CN101415811B - 针对肝细胞生长因子的人源化单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及针对肝细胞生长因子的人源化中和性单克隆抗体、含有它的药物组合物以及包括给患者施用这样的药物组合物的治疗方法。

Description

针对肝细胞生长因子的人源化单克隆抗体
相关申请的交叉引用
本申请是2006年4月1日提交的USSN60/788,243的非临时的申请，上述临时申请为所有目的以其全文引为参考。
政府权益陈述
本申请中描述的工作部分由国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)拨款2R44CA101283-02的资助。美国政府在本发明中享有确定的权利。
发明领域
本发明总的来说涉及将单克隆抗体(Mtb)和重组DNA技术相结合来开发新的生物制品，更具体来说，例如，涉及了结合和中和肝细胞生长因子的人源化单克隆抗体的生产。
发明背景
人类肝细胞生长因子(HGF)是间充质细胞产生的多功能的异二聚体多肽。HGF已经被显示出刺激血管生成、形态发生和活动发生(motogenesis)，以及各种不同细胞类型的生长和播散(Bussolino等，J.Cell.Biol.119：629，1992；Zarnegar和Michalopoulos，J.Cell.Biol.129：1177，1995；Matsumoto等，Ciba.Found.Symp.212：198，1997；Birchmeier和Gherardi，Trends Cell.Biol.8：404，1998；Xin等，Am.J.Pathol.158：1111，2001)。HGF多效的活性是通过它的受体—原癌基因cMet编码的跨膜酪氨酸激酶来介导的。除了调节各种正常的细胞功能之外，HGF及其受体c-Met已经显示参与了肿瘤的启动、浸润和转移(Jeffers等，J.Mol.Med.74：505，1996；Comoglio和Trusolino，J.Clin.Invest.109：857，2002)。在各种的人类实体肿瘤，包括源于肺、结肠、直肠、胃、肾、卵巢、皮肤、多种骨髓瘤和甲状腺组织的肿瘤上，HGF/cMet是共表达的，通常是过表达的(Prat等，Int.J.Cancer49：323，1991；Chan等，Oncogene2：593，1988；Weidner等，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.8：229，1993；Derksen等，Blood99：1405，2002)。HGF的功能是作为这些肿瘤的自分泌(Rong等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：4731，1994；Koochekpour等，Cancer Res.57：5391，1997)和旁分泌生长因子(Weidner等，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.8：229，1993)和抗凋亡调节因子(Gao等，J.Biol.Chem.276：47257，2001)。
HGF是102kDa的蛋白，序列和结构类似于纤溶酶原和其它凝血酶(Nakamura等，Nature342：440，1989；Weidner等，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.8：229，1993)。人类HGF被合成为728个氨基酸的前体(preproHGF)合成，它经过细胞内裂解成为无活性的单链的形式(proHGF)(Nakamura等，Nature342：440，1989；Rosen等，J.Cell.Biol.127：1783，1994)。细胞外分泌之后，proHGF被裂解，产生了由α-亚基和β-亚基构成的具有生物活性的二硫键连接的异二聚体分子(Nakamura等，Nature342：440，1989；Naldini等，EMBO J.11：4825，1992)。α-亚基含有440个残基(糖基化后为69kDa)，由N-末端发夹结构域和4个三环结构域组成。β-亚基含有234个残基(34kDa)，并具有丝氨酸蛋白酶样结构域，但是不具有蛋白水解活性。HGF具有两个独特的细胞特异性结合位点：cMet受体的高亲和性(Kd＝2x10-10M)结合位点和硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)的低亲和性(Kd＝10-9M)结合位点，它们存在于细胞表面和细胞外基质上(Naldini等，Oncogene6：501，1991；Bardelli等，J.Biotechnol.37：109，1994；Sakata等，J.Biol.Chem.，272：9457，1997)。
cMet受体是IV类蛋白酪氨酸激酶受体家族的成员。全长cMet基因被克隆并鉴定为cMet原癌基因(Cooper等，Nature311：29，1984；Park等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：6379，1987)。NK2(含有α-亚基的N-末端和前两个三环结构域的蛋白)足够与cMet结合并激活活动性的信号级联，但是对于促有丝分裂反应来说需要全长蛋白(Weidner等，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.8：229，1993)。HSPG通过与HGF的N末端相互作用来结合HGF。
已经报道HGF/cMet在癌症发展的几个方面中发挥了重要作用，例如肿瘤的启动、浸润、转移以及调控凋亡和血管生成。为了获得有效的拮抗分子，已经研究了几种不同的方法:截短的HGF蛋白例如NK1(N末端结构域加上三环结构域1；Lokker等，J.Biol.Chem.268：17145，1993)、NK2(N末端结构域加上三环结构域1和2；Chan等，Science254：1382，1991)和NK4(N-末端结构域加上4个三环结构域；Kuba等，Cancer Res.60：6737，2000)、抗cMet mAb(Dodge，硕士论文，San Francisco State University，1998)和抗HGF mAb(Cao等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98：7443，2001，在此引为参考)。
NK1和NK2可以与HGF的受体有效地竞争与HGF的结合，但是据报道在体外有部分拮抗活性(Cioce等，J.Biol.Chem.271：13110，1996；Schwall等，J.Cell Biol.133：709，1996)，而不是所需的纯粹的拮抗剂活性。最近，在Kuba等，Cancer Res.60：6737，2000中报道了，通过在裸鼠模型中持续输注NK4，NK4能够部分抑制鼠肺肿瘤LLC的原发生长和转移。但是，NK4必需连续给药才能获得部分抑制原发肿瘤生长的这个事实，表明NK4分子可能半衰期短和/或缺乏效能。
Cao等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98：7443，2001报道了根据体外抑制HGF的扩散活性的能力而选择的三种抗HGF mAb的混合物的给药，能够抑制人类异种移植肿瘤在裸鼠模型中的生长。他们推测为了体内抑制HGF的生物活性，需要识别HGF上的三种不同结合位点的三种mAb：两种mAb抑制HGF与cMet结合，一种mAb抑制HGF与肝素的结合。
最近，已经报道了使用转基因小鼠技术开发的单独结合和中和HGF的人类mAb(Burgess等，WO2005/017107A2和Burgess等，CancerRes66：1721，2006，其各在此引为通用参考)。但是，其中至少2.12.1mAb，其明显是异种移植肿瘤模型中最有潜能的，却不能抑制血管生成。已经开发的小鼠mAb L2G7中和HGF的所有测试过的生物活性包括血管生成(2004年8月13日提交的专利申请USSN10/917,915，以及Kim等，Clin Cancer Res12：1292，2006，各在此引为通用参考)。
因此，对于体外和体内阻断HGF生物活性的人源化单克隆抗体存在着需求。本发明实现了这种以及其它的需求。
发明简述
在一种实施方案中，本发明提供了针对人类肝细胞生长因子(HGF)的人源化中和性mAb。该mAb抑制HGF的至少一种、优选几种或所有的生物活性，包括与其受体cMet的结合、诱导细胞例如Madin-Darby狗肾细胞的扩散、诱导Mv1Lu水貂肺(lunk)上皮细胞和/或肝细胞和/或HUVEC的增殖、以及刺激血管生成。优选的人源化抗HGF mAb抑制、最优选完全抑制人类异种移植肿瘤在小鼠中的生长。在优选实施方案中，人源化mAb是人源化的L2G7mAb。在特别优选的实施方案中，mAb的重链和轻链可变区分别具有图2A和图2B中用线标记的HuL2G7上所显示的序列，或者与它们具有至少90％或以上同一性的序列。在另一个实施方案中，本发明提供了结合和中和人类肝细胞生长因子(HGF)的人源化单克隆抗体(mAb)，该人源化的抗体含有人源化的重链和轻链。人源化的重链含有来自L2G7的CDR和人类重链可变区框架，条件是人类重链可变区框架中选自H29、H30、H48、H66、H67、H71、H94的至少一个位置被占据L2G7重链中相应位置的氨基酸所占据。人源化的轻链含有来自L2G7的CDR和人类轻链可变区框架，条件是选自L3和L60的至少一个位置被占据L2G7轻链中相应位置的氨基酸所占据。
还提供了产生这样的人源化抗体的细胞系。在另一种实施方案中，提供了含有人源化L2G7mAb的药物组合物。在第三种实施方案中，给患者(通常为人类患者)施用该药物组合物治疗癌症或其它疾病。
附图简述
图1、从被克隆的cDNA翻译的L2G7成熟重链(A)和轻链(B)可变区的氨基酸序列。CDR被下划线。使用Kabat编号系统。
图2、显示了HuL2G7重链(A)和轻链(B)成熟可变区的氨基酸序列与L2G7和接纳体V区域的比对。在L2G7序列中CDR被下划线，在HuL2G7序列中被小鼠L2G7氨基酸取代的氨基酸被下划线，起始氨基酸H1E被双下划线。使用Kabat编号系统。
图3、完整的HuL2G7重链(A)和轻链(B)的氨基酸序列。成熟的重链和轻链(即裂解掉信号肽后)的第一个氨基酸被双下划线并用数字1标记；这些氨基酸也是成熟V区的第一个氨基酸。在重链中，CH1、铰链、CH2和CH3区的第一个氨基酸被下划线，在轻链中，Cκ区的第一个氨基酸被下划线。
图4、HuL2G7、ChL2G7和L2G7与HGF结合的竞争性结合分析。
图5、HuL2G7、ChL2G7和L2G7阻断HGF与Met结合的相对能力。
图6、HuL2G7和L2G7抑制HGF诱导的Mv1Lu细胞增殖的相对能力。
图7、用HuL2G7或L2G7mAb或PBS对照进行处理对U87皮下异种移植物在NIH III米色(Beige)/裸鼠组中的生长的影响。箭头指示注射开始的时间，误差棒显示了平均值的标准误差(s.e.m)。在图中L2G7和HuL2G7的符号重叠且不能区分开。
图8、四种不同的剂量水平的HuL2G7对U87皮下异种移植物在NIH III米色/裸鼠组中的生长的影响。箭头指示注射开始的时间，误差棒显示了s.e.m。
优选实施方案的详细描述
本发明提供了人源化中和性抗HGF单克隆抗体、含有它们的药物组合物以及使用它们治疗疾病的方法。
1、抗体
抗体是非常大的、具有复杂的内部结构的复合分子(分子量为大约150,000，或大约1320个氨基酸)。天然的抗体分子含有两对相同的多肽链，每对含有一条轻链和一条重链；因此抗体的基本结构单元是四聚体。每条轻链和重链又由两个区组成：参与结合靶抗原的可变(“V”)区，和与免疫系统的其它成分相互作用的恒定(“C”)区。轻链和重链可变区在三维空间中折叠在一起，形成与抗原(例如细胞表面上的受体)结合的可变区。在每个轻链或重链可变区内，有3个短片段(平均长度10个氨基酸)，被称为互补决定区(“CDR”)。抗体可变结构域中的6个CDR(3个来自轻链，3个来自重链)在三维空间中折叠在一起，形成了锁定在靶抗原上的实际抗体结合位点。CDR的位置和长度已经被精确地确定了。参见Kabat，E.等，《免疫学重要的蛋白序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，美国健康与人类服务部(U.S.Department of Health and Human Services)，1983，1987，在此引为参考。没有包含在CDR中的可变区部分被称为框架，它形成了CDR的环境。在每条链中，3个CDR与4个框架区段以下面的次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
来自免疫球蛋白的成熟重链和轻链可变区的氨基酸被分别命名为Hx和Lx，其中x是根据上面引用的Kabat的方案命名氨基酸位置的数字。Kabat为抗体的每个亚类列出了许多氨基酸序列，并列出了在该亚类中每个残基位置的最常出现的氨基酸，从而产生了保守序列。Kabat使用了一种为列出的序列中每个氨基酸指派残基编号的方法，而这种指派残基编号的方法在本技术领域中已经变成了标准。通过参考保守的氨基酸将所讨论的抗体与Kabat中的保守序列之一进行比对，Kabat方案可以扩展到未包含在他的目录中的其它抗体上。Kabat编号系统的使用便于鉴定不同抗体中等价的位置上的氨基酸的。例如，人类抗体L50位置上的氨基酸占据了小鼠抗体上等价于氨基酸位置L50的位置。此外，通过使用Kabat编号系统，使得一个抗体序列中的每个氨基酸与具有相同Kabat编号的另一个序列中的氨基酸进行比对，可以对任何两个抗体序列进行独一性比对，用于例如确定同一性百分率。比对后，如果目标抗体区域(例如重链或轻链的整个成熟可变区)正与参比抗体的同样区域进行比较，则在目标和参比抗体区域之间的序列同一性百分率是在目标和参比抗体区域中都被相同的氨基酸占据的位置的数量除以不计缺口的两个区域被比对的位置的总数，再乘以100转化成百分数。
单克隆抗体(mAb)是单一分子种类的抗体，因此不包括通过用抗原注射动物(例如啮齿动物、兔或山羊)产生的多克隆抗体和从动物提取的血清。人源化抗体是遗传工程的(单克隆)抗体，其中来自小鼠抗体(“供体抗体”，也可以是大鼠、仓鼠或其它类似的物种)的CDR被嫁接到人类抗体(“接纳体(acceptor)抗体”)上。人源化抗体也可以由少于小鼠抗体的全部CDR来制造(例如Pascalis等，J.Immunol.169：3076，2002)。最常见的是将Chothia & Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917，1987中定义的来自供体抗体的第一个重链超变环H1也转移到人源化抗体中。这样，人源化抗体是具有来自供体抗体的CDR和来自人类抗体的可变区框架和恒定区的抗体。轻链和重链接纳体框架可以来自相同或不同的人类抗体，每个都可以是两个或多个人类抗体框架的复合物，或者也可以是一组人类框架(例如在上面引用的Kabat等中定义的人类抗体亚组)的保守序列，即在每个位置上具有该组中最常出现的氨基酸的序列。此外，为了维持高的结合亲和性，可以使用两个其它结构要素中的至少一个。参见Queen等的美国专利No.5,530,101和5,585,089，它们每个在此引为参考，其中提供了构建人源化抗体的详细说明。
在第一个结构要素中，通过从许多已知的人类抗体中适当地选择接纳体抗体，可以选择人源化抗体的重链可变区框架，使得与供体抗体的重链可变区的框架的序列同一性高(至少65％)。在第二个结构要素中，在构建人源化抗体中，将人类接纳体抗体框架中(CDR之外)所选的氨基酸按照特定的规则用来自供体抗体的相应的氨基酸取代。具体来说，在框架中待取代的氨基酸一般是根据它们与CDR相互作用的能力来选择的。例如，在三维空间中测量时，被取代的氨基酸可以在供体抗体序列中与CDR邻近，或在人源化抗体中CDR的4-6埃内。
另一方面，因为人源化mAb必须源于非人类供体mAb，因此人源化mAb基本上不包括人类mAb，该人类mAb是通过从人类分离编码可变区的核酸，并使用噬菌体展示方法筛选它们(参见例如Dower等，WO91/17271；McCafferty等，WO92/001047；Winter，WO92/20791；和Winter，FEBS Lett.23：92，1998)或通过使用转基因小鼠(参见例如Lonberg等，WO93/12227；Kucherlapati WO91/10741和Burgess等，WO2005/027107A2)而制造的。
mAb的表位是与mAb结合的其抗原的区域。两种抗体，如果每种都竞争性抑制(阻断)另一种与抗原的结合，那么它们结合相同的或交叠的表位。也就是说，当在竞争性结合分析(参见例如Junghans等，Cancer Res.50：1495，1990)中测量时，1x、5x、10x、20x或100x过量的一种抗体抑制另一种抗体结合的至少50％，但优选75％、90％甚至99％。或者，如果抗原中降低或消除了一种抗体结合的所有氨基酸突变同时也降低或消除另一种的结合，那么这两种抗体具有同样的表位。如果降低或消除了一种抗体结合的某些氨基酸突变降低或消除了另一种抗体的结合，那么这两种抗体具有交叠的表位。
2、人源化中和性抗HGF抗体
与HGF结合的单克隆抗体(mAb)(即抗HGF mAb)，如果其结合部分或完全抑制了HGF的一种或多种生物活性(即当mAb被用作单一试剂时)，被称为中和了HGF，或是中和性的。中和性抗体可以抑制的HGF的生物学性质是HGF与其cMet受体结合的能力、引起某些细胞系例如Madin-Darby狗肾(MDCK)细胞扩散的能力、刺激某些细胞包括肝细胞、Mv1Lu水貂肺上皮细胞和各种不同的人类肿瘤细胞的增殖(例如促进它们的有丝分裂)的能力、或刺激血管生成的能力，例如通过刺激人类脐带血管内皮细胞(HUVEC)增殖或管形成、或通过施加于鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)时诱导血管而测量。本发明的抗体优选结合人类HGF，即结合GenBank登记号为D90334的序列编码的蛋白。
当通过在下面的实施例中描述的方法或本技术领域已知的方法进行分析时，浓度为例如0.01、0.1、0.5、1、2、5、10、20或50μg/ml的本发明的人源化中和性mAb将抑制大约至少50％的HGF生物学功能(例如刺激增殖或分散)，但是优选75％、更优选90％或95％甚至99％、最优选大约100％(基本上完全抑制)。通常，在测量抑制程度时，HGF的用量刚好足以完全刺激生物学活性，或者是0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、3或10μg/ml。优选当抗体与HGF的摩尔比率是0.1x、0.5x、1x、2x、3x、5x或10x时，将获得至少25％、50％、75％、90％或95％或基本上完全的抑制。更优选，mAb将中和不仅仅是一种而是几种上面列出的生物学活性；对于本发明的目的来说，中和HGF所有生物学活性的抗HGF mAb被称为“完全中和性的”，这样的mAb是最优选的。本发明的mAb优选与HGF特异性结合，即它们将不结合或仅仅在小得多的程度上结合与HGF有关的蛋白，例如成纤维细胞生长因子(FGF)和血管内皮生长因子(VEGF)。本发明的mAb通常对HGF的结合亲和性(Ka)为至少107M-1，但优选108M-1或更高，最优选109M-1或更高或甚至1010M-1或更高。
本发明的人源化mAb包括天然的四聚体形式的抗HGF抗体(两条重链和两条轻链)，可以是任何已知的同种型IgG、IgA、IgM、IgD和IgE以及它们的亚型，即IgG1、1gG2、1gG3、1gG4，并且可以含有κ或λ轻链。本发明的mAb也包括抗体片段例如Fv、Fab和F(ab′)2、双功能杂交抗体(例如Lanzavecchia等，Eur.J.Immunol.17：105，1987)、单链抗体(Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879，1988；Bird等，Science242：423，1988)以及恒定区改变的抗体(例如美国专利No.5,624,821)。mAb的CDR的来源可以是动物的(例如小鼠、大鼠、仓鼠或鸡)，或者它们也可以是遗传工程的。啮齿动物mAb通过在本技术领域中众所周知的标准方法来制造，包括用适当佐剂中的HGF通过腹膜内、静脉内或脚垫内进行多次免疫，然后提取脾脏或淋巴结细胞，并与适合的永生化细胞系融合，然后筛选产生结合HGF的抗体的杂交瘤。
本发明提供了小鼠L2G7mAb的人源化形式。小鼠L2G7mAb的成熟重链和轻链可变区的序列分别显示在图1A和1B中。因此，L2G7mAb的人源化形式在人类可变区框架(包括单一、复合或保守序列人类框架)中包含了来自这些序列的大多数或所有的CDR氨基酸。例如，某些人源化抗体包含了来自L2G7重链的3个完整CDR和来自轻链的3个完整CDR。其它的人源化抗体包含了来自L2G7重链的至少一个完整CDR和来自L2G7轻链的至少一个完整CDR。某些人源化抗体包含了至少一个CDR，其中某些残基来自L2G7的相应CDR，其它的残基来自人类抗体的CDR，优选为与提供含有CDR的可变区框架的人类抗体相同的人类抗体。
在本发明的某些人源化抗体中，选自H29、H30、H48、H66、H67、H71、H94、L3和L60的组的至少1、3、5个或所有的位置，都被小鼠L2G7抗体中Kabat编号的相应位置上存在的氨基酸所占据。在实施例中使用的人类接纳体可变区框架中，所有这些位置都被与小鼠L2G7抗体中相应位置上存在的氨基酸不相同的人类残基所占据。因此，优选取代选自该组的所有或大多数位置。如果使用了其它人类可变区框架，某些位置可以被在人类可变区框架和小鼠L2G7抗体中相同的氨基酸所占据。因此，取代不是在这样的位置上进行的，而是可以根据Queen的美国专利US5,530,101和US5,585,089的规则，在人类可变区框架和小鼠L2G7抗体之间不相同的其它位置上进行。无论人类可变区框架如何选择，正如下面讨论的那样，取代在上面的组中指出的那些氨基酸之外的其它氨基酸，也是可能的。但是，一般来说，在人源化抗体的重链可变区框架和轻链可变区框架中，都没有包含10个或12个以上的、在接纳体人类可变区框架(包括上面讨论的人类保守可变区框架和复合的人类可变区框架)中产生不存在的残基的取代。
本发明的人源化抗体中存在的任何恒定区是人类的或基本上如此的，相对于天然的人类恒定区来说具有不超过10个、优选2个或更少的取代。正如下面讨论的那样，某些取代对于增加抗体的半衰期和/或它对FcγRn的亲和性来说是有利的。其它的取代，通常是保守取代，正如下面讨论的那样，在效果上是中性的。
示例的人源化形式的L2G7包含的成熟重链和轻链可变区具有图1A和2B中分别显示的序列。其它优选形式的人源化L2G7包含的成熟重链和轻链可变区具有与这些序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性(当按照上述的Kabat编号进行比对时)、和/或与它们的差别仅有少数(通常涉及不超过5个或10个氨基酸)功能上无关紧要的取代、缺失和/或插入的序列。例如，重链的第一个氨基酸可以是Glu或Gln。取代通常是保守的，即用化学上相似的一个氨基酸取代另一个氨基酸。为了将氨基酸取代分为保守的或不保守的，可以将氨基酸分组如下：I组(疏水侧链)：Met，Ala，Val，Leu，Ile；II组(中性亲水侧链)：Cys，Ser，Thr；III组(酸性侧链)：Asp，Glu；IV组(碱性侧链)：Asn，Gln，His Lys，Arg；V组(影响链取向的残基)：Gly，Pro；以及VI组(芳香族侧链)：Trp，Tyr，Phe。保守取代是涉及同组中氨基酸之间取代的取代。优选避免在包含了来自小鼠L2G7的氨基酸的H29、H30、H48、H66、H67、H71、H94、L3和L60位置上进行关于图2A和2B中的V区的取代，因为正如在实施例中讨论的那样，这些位置与CDR相互作用。取代优选发生在可变区框架位置上，但是也可以发生在CDR区中。如果对CDR区进行取代，优选用来自人类抗体的相应位置(Kabat编号)的氨基酸取代小鼠氨基酸，优选使用与提供接纳体可变区框架的相同人类抗体。
通常情况下，人源化L2G7mAb是具有κ轻链的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。具有分别与完整的人类γ-1和κ恒定区组合的图2A和2B的可变区的IgG1mAb被被命名为HuL2G7。HuL2G7的完整的重链和轻链分别显示在图3A和3B中。这些序列只有从编号1指示的位置开始的成熟部分实际上构成了HuL2G7，因为前面的信号肽在抗体分泌之前或期间被切掉了。
保留了与HuL2G7类似的结合性质的HuL2G7的变异体可以通过诱变，然后使用上面讨论的噬菌体展示方法进行混合选择(massselection)来获得。最初选择与HGF特异性结合、任选与HuL2G7或小鼠L2G7竞争的变异体。然后可以对具有与示例的抗体相同或相似结合性质的变异体进行功能测试。
优选的人源化L2G7mAb对于HGF来说是中和性或完全中和性的，如上面所定义。优选对于被测量的HGF的某些、大多数或所有生物性质来说(例如与Met结合、刺激Mv1Lu或HUVEC细胞的增殖)，人源化mAb的中和活性在L2G7本身的中和活性的3倍以内，更优选2倍或1.5倍以内，最优选不相上下(即在实验误差范围内)。也就是说，为了获得对生物学性质的同样程度的抑制(例如当通过IC50测定时)，相对于L2G7来说需要不超过3倍、2倍、1.5倍或同样量的人源化mAb。优选人源化mAbs对HGF的亲和性也在L2G7亲和性的3倍以内、2倍以内或基本上不相上下。同样，在异种移植小鼠模型中(例如使用人类神经胶质瘤细胞系例如U87)，人源化mAbs对肿瘤生长的抑制优选在小鼠L2G7mAb的3倍以内、2倍以内或不相上下。的确，优选每周两次给药仅仅40、20或甚至10μg剂量的人源化mAb就能完全抑制U87异种移植肿瘤的生长。
人源化mAb可以通过各种不同的本技术领域已知的方法进行表达。例如，编码了它们的轻链和重链V区的基因可以首先从交叠的寡聚核苷酸合成，或通过对以前制备的所需基因的变异体进行PCR诱变来获得。由于遗传密码的简并性，每个抗体的氨基酸序列被多种不同的DNA序列编码。编码了本申请中描述的抗体的所有DNA序列明确地包含在本发明中。不论如何制造，编码人源化mAb轻链和重链基因的基因并与C区一起插入到表达载体中(例如可以从Invitrogen商购)的基因，该表达载体提供了需要的调控区，例如启动子、增强子、多聚A位点等。优选使用CMV启动子-增强子。C区的基因现在可以多方获得，或者可以容易地从人类抗体产生细胞通过PCR克隆。轻链和重链基因可以一起插入到单一载体中，或插入到分别的载体中。然后可以使用本技术领域已知的各种不同方法例如脂转染或电转穿孔，将表达载体转染到各种不同的哺乳动物细胞系中，例如CHO或293或不生产的骨髓瘤细胞包括Sp2/0和NS0中，并且通过适合的抗生素筛选来选择表达抗体的细胞。参见例如美国专利No.5,530,101。更大量的抗体可以通过在可商购的生物反应器中生长细胞来产生。
本发明的人源化mAb一旦表达后，可以按照本技术领域的标准程序进行纯化，例如微滤、超滤、蛋白A或G亲和色谱、体积排阻色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱和/或其它形式的基于有机染料的亲和色谱等。对于药物应用来说，至少大约90或95％同质性的基本上纯的抗体是优选的，98％或99％或以上的同质性更加优选。
3、治疗方法
在优选实施方案中，本发明提供了含有本文描述的人源化抗体的药物制剂。抗体的药物制剂含有生理可接受的载体中的mAb，任选带有赋形剂或稳定剂，采用冷冻干燥或水溶液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者没有毒性，并包括pH通常为5.0到8.0、更通常为6.0到7.0的缓冲剂例如磷酸盐、柠檬酸盐或乙酸盐；产生等渗的盐例如氯化钠、氯化钾等；抗氧化剂，防腐剂，低分子量多肽，蛋白，亲水性聚合物例如多乙氧基醚(polysorbate80)，氨基酸，碳水化合物，螯合剂，糖类，以及其它本技术领域的专业人员熟知的标准成分(参见《雷氏药物科学》第16版(Remington′sPharmaceutical Science16thedition)，Osol，A.编著，1980。mAb通常以1-100mg/ml的浓度存在，例如10mg/ml。
在另一个优选实施方案中，本发明提供了使用药物制剂中的人源化抗HGF mAb例如人源化的L2G7、如HuL2G7治疗患者疾病的方法。制备成药物制剂的mAb可以通过任何适当的途径、特别是通过静脉内输注或肌内或皮下推注的胃肠外途径对患者给药。静脉内输注可以在少至15分钟内给予，但是更通常进行30分钟、或超过1、2或甚至3小时。mAb也可以被直接注射到疾病部位中(例如肿瘤)，或包裹在携带剂例如脂质体中。给予的剂量足以减轻治疗的病症(“治疗有效剂量”)，可能是0.1到5mg/kg体重，例如1、2、3或4mg/kg，但是可以高达10mg/kg或甚至15或20mg/kg。也可以给予固定的单位剂量，例如50、100、200、500或1000mg，或者剂量也可以基于患者的表面积，例如100mg/m2。对于治疗癌症来说通常可以给药1到8剂之间(例如1、2、3、4、5、6、7或8剂)，但是也可以给予10、20或更多剂。mAb可以每天、一周两次、每周、每两周、每月给药，或者可以根据例如mAb的半衰期以某些其它的时间间隔例如1周、2周、4周、8周、3-6个月或更长给药。对于慢性给药来说，重复的治疗过程也是可能的。
对于使用本发明的人源化抗HGF mAb例如HuL2G7治疗特别敏感的疾病包括据认为需要血管生成或与HGF水平升高有关的实体肿瘤，例如卵巢癌、乳腺癌、肺癌(小细胞和非小细胞)、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、头颈部肿瘤、黑素瘤和儿童或成人的肉瘤，以及脑部肿瘤。事实上，本发明的方法，特别是使用人源化L2G7mAb的全身性治疗，对于治疗脑肿瘤包括脑脊膜瘤，神经胶质瘤包括室管膜瘤、少突神经胶质细胞瘤以及所有类型的星形细胞瘤(低度、间变性和多形性成胶质细胞瘤和单纯性成胶质细胞瘤)，成髓细胞瘤，神经节神经胶质瘤，神经鞘瘤，脊索瘤，以及主要在儿童中的脑肿瘤包括原生神经外胚层肿瘤特别有用。原发的脑肿瘤(即在脑中发生的)和继发或转移的脑肿瘤都可以用本发明的方法治疗。其它适合于通过本发明的方法治疗的疾病是与不利的血管形成有关的疾病，例如糖尿病性视网膜病、与衰老相关的黄斑变性、类风湿性关节炎以及牛皮癣。
在特别优选的实施方案中，人源化的抗HGF mAb例如HuL2G7，与其它的抗癌症疗法一起施用(即之前、同时或之后)。例如，mAb可以与在肿瘤学技术领域中的专业人员所知的任何一种或多种化疗药物一起给药，例如烷基化剂例如卡莫司汀、苯丁酸氦芥、顺铂、卡铂、草酸铂(oxiplatin)、甲基苄肼和环磷酰胺；抗代谢药例如氟尿嘧啶、氟尿苷、氟拉达滨、吉西他滨、氨甲蝶呤和羟基脲；天然产物包括植物生物碱和抗生素例如博来霉素、阿霉素、柔红霉素、依达比星、依托泊甙、丝裂霉素、米托蒽醌、长春花碱、长春花新碱以及泰素(紫杉醇)或相关的化合物例如
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；特别批准用于脑肿瘤的药剂包括替莫唑胺和含有卡莫司汀的
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膜片；以及其它的药物包括伊立替康和
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以及在WO2005/017107A2(在此引为参考)中列出的所有被批准的和实验的抗癌症药剂。其它可以与人源化抗HGFmAb一起给药的药剂包括生物制品例如单克隆抗体，包括针对HER2抗原的HerceptinTM、针对VEGF的AvastinTM、或针对EGF受体的抗体，以及小分子抗血管生成或EGF受体拮抗剂药物。此外，人源化抗HGF mAb可以与放射疗法或外科手术一起使用。
包括人源化抗HGF mAb抗体例如HuL2G7的治疗(例如标准化疗)，与同样的但是不使用抗HGF mAb的治疗(例如化疗)相比，可以增加患有这些肿瘤(例如卵巢、乳腺、肺、胰腺、脑和结肠肿瘤，特别是在复发或难治疗的时候)的患者的中位无进展存活或总存活时间至少30％或40％，但是优选50％、60％到70％甚至100％或以上。此外或可选的，包括抗HGF mAb的治疗(例如标准化疗)，与同样的但是不使用抗HGF mAb的治疗(例如化疗)相比，可以增加患有这些肿瘤(例如卵巢、乳腺、肺、胰腺、脑和结肠肿瘤，特别是在复发或难治疗的时候)的患者的完全有效率、部分有效率或客观有效率(完全+部分)至少30％或40％，但是优选50％、60％到70％甚至100％。对于脑肿瘤例如成胶质细胞瘤来说，单独或与其它药剂组合使用人源化抗HGF mAb治疗，优选提供了至少5％或10％、更优选20％或25％或30％、最优选40￥、50％或更高的部分、完全和客观有效率。
通常，在临床试验中(例如II期、II/III期或III期临床试验)，上面提到的与只接受标准疗法(或加上安慰剂)的患者的对照组相比，用标准疗法加上人源化抗HGF mAb例如HuL2G7治疗的患者的中位无进展存活时间和/或有效率提高，这是有统计学意义的，例如在p＝0.05或0.01或甚至0.001的水平上。完全或部分有效率通过临床试验中常用的用于癌症的客观标准来确定，例如国家癌症研究所(NationalCancerInstitute)和/或食品与药品管理局(Food and Drug Administration)所列出的或接受的判据。
4、其它方法
本发明的人源化抗HGF mAb也在诊断、预后和实验室方法中发现了应用。它们可以用于测量肿瘤中或肿瘤患者的循环中HGF的水平，从而跟踪并指导肿瘤的治疗。例如，与高水平HGF有关的肿瘤对于使用人源化抗HGF mAb治疗特别敏感。在特定的实施方案中，mAb可以用于ELISA或放射性免疫分析，以测量例如肿瘤活检样本中或血清中或HGF分泌细胞在细胞培养的培养基上清液中的HGF水平。对于各种不同的分析方法来说，抗HGF mAb可以用荧光分子、自旋标记分子、酶或放射性同位素进行标记，并可以提供成带有所有进行HGF分析所必需的试剂的试剂盒形式。在其它应用中，抗HGF mAb被用于例如通过亲和色谱纯化HGF。
实施例
1、人源化L2G7抗体的构建
小鼠抗HGF mAb L2G7，其中和HGF的所有被测试的生物学活性，其产生已经被描述(Kim等2004年8月13日提交的US20050019327，以及Kim等，Clin Cancer Res12：1292，2006)。人源化L2G7的第一步是克隆它的轻链和重链基因，这基本上是按照Co等，J.Immunol.148：1149，1992的方法来完成的。简单来说，从106个L2G7(IgG2a，κ)杂交瘤细胞中使用RNeasy小型试剂盒(Qiagen)制备RNA，然后使用来自Stratagene的试剂盒以随机引物进行第一链cDNA合成，并使用末端脱氧核苷酸转移酶(Promega)添加dG尾巴。使用与dG尾巴退火的引物和与重链的Cγ2a的N末端区退火的引物和与轻链的Cκ的N末端区退火的引物，使用高保真的聚合酶AccuPrime Pfx(Invitrogen)，从cDNA分别扩增了重链和轻链V区。PCR反应中大小适合的条带被凝胶纯化，并直接测序或克隆后再测序，测序使用双脱氧终止法利用自动化测序仪进行。对于重链来说发现了单一的cDNA序列，翻译后显示在图1A中。发现了两种不同的没有明显异常的轻链cDNA序列，但是对分离的L2G7轻链的N末端进行的氨基酸测序仅显示出这些链中的一条，其翻译的氨基酸序列在图1B中显示。
为了表达嵌合形式的L2G7以及随后的人源化mAb，从可商购的载体和DNA片段构建了与Co等，J.Immunol.148：1149，1992中描述的含有人类Cκ和Cγ1基因的pVk和pVg1载体类似的表达载体。但是，在轻链载体中用hyg选择性标记代替了gpt，在重链载体中用neo选择性标记代替了Dhfr。将克隆的VL和VH基因亚克隆到这些载体的适合的位点中，产生了嵌合的L2G7(chL2G7)mAb轻链和重链基因的表达质粒。产生了chL2G7mAb，并显示与L2G7和HGF的结合一样好，证明克隆了正确的轻链和重链V区。
为了设计人源化L2G7mAb，基本上依照Queen等的美国专利No.5,530,101和5,585,089的方法。对国立生物技术信息中心(NCBI)的人类抗体序列数据库进行了扫描，分别选择了人类VH序列AAC18323和Vκ序列BAC01726用作L2G7VH和VL序列的接纳体序列，因为它们与它们具有特别高的框架同源性(即序列同一性)。使用可以在万维网(http://www.expasy.org/spdbv/)上获得的计算机程序Deep ViewSwiss-Pdb Viewer，构建了L2G7可变区的分子模型，它被用于定位L2G7框架中与CDR近得足够与它们发生可能的相互作用的氨基酸。为了设计人源化L2G7重链和轻链可变区，将来自小鼠L2G7mAb的CDR首先在概念上嫁接到接纳体框架区中。在计算机模型据推测与CDR有明显接触、可能是维持CDR构象所需的框架位置上，来自小鼠抗体的氨基酸取代原来的人类框架氨基酸。对于被命名为HuL2G7的人源化L2G7mAb来说，这在使用Kabat编号的重链的29、30(在Chothia超变环H1内)、48、66、67、71和94位的残基以及轻链的3和60位残基上进行。此外，重链的1位氨基酸被E(Glu)取代，因为在抗体蛋白中该氨基酸比Q(Gln)经历衍生化的可能性低。在图2A和2B中显示了与相应的L2G7和接纳体V区比对的HuL2G7的重链和轻链V区序列，其中CDR和取代的氨基酸被突出。
本发明还提供了变异的人源化L2G7mAb，它们的成熟重链和轻链可变区与HuL2G7的序列有少量的(例如通常不超过1、2、3、5或10个)取代、缺失或插入的差别，通常在框架中，但是也可能在CDR中。具体来说，在接纳体框架中上面描述的取代只有一部分可以进行，或其它的取代可以进行，例如小鼠L2G7VH的氨基酸69F可以取代接纳体氨基酸69M。另一方面，VH的氨基酸1E可以被Q替换。事实上，在HuL2G7中许多不与CDR接触的框架残基可以接纳来自L2G7或其它小鼠或人类抗体的相应位置的氨基酸取代，甚至许多可能与CDR接触的残基也可以经受取代，或者甚至是CDR内的氨基酸。
最常见的情况下，在变异的人源化L2G7序列中进行的取代对于被取代的HuL2G7氨基酸来说是保守的。优选在HuL2G7中的取代(不管是否保守)对于人源化mAb的结合亲和性或效能，即它中和HGF的生物学活性的能力，没有显著影响(例如，在本文描述的一些或所有分析中，变异的人源化L2G7mAb的效能与HuL2G7的效能是基本上相同的，即在实验误差范围内)。优选成熟的变异体轻链和重链V区序列与相应的HuL2G7的成熟轻链和重链V区具有至少90％、更优选至少95％、最优选至少98％的同一性。或者，与L2G7的可变区具有高度序列同一性的其它人类抗体可变区也适合提供人源化抗体的框架，特别是人类亚组I的κV区和人类亚组I的重链V区，或这些亚组的保守序列。
在下面的实施例中讨论的示例的mAb HuL2G7具有人类κ和γ1恒定区，因此是IgG1：HuL2G7重链和轻链基因的完整序列包括信号肽显示在图3A和图3B中。(当然，信号肽被切除，不是HuL2G7的一部分。)但是，可以理解其它(IgG1，κ)同种异型的IgG1mAb也被名称HuL2G7所包涵。其它同种型(例如IgG2、IgG3和IgG4)的人源化mAb可以通过将HuL2G7可变区与适合的人类恒定区相组合来制造。在HuL2G7恒定区中可以进行取代，以降低或增加效应子功能例如补体介导的细胞毒性或ADCC(参见例如Winter等的美国专利No.5,624,821；Tso等的美国专利No.5,834,597；以及Lazar等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA103：4005，2006)，或延长在人类中的半衰期(参见例如Hinton等，J.Biol.Chem.279：6213，2004)。具体的但是不是限制性的，在IgG恒定区中具有250位Gln和/或在428位Leu突变的HuL2G7，是本发明的实施方案。
在设计了HuL2G7mAb、即选择了它的轻链和重链V区的氨基酸序列(图2和图3)后，通过遗传密码按照惯例选择编码V区(包括信号肽)的DNA序列；序列在起始ATG密码子之前以CTCGAGACCACC开始，以提供用于克隆的限制性位点和Kozak翻译起始信号。这些基因由Genscript Corp.(Piscataway，NJ)商业合成。或者，Co等，J.Immunol.148：1149，1992的方法也可以用于合成每个V区基因。简单来说，合成了在交替的链上两对交叠的寡核苷酸(AppliedBiosystems DNA合成仪)，它们一起涵盖了整个基因。寡核苷酸为110到140个碱基长，有15个碱基的交叠。使用Klenow聚合酶从寡核苷酸的5′对和另外从3′对合成了双链DNA片段。5′DNA片段用在5′端和V区基因的中心切割的限制性酶进行裂解。3′DNA片段用在V区基因的中心和3′末端切割的限制性酶进行裂解。每个被切下的片段被插入到适合的克隆载体中并转化到大肠杆菌中，来自许多分离群的DNA被测序，以发现具有完全正确的序列的片段。对于每个基因来说，然后进行3元连接，将正确的5′和3′片段插入到适合的表达载体中，形成完整的基因，其序列经过证实。
为了生产HuL2G7mAb，将人类肾上皮293-F细胞(Invitrogen)在FreeStyle293表达培养基(FS培养基；Invitrogen)中培养，并以106个细胞/2ml/大孔重新悬浮在FS培养基中。将HuL2G7轻链和重链表达载体DNA(每种1μg)与3μl Fugene6(Roche)在100μl FS培养基中在室温孵育30分钟；然后将混合物加入到细胞中。孵育48小时后，将转染的细胞在1mg/ml G418存在下进行培养以筛选表达neo的细胞，然后铺在96孔组织培养板中(100μl/孔)。在大约2周后，当含有活细胞的孔变成汇合时，通过ELISA测试那些孔的培养上清液中HuL2G7的存在和量。转染的细胞可能分泌不平衡的轻链和重链，所以为了确保只测量完整的HuL2G7，该ELISA使用了山羊抗人类Fc作为捕获剂，生物素化的抗人κ作为检测试剂。chL2G7mAb被同样表达。表达相对高水平的ChL2G7和HuL2G7的细胞的克隆在FS培养基中分别扩增和生长。使用蛋白A亲和色谱从培养上清液中纯化抗体，并通过SDS-PAGE分析纯度。
2、HuL2G7的性质
为了比较HuL2G7的结合亲和性与ChL2G7和L2G7的结合亲和性，进行了竞争性结合实验。用溶PBS中的2μg/ml山羊抗人IgG-Fc(GαhlgG-Fc)以50μl/孔在4℃将微量滴定板包被过夜，用2％BSA在室温阻断1小时。清洗后，将板以50μl/孔的ChL2G7mAb(2μg/孔)在室温孵育1小时，清洗后以50μl/孔的人IgG(10μg/ml)1小时降低背景。清洗后，将板的孔与50μl/孔不同浓度的作为竞争剂的纯化HuL2G7、ChL2G7或L2G7以及50μl/孔的HGF-Flag(1μg/ml)一起单独孵育1小时。清洗后，然后将板与50μl/孔的HRP-M2抗Flag mAb(Invitrogen)孵育，通过加入四甲基联苯胺底物检测结合的HRP-抗Flag M2。图4显示了HuL2G7、ChL2G7和L2G7基本上能够与结合在板上的L2G7同样好地竞争与可溶性HGF-Flag的结合，表明这三种mAb具有非常相近的亲和性。
HGF的重要的生物学活性是与其受体cMet结合的能力，因此比较了HuL2G7、ChL2G7和L2G7mAb抑制HGF与Met结合的能力。Met以Met-Fc的形式使用，HGF以HGF-Flag的形式使用，它们按照说明制备(2004年8月13日提交的专利申请USSN10/917,915，以及Kim等，Clin Cancer Res12：1292，2006)。用PBS中的各2μg/ml两种抗Met mAb(Galaxy Biotech)以50μl/孔在4℃将微量滴定板包被过夜(或者可以使用2μg/ml GαhlgG-Fc)，用2％BSA在室温阻断1小时。清洗板后，在每孔中加入50μl/孔的Met-Fc(1μg/ml)，室温下1小时，清洗后加入50μl/孔的人IgG(10μg/ml)1小时以降低背景。清洗板后，在每个孔中加入50μl/孔已与不同浓度的mAb预先孵育的HGF-Flag(0.5μg/ml)1小时。清洗后，将板与50μl/孔的HRP-M2抗Flag mAb(Invitrogen)孵育，如上所述通过加入底物检测结合的HRP-抗FlagM2。图5显示了HuL2G7、ChL2G7和L2G7同样好地阻断HGF与Met的结合，所以在该分析中这些mAb具有非常相似的活性。
HGF的另一个重要的生物学活性是刺激某些细胞、包括Mv1Lu水貂肺上皮细胞增殖的能力。为了比较HuL2G7和L2G7中和HGF的该种活性的能力，将在含有10％FCS的DMEM中生长的Mv1Lu细胞(2x104个细胞/100μL/孔)重新悬浮在无血清的DMEM中，并用100μL/孔的HGF(40ng/mL)加上转化生长因子-β1(1ng/mL，R&DSystems)进行刺激以减少背景，并加入不同浓度的HuL2G7、L2G7或无关的对照人类抗体。细胞增殖的水平通过加入WST-1(Roche AppliedScience)14小时来测定。图6显示了在该分析中HuL2G7和L2G7具有相同的抑制活性。概括来说，在使用的所有分析中，HuL2G7至少与L2G7有相等的活性，因而是完全中和性的：在人源化过程中L2G7的活性没有丧失。
3、HuL2G7体内抑制肿瘤生长的能力
已经显示了L2G7mAb能够完全抑制U87异种移植神经胶质瘤在裸鼠模型中的生长(2004年8月13日提交的专利申请USSN10/917,915，以及Kim等，Clin Cancer Res12：1292，2006)。为了证实HuL2G7也具有该活性，使用了同样的实验程序。简单来说，雌性4-6周龄的NIH III Xid/米色/裸鼠(Charles River Laboratories)用0.1ml PBS中的107个细胞在背部区域进行了皮下注射。当肿瘤大小达到大约50mm3时，将小鼠随机分组(每组n＝6)，并以0.1ml PBS体积每周两次腹膜内注射40μg HuL2G7、L2G7或对照PBS。每周通过测量两个维度(长度a和宽度b)并按照V＝ab2/2计算体积来确定肿瘤的体积。图7显示了在该分析中HuL2G7和L2G7不相上下地抑制了肿瘤的生长。为了进一步确定HuL2G7抑制异种移植肿瘤生长的能力，在相似的实验中使用了4种不同的mAb剂量：40μg、20μg、10μg和5μg。图8显示了即使是每周两次使用相当低的剂量10μg，也能够完全抑制肿瘤生长，而即使是更低的剂量5μg也能够给出良好的但是不完全的抑制。同样地，当全身给药时，HuL2G7有效抑制了颅内U87异种移植物的生长。
尽管已经参考目前优选的实施方案对本发明进行了描述，但应该理解可以作出各种不同的修改而不背离本发明。
所有引用的出版物、专利和专利申请在此以其全文引为通用参考，其程度等同于每个单独的出版物、专利和专利申请被特别和单独地指明以其全文引为通用参考。
L2G7杂交瘤已经按照布达佩斯公约的要求在2003年4月29日保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，P.O.Box1549Manassas，VA20108)，ATCC编号PTA-5162。该保藏将被保留在授权的保藏处和在突变、不存活或毁坏事件中进行替换，为期在保藏处收到最近一次发放样品的要求后至少5年的时期、在保藏日期后至少30年的时期、或在相关专利的可行使期期间，以最长的时期为准。一旦申请被颁布专利，对于这些细胞系的公众可用性的所有限制将不可撤销地消除。

Claims (5)

1.人源化单克隆抗体mAb，其包含：
图2A中HuL2G7的重链可变区序列显示的重链可变区；以及
图2B中HuL2G7的轻链可变区序列显示的成熟轻链可变区。
2.权利要求1的人源化单克隆抗体mAb，其是IgG1，κ同种型。
3.细胞系，其产生权利要求1的人源化单克隆抗体mAb。
4.药物组合物，其包含权利要求1的人源化单克隆抗体mAb。
5.权利要求1的人源化单克隆抗体mAb在制备用于治疗成胶质细胞瘤的药物中的应用。
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