CN101410522A - 繁殖去除构筑体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及繁殖发育的调控，尤其涉及被子植物和裸子植物中繁殖组织的基因去除。本文揭示繁殖优选的启动子、调控元件和细胞毒素核苷酸序列以及基因去除的构筑体与方法。

Description

繁殖去除构筑体
相关申请案
本申请案主张2004年9月22日申请的标题为REPRODUCTIVE ABLATIONCONSTRUCTS的美国申请案第10/946,622号的优先权，且所述专利以全文引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及繁殖发育的调控。具体说来，本发明涉及被子植物和裸子植物中繁殖组织的基因去除。本发明提供繁殖优选启动子(Reproductive-preferred promoter)、调控元件和细胞毒素核苷酸序列。本发明中还包括基因去除的构筑体和方法。
背景技术
随着植物基因工程技术的发展，基因修饰作物的生态学含义关系极其重大，尤其当不存在固有屏障通过有性繁殖散布转基因时更是这样。尤其，在可通过杂交将转基因从转基因植物散布到杂草物种或作物本身以杂草形式存在的情况下已出现问题。Bergelson等人，Nature 395：25(1998)。一种解决所述问题的方式是通过完全去除繁殖结构以基因工程设计使植物不育。
近来，使用去除系统控制植物的繁殖发育已引起广泛关注。已通过基因去除在多种植物中达成繁殖控制，所述基因去除使繁殖优选启动子与细胞毒素基因连接以去除繁殖细胞。举例来说，已使用一种来自解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquifacien)的胞外核糖核酸酶barmase诱导雄性不育。Paddon等人，J.Bacteriol.171：1185-1187(1989)。欧洲专利第344,029号描述在绒毡层特异性启动子控制下通过用DNA编码的barnase转化植物产生雄性不育植物的系统。用所述启动子-基因构筑体转化烟草和油菜植物以防止所述植物产生可育花粉。Mariani等人，Nature 347：737-741(1990)。表达APETALA3(AP3)启动子和白喉毒素A链(DTA)基因的融合构筑体的转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)植物的花缺乏花瓣和雄蕊，表明转基因表达已去除花瓣和雄蕊细胞。在LEAFY启动子控制下表达DTA基因的转基因拟南芥不开花。经驱动barnase基因的烟草柱头特异性启动子转化的烟草植物缺乏柱头分泌区且为雌性不育。
尽管已有效实施基因去除，但一般用于去除的启动子并不适于组织特异性表达。因此，漏出基因的表达可显著降低并破坏植物的营养生长。视植物的种类而定，去除可使营养生长降低80％。Strauss，S.H.和Meilan，R.TGERC Annual Report(1998)。就对林业经济有益的基因去除来说，破坏营养组织的量必须最小化至标称水平。
尽管多项专利和专利申请公开案中公开使用多种启动子和细胞毒素基因进行基因去除，但极少有公开内容解决去除对植物营养生长和发育的影响。已将在花分生组织中强烈表达而在叶发育时微弱表达的拟南芥LFY启动子用于制造已去除花的植物。Nilsson等人，Plant J.15：799-804(1998)。然而，经LFY转化的极少数植物已去除花而未危及营养发育。由于制造许多转基因树、使其生长并进行测试以鉴别具有不育性和正常营养生长的少数树将耗费数年时间，所以对树种使用类似繁殖去除方法将是不切实际的。
基因去除繁殖器官需要启动子活性与去除基因毒性之间的微妙平衡。尽管barnase基因广泛用于植物的去除，但barnase诱导的毒性常常会对植物生长和发育造成有害影响。因此，可能需要降低barnase的毒性，从而在对植物营养生长不造成有害和不可恢复的损害的情况下发生繁殖去除。
制造具有降低的毒性的突变体barnase的同时，也可能需要使植物营养组织中繁殖去除构筑体的漏出表达减至最少。通过使植物中繁殖去除构筑体的漏出或异常表达减至最少，所述植物归因于减弱的去除而可能较好地耐受营养组织中突变体barnase基因的表达，此视barnase突变体中启动子活性和RNA酶活性而定。
因此，需要在植物营养组织中具有降低的barnase诱导毒性和最小漏出表达的繁殖去除系统。
发明内容
本发明提供一种选自由SEQ ID NO：1-8和13-17组成的群组的经分离聚核苷酸，以及包含SEQ ID NO：18-27中任一者中所述的序列的质粒。
本发明还提供一种质粒，其包含图1(即，SEQ ID NO：18)、图2(即，SEQ ID NO：19)、图3(即，SEQ ID NO：20)、图4(即，SEQ ID NO：21)、图5(即，SEQ ID NO：22)、图6(即，SEQ ID NO：23)、图7(即，SEQ ID NO：24)、图8(即，SEQ ID NO：25)、图9(即，SEQ ID NO：26)或图19(即，SEQ ID NO：27)中任一者中所述的序列。
还提供一种经分离的聚核苷酸，其使得植物细胞中的繁殖优选基因能够表达，其中所述聚核苷酸包含SEQ ID NO：1、2、3、4或16中任一者所述的序列。
在一实施例中，所述聚核苷酸使植物细胞中雄性优选的基因能够表达。
还提供一种启动子，其包含SEQ ID NO：1、2、3、4或16中任一者所述的序列。
在一实施例中，SEQ ID NO：1-8的聚核苷酸在成熟前雄性(pre-male)繁殖结构或成熟前雌性繁殖结构中表达或具活性。
还提供一种经分离的聚核苷酸，其与SEQ ID NO：1、2、3、4或16中任一者的序列具有大于或等于99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％或60％的序列同一性。
在另一实施例中，提供一种聚核苷酸，其具有选自由以下序列组成的群组的序列：(i)与SEQ ID NO：1-8和16-17中任一者的聚核苷酸互补的序列；(ii)作为SEQ ID NO：1-8和16-17中任一者的聚核苷酸的反向序列的序列；和(iii)作为SEQ ID NO：1-8和16-17中任一者的聚核苷酸的反向补体的序列。
还提供一种经分离的聚核苷酸，其与根据权利要求1所述的聚核苷酸在严格条件下杂交，其中所述经分离的聚核苷酸在其全长序列范围内与SEQ ID NO：1-26中任一者的聚核苷酸杂交。
还提供一种经分离的聚核苷酸，其包含SEQ ID NO：17中所述的序列。
在一实施例中，提供一种具有SEQ ID NO：1-4和16中任一者的序列的聚核苷酸，其能够实现(i)与核酸分子结合或(ii)调控双子叶植物中可操作地连接的基因的表达的至少一者。
在另一实施例中，提供一种具有SEQ ID NO：1-4和16中任一者的序列的聚核苷酸，其能够实现(i)与核酸分子结合或(ii)调控裸子植物中可操作地连接的基因的表达的至少一者。
在一实施例中，提供一种具有SEQ ID NO：1-4和16中任一者的序列的聚核苷酸，其能够上调或下调植物中可操作地连接的基因的表达。
在本发明的一方面中，提供一种构筑体，其包含可操作地连接到所需核酸的选自SEQID NO：1、2、3、4或16中任一者的经分离聚核苷酸和其功能性变异体，其中所述启动子调控经所述构筑体转化的植物细胞中所述所需核酸的表达。在一实施例中，聚核苷酸上调或下调所述所需核酸的表达。在另一实施例中，所需核酸编码能够破坏植物繁殖发育的表达产物。
本发明提供一种经本文所公开的任何构筑体转化的植物。在一实施例中，所述经转化植物的表型表达与未经所述构筑体转化的相同种类植物相比的繁殖发育差异。在一实施例中，繁殖发育差异出现在雄性繁殖结构中。在另一实施例中，繁殖发育差异出现在花药、花丝、绒毡层、花粉、小孢子叶或雄球花中的任一者中。在替代性实施例中，繁殖发育差异出现在雌性繁殖结构中。在这一情况下，在一实施例中，繁殖发育的差异出现在柱头、花柱、子房、大孢子、胚珠中的任一者中。在又一实施例中，繁殖发育差异出现在成熟前雄性繁殖结构或成熟前雌性繁殖结构中。
一方面，所需核酸可产生RNA转录本，在一实施例中，其可包含植物细胞内源基因的反义序列。在一实施例中，RNA转录本诱导在植物细胞中正常表达的基因的RNA干预。
还提供一种包含构筑体的植物细胞，所述构筑体包含(i)具有SEQ ID NO：1、2、3、4或16中任一者的序列的聚核苷酸或其功能性变异体；和(ii)所需核酸；其中所述聚核苷酸可操作地连接到所述所需核酸。还提供一种包含所述植物细胞的转基因植物。
一方面，本发明提供一种用于制造转基因植物的方法，其包含(a)用构筑体转化植物细胞，所述构筑体包含(i)至少一种具有SEQ ID NO：1、2、3、4或16中任一者的序列的聚核苷酸或其功能性变异体，和(ii)所需核酸，其中所述聚核苷酸调控所述所需序列的活性；(b)在促进植物生长的条件下培养所述经转化植物细胞，其中所述植物为显示出与不含有所述构筑体的相同种类植物不同的表型的转基因植物。
在一实施例中，与不含有构筑体的相同种类植物相比，经转化植物的表型的特征在于繁殖发育的差异。在另一实施例中，与不含有构筑体的相同种类植物相比，经转化植物的表型的特征在于雄性繁殖发育的差异。或者，与不含有构筑体的相同种类植物相比，经转化植物的表型的特征在于雌性繁殖发育的差异。在另一实施例中，与不含有构筑体的相同种类植物相比，经转化植物的表型的特征在于成熟前雄性繁殖结构或成熟前雌性繁殖结构的差异。
另一方面，提供一种赋予植物繁殖不育性的方法，其包含(a)将构筑体引入植物细胞，所述构筑体包含(i)具有SEQ ID NO：1、2、3、4或16中任一者的序列或其功能性变异体的启动子，和(ii)编码能够去除繁殖发育的基因的核酸，其中所述核酸相对于所述启动子有义，且其中所述启动子调控所述基因的表达；(b)在促进植物生长的条件下培养所述经转化植物细胞，其中所述植物为显示出与不含有所述构筑体的相同种类植物不同的表型的转基因植物；和(c)选择繁殖不育的植物。
另一方面为一种去除植物中的繁殖结构的方法，其包含(a)将构筑体引入植物细胞，所述构筑体包含(i)具有SEQ ID NO：1、2、3、4或16中任一者的序列或其功能性变异体的启动子，和(ii)编码能够去除繁殖发育的基因的核酸，其中所述启动子调控所述基因的表达；(b)在促进植物生长的条件下培养所述经转化植物细胞，其中所述植物为显示出与不含有所述构筑体的相同种类植物不同的表型的转基因植物；和(c)选择具有已去除的繁殖结构的植物。在一实施例中，所述植物是选自被子植物或裸子植物种类。
还提供一种变化花粉育性的方法，其包含(a)将构筑体引入木本植物的植物细胞，所述构筑体包含(i)具有SEQ ID NO：1、2、3、4或16中任一者的序列或其功能性变异体的启动子，和(ii)和所需核酸，其中所述启动子调控所述所需核酸的表达；(b)在促进植物生长的条件下培养所述经转化植物细胞；和(c)获得具有变化的花粉育性的植物。在一实施例中，木本植物是选自桉树属或松属。
本文还提供一种选自SEQ ID NO：5-8中任一者的经分离聚核苷酸和其变异体。在一实施例中，这些聚核苷酸中的任一者编码突变体barnase酶。在一实施例中，所述聚核苷酸编码相比野生型barnase酶具有减弱的活性的突变体barnase酶。在一实施例中，变异体与SEQ ID NO：5-8中任一者的序列具有大于或等于99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％或60％的序列同一性。
还提供一种经分离的聚核苷酸，其具有选自以下序列的序列：(i)与SEQ ID NO：5-8中任一者的聚核苷酸互补的序列；(ii)作为SEQ ID NO：5-8中任一者的聚核苷酸的反向序列的序列；和(iii)作为SEQ ID NO：5-8中任一者的聚核苷酸的反向补体的序列。
在另一实施例中，经分离的聚核苷酸与SEQ ID NO：5-8中任一者的聚核苷酸在严格条件下杂交，其中所述经分离的聚核苷酸在其全长序列范围内与SEQ ID NO：5-8中任一者的聚核苷酸杂交。
另一方面，提供一种赋予植物繁殖不育性而不干扰营养生长的方法，其包含(a)将构筑体引入植物细胞中，所述构筑体包含(i)具有繁殖优选活性的启动子，(ii)编码能够去除繁殖发育的基因的核酸，其中所述启动子调控所述基因的表达；(b)在促进植物生长的条件下培养所述经转化植物细胞，其中所述植物为显示出与不含有所述构筑体的相同种类植物不同的表型的转基因植物；和(c)选择具有繁殖不育性和未受干扰的营养生长的植物。
还提供一种去除植物的繁殖发育而不干扰营养生长的方法，其包含(a)将构筑体引入植物细胞中，所述构筑体包含(i)具有SEQ ID NO：1、2、3、4或16中任一者的序列或其功能性变异体的启动子，(ii)编码能够去除繁殖发育的基因的核酸，其中所述启动子调控所述基因的表达；(b)在促进植物生长的条件下培养所述经转化植物细胞，其中所述植物为显示出与不含有所述构筑体的相同种类植物不同的表型的转基因植物；和(c)选择具有已去除的繁殖发育和未受干扰的营养生长的植物。
还提供一种赋予植物雄性不育性而不干扰营养生长的方法，其包含(a)将构筑体引入植物细胞中，所述构筑体包含(i)具有繁殖优选表达的启动子，(ii)编码突变体barnase的核酸，其中所述突变体barnase与野生型barnase相比具有减弱的活性；(b)在促进植物生长的条件下培养所述经转化植物细胞，其中所述植物为显示出与不含有所述构筑体的相同种类植物不同的繁殖表型的转基因植物；和(c)选择具有雄性不育性和未受干扰的营养生长的植物。在一实施例中，启动子具有选自由SEQ ID NO：1、2、3、4和16组成的群组的序列。在另一实施例中，启动子为选自由SEQ ID NO：1、2、3、4和16组成的群组的序列中任一者的功能性变异体。
在一实施例中，上述(ii)中的核酸具有SEQ ID NO：5-8中任一者的序列。
在一实施例中，本发明还提供一种具有已去除的繁殖发育和未受影响的营养生长的植物。
在另一实施例中，本发明还提供一种具有已去除的繁殖发育和正常营养生长的木本植物。
另一方面，提供一种获得木材的方法，其包含(a)将构筑体引入木本植物的植物细胞中，所述构筑体包含(i)具有SEQ ID NO：1、2、3、4或16中任一者的序列或其功能性变异体的启动子，和(ii)和所需核酸，其中所述启动子调控所述所需核酸的表达；(b)在促进植物生长的条件下培养所述经转化植物细胞；和(c)从所述植物获得木材。
另一方面为一种获得木浆的方法，其包含(a)将构筑体引入木本植物的植物细胞中，所述构筑体包含(i)具有SEQ ID NO：1、2、3、4或16中任一者的序列或其功能性变异体的启动子，和(ii)和所需核酸，其中所述启动子调控所述所需核酸的表达；(b)在促进植物生长的条件下培养所述经转化植物细胞；和(c)从所述植物获得木浆。
还提供一种去除植物中的繁殖结构的方法，其包含(a)将选自由SEQ ID NO：13-15组成的群组的质粒引入植物细胞中；(b)在促进植物生长的条件下培养所述经转化植物细胞，其中所述植物为显示出与不含有所述质粒的相同种类植物不同的表型的转基因植物；和(c)选择具有已去除的繁殖结构的植物。在另一实施例中，可将选自由SEQ ID NO：18-26组成的群组的质粒引入上述步骤(a)中的植物细胞中。
还提供一种赋予植物繁殖不育性的方法，其包含(a)将选自由SEQ ID NO：13-15组成的群组的质粒引入植物细胞中；(b)在促进植物生长的条件下培养所述经转化植物细胞，其中所述植物为显示出与不含有所述质粒的相同种类植物不同的表型的转基因植物；和(c)选择具有已去除的繁殖结构的植物。在另一实施例中，可将选自由SEQ ID NO：18-26组成的群组的质粒引入上述步骤(a)中的植物细胞中。
在另一实施例中，提供一种经本文所公开的任何质粒稳定转化的植物。在一实施例中，已稳定引入植物中的质粒具有SEQ ID NO：13-15或18-26中任一者的序列。
本发明还提供一种赋予转基因植物繁殖不育性的方法，其包含(a)用构筑体转化植物细胞，所述构筑体具有繁殖优选的启动子和非繁殖优选的启动子，所述繁殖优选的启动子可操作地连接到细胞毒素基因，所述非繁殖优选的启动子可操作地连接到编码抑制所述细胞毒素基因的蛋白质的基因；其中所述繁殖优选启动子在被子植物或裸子植物繁殖结构中具活性，且所述非繁殖优选启动子在被子植物或裸子植物繁殖结构中不具活性；(b)在促进植物生长的条件下培养所述经转化的植物细胞；和(c)选择具有已去除的繁殖结构的转基因植物。在一实施例中，繁殖优选启动子是选自由SEQ ID NO：1、2、3、4或16组成的群组。在另一实施例中，非繁殖优选的启动子是选自由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：17组成的群组。
还提供一种多肽，其包含SEQ ID NO：9-12中任一者所述的氨基酸序列或其变异体。在一实施例中，所述多肽变异体与SEQ ID NO：9-12中任一者的序列具有大于或等于99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％或60％的序列同一性。
本发明还涵盖一种包含启动子的构筑体，所述启动子包含可操作地连接到包含SEQID NO：5-8中任一者的序列的聚核苷酸的SEQ ID NO：1或2中任一者的序列。在一实施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO：5中所述的序列。在一实施例中，聚核苷酸包含SEQ IDNO：6中所述的序列。在另一实施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO：7中所述的序列。在另一实施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO：8中所述的序列。还提供一种经这一构筑体转化的植物。
还提供一种包含启动子的构筑体，所述启动子包含可操作地连接到编码多肽的聚核苷酸的SEQ ID NO：1或2中任一者的序列，所述多肽包含SEQ ID NO：9-12中任一者中所述的氨基酸序列。还提供一种经这一构筑体转化的植物。
在一实施例中，这些构筑体中的一者也可包含可操作地连接到barstar基因的非繁殖优选启动子。
本文所公开的非繁殖优选启动子可包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：17中所述的序列。
还提供一种诱导松属中球花形成的方法，其包含(a)从刚松松属(P.rigida)北美油松(pitch pine)与火炬松松属(P.taeda)火炬松(loblolly pine)杂交获得杂交后代植物；(b)用所需可操作地连接到繁殖组织优选的启动子的聚核苷酸转化杂交植物；(c)由经转化的杂交植物再生转基因杂交植物；和(d)回收球花。在一实施例中，繁殖组织优选的启动子包含SEQ ID NO：1、2、3、4或16中任一者所述的序列。在另一实施例中，杂交植物是通过农杆菌(Agrobacterium)或基因枪(biolistics)介导的转化进行转化。在一实施例中，球花为雄性或雌性。在另一实施例中，球花是由转基因杂交植物在1至3年的转化期内产生。
另一方面，提供一种测试裸子植物繁殖组织中候选启动子的活性的方法，其包含(a)获得候选启动子序列；(b)使所述候选启动子可操作地连接到报告基因；(c)将所述可操作地连接到报告基因的候选启动子引入植物材料中；和(d)鉴别植物材料中报告基因的表达。在本方法中，报告基因为GUS。在一实施例中，植物材料为植物外植体或植物细胞。在另一实施例中，报告基因的表达已经鉴别的植物材料是选自由花瓣、雄蕊、心皮、茎尖、花药、绒毡层、胼胝体和胚组成的群组。
本发明还提供一种杂交后代植物，其包含可操作地连接到所需聚核苷酸的繁殖组织优选启动子，其中所述杂交后代植物是由刚松松属北美油松与火炬松松属火炬松杂交获得。在一实施例中，繁殖组织优选的启动子包含SEQ ID NO：1、2、3、4或16中任一者所述的序列。在一实施例中，所需聚核苷酸包含SEQ ID NO：5-8中任一者所述的序列。在另一实施例中，所需聚核苷酸编码包含SEQ ID NO：9-12中任一者所述的氨基酸序列的多肽。还提供一种经包含SEQ ID NO：13-15中任一者的序列的构筑体转化的杂交后代植物，其中所述杂交后代植物是由刚松松属北美油松与火炬松松属火炬松杂交获得。
本发明还提供一种测试假定的开花控制构筑体延迟裸子植物繁殖的活性的方法，其包含(i)用可操作地连接到所需聚核苷酸的启动子转化刚松松属与火炬松松属杂交体的体细胞胚培养物(somatic embryogenic culture)；(ii)从经转化的培养物中选择转基因细胞；(iii)培养转基因细胞以获得至少一种体细胞胚；(iv)使所述胚发芽以获得转基因植物；(v)使植物生长；和(vi)检查植物球花的形成。在一实施例中，启动子为选择用于测试植物繁殖组织中启动子活性的聚核苷酸。在另一实施例中，所述培养是通过农杆菌介导的转化或基因枪转化进行转化。在另一实施例中，所需聚核苷酸为报告基因或去除构筑体。就这一点来说，在一实施例中，去除构筑体具有SEQ ID NO：13-15中任一者所述的核酸序列。在另一实施例中，构筑体可包含SEQ ID NO：18-26中任一者所述的序列。在一实施例中，上述步骤(v)的植物生长1至3年。
一般说来，可操作地连接到启动子或并入本文所公开的质粒或构筑体中的本发明的所需核酸或所需聚核苷酸可包含SEQ ID NO：5-8中任一者的序列。在一实施例中，所需核酸或所需聚核苷酸为已突变的barnase基因序列。在优选实施例中，繁殖优选的启动子可操作地连接到促进被子植物和裸子植物中繁殖组织基因去除的聚核苷酸。在优选实施例中，聚核苷酸为突变体barnase基因。在一实施例中，启动子包含SEQ ID NO：1-4或16中任一者所述的序列。在另一实施例中，barnase基因具有SEQ ID NO：5-8中任一者所述的序列，或编码包含SEQ ID NO：9-12中任一者所述的序列的多肽。任何构筑体都可包含所述启动子-所需聚核苷酸表达盒。
附图说明
图1-pWVR220[PrMC2.400::barnaseH102E](SEQ ID NO.18)。
图2-pWVCZ20[(AtAGenh)PrAG::GUS(内含子)](SEQ ID NO.19)。
图3-pWVCZ23[PrAG::barnaseE73G](SEQ ID NO.20)。
图4-pWVCZ24[(AtAGenh)PrAG::barnaseE73G](SEQ ID NO.21)。
图5-pARB599B[PrMC2::barnaseH102E](SEQ ID NO.22)。已公开的短核苷酸序列按出现的次序分别为SEQ ID NO：22的残基10431-10442、10261-10271、9885-9896和9569-9581。
图6-pARB639B[(AtAGenh)PrAG::barnaseE73G](SEQ ID NO.23)。
图7-pAGF243[PrMC2.400-3::barnaseH102E](SEQ ID NO.24)。
图8-pABDPO 10[CZ28-bstar+UBQ10::NPTII::E9/LPAG1d4::bstar::NOST的互补拷贝](SEQ ID NO.25)。
图9-pABDP04[CZ28-bstar+UBQ10::NPTII::E9/LPAG1d4::bstar::NOST的互补拷贝](SEQ ID NO.26)。
图10-pWVR220的质粒图谱。
图11-pWVCZ20的质粒图谱。
图12-pWVCZ23的质粒图谱。
图13-pWVCZ24的质粒图谱。
图14-pARB599B的质粒图谱。
图15-pARB639B的质粒图谱。
图16-pAGF243的质粒图谱。
图17-pABDPO 10的质粒图谱。
图18-pABDP04的质粒图谱。
图19-pARB 1005L[(AtAGenh)PrAG::barnaseE73G]。
具体实施方式
本发明涉及一种经分离的核酸分子，其包含与选自由下文所述的聚核苷酸序列(即，SEQ ID NO：1-26以及图1至9中所述的那些序列和其部分)中的任一者组成的群组的序列具有至少95％序列同一性的聚核苷酸。本发明还提供本文所公开的聚核苷酸序列的功能性片段。本发明另外提供与本文所揭示的任何聚核苷酸序列互补的核酸或其片段；以及包含至少15个相邻碱基的核酸，其与本文所公开的任何聚核苷酸序列杂交。
本发明还涉及一种经分离的聚核苷酸序列，其包含具有选自本文所述序列(诸如SEQID NO 9至12中所述的那些序列)的序列的多肽。
本发明使用所属领域技术人员众所周知的术语和短语。除非另作定义，否则本文所使用的所有科技术语都具有与本发明所属领域的技术人员通常了解的含义相同的含义。一般说来，本文所使用的命名法和本文所述的细胞培养、分子遗传学和核酸化学反应与杂交反应的实验室程序为众所周知和此项技术中常用者。重组核酸方法、聚核苷酸合成、微生物培养、细胞培养、组织培养、转化、转染、转导、分析化学、有机合成化学、化学合成、化学分析和医药调配和传递中都使用标准技术。一般说来，酶反应和纯化和/或分离步骤是根据制造商的说明书进行。技术和程序一般是根据常规方法进行。例如参看Sambrook & Russel，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001。
农杆菌：如所属领域众所周知，用于转化植物细胞的农杆菌为通常含有载体的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefacien)或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogene)的卸甲(disarmed)和剧毒衍生物。载体通常含有位于T-DNA边界之间的所需聚核苷酸。
被子植物：子房中封闭有种子的维管植物。被子植物是能够开花结果的种子植物。被子植物可细分成双子叶植物和单子叶植物。
被子植物繁殖结构：包括包含花的雄性和雌性组织。通常，被子植物的花具有四种不同的花器官：萼片(花萼)、花瓣(花冠)、雄蕊(雄蕊群(androcecium))和雌蕊(雌蕊群)。
被子植物繁殖结构也包含成熟前雄性繁殖结构和成熟前雌性繁殖结构。成熟前雄性繁殖结构和成熟前雌性繁殖结构包含在雄性组织和雌性组织发育和分化前形成的细胞和组织。
所需聚核苷酸：本发明的所需聚核苷酸为基因元件，诸如启动子、增强子或终止子；或基因组中包含所需聚核苷酸的经转化细胞中待转录和/或待翻译的基因或聚核苷酸。如果所需聚核苷酸包含编码蛋白质产物的序列，那么可使编码区可操作地连接到引起相关信使RNA转录本和/或由所需聚核苷酸编码的蛋白质产物表达的调控元件，诸如启动子和终止子。因此，“所需聚核苷酸”可包含以5′-至3′-方向可操作地连接的基因、启动子、编码蛋白质的基因和终止子。另外，所需聚核苷酸可包含“反义(antisense)”方向的基因或其片段，所述基因或其片段的转录产生可形成影响植物细胞中内源基因表达的二级结构的核酸。转录后所需聚核苷酸还可得到起始与所需聚核苷酸有关的基因的RNA干预的双链RNA产物。本发明的所需聚核苷酸可定位于T-DNA内，从而使左侧与右侧的T-DNA边界序列侧面相接，或位于所需聚核苷酸的任一侧上。本发明预期将一种或一种以上所需聚核苷酸稳定整合到至少一种植物细胞的基因组中。所需聚核苷酸可经突变或可为其野生型序列的变异体。应了解，可将所有或部分所需聚核苷酸整合到植物基因组中。还应了解，术语“所需聚核苷酸”涵盖一种或一种以上所述聚核苷酸。因此，本发明的T-DNA可包含一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或十种以上所需聚核苷酸。
双子叶植物(dicot)：胚中具有两半种子或子叶、分枝叶脉和四朵或五朵的花部分的有花植物。双子叶植物的实例包括(但不限于)桉树、杨树、枫香属、金合欢、柚木、桃花心木、棉、烟草、拟南芥、番茄、马铃薯、甜菜、椰菜、木薯、甘薯、胡椒、猩猩木、菜豆、紫花苜蓿、大豆、胡萝卜、草莓、莴苣、栎树、槭树、胡桃、蔷薇、薄荷、南瓜、雏菊、老獾草、鳄梨、仙人掌和马蹄金属。
内源：是指植物基因组的天然基因。
雌性繁殖组织：包括(例如)柱头、花柱、子房、大孢子、雌球花(胚珠)、雌配子、雌合子、大孢子母细胞和成熟前雌性繁殖结构。
雌性不育性基因：是指编码破坏雌配子体、雌配子、雌合子、种子、胚珠或成熟前雌性繁殖结构的生长和发育的RNA、蛋白质或多肽的核酸分子。表达雌性不育性基因的植物产生不具生育力的种子。存在许多可导致雌性不育性的不同突变，涉及雌性繁殖器官或成熟前雌性繁殖结构的特定组织发育的所有阶段。
雌性不育性基因的实例包括(但不以任何方式限制)编码催化植物激素合成的酶，诸如：异戊烯基转化酶，其为一种催化细胞分裂素生物合成的第一步骤且由农杆菌T-DNA的基因4编码的酶；或一种或两种涉及生长素合成且由农杆菌T-DNA的基因1和基因2编码的酶。雌性不育性基因的其他实例编码：葡聚糖酶；脂酶，诸如磷脂酶A2(Verheij等人，Rev.Blochem.Pharmacol.91：92-203(1981))；脂质过氧化物酶；或植物细胞壁抑制剂。雌性不育性基因的其它实例编码对植物细胞有毒的蛋白质，诸如细菌毒素(例如，白喉毒素或肉毒杆菌毒素的A片段)。
雌性不育性基因的另一实例为反义核酸，或RNA干预(RNAi)中涉及的RNA(诸如小干预RNA(siRNA))，其可用于抑制或完全阻断目标基因的表达。举例来说，本发明的反义或RNAi分子编码与植物繁殖细胞中在内源启动子控制下天然转录的链互补的核酸链，举例来说，所述内源启动子如欧洲专利公开案0,223,399中所述。所述反义核酸或RNAi分子能够与繁殖细胞中天然产生的RNA的编码和/或非编码部分结合，从而抑制天然产生的RNA的翻译。在一实施例中，可在植物的花、胚珠、种子、胚、雌配子、雌配子体、大孢子母细胞和成熟前雌性繁殖结构中于植物的互补内源DNA链(或基因)的内源启动子控制下表达本发明的反义核酸和RNAi分子。
所述反义核酸的实例为以下基因的反义DNA序列：STMG型基因，诸如STMG07、STMG08、STMG4B12和STMG3C9基因。Jofuku和Goldberg.The Plant Cell 1：1079-1093(1989)。使用RNAi抑制基因表达一般描述于Paddison等人，Genes & Dev.16：948-958(2002)中，且使用RNAi抑制植物基因的表达特别描述于WO 99/61631中，两篇专利文献都以引用的方式并入本文。
雌性不育性基因的另一实例编码特定RNA酶(即，“核糖酶”)，其能够高度特异性裂解给定目标序列，如Haseloff和Gerlach等人.Nature 334，585-591(1998)所述。
纤维组成：如本文所使用，纤维组成是指可经修饰以改变纤维的结构、外观或用途的特质。确定纤维组成的特质包括(但不限于)纤维长度、粗糙度、强度、颜色、横截面、宽度和纤维密度。举例来说，已知纤维长度给予强度，而纤维粗糙度确定结构和弹性。
在被子植物中，花分生组织起始具有四种不同类型花器官的花结构：萼片(花萼)、花瓣(花冠)、雄蕊(雄蕊群)和雌蕊(雌蕊群)。每一花器官都是以轮生体起始，包含围绕花分生组织侧翼的同心环。花结构是由花柄或花梗支撑。
有花植物产生为小孢子(雄性)或大孢子(雌性)的减数孢子。
外来：就核酸来说，“外来”的意思是所述核酸是得自非植物有机体，或得自与待转化的植物种类不同的植物，或得自与待转化的植物混种繁殖的植物，或不属于目标植物种类。根据本发明，外来DNA或RNA可包括天然存在于真菌、细菌、病毒、哺乳动物、鱼或鸟类的基因组成中但并非天然存在于待转化的植物中的核酸。因此，外来核酸为编码(例如)不是由经转化植物天然产生的多肽的核酸。外来核酸无需编码蛋白质产物。
基因：基因为含有合成产物、多肽链或RNA分子所需的所有信息且包括编码与非编码序列的DNA分子的区段。
基因元件：“基因元件”为任何不连续的核苷酸序列，包括(但不限于)启动子、基因、终止子、内含子、增强子、间隔子、5′-未翻译区、3′-未翻译区或重组酶识别位点。
基因修饰：通过应用分子生物学和细胞生物学方法将DNA稳定引入某些有机体的基因组中。
裸子植物：如本文所使用，其是指具有种子而无子房的种子植物。裸子植物的实例包括松类、苏铁类、银杏属和麻黄属。在裸子植物中，繁殖芽原体(reproductive shootprimordia)发育成雄球花(male cone/staminate cone)或雌球花(female cone/ovulate cone)。
裸子植物繁殖结构：包括包含雄性花粉球(雄球花)的雄性组织和包含雌球花(femalecone/ovulate cone)的雌性组织。裸子植物繁殖结构还包含成熟前雄性繁殖结构和成熟前雌性繁殖结构。成熟前雄性繁殖结构和成熟前雌性繁殖结构包含在雄性组织和雌性组织发育和分化前形成的细胞和组织。
引入：如本文所使用，其是指通过包括感染、转染、转化或转导的方法将核酸序列插入细胞中。
木质素：如本文所使用，其是指由类苯丙醇(phenylpropanoid)单元构成的聚合组合物，包括单木质醇松柏醇、香豆醇和芥子醇的聚合衍生物。木质素的品质是指木质素组合物给予细胞壁基质强度、辅助水运输和/或阻止细胞壁多醣降解的能力。可通过变化每一单木质醇(monolignol)的相对量或变化木质素类型来改变木质素组成或木质素结构。举例来说，愈创木基木质素(衍生自阿魏酸)在软木种类中占优势，而愈创木基-紫丁香基木质素(衍生自阿魏酸和芥子酸)为硬木种类的特性。与移除硬木中的木质素相比，降解软木(诸如松树)中的木质素实质上需要较多的碱和较长的培育时间。可通过上调或下调木质素生物合成中所涉及的酶来调控木质素组成。举例来说，木质素生物合成的关键酶包括(但不限于)4-香豆酸：辅酶A连接酶(4CL)、苯丙烯醇脱氢酶(CinnamylAlcohol dehydrogenase，CAD)和芥子醇脱氢酶(Sinapyl Alcohol Dehydrogenase，SAD)。
在被子植物中，雄性配子体或花粉粒在花药中发育，且由雄蕊产生花药。花药的发育出现于两个与花粉发育相关的阶段。第I阶段，花药中的造孢细胞经历小孢子发生；非造孢细胞形成表皮和绒毡层。绒毡层为包围造孢细胞并向花粉发育提供营养物质的组织。此外，绒毡层分泌酶过氧化氢酶。第II阶段，花药扩大且花丝伸长。此时，花粉粒形成，出现开裂，并释放出花粉粒。
在裸子植物(诸如松类)中，雄性花粉球是由具有一连串鳞苞的茎轴和每一鳞苞下表面上的两个花粉囊组成。雄球花是由在能育枝茎轴(fertile shoot axis)上以螺旋排列紧密丛集的大量小孢子叶组成。每一小孢子叶在其底部、离茎侧都具有两个小孢子囊，也称为花粉囊。每一小孢子囊内都存在造孢组织。造孢组织是由大量经历减数分裂的二倍体细胞(称为小孢子母细胞)组成。每一小孢子囊的周围都存在绒毡层。在小孢子囊内，小孢子都经历有丝分裂，且在两次有丝分裂后，产生四室雄性配子体。花粉粒包含小孢子壁和所含的雄性配子体。
在裸子植物中，雌球花是由大量经高度修饰的能育枝融合形成。举例来说，在松树中，雌球花包含连接到单一、中央茎轴的个体单元。个体单元是由珠鳞(ovuliferous scale)(具有胚珠)和几乎完全融合至珠鳞的苞片(subtending bract)组成。每一珠鳞都是由大孢子叶与其它能育枝组件融合形成。在顶部，每一珠鳞的离茎表面都具有两个胚珠。胚珠以其珠孔朝向中央锥形茎轴(cone axis)定向且部分埋入珠鳞组织中。每一胚珠都具有完全包围除珠孔外的大孢子囊的珠被(一种多细胞层)。珠被或珠心起到营养组织的作用，且每一珠心都具有单一大孢子母细胞。大孢子母细胞为经历减数分裂的二倍体细胞。珠孔室是位于每一胚珠内珠心与珠孔之间。
雄性繁殖组织：包括(例如)花粉粒、绒毡层、花药、花丝、花粉母细胞、小孢子、小孢子母细胞、雄性花粉球(雄球花)、花粉囊和成熟前繁殖结构。
雄性不育性基因：是指编码干扰表达雄性不育性基因的任何繁殖细胞中适当代谢、功能和/或发育且由此导致任何所述繁殖细胞死亡和/或破坏的RNA、蛋白质或多肽的核酸分子。存在许多可导致雄性不育性的不同突变，涉及雄性繁殖器官或成熟前雄性繁殖结构特定组织发育的所有阶段。
举例来说，雄性不育性基因的表达使植物无法产生可育花粉。经转化植物中雄性不育性基因的表达可导致植物产生花粉，但花粉可能对于传粉来说为异常且无功能的。举例来说，非功能性花粉可能无法使花粉管发芽。并非出于限制，雄性不育性基因的实例编码：RNA酶，诸如RNA酶T1(其通过水解任何鸟嘌呤残基后的键降解RNA分子)和Barnase；DNA酶，诸如核酸内切酶(例如，EcoRI)；或蛋白酶，诸如木瓜蛋白酶(例如，木瓜蛋白酶酶原和木瓜蛋白酶活性蛋白)。
其它雄性不育性基因编码催化植物激素合成的酶。举例来说，可使用异戊烯基转移酶(一种催化细胞分裂素生物合成的第一步骤的酶)，且生长素合成所涉及的酶可用于诱导雄性不育性。其它雄性不育性基因编码葡聚糖酶；脂酶，诸如磷脂酶A2(Verheij等人.Rev.Biochem.Pharmacol.91：92-203(1981))；脂质过氧化物酶；或植物细胞壁抑制剂。雄性不育性基因的其它实例编码对植物细胞有毒的蛋白质，诸如细菌毒素(例如，白喉毒素或肉毒杆菌毒素的B片段)。
雄性不育性基因的另一实例为反义核酸，或RNA干预(RNAi)中涉及的RNA(诸如小干预RNA(siRNA))，其可用于抑制或完全阻断目标基因的表达。举例来说，本发明的反义或RNAi分子编码与植物繁殖细胞中在内源启动子控制下天然转录的链互补的核酸链，举例来说，所述内源启动子如欧洲专利公开案0,223,399中所述。所述反义核酸或RNAi分子能够与繁殖细胞中天然产生的RNA的编码和/或非编码部分结合，从而抑制天然产生的RNA的翻译。在一实施例中，可在花粉粒、绒毡层、花粉囊、花丝、花粉母细胞、小孢子、小孢子母细胞、雄性花粉球(雄球花)、花粉囊和成熟前雄性繁殖结构中表达本发明的反义核酸和RNAi分子。
小孢子发生是二倍体细胞、即小孢子母细胞经历减数分裂分离而产生四个单倍体小孢子(小孢子四分体)的过程。小孢子四分体是封闭于胼胝质细胞壁中。
在被子植物中，小孢子发生出现于雄蕊(即花的雄性繁殖组织)中。每一雄蕊都具有花丝和花药。每一花药都具有一到四个室，称为花粉囊或花药囊。每一花药囊产生多个小孢子母细胞，也称为花粉母细胞。
在裸子植物中，小孢子发生出现于小孢子叶的小孢子囊或花粉囊中。在小孢子囊内，小孢子经历有丝分裂并产生四室雄性配子体。裸子植物的花粉粒包含小孢子壁和所含的雄性配子体。
单子叶植物(monocot)：具有含一个子叶(cotyledon或seed leaf)的胚、平行叶脉和三朵花部分的有花植物。单子叶植物的实例包括(但不限于)草坪草、玉米、稻子、燕麦、小麦、大麦、高粱、兰花、鸢尾属植物、百合花、洋葱和棕榈。草坪草的实例包括(但不限于)翦股颖属(Agrostis spp.)(包括细弱翦股颖(colonial bentgrass)和匍匐翦股颖(creeping bentgrasses)的翦股颖属)、草地早熟禾(Poa pratensis/kentuckybluegrass)、黑麦草属(Lolium spp.)(包括一年生黑麦草(annual ryegrass)和多年生黑麦草(perennial ryegrass)的黑麦草属)、高羊茅(Festuca arundinacea/tall fescue)、丛生型紫羊茅(Festuca rubra commutata)(细羊茅(fine fescue))、狗牙根(Cynodon dactylon)(包括Tifgreen、Tifway II和Santa Ana的常见狗牙根品种和其杂交体)、东非狼尾草(Pennisetum clandestinum)(克育草(kikuyugrass))、钝叶草(Stenotaphrum secundatum)(圣奥古斯丁草(st.augustinegrass))、结缕草(Zoysia japonica/zoysiagrass)和马蹄金(Dichondra micrantha)。
可操作地连接：以使两个或两个以上分子的组合在植物细胞中适当起作用的方式组合所述两种或两种以上分子。举例来说，当启动子控制结构基因的转录时，启动子可操作地连接到结构基因。
表型：表型为植物可辨识的特征或特性，可根据本发明通过将一种或一种以上“所需聚核苷酸”和/或可筛选/可选择的标记整合到经转化植物的至少一个植物细胞的基因组中来变化所述特征或特性。“所需聚核苷酸”和/或标记可通过改变经转化植物细胞或植物整体的多个遗传、分子、生物化学、生理学、形态学或农艺学特性或性质中的任一个来使经转化植物的表型改变。因此，植物基因组中一个或一个以上稳定整合的所需聚核苷酸的表达可得到选自由(例如)以下表型组成的群组的表型：增加的耐旱性、增强的耐寒和耐冻性、改良的活力、增强的颜色、增强的健康和营养特性、改良的储存、增强的产量、增强的耐盐性、增强的对重金属的耐受性、增加的对疾病的耐受性、增加的对昆虫的耐受性、增加的对水压的耐受性、增强的甜味、改良的活力、改良的味道、改良的结构、降低的磷酸盐含量、增加的发芽率、增加的微量营养素摄取、改良的淀粉组成和改良的花期。
植物组织：“植物”是特性上产生胚、含有叶绿体且具有纤维素细胞壁的植物界王国中多种光合成、真核、多细胞有机体中的任一种。可根据本发明的方法转化植物的一部分(即“植物组织”)以制造转基因植物。许多适当的植物组织可根据本发明加以转化，且包括(但不限于)体细胞胚、花粉、叶、杆、胼胝体、匍匐茎、微管和枝条。因此，本发明预期被子植物和裸子植物的转化，所述植物诸如草坪草、小麦、玉米、稻子、大麦、燕麦、甜菜、马铃薯、番茄、烟草、紫花苜蓿、莴苣、胡萝卜、草莓、木薯、甘薯、老獾草、大豆、栎树、苹果、葡萄树、松树、冷杉、金合欢、桉树、胡桃和棕榈。根据本发明，“植物组织”也涵盖植物细胞。植物细胞包括悬浮培养物、胼胝体、胚、分生组织区、胼胝体、叶、根、枝条、配子体、孢子体、花粉、种子和小孢子。植物组织可处于成熟期的各个阶段，且可生长于罐、温室或田间的液体或固体培养物中或土壤中或适当培养基中。植物组织也是指无性繁殖或有性繁殖产生的所述植物、种子、后代、繁殖体的任何克隆，和任何所述植物组织的子孙后代，诸如插枝或种子。特别引人关注的为松类，诸如松树、冷杉和云杉；单子叶植物，诸如草地早熟禾、匍匐翦股颖、玉米和小麦；和双子叶植物，诸如棉、番茄、莴苣、拟南芥、烟草、苹果和老獾草。
植物转化和细胞培养：广义上是指基因修饰植物细胞并将其转移至适当的植物培养基中以供维持、进一步生长和/或进一步发育的方法。所属领域技术人员众所周知所述方法。
花粉是指种子植物的小孢子且小孢子的粉末状块是从花药和雄球花中流出的。
成熟前雌性繁殖结构：是指在被子植物和裸子植物种类中的雌性组织发育和分化前形成的细胞和组织。
成熟前雄性繁殖结构：是指在被子植物和裸子植物种类中的雄性组织发育和分化前形成的细胞和组织。
后代：本发明的“后代”(诸如转基因植物的后代)为出自植物或转基因植物、由植物或转基因植物产生或源自植物或转基因植物的物质。因此，“后代”植物，即“F1”代植物是由本发明的方法制造的转基因植物的苗种或子孙后代。转基因植物的后代可含有至少一种、部分或全部的其细胞基因组，即已通过本文所述的方法整合到亲代转基因植物细胞中的所需聚核苷酸。因此，后代植物得以“传递”或“继承”所需聚核苷酸。后代植物由此继承的所需聚核苷酸可存在于T-DNA构筑体内，所述T-DNA构筑体也是由后代植物从其亲代继承得到。也可认为如本文所使用的术语“后代”为一组植物的苗种或子孙后代。
启动子：旨在意谓结合RNA聚合酶和/或其它转录调控元件的核酸、优选DNA。与任何启动子一样，本发明的启动子序列将促进或控制DNA或RNA转录而由可操作地连接到所述启动子的核酸分子产生mRNA分子。如上文所述，所产生的RNA可编码蛋白质或多肽，或可编码RNA干预或反义分子。
如本文所使用的启动子也可包括调控元件。相反，调控元件也可与启动子分离。调控元件赋予启动子区多种重要特性。一些元件与增强可操作地连接的核酸的转录速率的转录因子结合。其它元件与抑制转录活性的阻遏物结合。转录因子对启动子活性的作用可确定启动子活性为高或低的，即启动子为“强”或“弱”。
植物启动子是能够起始植物细胞转录的启动子，无论其起点是否在植物细胞内。示范性植物启动子包括(但不限于)从植物、植物病毒和细菌(诸如农杆菌或根瘤菌)获得的启动子，其包含植物细胞中所表达的基因。发育控制下的启动子的实例包括优先起始某些组织的转录的启动子，所述组织诸如绒毡层、木质部、叶、根或种子。所述启动子称为组织优选的启动子。仅起始某些组织的转录的启动子称为组织特异性启动子。细胞类型特异性启动子主要驱动一种或一种以上器官(例如根或叶中的脉管细胞)中某些细胞类型的表达。可诱导或可阻遏的启动子为环境控制下的启动子。可通过可诱导启动子影响转录的环境条件的实例包括厌氧条件、热或存在光。组织特异性、组织优选、细胞类型特异性和可诱导启动子将组成非组成性启动子类。组成性启动子为在大部分环境条件下且在大部分植物部分中具活性的启动子。
聚核苷酸是包含基因编码序列或其片段(包含至少15个连续核苷酸、至少30个连续核苷酸或至少50个连续核苷酸)、启动子、内含子、增强子区、多聚腺苷酸化位点、翻译起始位点、5′或3′未翻译区、报告基因、可选择标记等的核苷酸序列。聚核苷酸可包含单链或双链DNA或RNA。聚核苷酸可包含经修饰碱基或经修饰骨架。聚核苷酸可为基因组、RNA转录本(诸如mRNA)或经加工核苷酸序列(诸如cDNA)。聚核苷酸可包含有义或反义方向的序列。
经分离聚核苷酸为非天然状态的聚核苷酸序列，例如，聚核苷酸包含未见于自然界中的核苷酸序列，或聚核苷酸与其通常接近的核苷酸序列分离，或聚核苷酸与其通常不接近的核苷酸序列接近。
可再生性：如本文所使用，其是指植物由脱分化组织再分化的能力。
繁殖优选的启动子是指优先在植物繁殖组织中表达的启动子。繁殖植物组织包括繁殖结构的雄性与雌性部分，以及成熟前雄性繁殖结构与成熟前雌性繁殖结构。雄性繁殖组织包括(例如)花粉粒、绒毡层、花药、花丝、花粉母细胞、小孢子、雄性花粉球(雄球花)和成熟前雄性繁殖结构。雌性繁殖组织包括(例如)柱头、花柱、子房、大孢子、珠鳞、苞叶、雌球花(胚珠)和成熟前雌性繁殖结构。因此，繁殖优选的启动子可优先在任何被子植物繁殖结构或裸子植物繁殖结构中表达。
种子：可认为“种子”是含有胚的成熟植物胚珠和植物的繁殖部分(如块茎或孢子)。可在进行农杆菌介导的转化之前，例如于暗室中培育种子以促进发芽。也可在培育之前诸如通过用漂白法进行简单处理使种子灭菌。随后，可将所得籽苗暴露至所需的农杆菌菌株。
可选择/可筛选标记：如果在植物或植物组织中表达时可能使该等组织与其他植物或植物组织相区别的基因，其中所述其他植物或植物组织并不表达所述基因。筛选程序可能需要对可筛选标记基因编码的蛋白质表达进行分析。所述标记的实例包括β葡糖苷酸酶(GUS)基因和荧光素酶(LUX)基因。可选择的标记的实例包括编码卡那霉素(kanamycin)和遗传霉素(geneticin)抗性的新霉素磷酸转移酶(neomycinphosphotransferase，NPTII)基因；编码对潮霉素(hygromycin)的抗性的潮霉素磷酸转移酶(HPT或APHIV)基因；编码对磺酰脲型除草剂抗性的乙酰乳酸合成酶(als)基因；编码对除草剂的抗性的基因(BAR和/或PAT)，所述除草剂起到抑制谷氨酰胺合成酶作用的作用，诸如草铵膦(phosphinothricin)(Liberty或Basta)；或其它此项技术中已知的类似基因。
序列同一性：如本文关于两种核酸或多肽序列的内容中所使用，“序列同一性”或“同一性”包括当在特定区域内对准以达成最大对应时两个序列中相同的残基的相关物。
如本文所使用，序列同一性百分数意指通过比较比较窗(comparison window)内两个最佳对准的序列所测定的值，其中当与两个序列的最佳对准的参考序列(不包含加入或缺失)相比较时，所述比较窗中聚核苷酸序列的部分可包含加入或缺失(即，间隙)。通过测定相同核酸碱基出现于两个序列中的位置的数量得到匹配位置的数量，以匹配位置的数量除以比较窗中的位置总数并将结果乘以100以得到序列同一性的百分数，从而来计算所述百分数。
雄蕊：是指产生雄配子的花器官且包括花药和花丝。
绒毡层：是指包围被子植物花药的小造孢细胞(microsporogenous cell)或裸子植物雄球花内的微造孢细胞的细胞层。已知其极其接近正在发育的小孢子，绒毡层可能向正在发育的小孢子提供养分，诸如还原糖、氨基酸和脂质。Reznickova，C.R.，Acad.Bulg.Sci.31：1067(1978).Nave等人，J.Plant Physiol.125：451(1986).Sawhney等人，J.Plant Physiol125：467(1986)。绒毡层细胞也产生β(1，3)葡聚糖酶(过氧化氢酶)，其通过消化胼胝质细胞壁促进小孢子释放。因此，绒毡层与小造孢细胞之间存在脆弱的关系，且对于绒毡层的任何破坏都可能导致无功能的花粉粒。举例来说，已展示，绒毡层生物发生的损伤会导致雄性不育性突变体(Kaul，″Male Sterility in Higher Plants″in Monographs onTheoretical and Applied Genetics；Frankel等人编辑；Springer Verlag；Vol.10；第15-95页；(1988))。因此，编码过氧化氢酶的基因可用于破坏雄性繁殖发育。由此，可使用例如重组DNA分子来诱导使小孢子无法发育成成熟花粉粒，所述重组DNA分子包含能够在绒毡层特异性调控序列控制下破坏绒毡层功能的基因。
转录因子：转录因子是指通过与一种或一种以上与基因编码序列有关的核苷酸序列直接结合或间接影响与一种或一种以上与基因编码序列有关的核苷酸序列直接结合的另一聚核苷酸的活性来调控基因表达的多肽序列。转录因子可活化(上调)或阻遏(下调)基因的表达。转录因子可含有DNA结合结构域、活化结构域或蛋白质-蛋白质相互作用结构域。在本发明中，转录因子能够进行(1)与核酸序列结合或(2)调控植物细胞中基因的表达的至少一种。
转录和翻译终止子：本发明的表达DNA构筑体通常在转录起始调控元件对立端具有转录终止区。可根据mRNA的稳定性来选择转录终止区以增强表达，和/或可根据加入到基因转录产物中的多聚腺苷酸化尾的加入来选择转录终止区。
转移DNA(T-DNA)：农杆菌T-DNA是一种基因元件，众所周知，其为一种能够将其边界内所含的核苷酸序列整合到另一基因组中的元件。就这方面来说，T-DNA通常通过两个“边界”序列侧面相接。本发明的所需聚核苷酸和可选择标记可定位于T-DNA的左边界样序列(left border-like sequence)与右边界样序列之间。可将T-DNA内所含的所需聚核苷酸和可选择标记可操作地连接到促进其表达(即，由所需聚核苷酸或可选择标记编码的DNA序列的转录和/或翻译)的多种不同、植物特异性(即，天然)或外来核酸，如启动子和终止子调控元件。
植物细胞的转化：一种将核酸稳定插入到植物细胞基因组中的方法。转化可在天然或人工条件下使用多种此项技术中众所周知的方法发生。转化可取决于将核酸序列插入到原核或真核宿主细胞中的任何已知方法，包括农杆菌介导的转化方案、病毒感染、噬菌体晶须(whisker)、电穿孔、微注射、聚乙二醇处理、热休克(heat shock)、脂转染(lipofection)和粒子轰击。
转基因植物：本发明的转基因植物是包含至少一种已稳定整合外源核酸的细胞基因组的植物。根据本发明，转基因植物是一种可仅包含一种经基因修饰的细胞和细胞基因组的植物，或其可包含若干种或许多经基因修饰的细胞，或所有所述细胞都可经基因修饰。本发明的转基因植物可为一种所需聚核苷酸(即，外源核酸)的表达仅发生于植物的某些部分中的植物。因此，转基因植物可仅在其结构的某些部分中含有经基因修饰的细胞。
变异体：如本文所使用的“变异体”应理解为意指源自特定基因的参考(即，天然、标准或已知)核苷酸序列的核苷酸序列。术语“同工型(isoform)”、“同种型(isotype)”和“类似物”也是指核苷酸序列的“变异体”形式。
变异体也可指“改组基因(shuffled gene)”，诸如颁予Maxygen的专利中所述的那些基因。举例来说，本发明的变异体可包括根据美国专利第6,132,970号中所公开的方法和基本原理修饰的序列和所需聚核苷酸的变异体，所述专利是以引用的方式并入本文。
营养生长：这一为此项技术广泛接受的术语是指植物的常规、总体发育。详细说来，例如，繁殖后，分生组织细胞分化成最终发育成根和枝条且之后发育成叶和花的顶端分生组织和侧分生组织。枝条和根构型、分枝模式、发育成叶、花瓣、花和果实的杆、腋芽和原基细胞等都被认为是植物的“营养期”和“营养生长”循环的一部分。所述特征的发育速率视多种因素而定，诸如植物种类、光合作用、养分的可用性和植物生长的一般环境。
遗传学也在成形植物发育中起到重要的文字和比喻作用。举例来说，可通过基因表达推断“单叶”或“复叶”的形状，即其以周边光滑、深叶片(deep lobe)、个别小叶或卷须为特征。例如，“LEAFY”基因对于复叶发育起到作用且对于从营养生长至繁殖发育的过渡至关重要。已在拟南芥和金鱼草中鉴别出LEAFY，且其与其他被子植物中的基因相同。豌豆的同源物Unifoliata具有复叶变为单叶的突变体表型，其可表明枝条与复叶之间的调控关系。
类似地，金合欢突变体“tl”将卷须转变成小叶，同时突变afilia(“af”)将小叶转变成卷须。“af tl”双突变体具有复杂构型，类似于欧芹叶。同样，始终在所述“营养”植物细胞和组织中表达的其它基因也是这样，且包含植物其它细微部分的发育、生理学和结构特性。因此，存在许多特定或主要在所有营养组织(诸如，根、枝条、杆和叶)中表达的“营养特异性”基因，或其为营养组织特异性。因此，所述基因的启动子可用于引导所需的内源或外来基因表达特定的营养组织。由此，可能优先在一种或一种以上营养组织中表达基因产物，同时避免在诸如繁殖组织细胞的非营养组织中表达相同产物。
木材组成：是指可经修饰以改变木材的结构、外观或用途的特质。并非出于限制，确定木材组成的特质包括细胞壁厚度、细胞长度、细胞尺寸、内腔尺寸、细胞密度、微纤维角度、拉伸强度、撕裂强度、木材颜色和细胞分裂的长度和频率。
木浆：是指由具有不同纯度的树木产生的纤维。木浆可用于造纸、纸板和化学制品。
应了解，由于本文所述的特定方法、方案、载体和试剂等可变化，所以本发明不限于此。还应了解，本文所使用的术语只是出于描述特定实施例的目的使用，且不打算限制本发明的范畴。必须注意，除非本文另作清楚指示，否则如本文和随附权利要求中所使用的单数形式“一种”和“所述”包括多种参考物。因此，举例来说，“基因”的相关物为一种或一种以上基因的相关物，且包括其所属领域技术人员已知的等效物。当然，所属领域技术人可使用本文所述的方法来表达植物宿主系统中的任何天然基因(当前或后来已知)。
核酸
“经分离”核酸分子预期表示已从天然环境中移除的核酸分子、DNA或RNA。举例来说，认为载体中所含的重组DNA分子是出于本发明的目的而分离的。经分离的DNA分子的其它实例包括异源宿主细胞中维持的重组DNA分子，或溶液中的经纯化(部分或大体全部)DNA分子。经分离的RNA分子包括本发明的DNA分子的体外RNA转录本。根据本发明，经分离核酸分子另外包括合成制得的所述分子。
本发明的核酸分子可为RNA的形式，诸如mRNA；或DNA的形式，包括(例如)通过克隆获得或合成制得的cDNA和基因组DNA。DNA或RNA可为双链或单链。单链DNA可为编码链，也称为有义链；或其可为非编码链，也称为反义链。
除非另外指出，否则通过对本文中的DNA分子测序所测定的所有核苷酸序列都是使用自动化DNA测序仪(诸如来自Applied Biosystems，Inc.的3700型)测定，且由本文所测定的DNA分子编码的多肽的所有氨基酸序列都是通过翻译如上文所测定的DNA序列进行预测。由于此项技术中已知通过此自动化方法测定的任何DNA序列，所以本文所测定的任何核苷酸序列都可能含有一些错误。通过自动操作测定的核苷酸序列与经测序DNA分子的实际核苷酸序列具有通常至少约95％、更通常至少约96％直至至少约99％同一性。可通过其它方法(包括此项技术中众所周知的人工DNA测序方法)更精确地测定实际序列。也如此项技术中已知，与实际序列相比，已测定的核苷酸序列中的单一插入或缺失将引起核苷酸序列翻译时框架移位(frame shift)，从而使所预测的由已测定的核苷酸序列编码的氨基酸序列可能从所述插入或缺失点开始与由经测序的DNA分子实际编码的氨基酸序列完全不同。
除非另作指示，否则本文所述的每一“核苷酸序列”都是以脱氧核糖核苷酸序列(简写为A、G、C和T)呈现。然而，预期核酸分子或聚核苷酸的“核苷酸序列”为DNA分子或聚核苷酸，即脱氧核糖核苷酸；和RNA分子或聚核苷酸，即特定脱氧核苷酸序列中的每一胸苷脱氧核苷酸(T)都经核糖核苷酸尿苷(U)置换的核糖核苷酸(A、G、C和U)的对应序列。举例来说，预期具有使用脱氧核糖核苷酸简写陈述的SEQ ID NO：1序列的RNA分子的相关物表明具有其中SEQ ID NO：1的每一脱氧核糖核苷酸A、G或C都已经相应核糖核苷酸A、G或C置换且每一脱氧核糖核苷酸T都已经核糖核苷酸U置换的序列的RNA分子。
本发明还涉及本文所述的经分离核酸分子的片段。预期具有本文所公开的核苷酸序列的经分离DNA分子的片段为至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少30个核苷酸长的DNA片段，其可用作诊断探针，且引物将于下文中更详细地讨论。当然，根据常规杂交技术，长达本发明核酸分子的全长的较长核酸片段也可在诊断上用作探针，或用作引物以通过聚合酶链反应(PCR)扩增目标序列，举例来说，如Molecular Cloning，ALaboratory Manual，第3版，Sambrook，J和Russel，D.W.编辑，(2001)，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York中所述，所述文献的整个公开内容以引用的方式并入本文。
预期(例如)至少20个核苷酸长的片段为包括20个或20个以上来自如本文所公开的核苷酸序列(即，SEQ ID NO 1-26)的相邻碱基的片段。可使用对于所属领域技术人员来说为例行程序的常规DNA合成方法来产生包含本文所公开的核苷酸序列的核酸。举例来说，可简单地使用限制性核酸内切酶裂解或超音波处理剪切来产生各种尺寸的片段。或者，可根据已知技术合成性产生本发明的DNA片段。
另一方面，本发明提供一种经分离的核酸分子，其包含在严格杂交条件下与上述本发明核酸分子中的一部分聚核苷酸杂交的聚核苷酸。预期与“一部分”聚核苷酸杂交的聚核苷酸为与参考聚核苷酸中至少约15个核苷酸、至少约20个核苷酸、至少约30个核苷酸和30个以上核苷酸杂交的聚核苷酸(DNA或RNA)。与参考片段杂交的这些片段可用作诊断探针和引物。如本文所使用，探针是定义为一个本文所公开的核酸(即，SEQ IDNO 1-8和13-26)中的至少约50个相邻碱基。出于本发明的目的，当两个序列在6×SSC、0.5％ SDS、5×Denhardt氏溶液和100μg非特异性DNA载体的杂交溶液中形成双链复合物时，其杂交。参看Ausubel等人，第2.9节，第27增补版(1994)。序列可在“中等严格度”下杂交，所述“中等严格度”定义为在6×SSC、0.5％ SDS、5×Denhardt氏溶液和100μg非特异性载体DNA的杂交溶液中、在60℃的温度下。就“高严格度”杂交来说，温度增加至68℃。在中等严格度杂交反应后，室温下，在2×SSC和0.05％SDS溶液中洗涤核苷酸5次，随后在60℃下用0.1×SSC和0.05％SDS溶液洗涤1h。对于高严格度来说，洗涤温度增加至68℃。出于本发明的目的，杂交核苷酸为使用具有10,000cpm/ng的比放射性的1ng经放射标记的探针检测的核苷酸，其中杂交核苷酸在-70℃下曝露于X射线胶片仅72小时后即清晰可见。
如前文所提及，本申请案涉及与上述核酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的所述核酸分子。一个实施例涵盖与SEQ ID NO 1-8和13-26中所示的核酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸分子。具有与参考核苷酸序列具有至少(例如)95％同一性的核苷酸序列的聚核苷酸意味着聚核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同，但对于每100个参考核苷酸序列的核苷酸来说，聚核苷酸序列可包括多达五个突变点。换句话说，为获得具有与参考核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列的聚核苷酸，参考序列中多达5％核苷酸可缺失或经另一核苷酸取代，或可将占参考序列中总核苷酸多达5％的数量的核苷酸插入到参考序列中。参考序列的这些突变可出现于参考核苷酸序列的5′或3′末端位置处，或所述末端位置之间的任何位置处，独立地散布于参考序列中的核苷酸之间或散布于参考序列内一个或一个以上相邻基团中。
实际上，任何特定核酸分子是否与参考核苷酸片段具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性是指使用此项技术中众所周知的标准算法在两个分子之间作出的比较。尽管可使用任何序列算法来定义序列的同一性，但为清楚起见，本发明参考基本局部比对搜寻工具(Basis Local Alignment Search Tool，BLAST)算法(Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990))来定义同一性，其中将发明内容中所述的启动子序列用作参考序列以在其长度范围内定义聚核苷酸同源物的同一性百分数。匹配、错配和插入或缺失的参数值的选择是任意的，但已经发现某些参数值以得到在生物学上比其它值切合实际的结果。
当使用BLAST或任何其它序列比对程序来确定特定序列(例如)是否与本发明的参考序列具有95％同一性时，当然设置参数，从而能够在参考核苷酸序列的全长范围内计算同一性百分数，且能够允许同源性的间隙占参考序列中总核苷酸数量多达5％。
也可参考两种聚核苷酸通过形成互补碱基对而杂交形成双链复合物的能力来描述其间关联。本文先前已描述杂交条件。可使用增加温度来分裂这些复合物。在结构上更相同的两个序列为需要较高温度使其分裂或将其“熔解”的序列。熔解双链复合物所需的温度称为“Tm”。Tm与其它杂交参数之间的关系为：
Tm(℃)＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(分率G+C)-0.63(甲酰胺％)-(600/l)
其中Tm为由探针和其目标组成的DNA双链体的熔解温度；且l＝碱基对中杂合物的长度，限制条件为l＞100个碱基对。Bolton等人，Proc.Natl.Acad.Sci.48：1390(1962)。一般说来，熔点改变1℃表示DNA序列相似度存在0.7％至3.2％的差异。Bonner等人，Journal of Molecular Biology 81：123-35(1973)；McCarthy等人，In Evolution of GeneticSystems，H.H.Smith(编辑)，Brookhaven Symposium in Biology No.23，Gordon and Breach，New York，第1-43页(1972)。在60℃下形成稳定的DNA双链体通常需要序列之间存在至少80％的序列同一性。Sibley等人，ACTA 1：83-121(第18届国际鸟类学大会的会议记录(Proceedings of the 18th International Ornithological Congress)，Moscow，1982年8月16-24日，Academy of Sciences of the USSR)。
在一实施例中，本发明的核酸使被子植物和裸子植物的繁殖组织中的多肽或蛋白质能够优先表达。本发明的核酸也可优先引导植物繁殖组织中反义RNA或RNA干预(RNAi)中涉及的RNA(诸如，小干预RNA(siRNA))的表达，其可用于抑制或完全阻断目标基因的表达。
繁殖植物组织包括繁殖器官的雄性与雌性部分。雄性组织包括(例如)花粉、绒毡层、花药、花丝、花粉母细胞、小孢子、雄性花粉球(雄球花)和成熟前雄性繁殖结构。雌性繁殖组织包括(例如)柱头、花柱、子房、大孢子、雌球果(胚珠)和成熟前雌性繁殖结构。
繁殖优选的启动子是指优先在植物繁殖组织中表达的启动子。繁殖植物组织包括繁殖结构的雄性与雌性部分，以及成熟前雄性繁殖结构与成熟前雌性繁殖结构中表达的启动子。雄性繁殖组织包括(例如)花粉粒、绒毡层、花药、花丝、花粉母细胞、小孢子和花粉球。雌性繁殖组织包括(例如)柱头、花柱、子房、大孢子和胚珠。因此，繁殖优选的启动子除在裸子植物和被子植物的任何成熟前雄性组织或成熟前雌性组织中表达外，还可优先在任何被子植物或裸子植物种类的任何繁殖结构中表达。
在一实施例中，繁殖优选的启动子使雄性繁殖组织中的基因得以表达。在一实施例中，繁殖优选的启动子使被子植物种类的花药、花粉或花丝细胞中能够基因表达。在另一实施例中，繁殖优选的启动子使绒毡层或花药表皮细胞中能够基因表达。在另一实施例中，繁殖优选的启动子使雄性花粉球、绒毡层、小孢子叶或裸子植物中存在的任何其它雄性繁殖组织中能够基因表达。对于被子植物和裸子植物来说，繁殖优选的启动子使成熟前雄性繁殖结构或成熟前雌性繁殖结构中能够基因表达。
繁殖优选的启动子可用于(例如)使植物雄性不育。举例来说，可使繁殖优选的启动子可操作地连接到细胞毒素基因，从而使雄性繁殖组织中细胞毒素基因的表达使植物无法产生可育雄配子。在另一实施例中，可选择并分离繁殖优选的启动子，从而使所述启动子不表达非繁殖组织(诸如营养组织)中可操作地连接的基因。
在一实施例中，繁殖优选的启动子使雌性繁殖组织中的基因能够表达。在一实施例中，繁殖优选的启动子使被子植物的柱头、花柱或子房中的基因能够表达。在另一实施例中，繁殖优选的启动子使雌球花(胚珠)、大孢子叶或裸子植物中存在的任何其它雌性繁殖组织中能够基因表达。对于被子植物和裸子植物来说，繁殖优选的启动子使成熟前雄性繁殖结构或成熟前雌性繁殖结构中能够基因表达。
繁殖优选的启动子可用于(例如)使植物雌性不育。在一实施例中，可使繁殖优选启动子可操作地连接到细胞毒素基因，从而使雌性繁殖组织中细胞毒素基因的表达使植物无法产生可育雌配子、雌合子和/或种子。在另一实施例中，可选择并分离繁殖优选启动子，从而使启动子不表达非繁殖组织(诸如营养组织)中可操作地连接的基因。
举例来说，可通过搜寻仅在繁殖发育过程中存在的mRNA来鉴别繁殖优选的启动子。另外，繁殖优选的启动子可存在于成熟前雄性繁殖组织和成熟前雌性繁殖组织中。在一实施例中，由植物雄性繁殖组织发育过程中存在的mRNA鉴别繁殖优选启动子，所述雄性繁殖组织包括(例如)花药、花粉、花丝、雄球花和成熟前雄性繁殖组织。在一实施例中，由植物雌性繁殖组织发育过程中存在的mRNA鉴别繁殖优选启动子，所述雌性繁殖组织包括(例如)柱头、花柱、子房、胚珠和成熟前雌性繁殖组织。鉴别并分离繁殖优选mRNA后，由这一繁殖优选mRNA制备cDNA。可将所得cDNA用作探针以鉴别植物基因组中含有编码繁殖优选mRNA的DNA的区域。已鉴别DNA后，可分离编码繁殖优选启动子的DNA上游(即，5′)的序列。
如本文所使用，预期启动子意指结合RNA聚合酶和/或其它转录调控元件的核酸、优选DNA。与任何启动子一样，本发明的启动子将促进或控制DNA或RNA转录，从而由可操作地连接到所述启动子的核酸分子产生mRNA分子。如上文所述，所产生的RNA可编码蛋白质或多肽，或可编码RNA干预或反义分子。如本文所使用，“可操作地连接”是指DNA的化学融合、接合或合成，从而以适当的方向形成启动子-核酸序列组合以使核酸序列转录成RNA区段。本发明的启动子也可含有所得mRNA转录本的部分或所有5′未翻译区(5′UTR)。另一方面，本发明的启动子不需具有任何5′UTR。
如本文所使用的启动子也可包括调控元件。相反，调控元件也可与启动子分离。调控元件赋予启动子区多种重要特性。一些元件与增强可操作地连接的核酸的转录速率的转录因子结合。其它元件与抑制转录活性的阻遏物结合。转录因子对启动子活性的综合作用可确定启动子活性为高或低的，即启动子为“强”或“弱”。结合调控元件的转录因子本身可通过对胞外刺激物起反应而与其它已结合的蛋白质相互作用或通过共价修饰(例如，磷酸化)得到调控。通过与细胞核联系的信号转导分子(诸如，有机体的胞内代谢物或外源化学物质)来调节某些转录因子的活性。不受细胞环境改变影响的启动子称为组成性启动子。
在另一实施例中，本发明的核酸编码破坏表达核酸的细胞的代谢、功能和/或发育的表达产物。在一实施例中，本发明的核酸编码细胞毒素表达产物。在一实施例中，本发明的核酸包含barnase。在另一实施例中，可通过此项技术中已知的增加和/或降低barnase活性的方法使barnase突变。在一实施例中，突变barnase可具有减弱的细胞毒素活性。
本发明还提供包含本发明的经分离的核酸分子和多肽的载体。在一实施例中，本发明的载体为得自根癌农杆菌的Ti质粒。
在研究本发明的构筑体时，通常将所述构筑体或其片段的各种组件插入到常规克隆载体中，例如，能够在细菌宿主(例如大肠杆菌(E.coli))中复制的质粒。存在多种已在文献中描述的载体，许多载体市面有售。每次克隆后，可分离具有所需插入物的克隆载体，并使其经历进一步处理以定制具有所需序列的组件，所需处理诸如限制性消化、插入新片段或核苷酸、接合、缺失、突变、切除等。已完成构筑体后，随后可将其转移至适当的载体中以供根据宿主细胞的转化方式进行的进一步处理。
本发明的重组DNA分子通常包括可选择的标记，从而可能从未经转化的细胞中轻易地鉴别经转化细胞并加以选择。所述标记的实例包括(但不限于)新霉素磷酸转移酶(nptII)基因，其赋予卡那霉素抗性。Potrykus等人，Mol.Gen.Genet.199：183-188(1985)。可使用诸如卡那霉素或G418的适当抗生素来选择表达nptII基因的细胞。其它常用的可选择标记包括bar基因，其赋予双丙氨膦(bialaphos)抗性；突变体EPSP合成酶基因(Hinchee等人，Bio/Technology 6：915-922(1988))，其赋予草甘膦抗性；腈水解酶基因，其赋予对溴苯腈的抗性(Stalker等人，J.Biol，Chem.263：6310-6314(1988))；突变体乙酰乳酸合成酶基因(ALS)，其赋予咪唑啉酮或磺酰脲抗性(欧洲专利申请案154,204，1985)；和抗甲胺喋呤(methotrexate)的DHFR基因(Thillet等人，J.Biol.Chem.263：12500-12508(1988))。
另外，载体可包括特定宿主细胞的复制起点(复制子)。所属领域技术人员已知多种原核复制子，且其起到引导原核宿主细胞自主复制和维持重组分子的作用。
载体将优选含有可选择的标记。用于选择经转染植物细胞的多种可选择标记包括(但不限于)在大肠杆菌、根癌农杆菌和其它细菌中培养的抗卡那霉素基因、抗草甘膦基因和四环素或氨比西林(ampicillin)抗性基因。
适于使用微弹轰击(microprojectile bombardment)将本发明的核酸引入单子叶植物中的质粒载体是由以下元件构成：选择性启动子；提供剪接位点以促进基因表达的内含子，诸如Hsp70内含子(PCT公开案WO 93/19189)；和3′多聚腺苷酸化序列，诸如胭脂碱合成酶(nopaline synthase)3′序列(NOS 3′)。Fraley等人，Proc Natl Acad Sci USA 80：4803-4807(1983)。这一表达盒可组装于适于产生大量DNA的高拷贝复制子上。
用于转化双子叶植物的特别有益的基于农杆菌的植物转化载体为质粒载体pMON530(Rogers等人，(1987)Improved vectors for plant transformation：expressioncassette vectors and new selectable markers.In Methods in Enzymology.R.Wu和L.Grossman编辑，第253-277页，San Diego：Academic Press)。质粒pMON530是通过将pMON316的2.3kb StuI-HindII片段(Rogers等人，(1987)Improved vectors for planttransformation：expression cassette vectors and new selectable markers.In Methods inEnzymology.R.Wu和L.Grossman编辑.第253-277页.San Diego：Academic Press)转移至pMON526中而制备的pMON505衍生物。质粒pMON526是其中SmaI位点因XmaI消化、Klenow聚合酶处理和接合而移除的pMON505的简单衍生物。质粒pMON530保留pMON505和CaMV35S-NOS表达盒的所有特性，且现在启动子与多聚腺苷酸化信号之间含有独特的SmaI切割位点。
二元载体pMON505是Ti质粒同源区LIH已经小RK2质粒(mini RK2 plasmid)pTJS75的3.8kb HindIII到SmaI区段置换的pMON200(Rogers等人，1987)的衍生物(Schmidhauser和Helinski.J.Bacteriol.164-155(1985))。这一区段含有使用三亲交配程序(tri-parental mating procedure)结合到农杆菌中的RK2复制起点oriV和转移起点oriT(Horsch和Klee Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：4428-4432(1986))。质粒pMON505保留pMON200的所有重要特征，包括用于插入所需DNA片段中的合成多连接子(syntheticmulti-linker)；用于植物细胞抗卡那霉素的嵌合NOS/NPTII/NOS基因；用于大肠杆菌和根癌农杆菌选择的抗奇放线菌素(spectinomycin)/抗链霉素(streptomycin)决定子；便于对转化体和后代遗传记分的完整胭脂碱合成酶基因；和便于在大肠杆菌中制得大量载体的pBR322复制起点。质粒pMON505含有得自pTiT37胭脂碱型T-DNA的右端的单一T-DNA边界。Southern印记分析已展示，质粒pMON505和其所携带的任何DNA都已整合到植物基因组中，也就是说，完整的质粒为已插入到植物基因组中的T-DNA。整合DNA的一端位于右边界序列与胭脂碱合成酶基因之间，且另一端是介于边界序列与pBR322序列之间。
另一特别有用的Ti质粒盒载体为pMON17227。这一载体在PCT公开案WO 92/04449中得以描述，且含有编码赋予草甘膦抗性的酶的基因(命名为CP4)，其是许多植物优良的选择性标记，包括马铃薯和番茄。使基因与拟南芥EPSPS叶绿体转运肽(CTP2)融合，且通过所选择的启动子驱动表达。
为将经翻译蛋白质分泌到内质网内腔、周质空间或胞外环境中，可将适当的分泌信号并入所表达的多肽中。所述信号对于所述多肽来说可为内源信号，或其可为异源信号。
在一实施例中，以使本文所述的核酸为组织特异性启动子的方式设计本发明的载体，所述启动子可操作地连接到编码所关注的多肽的DNA。在另一实施例中，所关注的多肽为繁殖发育或调控繁殖发育方面所涉及的蛋白质。编码繁殖发育中所涉及的许多蛋白质的多肽包括(但不限于)AGAMOUS(AG)、APETALA1(AP1)、APETAL3(AP3)、PISTILLATA(PI)、LEAFY(LFY)和LEUNIG(LUG)。
在另一实施例中，可操作地连接到启动子的编码序列可编码抑制繁殖发育所涉及的蛋白质的表达或活性的基因产物。举例来说，可将编码消化包围正在发育的花粉粒的胼胝质细胞壁的酶过氧化氢酶的基因可操作地连接到绒毡层优选的启动子，并在花粉成熟前表达，由此破坏花粉的发育。
在另一实施例中，可操作地连接到启动子的编码序列可编码细胞毒素基因产物。举例来说，可使编码barnase的基因可操作地连接到繁殖优选的启动子，并使其在繁殖组织中表达。在另一实施例中，可使用标准分子生物学方法使barnase活性突变。在一实施例中，经突变的barnase与野生型barnase蛋白质相比具有降低的RNA酶活性。在另一实施例中，使具有降低的RNA酶活性的突变barnase可操作地连接到繁殖优选的启动子，并使其在繁殖组织中表达。在又一实施例中，繁殖组织中具有降低的RNA酶活性的突变barnase的表达并不危及营养生长和发育。
在另一实施例中，设计本发明的载体从而使本发明的核酸可操作地连接到编码反义RNA或干预RNA且与编码所关注的多肽的基因对应的核酸，引起目标基因产物的表达减少。在一实施例中，旨在抑制的基因产物为繁殖发育所涉及的蛋白质。使用RNAi抑制基因表达一般在Paddison等人，Genes & Dev.16：948-958(2002)中得以描述，且使用RNAi抑制植物基因的表达特别描述在WO 99/61631中，所述两种专利文献都以引用的方式并入本文中。
使用反义核酸技术(antisense technology)来降低或抑制特定植物基因的表达已描述在(例如)欧洲专利公开案第271,988号中。基因表达的降低导致植物表型改变，在总可见表型差异水平上，例如导致番茄果实中番茄红素合成的缺乏，引起产生黄色而非红色果实；或在更细微的生物化学水平上，例如导致番茄果实成熟期间多聚半乳糖醛酸酶的量改变和胶质解聚合减少。Smith等人，Nature，334：724-726(1988)。Smith等人，PlantMol.Biol.，14：369-379(1990)。因此，已证实反义RNA可用于达成植物中基因表达的减少。
在制造本发明的植物的方法的一个实施例中，将能够在植物内转录得到反义RNA转录本的外源DNA引入植物中，例如引入植物细胞中。举例来说，可通过关于基因序列的启动子倒转基因序列方向来制备外源DNA。植物细胞中外源DNA转录会产生关于所述基因为“反义”的胞内RNA转录本。
本发明还提供包含本发明的载体的宿主细胞。如本文所使用，宿主细胞是指最终表达编码产物的细胞。因此，宿主细胞可为个体细胞、细胞培养物或作为有机体的部分的细胞。宿主细胞也可为胚、胚乳、精子或卵细胞或受精卵的一部分。
可通过此项技术中已知的将重组载体DNA引入目标宿主细胞中的标准程序将本发明的载体引入宿主细胞中。所述程序包括(但不限于)转染、感染、转化、正常摄取、电穿孔、基因枪和农杆菌。此项技术中已知将外来基因引入植物中的方法，且所述方法可用于将本发明的基因构筑体插入植物宿主中，所述方法包括生物和物理植物转化方案。例如，参看Miki等人，1993，″Procedure for Introducing Foreign DNA Into Plants″，In：Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，Glick和Thompson编辑，CRC Press，Inc.，Boca Raton，第67-88页。所选择的方法随宿主植物而变化，且包括化学物质转染方法，诸如磷酸钙；微生物介导的基因转移，诸如农杆菌(Horsch等人，Science 227：1229-31，(1985))；电穿孔；微注射；和基因枪轰击。
因此，本发明还提供植物或植物细胞，其包含本发明的载体。在一实施例中，所述植物为被子植物或裸子植物。在另一实施例中，所述植物是选自桉树属和其杂交物，和松属。或者，所述植物可选自北美短叶松(Pinus banksiana)、爱琴海松(Pinus brutia)、加勒比松(Pinus caribaea)、砂地松(Pinus clausa)、小干松(Pinus contorta)、加州松(Pinuscoulteri)、萌芽松(Pinus echinata)、阿富汗松(Pinus eldarica)、(Pinus ellioti)、黑材松(Pinus jeffreyi)、糖松(Pinus lambertiana)、马尾松(Pinus massoniana)、山白松(Pinusmonticola)、欧洲黑松(Pinus nigra)、长叶松(Pinus palustrus)、海岸松(pinus pinaster)、西黄松(Pinus ponderosa)、辐射松(Pinus radiata)、美加红松(Pinus resinosa)、刚松(Pinusrigida)、晚松(Pinus serotina)、北美乔松(Pinus strobus)、樟子松(Pinus sylvestris)、火炬松(Pinus taeda)、北美二针松(Pinus virginiana)、太平洋银冷杉(Abies amabilis)、香脂冷杉(Abies balsamea)、科罗拉多冷杉(Abies concolor)、北美冷杉(Abies grandis)、高山冷杉(Abies lasiocarpa)、加州红冷杉(Abies magnifica)、壮丽冷杉(Abies procera)、美国扁柏(Chamaecyparis lawsoniona)、黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis)、美国尖叶扁柏(Chamaecyparis thyoides)、雪松(Juniperus virginiana)、欧洲落叶松(Larix decidua)、北姜藩叶松(Larix laricina)、日本落叶松(Larix leptolepis)、美国西部落叶松(Larixoccidentalis)、西比利亚落叶松(Larix siberica)、美国西部肖楠(Libocedras decurrens)、欧洲云杉(Picea abies)、恩氏云杉(Picea engelmanni)、白云杉(Picea glauca)、黑云杉(Picea mariana)、北美云杉(Picea pungens)、红云杉(Picea rubens)、西加云杉(Piceasitchensis)、花旗松(Pseudotsuga menziesii)、巨杉(Sequoia gigantea)、北美红杉(Sequoiasempervirens)、落羽杉(Taxodium distichum)、加拿大铁杉(Tsuga canadensis)、西部铁杉(Tsuga heterophylla)、高山铁杉(Tsuga mertensiana)、北美香柏(Thuja occidentalis)、北美乔柏(Thuja plicata)、白桉(Eucalyptus alba)、橙桉(Eucalyptus bancroftii)、葡萄桉(Eucalyptus botryoides)、苹果桉(Eucalyptus bridgesiana)、尾叶桉(Eucalyptuscalophylla)、赤桉(Eucalyptus camaldulensis)、柠檬桉(Eucalyptus citriodora)、甜叶桉(Eucalyptus cladocalyx)、南澳雪桉(Eucalyptus coccifera)、Eucalyptus curtisii、丰桉(Eucalyptus dalrympleana)、剥皮桉(Eucalyptus deglupta)、大桉(Eucalyptus delagatensis)、红桉(Eucalyptus diversicolor)、邓恩桉(Eucalyptus dunnii)、红花桉(Eucalyptus ficifolia)、巨桉(Eucalyptus grandis)、蓝桉(Eucalyptus globulus)、棒头桉(Eucalyptusgomphocephala)、加利桉(Eucalyptus gunnii)、Eucalyptus henryi、银顶纤皮桉(Eucalyptuslaevopinea)、毛皮桉(Eucalyptus macarthurii)、大咀桉(Eucalyptus macrorhyncha)、斑皮桉(Eucalyptus maculata)、赤桉(Eucalyptus marginata)、Eucalyptus megacarpa、蜜味桉(Eucalyptus melliodora)、Eucalyptus nicholii、亮果桉(Eucalyptus nitens)、Eucalyptusnova-angelica、斜叶桉(Eucalyptus obliqua)、西方桉(Eucalyptus occidentalis)、Eucalyptusobtusiflora、奥里桉(Eucalyptus oreades)、雪桉(Eucalyptus pauciflora)、多枝桉(Eucalyptuspolybractea)、王桉(Eucalyptus regnans)、树脂桉(Eucalyptus resinifera)、大叶桉(Eucalyptusrobusta)、野桉(Eucalyptus rudis)、柳叶桉(Eucalyptus saligna)、红皮铁桉(Eucalyptussideroxylon)、Eucalyptus stuartiana、细叶桉(Eucalyptus tereticornis)、毛叶桉(Eucalyptustorelliana)、丽桉(Eucalyptus urnigera)、尾叶桉(Eucalyptus urophylla)、多枝桉(Eucalyptusviminalis)、Eucalyptus viridis、Eucalyptus wandoo和Eucalyptus youmanni。具体说来，转基因植物可为以下种类：巨桉、辐射松、火炬松(Pinus taeda L)(火炬松)、钻天杨(Populusnigra)、三角杨(Populus deltoides)、柚木(Tectona grandis)或马占相思(Acacia mangium)。
除植物的一般含义之外，预期术语“植物”还意谓植物的果实、种子、花、球果等。本发明的植物可为直接转染体，表明诸如通过农杆菌将载体直接引入植物中；或所述植物可为经转染植物的后代。第二代或继代植物可通过有性繁殖(即，传粉)产生，或可不通过其产生。而且，植物可为配子体(单倍体阶段)或孢子体(二倍体阶段)。
本发明还提供一种控制植物繁殖发育的方法，其包含栽培包含本发明的载体的植物或种子。诱导或维持本发明的植物或种子生长或萌发的适当栽培具有种属特异性，且在此项技术中的普通技术范围内。关于栽培的环境可为促进植物或种子生长或萌发的任何地方。而且，栽培也可包括以下步骤，诸如(但不限于)提供胁迫处理(stress treatment)(例如，脱氮、热休克、低温、蔗糖脱除)，其可诱导胚发生(embyrogenesis)。
本发明另外提供经分离的调控元件，其与转录因子结合并能够调控组织优选或组织特异性表达。通过调控元件所赋予的调控程度可为完全的，表明在无转录因子的情况下转录不可检测；或可为部分的，表明在转录因子存在下转录增强。在一实施例中，使至少一种调控元件可操作地连接到异源启动子以提供复合启动子。所述复合启动子优先或特异性在繁殖组织中表达。如本文所使用，异源启动子是含义相对于调控元件来说的短语。如果在自然环境中调控元件和启动子彼此无关，那么认为启动子相对于调控元件为异源的。通常，启动子区内调控元件的确切定向将不会影响其活性。而且，当将调控元件插入到异源启动子区中时，其可正常起作用。因此，举例来说，可将繁殖优选的调控元件从其内源启动子移除，且可将其插入到异源启动子区中以赋予繁殖特异性或优先选择性。异源启动子可为(例如)最小CaMV 35S启动子。在植物细胞中直接表达且适于修饰成最小启动子的启动子包括花椰菜病毒(CaMV)35S启动子(Jefferson等人，EMBOJ.，6：3901-07(1987))；稻子肌动蛋白启动子(rice actin promoter)(McElroy等人，PlantCell，2：163-71(1990))；玉米泛素-1启动子(maize ubiquitin-1 promoter)(Christensen等人，Transgenic Research，5：213-18(1996))；和胭脂碱合成酶启动子(Kononowics等人，Plant Cell 4：17-27(1992))。
为制备本发明的核酸，由辐射松和火炬松使用多种限制性核酸内切酶将基因组消化成不连续片段来制造基因组文库。基因组文库可类似地由获得组织选择性启动子所需的任何植物种类构筑。根据Clontech有关其Genome WalkerTM系统(Clontech，Palo Alto，CA)的使用所提供的程序，使接头与每一所述基因组序列接合。随后，使用接头特异性引物和“基因特异性引物”以PCR扩增启动子序列。或者，这一PCR扩增步骤视情况可由以引用方式并入本文的美国专利第5,565,340号和第5,759,822号中所述的方法进行，以得到具有较长长度和最小背景的反应产物。使用这一通用PCR扩增方法，通过选择“基因特异性引物”来管理本发明的启动子的鉴定和其作为组织选择性启动子的鉴定。
基因特异性引物为在所关注的组织中以高水平表达的任何经转录的序列。在本发明中，基因特异性引物为在繁殖组织中以高水平表达的mRNA的片段，或其与在繁殖组织中以高水平表达的mRNA互补。在一实施例中，基因特异性引物是通过已知在特定繁殖组织类型中特异性表达的其同源基因选择。特别关注的基因为在特定繁殖组织中以高水平表达的基因，其通常指示对应启动子的繁殖优选活性。
表达序列标签(EST)提供另一基因特异性引物来源。EST是存在于给定文库中的对应mRNA的cDNA片段。可电子搜寻任何植物EST数据库以发现与已知在所需组织类型中特异性表达的基因的区段相同的EST(“计算机筛选(in silico screening)”)。因此，这些EST将提供基因特异性引物以在给定基因组文库中扩增对应基因的启动子。经扩增的基因启动子无需来自获得EST数据库的相同物种。所需要的只是EST与所关注的基因启动子具有足够的序列相似性以充当所述基因的目标区段PCR扩增的引物。
另一鉴别组织特异性启动子的方法是检测在一种组织类型中表达而在另一种中不表达的mRNA(暗示其是从组织特异性启动子转录)。举例来说，可在此基础上通过消减杂交(subtractive hybridization)来辨识mRNA群体。一种此类适当消减杂交技术为Clontech所述的PCR-SelectTM。
另外，可通过具有放射性标记探针的植物组织薄片的原位杂交来确定组织特异性mRNA的分布。随后，使用对特定组织类型放射性染色的探针以通过基因组文库的Southern分析使用下文所述的方法检测与mRNA有关的启动子。所有上文所提及的技术都需要由所关注的组织(在这一情况下为繁殖组织)制备mRNA文库。cDNA文库可由从木本植物种类分离的繁殖组织制得。举例来说，可从辐射松和火炬松分离雄芽(malebud)和雌芽。简单说来，使用标准技术分离全部RNA，且随后分离poly(A)RNA并进行反转录以构筑繁殖优选组织的cDNA文库。可使用Strategene cDNA合成和GigapakIIGoldTM包装试剂盒在λZAP-XR载体中构筑cDNA文库。接着，可使用基因特异性探针和识别启动子5′端序列的引物通过PCR从所述cDNA文库中分离繁殖特异性启动子。可通过上述计算机方法或(如果已知)基于mRNA序列通过设计特异性探针获得基因特异性探针。而且，可合成与所需目标基因的5′UTR互补的引物。或者，可由所编码的蛋白质的部分氨基酸序列设计引物，即所谓的简并引物。
分离所关注的启动子后，可使用各种方法表征其组织特异性表达模式和启动子强度。一种常用方法是使启动子可操作地连接到易于分析的报告基因。举例来说，已使繁殖优选启动子可操作地连接到编码β-葡糖苷酸酶(GUS)的基因。Lacombe等人，Plant J.23：663-76(2000)。可使用众所周知的方法制得适当的表达构筑体。
植物的转化可通过包括农杆菌介导的转化的多种适当技术中的任一种实现，如美国专利第6,051,757号中所述。此项技术中已知转化树的其它方法，如美国专利第5,681,730号中所例示，所述专利公开加速的裸子植物体细胞胚粒子转化方法。其它转化方法包括微弹轰击(Klein等人，Biotechnology 6：559-63(1988))；电穿孔(Dhalluin等人，Plant Cell4：1495-1505(1992))；和聚乙二醇处理(Golovkin等人，Plant Sci.90：41-52(1993))。此外，美国专利第6,187,994号中公开重组酶辅助的将表达构筑体插入到植物基因组内的特异性、选择性位点中。上文所提及的所有专利和公开案都以引用的方式并入本文中。
可通过任何适当的方法将本发明的DNA分子插入到植物基因组中。适当的植物转化载体包括得自根癌农杆菌的Ti质粒的载体，以及例如Herrera-Estrella等人，Nature 303：209(1983)、Bevan Nucleic Acids Res.12(22)：8711-8721(1984)、Klee等人，Bio/Technology 3(7)：637-642(1985)和欧洲专利公开案120,516所公开的载体。除得自农杆菌的Ti或诱根(root-inducing)(Ri)质粒的植物转化载体外，还可使用其它方法将本发明的DNA构筑体插入到植物细胞中。所述方法可涉及(例如)使用脂质体、电穿孔、增加游离DNA摄取的化学制品、通过微弹轰击传递游离DNA和使用病毒或花粉进行转化。也可将DNA插入到叶绿体基因组中(Daniell等人，Nature Biotechnology 16：345-348(1998))。
当获得适量含有所关注的核酸的细胞(或原生质体)时，使所述细胞(或原生质体)再生成为整个植物。有关再生步骤的方法的选择并不严格，且适当方案可用于来自下述物质的宿主：豆科(Leguminosae)(紫花苜蓿、大豆、苜蓿等)、伞形科(Umbelliferae)(胡萝卜、芹菜、防风草)、十字花科(Cruciferae)(甘蓝、萝卜、卡诺拉(canola)/油菜籽等)、葫芦科(Cucurbitaceae)(甜瓜和黄瓜)、禾本科(Gramineae)(小麦、大麦、稻子、玉米等)、茄科(Solanaceae)(马铃薯、烟草、蕃茄、胡椒)、各种繁殖作物(诸如向日葵)和坚果树(nut-bearing tree)(诸如杏树、腰果树、胡桃和美洲山核桃树(pecan))。例如，参看Ammirato等人，(1984)Handbook of Plant Cell Culture-Crop Species.Macmillan Publ.Co.；Fromm，M.，(1990)UCLA Symposium on Molecular Strategies for CropImprovement，1990年4月16-22日，Keystone，CO.；Vasil等人，Bio/Technology 8：429-434(1990)；Vasil等人，Bio/Technology 10：667-674(1992)；Hayashimoto等人，Plant Physiol.93：857-863(1990)；和Datta等人，(1990)。
包含启动子和报告基因的载体包括选择经所述载体成功转化的植物细胞的机制，其可为(例如)卡那霉素抗性。转化体中GUS基因的存在可使用GUS特异性PCR引物(Clontech，Palo Alto)通过PCR方法确认。经转化植物细胞后代中卡那霉素抗性的隔离可与Southern分析组合使用以测定停泊已稳定插入的载体的位点数。随后，由报告基因表达的数量推断启动子表达的时间和空间模式，如Jefferson等人，EMBO J.6：3901-07(1987)中所述。一般说来，GUS的表达是以组织化学方法在植物组织薄片中测定，所述植物组织薄片首先在90％丙酮中且随后在含有GUS底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-葡糖醛酸(X-Gluc)的缓冲溶液中固定。GUS表达产物的存在是通过与X-Gluc的比色反应指示。
举例来说，可通过特异性结合繁殖组织中的转录因子的调控元件的存在使繁殖特异性表达能够进行。繁殖特异性调控元件与繁殖优选转录因子之间的相互作用视调控元件碱基对分组与转录因子的氨基酸残基之间的对准而定。同样，例如，可通过特异性结合绒毡层组织中的转录因子的调控元件的存在使绒毡层特异性表达能够进行。可以其它碱基对取代不与所结合的转录因子相互作用的碱基对，同时保持调控元件特异性结合组织特异性转录因子的全部能力。
将启动子鉴定为组织优选或组织特异性启动子后，可使用各种方法鉴别和表征影响组织优选或组织特异性启动子活性的调控元件。在一种方法中，在5′端顺次截断启动子区，并使一连串经截断的启动子各自可操作地连接到报告基因。当缺失调控元件时，通过报告基因组织特异性表达的损失来推断对启动子活性的影响。另外，可将假定的调控元件插入到含有诸如CaMV 35S最小启动子的最小启动子(Keller等人，Plant Mol.Biol.26：747-56)的表达构筑体中，以确定所述假定调控元件是否赋予组织特异性表达。最小启动子仅含有启动子活性绝对需要的元件，诸如RNA聚合酶结合位点。阐明假定调控元件的其它实例是由有关同等地调控编码1-苯基-丙氨酸脱氨酶(PAL)和4-香豆素辅酶A接合酶(4CL)的基因转录的组织特异性调控元件的研究提供。Hatton等人，Plant J.7：859-76(1995)；Leyva等人，Plant Cell 4：263-71(1992)；Hauffe等人，Plant J.4：235-53(1993)；Neustaedter等人，Plant J.18：77-88(1999)，所有文献都以引用的方式并入本文中。
本发明启动子的功能性变异体或片段
本发明启动子的其它变异体或片段为具有散布于整个序列中的修饰的变异体或片段。如本文所使用，功能性变异体或片段为具有与参考核酸具有至少约70％同一性的核酸序列但仍使编码产物能够组织特异性表达的核酸。功能性变异体的组织特异性或优选必须针对与参考核酸相同的组织。然而，即使所述功能性变异体不与参考核酸一样具有优先选择性或特异性，仍认为所述变异体为如本文所使用的功能性变异体。在一实施例中，功能性变异体或片段的序列与参考核酸具有至少约75％同一性。在其它实施例中，功能性变异体或片段的序列与参考核酸具有至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
可通过从5′端相继缺失残基或从3′端缺失5′UTR序列而进行能够产生功能性变异体的修饰。或者，可对内部残基进行修饰。不影响启动子区功能的修饰很可能为不影响转录因子结合的修饰。本发明所涵盖的修饰还包括以本发明启动子等位基因变异体(allelicvariant)形式天然存在的修饰。
制造本发明的核酸的方法
可通过使用众所周知的合成技术、标准重组方法、纯化技术或其组合获得本发明的核酸。举例来说，可使用固相亚磷酰胺三酯方法(Beaucage等人，Tetra.Letts.22：1859-1862(1981))、自动化合成器(Van Devanter等人，Nucleic Acids Res.12：6159-6168(1984))或美国专利第4,458,066号的固体载体方法通过直接化学合成来制备本发明的经分离聚核苷酸。化学合成一般产生单链寡核苷酸，其可通过与互补序列杂交或通过使用单链作为模板进行的聚合反应而转变成双链寡核苷酸。同样，可通过接合较短序列获得较长序列。
或者，可使用相互引发的寡核苷酸通过重组方法获得本发明的核酸。例如，参看Ausubel等人，(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons，Inc.1990)。同样，参看Wosnick等人，Gene 60：115(1987)；和Ausubel等人，(编辑)，ShortProtocols in Molecular Biology，第3版，(John Wiley & Sons，Inc.1995)。已确立的使用聚合酶链反应的技术提供合成至少2千碱基长的聚核苷酸的能力。Adang等人，Plant Mol.Biol.21：1131(1993)；Bambot等人，PCR Methods and Applications 2：266(1993)；Dillon等人，″Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes，″in Methods In Molecular Biology，第15卷：PCR Protocols：Current Methods AndApplications，White(编辑)，第263-268页，(Humana Press，Inc.1993)；Holowachuk等人，PCR Methods Appl.4：299(1995)。
使用本发明的核酸的方法
本发明的核酸可用于变化植物的特性。可使核酸可操作地连接到所关注的基因以增加繁殖组织中所见的分子的含量。另外，所关注的基因可抑制繁殖发育，由此赋予植物不育性。
所述经操纵的表达的一个主要目标为繁殖发育。出于上述原因，通过基因去除所实现对繁殖发育的调控相当值得关注。举例来说，已在绒毡层优选启动子的控制下使用细胞毒素barnase分子来调控繁殖发育。欧洲专利公开案344,029。
举例来说，可使用具有降低的RNA酶活性的突变体barnase基因调控繁殖发育。在一实施例中，可使突变体barnase基因可操作地连接到启动子，从而使barnase基因的表达可对营养组织造成极低损害或无损害，而突变体barnase可为繁殖去除提供适当的RNA酶活性。
参考下列实例由此一般描述将更易于理解本发明，所述实例是借助说明提供且不打算限制本发明。
实例
实例1
分离繁殖优选启动子
可从基因组文库和cDNA文库分离繁殖优选植物启动子。使用繁殖优选启动子序列作为探针，可分离假定的繁殖优选启动子序列。举例来说，可将来自辐射松的AGAMOUS(AG)启动子用作鉴别其它繁殖优选启动子序列的探针。
举例来说，基因组DNA是从火炬松的雄芽分离的。分离雄芽DNA后，将辐射松AG1序列用作筛选经分离的雄芽基因组DNA的探针。使用基于PCR的筛选方法，分离出两种假定的火炬松AG启动子序列，称为LPAG1(SEQ ID NO：1)和LPAG2(SEQ ID NO：2)。每一经克隆的LPAG启动子都为约1400bp，包括600bp5′未翻译区，其含有139bpLPAG1或LPAG2基因的第一个内含子。
使用“基因组步行(Genome Walker)”试剂盒(Clontech，Palo Alto，CA)来克隆启动子。这是一种基于PCR的方法，其需要构筑四种PCR引物，其中两种必须具有基因特异性。一般将基因特异性引物设计到基因的5′UTR内。扩增片段且随后将其克隆到GUS报告基因之前具T尾(T-tailed)的载体中。
实例2
确定启动子组织特异性的方法
如实例1所述鉴别并克隆启动子后，使启动子可操作地连接到报告基因以确定启动子具有活性的组织的类型。出于此目的，通过电穿孔将含有本发明启动子的构筑体转化到根癌农杆菌中。简单说来，将40μl稀AgL-1感受态细胞放置到冰上，并使其与约10ng含有启动子序列的pART27载体接触。在以下参数下进行电穿孔：
电阻＝129欧姆
充电电压＝1.44kV
电场强度＝14.4kV/cm
脉冲持续时间＝5.0ms。
电穿孔后，加入400μl YEP液体培养基，并在室温下使细胞恢复1小时。随后，在6000rpm下使细胞离心3min，并将其再悬浮到约50μl YEP中。将细胞样本展布到YEPKan50/Rif50板的表面上，用石蜡膜(parafilm)密封，并在29℃下培育2天供菌落生长。
通过农杆菌介导的叶组织转化，用所关注的构筑体转化烟草(Nicotiana tabacum)植物(Burow等人，Plant Mol.Biol.Rep.8：124-139，1990)。
随后，分析经成功转化的植物中可操作地连接的报告基因的表达。将叶、杆、根和繁殖区浸到染色溶液(50mM NaPO4 pH7.2、0.5％ Triton X-100、1mM X-葡糖苷酸、放线菌酮盐(cycloheximide salt)(Ducheffa))中。施加真空两次历时5min以使染色溶液渗透组织。随后，在37℃下震荡组织整夜以使颜色发展。在三或四个时间点时检查组织以检查染色发展，且如果样本展示出早期的发展，那么用70％乙醇使一片组织脱去染色。
如表1所示，GUS定位证实所公开的经分离的核苷酸序列使报告基因优先在诸如绒毡层的繁殖组织中表达。
如实例6所示，当腋芽(axilliary bud)的营养生长受到抑制且营养芽和繁殖芽的转变极快时，在初生花序(primary inflorescence)存在下，预期繁殖优选启动子在营养茎尖(vegetative tip)中表达。
表1：植株原位法(in planta)GUS繁殖表达
Figure A20058003931000421
如下文更详细地描述，“PRMC2”启动子构筑体包含可操作地连接到barnase突变体的来自辐射松的繁殖优选启动子，尤其PrMC2.400-1和PrMC2.400-3的H102E。在经PrMC2.400启动子转化的烟草花药中尚未观察到GUS表达。因此，克隆同框(in-frame)PrMC2.400启动子以供去除构筑体中使用并将其用于上述实验中。
实例3
使用繁殖特异性启动子的方法
发现具有适当组织特异性和发育模式表达的启动子后，可使用这一启动子来调控转基因植物中的所需特性。在一实施例中，将绒毡层优选的启动子用于调控植物的繁殖发育。在本实例中，使本发明的绒毡层优选启动子可操作地连接到编码细胞毒素蛋白质的基因。举例来说，可使绒毡层优选启动子可操作地连接到编码barnase的基因。繁殖优选组织(诸如绒毡层)中barnase的表达可导致花粉去除。欧洲专利公开案344,1990。
为构筑具有已去除的雄性繁殖发育的转基因植物，使barnase cDNA片段以适当方向可操作地连接到本发明的繁殖特异性启动子和胭脂碱合成酶3′终止子。将整个构筑体作为限制性片段插入到二元载体pBI101.1(Clontech，Palo Alto，CA)中。对于烟草或白杨转化来说，分别使载体电穿孔到根癌农杆菌菌株LBA4404或C58pMP90。一般参看No等人，Plant Science 160：77-86(2000)。根据Leple等人，Plant Cell Rep.11：137-141(1992)的程序，将如上文所述的烟草叶圆片或白杨杆断片浸入到如上文所述的农杆菌培养物中。测试抗卡那霉素转化体的活性，通过Southern分析来测定转基因拷贝的数量，且使适当的转化体生根并将其转移到温室中。
实例4
制造并选择已减弱的细胞毒素酶的方法
Barnase E73G和Barnase F106S的合成
通过随机PCR突变发生获得barnase突变体F106S和E73G。使PrAG启动子可操作地连接到野生型barnase编码区，且进行三次PCR反应，从而以barnase翻译密码子置换PrAG翻译起始密码子ATG。在第一次PCR中，使5′引物PrAGKpn(5′-GGTTTGGTACCTAACTTGCC-3′，SEQ ID NO：27)与PrAG启动子的-199位至-179位关于其翻译起始ATG位置退火，而3′引物PrAG-7：
(5′-GTGTTGATAACCTGTGCCATGATTTGTACACAAAATTTCCG-3′，SEQ ID NO：28)
与包括翻译起始ATG的-21至+3位退火。PrAG-7引物具有与barnase编码区5′互补的额外18个碱基。PCR混合物含有50ng模板DNA(pWVCZ3 DNA)、200μM dNTP、1.5mM MgCl2和0.5μl Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer)。在95℃下使DNA变性20秒，在55℃下使其再退火30秒，并在72℃下培育60秒。将这一PCR循环重复25次。PCR后，凝胶纯化220bp产物。
在第二次PCR中，使5′引物PrAG-8：
(5′-CGGAAATTTTGTGTACAAATCATGGCACAGGTTATCAACACG-3′，SEQ ID NO：29)
与barnase编码区的5′退火，且这一引物具有与PrAG启动子3′互补的21个额外碱基。使3′引物3Barn(GGTTCTCGAGTTTCACGTTAACTGGCTAG，SEQ ID NO：30)与barnase DNA的3′退火，并携带供克隆的Sac I位点。PCR混合物含有50ng模板DNA(pWVR14)、200μM dNTP、1.5mM MgCl2和0.5μl Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer)。在95℃下使DNA变性20秒，在55℃下使其再退火30秒，并在72℃下培育60秒。将这一PCR循环重复25次。PCR后，凝胶纯化462bp产物。
在第三次PCR中，5′引物为PrAGKpn且3′引物为3Barn，而DNA模板为等量的第一次PCR与第二次PCR产物(各自约40ng)的混合物。第三次PCR的扩增产物为640bp，其为PrAG的3′与barnase编码区之间的融合。第三次PCR后，用Kpn I和Sac I消化PCR片段，并使其与已携带PrAG启动子的质粒(pUC19)接合，从而在接合后通过全长PrAG启动子驱动barnase。
通过电穿孔将接合混合物引入大肠杆菌中，并使经转化的菌落在含有75μg/ml氨比西林的LB琼脂上生长。从两个菌落中提取质粒，且以限制性酶消化来确认PrAG::barnase插入物的存在。对质粒DNA测序以确认其在barnase编码区中都具有突变。
已认识到，在LB培养板上生长的所有菌落都含有突变体形式的barnase，且大部分突变都已废除barnase活性。然而，如LB培养板上较小尺寸的菌落所指示，部分突变会降低barnase的活性。选择约100个菌落，并将其培育到含有75μg/ml氨比西林的1ml LB液体中。在37℃下培养整夜后，比较培养物中的细胞密度，且选择5份具有显著较低细胞密度的培养物。低细胞密度指示barnase具有活性，但具有小得多的毒性。从5份大肠杆菌培养物中纯化质粒，并将其再引入到大肠杆菌中以确认所引入的质粒确实在LB琼脂板上产生较小尺寸的菌落，表明质粒具有减弱的barnase活性。重复将质粒再引入到大肠杆菌中三次。对已确认的质粒测序，且结果表明，从大肠杆菌培养物提取的质粒29-S在barnase编码区73位处谷氨酸的密码子中含有单核苷酸取代(A→G)，导致谷氨酸变为甘氨酸。这一barnase突变体称为barnase E73G(SEQ ID NO.11)。从大肠杆菌培养物提取的质粒43-S在barnase编码区106位处苯丙氨酸的密码子中含有单核苷酸取代(T→C)，导致苯丙氨酸变为丝氨酸。这一barnase突变体称为barnase F106S(SEQ ID NO.12)。
Barnase F106S分析
为分析F106S毒性，如上文实例2所述，用具有PrAG启动子的构筑体转化烟草植物，所述启动子可操作地连接到编码突变体barnase F106S的基因。由于突变体barnaseF106S的表达是致死的，所以并无可见的烟草转化体产生。这些结果表明，需要例如可诱导雄性不育性而对营养生长无不利影响的已减弱的barnase。
Barnase E73G分析
基于大肠杆菌中毒性筛选的结果，选择barnase突变体E73G用于繁殖去除。大肠杆菌中barnase E73G的表达导致低毒性水平。具体说来，barnase E73G抑制大肠杆菌在LB液体培养基中和LB固体板上的生长。尽管不能从这一生物筛选获得barnase突变体降低的RNA酶活性(毒性)的值，但这些结果仍表明E73G具有减弱的RNA酶活性。
有关barnase E73G中barnase活性减弱的另一证据可见于barnase E73G与F106S之间的比较研究。在比较中，barnase F106S引起比barnase E73G显著高的大肠杆菌毒性。这些结果表明，barnase F106S具有比barnase E73G高的RNA酶活性。
Barnase H102E
基于有关相关酶barnase中的对应突变具有约2％天然酶活性的报告，选择barnaseH102E突变。Yakovlev等人，FEBS Lett.354：305-306(1994)。如下文实例5中所述，barnaseH102E具有减弱的活性。在这一突变体中，组氨酸102的密码子经谷氨酸密码子取代。
Barnase区段的定向突变发生利用包含野生型barnase编码区的现存质粒pWVR14。Barnase的这一先验克隆使用引物BAR5NCO(5′-TGACAACCATGGCACAGGTTATCAACACGTTTGAC-3′，SEQ ID NO：31)和BAR3MFE(5′-AAAGTGCAATTGACCGATCAGAGTTTGAAG-3′，SEQ ID NO：32)以扩增质粒pMT416的barnase盒的整个编码区。Hartley，R.W.J.Mol.Biol.202：913-915(1988)。用NcoI消化经扩增的片段，并将其克隆到已制备的具有一个NcoI端和一个平端的载体中。所得质粒pWVR14将barnase区段放到启动子和SEPALLATA1基因(SEP1，以前称为AGL2)5′-UTR的相邻处，且突变发生程序利用所述启动子序列。使用引物AGL2PB(5′-TTTCACAACCTCCACACACTT-3′，SEQ ID NO：33)和BARH2E(5′-GTAAAGGTCTGATACTCGTCCGTTG-3′，SEQ ID NO：34)来扩增编码区的5′部分和邻接启动子区段。使用引物BAR5NCO和BAR3MFE扩增野生型barnase盒。扩增后，使用凝胶电泳和QIAEX凝胶纯化试剂盒(QIAGEN)来纯化分离片段和引物与PCR试剂。使约100ng每一片段与50μl反应物中的1×Perkin Elmer Taq缓冲液、1.6mM MgCl2、0.10mM各dNTP和0.5μl Perkin Elmer Taq DNA聚合酶组合，且重复使混合物在95℃下变性、在50℃下再退火和在72℃下培育(5个循环)，以便使包含一部分SEP1启动子和完整barnase编码区的0.75kb片段延长。将10μl延长反应物加入到50μl含有20pmol引物AGL2PB和BAR3MFE的每一者、1×PCR缓冲液、1.6mM MgCl2、0.250mM各dNTP和0.5μl Taq DNA聚合酶中，并且再执行七次循环，从而进一步扩增所述0.75kb的片段。用NcoI消化片段，并对barnase区段进行凝胶纯化，且用NcoI和平端将其接合到载体中。通过序列分析来验证正确的突变。在诸如组装pWVR220的后续工作中，使用引物BAR5NCO和BAR3SAC(5′-GAAGAAGAGCTCTTGACCGATCAGAGTTTGAAG-3′，SEQID NO：35)扩增全长barnase H102E片段，用NcoI和SacI消化并加以纯化。由于需要在翻译起始密码子处需要具有NcoI位点，所以引物BAR5NCO中包括ATG后紧接着的额外丙氨酸密码子。这导致实际最终编码区中密码子103处His成为Glu的突变。
基于有关相关酶barnase中的对应突变具有约20％天然酶活性的报告，选择barnaseK27A突变。Yakovlev等人，FEBS Lett.354：305-306(1994)。另一报告表明，barnase K27A突变体相比天然酶具有降低的活性。Mossakowska等人，Biochemistry 28：3843-3850(1989)。变化barnase编码区，从而使赖氨酸27的密码子经丙氨酸密码子取代。使用PCR同时实现对barnase区段的扩增和定向突变。使用引物BAR5NCO(5′-TGACAACCATGGCACAGGTTATCAACACGTTTGAC-3′，SEQ ID NO：31)和BARK27AR(5′-TGCTTCTGATGCTGTAATGTAATTATCAG-3′，SEQ ID NO：36)来扩增编码区的5′部分，且使用引物BARK27AF(5′-AATTACATTACAGCATCAGAAGCACAAG-3′，SEQ ID NO：37)和BAR3SAC(5′-GAAGAAGAGCTCTTGACCGATCAGAGTTTGAAG-3′，SEQ ID NO：35)来扩增质粒pMT416barnase盒编码区的3′部分。扩增后，纯化分离所述片段与引物和PCR试剂，且随后将其组合。使约100ng每一片段与25μl反应物中的1×Stratagene高盐缓冲液、0.175mM各dNTP和0.25μl TaqPlusLong组合，且重复使混合物在95℃下变性、在50℃下再退火和在72℃下培育(5个循环)，以便使全部编码区延长。将延长反应物加入到75μl含有20pmol引物BAR5NCO和BAR3SAC的每一者、1×Stratagene高盐缓冲液、0.175mM各dNTP和0.75μl TaqPlusLong中，并且再执行十五次循环，从而进一步扩增全长barnase K27A片段。用NcoI和SacI消化所得全长片段，并加以纯化。经突变的编码序列陈述在SEQ ID NO：8中。如上所述，引物BAR5NCO中ATG后紧接着包括额外丙氨酸密码子。这导致实际最终编码区中密码子28处Lys成为Ala的突变。
实例5
大肠杆菌中barnase突变体的毒性分析
通过PCR在PrAG启动子的3′端融合barnase DNA，且将所得PCR片段克隆到pUC19中，并将其引入到大肠杆菌中。在37摄氏度下在补充有80μg/ml氨比西林的LB琼脂上生长整夜(约16小时)后，选择单个菌落，并在1ml含有氨比西林的LB液体中培育。培育整夜后，选择正缓慢生长的大肠杆菌培养物，并提取质粒。将经纯化的质粒再引入到大肠杆菌中，且在37摄氏度下培育整夜后在LB琼脂上获得单个菌落。测量菌落直径，并将其与对照物(由PrAG启动子驱动的具有barnase H102Y插入物的pUC19)相比较。具有barnase突变体的单个菌落的直径为从将质粒引入大肠杆菌中的步骤起重复的三个独立实验的平均值。
通过将所述单个菌落的直径与对照菌落的直径相比较来确定barnase突变体的毒性。如下表2所示，大直径菌落指示无毒性，而小直径菌落表明强毒性。
表2：大肠杆菌中Barnase突变体的毒性
 Barnase突变体构筑体   培养板上的菌落数   菌落直径(mm)   具有经计算直径的菌落的百分数   毒性水平
 对照(*BarnaseH102Y)   245   0.8-1.0   85   无
 Barnase H102E   ＜300   0.9-1.1   85   无
 Barnase E73G   180   0.5-0.8   85   中等
Barnase F106S 320 0.2-0.5 95 高
*Barnase H102Y不具有所报告的RNA酶生物活性。
实例6A
LAPG启动子的组织优选表达
通过实例1所述的程序鉴别和克隆启动子后，使启动子可操作地连接到报告基因以确定启动子具有活性的那些组织类型。为确定LPAG1和LPAG2启动子的组织特异性，如实例2所述，使每一启动子都可操作地连接到GUS报告基因，并将所得构筑体引入烟草植物中。
萼片和花瓣的GUS分析
简单说来，为分析烟草中LPGA1启动子活性的GUS表达，从高度为约2到5mm的未成熟、幼花中移除萼片和花瓣。使用刀片垂直切下中间的心皮，且在37℃下对所得一半心皮(连有2-3片幼雄蕊)染色历时16小时以用于GUS活性分析。对来自每一转基因株的三朵单独花染色，且在70％乙醇中且且随后在95％乙醇中进行脱染色。
幼叶的GUS分析
分析与花相邻的幼叶的GUS表达。对于每一转基因株来说，将三片幼叶切成小正方形(9mm2)，并如上文关于萼片和花瓣所述，在37℃下染色16小时以供GUS活性分析，且随后脱染色。
营养茎尖的GUS分析
从处于两个不同生长阶段的个别植物收集幼茎尖。第一生长阶段的分析涵盖收集烟草植物的茎尖，其中初生顶生花序(primary terminal inflorescence)上30％的花已开放。在这一第一生长阶段分析具有初生顶生花序的茎尖。具有初生顶生花序的茎尖表示从初生杆与初生叶的横断面长出的腋生茎尖(axillary shoot tip)。具有初生顶生花序的每一茎尖为约10至15mm长。
分析第二生长阶段涵盖收集移除初生顶生花序6天后的茎尖。这些茎尖不具有初生顶生花序，且表示从初生杆与初生叶的横断面长出的腋生茎尖。所收集的每一无初生顶生花序的茎尖都为约25至40mm长。
移除茎尖周围大部分的幼叶，且仅使一到三片叶子与茎尖相连。从中间垂直切下分开的茎尖，且在37℃下对所得一半茎尖(仍连有1-3片叶)染色历时16小时以供GUS活性分析。从每一转基因株收集三个茎尖，并加以染色。
如下表3所示，LPAG1启动子优先在雄蕊和心皮(繁殖组织)中具有活性且在叶(营养组织)中未展示活性。
表3：转基因烟草中LPAG1活性的GUS表达分析
  植株编号   雄蕊和心皮   幼叶   当存在初生顶生花序时营养茎尖的分析   当不存在初生顶生花序时营养茎尖的分析
  1   无   无   未测试   未测试
  2   有—中等表达   无   有—中等表达   无
  4   有—强表达   无   有—强表达   有—弱表达
  5   有—中等表达   无   有—中等表达   无
  6   有—中等表达   无   有—中等表达   无
  7   有—中等表达   无   有—中等表达   无
  8   有—中等表达   无   有—中等表达   无
  9   有—强表达   无   有—强表达   有—中等表达
  11   有—弱表达   无   无   无
  12   有—中等表达   无   有—中等表达   有—弱表达
  13   有—中等表达   无   有—弱表达   无
  14   有—强表达   无   有—强表达   有—中等表达
  15   有—弱表达   无   有—弱表达   无
  16   有—强表达   无   有—中等表达   无
  17   有—弱表达   无   有—弱表达   无
  18   有—弱表达   无   有—弱表达   无
如上表3所示，移除初生顶生花序后，茎尖中LPAG1启动子活性降低。在初生花序存在下，腋芽的营养生长受抑制，且营养芽极快转变为繁殖芽。在一些情况下，当腋生枝仅10mm长时，出现花芽。在烟草的繁殖生长期间，养分获取和激素产生会诱导腋生枝中花基因的表达。移除初生顶生花序使烟草植物恢复营养生长，且腋芽的生长不再经历由顶生花强加的抑制。
已观察到，移除初生顶生花序后，当腋生枝为40mm长时，腋芽生长加快，且不存在花芽。因此，在顶生花存在下，腋生枝的分生组织已转变成花分生组织，或中途朝向花分生组织转变，其中诸如LEAFY和AGAMOUS的花基因的表达开启且LPAG1启动子也开启。移除顶生花使腋芽恢复营养生长，且腋生枝分生组织中花基因的表达关闭，且因此LPAG1启动子活性也可能关闭。
实例6B
LPAG1启动子的缺失分析
可使用启动子缺失分析来确定启动子序列内的最小启动子和调控元件。使每一启动子缺失可操作地连接到报告基因，并分析启动子-报告基因构筑体的表达概况。
举例来说，连续缺失LPAG1启动子(SEQ ID NO.1)。简单说来，从LPAG1启动子序列的5′端得到5个连续缺失。每一连续缺失都缺失约160bp，共800bp缺失。以下为有关LPAG1启动子缺失的初步结果的摘要。将5个连续缺失构筑体(称为LPAG1d1-LPAG1d5)引入到松树和烟草中。由于缺失是从LPAG1启动子序列的5′端得到，估计LPAG1d5缺失构筑体将切开LPAG1基因的5′未翻译区，且因此LPAG1启动子序列将不在LPAG1d5构筑体中。
用启动子缺失构筑体转化松树和烟草植物后，如实例2所述，分析经转化胼胝体的LPAG1启动子活性。如实例5所述确定GUS表达分析。LPAG1启动子缺失实验的结果概括于下表4中。
表4：LPAG1的启动子缺失分析
 构筑体   启动子长度   松树胼胝体的相对活性   烟草花的相对活性
 LPAG1   1400   强   强
 LPAG1d1   1240   与全长启动子相同   与全长启动子相同
 LPAG1d2   1080   与全长启动子相同   与全长启动子相同
 LPAG1d3   920   与全长启动子相同   与全长启动子相同
 LPAG1d4   760   与全长启动子相同   极低的GUS检测活性
 LPAG1d5   600   未检测到GUS染色活性   未检测到GUS染色活性
基于表4所示的GUS表达概况，结果清楚地表明存在于LPAG1d3中但不存在于LPAG1d4中的核苷酸序列(约150bp)对于在烟草花雄蕊和心皮中具活性的LPAG1启动子至关重要，但由于LPAG1d4在胼胝体中仍具有类似GUS活性，所以相同序列对于在松树胼胝体中具活性的LPAG1启动子不太重要，如GUS染色和MUG分析所示。
实例7
使用具有LPAG1和PrAG启动子的构筑体去除松树雄球花和雌球花的方法
基于实例6表4所示的结果，可将LPAG1和PrAG启动子和其启动子缺失用于去除松树中的雄球花和雌球花。
举例来说，去除构筑体可具有可操作地连接到编码barnase的基因的LPAG1启动子，而PrAG或LPAG1d4启动子可操作地连接到编码barstar(barnase抑制剂)的基因。如上文实例6中所示，LPAG1启动子在松球和胚中具活性，而PrAG或LPAGd4启动子仅在松树胚中具活性。通过在启动子(PrAG)下放置在松球中展示极低活性的编码barstar的基因，由其它启动子(LPAG)产生的barnase毒性可有效去除雄球花和雌球花。另一方面，松树胚中两个启动子的相似活性水平会产生相似量的barnase和barstar，且因此胚中的barnase毒性得以有效中和，导致松树胚性愈伤组织和胚的转化和再生。实例2中所述的转化方案后，分析松树愈伤组织的LPAG1表达。
实例8
辐射松AGAMOUS启动子的分析
如实例1所述，可从诸如辐射松或巨桉的树种类中鉴别繁殖优选启动子并进行克隆。PrAG启动子为来自辐射松的AGAMOUS启动子。PrAG启动子具有约1400bp的长度，包括5′-未翻译区。PrAG启动子公开于WO 00/55172中，所述专利以引用的方式并入本文中。
为确定PrAG是否能够繁殖优选表达，使PrAG启动子可操作地连接到具有内含子的GUS报告基因。如实例2中所述，将所得PrAG-GUS启动子构筑体引入烟草植物中。分析烟草组织的GUS表达，且表5中概括PrAG启动子活性。
表5：PrAG启动子活性的GUS分析
  烟草组织样本  GUS表达水平
  叶  无
  花瓣 是
  雄蕊 是
  心皮 是
尽管通过酶分析未检测到叶、花瓣、雄蕊和心皮组织中的GUS表达，但使用更敏感的方法(诸如用poly(A+)RNA进行的RNA酶保护分析(RNase Protection Assay))可检测到花瓣、雄蕊和心皮组织中的GUS表达。
实例9
花特异性增强子增加PrAG启动子活性
如实例8所述，PrAG启动子使繁殖优选启动子在烟草中极弱地表达。已展示，拟南芥AGAMOUS基因含有存在于AG基因的第二个内含子中的花特异性增强子(AtAGenh)。Sieburth，L.E.和Meyerowitz，E.M.The Plant Cell 9，355-365(1997)。Busch，M.A.，Bomblies，K.和Weigel，D.Science 285，585-587(1999)。Deyholos，M.K.和Sieburth，L.E.The Plant Cell 12：1799-1810(2000)。AtAGenh增强子元件可优先在被子植物花的繁殖组织中上调PrAG启动子活性是可能的。
为确定AtAGenh是否增强繁殖组织中的PrAG启动子活性，分离拟南芥AG(2750bp)的第二个内含子并使其与可操作地连接到具有内含子((AtAGenh)PrAG::GUSIN)的GUS报告基因的PrAG启动子的5′端融合，并将所得构筑体(pWVCZ20，参看图2)引入烟草中。
烟草转化后，收集烟草组织，并分析其GUS表达。如下表6中所示，GUS染色揭示，AtAGenh确实增强主要在雄蕊和心皮中的PrAG启动子活性，且也在花瓣中观察到部分增加。在萼片、叶和营养茎尖中未观察到GUS染色。
表6：AtAGenh增强PrAG启动子活性
  烟草组织样本   GUS表达PrAG::GUSIN   GUS表达(AtAGenh)PrAG::GUSIN
  雄蕊   弱表达   增强的GUS表达
  心皮   弱表达   增强的GUS表达
  花瓣   弱表达   增强的GUS表达
  萼片   无GUS表达   无GUS表达
  叶   无GUS表达   无GUS表达
  营养枝   无GUS表达   无GUS表达
实例10
使用繁殖优选启动子::突变体barnase构筑体用于繁殖去除而不干扰营养生长
如上文实例4中所述，可使用各种方法产生具有减弱的细胞毒素作用的突变体细胞毒素基因。通过降低barnase酶的毒性作用，可将barnase用于繁殖去除，而不危及植物的营养生长。而且，可操作地连接到减弱的barnase的繁殖优选启动子组合提供一种供繁殖去除而不破坏营养生长的方式。举例来说，分别使突变体barnase E73G与PrAG融合以建立pWVCZ23(图3)，与(AtAGenh)PrAG融合以建立pWVCZ24(图4)，并将所得构筑体引入烟草中。转化后，分析烟草植物，并将结果展示于下表7中。
表7
  转化构筑体   花的表型   所回收的不产生花粉的全部转基因植物的百分数(％)   所回收的不产生种子的全部转基因植物的百分数(％)   对营养生长的负面影响
  (AtAGenh)PrAG::E73G   退化的雄蕊和心皮；发育迟缓的花瓣；正常萼片   68   68   无
  PrAG::E73G   正常   10   10   无
如表7所示，68％经(AtAGenh)PrAG::E73G转化的烟草植物具有不育性繁殖表型，即许多经转化植物不产生具生育力的花粉，也不产生具生育力的种子。同样，10％经PrAG::E73G转化的植物不产生具生育力的花粉和种子。有趣的是，以任一构筑体转化都不危及营养生长。所得结果清楚地证实，去除盒(AtAGenh)PrAG::E73G可产生雄性不育性和雌性不育性烟草，且此盒能够对其它被子植物(包括被子植物和裸子植物)产生类似的去除作用。
实例11
使用温度敏感型Barnase去除繁殖原基而不干扰营养生长
Barnase是一种经良好表征的酶，且已鉴定出多种突变体。具体说来，已鉴定出具有变化的稳定性和/或毒性的barnase突变体。可能需要温度敏感型barnase来去除繁殖原基而不影响营养生长。
举例来说，可将热敏感型barnase用于繁殖去除。举例来说，在夏季(高温)，当出现大量营养生长时，热敏感型barnase的表达可具有极低毒性作用，但在冬天或低温产生繁殖芽时可具有毒性。可使用诸如PrMC2(SEQ ID NO 4或16)的繁殖优选启动子使营养组织中热敏感型barnase的表达减到最低。
实例12
Barstar中和转基因松树愈伤组织和再生胚中的barnase毒性
Barstar是一种天然的barnase抑制剂，且已将其用于保护非目标组织免受barnase毒性影响和恢复植物的繁殖力。Beals T.P.和Goldberg R.B，Plant Cell.9：9：1527-45(1997)。Kuvshinov V等人，Plant Sci.160：3：517-522(2001)。先前的实验证实，三种启动子LPAG1、PrAG和LPAG1d4在松树愈伤组织和再生胚中具有相似的活性。LPAG1启动子在烟草花中具有高活性，而PrAG和LPAG1d4启动子在烟草花中不展示活性或展示痕量活性，表明PrAG和LPAG1d4启动子在被子植物或裸子植物繁殖组织中可能不具活性。因此，可使PrAG和LPAG1d4启动子可操作地连接到中和barnase的细胞毒素作用的基因，诸如barstar，且启动子::barstar构筑体将靶向非繁殖组织。所述启动子::barstar构筑体(例如，PrAG::barstar)将保护营养组织免受有害barnase表达的影响。
而且，建立具有可操作地连接到barnase的繁殖优选启动子和可操作地连接到barstar的非繁殖优选启动子的去除构筑体可能极为有益。举例说来，松球去除构筑体可具有驱动barnase的LPAG1启动子，而PrAG或LPAG1d4启动子驱动barstar(诸如LPAG1::barnaseE73G/PrAG::barstar或LPAG1::barnase E73G/LPAG1d4::barstar)，且两个盒在一个骨架中。在松树转化期间，由松树愈伤组织和再生胚中的LPAG1活性引起的barnase毒性将由PrAG或LPAG1d4启动子活性产生的barstar有效中和，且因此可平稳地进行转化。然而，在成熟转基因松树中，松球芽(pine-cone bud)中由LPAG1启动子活性引起的barnase的存在将因barnase毒性和松球芽中barstar的缺乏而有效杀死松球。
实例13
同框PrMC2.400启动子片段的克隆
如美国专利申请公开案20030101487中所述，鉴别并分离PrMC2.400启动子序列，所述专利以引用的方式并入本文。PrMC2.400序列具有与pWVR220和其它PrMC2构筑体中所使用的ATG不同框的ATG。尽管先前有关拟南芥的测试清楚表明GUS是由PrMC2.400启动子表达的，但在经PrMC2.400启动子转化的烟草花药中未观察到GUS表达。因此，克隆同框PrMC2.400以用于去除构筑体中。
使用下述PCR引物，分离两种不同PrMC2.400启动子的序列。如下文所述，将两个PrMC2.400启动子克隆到表达载体中，以确保所述序列与可操作地连接的基因同框。
在PrMC2.400启动子序列中尤其361、367和397位处存在若干个同框ATG。使用所述的反向引物，产生两种不同的PrMC2.400产物。PrMC2.400-1含有所有三个ATG；PrMC2.400-3仅含有第一个ATG。反向引物的5′端经磷酸化，因此其可与克隆载体中的适当位点平末端接合(blunt-ligated)。PrMC2-XG引物含有XhoI位点。使用高保真Taq聚合酶掺合物(TaqPlus Long，Stratagene)进行PCR。PCR后，凝胶纯化扩增产物且随后使用标准程序用XhoI进行消化。将每一产物克隆到中间载体中并测序。测序指示PrMC2.400-1序列与原始序列存在1个核苷酸的差异，即35位处存在“T”残基插入。
将PrMC2.400-1和PrMC2.400-3序列克隆到表达载体中已确保所有ATG位点都与所关注的基因保持同框。
PrMC2-XG(正向)：
5′-GAAGAACTCGAGTAAAACATAATTTTGGCAGTAAAAAGTGA-3′(SEQ ID NO：38)
PrMC2-R1(反向)：
5′-CATGTTCCCGTTTGATACCTGAATTTTG-3′(SEQ ID NO：39)
PrMC2-R3(反向)：
5′-CATAAATCTTCTAAAAACAGCAGAACTGAC-3′(SEQ ID NO：40)
PrMC2-XG+PrMC2-R1：产生指定为PrMC2.400-1的3966(KNC)bp产物(SEQ IDNO：5)
PrMC2-XG+PrMC2-R3：产生指定为PrMC2.400-3的3603(KNC)bp产物(SEQ IDNO：16)。
实例14
将同框PrMC2.400-1::突变体barnase克隆到二元载体中
如实例17中所述，可使同框启动子PrMC2.400-1和PrMC2.400-3可操作地连接到所关注的基因以用于基因去除。举例说来，可使同框PrMC2.400-1启动子可操作地连接到减弱的barnase序列以用于繁殖去除。
K27A
如实例4中所述，将K27A突变体barnase预先克隆到高拷贝载体pWVR63中。将PCR产生的片段PrMC2.400-1克隆到pWVR63中，所述pWVR63预先经NcoI消化，经绿豆核酸酶处理以产生平末端，随后经XhoI消化和凝胶纯化以分离载体片段。随后的中间质粒pWVR205现含有去除盒PrMC2.400-1::K27Abarnase::RNS2TER。接着，使用KpnI和ApaI将此盒亚克隆到二元载体中以产生pWVR216。
H102E
如实例4中所述，预先将H102E突变体barnase克隆到高拷贝载体pWVR15中。为得到更便利的限制性酶末端以供克隆，使用PCR引物由pWVR15模板产生H102E。使用以下PCR引物产生突变体barnase H102E：
Agl2-PB：5′-TTTCACAACCTCCACACACTT-3′(SEQ ID NO：33)
Bar3Sac：5′-GAAGAAGAGCTCTTGACCGATCAGAGTTTGAAG-3′(SEQ ID NO： 35)。
使用高保真Taq聚合酶掺合物(TaqPlus Long，Strategene)进行PCR。使用标准的三步骤PCR方法。凝胶纯化PCR反应物，且随后用NcoI和SacI进行消化。凝胶纯化限制性消化物，并分离片段且浓缩。将这一经纯化PCR片段克隆到预先经NcoI和SacI消化的中间载体中，产生构筑体pWVR218。对这一构筑体测序以确保正确的突变体barnase序列。随后，将PCR产生的片段PrMC2.400-1克隆到pWVR218中，所述pWVR218预先经NcoI消化，经绿豆核酸酶处理以产生平末端，随后经XhoI消化和凝胶纯化以分离载体片段。随后的质粒pWVR219现含有去除盒PrMC2.400-1::H102Ebarnase::RNS2TER。对这一构筑体测序以确保正确的启动子序列和启动子：基因联接。接着，使用KpnI和ApaI将此盒亚克隆到二元载体中以产生pWVR220。
E73G
如实例4中所示，预先将E73G突变体barnase克隆到高拷贝载体中。为得到更便利的限制性酶末端以供克隆，使用PCR引物由质粒模板产生E73G序列。使用以下PCR引物产生突变体barnase E73G：
Bar5Nco：5′-TGACAACCATGGCACAGGTTATCAACACGTTTGAC-3′(SEQ ID NO： 31)
Bar3Sac：5′-GAAGAAGAGCTCTTGACCGATCAGAGTTTGAAG-3′(SEQ ID NO： 35)。
使用高保真Taq聚合酶掺合物(TaqPlus Long，Strategene)进行PCR。使用标准的三步骤PCR方法。凝胶纯化PCR反应物，且随后用NcoI和SacI进行消化。凝胶纯化限制性消化物，并分离片段且浓缩。将这一经纯化PCR片段克隆到预先经NcoI和SacI消化的中间载体中，产生构筑体pWVR230。对这一构筑体测序以确保正确的突变体barnase序列。随后，将PCR产生的片段PrMC2.400-1克隆到pWVR230中，所述pWVR230预先经NcoI消化，经绿豆核酸酶处理以产生平末端，随后经XhoI消化和凝胶纯化以分离载体片段。随后的质粒pWVR231现含有去除盒PrMC2.400-1::E73Gbarnase::RNS2TER。对这一构筑体测序以确保正确的启动子序列和启动子：基因联接。接着，使用KpnI和ApaI将此盒亚克隆到二元载体中以产生pAGF232。
GUS对照
尽管先前关于拟南芥的测试证实GUS是从原始PrMC2.400启动子表达的，但在经转化的烟草花药中未观察到染色。合成新的报告基因盒(参看下文)，从而使其匹配去除构筑体的框架。
将PCR产生的片段PrMC2.400-1克隆到pWVR52中，所述pWVR52预先经NcoI消化，经绿豆核酸酶处理以产生平末端，随后经XhoI消化和凝胶纯化以分离载体片段。随后的质粒pWVR233现含有盒PrMC2.400-1::GUS::RNS2TER。对这一构筑体测序以确保正确的启动子序列和启动子：基因联接。接着，使用KpnI和ApaI将此盒亚克隆到二元载体中以产生pAGF234。
实例15
PrMC2.400-1：Barnase的植物原位表达
通过电穿孔以二元载体pWVR216或pWVR220或pAGF232或pAGF234转化根癌农杆菌菌株GV2260。
由农杆菌介导的烟草(Nicotiana tabacum)转化制造转基因植物。在含有卡那霉素的培养基上选择转化体。通过PCR鉴别阳性转化体，将其转移到土壤中，并使其在标准温室条件下生长。分析植物的总营养生长速率、开花时间和雄性不育性。
由PrMC2.400-1启动子驱动表达突变体barnase基因的植物展现出雄性不育表型。具体说来，转基因植物不产生花粉粒。这是以显微镜通过在复式光学显微镜下(compoundlight microscope)观察得到确认。另外，无花粉植物不产生果实蒴果(fruit capsule)和种子。然而，当用野生型(wt)烟草花粉对植物进行异花授粉时，出现正常结实，表明雌性繁殖力未受影响。此外，这些异花授粉的苗种产生无花粉表型，表明转基因得以继承且后代中转基因的存在产生雄性不育植物。
应注意，由PrMC2.400-1启动子驱动表达突变体barnase基因的烟草株具有相对于心皮降低的雄蕊高度。开花时间也有所延迟。易于相对于对照株由表达K27A和E73G的烟草株观察到营养生长的降低。所述营养生长的降低导致较小的植物和较慢的发育。表达H102E的植株展示出最小的营养影响标志，且在总体生长方面与对照株极其类似。营养生长降低可指示烟草组织中PrMC2.400启动子表达的“漏出程度(leakiness)”。
为分析营养组织中PrMC2.400启动子的活性，对经PrMC2.400-1::GUS株转化的植株中幼叶组织、根和营养茎尖的GUS活性进行测试。使用发色底物X-Gluc以组织化学方法分析GUS活性。室温下，使组织中真空渗入X-Gluc历时1小时，随后在37℃下培育16小时。培育后，使组织在100％甲醇中且随后在95％乙醇中脱染色。这些组织显示并无GUS表达。也可能GUS表达水平过低而无法通过这一分析检测。
进行使用连接到GUS的PrMC2.400-1进行的其它实验以进一步了解烟草花药发育期间的时间和空间表达模式。可将烟草花发育细分成12个阶段以提供花器官系统中基因表达的参考点。Koltunow等人，The Plant Cell 2：1201-1224(1990)。在每一阶段时都移除花芽，切细，染色以分析GUS活性，并以显微镜观察。使用发色底物X-Gluc以组织化学方法分析GUS活性。室温下，使花芽中真空渗入X-Gluc历时1小时，随后在37℃下培育16小时。使组织在100％甲醇中且随后在95％乙醇中脱染色。结果指示PrMC2.400-1启动子仅在花药中表达，且PrMC2.400-1的表达限于其中存在绒毡层的发育阶段。这些绒毡层在花粉形成中起到重要作用。因此，绒毡层中细胞毒素基因的表达可防止花粉产生。
实例16
将PrMC2.400-3::突变体barnase克隆到二元载体中
H102E
如上文实例13所述，使用引物PrMC2.400-XG和PrMC2-R3产生PrMC2.400-3。用于扩增这一片段的模板是二元载体pWVR220。将这一经纯化PCR片段克隆到预先经NcoI和SacI消化的中间载体中，产生构筑体pWVR242，其现含有去除盒PrMC2.400-3::H102Ebarnase::RNS2TER。对这一构筑体测序以确保正确的启动子序列和启动子：基因联接。随后，使用KpnI和ApaI将此盒亚克隆到二元载体中产生pWVR243。
GUS对照
将PCR产生的片段PrMC2.400-3克隆到pWVR52中，所述pWVR52预先经NcoI消化，经绿豆核酸酶处理以产生平末端，随后经XhoI消化和凝胶纯化以分离载体片段。随后的质粒pWVR244现含有所述盒PrMC2.400-3::GUS::RNS2TER。对这一构筑体测序以确保正确的启动子序列和启动子：基因联接。随后，使用KpnI和ApaI将此盒亚克隆到二元载体中以产生pWVR245。
实例17
PrMC2.400-3：barnase的植物原位表达
通过电穿孔以二元载体pAGF243或pAGF245转化根癌农杆菌菌株GV2260。
由农杆菌介导的烟草(Nicotiana tabacum)转化制造转基因植物。在含有卡那霉素的培养基上选择转化体。通过PCR鉴别阳性转化体，将其转移到土壤中，并使其在标准温室条件下生长。观察植物的总营养生长速率、开花时间和雄性不育性。转基因烟草植株显示出雄性不育表型。具体说来，植物不产生花粉粒。另外，PrMC2.4000-1::H102E株相对于心皮高度具有降低的雄蕊高度，且开花时间有所延迟。
将含有连接到报告基因GUS的PrMC2.400-3的植株与PrMC2.400-1::GUS株相比较。花芽、尤其花药组织中GUS染色的强度可与PrMC2.400-1::GUS株相较。
实例18
构筑具有开花对照盒的前体质粒
质粒的构筑是以得自因缺失非必需DNA区段而降低尺寸的pBIN19的二元载体pARB310(SEQ ID NO：Z1)开始。通过BstXI消化将先前已以侧翼BstXI位点克隆的barstar基因(Hartley，R.W.J.Mol.Biol.202：913-915(1988))从pWVR200B移除，并进行凝胶纯化。使约470bp片段接合到已经BstXI消化的pARB310中，产生pARB310B。
接下来，使用PCR以下述引物对由pART27(Gleave，1992)扩增ColE1复制起点和周围区域：ColE1-F4(5′-GAGAGAGGATCCGGTGTGAAATACCGCACAG-3′，SEQ ID NO：41)和ColE1-R4(5′-GAGAGATGATCAGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTG-3′，SEQID NO：42)。用BamHI和BclI消化1.0kb的ColE1片段，随后加以纯化并将其接合到trfA基因末端与T-DNA左边界(LB)之间pARB310B的BclI位点中。这产生pAGF50，其充当大肠杆菌中的高拷贝数质粒，但仍在农杆菌中复制。
用AscI和NcoI消化pAGF50以移除UBQ3启动子和大部分NPTII编码区，并对所得5.7kb片段进行凝胶纯化。通过AscI和NcoI消化将连接到NPTII编码区5′端的1.9kb片段和UBQ10启动子从pWVR3释放，凝胶纯化并将其接合到pAGF50片段中以产生pARB1000。通过加入SUBIN::GUSIN::NOSTER报告基因盒进一步修饰这一质粒。SUBIN表示来自辐射松的独特启动子，其包括编码5′-UTR和内含子的基因组DNA；GUSIN表示来自马铃薯tuberin基因的β-葡糖苷酸酶编码区和内含子(Vancanneyt等人，1990)。通过DraI消化将报告基因盒从pARB494移除，并将其接合到pARB1000的SmaI位点中以产生pARB1001。除能够充当转化对照物外，由于pARB1001具有两个在报告基因侧面的可用于使其与所关注的其它基因转换的NotI位点，所以还将其用作开花对照质粒的直接前体。
雄性特异性开花对照基因PrMC2.400::barnaseH102E::RNS2TER存在于pWVR219中，且具有一个接近3′端的不合需要的NotI位点。用NotI消化质粒，且随后在dNTP存在下通过用T4 DNA聚合酶处理并与载体再接合来破坏所述位点。用AscI和XhoI将PrMC2.400::barnaseH102E::RNS2TER盒从已变化的pWVR219切除，并对1.1kb的片段进行凝胶纯化。通过用XhoI部分消化随后以AscI完全消化来制备pARB1001以使质粒线性化。使PrMC2.400::barnaseH102E::RNS2TER盒与所制备的pARB1001载体接合以产生pARB1002。用单边测序(single-pass sequencing)验证质粒的结构。
通过EcoRI和AscI消化将(AtAGenh)PrAG::barnaseE73G::NOSTER盒从pWVCZ24移除。将包含寡核苷酸EcoNot1(5′-AATGCGGCCGCAGAGA-3′，SEQ ID NO：43)和EcoNot2(5′-TCTCTGCGGCCGC-3′，SEQ ID NO：44)的NotI接头接合到EcoRI位点，并用NotI消化，且随后纯化4.9kb片段。用NotI和AscI消化质粒pARB1001，并对7.6kb载体片段进行凝胶纯化。将上述盒接合到这些位点中以产生pARB1005L(图19)。用单边测序验证质粒的结构。
实例19
西方桉早花(Early Flowering)的转化
本实例详细说明西方桉早花的感染和转化。为测试开花对照构筑体，在温室生长条件下测试西方桉籽苗的早花，并基于六个月内的开花情况选择克隆。将这些克隆引入不育组织培养物中以用于本发明的去除构筑体和对照GUS构筑体的转化。如下表所示，根据美国专利申请案10/861,909的方法，采集叶外植体(Leaf explant)，并预培养4天，且随后用具有p35SGUSINT(35S::GUSINT，NOS::NPTII)或本发明的构筑体的农杆菌菌株GV2260感染单独外植体，所述专利以以引用的方式并入本文。根除农杆菌后，将外植体移植到选择培养基中，所述选择培养基是由如同一专利申请案中所述的常规再生培养基和30mg/l遗传霉素组成。使转化体的再生枝条生根，并使其在温室中在容器中的土壤上生长以相对于对照物测试经去除构筑体转化的桉树的开花时间。
也使用美国专利申请案10/861,909的方法将本发明的构筑体转化到赤桉克隆和尾叶桉和巨桉的商用克隆中。使转化体的再生枝条生根，将其转移到土壤中并使其适应温室，随后在美国农业部植物健康检查服务(US Agricultural Plant Health Inspection Service)通知下将其转移到Florida和South Carolina的田间种植点。定期监测植物花芽的发育。迄今尚未观察到开花。
表8
  构筑体名称   开花对照启动子  减弱的Barnase基因(例如，H102E)   桉树种类和克隆  转化(或计划转化)的大致日期 所记录的关于组织培养中表明驱动减弱的barnase基因的启动子漏出的任何影响
  pARB598   PrMC2  H102E   西方桉克隆129和208  12月3日 无
  pAGF243   PrMC2.400-3  H102E   西方桉克隆129  3月4日
  pARB598   PrMC2  H102E   尾叶桉克隆IPB1  6月3日 无
  pARB599   PrMC2  H102E   尾叶桉克隆IPB1  6月3日 相对于对照物有效的减少的转化
  pARB675   PrMC2  H102E   尾叶桉克隆IPB1  4月4日
  pARB639   PrAG  E73G   尾叶桉克隆IPB1  6月3日 无法用所有T-DNA组份恢复植株
  pWVCZ24   PrAG  E73G   赤桉克隆C9  3月3日 无
  PWVCZ101   PrAG  E73G   赤桉克隆C10  3月3日 无
  pWVCZ24   PrAG  E73G   巨桉克隆IP1  4月3日 无
  PWVCZ101   PrAG  E73G   巨桉克隆IP1  4月3日 无
  pWVR220   PrMC2  H102E   巨桉克隆IP1  4月3日 无
  pAGF232   PrMC2  E73G   巨桉克隆IP1  4月3日 无
实例20
杂交松
使用美国专利第5,856,191号中所述的程序从个别未成熟大配子体的合子胚起始杂交松(火炬松属×刚松属)和火炬松(火炬松属)胚细胞系，并使用美国专利第5,506,136号中所述的程序加以维持。
在维持培养基上培养一到三个月后，低温保存组织培养物，储存长达数年的时间，且随后使用美国专利第6,682,931号中的方法加以恢复。植物组织培养领域的技术人员将认识到，其它低温保存和回收方案将适用于本方法中且不可将本实例中的细节解释为对本方法应用的限制。
根据美国专利第5,491,090号中的方法，两种遗传不同的杂交松组织培养细胞系和多种火炬松细胞系的均匀悬浮培养物是通过在250ml Nephelo侧臂烧瓶(Nephelo sidearmflask)(Kontes Chemistry and Life Sciences Products)中接种1g各组织而建立的。在23℃+2℃的温度下，在暗培养室中将含有液体培养基中的细胞的烧瓶放置到100rpm下的回转式震荡器(gyrotory shaker)中。一周后，通过将15ml新鲜培养基倾入培养烧瓶中并打漩以均匀分布细胞来使每一烧瓶中的液体达到35ml。将细胞和培养基倾析到烧瓶的侧臂部分中，使细胞沉降30分钟且随后测量产将细胞体积(SCV)，从而来测量侧臂中细胞的生长。当SCV大于或等于最大SCV的一半(烧瓶中50％体积由植物细胞占据)时，将每一培养物转移到含有总计80ml细胞和培养基的500ml侧臂烧瓶中，并在相同条件下维持所转移的培养物。
为准备基因转移，通过高压灭菌使聚酯膜载体无菌，并将其放置到单独的无菌布氏漏斗(Buchner funnel)中，且对于每个细胞系6个复制平板中的每一个而言，将1微升到3微升松树胚性细胞悬浮液吸到每一载体上，从而使胚性组织均匀分布。从所述组织抽吸液体培养基，并根据美国专利公开案第20020100083号中所述的方法，将具有胚性组织的每一载体放置到凝胶化制备型培养基上以供农杆菌培育。通过所属领域技术人员众所周知的技术将二元报告基因构筑体引入到不同根癌农杆菌的分离物中(isolatesAgrobacterium tumefacien)，并通过常用技术以投与乙酰丁香酮诱导毒性，于是，使每一经诱导的农杆菌分离物与单独的植物材料复本共混合。在22℃+2℃下，在暗室中共培植所述细胞历经约72小时。
共培植后，根据美国专利公开案第20020100083号中所述的方法，从培养物中根除农杆菌。随后，以2周的时间间隔将聚酯膜载体上生长的细胞转移到新鲜选择培养基上。在许多皮氏培养皿(petri dish)上的多个独立部分中出现选择培养基上的活跃生长。所述在选择剂存在下的活跃生长通常表明生长组织已将选择基因整合到其染色体中并经稳定转化。将这些活跃生长区作为独立转化事件处理，且在下文中将其称为假定的转基因亚株(putative transgenic subline)。通过将正在生长的转基因部分转移到补充有个别选择剂的新鲜半固体维持培养基中来繁殖假定转基因胚性组织。
在推定经转化亚株达到约2g后，使用标准技术对其进行选择以用于聚合酶链反应(PCR)扩增，从而确认转基因的存在。
表9.PCR引物对
Figure A20058003931000621
牺牲来自每一亚株的材料以供GUS染色和显微镜检验。对于GUS染色而言，根据植物转化技术中众所周知的技术，在暴露到发色葡糖苷酸酶(colorigenic glucuronidase)酶底物“X-gluc”(购自Inalco)后通过每一转基因细胞系中细胞的深蓝染色来检测编码在组织培养细胞中表达的β-葡糖苷酸酶的已插入uidA基因。显微镜检验证实，细胞分裂已恢复，且uidA转基因的瞬时表达展现出这些轰击的正常频率。
如下制备可发芽胚。使已在选择培养基上经培养的细胞团块增殖到至少1克后，再次将每一细胞团块单独地再悬浮到液体培养基中。当细胞悬浮液达到均匀(最大的一半)SCV时，将等量的悬浮培养细胞吸到无菌膜载体上以放置到如美国专利第5,506,136号中所述的发育/突变培养基上，从而萌发高品质的可采集的第3阶段(子叶)胚。在暗生长室中，在23℃+2℃下培育培养皿。每三周将膜载体转移到含有新鲜培养基的新皮氏培养皿中。第9周时，视觉分析第3阶段(子叶)胚的发芽品质，并将其采集到如美国专利第5,506,136号中所述的培养基上的织物载体上，且在黑暗中在4℃±2℃的温度下培育约4周。接着，在25℃±2℃的温度下在黑暗中，在密封容器中的水中培育其织物载体上的胚历经约3周。上述两种处理后，将其织物载体上的胚转移到培养基萌发培养基上，并在黑暗中在25℃±2℃的温度下培育约3天。随后将胚从其织物载体上移除，并将其放置到新鲜萌发培养基上。在光照下在25℃±2℃的温度下进行萌发。每周检查萌发平板，历时约4周的一段时间，并将正在萌发的胚转移到含有100ml萌发培养基的盒中以转变成幼苗。在光照下，在25℃±2℃的温度下培育含有正在发育的幼苗的盒历经约8到12周。
当幼苗形成上胚轴(新近形成的约2cm到4cm的嫩枝)时，将其转移到填充有灌封混合物(potting mix)[2∶1∶2的泥炭块∶珍珠岩∶蛭石，含有602g/m3 OSMOCOTE肥料(18-6-12)、340g/m3白云石和78g/m3 MICRO-MAX微量养料混合物(Sierra ChemicalCo.)]的容器中。使幼苗在阴凉的温室中生长且偶尔喷雾历经约2周的一段时间。将其从薄雾中移除以适应温室中的环境历经约4周。随后，将幼苗转移到户外荫凉处历经约6周以最后适应环境，此后，将其移到全光照条件下。接着，使其在容器中生长直至条件适于田间种植。
也将由火炬松松属(P.taeda)植株再生的植物种植到相同田间地点，在种植后长达6年的时间内未观察到球果产生。然而，出人意料的是，在种植后三年时，转基因杂交松树植株产生球花。此时，所述杂交树大约1米高，比相邻转基因火炬松小得多。
下表10展示另一次种植的结果，其包括作为对照物的非转基因杂交松树原始株以用于体细胞胚发生；与对照物具有相同亲代不经过组织培养的多种籽苗基因型；和使用两种不同载体由97LP0006产生的总计24种不同的转基因植株，一些使用基因枪转化且一些使用农杆菌转化，且总计超过250棵植物中大部分植株的多个复本在种植2年后产生一些球花且在种植三年后产生显著数量的球花。测试以下述观察结果终止。
表10
  报告基因构筑体   转化方法   转基因植株数量   由此植株种植的树木的编号   无球花   雌球花   雄球花   雄球花与雌球花   无球花的树％   展示雌球花的树％   展示雄球花的树％   展示雄球花和雌球花的树％
  Act2::GUS   农杆菌   28   9   6   3   1   1   67％   33％   11％   11％
  Act2::GUS   农杆菌   29   10   9   1   1   1   90％   10％   10％   10％
  Act2::GUS   农杆菌   31   8   0   7   2   1   0％   88％   25％   13％
  Act2::GUS   农杆菌   32   10   0   10   2   2   0％   100％   20％   20％
  Act2::GUS   农杆菌   34   10   2   8   1   1   0％   80％   10％   10％
  Act2::GUS   农杆菌   36   10   0   10   2   2   0％   100％   20％   20％
  Act2::GUS   农杆菌   38   10   0   10   3   3   0％   100％   30％   30％
  Act2::GUS   农杆菌   39   3   3   0   0   0   100％   0％   0％   0％
  Act2::GUS   农杆菌   53   9   1   8   3   3   11％   89％   33％   33％
  Act2::GUS   基因枪   64   8   1   5   4   2   20％   100％   80％   40％
  UBQ3::GUS   农杆菌   117   9   1   8   3   3   11％   89％   33％   33％
  UBQ3::GUS   农杆菌   118   9   0   9   2   2   0％   100％   22％   22％
  UBQ3::GUS   农杆菌   119   10   1   9   5   5   10％   90％   50％   50％
  UBQ3::GUS   农杆菌   120   10   0   10   0   0   0％   100％   0％   0％
  UBQ3::GUS   农杆菌   122   8   0   8   0   0   0％   100％   0％   0％
  UBQ3::GUS   农杆菌   125   10   0   10   2   2   0％   100％   20％   20％
  UBQ3::GUS   农杆菌   127   10   0   10   3   3   0％   100％   30％   30％
  UBQ3::GUS   农杆菌   128   10   1   9   2   2   10％   90％   20％   20％
  n.a.   非转基因体细细胞胚发生对照   97LP0006   7   2   5   0   0   29％   71％   0％   0％
  n.a.   非转基因合子植物对照   间距×火炬松籽苗   46   27   15   7   3   59％   33％   15％   7％
表10所示的结果表明，经过组织培养和转化是达成产生本发明的早球花(earlystrobili)结果所必需的，这是因为SE对照物不产生球花，而极少数未经组织培养的基因型产生球花。然而，几乎所有的转基因植株都以极高频率产生雄球花或雌球花或二者。18种转基因植株中仅一种在三年内未产生球花。所述结果与所使用的转化无关且也与所使用的转化载体无关。这表明最佳模式是使用(例如)经报告基因构筑体转化的转基因对照物以供所预期的比较，从而展示诸如本发明的去除构筑体的繁殖对照构筑体的效率。
在产生球花时，树平均约为1.2米高，具有平均高度的人无需专用工具就可轻易采集。
随后，使用这一系统来测试本申请案的繁殖对照构筑体在裸子植物中的功用，所述测试为一种不可能以其它方式进行的测试。胚性愈伤组织提供测试所测试的启动子是否在裸子植物中漏出和当以漏出方式表达时减弱的barnase基因是否有害的机会(参看表中第4列)。使树再生并将其种植到田间后，相对于经GUS转化的对照物可在三年内测量对球果形成日期的影响，此后田间测试可终止。这将另外允许供这些田间测试用的昂贵制造林地更快的轮种。
表11
  构筑体名称   启动子   基因   松树胼胝体中可注意的影响   适于田间种植的植物   松树转化的大致日期   经转化的SE株
  pWVR216   PrMC2.400   barnaseK27A   无   否   7/1/2002   92AA0033
  pWVR217   PrMC2.400   LPRNasel   无   否   7/1/2002   92AA0033
  pAGF234   PrMC2.400-1   GUS   NA   是   12/6/2002   97LP0033
  pWVR220   PrMC2.400-1   barnaseH102E   无   是   12/6/2002   97LP0033
  pWVR216   PrMC2.400-1   barnaseK27A   有害   否   12/6/2002   97LP0033
  pAGF232   PrMC2.400-1   barnaseE73G   有害   否   12/6/2002   97LP0033
  pAGF245   PrMC2.400-3   GUS   NA   否   12/2/2003   97LP0033
pAGF243 PrMC2.400-3 barnaseH102E 无   是   12/2/2003   97LP0033
实例21
使用具有LPAG1和LPAG1d4启动子的构筑体去除松树雄球花和雌球花的方法
基于实例6表4所示的结果，可使用LPAG1和LPAG1d4启动子去除松树的雄球花和雌球花。举例说来，去除构筑体可具有可操作地连接到编码barnase的基因的LPAG1启动子，而LPAG1d4启动子可操作地连接到编码barstar(barnase抑制剂)的基因。如上述实例6所示，LPAG1启动子在松球和松胚中具活性，而LPAG1d4启动子仅在松胚(pine embryo)中具活性。这一设想是基于LPAG1在烟草花中具有高活性而LPAG1d4在烟草花中具极低活性的观察作出的。通过在可在松球中具有极低活性的LPAG1d4启动子的控制下放置编码barstar的基因，由另一启动子(LPAG1)所产生的barnase毒性可有效去除雄球花和雌球花。另一方面，在松胚中两种启动子的类似活性水平产生类似量的barnase和barstar，且因此所述胚中barnase毒性得以有效中和，引起松树胚性愈伤组织和胚的转化和再生。
序列鉴别符的说明：
SEQ ID NO.1-LPAG1
SEQ ID NO.2-LPAG2
SEQ ID NO.3-PrAG-ATenh
SEQ ID NO.4-PrMC2.400-1
SEQ ID NO.5-barnase突变体E73G(DNA)
SEQ ID NO.6-barnase突变体F106S(DNA)
SEQ ID NO.7-barnase突变体H102E(DNA)
SEQ ID NO.8-barnase突变体K27A(DNA)
SEQ ID NO.9-barnase突变体E73G(AA)
SEQ ID NO.10-barnase突变体F106S(AA)
SEQ ID NO.11-barnase突变体H102E(AA)
SEQ ID NO.12-barnase突变体K27A(AA)
SEQ ID NO.13-PrMC2+barnase突变体H102E
SEQ ID NO.14-PrMC2+barnase突变体K27A
SEQ ID NO.15-PrMC2+barnase突变体E73G
SEQ ID NO.16-PrMC2.400-3
SEQ ID NO.17-LPAG1d4
SEQ IDNO.18-pWVR220[PrMC2.400::barnaseH102E](图1)
SEQ ID NO.19-pWVCZ20[(AtAGenh)PrAG::GUS(内含子)](图2)
SEQ ID NO.20-pWVCZ23[PrAG::barnaseE73G](图3)
SEQ IDNO.21-pWVCZ24[(AtAGenh)PrAG::barnaseE73G](图4)
SEQ IDNO.22-pARB599B[PrMC2::barnaseH102E](图5)
SEQ ID NO.23-pARB639B[(AtAGenli)PrAG::barnaseE73G](图6)
SEQ ID NO.24-pAGF243[PrMC2.400-3::barnaseH102E](图7)
SEQ ID NO.25-pABDP010[CZ28-bstar+UBQ10::NPTII::E9/LPAG1d4::bstar::NOST的互补拷贝](图8)
SEQ ID NO.26-pABDP04[CZ28-bstar+UBQ10::NPTII::E9/LPAG1d4::bstar::NOST的互补拷贝](图9)
序列如下。
SEQ ID NO.1-LPAG1
CAGCAAATATGATTTAGATTATGACCTAGAAATAAGCATAGCATTAAAGCATATACAAAACAAGCGGTG
ATATACTCTGACTGCCACTGTACTTGAGGAAAGGTAGTGGACTCTGCTCAGGTACATTAGTTTGGTAAG
GTTGGCTTGGCTTCTGGGTAATATGAGAAGTAAAGAAGTAAAAGGTATTTGACTCTAGTCAAGTACATT
GGATTGCCTTCGTCGGGGCTTGGATGGCTTGGGTTCGTGTGAGAAGCCAACAATTTATAAAAAAATATA
TTGAAAAAAAAAAAAATCGTCTAAGTGTTGGAAGTGAAAACGGTGGGACATAAATATACACAGAAGAGT
ACTTTAACAATGCGCAACCAAGGCAGATTCACAACTTGATTTCTGGACCTCGAATACGAGATAATGGTG
GTAAGAAATAAAGGAAGAGTGGAGTGCATTTGAAAATGAATGGAGAGCGCACAAAATGGAGGACGAATA
AATGAAATATAATGCAAGAGTGCATTTCCCTATTATTTCCAGAAATGTATATGTGGGGTCGGCATTCAC
ATGGGCGTCGCATTCAGGGGGTGTCATAGCGGTCCTTTGATTGCAGTGTGGGAGTTGCAACATGTACCA
ACAAATTCATTCATCCCAAAACCTAAATTTATCCTCTCCATTACTATTACCTACACCTATACCTAGTAA
ATATGTCCTGCCTTGTAACTCCTCCACTGCCTGCACACGTCTTAGTCAATCCATCTGCCTTCAAATAGG
CATTATTTTGTTCTTTCCCCTCCGACTGAAAGGCTATCGACCGACCGACCGCTCATCTTCTTCTTCTGC
GCAATTTTTTCTGCTGGATCATCATCATTACCATCATCGCCATCCCCACCATCATCATCATGATGGTAT
CTCTATCTCTCCCTGGCAATCGATTGTAGAGGAAAGGAAGAGGGAAGGGGCATATGTATTGATCAACCT
ACCCGAAAAAACAATCTGATCAGCCCTGCTAATCTTGCTTATAAATCTCTTATCCACTGTTCAATCATT
CAGGTTTCTTCCCACTTCCAAGCAAAGGCGCCCGGATTGGCCGTGTTCTTAGATTTTCAGGTACTTAAA
TGGACAATATTCCCCACCTGAAGCCGTTCTGAAAAAGATTTGTTTGTAGAAACAAACGATTGTAATATT
TGCTTAAGTTGAGCTTAAGGGGTTTGGTACCTAACTTGCCTTGTGGTTATTTGTTTCTCAGAACTCGGG
CTGCGTCCAACTGTAGGAACGAACCAGCACAAGGGGTTGCAGCTTTTGCTGTTGCTGTTGCGCCCATTG
CTTTTGGACTGGTATTAGTAGTTGCAGCTTTGTTTTGCATACGCTGTGAGGATCTGTGCGCGGAAATTT
TGTGTACAAATCATG
SEQ ID NO.2-LPAG2
CAGCAAATATGATTTAGATTATGACCTAGAAATAAGCATAGCATTAAAGCATATACATAACAAGCGGTG
ATATACTCTGACTGCCACTGTACTTGATGAAAGGTAGTGGACTCTGCTCAGGTACATTAGTTTGGTAAG
GTTGGCTTGGCTTCTGGGTAATATGAGAAGTAAAGAAGTAAAAGGTATTTGACTCTAGTCAAGTACATT
GGATTGCCTTTGTCGGGGCTTGGATGGCTTGGGTTCGTGTGAGAAGCCAACAATTTATAATAAAAATAA
AATAAAAAATCGAAGTGTTGGAAGTGAAAACGGTGGGGCATAAATATACACAGAAGAGTACTTTAACAA
TGCGCAACCAAGGCAGATTCACAACTTGATTTCTGGACCTCGAATACGAGATAATGGTGGTAAGAAATA
AAGGAAGAGTGGAGTGCATTTGAAAATGAATGGAGAGCGCACAAAATGGAGGACGAATAAATGAAATAT
AATGCAAGAGTGCATTTCCCTATTATTTCCAGAAATGTATATGTGGGGTCGGCATTCACATGGGCGTCG
CATTCAGGGGGTGTCATAGCGGTCCTTTGATTGCAGTGTGGGAGTTGCAACATGTACCAACAAATTCAT
TCATCCCAAAACCTAAATTTATCCTCTCCATTACTATTACCTACACCTATACCTAGTAAATATGTCCTG
CCTTGTAACTCCTCCACTGCCTGCACACGTCTTAGTCAATCCATCTGCCTTCAAATAGGCATTATTTTG
TTCTTTCCCCTCCGACTGAAAGGCTATCGACCGACCGACCGCTCATCTTCTTCTTCTGCGCAATTTTTT
CTGCTGGATCATCATCATTACCATCATCGCCATCCCCACCATCATCATCATGATGGTATCTCTATCTCT
CCCTGGCAATCGATTGTAGAGGAAAGGAAGAGGGAAGGGGCATATGTATTGATCAACCTACCCGAAAAA
ACAATCTGATCAGCCCTGCTAATCTTGCTTATAAATCTCTTATCCACTGTTCAATCATTCAGGTTTCTT
CCCACTTTCAAGCAAAGGCGCCCGGATTGGCCGTGTTCTTAGATTTTCAGGTACTTAAATGGACAATAT
TCCCCACCTGAAGCCGTTCTGAAAAAGATTTGTTTGTAGAAACAAACGATTGTAATATTTGCTTAAGTT
GAGCTTAAGGGGTTTGGTACCTAACTTGCCTTGTGGTTATTTGTTTCTCAGAACTCGGGCTGCGTCCAA
CTGTAGGAACGAACCAGCACAAGGGGTTGCAGCTTTTGCTGTTGCTGTTGCGCCCATTGCTTTTGGACT
GGTATTAGTAGTTGCAGCTTTGTTTTGCATACGCTGTGAGGATCTGTGCGCGGAAATTTTGTGTACAAA
TCATG
SEQ ID NO.3-PrAG-ATenh
GATAGGGTCAAATCGACCACTTGCACAGTTAAGTGATTCTAATACGAAACCTTAAAAGCAAACATCGGT
TCTTTTGAGTCAGAAGAAATGCAACTTAATGTGACACATGATGTGAAGAAAAAACAAAAGTAATATAAG
AAAAGGGAACAATTAAATAGTTAATAAAATATTTCCTTAAAGTTGTAACAAATAAAGAATCATTTTATG
AAACAATATGAACCCTAAATAAATTAAAATTCCTCTGAAACCTTAAATTTATCGAGCTAGTGATTGGCT
GCCAACTGCCATGCTGGCAAAATTAGAGTGACATGATTGGTCTGAACATGTCTAGGGTTTCAGACATGT
GACATGTGTCAACAACCCATTAACACATTGGGTATAAATCCAATAGACATTTGATAGTATTAAAATTGT
AACCATTGGATTAAATTTAAACGTGATGGATGTAACTAAATGACTTGTCCGAGTAACATCACAACGTTC
CATACTTTCCTTATTTGGAATATAATTAAATTTACCATTTATTCTTTTTTCTTGAGTTTCCTGTATATG
TACTTGTACATAGATATATATGCACAAATACGTATTACAATGACATATTATAGACTTTGATGTCTGAAC
TCTCAACCTTCTCGATGGAGAGATCATGACCGTAGATTTTTTTGGATCGTAGAAGGCAGACCAAACTCT
TAAACTATTGGATCCGGACTAAAAATCTCACTTTCCTCTCAGTACCCATAATGAGAGAGAAAATGATAA
AAATCCCTAACATTATTCTCTCTCTAGAAAAAAAAAGATACTTCAAAAAGAAAGAGAAATTGCATAAAT
CTATCTACACCAAAGATGTTGAAGCAATTCCAATGCTATACTTCTATGCCAAATCTATTTATTCAGTGA
TCATTAATCTTTTTACTTCCAAGAAATATGAACAATTTAGTATCCTTATAATTTTTGTCTCTATATATG
TAATATGAACATTGGGTATTGACCAAATGAGAAATCTAATATTAAATGGTCAAAAGTAGTAATATGATG
ACATTTTTGAATTTATAAATAGGTTACAAATTAATTCATTATGACATAAAACCTTCTTGTCAGAAGTCA
AGAACTGAAACTAACAAAACTTTATAATAAATTAGTAAAAATACAAATGAAAAATAAAAAGAAATAATA
TCTGAGTGATGACGTGATCAAAGATTCTTTAACAAAGACAACAAATCTTACAGACCCAAAACCTAATCT
TGCGCTCAATTCCAACCTCTGAAAAAACCTCAAAAATCTTATAAAAGAAAATAAATAAAGAAACGAAAC
TCTGATTTCGTAGAGTACCCATCGGATATATAAAAAGAAATTAGTAGGTAAATGAAGACTAATTTTGAT
TGACTGATTTAATTTGAAGTCGTTGTTAGCTTTTCTTGTTTTGGACATGAGAATTATATATTTCAGGAC
ATGAGAGTTGACAACTGTAAACGATTAAGAAAATTGATCTTTTAATTTTCAAACACCATTTAATCTTGA
CATGTTTTATGTTTTGGTGGAGAAGAAAGTAATCACGTGGGACTCTCTACTAATAAGTATTTGGAAATT
GCGTGTCGAATTAGAGATTACTAGTTTGAGTAATGTAGTTCGAAATGAGATTAGTTATTTTTAATTTTA
AAAAGAGTAATTTTAAGGAATAACAAAAAAGAGTCCCCATAAGCTAATTTGTCTTAATTACCTCCTTGT
TTCATTGACTATTTGAAATCTTGAAAATTCAGTTGAAATTTCAAATCTATGTTTCTTTTGACCACTTCT
AAACTAATCTTAGCTCATATATAATTTTCCAAAACTACAAAAATAACACTAACATTTAACATTCTCAAG
AGAAAACAAAAACAAAAACTTAGATAACCATCTAAATTGTCCTACATGTACGTATAAGTTCCATTATTT
TCTATCACTCATATAAGTTAAAATTTCATGAAAACTCAAAAATCTAGCTAGTTTCACCTTATTCACTCT
CACTTACCATCACATGTGTTTGTATCAAATATATGATATGATATAATTCATGAGAGAGAAAGAGAGCTA
GAGATAAGAAAGGAAAGTAAGAGAAAGAAGAGAAGAAAAAGAGAGACACAGACATTAACAACAATGGAG
GATGGATGATCACAAAACAGAAGATATGACCTCATAGTCCTTCCTTACTCTCTCCCCAATTTGTTTCCC
AAAACTTACTTTTATAGTCATAAAAATCAAGTTTTTACCTATTACAACACCAGATCTATAAATATATCT
AAATCTTCAAGTACTTGTTAGTAAGGAAAATAGAAAGATATAAGATTTTATTATTATTATAATAACAGA
AATGAGTGAAGAAAGAACACCCAACAAAGTGAATCTTAGTTCTACAAAACTGAATCTAAAACTCCACAT
TAGAAAAAACCCTGATGGTTTCTTATTTCTTTTCATTTATTATCTAACTCTCACTCAGATCTCCTTTAA
CTTTGTACCATTTCCCTCACTTCATATATCTATATATAACAAACTCTCTCTTTTTATTTAAGTCTTAAG
GGAAAATTAATATACACATGAAGAACAAGAAATTAGATCTACAAAATTGTTACAAAAACCCCCGAAGTA
AATAAAATAAACATATCAAACAAATATTCCCACTAATGTTAGTGTGTTTATATATATATGTGTGTGGAA
TATGAAGGAAAAAAGTGAAAAATAATCCTACCCATAAGAGCATTCAAGAAGAAGCTCGAGGTCGACGGT
ATCGATAAGCTTAAACTCGACAGCAAATATGATTTAGATTATGACCTAGAAATAAGCATAGCATTAAAG
CATATACATAACAAGCGGTGATATACTCTGACTGCCACTGTACTTGAGGAAAGGTAGTGGACTCTGCTC
AGGTACATTAGTTTGGTAAGGTTGGCTTGGCTTCTGGGTAATATGAGAAGTAAAGAAGTAAAAGGTATT
TGACTCTAGTCAAGTACATTGGATTGCCTTTGTCGGGGCTTGGATGGCTTGGGTTCGTGTGAGAAGCCA
ACAATTTATAAGAAATATATAAAATAAAAAATAAAAAAATTTAAGTGTTGGAAGTGAAAACGGTGGGGC
AGAAATATACACAGAAGAGTACTTTAACAATGCGCAACCAAGGCAGATTCACAACTTGATTTCTGGACC
TCGAATACGAGATAATGGTGGTAAGAAATAAAGGAAGAGTGGAGCGCATTTGAAAATGAATGGAGAGCG
CACAAAATGGAGGACGAATAAATGAAATATAATGCAAGGGTGCATTTCCCTATTATTTCCAGAAATGTA
TATGTGGGGTCGGCATTCTCATGGGCGTCGCATTCAGGGGGTGTCATAGCGGTCCTTTGATTGCAGTGT
GGGAGTTGCAACATGTACCAACAAATCCATTCATCCCAAAACCTAAATTTATCCTCTCCATTACTATTA
CCTACACCTATACCTAGTAAATATGTCCTGCCTTGTAACTCCTCCACTGCCTGCACACGTCTTAGTCAA
TCCATCTGCCTTCAAATAGGCATTATTTTGTTCTTTCCCCTCCGACTGAAAGGCTATCGACCGACCGAC
CGCTCATCTTCTTCTTCTGCGCAATTTTTTCTGCTGGATCATCATCATTACCATCATCGCCATCCCCAC
CATCATCATCATGATGGTATCTCTATCTCTCCCTGGCAATCGATTGTAGAGGAAAGGAAGAGGGAAGGG
GCATATGTATTGATCAACCTACCCGAAAAAACAATCTGATCAGCCCTGCTAATCTTGCTTATAAATCTC
TTATCCACTGTTCAATCATTCAGGTTTCTTCCCACTTTCAAGCAAAGGCGCCCGGATTGGCCGTGTTCT
TAGATTTTCAGGTACTTAAATGGACAATATTCCCCACCTGAAGCCGTTCTGAAAAAGATTTGTTTGTAG
AAACAAACGATTGTAATATTTGCTTAAGTTGAGCTTAAGGGGTTTGGTACCTAACTTGCCTTGTGGTTA
TTTGTTTCTCAGAACTCGGGCTGCGTCCAACTGTAGGAACGAACCAGCACAAGGGGTTGCAGCTTTTGC
TGTTGCTGTTGCGCCCATTGCTTTTGGACTGGTATTAGTAGTTGCAGCTTTGTTTTGCATACGCTGTGA
GGATCTGTGCGCGGAAATTTTGTGTACAAATC
SEQ ID NO.4-PrMC2-400.1
CTCGAGTAAAACATAATTTTGGCAGTAAAAAGTGAATTCTATTGTTTTGAAAACAAAACAAAATACAGG
AAGCGTGATTGTGGGGTTGTTGTTGAACTTGCCCGGGCAAAAGAAGAATGATTAGCGGTAGAGGAGTTA
GTAGTTACGTTCAACTAAATGCGTGACTAAATTATTTATCCTCCGCCATGGAAGCAGGTGATTCACACA
CAACTTGCTGCACACATTGCTCTCAAACCTTTCCTATAAATATCCGTAGCAGGGGCTGCGATGATACAC
AACGCATTTAATCAAACTACTTTGATTACTTTCTGTGGGTTCTACTTTCTTTGAATAGTCAGTTCTGCT
GTTTTTAGAAGATTTATGAGAATGGCCAAAATTCAGGTATCAAACGGGAAC
SEQ ID NO.5-barnase突变体  E73G(DNA)
ATGGCACAGGTTATCAACACGTTTGACGGGGTTGCGGATTATCTTCAGACATATCATAAGCTACCTGAT
AATTACATTACAAAATCAGAAGCACAAGCCCTCGGCTGGGTGGCATCAAAAGGGAACCTTGCAGACGTC
GCTCCGGGGAAAAGCATCGGCGGAGACATCTTCTCAAACAGGGAAGGCAAACTCCCGGGCAAAAGCGGA
CGAACATGGCGTGGAGCGGATATTAACTATACATCAGGCTTCAGAAATTCAGACCGGATTCTTTACTCA
AGCGACTGGCTGATTTACAAAACAACGGACCATTATCAGACCTTTACAAAAATCAGATAA
SEQ ID NO.6-barnase突变体F106S(DNA)
ATGGCACAGGTTATCAACACGTTTGACGGGGTTGCGGATTATCTTCAGACATATCATAAGCTACCTGAT
AATTACATTACAAA TCAGAAGCACAAGCCCTCGGCTGGGTGGCATCAAAAGGGAACCTTGCAGACGTC
GCTCCGGGGAAAAGCATCGGCGGAGACATCTTCTCAAACAGGGAAGGCAAACTCCCGGGCAAAAGCGGA
CGAACATGGCGTGAAGCGGATATTAACTATACATCAGGCTTCAGAAATTCAGACCGGATTCTTTACTCA
AGCGACTGGCTGATTTACAAAACAACGGACCATTATCAGACCTCTACAAAAATCAGATAA
SEQ ID NO.7-barnase突变体H102E(DNA)
ATGGCACAGGTTATCAACACGTTTGACGGGGTTGCGGATTATCTTCAGACATATCATAAGCTACCTGAT
AATTACATTACAAA TCAGAAGCACAAGCCCTCGGCTGGGTGGCATCAAAAGGGAACCTTGCAGACGTC
GCTCCGGGGAAAAGCATCGGCGGAGACATCTTCTCAAACAGGGAAGGCAAACTCCCGGGCAAAAGCGGA
CGAACATGGCGTGAAGCGGATATTAACTATACATCAGGCTTCAGAAATTCAGACCGGATTCTTTACTCA
AGCGACTGGCTGATTTACAAAACAACGGACGAGTATCAGACCTTTACAAAAATCAGATAA
SEQ ID NO.8-barnase突变体  K27A(DNA)
ATGGCACAGGTTATCAACACGTTTGACGGGGTTGCGGATTATCTTCAGACATATCATAAGCTACCTGAT
AATTACATTACAGCATCAGAAGCACAAGCCCTCGGCTGGGTGGCATCAAAAGGGAACCTTGCAGACGTC
GCTCCGGGGAAAAGCATCGGCGGAGACATCTTCTCAAACAGGGAAGGCAAACTCCCGGGCAAAAGCGGA
CGAACATGGCGTGAAGCGGATATTAACTATACATCAGGCTTCAGAAATTCAGACCGGATTCTTTACTCA
AGCGACTGGCTGATTTACAAAACAACGGACCATTATCAGACCTTTACAAAAATCAGATAA
SEQ ID NO.9-barnase突变体  E73G(AA)
MetAlaGlnValIleAsnThrPheAspGlyValAlaAspTyrLeuGlnThrTyrHisLysLeuProAsp
AsnTyrIleThrLysSerGluAlaGlnAlaLeuGlyTrpValAlaSerLysGlyAsnLeuAlaAspVal
AlaProGlyLysSerIleGlyGlyAspIlePheSerAsnArgGluGlyLysLeuProGlyLysSerGly
ArgThrTrpArgGlyAlaAspIleAsnTyrThrSerGlyPheArgAsRSerAspArgIleLeuTyrSer
SerAspTrpLeuIleTyrLysThrThrAspHisTyrGlnThrPheThrLysIleArg
SEQ ID NO.10-barnase突变体  F106S(AA)
MetAlaGlnValIleAsnThrPheAspGlyValAlaAspTyrLeuGlnThrTyrHisLysLeuProAsp
AsnTyrIleThrLysSerGluAlaGlnAlaLeuGlyTrpValAlaSerLysGlyAsnLeuAlaAspVal
AlaProGlyLysSerIleGlyGlyAspIlePheSerAsnArgGluGlyLysLeuProGlyLysSerGly
ArgThrTrpArgGluAlaAspIleAsnTyrThrSerGlyPheArgAsnSerAspArgIleLeuTyrSer
SerAspTrpLeuIleTyrLysThrThrAspHisTyrGlnThrSerThrLysIleArg
SEQ ID NO.11-barnase突变体  H102E(AA)
MetAlaGlnValIleAsnThrPheAspGlyValAlaAspTyrLeuGlnThrTyrHisLysLeuProAsp
AsnTyrIleThrLysSerGluAlaGlnAlaLeuGlyTrpValAlaSerLysGlyAsnLeuAlaAspVal
AlaProGlyLysSerIleGlyGlyAspIlePheSerAsnArgGluGlyLysLeuProGlyLysSerGly
ArgThrTrpArgGluAlaAspIleAsnTyrThrSerGlyPheArgAsnSerAspArgIleLeuTyrSer
SerAspTrpLeuIleTyrLysThrThrAspGluTyrGlnThrPheThrLysIleArg
SEQ ID NO.12-barnase突变体  K27A(AA)
MetAlaGlnValIleAsnThrPheAspGlyValAlaAspTyrLeuGlnThrTyrHisLysLeuProAsp
AsnTyrIleThrAlaSerGluAlaGlnAlaLeuGlyTrpValAlaSerLysGlyAsnLeuAlaAspVal
AlaProGlyLysSerIleGlyGlyAspIlePheSerAsnArgGluGlyLysLeuProGlyLysSerGly
ArgThrTrpArgGluAlaAspIleAsnTyrThrSerGlyPheArgAsnSerAspArgIleLeuTyrSer
SerAspTrpLeuIleTyrLysThrThrAspHisTyrGlnThrPheThrLysIleArg
SEQ ID NO.13-PrMC2::Barnase H102E::RNS2TER cassette
TCTCGAGTAAAACATAATTTTGGCAGTAAAAAGTGAATTCTATTGTTTTGAAAACAAAACAAAATACAG
GAAGCGTGATTGTGGGGTTGTTGTTGAACTTGCCCGGGCAAAAGAAGAATGATTAGCGGTAGAGGAGTT
AGTAGTTACGTTCAACTAAATGCGTGACTAAATTATTTATCCTCCGCCATGGAAGCAGGTGATTCACAC
ACAACTTGCTGCACACATTGCTCTCAAACCTTTCCTATAAATATCCGTAGCAGGGGCTGCGATGATACA
CAACGCATTTAATCAAACTACTTTGATTACTTTCTGTGGGTTCTACTTTCTTTGAATAGTCAGTTCTGC
TGTTTTTAGAAGATTTATGAGAATGGCCAAAATTCAGGTATCAAACGGGAACATGGCACAGGTTATCAA
CACGTTTGACGGGGTTGCGGATTATCTTCAGACATATCATAAGCTACCTGATAATTACATTACAAAATC
AGAAGCACAAGCCCTCGGCTGGGTGGCATCAAAAGGGAACCTTGCAGACGTCGCTCCGGGGAAAAGCAT
CGGCGGAGACATCTTCTCAAACAGGGAAGGCAAACTCCCGGGCAAAAGCGGACGAACATGGCGTGAAGC
GGATATTAACTATACATCAGGCTTCAGAAATTCAGACCGGATTCTTTACTCAAGCGACTGGCTGATTTA
CAAAACAACGGACGAGTATCAGACCTTTACAAAAATCAGATAACGAAAAAAACGGCTTCCCTGCGGGAG
GCCGTTTTTTTCAGCTTTACATAAAGTGTGTAATAAATTTTTCTTCAAACTCTGATCGGTCAAGAGCTC
TTCTGAGAGACAATACATACATGTCTCTGATGTTGTAACTTTACTACCAAAACCTATAAAGATTGGCTT
ATTTCGTTCTATTGGATATGTATCATCATTACTGGTAAATCAAGTTTCTTTCTAATAATGTAGAAGATC
AGAAAATCCATAAGAAGATATCAACATTTGAGTTCTATGGTAAATTGAATTATATCAACTTAGTTGCAA
TGATTCATTCTTGACTGATGCATTGATGGCTTATCAAACCAGTTTACAAAATTCGATTAGATAGGGCCC
A
SEQ ID NO.14-PrMC2::Barnase K27A::RNS2TER cassette
CTCGAGTAAAACATAATTTTGGCAGTAAAAAGTGAATTCTATTGTTTTGAAAACAAAACAAAATACAGG
AAGCGTGATTGTGGGGTTGTTGTTGAACTTGCCCGGGCAAAAGAAGAATGATTAGCGGTAGAGGAGTTA
GTAGTTACGTTCAACTAAATGCGTGACTAAATTATTTATCCTCCGCCATGGAAGCAGGTGATTCACACA
CAACTTGCTGCACACATTGCTCTCAAACCTTTCCTATAAATATCCGTAGCAGGGGCTGCGATGATACAC
AACGCATTTAATCAAACTACTTTGATTACTTTCTGTGGGTTCTACTTTCTTTGAATAGTCAGTTCTGCT
GTTTTTAGAAGATTTATGAGAATGGCCAAAATTCAGGTATCAAACGGGAACATGGCACAGGTTATCAAC
ACGTTTGACGGGGTTGCGGATTATCTTCAGACATATCATAAGCTACCTGATAATTACATTACAGCATCA
GAAGCACAAGCCCTCGGCTGGGTGGCATCAAAAGGGAACCTTGCAGACGTCGCTCCGGGGAAAAGCATC
GGCGGAGACATCTTCTCAAACAGGGAAGGCAAACTCCCGGGCAAAAGCGGACGAACATGGCGTGAAGCG
GATATTAACTATACATCAGGCTTCAGAAATTCAGACCGGATTCTTTACTCAAGCGACTGGCTGATTTAC
AAAACAACGGACGAGTATCAGACCTTTACAAAAATCAGATAACGAAAAAAACGGCTTCCCTGCGGGAGG
CCGTTTTTTTCAGCTTTACATAAAGTGTGTAATAAATTTTTCTTCAAACTCTGATCGGTCAAGAGCTCT
TCTGAGAGACAATACATACATGTCTCTGATGTTGTAACTTTACTACCAAAACCTATAAAGATTGGCTTA
TTTCGTTCTATTGGATATGTATCATCATTACTGGTAAATCAAGTTTCTTTCTAATAATGTAGAAGATCA
GAAAATCCATAAGAAGATATCAACATTTGAGTTCTATGGTAAATTGAATTATATCAACTTAGTTGCAAT
GATTCATTCTTGACTGATGCATTGATGGCTTATCAAACCAGTTTACAAAATTCGATTAGATAGGGCCC
SEQ ID NO.15-PrMC2::Barnase E73G::RNS2TER cassette
CTCGAGTAAAACATAATTTTGGCAGTAAAAAGTGAATTCTATTGTTTTGAAAACAAAACAAAATACAGG
AAGCGTGATTGTGGGGTTGTTGTTGAACTTGCCCGGGCAAAAGAAGAATGATTAGCGGTAGAGGAGTTA
GTAGTTACGTTCAACTAAATGCGTGACTAAATTATTTATCCTCCGCCATGGAAGCAGGTGATTCACACA
CAACTTGCTGCACACATTGCTCTCAAACCTTTCCTATAAATATCCGTAGCAGGGGCTGCGATGATACAC
AACGCATTTAATCAAACTACTTTGATTACTTTCTGTGGGTTCTACTTTCTTTGAATAGTCAGTTCTGCT
GTTTTTAGAAGATTTATGAGAATGGCCAAAATTCAGGTATCAAACGGGAACATGGCACAGGTTATCAAC
ACGTTTGACGGGGTTGCGGATTATCTTCAGACATATCATAAGCTACCTGATAATTACATTACAAAATCA
GAAGCACAAGCCCTCGGCTGGGTGGCATCAAAAGGGAACCTTGCAGACGTCGCTCCGGGGAAAAGCATC
GGCGGAGACATCTTCTCAAACAGGGAAGGCAAACTCCCGGGCAAAAGCGGACGAACATGGCGTGGAGCG
GATATTAACTATACATCAGGCTTCAGAAATTCAGACCGGATTCTTTACTCAAGCGACTGGCTGATTTAC
AAAACAACGGACGAGTATCAGACCTTTACAAAAATCAGATAACGAAAAAAACGGCTTCCCTGCGGGAGG
CCGTTTTTTTCAGCTTTACATAAAGTGTGTAATAAATTTTTCTTCAAACTCTGATCGGTCAAGAGCTCT
TCTGAGAGACAATACATACATGTCTCTGATGTTGTAACTTTACTACCAAAACCTATAAAGATTGGCTTA
TTTCGTTCTATTGGATATGTATCATCATTACTGGTAAATCAAGTTTCTTTCTAATAATGTAGAAGATCA
GAAAATCCATAAGAAGATATCAACATTTGAGTTCTATGGTAAATTGAATTATATCAACTTAGTTGCAAT
GATTCATTCTTGACTGATGCATTGATGGCTTATCAAACCAGTTTACAAAATTCGATTAGATAGGGCCC
SEQ ID NO.16-PrMC2.400-3启动子
TAAAACATAATTTTGGCAGTAAAAAGTGAATTCTATTGTTTTGAAAACAAAACAAAATACAGGAAGCGT
GATTGTGGGGTTGTTGTTGAACTTGCCCGGGCAAAAGAAGAATGATTAGCGGTAGAGGAGTTAGTAGTT
ACGTTCAACTAAATGCGTGACTAAATTATTTATCCTCCGCCATGGAAGCAGGTGATTCACACACAACTT
GCTGCACACATTGCTCTCAAACCTTTCCTATAAATATCCGTAGCAGGGGCTGCGATGATACACAACGCA
TTTAATCAAACTACTTTGATTACTTTCTGTGGGTTCTACTTTCTTTGAATAGTCAGTTCTGCTGTTTTT
AGAAGATTT
SEQ ID NO.17-LPAG1d4
TTCATTCATCCCAAAACCTAAATTTATCCTCTCCATTACTATTACCTACACCTATACCTAGTAAATATG
TCCTGCCTTGTAACTCCTCCACTGCCTGCACACGTCTTAGTCAATCCATCTGCCTTCAAATAGGCATTA
TTTTGTTCTTTCCCCTCCGACTGAAAGGCTATCGACCGACCGACCGCTCATCTTCTTCTTCTGCGCAAT
TTTTTCTGCTGGATCATCATCATTACCATCATCGCCATCCCCACCATCATCATCATGATGGTATCTCTA
TCTCTCCCTGGCAATCGATTGTAGAGGAAAGGAAGAGGGAAGGGGCATATGTATTGATCAACCTACCCG
AAAAAACAATCTGATCAGCCCTGCTAATCTTGCTTATAAATCTCTTATCCACTGTTCAATCATTCAGGT
TTCTTCCCACTTCCAAGCAAAGGCGCCCGGATTGGCCGTGTTCTTAGATTTTCAGGTACTTAAATGGAC
AATATTCCCCACCTGAAGCCGTTCTGAAAAAGATTTGTTTGTAGAAACAAACGATTGTAATATTTGCTT
AAGTTGAGCTTAAGGGGTTTGGTACCTAACTTGCCTTGTGGTTATTTGTTTCTCAGAACTCGGGCTGCG
TCCAACTGTAGGAACGAACCAGCACAAGGGGTTGCAGCTTTTGCTGTTGCTGTTGCGCCCATTGCTTTT
GGACTGGTATTAGTAGTTGCAGCTTTGTTTTGCATACGCTGTGAGGATCTGTGCGCGGAAATTTTGTGT
ACAAATC
关于用SEQ ID NO.18-26表示的序列，见图1-9和图13。
序列表
<110>阿博根有限公司
<120>繁殖去除构筑体
<130>044463-0347
<140>10/946,622
<141>2004-09-22
<160>52
<170>PatentIn Ver.3.3
<210>1
<211>1395
<212>DNA
<213>火炬松松属
<400>1
cagcaaatat gatttagatt atgacctaga aataagcata gcattaaagc atatacaaaa    60
caagcggtga tatactctga ctgccactgt acttgaggaa aggtagtgga ctctgctcag    120
gtacattagt ttggtaaggt tggcttggct tctgggtaat atgagaagta aagaagtaaa    180
aggtatttga ctctagtcaa gtacattgga ttgccttcgt cggggcttgg atggcttggg    240
ttcgtgtgag aagccaacaa tttataaaaa aatatattga aaaaaaaaaa aatcgtctaa    300
gtgttggaag tgaaaacggt gggacataaa tatacacaga agagtacttt aacaatgcgc    360
aaccaaggca gattcacaac ttgatttctg gacctcgaat acgagataat ggtggtaaga    420
aataaaggaa gagtggagtg catttgaaaa tgaatggaga gcgcacaaaa tggaggacga    480
ataaatgaaa tataatgcaa gagtgcattt ccctattatt tccagaaatg tatatgtggg    540
gtcggcattc acatgggcgt cgcattcagg gggtgtcata gcggtccttt gattgcagtg    600
tgggagttgc aacatgtacc aacaaattca ttcatcccaa aacctaaatt tatcctctcc    660
attactatta cctacaccta tacctagtaa atatgtcctg ccttgtaact cctccactgc    720
ctgcacacgt cttagtcaat ccatctgcct tcaaataggc attattttgt tctttcccct    780
ccgactgaaa ggctatcgac cgaccgaccg ctcatcttct tcttctgcgc aattttttct    840
gctggatcat catcattacc atcatcgcca tccccaccat catcatcatg atggtatctc    900
tatctctccc tggcaatcga ttgtagagga aaggaagagg gaaggggcat atgtattgat    960
caacctaccc gaaaaaacaa tctgatcagc cctgctaatc ttgcttataa atctcttatc    1020
cactgttcaa tcattcaggt ttcttcccac ttccaagcaa aggcgcccgg attggccgtg    1080
ttcttagatt ttcaggtact taaatggaca atattcccca cctgaagccg ttctgaaaaa    1140
gatttgtttg tagaaacaaa cgattgtaat atttgcttaa gttgagctta aggggtttgg    1200
tacctaactt gccttgtggt tatttgtttc tcagaactcg ggctgcgtcc aactgtagga    1260
acgaaccagc acaaggggtt gcagcttttg ctgttgctgt tgcgcccatt gcttttggac    1320
tggtattagt agttgcagct ttgttttgca tacgctgtga ggatctgtgc gcggaaattt    1380
tgtgtacaaa tcatg                                                     1395
<210>2
<211>1385
<212>DNA
<213>火炬松松属
<400>2
cagcaaatat gatttagatt atgacctaga aataagcata gcattaaagc atatacataa    60
caagcggtga tatactctga ctgccactgt acttgatgaa aggtagtgga ctctgctcag    120
gtacattagt ttggtaaggt tggcttggct tctgggtaat atgagaagta aagaagtaaa    180
aggtatttga ctctagtcaa gtacattgga ttgcctttgt cggggcttgg atggcttggg   240
ttcgtgtgag aagccaacaa tttataataa aaataaaata aaaaatcgaa gtgttggaag   300
tgaaaacggt ggggcataaa tatacacaga agagtacttt aacaatgcgc aaccaaggca   360
gattcacaac ttgatttctg gacctcgaat acgagataat ggtggtaaga aataaaggaa   420
gagtggagtg catttgaaaa tgaatggaga gcgcacaaaa tggaggacga ataaatgaaa   480
tataatgcaa gagtgcattt ccctattatt tccagaaatg tatatgtggg gtcggcattc   540
acatgggcgt cgcattcagg gggtgtcata gcggtccttt gattgcagtg tgggagttgc   600
aacatgtacc aacaaattca ttcatcccaa aacctaaatt tatcctctcc attactatta   660
cctacaccta tacctagtaa atatgtcctg ccttgtaact cctccactgc ctgcacacgt   720
cttagtcaat ccatctgcct tcaaataggc attattttgt tctttcccct ccgactgaaa   780
ggctatcgac cgaccgaccg ctcatcttct tcttctgcgc aattttttct gctggatcat   840
catcattacc atcatcgcca tccccaccat catcatcatg atggtatctc tatctctccc   900
tggcaatcga ttgtagagga aaggaagagg gaaggggcat atgtattgat caacctaccc   960
gaaaaaacaa tctgatcagc cctgctaatc ttgcttataa atctcttatc cactgttcaa   1020
tcattcaggt ttcttcccac tttcaagcaa aggcgcccgg attggccgtg ttcttagatt   1080
ttcaggtact taaatggaca atattcccca cctgaagccg ttctgaaaaa gatttgtttg   1140
tagaaacaaa cgattgtaat atttgcttaa gttgagctta aggggtttgg tacctaactt   1200
gccttgtggt tatttgtttc tcagaactcg ggctgcgtcc aactgtagga acgaaccagc   1260
acaaggggtt gcagcttttg ctgttgctgt tgcgcccatt gcttttggac tggtattagt   1320
agttgcagct ttgttttgca tacgctgtga ggatctgtgc gcggaaattt tgtgtacaaa   1380
tcatg                                                               1385
<210>3
<211>4172
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成构筑体
<400>3
gatagggtca aatcgaccac ttgcacagtt aagtgattct aatacgaaac cttaaaagca   60
aacatcggtt cttttgagtc agaagaaatg caacttaatg tgacacatga tgtgaagaaa   120
aaacaaaagt aatataagaa aagggaacaa ttaaatagtt aataaaatat ttccttaaag   180
ttgtaacaaa taaagaatca ttttatgaaa caatatgaac cctaaataaa ttaaaattcc   240
tctgaaacct taaatttatc gagctagtga ttggctgcca actgccatgc tggcaaaatt   300
agagtgacat gattggtctg aacatgtcta gggtttcaga catgtgacat gtgtcaacaa   360
cccattaaca cattgggtat aaatccaata gacatttgat agtattaaaa ttgtaaccat   420
tggattaaat ttaaacgtga tggatgtaac taaatgactt gtccgagtaa catcacaacg   480
ttccatactt tccttatttg gaatataatt aaatttacca tttattcttt tttcttgagt   540
ttcctgtata tgtacttgta catagatata tatgcacaaa tacgtattac aatgacatat   600
tatagacttt gatgtctgaa ctctcaacct tctcgatgga gagatcatga ccgtagattt   660
ttttggatcg tagaaggcag accaaactct taaactattg gatccggact aaaaatctca   720
ctttcctctc agtacccata atgagagaga aaatgataaa aatccctaac attattctct   780
ctctagaaaa aaaaagatac ttcaaaaaga aagagaaatt gcataaatct atctacacca   840
aagatgttga agcaattcca atgctatact tctatgccaa atctatttat tcagtgatca   900
ttaatctttt tacttccaag aaatatgaac aatttagtat ccttataatt tttgtctcta   960
tatatgtaat atgaacattg ggtattgacc aaatgagaaa tctaatatta aatggtcaaa   1020
agtagtaata tgatgacatt tttgaattta taaataggtt acaaattaat tcattatgac   1080
ataaaacctt cttgtcagaa gtcaagaact gaaactaaca aaactttata ataaattagt   1140
aaaaatacaa atgaaaaata aaaagaaata atatctgagt gatgacgtga tcaaagattc   1200
tttaacaaag acaacaaatc ttacagaccc aaaacctaat cttgcgctca attccaacct   1260
ctgaaaaaac ctcaaaaatc ttataaaaga aaataaataa agaaacgaaa ctctgatttc   1320
gtagagtacc catcggatat ataaaaagaa attagtaggt aaatgaagac taattttgat   1380
tgactgattt aatttgaagt cgttgttagc ttttcttgtt ttggacatga gaattatata   1440
tttcaggaca tgagagttga caactgtaaa cgattaagaa aattgatctt ttaattttca   1500
aacaccattt aatcttgaca tgttttatgt tttggtggag aagaaagtaa tcacgtggga   1560
ctctctacta ataagtattt ggaaattgcg tgtcgaatta gagattacta gtttgagtaa   1620
tgtagttcga aatgagatta gttattttta attttaaaaa gagtaatttt aaggaataac   1680
aaaaaagagt ccccataagc taatttgtct taattacctc cttgtttcat tgactatttg   1740
aaatcttgaa aattcagttg aaatttcaaa tctatgtttc ttttgaccac ttctaaacta   1800
atcttagctc atatataatt ttccaaaact acaaaaataa cactaacatt taacattctc   1860
aagagaaaac aaaaacaaaa acttagataa ccatctaaat tgtcctacat gtacgtataa   1920
gttccattat tttctatcac tcatataagt taaaatttca tgaaaactca aaaatctagc   1980
tagtttcacc ttattcactc tcacttacca tcacatgtgt ttgtatcaaa tatatgatat   2040
gatataattc atgagagaga aagagagcta gagataagaa aggaaagtaa gagaaagaag   2100
agaagaaaaa gagagacaca gacattaaca acaatggagg atggatgatc acaaaacaga   2160
agatatgacc tcatagtcct tccttactct ctccccaatt tgtttcccaa aacttacttt   2220
tatagtcata aaaatcaagt ttttacctat tacaacacca gatctataaa tatatctaaa   2280
tcttcaagta cttgttagta aggaaaatag aaagatataa gattttatta ttattataat   2340
aacagaaatg agtgaagaaa gaacacccaa caaagtgaat cttagttcta caaaactgaa   2400
tctaaaactc cacattagaa aaaaccctga tggtttctta tttcttttca tttattatct   2460
aactctcact cagatctcct ttaactttgt accatttccc tcacttcata tatctatata   2520
taacaaactc tctcttttta tttaagtctt aagggaaaat taatatacac atgaagaaca   2580
agaaattaga tctacaaaat tgttacaaaa acccccgaag taaataaaat aaacatatca   2640
aacaaatatt cccactaatg ttagtgtgtt tatatatata tgtgtgtgga atatgaagga   2700
aaaaagtgaa aaataatcct acccataaga gcattcaaga agaagctcga ggtcgacggt   2760
atcgataagc ttaaactcga cagcaaatat gatttagatt atgacctaga aataagcata   2820
gcattaaagc atatacataa caagcggtga tatactctga ctgccactgt acttgaggaa   2880
aggtagtgga ctctgctcag gtacattagt ttggtaaggt tggcttggct tctgggtaat   2940
atgagaagta aagaagtaaa aggtatttga ctctagtcaa gtacattgga ttgcctttgt   3000
cggggcttgg atggcttggg ttcgtgtgag aagccaacaa tttataagaa atatataaaa   3060
taaaaaataa aaaaatttaa gtgttggaag tgaaaacggt ggggcagaaa tatacacaga   3120
agagtacttt aacaatgcgc aaccaaggca gattcacaac ttgatttctg gacctcgaat   3180
acgagataat ggtggtaaga aataaaggaa gagtggagcg catttgaaaa tgaatggaga   3240
gcgcacaaaa tggaggacga ataaatgaaa tataatgcaa gggtgcattt ccctattatt   3300
tccagaaatg tatatgtggg gtcggcattc tcatgggcgt cgcattcagg gggtgtcata   3360
gcggtccttt gattgcagtg tgggagttgc aacatgtacc aacaaatcca ttcatcccaa   3420
aacctaaatt tatcctctcc attactatta cctacaccta tacctagtaa atatgtcctg   3480
ccttgtaact cctccactgc ctgcacacgt cttagtcaat ccatctgcct tcaaataggc   3540
attattttgt tctttcccct ccgactgaaa ggctatcgac cgaccgaccg ctcatcttct   3600
tcttctgcgc aattttttct gctggatcat catcattacc atcatcgcca tccccaccat   3660
catcatcatg atggtatctc tatctctccc tggcaatcga ttgtagagga aaggaagagg   3720
gaaggggcat atgtattgat caacctaccc gaaaaaacaa tctgatcagc cctgctaatc   3780
ttgcttataa atctcttatc cactgttcaa tcattcaggt ttcttcccac tttcaagcaa   3840
aggcgcccgg attggccgtg ttcttagatt ttcaggtact taaatggaca atattcccca   3900
cctgaagccg ttctgaaaaa gatttgtttg tagaaacaaa cgattgtaat atttgcttaa   3960
gttgagctta aggggtttgg tacctaactt gccttgtggt tatttgtttc tcagaactcg   4020
ggctgcgtcc aactgtagga acgaaccagc acaaggggtt gcagcttttg ctgttgctgt   4080
tgcgcccatt gcttttggac tggtattagt agttgcagct ttgttttgca tacgctgtga   4140
ggatctgtgc gcggaaattt tgtgtacaaa tc                                 4172
<210>4
<211>396
<212>DNA
<213>辐射松
<400>4
ctcgagtaaa acataatttt ggcagtaaaa agtgaattct attgttttga aaacaaaaca    60
aaatacagga agcgtgattg tggggttgtt gttgaacttg cccgggcaaa agaagaatga    120
ttagcggtag aggagttagt agttacgttc aactaaatgc gtgactaaat tatttatcct    180
ccgccatgga agcaggtgat tcacacacaa cttgctgcac acattgctct caaacctttc    240
ctataaatat ccgtagcagg ggctgcgatg atacacaacg catttaatca aactactttg    300
attactttct gtgggttcta ctttctttga atagtcagtt ctgctgtttt tagaagattt 360
atgagaatgg ccaaaattca ggtatcaaac gggaac                           396
<210>5
<211>336
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成构筑体
<400>5
atggcacagg ttatcaacac gtttgacggg gttgcggatt atcttcagac atatcataag 60
ctacctgata attacattac aaaatcagaa gcacaagccc tcggctgggt ggcatcaaaa 120
gggaaccttg cagacgtcgc tccggggaaa agcatcggcg gagacatctt ctcaaacagg 180
gaaggcaaac tcccgggcaa aagcggacga acatggcgtg gagcggatat taactataca 240
tcaggcttca gaaattcaga ccggattctt tactcaagcg actggctgat ttacaaaaca 300
acggaccatt atcagacctt tacaaaaatc agataa                           336
<210>6
<211>336
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成构筑体
<400>6
atggcacagg ttatcaacac gtttgacggg gttgcggatt atcttcagac atatcataag  60
ctacctgata attacattac aaaatcagaa gcacaagccc tcggctgggt ggcatcaaaa  120
gggaaccttg cagacgtcgc tccggggaaa agcatcggcg gagacatctt ctcaaacagg  180
gaaggcaaac tcccgggcaa aagcggacga acatggcgtg aagcggatat taactataca  240
tcaggcttca gaaattcaga ccggattctt tactcaagcg actggctgat ttacaaaaca  300
acggaccatt atcagacctc tacaaaaatc agataa                            336
<210>7
<211>336
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成构筑体
<400>7
atggcacagg ttatcaacac gtttgacggg gttgcggatt atcttcagac atatcataag 60
ctacctgata attacattac aaaatcagaa gcacaagccc tcggctgggt ggcatcaaaa 120
gggaaccttg cagacgtcgc tccggggaaa agcatcggcg gagacatctt ctcaaacagg 180
gaaggcaaac tcccgggcaa aagcggacga acatggcgtg aagcggatat taactataca 240
tcaggcttca gaaattcaga ccggattctt tactcaagcg actggctgat ttacaaaaca 300
acggacgagt atcagacctt tacaaaaatc agataa                           336
<210>8
<211>336
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成构筑体
<400>8
atggcacagg ttatcaacac gtttgacggg gttgcggatt atcttcagac atatcataag  60
ctacctgata attacattac agcatcagaa gcacaagccc tcggctgggt ggcatcaaaa  120
gggaaccttg cagacgtcgc tccggggaaa agcatcggcg gagacatctt ctcaaacagg  180
gaaggcaaac tcccgggcaa aagcggacga acatggcgtg aagcggatat taactataca  240
tcaggcttca gaaattcaga ccggattctt tactcaagcg actggctgat ttacaaaaca  300
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<210>9
<211>111
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成构筑体
<400>9
Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Phe Asp Gly Val Ala Asp Tyr Leu Gln
  1               5                  10                  15
Thr Tyr His Lys Leu Pro Asp Asn Tyr Ile Thr Lys Ser Glu Ala Gln
             20                  25                  30
Ala Leu Gly Trp Val Ala Ser Lys Gly Asn Leu Ala Asp Val Ala Pro
         35                  40                  45
Gly Lys Ser Ile Gly Gly Asp Ile Phe Ser Asn Arg Glu Gly Lys Leu
     50                  55                  60
Pro Gly Lys Ser Gly Arg Thr Trp Arg Gly Ala Asp Ile Asn Tyr Thr
 65                  70                  75                  80
Ser Gly phe Arg Asn Ser Asp Arg Ile Leu Tyr Ser Ser Asp Trp Leu
                 85                  90                  95
Ile Tyr Lys Thr Thr Asp His Tyr Gln Thr Phe Thr Lys Ile Arg
            100                 105                 110
<210>10
<211>111
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成构筑体
<400>10
Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Phe Asp Gly Val Ala Asp Tyr Leu Gln
  1               5                  10                  15
Thr Tyr His Lys Leu Pro Asp Asn Tyr Ile Thr Lys Ser Glu Ala Gln
             20                  25                  30
Ala Leu Gly Trp Val Ala Ser Lys Gly Asn Leu Ala Asp Val Ala Pro
         35                  40                  45
Gly Lys Ser Ile Gly Gly Asp Ile Phe Ser Asn Arg Glu Gly Lys Leu
     50                  55                  60
Pro Gly Lys Ser Gly Arg Thr Trp Arg Glu Ala Asp Ile Asn Tyr Thr
 65                  70                  75                  80
Ser Gly Phe Arg Asn Ser Asp Arg Ile Leu Tyr Ser Ser Asp Trp Leu
                 85                  90                  95
Ile Tyr Lys Thr Thr Asp His Tyr Gln Thr Ser Thr Lys Ile Arg
            100                 105                 110
<210>11
<211>111
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成构筑体
<400>11
Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Phe Asp Gly Val Ala Asp Tyr Leu Gln
  1               5                  10                  15
Thr Tyr His Lys Leu Pro Asp Asn Tyr Ile Thr Lys Ser Glu Ala Gln
             20                  25                  30
Ala Leu Gly Trp Val Ala Ser Lys Gly Asn Leu Ala Asp Val Ala Pro
         35                  40                  45
Gly Lys Ser Ile Gly Gly Asp Ile Phe Ser Asn Arg Glu Gly Lys Leu
     50                  55                  60
Pro Gly Lys Ser Gly Arg Thr Trp Arg Glu Ala Asp Ile Asn Tyr Thr
 65                  70                  75                  80
Ser Gly Phe Arg Asn Ser Asp Arg Ile Leu Tyr Ser Ser Asp Trp Leu
                 85                  90                  95
Ile Tyr Lys Thr Thr Asp Glu Tyr Gln Thr Phe Thr Lys Ile Arg
            100                 105                 110
<210>12
<211>111
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成构筑体
<400>12
Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Phe Asp Gly Val Ala Asp Tyr Leu Gln
  1               5                  10                  15
Thr Tyr His Lys Leu Pro Asp Asn Tyr Ile Thr Ala Ser Glu Ala Gln
             20                  25                  30
Ala Leu Gly Trp Val Ala Ser Lys Gly Asn Leu Ala Asp Val Ala pro
         35                  40                  45
Gly Lys Ser Ile Gly Gly Asp Ile Phe Ser Asn Arg Glu Gly Lys Leu
     50                  55                  60
Pro Gly Lys Ser Gly Arg Thr Trp Arg Glu Ala Asp Ile Asn Tyr Thr
 65                  70                  75                  80
Ser Gly Phe Arg Asn Ser Asp Arg Ile Leu Tyr Ser Ser Asp Trp Leu
                 85                  90                  95
Ile Tyr Lys Thr Thr Asp His Tyr Gln Thr Phe Thr Lys Ile Arg
            100                 105                 110
<210>13
<211>1105
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成构筑体
<400>13
tctcgagtaa aacataattt tggcagtaaa aagtgaattc tattgttttg aaaacaaaac   60
aaaatacagg aagcgtgatt gtggggttgt tgttgaactt gcccgggcaa aagaagaatg   120
attagcggta gaggagttag tagttacgtt caactaaatg cgtgactaaa ttatttatcc   180
tccgccatgg aagcaggtga ttcacacaca acttgctgca cacattgctc tcaaaccttt   240
cctataaata tccgtagcag gggctgcgat gatacacaac gcatttaatc aaactacttt   300
gattactttc tgtgggttct actttctttg aatagtcagt tctgctgttt ttagaagatt   360
tatgagaatg gccaaaattc aggtatcaaa cgggaacatg gcacaggtta tcaacacgtt   420
tgacggggtt gcggattatc ttcagacata tcataagcta cctgataatt acattacaaa   480
atcagaagca caagccctcg gctgggtggc atcaaaaggg aaccttgcag acgtcgctcc   540
ggggaaaagc atcggcggag acatcttctc aaacagggaa ggcaaactcc cgggcaaaag   600
cggacgaaca tggcgtgaag cggatattaa ctatacatca ggcttcagaa attcagaccg   660
gattctttac tcaagcgact ggctgattta caaaacaacg gacgagtatc agacctttac   720
aaaaatcaga taacgaaaaa aacggcttcc ctgcgggagg ccgttttttt cagctttaca   780
taaagtgtgt aataaatttt tcttcaaact ctgatcggtc aagagctctt ctgagagaca   840
atacatacat gtctctgatg ttgtaacttt actaccaaaa cctataaaga ttggcttatt   900
tcgttctatt ggatatgtat catcattact ggtaaatcaa gtttctttct aataatgtag   960
aagatcagaa aatccataag aagatatcaa catttgagtt ctatggtaaa ttgaattata  1020
tcaacttagt tgcaatgatt cattcttgac tgatgcattg atggcttatc aaaccagttt  1080
acaaaattcg attagatagg gccca                                        1105
<210>14
<211>1103
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成构筑体
<400>14
ctcgagtaaa acataatttt ggcagtaaaa agtgaattct attgttttga aaacaaaaca   60
aaatacagga agcgtgattg tggggttgtt gttgaacttg cccgggcaaa agaagaatga   120
ttagcggtag aggagttagt agttacgttc aactaaatgc gtgactaaat tatttatcct   180
ccgccatgga agcaggtgat tcacacacaa cttgctgcac acattgctct caaacctttc   240
ctataaatat ccgtagcagg ggctgcgatg atacacaacg catttaatca aactactttg   300
attactttct gtgggttcta ctttctttga atagtcagtt ctgctgtttt tagaagattt   360
atgagaatgg ccaaaattca ggtatcaaac gggaacatgg cacaggttat caacacgttt   420
gacggggttg cggattatct tcagacatat cataagctac ctgataatta cattacagca   480
tcagaagcac aagccctcgg ctgggtggca tcaaaaggga accttgcaga cgtcgctccg   540
gggaaaagca tcggcggaga catcttctca aacagggaag gcaaactccc gggcaaaagc   600
ggacgaacat ggcgtgaagc ggatattaac tatacatcag gcttcagaaa ttcagaccgg   660
attctttact caagcgactg gctgatttac aaaacaacgg acgagtatca gacctttaca   720
aaaatcagat aacgaaaaaa acggcttccc tgcgggaggc cgtttttttc agctttacat   780
aaagtgtgta ataaattttt cttcaaactc tgatcggtca agagctcttc tgagagacaa   840
tacatacatg tctctgatgt tgtaacttta ctaccaaaac ctataaagat tggcttattt   900
cgttctattg gatatgtatc atcattactg gtaaatcaag tttctttcta ataatgtaga   960
agatcagaaa atccataaga agatatcaac atttgagttc tatggtaaat tgaattatat   1020
caacttagtt gcaatgattc attcttgact gatgcattga tggcttatca aaccagttta   1080
caaaattcga ttagataggg ccc                                           1103
<210>15
<211>1103
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成构筑体
<400>15
ctcgagtaaa acataatttt ggcagtaaaa agtgaattct attgttttga aaacaaaaca  60
aaatacagga agcgtgattg tggggttgtt gttgaacttg cccgggcaaa agaagaatga  120
ttagcggtag aggagttagt agttacgttc aactaaatgc gtgactaaat tatttatcct  180
ccgccatgga agcaggtgat tcacacacaa cttgctgcac acattgctct caaacctttc  240
ctataaatat ccgtagcagg ggctgcgatg atacacaacg catttaatca aactactttg  300
attactttct gtgggttcta ctttctttga atagtcagtt ctgctgtttt tagaagattt  360
atgagaatgg ccaaaattca ggtatcaaac gggaacatgg cacaggttat caacacgttt  420
gacggggttg cggattatct tcagacatat cataagctac ctgataatta cattacaaaa  480
tcagaagcac aagccctcgg ctgggtggca tcaaaaggga accttgcaga cgtcgctccg  540
gggaaaagca tcggcggaga catcttctca aacagggaag gcaaactccc gggcaaaagc  600
ggacgaacat ggcgtggagc ggatattaac tatacatcag gcttcagaaa ttcagaccgg  660
attctttact caagcgactg gctgatttac aaaacaacgg acgagtatca gacctttaca  720
aaaatcagat aacgaaaaaa acggcttccc tgcgggaggc cgtttttttc agctttacat  780
aaagtgtgta ataaattttt cttcaaactc tgatcggtca agagctcttc tgagagacaa  840
tacatacatg tctctgatgt tgtaacttta ctaccaaaac ctataaagat tggcttattt  900
cgttctattg gatatgtatc atcattactg gtaaatcaag tttctttcta ataatgtaga  960
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caacttagtt gcaatgattc attcttgact gatgcattga tggcttatca aaccagttta  1080
caaaattcga ttagataggg ccc                                          1103
<210>16
<211>354
<212>DNA
<213>辐射松
<400>16
taaaacataa ttttggcagt aaaaagtgaa ttctattgtt ttgaaaacaa aacaaaatac  60
aggaagcgtg attgtggggt tgttgttgaa cttgcccggg caaaagaaga atgattagcg  120
gtagaggagt tagtagttac gttcaactaa atgcgtgact aaattattta tcctccgcca  180
tggaagcagg tgattcacac acaacttgct gcacacattg ctctcaaacc tttcctataa  240
atatccgtag caggggctgc gatgatacac aacgcattta atcaaactac tttgattact  300
ttctgtgggt tctactttct ttgaatagtc agttctgctg tttttagaag attt        354
<210>17
<211>766
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成构筑体
<400>17
ttcattcatc ccaaaaccta aatttatcct ctccattact attacctaca cctataccta  60
gtaaatatgt cctgccttgt aactcctcca ctgcctgcac acgtcttagt caatccatct  120
gccttcaaat aggcattatt ttgttctttc ccctccgact gaaaggctat cgaccgaccg  180
accgctcatc ttcttcttct gcgcaatttt ttctgctgga tcatcatcat taccatcatc  240
gccatcccca ccatcatcat catgatggta tctctatctc tccctggcaa tcgattgtag  300
aggaaaggaa gagggaaggg gcatatgtat tgatcaacct acccgaaaaa acaatctgat  360
cagccctgct aatcttgctt ataaatctct tatccactgt tcaatcattc aggtttcttc  420
ccacttccaa gcaaaggcgc ccggattggc cgtgttctta gattttcagg tacttaaatg  480
gacaatattc cccacctgaa gccgttctga aaaagatttg tttgtagaaa caaacgattg  540
taatatttgc ttaagttgag cttaaggggt ttggtaccta acttgccttg tggttatttg  600
tttctcagaa ctcgggctgc gtccaactgt aggaacgaac cagcacaagg ggttgcagct  660
tttgctgttg ctgttgcgcc cattgctttt ggactggtat tagtagttgc agctttgttt  720
tgcatacgct gtgaggatct gtgcgcggaa attttgtgta caaatc                 766
<210>18
<211>8006
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成载体序列
<400>18
cgccggcgtt gtggatacct cgcggaaaac ttggccctca ctgacagatg aggggcggac  60
gttgacactt gaggggccga ctcacccggc gcggcgttga cagatgaggg gcaggctcga  120
tttcggccgg cgacgtggag ctggccagcc tcgcaaatcg gcgaaaacgc ctgattttac  180
gcgagtttcc cacagatgat gtggacaagc ctggggataa gtgccctgcg gtattgacac  240
ttgaggggcg cgactactga cagatgaggg gcgcgatcct tgacacttga ggggcagagt  300
gctgacagat gaggggcgca cctattgaca tttgaggggc tgtccacagg cagaaaatcc  360
agcatttgca agggtttccg cccgtttttc ggccaccgct aacctgtctt ttaacctgct  420
tttaaaccaa tatttataaa ccttgttttt aaccagggct gcgccctgtg cgcgtgaccg  480
cgcacgccga aggggggtgc ccccccttct cgaaccctcc cggcccgcta acgcgggcct  540
cccatccccc caggggctgc gcccctcggc cgcgaacggc ctcaccccaa aaatggcagc  600
gctggcagtc cataattgtg gtccaatttg cagccgtccg agacaggagg acatcgtcca  660
gctgaaaccg gggcagaatc cggccatttc tgaagagaaa aatggtaaac tgatagaata  720
aaatcataag aaaggagccg cacatgaaaa aagcagtcat taacggggaa caaatcagaa  780
gtatcagcga cctccaccag acattgaaaa aggagcttgc ccttccggaa tactacggtg  840
aaaacctgga cgctttatgg gattgtctga ccggatgggt ggagtacccg ctcgttttgg  900
aatggaggca gtttgaacaa agcaagcagc tgactgaaaa tggcgccgag agtgtgcttc  960
aggttttccg tgaagcgaaa gcggaaggct gcgacatcac catcatactt tcttaatacg  1020
atcaatggga gaggaacaat atggaaacac aaaccacaat tgtggtttca aaatcggctc  1080
cgtcgatact atgttatacg ccaactttga aaacaacttt gaaaaagctg ttttctggta  1140
tttaaggttt tagaatgcaa ggaacagtga attggagttc gtcttgttat aattagcttc  1200
ttggggtatc tttaaatact gtagaaaaga ggaaggaaat aataaatggc taaaatgaga  1260
atatcaccgg aattgaaaaa actgatcgaa aaataccgct gcgtaaaaga tacggaagga  1320
atgtctcctg ctaaggtata taagctggtg ggagaaaatg aaaacctata tttaaaaatg  1380
acggacagcc ggtataaagg gaccacctat gatgtggaac gggaaaagga catgatgcta  1440
tggctggaag gaaagctgcc tgttccaaag gtcctgcact ttgaacggca tgatggctgg  1500
agcaatctgc tcatgagtga ggccgatggc gtcctttgct cggaagagta tgaagatgaa  1560
caaagccctg aaaagattat cgagctgtat gcggagtgca tcaggctctt tcactccatc  1620
gacatatcgg attgtcccta tacgaatagc ttagacagcc gcttagccga attggattac  1680
ttactgaata acgatctggc cgatgtggat tgcgaaaact gggaagaaga cactccattt  1740
aaagatccgc gcgagctgta tgatttttta aagacggaaa agcccgaaga ggaacttgtc  1800
ttttcccacg gcgacctggg agacagcaac atctttgtga aagatggcaa agtaagtggc  1860
tttattgatc ttgggagaag cggcagggcg gacaagtggt atgacattgc cttctgcgtc  1920
cggtcgatca gggaggatat cggggaagaa cagtatgtcg agctattttt tgacttactg  1980
gggatcaagc ctgattggga gaaaataaaa tattatattt tactggatga attgttttag  2040
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caagtgtttt ggctctcagg ccgaggccca cggcaagtat ttgggcaagg ggtcgctggt  2160
attcgtgcag ggcaagattc ggaataccaa gtacgagaag gacggccaga cggtctacgg  2220
gaccgacttc attgccgata aggtggatta tctggacacc aaggcaccag gcgggtcaaa  2280
tcaggaataa gggcacattg ccccggcgtg agtcggggca atcccgcaag gagggtgaat  2340
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gccgtggccg gacacgatgc gagcgatgcc aaacgacacg gcccgctctg ccctgttcac  2820
cacgcgcaac aagaaaatcc cgcgcgaggc gctgcaaaac aaggtcattt tccacgtcaa  2880
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gtggcagcag gtgttggagt acgcgaagcg cacccctatc ggcgagccga tcaccttcac  3000
gttctacgag ctttgccagg acctgggctg gtcgatcaat ggccggtatt acacgaaggc  3060
cgaggaatgc ctgtcgcgcc tacaggcgac ggcgatgggc ttcacgtccg accgcgttgg  3120
gcacctggaa tcggtgtcgc tgctgcaccg cttccgcgtc ctggaccgtg gcaagaaaac  3180
gtcccgttgc caggtcctga tcgacgagga aatcgtcgtg ctgtttgctg gcgaccacta  3240
cacgaaattc atatgggaga agtaccgcaa gctgtcgccg acggcccgac ggatgttcga  3300
ctatttcagc tcgcaccggg agccgtaccc gctcaagctg gaaaccttcc gcctcatgtg  3360
cggatcggat tccacccgcg tgaagaagtg gcgcgagcag gtcggcgaag cctgcgaaga  3420
gttgcgaggc agcggcctgg tggaacacgc ctgggtcaat gatgacctgg tgcattgcaa   3480
acgctagggc cttgtggggt cagttccggc tgggggttca gcagccagcg ctttactggc   3540
atttcaggaa caagcgggca ctgctcgacg cacttgcttc gctcagtatc gctcgggacg   3600
cacggcgcgc tctacgaact gccgatagac aactgtcacg gttaagcgag aaatgaataa   3660
gaaggctgat aattcggatc tctgcgaggg agatgatatt tgatcacagg cagcaacgct   3720
ctgtcatcgt tacaatcaac atgctaccct ccgcgagatc atccgtgttt caaacccggc   3780
agcttagttg ccgttcttcc gaatagcatc ggtaacatga gcaaagtctg ccgccttaca   3840
acggctctcc cgctgacgcc gtcccggact gatgggctgc ctgtatcgag tggtgatttt   3900
gtgccgagct gccggtcggg gagctgttgg ctggctggtg gcaggatata ttgtggtgta   3960
aacaaattga cgcttagaca acttaataac acattgcgga cgtttttaat gtactggggt   4020
ggtttttctt ttcaccagtg agacgggcaa cagctgattg cccttcaccg cctggccctg   4080
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agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa   4260
gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccacggccgc tctagaacta gtggatcccc   4320
cctacgtgcg atctagtaac atagatgaca ccgcgcgcga taatttatcc tagtttgcgc   4380
gctatatttt gttttctatc gcgtattaaa tgtataattg cgggactcta atcataaaaa   4440
cccatctcat aaataacgtc atgcattaca tgttaattat tacatgctta acgtaattca   4500
acagaaatta tatgataatc atcgcaagac cggcaacagg attcaatctt aagaaacttt   4560
attgccaaat gtttgaacga tccctcagaa gaactcgtca agaaggcgat agaaggcgat   4620
gcgctgcgaa tcgggagcgg cgataccgta aagcacgagg aagcggtcag cccattcgcc   4680
gccaagctct tcagcaatat cacgggtagc caacgctatg tcctgatagc ggtccgccac   4740
acccagccgg ccacagtcga tgaatccaga aaagcggcca ttttccacca tgatattcgg   4800
caagcaggca tcgccatggg tcacgacgag atcctcgccg tcgggcatgc gcgccttgag   4860
cctggcgaac agttcggctg gcgcgagccc ctgatgctct tcgtccagat catcctgatc   4920
gacaagaccg gcttccatcc gagtacgtgc tcgctcgatg cgatgtttcg cttggtggtc   4980
gaatgggcag gtagccggat caagcgtatg cagccgccgc attgcatcag ccatgatgga   5040
tactttctcg gcaggagcaa ggtgagatga caggagatcc tgccccggca cttcgcccaa   5100
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caaatcgaag agtaattatt cgacaaaact caaattattt gaacaaatcg gatgatattt   5520
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gatctaagat taacagaatc taaaccaaag aacatatacg aaattgggat cgaacgaaaa   5640
caaaatcgaa gattttgaga gaataaggaa cacagaaatt taccttgatc acggtagaga   5700
gaattgagag aaagttttta agattttgag aaattgaaat ctgaattgtg aagaagaaga   5760
gctctttggg tattgtttta tagaagaaga agaagaaaag acgaggacga ctaggtcacg   5820
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gctttgagtt gataaacacg actcgtgtgt gccggctgca accactttga cgccgtttat   6000
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aatgcaagtg ggcttataaa atcagtgaat ttcttggaaa agtaacttct ttatcgtata   6300
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tttcattaat aacaatgtaa caagaatgat acacaaaaca ttctttgaat aagttcgcta   6600
tgaagaaggg aacttatccg gtcctagatc atcagttcat acaaacctcc atagagttca   6660
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ggccctatct aatcgaattt tgtaaactgg tttgataagc catcaatgca tcagtcaaga   6780
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caacatcaga gacatgtatg tattgtctct cagaagagct cttgaccgat cagagtttga   7020
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gtttttttcg ttatctgatt tttgtaaagg tctgatactc gtccgttgtt ttgtaaatca   7140
gccagtcgct tgagtaaaga atccggtctg aatttctgaa gcctgatgta tagttaatat   7200
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gaagataatc cgcaaccccg tcaaacgtgt tgataacctg tgccatgttc ccgtttgata   7440
cctgaatttt ggccattctc ataaatcttc taaaaacagc agaactgact attcaaagaa   7500
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cacaatcacg cttcctgtat tttgttttgt tttcaaaaca atagaattca ctttttactg   7800
ccaaaattat gttttactcg agagcccggg ctcctgcagg taccttaatt aaaagtttaa   7860
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gaataatcgg atatttaaaa gggcgtgaaa aggtttatcc gttcgtccat ttgtatgtgc   7980
atgccaacca cagggttccc cagatc                                        8006
<210>19
<211>13001
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成载体序列
<400>19
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gcaggagccc gggctgcagg aattcgatat caagcttgat agggtcaaat cgaccacttg   120
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agaaatgcaa cttaatgtga cacatgatgt gaagaaaaaa caaaagtaat ataagaaaag   240
ggaacaatta aatagttaat aaaatatttc cttaaagttg taacaaataa agaatcattt   300
tatgaaacaa tatgaaccct aaataaatta aaattcctct gaaaccttaa atttatcgag   360
ctagtgattg gctgccaact gccatgctgg caaaattaga gtgacatgat tggtctgaac   420
atgtctaggg tttcagacat gtgacatgtg tcaacaaccc attaacacat tgggtataaa   480
tccaatagac atttgatagt attaaaattg taaccattgg attaaattta aacgtgatgg   540
atgtaactaa atgacttgtc cgagtaacat cacaacgttc catactttcc ttatttggaa   600
tataattaaa tttaccattt attctttttt cttgagtttc ctgtatatgt acttgtacat   660
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gattcacaac ttgatttctg gacctcgaat acgagataat ggtggtaaga aataaaggaa  3300
gagtggagcg catttgaaaa tgaatggaga gcgcacaaaa tggaggacga ataaatgaaa  3360
tataatgcaa gggtgcattt ccctattatt tccagaaatg tatatgtggg gtcggcattc  3420
tcatgggcgt cgcattcagg gggtgtcata gcggtccttt gattgcagtg tgggagttgc  3480
aacatgtacc aacaaatcca ttcatcccaa aacctaaatt tatcctctcc attactatta  3540
cctacaccta tacctagtaa atatgtcctg ccttgtaact cctccactgc ctgcacacgt  3600
cttagtcaat ccatctgcct tcaaataggc attattttgt tctttcccct ccgactgaaa  3660
ggctatcgac cgaccgaccg ctcatcttct tcttctgcgc aattttttct gctggatcat  3720
catcattacc atcatcgcca tccccaccat catcatcatg atggtatctc tatctctccc  3780
tggcaatcga ttgtagagga aaggaagagg gaaggggcat atgtattgat caacctaccc  3840
gaaaaaacaa tctgatcagc cctgctaatc ttgcttataa atctcttatc cactgttcaa  3900
tcattcaggt ttcttcccac tttcaagcaa aggcgcccgg attggccgtg ttcttagatt  3960
ttcaggtact taaatggaca atattcccca cctgaagccg ttctgaaaaa gatttgtttg  4020
tagaaacaaa cgattgtaat atttgcttaa gttgagctta aggggtttgg tacctaactt  4080
gccttgtggt tatttgtttc tcagaactcg ggctgcgtcc aactgtagga acgaaccagc  4140
acaaggggtt gcagcttttg ctgttgctgt tgcgcccatt gcttttggac tggtattagt  4200
agttgcagct ttgttttgca tacgctgtga ggatctgtgc gcggaaattt tgtgtacaaa  4260
tcatgttacg tcctgtagaa accccaaccc gtgaaatcaa aaaactcgac ggcctgtggg  4320
cattcagtct ggatcgcgaa aactgtggaa ttggtcagcg ttggtgggaa agcgcgttac  4380
aagaaagccg ggcaattgct gtgccaggca gttttaacga tcagttcgcc gatgcagata  4440
ttcgtaatta tgcgggcaac gtctggtatc agcgcgaagt ctttataccg aaaggttggg  4500
caggccagcg tatcgtgctg cgtttcgatg cggtcactca ttacggcaaa gtgtgggtca  4560
ataatcagga agtgatggag catcagggcg gctatacgcc atttgaagcc gatgtcacgc  4620
cgtatgttat tgccgggaaa agtgtacgta agtttctgct tctacctttg atatatatat  4680
aataattatc attaattagt agtaatataa tatttcaaat atttttttca aaataaaaga  4740
atgtagtata tagcaattgc ttttctgtag tttataagtg tgtatatttt aatttataac  4800
ctttctaata tatgaccaaa atttgttgat gtgcaggtat caccgtttgt gtgaacaacg  4860
aactgaactg gcagactatc ccgccgggaa tggtgattac cgacgaaaac ggcaagaaaa  4920
agcggtctta cttccatgat ttctttaact atgccggaat ccatcgcagc gtaatgctct  4980
acaccacgcc gaacacctgg gtggacgata tcaccgtggt gacgcatgtc gcgcaagact  5040
gtaaccacgc gtctgttgac tggcaggtgg tggccaatgg tgatgtcagc gttgaactgc  5100
gtgatgcgga tcaacaggtg gttgcaactg gacaaggcac tagcgggact ttgcaagtgg  5160
tgaatccgca cctctggcaa ccgggtgaag gttatctcta tgaactgtgc gtcacagcca  5220
aaagccagac agagtgtgat atctacccgc ttcgcgtcgg catccggtca gtggcagtga  5280
agggcgaaca gttcctgatt aaccacaaac cgttctactt tactggcttt ggtcgtcatg  5340
aagatgcgga cttgcgtggc aaaggattcg ataacgtgct gatggtgcac gaccacgcat  5400
taatggactg gattggggcc aactcctacc gtacctcgca ttacccttac gctgaagaga  5460
tgctcgactg ggcagatgaa catggcatcg tggtgattga tgaaactgct gctgtcggct  5520
ttaacctctc tttaggcatt ggtttcgaag cgggcaacaa gccgaaagaa ctgtacagcg  5580
aagaggcagt caacggggaa actcagcaag cgcacttaca ggcgattaaa gagctgatag  5640
cgcgtgacaa aaaccaccca agcgtggtga tgtggagtat tgccaacgaa ccggataccc  5700
gtccgcaagg tgcacgggaa tatttcgcgc cactggcgga agcaacgcgt aaactcgacc  5760
cgacgcgtcc gatcacctgc gtcaatgtaa tgttctgcga cgctcacacc gataccatca  5820
gcgatctctt tgatgtgctg tgcctgaacc gttattacgg atggtatgtc caaagcggcg  5880
atttggaaac ggcagagaag gtactggaaa aagaacttct ggcctggcag gagaaactgc  5940
atcagccgat tatcatcacc gaatacggcg tggatacgtt agccgggctg cactcaatgt  6000
acaccgacat gtggagtgaa gagtatcagt gtgcatggct ggatatgtat caccgcgtct  6060
ttgatcgcgt cagcgccgtc gtcggtgaac aggtatggaa tttcgccgat tttgcgacct  6120
cgcaaggcat attgcgcgtt ggcggtaaca agaaagggat cttcactcgc gaccgcaaac  6180
cgaagtcggc ggctttcctg ctgcaaaaac gctggactgg catgaacttc ggtgaaaaac  6240
cgcagcaggg aggcaaacaa tgaatcaaca actctcctgg cgcaccatcg tcggctacag  6300
cctcgggaat tgctaccgga gagagagctc gaatttcccc gatcgttcaa acatttggca  6360
ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca tataatttct  6420
gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg  6480
ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa acaaaatata  6540
gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag atcgggaatt  6600
cctgcagccc gggggatcca ctagttctag agcggccgct tggcgcgccg tcaacggatc  6660
aggatatcct tgtttaagat gttgaactct atggaggttt gtatgaactg atgatctagg  6720
accggataag ttcccttctt catagcgaac ttattcaaag aatgttttgt gtatcattct  6780
tgttacattg ttattaatga aaaaatatta ttggtcattg gactgaacac gagtgttaaa  6840
tatggaccag gccccaaata agatccattg atatatgaat taaataacaa gaataaatcg  6900
agtcaccaaa ccacttgcct tttttaacga gacttgttca ccaacttgat acaaaagtca  6960
ttatcctatg caaatcaata atcatacaaa aatatccaat aacactaaaa aattaaaaga  7020
aatggataat ttcacaatat gttatacgat aaagaagtta cttttccaag aaattcactg  7080
attttataag cccacttgca ttagataaat ggcaaaaaaa aacaaaaagg aaaagaaata  7140
aagcacgaag aattctagaa aatacgaaat acgcttcaat gcagtgggac ccacggttca  7200
attattgcca attttcagct ccaccgtata tttaaaaaat aaaacgataa tgctaaaaaa  7260
atataaatcg taacgatcgt taaatctcaa cggctggatc ttatgacgac cgttagaaat  7320
tgtggttgag tcagtaataa acggcgtcaa agtggttgca gccggcacac acgagtcgtg  7380
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tcgattaggg tttcataaat atcatccgat ttgttcaaat aatttgagtt ttgtcgaata  7860
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gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg  8220
aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc  8280
tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc  8340
ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat  8400
ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc  8460
cgaactgttc gccaggctca aggcgcgcat gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca  8520
tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga  8580
ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat   8640
tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc   8700
tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gagggatcgt   8760
tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt   8820
atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg   8880
ttatttatga gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta atacgcgata   8940
gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta   9000
ctagatcgca cgtagggggg atccactagt tctagagcgg ccgtgggcca tcgccctgat   9060
agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc   9120
aaactggaac aacactcaac cctatctcgg gctattcttt tgatttataa gggattttgc   9180
cgatttcgga accaccatca aacaggattt tcgcctgctg gggcaaacca gcgtggaccg   9240
cttgctgcaa ctctctcagg gccaggcggt gaagggcaat cagctgttgc ccgtctcact   9300
ggtgaaaaga aaaaccaccc cagtacatta aaaacgtccg caatgtgtta ttaagttgtc   9360
taagcgtcaa tttgtttaca ccacaatata tcctgccacc agccagccaa cagctccccg   9420
accggcagct cggcacaaaa tcaccactcg atacaggcag cccatcagtc cgggacggcg   9480
tcagcgggag agccgttgta aggcggcaga ctttgctcat gttaccgatg ctattcggaa   9540
gaacggcaac taagctgccg ggtttgaaac acggatgatc tcgcggaggg tagcatgttg   9600
attgtaacga tgacagagcg ttgctgcctg tgatcaaata tcatctccct cgcagagatc   9660
cgaattatca gccttcttat tcatttctcg cttaaccgtg acagttgtct atcggcagtt   9720
cgtagagcgc gccgtgcgtc ccgagcgata ctgagcgaag caagtgcgtc gagcagtgcc   9780
cgcttgttcc tgaaatgcca gtaaagcgct ggctgctgaa cccccagccg gaactgaccc   9840
cacaaggccc tagcgtttgc aatgcaccag gtcatcattg acccaggcgt gttccaccag   9900
gccgctgcct cgcaactctt cgcaggcttc gccgacctgc tcgcgccact tcttcacgcg   9960
ggtggaatcc gatccgcaca tgaggcggaa ggtttccagc ttgagcgggt acggctcccg   10020
gtgcgagctg aaatagtcga acatccgtcg ggccgtcggc gacagcttgc ggtacttctc   10080
ccatatgaat ttcgtgtagt ggtcgccagc aaacagcacg acgatttcct cgtcgatcag   10140
gacctggcaa cgggacgttt tcttgccacg gtccaggacg cggaagcggt gcagcagcga   10200
caccgattcc aggtgcccaa cgcggtcgga cgtgaagccc atcgccgtcg cctgtaggcg   10260
cgacaggcat tcctcggcct tcgtgtaata ccggccattg atcgaccagc ccaggtcctg   10320
gcaaagctcg tagaacgtga aggtgatcgg ctcgccgata ggggtgcgct tcgcgtactc   10380
caacacctgc tgccacacca gttcgtcatc gtcggcccgc agctcgacgc cggtgtaggt   10440
gatcttcacg tccttgttga cgtggaaaat gaccttgttt tgcagcgcct cgcgcgggat   10500
tttcttgttg cgcgtggtga acagggcaga gcgggccgtg tcgtttggca tcgctcgcat   10560
cgtgtccggc cacggcgcaa tatcgaacaa ggaaagctgc atttccttga tctgctgctt   10620
cgtgtgtttc agcaacgcgg cctgcttggc ctcgctgacc tgttttgcca ggtcctcgcc   10680
ggcggttttt cgcttcttgg tcgtcatagt tcctcgcgtg tcgatggtca tcgacttcgc   10740
caaacctgcc gcctcctgtt cgagacgacg cgaacgctcc acggcggccg atggcgcggg   10800
cagggcaggg ggagccagtt gcacgctgtc gcgctcgatc ttggccgtag cttgctggac   10860
catcgagccg acggactgga aggtttcgcg gggcgcacgc atgacggtgc ggcttgcgat   10920
ggtttcggca tcctcggcgg aaaaccccgc gtcgatcagt tcttgcctgt atgccttccg   10980
gtcaaacgtc cgattcattc accctccttg cgggattgcc ccgactcacg ccggggcaat   11040
gtgcccttat tcctgatttg acccgcctgg tgccttggtg tccagataat ccaccttatc   11100
ggcaatgaag tcggtcccgt agaccgtctg gccgtccttc tcgtacttgg tattccgaat   11160
cttgccctgc acgaatacca gcgacccctt gcccaaatac ttgccgtggg cctcggcctg   11220
agagccaaaa cacttgatgc ggaagaagtc ggtgcgctcc tgcttgtcgc cggcatcgtt   11280
gcgccacatc taggtactaa aacaattcat ccagtaaaat ataatatttt attttctccc   11340
aatcaggctt gatccccagt aagtcaaaaa atagctcgac atactgttct tccccgatat   11400
cctccctgat cgaccggacg cagaaggcaa tgtcatacca cttgtccgcc ctgccgcttc   11460
tcccaagatc aataaagcca cttactttgc catctttcac aaagatgttg ctgtctccca   11520
ggtcgccgtg ggaaaagaca agttcctctt cgggcttttc cgtctttaaa aaatcataca   11580
gctcgcgcgg atctttaaat ggagtgtctt cttcccagtt ttcgcaatcc acatcggcca   11640
gatcgttatt cagtaagtaa tccaattcgg ctaagcggct gtctaagcta ttcgtatagg   11700
gacaatccga tatgtcgatg gagtgaaaga gcctgatgca ctccgcatac agctcgataa   11760
tcttttcagg gctttgttca tcttcatact cttccgagca aaggacgcca tcggcctcac   11820
tcatgagcag attgctccag ccatcatgcc gttcaaagtg caggaccttt ggaacaggca   11880
gctttccttc cagccatagc atcatgtcct tttcccgttc cacatcatag gtggtccctt   11940
tataccggct gtccgtcatt tttaaatata ggttttcatt ttctcccacc agcttatata   12000
ccttagcagg agacattcct tccgtatctt ttacgcagcg gtatttttcg atcagttttt   12060
tcaattccgg tgatattctc attttagcca tttattattt ccttcctctt ttctacagta   12120
tttaaagata ccccaagaag ctaattataa caagacgaac tccaattcac tgttccttgc   12180
attctaaaac cttaaatacc agaaaacagc tttttcaaag ttgttttcaa agttggcgta   12240
taacatagta tcgacggagc cgattttgaa accacaatta tggactgcca gcgctgccat   12300
ttttggggtg aggccgttcg cggccgaggg gcgcagcccc tggggggatg ggaggcccgc   12360
gttagcgggc cgggagggtt cgagaagggg gggcaccccc cttcggcgtg cgcggtcacg   12420
cgcacagggc gcagccctgg ttaaaaacaa ggtttataaa tattggttta aaagcaggtt   12480
aaaagacagg ttagcggtgg ccgaaaaacg ggcggaaacc cttgcaaatg ctggattttc   12540
tgcctgtgga cagcccctca aatgtcaata ggtgcgcccc tcatctgtca gcactctgcc   12600
cctcaagtgt caaggatcgc gcccctcatc tgtcagtagt cgcgcccctc aagtgtcaat   12660
accgcagggc acttatcccc aggcttgtcc acatcatctg tgggaaactc gcgtaaaatc   12720
aggcgttttc gccgatttgc gaggctggcc agctccacgt cgccggccga aatcgagcct   12780
gcccctcatc tgtcaacgcc gcgccgggtg agtcggcccc tcaagtgtca acgtccgccc   12840
ctcatctgtc agtgagggcc aagttttccg cgaggtatcc acaacgccgg cggatctggg   12900
gaaccctgtg gttggcatgc acatacaaat ggacgaacgg ataaaccttt tcacgccctt   12960
ttaaatatcc gattattcta ataaacgctc ttttctctta g                       13001
<210>20
<211>8534
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成载体序列
<400>20
gtttacccgc caatatatcc tgtcaaacac tgatagttta aacttttaat taaggtacct  60
gcaggagccc gggctctcga ggtcgacggt atcgataagc ttaaactcga cagcaaatat  120
gatttagatt atgacctaga aataagcata gcattaaagc atatacataa caagcggtga  180
tatactctga ctgccactgt acttgaggaa aggtagtgga ctctgctcag gtacattagt  240
ttggtaaggt tggcttggct tctgggtaat atgagaagta aagaagtaaa aggtatttga  300
ctctagtcaa gtacattgga ttgcctttgt cggggcttgg atggcttggg ttcgtgtgag  360
aagccaacaa tttataagaa atatataaaa taaaaaataa aaaaatttaa gtgttggaag  420
tgaaaacggt ggggcagaaa tatacacaga agagtacttt aacaatgcgc aaccaaggca  480
gattcacaac ttgatttctg gacctcgaat acgagataat ggtggtaaga aataaaggaa  540
gagtggagcg catttgaaaa tgaatggaga gcgcacaaaa tggaggacga ataaatgaaa  600
tataatgcaa gggtgcattt ccctattatt tccagaaatg tatatgtggg gtcggcattc  660
tcatgggcgt cgcattcagg gggtgtcata gcggtccttt gattgcagtg tgggagttgc  720
aacatgtacc aacaaatcca ttcatcccaa aacctaaatt tatcctctcc attactatta  780
cctacaccta tacctagtaa atatgtcctg ccttgtaact cctccactgc ctgcacacgt  840
cttagtcaat ccatctgcct tcaaataggc attattttgt tctttcccct ccgactgaaa  900
ggctatcgac cgaccgaccg ctcatcttct tcttctgcgc aattttttct gctggatcat  960
catcattacc atcatcgcca tccccaccat catcatcatg atggtatctc tatctctccc  1020
tggcaatcga ttgtagagga aaggaagagg gaaggggcat atgtattgat caacctaccc  1080
gaaaaaacaa tctgatcagc cctgctaatc ttgcttataa atctcttatc cactgttcaa  1140
tcattcaggt ttcttcccac tttcaagcaa aggcgcccgg attggccgtg ttcttagatt  1200
ttcaggtact taaatggaca atattcccca cctgaagccg ttctgaaaaa gatttgtttg  1260
tagaaacaaa cgattgtaat atttgcttaa gttgagctta aggggtttgg tacctaactt  1320
gccttgtggt tatttgtttc tcagaactcg ggctgcgtcc aactgtagga acgaaccagc  1380
acaaggggtt gcagcttttg ctgttgctgt tgcgcccatt gcttttggac tggtattagt  1440
agttgcagct ttgttttgca tacgctgtga ggatctgtgc gcggaaattt tgtgtacaaa  1500
tcatggcaca ggttatcaac acgtttgacg gggttgcgga ttatcttcag acatatcata  1560
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gggaaggcaa actcccgggc aaaagcggac gaacatggcg tgaagcggat attaactata  1740
catcaggctt cagaaattca gaccggattc tttactcaag cgactggctg atttacaaaa  1800
caacggacca ttatcagacc tctacaaaaa tcagataacg aaaaaaacgg cttccctgcg  1860
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ggccgcaaca ctgatagttt aaactgaagg cgggaaacga caatctgatc atgagcggag  2280
aattaaggga gtcacgttat gacccccgcc gatgacgcgg gacaagccgt tttacgtttg  2340
gaactgacag aaccgcaacg ttgaaggagc cactcagccg cgggtttctg gagtttaatg  2400
agctaagcac atacgtcaga aaccattatt gcgcgttcaa aagtcgccta aggtcactat  2460
cagctagcaa atatttcttg tcaaaaatgc tccactgacg ttccataaat tcccctcggt  2520
atccaattag agtctcatat tcactctcaa tccaaataat ctgcaccgga tctggatcgt  2580
ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc  2640
tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc  2700
tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg  2760
aactgcagga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag  2820
ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg  2880
ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg  2940
caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac  3000
atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg  3060
acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgcgcatgc  3120
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aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc  3240
aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc  3300
gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc  3360
ttcttgacga gttcttctga gcgggactct ggggttcgaa atgaccgacc aagcgacgcc  3420
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aatcgttttc cgggacgccg gctggatgat cctccagcgc ggggatctca tgctggagtt  3540
cttcgcccac gggatctctg cggaacaggc ggtcgaaggt gccgatatca ttacgacagc  3600
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ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggaa ccaccatcaa acaggatttt  4260
cgcctgctgg ggcaaaccag cgtggaccgc ttgctgcaac tctctcaggg ccaggcggtg  4320
aagggcaatc agctgttgcc cgtctcactg gtgaaaagaa aaaccacccc agtacattaa  4380
aaacgtccgc aatgtgttat taagttgtct aagcgtcaat ttgtttacac cacaatatat  4440
cctgccacca gccagccaac agctccccga ccggcagctc ggcacaaaat caccactcga  4500
tacaggcagc ccatcagtcc gggacggcgt cagcgggaga gccgttgtaa ggcggcagac  4560
tttgctcatg ttaccgatgc tattcggaag aacggcaact aagctgccgg gtttgaaaca  4620
cggatgatct cgcggagggt agcatgttga ttgtaacgat gacagagcgt tgctgcctgt  4680
gatcaaatat catctccctc gcagagatcc gaattatcag ccttcttatt catttctcgc  4740
ttaaccgtga cagttgtcta tcggcagttc gtagagcgcg ccgtgcgtcc cgagcgatac  4800
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gctgctgaac ccccagccgg aactgacccc acaaggccct agcgtttgca atgcaccagg  4920
tcatcattga cccaggcgtg ttccaccagg ccgctgcctc gcaactcttc gcaggcttcg  4980
ccgacctgct cgcgccactt cttcacgcgg gtggaatccg atccgcacat gaggcggaag  5040
gtttccagct tgagcgggta cggctcccgg tgcgagctga aatagtcgaa catccgtcgg  5100
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aacagcacga cgatttcctc gtcgatcagg acctggcaac gggacgtttt cttgccacgg  5220
tccaggacgc ggaagcggtg cagcagcgac accgattcca ggtgcccaac gcggtcggac  5280
gtgaagccca tcgccgtcgc ctgtaggcgc gacaggcatt cctcggcctt cgtgtaatac  5340
cggccattga tcgaccagcc caggtcctgg caaagctcgt agaacgtgaa ggtgatcggc  5400
tcgccgatag gggtgcgctt cgcgtactcc aacacctgct gccacaccag ttcgtcatcg  5460
tcggcccgca gctcgacgcc ggtgtaggtg atcttcacgt ccttgttgac gtggaaaatg  5520
accttgtttt gcagcgcctc gcgcgggatt ttcttgttgc gcgtggtgaa cagggcagag  5580
cgggccgtgt cgtttggcat cgctcgcatc gtgtccggcc acggcgcaat atcgaacaag  5640
gaaagctgca tttccttgat ctgctgcttc gtgtgtttca gcaacgcggc ctgcttggcc  5700
tcgctgacct gttttgccag gtcctcgccg gcggtttttc gcttcttggt cgtcatagtt  5760
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tcgatcagtt cttgcctgta tgccttccgg tcaaacgtcc gattcattca ccctccttgc  6060
gggattgccc cgactcacgc cggggcaatg tgcccttatt cctgatttga cccgcctggt  6120
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ccgtccttct cgtacttggt attccgaatc ttgccctgca cgaataccag cgaccccttg  6240
cccaaatact tgccgtgggc ctcggcctga gagccaaaac acttgatgcg gaagaagtcg  6300
gtgcgctcct gcttgtcgcc ggcatcgttg cgccacatct aggtactaaa acaattcatc  6360
cagtaaaata taatatttta ttttctccca atcaggcttg atccccagta agtcaaaaaa  6420
tagctcgaca tactgttctt ccccgatatc ctccctgatc gaccggacgc agaaggcaat  6480
gtcataccac ttgtccgccc tgccgcttct cccaagatca ataaagccac ttactttgcc  6540
atctttcaca aagatgttgc tgtctcccag gtcgccgtgg gaaaagacaa gttcctcttc  6600
gggcttttcc gtctttaaaa aatcatacag ctcgcgcgga tctttaaatg gagtgtcttc  6660
ttcccagttt tcgcaatcca catcggccag atcgttattc agtaagtaat ccaattcggc  6720
taagcggctg tctaagctat tcgtataggg acaatccgat atgtcgatgg agtgaaagag  6780
cctgatgcac tccgcataca gctcgataat cttttcaggg ctttgttcat cttcatactc  6840
ttccgagcaa aggacgccat cggcctcact catgagcaga ttgctccagc catcatgccg  6900
ttcaaagtgc aggacctttg gaacaggcag ctttccttcc agccatagca tcatgtcctt  6960
ttcccgttcc acatcatagg tggtcccttt ataccggctg tccgtcattt ttaaatatag  7020
gttttcattt tctcccacca gcttatatac cttagcagga gacattcctt ccgtatcttt  7080
tacgcagcgg tatttttcga tcagtttttt caattccggt gatattctca ttttagccat  7140
ttattatttc cttcctcttt tctacagtat ttaaagatac cccaagaagc taattataac  7200
aagacgaact ccaattcact gttccttgca ttctaaaacc ttaaatacca gaaaacagct  7260
ttttcaaagt tgttttcaaa gttggcgtat aacatagtat cgacggagcc gattttgaaa  7320
ccacaattat gggagagacc ataatgtggt ccaatttgca gcagccgtcc gagacaggag  7380
gacatcgtcc agctgaaacc ggggcagaat ccggccattt ctgaagagaa aaatggtaaa  7440
ctgatagaat aaaatcataa gaaaggagcc gcacatgaaa aaagcagtca ttaacgggga  7500
acaaatcaga agtatcagcg acctccacca gacattgaaa aaggagcttg cccttccgga  7560
atactacggt gaaaacctgg acgctttatg ggattgtctg accggatggg tggagtaccc  7620
gctcgttttg gaatggaggc agtttgaaca aagcaagcag ctgactgaaa atggcgccga  7680
gagtgtgctt caggttttcc gtgaagcgaa agcggaaggc tgcgacatca ccatcatact  7740
ttcttaatac gatcaatggg agatgaacaa tatggaaaca caaaccacaa ttatgtctct  7800
cagcccacaa ttatggactg ccagcgctgc catttttggg gtgaggccgt tcgcggccga  7860
ggggcgcagc ccctgggggg atgggaggcc cgcgttagcg ggccgggagg gttcgagaag  7920
ggggggcacc ccccttcggc gtgcgcggtc acgcgcacag ggcgcagccc tggttaaaaa  7980
caaggtttat aaatattggt ttaaaagcag gttaaaagac aggttagcgg tggccgaaaa  8040
acgggcggaa acccttgcaa atgctggatt ttctgcctgt ggacagcccc tcaaatgtca  8100
ataggtgcgc ccctcatctg tcagcactct gcccctcaag tgtcaaggat cgcgcccctc  8160
atctgtcagt agtcgcgccc ctcaagtgtc aataccgcag ggcacttatc cccaggcttg  8220
tccacatcat ctgtgggaaa ctcgcgtaaa atcaggcgtt ttcgccgatt tgcgaggctg  8280
gccagctcca cgtcgccggc cgaaatcgag cctgcccctc atctgtcaac gccgcgccgg  8340
gtgagtcggc ccctcaagtg tcaacgtccg cccctcatct gtcagtgagg gccaagtttt  8400
ccgcgaggta tccacaacgc cggcggatct ggggaaccct gtggttggca tgcacataca  8460
aatggacgaa cggataaacc ttttcacgcc cttttaaata tccgattatt ctaataaacg  8520
ctcttttctc ttag                                                    8534
<210>21
<211>11300
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成载体序列
<400>21
gtttacccgc caatatatcc tgtcaaacac tgatagttta aacttttaat taaggtacct  60
gcaggagccc gggctgcagg aattcgatat caagcttgat agggtcaaat cgaccacttg  120
cacagttaag tgattctaat acgaaacctt aaaagcaaac atcggttctt ttgagtcaga  180
agaaatgcaa cttaatgtga cacatgatgt gaagaaaaaa caaaagtaat ataagaaaag  240
ggaacaatta aatagttaat aaaatatttc cttaaagttg taacaaataa agaatcattt  300
tatgaaacaa tatgaaccct aaataaatta aaattcctct gaaaccttaa atttatcgag  360
ctagtgattg gctgccaact gccatgctgg caaaattaga gtgacatgat tggtctgaac  420
atgtctaggg tttcagacat gtgacatgtg tcaacaaccc attaacacat tgggtataaa  480
tccaatagac atttgatagt attaaaattg taaccattgg attaaattta aacgtgatgg  540
atgtaactaa atgacttgtc cgagtaacat cacaacgttc catactttcc ttatttggaa  600
tataattaaa tttaccattt attctttttt cttgagtttc ctgtatatgt acttgtacat  660
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aaactcttaa actattggat ccgtactaaa aatctcactt tcctctcagt acccataatg  840
acagagaaaa tgataaaaat ccctaacatt attctctctc tagaaaaaaa aagatacttc  900
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ctatacttct atgccaaatc tatttattca gtgatcatta atctttttac ttccaagaaa  1020
tatgaacaat ttagtatcct tataattttt gtctctatat atgtaatatg aacattgggt  1080
attgaccaaa tgagaaatct aatattaaat ggtcaaaagt agtaatatga tgacattttt  1140
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caaaactaca aaaataacac taacatttaa cattctcaag agaaaacaaa aacaaaaact  1980
tagataacca tctaaattgt cctacatgta cgtataagtt ccattatttt ctatcactca  2040
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ctgaaaggct atcgaccgac cgaccgctca tcttcttctt ctgcgcaatt ttttctgctg  3720
gatcatcatc attaccatca tcgccatccc caccatcatc atcatgatgg tatctctatc  3780
tctccctggc aatcgattgt agaggaaagg aagagggaag gggcatatgt attgatcaac  3840
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cgtccacatc aacggcgtcg gcggcgactg cccaggcaag accgagatgc accgcgatat  6480
cttgctgcgt tcggatattt tcgtggagtt cccgccacag acccggatga tccccgatcg  6540
ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat  6600
tatcatataa tttctgttga attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac  6660
gttatttatg agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat  6720
agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt  6780
actagatcgg gcctcctgtc aatgctggcg gcggctctgg tggtggttct ggtggatcca  6840
ctagttctag agcggccgtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt  6900
ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat  6960
ctcgggctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggaaccac catcaaacag  7020
gattttcgcc tgctggggca aaccagcgtg gaccgcttgc tgcaactctc tcagggccag  7080
gcggtgaagg gcaatcagct gttgcccgtc tcactggtga aaagaaaaac caccccagta  7140
cattaaaaac gtccgcaatg tgttattaag ttgtctaagc gtcaatttgt ttacaccaca  7200
atatatcctg ccaccagcca gccaacagct ccccgaccgg cagctcggca caaaatcacc  7260
actcgataca ggcagcccat cagtccggga cggcgtcagc gggagagccg ttgtaaggcg  7320
gcagactttg ctcatgttac cgatgctatt cggaagaacg gcaactaagc tgccgggttt  7380
gaaacacgga tgatctcgcg gagggtagca tgttgattgt aacgatgaca gagcgttgct  7440
gcctgtgatc aaatatcatc tccctcgcag agatccgaat tatcagcctt cttattcatt  7500
tctcgcttaa ccgtgacagt tgtctatcgg cagttcgtag agcgcgccgt gcgtcccgag  7560
cgatactgag cgaagcaagt gcgtcgagca gtgcccgctt gttcctgaaa tgccagtaaa  7620
gcgctggctg ctgaaccccc agccggaact gaccccacaa ggccctagcg tttgcaatgc  7680
accaggtcat cattgaccca ggcgtgttcc accaggccgc tgcctcgcaa ctcttcgcag  7740
gcttcgccga cctgctcgcg ccacttcttc acgcgggtgg aatccgatcc gcacatgagg  7800
cggaaggttt ccagcttgag cgggtacggc tcccggtgcg agctgaaata gtcgaacatc  7860
cgtcgggccg tcggcgacag cttgcggtac ttctcccata tgaatttcgt gtagtggtcg  7920
ccagcaaaca gcacgacgat ttcctcgtcg atcaggacct ggcaacggga cgttttcttg  7980
ccacggtcca ggacgcggaa gcggtgcagc agcgacaccg attccaggtg cccaacgcgg  8040
tcggacgtga agcccatcgc cgtcgcctgt aggcgcgaca ggcattcctc ggccttcgtg  8100
taataccggc cattgatcga ccagcccagg tcctggcaaa gctcgtagaa cgtgaaggtg  8160
atcggctcgc cgataggggt gcgcttcgcg tactccaaca cctgctgcca caccagttcg  8220
tcatcgtcgg cccgcagctc gacgccggtg taggtgatct tcacgtcctt gttgacgtgg  8280
aaaatgacct tgttttgcag cgcctcgcgc gggattttct tgttgcgcgt ggtgaacagg  8340
gcagagcggg ccgtgtcgtt tggcatcgct cgcatcgtgt ccggccacgg cgcaatatcg  8400
aacaaggaaa gctgcatttc cttgatctgc tgcttcgtgt gtttcagcaa cgcggcctgc  8460
ttggcctcgc tgacctgttt tgccaggtcc tcgccggcgg tttttcgctt cttggtcgtc  8520
atagttcctc gcgtgtcgat ggtcatcgac ttcgccaaac ctgccgcctc ctgttcgaga  8580
cgacgcgaac gctccacggc ggccgatggc gcgggcaggg cagggggagc cagttgcacg  8640
ctgtcgcgct cgatcttggc cgtagcttgc tggaccatcg agccgacgga ctggaaggtt  8700
tcgcggggcg cacgcatgac ggtgcggctt gcgatggttt cggcatcctc ggcggaaaac  8760
cccgcgtcga tcagttcttg cctgtatgcc ttccggtcaa acgtccgatt cattcaccct  8820
ccttgcggga ttgccccgac tcacgccggg gcaatgtgcc cttattcctg atttgacccg  8880
cctggtgcct tggtgtccag ataatccacc ttatcggcaa tgaagtcggt cccgtagacc  8940
gtctggccgt ccttctcgta cttggtattc cgaatcttgc cctgcacgaa taccagcgac  9000
cccttgccca aatacttgcc gtgggcctcg gcctgagagc caaaacactt gatgcggaag  9060
aagtcggtgc gctcctgctt gtcgccggca tcgttgcgcc acatctaggt actaaaacaa  9120
ttcatccagt aaaatataat attttatttt ctcccaatca ggcttgatcc ccagtaagtc  9180
aaaaaatagc tcgacatact gttcttcccc gatatcctcc ctgatcgacc ggacgcagaa  9240
ggcaatgtca taccacttgt ccgccctgcc gcttctccca agatcaataa agccacttac  9300
tttgccatct ttcacaaaga tgttgctgtc tcccaggtcg ccgtgggaaa agacaagttc  9360
ctcttcgggc ttttccgtct ttaaaaaatc atacagctcg cgcggatctt taaatggagt  9420
gtcttcttcc cagttttcgc aatccacatc ggccagatcg ttattcagta agtaatccaa  9480
ttcggctaag cggctgtcta agctattcgt atagggacaa tccgatatgt cgatggagtg  9540
aaagagcctg atgcactccg catacagctc gataatcttt tcagggcttt gttcatcttc  9600
atactcttcc gagcaaagga cgccatcggc ctcactcatg agcagattgc tccagccatc  9660
atgccgttca aagtgcagga cctttggaac aggcagcttt ccttccagcc atagcatcat  9720
gtccttttcc cgttccacat cataggtggt ccctttatac cggctgtccg tcatttttaa  9780
atataggttt tcattttctc ccaccagctt atatacctta gcaggagaca ttccttccgt  9840
atcttttacg cagcggtatt tttcgatcag ttttttcaat tccggtgata ttctcatttt   9900
agccatttat tatttccttc ctcttttcta cagtatttaa agatacccca agaagctaat   9960
tataacaaga cgaactccaa ttcactgttc cttgcattct aaaaccttaa ataccagaaa   10020
acagcttttt caaagttgtt ttcaaagttg gcgtataaca tagtatcgac ggagccgatt   10080
ttgaaaccac aattatggga gagaccataa tgtggtccaa tttgcagcag ccgtccgaga   10140
caggaggaca tcgtccagct gaaaccgggg cagaatccgg ccatttctga agagaaaaat   10200
ggtaaactga tagaataaaa tcataagaaa ggagccgcac atgaaaaaag cagtcattaa   10260
cggggaacaa atcagaagta tcagcgacct ccaccagaca ttgaaaaagg agcttgccct   10320
tccggaatac tacggtgaaa acctggacgc tttatgggat tgtctgaccg gatgggtgga   10380
gtacccgctc gttttggaat ggaggcagtt tgaacaaagc aagcagctga ctgaaaatgg   10440
cgccgagagt gtgcttcagg ttttccgtga agcgaaagcg gaaggctgcg acatcaccat   10500
catactttct taatacgatc aatgggagat gaacaatatg gaaacacaaa ccacaattat   10560
gtctctcagc ccacaattat ggactgccag cgctgccatt tttggggtga ggccgttcgc   10620
ggccgagggg cgcagcccct ggggggatgg gaggcccgcg ttagcgggcc gggagggttc   10680
gagaaggggg ggcacccccc ttcggcgtgc gcggtcacgc gcacagggcg cagccctggt   10740
taaaaacaag gtttataaat attggtttaa aagcaggtta aaagacaggt tagcggtggc   10800
cgaaaaacgg gcggaaaccc ttgcaaatgc tggattttct gcctgtggac agcccctcaa   10860
atgtcaatag gtgcgcccct catctgtcag cactctgccc ctcaagtgtc aaggatcgcg   10920
cccctcatct gtcagtagtc gcgcccctca agtgtcaata ccgcagggca cttatcccca   10980
ggcttgtcca catcatctgt gggaaactcg cgtaaaatca ggcgttttcg ccgatttgcg   11040
aggctggcca gctccacgtc gccggccgaa atcgagcctg cccctcatct gtcaacgccg   11100
cgccgggtga gtcggcccct caagtgtcaa cgtccgcccc tcatctgtca gtgagggcca   11160
agttttccgc gaggtatcca caacgccggc ggatctgggg aaccctgtgg ttggcatgca   11220
catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt taaatatccg attattctaa   11280
taaacgctct tttctcttag                                               11300
<210>22
<211>12631
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成载体序列
<400>22
ggccgcattt gggctcctgc aggtacctta attaaaagtt taaactatca gtgtttgaca   60
ggatatattg gcgggtaaac ctaagagaaa agagcgttta ttagaataat cggatattta   120
aaagggcgtg aaaaggttta tccgttcgtc catttgtatg tgcatgccaa ccacagggtt   180
ccccagatcc gccggcgttg tggatacctc gcggaaaact tggccctcac tgacagatga   240
ggggcggacg ttgacacttg aggggccgac tcacccggcg cggcgttgac agatgagggg   300
caggctcgat ttcggccggc gacgtggagc tggccagcct cgcaaatcgg cgaaaacgcc   360
tgattttacg cgagtttccc acagatgatg tggacaagcc tggggataag tgccctgcgg   420
tattgacact tgaggggcgc gactactgac agatgagggg cgcgatcctt gacacttgag   480
gggcagagtg ctgacagatg aggggcgcac ctattgacat ttgaggggct gtccacaggc   540
agaaaatcca gcatttgcaa gggtttccgc ccgtttttcg gccaccgcta acctgtcttt   600
taacctgctt ttaaaccaat atttataaac cttgttttta accagggctg cgccctgtgc   660
gcgtgaccgc gcacgccgaa ggggggtgcc cccccttctc gaaccctccc ggcccgctaa   720
cgcgggcctc ccatcccccc aggggctgcg cccctcggcc gcgaacggcc tcaccccaaa   780
aatggcagcg ctggcagtcc ataattgtgg tccaatttgc agccgtccga gacaggagga   840
catcgtccag ctgaaaccgg ggcagaatcc ggccatttct gaagagaaaa atggtaaact   900
gatagaataa aatcataaga aaggagccgc acatgaaaaa agcagtcatt aacggggaac   960
aaatcagaag tatcagcgac ctccaccaga cattgaaaaa ggagcttgcc cttccggaat   1020
actacggtga aaacctggac gctttatggg attgtctgac cggatgggtg gagtacccgc   1080
tcgttttgga atggaggcag tttgaacaaa gcaagcagct gactgaaaat ggcgccgaga   1140
gtgtgcttca ggttttccgt gaagcgaaag cggaaggctg cgacatcacc atcatacttt   1200
cttaatacga tcaatgggag atgaacaata tggaaacaca aaccacaatt gtggtttcaa   1260
aatcggctcc gtcgatacta tgttatacgc caactttgaa aacaactttg aaaaagctgt  1320
tttctggtat ttaaggtttt agaatgcaag gaacagtgaa ttggagttcg tcttgttata  1380
attagcttct tggggtatct ttaaatactg tagaaaagag gaaggaaata ataaatggct  1440
aaaatgagaa tatcaccgga attgaaaaaa ctgatcgaaa aataccgctg cgtaaaagat  1500
acggaaggaa tgtctcctgc taaggtatat aagctggtgg gagaaaatga aaacctatat  1560
ttaaaaatga cggacagccg gtataaaggg accacctatg atgtggaacg ggaaaaggac  1620
atgatgctat ggctggaagg aaagctgcct gttccaaagg tcctgcactt tgaacggcat  1680
gatggctgga gcaatctgct catgagtgag gccgatggcg tcctttgctc ggaagagtat  1740
gaagatgaac aaagccctga aaagattatc gagctgtatg cggagtgcat caggctcttt  1800
cactccatcg acatatcgga ttgtccctat acgaatagct tagacagccg cttagccgaa  1860
ttggattact tactgaataa cgatctggcc gatgtggatt gcgaaaactg ggaagaagac  1920
actccattta aagatccgcg cgagctgtat gattttttaa agacggaaaa gcccgaagag  1980
gaacttgtct tttcccacgg cgacctggga gacagcaaca tctttgtgaa agatggcaaa  2040
gtaagtggct ttattgatct tgggagaagc ggcagggcgg acaagtggta tgacattgcc  2100
ttctgcgtcc ggtcgatcag ggaggatatc ggggaagaac agtatgtcga gctatttttt  2160
gacttactgg ggatcaagcc tgattgggag aaaataaaat attatatttt actggatgaa  2220
ttgttttagt acctagatgt ggcgcaacga tgccggcgac aagcaggagc gcaccgactt  2280
cttccgcatc aagtgttttg gctctcaggc cgaggcccac ggcaagtatt tgggcaaggg  2340
gtcgctggta ttcgtgcagg gcaagattcg gaataccaag tacgagaagg acggccagac  2400
ggtctacggg accgacttca ttgccgataa ggtggattat ctggacacca aggcaccagg  2460
cgggtcaaat caggaataag ggcacattgc cccggcgtga gtcggggcaa tcccgcaagg  2520
agggtgaatg aatcggacgt ttgaccggaa ggcatacagg caagaactga tcgacgcggg  2580
gttttccgcc gaggatgccg aaaccatcgc aagccgcacc gtcatgcgtg cgccccgcga  2640
aaccttccag tccgtcggct cgatggtcca gcaagctacg gccaagatcg agcgcgacag  2700
cgtgcaactg gctccccctg ccctgcccgc gccatcggcc gccgtggagc gttcgcgtcg  2760
tctcgaacag gaggcggcag gtttggcgaa gtcgatgacc atcgacacgc gaggaactat  2820
gacgaccaag aagcgaaaaa ccgccggcga ggacctggca aaacaggtca gcgaggccaa  2880
gcaggccgcg ttgctgaaac acacgaagca gcagatcaag gaaatgcagc tttccttgtt  2940
cgatattgcg ccgtggccgg acacgatgcg agcgatgcca aacgacacgg cccgctctgc  3000
cctgttcacc acgcgcaaca agaaaatccc gcgcgaggcg ctgcaaaaca aggtcatttt  3060
ccacgtcaac aaggacgtga agatcaccta caccggcgtc gagctgcggg ccgacgatga  3120
cgaactggtg tggcagcagg tgttggagta cgcgaagcgc acccctatcg gcgagccgat  3180
caccttcacg ttctacgagc tttgccagga cctgggctgg tcgatcaatg gccggtatta  3240
cacgaaggcc gaggaatgcc tgtcgcgcct acaggcgacg gcgatgggct tcacgtccga  3300
ccgcgttggg cacctggaat cggtgtcgct gctgcaccgc ttccgcgtcc tggaccgtgg  3360
caagaaaacg tcccgttgcc aggtcctgat cgacgaggaa atcgtcgtgc tgtttgctgg  3420
cgaccactac acgaaattca tatgggagaa gtaccgcaag ctgtcgccga cggcccgacg  3480
gatgttcgac tatttcagct cgcaccggga gccgtacccg ctcaagctgg aaaccttccg  3540
cctcatgtgc ggatcggatt ccacccgcgt gaagaagtgg cgcgagcagg tcggcgaagc  3600
ctgcgaagag ttgcgaggca gcggcctggt ggaacacgcc tgggtcaatg atgacctggt  3660
gcattgcaaa cgctagggcc ttgtggggtc agttccggct gggggttcag cagccagcgc  3720
tttactggca tttcaggaac aagcgggcac tgctcgacgc acttgcttcg ctcagtatcg  3780
ctcgggacgc acggcgcgct ctacgaactg ccgatagaca actgtcacgg ttaagcgaga  3840
aatgaataag aaggctgata attcggatct ctgcgaggga gatgatattt gatccggtgt  3900
gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg  3960
ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag  4020
gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa  4080
ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc  4140
cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca  4200
ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg  4260
accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct  4320
catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt  4380
gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag  4440
tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc  4500
agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac  4560
actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga  4620
gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc  4680
aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tatcaagaag atcctttgat cttttctacg  4740
gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca  4800
aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt  4860
atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttca tcagtgaggc tgatcacagg  4920
cagcaacgct ctgtcatcgt tacaatcaac atgctaccct ccgcgagatc atccgtgttt  4980
caaacccggc agcttagttg ccgttcttcc gaatagcatc ggtaacatga gcaaagtctg  5040
ccgccttaca acggctctcc cgctgacgcc gtcccggact gatgggctgc ctgtatcgag  5100
tggtgatttt gtgccgagct gccggtcggg gagctgttgg ctggctggtg gcaggatata  5160
ttgtggtgta aacaaattga cgcttagaca acttaataac acaccgcggt ctagaactag  5220
tggatccccc ctacgtgcga tctagtaaca tagatgacac cgcgcgcgat aatttatcct  5280
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tcataaaaac ccatctcata aataacgtca tgcattacat gttaattatt acatgcttaa  5400
cgtaattcaa cagaaattat atgataatca tcgcaagacc ggcaacagga ttcaatctta  5460
agaaacttta ttgccaaatg tttgaacgat ccctcagaag aactcgtcaa gaaggcgata  5520
gaaggcgatg cgctgcgaat cgggagcggc gataccgtaa agcacgagga agcggtcagc  5580
ccattcgccg ccaagctctt cagcaatatc acgggtagcc aacgctatgt cctgatagcg  5640
gtccgccaca cccagccggc cacagtcgat gaatccagaa aagcggccat tttccaccat  5700
gatattcggc aagcaggcat cgccatgggt cacgacgaga tcctcgccgt cgggcatgcg  5760
cgccttgagc ctggcgaaca gttcggctgg cgcgagcccc tgatgctctt cgtccagatc  5820
atcctgatcg acaagaccgg cttccatccg agtacgtgct cgctcgatgc gatgtttcgc  5880
ttggtggtcg aatgggcagg tagccggatc aagcgtatgc agccgccgca ttgcatcagc  5940
catgatggat actttctcgg caggagcaag gtgagatgac aggagatcct gccccggcac  6000
ttcgcccaat agcagccagt cccttcccgc ttcagtgaca acgtcgagca cagctgcgca  6060
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cacggcggca tcagagcagc cgattgtctg ttgtgcccag tcatagccga atagcctctc  6240
cacccaagcg gccggagaac ctgcgtgcaa tccatcttgt tcaatcatct gttaatcaga  6300
aaaactcaga ttaatcgaca aattcgatcg cacaaactag aaactaacac cagatctaga  6360
tagaaatcac aaatcgaaga gtaattattc gacaaaactc aaattatttg aacaaatcgg  6420
atgatattta tgaaacccta atcgagaatt aagatgatat ctaacgatca aacccagaaa  6480
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agaagaagag ctctttgggt attgttttat agaagaagaa gaagaaaaga cgaggacgac  6720
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gttgagattt aacgatcgtt acgatttata tttttttagc attatcgttt tattttttaa  7020
atatacggtg gagctgaaaa ttggcaataa ttgaaccgtg ggtcccactg cattgaagcg  7080
tatttcgtat tttctagaat tcttcgtgct ttatttcttt tcctttttgt ttttttttgc  7140
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ttttgtatga ttattgattt gcataggata atgacttttg tatcaagttg gtgaacaagt  7320
ctcgttaaaa aaggcaagtg gtttggtgac tcgatttatt cttgttattt aattcatata  7380
tcaatggatc ttatttgggg cctggtccat atttaacact cgtgttcagt ccaatgacca  7440
ataatatttt ttcattaata acaatgtaac aagaatgata cacaaaacat tctttgaata  7500
agttcgctat gaagaaggga acttatccgg tcctagatca tcagttcata caaacctcca  7560
tagagttcaa catcttaaac aaggatatcc tgatccgttg acggcgcgcc aagcggggcc  7620
gcatttaaat gggccctatc taatcgaatt ttgtaaactg gtttgataag ccatcaatgc  7680
atcagtcaag aatgaatcat tgcaactaag ttgatataat tcaatttacc atagaactca  7740
aatgttgata tcttcttatg gattttctga tcttctacat tattagaaag aaacttgatt  7800
taccagtaat gatgatacat atccaataga acgaaataag ccaatcttta taggttttgg  7860
tagtaaagtt acaacatcag agacatgtat gtattgtctc tcagaagagc tcttgaccga  7920
tcagagtttg aagaaaaatt tattacacac tttatgtaaa gctgaaaaaa acggcctccc  7980
gcagggaagc cgtttttttc gttatctgat ttttgtaaag gtctgatact cgtccgttgt  8040
tttgtaaatc agccagtcgc ttgagtaaag aatccggtct gaatttctga agcctgatgt  8100
atagttaata tccgcttcac gccatgttcg tccgcttttg cccgggagtt tgccttccct  8160
gtttgagaag atgtctccgc cgatgctttt ccccggagcg acgtctgcaa ggttcccttt  8220
tgatgccacc cagccgaggg cttgtgcttc tgattttgta atgtaattat caggtagctt  8280
atgatatgtc tgaagataat ccgcaacccc gtcaaacgtg ttgataacct gtgccatgtt  8340
cccgtttgat acctgaattt tggccattct cataaatctt ctaaaaacag cagaactgac  8400
tattcaaaga aagtagaacc cacagaaagt aatcaaagta gtttgattaa atgcgttgtg  8460
tatcatcgca gcccctgcta cggatattta taggaaaggt ttgagagcaa tgtgtgcagc  8520
aagttgtgtg tgaatcacct gcttccatgg cggaggataa ataatttagt cacgcattta  8580
gttgaacgta actactaact cctctaccgc taatcattct tcttttgccc gggcaagttc  8640
aacaacaacc ccacaatcac gcttcctgta ttttgttttg ttttcaaaac aatagaattc  8700
actttttact gccaaaatta tgttttactc gagagcccaa atgcggccgc ggccgggtgg  8760
tgacatttat tcataaattc atctcaaaac aagaaggatt tacaaaaata aaagaaaaca  8820
aaattttcat ctttaacata attataattg tgttcacaaa attcaaactt aaacccttaa  8880
tataaagaat ttctttcaac aatacacttt aatcacaact tcttcaatca caacctcctc  8940
caacaaaatt aaaatagatt aataaataaa taaacttaac tatttaaaaa aaaatattat  9000
acaaaattta ttaaaacttc aaaataaaca aactttttat acaaaattca tcaaaacttt  9060
aaaataaagc taaacactga aaatgtgagt acatttaaaa ggacgctgat cacaaaaatt  9120
ttgaaaacat aaacaaactt gaaactctac cttttaagaa tgagtttgtc gtctcattaa  9180
ctcattagtt ttatagttcg aatccaatta acgtatcttt tattttatgg aataagggtg  9240
ttttaataag tgattttggg atttttttag taatttattt gtgatatgtt atggagtttt  9300
taaaaatata tatatatata tatatttttg ggttgagttt acttaaaatt tggaaaaggt  9360
tggtaagaac tataaattga gttgtgaatg agtgttttat ggatttttta agatgttaaa  9420
tttatatatg taattaaaat tttattttga ataacaaaaa ttataattgg ataaaaaatt  9480
gttttgttaa atttagagta aaaatttcaa aatctaaaat aattaaacac tattattttt  9540
aaaaaatttg ttggtaaatt ttatcttata tttagttaaa atttagaaaa aattaatttt  9600
aaattaataa acttttgaag tcaaatattc caaatatttt ccaaaatatt aaatctattt  9660
tgcattcaaa atacaattta aataataaaa cttcatggaa tagattaacc aatttgtata  9720
aaaaccaaaa atctcaaata aaatttaaat tacaaaacat tatcaacatt atgatttcaa  9780
gaaagacaat aaccagtttc caataaaata aaaaacctca tggcccgtaa ttaagatctc  9840
attaattaat tcttattttt taattttttt acatagaaaa tatctttata tcgtatccaa  9900
gaaatataga atgttctcgt ccagggacta ttaatctcca aacaagtttc aaaatcatta  9960
cattaaagct catcatgtca tttgtggatt ggaaattata ttgtataaga gaaatataga  10020
atgttctcgt ctagggacta ttaatttcca aacaaatttc aaaatcatta cattaaagct  10080
catcatgtca tttgtggatt ggaaattaga caaaaaaaat cccaaatatt tctctcaatc  10140
tcccaaaata tagttcgaac tccatatttt tggaaattga gaattttttt acccaataat  10200
atattttttt atacatttta gagattttcc agacatattt gctctgggat ttattggaat  10260
gaaggtttga gttataaact ttcagtaatc caagtatctt cggtttttga agatactaaa  10320
tccattatat aataaaaaca cattttaaac accaatttaa tgggatttca gatttgtatc  10380
ccatgctatt ggctaaggca tttttcttat tgtaatctaa ccaattctaa tttccaccct  10440
ggtgtgaact gactgacaaa tgcggtccga aaacagcgaa tgaaatgtct gggtgatcgg  10500
tcaaacaagc ggtgggcgag agagcgcggg tgttggccta gccgggatgg gggtaggtag  10560
acggcgtatt accggcgagt tgtccgaatg gagttttcgg ggtaggtagt aacgtagacg  10620
tcaatggaaa aagtcataat ctccgtcaaa aatccaaccg ctccttcaca tcgcagagtt  10680
ggtggccacg ggaccctcca cccactcact cgatcgcctg ccgtggttgc ccattattca  10740
accatacgcc acttgactct tcaccaacaa ttccaggccg gctttctata caatgtactg  10800
cacaggaaaa tccaatataa aaagccggcc tctgcttcct tctcagtagc ccccagctca  10860
ttcaattctt cccactgcag gctacatttg tcagacacgt tttccgccat ttttcgcctg  10920
tttctgcgga gaatttgatc aggttcggat tgggattgaa tcaattgaaa ggtttttatt  10980
ttcagtattt cgatcgccgg atcccccggg ctgcaggaat tgggctgcag atcgatattt  11040
gatttcacat gctattgtaa tgtatttatt gtttcaattc cgaattagac aaagtgctta  11100
aagctctctt ttcggatttt ttttttcatt aatgtataat aattgcggac attacaatat  11160
actgtacaac gtgatttgag cttgatgaat tacaagattg gaagaacttc gaagacaaaa  11220
aaaaaatcga tctgcaggaa ttcgtccagc agtaattcgg tacccctgat cagcactgct  11280
gccaagaatg taagttttta tttcttttat atgttcaaac agttttataa agtactataa  11340
gcttttttta gccaaaagaa atatcttaag ttttagtaac caataaagaa ttattgcggc  11400
ctccttattt aattatagta catatgtcat agtagatgtt ttttttatta ttattatttt  11460
ttattttttt atagtttttt acaaattcga cttggagacc ttatgatttg gaagatactc  11520
catttaattt tatgagttgt gtttgaaaac atattttaag actaaacacg tagagaacat  11580
tcttaacaaa tttgtaaata aataaattta actctattct ctaggattta aatattatag  11640
gtatatatat aattttctaa taagtttata tcgagtcact catacgagtt gtgtagaaag  11700
ttaatcacgg gtaccaattt taaattaaaa ataagaataa ttatatgatc ttaaatttat    11760
acaactctga taaaagattg ggctttgaca tctttgaaga aaactagatt tagtaatatt    11820
ctgattaaat tgggttcaca ctttgtagtg ggcacacttt ccgggttcga aatcgaaatc    11880
tggaagctta tcgatctcga ggggcccact agtatcgatc tcgaggggcc cactagtatc    11940
gatcgatttt ttttttgtct tcgaagttct tccaatcttg taattcatca agctcaaatc    12000
acgttgtaca gtatattgta atgtccgcaa ttattataca ttaatgaaaa aaaaaatccg    12060
aaaagagagc tttaagcact ttgtctaatt cggaattgaa acaataaata cattacaata    12120
gcatgtgaaa tcaaatatcg atccgatggg tgttatttgt ggataataaa ttcgggtgat    12180
gttcagtgtt tgtcgtattt ctcacgaata aattgtgttt atgtatgtgt tagtgttgtt    12240
tgtctgtttc agaccctctt atgttatatt tttcttttcg tcggtcagtt gaagccaata    12300
ctggtgtcct ggccggcact gcaataccat ttcgtttaat ataaagactc tgttatccgt    12360
gagctcgaat ttccccgatc gttcaaacat ttggcaataa agtttcttaa gattgaatcc    12420
tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata atttctgttg aattacgtta agcatgtaat    12480
aattaacatg taatgcatga cgttatttat gagatgggtt tttatgatta gagtcccgca    12540
attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg ataaattatc    12600
gcgcgcggtg tcatctatgt tactagatcg c                                   12631
<210>23
<211>16396
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成载体序列
<400>23
ggccgcattt gggctcctgc aggtacctta attaaaagtt taaactatca gtgtttgaca   60
ggatatattg gcgggtaaac ctaagagaaa agagcgttta ttagaataat cggatattta   120
aaagggcgtg aaaaggttta tccgttcgtc catttgtatg tgcatgccaa ccacagggtt   180
ccccagatcc gccggcgttg tggatacctc gcggaaaact tggccctcac tgacagatga   240
ggggcggacg ttgacacttg aggggccgac tcacccggcg cggcgttgac agatgagggg   300
caggctcgat ttcggccggc gacgtggagc tggccagcct cgcaaatcgg cgaaaacgcc   360
tgattttacg cgagtttccc acagatgatg tggacaagcc tggggataag tgccctgcgg   420
tattgacact tgaggggcgc gactactgac agatgagggg cgcgatcctt gacacttgag   480
gggcagagtg ctgacagatg aggggcgcac ctattgacat ttgaggggct gtccacaggc   540
agaaaatcca gcatttgcaa gggtttccgc ccgtttttcg gccaccgcta acctgtcttt   600
taacctgctt ttaaaccaat atttataaac cttgttttta accagggctg cgccctgtgc   660
gcgtgaccgc gcacgccgaa ggggggtgcc cccccttctc gaaccctccc ggcccgctaa   720
cgcgggcctc ccatcccccc aggggctgcg cccctcggcc gcgaacggcc tcaccccaaa   780
aatggcagcg ctggcagtcc ataattgtgg tccaatttgc agccgtccga gacaggagga   840
catcgtccag ctgaaaccgg ggcagaatcc ggccatttct gaagagaaaa atggtaaact   900
gatagaataa aatcataaga aaggagccgc acatgaaaaa agcagtcatt aacggggaac   960
aaatcagaag tatcagcgac ctccaccaga cattgaaaaa ggagcttgcc cttccggaat   1020
actacggtga aaacctggac gctttatggg attgtctgac cggatgggtg gagtacccgc   1080
tcgttttgga atggaggcag tttgaacaaa gcaagcagct gactgaaaat ggcgccgaga   1140
gtgtgcttca ggttttccgt gaagcgaaag cggaaggctg cgacatcacc atcatacttt   1200
cttaatacga tcaatgggag atgaacaata tggaaacaca aaccacaatt gtggtttcaa   1260
aatcggctcc gtcgatacta tgttatacgc caactttgaa aacaactttg aaaaagctgt   1320
tttctggtat ttaaggtttt agaatgcaag gaacagtgaa ttggagttcg tcttgttata   1380
attagcttct tggggtatct ttaaatactg tagaaaagag gaaggaaata ataaatggct   1440
aaaatgagaa tatcaccgga attgaaaaaa ctgatcgaaa aataccgctg cgtaaaagat   1500
acggaaggaa tgtctcctgc taaggtatat aagctggtgg gagaaaatga aaacctatat   1560
ttaaaaatga cggacagccg gtataaaggg accacctatg atgtggaacg ggaaaaggac   1620
atgatgctat ggctggaagg aaagctgcct gttccaaagg tcctgcactt tgaacggcat   1680
gatggctgga gcaatctgct catgagtgag gccgatggcg tcctttgctc ggaagagtat   1740
gaagatgaac aaagccctga aaagattatc gagctgtatg cggagtgcat caggctcttt   1800
cactccatcg acatatcgga ttgtccctat acgaatagct tagacagccg cttagccgaa  1860
ttggattact tactgaataa cgatctggcc gatgtggatt gcgaaaactg ggaagaagac  1920
actccattta aagatccgcg cgagctgtat gattttttaa agacggaaaa gcccgaagag  1980
gaacttgtct tttcccacgg cgacctggga gacagcaaca tctttgtgaa agatggcaaa  2040
gtaagtggct ttattgatct tgggagaagc ggcagggcgg acaagtggta tgacattgcc  2100
ttctgcgtcc ggtcgatcag ggaggatatc ggggaagaac agtatgtcga gctatttttt  2160
gacttactgg ggatcaagcc tgattgggag aaaataaaat attatatttt actggatgaa  2220
ttgttttagt acctagatgt ggcgcaacga tgccggcgac aagcaggagc gcaccgactt  2280
cttccgcatc aagtgttttg gctctcaggc cgaggcccac ggcaagtatt tgggcaaggg  2340
gtcgctggta ttcgtgcagg gcaagattcg gaataccaag tacgagaagg acggccagac  2400
ggtctacggg accgacttca ttgccgataa ggtggattat ctggacacca aggcaccagg  2460
cgggtcaaat caggaataag ggcacattgc cccggcgtga gtcggggcaa tcccgcaagg  2520
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gttttccgcc gaggatgccg aaaccatcgc aagccgcacc gtcatgcgtg cgccccgcga  2640
aaccttccag tccgtcggct cgatggtcca gcaagctacg gccaagatcg agcgcgacag  2700
cgtgcaactg gctccccctg ccctgcccgc gccatcggcc gccgtggagc gttcgcgtcg  2760
tctcgaacag gaggcggcag gtttggcgaa gtcgatgacc atcgacacgc gaggaactat  2820
gacgaccaag aagcgaaaaa ccgccggcga ggacctggca aaacaggtca gcgaggccaa  2880
gcaggccgcg ttgctgaaac acacgaagca gcagatcaag gaaatgcagc tttccttgtt  2940
cgatattgcg ccgtggccgg acacgatgcg agcgatgcca aacgacacgg cccgctctgc  3000
cctgttcacc acgcgcaaca agaaaatccc gcgcgaggcg ctgcaaaaca aggtcatttt  3060
ccacgtcaac aaggacgtga agatcaccta caccggcgtc gagctgcggg ccgacgatga  3120
cgaactggtg tggcagcagg tgttggagta cgcgaagcgc acccctatcg gcgagccgat  3180
caccttcacg ttctacgagc tttgccagga cctgggctgg tcgatcaatg gccggtatta  3240
cacgaaggcc gaggaatgcc tgtcgcgcct acaggcgacg gcgatgggct tcacgtccga  3300
ccgcgttggg cacctggaat cggtgtcgct gctgcaccgc ttccgcgtcc tggaccgtgg  3360
caagaaaacg tcccgttgcc aggtcctgat cgacgaggaa atcgtcgtgc tgtttgctgg  3420
cgaccactac acgaaattca tatgggagaa gtaccgcaag ctgtcgccga cggcccgacg  3480
gatgttcgac tatttcagct cgcaccggga gccgtacccg ctcaagctgg aaaccttccg  3540
cctcatgtgc ggatcggatt ccacccgcgt gaagaagtgg cgcgagcagg tcggcgaagc  3600
ctgcgaagag ttgcgaggca gcggcctggt ggaacacgcc tgggtcaatg atgacctggt  3660
gcattgcaaa cgctagggcc ttgtggggtc agttccggct gggggttcag cagccagcgc  3720
tttactggca tttcaggaac aagcgggcac tgctcgacgc acttgcttcg ctcagtatcg  3780
ctcgggacgc acggcgcgct ctacgaactg ccgatagaca actgtcacgg ttaagcgaga  3840
aatgaataag aaggctgata attcggatct ctgcgaggga gatgatattt gatccggtgt  3900
gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg  3960
ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag  4020
gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa  4080
ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc  4140
cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca  4200
ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg  4260
accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct  4320
catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt  4380
gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag  4440
tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc  4500
agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac  4560
actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga  4620
gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc  4680
aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tatcaagaag atcctttgat cttttctacg  4740
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cagcaacgct ctgtcatcgt tacaatcaac atgctaccct ccgcgagatc atccgtgttt  4980
caaacccggc agcttagttg ccgttcttcc gaatagcatc ggtaacatga gcaaagtctg  5040
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ttgtggtgta aacaaattga cgcttagaca acttaataac acaccgcggt ctagaactag  5220
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agtttgcgcg ctatattttg ttttctatcg cgtattaaat gtataattgc gggactctaa  5340
tcataaaaac ccatctcata aataacgtca tgcattacat gttaattatt acatgcttaa  5400
cgtaattcaa cagaaattat atgataatca tcgcaagacc ggcaacagga ttcaatctta  5460
agaaacttta ttgccaaatg tttgaacgat ccctcagaag aactcgtcaa gaaggcgata  5520
gaaggcgatg cgctgcgaat cgggagcggc gataccgtaa agcacgagga agcggtcagc  5580
ccattcgccg ccaagctctt cagcaatatc acgggtagcc aacgctatgt cctgatagcg  5640
gtccgccaca cccagccggc cacagtcgat gaatccagaa aagcggccat tttccaccat  5700
gatattcggc aagcaggcat cgccatgggt cacgacgaga tcctcgccgt cgggcatgcg  5760
cgccttgagc ctggcgaaca gttcggctgg cgcgagcccc tgatgctctt cgtccagatc  5820
atcctgatcg acaagaccgg cttccatccg agtacgtgct cgctcgatgc gatgtttcgc  5880
ttggtggtcg aatgggcagg tagccggatc aagcgtatgc agccgccgca ttgcatcagc  5940
catgatggat actttctcgg caggagcaag gtgagatgac aggagatcct gccccggcac  6000
ttcgcccaat agcagccagt cccttcccgc ttcagtgaca acgtcgagca cagctgcgca  6060
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ggcaccggac aggtcggtct tgacaaaaag aaccgggcgc ccctgcgctg acagccggaa  6180
cacggcggca tcagagcagc cgattgtctg ttgtgcccag tcatagccga atagcctctc  6240
cacccaagcg gccggagaac ctgcgtgcaa tccatcttgt tcaatcatct gttaatcaga  6300
aaaactcaga ttaatcgaca aattcgatcg cacaaactag aaactaacac cagatctaga  6360
tagaaatcac aaatcgaaga gtaattattc gacaaaactc aaattatttg aacaaatcgg  6420
atgatattta tgaaacccta atcgagaatt aagatgatat ctaacgatca aacccagaaa  6480
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tatcgtataa catattgtga aattatccat ttcttttaat tttttagtgt tattggatat  7260
ttttgtatga ttattgattt gcataggata atgacttttg tatcaagttg gtgaacaagt  7320
ctcgttaaaa aaggcaagtg gtttggtgac tcgatttatt cttgttattt aattcatata  7380
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ataatatttt ttcattaata acaatgtaac aagaatgata cacaaaacat tctttgaata  7500
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tctaatttct tgttcttcat gtgtatatta attttccctt aagacttaaa taaaaagaga  9960
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atgtcactct aattttgcca gcatggcagt tggcagccaa tcactagctc gataaattta  12240
aggtttcaga ggaattttaa tttatttagg gttcatattg tttcataaaa tgattcttta   12300
tttgttacaa ctttaaggaa atattttatt aactatttaa ttgttccctt ttcttatatt   12360
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agattaataa ataaataaac ttaactattt aaaaaaaaat attatacaaa atttattaaa   12780
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atatatatat ttttgggttg agtttactta aaatttggaa aaggttggta agaactataa   13140
attgagttgt gaatgagtgt tttatggatt ttttaagatg ttaaatttat atatgtaatt   13200
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atttaaataa taaaacttca tggaatagat taaccaattt gtataaaaac caaaaatctc   13500
aaataaaatt taaattacaa aacattatca acattatgat ttcaagaaag acaataacca   13560
gtttccaata aaataaaaaa cctcatggcc cgtaattaag atctcattaa ttaattctta   13620
ttttttaatt tttttacata gaaaatatct ttatatcgta tccaagaaat atagaatgtt   13680
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ctccacccac tcactcgatc gcctgccgtg gttgcccatt attcaaccat acgccacttg   14520
actcttcacc aacaattcca ggccggcttt ctatacaatg tactgcacag gaaaatccaa   14580
tataaaaagc cggcctctgc ttccttctca gtagccccca gctcattcaa ttcttcccac   14640
tgcaggctac atttgtcaga cacgttttcc gccatttttc gcctgtttct gcggagaatt   14700
tgatcaggtt cggattggga ttgaatcaat tgaaaggttt ttattttcag tatttcgatc   14760
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tgtaatgtat ttattgtttc aattccgaat tagacaaagt gcttaaagct ctcttttcgg   14880
attttttttt tcattaatgt ataataattg cggacattac aatatactgt acaacgtgat   14940
ttgagcttga tgaattacaa gattggaaga acttcgaaga caaaaaaaaa atcgatctgc   15000
aggaattcgt ccagcagtaa ttcggtaccc ctgatcagca ctgctgccaa gaatgtaagt   15060
ttttatttct tttatatgtt caaacagttt tataaagtac tataagcttt ttttagccaa   15120
aagaaatatc ttaagtttta gtaaccaata aagaattatt gcggcctcct tatttaatta   15180
tagtacatat gtcatagtag atgttttttt tattattatt attttttatt tttttatagt   15240
tttttacaaa ttcgacttgg agaccttatg atttggaaga tactccattt aattttatga   15300
gttgtgtttg aaaacatatt ttaagactaa acacgtagag aacattctta acaaatttgt   15360
aaataaataa atttaactct attctctagg atttaaatat tataggtata tatataattt   15420
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aattttaaat taaaaataag aataattata tgatcttaaa tttatacaac tctgataaaa   15540
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ttgtaatgtc cgcaattatt atacattaat gaaaaaaaaa atccgaaaag agagctttaa  15840
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cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc  16380
tatgttacta gatcgc                                                  16396
<210>24
<211>7970
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成载体序列
<400>24
cgccggcgtt gtggatacct cgcggaaaac ttggccctca ctgacagatg aggggcggac   60
gttgacactt gaggggccga ctcacccggc gcggcgttga cagatgaggg gcaggctcga   120
tttcggccgg cgacgtggag ctggccagcc tcgcaaatcg gcgaaaacgc ctgattttac   180
gcgagtttcc cacagatgat gtggacaagc ctggggataa gtgccctgcg gtattgacac   240
ttgaggggcg cgactactga cagatgaggg gcgcgatcct tgacacttga ggggcagagt   300
gctgacagat gaggggcgca cctattgaca tttgaggggc tgtccacagg cagaaaatcc   360
agcatttgca agggtttccg cccgtttttc ggccaccgct aacctgtctt ttaacctgct   420
tttaaaccaa tatttataaa ccttgttttt aaccagggct gcgccctgtg cgcgtgaccg   480
cgcacgccga aggggggtgc ccccccttct cgaaccctcc cggcccgcta acgcgggcct   540
cccatccccc caggggctgc gcccctcggc cgcgaacggc ctcaccccaa aaatggcagc   600
gctggcagtc cataattgtg gtccaatttg cagccgtccg agacaggagg acatcgtcca   660
gctgaaaccg gggcagaatc cggccatttc tgaagagaaa aatggtaaac tgatagaata   720
aaatcataag aaaggagccg cacatgaaaa aagcagtcat taacggggaa caaatcagaa   780
gtatcagcga cctccaccag acattgaaaa aggagcttgc ccttccggaa tactacggtg   840
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aatggaggca gtttgaacaa agcaagcagc tgactgaaaa tggcgccgag agtgtgcttc   960
aggttttccg tgaagcgaaa gcggaaggct gcgacatcac catcatactt tcttaatacg   1020
atcaatggga gaggaacaat atggaaacac aaaccacaat tgtggtttca aaatcggctc   1080
cgtcgatact atgttatacg ccaactttga aaacaacttt gaaaaagctg ttttctggta   1140
tttaaggttt tagaatgcaa ggaacagtga attggagttc gtcttgttat aattagcttc   1200
ttggggtatc tttaaatact gtagaaaaga ggaaggaaat aataaatggc taaaatgaga   1260
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tggctggaag gaaagctgcc tgttccaaag gtcctgcact ttgaacggca tgatggctgg   1500
agcaatctgc tcatgagtga ggccgatggc gtcctttgct cggaagagta tgaagatgaa   1560
caaagccctg aaaagattat cgagctgtat gcggagtgca tcaggctctt tcactccatc   1620
gacatatcgg attgtcccta tacgaatagc ttagacagcc gcttagccga attggattac   1680
ttactgaata acgatctggc cgatgtggat tgcgaaaact gggaagaaga cactccattt   1740
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tcaggaataa gggcacattg ccccggcgtg agtcggggca atcccgcaag gagggtgaat   2340
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ggaggcggca ggtttggcga agtcgatgac catcgacacg cgaggaacta tgacgaccaa   2640
gaagcgaaaa accgccggcg aggacctggc aaaacaggtc agcgaggcca agcaggccgc   2700
gttgctgaaa cacacgaagc agcagatcaa ggaaatgcag ctttccttgt tcgatattgc   2760
gccgtggccg gacacgatgc gagcgatgcc aaacgacacg gcccgctctg ccctgttcac   2820
cacgcgcaac aagaaaatcc cgcgcgaggc gctgcaaaac aaggtcattt tccacgtcaa   2880
caaggacgtg aagatcacct acaccggcgt cgagctgcgg gccgacgatg acgaactggt   2940
gtggcagcag gtgttggagt acgcgaagcg cacccctatc ggcgagccga tcaccttcac   3000
gttctacgag ctttgccagg acctgggctg gtcgatcaat ggccggtatt acacgaaggc   3060
cgaggaatgc ctgtcgcgcc tacaggcgac ggcgatgggc ttcacgtccg accgcgttgg   3120
gcacctggaa tcggtgtcgc tgctgcaccg cttccgcgtc ctggaccgtg gcaagaaaac   3180
gtcccgttgc caggtcctga tcgacgagga aatcgtcgtg ctgtttgctg gcgaccacta   3240
cacgaaattc atatgggaga agtaccgcaa gctgtcgccg acggcccgac ggatgttcga   3300
ctatttcagc tcgcaccggg agccgtaccc gctcaagctg gaaaccttcc gcctcatgtg   3360
cggatcggat tccacccgcg tgaagaagtg gcgcgagcag gtcggcgaag cctgcgaaga   3420
gttgcgaggc agcggcctgg tggaacacgc ctgggtcaat gatgacctgg tgcattgcaa   3480
acgctagggc cttgtggggt cagttccggc tgggggttca gcagccagcg ctttactggc   3540
atttcaggaa caagcgggca ctgctcgacg cacttgcttc gctcagtatc gctcgggacg   3600
cacggcgcgc tctacgaact gccgatagac aactgtcacg gttaagcgag aaatgaataa   3660
gaaggctgat aattcggatc tctgcgaggg agatgatatt tgatcacagg cagcaacgct   3720
ctgtcatcgt tacaatcaac atgctaccct ccgcgagatc atccgtgttt caaacccggc   3780
agcttagttg ccgttcttcc gaatagcatc ggtaacatga gcaaagtctg ccgccttaca   3840
acggctctcc cgctgacgcc gtcccggact gatgggctgc ctgtatcgag tggtgatttt   3900
gtgccgagct gccggtcggg gagctgttgg ctggctggtg gcaggatata ttgtggtgta   3960
aacaaattga cgcttagaca acttaataac acattgcgga cgtttttaat gtactggggt   4020
ggtttttctt ttcaccagtg agacgggcaa cagctgattg cccttcaccg cctggccctg   4080
agagagttgc agcaagcggt ccacgctggt ttgccccagc aggcgaaaat cctgtttgat   4140
ggtggttccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagcccga gatagggttg   4200
agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa   4260
gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccacggccgc tctagaacta gtggatcccc   4320
cctacgtgcg atctagtaac atagatgaca ccgcgcgcga taatttatcc tagtttgcgc   4380
gctatatttt gttttctatc gcgtattaaa tgtataattg cgggactcta atcataaaaa   4440
cccatctcat aaataacgtc atgcattaca tgttaattat tacatgctta acgtaattca   4500
acagaaatta tatgataatc atcgcaagac cggcaacagg attcaatctt aagaaacttt   4560
attgccaaat gtttgaacga tccctcagaa gaactcgtca agaaggcgat agaaggcgat   4620
gcgctgcgaa tcgggagcgg cgataccgta aagcacgagg aagcggtcag cccattcgcc   4680
gccaagctct tcagcaatat cacgggtagc caacgctatg tcctgatagc ggtccgccac   4740
acccagccgg ccacagtcga tgaatccaga aaagcggcca ttttccaccatgatattcgg    4800
caagcaggca tcgccatggg tcacgacgag atcctcgccg tcgggcatgc gcgccttgag   4860
cctggcgaac agttcggctg gcgcgagccc ctgatgctct tcgtccagat catcctgatc   4920
gacaagaccg gcttccatcc gagtacgtgc tcgctcgatg cgatgtttcg cttggtggtc   4980
gaatgggcag gtagccggat caagcgtatg cagccgccgc attgcatcag ccatgatgga   5040
tactttctcg gcaggagcaa ggtgagatga caggagatcc tgccccggca cttcgcccaa   5100
tagcagccag tcccttcccg cttcagtgac aacgtcgagc acagctgcgc aaggaacgcc   5160
cgtcgtggcc agccacgata gccgcgctgc ctcgtcctgg agttcattca gggcaccgga   5220
caggtcggtc ttgacaaaaa gaaccgggcg cccctgcgct gacagccgga acacggcggc   5280
atcagagcag ccgattgtct gttgtgccca gtcatagccg aatagcctct ccacccaagc   5340
ggccggagaa cctgcgtgca atccatcttg ttcaatcatc tgttaatcag aaaaactcag   5400
attaatcgac aaattcgatc gcacaaacta gaaactaaca ccagatctag atagaaatca   5460
caaatcgaag agtaattatt cgacaaaact caaattattt gaacaaatcg gatgatattt   5520
atgaaaccct aatcgagaat taagatgata tctaacgatc aaacccagaa aatcgtcttc  5580
gatctaagat taacagaatc taaaccaaag aacatatacg aaattgggat cgaacgaaaa  5640
caaaatcgaa gattttgaga gaataaggaa cacagaaatt taccttgatc acggtagaga  5700
gaattgagag aaagttttta agattttgag aaattgaaat ctgaattgtg aagaagaaga  5760
gctctttggg tattgtttta tagaagaaga agaagaaaag acgaggacga ctaggtcacg  5820
agaaagctaa ggcggtgaag caatagctaa taataaaatg acacgtgtat tgagcgttgt  5880
ttacacgcaa agttgttttt ggctaattgc cttattttta ggttgaggaa aagtatttgt  5940
gctttgagtt gataaacacg actcgtgtgt gccggctgca accactttga cgccgtttat  6000
tactgactcg tcgacaacca caatttctaa cggtcgtcat aagatccagc cgttgagatt  6060
taacgatcgt tacgatttat atttttttag cattatcgtt ttatttttta aatatacggt  6120
ggagctgaaa attggcaata attgaaccgt gggtcccact gcattgaagc gtatttcgta  6180
ttttctagaa ttcttcgtgc tttatttctt ttcctttttg tttttttttg ccatttatct  6240
aatgcaagtg ggcttataaa atcagtgaat ttcttggaaa agtaacttct ttatcgtata  6300
acatattgtg aaattatcca tttcttttaa ttttttagtg ttattggata tttttgtatg  6360
attattgatt tgcataggat aatgactttt gtatcaagtt ggtgaacaag tctcgttaaa  6420
aaaggcaagt ggtttggtga ctcgatttat tcttgttatt taattcatat atcaatggat  6480
cttatttggg gcctggtcca tatttaacac tcgtgttcag tccaatgacc aataatattt  6540
tttcattaat aacaatgtaa caagaatgat acacaaaaca ttctttgaat aagttcgcta  6600
tgaagaaggg aacttatccg gtcctagatc atcagttcat acaaacctcc atagagttca  6660
acatcttaaa caaggatatc ctgatccgtt gacggcgcgc caagcggccg catttaaatg  6720
ggccctatct aatcgaattt tgtaaactgg tttgataagc catcaatgca tcagtcaaga  6780
atgaatcatt gcaactaagt tgatataatt caatttacca tagaactcaa atgttgatat  6840
cttcttatgg attttctgat cttctacatt attagaaaga aacttgattt accagtaatg  6900
atgatacata tccaatagaa cgaaataagc caatctttat aggttttggt agtaaagtta  6960
caacatcaga gacatgtatg tattgtctct cagaagagct cttgaccgat cagagtttga  7020
agaaaaattt attacacact ttatgtaaag ctgaaaaaaa cggcctcccg cagggaagcc  7080
gtttttttcg ttatctgatt tttgtaaagg tctgatactc gtccgttgtt ttgtaaatca  7140
gccagtcgct tgagtaaaga atccggtctg aatttctgaa gcctgatgta tagttaatat  7200
ccgcttcacg ccatgttcgt ccgcttttgc ccgggagttt gccttccctg tttgagaaga  7260
tgtctccgcc gatgcttttc cccggagcga cgtctgcaag gttccctttt gatgccaccc  7320
agccgagggc ttgtgcttct gattttgtaa tgtaattatc aggtagctta tgatatgtct  7380
gaagataatc cgcaaccccg tcaaacgtgt tgataacctg tgccataaat cttctaaaaa  7440
cagcagaact gactattcaa agaaagtaga acccacagaa agtaatcaaa gtagtttgat  7500
taaatgcgtt gtgtatcatc gcagcccctg ctacggatat ttataggaaa ggtttgagag  7560
caatgtgtgc agcaagttgt gtgtgaatca cctgcttcca tggcggagga taaataattt  7620
agtcacgcat ttagttgaac gtaactacta actcctctac cgctaatcat tcttcttttg  7680
cccgggcaag ttcaacaaca accccacaat cacgcttcct gtattttgtt ttgttttcaa  7740
aacaatagaa ttcacttttt actgccaaaa ttatgtttta ctcgagagcc cgggctcctg  7800
caggtacctt aattaaaagt ttaaactatc agtgtttgac aggatatatt ggcgggtaaa  7860
cctaagagaa aagagcgttt attagaataa tcggatattt aaaagggcgt gaaaaggttt  7920
atccgttcgt ccatttgtat gtgcatgcca accacagggt tccccagatc             7970
<210>25
<211>10312
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成载体序列
<400>25
gtttacccgc caatatatcc tgtcaaacac tgatagttta aacttttaat taaggtacct   60
gcaggagccc gggctctcga gcagcaaata tgatttagat tatgacctag aaataagcat   120
agcattaaag catatacaaa acaagcggtg atatactctg actgccactg tacttgagga   180
aaggtagtgg actctgctca ggtacattag tttggtaagg ttggcttggc ttctgggtaa   240
tatgagaagt aaagaagtaa aaggtatttg actctagtca agtacattgg attgccttcg   300
tcggggcttg gatggcttgg gttcgtgtga gaagccaaca atttataaaa aaatatattg  360
aaaaaaaaaa aaatcgtcta agtgttggaa gtgaaaacgg tgggacataa atatacacag  420
aagagtactt taacaatgcg caaccaaggc agattcacaa cttgatttct ggacctcgaa  480
tacgagataa tggtggtaag aaataaagga agagtggagt gcatttgaaa atgaatggag  540
agcgcacaaa atggaggacg aataaatgaa atataatgca agagtgcatt tccctattat  600
ttccagaaat gtatatgtgg ggtcggcatt cacatgggcg tcgcattcag ggggtgtcat  660
agcggtcctt tgattgcagt gtgggagttg caacatgtac caacaaattc attcatccca  720
aaacctaaat ttatcctctc cattactatt acctacacct atacctagta aatatgtcct  780
gccttgtaac tcctccactg cctgcacacg tcttagtcaa tccatctgcc ttcaaatagg  840
cattattttg ttctttcccc tccgactgaa aggctatcga ccgaccgacc gctcatcttc  900
ttcttctgcg caattttttc tgctggatca tcatcattac catcatcgcc atccccacca  960
tcatcatcat gatggtatct ctatctctcc ctggcaatcg attgtagagg aaaggaagag  1020
ggaaggggca tatgtattga tcaacctacc cgaaaaaaca atctgatcag ccctgctaat  1080
cttgcttata aatctcttat ccactgttca atcattcagg tttcttccca cttccaagca  1140
aaggcgcccg gattggccgt gttcttagat tttcaggtac ttaaatggac aatattcccc  1200
acctgaagcc gttctgaaaa agatttgttt gtagaaacaa acgattgtaa tatttgctta  1260
agttgagctt aaggggtttg gtacctaact tgccttgtgg ttatttgttt ctcagaactc  1320
gggctgcgtc caactgtagg aacgaaccag cacaaggggt tgcagctttt gctgttgctg  1380
ttgcgcccat tgcttttgga ctggtattag tagttgcagc tttgttttgc atacgctgtg  1440
aggatctgtg cgcggaaatt ttgtgtacaa atcatggcac aggttatcaa cacgtttgac  1500
ggggttgcgg attatcttca gacatatcat aagctacctg ataattacat tacaaaatca  1560
gaagcacaag ccctcggctg ggtggcatca aaagggaacc ttgcagacgt cgctccgggg  1620
aaaagcatcg gcggagacat cttctcaaac agggaaggca aactcccggg caaaagcgga  1680
cgaacatggc gtggagcgga tattaactat acatcaggct tcagaaattc agaccggatt  1740
ctttactcaa gcgactggct gatttacaaa acaacggacc attatcagac ctttacaaaa  1800
atcagataac gaaaaaaacg gcttccctgc gggaggccgt ttttttcagc tttacataaa  1860
gtgtgtaata aatttttctt caaactctga tcggtcaatt gcactttgag ctcgaatttc  1920
cccgatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt  1980
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gatatccttg tttaagatgt tgaactctat ggaggtttgt atgaactgat gatctaggac  2280
cggataagtt cccttcttca tagcgaactt attcaaagaa tgttttgtgt atcattcttg  2340
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tggataattt cacaatatgt tatacgataa agaagttact tttccaagaa attcactgat  2640
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ataaatcgta acgatcgtta aatctcaacg gctggatcttatgacgaccgt tagaaattg   2880
tggttgtcga cgagtcagta ataaacggcg tcaaagtggt tgcagccggc acacacgagt  2940
cgtgtttatc aactcaaagc acaaatactt ttcctcaacc taaaaataag gcaattagcc  3000
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cttcaccgcc ttagctttct cgtgacctag tcgtcctcgt cttttcttct tcttcttcta  3120
taaaacaata cccaaagagc tcttcttctt cacaattcag atttcaattt ctcaaaatct  3180
taaaaacttt ctctcaattc tctctaccgt gatcaaggta aatttctgtg ttccttattc  3240
tctcaaaatc ttcgattttg ttttcgttcg atcccaattt cgtatatgtt ctttggttta  3300
gattctgtta atcttagatc gaagacgatt ttctgggttt gatcgttaga tatcatctta  3360
attctcgatt agggtttcat aaatatcatc cgatttgttc aaataatttg agttttgtcg  3420
aataattact cttcgatttg tgatttctat ctagatctgg tgttagtttc tagtttgtgc  3480
gatcgaattt gtcgattaat ctgagttttt ctgattaaca gatgattgaa caagatggat  3540
tgcacgcagg ttctccggcc gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac tgggcacaac  3600
agacaatcgg ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc  3660
tttttgtcaa gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact ccaggacgag gcagcgcggc  3720
tatcgtggct ggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag  3780
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cccaggtcct ggcaaagctc gtagaacgtg aaggtgatcg gctcgccgat aggggtgcgc  7680
ttcgcgtact ccaacacctg ctgccacacc agttcgtcat cgtcggcccg cagctcgacg  7740
ccggtgtagg tgatcttcac gtccttgttg acgtggaaaa tgaccttgtt ttgcagcgcc  7800
tcgcgcggga ttttcttgtt gcgcgtggtg aacagggcag agcgggccgt gtcgtttggc  7860
atcgctcgca tcgtgtccgg ccacggcgca atatcgaaca aggaaagctg catttccttg  7920
atctgctgct tcgtgtgttt cagcaacgcg gcctgcttgg cctcgctgac ctgttttgcc  7980
aggtcctcgc cggcggtttt tcgcttcttg gtcgtcatag ttcctcgcgt gtcgatggtc  8040
atcgacttcg ccaaacctgc cgcctcctgt tcgagacgac gcgaacgctc cacggcggcc  8100
gatggcgcgg gcagggcagg gggagccagt tgcacgctgt cgcgctcgat cttggccgta  8160
gcttgctgga ccatcgagcc gacggactgg aaggtttcgc ggggcgcacg catgacggtg  8220
cggcttgcga tggtttcggc atcctcggcg gaaaaccccg cgtcgatcag ttcttgcctg  8280
tatgccttcc ggtcaaacgt ccgattcatt caccctcctt gcgggattgc cccgactcac  8340
gccggggcaa tgtgccctta ttcctgattt gacccgcctg gtgccttggt gtccagataa  8400
tccaccttat cggcaatgaa gtcggtcccg tagaccgtct ggccgtcctt ctcgtacttg  8460
gtattccgaa tcttgccctg cacgaatacc agcgacccct tgcccaaata cttgccgtgg  8520
gcctcggcct gagagccaaa acacttgatg cggaagaagt cggtgcgctc ctgcttgtcg  8580
ccggcatcgt tgcgccacat ctaggtacta aaacaattca tccagtaaaa tataatattt  8640
tattttctcc caatcaggct tgatccccag taagtcaaaa aatagctcga catactgttc  8700
ttccccgata tcctccctga tcgaccggac gcagaaggca atgtcatacc acttgtccgc  8760
cctgccgctt ctcccaagat caataaagcc acttactttg ccatctttca caaagatgtt  8820
gctgtctccc aggtcgccgt gggaaaagac aagttcctct tcgggctttt ccgtctttaa  8880
aaaatcatac agctcgcgcg gatctttaaa tggagtgtct tcttcccagt tttcgcaatc  8940
cacatcggcc agatcgttat tcagtaagta atccaattcg gctaagcggc tgtctaagct  9000
attcgtatag ggacaatccg atatgtcgat ggagtgaaag agcctgatgc actccgcata  9060
cagctcgata atcttttcag ggctttgttc atcttcatac tcttccgagc aaaggacgcc  9120
atcggcctca ctcatgagca gattgctcca gccatcatgc cgttcaaagt gcaggacctt  9180
tggaacaggc agctttcctt ccagccatag catcatgtcc ttttcccgtt ccacatcata  9240
ggtggtccct ttataccggc tgtccgtcat ttttaaatat aggttttcat tttctcccac  9300
cagcttatat accttagcag gagacattcc ttccgtatct tttacgcagc ggtatttttc  9360
gatcagtttt ttcaattccg gtgatattct cattttagcc atttattatt tccttcctct  9420
tttctacagt atttaaagat accccaagaa gctaattata acaagacgaa ctccaattca  9480
ctgttccttg cattctaaaa ccttaaatac cagaaaacag ctttttcaaa gttgttttca  9540
aagttggcgt ataacatagt atcgacggag ccgattttga aaccacaatt atggactgcc  9600
agcgctgcca tttttggggt gaggccgttc gcggccgagg ggcgcagccc ctggggggat  9660
gggaggcccg cgttagcggg ccgggagggt tcgagaaggg ggggcacccc ccttcggcgt  9720
gcgcggtcac gcgcacaggg cgcagccctg gttaaaaaca aggtttataa atattggttt  9780
aaaagcaggt taaaagacag gttagcggtg gccgaaaaac gggcggaaac ccttgcaaat  9840
gctggatttt ctgcctgtgg acagcccctc aaatgtcaat aggtgcgccc ctcatctgtc  9900
agcactctgc ccctcaagtg tcaaggatcg cgcccctcat ctgtcagtag tcgcgcccct  9960
caagtgtcaa taccgcaggg cacttatccc caggcttgtc cacatcatct gtgggaaact  10020
cgcgtaaaat caggcgtttt cgccgatttg cgaggctggc cagctccacg tcgccggccg  10080
aaatcgagcc tgcccctcat ctgtcaacgc cgcgccgggt gagtcggccc ctcaagtgtc  10140
aacgtccgcc cctcatctgt cagtgagggc caagttttcc gcgaggtatc cacaacgccg  10200
gcggatctgg ggaaccctgt ggttggcatg cacatacaaa tggacgaacg gataaacctt  10260
ttcacgccct tttaaatatc cgattattct aataaacgct cttttctctt ag          10312
<210>26
<211>10312
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成载体序列
<400>26
gtttacccgc caatatatcc tgtcaaacac tgatagttta aacttttaat taaggtacct  60
gcaggagccc gggctctcga gcagcaaata tgatttagat tatgacctag aaataagcat  120
agcattaaag catatacaaa acaagcggtg atatactctg actgccactg tacttgagga  180
aaggtagtgg actctgctca ggtacattag tttggtaagg ttggcttggc ttctgggtaa  240
tatgagaagt aaagaagtaa aaggtatttg actctagtca agtacattgg attgccttcg  300
tcggggcttg gatggcttgg gttcgtgtga gaagccaaca atttataaaa aaatatattg  360
aaaaaaaaaa aaatcgtcta agtgttggaa gtgaaaacgg tgggacataa atatacacag  420
aagagtactt taacaatgcg caaccaaggc agattcacaa cttgatttct ggacctcgaa  480
tacgagataa tggtggtaag aaataaagga agagtggagt gcatttgaaa atgaatggag  540
agcgcacaaa atggaggacg aataaatgaa atataatgca agagtgcatt tccctattat  600
ttccagaaat gtatatgtgg ggtcggcatt cacatgggcg tcgcattcag ggggtgtcat  660
agcggtcctt tgattgcagt gtgggagttg caacatgtac caacaaattc attcatccca  720
aaacctaaat ttatcctctc cattactatt acctacacct atacctagta aatatgtcct  780
gccttgtaac tcctccactg cctgcacacg tcttagtcaa tccatctgcc ttcaaatagg  840
cattattttg ttctttcccc tccgactgaa aggctatcga ccgaccgacc gctcatcttc  900
ttcttctgcg caattttttc tgctggatca tcatcattac catcatcgcc atccccacca  960
tcatcatcat gatggtatct ctatctctcc ctggcaatcg attgtagagg aaaggaagag  1020
ggaaggggca tatgtattga tcaacctacc cgaaaaaaca atctgatcag ccctgctaat  1080
cttgcttata aatctcttat ccactgttca atcattcagg tttcttccca cttccaagca  1140
aaggcgcccg gattggccgt gttcttagat tttcaggtac ttaaatggac aatattcccc  1200
acctgaagcc gttctgaaaa agatttgttt gtagaaacaa acgattgtaa tatttgctta  1260
agttgagctt aaggggtttg gtacctaact tgccttgtgg ttatttgttt ctcagaactc  1320
gggctgcgtc caactgtagg aacgaaccag cacaaggggt tgcagctttt gctgttgctg  1380
ttgcgcccat tgcttttgga ctggtattag tagttgcagc tttgttttgc atacgctgtg  1440
aggatctgtg cgcggaaatt ttgtgtacaa atcatggcac aggttatcaa cacgtttgac  1500
ggggttgcgg attatcttca gacatatcat aagctacctg ataattacat tacaaaatca  1560
gaagcacaag ccctcggctg ggtggcatca aaagggaacc ttgcagacgt cgctccgggg  1620
aaaagcatcg gcggagacat cttctcaaac agggaaggca aactcccggg caaaagcgga  1680
cgaacatggc gtgaagcgga tattaactat acatcaggct tcagaaattc agaccggatt  1740
ctttactcaa gcgactggct gatttacaaa acaacggacc attatcagac ctctacaaaa  1800
atcagataac gaaaaaaacg gcttccctgc gggaggccgt ttttttcagc tttacataaa  1860
gtgtgtaata aatttttctt caaactctga tcggtcaatt gcactttgag ctcgaatttc  1920
cccgatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt  1980
gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa  2040
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tctatgttac tagatcggga aggcgcgccg cggccgcttg gcgcgccgtc aacggatcag  2220
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tggttgtcga cgagtcagta ataaacggcg tcaaagtggt tgcagccggc acacacgagt  2940
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cttcaccgcc ttagctttct cgtgacctag tcgtcctcgt cttttcttct tcttcttcta  3120
taaaacaata cccaaagagc tcttcttctt cacaattcag atttcaattt ctcaaaatct  3180
taaaaacttt ctctcaattc tctctaccgt gatcaaggta aatttctgtg ttccttattc   3240
tctcaaaatc ttcgattttg ttttcgttcg atcccaattt cgtatatgtt ctttggttta   3300
gattctgtta atcttagatc gaagacgatt ttctgggttt gatcgttaga tatcatctta   3360
attctcgatt agggtttcat aaatatcatc cgatttgttc aaataatttg agttttgtcg   3420
aataattact cttcgatttg tgatttctat ctagatctgg tgttagtttc tagtttgtgc   3480
gatcgaattt gtcgattaat ctgagttttt ctgattaaca gatgattgaa caagatggat   3540
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agacaatcgg ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc   3660
tttttgtcaa gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact ccaggacgag gcagcgcggc   3720
tatcgtggct ggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag   3780
cgggaaggga ctggctgcta ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc   3840
ttgctcctgc cgagaaagta tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg   3900
atccggctac ctgcccattc gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc   3960
ggatggaagc cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga agagcatcag gggctcgcgc   4020
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tatgccttcc ggtcaaacgt ccgattcatt caccctcctt gcgggattgc cccgactcac  8340
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tccaccttat cggcaatgaa gtcggtcccg tagaccgtct ggccgtcctt ctcgtacttg  8460
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cacatcggcc agatcgttat tcagtaagta atccaattcg gctaagcggc tgtctaagct  9000
attcgtatag ggacaatccg atatgtcgat ggagtgaaag agcctgatgc actccgcata  9060
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gggaggcccg cgttagcggg ccgggagggt tcgagaaggg ggggcacccc ccttcggcgt  9720
gcgcggtcac gcgcacaggg cgcagccctg gttaaaaaca aggtttataa atattggttt  9780
aaaagcaggt taaaagacag gttagcggtg gccgaaaaac gggcggaaac ccttgcaaat  9840
gctggatttt ctgcctgtgg acagcccctc aaatgtcaat aggtgcgccc ctcatctgtc  9900
agcactctgc ccctcaagtg tcaaggatcg cgcccctcat ctgtcagtag tcgcgcccct  9960
caagtgtcaa taccgcaggg cacttatccc caggcttgtc cacatcatct gtgggaaact  10020
cgcgtaaaat caggcgtttt cgccgatttg cgaggctggc cagctccacg tcgccggccg  10080
aaatcgagcc tgcccctcat ctgtcaacgc cgcgccgggt gagtcggccc ctcaagtgtc  10140
aacgtccgcc cctcatctgt cagtgagggc caagttttcc gcgaggtatc cacaacgccg  10200
gcggatctgg ggaaccctgt ggttggcatg cacatacaaa tggacgaacg gataaacctt  10260
ttcacgccct tttaaatatc cgattattct aataaacgct cttttctctt ag          10312
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ggtttggtac ctaacttgcc                                                  20
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cgtgttgata acctgtgcca tgatttgtac acaaaatttc  cg                        42
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cggaaatttt gtgtacaaat catggcacag gttatcaaca cg                         42
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ggttctcgag tttcacgtta actggctag                                        29
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tgacaaccat ggcacaggtt atcaacacg tttgac    35
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aaagtgcaat tgaccgatca gagtttgaag          30
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tttcacaacc tccacacactt                    21
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gtaaaggtct gatactcgtc cgttg              25
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gaagaagagc tcttgaccga tcagagtttg aag              33
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tgcttctga tgctgtaatgt aattatcag                   29
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aattacatta cagcatcaga agcacaag                    28
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gaagaactcg agtaaaacat aattttggca gtaaaaagtg a     41
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catgttcccg tttgatacct gaattttg                    28
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cataaatctt ctaaaaacag cagaactgac             30
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gagagaggat ccggtgtgaa ataccgcaca g           31
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gagagatgat cagcctcact gattaagcat tggtaactg    39
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gaagaaagcc gaaataaaga gg                   22
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ttgaacgtat agtcgccgat ag                   22
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aaggagatat aacaatgatt gaacaagatg gattgc    36
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tcagaagaac tcgtcaagaa gg              22
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cgaaaacggc aagaaaaagc ag              22
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acgaccaaag ccagtaaagt ag              22
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aatgggaagc ctgagtttac a               21
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<223>人工序列的说明：合成引物
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ggccagcatg ttttcctcca g               21

Claims (27)

1.一种选自由SEQ ID NO：1-8与13-26组成的群组的经分离聚核苷酸或其功能性变异体，其中SEQ ID NO：1、2、3、4或16中任一者所述的序列使植物细胞表达繁殖优选基因。
2.根据权利要求1所述的经分离聚核苷酸，其中所述功能性变异体与所述经分离聚核苷酸的序列具有大于或等于99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％或60％的序列同一性。
3.一种构筑体，其包含可操作地连接到所需核酸的选自SEQ ID NO：1、2、3、4或16中任一者的聚核苷酸或其功能性变异体，其中所述聚核苷酸调控所述所需核酸在经所述构筑体转化的植物细胞中的表达。
4.根据权利要求3所述的构筑体，其中所述所需核酸编码表达产物，所述表达产物能够破坏植物中雄性繁殖结构、雌性繁殖结构、成熟前雄性繁殖结构或成熟前雌性繁殖结构中至少一种繁殖结构的繁殖发育。
5.根据权利要求4所述的构筑体，其中所述雄性繁殖结构为花药、花丝、绒毡层、花粉、小孢子叶或雄球花中的至少一种，且其中所述雌性繁殖结构为柱头、花柱、子房、大孢子或胚珠(ovuliferous cone)中的至少一种。
6.根据权利要求4所述的构筑体，其中所述表达产物是降低所述植物表达目标基因的RNA转录本。
7.一种包含权利要求3所述的构筑体的转基因植物。
8.一种制造转基因植物的方法，其包含：
(a)用构筑体转化植物细胞，所述构筑体包含(i)至少一种可操作地连接到所需核酸的具有SEQ ID NO：1、2、3、4或16中任一者的序列的聚核苷酸或其功能性变异体，其中所述聚核苷酸调控所述所需核酸的活性，或(ii)具有SEQ ID NO：13、14或15中任一者所述的序列的聚核苷酸；(b)在促进植物生长的条件下培养所述经转化植物细胞，其中所述植物为显示出与不含有所述构筑体的相同种类植物不同的表型的转基因植物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述经转化植物的表型的特征在于与不含有所述构筑体的相同种类植物相比的雄性繁殖结构、雌性繁殖结构、成熟前雄性繁殖结构或成熟前雌性繁殖结构中至少一种繁殖结构的繁殖发育中的差异。
10.根据权利要求8所述的方法，其另外包含选择繁殖不育、已去除繁殖发育、已变化花粉育性和/或具有未受干扰的营养生长的植物。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述植物细胞是来自木本植物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述木本植物是选自桉树属(Eucalyptus)或松属(Pinus)。
13.一种经分离的突变体barnase酶，其是由包含SEQ ID NO：5-8中任一者所述的序列的聚核苷酸或其变异体编码，其中所述经编码的突变体barnase酶与野生型barnase酶相比具有已减弱的活性。
14.根据权利要求13所述的经分离突变体barnase酶，其中所述变异体与SEQ ID NO：5-8中任一者的序列具有大于或等于99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％或60％的序列同一性。
15.一种获得木浆的方法，其包含(a)将构筑体引入木本植物的植物细胞中，所述构筑体包含：(i)具有SEQ ID NO：1、2、3、4或16中任一者的序列的启动子或其功能性变异体，其可操作地连接到(ii)所需核酸，所述核酸包含SEQ ID NO：5、6、7或8中任一者所述的序列；(b)在促进植物生长的条件下培养所述经转化植物细胞；和(c)从所述植物获得木浆。
16.一种使转基因植物繁殖不育性的方法，其包含(a)用构筑体转化植物细胞，所述构筑体具有繁殖优选启动子和非繁殖优选启动子，所述繁殖优选启动子可操作地连接到细胞毒素基因，所述非繁殖优选启动子可操作地连接到编码抑制所述细胞毒素基因的蛋白质的基因；其中所述繁殖优选启动子在被子植物或裸子植物繁殖结构中具活性，且所述非繁殖优选自动子在被子植物或裸子植物繁殖结构中不具活性；(b)在促进植物生长的条件下培养所述经转化植物细胞；和(c)选择具有已去除的繁殖结构的转基因植物，其中所述繁殖优选启动子是选自由SEQ ID NO：1、2、3、4或16组成的群组。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述非繁殖优选启动子包含SEQ ID NO：17中所述的序列。
18.一种构筑体，其包含(i)SEQ ID NO：1或2中任一者的序列，其可操作地连接到包含SEQ ID NO：5-8中任一者的序列的聚核苷酸；(ii)SEQ ID NO：3的序列，其可操作地连接到SEQ ID NO：9的序列；(iii)SEQ ID NO：4或16的序列，其可操作地连接到SEQ ID NO：7的序列；(iv)SEQ ID NO：1或2的序列，其可操作地连接到编码包含SEQ ID NO：9-12中任一者中所述的氨基酸序列的多肽的聚核苷酸；或(v)SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23中所述的序列。
19.一种转基因植物，其包含权利要求18所述的构筑体。
20.根据权利要求18所述的构筑体，其另外包含可操作地连接到barstar基因的非繁殖优选启动子。
21.根据权利要求20所述的构筑体，其中所述非繁殖优选启动子包含SEQ ID NO：17中所述的序列。
22.一种转基因植物，其包含权利要求20所述的构筑体。
23.根据权利要求7所述的转基因植物，其中所述所需核酸包含SEQ ID NO：5-8中任一者的序列。
24.根据权利要求8所述的方法，其中所述所需核酸包含SEQ ID NO：5-8中任一者的序列。
25.根据权利要求3所述的构筑体，其中所述核酸包含SEQ ID NO：5-8中任一者的序列。
26.一种经包含SEQ ID NO：1 8-26中任一者的序列的构筑体转化的杂交后代植物。
27.根据权利要求26所述的杂交后代植物，其中所述杂交后代植物是由刚松松属(P.rigida)北美油松(pitch pine)与火炬松松属(P.taeda)火炬松(loblolly pine)杂交而获得。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100107473A1 (en) * 2007-03-29 2010-05-06 Arborgen Llc Enhancement of cold tolerance in plants
US20120266339P1 (en) * 2011-04-12 2012-10-18 Arborgen Inc. Freeze tolerant hybrid eucalyptus named 'FTE 427'
WO2013033094A2 (en) * 2011-08-31 2013-03-07 Arborgen Inc. Elimination of seed formation by ablating floral organs
BR112014022704A2 (pt) 2012-03-13 2017-08-22 Pioneer Hi Bred Int Método para aumentar a produtividade em plantas sob condições limitadoras de nitrogênio, método para a produção de uma planta transigência, molécula de acido nucleico isolada, cassete de expressão, vetor, método para gerar mutantes de tls1
WO2013138358A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genetic reduction of male fertility in plants
CA2867377A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genetic reduction of male fertility in plants

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3506136A (en) 1968-01-25 1970-04-14 Whittaker Corp Removable rack for cargo containers
GB1595202A (en) 1977-07-06 1981-08-12 Abru Aluminium Ltd Ladders
US4458066A (en) * 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US6051757A (en) * 1983-01-14 2000-04-18 Washington University Regeneration of plants containing genetically engineered T-DNA
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
DE3587718T2 (de) 1984-03-06 1994-08-04 Mgi Pharma Inc Herbizide Resistenz in Pflanzen.
US6617496B1 (en) 1985-10-16 2003-09-09 Monsanto Company Effecting virus resistance in plants through the use of negative strand RNAs
GB8626879D0 (en) 1986-11-11 1986-12-10 Ici Plc Dna
GB8810120D0 (en) 1988-04-28 1988-06-02 Plant Genetic Systems Nv Transgenic nuclear male sterile plants
JP3173785B2 (ja) 1990-08-31 2001-06-04 モンサント カンパニー グリホセート耐性５―エノールピルビルシキミ酸―３―ホスフェートシンターゼ
WO1992010251A1 (en) 1990-12-10 1992-06-25 Nordica S.P.A. Adjustment device for sports implements
JP3462497B2 (ja) 1991-02-08 2003-11-05 バイエル・バイオサイエンス・エヌ・ヴェー コメ由来の雄ずい特異的プロモーター
CA2075135A1 (en) * 1991-08-02 1993-02-03 David E. Ellis Particle-mediated transformation of gymnosperms
HU218897B (hu) 1991-11-20 2000-12-28 Mogen International N. V. Növényi parazita nematódokra csökkentett fogékonyságú növények és eljárás az előállításukra
US5593874A (en) 1992-03-19 1997-01-14 Monsanto Company Enhanced expression in plants
US5506136A (en) * 1993-10-21 1996-04-09 Westvaco Corporation Method for regeneration of coniferous plants by somatic embryogenesis
US5491090A (en) * 1994-02-09 1996-02-13 Westvaco Corporation Embryogenic coniferous liquid suspension cultures
US5605793A (en) * 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5565340A (en) * 1995-01-27 1996-10-15 Clontech Laboratories, Inc. Method for suppressing DNA fragment amplification during PCR
EP0759085A1 (en) * 1995-03-09 1997-02-26 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Chimeric genes comprising a fungus-responsive element
US5962769A (en) * 1995-06-07 1999-10-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Induction of male sterility in plants by expression of high levels of avidin
US5677185A (en) * 1996-05-14 1997-10-14 Westvaco Corporation Method for regeneration of coniferous plants by somatic embryogenesis in culture media containing abscisic acid
ID18492A (id) * 1996-09-23 1997-10-16 F B Invest Pty Ltd Pemetaan dan metoda modifikasi
GB9703681D0 (en) * 1997-02-21 1997-04-09 Gene Shears Pty Ltd Protein complemention
NZ503859A (en) * 1997-11-18 2003-02-28 Pioneer Hi Bred Int Non-identical minimal recombination sites (FRT) which are non-identical for targeted integration of nucleotide sequences into transformed plants
CN1234447A (zh) * 1998-05-04 1999-11-10 中国科学院遗传研究所 芽孢杆菌核糖核酸酶基因植物花药特异性表达载体
AR020078A1 (es) 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
JP3478975B2 (ja) 1998-08-04 2003-12-15 日本たばこ産業株式会社 変異バルナーゼ遺伝子およびその形質転換植物
US6858776B1 (en) 1999-03-17 2005-02-22 Carter Holt Harvey Limited Plants having modified reproductive capacity
US6596925B1 (en) * 1999-03-25 2003-07-22 Genesis Research & Development Corp. Ltd. Compositions and methods for the modification of gene expression
US6682931B2 (en) * 1999-05-25 2004-01-27 Meadwestvaco Corporation Recovering cryopreserved conifer embryogenic cultures
US6727411B2 (en) * 1999-12-13 2004-04-27 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing transgenic plants having improved amino acid composition
CA2424314C (en) * 2000-10-10 2013-04-16 Westvaco Corporation Enhanced selection of genetically modified pine embryogenic tissue

Also Published As

Publication number Publication date
CN101410522B (zh) 2013-06-26
US20110107456A1 (en) 2011-05-05
EP2322542B1 (en) 2012-08-29
EP1804570A2 (en) 2007-07-11
EP1804570A4 (en) 2009-10-21
JP2011101659A (ja) 2011-05-26
JP2008513029A (ja) 2008-05-01
US8034998B2 (en) 2011-10-11
US7453025B2 (en) 2008-11-18
WO2006036736A2 (en) 2006-04-06
EP2322542A1 (en) 2011-05-18
US7851679B2 (en) 2010-12-14
US20060085867A1 (en) 2006-04-20
JP5089391B2 (ja) 2012-12-05
US20130091603A1 (en) 2013-04-11
US20090075326A1 (en) 2009-03-19
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