CN101431996A

CN101431996A - 蛋白质异戊二烯基转移酶的抑制剂

Info

Publication number: CN101431996A
Application number: CNA2007800144909A
Authority: CN
Inventors: 玉野井冬彦; 权五铉; 渡边胜; 汉娜·斐济
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2006-03-22
Filing date: 2007-03-22
Publication date: 2009-05-13
Also published as: JP2009530392A; US8093274B2; AU2007229457A1; CA2647038A1; WO2007111948A3; US20100063114A1; EP2007383A2; EP2007383A4; WO2007111948A2

Abstract

本发明涉及新的化合物。这些化合物可用于抑制GGT酶I的活性。所述化合物也可用作抗癌治疗剂，包括其作为治疗癌症的方法、测试方法和试剂盒的一部分。

Description

蛋白质异戊二烯基转移酶的抑制剂

本发明的实施方案是在由NIH提供基金号为CA32737的政府支持下做出的。政府可能拥有本发明的某些权利。

背景技术

某些蛋白质异戊二烯基转移酶涉及癌症过程。有两种这样的异戊二烯基转移酶—蛋白质法呢基转移酶(FT酶)和蛋白质香叶基香叶基转移酶(GGT酶I)被认为是结构上相似的酶。参见Protein Lipidation(2001)The Enzymes vol.21.(eds.Tamanoi，F.and Sigman D.S.)Academic Press。FT酶由两个亚基α和β组成。其结构仅由α螺旋组成，所述α亚基缠绕形成β-β桶状结构的β亚基。GGT酶I也是一种含有α亚基的异二聚体，FT酶也含有所述α亚基。而且，GGT酶I的β亚基与FT酶的β亚基非常相似。

FT酶催化焦磷酸法呢酯(胆固醇生物合成的中间体)的C15法呢基向蛋白质(比如Ras，Rheb，核纤层蛋白，CENP-E、F和蛋白质酪氨酸磷酸酯酶pRLl-3)的转移。参见Tamanoi，F.，Gau，C.L.，Edamatsu，H.，Jiang，C.and Kato-Stankiewicz，J.(2001)Protein farnesylation inmammalian cells，Cell Mol.Life Sci.58，1-14。这些蛋白质的末端为可被FT酶识别的CaaX基序。

GGT酶I催化焦磷酸香叶基香叶酯的C20香叶基香叶基向具有CaaL基序的蛋白质末端的转移。香叶基香叶基化的蛋白质包括Rho、Rac、Cdc42以及异三聚体G蛋白的γ亚基。

在过去十年中已经提出了FT酶和GGT酶I对于癌症的重要性。参见Tamanoi，F.，Gau，C.L.，Edamatsu，H.，Jiang，C.andKato-Stankiewicz，J.(2001)Protein farnesylation in mammalian cells，CellMol.Life Sci.58，1-14；Carrico，D.，Blaskovich，M.A.，Bucher，C.J.，Sebti，S.M.，Hamilton，A.D.(2005)Design，synthesis，and evaluation ofpotent and selective benzoyleneurea-based inhibitors of proteingeranylgeranyltransferase-I，Bioorg.Med.Chem.13，677-688；Peterson，Y.K.，Kelly，P.，Weinbaum，C.A.，Casey，P.J.(2006)A Novel ProteinGeranylgeranyltransferase-I Inhibitor with High Potency，Selectivityand Cellular Activity，J.Biol.Chem.。

已经开发了大量的FT酶的小分子抑制剂，其中一些抑制剂目前作为抗癌治疗剂处于临床试验中。参见O’Regan，R.M.，Khuri，F.R.(2004)Farnesyl transferase inhibitors：the next targeted therapies for breastcancer？Endocr.Relat.Cancer 11，191-205；ClinicalTrials.gov：www.clinicaltrials.gov。法呢基转移酶抑制剂(FTI)表现出了对白血病、多发性骨髓瘤、恶性胶质瘤和晚期乳腺癌的临床活性。Ras蛋白被法呢基化，Ras蛋白的法呢基化和膜结合对于其转化细胞的能力来说是至关重要的。利用由活化的H-ras驱动的小鼠模型系统进行的临床前研究表明了FTI抑制肿瘤生长的显著能力。然而，后来的研究证实了FTI不能抑制K-ras4B和N-ras的异戊二烯化，因为这些蛋白质在FTI存在下可被香叶基香叶基转移酶I替代性修饰。因此，推测FTI的作用是由于对其它法呢基化的蛋白质(比如Rheb、CENP-E、F、RhoB)的抑制。

与FTI相比，I型香叶基香叶基转移酶的抑制剂(GGTI)的开发已落在了后面。仅确定了少数化合物，并且这些化合物中的多数都源自CaaL肽。参见(a)Farnesyltransferase inhibitors in cancer therapy(eds.Sebti，S.M.and Hamilton，A.D.)Humana Press.(b)Oualid，F.E.，vanden Elst，H.，Leroy，I.M.，Pieterman，E.，Cohen，L.H.，Burm，B.E.A.，Overkleeft，H.S.，van der Marel，G.A.，Overhand，M.(2005)ACombinatorial Approach toward the Generation of AmbiphilicPeptide-Based Inhibitors of Protein：Geranylgeranyl Transferase-1，J.Comb.Chem.7，703-713.(c)Carrico，D.，Blaskovich，M.A.，Bucher，C.J.，Sebti，S.M.，Hamilton，A.D.(2005)Design，synthesis，and evaluation ofpotent and selective benzoyleneurea-based inhibitors of proteingeranylgeranyltransferase-I，Bioorg.Med.Chem.13，677-688.(d)Peterson，Y.K.，Kelly，P.，Weinbaum，C.A.，Casey，P.J.(2006)A NovelProtein Geranylgeranyltransferase-I Inhibitor with High Potency，Selectivity and Cellular Activity，J.Biol.Chem.。

化学基因组学旨在以系统性方式鉴定医学相关靶点的小分子抑制剂。虽然在人体内存在着超过100,000种蛋白质，并且大约10％的这些蛋白质涉及人的疾病，但仅有500种已作为药物靶点使用过。因此，存在大量的新靶点，鉴定这些未知靶点的小分子抑制剂极其重要。为使鉴定对抗这些靶点的小分子化合物的机会最大化，需要多种具有多样性结构基序的库。这是多样性导向合成(DOS)的目标。与旨在产生源自一个骨架的化合物库的组合化学相反，DOS的目标在于产生一批具有不同三维结构的化合物。参见(a)Richter，H.；Walk，T.；

，A.；Jung，G.“Polymer Bound 3-Hydroxy-2-methylidenepropionic Acids.A Templatefor Multiple Core Structure Libraries”J.Org.Chem.1999，64，1362-1365.(b)Purandare，A.V.；Gao，A.；Poss，M.A.＂Solid-phasesynthesis of ‘diverse’heterocycles”Tetrahedron Lett.2002，43，3903-3906.(c)Huang，X.；Liu，Z.“Solid-Phase synthesis of4(1H)-Quinolone and Pyrimidine Derivatives Based on a NewScaffold-Polymer-Bound Cyclic Malonic Acid Ester”J.Org.Chem.2002，67，6731-6737.(d)Couladouros E.A.；Strongilos，A.T.“Generation ofLibraries of Pharmacophoric Structures with Increased Complexity andDiversity by Employing Polymorphic Scaffolds”Angew.Chem.，Int.Ed.2002，41，3677-3680.(e)Bertozzi，F.；Gundersen，B.V.；Gustafsson，M.；Olsson，R.“A Combinatorial Scaffold Approach Based upon aMulticomponent Reaction”Org.Lett.2003，5，1551-1554.(f)Taylor，S.J.；Taylor，A.M.；S chreib er，S.L.“Synthetic Strategy toward SkeletalDiversity via Solid-Supported，Otherwise Unstable ReactiveIntermediates”Angew.Chem.，Int.Ed.2004，43，1681-1685。

化合物库的多样性导向合成提供了鉴定对抗医学相关靶点的小分子抑制剂的有利手段。对先导库(pilot library)进行初筛然后利用固相合成进行多样化可在相对短的时间内产生强效的酶抑制剂。

自从20世纪90年代晚期以来，已报道了进行多样性导向合成的很多尝试。一个实例是利用方酸作为多反应活性核心分子以产生由不同核心结构所组成的库。参见Tempest，P.A.and Armstrong，R.W.(1997)Cyclobutenedione derivatives on solid support：Toward multiple corestructure libraries.J.Am.Chem.Soc.1 19，7607-7608。然而，这些实例很少用于实际的库合成中。参见(a)Ding，S.；Gray，N.S.；Wu，X.；Ding，Q.；Schultz，P.G.“ACombinatorial Scaffold Approach towardKinase-Directed Heterocycle Libraries”J.Am.Chem.Soc.2002，124，1594-1596.(b)Kwon，O.；Park，S.B.；Schreiber，S.L.“SkeletalDiversity via a Branched Pathway：Efficient Synthesis of 29，400Discrete，Polycyclic Compounds and Their Arraying into StockSolutions”J.Am.Chem.Soc.2002，124，13402-13404.(c)Burke，M.D.；Berger，E.M.；Schreiber，S.L.“Generating Diverse Skeletons of SmallMolecules Combinatorially”Science 2003，302，613-618。由于反应条件差别很大，不同反应的产率大大不同，这阻碍了对固相中组合库合成方法的调整。

因此，需要鉴定多反应活性核心分子，对其来说，可使用更一致的反应条件并在多样性导向合成中获得更一致的产率。需要新的GGTI化合物。需要特异性对抗K-Ras4B的GGTI。

发明内容

本发明的一些示例性实施方案涉及下式的化合物和所述化合物的盐：

其中J是氢或1～2个选自C₁-C₃烷基和卤素的取代基，

其中G是

其中E选自氢、C₁-C₃烷基和卤素，

其中W选自2～8个碳的环状、直链或支链烷基、未取代的苯基、以及被C₁-C₃烷基、氢或卤素所取代的苯基，

其中X-Y选自

和

其中A选自

和-CO₂M；

其中M选自氢和1～2个碳的烷基，

其中n为0～3个碳；

其中R是氨基酸的任意α取代基；

其中Z是S-U；和

其中U选自2～10个碳的烷基。

本发明的一些示例性实施方案涉及下式的化合物或其盐：

本发明的一些示例性实施方案涉及下式的化合物或其盐：

本发明的一些示例性实施方案涉及下式的化合物：

在本发明的一些示例性实施方案中，所述化合物或其盐抑制蛋白质异戊二烯基转移酶的活性。本发明还涉及包含本发明所述化合物或其盐以及药学上可接受载体或稀释剂的药物组合物。

本发明的一些实施方案涉及包括将足以抑制GGT酶I活性的量的本发明化合物或其盐施用给细胞的方法。

本发明的一些实施方案涉及包括以足以抑制癌细胞生长的量施用本发明化合物或其盐的方法。所述癌症可以是但不限于胰腺癌、白血病、乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、胃癌和前列腺癌。在一些实施方案中，所述癌细胞包括GGT酶I修饰的蛋白。

本发明的一些实施方案涉及包括将本发明的药物组合物以足以抑制蛋白质异戊二烯基转移酶活性的量施用给需要治疗的对象的方法。

本发明的一些实施方案涉及包括测量本发明化合物的GGT酶I抑制活性的方法。

附图说明

图1显示了化合物的先导库。

图2显示了从所述先导库鉴定的GGTI的结构。

图3举例说明了GGTI的作用不受加入去污剂的影响。

图4显示了从所述先导库鉴定的FTI的结构。

图5显示了合成步骤的举例说明。所述步骤可包括(a)联烯酸(allenoic acid)、Mukaiyama试剂、DIPEA或Et₃N、DCM、室温、持续12小时；(b)PPH₃或PBu₃、亚胺、苯或DCM、在室温或60℃下；(c)2.5％TFA/DCM、持续12小时；(d)硫醇、正丁基锂、-25℃、THF。

图6显示了制备构建模块(building block)的化学步骤的举例说明。

图7显示了γ取代的联烯酸构建模块。

图8显示了α取代的联烯酸构建模块。

图9显示了N-磺酰亚胺构建模块。

图10显示了硫醇构建模块。

图11A-H显示了所述库化合物的结构和数目。

图12显示了具有GGTI活性的四氢吡啶结构骨架化合物。

图13显示了具有GGTI活性的哌啶结构骨架化合物。

图14显示了具有GGTI活性的哌啶结构骨架化合物.

图15A和15B显示了两种GGTI化合物对GGT酶I抑制的剂量依赖性。

图16显示了3种化合物对GGT酶抑制作用和FT酶抑制作用的比较。

图17A和17B显示了对K-Ras4B驱动的GGT酶I活性具有优先抑制作用的GGTI化合物。

图18显示了基于SAR分析的特别具有前景的库。

图19-1至19-27显示了各个化合物的测定的Kras抑制活性。

图20A-20C显示了P3-E5和P5-H6对GGT酶I的特异性抑制作用。图20D-F显示了GGT酶I(D)、FT酶(E)和GGT酶II(F)的结构。

图21A-21D举例说明了GGTI与底物蛋白质竞争但不与GGPP竞争，图示于21E中。

图22A和22B显示了在用P3-E5处理的细胞中对香叶基香叶基化的抑制作用。

图23举例说明了GGTI对K562细胞增殖的抑制作用。

图24A举例说明了GGTI诱导K562细胞中的G1细胞周期阻滞，图示于24B中。

图25A和25B举例说明了mP5-H6抑制体内的香叶基香叶基化作用。

图26举例说明了mP5-H6表现出抑制Panc-1细胞和Jurkat细胞增殖的增加的潜力。

图27图示了本发明的示例性GGTI(mP5-H6、P5-H6和P3-E5)以及一些其它的GGTI化合物。

图28举例说明了具有二氢吡咯骨架6的GGTI的结构。

图29A至29C举例说明了具有吡咯烷骨架10的GGTI的结构。

图30A至30E举例说明了化合物库的结构和成员。

图31举例说明了合成GGTI的方法。

图32举例说明了本发明的示例性化合物的化学式。

图33显示了利用化合物22和23在细胞裂解物中对香叶基香叶基化Rheb的Western印迹。

发明详述

下面详细论述本发明的实施方案。在描述实施方案中，为清楚起见，使用特定的术语。然而，本发明并非意在限制在所选的特定术语。相关领域的技术人员公认可使用其它的等同部分以及开发其它方法，而不背离本发明的精神和范围。本文中所引用的所有参考文献均通过参考并入，如同它们各自被并入本文中。

对于GGT酶I也是抗癌药开发的有吸引力的靶点，存在着几个原因。首先，Rho蛋白比如RhoA和Rac在增强转化方面是至关重要的。实际上，GGT酶I的肽模拟物抑制剂已经显现出在抑制癌细胞增殖方面的前景。利用GGT酶I抑制剂，始终一致地观察到细胞周期阻滞在G0/G1期。

其次，一种香叶基香叶基化蛋白质RhoC已被鉴定为与癌转移相关的蛋白质。参见(a)Clark，E.A.，Golub，T.R.，Lander，E.S.and Hynes，R.O.(2000)Genomic analysis of metastasis reveals an essential role forRhoC.Nature 406，466-467.(b)Hakem，A.，Sanchez-Sweatman，You-Ten，A.，Duncan，G.，Wakeham，A.，Khokha，R.and Mak，T.W.(2005)RhoCis dispensable for embryogenesis and tumor initiation but essential formetastasis.Genes & Develop.19，1974-1979。因此，通过抑制RhoC的香叶基香叶基化而阻断其功能提供了一个抑制转移的有效方法。第三，GGTI可用于抑制K-Ras4B的替代性异戊二烯化。

特异性地抑制K-Ras4B的香叶基香叶基化但不抑制RhoA的香叶基香叶基化的GGTI是令人感兴趣的，因为它们可提供一个克服当前可用FTI的一个主要缺点的方法。虽然FTI可有力地抑制FT酶，但它们不能抑制K-Ras，因为这种蛋白经历GGT酶I的修饰。参见Tamanoi，F.，Gau，C.L.，Edamatsu，H.，Jiang，C.and Kato-Stankiewicz，J.(2001)Protein farnesylation in mammalian cells，Cell Mol.Life Sci.58，1-14。还试验了联合利用FTI和GGTI以及能抑制FT酶和GGT酶I二者的双重特异性FTI。参见Lobell，R.B.，Liu，D.，Buser，C.A.，Davide，J.P.，DePuy，E.，Hamilton，K.，Koblan，K.S.，Lee，Y.，Mosser，S.，Motzel，S.L.，Abbruzzese，J.L.，Fuchs，C.S.，Rowinsky，E.K.，Rubin，E.H.，Sharma，S.，Deutsch，P.J.，Mazina，K.E.，Morrison，B.W.，Wildonger，L.，Yao，S.L.and Kohl，N.E.(2002)Preclinical and clinical pharmacodynamicassessment of L-778，123，a dual inhibitor of farnesyl protein transferaseand geranylgeranyl：protein transferase type-I.Mol.Cancer Ther.1，747-758。产生具有抗K-Ras4B特异性的GGTI可抑制K-Ras功能，而不影响其它香叶基香叶基化蛋白质。这样的底物特异性GGTI然后可与FTI联合以抑制所有的H、N、K-Ras蛋白。

化学定义

除非另外说明，在整个以下部分中使用下述化学定义。

本文中使用的术语“烷基”指支链或直链的烃链，优选具有约1至约8个碳的烃链，比如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、2-甲基戊基、戊基、己基、异己基、庚基、4，4-二甲基戊基、辛基、2，2，4-三甲基戊基等。“取代烷基”包括任选地被一个或多个官能团(比如羟基、溴、氟、氯、碘、巯基或硫、氰基、烷硫基、杂环基、芳基、杂芳基、羧基、碳烷酰基(carbalkoyl)、烷基、烯基、硝基、氨基、烷氧基、酰胺基(amido)等)取代的烷基，所述官能团可连接到这样的链上以形成烷基，比如3-氟甲基、3-羟基己基、2-羧基丙基、2-氟乙基、羧甲基、氰基丁基等。“大体积烷基”(“bulky alky”)包括具有4～8个碳的环烷基和直链烷基。

本文中使用的术语“环烷基”单独或作为另一个基团的一部分包括饱和或部分不饱和(含有1个或多个双键)的含有1～3个环的环状烃基，包括含有总共3～20个成环碳的单环烷基、双环烷基和三环烷基，优选含有总共3～10个成环碳，所述环烷基可稠合到1或2个如针对芳基所述的芳香环上，所述环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环癸基和环十二烷基、环己烯基。“取代环烷基”包括任选地被1个或更多个取代基(比如卤素、烷基、烷氧基、羟基、芳基、芳基氧基、芳基烷基、环烷基、烷基酰胺基、烷酰基氨基、氧代、酰基、芳基羰基氨基、氨基、硝基、氰基、硫醇和/或烷硫基和/或在“取代烷基”定义中所包括的任何取代基)取代的环烷基。例如，

等。

除非另外说明，本文中使用的术语“烯基”自身或者作为另一个基团的一部分指在正链(normal chain)上含有2～20个碳、优选2～12个碳、更优选2～8个碳的直链或支链基团，其在所述正链上包含一个或多个双键，比如乙烯基、2-丙烯基、3-丁烯基、2-丁烯基、4-戊烯基、3-戊烯基、2-己烯基、3-己烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、4-庚烯基、3-辛烯基、3-壬烯基、4-癸烯基、3-十一碳烯基、4-十二碳烯基、4，8，12-十四碳三烯基等。“取代的烯基”包括任选地被一个或多个取代基(比如在上述“取代烷基”和“取代环烷基”定义中所包括的取代基)取代的烯基。

本文中使用的术语“炔基”自身或者作为另一个基团的一部分指在正链上含有2～20个碳、优选2～12个碳、更优选2～8个碳的直链或支链基团，其在所述正链上包含一个或多个叁键，比如2-丙炔基、3-丁炔基、2-丁炔基、4-戊炔基、3-戊炔基、2-己炔基、3-己炔基、2-庚炔基、3-庚炔基、4-庚炔基、3-辛炔基、3-壬炔基、4-癸炔基、3-十一碳炔基、4-十二碳炔基等。“取代的炔基”包括任选地被一个或多个取代基(比如在上述“取代烷基”和“取代环烷基”定义中所包括的取代基)取代的炔基。

术语“芳基烷基”、“芳基烯基”和“芳基炔基”单独或作为另一个基团的一部分而使用时指具有芳基取代基的上述烷基、烯基和炔基。芳基烷基的代表性实例包括但不限于苄基、2-苯基乙基、3-苯基丙基、苯乙基、二苯甲基和萘基甲基等。“取代的芳基烷基”包括其中芳基部分任选地被一个或多个取代基(比如在上述“取代烷基”和“取代环烷基”定义中所包括的取代基)取代的芳基烷基基团。

本文中单独或作为另一个基团的一部分而使用的术语“卤素”或“卤代”指氯、溴、氟和碘。

本文中单独或作为另一个基团的一部分而使用的术语“卤代烷基”、“卤代烯基”和“炔基”指被选自氟、氯、溴、氟和碘的一个或多个原子取代的“烷基”、“烯基”和“炔基”。

本文中使用的术语“芳基”或“Ar”单独或作为另一个基团的一部分指在环部分(比如苯基或萘基(包括1-萘基和2-萘基))含有6～10个碳的单环和多环芳香基团，并且其可任选地包含稠合到碳环或杂环(比如芳基、环烷基、杂芳基或环杂烷基环)上的1～3个额外的环。

“取代芳基”包括任选地被一个或多个官能团取代的芳基，所述官能团比如卤素、卤代烷基、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、烯基、三氟甲基、三氟甲氧基、炔基、环烷基-烷基、环杂烷基、环杂烷基烷基、芳基、杂芳基、芳基烷基、芳基氧基、芳基氧基烷基、芳基烷氧基、烷氧基羰基、芳基羰基、芳基烯基、氨基羰基芳基、芳基硫基、芳基亚磺酰基、芳基偶氮基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基杂芳基、杂芳基氧基、羟基、硝基、氰基、氨基、取代氨基(其中所述氨基包含1或2个取代基(其为烷基、芳基或在定义中提到的任何其它芳基化合物))、硫醇、烷基硫基、芳基硫基、杂芳基硫基、芳基硫基烷基、烷氧基芳基硫基、烷基羰基、芳基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、芳基亚磺酰基、芳基亚磺酰基烷基、芳基磺酰基氨基或芳基磺酰氨基羰基和/或本文中所提出的任何烷基取代基。

本文中使用的术语“杂环”表示未取代或取代的稳定的5～10元单环体系，其可以是饱和或不饱和的，并且其由碳原子和选自N、O或S的1～4个杂原子所组成，其中氮和硫杂原子可任选地被氧化，氮杂原子可任选地被季铵化。所述杂环可在导致形成稳定结构的任何杂原子或碳原子处连接。这样的杂环基的实例包括但不限于哌啶基、哌嗪基、氧代哌嗪基、氧代哌啶基、氧代吡咯烷基、氧代氮杂革基、氮杂基、吡咯基、吡咯烷基、呋喃基、噻吩基、吡唑基、吡唑烷基、咪唑基、咪唑啉基、咪唑烷基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、噁唑基、噁唑烷基、异噁唑基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑基、噻唑烷基、异噻唑基、噻二唑基、四氢吡喃基、硫杂吗啉基(thiamorpholinyl)、硫杂吗啉基亚砜、硫杂吗啉基砜以及噁二唑基。本文中使用的术语“杂环芳香的”单独或作为另一个基团的一部分指包含1、2、3或4个杂原子(比如氮、氧或硫)的5或7元芳香环，并且这些环稠合到芳基、环烷基、杂芳基或杂环烷基环(例如苯并噻吩基、吲哚基)上并包括可能的N-氧化物。“取代杂芳基”包括任选地被1～4个取代基(比如在上述“取代烷基”和“取代环烷基”定义中所包括的取代基)取代的杂芳基。杂芳基的实例包括以下的：

等。

I.先导库的构建和筛选

为克服与多样性导向合成相关的问题，开发了利用联烯酸类(allenoates)作为多反应活性核心分子并利用在类似反应条件下(膦催化)与联烯酸酯反应的另一组构建模块(亚胺、醛和马来酰亚胺)的方法。这导致产生了包括二氢吡咯类和四氢吡啶类的多种化合物。

利用联烯酸酯作为多反应活性核心分子构建了先导库。从该先导库中筛选抑制蛋白质法呢基转移酶(FT酶)的化合物(即法呢基转移酶抑制剂(FTI))和抑制I型蛋白质香叶基香叶基转移酶(GGT酶I)的化合物(即I型香叶基香叶基转移酶抑制剂(GGTI))。因为这些酶催化对信号传递蛋白(比如Ras、Rheb和Rho)的修饰，所以小分子抑制剂可以是抗癌治疗剂。合成了4,314种化合物并从中筛选具有提高抑制潜能的化合物。如以下进一步所述，对这些化合物的结构活性关系研究暗示了某些取代模式对最初选中结构(hit)的所述骨架环结构的芳香性取代的重要性。

基于联烯酸类化学构建先导库

通过使联烯酸类与亚胺、醛和马来酰亚胺在膦催化条件下反应来构建所述先导库，从而制得一批化合物，包括二氢吡咯类、四氢吡啶类、双环琥珀酰亚胺类、亚二噁烷类(dioxanylidenes)和二氢呋喃类。在图1中举例显示了为此先导库而制备的171种化合物。

I型蛋白质香叶基香叶基转移酶的新型抑制剂的鉴定

从该先导库中筛选I型蛋白质香叶基香叶基转移酶的抑制剂。通过利用滤膜结合(filter binding)进行蛋白质异戊二烯基转移酶试验。将两种不同的底物RhoA和K-Ras4B用于本试验中。RhoA的末端是CaaL基序并且只是GGT酶I的底物，而K-Ras4B的末端则是CaaX基序并且被GGT酶I和FT酶二者所修饰。由邻近所述CaaX基序的一段赖氨酸组成的多碱性结构域的存在使得所述CaaX基序能够被GGT酶I识别。因此，RhoA和K-Ras4B是该酶的两种极其不同的底物，感兴趣的是鉴别对由一种底物优于另一种底物驱动的反应表现出优先抑制作用的小分子抑制剂。

对171种化合物的先导库的筛选导致鉴定了三组示于图2中的化合物。在该试验中，使用100μM的固定浓度，将结果针对RhoA抑制作用(纵轴)和K-Ras4B抑制作用(横轴)作图。当将RhoA和K-Ras4B用作底物时，一组包含P2-D5、P2-D7、P2-D8、P2-D9和P2-D10的化合物等同地抑制GGT酶I。它们是2，6-二芳基-N-甲苯磺酰基-1，2，5，6-四氢吡啶-3-羧酸，例外是P2-D5在C2缺少芳基取代基。当将K-Ras4B用作底物时，第二组化合物P2-F10、P2-F12、P2-G3和P2-G6表现出稍微更强的抑制作用。特别是，当将K-Ras4B用作底物时，P2-F10表现出了明显的GGT酶I抑制作用；而当将RhoA用作底物时，则几乎观察不到抑制作用。需要指出，已知的GGTI化合物GGTI-298和GGTI-2166抑制RhoA驱动的GGT酶I活性要比抑制K-Ras4B驱动的GGT酶I活性稍微强些(图17)。该组化合物具有5-烷基-2-芳基-N-甲苯磺酰基-2，5-二氢吡咯-3-羧酸的结构，其与前述的四氢吡啶模块完全不同。

还鉴别了与上述两组不同的另一种化合物。当将RhoA用作底物时，该化合物(标记为P1-F10)抑制GGT酶-I；但当将K-Ras4B用作底物时，则几乎没有发现抑制作用。在同样的浓度下，所鉴定的GGTI并不抑制FT酶。

据报道，一些化合物在高浓度下形成聚集体，并且这些聚集体抑制多种酶反应。参见(a)McGovern，S.L.，Caselli，E.，Grigorieff，N.andShoichet，B.K.(2003)A common mechanism underlying promiscuousinhibitors from virtual and high-throughput screening.J.Med.Chem.45，1712-1722.(b)McGovern，S.L.，Helfand，B.T.，Feng，B.andShoichet，B.K.(2003)A specific mechanism of nonspecific inhibition.J.Med.Chem.46，4265-4272。为排除这种可能性，可加入能防止形成这些聚集体的去污剂。如图3中可见，所观察到的对GGT酶I的抑制作用不受存在去污剂(0.01％TritonX-100)的影响。同样，所观察到的所有抑制作用在去污剂的存在下都可再现。

蛋白质法呢基转移酶的新型抑制剂的鉴定

为进一步表征所述先导库，鉴定了蛋白质法呢基转移酶的抑制剂。这通过利用作为底物蛋白的K-Ras4B、氚化焦磷酸法呢基酯([³H]FPP)和蛋白质法呢基转移酶而实现。参见Finegold，A.A.，Johnson，D.I.，Farnsworth，C.C，Gelb，M.H.，Judd，S.R.，Glomset，J.A.and Tamanoi，F.(1991)Protein geranylgeranyltransferase of Saccharomyces cerevisiaeis specific for Cys-Xaa-Xaa-Leu motif and requires the CDC43 geneproduct but not the DPRI gene product.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，4448-4452。此筛选导致鉴定了6种图4中所示的选中化合物。有趣地是，化合物P1-E11、P1-F1和P1-F2包含与上述作为GGTI化合物而鉴定的那些化合物截然不同的共同结构。另一方面，化合物P1-F11、P2-B7和P2-E9的结构与GGTI相似。所述FTI P1-F11与所述GGTI P1-F10相似，而所述FTI P2-B7与所述GGTI P2-C10相似。所述FTI P2-E9与所述GGTI P2-G3相似。某些GGTI和FTI化合物的相似性可表明这两类密切相关酶之间的共同结构特征。如前所述，FT酶和GGT酶具有类似的三维结构并具有共同的α亚基。另一方面，FT酶特异性抑制剂可识别该两种酶间不同的一个或多个区域。本文中鉴定的FTI在抑制FT酶的浓度下表现出对GGT酶I更弱的抑制作用。

使所述化合物库进一步多样化以及对改进的GGTI化合物的鉴定

利用本文中所述多样性导向库的一个优点是可迅速合成与先导化合物相关的大量化合物。固相上的分开-合并合成(Split-and-poolsynthesis)是产生大量空间分离的化合物的最迅速和最有效的方法之一。参见(a)Furka，A.；Sebestyén，F.；Asgedom，M.；Dibó(1988)，inHighlights of Modern Biochemistry，Proceedings of the 14th InternationalCongress of Biochemistry，Prague，Czechoslovakia(VSP，Utrecht，Netherlands)，13，47.(b)Furka，A.；Sebestyén，F.；Asgedom，M.；Dibó(1991)，Int.J.Pept.Protein Res.37，487.(c)Houghton，R.A.；Pinilla，C.；Blondelle，S.E.；Appel，J.R.；Dooley，C.T.；Cuervo，J.H.(1991)“Generation and use of synthetic peptide combinatorial libraries forbasic research and drug discovery”Nature 354，84-86.(d)Lam，K.S.；Salmon，S.E.；Hersh，E.M.；Hruby，V.J.；Kazmierski，W.M.；Knapp，R.J.(1991)“A new type of synthetic peptide library for identifyingligand-binding activity＂Nature 354，82-84.；(e)Obrecht，D.；Villalgordo，J.M.(1998)Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis ofSmall-Molecular-Weight Compound Libraries，Elsevier Science Ltd，Oxford。IRORI NanoKan系统或SynPhaseTM笼形树脂(lantern)的使用降低了对化学编码的需要，与使用珠粒相比，为给定化合物提供了更多的材料。有关这些系统的更多信息可见于www.discoverypartners.com/products/irori_tech_nanokan.html或www.synphase.com/combichem/lanterns.html。决定使用SynPhase笼形树脂，但本领域技术人员将会理解，本文中所描述的本发明并非限于使用SynPhase笼形树脂(可购自Mimotopes Pty Ltd.，Victoria，Australia)。

所述SynPhase笼形树脂由被接枝到刚性且化学惰性的基础聚合物(其外形为圆柱形)上的可动性表面聚合物(比如聚苯乙烯)组成。可以得到载量15μmol、35μmol和75μmol的三种不同规格的所述SynPhase笼形树脂。考虑到一般试验需要1nmol的小有机分子，因此15～75μmol的化合物提供了足够用于多次试验的大量的化学品。在接枝的可动相下的笼形树脂刚性聚合物载体使得不必称重并且比树脂更容易处理。

图5中显示了对4,314种化合物进行此多样化反应的总体反应次序。对聚合物载体上合成路线的验证从形成树脂键合的联烯酸酯2和3开始。在最佳加载程序中，通过利用Mukaiyama试剂使联烯酸(allenoicacid)与用王树脂(Wang resin)1接枝的SynPhase-PS笼形树脂的苄醇偶联。参见(a)Mukaiyama，T.；Usui，M.；Shimada，E.；Saigo，K.(1975)“A Convenient Method for the Synthesis of Carboxylic Esters”Chem.Lett.1045-1048.(b)Mukaiyama，T.；Toda，H.；Kobayashi，S.(1976)“Betaine as an Effective Acid Captor：A Convenient Method for theSynthesis of Carboxylic Esters”Chem.Lett.13-14.(c)Saigo，K.；Usui，M.；Kikuchi，K.；Shimada，E.；Mukaiyama，T.(1977)“New Method forthe Preparation of Carboxylix Esters”Bull.Chem.Soc.Jpn.50，1863-1866。在以聚合物为载体的联烯酸酯2和3与N-磺酰基芳基亚胺间的膦催化环化顺利进行，提供了与聚合物键合的二氢吡咯4和四氢吡啶5。将杂环4和5从所述树脂上切除以在快速柱色谱(FCC)后提供酸6和7(产率91～92％)(基于15M/笼形树脂的理论载量)。利用正丁基锂作为碱，将硫醇Michael加成到4和5而得到8和9，所述8和9当经历三氟乙酸(TFA)介导的切割时得到10和11。参见Miyata，O.；Shinada，T.；Ninomiya，I.；Naito，T.；Date，T.；Okamura，K.；Inagaki，S.(1991)“Stereospecific Nucleophilic Addition Reactions to Olefins.Addition of Thiols to α，β-Unsaturated Carboxylic Acid Derivatives”J.Org.Chem.56，6556-6564。通过X射线晶体分析证实了10和11的相对立体化学。对5进行Tebbe反应得到与固相键合的烯醇醚12，其能在盐酸(HCl)的作用下从所述聚合物载体上断裂下来而以92％的总产率得到13。参见(a)Ball，C.P.；Barrett，A.G.M.；Commercon，A.；Compére，D.；Kuhn，C.；Roberts，R.S.；Smith，M.L.；Venier，O.(1998)“Chameleon Catches in Combinatorial Chemistry：Tebbe Olefination ofPolymer Supported Esters and the Synthesis of Amines，Cyclohexanones，Enones，Methyl Ketones and Thiazoles”Chem.Commun.2019-2020.(b)Barrett，A.G.M.；Procopiou，p.A.；Voigtmann，U.(2001)“Solid-Phase Synthesis of Isoxazoles Using Vinyl Ethers asChamelon Catches”Org.Lett.3，3165-3168.；(d)Mori，A.；Yamamoto，H.(1985)“Resolution of Ketones via Chiral Acetals.Kinetic Approach”J.Org.Chem.，50，5444-5446.；(e)Lienhard，G.E.；Wang，T.(1969)“Onthe Mechanism of Acid-Catalyzed Enolization of Ketones”J.Am.ChemSoc.91，1146-1153。

在固相载体上证实了合成GGTI选中结构(hit)类似物的反应路线(参见图5中的6和7)之后，我们购买/制备了构建模块。制备构建模块所涉及的化学反应如下(图6)。γ取代的联烯酸17来自相应的γ取代的联烯酸酯16，所述16进而通过正膦14与酰氯15之间的反应而得到。参见Lang，R.W.；Hansen，H.-J.(1990)“of-Allenic Esters fromα-Phosphoranylidene Esters and Acid Chlorides：Ethyl 2，3-Pentadienoate”Org.Synth.Coll.Vol.7，232-235。当用酰卤18处理正膦14时，得到卤化鏻19。当用三乙胺(2当量)和乙酰氯(1当量)处理时，卤化鏻19被转化为α取代的联烯酸酯20。参见Scholz，D.；Weber-Roth，S.；Macoratti，E.；Francotte，E.(1999)“ExpedientSynthesis of α-substituted α，β-unsaturated γ-amino acids(dipeptidememetics)；Wittig reaction of α-amino aldehydes with α-substitutedalkoxycarbonylphosphoranes”Synth.Commun.29，1143-1155。

通过酯20的皂化而制得α取代的联烯酸21。利用从合适的磺酰胺22、醛23和催化酸的甲苯回流混合物中共沸除去水而形成N-磺酰基亚胺24。参见(a)McKay，W.R.；Proctor，G.R.(1981)“Removal oftoluene-p-sulfonyl groups from sulfonamides.Part 4.Synthesis ofphenylglyoxal imine monomers”J.Chem.Soc.Perkin Trans.1，2435-2442.(b)Jennings，W.B.；Lovely，C.J.(1991)“The titaniumtetrachloride induced synthesis of N-phosphinoylimines andN-sulfonylimines directly from aromatic aldehydes”Tetrahedron，47，5561-5568.(c)Love，B.E.；Raje，P.S.；Williams II，T.C.(1994)“Preparation of N-Tosylaldimines”Synlett 493-494.(d)Bilodeau，M.T.；Cunningham，A.M.(1998)“Solid-Supported Synthesis of Imidazoles：Astrategy for Direct Resin-Attachment to the Imidazole Core”J.Org.Chem.63，2800-2801.(e)Chemla，F.；Hebbe，V.；Normant，J.-F.(2000)“An Easy Synthesis of Aliphatic and Aromatic N-Sulfonyl Aldimines”Synthesis，75-77。

根据图6中举例说明所合成的构建模块示于图7(γ取代的联烯酸17)、图8(α取代的联烯酸21)和图9(N-磺酰基亚胺24)中。为库的合成而购买的其它构建模块硫醇示于图10中。

一旦合成了所述构建模块，就对它们进行试验以确定它们是否将被纳入GGTI目标库的合成中。选择构建模块以便仅是那些为最终粗产品提供高纯度(通过1H NMR和LC/MS分析)的才会被用于所述库的合成中。为合成所述库而选择的构建模块和所得到化合物的数目示于图11中。分别标示了需要不同系列反应条件的骨架(scaffold)。

为合成2-芳基-N-磺酰基-2，5-二氢吡咯-3-羧酸(6，其中R1＝H)，30种亚胺(C01-C03、C06、C09-C16、C18、C19、C23、C24、C26-C31、C33、C36、C40-C44、C46)提供了令人满意的结果，得到了30种2-芳基-N-磺酰基-2，5-二氢吡咯-3-羧酸(图11A)。

为合成5-烷基-2-芳基-N-磺酰基-2，5-二氢吡咯-3-羧酸6，选择了10种联烯酸(A02-A11)和21种亚胺(C01-C03、C06、C09-C14、C16、C20、C23、C24、C26、C27、C29、C30、C33、C40、C41)以提供210(10×21)种5-烷基-2-芳基-N-磺酰基-2，5-二氢吡咯-3-羧酸(图11B)。

为合成5-烷基-2-芳基-4-巯基-N-磺酰基-2，5-二氢吡咯-3-羧酸10，选择了7种联烯酸(A05-A11)、25种亚胺(C01-C06、C09-C14、C16、C20、C21、C23、C24、C26、C27、C29、C30、C33、C35、C40、C41)和19种硫醇(E01、E02、E04、E06、E07、E16-E25、E28-E30、E32)以得到3,325(7×25×19)种5-烷基-2-芳基-4-巯基-N-磺酰基-2，5-二氢吡咯-3-羧酸(图11C)。

为合成6-芳基-N-磺酰基-1，2，5，6-四氢吡啶-3-羧酸7(R3＝H)，选择了26种亚胺(C01-C06、C10、C12、C15、C16、C20、C21、C24、C25、C30、C33-C43)，得到26种6-芳基-N-磺酰基-1，2，5，6-四氢吡啶-3-羧酸(图11D)。

为合成3-酰基-6-芳基-N-磺酰基-1，2，5，6-四氢吡啶13，25种亚胺(C01-C06、C10-C12、C15、C16、C20、C21、C24、C25、C30、C33-C43、C46)提供了令人满意的结果，得到25种3-酰基-6-芳基-N-磺酰基-1，2，5，6-四氢吡啶(图11E)。

为合成2，6-二芳基-N-磺酰基-1，2，5，6-四氢吡啶-3-羧酸7，选择了11种取代的联烯酸(B02-B12)和31种亚胺(C01-C06、C09-C13、C15、C19-C21、C23、C24、C26-C28、C30、C33、C35、C37-C43、C46)，得到341(11×31)种2，6-二芳基-N-磺酰基-1，2，5，6-四氢吡啶-3-羧酸(图11F)。

为合成6-芳基-4-巯基-N-磺酰基-哌啶-3-羧酸11，选择了21种亚胺(C01-C06、C10-C12、C15、C20、C25、C30、C35、C37-C41、C43、C46)和17种硫醇(E01、E02、E04-E07、E09、E15、E16、E18、E21-E25、E28、E30)以提供357(21×17)种6-芳基-4-巯基-N-磺酰基-哌啶-3-羧酸(图11G)。因此，所述库化合物的总数为4,314种化合物。

下一步骤是杂环库的分开-合并合成(示于图5中)。目标库合成的第一个分开步骤是将23种不同的联烯酸偶联到王树脂的苄醇上。在第二个分开步骤中，在亲核性膦催化条件下使键合了树脂的联烯酸酯(MCM)与亚胺反应以得到两类不同的杂环4和5。最后的分开步骤包括利用硫醇在立体选择性Michael加成中使用α，β-不饱和酯部分(MCF)以进一步增加结构多样性，得到另外两种骨架8和9。将240种具有与树脂键合的杂环4的笼形树脂、357种具有与树脂键合的杂环5的笼形树脂、3,325种具有与树脂键合的杂环8的笼形树脂、以及357种具有与树脂键合的杂环9的笼形树脂插入单独的管中并在二氯甲烷中用2.5％TFA切割，以提供相应的羧酸。将25种具有与聚合物键合的杂环5的笼形树脂用Tebbe试剂处理以得到烯醇醚12，用0.1N的在丙酮中的HCl将所述烯醇醚12切割以得到25种烯酮13。利用与树脂键合的联烯酸酯以分开-混合方式辅助了杂化化合物的固相组合合成。SynPhaseTM笼形树脂的使用降低了对化学编码的需要并为给定化合物提供了更多的材料。参见(a)Gerritz，S.W.；Norman，M.H.；Barger，L.A.；Berman，J.；Bigham，E.C；Bishop，M.J.；Drewry，D.H.；Garrison，D.T.；Heyer，D.；Hodson，S.J.；Kakel，J.A.；Linn，J.A.；Marron，B.E.；Nanthakumar，S.S.；Navas，F.J.，III.(2003)“High-ThroughputManual Parallel Synthesis Using SynPhase Crowns and Lanterns”J.Comb.Chem.5，110-117.(b)Feliu，L.；Subra，G.；Martinez，J.；Amblard，M.(2003)“Spiroimidazolidinone Library Derivatives on SynPhaseLanterns”J.Comb.Chem.5，356-361。将15μmol载量的L-系列笼形树脂用于我们的库合成。通过带色的轴(spindle)和齿(cog)给在所述库各个成员合成中使用的构建模块的身份进行编码。

对于手头的4,314种小分子，检测了它们对于K-Ras4B和RhoA而言对抗GGT酶I的抑制活性。对含有四氢吡啶和哌啶骨架的库的所有成员进行了筛选。这些成员对应于7、11和13的749种化合物。在50μM浓度下表现出对GGT酶I活性超过80％抑制作用的GGTI化合物示于图12、13和14中。每个表的第一个格内包含代表性骨架的结构。每个表的第一行和第一列列出了用于制备示于表中的GGTI化合物的构建模块。GGTI结构下面的一对数字是在所述GGTI化合物存在下针对蛋白质K-Ras4B/RhoA的GGT酶I的活性％。数字越小，表明抑制作用就越好。在对于两种蛋白质都低于10％的活性(超过90％抑制)下划了线。在括号中的是对RhoA比K-Ras4B显著更好的抑制作用。

含有10种α取代联烯酸(按出现频率的次序为B06>B05>B07>B04＝B02＝B10>B03＝B08＝B09＝B11)和7种亚胺(C40>C13>C15>C12＝C27>C30＝C24)的2，6-二芳基-N-磺酰基-1，2，5，6-四氢吡啶-3-羧酸7显示了显著的抑制活性(图12)。

对于各个化合物的测定的抑制活性，参见图19-1至19-27。所述“标记”栏提供了针对每个项目(entry)的每种化合物的注解(例如，B01C01T意指由B01和C01以及Tebbe反应所制得的化合物，B01C01E21意指由构建模块B01、C01和E21所制得的化合物)。所述“Kras”栏提供了在存在该项目的化合物下GGT酶I针对蛋白质K-Ras4B的活性％。

GGT酶I的活性％测定如下：制备含有浓度为1mM的在DMSO中的每种化合物的工作溶液。将所述工作溶液加入到GGT酶I反应混合物中使得所述化合物的最终浓度是50μM。通过在GGT酶I存在下将[³H]GGPP与K-Ras4B或RhoA蛋白一起孵育并通过点样到滤纸上检测被引入到所述底物蛋白质中的放射性而测定GGT酶I活性。在用TCA、乙醇和丙酮清洗之后，通过利用闪烁计数器检测滤纸上保留的放射性。将在DMSO存在下的GGT酶I活性的值作为100％，而将在化合物存在下的活性表示为与此100％值相比较的百分活性。图12中的表显示了从367种化合物中选出的24种2，6-二芳基-N-磺酰基-1，2，5，6-四氢吡啶-3-羧酸7。烯酮化合物13都没有活性，表明羧酸部分对于GGTI活性而言是至关重要的。对于6-芳基-4-巯基-N-磺酰基-哌啶-3-羧酸11来说，4-巯基取代基似乎对于赋予GGT酶抑制活性而言是关键的。21种具有4-苯乙基硫基部分(E15)中有16种化合物是有活性的(图13)。4-氯苄基硫基取代基是其次最好的，21种具有4-氯苄基硫基部分的化合物中有12种化合物是有活性的。4-苄基硫基取代基也是良好的；21种具有4-苄基硫基基团的化合物中有7种哌啶类是有活性的。带有较不常见的4-巯基取代基归纳于图14中。17种硫醇中有9种硫醇(E15>E09>E06>E22>E05＝E23＝E21＝E30>E24)显示在GGTI中。21种中有19种亚胺(C15>C12＝C41>C40>C01＝C11>C05＝C10＝C30＝C35＝C37＝C38>C02、C03、C04、C06、C39＝C43)显示在GGTI中。4种亚胺：C15、C12、C41和C40是特别令人感兴趣的，因为它们在超过三种GGTI化合物中显示出来。这对应于从357种化合物中选出47种6-芳基-4-巯基-N-磺酰基-哌啶-3-羧酸。这71种GGTI对RhoA表现出了比K-Ras4B更好的抑制作用；一些化合物对RhoA的抑制活性比对K-Ras4B的强100倍(例如化合物P4-G5＝B01C15E05)。

图15中显示了两种化合物抑制作用的剂量依赖性。对于P3-D9和P3-E5来说，利用RhoA作为底物对GGT酶I抑制作用的IC50值分别为5和7M(P3-D9和P3-E5的结构参见图12)。在相同反应条件下，测定了已知的GGTI：GGTI-298和GGTI-2166的IC50值分别为1.6和0.5M。检测了P3-D9和P3-E5对GGT酶I抑制作用的特异性。从图16中可见，甚至当浓度增加到100μM时，也未观察到这些化合物对FT酶活性的抑制作用。用作对照的FTI化合物(BMS225975)抑制FT酶但不抑制GGT酶I。GGTI-298抑制GGT酶I，而观察到对FT酶的抑制作用很少(P5-H6和GGTI-298的结构参见图17)。

底物特异性GGTI化合物的鉴定

我们的筛选还导致鉴定出了表现出对利用特定底物之GGT酶的优先抑制作用的化合物。图17列出了对于K-Ras4B驱动的GGT酶I活性比RhoA驱动的GGT酶I活性具有可再现的更强抑制作用的GGTI化合物。例如，新化合物P4-F1抑制K-Ras4B驱动的GGT酶I活性，但不抑制RhoA驱动的GGT酶I活性。

对于图12中结构的分析提示，构建由B02至B07和新亚胺C47至C49所组成的2，6-二芳基-N-磺酰基-1，2，5，6-四氢吡啶-3-羧酸7的库以便进一步提高GGTI活性(图18)。对图13和14中GGTI化合物的研读表明，由B01、新亚胺C47至C51和硫醇(E15>E09>E06>>E22>E05)所构建的6-芳基-4-巯基-N-磺酰基-哌啶-3-羧酸11的库将是进一步提高GGTI活性的下一步。

II.GGTI化合物

通过对所述库的筛选和本文中所描述的其它方法，鉴定了可抑制GGT酶I的众多化合物。这些化合物具有下式：

其中J是氢或选自C₁～C₃烷基和卤素中的1～2个取代基，

其中G是

其中E选自氢、C₁～C₃烷基和卤素，

其中W选自2～8个碳的环状、直链或支链烷基，未取代的苯基、以及被C₁～C₃烷基、氢或卤素取代的苯基，

其中X-Y选自

和

其中A选自

和-CO₂M；

其中M选自氢和1～2个碳的烷基，

其中n是0～3个碳；

其中R是氨基酸的任意α取代基；

其中Z是S-U；和

其中U选自2～10个碳的烷基。

在一些实施方案中，这些化合物可以基于骨架6、7和10。这些结构骨架具有以下结构：

在骨架6上构建的化合物可包括R1、P和R3处的取代基。R1可选自2～6个碳的直链或支链烷基，未取代的苯基，以及被C₁～C₃烷基、氢或卤素取代的苯基。在一些实施方案中，R1是叔丁基、环戊基甲基、或其它大体积烷基或环烷基。在本文中R1还以W表示。

在一些实施方案中，P是保护基。虽然在P处可使用多种保护基，但以下保护基是优选的：

在本文中P还以G表示。在一些实施方案中，E选自氢、C₁～C₃烷基和卤素。在一些实施方案中，E是甲基。

R3可以是未取代的苯基或取代的苯环。所述取代基(也以J表示)可以在所述苯环的任意位置上。在一些实施方案中，J是氢或选自C₁～C₃烷基和卤素中的1～2个取代基。

可由骨架6构建的化合物的一个实施方案是化合物UC-22(也称为P5-H6)。该化合物具有以下化学结构：

基于骨架6的抑制GGT酶I活性的一些示例性化合物包括表1中列出的那些：

表1：基于骨架6的示例性化合物

在图2中列出了可基于骨架6的另一些目标化合物。这些化合物包括P2-F10、P2-F12、P2-G3和P2-G6。

在一些实施方案中，抑制GGT酶I的化合物可基于骨架7。所述基于骨架7的化合物可包括在R3、P和R2处的取代基。R3可选自2～6个碳的直链或支链烷基，未取代的苯基，以及被C₁～C₃烷基、氢或卤素取代的苯基。在本文中R3还以W表示。

在一些实施方案中，P是如上所述的保护基。

R2可以是未取代的苯基或取代的苯环。所述取代(也以J表示)可以在所述苯环的任意位置上。在一些实施方案中，J是氢或选自C₁～C₃烷基和卤素中的1～2个取代基。

可基于骨架7的化合物的一个实施方案是化合物UC-23(也称为P3-E5)。该化合物具有以下化学结构：

基于骨架7的抑制GGT酶I活性的一些示例性化合物包括表2中列出的那些：

表2：基于骨架7的示例性化合物

在图2中列出了可基于骨架7的另一些目标化合物。这些化合物包括P2-D5、P2-D7、P2-D8、P2-D9和P2-D10。

另一些化合物可基于结构10构建。在骨架10上构建的化合物可包括在R1、P、R3和SR4位置上的取代基。R1可选自1～6个碳的直链或支链烷基，未取代的苯基，以及被C₁～C₃烷基、氢或卤素取代的苯基。在本文中R1还以W表示。

在一些实施方案中，P是如上所述的保护基。

SR4可代表硫醇，其中R4选自氢、2～10个碳的烷基。

利用骨架10构建的抑制GGT酶I活性的一些示例性化合物包括表3中列出的那些：

表3：基于骨架10的示例性化合物

可利用例如图6中所示的合成方法制备本文中列出的基于所述骨架的化合物。然而，本领域技术人员将会理解，可使用其它的合成方法，本发明并不限于图6中所示的方法。

可利用以下的合成方法制备另一些化合物，包括示例性的化合物mP5-H6：

利用该合成方法已制备了化合物mP5-H6。化合物mP5-H6具有上述合成方法中所述的结构，并表现出以下实施例中所示的抑制GGT酶I的活性。

可利用本文中所述的方法制备另一些化合物。在一些实施方案中，这些化合物具有以下的化学结构：

虽然n被描述为1～3，但在一些实施方案中n可以是0。在另一些实施方案中，n是1、2或3。

可利用本文中所述的合成方法合成本文中的化合物。本领域技术人员将会理解，可将作为库的一部分的所述各种取代基加到每一个骨架上以产生落入本发明范围内的化合物。例如，可将表1、2和3中所示的取代基放置到骨架6、7或10上，而不管是否本文中描述了所述取代基在所述骨架上。

本领域技术人员将会理解，本文中所述的化合物可以盐形式(例如钠盐、钾盐或其它可药用盐)或以结晶形式使用。对于一些化合物(例如mP5-H6)来说，利用常规方法不易制得盐，但本领域技术人员将会理解，可使用替代性方法制备盐。本文中所述化合物的盐或结晶形式可用作药物组合物的一部分。

III.药物组合物

本发明的化合物可用作药物组合物，所述药物组合物是利用如本文中所定义的治疗有效量的本发明化合物与药学上可接受的载体或稀释剂一起制备的。

可将本发明的化合物配制成药物组合物并将其以各种适于所选施用途径的形式施用给需要治疗的对象(例如哺乳动物，比如人患者)，所述施用途径例如口服、经鼻、腹膜内或胃肠外、静脉内、肌肉内、局部或皮下途径，或者通过注射进组织内。

用于施用所述化合物的合适的口服形式包括糖锭(lozenge)、锭剂(troche)、片剂、胶囊、泡腾片、口腔崩解片、设计增加胃滞留时间的漂浮片、口腔贴片和舌下片。

本发明的化合物可与药学上可接受的载体(比如惰性稀释剂或可吸收的可食用载体)一起全身施用(例如口服)，或者通过吸入或吹入施用。它们可被包封在包衣或未包衣的硬壳或软壳明胶胶囊中，可被压制成片，或者可被直接掺入患者饮食的食物中。对于口服治疗施用来说，所述化合物可以与一种或多种赋形剂组合并且可以咀嚼片、口含片、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆、薄片(wafer)等形式使用。对于适合施用给人的组合物来说，术语“赋形剂”旨在包括但不限于在Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Lippincort Williams& Wilkins，21st ed.(2006)(以下称Remington)(其在此通过引用全部并入本文中)中所描述的那些成分。

所述化合物可与惰性粉末化载体组合并被所述对象吸入或吹入。这样的组合物和制剂应当包含至少0.1％的化合物。所述组合物和制剂的百分数当然可以变化并且可以便利地为所给定单位剂型之重量的约2％至约60％。在这些治疗有用的组合物中化合物的量是获得有效剂量水平的量。

所述片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可包含以下成分：粘合剂比如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂比如磷酸氢二钙；崩解剂比如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂比如硬脂酸镁；以及甜味剂比如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜或者可加入调味剂比如薄荷、冬青油或樱桃调味剂。当单位剂型是胶囊时，除了上述类型的物质外，其还可包括液体载体，比如植物油或聚乙二醇。糖浆或酏剂可包含活性化合物、作为甜味剂的蔗糖或果糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和调味剂比如樱桃香料或橘子香料。

多种其它物质可作为包衣剂而存在或者另外用于改进固体单位剂型的物理形式。例如，可利用明胶、蜡、虫胶或糖等将片剂、丸剂或胶囊包衣。当然，用于制备任何单位剂型的任何材料都应当是药学上可接受的并且在所施用的量下基本上无毒。

此外，可将所述化合物掺入缓释制剂或装置中。例如，可将所述化合物掺入定时释放胶囊、定时释放片剂和定时释放丸剂中。在一些实施方案中，利用选自以下的剂型施用所述组合物：泡腾片、口腔崩解片、设计增加胃滞留时间的漂浮片、口腔贴片和舌下片。

还可以通过输注或注射来静脉内或腹膜内施用所述化合物。可在水中(优选与无毒的表面活性剂混合)制备所述化合物的溶液。还可在甘油、液体聚乙二醇、三醋精及其混合物中和在油中制备分散体系。在普通的贮存和使用条件下，这些制剂可含有防腐剂以防止微生物生长。

适于注射或输注的药物剂型可包括无菌水溶液或分散系或含有适于即时制备无菌注射溶液或输注溶液或分散系(任选地以脂质体包封)的无菌粉末。在所有情形下，最终的剂型都应该是无菌流体并且在生产和贮存的条件下稳定。所述液体载体或赋形剂可以是包含例如以下成分的溶剂或液体分散介质：水，乙醇，多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)，植物油，无毒的甘油酯，及其合适的混合物。可例如通过形成脂质体、在分散系情况下通过保持所需颗粒大小或者通过使用表面活性剂来保持合适的流动性。

可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂带来对微生物作用的预防，所述抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在很多情况下，优选包含等渗剂，例如糖、缓冲剂或氯化钠。可通过在组合物中使用延缓吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)而带来可注射组合物的延长吸收。

无菌注射溶液通过将需要量的化合物纳入合适的溶剂中以及根据需要的上述所列举的各种其它成分中然后过滤除菌而制得。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，所述方法得到活性成分加上存在于前述过滤除菌之溶液中任何额外所需成分的粉末。

对于局部施用而言，可以纯的形式施用所述化合物。然而，期望将它们与皮肤病学上可接受的载体(其可为固体或液体)组合而作为组合物或制剂来施用。

可用的固体载体包括细颗粒固体比如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等。另一些固体载体包括无毒的聚合物纳米颗粒或微米颗粒。可用的液体载体包括水、醇或二醇或水/醇/二醇混合物，所述化合物可以有效水平溶解或分散于其中(任选地借助于无毒的表面活性剂)。可加入佐剂比如香料以及额外的抗微生物剂以优化所给定用途的性质。所得的液体组合物可以从用来充满绷带或其它辅料的吸收垫(absorbent pad)中施用，或者利用泵式喷雾器或气雾喷雾器被喷雾到受影响区域表面。

还可以将增稠剂(比如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐及酯、脂肪醇、改性纤维素或改性的矿物质)与液体载体一起施用以形成可铺展的糊、凝胶、软膏、皂等，用于直接施用到使用者的皮肤上。

可用于将所述化合物递送到皮肤的有用的皮肤病学组合物的实例对本领域来说是已知的，例如参见Jacquet et al.(美国专利号4,608,392)，Geria(美国专利号4,992,478)，Smith et al.(美国专利号4,559,157)和Wortzman(美国专利号4,820,508)，所有这些文献在此通过引用并入本文中。

可通过比较式I化合物在动物模型中的体外活性和体内活性而确定其有用剂量。将在小鼠和其它动物中的有效剂量外推到人的方法是本领域中所公知的，例如参见美国专利号4,938,949，其在此通过引用并入本文中。

例如，所述化合物在液体组合物(比如洗剂)中的浓度可以是约0.1-25重量％，或者约0.5-10重量％。在半固体或固体组合物(比如凝胶或粉末)中的浓度可以是约0.1-5重量％，或者约0.5-2.5重量％。

用于治疗所需的所述化合物的量将不仅随所选的具体盐而变化，而且还随施用途径、被处理病症的性质以及患者的年龄和身体状况而变化，并将最终由主治医师来判断决定。

本发明药剂的有效剂量和施用途径是常规的。所述药剂的确切量(有效剂量)将随对象不同而变化，取决于例如对象的物种、年龄、重量和一般健康状况或临床状况、被治疗的任何病症的严重程度或机制、所用的具体药剂或载体、施用的方法和方案等。可根据经验通过本领域技术人员已知的常规方法确定治疗有效剂量。参见例如ThePharmacological Basis of Therapeutics，Goodman and Gilman，eds.，Macmillan Publishing Co.，New York。例如，可在细胞培养试验或在合适的动物模型中初步估计有效剂量。还可使用动物模型确定合适的浓度范围和施用途径。然后可利用这些信息来确定在人中的可用剂量和施用途径。也可通过利用可比治疗剂的剂量类推而选择治疗剂量。

在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物包含治疗有效剂量的化合物。本文中所用的术语“有效量”或“治疗有效量”指在单次剂量(其中单次剂量包含一个或多个剂量单位)后或在多次给药的过程后(例如，在所述治疗阶段期间或结束时)可有效实现其预期目的的活性化合物的量。因此，例如术语本文中所公开的化合物的“治疗有效量”当用于治疗癌症的方法中时，指当施用给有此治疗需要的哺乳动物时可减轻或预防癌症发生的化合物的剂量。虽然所述治疗有效量将根据对象的需要而变化，但该量可容易地由本领域技术人员(例如医师)确定。

具体施用方式和给药方案将由主治医师考虑病例的具体情况来选择(例如对象、疾病、所涉及的疾病状态以及所述治疗是否是预防性的)。治疗可包括一种或多种化合物在数天至数月或者甚至数年的阶段内每日或每多日给药。

然而，通常合适的剂量将为约0.001到约100mg/kg体重每天，例如约0.01至约100mg/kg体重每天，比如超过约0.1mg/kg，或者为约1至10mg/kg服用者体重每天。例如，合适的剂量可以为约1mg/kg体重每天，10mg/kg体重每天，或50mg/kg体重每天。

所述化合物便利地以单位剂型施用，例如每个单位剂型含有0.05～10000mg、0.5～10000mg、5～1000mg或约100mg的活性成分。在一些实施方案中，所述剂量单位含有约1mg、约10mg、约25mg、约50mg、约75mg、约100mg、约150mg、约200mg、约250mg、约300mg、约350mg、约400mg、约450mg、约500mg、约750mg或约1000mg的活性成分。

可施用所述化合物以达到例如约0.5至约75μM、约1至约50μM、约2至约30μM、或约5至约25μM的峰值血浆浓度。示例性的理想血浆浓度包括至少或不超过0.25、0.5、1、5、10、25、50、75、100或200μM。例如，血浆水平可以是约1至100微摩每升或约10至约25微摩每升。这可以例如通过静脉内注射0.05～5％的所述化合物的溶液(任选地在盐水中)或者口服含有约1-100mg所述化合物的大丸剂而实现。可通过持续输注以提供约0.00005-5mg每kg体重每小时、例如至少或不超过0.00005、0.0005、0.005、0.05、0.5或5mg/kg/hr而维持理想的血液水平。或者，可以通过间歇式输注含有约0.0002-20mg每kg体重、例如至少或不超过0.0002、0.002、0.02、0.2、2、20或50mg所述化合物每kg体重的输液而获得这样的水平。

所述化合物可以方便地以单剂量存在或者作为分开的剂量以适当的间隔施用，例如以每天两次、三次、四次或更多次分剂量施用。还可将所述分剂量进一步分割，例如分成多个空间上松散分离的施用形式，比如从吹药器(insufflator)中多次吸入。

IV.治疗、测定的方法和试剂盒

本发明的一些实施方案涉及使用本文中所述化合物的方法。这些化合物(如在以下实施例和整个说明书中所示的)可用于通过抑制至少GGT酶I的活性而抑制信号传递蛋白的香叶基香叶基化。然而，因为GGTI(比如本文中所述的那些)可抑制多种信号传递蛋白的香叶基香叶基化，所以本文中所述的化合物可有效用于治疗广泛的人类癌症。例如，mP5-H6可抑制白血病细胞系(Jurkat)、乳腺癌细胞系(BT474和MDA-MB231)和胰腺癌细胞系(Panc-1和MiaPaCa2)的增殖。

胰腺癌是特别感兴趣的，因为近来的研究(Lim，K-H et al.，CurrentBiology 16，2385；Lim，K-H et al.，Cancer Cell 7，533)已确立了RalA和RalB蛋白(两者均是香叶基香叶基化的)在胰腺癌中的重要性。RalA通常在一组来自胰腺癌的细胞系中被活化。利用siRNA的研究表明对RalA的抑制减少了肿瘤生长。发现RalB对转移而言是重要的。有趣地是，所述RalA活化发生在K-ras活化的下游，所述K-ras活化可见于超过80％的胰腺癌病例中。因为K-ras异戊二烯基化可被GGTI和FTI联合抑制，所以GGTI可能对于胰腺癌来说特别重要。

乳腺癌也是所感兴趣的，因为GGTI已表明可抑制乳腺癌细胞的增殖(Vogt，A.et al.，J.Biol.Chem.272，27224)。这通过G1期细胞的积聚和p21的增加而实现。此外，据报道香叶基香叶基化蛋白Rac3在乳腺癌细胞(Mira J-P et al.，PNAS97，185)中被过度活化。最后，siRNA对RhoA或RhoC的抑制抑制了体外和体内乳腺癌细胞的增殖和侵袭(Pille，J-Y et al.，Molecular Therapy 11，267)。

GGTI还可在抑制癌症转移中具有价值。这是基于香叶基香叶基化蛋白质在转移中发挥重要作用这一发现。除了上述的RaIB以外，另一种香叶基香叶基化蛋白RhoC也在癌症转移中发挥着必要作用(HakemA.et al.，Genes & Dev.19，1974；Clark，E.A.et al.，Nature 406，532)。

因此，所述化合物可用在治疗癌症的方法中。在一些实施方案中，所述治疗癌症的方法包括通过给有此治疗需要的对象施用本文中所述的化合物或其盐而抑制蛋白质异戊二烯基转移酶。所述治疗癌症的方法可以应用于通过涉及GGT酶I的信号传递途径而活化的任何癌症。例如，Rho蛋白活化，例如癌症细胞中的RhoA和Rac。在一些实施方案中，所述癌症选自胰腺癌、白血病、乳腺癌和前列腺癌。在一些实施方案中，所述癌症选自胰腺癌、白血病、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌和胃癌。

本文中所述的化合物还可通过将其施用于细胞而用于抑制GGT酶I活性的方法中。这些方法可在体内或在体外应用。例如，这些化合物可用于与抑制有治疗需要的对象中GGT酶I活性相关的治疗目的。这些方法还可用在为开发这样的治疗剂而设计的研究方法中。例如，作为如本文中所述的库筛选的一部分。

本文中所述的化合物还可以用在抑制癌细胞生长的细胞抑制方法中。这些方法可用作单独治疗或者与细胞毒性治疗或手术方法联用。本发明中所述的方法可在除去肿瘤的手术或者在设计杀死肿瘤细胞的化疗之后施用，以控制这些治疗可能漏掉的任何癌细胞的生长。当在这些实施方案中施用时，这些化合物可作为预防性措施起作用以减少复发的可能性。

本文中所述的化合物还可以用在测量化合物的GGT酶I抑制活性的方法中。例如，本文中所公开的化合物可用作对照以评价新化合物的潜在GGT酶I抑制活性。本文中所公开的化合物还可用作确定用于本文中所公开方法中的治疗性化合物的方法的一部分。

本发明还提供了包含以药学上可接受剂型的形式或作为化合物形式的本发明化合物的试剂盒。这些试剂盒包括填装了所述药物剂型的一种或多种成分的一个或多个容器。

在一些实施方案中，所述试剂盒包含容纳所述剂型或化合物的容器。合适的容器包括例如瓶、盒、泡罩板、金属箔片包装、或其组合。任选地，所述试剂盒还包含用于恰当施用所述剂型或恰当使用所述化合物的说明书，例如作为测定的一部分。还可设计所述试剂盒从而使其可防止篡改(tamper)或将其设计成指示是否已发生篡改。任选地，所述试剂盒可包含与其它药物组合物或化合物(例如FTI)一起的所述剂型或化合物。

任选地可将注意事项或印刷说明书与所述试剂盒中的一个或多个容器组合在一起。这样的印刷说明书可以是由管理药品或生物制品的生产、使用或销售的政府机构所规定的形式，其内容反映了所述机构对于治疗可由本文中所述化合物和剂型治疗的病症的对人施用的生产、使用或销售的批准。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含印刷材料(其例如提供了关于使用该剂型以治疗病症或疾病的信息)或预记录介质装置(其例如提供了关于使用该剂型以治疗病症或疾病的信息)或者服药计划表(planner)。

“印刷材料”可以是例如书、小册子或单页。所述印刷材料可以说明本文中所述剂型的治疗病症或疾病的用途，例如治疗涉及蛋白质的GGT酶I修饰的癌症。可能的格式包括但不限于要点列表、常见问题(FAQ)列表或图表。另外，还可以非文本形式利用图片、图形或其它符号来表明所要提供的信息。

“预记录介质装置”可以是例如可视介质装置，比如录像带、DVD(数字视频光盘)、电影胶片、35mm电影、或任何其它可视介质装置。或者，预记录介质装置可以是互动软件应用，比如CD-ROM(只读存储压缩光盘)或软盘。或者，预记录介质装置可以是例如音频介质装置，比如唱片、盒式录音带或音频压缩光盘。包含在所述预记录介质装置上的信息可描述本发明中所述剂型和化合物的治疗病症或疾病的用途，例如治疗涉及蛋白质的GGT酶I修饰的癌症。

“服药计划表”可以是例如周度的、月度的、多月的、年度的或多年的。所述服药计划表可以用作监测用药量、跟踪所施用剂量或者为未来事件而准备的日记，其中定期施用如本文中所述的剂型。或者，所述服药计划表可以是提供为监督何时已服用以及何时还未服用的手段的日历。这种类型的服药计划表对于不按正常计划给自己服药的患者来说特别有用。此外，所述服药计划表还可用于老年人、儿童或者可能给自己服药并且可能健忘的其它患者群体。本领域技术人员将会理解，有多种计划工具适于与本文中所述的化合物和剂型一起使用。

所述试剂盒还可包含用于储存所述试剂盒中其它成分的容器。所述容器可以是例如袋、盒、封套(envelope)或可适于与本文中所述的化合物和剂型一起使用的任何其它容器。优选地，所述容器大到足以容纳可与本发明剂型一起使用的每种成分和/或任何施用装置。然而，在一些情况下，具有可藏在患者的皮夹、公文包或口袋中的较小容器可以是理想的。

在一些实施方案中，本发明包括含有本文中所述药物剂型的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括印刷的使用说明书。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括印刷材料、预记录介质装置或服药计划表，说明使用本发明的药物剂型以治疗或预防可通过服用本文所公开组合物而有帮助的病症。

在一些方面中，本发明提供了一种将本文所述药物剂型递送给有此需要的患者的方法，所述方法包括：

(a)在计算机可读存储介质中登记允许开出所述药物剂型的医师的身份；

(b)给患者提供有关伴随该药物剂型的风险的咨询信息；

(c)获取患者在尽管有所述风险仍接受该药物剂型的知情同意；

(d)在获取知情同意后在计算机可读介质中登记该患者；和

(e)允许该患者获取所述药物剂型。

在该方法的一些实施方案中，所述获取所述药物剂型是提供处方。

本发明的另一方面包括就本文中所述的药物剂型教育消费者的方法，所述方法包括在销售点将所述口服药物剂型随同消费者信息分发给消费者。

在一些实施方案中，所述消费者信息提供于选自以下的格式中：英文文本、外语文本、可视图像、图表、电话记录、网址、以及对现场客户服务代表的访问。在一些实施方案中，所述消费者信息是关于用法、适当年龄用法、适应症、禁忌症、适当的剂量、警告、电话号码或网址的说明。

在一些实施方案中，所述教育消费者的方法还包括给处于答复消费者关于所述药物剂型的问题的位置的相关人员提供专业信息。在一些实施方案中，所述相关人员是医师、医师助理、护理专业人员、药师或客户服务代表。

在一些实施方案中，所述药物剂型被分发至药师或保健提供者处。

实施例1

我们报告了与聚合物键合的联烯酸酯的膦催化的第一个实例以及开发I型蛋白质香叶基香叶基转移酶(GGT酶-I)的高效抑制剂的组合库方法。

对一组138种杂环筛选了其抑制人GGT酶-I将K-Ras4B或RhoA香叶基香叶基化之活性的能力。将纯化的GGT酶-I与其底物蛋白K-Ras4B或RhoA、[³H]GGPP、以及138种化合物一起孵育。30分钟以后，利用闪烁计数器测量氘化香叶基香叶基的掺入程度。

多种化合物被鉴定为GGTI，包括以下编号为1和2的化合物：

有前景的GGTI先导化合物及其适度活性这一发现保证了对类似结构的高效和快速合成和评价的开发以寻找更好的抑制剂；我们构思了一种利用SynPhase^TM笼形树脂作为固相载体的短的模块式合成路线(方案1)。对聚合物载体上合成路线的验证开始于与树脂键合的联烯酸酯5的形成。以前没有报道过将联烯酸加载到固相载体上。利用Mukaiyama试剂和Hünig’s碱(对于4a/b)或Et₃N(对于4c/d)将联烯酸4偶联到用王树脂3接枝的SynPhase-PS笼形树脂上的苄醇单元上。直接使用未修饰的王树脂尽可能减少了在固相载体上进行合成操作的数目。此外，我们的策略能实现简单的三氟乙酸(TFA)介导的切割以释放所述羧酸基团，所述羧酸基团为我们GGTI中的关键官能团。

方案1.二氢吡咯8和四氢吡啶9的固相合成

以固相键合聚合物为载体的联烯酸酯5和N-甲苯磺酰基亚胺之间的膦催化环化顺利进行。在60℃下将联烯酸酯5a和5b用N-甲苯磺酰基甲基苯甲醛亚胺(N-tosyltolualdimine)和在苯中的50mol％PPh₃(对于5a)或PBu₃(对于5b)进行处理以得到与聚合物键合的二氢吡咯6。在50mol％的PBu₃存在下在室温下由5c和5d与N-甲苯磺酰基甲基苯甲醛亚胺分别反应2天和4天形成四氢吡啶7。利用在DCM中的2.5％TFA将杂环6和7从树脂上切割下来而在色谱纯化后以高非对映体选择性(对于8b:dr＝99:1；对于9b:dr＝93:7)以91-94％的产率(基于15μmol/笼形树脂的理论载量)得到羧酸8和9。

利用6和7中的α，β-不饱和烯酸酯官能团进一步增加类似物的模块性和数目。例如，利用正丁基锂作为碱将硫醇Michael加成到6和7上，分别得到10和11，其经TFA介导的裂解分别以77-95％的产率得到12和13(方案2)。这两步次序以高非对映体选择性发生，提供了作为单一非对映异构体产物的五取代吡咯烷12和四取代哌啶13。显然，硫醇被加成到所述二氢吡咯6和所述四氢吡啶7中已有取代基的对位上。然而，有趣的是，所得α负碳离子的质子化发生在所加成β巯基的反式(对于10)和顺式(对于11)位置上。

方案2.固相非对映体选择性的Michael加成

在成功地确立了固相反应条件之后，我们接下来制备α和γ取代的联烯酸构建模块(方案3)。在Et₃N(1当量)存在下正膦14和酰氯15(1当量)之间的反应提供了联烯酸酯16，其被水解成γ取代的联烯酸A。用卤代烷17处理正膦14以得到膦鎓盐18，经Et₃N(2当量)和乙酰氯(1当量)处理后所述膦鎓盐18被转化为α取代的联烯酸酯19。通过所述酯19的皂化制得α取代的联烯酸B。所述N-磺酰基亚胺C通过在甲苯中回流下从合适的磺酰胺20、醛21和BF₃·OEt₂的混合物中共沸除去水而简单地形成。图表1提供了如方案3中所示合成的构建模块和可商购的硫醇构建模块D。

方案3.构建模块的制备

对所述构建模块进行试验，使得只有以高纯度和立体选择性(经¹H NMR谱和LCMS分析所判断)提供其粗切割产物的那些才会用到GGTI类似物库的合成中。如方案1中所示，加载11种γ取代的联烯酸A和12种α取代的联烯酸B并在催化量的膦存在下与亚胺C02反应。在用TFA切割并分析(¹H NMR和LCMS谱)23种环化产物6和7的纯度和非对映体选择性后，我们发现，除了A10以外，每种联烯酸都以高纯度(72-100％；LCMS/UV210)得到了单一可鉴定的化合物(dr≥12:1；¹H NMR)。选择与树脂键合的来自联烯酸A01、A05、B01和B05的联烯酸酯以评价46种亚胺在膦催化环化中的反应活性和立体选择性(因为A01、A02-A11、B01和B02-B12需要不同的环化反应条件)。利用>70％纯度和>9:1dr的标准，对于联烯酸酯A01，我们(从46种中)选择了30种亚胺构建模块；对于A05选择了21种；对于B01选择了25种；以及对于B05选择了31种。

图表1.11种γ取代的联烯酸A、12种α取代的联烯酸B、46种N-磺酰亚胺C和32种硫醇D

对于硫醇的Michael加成而言，对所有三种构建模块进行如下测试：为选择合适的联烯酸，将23种上述合成的环化产物利用苯硫醇、甲苯硫醇或苄醇进行Michael加成。对所述切割产物的分析表明，(23种中)有8种联烯酸是合适的候选化合物。对于亚胺选择来说，对A05和B01与46种亚胺的环化产物进行了试验，因为联烯酸A01-04和B02-B12被排除在Michael加成序列之外。所选亚胺的数目是(从46种中选出)25种(对于A05而言)和21种(对于B01而言)。使用环化产物6和7(方案2)来选择硫醇；不同硫醇需要不同的反应时间和温度。经过广泛的优化，(从32种中)选出了针对二氢吡咯6的19种硫醇和针对四氢吡啶7的17种硫醇。对这些所选构建模块进行组合，导致制得了4288种化合物。

利用所选构建模块，我们在SynPhase笼形树脂上开始了所述4288种GGTI类似物的分开-合并合成。在合成所述库之前，通过向所述笼形树脂中插入带色色的轴(spindle)和齿轮(cog)而进行标记¹⁴。利用Mukaiyama试剂将23种联烯酸A和B加载到王树脂3上(方案1)。针对每组联烯酸(A01、A02-A11、B01和B02-B12)，将所得的负载有联烯酸酯的笼形树脂5合并然后分到多个对应于亚胺数的烧瓶中。将成组的加载有240种二氢吡咯的笼形树脂6和加载有366四氢吡啶的笼形树脂7放置一旁以备切割。将成组的加载有3325种键合二氢吡咯的笼形树脂6和加载有357种键合四氢吡啶的笼形树脂7分别分到19个和17个烧瓶中，并进行硫醇的Michael加成(方案2)。

将4288种笼形树脂插入4288个管中并用在CH₂Cl₂中的2.5％TFA处理12小时；然后除去笼形树脂并用CH₂Cl₂漂洗。将所得的溶液浓缩并进一步与CHCl₃共蒸发以有效除去TFA。将切下来的化合物称重并再溶解在CHCl₃中；将每种化合物的一部分(2μmol)转移至54个96孔板(每孔80种化合物；每个板的两列孔保持空的以容纳随后测定中的对照)中并使溶剂蒸发。将产物再溶解在DMSO中并在同一测定中分析抗GGT酶-I的活性。

在体外测试中，研究了活性化合物抑制RhoA和K-Ras4B的香叶基香叶基化的能力。表现出迄今所获得的大致最高活性的两种化合物(22和23)显示在以下(a)中。这些化合物表现出对GGT酶-I的特异性抑制作用，即它们在以其超过90％抑制GGT酶-I的浓度下并不抑制FT酶。

图33显示了定性检测香叶基香叶基化Rheb的细胞裂解物的Western印迹。标识符P和U分别指出了处理的和未处理的Rheb。

最后，我们研究了化合物22(又称为UC-22)和23(又称为UC-23)的体内作用。利用表达所述Rheb蛋白的香叶基香叶基化形式的Rheb-CSVL构建物转染人胚肾(HEK)293细胞。可从该蛋白质在SDS聚丙烯酰胺凝胶上迁移率的变化来检测对其香叶基香叶基化的抑制作用；未处理的形式表现为缓慢移动的带。图33表明，化合物22和23对所述细胞的处理导致出现缓慢迁移的带(比较DMSO带与化合物22和23的带)；使用已知的GGTI(GGTI298，GGTI2166)作为对照。这些结果表明，化合物22和23在细胞内抑制香叶基香叶基化。

实施例2

如图20A-20C所示，化合物P3-E5和P5-H6特异性地抑制GGT酶I。所述图举例说明了P3-E5和P5-H6对GGT酶-I(A)、FT酶(B)、GGT酶-II(C)的酶活性的作用。将不同浓度的两种化合物加入到每个酶反应中。利用作为底物蛋白的K-Ras4B、FT酶(JENA Bioscience，SanDiego，CA)和[³H]焦磷酸法呢基酯进行FT酶(蛋白质法呢基转移酶)试验。在37℃孵育30分钟。

利用作为底物蛋白的RhoA、GGT酶-I(JENA Bioscience)和[³H]焦磷酸香叶基香叶基酯进行GGT酶-I试验。在37℃孵育30分钟。利用作为底物蛋白的YPT1、GGT酶-II(Calbiochem，San Diego，CA)和REP1(Calbiochem)以及[³H]焦磷酸香叶基香叶基酯进行GGT酶-II(或RabGGT酶)试验。在37℃孵育30分钟。图20D-20F显示了GGT酶I(D)、FT酶(E)和GGT酶II(F)的三维结构，其可从蛋白质晶体的X射线衍射研究而获得。

实施例3

如图21A-21D所示，P3-E5和P5-H6与底物蛋白竞争但不与GGPP竞争。图21中的图显示了得自底物速率曲线的P3-E5(左)和P5-H6(右)对GGT酶-I抑制作用的双倒数(double reciprocal)图。上面的图显示了使用固定的RhoA蛋白浓度以及变化的GGPP浓度。下面的图显示了使用固定的GGPP浓度以及变化的RhoA蛋白浓度。使用以下符号作图：Y-轴：1/v，fmol/分钟。X-轴：1/s，mM。

实施例4

如图22A和22B所示，P3-E5在细胞中抑制香叶基香叶基化。将表达Myc-HA标记的Rheb-CVSL(上图)或Myc-HA标记的Rheb-WT(下图)的人胚肾(HEK)293细胞用P3-E5处理48小时然后裂解。将所述细胞裂解物跑SDS聚酰胺凝胶并利用抗Myc抗体或抗肌动蛋白抗体进行免疫印迹。标识符P和U分别指出了处理和未处理的Rheb。利用P5-H6获得了类似的结果但并未显示在图22中。

实施例5

如图23所示，P3-E5和P5-H6抑制K562细胞的增殖。K562细胞是一种人红白血病细胞的细胞系。将所述K562细胞用P3-E5、P5-H6或GGTI-298(示于图27中的一种已知GGTI化合物)处理72小时，然后利用细胞计数试剂盒8(Dojindo，Gaithersburg，MD)将细胞计数。将相对于DMSO对照和已知GGTI化合物的细胞活力绘制在图23中。可以看出P3-E5和P5-H6均抑制K562细胞的生长。

实施例6

如图24A所示，P3-E5在K562细胞中诱导G1期阻滞。将K562细胞用标明浓度(mM)的P3-E5(0～10mM)或GGTI-298(0～10mM)处理48小时。通过流式细胞术监测细胞周期特性。通过不同的颜色标出细胞周期的每一期中细胞的百分数。红：G0/G1期。黑：S期。灰：G2/M期。利用P5-H6获得了类似的结果。

不希望受任何单一理论的限制，图24B举例说明了一种示例性的机制以解释GGTI的细胞周期作用。已知RhoA抑制p21WAF的表达。GGTI可通过抑制RhoA的香叶基香叶基化而起作用，导致p21WAF表达的增加。这将会导致G1期阻滞。

实施例7

如图25所示，mP5-H6抑制体内的香叶基香叶基化。将表达Myc-HA标记的Rheb-CVSL(上图)或Myc-HA标记的Rheb-WT(下图)的人胚肾(HEK)293细胞用mP5-H6a(也称为mP5-H6)或GGTI-298处理48小时然后裂解。将细胞裂解物跑SDS聚酰胺凝胶并利用抗Myc抗体或抗肌动蛋白抗体进行免疫印迹。处理和未处理的Rheb可用于本实施例所述的方法中，如图22所示。

实施例8

如图26所示，相对于P5-H6，mP5-H6表现出了增加的抑制增殖的潜力。将Panc-1细胞(胰腺癌细胞系)和Jurkat细胞(T细胞白血病)用12.5μM的P5-H6或12.5μM的mP5-H6a处理72小时。如实施例5中所述对细胞进行计数。该图表明，mP5-H6a比P5-H6更好地抑制Panc-1细胞和Jurkat细胞的生长。

本说明书中举例说明和论述的实施方案仅旨在将本发明人所知的实施和利用本发明的最佳方式教导给本领域技术人员。本说明书中任何内容都不应被视为是限制本发明的范围。给出的所有实施例都是代表性的和非限制性的。本领域技术人员根据以上教导将会理解，可将本发明的实施方案进行修饰或改变而不背离本发明。因此，应当理解，在所述权利要求及其等同方案的范围内，可按不同于所具体描述的方式实施本发明。