的寡聚(dT)引物，从765ng mRNA(实施例1)合成纤细眼虫cDNA。将合成的cDNA溶解于20μL水中。
采用下文所述条件，从cDNA扩增纤细眼虫Δ8去饱和酶。具体地，将cDNA(1μL)与50pmol Eg5-1(SEQ ID NO：62)、50pmol Eg3-3(SEQID NO：63)、1μL PCR核苷酸混合物(10mM，Promega，Madison，WI)、5μL 10X PCR缓冲液(Invitrogen)、1.5μL MgCl2(50mM，Invitrogen公司)、0.5μTaq聚合酶(Invitrogen公司)和水混合到50μL。反应条件是94℃ 3分钟，然后是35个循环的94℃ 45秒，55℃ 45秒和72℃ 1分钟。72℃下使PCR终止7分钟，然后保持在4℃。用5μL通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR反应，观察到分子量为大约1.3kB的DNA条带。通过琼脂糖凝胶电泳分离剩余的45μL产物，按照制造商的方案，用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo Research，Orange，CA)纯化DNA条带。按照制造商的方案将得到的DNA克隆到
Figure A200680051550D00861
 Easy载体(Promega)中。用T7(SEQ ID NO：64)、M13-28Rev(SEQ ID NO：65)、Eg3-2(SEQ ID NO：66)和Eg5-2(SEQ IDNO：67)对多个克隆进行测序。
由此获得了纤细眼虫Δ8去饱和酶(即Eg5)的DNA序列(SEQ IDNO：60)。Eg5的翻译得到了SEQ ID NO：61所示的蛋白序列。为了本文的目的，“Eg5”在说明书其余的部分称作“EgD8”。
尽管在此没有详细描述，也用上文实施例5描述的方法制备了为在解脂耶氏酵母中表达而进行了密码子优化的合成形式的EgD8(如美国专利申请No.11/166003和No.11/166993(相应于PCT公开No.WO06/012325和No.WO 06/012326)中的公开)。该基因命名为EgD8S，在本文描述为SEQ ID NOs：68和69。
实施例13
构建用于共表达EgD9e和EgD8的大豆表达载体pKR913
本实施例描述了构建用于共表达EgD9e和EgD8的大豆载体pKR913。
以前描述于PCT公开No.WO 02/00904(其内容在此导入作为参考)的载体pKS121(SEQ ID NO：70)含有NotI位点，其侧翼是Kunitz大豆胰蛋白酶抑制剂(KTi)启动子(Jofuku等，Plant Cell，1：1079-1093(1989))和KTi3’终止区，其分离描述于美国专利No.6,372,965(KTi/NotI/KTi3’盒)。
以前描述于PCT公开No.WO 05/047479(其内容在此导入作为参考)的载体pKR457(SEQ ID NO：71)是pKS121的衍生物，其中KTi/NotI/KTi3’盒上游和下游的限制位点通过许多亚克隆步骤而改变。载体pKR457也含有以前描述于PCT公开No.WO 04/071467(其内容在此导入作为参考)中的大豆白蛋白转录终止子(GM-ALB TERM)，位于KTi终止子下游，用于延伸和加强转录终止。在pKR457中，除去KTi/NotI/KTi3’盒中的KTi启动子上游的BamHI位点，并且加入含有BsiWI，SalI，SbfI和HindIII位点的新序列(SEQ ID NO：72)，其中BsiWI位点距离Kti启动子的5’末端最近。
此外，除去来自pKS121的KTi/NotI/KTi3’盒中的Kti终止子下游的SalI点，并且加入含XbaI(距离Kti终止子的3’末端最近)，BamHI位点，大豆白蛋白转录终止子序列，BsiWI位点和另一BamHI位点的新序列(SEQ ID NO：73)。以前已经用设计用于在终止子的3’末端导入BsiWI位点的引物oSalb-12(SEQ ID NO：74)和设计用于在终止子的5’末端导入BamHI位点的引物oSalb-13(SEQ ID NO：75)，从大豆基因组DNA扩增白蛋白转录终止子。
通过用NotI消化，从实施例12描述
Figure A200680051550D00871
 Easy载体释放EgD8(SEQ ID NO：60)，并且克隆到pKR457的NotI位点，产生pKR680(SEQID NO：76)。然后用BsiWI消化质粒pKR680，将含有EgD8的片段克隆到pKR911(SEQ ID NO：59；实施例11)的BsiWI位点。pKR913的示意性描述示于图12B。其中EgD9e标示为“eug el1”，EgD8标示为eug d8-sq5。
实施例14
构建用于共表达EgD9e和EgD8的大豆表达载体
本实施例描述了构建用于共表达EgD9e和EgD8的大豆载体。具体地，用BsiWI消化质粒pKR680(SEQ ID NO：76；实施例13)，将含有EgD8(SEQ ID NO：60)的片段克隆到pKR912(SEQ ID NO：56；实施例10)的BsiWI位点。以此方式，在强、种子特异性启动子控制下共表达EgD8与EgD9e。
实施例15
构建用于与高山被孢霉Δ5去饱和酶(Mad5)共表达EgD9e和EgD8的载体
本实施例描述了构建用于共表达EgD9e和EgD8以及其它PUFA基因(即Δ5去饱和酶)的大豆载体。
以下面的方式构建美国专利No.6,075,183和PCT公开Nos.WO04/071467和WO 05/0479479(其内容在此导入作为参考)中描述的含EgD8(SEQ ID NO：60)，EgD9e(SEQ ID NO：1)和高山被孢霉Δ5去饱和酶(SEQ ID NO：78；“Mad5”)的大豆表达载体，所有这些都处于强的种子特异性启动子控制下。
通过许多亚克隆步骤，将DNA序列(SEQ ID NO：80)有效加入载体pKR287(描述于PCT公开No.WO 04/071467，其内容在此导入作为参考)的SmaI位点，以产生pKR767(SEQ ID NO：81)。以此方式，将SbfI限制位点加入Gy1/Mad5/legA2盒的leg1A转录终止子的3’末端，其描述于PCT公开Nos.WO 04/071467和WO 05/0479479。
通过用SbfI消化，从pKR767释放Gy1/Mad5/legA2盒，将得到的片段克隆到实施例14描述的载体的SbfI位点，产生共表达处于种子特异性强启动子控制下的所有三种基因(即EgD9e，EgD8和Mad5)的新载体。
实施例16
与异丝水霉Δ17去饱和酶(SdD17)共表达包含EgD9e、EgD8和Mad5的大豆表达载体
本实施例描述了与表达多种不同的种子特异性启动子/长链PUFA生物合成基因组合(如表达Δ17去饱和酶)的其它载体一起共转化实施例15描述的大豆表达载体(表达EgD9e，EgD8和Mad5)。采用了完整质粒或来自含有合适的基因组合的质粒的纯化AscI片段(也可以采用任何质粒片段的任何组合)。
例如，实施例15描述的载体可以与包含膜联蛋白启动子控制下的异丝水霉Δ17去饱和酶(SdD17)并且具有用于在植物中进行选择的潮霉素抗性基因的pKR328(SEQ ID NO：82，描述于PCT公开No.WO04/071467)共转化。
类似地，实施例15描述的载体可以与pKR886或pKR886r(分别见图13A和13B)共转化，pKR886和pKR886r是两种类似于pKR328的载体，但具有SAMS/ALS/ALS3’盒(描述于PCT公开No.WO04/071467)，用于在植物中进行选择。具体地，通过将含有来自pKR271(SEQ ID NO：85，描述于PCT公开No.WO 04/071467)的Ann/Sdd17/BD30盒的PstI片段克隆到pKR226(SEQ ID NO：86，描述于PCT公开No.WO04/071467)的SbfI位点，制备载体(SEQ ID NO：83)和pKR886r(SEQ ID NO：84)。
实施例17
与SdD17和拟南芥Fad3共表达包含EgD9e、EgD8和Mad5的大豆表达载体
本实施例描述了与表达多种不同的种子特异性启动子/长链PUFA生物合成基因组合(如表达Δ17去饱和酶和Fad3)的其它载体一起共转化实施例15描述的大豆表达载体(表达EgD9e，EgD8和Mad5)。
实施例15的载体可以与pKR275(SEQ ID NO：87，描述于PCT公开No.WO 04/071467并具有ATCC保藏号PTA-4989)或pKR329(SEQ ID NO：88，描述于PCT公开No.WO 04/07146)共转化到大豆中。质粒pKR275和pKR329分别具有ALS或潮霉素选择，并且除Ann/Sdd17/BD30盒外还含有KTi/Fad3/KTi3’基因盒(描述于PCT公开No.WO 04/071467)。以此方式，拟南芥Fad3基因可以与种子特异性强启动子后的异丝水霉Δ17去饱和酶(SdD17)共表达。
实施例18
与SdD17和串珠镰孢Δ15去饱和酶(FmD15)共表达包含EgD9e、EgD8和Mad5的大豆表达载体
本实施例描述了与表达多种不同的种子特异性启动子/长链PUFA生物合成基因组合(如表达Δ17去饱和酶和Δ15去饱和酶)的其它载体一起共转化实施例15描述的大豆表达载体(表达EgD9e，EgD8和Mad5)。
实施例15描述的载体可以与具有潮霉素选择并且含有KTi启动子控制下的串珠镰孢Δ15去饱和酶(FmD15)的pKR585(SEQ ID NO：89，描述于PCT公开No.WO 05/0479479并具有ATCC保藏号PTA-6019)共转化到大豆中。
实施例15描述的载体也可以与具有ALS选择并且含有KTi启动子控制下的串珠镰孢Δ15去饱和酶以及Ann/Sdd17/BD30盒的pKR669共转化到大豆中。通过以下途径生产质粒pKR669。KTi启动子:FmD15:KTi终止子盒通过BsiWI消化从质粒pKR578(SEQ ID NO：90，描述于PCT公开No.WO 05/0479479并具有ATCC保藏No.PTA-6280)释放，并且克隆到质粒pKR226(SEQ ID NO：86，描述于PCT公开No.WO 04/071467)的BsiWI位点中，得到pKR667(SEQ ID NO：91)，所述质粒pKR226含有用于选择的ALS基因、T7prom/HPT/T7term盒和细菌ori区。用PstI消化质粒pKR271(SEQ ID NO：85，描述于PCT公开No.WO 04/071467)，将含有异丝水霉Δ17去饱和酶的片段克隆到pKR667的SbfI位点，产生pKR669。以此方式，串珠镰孢Δ15去饱和酶可以与种子特异性强启动子后的异丝水霉Δ17去饱和酶共表达。pKR669的示意性描述示于图14A。
实施例15描述的载体也可以与具有ALS选择并且含有大豆白蛋白启动子控制下的串珠镰孢Δ15去饱和酶(FmD15)(描述于PCT公开No.WO 04/071467)以及Ann/Sdd17/BD30盒的pKR873(SEQ ID NO：92)共转化到大豆中。具体地，通过以下途径生产质粒pKR873。用PCR从质粒pKR132(SEQ ID NO：93，描述于PCT公开No.WO 04/071467)扩增SA/NotI/SA3’盒。设计引物oSA1b-9(SEQ ID NO：94)，用于在启动子的5’末端导入XbaI和BsiWI位点，并设计引物oSA1b-2(SEQ IDNO：95)，用于在终止子的3’末端导入BsiWI和XbaI位点。随后将得到的PCR片段克隆到AMP SK(+)(Stratagene Company，San Diego，CA)中，产生pKR160(SEQ ID NO：96)。然后用BsiWI消化质粒pKR160，并且将SA/NotI/SA3’盒连接到pKR124(SEQ ID NO：97，描述于PCT公开No.WO 05/0479479)的BsiWI位点中，产生pKR163(SEQ ID NO：98)。将来自pY34(SEQ ID NO：99，描述于PCT公开No.WO 05/0479479)的含有串珠镰孢Δ15去饱和酶的NotI片段克隆到pKR163(SEQ ID NO：98)的NotI位点，产生pKR863(SEQ ID NO：100)。通过用BsiWI消化从质粒pKR863释放SA/FmD15/SA3’盒，并且克隆到质粒pKR226(SEQ ID NO：86，描述于PCT公开No.WO 04/071467)的BsiWI位点，产生pKR869(SEQ ID NO：101)，所述质粒pKR863含有用于选择的ALS基因、T7prom/HPT/T7term和细菌ori区。用PstI消化质粒pKR271(SEQ ID NO：85，描述于PCT公开No.WO04/071467)，将含有异丝水霉Δ17去饱和酶的片段克隆到pKR869(SEQID NO：101)的SbfI位点中，产生pKR873(SEQ ID NO：92)。以此方式，串珠镰孢Δ15去饱和酶可以与种子特异性强启动子后的异丝水霉Δ17去饱和酶共表达。pKR873的示意性描述示于图14B。
实施例19
与SdD17和高山被孢霉延伸酶(MaELO)共表达包含EgD9e、EgD8和Mad5的大豆表达载体
本实施例描述了与表达多种不同的种子特异性启动子/长链PUFA生物合成基因组合(如表达Δ17去饱和酶和延伸酶)的其它载体一起共转化实施例15描述的大豆表达载体(表达EgD9e，EgD8和Mad5)。
实施例15描述的载体可以与具有ALS选择并且含有大豆白蛋白启动子控制下的高山被孢霉延伸酶(描述于PCT公开Nos.WO 04/071467和WO 00/12720)以及Ann/Sdd17/BD30盒的载体共转化到大豆中。该质粒可以通过与上文所述相似的方式产生。例如，含有高山被孢霉延伸酶(“Maelo”)的来自pKR270(SEQ ID NO：102，描述于PCT公开No.WO 04/071467)的NotI片段可以克隆到pKR163(SEQ ID NO：98)的NotI位点，产生具有SA/Maelo/SA3’盒的载体。可以通过用BsiWI消化从该质粒释放SA/Maelo/SA3’盒，并且克隆到质粒pKR226(SEQID NO：86，描述于PCT公开No.WO 04/071467)的BsiWI位点，产生新质粒，所述质粒pKR226含有用于选择的ALS基因、T7prom/HPT/T7term和细菌ori区。然后可以用PstI消化质粒pKR271(SEQ ID NO：85，描述于PCT公开No.WO 04/071467)，并且可以将含有异丝水霉Δ17去饱和酶的片段克隆到含有SA/Maelo/SA3’盒的新质粒的SbfI位点。以此方式，高山被孢霉延伸酶可以与种子特异性强启动子后的异丝水霉Δ17去饱和酶共表达。
实施例20
与C20/22延伸酶和Δ4去饱和酶共表达包含EgD9e、EgD8和Mad5的大豆表达载体
本实施例描述了与表达多种不同的种子特异性启动子/长链PUFA生物合成基因组合(如表达C20/22延伸酶和Δ4去饱和酶)的其它载体一起共转化实施例15描述的大豆表达载体(表达EgD9e，EgD8和Mad5)。
C20/22延伸酶(也鉴定为Δ5延伸酶和/或EPA延伸酶)和/或Δ4去饱和酶也可以在与本文描述相类似的大豆表达载体中共表达。例如，可以将来自聚集裂殖壶菌(Schizochytrtum aggregatum)的Δ4去饱和酶(描述于PCT公开No.WO 02/090493)或来自巴夫藻(Pavlova)的Δ5延伸酶(描述于PCT公开No.WO 04/071467)克隆到合适的大豆表达载体，如描述于PCT公开No.WO 04/071467描述的载体中。设计用于在Δ4去饱和酶或Δ5延伸酶的5’和3’末端导入NotI位点的PCR引物可以用于扩增基因。然后，可以用NotI消化得到的PCR产物，并且克隆到含有NotI位点的合适大豆表达载体中，所述位点的侧翼是种子特异性强启动子和转录终止子。进一步亚克隆到其它载体，如本文或PCT公开No.WO 04/071467或PCT公开No.WO 05/047479描述的那些载体中，应该产生适合用于在大豆中表达和共表达Δ4去饱和酶和Δ5延伸酶的载体。
实施例21
制备双鞭藻虫种CCMP389基因组DNA、RNA和cDNA
本实施例描述了从双鞭藻虫种CCMP389制备基因组DNA、RNA和cDNA，其购自Provasoli-Guillard国家海洋浮游植物培养中心(CCMP)(Bigelow海洋科学实验室，West Boothbay Harbor，缅因州)。
从双鞭藻虫种CCMP389制备RNA和基因组DNA
根据制造商的方案，用Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)从1升培养物分离总RNA和基因组DNA。具体地，将细胞沉淀物悬浮在0.75mL Trizol试剂中，与0.5mL 0.5mm的玻璃珠混合，在Biospec微珠搅拌器(Bartlesville，OK)中以最高设置匀浆3分钟。将混合物在Eppendorf离心机中以14,000rpm离心30秒，以除去碎屑和玻璃珠。用150μl 24:1氯仿:异戊醇(Invitrogen)萃取上清液。将上层水相用于RNA分离，下层有机相用于DNA分离。
为了分离RNA，将水相与0.375mL异丙醇混合，在室温下温育5分钟。通过以8,000rpm 4℃下离心5分钟，收集沉淀的RNA。将沉淀物用0.7mL 80％乙醇洗涤一次，在空气中干燥。以此方式，获得了360μg总RNA。
为了分离基因组DNA，将下层有机相与75μl乙醇混合，在室温下温育5分钟。然后在Eppendorf离心机中以5,000rpm将样品离心2分钟。用0.75mL 0.1M柠檬酸钠:10％乙醇将沉淀物洗涤两次。每次，将样品在洗涤溶液中室温下温育15分钟，然后4℃下以5,000rpm离心5分钟。将沉淀物在空气中干燥，重新溶解于300μl 8mM NaOH中。用1M HEPES将样品的pH调节到7.5。然后完全按照制造商的方案，用Qiagen PCR纯化试剂盒(Valencia，CA)进一步纯化基因组DNA。由此，分离了40μg基因组DNA。
从双鞭藻虫种CCMP389制备cDNA
用BD Bioscience Clontech(Palo Alto，CA)的Creator TM SMARTTMcDNA文库构建试剂盒制备双链cDNA。具体地，为了合成第一链cDNA，将1μl总RNA样品(1.2μg)单独与1μl SMARTTM IV寡核苷酸(SEQ ID NO：103)，1μl CDSIII/3’PCR引物(SEQ ID NO：104)和2μl水混合。将混合物加热到75℃持续5分钟，在冰上冷却5分钟。在样品中加入2μl5×第一链缓冲液，1μl 20mM DTT，1μl dNTP混合物(dATP，dCTP，dGTP和dTTP各10mM)和1μlPowerScript逆转录酶。将样品在42℃下温育1小时。
将第一链cDNA合成混合物用作扩增模板。具体地，反应混合物含有2μl上述第一链cDNA样品，80μl水，10μl 10X Advantage 2PCR缓冲液，2μl 50X dNTP混合物(dATP，dCTP，dGTP和dTTP各10mM)，2μl 5’-PCR引物(SEQ ID NO：105)，2μl CDSIII/3’-PCR引物(SEQ ID NO：104)和2μl 50X Advantage 2聚合酶混合物。用以下条件进行PCR扩增：95℃下1分钟，然后是20个循环的95℃下10秒和68℃下6分钟。完全按照制造商的方案，用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化扩增产物。用50μl水洗脱纯化的产物。
实施例22
从双鞭藻虫种CCMP389分离全长Δ9延伸酶
本实施例描述了通过使用来源于纤细眼虫(EgD9e；实施例3)和球等鞭金藻(IgD9e)Δ9延伸酶序列保守区的引物，从双鞭藻虫种CCMP389鉴定编码Δ9延伸酶的部分cDNA片段。然后，基于部分cDNA片段，分离基因的5’和3’末端。这使得能够组装重叠群(SEQID NO：17)，其延伸双鞭藻虫种CCMP389Δ9延伸酶翻译起始“ATG”密码子上游的51个碱基并且超过Δ9延伸酶终止密码子662bp。
鉴定编码来自双鞭藻虫种CCMP389的部分Δ9延伸酶的cDNA片段
分析双鞭藻虫种CCMP389中Δ9延伸酶的存在。适于分离双鞭藻虫种CCMP389 Δ9延伸酶的简并引物的设计是基于当用DNASTAR软件的MegAlignTM程序的Clustal W方法(缓慢，准确，Gonnet选项；Thompson等，Nucleic Acids Res.，22：4673-4680(1994))对两种延伸酶进行比对时，鉴定了EgD9e(SEQ ID NO：2)和IgD9e(SEQ ID NO：8)共有的一些保守氨基酸序列段(Clustal W比对在本文中没有示出，参照图4提供的EgD9e和IgD9e的Clustal V比对)。
基于该比对，设计了如下简并寡核苷酸组，用于扩增双鞭藻虫种CCMP389的Δ9延伸酶基因的一部分编码区，如表10所示。
                         表10
用于从双鞭藻虫种CCMP389扩增Δ9延伸酶基因的简并寡核苷酸
 
引物 核苷酸序列 氨基酸序列 SEQ ID NO：2(EgD9e)内的位置
EuEF3 YTNCARTTYTTYCAYCAYTT(SEQ ID NO：106) LQFFHHL(SEQ ID NO：107) 150-156
EuER3 TTRAAYTGDATDATYTGCAT(SEQ ID NO：108) MQIIQFN(SEQ ID NO：109) 210-216
[注：用于SEQ ID NOs：106和108的核酸简并密码如下：R＝A/G；Y＝C/T；D＝G/A/T；N＝A/C/T/G.]
反应混合物含有1μl 1:20稀释的cDNA，正向和反向引物(20μM)各5μl，14μl水和25μl TaKaRa ExTaq 2X预混合物(TaKaRaBio，Mountain View，CA)。用以下参数进行PCR扩增：94℃下1min，然后是35个循环的94℃下20sec，55℃下20sec，和72℃下1min，然后是72℃下5min的最终延伸循环。
PCR产物的琼脂糖凝胶分析显示获得了约200bp的片段。用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化片段，克隆到pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中并测序。当得到的序列(SEQ ID NO：13)翻译时，基于BLAST程序分析(基本局部比对检索工具；Altschul，S.F.，等，J.Mol.Biol.，215：403-410(1993)；实施例3)，与来自球等鞭金藻的已知Δ9延伸酶(IgD9e；SEQ ID NO：8)具有同源性。
分离双鞭藻虫种CCMP389Δ9延伸酶的5’-末端序列
在两轮独立的PCR扩增中，将双鞭藻虫种CCMP389的双链cDNA(实施例21)用作模板。在第一轮PCR扩增中，寡核苷酸引物由基因特异性寡核苷酸(即389Elo-5-1[SEQ ID NO：110])和来自BD-ClontechCreatorTM SMARTTMcDNA文库试剂盒的通用寡核苷酸5’-PCR引物(SEQ ID NO：105)组成。以50μl总体积进行PCR扩增，其中包含：1μl 1:10稀释的双鞭藻虫种CCMP389 cDNA作为模板，每种引物(20μM)各1μl，22μl水和25μl TaKaRa ExTaq 2X预混合物。扩增在以下条件下进行：94℃下90sec，然后是30个循环的94℃下30sec，55℃下30sec和72℃下1min，然后是72℃下7min的最终延伸。
第二轮PCR扩增采用1μl来自第一轮PCR反应的稀释产物(1:50)作为模板。引物由基因特异性寡核苷酸(即389Elo-5-2(SEQ ID NO：111))和寡核苷酸DNR CDS5′-2(SEQ ID NO：112)组成。按照上文的描述进行扩增。
在1％(w/v)琼脂糖中电泳第二轮PCR反应产物，显示为跨200-800bp的大小范围的分散条带。根据制造商的方案用Qiagen凝胶纯化试剂盒分离400bp-600bp之间的产物，克隆到pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中，并转化到大肠杆菌中。在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB琼脂中选择转化体。
对来自一个包含推定Δ9延伸酶cDNA的5’区的转化体的质粒DNA进行序列分析，发现406bp的片段(即5’-cDNA片段1；SEQ IDNO：14)。该片段延伸到基因的“ATG”翻译起始密码子附近，但起始密码子和前20-30个氨基酸都没有包括在SEQ ID NO：14中。
然后，设计额外的寡核苷酸(即389Elo-5-4(SEQ ID NO：113))，用于基于5’-cDNA片段1(SEQ ID NO：14)的序列通过PCR获得基因的完整5’末端。反应混合物和扩增条件与上文用于第二轮PCR的相同，只是用389Elo-5-4代替了引物389Elo-5-2。当通过琼脂糖凝胶电泳分析时，PCR产物再次显示为200-800bp的分散条带，分离大小为200-500bp的条带，按照上文的描述克隆和转化。
对来自一个包含推定Δ9延伸酶cDNA的5’区的转化体的质粒DNA进行序列分析，发现197bp的片段(5’-cDNA片段2；SEQ ID NO：15)。这包括cDNA的5’-末端和上游非翻译区的51bp。
分离双鞭藻虫种CCMP389Δ9延伸酶的3’-末端
采用cDNA作为模板，也通过PCR扩增推定的Δ9延伸酶的3’末端。方法是上文针对分离5’末端而描述的方法；但是，用于第一轮和第二轮PCR扩增的引物示于下表11，并且用10μM代替20μM。此外，72℃下的最终延伸循环从7分钟减少到5分钟。
                   表11
      用于3’ cDNA分离的寡核苷酸引物
 
PCR扩增 基因特异性寡核苷酸 通用寡核苷酸
第一轮 389Elo-3-1(SEQ ID NO：114) CDSIII/3’PCR引物(SEQ ID NO：104)
第二轮 389Elo-3-2(SEQ ID NO：115) CDSIII/3’PCR引物(SEQ ID NO：104)
*CDSIII/3’PCR引物在Clontech的CreatorTM SMARTTM cDNA文库构建试剂盒中提供
从第二轮PCR扩增产生约1kB DNA片段，用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化，克隆到pCR2.1-TOPO中，转化并测序。一些克隆的序列分析显示所述约1kB的DNA片段含有推定Δ9延伸酶cDNA的3’-区，包括聚腺苷酸尾。3’-区的920bp的组装重叠群序列示于SEQ ID NO：16。
从双鞭藻虫种CCMP389组装全长Δ9延伸酶序列
组装最初的部分cDNA片段(SEQ ID NO：13)、两个5’cDNA片段(SEQ ID NOs：14和15)和3’-cDNA片段(SEQ ID NO：16)，得到来自双鞭藻虫种CCMP389的Δ9延伸酶的完整序列，加上51bp的5’非翻译区和662bp的3’非翻译区(SEQ ID NO：17；1504bp)。编码区的长度是792bp，并且编码263个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO：5)。SEQID NO：4是双鞭藻虫种CCMP389Δ9延伸酶(本文中命名为E389D9e)的编码序列的核苷酸序列。
比较双鞭藻虫种CCMP389的Δ9延伸酶序列(E389D9e)与已知的Δ9延伸酶
通过进行BLAST相似性检索，确定SEQ ID NO：5(i.e.，E389D9e)与BLAST“nr”数据库中包含的序列(实施例3)的同一性。概括了与SEQ ID NO：5具有最高相似性的BLAST比较的结果是根据同一性百分比、相似性百分比和预期值来报道的。“同一性百分比”定义为在两种蛋白之间相同的氨基酸的百分比。“相似性百分比”定义为在两种蛋白之间相同或保守的氨基酸的百分比。“预期值”估计了匹配的统计学显著性，给匹配的数目指定特定得分，其是完全随机在该大小的数据库中进行检索而预期的。
因此，本文描述为SEQ ID NO：5的氨基酸片段与球等鞭金藻的Δ9延伸酶IgD9e(SEQ ID NO：8)具有38％同一性和56％相似性，预期值为2E-43。类似地，采用Clustal V方法，E389D9e与IgD9e具有33.1％同一性，E389D9e与EgD9e具有65.1％同一性(图2)。采用LASERGENE生物信息计算程序组的MegAlignTMv6.1程序通过Clustal V方法进行序列同一性百分比计算(Higgins，D.G.和Sharp，P.M.，Comput.Appl.Biosci.，5：151-153(1989)；Higgins等，Comput.Appl.Biosci.，8：189-191(1992))，其中采用逐对比对的默认参数(KTUPLE＝1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5，DIAGONALSSAVED＝5和GAP LENGTHPENALTY＝10)。
实施例23
解脂耶氏酵母表达载体pFBAIN-389Elo(包含双鞭藻虫种CCMP389Δ9延伸酶(E389D9e))在解脂耶氏酵母株Y2224中的构建和功能分析
本实施例描述了解脂耶氏酵母表达载体pFBAIN-389Elo(包含嵌合FBAINm::E389D9e::Pex20基因)的合成。随后确定当在解脂耶氏酵母株Y2224中表达时E389D9e的Δ9延伸酶活性。
构建解脂耶氏酵母表达载体pFBAIN-389Elo
用寡核苷酸389Elo-F和389Elo-R1(分别是SEQ ID NOs：116和117)作为引物，扩增E389D9e的全长cDNA(SEQ ID NO：4)。在50μ1总体积中单个进行以双鞭藻虫种CCMP389cDNA(实施例21)为模板的PCR反应，所述总体积中包含：20μM正向和反向引物各1μl，1μl cDNA，10μl 5X PCR缓冲液，1μl dNTP混合物(各10μM)，35μl水和1μl Phusion聚合酶(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)。98℃下扩增1min，然后是30个循环的98℃下10sec，55℃下10sec，和72℃下30sec，然后是72℃下5min的最终延伸。用NcoI和EarI消化PCR产物，得到约210bp的片段，其含有Δ9延伸酶cDNA的5’区。也用EarI和NotI消化，得到约600bp的片段，其含有cDNA的3’区。在1％(w/v)琼脂糖中凝胶电泳后，纯化NcoI/EarI和EarI/NotI消化的片段。
将NcoI/EarI和theEarI/NotI Δ9延伸酶消化的片段有方向地连接于NcoI/NotI消化的pFBAIN-MOD-1(SEQ ID NO：118)，使得E389D9e基因处于解脂耶氏酵母FBAINm启动子和PEX20-3’终止子区的控制下。具体地，连接反应包含：10μl2X连接缓冲液，1μl T4 DNA连接酶(Promega)，约210bp和约600bp的片段各4μl(各约300ng)，和1μl pFBAIN-MOD-1(约150ng)。将反应混合物在室温下温育2小时，并且用于转化大肠杆菌Top10感受态细胞(Invitrogen)。用Qiagen微量制备试剂盒回收来自转化体的质粒。通过限制性图谱鉴定正确的克隆，最终构建体命名为“pFBAIN-389Elo”。
由此，pFBAIN-389Elo(图15A；SEQ ID NO：119)含有以下成分：
      质粒pFBAIN-389Elo(SEQ ID NO：119)的成分
 
SEQ ID NO：119内的RE位点和核苷酸 片段和嵌合基因成分的说明
BglII-BsiWI(6040-301) FBAINm::E389D9e::Pex20，包含：·FBAINm：解脂耶氏酵母FBAINm启动子(PCT公开No.WO 2005/049805)·E389D9e：双鞭藻虫种CCMP389Δ9延伸酶(本文描述为SEQ ID NO：4)·Pex20：耶氏酵母Pex20基因的Pex20终止子序列(GenBank登录号AF054613)
PacI-BglII(4533-6040) 耶氏酵母Ura 3基因(GenBank登录号AJ306421)
(3123-4487) 耶氏酵母自主复制序列(ARS18；GenBank登录号A17608)
(2464-2864) f1起点
(1424-2284) 用于在大肠杆菌中进行选择的氨苄青霉素抗性基因(AmpR)
(474-1354) ColE1质粒复制起点
包含pFBAIN-389Elo的解脂耶氏酵母转化体的功能分析
按照一般方法中的描述，将pFBAIN-389Elo(包含E389D9e)和对照质粒pFBAIN-MOD-1的五个(5个)单个克隆转化到解脂耶氏酵母株Y2224(实施例7)中。将细胞铺板到缺乏尿嘧啶的MM板中，30℃下保持2-3天。然后，刮掉每个板的细胞，提取脂质，通过酯交换制备脂肪酸甲酯，随后用Hewlett-Packard 6890 GC分析。
GC分析显示在所有5个包含pFBAIN-389Elo的转化体中都产生EDA，而对照菌株中不产生EDA(表13)。脂肪酸鉴定为18:2(LA)和20:2(EDA)；每一种脂肪酸的组成以总脂肪酸的百分比表示。根据以下公式计算转化效率：([产物]/[产物+底物])*100，其中“产物”包括来源于其的途径中的中间产物和所有产物。
                            表13
工程化以超量表达双鞭藻虫种CCMP389Δ9延伸酶(E389D9e)的解脂 耶氏酵母株Y2224中的脂质组成
Figure A200680051550D01011
上面所示的结果证实本文描述为SEQ ID NOs：4和5的来自双鞭藻虫种CCMP389的克隆cDNA有效将LA去饱和为EDA，由此作为Δ9延伸酶而起作用。
实施例24
解脂耶氏酵母表达载体pZUFE389S的构建和功能分析，该载体包含为在解脂耶氏酵母中表达而进行了密码子优化的合成的Δ9延伸酶基因(E389D9eS)(来源于双鞭藻虫种CCMP389)
本实施例描述了解脂耶氏酵母载体pZUFE389的功能表达，该载体包含嵌合FBAIN::E389D9eS::Pex20基因，其中E389D9eS是来源于双鞭藻虫种CCMP389的合成的Δ9延伸酶并且为在解脂耶氏酵母中表达而进行了密码子优化。因此，该分析需要：(1)合成E389D9eS；(2)将pZUFE389S构建和转化到解脂耶氏酵母株Y2224中；和(3)分析包含pZUFE389S(表达E389D9eS)的解脂耶氏酵母株Y2224的转化生物体中的脂质谱。
合成E389D9eS
以类似于实施例5、实施例8和PCT公开No.WO 2004/101753中描述的方式，优化双鞭藻虫种CCMP389的Δ9延伸酶基因(E389D9e；SEQ ID NOs：4和5)的密码子选择。具体地，基于E389D9e的编码序列(SEQ ID NO：4)、根据耶氏酵母密码子选择模式(PCT公开No.WO2004/101753)、“ATG”翻译起始密码子附近的共有序列和RNA稳定性的一般规则(Guhaniyogi，G.和J.Brewer，Gene，265(1-2)：11-23(2001))设计密码子优化的Δ9延伸酶基因(命名为“E389D9eS”，SEQ ID NO：6)。除了修饰翻译起始位点，修饰了792bp编码区的128bp(包括终止密码子)(16.2％)，并且优化了113个密码子。GC含量从野生型基因(即E389D9e)中的45.7％增加到合成基因(即E389D9eS)中的50.1％。分别在翻译起始密码子附近和E389D9eS的终止密码子后掺入NcoI位点和NotI位点。图16显示了E389D9e和E389D9eS的核苷酸序列的比较。密码子优化的基因中的修饰都没有改变编码的蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。
由GenScript公司(Piscataway，NJ)合成设计的E389D9eS基因(SEQID NO：6)，并且克隆到pUC57(GenBank登录号Y14837)中，产生pE389S(SEQ ID NO：120)。
制备包含E389D9eS的构建体pZUFE389S。
通过用pE389S(SEQ ID NO：120)的Nco I/Not I片段代替pZUF17(图7C；SEQ ID NO：121)的Nco I/Not I片段，构建质粒pZUFE389S(图15B；SEQ ID NO：122)。该连接的产物是pZUFE389S，其由此含有以下成分：
                       表14
         质粒pZUFE389S(SEQ ID NO：122)的成分
 
SEQ ID NO：122内的RE位点和核苷酸 片段和嵌合基因成分的说明
EcoR I/BsiWI(6857-1112) FBAIN::E389D9eS::Pex20，包含：·FBAIN：解脂耶氏酵母FBAIN启动子(PCT公开No.WO 2005/049805)·E389D9eS：密码子优化的Δ9延伸酶(SEQID NO：6)，来源于双鞭藻虫种CCMP389·Pex20：耶氏酵母Pex20基因的Pex20终止子序列(GenBank登录号AF054613)
2148-1268 ColE1质粒复制起点
3078-2218 用于在大肠杆菌中进行选择的氨苄青霉素抗性基因(AmpR)
3977-5281 耶氏酵母自主复制序列(ARS18；GenBank登录号A17608)
6835-5324 耶氏酵母Ura3基因(GenBank登录号AJ306421)
包含pZUFE389S的解脂耶氏酵母转化体的功能分析
按照一般方法中的描述，将质粒pZUFE389S转化到菌株Y2224(来自野生型耶氏酵母株ATCC#20362的Ura3基因自主突变的FOA抗性突变体，实施例7)中。在MM板上选择转化体。30℃下生长2天后，挑选转化体，重新划线到新的MM板上。一旦生长，将这些菌株30℃下单个接种到3mL液体MM中，并且250rpm/min下振荡2天。通过离心收集细胞，提取脂质，通过酯交换制备脂肪酸甲酯，随后用Hewlett-Packard 6890 GC进行分析。
GC分析显示在所有12个转化体中产生占总脂质的约2.2％的C20:2(EDA)，其中在这12个菌株中C18:2转化为C20:2的平均转化效率确定为约12％(平均值；按照实施例23的描述计算)。
实施例25
构建用于表达纤细眼虫(EgD9e或EgD9eS)和/或双鞭藻虫种CCMP389(E389D9e或E389D9eS)Δ9延伸酶的替代大豆表达载体
本领域技术人员可以理解，上文的实施例是说明性的，而不是限制性的。例如，上文实施例10、11和13-15建立的用于表达EgD9e的任何大豆表达载体都可以用类似于但不限于本文描述的方法容易地修饰，用于替代地能够表达(或共表达)EgD9eS，E389D9e和/或E389D9eS。设计用于在Δ9延伸酶的5’和3’末端导入NotI位点的PCR引物可以用于扩增基因。然后可以用NotI消化得到的PCR产物，并且可以克隆到合适的大豆表达载体中，该载体含有NotI位点，该位点的侧翼是种子特异性强启动子和转录终止子。按照本文或PCT公开Nos.WO 2004/071467或WO 2005/047479(但不限于这些)的描述进一步亚克隆到其它载体中，将产生适用于在大豆中表达Δ9延伸酶的载体。
此外，除了本文描述的基因、启动子、终止子和基因盒，本领域技术人员可以理解，可以通过类似于但不限于本文针对EgD9e，EgD9eS，E389D9e和/或E389D9eS的表达所描述的方式合成其它启动子/基因/终止子盒。类似地，可能需要表达其它PUFA基因(如下文表17描述的那些)，用于与本发明的任何Δ9延伸酶共表达。
例如，PCT公开Nos.WO 2004/071467和WO 2004/071178描述了分离许多启动子和转录终止子序列，用于在大豆中进行胚特异性表达。此外，PCT公开Nos.WO 2004/071467、WO 2005/047479和WO 2006/012325描述了通过将各个启动子、基因和转录终止子以独特的组合连接在一起而合成多个启动子/基因/终止子盒的组合。通常，用侧翼于合适的启动子(例如列于但不限于表15的那些)和转录终止子(例如列于但不限于表16的那些)的NotI位点克隆需要的基因。可以采用PCR扩增，用设计用于在基因的5’和3’导入NotI位点的寡核苷酸进行PCR扩增，将NotI位点加入感兴趣的基因，例如但不限于表17列出的那些。然后用NotI消化得到的PCR产物，并且克隆到合适的启动子/NotI/终止子盒。
此外，PCT公开Nos.WO 2004/071467，WO 2005/047479和WO2006/012325描述了将各个基因盒以独特的组合(以及合适的选择标记盒)进一步连接在一起，以便获得需要的表型表达。尽管这主要是用不同的限制酶位点进行的，本领域技术人员可以理解，可以利用许多技术实现需要的启动子/基因/转录终止子的组合。以此方式，可以实现胚特异性启动子/基因/转录终止子盒的任何组合。本领域技术人员也可以理解，这些盒可以位于单独的DNA片段或多个片段上，其中基因的共表达是多个DNA片段共转化的结果。
                       表15
                种子特异性启动子
 
启动子 生物 启动子参考文献
β-大豆球蛋白α’-亚基 大豆 Beachy等，EMBO J.，4：3047-3053(1985)
Kunitz胰蛋白酶抑制剂 大豆 Jofuku等，Plant Cell，1：1079-1093(1989)
膜联蛋白 大豆 WO 2004/071467
大豆球蛋白Gyl 大豆 WO 2004/071467
白蛋白2S 大豆 美国专利No.6,177,613
豆球蛋白A1 豌豆 Rerie等，Mol.Gen.Genet.，225：148-157(1991)
β-大豆球蛋白β-亚基 大豆 WO 2004/071467
BD30(也称作P34) 大豆 WO 2004/071467
豆球蛋白A2 豌豆 Rerie等，Mol.Gen.Genet.，225：148-157(1991)
                     表16
                  转录终止子
 
转录终止子 生物 Reference
菜豆蛋白3’ 菜豆 WO 2004/071467
Kunitz胰蛋白酶抑制剂3’ 大豆 WO 2004/071467
BD30(也称作P34)3’ 大豆 WO 2004/071467
豆球蛋白A23’ 豌豆 WO 2004/071467
白蛋白2S3’ 大豆 WO 2004/071467
                  表17
          PUFA生物合成途径基因
 
基因 生物 参考文献
Δ6去饱和酶 异丝水霉 WO 2002/081668
Δ6去饱和酶 高山被孢霉 美国专利No.5,968,809
延伸酶 高山被孢霉 WO 2000/12720；美国专利No.6,403,349
Δ5去饱和酶 高山被孢霉 美国专利No.6,075,183
Δ5去饱和酶 异丝水霉 WO 2002/081668
Δ15去饱和酶 串珠镰孢 WO 2005/047479
Δ17去饱和酶 异丝水霉 WO 2002/081668
延伸酶 金黄色破囊壶菌 WO 2002/08401；美国专利No.6,677,145
延伸酶 巴夫藻 Pereira等，Biochem.J.，384：357-366(2004)
Δ4去饱和酶 裂殖壶菌 WO 2002/090493
Δ9延伸酶 球等鞭金藻 WO 2002/077213
Δ8去饱和酶 纤细眼虫 WO 2000/34439；美国专利No.6,825,017；WO 2004/057001；WO 2006/012325
 
Δ8去饱和酶 卡氏棘阿米巴 Sayanova等，FEBS Lett.，580：1946-1952(2006)   
Δ8去饱和酶 盐生巴夫藻 WO 2005/103253
Δ8去饱和酶 Pavlova lutheri 美国临时申请No.60/795810      
Δ8去饱和酶 TetruetreptiapomquetensisCCMP1491      美国临时申请No.60/853563      
Δ8去饱和酶 双鞭藻虫种CCMP389    美国临时申请No.60/853563      
Δ8去饱和酶 Eutreptiellacf_gymnasticaCCMP1594      美国临时申请No.60/853563      
实施例26
转化大豆体细胞胚培养物
培养条件：
可以在26℃下150rpm的旋转振荡器上的35mL液体培养基SB196(参见下文的配方)中维持大豆胚发生悬浮培养物(cv.Jack)，其中采用60-85μE/m2/s的光密度，16:8h日/夜的光周期。每7天-2周，通过将大约35mg组织接种到35mL新鲜的液体SB196中，对培养物进行传代培养(优选的传代培养间隔是每隔7天)。
可以通过粒子枪轰击方法(Klein等，Nature(London)，327：70-73(1987)；美国专利No.4,945,050)，用前面描述的质粒和DNA转化大豆胚发生悬浮培养物。可以将DuPont BiolisticTM PDS1000/HE仪器(氦改进型)用于所有转化。
大豆胚发生悬浮培养起始：
大豆培养每个月起始两次，每次起始之间采用5-7天的间隔。挑选具有来自种植后45-55天可获得的大豆植物的不成熟种子的豆荚，从它们的壳中取出，放置在灭菌的洋红色盒子中。通过在含有1滴象牙皂(即95mL高压灭菌蒸馏水+5mL Clorox和1滴皂，充分混合)的5％Clorox溶液中振荡15分钟，给大豆种子灭菌。用两个1升的瓶子中的灭菌蒸馏水冲洗种子，将小于4mm的种子放置在单个显微镜载玻片上。切除种子的小末端，将子叶挤出种皮。将子叶转移到含有SB1培养基(每板25-30个子叶)的板中。用纤维胶带包裹板，储存8周。此后，切下次生胚，放置在SB196液体培养基中7天。
制备用于轰击的DNA：
完整质粒或含有感兴趣的基因和选择标记基因的DNA质粒片段可以用于轰击。可以通过消化的质粒的凝胶分离获得来自质粒，如pKR274(ATCC保藏号PTA-4988)，pKR685(ATCC保藏号PTA-6047)或pKR681(ATCC保藏号PTA-6046)和/或其它表达质粒的片段。在每种情况下，可以将100μg质粒DNA用于下文描述的0.5mL特异性酶混合中。可以用NEBuffer 4(20mM Tris-醋酸，10mM醋酸镁，50mM醋酸钾，1mM二硫苏糖醇，pH7.9)中的AscI(100个单位)、100μg/mLBSA和5mM β-巯基乙醇在37℃下将质粒消化1.5小时。可以通过在1％
Figure A200680051550D0108154547QIETU
GTG琼脂糖(BioWhitaker Molecular Applications)上凝胶电泳，分离得到的DNA片段，可以从琼脂糖凝胶上切下含PUFA生物合成基因的DNA片段。可以按照制造商的方案，用
Figure A200680051550D0108154638QIETU
消化酶从琼脂糖纯化DNA。或者，可以使用完整质粒或完整质粒与片段的组合。
可以将含有3mg金粒子(3mg金)的50μL无菌蒸馏水等分物加入5μL 1μg/μL DNA溶液(按照上文的描述制备的质粒或DNA片段)，50μL 2.5M CaCl2和20μL of 0.1M亚精胺。以涡旋振荡器的水平3将混合物振荡3分钟，在台式离心机中离心10秒。用400μL100％乙醇洗涤后，通过在40μL 100％乙醇中超声处理，悬浮沉淀物。将5μL DNA悬浮液分散到Biolistic PDS1000/HE仪器盘的每个飞行盘上。每5μL等分物含有用于每次轰击(如每盘)的大约0.375mg金。
组织制备和用DNA轰击：
将大约150-200mg7日龄胚悬浮培养物置于空的、无菌60 x 15mm培养皿中，用塑料筛网覆盖培养皿。用设置为1100PSI的膜爆裂压和抽真空到27-28英寸汞柱的真空的室，以每板1-2次射击，轰击组织。将组织放置在距离保留/终止筛大约3.5英寸。
选择转化的胚
用潮霉素(当潮霉素B磷酸转移酶(HPT)基因用作选择标记时)或氯磺隆(Chlorsulfuron)(即，当乙酰乳酸合酶(ALS)基因用作选择标记时)选择转化的胚。
潮霉素(HPT)选择：
轰击后，将组织放置在新的SB196培养基中，按照上文的描述培养。轰击后6天，将SB196用含有30mg/L潮霉素选择剂的SB196交换。选择培养基每周更新。选择后4-6周，可以观察到从未转化的坏死胚发生簇中长出绿色的转化组织。取出分离的绿色组织，接种到多孔板中，产生新的、克隆繁殖的、转化的胚发生悬浮培养物。
氯磺隆(ALS)选择：
轰击后，在含有新的SB196培养基的两个烧瓶中分装组织，按照上文的描述培养。轰击后6-7天，将SB196用含有100ng/L氯磺隆选择剂的SB196交换。选择培养基每周更新。选择后4-6周，可以观察到从未转化的坏死胚发生簇中长出绿色的转化组织。取出分离的绿色组织，接种到含有SB196的多孔板中，产生新的、克隆繁殖的、转化的胚发生悬浮培养物。
将大豆体细胞胚再生为植物：
为了从胚发生悬浮培养物获得完整植物，需要进行组织再生。
胚成熟：
在26℃下，在SB196中，在冷白色荧光(Phillips冷白色EconowattF40/CW/RS/EW)和氩(Phillips F40 Agro)灯泡(40瓦)下，以16：8小时光周期，光强度90-120μE/m2s，按照上文的描述在多孔板中将来自生产转化的转化胚发生簇培养4-6周(模型系统是1-3周)。此后，将胚簇转移到固体琼脂培养基SB166中持续1-2周(模型系统是1周)，然后在SB103培养基中传代培养2-4周，成为成熟的胚。在板上的SB103中成熟后，从簇中取出单个的胚，干燥，筛选，用于按照上文的描述改变它们的脂肪酸组成。当需要时，按照下文的描述从一些事件获得植物。
或者，在一些模型系统实验中，用改进的程序使胚在大豆组织分化和成熟液体培养基(SHaM液体培养基；Schmidt等，Cell Biology和Morphogenesis 24：393(2005))中成熟。简言之，按照上文在SB196中选择4周后，将胚簇转移到250mL Erlenmeyer烧瓶中的35mL SB228(SHaM液体培养基)中。26℃下将组织保持在130rpm的旋转振荡器上的SHaM液体培养基中，采用冷白色荧光，16:8hr光/暗光周期，光强度是60-85μE/m2/s，持续2-3周，使胚成熟。在SHaM液体培养基中生长2-3周的胚在大小和脂肪酸含量方面与在SB166/SB103上培养5-8周的胚相同。
在SHaM液体培养基中成熟后，从簇中取出单个的胚，干燥，筛选，用于按照上文的描述改变它们的脂肪酸组成。当需要时，按照下文的描述从一些事件获得植物。
胚干燥和萌芽
通过放置在空的小培养皿(35 x 10mm)中大约4-7天，可以干燥成熟的单个的胚。用纤维胶带密封平板(产生小的湿室)。可以将干燥的胚种植在SB71-4培养基中，其中使它们在上文描述的相同培养条件下萌芽。从萌芽培养基上取出萌芽的幼苗，用水彻底冲洗，然后种植在透明塑料圆顶覆盖的24室包装盘中的Redi土壤中。两周后，取下圆顶，使植物强化一周。如果幼苗看起来是强化的，则将它们移植到10英寸罐的Redi土壤中，每罐最多3个幼苗。10-16周后，可以收获成熟的种子，切碎，按照上文进行脂肪酸分析。
培养基配方：
        SB 196   FN滴盐液体增殖培养基(每升)
MS FeEDTA-100x储液                               110mL
MS硫酸盐-100x储液2                               10mL
FN低盐卤化物-100x储液3                           10mL
FN低盐P，B，Mo-100x储液4                         10mL
维生素B5(1mL/L)                                  1.0mL
2，4-D(10mg/L终浓度)                             1.0mL
KNO3                                             2.83gm
(NH4)2SO4                                         0.463gm
天冬酰胺                                         1.0gm
蔗糖(1％)                            10gm
pH5.8
FN低盐储液
储液编号            1000mL           500mL
1-MS Fe EDTA 100x储液
Na2EDTA*            3.724g           1.862g
FeSO4  7H2O         2.784g           1.392g
*首先添加，搅拌下溶解在暗瓶中
2 MS硫酸盐100x储液
MgSO4-7H2O                    37.0g            18.5g
MnSO4-H2O                     1.69g            0.845g
ZnSO4-7H2O                    0.86g            0.43g
CuSO4-5H2O                    0.0025g          0.00125g
3 FN低盐卤化物100x储液
CaCl2-2H2O                    30.0g            15.0g
KI                            0.083g           0.0715g
CoCl2-6H2O                    0.0025g          0.00125g
4 FN低盐P，B，Mo 100x储液
KH2PO4                        18.5g            9.25g
H3BO3                         0.62g            0.31g
Na2MoO4-2H2O                  0.025g           0.0125g
SB1固体培养基(每升)：1包MS盐(Gibco/BRL-目录号)，1mL维生素B51000X储液，31.5g蔗糖，2mL2，4-D(20mg/L终浓度)，pH5.7，8g TC琼脂
SB166固体培养基(每升)：1包MS盐(Gibco/BRL-目录号)，1mL维生素B51000X储液，60g麦芽糖，750mg MgCl2六水合物，5g活性炭，pH5.7，2g脱乙酰吉兰糖胶
SB103固体培养基(每升)：1包MS盐(Gibco/BRL-目录号)，1mL维生素B5 1000X储液，60g麦芽糖，750mg MgCl2六水合物，pH5.7，2g脱乙酰吉兰糖胶
SB71-4固体培养基(每升)：1瓶Gamborg的B5盐w/蔗糖(Gibco/BRL目录号21153-036)，pH5.7，5g TC琼脂
2，4-D储液：从Phytotech目录号D295获得预制品-浓度1mg/mL
维生素B5储液(每100mL)：10g肌醇，100mg烟酸，100mg吡哆醇HCl，1g硫胺。-20℃下储存等分物；如果溶液不能足够快地溶解，则通过热搅拌板施加低水平的热。
氯磺隆储液：1mg/mL，溶于0.01N氢氧化铵
为了诱导体细胞胚，可以将从大豆品种A2872的表面灭菌的未成熟种子解剖出的3-5mm长的子叶在26℃下在合适的琼脂培养基上在光或暗条件下培养6-10周。然后，切下产生次生胚的体细胞胚，放置在合适的液体培养基中。重复选择作为早期球形阶段胚而增殖的体细胞胚的簇后，按照下文的描述保持悬浮液。
可以26℃下在150rpm的旋转振荡器上的35mL液体培养基中保持大豆胚发生悬浮培养物，其中采用16:8h日/夜方案的荧光。通过将大约35mg组织接种在35mL液体培养基中，每两周对培养物进行一次传代培养。
然后可以通过粒子枪轰击方法(Klein等，Nature(London)，327：70-73，美国专利No.4,945,050)，转化大豆胚发生悬浮培养物。可以将DuPont BiolisticTMPDS1000/HE仪器(氦改进型)用于这些转化。
可以用于促进大豆转化的选择标记基因是包含花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell等，Nature，313：810-812(1985))、质粒pJR225(来自大肠杆菌；Gritz等，Gene，25：179-188(1983))的潮霉素B磷酸转移酶基因和来自根癌土壤杆菌的Ti质粒的T-DNA的胭脂碱合酶基因的3’区的重组DNA构建体。包含菜豆蛋白5′区、编码本发明的多肽的片段和菜豆蛋白3′区的种子表达盒可以作为限制性片段分离。然后可以将该片段插入携带标记基因的载体的独特限制位点。
在50μL 60mg/mL 1μm金粒子悬浮液中(按顺序)加入以下成分：5μL DNA(1μg/μL)，20μL亚精胺(0.1M)，和50μL CaCl2(2.5M)。然后将粒子制剂搅拌3分钟，在微量离心机中离心10秒，除去上清液。然后在400μL 70％乙醇中将DNA包被的粒子洗涤一次，重新悬浮于40μL无水乙醇中。可以将DNA/粒子悬浮液超声处理3次，每次1秒。然后将5μL DNA包被的金粒子加入每个大载体盘。
将大约300-400mg两周龄的悬浮培养物置于空的60x15mm培养皿中，用移液管从组织除去残留液体。对于每个转化实验，通常轰击大约5-10个平板的组织。膜爆裂压设置为1100psi，室抽真空到28英寸汞柱的真空。将组织放置在距离保留筛大约3.5英寸并轰击3次。轰击后，可以将组织分成两半，放置到液体中，按照上文培养。
轰击后5-7天，可以用新鲜培养基更换液体培养基，并且在轰击后11-12天，用含有50mg/mL潮霉素的新培养基更换。可以每周更换该选择培养基。选择后7-8周，可以观察到从未转化的坏死胚发生簇中长出绿色的转化组织。取出分离的绿色组织，接种到各个烧瓶中，产生新的、克隆繁殖的、转化的胚发生悬浮培养物。每个新的细胞系作为独立转化事件处理。然后可以传代培养并且作为未成熟胚的簇保持这些悬浮液，通过单个体细胞胚的成熟和萌芽，再生为完整植物。
Figure A200680051550E01141
Figure A200680051550E01151
Figure A200680051550E01161
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Claims (21)

1.选自下组的分离的多核苷酸：
(a)分离的核酸序列，包含编码具有Δ9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比对方法，所述多肽与SEQ ID NO：2或SEQID NO：5所示氨基酸序列相比，具有至少70％氨基酸同一性；
(b)分离的核酸序列，包含编码具有Δ9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于BLASTN比对方法，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示核苷酸序列相比，具有至少70％序列同一性；
(c)分离的核酸序列，包含编码具有Δ9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在以下严格杂交条件下与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示核苷酸序列杂交：0.1X SSC，0.1％ SDS，65℃，并且用2X SSC，0.1％ SDS洗涤，随后用0.1X SSC，0.1％ SDS洗涤；或
(d)上述(a)、(b)或(c)的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和所述核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成，并且是100％互补的。
2.权利要求1的多核苷酸，其中所述核苷酸序列包含SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6。
3.权利要求2的多核苷酸，选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6。
4.Δ9延伸酶多肽，其中所述多肽的氨基酸序列选自下组：
(a)SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；和
(b)通过至少一个保守氨基酸取代而与(a)的氨基酸序列不同的氨基酸序列。
5.分离的转化的宿主细胞，包含权利要求1的分离的核酸序列。
6.权利要求5的转化的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自：藻类、细菌、酵母、卵菌和真菌。
7.权利要求6的转化的宿主细胞，其中所述宿主细胞是选自下组的真菌：破囊壶菌种、裂殖壶菌种和被孢霉种。
8.权利要求6的转化的宿主细胞，其中所述酵母是含油酵母。
9.权利要求8的转化的宿主细胞，其中所述含油酵母选自：耶氏酵母属，假丝酵母属，红酵母属，红冬孢属，隐球酵母属，丝孢酵母属和油脂酵母属。
10.权利要求9的转化的宿主细胞，其中所述酵母是耶氏酵母种。
11.权利要求10的转化的酵母，其中所述耶氏酵母种选自：解脂耶氏酵母ATCC #20362、解脂耶氏酵母ATCC #8862、解脂耶氏酵母ATCC #18944、解脂耶氏酵母ATCC #76982和解脂耶氏酵母LGAMS(7)1。
12.生产二十碳二烯酸的方法，包括：
a)提供分离的转化的酵母宿主细胞，其包含：
i)分离的多核苷酸序列，编码具有Δ9延伸酶活性的多肽，所述多核苷酸序列选自：
(1)分离的核酸序列，包含编码具有Δ9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比对方法，所述多肽与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5所示氨基酸序列相比，具有至少70％氨基酸同一性；
(2)分离的核酸序列，包含编码具有Δ9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在以下严格杂交条件下与SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示核苷酸序列杂交：0.1X SSC，0.1％ SDS，65℃，并且用2X SSC，0.1％ SDS洗涤，随后用0.1X SSC，0.1％ SDS洗涤；和
(ii)亚油酸的来源；
b)在表达编码Δ9延伸酶多肽的核酸序列并且将亚油酸转化为二十碳二烯酸的条件下使步骤(a)的酵母宿主细胞生长；以及
c)任选回收步骤(b)的二十碳二烯酸。
13.生产二十碳三烯酸的方法，包括：
a)提供分离的转化的酵母宿主细胞，其包含：
i)分离的多核苷酸序列，编码具有Δ9延伸酶活性的多肽，所述多核苷酸序列选自：
(1)分离的核酸序列，包含编码具有Δ9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比对方法，所述多肽与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5所示氨基酸序列相比，具有至少70％氨基酸同一性；
(2)分离的核酸序列，包含编码具有Δ9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在以下严格杂交条件下与SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示核苷酸序列杂交：0.1X SSC，0.1％ SDS，65℃，并且用2X SSC，0.1％ SDS洗涤，随后用0.1X SSC，0.1％ SDS洗涤；和
(ii)α-亚麻酸的来源；
b)在表达编码Δ9延伸酶多肽的核酸序列并且将α-亚麻酸转化为二十碳三烯酸的条件下使步骤(a)的宿主细胞生长；以及
c)任选回收步骤(b)的二十碳三烯酸。
14.权利要求12或13的方法，其中所述编码Δ9延伸酶多肽的分离的多核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的多肽。
15.权利要求14的方法，其中所述编码Δ9延伸酶多肽的分离的多核苷酸序列选自：
a)SEQ ID NO：5，其中至少113个密码子为在耶氏酵母中表达而进行了密码子优化；和
b)SEQ ID NO：2，其中至少106个密码子为在耶氏酵母中表达而进行了密码子优化。
16.由权利要求6的宿主细胞生产的微生物油。
17.包含有效量的权利要求16的微生物油的食品。
18.权利要求17的食品，选自食物类似物、肉类产品、谷物产品、烘烤食品、快餐食品和乳制品。
19.一种产品，选自包含有效量的权利要求16的微生物油的医学食品、营养补充物、婴儿配方和药物。
20.包含有效量的权利要求16的微生物油的动物饲料。
21.权利要求20的动物饲料，其中所述动物饲料选自：宠物饲料、反刍动物饲料、禽类饲料和水产养殖饲料。
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