CN101426899A - 用于附着生物分子的功能性多孔基材 - Google Patents

用于附着生物分子的功能性多孔基材 Download PDF

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Abstract

一种基材，其包括微孔微结构、在至少一部分所述微结构上的夹层以及附在该夹层上的功能层；所述功能层具有密度至少为50毫微摩尔/厘米2的功能位点。

Description

用于附着生物分子的功能性多孔基材
发明领域
本发明涉及一种功能性多孔基材，更具体涉及用于微阵列应用中以检测生物分子的这种基材。
发明背景
出于其高通量的筛分能力，微阵列已经成为研究人员正致力于诊断疾病或者发现新药的健康护理和制药工业的重要工具。而且，农业和国土防御机构正使用微阵列来获取有关是否存在有害病原体的信息。这种同时筛分可以通过以下方式进行：将生物学分子(即，生物分子，如核酸片段、抗体、肽、蛋白质、病原体、细胞等)的许多显微镜可见的观察点(通常大小为10-250微米)作为探针印刷到相同基材上，形成微阵列。出于研究目的研发的高密度微阵列通常包括1000-50000个探针点，它们以预定规则的图案设置在基材上，由此得到约50-2500点/厘米2的点密度。这种基材的尺寸可以变化，但通常是1英寸×3英寸显微镜载玻片的大小。关键的是所述基材表面应活性的，能结合已知序列的探针生物分子。在使用中，微阵列用未知序列的靶生物分子杂交，以同时检测该阵列表面上具有不同探针的靶的响应。通常，所述靶用荧光染料标记，并且在杂交之后最常用荧光基检测技术来将靶生物分子对探针的响应量化。所述靶对微阵列基材上所有探针的复合量化响应就是来自微阵列实验的数据。
微阵列实验可以用来检测指定有机体(即，人、鼠、植物、细菌等)的各种基因或蛋白质的表达水平。高表达的基因或者蛋白质更加容易检测，这是因为它们在指定样品中的浓度常常最高。但是，当表达水平低或者样品稀少时，灵敏且可靠的检测技术就是关键。这种类型的检测技术对研究蛋白质-蛋白质相互作用或者蛋白质生物化学活性来说越来越重要，这是因为蛋白质浓度不能经酶反应如聚合酶链式反应来放大。
结果，在微阵列工业中，对低丰度蛋白质和/或核酸的可靠检测是最重要的。当微阵列实验中试图精确测量或者检测这种低水平时，势必要求研究人员使用能使灵敏度和综合信噪比最大的系统部件。可以使用许多途径来影响灵敏度和信噪比，其中，3个常见的如下：(1)改进扫描装置的灵敏度和检测极限，(2)通过标记方法来提高荧光信号的放大率，以及(3)使用高灵敏度的基材。本发明着重于通过使用高灵敏度的微阵列基材来提高信噪比。
提高信号强度可以通过提高每单位面积上结合位点数(功能性位点密度)来实现，这最终影响固定的生物分子探针的保留以及当用荧光标记靶分子杂交时增强信号的发射。信号清晰度也可以通过减少用于检测材料固有的自发荧光来提高。这些途径最终通过提高信号强度和/或降低噪声来影响所述信噪比。已经尝试了几种现有技术的途径。
用于制造高密度微阵列的许多常规方法使用包含用于结合目标样品的功能位点的无孔二维玻璃基材。优选玻璃，这是因为其本身惰性，且固有的自发荧光低，这有利于减少要检测信号的噪声(通常使用荧光基技术测量)。这种市售基材的例子是UltraGAPS  
Figure A200780014129D0009080339QIETU
载玻片(纽约州欧耐塔的康宁公司生命科学部(Corning Inc.，LifeSciences，Oneonta，NY))、
Figure A200780014129D0009080454QIETU
载玻片(肯塔基州路易斯维尔的斯科特北美公司(Schott North America，Inc.，Luisville，KY))和Array-
Figure A200780014129D0009080520QIETU
载玻片(加利福尼亚州桑尼维尔的泰勒凯姆国际公司(Telechem International Inc.，Sunnyvale，CA))。使用无孔玻璃的一个缺点是功能位点密度很低，导致信号相对较弱，使得很难检测到目标样品，尤其是当试图检测低表达基因或蛋白质时。通过提高目标样品的体积或浓度可以使这种影响最小，但是这种方法只能在可以获得大量足够样品时使用。通常，研究人员受到指定样品的量、浓度或体积的极大限制。提高功能位点密度的通常方式是使用多孔基材来提高包含功能位点的有效(accessible)表面积。泰纳(Tanner)等(美国专利6750023)讲述了一种形成用于附着生物或化学分析物的功能材料的方法，它通过将无机多孔层施加到无机无孔基础材料上来提供。
已经尝试了使用有机聚合物作为功能材料的另一种途径。海德(Haddad)等(WO 01/66244)讲述了使用得自取向聚合物薄膜的有纹理的无孔功能材料来制造阵列。在微阵列基材中也已经使用多孔取向聚合物，这种市售材料的例子是Vivid微阵
Figure A200780014129D0009080552QIETU
载玻片(纽约州东山的鲍罗公司(Pall Corporation，East Hills，NY))和
Figure A200780014129D0009080536QIETU
载玻片(新罕布什尔州克依纳的S&S生物科学公司(Schleicher & SchuellBiosciences，Inc.，Keene，NH))，两者均使用多孔尼龙膜。
相转化是用来从有机聚合物制造微孔膜的常规技术。在Solomon等的美国专利申请2003/0219816和Andreoli等的2004/0157320中详细描述了这种膜作为微阵列基材的用途。在文献中也讨论了各种微孔材料，其中，尼龙和硝化纤维是最常见的。尼龙的好处在于它容易出现微孔，并对DNA有天然的亲合性。类似地，硝化纤维也已知能有效结合蛋白质。在使用尼龙和硝化纤维时，与DNA和/或蛋白质的结合依赖于尼龙或硝化纤维聚合物主链中存在的固有官能团。因此，通过这些材料提供的功能位点密度是有限的。而且，相转化膜的孔径不仅足够小，以放置潜在的点扩散，导致串扰，由此限制了阵列的密度。使用有机聚合物如尼龙或硝化纤维的另一个常见问题是：这些材料本身具有高自发荧光。由于荧光基检测是用于量化所述杂交靶生物分子的最常用的技术，高自发荧光会增大背景噪声，由此对荧光信号的清晰度不利。显示使用颜料如碳黑会减少自发荧光。或者，如Montagu(WO 2004/018623)所述，背景噪声也可以通过使用薄(小于约5μ)的功能材料来降低。
需要一种容易制造的、提供高功能位点密度并且自发荧光低以使信噪比最大的阵列基材。本发明着手处理所有这些需求并提供很高的精度。
发明概述
本发明提供一种基材，它包括微孔微结构、在至少一部分所述微结构上的夹层以及附在该夹层上的功能层；所述功能层具有密度至少为50毫微摩尔/厘米2的功能位点。
另一方面，本发明提供一种制造功能化制件的方法，它包括：(1)提供具有微结构的微孔基材，(2)将夹层沉积在所述微结构上，(3)将功能层附在夹层上，使所述制件具有至少50毫微摩尔/厘米2的功能位点密度。
另一方面，本发明提供一种制件，它包括邻近含多孔微结构的聚四氟乙烯基材的支撑层、在至少一部分所述微结构上的夹层以及附在该夹层上的功能层；所述功能层具有密度至少为50毫微摩尔/厘米2的功能位点。
再一方面，本发明提供一种制件，它包括邻近含多孔微结构的聚四氟乙烯基材的支撑层、在至少一部分所述微结构上的夹层、附在该夹层上的功能层，所述功能层具有密度至少为50毫微摩尔/厘米2的功能位点，以及附于该功能材料的生物分子。
另一方面，本发明提供一种测量生物分子的方法，所述方法包括：
(a)提供一种支撑层，
(b)将支撑层功能化，
(c)将粘合剂施加到支撑层的至少一部分上，
(d)通过粘合剂将具有节点和原纤(fibril)微结构的微孔聚四氟乙烯基材附到支撑层上，
(e)将微孔聚四氟乙烯基材功能化，形成功能位点，
(f)将生物分子结合到功能位点上，并
(g)检测结合到功能层上的生物分子的量。
在另一方面，本发明提供一种制备微阵列基材的方法，所述方法包括：
(a)提供一种支撑层，
(b)任选地将支撑层功能化，
(c)将粘合剂施加到支撑层的至少一部分上，
(d)通过粘合剂将具有节点和原纤微结构的微孔聚四氟乙烯基材附到支撑层上，
(e)将微孔聚四氟乙烯基材功能化。
在另一方面，本发明提供一种微阵列基材，它包括在635微米波长下低于100RFU的自发荧光水平，以及大于50毫微摩尔/厘米2的功能位点密度。
另一方面，本发明提供一种微阵列基材，它包括在532微米波长下低于1000RFU的自发荧光水平，以及大于50毫微摩尔/厘米2的功能位点密度。
另一方面，本发明提供一种微阵列基材，它包括对Cy5染料的信噪比大于130，较好大于150。
另一方面，本发明提供一种微阵列基材，它包括对Cy3染料的信噪比大于90，较好大于110。
另一方面，本发明提供一种微阵列基材，它包括1.5倍精确水平(1.5 fold precisionlevel)至少为99％。
另一方面，本发明提供一种微阵列基材，它包括1.2倍精确水平(1.2 fold precisionlevel)至少为76％。
附图简要说明
图1是本发明示例实施方式的一端的横截面视图。
图2(A)是本发明示例实施方式中微阵列在功能化之前的微孔表面的扫描电子显微图。
图2(B)是本发明示例实施方式中微阵列在功能化之后的微孔表面的扫描电子显微图。
图2(C)是本发明示例实施方式中微阵列在功能化之后的微孔表面的扫描电子显微图。
图3(A)是使用本发明示例实施方式中基材的微阵列的归一化Cy3和Cy5信号强度的散布图。
图3(B)是使用现有技术中基材的微阵列的归一化Cy3和Cy5信号强度的散布图。
发明详述
本发明涉及改进的功能化多孔和微孔基材，当用作生物分析检测技术中的微阵列基材时，它具有高官能团密度和低自发荧光，由此提供之前无法获得的高信噪比和高精度水平。这些属性来自于以下因素的独特组合：多孔和微孔材料的选择以及功能化这些材料的方法。微阵列定义为用于筛选和分析基因组中所含信息的工具。这种工具包括不同的生物分子(核酸、蛋白质、细胞等)探针，它们化学附着在基材上，所述基材可以是微芯片、玻璃载玻片或者微球大小的珠子。在以下讨论中，“多孔材料”是指具有孔的材料，所述孔延伸穿过整个截面，从而使得该材料对于流体是通透的。多孔材料通常通过平均流动孔径(mean flow pore size)来表征。或者，多孔材料可通过泡点来表征，泡点是最大孔径的量度。所述平均流动孔径和泡点均可以通过有压流试验来测量。微孔材料是多孔材料的亚类，其平均流动孔径小于约1微米，或者泡点大于约10psi。
本发明多孔材料本身是平的，可以呈膜或片的形式。本发明多孔基材由于存在横跨整个截面的互连孔而可以透过液体。这种微结构的表面积比等体积的无孔材料大得多。本发明使用这种微结构及其伴随的高表面积-体积比，形成高功能密度(functional density)的基材。这种内表面积(更好是称为比表面积)与多孔材料的孔径有关，所述表面积随材料平均孔径的减小而增大。通常，多孔材料的比表面积至少为0.1m2/gm，较好是1m2/gm，更好是大于10m2/gm(使用标准气体吸附技术测量)。
在本文中，“功能位点”是位于多孔基材的外表面或内表面上的位点。功能位点可以使用本文所述的表面改性技术来产生，它们可以用来提供可以附着生物分子的粘合位点。在某些优选实施方式中，附着到功能位点上的生物分子起到探针分子的作用，可以共价或非共价地结合靶生物分子(通常为溶液中的分析物)。本发明所述生物分子的非限制性例子包括核酸、寡核苷酸和抗体。在本文中，“官能团”是作为单独单元参与反应并决定功能位点性质的原子团。功能化基材是具有功能位点的多孔基材，所述位点位于微结构的表面上。术语“功能化”是指将官能团附到多孔基材的微结构上的方法。
相比无孔基材，如无孔玻璃，具有固有高比表面积-体积比的多孔材料提供更大面积的功能化。如之前所述，在现有技术文献如美国专利申请2004/0157320(Andreoli)和美国专利6750026(Tanner)中已经讲述了用于微阵列应用的功能化多孔基材。虽然这些内容利用了多孔微结构提供的高内表面积，但是它们依赖于结合位点上多孔材料的固有官能团密度。例如，Andreoli讲述了多孔尼龙作为基材的应用，它具有由尼龙分子化学结构中的酰氨基提供的官能度。相比较，Tanner讲述了多孔玻璃的应用，但是它依赖于玻璃表面存在随后通过硅烷处理进行功能化的表面羟基。
本发明使用新途径来制造用于微阵列应用的高功能密度的基材。本发明的方法从使用多孔材料开始，所述材料不依赖于材料的固有化学性质来形成官能团。相反，多孔材料的微结构基本涂布有包含活性官能团如羟基官能团的中间层。然后，通过使合适的功能性化学物质与中间层的羟基官能团反应来形成功能性基材。功能化所述基材因此包括将夹层沉积在多孔微结构上的步骤。在这种方式中，中间层的选择(而非多孔材料的选择)现在控制了官能团的密度。所有现有技术的材料按照本发明所述进行功能化，显示出高得多的官能团密度。
本发明所述高功能密度的基材使用多孔材料(较好是平面形式如膜或片)作为原料制得。多孔材料本身可以是有机或无机的。这种有机多孔材料的非限制性例子包括超高分子量聚乙烯(UHMWPE)多孔片(Porex公司销售)、聚丙烯(PP)或者聚四氟乙烯(PTFE)(购自佛罗里达州迈阿密湖的小部件有限公司(Small Parts，Incorporated，Miami Lakes，FL)。由有机聚合物制得的膜通常本身是有微孔的，并且市售。这种材料的例子是发泡PTFE(ePTFE)膜(购自W.L.G联合公司(W.L.Goreand Associates))、尼龙和聚偏1，1-二氟乙烯(PVDF)膜(分别以BiodyneTM和BiotraceTM的商品名购自鲍罗公司(Pall corp))、PP膜(以PolySepTM的商品名购自奥斯莫尼克公司(Osmonics Inc.))以及PTFE膜(以MuporTM的商品名购自Porex公司)。无机多孔材料通常以硬片获得。这种材料通常通过烧结无机材料如金属、陶瓷和金属氧化物来获得。多孔玻璃是这种烧结材料常见的例子，可以从如R&H过滤器公司(R&H Filter company)(特拉华州乔治城(Georgetown，DE))或者先进玻璃和陶瓷公司(Advanced Glass & Ceramics)(马萨诸塞州，霍顿(Holden，MA))获得。通过正确选择多孔材料以及后续的功能化学物质，也可以制得本发明高功能密度的基材，其自发荧光低。通常，在其化学结构中没有共轭键的材料显示出低荧光性质。这种多孔材料的例子是从如PTFE、UHMWPE、PP和玻璃的材料制得的那些。
尤其优选发泡PTFE作为多孔材料，这是因为其自发荧光低、其化学惰性、且温度稳定性高。制造ePTFE的方法在美国专利3953566(Gore)中描述。发泡PTFE是由无规成型孔隙组成的PTFE多微孔形式。虽然这种超高的表面积-体积比的微孔发泡PTFE(ePTFE)暗示它在该应用中可以很好的发挥作用，但是无规孔隙形状使其成为不太可靠的候选者。但是令人惊奇的是，ePTFE结构的无规则性以及非圆形孔隙并不会妨碍其性能；实际上，ePTFE是最优选的多孔材料。发泡PTFE的孔隙通过在高温下进行的发泡-拉伸工艺形成。发泡产生微孔结构，其中，节点通过细的原纤互连。优选的ePTFE材料按照美国专利4187390(Gore)中所述制造。
孔径的选择是选择多孔材料的关键因素。为了成为有效的微阵列基材，所述孔径必须足够小，以抑制定点工艺过程中溶液的潜在扩散。认为如果孔径太大，则定点液体会沿所有方向扩散，且所述点会互相遭遇，导致出现串扰和污染。可以增大点到点的距离，以避免这种问题，但是这会对指定面积内设置的点数不利。另一方面，所述孔径必须足够大，以使生物分子能进入孔隙，并允许反应试剂在洗涤过程中自由地进入和离开所述孔隙。泡点测量是用来表征多孔材料最大孔径的标准技术。
虽然大多数多孔基材可以用来形成本发明的高功能密度基材，但是对于微阵列应用，泡点应至少为0.007MPa(1psi)，较好是至少0.070MPa(10psi)。优选的ePTFE材料的泡点值至少为0.070MPa(10psi)。所述ePTFE材料的泡点值最好至少为0.207MPa(30psi)。
微孔ePTFE材料的微结构由通过原纤互连的节点组成，并用平均原纤长度表征。所述原纤长度可以在合理的高放大倍数(如，20000×)下对ePTFE膜的表面进行扫描电子显微镜观察，然后测量节点间原纤的长度来测量。对原纤进行30次这种测量，将平均原纤长度记录为这些测量的平均值。越大的平均原纤长度通常与更低的泡点和更高的平均流动孔径关联。对于优选的ePTFE材料，认为其平均原纤长度应为0.5-5微米，较好为0.5-3微米，最好为0.5-2微米。
本发明所述高功能位点密度的基材可以使用厚度为5微米和以上的多孔材料制得。更大的厚度可以提供更大的用于附着官能团的内部表面，由此提供更高的功能密度。但对微阵列应用，多孔材料的厚度存在一个极限。超厚的材料是不利的，这是因为这种材料在接触印刷过程中吸收过量的探针溶液，导致印刷针迅速变干，由此影响点的清晰度。此外，过厚的材料难以加工，尤其是在杂交之后的洗涤步骤中。不能充分地将杂交液体从材料上洗去会导致残留反应试剂，使基材的自发荧光增大。对于微阵列应用，多孔材料的优选厚度约为250微米或以下，最好是约125微米或以下。
本发明依赖多孔材料的内表面来附着官能团。内表面积是多孔材料的厚度和比表面积的函数。比表面积是选择多孔材料的重要考虑因素。但是，比表面积与孔径有关。通常，孔径越小，比表面积越大。与孔径要求一致，具有任意比表面积的多孔材料可以转化成本发明高功能位点密度。但是，对于可行的微阵列基材而言，多孔材料的比表面积至少为1m2/gm。优选的ePTFE材料的比表面积至少为1m2/gm，最好是至少10m2/gm。
可用于本发明的多孔材料优选不含任何添加剂，尤其是会增大自发荧光的添加剂。但是，若需要的话，所述多孔材料可以包含如颜料、填料、着色剂、UV吸收剂等的添加剂。
所述多孔材料通过以下方式转化成本发明高功能密度的多孔基材：首先，将包含羟基的功能涂料的中间层沉积到多孔材料的整个微结构上，之后使用有机硅烷化学品与中间层的羟基反应。这种转化工艺的细节在下文主要针对优选的ePTFE材料中有述。但是，所述转化方法类似地可以适用于之前所述的大量多孔材料。
由于ePTFE固有的疏水性，极性溶液如微阵列印刷和杂交缓冲液不能润湿基材。而且，由于ePTFE的化学结构，生物分子如核酸和蛋白质不能高效地结合到所述材料上。因此，为了有效地结合生物分子，ePTFE表面必须进行改性并需要在之后附上官能团。ePTFE的表面改性通过使用有机聚合物涂布微结构来进行，以使其具有表面亲水性，这已经分别在Fujimoto和Drumheller的美国专利5130024和5897955中提到。在日本专利公报08-250101和美国专利申请2004/0081886A1(Zuckerbrod)中提到了使用无机溶胶-凝胶制剂来类似亲水处理ePTFE。
对本发明来说，优选使用低自发荧光的亲水涂层来进行表面改性，所述涂层提供能后续和硅烷反应的羟基。适于用作这种亲水涂层的有机聚合物的非限制性例子是聚乙烯醇、聚乙二醇、聚丙二醇、聚缩水甘油、乙烯醇-乙烯共聚物、乙二醇-丙二醇共聚物、乙二醇-丙二醇共聚物、乙酸乙烯酯-乙烯醇共聚物，它们可单独或组合使用。任选地，这些聚合涂层可以通过使用合适的交联剂如醛、环氧化物和酸酐等在原位相互共价交联。对于亲水处理ePTFE，聚乙烯醇(PVOH)是优选的有机聚合物。所述任选的交联可以使用醛如戊二醛来实现。
如以下所述，溶胶-凝胶溶液是更优选的溶液，这是因为它使ePTFE表面更易于通过提供大量的羟基进行后续功能化。溶液-凝胶溶液是制备金属氧化物特种玻璃和陶瓷的技术：通过水解化学中间体或者化学中间体的混合物(在脱水成玻璃或陶瓷之前相续经过溶液状态和凝胶状态)。用来使ePTFE亲水的溶胶-凝胶处理的细节在日本专利公报08-250101中有述。
优选的溶胶-凝胶涂料溶液来自原硅酸四乙酯(TEOS)、原硅酸四甲酯、或者来自硅酸钠溶液或胶体二氧化硅悬浮液的溶胶-凝胶涂料。来自TEOS的溶胶-凝胶涂料溶液最优选。如上所述，亲水涂料也可以用于表面改性其它微孔材料，包括但不限于那些由尼龙、超高分子量聚乙烯(UHMWPE)、聚丙烯、多孔PTFE、PVDF、多孔玻璃等制得的那些。ePTFE和其它微孔材料的亲水处理可以使用许多方式进行。通常，这种处理通过以下方式进行：通过已知的方法如浸涂、喷涂、旋涂、刷涂、辊涂或者Meyer棒涂来将有机聚合物溶液或无机溶胶-凝胶施涂到膜上。必须小心仅加入足够的涂料，以提供表面亲水性，同时保持材料的孔隙率。加入过量的亲水涂层也会增大基材的自发荧光。
如上所述，亲水处理使ePTFE和其它微孔材料亲水：将含羟基涂层沉积到整个微结构上。在后续步骤中，羟基和低自发荧光的有机硅烷反应，得到所需的官能团，这取决于要附着的特定生物分子。例如，若互补DNA(cDNA)分子要附着到基材上，则胺官能团最合适。这种官能团能通过使亲水ePTFE材料和合适的直链或支链氨基硅烷、氨基烷氧基硅烷、氨基烷基硅烷、氨基芳基硅烷反应来引入。可以使用的硅烷例子是γ-氨基丙基三甲氧基硅烷、γ-氨基丙基三乙氧基硅烷、N-(β-氨基乙基)-γ-氨基丙基三甲氧基硅烷、N-(β-氨基乙基)-γ-氨基丙基三乙氧基硅烷。也可以通过与购自如密歇根州米德兰的枝状聚合体技术公司(Dendritech，Inc.，Midland，MI)的有机硅烷偶合的枝状聚合体(dendrimer)引入这种胺官能团。使用这种方式，通过选择合适的有机硅烷，可以将不同的活性官能团附到ePTFE基材上。对于相同的官能团，将官能团从附着位点放置到表面上也可以通过所选有机硅烷中使用的连结分子的大小来控制。可以附着的活性官能团的非限制性例子是：胺、环氧化物、醛、含羧基物质(carboxyl)、酸酐、羟基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、酯、硫醇、叠氮化物、磺酸酯和膦酸酯等。若需要，可以将一种以上的官能团沉积到基材上：使具有不同的有机官能团的硅烷混合物和来自中间层的羟基反应。所述官能团还能和其它化学试剂反应，形成目标终端应用所需的官能团。例如，环氧基还可以和二醇反应，重新形成羟基官能团，或者，使用马来酰亚胺-NHS基交联剂，胺官能团还可以交联形成能与具有胺官能团的生物分子如抗体反应的官能团。
通过在低pH下使用硅烷在有机溶剂中的稀释溶液处理亲水ePTFE材料来进行硅烷处理。有关这种硅烷处理以及各种具有不同有机官能团和不同连接基(linker)大小的硅烷的细节可见brochure的“Silane Coupling Agents：Connecting AcrossBoundaries(硅烷偶联剂：跨越边界连接)”(宾州莫瑞斯维尔的格莱斯特公司(Gelest，Inc.，Morrisville，PA))。类似的信息和化学品也可以从其它公司(如联合化学技术公司(United Chemical Technologies，Bristol，PA)、道康宁公司(Dow-Corning，Midland，MI)和先进材料公司(GE Advanced Material，Wilton，CT))获得。在本发明中，硅烷处理可以通过常规液体涂布方法如浸涂、喷涂、旋涂、刷涂、辊涂或者Meyer棒涂来进行。或者，所述硅烷可以通过气相涂布沉积到膜微结构上。必须小心仅加入足够的涂料，以功能化ePTFE，同时保持材料的孔隙率。
本发明的方法戏剧化地改进了各种膜的功能性，有显著提高胺密度值为佐证(使用本领域技术人员熟知的试验方法)。最显著的是，本发明处理后的ePTFE和其它微孔膜相比现有技术的材料显示出胺基密度有超过一个数量级的提高。这种级别的对功能化膜的改进是令人惊奇和出乎意料的。
官能团密度可以每单位表面积基材或者每单位体积基材上官能团的摩尔数来测定。使用本发明的方法，可以将氨基密度为0-5毫微摩尔/厘米2的多孔材料转化成官能团密度为50-1300毫微摩尔/厘米2的基材，这取决于多孔材料的具体化学性质。指定这些基材的厚度，每单位体积的官能团密度转换为2500-150000毫微摩尔/厘米3。例如，使用本发明的方法，不含任意氨基官能团的ePTFE和微孔PP材料转化成氨基官能团密度为416-487毫微摩尔/厘米2的氨基功能化基材。由于本发明的方法通过使不同有机硅烷和中间层涂布过程中沉积的羟基反应来产生功能位点，以上官能团密度值不限于仅仅针对胺官能团。相反，功能位点密度基本取决于来自中间层涂布的羟基密度。因此预计，通过选择合适的有机官能硅烷化合物，不论所选官能团的具体性质如何，可以获得大于50毫微摩尔/厘米2或大于2500毫微摩尔/厘米3的功能位点密度。
不同于在微阵列中的应用，本发明高功能化基材可在其它应用如诊断装置、活性过滤应用、印迹应用等中用于有效地结合和俘获各种生物分子。
所述基材的功能密度可以显著提高，并保持很低的自发荧光。这种高功能密度和低自发荧光的组合在微阵列基材中是很有利的，这是因为它使来自杂交的靶生物分子的荧光信号相比背景噪声最大。所述基材的自发荧光可以通过在印刷生物分子之前使用微阵列扫描仪扫描基材来测定，所述扫描仪可从几个供应商处获得，如加州联合城的爱克森仪器公司(Axon Instruments，Union City，CA)和马萨诸塞州韦尔斯利的PE公司(Perkin-Elmer，Wellesley，MA)。扫描可以在多个感兴趣的波长下进行，这取决于所用扫描仪的类型。由扫描基材的数据计算在感兴趣波长下的平均荧光值。应注意，扫描可以在不同仪器设定值如激光能量、聚焦深度和PMT增益下进行。信号强度是这些设定值的函数。因此，对指定仪器而言，自发荧光值由扫描仪设定值确定。
使用GenePix 4000A扫描仪(Axon)来测量本发明基材的自发荧光。这种扫描仪的激光能量和聚焦深度分别设定在100％和0微米，所有测量均在PMT设定值为350时进行。使用本发明的方法，对低荧光多孔材料如PTFE、UHMWPE、PP、玻璃等而言，可以制得在532nm(绿)和635nm(红)波长下自发荧光水平分别小于1000相对荧光单位(RFU)和100RFU的高功能密度基材。在大多数情况下，这种高功能位点密度基材的自发荧光水平可以更低，通常在532nm和635nm波长下自发荧光水平分别小于100RFU和30RFU。
由于预计能在背景噪声下提高信号强度，所述高功能密度和低自发荧光的多孔基材最适于微阵列应用。这种基材有各种方式用在微阵列应用中。所述基材本身可以进行使用，或者所述基材可以通过插入模制或其它组合技术如超声波结合、RF焊接、加热焊接等将其和其它塑料、陶瓷或金属部件组合，由此转化成盒式或者显微镜载玻片的形状。通过选择合适的官能团，它可以将大量各种生物分子附着到本发明高功能位点密度的基材上。可附着的生物分子的非限制性例子包括核酸、蛋白质、肽、寡核苷酸、抗体、细胞、酶和病原体等。
对许多应用来说，为了便于搬运和印刷，要求将本发明的高密度功能位点基材支撑在支撑层上。这种支撑层可以是柔韧的和坚硬的。柔韧的支撑层可以是塑料膜和金属箔。但是，对传统微阵列应用来说，所述支撑层通常为坚硬的。这种坚硬支撑层可以用硬材料制得，只要在杂交温度下所述材料保持尺寸稳定性，并且也不会受到在常规微阵列实验中涉及的印刷、杂交、洗涤和干燥步骤中使用的反应试剂的影响。适于用作支撑层的材料的非限制性例子是玻璃、金属、陶瓷和塑料。显微镜玻璃载玻片是最常用的支撑层。
在本发明的实施方式中，功能基材可以是用粘合剂至少部分地结合到硬性支撑物上，形成复合微阵列基材。所得粘合剂结合应足够结实，以应对常规微阵列实验中涉及的印刷、杂交、洗涤和干燥的工艺步骤。因此，粘合剂必须具有盒式的耐热性和耐化学性。也要求粘合剂的自发荧光水平尽可能地低。通常，在其化学结构中不含共轭键的粘合剂常常具有低自发荧光。所选粘合剂必须很好地结合到硬性支撑物以及功能多孔层上。若需要，支撑表面可以进行处理，提高与粘合剂的结合性用有机硅烷处理支撑表面是可以用来提高粘合性的一个表面处理例子。或者，可以将粘合性促进添加剂如硅烷偶联剂加入到粘合剂中，促进粘合剂和硬性支撑物之间更好地结合。对功能性多孔基材可接受的结合来说，所述粘合剂必须渗入功能性多孔基材中。若粘合剂粘度或者表面张力不够低，不能渗入的话，粘合剂可以用低粘度和/或低表面张力的溶剂溶解，以促进这种渗入。但是，必须小心，确保粘合剂不会过度渗入，而进入功能性基材的截面中，因为这会降低官能团的可利用率，并增大复合微阵列基材的自发荧光水平。
可以使用各种粘合剂，所述粘合剂可以是热固性的。这种粘合剂的例子包括但不限于环氧化物、丙烯酸、硅氧烷。这些粘合剂可以施加到支撑层上，或者施加到功能层上、与要结合的其它表面接触，然后通过施加呈热、UV辐射等形式的能量来进行固化。来自Tra-Con公司(马萨诸塞州Bedford)的TRA-BOND FDA2是可用的双组分热固性环氧化物的例子。若粘合剂呈液体形式，则它可以通过诸如喷涂、刷涂、辊涂等的各种常用方法来施加。若粘合剂成部分固化的薄膜形式，则它可以通过施压和/或加热来进行层压。所述粘合剂也可以是压敏粘合剂，属于不同化学类型。丙烯酸(例如，3M 9461P粘合转印带(明尼苏达州圣保罗市3M公司))和硅氧烷(例如，来自道康宁公司的Dow-Corning
Figure A200780014129D0019081232QIETU
 MD7-4602)是常用的压敏粘合剂(PSA)。在这种情况下，粘合剂可以施加到支撑层或功能基材上，并通过施压和/或加热结合到其它材料上。若粘合剂呈液体形式，则如上所述进行施涂，若需要的话可进行干燥，除去挥发物质，然后结合到相应部分上。最后，所述粘合剂可以是热塑性的。这种低荧光性的粘合剂例子是含氟塑料(明尼苏达州Oakdale市Dyneon有限公司的DyneonTM THV含氟热塑性材料)、来自纽约Orangeburg的大金美国公司的eFEPTM、
Figure A200780014129D00191
 FEP(特拉华州Wilmington的杜邦氟制品公司)、环烯烃共聚物(新泽西Chatham的Ticona公司)，以上仅举了几个例子。可以使用这些材料的薄膜形式在层压步骤中通过加热和施压来将功能层粘结到支撑层上。若可以树脂形式获得，则热塑性材料可以溶解在合适的溶剂中，并作为薄层施加到功能膜或支撑层上，干燥除去挥发物，并结合到相应部分上。在功能化之前，所述多孔材料层可以用粘合剂结合到支撑层上，然后通过上述的杂交处理和硅烷处理步骤将上述复合物杂交。
图1显示了本发明实施方式的制件10。支撑层12具有施加于其上的粘合剂14。将微孔含氟聚合物、ePTFE、基材层16通过粘合剂14附到支撑层12上。
支撑层12是使用或无需粘合剂而能结合到微孔含氟聚合物层16上的任意硬性表面。支撑层12优选是玻璃。在施加粘合剂14(若使用的话)和微孔含氟聚合物层16之前，支撑层12的表面任选进行处理。
图2(A)显示了ePTFE材料的表面20的扫描电子显微镜图。该图显示存在通过原纤24互连的节点22。该显微图也显示了这种材料的无规孔隙。
图2(B)和2(C)是本发明使用ePTFE作为原料的多孔基材表面在两种不同放大倍下的扫描电子显微图。这种多孔ePTFE材料的微结构首先用二氧化硅溶胶-凝胶处理，形成中间层，然后用氨基硅烷进行处理。图2(C)显示了微结构的经过涂布的节点26和经涂布的原纤28。
使用本发明的方法，可以制造使用本发明功能化ePTFE层的复合微阵列基材，它显示出所需的不同寻常的高官能团密度和低自发荧光性。具体是，根据ePTFE的性质，可以制造官能团密度至少为50毫微摩尔/厘米2、较好是至少100毫微摩尔/厘米2，最好是至少250毫微摩尔/厘米2的复合基材。这比现有技术基材所获得的官能团密度高至少一个数量级。例如，根据所用ePTFE材料的具体性质，复合微阵列基材测得的胺密度约为100-400毫微摩尔/厘米2。相比较，氨基硅烷处理的非多孔玻璃载玻片(康宁UltragapsTM)和多孔尼龙膜基VividTM微阵列载玻片分别约为4.8和6.5毫微摩尔/厘米2。
当提供高功能位点密度时，本发明复合微阵列基材将其自发荧光性保持在低水平。复合基材的自发荧光性可以通过在印刷生物分子之前使用GenePix 4000A微阵列扫描仪在PMT设定值为350时扫描该基材来确定。使用本发明的方法可以制造在532nm(绿)和635nm波长下自发荧光水平分别小于1000相对荧光单位(RFU)和小于100RFU的包括功能ePTFE层的复合微阵列基材。在大多数情况下，复合微阵列基材的自发荧光水平低得多，通常在532nm和635nm波长下分别小于200RFU和小于30RFU。
本发明的复合微阵列基材提供用于固定生物分子的通用表面。不同于其在常规微阵列分析中的应用，本发明基材也可以用作具有其上以任意图案附着生物分子的基材。可附着的生物分子的例子是核酸、蛋白质、肽、寡核苷酸、抗体、细胞、病原体，等等。
通过评估来确定复合微阵列基材的性能：使用复合基材来制造DNA微阵列。然后用标记有在两种不同波长下发出荧光信号的两种荧光染料(即Cy3和Cy5)的cDNA来杂交微阵列。然后，使用微阵列扫描仪(使用激光光源和光电倍增管(PMT))作为检测器，在两个不同波长下检测杂交载玻片内各点(及其附近)的荧光信号。所述扫描仪检测来自杂交的微阵列基材的荧光强度，并将数据储存为在颜色标尺上表示强度的基材扫描图的形式。因此获得的原始信号强度使用标准微阵列数据分析软件(来自爱克森仪器公司的 Pro、来自洛拜恩信息公司(Lobioninformatics)的或来自PE公司的 Express)进行统计学分析，以确定一些关键的性能量度，如信噪比和精确水平。确定本发明复合微阵列基材以及现有技术中的基材的性能标准。微阵列数据分析的细节容易在书籍中获得，例如，Ulrike A Nuber编著的《DNA微阵列(DNA Microarrays)》(泰勒弗兰克公司(Taylor & Francis)，纽约，2005)或者Mark Schena编著的《微阵列分析(Microarrayanalysis)》(约翰威利父子公司(John Wiley & Sons)，Hoboken，NY，2003)。
信噪比(SNR)是测量微阵列基材的关键性能量度。来自微阵列内某点的信号的质量取决于其相对周边环境(也称为局部背景噪声)的强度。当来自某点的信号强度靠近局部背景噪声的强度时，各测量中的误差变得相当高。在指定波长下，来自点的SNR容易算出：首先确定净信号强度，它是表示某点的所有像素的信号强度中值(S)与表示仅仅在所述点外围的周边区域的所有像素的局部背景中值(B)之差。通过计算局部背景的标准偏差来估算背景噪声(NB)。该点的SNR则可定义为：
SNR＝(S-B)/NB
式中，S、B和NB用相对荧光单位(RFU)表示。
通常，确定阵列中各点的SNR。平均SNR(ASNR)是阵列中各点的所有SNR的平均值。使用微阵列数据分析软件，可以自动对常规微阵列中大量的点进行SNR计算。
由于在微阵列实验中获得的数据精度方面提供更高的可靠性，因此总需要高ASNR。相比现有技术的基材，本发明的复合微阵列基材提供高得多的ASNR。通常，本发明复合基材的ASNR在两个波长下平均是氨基硅烷处理的玻璃载玻片的至少两倍。例如，附到玻璃载玻片的功能化ePTFE膜的性能远远超过现有技术中的所有材料。它对Cy5和Cy3的平均信噪比分别至少约为191和94。现有技术中最常用的载玻片对Cy5和Cy3的信噪比分别至少约为110和62。
令人惊奇的是，本发明的复合微阵列基材不仅提供高ASNR，而且能很有效地稳定获得的荧光信号。本领域熟知来自Cy5染料的信号极其不稳定，尤其是在臭氧影响下。实际上，由于环境条件下臭氧水平的合理变化，因此通常能看到当环境臭氧水平升高时Cy5信号的稳定性变差。现在发现相比现有技术中的基材，本发明使用功能化ePTFE层的复合微阵列基材能显著地更加有效地稳定Cy5信号。例如，在环境臭氧水平高的夏季，本发明基材的Cy5 SNR约为氨基硅烷处理的玻璃载玻片上的Cy5 SNR的7.7倍。在24小时内，这种比例增至38.9，这是因为玻璃载玻片上的Cy5信号剧烈降低，而本发明复合基材上的Cy5信号相对更稳定。
除了高ASNR之外，精确度是另一个很需要的性能量度。在微阵列实验中，当用两种不同荧光染料(Cy3和Cy5)标记相同靶时，预计来自两个波长的信号应提供相同的信息。换句话说，若Cy3信号强度和Cy5信号强度以相同的x和y轴绘图，则理论数据应为1:1(或45°)的线。实际上，所述数据通常来自这种线，并且离所述1:1线越远则数据的可靠性越低。数据精确度的测量可以通过确定所述数据距离所述1:1线多近来获得。若有M个数据点，其中有N个数据点在Z-倍(Z-fold)以上和Z-倍以下边界之外，则Z-倍精确水平定义为：
PZ＝Z-倍％精确度水平＝100×(1-(N/M))
式中，Z-正倍(fold up)和Z-倒数倍(fold down)边界表示Cy3信号强度是Cy5信号强度的Z倍或者1/Z倍。例如，2-倍以上是指Cy3信号强度是Cy5信号强度的2倍，2-倒数倍是指Cy3信号强度是Cy5信号强度的一半。在较低Z水平下Pz值越高则表示精度越高、数据约可靠。本发明复合微阵列基材显示出更高的精确度水平。通常，对本发明的基材而言，P1.5和P1.2是分别至少99％和至少90％。相比较，氨基硅烷处理的玻璃载玻片的各值分别为96％和73％。显然，当用在微阵列实验中时本文所述的复合基材可获得极高的精确度和可靠的数据。
实施例
测试方法
厚度测量
将所述膜置于2片Kafer FZ1000/30厚度卡规(德国Villingen-Schwenningen的K
Figure A200780014129D0022081424QIETU
fer Messuhrenfabrik GmbH)之间来测量膜的厚度。取三次测量值的平均值。
泡点测量
按照ASTM F31 6-03使用毛细管流量气孔计(CFP 1500 AEXL型，纽约州伊萨卡镇的多孔材料公司(Porous Materials Inc.，Ithaca，NY))测量泡点和平均流动孔径。将样品膜置于样品室中，并用表面张力为19.1达因/厘米的SilWick硅氧烷流体(纽约州伊萨卡镇的多孔材料公司)润湿。样品室的底部夹子具有直径2.54cm，厚3.175mm的多孔金属盘插入物(40微米多孔金属盘，康涅狄格州法明顿MM公司(Mott Metallurgical，Farmington，CT))，样品室的顶部夹子具有直径3.175mm的孔。使用Capwin软件(6.62.1版本)，按照下表所述设定以下参数。表示泡点和平均流动孔径的值是两个测量值的平均。
 
参数 设定点 参数 设定点
最大流量(maxflow)(cc/m) 200000 最小平衡时间(mineqtime)(秒) 30
泡点流量(bublflow)(cc/m) 100 挤压回转(presslew)(cts) 10
F/PT(老泡点时间(old bubltime)) 40 流动回转(Flowslew)(cts) 50
最小泡点压力(minbppres)(PSI) 0 平衡重复(eqiter) 3
零时(zerotime)(秒) 1 平均重复(aveiter) 20
v2增益(v2incr)(cts) 10 最大压力差(maxpdif)(PSI) 0.1
预增益(Preginc)(cts) 1 最大流量差(maxfdif)(cc/m) 50
脉冲延迟(pulse delay)(秒) 2 起点压力(Sartp)(PSI) 1
最大压力(maxpre)(PSI) 500 起点流量(Sartf)(cc/m) 500
脉冲宽度(pulse width)(秒) 0.2
官能团密度测量
使用茚三酮基试验来确定氨基官能团的密度。所述试验基于Sarin等的讲述(Sarin，V.K.、Kent，S.B.H.、Tam；JP.& Merrifield，R.B.(1981)Anal.Biochem.117，147-157)。在这一试验中，茚三酮和本发明的基材反应。在所得液体中的反应产物通过分光光度计(sprectroscopically)进行测定，获得胺官能团的浓度。该试验使用从样品基材上获得的约1cm2大小的样品，并进行以下步骤：
反应试剂A-在烧杯中混合40g苯酚和10ml的纯乙醇，升温直到获得透明液体。在另一烧杯中将0.042g氰化钾(KCN)溶解在65ml水中。然后在另一烧杯中用100ml纯吡啶稀释约2ml的KCN溶液。在标记为“反应试剂A”的单独容器中，将6ml的苯酚/乙醇溶液和12.5ml的KCN/吡啶溶液混合。
反应试剂B-将2.5g茚三酮溶解在10ml的纯乙醇中。
样品分析
在试验管中加入800微升的反应试剂A和200微升的反应试剂B。将试验管置于设定在100℃的加热块中，将所述加热块置于振荡器上。所述振荡器以110rpm运行10分钟。然后去除试验管，并置于水浴中。往该管中加入乙醇，直到总体积为2ml，将溶液很好地混合。用吸液管将200微升等份的这种混合物加入到96孔玻璃平板上，使用分光光度计测量570nm的吸光度。
数据分析
在减去空白样的吸光度之后，使用吸光度值由以下关系式计算各样品的胺密度。
胺密度(毫微摩尔/厘米2)＝[吸光度样品×体积(L)×109(nmol/mol)]/[(Ext.Co.570(M-1cm-1)×路径长度(cm)×面积样品(cm2))]，
式中，体积＝2ml＝0.002L，Ext.Co.＝消光系数＝15000M-1cm-1，所用路径长度为0.4146cm。
对于各样品，进行三次测量，并将胺密度值记录为三个重复测量的平均值。
在无支撑功能基材的情况下，直接测量基材的厚度。在这种情况下，官能团密度表示为：
官能团密度(毫微摩尔/厘米3)＝官能团密度(毫微摩尔/厘米2)/基材厚度(厘米)
自发荧光测量
使用PMT设定值为350、分辨率为10微米的Axon Genepix 4000A(美国中部联合城的爱克森仪器公司)扫描仪测量用这些功能化基材制备的无支撑基材以及微阵列载玻片的自发荧光。在635nm和532nm波长下测量自发荧光。将载玻片样品(包括硬性Vycor基材)置于载玻片固定器中，基材面向下，并扫描获得自发荧光。在无支撑基材如膜的情况下，将样品置于平的玻璃显微镜载玻片上，并置于载玻片固定器上，基材面向下，并扫描获得自发荧光。使用GenePix Pro 5.0软件分析扫描的图像。记录在载玻片矩形面积中的4800离散位置处的自发荧光。所述面积的左上角离样品的左边缘2.27mm，离样品的上边缘12.21mm，所述样品为25.4mm×76.2mm。所述面积的右下角离样品的左边缘18.04mm，离样品的下边缘59.82mm。对每个样品载玻片和各基材记录在两个波长下的平均自发荧光值。
信噪比测量
通过在加拿大多伦多大学健康网络(UHN)的微阵列中心进行本发明的微阵列载玻片的信噪比测量。使用浓度为0.2微克/毫升的DNA印刷溶液(3×SSC)将来自人类基因组的1718个克隆组印刷到载玻片上。所印刷的阵列组织成32块，排列成8排×4列，格与格之间的距离为4500μ。在各格中，以10排×12列设置120个特征(feature)。所述特征大小为100微米，特征和特征之间的距离为200μ。将印刷过程中的湿度水平控制在55-60％。在印刷之后，将载玻片上的印刷探针造95℃下干燥1分钟，然后使用UV StratalinkerTM 1800(Stratagene)在2500微焦的能量下交联。
使用以下标记方案由总量10微克的RNA来制得标记的cDNA。
反转录
·在0.5微升的管中混合8.0微升5X第一链缓冲液(Superscript II，Invitrogen)、1.5微升AncT引物(5’-T20VN，100pmol/μl)、3.0微升dNTP-dTTP(dATP、dCTP、dGTP各6.67mM)、3.0微升2mM dTTP、3.0微升2mM AA-dUTP(Sigma，目录号：A-0410)、4.0微升0.1M DTT、1.0微升对照RNA(人造Arabadopsis转录物(2-10ng/微升)，任选的)、0.1-10微克总RNA(0.1-0.5微克mRNA或5-10微克总RNA)和40微升不含核酸酶的水。
·在65℃下培育标记反应物5分钟，然后在42℃下2分钟(部分冷却溶液)。培育不一定要在黑暗中。
·加入2微升反转录酶(Superscript II，Invitrogen)，并在42℃下培育2小时。
·加入8微升1M氢氧化钠，并在65℃下加热15分钟，水解RNA
·加入8微升1M盐酸和4微升1M tris-HCL(pH7.5)，将所述溶液中和。
氨基烯丙基-cDNA纯化
使用CyScribeTM GFX TM纯化试剂盒(爱默生公司(GE Amersham)，目录号：27-9606-02)进行纯化。使用以下方案在一个GFX柱中纯化各样品。
·向各柱中加入500微升的俘获缓冲液。
·将cDNA产品(约62微升)转移到所述柱中，用移液管上下吸取几次以进行混合，在13800xg下旋转30秒，并弃去流出物。
·加入600微升80％的乙醇，在1300rpm下旋转30秒，并丢弃流出物；重复该步骤，进行总共3次洗涤。
·将该柱再旋转30秒，确保除去所有的乙醇。
·将GFX柱转移到新试管中，加入60微升0.017M的碳酸氢钠(pH9)
·在室温下培育GFX柱1分钟
·在13800xg下旋转1分钟，洗脱纯化的标记cDNA。
·使用Speed Vac来充分干燥样品。重悬于7微升不含核酸酶的水。
制备单官能团活性花青染料并标记
·在本研究中使用Alexa 647/Alexa 555 fluors(Invitrogen)和Cy5/Cy3(Amersham)，两者将分别被称为Cy5和Cy3。Alexa fluors单独包装销售。每管加入3微升DMSO，将染料再次悬浮。将整管内容物加入到各标记反应物中。Cy染料呈5微升的包装。各管加入45微升DMSO。再往各标记反应物中加入3微升重悬的染料。
·将3微升染料加入7微升氨基烯丙基标记的cDNA中，通过移液管上下吸取进行混合，并在室温下于黑暗环境中培育1小时。
·加入4.5微升4M的羟胺，将非共轭染料淬灭。在室温下于黑暗环境中培育15分钟。
纯化荧光标记的探针
·向各反应加入35微升的水，使各反应物的体积达到约50微升。
·混合Cy5和Cy3标记的样品，它们将被共杂交(co-hybridized)
·往各柱中加入500微升俘获缓冲液。
·将标记的cDNA产品(约100微升)加入到各柱中，用移液管上下吸取以进行混合，在13800xg下旋转30秒，并丢弃流出物。
·加入600微升80％的乙醇，在13800xg下旋转30秒，并丢弃流出物；重复该步骤，进行总共3次洗涤。
·将该柱再旋转30秒，确保除去所有的乙醇。
·将GFX柱转移到新试管中，加入60微升洗脱缓冲液(随试剂盒一起提供)。
·在室温下培育GFX柱1分钟。
·在13800xg下旋转1分钟，洗脱纯化的氟标记的cDNA。
·使用SpeedVac来干燥样品(在高温下，小心不要过干)并重悬于5微升不含核酸酶的水。
杂交
·不需要预杂交步骤。
·为所有杂交提供足够的溶液—为每个载玻片提供100微升，并有额外的100微升以免移液时产生误差。
·往各100微升DIG Easy Hyb溶液(Roche)中加入5微升酵母tRNA(Invitrogen；10mg/ml)和5微升小牛胸腺DNA(Sigma；10mg/ml)。在65℃下培育该混合物2分钟，并冷却至室温。
·将100微升制备的杂交溶液加入各对收集的Cy5和Cy3标记的cDNA(约5微升)中。
·将杂交溶液和标记的cDNA混合，在65℃下培育该混合物2分钟，并冷却至室温。
·将盖片(24x60mm，非提升盖(non-lifter slip))置于可靠表面(锥形盒(tip box)的角落工作良好)，并用移液管将杂交混合物移到盖片上。将载玻片的“阵列侧”面向下地置于盖片顶部(实际上不是简单地将载玻片向下置于盖片上，而是使其位于盖片顶部，直到载玻片足够湿润，能吸附起盖片)。快速翻转载玻片(盖片吸在其上)，从而使盖片位于载玻片顶部。
·将载玻片小心置于杂交室中。我们所用的杂交室是塑料显微镜载玻片盒，在其底部含有少量的DIG Easy Hyb溶液(以保持湿润环境)。将透明的平显微镜载玻片间隔1或2个载玻片位置放置在载玻片盒中，形成轨道或平台，在其上可放置杂交阵列。各杂交室可容纳2或3杂交载玻片(这取决于载玻片放置的方向)。将盖子小心置于盒上，然后用塑料带裹住该盒。
·在37℃培养箱的水平表面上培育过夜(约16-18小时)。
洗涤
·通过迅速且轻柔地将阵列浸渍在1XSSC中来移走盖片(使盖片轻柔地滑走，用镊子在条形码末端处固定载玻片)。将载玻片置于染色架中并置入装有新鲜1×SSC的染料皿中(Evergreen Scientific through Diamed cat# E/S258-4100-000)。
·当从杂交室中取出所有阵列时，在轻柔的不定期搅拌条件下，在装有预热的(50℃)1×SSC/0.1％ SDS的干净的载玻片染色盒中50℃洗涤三次，每次15分钟。
·在完成洗涤之后，在室温的1×SSC中清洗载玻片(倒转4-6次)，然后在0.1×SSC中清洗
·在衬有Whatman纸的载玻片盒中以89xg旋转干燥载玻片5分钟。或者，在50毫升Falcon管中干燥载玻片(并在89xg下旋转5分钟)。
·阵列应在黑暗环境中存储。推荐阵列在洗涤之后立即进行扫描(至少在2天之内)。本发明的杂交载玻片使用ScanarrayTM 4000扫描仪(马萨诸塞州韦尔斯利的PE公司)进行扫描，激光能量设定在65-75之间，PMT设定在50-55。
使用ArrayVision v.8.0(Imaging Research Inc.)量化TIFF图像。然后，将数据和图像载入GeneTrafficTM(Lobion Informatics)中，进行归一化。在GeneTrafficTM中选择“Lowess，sub-grid”方法进行归一化。归一化的强度值从GeneTrafficTM数据库下载。对各载玻片类型在Excel中计算平均S/N。对各载玻片类型，各重复实验的标准偏差在Excel中计算。在每个阵列上各点出现两次，在仅测试一个阵列的情况时，进行2次重复实验，计算它们之间的S/N标准偏差。当使用更多阵列时，在所有重复实验阵列和重复点(每个阵列2点)上计算S/N的标准偏差。
也测量来自康宁生命科学公司的Ultragaps载玻片的信噪比。步骤与上述相同，除了使用较少的(80微升)的杂交缓冲液以外。而且，在不同设定值下进行扫描，确定这些设定值以使这些载玻片最适宜。具体地说，所用激光能量设定值为95-100，PMT设定在70-80。
精确水平
使用阵列进行精确水平测量，所述阵列在Cy5和Cy3室中用相同的RNA样品进行标记。理论上，所有数据点均准确落在45°线上，所述线穿过归一化Cy3信号强度散布图的原点画出(针对载玻片上所有数据点(M)的Log-log图上归一化Cy5信号强度)。从该图可确定在Z-正倍和Z-倒数倍的范围之外数据点的数量(N)。一致性或特异性或精确度水平定义为：
Z-倍精确度水平，％＝100×(1-(N/M))
功能化基材实施例
溶胶-凝胶溶液
制备前体溶液：在65℃下，将40.7份四乙氧基硅烷(Dynasil A，由新泽西州Parsippany的Degussa公司制造)、14.1份去离子水、44.8份乙醇和0.4份盐酸(37％)反应24小时。然后冷却所述溶液，并在冷冻器中储存直到下一步使用。
硅烷溶液
制备硅烷溶液：将2份的氨基丙基三乙氧基硅烷(A0750，宾州布里斯托尔联合化学技术公司)和98份95/5(w/w)的乙醇/水混合物混合。这种溶液在使用前才制得，并在使用前静置至少5分钟。
实施例1
本实施例说明了本发明以ePTFE作为多孔原料制得的高功能化微孔基材。当检测所述处理和未处理的膜的实质改进时，本发明的方法和制件令人惊奇的优点是显而易见的。
材料类型：ePTFE
按照美国专利4187390所述制得发泡聚四氟乙烯(ePTFE)膜。所述ePTFE膜约74微米厚，具有0.434Mpa(63psi)的泡点。将水洒在膜的表面上来检测其疏水性。
溶胶-凝胶处理
ePTFE膜进行处理：将膜安装到绣花圈上，便于移动，然后将膜浸没在通过等重量的乙醇稀释的溶胶-凝胶溶液所获得的溶液中。5分钟后，取出所述膜，并浸没在去离子水中5分钟。在清洗步骤之后，将所述膜风干，然后在150℃下加热5分钟。在这一阶段，所述膜是亲水的，水容易润湿所述膜。
氨基硅烷处理
用氨基硅烷进一步处理亲水膜，在其微结构上提供氨基官能团。这通过将膜浸没在硅烷溶液中5分钟，然后在异丙醇(IPA)中清洗2分钟，并在110℃下加热所述膜10分钟来完成。所述膜通过重复相同的步骤再次用硅烷进行处理：浸没在硅烷溶液中5分钟、在IPA中清洗2分钟，并在110℃下加热10分钟。
最终膜
所得功能化ePTFE膜厚34微米，茚三酮试验显示胺密度为416.4毫微摩尔/厘米2(或者121435毫微摩尔/厘米3)。在635nm和532nm下测得所述功能化ePTFE膜的自发荧光为21.2和30.4。为了进行对比，使用茚三酮试验来测试相同的未处理的ePTFE膜是否存在任何氨基官能团。未检测到氨基官能团。
实施例2
本实施例也说明了本发明以ePTFE作为多孔原料制得的高功能化微孔基材。除了使用PVOH代替溶胶-凝胶之外，重复实施例1。而且，如实施例所述，本发明的制件比相同类型的未处理的膜好得多。
材料类型：ePTFE
PVOH处理
实施例1中使用的ePTFE膜进行处理：将膜安装到绣花圈上，便于移动，然后将膜浸没在IPA中5分钟、然后浸没在去离子水中2分钟，然后浸没在5重量％的聚乙烯醇水溶液(P1180，加州光谱化学品公司(Spectrum Chemicals，Gardena，CA))中10分钟。取出所述膜，并浸没在去离子水中10分钟。在清洗步骤之后，所述膜在室温条件下风干过夜，然后在110℃下加热10分钟。在这一阶段，所述膜是亲水的，水容易润湿所述膜。
氨基硅烷处理
用氨基硅烷进一步处理亲水膜，在其微结构上提供氨基官能团。这通过将膜浸没在硅烷溶液中5分钟，然后在异丙醇(IPA)中清洗2分钟，并在110℃下加热所述膜10分钟来完成。所述膜通过重复相同的步骤再次用硅烷进行处理：浸没在硅烷溶液中5分钟、在IPA中清洗2分钟，并在110℃下加热10分钟。
最终膜
使用茚三酮试验来测试所得膜，氨基官能团的平均密度为118.5毫微摩尔/厘米2。
实施例3
本实施例说明了本发明以微孔尼龙作为多孔原料制得的高功能化微孔基材。当检测所述处理和未处理的膜的实质改进时，本发明的方法和制件令人惊奇的优点是显而易见的。
材料类型：微孔尼龙
膜
从新泽西州皮斯卡塔韦的爱默生生物科学公司(Amersham Biosciences Corp.，Piscataway，NJ)获得表面经处理的市售微孔尼龙膜(Hybond N+)。
该膜约厚150微米，泡点约为12.5psi。茚三酮试验显示从供应商处获得的膜的氨基官能团密度为9.7毫微摩尔/厘米2(或638毫微摩尔/厘米3)。
溶胶-凝胶处理和氨基硅烷处理
使用实施例1所述步骤功能化所述膜。
最终膜
所得膜约厚147微米。官能团密度为1093毫微摩尔/厘米2(74199毫微摩尔/厘米3)。这种氨基官能团密度的显著提高源自本发明的方法。
实施例4
本实施例说明了本发明以多孔超高分子量聚乙烯(UHMWPE)片作为多孔原料制得的高功能化微孔基材。当检测所述处理和未处理的膜的实质改进时，本发明的方法和制件令人惊奇的优点是显而易见的。
材料类型：多孔UHMWPE
膜
从乔治亚州Fairburn的Porex公司获得市售多孔UHMWPE片(Porex 9619)。该片约厚1524微米，泡点约为0.009Mpa(1.3psi)。
溶胶-凝胶处理和氨基硅烷处理
使用实施例1所述步骤功能化所述膜。
最终膜
所得片厚约1524微米。官能团密度为426.9毫微摩尔/厘米2(2801毫微摩尔/厘米3)。在635nm和532nm下测得所述功能化UHMWPE片的自发荧光分别为31.1和107.2RFU。为了进行比较，使用茚三酮检测市场上获得的多孔UHMWPE片存在的任意氨基官能团。所述试验显示膜的氨基官能团密度是1.1毫微摩尔/厘米2(7.0毫微摩尔/厘米3)。市售UHMWPE片在635nm和532nm下测得的自发荧光分别为23.9和48.7RFU。这种氨基官能团密度的显著提高并不会导致自发荧光显著增大，这源自本发明的方法。
实施例5
本实施例说明了本发明以微孔聚丙烯作为多孔原料制得的高功能化微孔基材。当检测所述处理得的微孔聚丙烯和现有技术的微孔聚丙烯膜的实质改进时，本发明的方法和制件令人惊奇的优点是显而易见的。
材料类型：微孔聚丙烯
膜
从马萨诸塞州水镇的奥斯莫尼克公司(GE Osmonics Inc.，Watertown，MA)获得市售微孔聚丙烯膜(Polysep，0.1μ，目录号：M01WP320F5)。该膜厚约86μ，泡点约为0.135Mpa(19.6psi)。
溶胶-凝胶处理和氨基硅烷处理
使用实施例1所述步骤功能化所述膜。
最终膜
所得片厚约74微米。官能团密度为486.8毫微摩尔/厘米2(66087毫微摩尔/厘米3)。为了进行比较，使用茚三酮检测市场上获得的微孔聚丙烯膜存在的任意氨基官能团。所述试验在该膜上没有检出任何氨基官能团。
实施例6
本实施例说明了本发明以多孔PTFE作为多孔原料制得的高功能化微孔基材。当检测所述处理和未处理的膜的实质改进时，本发明的方法和制件令人惊奇的优点是显而易见的。
材料类型：多孔PTFE
膜
从乔治亚州Fairburn的Porex公司获得市售多孔聚四氟乙烯(PTFE)膜(MuporPM17Y)。该膜厚约152微米，泡点约为0.044Mpa(6.4psi)。
溶胶-凝胶处理和氨基硅烷处理
使用实施例1所述步骤功能化所述膜。
最终膜
所得膜厚约152微米，官能团密度为78.6毫微摩尔/厘米2(5158毫微摩尔/厘米3)。对未处理的膜没有进行茚三酮试验，这是因为其上不存在任何氨基官能团。
实施例7
本实施例说明了本发明以微孔聚偏1，1-二氟乙烯作为多孔原料制得的高功能化微孔基材。当检测所述处理和未处理的膜的实质改进时，本发明的方法和制件令人惊奇的优点是显而易见的。
材料类型：微孔聚偏1，1-二氟乙烯膜
膜
从马萨诸塞州Watertown的GE Osmonics公司获得市售微孔聚偏1，1-二氟乙烯膜(PVDF+转印膜，0.22μ，目录号：PV2HY320F5)。该膜厚约152μ，泡点约为0.135Mpa(19.6psi)。
溶胶-凝胶处理和氨基硅烷处理
使用实施例1所述步骤功能化所述膜。
最终膜
所得膜厚约154微米。官能团密度为420.6毫微摩尔/厘米2(27146毫微摩尔/厘米3)。在635nm和532nm下测得所述功能化PVDF膜的自发荧光分别为173.4和526.5RFU。对未处理的膜没有进行茚三酮试验，这是因为其上不存在任何氨基官能团。在635nm和532nm下测得所述未处理的PVDF膜的自发荧光分别为36.6和58.2RFU。
实施例8
本实施例说明了本发明以多孔玻璃作为多孔原料制得的高功能化微孔基材。当检测所述处理和未处理的膜的实质改进时，本发明的方法和制件令人惊奇的优点是显而易见的。
材料类型：多孔玻璃
基材
从马萨诸塞州霍顿的先进玻璃和陶瓷公司获得由Vycor 7930多孔玻璃制得的25.4mm×76.2mm×1mm厚的矩形载玻片。
氨基硅烷处理
按照现有技术的内容，使用实施例1中所述的硅烷处理步骤将多孔玻璃载玻片官能化。
溶胶-凝胶处理和氨基硅烷处理
使用实施例1中所述的溶胶-凝胶处理和氨基硅烷处理步骤将另一个多孔玻璃载玻片样品也官能化。
最终基材
仅用硅烷处理的载玻片显示氨基密度为1169.6毫微摩尔/厘米2(12118毫微摩尔/厘米3)，635nm和532nm下的自发荧光水平分别为23.9和93.7RFU。相比较，使用本发明实施例1所述方法官能化的多孔玻璃载玻片(即用溶胶-凝胶以及氨基硅烷处理)显示氨基官能团密度为1311.7毫微摩尔/厘米2(13590毫微摩尔/厘米3)。在635nm和532nm下测得所述载玻片的自发荧光分别为36.3和332RFU。对未处理的基材没有进行茚三酮试验，这是因为其上不存在任何氨基官能团。在635nm和532nm下测得所述未处理的多孔玻璃载玻片的自发荧光分别为23.1和39.4RFU。
复合微阵列基材实施例
对比例
获得市售微阵列载玻片，并使用茚三酮试验来分析氨基官能团密度和自发荧光水平。来自康宁、泰勒凯姆国际公司和依莱科技公司(Erie Scientific)的载玻片是具有氨基官能化表面的非多孔玻璃载玻片。相比较，来自Pall公司的
Figure A200780014129D00331
微阵列载玻片是可用粘合剂粘到玻璃载玻片上的微孔尼龙聚合物膜。这些市售微阵列载玻片的结果列于表1中。
 
名称 来源 氨基密度(毫微摩尔/厘米2) 635nm的平均RFU 532nm的平均RFU
Ultragaps载玻片 康宁生命科学公司 4.8 21 23.4
Array-ItSuperamine-2载玻片       泰勒凯姆国际公司             0.9 21 26.5
氨基官能化载玻片 依莱科技公司 1.0
Vivid微阵列载玻片 Pall公司 6.5 33.5 176
实施例9
将ePTFE膜结合到玻璃载玻片上，然后官能化。
平的预先清洁的玻璃显微镜载玻片(VWR，目录号：48300)用上述硅烷溶液进行处理：将载玻片浸渍在溶液中5分钟，然后在IPA中清洗2分钟，然后在110℃下加热10分钟。所述硅烷处理的载玻片结合到ePTFE膜上，所述膜厚74微米，泡点约为0.434Mpa(63psi)，平均原纤长度为1.2微米。所述结合通过使用空气刷盒(air-brush kit)(McMaster-Carr，目录号：9546T13)将TRABOND FDA2环氧化物粘合剂(马萨诸塞州Bedford的Tar-Con公司)在甲乙酮中的40重量％溶液喷涂到硅烷处理的载玻片上来进行。
将粘合剂处理的载玻片置于ePTFE膜的顶部，所述膜固定在绣花圈上。然后所述粘合剂在110℃的强制通风炉中固化60分钟。在固化之后，使用刀片沿玻璃载玻片切除多余的ePTFE膜。所得复合载玻片具有一层附于载玻片表面上的ePTFE膜。所述膜的表面是疏水的。茚三酮试验显示没有氨基官能团。635nm和532nm下膜表面的自发荧光分别约为21和22RFU。
然后，复合载玻片置于载玻片架(Wheaton，目录号900403)上，用溶胶-凝胶处理该载玻片：将它们浸没在溶胶-凝胶溶液(用等重量份的一层稀释)中。在浸没5分钟之后，取出载玻片，并用去离子水清洗5分钟。清洗后的载玻片风干，然后在150℃下干燥5分钟。在该阶段，ePTFE膜极其亲水，从它容易被水润湿可以得到证实。这些溶胶-凝胶处理的载玻片进行进一步处理：将它们浸没在硅烷溶液中5分钟，在IPA中清洗2分钟，然后在设定在110℃的烘箱中加热10分钟。在该阶段，载玻片的ePTFE膜表面具有氨基官能团。茚三酮试验显示氨基官能团密度为338.6毫微摩尔/厘米2。在635nm和532nm下测得所述载玻片的模表面的自发荧光水平分别为22.7和191.2RFU。
将这些结果与表1中所示现有技术中的那些进行比较，显示本发明提供了氨基官能团密度明显更高且同时保持与市售多孔聚合物膜基产品相当的自发荧光水平的微阵列载玻片。
实施例10
平的预先清洁的玻璃显微镜载玻片(VWR，目录号：48300)用丙酮进行处理，然后结合到ePTFE膜上，所述膜厚74微米，泡点约为0.434Mpa(63psi)，平均原纤长度为1.2微米。所述结合通过使用空气刷盒(McMaster-Carr，目录号：9546T13)将包含1.8％(以环氧化物固体计)的3-甘油基氧丙基三甲氧基硅烷(G6720，宾州布里斯托尔的联合化学技术公司)的TRABOND FDA2环氧化物粘合剂在甲乙酮中的40重量％溶液喷涂到玻璃载玻片上来进行，然后将粘合剂处理的载玻片置于ePTFE膜的顶部，所述膜固定在绣花圈上。然后所述粘合剂在80℃的空气循环烘箱中固化18小时。在固化之后，使用刀片沿玻璃载玻片切除多余的ePTFE膜。所得复合载玻片具有一层附于载玻片表面上的ePTFE膜。所述膜的表面是疏水的。茚三酮试验显示没有氨基官能团。635nm和532nm下膜表面的自发荧光分别约为21和22RFU。
然后，复合载玻片置于载玻片架(Wheaton，目录号900403)上，用溶胶-凝胶处理该载玻片：将它们浸没在溶胶-凝胶溶液(用等重量份的一层稀释)中。在浸没5分钟之后，取出载玻片，并用去离子水清洗5分钟。清洗后的载玻片风干，然后在150℃下干燥5分钟。在该阶段，ePTFE膜极其亲水，容易被水润湿。这些溶胶-凝胶处理的载玻片进行进一步处理：将溶胶-凝胶处理的载玻片浸没在硅烷溶液中5分钟，在IPA中清洗2分钟，然后在设定在110℃的烘箱中加热10分钟。在该阶段，在635nm和532nm下测得所述载玻片的模表面的自发荧光水平分别为27.4和350.8RFU。
实施例11
将实施例10的复合微阵列载玻片在2005年12月在UHN下处理，确定平均信噪比。为进行比较，同时也处理Ultragaps微阵列载玻片(康宁)。使用微阵列载玻片(Pall公司)，使用相同的规则进行类似的比较。但是，使用本文所述的接触印刷方法不可能将复合微阵列印刷到这些载玻片上。
已知环境臭氧水平对Cy5通道中信号的稳定性有显著的影响。在夏季测量现有技术中的样品显示出比较冷季节时测量相同样品所得信噪比更低。之前所述本发明(实施例9)和现有技术的样品也是在2005年3月进行试验。
信噪比数据列于表2中。
 
载玻片说明 所用载玻片数 平均信噪比，Cy5 平均信噪比，Cy3
本发明样品在12月测试 2 205.8 116.1
UltraGaps样品在12月测试   5 110.1 81.35
本发明样品在3月测试  2 191.5 93.7
UltraGaps样品在3月测试    2 87.8 40.2
这一数据证实当在相同时间窗进行测试时本发明制件相比现有技术的制件具有明显更高的信噪比。所述数据也显示了对载玻片性能的合理影响。来自本发明微阵列基材的Cy5信号比现有技术中的那些基材显示少得多的影响。本发明样品显示约7％的变化，而常规产品显示了约25％的变化。因此，本发明样品具有更高的稳定性(在上述条件下变化小于20％，更好是小于10％)。
图3(A)和3(B)分别显示该例中本发明和现有技术(Ultragaps)样品的散布图，它们在2005年12月进行测试。这些附图也显示2-倍、1.5倍和1.2倍极限，以此计算不同的精确度水平。精确度值列于表3中。
表3
 
载玻片说明 测试载玻片数 P2，2-倍精确度水平，％       P1.5，1.5-倍精确度水平，％       P1.2，1.2-倍精确度水平，％      
本发明样品 2 100 99.99 99.92
现有技术样品 5 99.88 98.88 92.73
该数据显示本发明微阵列载玻片具有明显更高的精确度水平，这是因为倍极限(fold limit)更小。即，当倍极限更紧密时，本发明制件保持极高的精确度水平，而现有技术制件的精确度显著降低。因此，本发明基材能获得比现有技术基材更有用的数据。而且，本发明基材提供的精确度水平更高，则微阵列数据的可靠性程度越高，这样重复试验就不必那么多。
实施例12
按照实施例9所述步骤制得的另一个复合微阵列载玻片在2005年3月在UHN下进行，确定其平均信噪比。在这种情况下，使用大鼠基因组的7407克隆组作为探针。为进行比较，同时也进行Ultragaps微阵列载玻片(康宁)。确定信噪比，并且结果列于表4。
表4
 
载玻片说明 所用载玻片数 平均信噪比，Cy5 平均信噪比，Cy3
本发明样品 2 75.8 54.5
UltraGaps样品 2 34.5 34.1
相比现有技术的微阵列，本发明微阵列在两个波长下的信噪比高得多。
也获得本发明和现有技术(Ultragaps)样品的归一化Cy5和Cy3信号强度的散布图。从散布图计算2-倍、1.5倍和1.2倍极限。精确度值列于表5中。
表5
Figure A200780014129D00371
该数据显示本发明微阵列载玻片具有明显更高的精确度水平，这是因为倍极限更小。即，当倍极限更紧密时，本发明制件保持极高的精确度水平，而现有技术制件的精确度显著降低。因此，本发明基材能获得比现有技术基材更有用的数据。而且，本发明基材提供的精确度水平更高，则微阵列数据的可靠性程度越高，这样重复试验就不必那么多。
实施例13
于2005年6月在UHN按照实施例9所述步骤制备复合微阵列载玻片以确定其平均信噪比。在这种情况下，使用人类基因组的19008克隆组作为探针。为进行比较，同时处理Ultragaps微阵列载玻片(康宁)。为了研究信号稳定性，在连续天数内扫描相同的载玻片。确定信噪比并将结果总结于表6。
表6
 
本发明样品 本发明样品 UltraGaps样品 UltraGaps样品
染料类型 Cy5 Cy3 Cy5 Cy3
测试载玻片数 3 3 3 3  
第1天平均信噪比 88.9 54.8 11.5 25.6
第2天平均信噪比 58.3 38.1 1.5 20.6
第3天平均信噪比 53.3 30.7 1.05 20.9
数据证实，本发明微阵列基材能显著地更加有效地在较长时间内保持Cy5信号。

Claims (101)

1.一种基材，它包括微孔微结构、在至少一部分所述微结构上的夹层以及附在该夹层上的功能层；所述功能层具有密度至少为50毫微摩尔/厘米2的功能位点。
2.如权利要求1所述的基材，其特征在于，所述功能位点的密度至少为100毫微摩尔/厘米2。
3.如权利要求1所述的基材，其特征在于，所述功能位点的密度至少为250毫微摩尔/厘米2。
4.如权利要求1所述的基材，其特征在于，所述功能位点的密度至少为500毫微摩尔/厘米2。
5.如权利要求1所述的基材，其特征在于，所述功能位点的密度至少为1000毫微摩尔/厘米2。
6.如权利要求1所述的基材，其特征在于，所述基材还包括2500-150000毫微摩尔/厘米3的功能化位点密度。
7.如权利要求1所述的基材，其特征在于，所述基材包括发泡聚四氟乙烯。
8.如权利要求1所述的基材，其特征在于，所述基材包括尼龙。
9.如权利要求1所述的基材，其特征在于，所述基材包括超高分子量聚乙烯。
10.如权利要求1所述的基材，其特征在于，所述基材包括聚丙烯。
11.如权利要求1所述的基材，其特征在于，所述基材包括玻璃。
12.如权利要求1所述的基材，其特征在于，所述基材包括聚偏1，1-二氟乙烯。
13.如权利要求1所述的基材，其特征在于，所述基材包括聚四氟乙烯。
14.如权利要求1所述的基材，其特征在于，所述夹层包括溶胶-凝胶涂层。
15.如权利要求1所述的基材，其特征在于，所述夹层包括聚乙烯醇。
16.如权利要求1所述的基材，其特征在于，所述功能位点包括羟基。
17.如权利要求1所述的基材，其特征在于，所述功能位点包括胺基。
18.如权利要求1所述的基材，其特征在于，所述功能位点包括羧基。
19.如权利要求1所述的基材，其特征在于，所述功能位点包括醛基。
20.如权利要求1所述的基材，其特征在于，所述功能位点包括环氧基。
21.如权利要求1所述的基材，其特征在于，所述功能层包括有机硅烷。
22.如权利要求1所述的基材，其特征在于，所述基材包括发泡聚四氟乙烯，所述夹层包括溶胶-凝胶涂层，所述功能层包括有机硅烷。
23.如权利要求1所述的基材，其特征在于，所述基材还包括结合到功能位点上的生物分子。
24.如权利要求23所述的基材，其特征在于，所述生物分子包括核酸。
25.如权利要求23所述的基材，其特征在于，所述生物分子包括蛋白质。
26.如权利要求23所述的基材，其特征在于，所述生物分子包括肽。
27.如权利要求23所述的基材，其特征在于，所述生物分子包括寡核苷酸。
28.如权利要求23所述的基材，其特征在于，所述生物分子包括抗体。
29.如权利要求23所述的基材，其特征在于，所述生物分子包括细胞。
30.如权利要求23所述的基材，其特征在于，所述生物分子包括酶。
31.如权利要求23所述的基材，其特征在于，所述生物分子包括病原体。
32.如权利要求1所述的基材，它用作微阵列的部件。
33.如权利要求1所述的基材，它用作活性过滤器的部件。
34.如权利要求1所述的基材，它用作印迹表面的部件。
35.如权利要求1所述的基材，它用作诊断装置的部件。
36.一种制造功能化制件的方法，它包括以下步骤：
(1)提供具有微结构的微孔基材，(2)将夹层沉积在所述微结构上，(3)将功能层附在所述夹层上，使所述制件具有至少50毫微摩尔/厘米2的功能位点密度。
37.如权利要求36所述的方法，其特征在于，还包括2500-150000毫微摩尔/厘米3的功能位点密度。
38.一种制件，它包括邻近含多孔微结构的聚四氟乙烯基材的支撑层、在至少一部分所述微结构上的夹层、和附在该夹层上的功能层；所述功能层具有密度至少为50毫微摩尔/厘米2的功能位点。
39.如权利要求38所述的制件，其特征在于，所述基材包括发泡聚四氟乙烯。
40.如权利要求39所述的制件，其特征在于，所述发泡聚四氟乙烯的原纤长度为0.5-5微米。
41.如权利要求39所述的制件，其特征在于，所述发泡聚四氟乙烯的原纤长度为0.5-3微米。
42.如权利要求39所述的制件，其特征在于，所述发泡聚四氟乙烯的原纤长度为0.5-2微米。
43.如权利要求38所述的制件，其特征在于，所述聚四氟乙烯基材的厚度小于约250微米。
44.如权利要求38所述的制件，其特征在于，所述聚四氟乙烯基材的厚度小于约125微米。
45.如权利要求38所述的制件，其特征在于，所述聚四氟乙烯基材的厚度小于约75微米。
46.如权利要求38所述的制件，其特征在于，所述功能位点的密度至少为100毫微摩尔/厘米2。
47.如权利要求38所述的制件，其特征在于，所述功能位点的密度至少为200毫微摩尔/厘米2。
48.如权利要求38所述的制件，其特征在于，所述功能位点的密度至少为250毫微摩尔/厘米2。
49.如权利要求38所述的制件，其特征在于，所述功能位点包括胺基。
50.如权利要求38所述的制件，其特征在于，所述功能位点包括羟基。
51.如权利要求38所述的制件，其特征在于，所述功能位点包括羧基。
52.如权利要求38所述的制件，其特征在于，所述功能位点包括醛基。
53.如权利要求38所述的制件，其特征在于，所述功能位点包括环氧基。
54.如权利要求38所述的制件，其特征在于，所述功能位点包括硫醇基。
55.如权利要求38所述的制件，其特征在于，所述功能位点包括酸酐基。
56.如权利要求38所述的制件，其特征在于，所述功能位点包括丙烯酸酯基。
57.如权利要求38所述的制件，其特征在于，所述功能位点包括甲基丙烯酸酯基。
58.如权利要求38所述的制件，其特征在于，所述功能位点包括酯基。
59.如权利要求38所述的制件，其特征在于，所述功能位点包括叠氮基。
60.如权利要求38所述的制件，其特征在于，所述功能位点包括磺酸酯基。
61.如权利要求38所述的制件，其特征在于，所述功能位点包括膦酸酯基。
62.如权利要求38所述的制件，其特征在于，所述聚四氟乙烯基材通过粘合剂附到所述支撑层上。
63.如权利要求38所述的制件，其特征在于，所述聚四氟乙烯基材通过热固性粘合剂附到所述支撑层上。
64.如权利要求38所述的制件，其特征在于，所述聚四氟乙烯基材通过热塑性粘合剂附到所述支撑层上。
65.如权利要求38所述的制件，其特征在于，所述聚四氟乙烯基材通过压敏粘合剂附到所述支撑层上。
66.如权利要求38所述的制件，其特征在于，通过仅置于所述基材或支撑层的一部分上的粘合剂将所述聚四氟乙烯基材附到所述支撑层上。
67.如权利要求38所述的制件，其特征在于，所述支撑层包括玻璃。
68.如权利要求38所述的制件，其特征在于，所述支撑层包括石英。
69.如权利要求38所述的制件，其特征在于，所述支撑层包括不锈钢。
70.如权利要求38所述的制件，其特征在于，所述支撑层包括塑料。
71.如权利要求38所述的制件，其特征在于，所述制件是微阵列基材。
72.如权利要求71所述的制件，其特征在于，所述制件还包括在532微米波长下自发荧光水平小于约1000RFU。
73.如权利要求71所述的制件，其特征在于，所述制件还包括在532微米波长下自发荧光水平小于约1000RFU，且功能位点密度大于50毫微摩尔/厘米2。
74.如权利要求71所述的制件，其特征在于，所述制件还包括在635微米波长下自发荧光水平小于约100RFU。
75.如权利要求71所述的制件，其特征在于，所述制件还包括在635微米波长下自发荧光水平小于约100RFU，且功能位点密度大于50毫微摩尔/厘米2。
76.如权利要求71所述的制件，其特征在于，所述制件还包括对Cy5染料的平均信噪比大于130。
77.如权利要求71所述的制件，其特征在于，所述制件还包括对Cy5染料的平均信噪比大于150。
78.如权利要求71所述的制件，其特征在于，所述制件还包括对Cy3染料的平均信噪比大于90。
79.如权利要求71所述的制件，其特征在于，所述制件还包括对Cy3染料的平均信噪比大于110。
80.如权利要求71所述的制件，其特征在于，所述制件还包括1.5倍精确水平至少为99％。
81.如权利要求71所述的制件，其特征在于，所述制件还包括1.2倍精确水平至少为76％。
82.如权利要求71所述的制件，其特征在于，所述制件的改进稳定性小于20％。
83.如权利要求71所述的制件，其特征在于，所述制件的改进稳定性小于10％。
84.一种制件，它包括邻近含多孔微结构的聚四氟乙烯基材的支撑层、在至少一部分所述微结构上的夹层、附在该夹层上的功能层，所述功能层具有密度至少为50毫微摩尔/厘米2的功能位点，以及附于所述功能位点的生物分子。
85.如权利要求84所述的制件，其特征在于，所述生物分子是核酸。
86.如权利要求84所述的制件，其特征在于，所述生物分子是蛋白质。
87.如权利要求84所述的制件，其特征在于，所述生物分子是寡核苷酸。
88.如权利要求84所述的制件，其特征在于，所述生物分子是肽。
89.如权利要求84所述的制件，其特征在于，所述生物分子是抗体。
90.如权利要求84所述的制件，其特征在于，所述生物分子是酶。
91.如权利要求84所述的制件，其特征在于，所述生物分子是细胞。
92.一种测量生物分子的方法，所述方法包括：
(a)提供一种支撑层，
(b)任选将支撑层功能化，
(c)将粘合剂施加到所述支撑层的至少一部分上，
(d)通过粘合剂将具有节点和原纤微结构的微孔聚四氟乙烯基材附到所述支撑层上，
(e)将所述微孔聚四氟乙烯基材功能化，形成功能位点，
(f)将生物分子结合到功能位点上，并
(g)检测结合到所述功能层上的生物分子的量。
93.一种制备微阵列基材的方法，所述方法包括：
(a)提供一种支撑层，
(b)任选将支撑层功能化，
(c)将粘合剂施加到所述支撑层的至少一部分上，
(d)通过粘合剂将具有节点和原纤微结构的微孔聚四氟乙烯基材附到所述支撑层上，
(e)将所述微孔聚四氟乙烯基材功能化。
94.一种微阵列基材，它包括在635微米波长下低于100RFU的自发荧光水平，以及大于50毫微摩尔/厘米2的功能位点密度。
95.一种微阵列基材，它包括在532微米波长下低于1000RFU的自发荧光水平，以及大于50毫微摩尔/厘米2的功能位点密度。
96.一种微阵列基材，它包括对Cy5染料的信噪比大于130。
97.如权利要求96所述的微阵列基材，其特征在于，对Cy5染料的信噪比大于150。
98.一种微阵列基材，它包括对Cy3染料的信噪比大于90。
99.如权利要求98所述的微阵列基材，其特征在于，对Cy3染料的信噪比大于110。
100.一种微阵列基材，它包括1.5倍精确水平至少为99％。
一种微阵列基材，它包括1.2倍精确水平至少为76％。
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