CN101445800A - T1r味觉受体及其编码基因 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了新鉴定的哺乳动物味觉细胞特异性G蛋白耦联受体,以及编码这些受体的基因和cDNA。尤其描述了具有味觉信号形成活性的T1R G蛋白耦联受体及其编码基因和cDNA,以及分离这些基因和分离和表达这些受体的方法。本发明同时描述了表征哺乳动物中特定味觉元的味觉感知的方法,以及产生能够在哺乳动物中引发预定味觉感知的新分子和分子组合的方法,和刺激一种或多种味觉的方法。此外,本发明也描述了在哺乳动物中刺激或阻断味觉感知的方法。
Description
涉及申请
本专利申请涉及以下临时申请:U.S.Ser.No.60/187,546,2000年3月7日提出申请,标题为“新型味觉受体及其编码基因,”授予Zozulya和Adler;U.S.Ser.No.60/195,536,2000年4月7日提出申请,标题为“哺乳动物味觉受体和人类直向进化同源物(ortholog),”授予Adler;U.S.Ser.No.60/209,840,2000年6月6日提出申请,标题为“新型味觉受体及其编码基因,”授予Zozulya和Adler;U.S.Ser.No.60/214,213,2000年6月23日提出申请,标题为“新型味觉受体及其编码基因,”授予Zozulya和Adler;U.S.Ser.No.60/226,448,2000年8月17日提出申请,标题为“新型味觉受体及其编码基因,”授予Zozulya和Adler;U.S.Ser.No.60/259,227,2001年1月3日提出申请,标题为“T1R味觉受体及其编码基因,”授予Adler、Li、Staszewski和O’Connell,这些专利申请此处全文引用作为参考。
发明背景
发明领域
本发明涉及最近鉴定的哺乳动物化学感受G蛋白耦联受体、这些受体家族和编码这些受体的基因和cDNA。本发明尤其涉及最近鉴定的哺乳动物在味觉信号发生活跃的化学感受G蛋白耦联受体、这些受体家族、编码这些受体的基因和cDNA和涉及在分析、发现味觉调节子时这些受体、基因和cDNA的使用方法。
背景技术
味觉系统提供了关于外界化学组分的感受信息。味觉转换是哺乳动物化学触发的感受中最复杂的形式之一。至今人们对于味觉感受由何种途径引发仍缺乏了解。例如参见,Margolskee,生物试验(Bioassays),15:645-50(1993);Avenet等,膜生物学杂志(J.Membrane Biol.),112:1-8(1989)。整个动物界,从简单的后生动物(metazoans)到最复杂的脊椎动物都普遍存在味觉信号发生现象。通常认为味觉感受包括截然不同的信号发生途径。这些途径被认为是由受体介导,即代谢趋向性(metabotropic)受体和变力(inotropic)受体。表达这些味觉受体的细胞在暴露在特定化学刺激下,通过去极化产生动作电位从而引发味觉感受,其被认为是触发感受。通常认为这个事件在尝觉传入神经元突触处触发了神经传递素的释放,从而启动了神经途径上的信号发生,由此介导味觉感知。例如参见,Roper,神经科学年度综述(Ann.Rev.Neurosci.),12:329-53(1989)。
同样,味觉受体特异性地识别能够引发特异味觉感受的分子。这些分子在此处也被称作“味觉元(tastant)”。许多味觉受体属于7-跨膜受体超家族(Hoon等,细胞(Cell)96:451(1999);Adler等,细胞100:693(2000)),同样也被认为是G蛋白耦联受体(GPCR)。其它味觉被认为由通道蛋白质介导。G蛋白耦联受体控制许多生理功能,如内分泌功能、外分泌功能、心率、脂解作用、糖代谢和跨膜信号发生。许多这类受体的生物化学分析和分子克隆已经揭示了关于这些受体功能的许多基本原理。
例如,美国专利号5,691,188描述了如何在配体(ligand)与GPCR结合后,这个受体可能发生构象改变,从而导致G蛋白活化。G蛋白包含三个亚基:一个脒基核苷酸结合α亚基,一个β亚基和一个γ亚基。G蛋白在两种形式中循环,取决于是GDP还是GTP结合到α亚基上。GDP结合上之后,G蛋白以异三体(heterotrimer)形式存在:即Gαβγ复合物。当GTP结合后,α亚基从异三体上解离,剩下Gβγ复合物。当Gαβγ复合物与细胞膜上的活化G蛋白耦联受体功能性结合时,GTP交换成结合GDP的速度加快,结合的Gα亚基从Gαβγ复合物中解离的速度亦随之加快。自由Gα亚基和Gβγ复合物因此能够传递一个信号到多种信号传导途径下游环节。这些事件形成不同细胞信号现象多样性的基础,包括例如味觉和/或嗅觉等被认为是神经学感受感知的信号现象。
通常认为哺乳动物有五种基本味觉形式:甜、苦、酸、咸和鲜(umami,谷氨酸钠的味道)。例如参见,Kawamura等,鲜味入门:一种基本味道(Introduction to Umami:A Basic Taste)(1987);Kinnamon等,生理学年度综述(Ann.Rev.Physiol.),54:715-31(1992);Lindemann,生理学综述(Physiol.Rev.),76:718-66(1996);Stewart等,美国生理学杂志(Am.J.Physiol.),272:1-26(1997).大量动物生理学研究表明味觉受体细胞可能对不同化学刺激进行选择性的反应。例如参见,Akabas等,科学(Science),242:1047-50(1988);Gilbertson等,遗传生理学杂志(J.Gen.Physiol.),100:803-24(1992);Bernhardt等,生理学杂志(J.Physiol.),490:325-36(1996);Cummings等,神经生理学杂志(J.Neurophysiol.),75:1256-63(1996)。
在哺乳动物中,味觉受体细胞被组装进味蕾,这些味蕾广泛分布在舌上皮细胞的乳状乳头中。轮廓乳头位于舌的最后部,包含成百上千个味蕾。与此相对照的是,位于舌后侧面的叶状乳头含有几十到几百个味蕾。此外,位于舌前部的菌状乳头,仅有一个或几个味蕾。
根据不同种类,每个味蕾含有50-150个细胞,包括前体细胞、支持细胞和味觉受体细胞。例如参见,Lindemann,生理学综述(Physiol.Rev.),76:718-66(1996)。受体细胞在其基部受传入神经末梢支配,通过脑干和丘脑的突触,这些神经末梢将信息传递给大脑皮层的味觉中枢。阐明味觉细胞信号发生和信息处理的机制对于理解味觉的功能、调节和感知是非常重要的。
尽管人们对于味觉细胞功能的精神物理学和生理学了解很多,但对于介导感受信号反应的分子和途径缺乏了解。新型味觉受体和味觉信号发生分子的鉴定和分离能够产生化学和遗传调节味觉传导途径的新方法。例如,利用受体和通道蛋白,能够筛选味觉活性的高亲和力激动剂、拮抗剂、反向激动剂和调节剂。这些味觉调节化合物在药品和食品工业十分有益,它们可以改进多种消费品的味道,或阻断一些令人不快的味道,如药剂的味道。
众多的人类和其它真核生物化学感受受体全部或部分序列现在都已清楚。例如参见,Pilpel,Y和Lancet,D,蛋白质科学(Protein Science),8:969-977(1999);Mombaerts,P.,神经科学年度综述,22:487-50(1999)。同样参见,EP0867508A2,US 5874243,WO 92/17585,WO 95/18140,WO 97/17444,WO 99/67282。由于配体-受体作用的复杂性,以及尤其是味觉元-受体作用的复杂性,配体-受体识别信息十分缺乏。本发明部分强调更好地了解化学感受受体和化学刺激之间作用的必要性。除此之外,本发明也提供新型化学感受受体、使用这些受体的方法、编码这些受体的基因和cDNA来鉴定用于调节化学感受例如味觉感受传导的分子。
发明概述
本发明涉及一种G蛋白耦联受体新家族,和编码这些受体的基因和cDNA。这些受体被认为主要参与甜味味觉传导,但也可能参与从其它味觉形式的信号转换。
本发明提供了哺乳动物包括人类中味觉感知的描述方法和/或预知味觉感知的方法。优选地,这些方法可以通过使用这些受体和使用编码此处所述受体的基因来完成。
为此,本发明的一个目的就是提供哺乳动物G蛋白耦联受体新家族,在此称为T1R,T1R在味觉感知中具有活性。本发明的另一个目的是提供能够保留味觉元结合活性的这些T1R的片段和变体(variants)。
本发明的另一个目的是提供编码这种T1R及其片段或变体的核酸序列和分子。
本发明的另一个目的仍是提供表达载体,其中包含编码这种T1R及其片段或变体的核酸序列,这些序列可操作性地连接到至少一种调节序列如启动子、增强子或参与正向或负向基因转录和/或翻译的其它序列。
本发明的另一个目的仍是提供正常表达至少一种这种T1R或其片段或变体的人类或非人类细胞。
本发明的另一个目的仍是提供T1R融合蛋白质或多肽,其包含至少一种这种T1R中的至少一个片段。
本发明的另一个目的是提供分离的编码T1R多肽的核酸分子,该分子包含一个核酸序列,其与选自下列的核酸序列至少50%,优选75%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同:SEQ ID NO:1,2,3,9,11,13,15,16,20及其保守性修饰的变体序列。
本发明的又一个目的是提供分离的核酸分子,该分子包含一个核酸序列,其编码一条多肽,其氨基酸序列与选自下列的氨基酸序列至少35%到50%,和优选60%、75%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同:SEQ ID NO:4,10,12,14,17和其保守性修饰的变体序列,其中该片段长度至少是20,优选40,60,80,100,150,200或250个氨基酸。任选地,片段可以是能结合抗-T1R抗体的抗原性片段。
本发明的另一个目的是提供分离的多肽,其包含所述片段的变体,其中最多在10,优选5,4,3,2或1个氨基酸残基处存在变异。
本发明的另一个目的是提供这些T1R的激动剂和拮抗剂,或其片段或变体。
本发明的另一个目的是提供哺乳动物包括人类中味觉感知的展示方法和/或预知味觉感知的方法。优选地,这些方法可以通过使用此处所述的T1R,或其片段或变体,和编码该T1R的基因,或其片段或变体来完成。
本发明的另一个目的是提供能够在哺乳动物中引发预定味觉感知的新型分子或分子组合。这些分子或组合物可以由以下方法得到:对于已知分子或分子组合确定其在哺乳动物中的味觉感知值;对于一种或多种未知分子或分子组合确定其在哺乳动物中的味觉感知值;比较一种或多种未知组合物和一种或多种已知组合物在哺乳动物中的味觉感知值;选择能够引发哺乳动物特定味觉感知的分子或分子组合;和合并两种或多种分子或分子组合形成分子或分子组合,其能够引发一种特定的哺乳动物味觉感知。合并步骤产生单独分子或分子组合,其能够引发特定的哺乳动物味觉感知。
本发明的另一个目的是提供筛选一种或多种化合物以鉴定是否存在哺乳动物可察觉的味道的方法,包括:把上述所指的一种或多种化合物与至少一种公开的T1R、其片段或变体接触的步骤,其中优选地哺乳动物是人。
本发明的另一个目的是提供一种刺激味觉的方法,包括以下步骤:对于此处所述多数T1R中的每一个,或其变体的片段,优选地人类T1R来说,确定T1R与味觉元相互作用程度;合并多个化合物,其中每个化合物都有与一种或多种T1R预先确定的相互作用,以达到一起提供受体-刺激模式的程度,这种程度可以模仿味觉模式。通过在此描述的任何一个结合或报告试验可以确定味觉元与T1R的相互作用。多数化合物然后可以结合形成混合物。需要的话,多数化合物中的一种或多种可以共价结合。结合后的化合物基本上刺激至少50%、60%、70%、75%、80%或90%或全部可以实质上由味觉元刺激的受体。
本发明的另一个方面是提供一种方法,其中针对多数T1R、或其片段或变体,对多数标准化合物进行测试,以确定每一个T1R和每一标准化合物的相互作用程度,由此产生每一标准化合物的受体刺激模式。这些受体刺激模式可以存储在数据存储介质上的相关数据库中。本方法还可以包括提供一个味觉的所希望的受体刺激模式;将所希望的受体刺激模式与相关数据库比较;并确定能够与所希望的受体刺激模式最密切相匹配的一种或多种标准化合物组合。本方法还进一步包括将标准化合物组合成一种或多种已经确定的组合物来刺激味觉。
本发明的另一个目的是提供展示哺乳动物感知特定味觉元的方法,包括以下步骤:提供X1到Xn值代表该脊椎动物n个T1R中每一个的刺激量,其中n大于或等于2;从该值中产生味觉感知的定量表示法。T1R可能是在此公开的味觉受体,或其片段或变体,表示法可能包含一个点或n维空间的体积,可能包含一个图或一个谱,还可能包含一个定量表示法矩阵。同样,提供的步骤可能包括将多数重组产生的T1R、或其片段或变体与试验组合物接触,并定量测量该组合物与该受体的作用。
本发明的另一个目的是提供预测哺乳动物味觉感知的方法(该感知是由一种或多种分子或分子组合在哺乳动物中产生的未知的味觉感知),包括以下步骤:提供X1到Xn值代表该脊椎动物n个T1R中每一个的刺激量,其中n大于或等于2;对于一种或多种分子或分子组合在哺乳动物中产生已知的味觉感知;并针对在哺乳动物中产生已知味觉感知的一种或多种分子或分子组合,从该值中产生哺乳动物味觉感知的定量表示法,提供X1到Xn值代表该脊椎动物n个T1R中每一个的刺激量,其中n大于或等于2;对于一种或多种分子或分子组合在哺乳动物中产生未知的味觉感知;针对一种或多种分子或分子组合在哺乳动物中产生未知味觉感知,从该值中产生一个哺乳动物味觉感知的定量表示法,通过比较哺乳动物对一种或多种分子或分子组合产生未知味觉感知的定量表示法和哺乳动物对一种或多种分子或分子组合产生已知味觉感知的定量表示法,预测哺乳动物的味觉感知(该味觉感知是由一种或多种分子或分子组合产生的未知味觉感知)。本方法使用的T1R可能包括在此公开的味觉受体、或其片段或变体。
附图简述
图1是一个冷冻小鼠舌的冰冻切片,通过原位杂交显示在小鼠轮廓乳头味蕾有T1R3基因表达。箭头所示为选择T1R3表达味觉受体细胞。
发明详述
本发明因此提供分离的编码味觉细胞特异性G蛋白耦联受体(“GPCR”)的核酸分子,和它们编码的多肽。这些核酸分子和它们编码的多肽是味觉细胞特异性GPCR T1R家族成员。味觉细胞特异性GPCR T1R家族成员由Hoon等,Cell,96:541-551(1999),WO 00/06592和WO00/06593鉴定,在此全文引用以供参考。
本发明尤其提供编码味觉细胞特异性GPCR新家族的核酸。这些核酸和编码受体在此处被称为味觉细胞特异性GPCR“T1R”家族成员。在本发明的特定实施方案中,T1R家族成员包括rT1R3、mT1R3、hT1R3和hT1R1。不局限于具体理论,通常认为味觉细胞特异性GPCR是味觉传导途径的组分,可能参与甜味物质和/或其它味觉形式的味觉检测。
此外,通常认为T1R家族成员可能与其它T1R家族成员、其它味觉细胞特异性GPCR,或其组名结合发挥作用,由此产生化学感觉的味觉传导。例如,一般认为T1R1和T1R3在相同味觉受体细胞型中可能共同表达,两种受体可能物理上相互作用,形成一个异二聚体味觉受体。或者,T1R1和T1R3可能都单独与同一类型配体结合,而它们的共同结合可能会导致一种特异感知的味觉。
因为这些核酸是在味觉细胞中特异表达的,这些核酸为鉴定味觉细胞提供了有价值的探针。例如,T1R多肽和蛋白质的探针可用于鉴定存在于叶状、轮廓和菌状乳头的味觉细胞,以及存在于geschmackstreifen、口腔、胃肠道上皮和会厌的味觉细胞。它们同样可以作为制作味觉拓扑图的工具,用来阐明舌味觉细胞和味觉感受神经元(通向脑味觉中枢)之间的关系。特别是检测T1R的方法可用于鉴定对甜味或其它特定味觉形式味觉元敏感的味觉细胞。而且,该核酸和其编码的蛋白质可以作为研究味觉诱导的行为的探针。同样,编码人类T1R的基因在染色体上的定位可用于由T1R家族成员引起的和与之关联的疾病、突变和性状的鉴定。
本发明的编码T1R蛋白质和多肽的核酸可以依据WO 00/035374公开的方法,从多种来源经遗传工程、扩增、合成、和/或重组表达方法分离。该专利申请在此全文引用作为参考。
本发明也提供筛选这些新型味觉细胞特异性GPCR调节子(如活化子(activator)、抑制子(inhibitor)、刺激子(stimulator)、增强子、激动剂和拮抗剂等)的方法。这些味觉传导调节子对于味觉信号发生途径的药理、化学、和遗传调节等十分有用。这些筛选方法可用于鉴定味觉细胞活性的高亲和力激动剂和拮抗剂。这些调节化合物然后能用于食品和药物工业来定制味道,例如调节食品和药品的甜味。
因此,本发明提供检测和鉴定味道调节的验定法,其中T1R家族成员作为调节子对味觉传导影响的直接或间接报告分子。例如GPCR可用于例如在体内、体外和离体(ex vivo)测量配体结合、离子浓度、膜电位、电流、离子流量、转录、信号传导、受体配体相互作用、第二信使浓度等变化的试验中。在一个实施方案中,T1R家族成员可以通过与第二报告分子如绿色荧光蛋白质结合而作为间接报告子(reporter)(例如参见,Mistili & Spector,Nature Biotechnology,15:961-964(1997))。在另一个实施方案中,T1R家族成员可以在细胞中重组表达,并且通过GPCR活性对味觉传导的调节,可以通过测量钙离子水平和其它细胞内信息如cAMP、cGMP或IP3的变化来进行分析。
在某些实施方案中,T1R多肽的结构域,例如细胞外、跨膜或细胞内结构域,与异源多肽融合,从而形成嵌合多肽,例如具有GPCR活性的嵌合多肽。该嵌合多肽十分有用,例如可用于鉴定T1R多肽的配体、激动剂、拮抗剂或其它调节子的试验中。另外,该嵌合多肽还可用于产生具有新的配体结合专一性、调节模式、信号传导途径或其它此类性质的新型味觉受体,或用于产生具有新的配体结合专一性、调节模式、信号传导途径等的组合特性的新型味觉受体。
在一个实施方案中,T1R多肽在真核细胞内表达,与促进质膜运输、或成熟并定向通过分泌途径异源、伴侣序列一起表达为一个嵌合受体。任选的异源序列可以是一个视紫红质序列,例如视紫红质N末端片段。这种嵌合T1R受体可以在任何真核细胞如HEK-293细胞中表达。优选地,这些细胞包含G蛋白,例如Gα15或Gα16或其它形式的混栖G蛋白,这些蛋白能够使广泛的化学感受GPCR与细胞内信号发生途径配对或与信号蛋白如磷脂酶C配对。可以用任何标准方法检测这些细胞中的嵌合受体的活化,例如通过检测细胞中FURA-2依赖的荧光来检测细胞内钙的变化。如果优选的宿主细胞不表达合适的G蛋白,它们可以用编码混栖G蛋白的基因(例如美国专利申请号US 60/243,770中所描述的)转染。该专利申请在此全文引用作为参考。
分析味觉传导调节子的方法包括体外配体结合试验,其中使用:T1R多肽,其部分,即细胞外结构域、跨膜区或其组合、或包含一种或多种T1R家族成员结构域的嵌合蛋白;表达T1R多肽、片段或融合蛋白质的卵母细胞或组织培养细胞;T1R家族成员的磷酸化和去磷酸化;结合到GPCR上的G蛋白;配体结合试验;电压、膜电位和电阻变化;离子流量试验;细胞内第二信使如cGMP、cAMP和三磷酸肌醇的变化;细胞内钙水平的变化;神经递质释放。
此外,本发明提供检测T1R核酸和蛋白质表达的方法,用来进行味觉传导调节和味觉受体细胞的特异性鉴定的研究。T1R家族成员也提供亲子和法医鉴定有用的核酸探针。T1R基因也可作为用以鉴定味觉受体细胞,如叶状、菌状、轮廓、geschmackstreifen和会厌味觉受体细胞的有用的核酸探针。T1R受体也可用于制备鉴定味觉受体细胞的单克隆和多克隆抗体。可以使用如下技术如mRNA反转录和扩增、总RNA或多聚A+RNA的提取、Nothern印迹、点印迹、原位杂交、RNA酶保护、S1消化、探明DNA微芯片阵列、Western印迹等技术鉴定味觉受体细胞。
从功能上讲,T1R多肽包含一个涉及7种跨膜G蛋白耦联受体的家族,其被认为参与味觉传导,可能与G蛋白相互作用以介导味觉信号传导(例如参见,Fong,Cell Signal,8:217(1996);Baldwin,Curr.Opin.CellBiol.,6:180(1994))。从结构上来说,T1R家族成员核苷酸序列可能编码相关多肽,其包含一个细胞外结构域、7个跨膜域和一个胞质结构域。来自其它物种的相关T1R家族基因与SEQ ID NO:1,2,3,9,11,13,15,16,20,或其保守性修饰的变体中至少有50核苷酸长度,可选地100、200、500或更多核苷酸长度的区域,至少有50%,可选地60%、70%、80%或90%核苷酸序列相同,或编码多肽与SEQ ID NO:4,10,12,14,17,或其保守性修饰的变体中的至少约25个氨基酸,任选地50到100氨基酸的区域,至少大约35到50%,可选地60%、70%、80%或90%氨基酸序列相同。
已经鉴定了T1R家族成员特征性的几个共有氨基酸序列或结构域。例如,T1R家族成员通常包括与T1R共有序列1和2(分别为SEQ ID NO 18和19)至少有50%,可选地55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95-99%或更高的一致性的序列。通过同一性、特异杂交或扩增、或与针对结构域产生的抗体的特异结合,这些保守的结构域因而可用于鉴定T1R家族的成员。这些T1R共有序列具有下列氨基酸序列:
T1R家族共有序列1:(SEQ ID NO:18)
(TR)C(FL)(RQP)R(RT)(SPV)(VERKT)FL(AE)(WL)(RHG)E
T1R家族共有序列2:(SEQ ID NO:19)
(LQ)P(EGT)(NRC)YN(RE)A(RK)(CGF)(VLI)T(FL)(AS)(ML)
这些共有序列包含此处所述的T1R多肽中发现的序列,但是其它生物体T1R家族成员可能期望包含与在此特别描述的共有序列75%或更高一致性的共有序列。
T1R核苷酸和氨基酸序列的特异区可能用于鉴定多态变体、种间同源体和T1R家族成员等位基因。这些鉴定可以体外进行,例如在严谨杂交条件或PCR(例如,使用编码T1R的上述共有序列的引物),或通过在一个计算机系统中使用这些序列信息用以和其它核苷酸序列进行比较。单一物种群内T1R基因的不同等位基因也可用于确定等位基因序列差异是否与种群不同成员之间味觉感知差异相关。典型PCR形式的扩增和克隆技术对于分离直向进化同源物(ortholog)十分有益,例如简并引物能有效地检测跨物种的相关基因,但是通常比同一个物种内T1R家族的共生同源成员具有更高水平的相关一致性。
例如,简并引物SAP077(SEQ ID NO:5)和SAP0079(SEQ ID NO:6)可以用于从不同哺乳动物基因组中扩增和克隆T1R3基因。相反,单一物种内与T1R3相关的基因最好使用序列模式识别软件来寻找相关序列。通常,可以通过比较一个大约25个氨基酸或更多,如50-100个氨基酸的氨基酸序列来实施T1R家族成员多态变体和等位基因的鉴定。氨基酸相同性大约至少35-50%,和可选地60%、70%、75%、80%、85%、90%、95-99%或更高通常表明蛋白质是T1R家族成员的多态变体、种间同源体或等位基因。序列比较可以由下述任何一种序列比较算法实现。特异性结合T1R多肽或其保守区的抗体也可用于鉴定等位基因、种间同源体和多态变体。
T1R基因的多态变体、种间同源体和等位基因可通过检验推定T1R多肽的味觉细胞特异性表达来确认。通常,拥有在此公开的氨基酸序列的T1R多肽可作为与推定的T1R多肽比较的阳性对照,以证明T1R家族成员的多态变体或等位基因的鉴定。多态变体、等位基因和种间同源体预计保留有G蛋白耦联受体的7个跨膜结构。更详细内容参见WO 00/06592,其中公开了相关的T1R家族成员,GPCR-B3,该专利申请在此引用作为参考。GPCR-B3受体在此处称为rT1R1和mT1R1。另外参见WO 00/06593,其中也公开了相关的T1R家族成员GPCR-B4,该专利申请在此引用作为参考。GPCR-B4受体在此处称为rT1R2和mT1R2。
T1R家族成员的核苷酸和氨基酸序列信息还可以用来在计算机系统中构建味觉细胞特异性多肽模型。这些模型然后可用于鉴定可激活或抑制T1R受体蛋白质的化合物。然后这些调节T1R家族成员活性的化合物可用于研究T1R基因和受体在味觉传导中的作用。
本发明同样提供分析方法,特别是高通量分析方法,用来鉴定与T1R多肽相互作用和/或调节T1R多肽的分子。在众多方法中,使用了独特的T1R家族成员的结构域,例如细胞外、跨膜、或细胞内结构域或区。在众多的实施方案中,细胞外结构域、跨膜区或其组合可以结合固体基质,并用来例如分离配体、激动剂、拮抗剂、或其它能够结合T1R多肽和/或调节T1R多肽活性的分子。
本发明的另一个方面是提供新的定义为hT1R3的人类T1R家族GPCR基因。该hT1R3基因从包括GenBank的HTGS部的人类基因组序列数据库中鉴定出来。hT1R3的核苷酸序列和概念性翻译的氨基酸序列见SEQ IDNO1-4。由于它与候选大鼠味觉受体rT1R1(数据库登录号AL127389)序列相似,因而将hT1R3受体从部分测序的BAC基因组克隆RP5-89003(数据库登录号AL139287)中确定出来。作为参考,预测的hT1R3和rT1R1蛋白序列配对相同性大约为34%。与GPCR C家族(包括钙敏感性受体、推定的V2R信息素受体、GABA-B受体、鱼味觉受体和代谢趋向性谷氨酸受体)的另外成员序列比较显示,hT1R3很可能属于T1R1和另一大鼠候选味觉受体(rT1R2,登录号AF127390)定义的C家族亚组。
本发明也提供称为rT1R1的大鼠味觉受体的称为hT1R1的人类直向进化同源物。rT1R1和hT1R1的基因产物大约有74%的一致性。小鼠基因mT1R1已经有报道,参加Hoon等,Cell,96:541-551(2000),并且绘制在与含有hT1R1的间隔区同源的染色体间隔上。hT1R1核苷酸和概念性翻译的序列在此分别被描述为SEQ.ID NOS 15和16。
不局限于任何理论,因为mT1R3与Sac位点(位于4号染色体远端能够影响甜味味觉)的连锁,预计受体T1R家族参与了甜味味觉传导。也有报道认为人T1R3定位于1p36.2-1p36.33,这个区表现出与小鼠含有Sac和T1R1的间隔区有保守同线性(conserved synteny)。但是,T1R类型受体可能介导其它味觉形式,如苦、鲜、酸和咸等。
预想到的各种保守性突变和替换都在本发明范围内。例如,利用已知的包括PCR、基因克隆、cDNA定点突变、宿主细胞转染和体外转录的重组基因技术方法进行氨基酸替换都将在本领域技术人员的水平之内。由此可以筛选到具有味觉细胞特异性GPCR功能活性的变体。
A.T1R多肽的鉴定和特性表征
本发明T1R蛋白和多肽的氨基酸序列可以通过编码核酸序列的推定翻译得到鉴定。这些多种多样的氨基酸序列和编码核酸序列可以按照许多方法互相比较或与其它序列比较。
例如在序列比较中,通常一条序列作为参考序列,与另外的试验序列进行比较。当使用序列比较算法时,将试验和参考序列输入计算机,必要时指定亚序列坐标,并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数,如下面就BLASTN和BLASTP程序所述,或指定替代参数。序列比较算法然后根据程序参数计算试验序列相对于参考序列的百分序列相同性。
此处所用的“比较窗口”包括参考任何毗邻位置数的区段,(选自20到600,通常大约50到大约200,更经常是大约100到大约150),其中经过两个序列优化比对后,可以将序列与相同号码的邻近位置的参考序列比较。
计算序列的排列方法在本领域已经广为人知。可以例如通过Smith &Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源算法,通过Needleman & Wunsch,J Mol.Biol.48:443(1970)的同源比对算法,通过Pearson & Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)相似搜寻方法,通过这些算法的计算机化实施方案(GAP,BESTFIT,FASTA,和TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package,GeneticsComputer Group,575 Science,Dr.,Madison,WI),或通过手工比对和肉眼观察(例如参见,Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等,eds.1995增刊))的方法进行比较序列的优化比对。
适于确定序列同源性和序列相似性百分比的算法优选的实施例是BLAST和BLAST2.0算法,其分别由Altschul等,Nuc.Acids Res.25:3389-3402(1977)和Altschul等,J Mol.Biol.,215:403-410(1990)描述。执行BLAST分析的软件已经可以从国家生物工程信息中心(NatinalCenter for Biotechnology Information)公开(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/)得到。该算法包括首先通过确定查询序列W长度中的短字来确定高分序列对(HSPs),当与数据库中一个序列的相同长度的字比对时,其或是匹配或是符合一些阳性值阈值分数T。T是指邻近字分数阈值(Altschul等,Nuc.Acids Res.25:3389-3402(1977)和ltschul等,JMol.Biol.,215:403-410(1990))。这些初始的邻近字值(word hit)作为种子,以启动搜索去寻找包含它们的更长的HSPs。沿着序列向两边延伸该字值,直到累积比对分数能被增加。对于核苷酸序列,用参数M(一对匹配残基的奖励分数;总是>0)和N(错配残基的惩罚分数;总是<0)来计算累积分数。对于氨基酸序列,使用计分矩阵来计算累积分数。字值向每个方向的延伸当出现下列情形即停止:累积比对分数X量从其最大获得值下降;由于一种或多种负分数残基比对结果导致累积分数变为0或以下;或到达了序列任一末端。BLAST算法参数W,T和X决定比对的敏感性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用的默认值为字长(W)为11,预期值(E)为10,M=5,N=-4以两条链的比较。对于氨基酸序列,BLASTP程序使用的默认值为字长为3,预期值(E)为10,而BLOSUM62计分矩阵(参见Henikoff & Henikoff,Proc.Natl.Acad Sci.USA 89:10915(1989))比对(B)为50,预期值(E)为10,M=5,N=-4和两条链的比较。
另一个有益的算法实施例是PILEUP。PILEUP从一组相关序列中产生多重序列比对结果,它使用渐进的、配对比对方式来显示关系和序列同源性百分比。它也能画出一个所谓的“树”或“树状图”来显示聚类关系用以产生比对(例如参见图2)。PILEUP使用一个简化了的Feng &Doolittle的渐进式比对方法(J Mol.Evol.35:351-360(1987))。该方法与Higgins & Sharp,CABIOS 5:151-153(1989)描述的方法相似。该程序可以比对多达300条序列,每条的最大允许长度为5000个核苷酸或氨基酸。多重比对程序由两条最相似序列的配对比对开始,产生两条比对序列的簇(cluster)。该簇然后与下一个最相关序列或比对序列的簇比对。通过两条单独序列配对比对的简单延伸,两个簇序列就被比对了。通过一系列渐进式、配对比对,完成最后的比对。通过指定序列比较区的特异序列和它们的氨基酸或核苷酸坐标以及程序参数后,运行程序。使用PILEUP,将参考序列与其它试验序列比较,使用如下参数来确定百分序列同一关系,:默认缺口加权(3.00),默认缺口长度加权(0.10)和末端缺口加权。PILEUP可以从GCG序列分析软件包中获得,例如版本7.0(Devereaux等,Nuc.Acids Res.12:387-395(1984))。编码基因的蛋白质序列可以由相应的开放阅读框架概念性地翻译而得到。使用BLASTP算法将这些蛋白质序列与公开数据库中所有已知的蛋白质比较,显示它们与T1R家族成员有很高的同源性,每一个T1R家族与至少一种已知的家族成员有至少大约35到50%,优选地至少55%、至少60%、至少65%和最优选70%的氨基酸同源性。
B.定义
除非另有所指,此处使用的下列术语各自具有描述给它们的意义。
“味觉细胞”包括神经上皮细胞,其成组后形成舌的味蕾,例如叶状、菌状和轮廓细胞(例如参见,Roper等,Ann.Rev.Neurosci.12:329-353(1989))。味觉细胞同样也见于颚和其它组织,如食管和胃。
“T1R”指G蛋白耦联受体家族中的一种或多种成员,这些受体在诸如叶状、菌状和轮廓细胞,以及上颚和食管的细胞中表达(例如参见,Hoon等,Cell,96:541-551(1999),在此全文引用以作参考)。该家族成员在WO 00/06592中也称为GPCR-B3和TR1,在WO 00/06593中也称为GPCR-B4和TR2。GPCR-B3在此同样称为rT1R1,GPCR-B4也被称作rT1R2。味觉受体细胞也可以通过形态学(例如参见,Roper,Supra)来鉴定,或通过味觉细胞特异性表达蛋白的表达来鉴定。T1R家族成员可能具有作为甜味味觉传导受体的能力,或辨别其它不同味觉形式的能力。
“T1R”核酸编码拥有7个跨膜区的GPCR家族,其具有G蛋白耦联受体活性,例如在一些酶如磷脂酶C和腺苷酸环化酶(关于GPCR结构和功能的描述,参见例如,Fong,Supra,和Baldwin,Supra)的刺激下,它们可以响应外界刺激而与G蛋白结合并促进产生第二信使如IP3、cAMP、cGMP和钙离子。一个单独的味觉细胞可能包括多种截然不同的T1R多肽。
术语“T1R”家族因此是指具有以下特征的多态变体、等位基因、突变体和种间同源体:(1)与SEQ ID NO 4,10,12,14或17在一个大约25个氨基酸,可选地50-100个氨基酸的窗口上相比,具有至少大约35到50%氨基酸同一性,可选地大约60,75,80,85,90,95,96,97,98,或99%的氨基酸同一性;(2)特异性地结合针对某个免疫原(包含选自下列的氨基酸序列,SEQ ID NO:4,10,12,14,17和其保守性修饰的变体)产生的抗体;(3)由一条核酸分子编码,在严谨条件下该分子可以特异性地与选自SEQ ID NO:1,2,3,9,11,13,15,16,20和其保守性修饰变体的序列杂交(大小至少大约100,可选地至少大约500-1000个核苷酸);(4)包括与选自SEQ ID NO:4,10,12,14或17的氨基酸序列至少有大约35到50%同一性的序列;或(5)能被引物扩增,该引物在严谨杂交条件下可以与编码SEQ ID NO:7,8和其保守性修饰的变体的简并引物的相同序列进行杂交。
从拓扑结构上来说,某些化学感受GPCR具有“N端结构域”、“细胞外结构域”、包含7个跨膜区和相关胞浆、细胞外环的“跨膜结构域”;“胞浆结构域”和”C端结构域”(参见例如,Hoon等,Cell,96:541-551(1999);Buck & Axel,Cell,65:175-187(1991))。使用本领域技术人员已知的方法可以从结构上鉴定这些结构域,例如鉴定亲水和疏水结构域的序列分析程序(参见例如,Stryer,Biochemistry,(3rd ed.1988);另见任何一款基于因特网的序列分析程序,例如可以在dot.imgen.bcm.tmc.edu上可以找到的程序)。这些结构域对于制备嵌合蛋白和本发明的体外试验,例如配体结合试验十分有用。
“细胞外结构域”因而指从细胞膜向外突出并暴露到细胞外一边的T1R多肽的结构域。这些结构域一般包括暴露到细胞的细胞外一边的“N端结构域”,可选地可能包括暴露到细胞的细胞外一边的跨膜结构域的细胞外环部分,即跨膜区2和3之间、跨膜区4和5之间、跨膜区6和7之间的环。
“N端结构域”区起始于N末端并延伸至靠近跨膜结构域起始部位的区域。更具体而言,在本发明的一个实施例中,该结构域起始于N末端,并大约结束于大约位于563±20个氨基酸位置处的保守性谷氨酸。SEQ ID40的1-580氨基酸相应区是细胞外结构域的一个特别的实施例,它稍微延伸进跨膜结构域内部。这些细胞外结构域对于体外可溶性和固相配体结合试验十分有益。另外,下面描述的跨膜区,与细胞外结构域组合同样也能够结合配体,因而对于体外配体结合试验十分有用。
“跨膜结构域”包括7个“跨膜区”,是指位于胞浆膜内的T1R多肽的结构域,并同样可能包括相应的胞浆(细胞内)和细胞外环。在一个实施例中,该区对应于T1R家族成员大约起始于位于大约563±20氨基酸处的位置处的保守谷氨酸残基、结束于位于大约812±10氨基酸的位置处的保守酪氨酸残基的结构域。使用由Kyte & Doolittle,J.Mol.Biol.,157:105-32(1982),或Stryer,Supra描述的标准方法,可以对7个跨膜区和细胞外和胞浆环进行鉴定。
“胞浆结构域”是指朝向细胞内部的T1R多肽的结构域,例如“C端结构域”和跨膜结构域的细胞内环,例如跨膜区1和2之间、跨膜区3和4之间、跨膜区5和6之间的细胞内环。“C端结构域”是指跨越最后一个跨膜结构域末端和蛋白质的C末端的区域,通常位于细胞胞浆内。在一个实施例中,该区起始于位于大约812±10氨基酸的位置处的保守酪氨酸残基,并继续至多肽的C末端。
术语“配体结合区”或“配体结合结构域”是指从化学感受受体特别是味觉受体衍生出的序列,它基本上包含至少是受体的细胞外结构域。在一个实施例中,配体结合区的细胞外结构域可能包含N端结构域和,可选地,跨膜结构域的一部分,例如跨膜结构域的细胞外环。配体结合区可能能够结合配体,特别是味觉元。
在测试能够调节T1R家族成员介导的味觉传导的化合物的试验中,短语“功能性效果”包括确定任何一个间接或直接受受体影响的参数,例如功能性、物理和化学效果。它包括体内、体外和离体(ex vivo)配体结合、离子流量、膜电位、电流、转录、G蛋白结合、GPCR磷酸化或去磷酸化、信号传导、受体配体相互作用、第二信使浓度(如cAMP、cGMP、IP3,或细胞内钙离子浓度),还包括其它生理学效果例如神经递质或激素释放的增加或减少等。
试验中的“确定功能性效果”是指检验使直接或间接受T1R家族成员影响的参数增加或减少的化合物,例如功能性、物理和化学效果。这些功能性效果可用本领域技术人员已知的手段进行测量,例如光谱特征(例如荧光,吸收,折射率)、流体动力学(如形状)、色谱的或溶解性、膜片钳试验(patch clamping)、电压敏感性染料、全细胞电流、放射性同位素流出、可诱导标志物、卵母细胞TIR基因表达的变化;组织培养细胞T1R表达;T1R基因的转录活化;配体结合试验;电压、膜电位和电导变化;离子流量试验、细胞内第二信使如cAMP、cGMP和三磷酸肌醇(IP3)的变化;细胞内钙水平的变化;神经递质释放等。
T1R基因或蛋白质的“抑制子”、“激活子”和“调节子”可交替使用,是指利用体内、体外味觉传导试验鉴定的抑制性、激活性和调节性的分子,例如配体、激动剂、拮抗剂和它们的同源物和模拟物。例如抑制子是指例如能够与味觉信号传导结合,部分或完全阻断刺激、降低、防止、延迟活化,失活、脱敏或负向调节味觉传导的化合物,如拮抗剂。激活子是指例如能够与味觉信号传导结合,刺激、增加、打开、活化、促进、增强活性、增敏或正向调节味觉传导的化合物,如激动剂。调节子包括例如能够改变受体与以下物质相互作用的化合物:能够结合激活子或抑制子的细胞外蛋白质(例如ebnerin和其它疏水载体家族成员);G蛋白;激酶(例如参与受体去活化和脱敏的视紫红质激酶和β肾上腺素能受体激酶类似物);和同样能够使受体去活化和脱敏的拘捕素(arrestin)。调节子可包括遗传修饰的T1R家族成员,例如活性改变的以及天然产生的和合成的配体、拮抗剂、激动剂、小化学分子等。这些抑制子和激活子的试验包括,例如,在细胞或细胞膜内表达T1R家族成员,在有或无味觉元如甜味味觉元的情况下,应用推测的调节子化合物,然后确定对上述味觉传导的功能性影响。包含T1R家族成员的样品或试验经过潜在的激活子、抑制子或调节子处理后与不用抑制子、激活子或调节子的对照样品比较,检验调节的程度。对照样品(未经调节子处理)指定为100%的相对T1R活性值。当T1R活性值相对于对照大约有80%活性,可选地50%或25-0%时,就判定获得了对T1R的抑制。当T1R活性值相对于对照有110%活性,可选地150%、可选地200-500%或1000-3000%或更高时,就判定获得了对T1R的活化。
此处所用术语“纯化的”、“基本纯化的”和“分离的”是指不含其它不同化合物的状态(这些不同化合物与本发明化合物在自然状态下是结合在一起的),从而以给定样品的重量计,“纯化的”、“基本纯化的”和“分离的”物质至少包含样品的0.5%、1%、5%、10%或20%,和最优选地至少50%或70%的质量。在一个优选的实施方案中,这些术语用来指(以重量计)至少包含指定的样品95%的质量的本发明化合物。当涉及核酸或蛋白质时,此处所用术语“纯化的”、“基本纯化的”和“分离的”核酸和蛋白质是指一种纯化状态或浓度(不同于哺乳动物体特别是人体内天然产生的状态或浓度)。大于哺乳动物体特别是人体内天然状态和浓度任何程度的纯化或浓度,包括(1)从其它相关结构或化合物中纯化或(2)与非哺乳动物体特别是人体正常相关的结构和化合物结合,均属于“分离的”定义范畴。此处描述的核酸或蛋白质或核酸或蛋白质种类可根据本领域技术人员已知的多种方法和过程分离,或与自然状态下无关联的结构和化合物相连。
当涉及核酸或多肽时,此处所用术语“分离的”是指一种纯化状态或浓度,其不同于哺乳动物体特别是人体内天然产生的状态或浓度。大于机体内天然产生的状态和浓度任何程度的纯化和浓度,包括(1)从其它天然产生的相关结构或化合物纯化或(2)与机体内非正常关联的结构和化合物结合均属于此处所用“分离的”定义范畴。此处描述的核酸或多肽可根据本领域已知的多种方法和过程分离或与自然状态无正常关联的结构和化合物结合。
此处所用术语“扩增”是指如下详述的为产生或检测重组子或天然表达的核酸的任何合适的扩增方法学的应用。例如,本发明提供方法和试剂(例如,特异性简并寡核苷酸引物对),用于体内或体外扩增(例如,通过聚合酶链反应PCR)本发明的(例如,本发明的味觉元结合序列)天然表达的(例如,基因组或mRNA)或重组子(例如,cDNA)核酸。
术语“7-跨膜受体”指属于跨膜蛋白超家族的多肽,其拥有7个结构域,横穿胞浆膜7次(因此,这7个结构域被称作“跨膜”或“TM”结构域TM I至TM VII)。嗅觉家族和某些味觉受体均属于这个超家族。7-跨膜受体多肽具有相似和特征性的一级、二级和三级结构,下面将会详细介绍。
术语“文库”指含有不同核酸或多肽分子的混合制剂,例如重组产生的化学感受文库,特别是由简并引物对扩增核酸产生的味觉受体配体结合结构域,或分离的含有扩增的配体结合结构域的载体集合,或每个细胞都随机转染了至少一个编码味觉受体的载体的细胞混合物。
术语“核酸”或“核酸序列”指或者是单链或者是双链形式的脱氧核糖核酸或核糖核酸寡核苷酸。该术语包括核酸,即含有天然核苷酸已知类似物的寡核苷酸。该术语还包括有合成主链的核酸样结构(参见例如,Oligonucleotides and Analogues,a Practical Approach,ed.F.Eckstein,Oxford Univ.Press(1991);Antisense Strategies,Annalsof the N.Y.Academy of Sciences,Vol.600,Eds.Baserga等.(NYAS1992);Milligan,J.Med.Chem.36:1923-1937(1993);AntisenseResearch and Applications(1993,CRC Press),WO 97/03211;WO96/39154;Mata,Toxicol.Appl.Pharmacol.144:189-197(1997);Strauss-Soukup,Biochemistry 36:8692-8698(1997);Samstag,Antisense Nucleic Acid Drug Dev,6:153-156(1996))。
除非另有所指,特定的核酸序列也暗指其保守性修饰的变体(例如,简并密码子替换)和互补序列,以及清楚指出的序列。特别是,简并密码子替换可以通过产生其中一种或多种定密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基替代的序列来实现(Batzer等,Nucleic Acid Res.,19:5081(1991);Ohtsuka等,J.Biol.Chem.,260:2605-2608(1985);Rossolini等,Mol.Cell.Probes,8:91-98(1994))。术语核酸可与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸(polynucleotide)交替使用。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”此处可交替使用,是指氨基酸残基多聚物。本术语适用于序列中一种或多种氨基酸残基是相应天然产生氨基酸的人工化学类似物的氨基酸多聚物,以及天然产生的氨基酸多聚物和非天然产生的氨基酸多聚物。
术语“胞浆膜转位结构(plasma membrane translocation domain)域”或简称“转位结构域”指掺入到多肽编码序列的氨基端时能够有效地把杂合(“融合”)蛋白“伴随(chaperone)”或“转位”至胞浆膜的多肽结构域。例如,“转位结构域”可以从牛视紫红质受体多肽,一个7跨膜受体的氨基端衍生出来。但是,可以使用任何哺乳动物的视紫红质,以及其它转位促进序列。因此,转位结构域在转位7跨膜融合蛋白至胞浆膜时非常有效,并且包含氨基端转位结构域的蛋白质(例如味觉受体多肽)比没有该结构域的蛋白质更容易有效地运输至胞浆膜上。但是,如果多肽N端结构域在结合中具有活性,应当优选其它的转位结构域。
此处描述的“转位结构域”、“配体结合结构域”和嵌合受体组分也包括具有与示例序列基本一致的结构和活性的“类似物(analogs)”或“保守性变体”和“模拟物”(“肽模拟物”)。因此,术语“保守性变体”或“类似物”或“模拟物”指具有修饰过的氨基酸序列的多肽,这类修饰基本上不影响多肽的(保守性变体的)在此描述的结构和/或活性。这包括氨基酸序列的保守性修饰变异,即替换、增加或缺失对于蛋白质活性无关紧要的氨基酸残基,或使用相似属性的残基进行氨基酸替换(例如酸性、碱性、正电、负电、极性或非极性等),以至于甚至替换关键的氨基酸也基本上不影响结构和/或活性。
更具体而言,“保守性修饰变体”对氨基酸和核酸序列都适用。至于特定核酸序列,保守性修饰变体是指编码同样或基本同样氨基酸序列的核酸,或当核酸并不编码氨基酸序列时,是指与它基本相同的序列。由于遗传密码子的简并性,大量功能性相同的核酸分子编码任意特定的蛋白质。
例如,密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码丙氨酸。因此,在由密码子决定的丙氨酸每一个位置,密码子可以改变为由所述的任何不改变编码多肽的密码子。
这些核酸变异是“沉默变异”,是一种保守性修饰的变异。此处的每一条编码多肽的核酸序列也描述了该核酸的每一个可能的沉默变异。本领域技术人员可以判断核酸中的每个密码子(除了通常情况下是甲硫氨酸的唯一密码子的AUG,和通常情况下是色氨酸的唯一密码子的TGG之外)都可以被修饰而产生功能完全相同的分子。因此,编码多肽的核酸的每一个沉默变异隐含在每个描述的序列中。
能够提供功能相似的氨基酸的保守性替换表在本领域众所周知。例如,一个选择保守性替换的示例性指南包括(原始残基,其后是示例替换):ala/gly或ser;arg/lys;asn/gln或his;asp/glu;cys/ser;gln/asn;gly/asp;gly/ala或pro;his/asn或gln;ile/leu或val;leu/ile或val;lys/arg或gln或glu;met/leu或tyr或ile;phe/met或leu或tyr;ser/thr;thr/ser;trp/tyr;tyr/trp或phe;val/ile或leu。另一示例指南使用下列六组,每组包含保守性互相替换的氨基酸:1)丙氨酸(A),丝氨酸(S),苏氨酸(T);2)天冬氨酸(D),谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N),谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R),赖氨酸(I);5)异亮氨酸(I),亮氨酸(L),甲硫氨酸(M),缬氨酸(V);和6)苯丙氨酸(F),酪氨酸(Y),色氨酸(W);(参见例如,Creighton,Proteins,W.H.Freeman和Company(1984);Schultz和Schimer,Principles of ProteinStructure,Springer-Vrlag(1979))。本领域的技术人员会理解上述确定的替换并不是唯一的可能保守性替换。例如,出于某种原因,人们可能将所有带电的氨基酸互为保守性替换体,不管它们是正电还是负电。另外,在编码序列中的个别替换、缺失或增加从而导致变化、增加或缺失单一氨基酸或小部分氨基酸同样也被认为是“保守性修饰变异”。
术语“模拟物”和“肽模拟物”指合成的化学化合物,它具有本发明受体的基本上同样结构和/或功能特征,例如转位结构域、配体结合结构域或嵌合受体。模拟物既可以是完全由化学合成的非天然氨基酸类似物组成,或是部分天然肽氨基酸和部分非天然氨基酸类似物的嵌合分子。该模拟物同样可以具有任意量的天然氨基酸保守性替换,只要这种替换也同样基本上不改变模拟物的结构和/或活性即可。
对于本发明中属于保守性变体的多肽,常规试验将确定模拟物是否属于本发明的范围,即它的结构和/或活性基本上没有被改变。多肽模拟物组分可包括任何非天然结构组分的组合,其通常来源于三个结构基团:a)非天然酰胺键(“肽键”)的残基连接基团;b)非天然残基替代天然产生的氨基酸残基;或c)可诱导二级结构模仿的残基,即能够诱导或稳定二级结构例如β转角、γ转角、β折叠片和α螺旋构象等的残基。当多肽的所有残基或一些残基是通过化学手段而非天然肽键连接的时,该多肽就可以被鉴定为模拟物。单独的肽模似物残基可以通过肽键、其它的化学键或耦联手段连接,诸如戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯、双功能马来酰亚胺、N,N’-双环己基碳二酰亚胺(DCC)或N,N’-二异丙基基碳二酰亚胺(DIC)。可以成为传统酰胺键(“肽键”)的替代物的连接基团包括,例如酮亚甲基(例如-C(=O)-CH2-替换-C(=O)-NH-)、氨甲基(CH2-NH)、乙烯基、烯烃基(CH=CH)、醚(CH2-O)、硫醚(CH2-S)、四唑、噻唑、retroamide、硫代酰胺或酯(参见例如,Spatola,Chemistry and Biochemistry ofAmino Acids,Peptides and Proteins,Vol.7,pp267-357,“PeptideBackbone Modifications,”Marcell Dekker,NY(1983))。包含所有或部分非天然残基替代天然产生氨基酸残基的多肽也可以被鉴定为模拟物;非天然残基在科学和专利文献中有详尽描述。
“标记”或”可检测的部分”是可以被光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测到的组分。例如有用标记包含32P、荧光素、电子致密试剂、酶(例如通常用于ELISA)、生物素、地高辛、或半抗原和可被检测(例如通过在肽中掺入放射标记)或用来检测可特异性与肽反应的抗体的蛋白质。
“标记的核酸探针或寡核苷酸”是指一个或者是通过接头或是化学键而共价结合,或者是通过离子、范德华力、静电、或氢键等非共价结合而结合了标记的核酸或寡核苷酸,这样通过检测探针上结合的标记就可以检测探针的存在。
此处所用的“核酸探针或寡核苷酸”被定义为能通过一种或多种形式的化学键结合到互补序列的靶核酸上的核酸(一般是通过氢键形成的互补碱基配对来实现)。此处所指的探针可以包括天然的(即A、G、C或T)或修饰碱基(7-脱氮鸟苷酸,次黄嘌呤等)。另外,探针中的碱基可以由非磷酸二酯键的连键连接,只要它不影响杂交即可。因此,例如,探针可以是其组成碱基由肽键连接而非磷酸二酯键连接的肽核酸。本领域的技术人员应当理解,根据杂交条件的严谨性,探针可以结合不完全与之互补的靶序列。探针任选地直接标记同位素、发色物质、荧光物质、色原体,或间接标记如可被链霉亲和素复合物结合的生物素。通过分析探针的有无,人们可以检测选择序列或亚序列的有无。
当针对核酸的一部分使用术语“异源的”时,是指该核酸包含两个或更多在天然状态下互相没有相同关系的亚序列。例如,核酸通常是重组产生的,具有两个或更多非相关基因序列重组在一起形成一个新的功能性核酸分子,例如,一个来源的启动子和另一个来源的编码区。同样,异源蛋白质指该蛋白包含两个或多个在天然状态下不以相同相互关系存在的亚序列(例如,融合蛋白质)。
“启动子”是核酸序列阵列,其能指导核酸转录,此处所用的启动子包括在转录起始位置附近的必要的核酸序列,例如在聚合酶II型启动子情形中的TATA元件。启动子可选地包括远端增强子或阻遏子元件,其可能位于离转录起始位点多达几千个碱基对的地方。“组成性”启动子是在大多数环境和发育条件下都具有活性的启动子。“可诱导”启动子是在环境或发育调节下具有活性的启动子。术语“可操作性连接”是指核酸表达调控序列(例如启动子,或转录因子结合位点排列)和另一核酸序列之间的功能性连接,其中表达调控序列指导对应于第二序列的核酸转录。
此处所用的“重组”是指合成或其它体外操作的多核苷酸(例如,“重组多核苷酸”),以及使用重组多核苷酸在细胞或其它生物系统中产生基因产物的方法,或指由重组多聚核苷酸编码的多肽(“重组蛋白质”)。“重组手段”也包括将来源不同、具有不同编码区或结构域或启动子序列的核酸连接至一个表达盒或载体中用于表达,例如可诱导的或组成性表达包含本发明转运结构域和使用本发明的引物扩增的核酸序列的融合蛋白。
短语“选择性(或特异性)与……杂交”指在严谨杂交条件下,分子仅与特定的存在于复合混合物中(例如,总细胞或文库DNA或RNA)的核苷酸序列结合、形成双螺旋或杂交。
短语“严谨杂交条件”指在这样的条件下,探针仅与通常存在于核酸复合混合物中的靶序列杂交,而不与其它序列杂交。严谨条件是序列依赖性的并且在不同情况下会有所不同。长序列在高温下才具有杂交特异性。有关核酸杂交更详尽的指南参见Tijssen,Techniques inBiochemistry and Molecular Biology—Hybridization with NucleicProbes,“Overview of Principles of Hybridization and the Strategyof Nucleic Acid Assays”(1993)。通常,在特定的离子强度pH下,选择的严谨条件比特定序列的热溶解点(thermal melting point,Tm)低大约5-10℃。Tm是指达到平衡后(此时靶序列过剩,在Tm下,平衡条件下50%的探针被饱和)与靶序列互补的探针中有50%与靶序列发生杂交时的温度(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)。严谨条件意味着其中的盐浓度小于大约1.0M钠离子,通常大约0.01至1.0M钠离子(或其它盐)浓度、pH 7.0至8.3,对于短探针(例如10至50个核苷酸)温度至少大约30℃、对于长探针(例如大于50个核苷酸)温度至少大约60℃。加入一些破坏稳定的试剂如甲酰胺也可以形成严谨条件。为了选择性或特异性的杂交,阳性信号至少是背景值的两倍,可选地10倍于杂交背景值。示例严谨条件如下:50%甲酰胺、5×SSC和1% SDS,42℃温育,或者5×SSC和1% SDS,65℃温育,使用0.2×SSC和0.1% SDS在65℃下漂洗。这类杂交和漂洗步骤可以进行例如1,2,5,10,15,30,60分钟或更长时间。
如果核酸编码的多肽是基本相关的话,在严谨条件下互不杂交的核酸仍是基本上相关的。例如,利用遗传密码允许下最大密码子简并性产生核酸拷贝时就会发生这种情况。在这些情况下,核酸通常在中等严谨杂交条件下杂交。示例的“中等严谨杂交条件”包括在具有40%甲酰胺、1M NaCl、1% SDS缓冲液中,37℃下的杂交,使用1×SSC在45℃漂洗。这类杂交和漂洗步骤可以进行例如1,2,5,10,15,30,60分钟或更长时间。阳性杂交至少是背景值的两倍。本领域的普通技术人员应该很容易认识到其它杂交和漂洗条件可以用以提供相似严谨程度的条件。
“抗体”指包含免疫球蛋白基因或其片段的框架区域的多肽,其可特异性地与抗原结合和识别。已知的免疫球蛋白基因包括K、λ、α、γ、Δ、ε和μ恒定区基因,以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链被归类为κ或λ。重链归类为γ、μ、α、Δ和ε,它们因此分别确定了免疫球蛋白种类,即IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
示例的免疫球蛋白(抗体)结构单位包括四聚体(tetramer)。每个四聚体由两对等同的多肽链组成,每对多肽链具有一条“轻”链(大约25kDa)和一条“重”链(大约50-70kDa)。每条链N末端确定了一个大约100至110或更多个氨基酸的可变区,主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指的就是这些轻链和重链。
“嵌合抗体”是指一个抗体分子,其中(a)恒定区或其部分被改变、替换或交换,以至于抗原结合位点(可变区)与类别、效应物功能和/或种类不同或被改变的恒定区相连,或与能够赋予嵌合抗体以新的特性的完全不同的分子(例如酶、毒素、激素、生长因子和药物等)相连接;或(b)可变区或其部分被改变、替换或交换成具有不同或改变了抗原特异性的可变区。
“抗T1R抗体”是一种可以特异性结合T1R基因、cDNA或其亚序列编码的多肽的抗体或抗体片段。
术语“免疫试验”是使用抗体特异性结合抗原的试验。免疫试验的特征是使用特定抗体的特异性结合特性来分离、定向和/或量化抗原。
当涉及到蛋白质或肽时,短语与抗体“特异性(或选择性)结合”或“特异性(或选择性)与……发生免疫反应”是指结合反应,其可以在异源蛋白质和其它生物物质群中确定蛋白质的存在。因此,在指定的免疫试验条件下,指定抗体与特定蛋白质的结合至少是背景值的两倍,并且基本上不与样品中存在的其它蛋白质发生明显的结合。这些条件下与抗体的特异性结合可能要求针对其对某个特定蛋白质的特异性进行了选择的抗体。例如,可选择针对特定物种如大鼠、小鼠、或人T1R家族成员产生的多克隆抗体以获得那些仅与T1R多肽或其免疫原部分而非其它蛋白质(T1R多肽直向进化同源物或多态变体和等位基因除外)发生特异性免疫反应的多克隆抗体。这种选择过程可以通过去除与其它物种T1R分子或其它T1R分子有交叉反应的抗体来完成。也可以选择仅识别T1R GPCR家族成员而非其它家族GPCR的抗体。有多种免疫试验形式可以用于特异性与特定蛋白质发生免疫反应的抗体的选择。例如,固相ELISA免疫试验一般用来选择特异性与特定蛋白质发生免疫反应的抗体(例如参见,Harlow & Lane,Antibodies,A LaboratoryManual,(1988),其中有关可用于确定特异性免疫反应的免疫试验形式和条件的描述)。通常特异性或选择性反应至少是背景信号或噪声的两倍,更优选地大于背景10至100倍。
短语“与……选择性结合”指核酸与另外上述核酸“选择性杂交”的能力,或抗体与上述蛋白质“选择性结合”的能力。
术语“表达载体”指目的是在任何细胞,包括原核、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞中,体内或体外组成性或诱导表达本发明的核酸序列的任何重组表达系统。该术语包括线性或环状表达系统。该术语包括游离状态或整合至宿主细胞基因组中的表达系统。表达系统具有自我复制或不具有自我复制的能力,即在细胞内引发短暂的表达。该术语包括重组表达“盒”,其仅包括重组核酸转录所需的最小元件。
“宿主细胞”是指包含表达载体和支持表达载体复制或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌,或真核细胞如酵母、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞,如CHO、Hela和HEK-293及其它,例如培养的细胞、外植体(explants)和体内细胞等。
C.T1R多肽的分离和表达
本发明T1R或其片段或变体的分离和表达可如下所述完成。可使用PCR引物扩增编码味觉受体配体结合区域的核酸,可选地建立这些核酸的文库。使用单一表达载体或表达载体文库感染或转染宿主细胞,用来功能性表达这些核酸或文库。可在体内或体外表达这些基因和载体。本领域技术人员应知道,通过调节本发明载体内基因和核酸(例如,启动子、增强子等)的表达和活性,可以得到改变和控制核酸表达的理想表型。可以使用针对增加或降低表达或活性描述的任何已知方法。本发明的实践可以与本领域任何已知的方法或方案相结合,这些方法或方案在科学和专利文献中有详尽描述。
本发明的核酸序列和其它用于本发明实施的核酸分子,不管是RNA、cDNA、基因组DNA、载体、病毒或其杂合体,可以从多种来源分离、遗传工程化加工、扩增、和/或重组表达。可以使用任何一个重组表达系统,包括例如哺乳动物细胞、细菌、酵母、昆虫或植物系统。
另外,这些核酸分子可用已知的化学合成方法体外合成。例如以下描述的方法,Carruthers,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47:411-418(1982);Adams,Am.Chem.Soc.105:661(1983);Belousov,Nucleic Acids Res.25:3440-3444(1997);Frenkel,Free Radic.Biol.Med.19:373-380(1995);Blomers,Biochemistry 33:7886-7896(1994);Narang,Meth.Enzymol.68:90(1979);Brown,Meth.Enzymol.68:109(1979);Beaucage,Tetra.Lett.22:1859(1981);U.S.Patent No.4,458,066。然后或者通过合成互补链,并在适合条件下使之退火,或通过用合适的引物序列及用DNA聚合酶加入互补链的方法可以获得双链DNA片段。
核酸操作技术,例如产生序列突变、亚克隆、探针标记、测序、杂交等技术,在科学和专利文献中有详尽描述。参见例如,Sambrook,ed.,Molecular Cloning:a Laboratory Manual(2nd ed),Vols.1-3,ColdSpring Harbor laboratory(1989);Current Protocols in MolecularBiology,Ausubel,ed.Jon Wiley & Sons,Inc.,New York(1997);Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology:Hybridization with Nucleic Acid Probes,Part I,Theory and NucleicAcid Preparation,Tijssen,ed.Elsevier,N.Y.(1993)。
核酸、载体、衣壳(capsids)、多肽等可以通过任何一个本领域技术人员众所周知的方法来分析和定量。这些方法包括如分析生物化学方法例如NMR、光谱、放射、电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层层析(TLC)和超滤层析等,多种免疫学方法例如流体或胶沉淀素反应、免疫扩散、免疫电泳、放射免疫试验(RIAs)、酶联免疫吸附试验(ELISAs)、免疫荧光试验、Southern分析、Northern分析、点印迹分析、凝胶电泳(例如:SDS-PAGE)、RT-PCR、定量PCR、其它核酸或靶物质或信号扩增方法、放射标记、液体闪烁计数和亲和层析等。
寡核苷酸探针可以用来扩增编码味觉受体配体结合区域的核酸片段。此处描述的核酸同样可以利用扩增技术进行克隆或定量测量。扩增方法是本领域众所周知的方法,包括例如聚合酶链反应、PCR(PCR Protocols,a Guide to Methods and Applications,ed.Innis.Academic Press,N.Y.(1990)and PCR Strategies,ed.Innis,Academic Press,Inc.,N.Y.(1995)、连接酶链反应(Ligase chain reaction,LCR,例如参见,Wu,Genomics 4:560(1989);Landegren,Sciencee 241:1077,(1988);Barringer,Gene 89:117(1990))、转录扩增(例如参见,Kwoh,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173(1989))、自我维持序列复制(例如参见,Guatelli,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874(1990))、Q-β复制酶扩增(例如参见,Smith,J.Clin.Microbiol.35:1477-1491(1997))、自动Q-β复制酶扩增试验(例如参见,Burg,Mol.Cell.Probes10:257-271(1996))和其它RNA聚合酶介导的技术(例如NASBA,Cangene,Mississauga,Ontario)等,同样参见,Berger,Methods Enzymol.152:307-316(1987);Sambrook;Ausubel;U.S.Patent NOs.4,683,195and 4,683,202;Sooknanan,Biotechnology 13:563-564(1995)。引物可以设计成保留有“供体”7跨膜受体的原始序列。或者,引物可以编码保守性替换的(例如疏水性残基换成疏水性残基,参见上面的讨论)或功能上有利的替换(例如,不干扰胞浆膜插入、导致肽酶裂解、导致受体非正常折叠等)的氨基酸残基。一旦扩增后,按照本领域已知的方法,使用常规分子生物学方法,将核酸分子单独或以文库形式按照所需克隆到任意一个载体上;体外克隆扩增核酸的方法参见如U.S.Pat.No.5,426,039的描述。
引物对可以设计成选择性扩增T1R家族成员的配体结合区域。对于不同配体或味觉元,这些区域可能变化很大。因此,一种味觉元的可能是最小的结合区域,对于另一个味觉元来说可能具有很大的局限性。因此,需要扩增不同大小、包含不同细胞外结构域结构的配体结合区域。
设计简并引物对的范例在本领域已众所周知。例如,COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer(CODEHOP)策略计算机程序可以由http://blocks.fhcrc.org/codehop.html处获得,引物可直接连接到Blockmaker多序列比对地址进行杂合引物预测,其由一套相关蛋白质序列开始,如已知的味觉受体配体结合区域(例如参见,Rose,Nucleic Acids Res.26:1628-1635(1998);Singh,Biotechniques24:318-319(1998))。
合成寡核苷酸引物对的手段在本领域已众所周知。可以使用“天然”碱基对或合成碱基对。例如,使用人工核苷酸碱基能够提供操作引物序列、产生更加复杂的扩增产物混合物的多样途径。人工核苷酸碱基多种家族通过内部键旋转,能够采取多种氢键方向,从而提供简并分子识别的手段。这些类似物掺入PCR引物的单一位点将导致扩增产物复杂文库的产生。例如参见,Hoops,Nucleic Acids Res.25:4866-4871(1997)。非极性分子同样可以用来模仿天然DNA碱基的形状。腺嘌呤的非氢键形状模拟物可以对胸腺嘧啶非极性形状的模拟物有效和选择性地复制(例如参见,Morales,Nat.Struct.Bioo.5:950-954(1998))。例如两个简并碱基可以是嘧啶碱基6H,8H-3,4-二羟基嘧啶并[4,5-c][1,2]噁嗪-7-酮或嘌呤碱基N6-甲氧基-2,6-二氨基嘌呤(例如参见,Hill,Proc.Natl.Acad.Sci,USA 95:4258-4263(1998))。本发明简并引物的范例是掺入核碱基类似物5’-二甲氧三苯甲基-N-苯甲酰基-2’-脱氧胞嘧啶,3’-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺(参见如下所述序列中的“P”)。这种嘧啶类似物与嘌呤,包括A和G残基形成氢键。
与此处公开的味觉受体基本上是等同的多态变体、等位基因和种间同源体,可以使用下述的核酸探针分离。或者,通过检测与抗血清或针对T1R多肽产生的纯化抗体发生免疫反应的表达同源体(该表达的同源体同样可以识别和选择性结合到T1R同源体上),表达文库可以用于克隆T1R多肽和其多态变体、等位基因和种间同源体。
编码味觉受体的配体结合区域的核酸可以使用简并引物对扩增(如PCR)适当核酸序列得到。扩增的核酸可以是来自任何细胞或组织的基因组DNA或味觉受体表达细胞衍生的cDNA或mRNA。
在一个实施方案中,可以构建出包含有融合了转位序列的编码T1R的核酸的杂合蛋白质编码序列。同样可以提供包含转位基元和其它化学感受受体,特别是味觉受体家族的味觉元结合结构域的杂合T1R。这些核酸序列可以可操作地连接转录或翻译控制元件,例如转录和翻译起始序列、启动子和增强子、转录和翻译终止子、聚腺苷酸化序列、和其它对DNA转录成RNA有用的序列等。在重组表达盒、载体和转基因动物构建过程中,可以利用启动子片段指导在所有目的细胞或组织中表达目的核酸。
在另外一个实施方案中,融合蛋白可能包括C末端或N末端转位序列。此外,融合蛋白可包括额外的元件,如用于蛋白质检测、纯化或其它应用的元件。促进检测和纯化的结构域包括,如金属鳌合肽如聚组氨酸序列串、组氨酸色氨酸组件或其它可以在固定金属上纯化的结构域等;麦芽糖结合蛋白;可以在固定的免疫球蛋白上进行纯化的蛋白A结构域;或FLAGS延伸/亲和纯化系统中使用的结构域(Immunex Corp,SeattleWA)。
在转位域(为了有效的胞浆膜表达)和新翻译的多肽其余部分之间,包含一个可裂解连接物序列如Xa因子(例如参见,Ottavi,Biochimie80:289-293(1998))、枯草杆菌素(subtilisin)蛋白酶识别基元(例如参见,Polyak,Protein Eng.10:615-619(1997))、肠激酶(Invitrogen,San Diego,CA)等对促进纯化可能有利。例如,一个构建体可以包括一条多肽编码核酸序列(与6个组氨酸残基连接,后跟一个是肠激酶裂解位点的硫氧还蛋白(例如参见,Williams,Biochemistry 34:1787-1797(1995)))和一个C末端转位域。组氨酸残基可促进检测和纯化,而肠激酶裂解位点提供了从剩余融合蛋白中纯化目的蛋白的手段。有关编码融合蛋白的载体技术和融合蛋白应用的技术在科学和专利文献中已有详细描述,例如参见,Kroll,DNA Cell.Biol.12:441-53(1993)。
包含配体结合结构域编码序列的表达载体(不管是单独表达载体还是表达载体文库)可以引入细胞的基因组或胞浆或细胞核,通过科学和专利文献中描述的多种多样的常规方法表达目的序列。例如参见,Roberts,Nature 328:731(1987);Berger supra;Schneider,Protein Expr.Purif.6435:10(1995);Sambrook;Ti jssen;Ausubel。生物试剂和试验器材厂家提供的产品信息手册也会提供有关已知生物学方法的信息。载体可以从天然来源分离,从诸如ATCC或GenBank文库获得,或通过合成或重组方法制备。
核酸可以在细胞内稳定或短暂表达(例如游离体表达系统)的表达盒、载体或病毒中表达。选择标志物可以掺入到表达盒和载体中,从而赋予转化细胞和序列以可选择的表型。例如,选择标记物可以编码游离体维持和复制,所以就不必整合至宿主基因组了。例如,标志物可能编码抗生素抗性(例如氯霉素、卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素)或除草剂抗性(例如chlorosulfuron或Basta),以选择转化了目的DNA序列的细胞(例如参见,Blondelet-Rouault,Gene 190:315-317(1997);Aubrecht,J.Pharmacol.Exp.Ther.281:992-997(1997))。赋予新霉素或潮霉素这类底物的抗性的可选择标志物基因仅能用于组织培养,而化学抗性基因可以作为体内和体外的选择性标记物。
嵌合核酸序列可以编码在任何7跨膜多肽内部的T1R配体结合结构域。因为7跨膜受体多肽具有相似的一级序列以及二级和三级结构,结构域(例如细胞外结构域、TM结构域、胞浆结构域等)可以很容易地通过序列分析鉴定。例如,同源性模建、傅立叶分析和螺旋周期检测可用于鉴定有7跨膜受体序列的7个结构域。快速傅立叶转换(FFT)算法可用于评估代表被分析序列疏水性和可变性概况的显性周期。周期检测增强和α螺旋周期指数可由如Donnelly,Protein Sci.2:55-70(1993)的方法完成。其它算法和模建算法在本领域已众所周知,例如参见,Peitsch,Receptors,Channels 4;161-164(1996);kyte & Doolittle,J.Md.Bio.,157:105-132(1982);Cronet,Protein Eng.6:59-64(1993)(同源和“发现模建”);http://bioinfo.weizman.ac.il/等。
本发明还包括具有指定核苷酸和氨基酸序列的核酸和蛋白质,同样包括DNA片段,特别是如40、60、80、100、150、200或250个核苷酸、或更多核苷酸的片段,以及如10、20、30、50、70、100或150个氨基酸、或更多氨基酸的蛋白质片段。可选地,核酸片段可编码能够与针对T1R家族成员产生的抗体结合的抗原性多肽。此外,本发明的蛋白质片段可选地是能够与针对T1R家族成员产生的抗体结合的抗原性片段。
本发明另外还包括嵌合蛋白,其包含此处公开的至少一种T1R多肽中的至少10、20、30、50、70、100或150个氨基酸或更多序列,并耦联至额外的氨基酸序列(该序列代表另一个GPCR、优选地7跨膜超家族成员的全部或部分)。这些嵌合子可以直接从受体和另一个GPCR获得,或组合两种或多种现有的受体获得。在一个实施方案中,嵌合子的一部分对应于本发明T1R多肽的细胞外结构域,或是从该细胞外结构域衍生出来。在另外一个实施方案中,嵌合子的一部分对应于细胞外结构域和此处描述的T1R多肽的一种或多种跨膜结构域,或是从中衍生出来,而嵌合子剩余部分来自另一个GPCR。嵌合受体在本领域众所周知,制备嵌合受体的技术和用于掺入的G蛋白耦联受体结构域或片段的选择及界定也是本领域众所周知。因此,本领域技术人员的知识可容易用于这种嵌合受体的制备。使用这种嵌合受体可以提供例如一种在此特别描述的受体的味觉选择性特征,并与另一个受体的信号传导特征相耦联,如现有技术实验系统中已知的一种受体。
例如,象配体结合结构域、细胞外结构域、跨膜结构域、胞浆结构域、N端结构域、C端结构域或其任意组合的结构域,可以共价地连接至异源蛋白质上。如T1R细胞外结构域可连接至异源GPCR跨膜结构域,或异源GPCR细胞外结构域可连接至T1R跨膜结构域。其它可选异源蛋白质包括,如绿色荧光蛋白、β-gal、谷氨酸受体和视紫红质前序列等。
表达本发明的T1R、片段或变体的宿主细胞也处在本发明范围之内。为了获得克隆的基因或核酸(例如编码本发明的T1R、片段或变体的cDNA)的高水平表达,本领域技术人员通常是将目的核酸序列亚克隆至含有指导转录的强启动子、转录/翻译终止子、并且对于编码蛋白质的核酸分子来说,还有转录起始的核糖体结合位点的表达载体中。适合的细菌启动子本领域众所周知,例如参见Sambrook等的描述。但是,细菌或真核表达系统都可以使用。
可以使用任何已知将外源核苷酸序列引入宿主细胞的方法。这些方法包括使用磷酸钙转染、polybrene、原生质体融合、电穿孔、脂质体、微注射、胞浆载体、病毒载体和其它任何已知的将克隆基因组DNA、cDNA、合成DNA或其它外源遗传物质引入宿主细胞的方法(例如参见,Sambrook等)。只要保证特定遗传工程方法能够成功地将至少一条核酸分子引入能表达目的T1R、片段或变体的宿主细胞即可。
将表达载体引入到细胞中后,被转染的细胞在适合目的受体、片段和变体表达的条件下培养,然后使用标准技术从培养物中回收。此类技术的实施例本领域众所周知。例如参见WO 00/06593,此处以与本公开内容具有一致性的方式引用。
D.T1R多肽的检测
除了使用核酸杂交技术检测T1R基因和基因表达以外,同样可以使用免疫试验检测T1R,例如鉴定味觉受体细胞和T1R家族成员的变体。免疫试验可用以定性或定量分析T1R。此技术应用的总体概述参见Harlow &Lane,Antibodies:A Laboratory Manual(1988)。
1.针对T1R家族成员的抗体
产生可以与T1R家族成员特异性反应的单克隆抗体和多克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的方法(例如参见,Coligan,CurrentProtocols in Immunology(1991);Harlow & Lane,supra;Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(2d ed.1986);andKohler & Milstein,Nature,256:495-497(1975))。此类技术包括通过从噬菌体或类似载体的重组抗体文库中选择抗体来制备相应抗体,以及通过免疫家兔或小鼠来制备单克隆抗体和多克隆抗体(例如参见,Huse等,Science,246:1275-1281(1989);Ward等,Nature,341:544-546(1989))。
许多包含T1R的免疫原可用于产生与T1R家族成员特异性反应的抗体。例如,重组T1R多肽,或其抗原性片段,可用此处描述的方法分离。合适的抗原区域包括,例如用于鉴定T1R家族成员的共有序列。重组蛋白可以使用上述方法在真核或原核细胞中表达,和使用上述的方法纯化。重组蛋白是优选的免疫原,用于产生单克隆或多克隆抗体。或者,从此处公开的序列衍生出的合成肽,与载体蛋白缀合后可用作免疫原。天然产生的蛋白质也可以纯净的或非纯净形式使用。产物然后被注射进能够产生抗体的动物。可得到单克隆或多克隆抗体,用于后续测量蛋白质的免疫试验。
产生多克隆抗体的方法本领域技术人员众所周知。例如,使用标准佐剂例如弗氏佐剂和标准免疫程序,用蛋白质免疫近交系小鼠(例如BALB/C小鼠)或家兔。通过采血和确定与T1R的反应滴度来监测动物对免疫原制备物的免疫反应。当获得合适的针对免疫原的抗体高滴度后,收集动物血液并制备抗血清。如果需要,可以通过对抗血清进一步分级分离来富集与蛋白质反应的抗体(参见Harlow & Lane,supra)。
可通过与本领域技术人员熟悉的多种技术得到单克隆抗体。简单地讲,通常经过与骨髓瘤融合,使目的抗原免疫的动物脾细胞永生化(参见kohler & Milstein,Eur.J.Immunol.,6:511-519(1976))。永生化的另外的方法包括使用E-B病毒(Epstein Barr Virus)、癌基因、或反转录病毒转化、或本领域已知的其它方法。对由单个永生的细胞形成的克隆筛选,选出能够产生针对抗原具有所需特异性和亲和性的抗体的克隆,通过多种技术可以提高这些细胞产生的单克隆抗体的产量,包括注射到脊椎动物宿主的腹腔内。或者,按照Huse等,Science,246:1275-1281(1989)概述的一般方法,通过从人B细胞筛选DNA文库,可以分离编码单克隆抗体或其结合片段的DNA序列。
收集单克隆抗体和多克隆血清并在免疫试验中用免疫原蛋白滴定,例如固相免疫试验,其中免疫原固定在固相支持物上。通常,选择具有104或更高滴度的多克隆抗血清,并使用竞争结合免疫试验,测试它们与非T1R多肽、或甚至其它T1R家族成员、或其它生物体的其它相关蛋白质的交叉反应。特异性多克隆抗血清和单克隆抗体一般结合的Kd会至少大约0.1mM,更经常地至少大约1pM,可选地至少大约0.1pM或更好,并且可选地0.01pM或更好。
一旦得到T1R家族成员特异性抗体,各T1R蛋白质和蛋白质片段可用一系列免疫试验方法来检测。有关免疫学和免疫试验程序的综述,参见Basic and Clinical Immunology(Stites & Terr eds.,7th ed.1991)。而且,本发明的免疫试验可以由几种形式来完成,这些形式在酶免疫学(Enzyme Immuncassay)中详述(Maggio,ed.,1980);和Harlow & Lane,supra。
2.免疫学结合试验
T1R蛋白、片段和变体可用任何一个已知的免疫学结合试验检测和/或定量(例如参见US Patents 4,366,241;4,376,110;4,517,288;和4,837,168)。对于一般性免疫试验的综述,同样参见细胞生物学方法:抗体在细胞生物学中的应用,Methods in Cell Biology Autibodies inCell Biology)volume 37(Asai,ed.1993);基础和临床免疫学(Basicand Clinical Immunoogy)(Stiters & Terr,eds.,7th ed.1991)。免疫学结合试验(或免疫试验)通常使用能够特异性与所选蛋白质或抗原(本专利申请中是T1R家族成员或其抗原性亚序列)结合的抗体。抗体(例如抗-T1R)可以使用本领域技术人员已知的多种手段和如上所述的各种方法产生。
免疫试验也经常使用标记物,其可特异性地结合和标记抗原抗体复合物。标记物本身可能是包含抗体/抗原复合物的一个部分。因此,标记物可以是标记的T1R多肽或标记的抗T1R抗体。或者,标记物可以是一个第三部分,如第二抗体,其能够特异性地结合抗体/T1R复合物(第二抗体通常特异性结合产生第一抗体的物种产生的抗体)。其它能够特异结合免疫球蛋白恒定区的蛋白质,如蛋白A或蛋白G同样可用作标记物。这些蛋白质表现出与许多物种的免疫球蛋白恒定区强烈的非免疫原性反应活性(例如参见,Kronval等,J.Immunol.,111:1401-1406(1973);Akerstrom等,J.Immunol.,135:2589-2542(1985))。可用可检测部分修饰标记物,如生物素,其可与另外一个分子特异结合,如链霉亲和素。多种可检测部分为本领域技术人员所熟知。
贯穿整个试验,每结合一个试剂都需要孵育和/或漂洗步骤。孵育步骤从5秒钟到几个小时,可选地从大约5分钟到大约24小时。但是,孵育时间将取决于试验形式、抗原、溶液体积、浓度等。一般情况下试验在室内温度下进行,尽管它们可以在一个温度范围内进行,如10℃到40℃。
a.非竞争性试验形式
检测样品中T1R多肽的免疫试验既可以是竞争性的也可以是非竞争性的。非竞争性免疫试验是其中的抗原量被直接测定。例如在一个优选的“夹心”(sandwich)试验中,抗T1R抗体直接结合在其固定的固相支持物上。这些固定化抗体然后捕获试验样品中的T1R多肽。T1R多肽因此被固定,然后结合标记物,例如带有标记的第二T1R抗体。或者,该第二抗体可能没有标记,但是它可以结合标记了的第三抗体,该第三抗体对产生第二抗体的物种的抗体具有特异性。该第二抗体或第三抗体通常用可检测部分修饰,例如生物素,其可和另外一个分子特异性结合如链霉亲和素,以提供可检测部分。
b.竞争性试验形式
在竞争性试验中,通过测量用样品中存在的未知的TIR多肽从抗-TIR抗体中去除(竞争去除)已知的外加的(外源的)TIR多肽的量,间接测量样品中存在的TIR多肽的量。在一个竞争性试验中,已知量的T1R多肽加入到样品中,样品然后与能特异结合T1R的抗体接触。与抗体结合的外源T1R多肽的量与样品中T1R多肽浓度成反比。在一个特别优选的实施方案中,抗体被固定在一个固相底物上。与抗体结合的T1R多肽的量可以通过测量T1R/抗体复合物中T1R多肽的量,或通过测量剩余未形成复合物的蛋白质的量来确定。通过提供一个标记的T1R分子可以检测T1R多肽的量。
半抗原抑制试验是另一种优选的竞争性试验。在这个试验中已知T1R多肽固定在一个固相底物上。已知量的抗T1R抗体加入到样品中,样品然后与固定的T1R接触。抗T1R抗体结合到已知的固定化T1R多肽的量与样品中存在的T1R多肽的量成反比。同样,固定化抗体的量可以通过检测抗体固定化部分或溶液中剩余抗体部分来检测。抗体被标记时可直接检测,或随后加入一个如上所述的特异结合抗体的标记部分进行间接检测。
c.交叉反应测定
竞争结合形式的免疫试验也可用来测定交叉反应。例如,一个由在此公开的核酸序列至少部分编码的蛋白质可以固定在一个固相支持物上。蛋白质(例如T1R多肽和同源物)加入到试验体系中,与固定的抗原竞争结合抗血清。加入蛋白质的与固定蛋白质竞争结合抗血清的竞争能力,与在此公开的核酸序列编码的T1R多肽与自己竞争的能力相比较。使用标准计算法计算上述蛋白质的交叉反应百分比。与每一个上述加入蛋白质交叉反应小于10%的抗血清被选择出来并合并在一起。通过加入特定蛋白质,例如远源同源物进行免疫吸收,交叉反应抗体可任选地从合并抗血清中去除。另外,用于鉴定T1R家族成员的含有代表保守基元的氨基酸序列的肽,可用于测定交叉反应性。
免疫吸收的和合并的抗血清然后用于进行如上所述的竞争结合免疫试验,用以第二蛋白质(该二级蛋白质被认为可能是T1R家族成员的一个等位基因或多态变体)和免疫原蛋白质(即由在此公开的核酸序列编码的T1R多肽)的比较。为了实现这个比较,该两种蛋白质都要在一个宽范围浓度内进行试验,确定抑制抗血清与固定的蛋白质50%结合需要的每一种蛋白质的量。如果抑制50%结合需要的第二蛋白质量小于在此公开核酸序列编码的蛋白质抑制50%结合需要的量10倍,那么该第二蛋白质就被认为能够特异性地结合由T1R免疫原产生的多克隆抗体。
针对T1R保守性基元的抗体也可用于制备仅与T1R家族GPCR特异性结合,而不与其它家族的GPCR结合的抗体。
特异性结合特定T1R家族成员的多克隆抗体可以通过使用其它T1R家族成员扣除交叉反应性抗体来制备。物种特异性多克隆抗体可以通过类似途径获得。例如人T1R1特异性抗体的制备,可以通过扣除例如与大鼠T1R1或小鼠T1R1直向进化同源物序列交叉反应的抗体来实现。
d.其它试验形式
Westem印迹(免疫印迹)分析可用于检测和定量样品中存在的T1R多肽。该技术一般包括通过基于分子重量的凝胶电泳分离样品蛋白质、将分离开的蛋白质转移到合适的固相支持物上(例如硝酸纤维素膜、尼龙膜或衍生尼龙膜)、将样品与特异结合T1R多肽的抗体孵育。抗T1R多肽抗体特异性与固相支持物上的T1R多肽结合。这些抗体可能直接被标记,或随后被特异结合抗T1R抗体的标记抗体所检测(例如标记的绵羊抗小鼠抗体)。
另外,试验形式包括脂质体免疫试验(LIA),其利用设计成结合特定分子(如抗体),并释放出封装好的试剂或标志物的脂质体。释放出的试剂然后可利用标准技术检测(参见Monroe等,Amer.Clin.Rev.,5:34-43(1986))。
e.非特异结合的降低
本领域技术人员应当领会,免疫试验中经常希望降低非特异性的结合。特别是当试验涉及固定在固相基质上的抗原或抗体时,希望降低非特异结合结合到固相基质上的量。降低非特异结合的手段本领域众所周知。一般来讲,该技术涉及使用一个蛋白质性质的组分来包被基质。特别是象牛血清白蛋白(BSA)、脱脂奶粉、明胶这样的组分具有广泛的应用,最优选的方案是使用奶粉。
f.标记物(labels)
试验中使用的特定标记物或可检测基团不是本发明的关键因素,只要它不显著影响试验中抗体特异性结合即可。可检测基团可以是任何具有可检测的物理或化学性质的物质。这类可检测标记在免疫试验领域发展完善,并且通常情况下,这些方法中有用的大多数标记物都可以应用于本发明。因此,标记物是指任何能用光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学的、光学的或化学的手段检测到的组分。本发明有用的标记物包括磁珠(如DYNABEADSTM)、荧光染料(如异硫氰酸荧光素、德克萨斯红(Texas red)、罗丹明等)、放射标记物(如3H、125I、3sS、14C或32P)、酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其它通常用于ELISA的酶)、和显色标记物如胶体金或彩色玻璃或塑料珠(如聚苯乙烯、聚丙乙烯、乳胶等)。
按照本领域已知的方法,标记物可以直接或间接耦联至试验中目的组分上。如上所述,根据所需要的灵敏度、与化合物缀合的难易度、所需稳定性、现有仪器、和废物处理条款,可以使用各种各样的标记物。
非放射标记物通常使用间接法标记。一般来讲,一个配基分子(如生物素)共价结合至分子上。该配基然后结合另外一个分子(如链霉亲和素),该链霉亲和素本身可被检测或共价连接至一个信号系统如可检测酶、荧光化合物、或化学发光化合物上。配基和它们的靶标可以与识别T1R多肽的抗体、或识别抗T1R多肽的二抗以任意适当的组合使用。
分子也可以直接缀合至信号产生化合物上,例如与酶或荧光素缀合。作为标记物的目的酶主要是水解酶,特别是磷酸酶、脂酶和糖苷酶、或氧化酶(oxidotase)特别是过氧化物酶。荧光化合物包括荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰化合物、伞形酮等。化学发光化合物包括萤光素(luciferin),和2,3-二氢吩嗪二酮类(2,3-dihydrophthalazinediones),例如鲁米诺。可能使用的多种标记或信号发生系统参见U.S.Patent No.4,391,904的综述。
检测标记物的方法本领域众所周知。因此,例如当标记物是放射标记物时,检测手段包括闪烁计数器或感光膜放射自显影。当标记物是荧光标记物时,可以通过合适波长的光激发荧光素来检测产生的荧光。荧光可以肉眼观察,通过感光膜,或通过电子检测器如电荷耦联装置(CCDs)或光电倍增器等检测。类似地,在提供酶的合适底物后,可以通过检测反应产物来检测酶标记物。最后,简单的显色标记物可以通过简单观察与标记物相关的颜色来实现。因此,在一系列试纸条(dipstick)试验中,缀合的胶体金通常显示粉红色,而各种缀合的小珠显示各自小珠本身的颜色。
一些试验形式不需要使用标记的组分。例如,凝集试验可用于检测靶抗体存在与否。在该试验中,抗原包被颗粒与包含靶抗体的样品发生凝集。在该形式中,参与组分均无需标记,通过肉眼简单观测就能判定靶抗体的有无。
E.调节子的检测
确定一个试验化合物是否能够在体内和体外特异性结合本发明的化学感受受体的组合物和方法如下所述。可以监测细胞生理学的许多指标来评价配体结合本发明T1R多肽的效果。这些试验可以在表达化学感受受体的完整细胞上进行,在通透化的细胞上进行,或在通过标准方法产生的膜成分上进行。
味觉受体结合味觉元并引发化学刺激转换成电信号。激活的或抑制的G蛋白因此改变了靶标酶、通道、或其它效应蛋白质的性质。一些例子如通过视觉系统的转导素(transducin)而引起cGMP磷酸二酯酶的活化、由刺激性G蛋白引起的腺苷环化酶的活化、由Gq和其它同类G蛋白引起的磷脂酶C的激活化、和由Gi和其它G蛋白引起的不同通道的调节等。下游结果也能检验,如由磷脂酶C引发二酰基甘油和IP3的产生,继而也可以检验由IP3引发的钙迁移。
试验中的T1R蛋白或多肽通常从具有SEQ ID NOS:4,10,12,14,17,或其片段或保守性修饰变体序列的多肽中选择。可选地,片段和变体可以是能够结合抗T1R抗体的抗原性片段和变体。
或者,试验中的T1R蛋白或多肽可以从真核宿主细胞衍生而来,其包含具有与SEQ ID NOS:4,10,12,14,17,或其片段或保守性修饰变体相同的氨基酸序列的氨基酸亚序列。一般来讲,氨基酸序列的相同性至少35至50%,或可选地75%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。可选地,试验中的T1R蛋白或多肽可以包含T1R蛋白的结构域,如细胞外结构域、跨膜区、跨膜结构域、胞浆结构域、配体结合结构域等。此外如上所述,T1R蛋白或其结构域可以共价连接异源蛋白质,以产生可用于此处描述的试验的嵌合蛋白。
可以使用如上所述的T1R蛋白质或多肽,不管是重组的还是天然产生的,来测试T1R受体活性的调节子。可以分离、在细胞中表达、在由细胞衍生出的膜上表达、在动物或组织中表达重组的或者是天然产生的TIR蛋白或多肽。例如,舌切片、从舌上分离下来的细胞、转化的细胞或膜都可以使用。可以使用此处描述的体内或体外试验中的一种来测试调节作用。
1.体外结合试验
使用一个本发明的T1R多肽,利用可溶性的或固相反应,可以体外检测味觉传导。在一个特定的实施方案中,可以利用T1R配体结合结构域,以可溶或固相反应形式在体外试验其配体结合活性。
例如,T1R的N端结构域被认为参与了配体结合。具体而言,TIR属于GPCR亚家族,其特征是具有大约600个氨基酸的大细胞外N端部分。这些N端部分被认为是形成配体结合结构域,至少是部分地形成配体结合结构域,并且因此对于T1R激动剂和拮抗剂的生物化学试验鉴定十分有益。配体结合域可能还包括额外的细胞外结构域部分,例如跨膜结构域的细胞外环。类似试验使用了与T1R相关的其它GPCR,例如代谢趋向性谷氨酸受体(例如参见,Han和Hampson,J.Biol.Chem.274:10008-10013(1999))。这些试验可能涉及替换一个放射标记或荧光标记的配体,测量内在荧光的变化或蛋白水解敏感性的变化等。
结合到本发明T1R多肽上的配体,可以在溶液、双层膜(可选地附着到固相上)、脂单层、或囊泡中检测。调节子的结合可以利用如光谱特征变化(例如荧光、吸收、折射指数)、流体力学(如形状)、层析或溶解性进行测试。本发明优选的结合试验是使用重组可溶性N端T1R结构域的生物化学结合试验。
受体-G蛋白相互作用也能被检验。例如,G蛋白与受体的结合,或它从受体上的释放都能被检验。特别是在没有GTP的情况下,活化子(activator)将导致G蛋白(全部三个亚基)和受体的紧密复合物的形成。该复合物可用上述的多种方法检测。这种试验改动后可用于寻找抑制子(inhibitors),例如在没有GTP的情况下,将活化子加入受体和G蛋白(它们形成紧密复合物),然后通过观察受体-G蛋白复合物的解离从而筛选抑制子。在GTP存在的情况下,G蛋白α亚基从其它两个G蛋白亚基的释放可作为活化标准。被活化或抑制的G蛋白将因此改变靶标酶、通道和其它效应蛋白的性质。
在本发明另一个实施方案中,可以使用GTPγS试验。如上所述,在GPCR的活化下,G蛋白复合物的Gα亚基被刺激,将结合的GDP交换成为GTP。配体介导的G蛋白交换活性的刺激可以通过在生物化学试验测量,其中测定在推测配体存在情况下,加入的放射标记GTPγ35S与G蛋白的结合。一般情况下,含有目的化学感受受体的膜与G蛋白复合物相混合。将潜在抑制子和/或活化子和GTPγS加入到试验中,测量结合到G蛋白上的GTPγS。可以通过液体闪烁计数或其它本领域已知的手段(包括闪烁接近试验(SPA))测量结合作用。在另一种试验形式中,可使用荧光标记的GTPγS。
2.荧光偏振试验
在另一实施方案中,基于荧光偏振(“FP”)的试验可用于检测和监测配体结合。荧光偏振试验是测量平衡结合、核酸杂交、和酶活性的实验室通用技术。荧光偏振试验是均一性的,因为它不需要分离步骤如离心、过滤、层析、沉淀或电泳等。这些试验在溶液中直接实时进行,不需要一个固定化阶级。偏振值可重复测量,在加入试剂后测量速度非常快,所以不会破坏样品。一般情况下,本技术可用于测量低至匹摩尔(picomolar)到微摩尔(micromolar)水平荧光基团(fluorophore)的偏振值。本节描述了怎样简单定量地将荧光偏振应用于测量本发明T1R多肽与配体的结合。
当荧光标记分子被平面偏振光激发,就发出具有一定偏振程度的光,偏振程度与其分子旋转成反比。大的荧光标记分子在激发态(对于荧光素来说为4纳秒)保持一定程度的稳定性,在激发和发射之间光的偏振保持一定程度的恒定。小的荧光标记分子在激发态快速旋转,在激发和发射之间光的偏振变化显著。因此,小分子偏振值较低而大分子偏振值较高。例如,一个单链荧光素标记的寡核苷酸具有相对较低的偏振值,但当它与互补链杂交后就具有较高的偏振值。当使用FP来检测和监测可能活化或抑制本发明化学感受受体的味觉元结合时,可以使用荧光素标记的味觉元或自发荧光味觉元。
荧光偏振(P)被定义为:
其中∏是与激发光平面平行的发射光强度,⊥是与激发光平面垂直的发射光强度。P,作为一个光强度的比值,是一个没有单位的数字。例如,和Beacon2000TM系统可以与这些试验结合使用。这类系统通常用毫偏振单位来表达偏振值(1偏振单位=1000mP单位)。
分子旋转和尺寸之间的关系由Perrin方程式描述,读物可以参考Jolley,M.E.(1991)在分析毒理学杂志236-240页(Journal ofAnalytical Toxicology,p236-240)的文献,在这篇文献中给出了该方程式的详细解释。概括地讲,Perrin方程式认为偏振与旋转弛豫(rotational relaxation)时间成正比关系,该时间是一个分子旋转过大约68.5°角所需要的时间。旋转弛豫时间与下列方程式中的粘度(η)、绝对温度(T)、分子体积(V)、和气体常数(R)有关:
旋转弛豫时间对于小分子如荧光素非常小(≈1纳秒),对于大分子如免疫球蛋白非常大(≈100纳秒)。如果粘度和温度保持恒定,旋转弛豫时间,也即偏振,与分子体积直接相关。分子体积的变化可能是由于与其它分子的相互作用、解离、聚合、降解、杂交或荧光标记分子的构象变化等引起。例如,荧光偏振已被用于测量大分子荧光素标记的聚合物的酶裂解,如用蛋白酶、DNA酶和RNA酶引起的裂解。它也同样被用于测量蛋白质/蛋白质相互作用、抗体/抗原结合、和DNA/蛋白质结合的平衡结合作用。
3.固相和可溶性高通量试验
在另一实施方案中,本发明提供了使用T1R多肽,或表达T1R多肽的细胞或组织的可溶性试验。在另一实施方案中,本发明以高通量形式提供了基于固相的体外试验,其中T1R多肽、或表达T1R多肽的细胞或组织附着在固相底物上。
在本发明的高通量试验中,在一天内筛选多达几千个不同的调节子或配体是可能的。特别是微孔板的每一个孔都可以用于进行针对选择的潜在调节子的单独的试验,或者如果是观察浓度或孵育时间效果,每5-10个孔可以测试一个调节子。因此,一个标准微孔板可以试验大约100个(例如96个)调节子。如果使用1536孔板,那么一个板可以轻松分析1000到大约1500个不同化合物。也可能在每个平板也中分析几个化合物。每天都可以分析几个不同的微孔板;使用本发明的这种整体系统分析多达大约6,000-20,000种不同的化合物是可行的。最近又发展了试剂操作的微流控制方法。
目的分子可以直接或间接通过共价或非共价键如经由一个标记物结合到固态组分上。标记物可以是任何的各种各样的组分。一般来讲,将可结合标记物的分子(标记物结合物)固定在一个固相支持物上,通过标记物和标记物结合物的相互作用,标记了的目的分子(如味觉传导目的分子)就固定在了固相支持物上。
根据文献描述的已知的分子相互作用,可以使用许多标记物和标记物结合物。例如,当一个标记物具有一个天然结合物时,例如生物素、蛋白A、或蛋白G,它就可以与适当的标记物结合物(亲和素、链霉亲和素、中性亲和素、免疫球蛋白Fc区等)结合使用。针对具有天然结合物的分子如生物素的抗体也可被广泛应用,并是合适的标记物结合物(参见,Sigma Immunochemicals 1998 Catalogue Sigma,St.Louis MO)。
类似地,任何半抗原或抗原化合物都可与适当抗体结合使用以形成标记物/标记物结合物对。几千种抗体都已商业化并且文献中还描述了许多其它的抗体。例如,在一个常见方法中,标记物是第一抗体,标记物结合物是特异识别第一抗体的第二抗体。除了抗体-抗原相互作用外,受体-配体相互作用也可以作为合适的标记物和标记物结合物对。例如,细胞膜受体激动剂和拮抗剂(例如,细胞受体-配体相互作用如转铁蛋白、c-盒、病毒受体配体、细胞因子受体、趋化因子受体、白介素受体、免疫球蛋白受体和抗体、钙粘着蛋白家族、整联蛋白家族、选择蛋白(selectin)家族等,例如参见,Pogott & Power,The Adhesion MoleculeFacts Book I(1993))。类似地,毒素和毒液(venoms)、病毒表位、激素(例如鸦片、类固醇等)、细胞内受体(例如,其介导各种小配体效果,包括类固醇、甲状腺激素、类维生素A(retinoids)和维生素D,和肽)、药物、凝集素、糖、核酸(线性和环状聚合物构型)、寡糖、蛋白质、磷脂和抗体等都可以与不同细胞受体作用。
合成聚合物如聚氨基甲酸酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲类、聚酰胺、聚乙烯亚胺、聚芳撑硫化物、聚硅氧烷、聚酰亚胺、聚乙酸酯(polyacetates)同样可以形成合适的标记物或标记物结合物。许多其它的标记物/标记物结合物对同样对于在此描述的试验系统十分有益,在浏览本公开专利时这对本领域技术人员是显而易见的。
一般连接物如肽、聚醚等同样可以作为标记物,并且包括多肽序列,例如大约5到200氨基酸的聚甘氨酸序列。这类弹性接头对于本领域技术人员来说是已知的。例如,聚(乙二醇)接头可以从ShearwaterPolymers,Inc.Huntsville,Alabama得到。这些接头可选地具有酰胺键、巯基键或异源功能键等。
标记物结合物可以使用现有的各种方法固定到固相底物上。通常固相底物全部或部分暴露于化学试剂(将一个能与标记物结合物的一部分发生反应的化学基团固定到表面)中以完成衍生或功能化。例如,适合附着在一个长链部分上的基团可包括胺、羟基、硫醇和羧基基团。氨基烷基硅烷(aminoalkylsilanes)和羟烷基硅烷(hydroxyalkylsilanes)可用于一系列表面的功能化,例如玻璃表面。构建此类固相生物聚合膜阵列的方法文献中均有详细描述。例如参见,Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2154(1963)(描述了固相如肽的合成);Geysen et al.,J.Immun.Meth.,102:259-274(1987)(描述了在针上固相组分的合成);Frank & Doring,Tetrahedron,44:6031-6040(1988)(描述了在纤维素盘上合成多种肽序列);Fodor et al.,Science,251:767-777(1991);Sheldon et al.,Clinical Chemistry,39(4):718-719(1993);和Kozalet al.,Nature Medicine,2(7):753-759(1996)(均描述了固定在固相支持物上的生物聚合物排列)。固定标记物结合物到底物上的非化学方法包括其它常用方法,如加热、UV辐射交联等。
4.基于计算机的试验
另外一种测定调节T1R多肽活性的化合物的试验涉及计算机辅助化合物设计,其中计算机系统在氨基酸序列编码的结构基础上,用于产生T1R多肽的三维结构。输入的氨基酸序列与计算机系统中预先建立的算法直接并积极相互作用,产生出蛋白质的二级、三级和四级结构模型。然后检验蛋白质结构模型,来确定具有结合例如配体的能力的结构区域。这些区域然后用于鉴定可结合蛋白质的配体。
通过输入至少有10个氨基酸残基的蛋白质氨基酸序列或相应的编码T1R多肽的核酸序列到计算机系统中,产生蛋白质三维结构模型。编码T1R多肽的核酸序列,或其氨基酸序列,可以是此处公开的任何序列和其保守性修饰的变体。
氨基酸序列代表了蛋白质的一级序列或亚序列,其编码蛋白质的结构信息。将至少10个残基的氨基酸序列(或编码10个氨基酸的核苷酸序列)通过键盘输入到计算机系统中,计算机可读的底物包括但并不局限于,电子存储介质(如磁盘、磁带、盒带(cartridges)、和芯片)、光学介质(如CD ROM)、由因特网和RAM发布的信息。然后通过氨基酸序列与计算机系统的相互作用,使用本领域技术人员已知软件,产生蛋白质的三维结构模型。
氨基酸序列代表了一级结构,其编码形成目的蛋白质的二级、三级和四级结构必要的信息。本软件根据一级序列编码的特定参数来产生结构模型。这些参数被称为“能量术语”,主要包括静电电势、疏水电势、溶剂可接近性表面、和氢键形成。二级能量术语包括范德华电势。生物分子形成以一种累积形式使该能量术语值最小化的结构。计算机程序然后使用这些由一级结构或氨基酸序列编码的术语值来产生二级结构模型。
在二级结构能量术语的基础上,形成由二级结构编码的蛋白质的三级结构。用户此时可以输入另外的变量,如蛋白质是膜结合的或是可溶性的、在机体内的定位、它的细胞内定位如胞浆、表面或细胞核等。这些变量以及二级结构能量术语用来产生三级结构模型。在三级结构模建中,计算机程序将二级结构疏水面和类似物匹配,以及将二级结构亲水面和类似物匹配。
一旦产生结构,计算机就会鉴定出潜在的配体结合区域。通过输入如上所述的氨基酸或核苷酸序列或化合物化学结构式,产生潜在配体的三维结构。潜在配体的三维结构然后与T1R多肽的三维结构相比较,从而鉴定结合蛋白质的配体。通过能量术语确定蛋白质和配体间的结合亲和性,由此可以确定哪些配体具有增加的与蛋白质结合的可能性。
计算机系统同样可用于筛选T1R基因的突变、多态变体、等位基因、和种间同源体。这类突变可能与疾病状态或遗传性状相关。如上所述,基因芯片(GeneChipTM)和相关技术同样可用于筛选突变、多态变体、等位基因、和种间同源体。一旦变体被鉴定,可以用诊断试验确定具有突变的基因的患者。突变T1R基因的鉴定涉及接收T1R基因或其保守性修饰变体第一核酸或氨基酸序列的输入。序列用如上所述的方法输入计算机系统。该第一条核酸或氨基酸序列然后与第二条与第一序列基本相同的核酸或氨基酸序列比较。第二序列用如上所述的方法输入计算机系统。一旦比较第一和第二序列,就能确定两序列中核苷酸或氨基酸的差异。这些序列能够代表不同的T1R基因中的等位基因差异、与疾病状态和遗传性状相关的突变。
5.基于细胞的结合试验
在一个实施方案中,T1R蛋白或多肽在真核细胞中表达为嵌合受体,其带有异源的、能够促进其成熟和定向通过分泌途径的伴侣序列。这类嵌合T1R多肽可在任何真核细胞中表达,如HEK-293细胞。优选地,这些细胞包含一个功能性G蛋白,例如Gα15,其可以耦联嵌合受体至细胞内信号发生途径上,或耦联至信号发生蛋白如磷脂酶C上。细胞内这类嵌合受体的化活可以用标准方法检测,如通过检测细胞内的FURA-2依赖性荧光变化来检测细胞内钙的变化。
激活的GPCR受体变成激酶的底物,激酶能够使受体C端尾部磷酸化(也可能是其它位置)。因此,激活子能促进32P从γ标记的GTP到受体的转移,其可用闪烁计数器分析。C端尾部磷酸化能促进捕获素(arrestin)样蛋白的结合,从而干扰G蛋白的结合。激酶/捕获素途径在许多GPCR受体的脱敏中起着重要的作用。例如,调节味觉受体保持活性的持续期的化合物可用作延长目的味道或去除一个不愉快的味道。GPCR信号传导和分析信号传导的方法的一般性综述参见,Methods in Enzymology,vols.237 and 238(1994)and volume 96(1983);Bourne et al.,Nature,10:349:117-27(1991);Bourne et al.,Nature,348:125-32(1990);Pitcher et al.,Annu.Rev.Biochem.,67:653-92(1998)。
通过比较由推定的调节子处理过的T1R多肽的反应和未处理过的对照样品的反应从而分析T1R调节作用。这类推定的T1R调节子可包括抑制或活化T1R多肽活性的味觉元。在一个实施方案中,对照样品(未用活化子或抑制子处理)的T1R相对活性值被指定为100。当T1R活性值相对于对照为大约90%,可选地50%,可选地25-0%时,就获得T1R多肽的抑制。当T1R活性值相对于对照为110%,可选地150%、200-500%或1000-2000%时,就获得T1R多肽的活化。
离子流量变化可通过确定表达T1R多肽的细胞或膜的离子偏振(即电势)变化来评价。确定细胞偏振变化的一个手段就是用电压-钳(voltage-clamp)和补丁-钳(patch-clamp)技术(例如参见,“细胞附着”模式、“内-外”模式、和“全细胞”模式,如Ackerman et al.,New Engl.J Med.,336:1575-1595(1997)))测量电流变化(从而检测偏振的变化)。全细胞电流可用标准方法很方便地测量到。其它已知的试验包括:放射标记离子流量试验和使用电压敏感性染料的荧光试验(例如参见,Vestergarrd-Bogind et al.,J.Membrane Biol.,88:67-75(1988);Gonzales & Tsien,Chem.Biol.,4:269-277(1997);Daniel et al.,J.Pharmacol.Meth.,25:185-193(1991);Holevinsky et al.,J.Membrane Biol.,137:59-70(1994))。一般来讲,待测试化合物的存在浓度为从1pM到100mM。
待测试化合物对于多肽功能的效果可以通过检验如上所述的任何一个参数来测量。任何影响GPCR活性的适当的生理学变化都可用于评价一个待测试化合物对本发明多肽的影响。当使用完整细胞或动物确定功能结果时,同样可测量一系列效果如递质释放、激素释放、已知或未鉴定遗传标志物的转录变化(例如Northern印迹)、细胞代谢变化如细胞生长或pH变化、和细胞内第二信使如Ca2+、IP3、cGMP或cAMP的变化等。
优选的分析GPCR的试验包括载有离子或电压敏感性染料,能够报告受体活性的细胞。确定这类受体活性的试验同样可使用其它G蛋白耦联受体已知的激动剂和拮抗剂作为阴性或阳性对照,来评价待测化合物的活性。在鉴定调节活性化合物(例如激动剂、拮抗剂)的试验中,胞浆内离子水平或膜电位的变化可以分别使用离子敏感或膜电位荧光指示剂来监测。可能使用到的离子敏感指示剂和电压探头在Molecular Probes1997 Catalot中有描述。对于G蛋白耦联受体,混栖G蛋白如Gα15和Gα16可用于选择实验(Wilkie et al,Proc.Natl.Acad.Sci.,88:10049-10053(1991))。这类混栖蛋白允许广泛的受体分子的耦联。
受体活化通常启动随后的细胞内事件,如第二信使如IP3的增加,其能够释放细胞内钙离子库存。一些G蛋白耦联受体的活化通过磷脂酶C介导的磷脂酰肌醇水解作用刺激三磷酸肌醇(IP3)的形成(Berridge &Irvine,Nature,312:315-21(1984))。IP3继而刺激细胞内钙离子库存的释放。因此胞浆钙离子水平变化,或第二信使如IP3水平的变化可用于评价G蛋白耦联受体的功能。表达这类G蛋白耦联受体的细胞可能会因为细胞内库存释放和通过离子通道活化而表现出胞浆钙离子水平增加,在这种情况下尽管不是十分必要但也应尽量在没有钙离子的缓冲液中进行该试验,可选地在溶液中加入一种鳌合剂如EGTA,用来区分由内部库存钙释放引起的荧光反应。
其它试验可包括确定受体活性,其活化后,通过活化或抑制酶如腺苷酸环化酶导致细胞内环核苷酸如cAMP或cGMP水平的变化。环核苷酸门控离子通道如锥状光受体细胞通道和嗅觉神经元通道,在结合cAMP或cGMP而活化下,对阳离子具有通透性(例如参见,Altenhofen et al.,Proc.Natl Acad.Sci.,88:9868-9872(1991)and Dhallan et al.,Nature,347:184-187(1990))。在受体活化导致环核苷酸水平降低的情况下,可优选在加入一个受体激活化合物到试验细胞之前,将细胞暴露在能够增加细胞内环核苷酸水平的试剂如毛喉素中。用于这种类型的试验中的细胞可通过用编码环核苷酸门控离子通道、GPCR磷酸酶的DNA和编码受体(例如某些谷氨酸受体、蕈毒碱性乙酰胆碱受体、多巴胺受体、五羟色胺受体等)的DNA共转染宿主细胞而制备,其在活化后将引起胞浆内环核苷酸水平的变化。
在优选的实施方案中,通过在异源细胞中表达T1R基因,以及可以将受体连接至磷脂酶C信号传导途径上的混栖G蛋白,测量T1R多肽的活性(参见Offermanns & Simon,J.Biol.Chem.,270:15175-15180(1995))。可选地该细胞系是HEK-293(其在天然状态下不表达T1R基因),混栖G蛋白是Gα15(Offermanns & Simon,supra)。通过测量细胞内钙离子水平(其通过吸收与T1R多肽结合的分子,响应于T1R信号传导途径的调节作用而变化)的变化来分析味觉传导的调节。钙离子水平可选地由荧光钙离子指示剂染料和荧光成像技术来测量。
在一个实施方案中,可以使用免疫试验测量细胞内的cAMP或cGMP的变化。Offermanns & Simon,J.Biol.Chem.,270:15175-15180(1995)描述的方法可以用于确定cAMP水平。同样,Felley-Bosco et al.,Am.J.Resp.Cell and Mol.Biol.,11:159-164(1994)描述的方法可以用于确定cGMP水平。此外,测量cAMP和/或cGMP的试验试剂盒见美国专利4,115,538,在此引用作为参考。
在另一个实施方案中,可以按照U.S.Patent 5,436,128分析磷脂酰肌醇(PI)水解,在此引用作为参考。简单地讲,该试验涉及用3H-肌醇标记细胞48小时或更长时间。标记后的细胞用待测化合物处理1小时。处理后的细胞裂解并用氯仿-甲醇-水抽提,其后通过离子交换层析分离磷酸肌醇,用闪烁计数定量。计算存在激动剂时的cpm和存在缓冲液对照时的cpm的比率,确定刺激作用倍数。类似地,计算存在拮抗剂时的cpm和存在缓冲液对照(可能含有或不含有激动剂)时的cpm的比率,可以确定抑制作用倍数。
在另一个实施方案中,可测量转录水平用于评价待测化合物对信号传导的影响。将包含目的T1R多肽的宿主细胞与待测化合物接触足够长的时间以实现任何相互作用,然后测量基因表达水平。实现这些相互作用的时间可以凭经验确定,例如执行一个时间进程并且测量转录水平作为时间的函数。转录量可以使用本领域技术人员已知的合适的方法测量。例如,目的蛋白mRNA的表达可以通过Northern印迹检测或利用免疫试验鉴定其多肽产物来检测。或者,可使用利用报告基因的基于转录的试验,参见U.S.Patent 5,436,128的描述,在此引用作为参考。报告基因可以是,例如氯霉素乙酰转移酶、萤光素酶、3’-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。此外,经过附着在第二报告子如绿色荧光蛋白后,目的蛋白可以间接用作报告子(例如参见,Mistili & Spector,NatureBiotechnology,15:961-964(1994))。
然后将转录量与在缺少待测化合物时相同细胞内的转录量相比较,或者与缺少目的T1R多肽的基本相同细胞的转录量相比较。基本相同的细胞可以从用于制备重组细胞的相同细胞衍生而来,但是未被引进异源DNA修饰。转录量的任何差异意味着待测化合物在一定程度上改变了目的T1R多肽的活性。
6.表达化学感受受体的转基因非人类动物
表达一种或多种本发明化学感受受体序列的非人类动物同样可用于受体试验。这种表达可用于确定试验化合物在体内是否可以特异性地结合至哺乳动物味觉跨膜受体多肽,具体方法是将用编码化学感受受体或其配体结合区域的核酸稳定或瞬时转染的非人类动物与待测化合物接触,并确定该动物是否通过特异性结合受体多肽而对待测化合物起反应。
使用本发明的载体转染或感染过的动物对于鉴定和鉴别可结合特异性或一组受体的味觉元/配体的试验特别有用。这类经载体感染、能表达人类化学感受受体序列的动物,可用于体内筛选味觉元和分析味觉元对细胞生理学(如对味觉神经元)、对CNS或行为的影响。
单独或作为文库形式感染/表达核酸和载体的手段本领域众所周知。各种各样个体细胞、器官、或整个动物的参数可用多种手段来测量。通过用感染剂如腺病毒表达载体投递,可在动物味觉组织中例如表达本发明的TIR序列。
内源性化学感受受体基因可保持有功能,并且野生型(天然的)活性仍然存在。在其它情况下,当需要所有的化学感受受体活性都是由引入的异源杂合受体引起时,优选使用敲除品系(knockout line)。构建非人类转基因动物,特别是转基因小鼠,和产生转化细胞的重组构建体的选择和制备的方法本领域众所周知。
构建“敲除”细胞和动物基于的前提是,通过将干扰待抑制基因的一部分DNA序列的新DNA序列引入到基因组中,可以降低或完全消除哺乳动物细胞中特定基因的表达水平。同样,“基因诱捕插入”(gene trapinsertion),可用于破坏宿主基因,小鼠胚胎干细胞(ES)可用于产生敲除的转基因动物(例如参见,Holzschu,Transgenic Res.6:97106(1997))。异源序列的插入通常由互补核酸序列间的同源重组实现。异源序列是待修饰靶基因的一部分,例如内部、外部或转录调节序列,或任何可影响靶基因表达水平的基因组序列;或其组合。多能胚胎干细胞中经过同源重组的基因打靶可以允许对目的基因组序列进行精确修饰。任何技术都可用于产生、筛选、繁殖敲除动物,例如参见Bijvoet,Hum.Mol.Genet.7:53-62(1998);Moreadith,J.Mol.Med.75:208-216(1997);Tojo,Cytotechnology 19:161-165(1995);Mudgett,Methods Mol.Biol.48:167-184(1995);Longo,Transgenic Res.6:321-328(1997);U.S.Patents NOs.5,616,491;5,464,764;5,631,153;5,487,992;5,627,059;5,272,071;WO 91/09955;WO 93/09222;WO 96/29411;WO95/31560;WO 91/12650。
本发明的核酸同样可作为产生“敲除”人细胞及其后代的试剂。类似地,本发明的核酸同样可作为产生小鼠“敲入(knock-ins)”的试剂。人或大鼠T1R基因序列可以替换小鼠基因组中的直向进化同源T1R。通过这个途径,产生表达人或大鼠T1R的小鼠。该小鼠然后可用于分析人或大鼠T1R的功能,和鉴定这类T1R的配体。
F.调节子
作为T1R家族成员调节子测试的化合物可以是任何小的化学化合物,或生物学实体如蛋白质、糖、核酸或脂。或者,调节子可以是T1R基因的遗传变体。一般情况下,试验化合物可以是小的化学分子和肽。基本上任何化学化合物都可以作为本发明试验中的潜在调节子或配体,尽管在大多数情况下化合物溶解于水或有机溶剂(特别是基于DMSO的)中。通过自动化试验步骤,及从任何方便的来源中提供化合物用于试验,这些试验可用于筛选大的化学文库,这些试验通常是平行方式进行(例如在机器试验中在微量滴定板上以微量滴定方式进行)。应当认识到有很多化学化合物供应商,包括Sigma(St.Louis,MO),Aldrich(St.Louis,MO),Sigma-Aldrich(St.Louis,MO),Fluka Chemika-Biochemica Analytika(Buchs,Switzerland)等。
在一个优选的实施方案中,高通量筛选方法涉及提供包含大量潜在治疗性化合物(潜在调节子或配体化合物)的组合化学或肽文库。然后在一种或多种上述试验中筛选这类“组合化学文库”或“配体文库”,来鉴定这些显示所需特征性活性的文库成员(特别是化学种类或亚类)。因此鉴定的化合物可以作为常规的“引导化合物(lead compounds)”或本身就可作为潜在或真正的治疗剂。
组合化学文库是不同化学化合物(由化学合成或生物合成产生的)的集合,通过大量化学“构造部件(building blocks)”如试剂组合而成。例如,线性组合化学文库如多肽文库是由一系列化学构造部件(氨基酸)用各种可能方式以指定化合物长度(即多肽化合物中含有氨基酸的数目)组合而形成。通过这种化学构造部件的组合混合可以合成出上百万个化学化合物。
组合化学文库的制备和筛选本领域技术人员众所周知。这类组合化学文库包括肽库,但并不局限于肽文库(例如参见,U.S.Patent 5,010,175,Furka,Int.J.Pept.Prot.Res.,37:487-493(1991)andHoughtonet al.,Nature,354:84-88(1991))。同样可以用其它产生化学多样文库的化学物质。这些化学物质包括,但并不局限于:类肽(例如PCTPublication No.WO 91/19735)、编码的肽(PCT Publication No.WO93/20242)、随机生物寡聚物(PCT Publication No.WO 92/00091)、苯并二氮杂(例如U.S.Pat.No.5,288,514)、乙内酰脲和苯并二氮杂以及二肽的异聚物(diversomers)(Hubbs等,Proc.Nat.Acad.Sci.,90:6906-6913(1993))、联乙烯(vinylogous)多肽(Hagihara等,J.Amer.Chem.Soc.,114:6568(1992))、具有葡萄糖支架的非肽性肽模仿物(nonpeptidal petidomimetics)(Hirschmann等,J.Amer.Chem.Soc.,114:9217-9218(1992))、类似的有机合成小分子化合物文库(Chen等,J.Amer.Chem.Soc.,116:2661(1994))、寡氨基甲酸酯(oligocarbamates)(Cho等,Science,2661:1303(1993))、肽基膦酸酯(Campbell等,J.Org.Chem.,59:658(1994))、核酸文库(Ausubel,Berger and Sambrook,all supra)、肽核酸文库(U.S.Patent5,539,083)、抗体文库(Vaughn等,Nature Biotechnology,14(3):309-314(1996)and PCT/US96/10278)、糖类文库(Liang等,Science,274:152001522(1996)and U.S.Patent 5,593853),有机小分子文库(苯并二氮杂,Baum,C& EN,Jan 18,page 33(1993);噻唑烷酮(thiazolidinones)和metathiazanones,U.S.Patent 5,549,974;pynrolidines,U.S.Patents 5,525,735和5,519,134;吗啉代化合物,U.S.Patent 5,506,337;苯并二氮杂,5,288,514等)。
制备组合文库的装置已经商业化(例如参见,357 MPS,390 MPS(Advanced Chem Tech,Louisville KY),Symphony(Rainin,Woburn,MA),433A(Applied Biosystems,Foster City,CA),9050 Plus(Millipore,Bedford,MA))。另外,无数组合文库本身也已经商业化(例如参见,ComGenex,Princeton,NJ;Tripos,Inc.,St.Louis,MO;3DPharmaceuticals,Exton,PA;Martek Biosciences;Columbia,MD等)。
本发明的一个方面是,T1R调节子可用于任何食品、糖果、药物组合物及其成分,从而以所需的方式调节产品、组合物或成分的味道。例如,可以加入能够增强甜味感觉的T1R调节子以增加产品或组合物的甜味,而可加入能阻断不愉快味觉的T1R调节子以改善产品或组合物的味道。
G.描述和预测味觉感受的方法
本发明同样优选地提供在哺乳动物特别是人类中描述味觉感知和/或预测味觉感知的方法。优选地,这些方法可以通过使用在此公开的这些受体和使用此处公开的编码该T1R多肽的基因来完成。
本发明还包括一种筛选一种或多种化合物以检测是否存在可被哺乳动物察觉到的味道的方法,包括:把上述所指的一种或多种化合物与公开受体接触,优选地其中哺乳动物是人。本发明同样可以包括展示哺乳动物对特定味道的味觉感知的方法,包括以下步骤:提供代表该脊椎动物n种化学感受受体中每一种的定量刺激的X1到Xn值,其中n大于或等于2;从这些值中产生出一个味觉感知的定量描述。化学感受受体可以是此处公开的化学感受受体,描述可能包含一个点或n维空间的一个体积,可能包含一个图或一个谱,还可能包含一个定量描述矩阵。同样,提供的步骤可能包括将多数重组产生的化学感受受体与待测组合物接触,定量测量该组合物与该受体的作用。
本发明同样涵盖预测在哺乳动物中产生未知的味觉感知的一种或多种分子或分子组合在哺乳动物中产生的味觉感知的法,包括以下步骤:对于在哺乳动物中产生已知味觉感知的一种或多种分子或分子组合,提供X1到Xn值代表该脊椎动物n个化学感受受体中每一个的刺激量,其中n大于或等于2;对于一种或多种分子或分子组合在哺乳动物中产生已知的味觉感知,从该值中产生出一个味觉感知的定量描述,对于在哺乳动物中产生未知味觉感知的一种或多种分子或分子组合,提供X1到Xn值代表该脊椎动物n个化学感受受体中每一个的刺激量,其中n大于或等于2;对于一种或多种分子或分子组合在哺乳动物中产生未知的味觉感知,从该值中产生出一个味觉感知的定量描述,预测一种或多种分子或分子组合在哺乳动物中产生的未知味觉感知,方法是将一种或多种分子或分子组合在哺乳动物中产生的未知味觉感知引起的定量的描述与一种或多种分子或分子组合在哺乳动物中产生的已知味觉感知引起的定量的描述相比较。本方法中所用化学感受受体可以包括此处公开的一个化学感受受体。
在另一个实施方案中,通过确定如上所述的已知分子或分子组合在哺乳动物中的味觉感知值;确定一种或多种未知分子或分子组合在哺乳动物中的味觉感知值;将一种或多种未知组合物在哺乳动物中的味觉感知值和一种或多种已知组合物在哺乳动物中的味觉感知值相比较;选择能够引发哺乳动物特定味觉感知的分子或分子组合;并合并两个或更多未知分子或分子组合以形成能够引发哺乳动物中预定味觉感知的分子或分子组合,从而获得在哺乳动物中引发预定味觉感知的新型分子或分子组合。合并步骤产生能够在哺乳动物中引发特定味觉感知的单独分子或分子组合。
本发明的另一个实施方案是提供刺激味觉的方法,包括以下步骤:对于克隆化学感受受体群,优选的是人类受体群中的每一个,确定化学感受受体与味觉元的作用程度;合并各自预先确定与一种或多种所述受体有相互作用的化合物群,其用量是在一起能提供模拟味觉元作用图的受体-刺激作用图。通过在此描述的任何一种结合或报告子试验可以确定味觉元与化学感受受体的相互作用。该多数化合物然后可以合并以形成一种混合物。如果需要,该多数化合物中的一种或多种可以共价结合。组合后的化合物基本上刺激至少75%、80%或90%的基本上由味觉元刺激的受体。
在本发明另一个优选实施方案中,针对多数化学感受受体测试多数标准化合物,来确定每一个受体和每一个标准化合物的相互作用程度,因此针对每一个标准化合物产生一个受体刺激图。然后这些受体刺激图可以存储在存在于数据存储介质上的相关数据库中。本方法可进一步包括提供味觉的所需受体刺激图;比较所需受体刺激图与相关数据库;确定与所需的受体刺激图最密切匹配的一种或多种标准化合物组合。本方法还进一步包括将标准化合物组合成一种或多种已经确定的组合形式来刺激味觉。
H.试剂盒
T1R基因和它们的同源体是鉴定化学感受受体细胞、法医学和亲子鉴定、检验味觉传导的有利工具。能够特异性与T1R核酸杂交的T1R家族特异性试剂,如T1R探针和引物,以及能够特异性结合T1R多肽的T1R特异性试剂,例如T1R抗体,可以用于检验味觉细胞表达和味觉传导调节。
确定样品中T1R家族成员DNA和RNA是否存在的核酸试验包括本领域众所周知的许多技术,例如Southern分析、Northern分析、点印迹、RNA酶保护、S1分析、扩增技术如PCR、和原位杂交。例如在原位杂交中,靶核酸从它的细胞内环境中释放出来,以便能在细胞内进行杂交,同时保持细胞形态,利于随后的解释和分析。以下文章提供了原位杂交的概况:Singer等,Biotechniques,4:230-250(1986);Haase等,Methodsin Virology,vol.VII pp.189-226(1984);and Nucleic AcidHybridization:A Practical Approach(Names et al.,eds.1987)。另外,T1R多肽可以使用如上描述的各种免疫试验技术来检测。测试样品通常同时与阳性对照(例如,表达重组T1R多肽的样品)和阴性对照比较。
本发明同样提供了筛选T1R家族成员调节子的试剂盒。这些试剂盒可以从现成材料和试剂中制备。例如,这些试剂盒可以包含以下材料中的任何一种或多种:T1R核酸或蛋白质、反应试管、测试T1R活性的指南等。可选地,试剂盒包含生物活性的T1R受体。按照本发明可以制备多种试剂盒和组分,这取决于试剂盒的特定用户和用户的特殊需求。
实施例
此处提供的蛋白质序列中,单字母X或Xaa指二十种常见氨基酸残基中的任意一种。此处提供的DNA序列中,单字母N或n代表四种常见核苷酸碱基A、T、C、G中的任意一种。
实施例1-hT1R3
下面提供为SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的hT1R3基因组DNA,其中推测的编码序列(cds)用粗体显示。5’和3’毗连(序列)群之间的切断用省略号(‘……’)表示。hT1R3推测的cds描述于SEQ ID NO3中。最后,优选的、推测的hT1R3氨基酸序列描述于SEQ ID NO4中,其中使用单字母表示氨基酸。
hT1R3基因组DNA-5’毗连(序列)群(SEQ ID NO 1)
AGCCTGGCAGTGGCCTCAGGCAGAGTCTGACGCGCACAAACTTTCAGGCCCAGGAAGCGA
GGACACCACTGGGGCCCCAGGGTGTGGCAAGTGAGGATGGCAAGGGTTTTGCTAAACAAA
TCCTCTGCCCGCTCCCCGCCCCGGGCTCACTCCATGTGAGGCCCCAGTCGGGGCAGCCACC
TGCCGTGCCTGTTGGAAGTTGCCTCTGCCATGCTGGGCCCTGCTGTCCTGGGCCTCAGC
CTCTGGGCTCTCCTGCACCCTGGGACGGGGGCCCCATTGTGCCTGTCACAGCAACTT
AGGATGAAGGGGGACTACGTGCTGGGGGGGCTGTTCCCCCTGGGCGAGGCCGAGGA
GGCTGGCCTCCGCAGCCGGACACGGCCCAGCAGCCCTGTGTGCACCAGGTACAGAGG
TGGGACGGCCTGGGTCGGGGTCAGGGTGACCAGGTCTGGGGTGCTCCTGAGCTGGGGCCG
AGGTGGCCATCTGCGGTTCTGTGTGGCCCCAGGTTCTCCTCAAACGGCCTGCTCTGGGC
ACTGGCCATGAAAATGGCCGTGGAGGAGATCAACAACAAGTCGGATCTGCTGCCCGG
GCTGCGCCTGGGCTACGACCTCTTTGATACGTGCTCGGAGCCTGTGGTGGCCATGAA
GCCCAGCCTCATGTTCCTGGCCAAGGCAGGCAGCCGCGACATCGCCGCCTACTGCAA
CTACACGCAGTACCAGCCCCGTGTGCTGGCTGTCATCGGGCCCCACTCGTCAGAGCT
CGCCATGGTCACCGGCAAGTTCTTCAGCTTCTTCCTCATGCCCCAGTGGGGCGCCCCC
CACCATCACCCACCCCCAACCAACCCCTGCCCCGTGGGAGCCCCTTGTGTCAGGAGAATGC
(SEQ ID NO:1)
hT1R3基因组DNA-3’毗连(序列)群(SEQ ID NO 2)
..................TACATGCACCCCACCCAGCCCTGCCCTGGGAGCCCTGTGTCAGAAGATGC
TCTTGGCCTTGCAGGTCAGCTACGGTGCTAGCATGGAGCTGCTGAGCGCCCGGGAGAC
CTTCCCCTCCTTCTTCCGCACCGTGCCCAGCGACCGTGTGCAGCTGACGGCCGCCGC
GGAGCTGCTGCAGGAGTTCGGCTGGAACTGGGTGGCCGCCCTGGGCAGCGACGACG
AGTACGGCCGGCAGGGCCTGAGCATCTTCTCGGCCCTGGCCGCGGCACGCGGCATCT
GCATCGCGCACGAGGGCCTGGTGCCGCTGCCCCGTGCCGATGACTCGCGGCTGGGG
AAGGTGCAGGACGTCCTGCACCAGGTGAACCAGAGCAGCGTGCAGGTGGTGCTGCT
GTTCGCCTCCGTGCACGCCGCCCACGCCCTCTTCAACTACAGCATCAGCAGCAGGCT
CTCGCCCAAGGTGTGGGTGGCCAGCGAGGCCTGGCTGACCTCTGACCTGGTCATGGG
GCTGCCCGGCATGGCCCAGATGGGCACGGTGCTTGGCTTCCTCCAGAGGGGTGCCCA
GCTGCACGAGTTCCCCCAGTACGTGAAGACGCACCTGGCCCTGGCCACCGACCCGGC
CTTCTGCTCTGCCCTGGGCGAGAGGGAGCAGGGTCTGGAGGAGGACGTGGTGGGCC
AGCGCTGCCCGCAGTGTGACTGCATCACGCTGCAGAACGTGAGCGCAGGGCTAAATC
ACCACCAGACGTTCTCTGTCTACGCAGCTGTGTATAGCGTGGCCCAGGCCCTGCACA
ACACTCTTCAGTGCAACGCCTCAGGCTGCCCCGCGCAGGACCCCGTGAAGCCCTGGC
AGGTGAGCCCGGGAGATGGGGGTGTGCTGTCCTCTGCATGTGCCCAGGCCACCAGGCACG
GCCACCACGCCTGAGCTGGAGGTGGCTGGCGGCTCAGCCCCGTCCCCCGCCCGCAGCTCC
TGGAGAACATGTACAACCTGACCTTCCACGTGGGCGGGCTGCCGCTGCGGTTCGACA
GCAGCGGAAACGTGGACATGGAGTACGACCTGAAGCTGTGGGTGTGGCAGGGCTCA
GTGCCCAGGCTCCACGACGTGGGCAGGTTCAACGGCAGCCTCAGGACAGAGCGCCT
GAAGATCCGCTGGCACACGTCTGACAACCAGGTGAGGTGAGGGTGGGTGTGCCAGGCG
TGCCCGTGGTAGCCCCCGCGGCAGGGCGCAGCCTGGGGGTGGGGGCCGTTCCAGTCTCCC
GTGGGCATGCCCAGCCGAGCAGAGCCAGACCCCAGGCCTGTGCGCAGAAGCCCGTGTCC
CGGTGCTCGCGGCAGTGCCAGGAGGGCCAGGTGCGCCGGGTCAAGGGGTTCCACTC
CTGCTGCTACGACTGTGTGGACTGCGAGGCGGGCAGCTACCGGCAAAACCCAGGTGA
GCCGCCTTCCCGGCAGGCGGGGGTGGGAACGCAGCAGGGGAGGGTCCTGCCAAGTCCTGA
CTCTGAGACCAGAGCCCACAGGGTACAAGACGAACACCCAGCGCCCTTCTCCTCTCTCACA
GACGACATCGCCTGCACCTTTTGTGGCCAGGATGAGTGGTCCCCGGAGCGAAGCACA
CGCTGCTTCCGCCGCAGGTCTCGGTTCCTGGCATGGGGCGAGCCGGCTGTGCTGCTG
CTGCTCCTGCTGCTGAGCCTGGCGCTGGGCCTTGTGCTGGCTGCTTTGGGGCTGTTC
GTTCACCATCGGGACAGCCCACTGGTTCAGGCCTCGGGGGGGCCCCTGGCCTGCTTT
GGCCTGGTGTGCCTGGGCCTGGTCTGCCTCAGCGTCCTCCTGTTCCCTGGCCAGCCC
AGCCCTGCCCGATGCCTGGCCCAGCAGCCCTTGTCCCACCTCCCGCTCACGGGCTGC
CTGAGCACACTCTTCCTGCAGGCGGCCGAGATCTTCGTGGAGTCAGAACTGCCTCTG
AGCTGGGCAGACCGGCTGAGTGGCTGCCTGCGGGGGCCCTGGGCCTGGCTGGTGGT
GCTGCTGGCCATGCTGGTGGAGGTCGCACTGTGCACCTGGTACCTGGTGGCCTTCCC
GCCGGAGGTGGTGACGGACTGGCACATGCTGCCCACGGAGGCGCTGGTGCACTGCC
GCACACGCTCCTGGGTCAGCTTCGGCCTAGCGCACGCCACCAATGCCACGCTGGCCT
TTCTCTGCTTCCTGGGCACTTTCCTGGTGCGGAGCCAGCCGGGCTGCTACAACCGTG
CCCGTGGCCTCACCTTTGCCATGCTGGCCTACTTCATCACCTGGGTCTCCTTTGTGCC
CCTCCTGGCCAATGTGCAGGTGGTCCTCAGGCCCGCCGTGCAGATGGGCGCCCTCCT
GCTCTGTGTCCTGGGCATCCTGGCTGCCTTCCACCTGCCCAGGTGTTACCTGCTCATG
CGGCAGCCAGGGCTCAACACCCCCGAGTTCTTCCTGGGAGGGGGCCCTGGGGATGC
CCAAGGCCAGAATGACGGGAACACAGGAAATCAGGGGAAACATGAGTGACCCAACCC
TGTGATCTCAGCCCCGGTGAACCCAGACTTAGCTGCGATCCCCCCCAAGCCAGCAATGACC
CGTGTCTCGCTACAGAGACCCTCCCGCTCTAGGTTCTGACCCCAGGTTGTCTCCTGACCCT
GACCCCACAGTGAGCCCTAGGCCTGGAGCACGTGGACACCCCTGTGACCATC(SEQ ID NO
2)
hT1R3全长基因组DNA(SEQ ID NO 20)
AGCCTGGCAGTGGCCTCAGGCAGAGTCTGACGCGCACAAACTTTCAGGCCCAGGAAGCGA
GGACACCACTGGGGCCCCAGGGTGTGGCAAGTGAGGATGGCAAGGGTTTTGCTAAACAAA
TCCTCTGCCCGCTCCCCGCCCCGGGCTCACTCCATGTGAGGCCCCAGTCGGGGCAGCCACC
TGCCGTGCCTGTTGGAAGTTGCCTCTGCCATGCTGGGCCCTGCTGTCCTGGGCCTCAGC
CTCTGGGCTCTCCTGCACCCTGGGACGGGGGCCCCATTGTGCCTGTCACAGCAACTT
AGGATGAAGGGGGACTACGTGCTGGGGGGGCTGTTCCCCCTGGGCGAGGCCGAGGA
GGCTGGCCTCCGCAGCCGGACACGGCCCAGCAGCCCTGTGTGCACCAGGTACAGAGG
TGGGACGGCCTGGGTCGGGGTCAGGGTGACCAGGTCTGGGGTGCTCCTGAGCTGGGGCCG
AGGTGGCCATCTGCGGTTCTGTGTGGCCCCAGGTTCTCCTCAAACGGCCTGCTCTGGGC
ACTGGCCATGAAAATGGCCGTGGAGGAGATCAACAACAAGTCGGATCTGCTGCCCGG
GCTGCGCCTGGGCTACGACCTCTTTGATACGTGCTCGGAGCCTGTGGTGGCCATGAA
GCCCAGCCTCATGTTCCTGGCCAAGGCAGGCAGCCGCGACATCGCCGCCTACTGCAA
CTACACGCAGTACCAGCCCCGTGTGCTGGCTGTCATCGGGCCCCACTCGTCAGAGCT
CGCCATGGTCACCGGCAAGTTCTTCAGCTTCTTCCTCATGCCCCAGTGGGGCGCCCCC
CACCATCACCCACCCCCAACCAACCCCTGCCCCGTGGGAGCCCCTTGTGTCAGGAGAATGC
TACATGCACCCCACCCAGCCCTGCCCTGGGAGCCCTGTGTCAGAAGATGCTCTTGGCCTTG
CAGGTCAGCTACGGTGCTAGCATGGAGCTGCTGAGCGCCCGGGAGACCTTCCCCTCC
TTCTTCCGCACCGTGCCCAGCGACCGTGTGCAGCTGACGGCCGCCGCGGAGCTGCTG
CAGGAGTTCGGCTGGAACTGGGTGGCCGCCCTGGGCAGCGACGACGAGTACGGCCG
GCAGGGCCTGAGCATCTTCTCGGCCCTGGCCGCGGCACGCGGCATCTGCATCGCGCA
CGAGGGCCTGGTGCCGCTGCCCCGTGCCGATGACTCGCGGCTGGGGAAGGTGCAGG
ACGTCCTGCACCAGGTGAACCAGAGCAGCGTGCAGGTGGTGCTGCTGTTCGCCTCCG
TGCACGCCGCCCACGCCCTCTTCAACTACAGCATCAGCAGCAGGCTCTCGCCCAAGG
TGTGGGTGGCCAGCGAGGCCTGGCTGACCTCTGACCTGGTCATGGGGCTGCCCGGCA
TGGCCCAGATGGGCACGGTGCTTGGCTTCCTCCAGAGGGGTGCCCAGCTGCACGAGT
TCCCCCAGTACGTGAAGACGCACCTGGCCCTGGCCACCGACCCGGCCTTCTGCTCTG
CCCTGGGCGAGAGGGAGCAGGGTCTGGAGGAGGACGTGGTGGGCCAGCGCTGCCCG
CAGTGTGACTGCATCACGCTGCAGAACGTGAGCGCAGGGCTAAATCACCACCAGACG
TTCTCTGTCTACGCAGCTGTGTATAGCGTGGCCCAGGCCCTGCACAACACTCTTCAGT
GCAACGCCTCAGGCTGCCCCGCGCAGGACCCCGTGAAGCCCTGGCAGGTGAGCCCGG
GAGATGGGGGTGTGCTGTCCTCTGCATGTGCCCAGGCCACCAGGCACGGCCACCACGCCT
GAGCTGGAGGTGGCTGGCGGCTCAGCCCCGTCCCCCGCCCGCAGCTCCTGGAGAACATGT
ACAACCTGACCTTCCACGTGGGCGGGCTGCCGCTGCGGTTCGACAGCAGCGGAAACG
TGGACATGGAGTACGACCTGAAGCTGTGGGTGTGGCAGGGCTCAGTGCCCAGGCTCC
ACGACGTGGGCAGGTTCAACGGCAGCCTCAGGACAGAGCGCCTGAAGATCCGCTGG
CACACGTCTGACAACCAGGTGAGGTGAGGGTGGGTGTGCCAGGCGTGCCCGTGGTAGCC
CCCGCGGCAGGGCGCAGCCTGGGGGTGGGGGCCGTTCCAGTCTCCCGTGGGCATGCCCAG
CCGAGCAGAGCCAGACCCCAGGCCTGTGCGCAGAAGCCCGTGTCCCGGTGCTCGCGGC
AGTGCCAGGAGGGCCAGGTGCGCCGGGTCAAGGGGTTCCACTCCTGCTGCTACGACT
GTGTGGACTGCGAGGCGGGCAGCTACCGGCAAAACCCAGGTGAGCCGCCTTCCCGGCA
GGCGGGGGTGGGAACGCAGCAGGGGAGGGTCCTGCCAAGTCCTGACTCTGAGACCAGAGC
CCACAGGGTACAAGACGAACACCCAGCGCCCTTCTCCTCTCTCACAGACGACATCGCCTG
CACCTTTTGTGGCCAGGATGAGTGGTCCCCGGAGCGAAGCACACGCTGCTTCCGCCG
CAGGTCTCGGTTCCTGGCATGGGGCGAGCCGGCTGTGCTGCTGCTGCTCCTGCTGCT
GAGCCTGGCGCTGGGCCTTGTGCTGGCTGCTTTGGGGCTGTTCGTTCACCATCGGGA
CAGCCCACTGGTTCAGGCCTCGGGGGGGCCCCTGGCCTGCTTTGGCCTGGTGTGCCT
GGGCCTGGTCTGCCTCAGCGTCCTCCTGTTCCCTGGCCAGCCCAGCCCTGCCCGATG
CCTGGCCCAGCAGCCCTTGTCCCACCTCCCGCTCACGGGCTGCCTGAGCACACTCTT
CCTGCAGGCGGCCGAGATCTTCGTGGAGTCAGAACTGCCTCTGAGCTGGGCAGACCG
GCTGAGTGGCTGCCTGCGGGGGCCCTGGGCCTGGCTGGTGGTGCTGCTGGCCATGCT
GGTGGAGGTCGCACTGTGCACCTGGTACCTGGTGGCCTTCCCGCCGGAGGTGGTGAC
GGACTGGCACATGCTGCCCACGGAGGCGCTGGTGCACTGCCGCACACGCTCCTGGGT
CAGCTTCGGCCTAGCGCACGCCACCAATGCCACGCTGGCCTTTCTCTGCTTCCTGGG
CACTTTCCTGGTGCGGAGCCAGCCGGGCTGCTACAACCGTGCCCGTGGCCTCACCTT
TGCCATGCTGGCCTACTTCATCACCTGGGTCTCCTTTGTGCCCCTCCTGGCCAATGTG
CAGGTGGTCCTCAGGCCCGCCGTGCAGATGGGCGCCCTCCTGCTCTGTGTCCTGGGC
ATCCTGGCTGCCTTCCACCTGCCCAGGTGTTACCTGCTCATGCGGCAGCCAGGGCTC
AACACCCCCGAGTTCTTCCTGGGAGGGGGCCCTGGGGATGCCCAAGGCCAGAATGAC
GGGAACACAGGAAATCAGGGGAAACATGAGTGACCCAACCCTGTGATCTCAGCCCCGG
TGAACCCAGACTTAGCTGCGATCCCCCCCAAGCCAGCAATGACCCGTGTCTCGCTACAGAG
ACCCTCCCGCTCTAGGTTCTGACCCCAGGTTGTCTCCTGACCCTGACCCCACAGTGAGCCC
TAGGCCTGGAGCACGTGGACACCCCTGTGACCATC(SEQ ID NO 20)
hT1R3推测的cds(SEQ ID NO 3)
ATGCTGGGCCCTGCTGTCCTGGGCCTCAGCCTCTGGGCTCTCCTGCACCCTGGGACGGGGG
CCCCATTGTGCCTGTCACAGCAACTTAGGATGAAGGGGGACTACGTGCTGGGGGGGCTGT
TCCCCCTGGGCGAGGCCGAGGAGGCTGGCCTCCGCAGCCGGACACGGCCCAGCAGCCCTG
TGTGCACCAGGTTCTCCTCAAACGGCCTGCTCTGGGCACTGGCCATGAAAATGGCCGTGGA
GGAGATCAACAACAAGTCGGATCTGCTGCCCGGGCTGCGCCTGGGCTACGACCTCTTTGAT
ACGTGCTCGGAGCCTGTGGTGGCCATGAAGCCCAGCCTCATGTTCCTGGCCAAGGCAGGC
AGCCGCGACATCGCCGCCTACTGCAACTACACGCAGTACCAGCCCCGTGTGCTGGCTGTCA
TCGGGCCCCACTCGTCAGAGCTCGCCATGGTCACCGGCAAGTTCTTCAGCTTCTTCCTCAT
GCCCCACTACGGTGCTAGCATGGAGCTGCTGAGCGCCCGGGAGACCTTCCCCTCCTTCTTC
CGCACCGTGCCCAGCGACCGTGTGCAGCTGACGGCCGCCGCGGAGCTGCTGCAGGAGTTC
GGCTGGAACTGGGTGGCCGCCCTGGGCAGCGACGACGAGTACGGCCGGCAGGGCCTGAGC
ATCTTCTCGGCCCTGGCCGCGGCACGCGGCATCTGCATCGCGCACGAGGGCCTGGTGCCGC
TGCCCCGTGCCGATGACTCGCGGCTGGGGAAGGTGCAGGACGTCCTGCACCAGGTGAACC
AGAGCAGCGTGCAGGTGGTGCTGCTGTTCGCCTCCGTGCACGCCGCCCACGCCCTCTTCAA
CTACAGCATCAGCAGCAGGCTCTCGCCCAAGGTGTGGGTGGCCAGCGAGGCCTGGCTGAC
CTCTGACCTGGTCATGGGGCTGCCCGGCATGGCCCAGATGGGCACGGTGCTTGGCTTCCTC
CAGAGGGGTGCCCAGCTGCACGAGTTCCCCCAGTACGTGAAGACGCACCTGGCCCTGGCC
ACCGACCCGGCCTTCTGCTCTGCCCTGGGCGAGAGGGAGCAGGGTCTGGAGGAGGACGTG
GTGGGCCAGCGCTGCCCGCAGTGTGACTGCATCACGCTGCAGAACGTGAGCGCAGGGCTA
AATCACCACCAGACGTTCTCTGTCTACGCAGCTGTGTATAGCGTGGCCCAGGCCCTGCACA
ACACTCTTCAGTGCAACGCCTCAGGCTGCCCCGCGCAGGACCCCGTGAAGCCCTGGCAGCT
CCTGGAGAACATGTACAACCTGACCTTCCACGTGGGCGGGCTGCCGCTGCGGTTCGACAGC
AGCGGAAACGTGGACATGGAGTACGACCTGAAGCTGTGGGTGTGGCAGGGCTCAGTGCCC
AGGCTCCACGACGTGGGCAGGTTCAACGGCAGCCTCAGGACAGAGCGCCTGAAGATCCGC
TGGCACACGTCTGACAACCAGAAGCCCGTGTCCCGGTGCTCGCGGCAGTGCCAGGAGGGC
CAGGTGCGCCGGGTCAAGGGGTTCCACTCCTGCTGCTACGACTGTGTGGACTGCGAGGCG
GGCAGCTACCGGCAAAACCCAGACGACATCGCCTGCACCTTTTGTGGCCAGGATGAGTGG
TCCCCGGAGCGAAGCACACGCTGCTTCCGCCGCAGGTCTCGGTTCCTGGCATGGGGCGAGC
CGGCTGTGCTGCTGCTGCTCCTGCTGCTGAGCCTGGCGCTGGGCCTTGTGCTGGCTGCTTT
GGGGCTGTTCGTTCACCATCGGGACAGCCCACTGGTTCAGGCCTCGGGGGGGCCCCTGGCC
TGCTTTGGCCTGGTGTGCCTGGGCCTGGTCTGCCTCAGCGTCCTCCTGTTCCCTGGCCAGCC
CAGCCCTGCCCGATGCCTGGCCCAGCAGCCCTTGTCCCACCTCCCGCTCACGGGCTGCCTG
AGCACACTCTTCCTGCAGGCGGCCGAGATCTTCGTGGAGTCAGAACTGCCTCTGAGCTGGG
CAGACCGGCTGAGTGGCTGCCTGCGGGGGCCCTGGGCCTGGCTGGTGGTGCTGCTGGCCA
TGCTGGTGGAGGTCGCACTGTGCACCTGGTACCTGGTGGCCTTCCCGCCGGAGGTGGTGAC
GGACTGGCACATGCTGCCCACGGAGGCGCTGGTGCACTGCCGCACACGCTCCTGGGTCAG
CTTCGGCCTAGCGCACGCCACCAATGCCACGCTGGCCTTTCTCTGCTTCCTGGGCACTTTCC
TGGTGCGGAGCCAGCCGGGCTGCTACAACCGTGCCCGTGGCCTCACCTTTGCCATGCTGGC
CTACTTCATCACCTGGGTCTCCTTTGTGCCCCTCCTGGCCAATGTGCAGGTGGTCCTCAGGC
CCGCCGTGCAGATGGGCGCCCTCCTGCTCTGTGTCCTGGGCATCCTGGCTGCCTTCCACCT
GCCCAGGTGTTACCTGCTCATGCGGCAGCCAGGGCTCAACACCCCCGAGTTCTTCCTGGGA
GGGGGCCCTGGGGATGCCCAAGGCCAGAATGACGGGAACACAGGAAATCAGGGGAAACA
TGAGTGA(SEQ ID NO 3)
hT1R3概念性翻译(SEQ ID NO 4)
MLGPAVLGLSLWALLHPGTGAPLCLSQQLRMKGDYVLGGLFPLGEAEEAGLRSRTRPSSPVCT
RFSSNGLLWALAMKMAVEEINNKSDLLPGLRLGYDLFDTCSEPVVAMKPSLMFLAKAGSRDI
AAYCNYTQYQPRVLAVIGPHSSELAMVTGKFFSFFLMPHYGASMELLSARETFPSFFRTVPSDR
VQLTAAAELLQEFGWNWVAALGSDDEYGRQGLSIFSALAAARGICIAHEGLVPLPRADDSRLG
KVQDVLHQVNQSSVQVVLLFASVHAAHALFNYSISSRLSPKVWVASEAWLTSDLVMGLPGM
AQMGTVLGFLQRGAQLHEFPQYVKTHLALATDPAFCSALGEREQGLEEDVVGQRCPQCDCIT
LQNVSAGLNHHQTFSVYAAVYSVAQALHNTLQCNASGCPAQDPVKPWQLLENMYNLTFHVG
GLPLRFDSSGNVDMEYDLKLWVWQGSVPRLHDVGRFNGSLRTERLKIRWHTSDNQKPVSRCS
RQCQEGQVRRVKGFHSCCYDCVDCEAGSYRQNPDDIACTFCGQDEWSPERSTRCFRRRSRFLA
WGEPAVLLLLLLLSLALGLVLAALGLFVHHRDSPLVQASGGPLACFGLVCLGLVCLSVLLFPG
QPSPARCLAQQPLSHLPLTGCLSTLFLQAAEIFVESELPLSWADRLSGCLRGPWAWLVVLLAML
VEVALCTWYLVAFPPEVVTDWHMLPTEALVHCRTRSWVSFGLAHATNATLAFLCFLGTFLVR
SQPGCYNRARGLTFAMLAYFITWVSFVPLLANVQVVLRPAVQMGALLLCVLGILAAFHLPRCY
LLMRQPGLNTPEFFLGGGPGDAQGQNDGNTGNQGKHE(SEQ ID NO 4)
实施例2-rT1R3和mT1R3
用基于人T1R3序列的简并引物通过PCR扩增的方法从基因组DNA分离大鼠和小鼠T1R3基因区段。简并引物SAPO77(5’-CGNTTYYTNGCNTGGGGNGARCC-3’;SEQ ID NO 5)和SAP079(5’-CGNGCNCGRTTRTARCANCCNGG-3’;SEQ ID NO 6)分别与人T1R3残基RFLAWGEPA(相应于SEQ ID NO 7)和PGCYNRAR(相应于SEQ ID NO 8)互补。PCR产物克隆后被测序。SAV115质粒携带小鼠T1R3基因的克隆区段,SAV118质粒携带大鼠基因的克隆区段。下面显示的这些序列,清楚地显示出人T1R3在啮齿类动物中的对应部分,因为小鼠区段有74%与相应的人T1R3区段相同,大鼠区段有80%与相应的人T1R3区段相同。小鼠和大鼠区段有88%相同。其它数据库序列与这些T1R3区段相比没有超过40%相同。
感觉定位中的SAV115小鼠T1R3区段(与简并引物相关的序列已被去
除)(SEQ ID NO 9)
GTGCTGTCACTCCTCCTGCTGCTTTGCCTGGTGCTGGGTCTAGCACTGGCTGCTCTGGGGCT
CTCTGTCCACCACTGGGACAGCCCTCTTGTCCAGGCCTCAGGCGGCTCACAGTTCTGCTTT
GGCCTGATCTGCCTAGGCCTCTTCTGCCTCAGTGTCCTTCTGTTCCCAGGACGGCCAAGCTC
TGCCAGCTGCCTTGCACAACAACCAATGGCTCACCTCCCTCTCACAGGCTGCCTGAGCACA
CTCTTCCTGCAAGCAGCTGAGACCTTTGTGGAGTCTGAGCTGCCACTGAGCTGGGCAAACT
GGCTATGCAGCTACCTTCGGGACTCTGGCCTGCTAGTGGTACTGTTGGCCACTTTTGTGGA
GGCAGCACTATGTGCCTGGTATTTGACCGCTTCACCAGAAGTGGTGACAGACTGGTCAGTG
CTGCCCACAGAGGTACTGGAGCACTGCCACGTGCGTTCCTGGGTCAACCTGGGCTTGGTGC
ACATCACCAATGCAATGGTAGCTTTTCTCTGCTTTCTGGGCACTTTCCTGGTACAAGACCA
G(SEQ ID NO 9)
mT1R3区段,概念性翻译(SEQ ID NO 10)
VLSLLLLLCLVLGLALAALGLSVHHWDSPLVQASGGSQFCFGLICLGLFCLSVLLFPGRPSSASC
LAQQPMAHLPLTGCLSTLFLQAAETFVESELPLSWANWLCSYLRDSGLLVVLLATFVEAALCA
WYLTASPEVVTDWSVLPTEVLEHCHVRSWVNLGLVHITNAMVAFLCFLGTFLVQDQ(SEQ ID
NO 10)
感觉定位中的SAV118大鼠T1R3区段(与简并引物相应的序列已被去
除)(SEQ ID NO 11)
GTGCTGTCACTTCTCCTGCTGCTTTGCCTGGTGCTGGGCCTGACACTGGCTGCCCTGGGGC
TCTTTGTCCACTACTGGGACAGCCCTCTTGTTCAGGCCTCAGGTGGGTCACTGTTCTGCTTT
GGCCTGATCTGCCTAGGCCTCTTCTGCCTCAGTGTCCTTCTGTTCCCAGGACGACCACGCTC
TGCCAGCTGCCTTGCCCAACAACCAATGGCTCACCTCCCTCTCACAGGCTGCCTGAGCACA
CTCTTCCTGCAAGCAGCCGAGATCTTTGTGGAGTCTGAGCTGCCACTGAGTTGGGCAAACT
GGCTCTGCAGCTACCTTCGGGGCCCCTGGGCTTGGCTGGTGGTACTGCTGGCCACTCTTGT
GGAGGCTGCACTATGTGCCTGGTACTTGATGGCTTTCCCTCCAGAGGTGGTGACAGATTGG
CAGGTGCTGCCCACGGAGGTACTGGAACACTGCCGCATGCGTTCCTGGGTCAGCCTGGGCT
TGGTGCACATCACCAATGCAGGGGTAGCTTTCCTCTGCTTTCTGGGCACTTTCCTGGTACA
AAGCCAG(SEQ ID NO 11)
rT1R3区段,概念性翻译(SEQ ID NO 12)
VLSLLLLLCLVLGLTLAALGLFVHYWDSPLVQASGGSLFCFGLICLGLFCLSVLLFPGRPRSASC
LAQQPMAHLPLTGCLSTLFLQAAEIFVESELPLSWANWLCSYLRGPWAWLVVLLATLVEAAL
CAWYLMAFPPEVVTDWQVLPTEVLEHCRMRSWVSLGLVHITNAGVAFLCFLGTFLVQSQ
(SEQ ID NO 12)
实施例3-rT1R3的克隆
上述鉴定为SEQ ID 9和11的mT1R3和rT1R3片段用于筛选大鼠味觉组织-衍生的cDNA文库。一个阳性克隆,经测序后发现含有全长的下面SEQ ID NO 13所示的rT1R3序列。与mT1R3和rT1R3部分序列和全长hT1R3序列比较后发现,该cDNA代表了hT1R3的大鼠对应序列。例如rT1R3和hT1R3之间的氨基酸成对相同性大约是72%,然而公开DNA序列数据库中与rT1R3最相关的注释序列只有大约33%的相同性。
rT1R3推测的cds(SEQ ID NO 13)
ATGCCGGGTTTGGCTATCTTGGGCCTCAGTCTGGCTGCTTTCCTGGAGCTTGGGATGGGGT
CCTCTTTGTGTCTGTCACAGCAATTCAAGGCACAAGGGGACTATATATTGGGTGGACTATT
TCCCCTGGGCACAACTGAGGAGGCCACTCTCAACCAGAGAACACAGCCCAACGGCATCCT
ATGTACCAGGTTCTCGCCCCTTGGTTTGTTCCTGGCCATGGCTATGAAGATGGCTGTAGAG
GAGATCAACAATGGATCTGCCTTGCTCCCTGGGCTGCGACTGGGCTATGACCTGTTTGACA
CATGCTCAGAGCCAGTGGTCACCATGAAGCCCAGCCTCATGTTCATGGCCAAGGTGGGAA
GTCAAAGCATTGCTGCCTACTGCAACTACACACAGTACCAACCCCGTGTGCTGGCTGTCAT
TGGTCCCCACTCATCAGAGCTTGCCCTCATTACAGGCAAGTTCTTCAGCTTCTTCCTCATGC
CACAGGTCAGCTATAGTGCCAGCATGGATCGGCTAAGTGACCGGGAAACATTTCCATCCTT
CTTCCGCACAGTGCCCAGTGACCGGGTGCAGCTGCAGGCCGTTGTGACACTGTTGCAGAAT
TTCAGCTGGAACTGGGTGGCTGCCTTAGGTAGTGATGATGACTATGGCCGGGAAGGTCTG
AGCATCTTTTCTGGTCTGGCCAACTCACGAGGTATCTGCATTGCACACGAGGGCCTGGTGC
CACAACATGACACTAGTGGCCAACAATTGGGCAAGGTGGTGGATGTGCTACGCCAAGTGA
ACCAAAGCAAAGTACAGGTGGTGGTGCTGTTTGCATCTGCCCGTGCTGTCTACTCCCTTTT
TAGCTACAGCATCCTTCATGACCTCTCACCCAAGGTATGGGTGGCCAGTGAGTCCTGGCTG
ACCTCTGACCTGGTCATGACACTTCCCAATATTGCCCGTGTGGGCACTGTTCTTGGGTTTCT
GCAGCGCGGTGCCCTACTGCCTGAATTTTCCCATTATGTGGAGACTCGCCTTGCCCTAGCT
GCTGACCCAACATTCTGTGCCTCCCTGAAAGCTGAGTTGGATCTGGAGGAGCGCGTGATGG
GGCCACGCTGTTCACAATGTGACTACATCATGCTACAGAACCTGTCATCTGGGCTGATGCA
GAACCTATCAGCTGGGCAGTTGCACCACCAAATATTTGCAACCTATGCAGCTGTGTACAGT
GTGGCTCAGGCCCTTCACAACACCCTGCAGTGCAATGTCTCACATTGCCACACATCAGAGC
CTGTTCAACCCTGGCAGCTCCTGGAGAACATGTACAATATGAGTTTCCGTGCTCGAGACTT
GACACTGCAGTTTGATGCCAAAGGGAGTGTAGACATGGAATATGACCTGAAGATGTGGGT
GTGGCAGAGCCCTACACCTGTACTACATACTGTAGGCACCTTCAACGGCACCCTTCAGCTG
CAGCACTCGAAAATGTATTGGCCAGGCAACCAGGTGCCAGTCTCCCAGTGCTCCCGGCAGT
GCAAAGATGGCCAGGTGCGCAGAGTAAAGGGCTTTCATTCCTGCTGCTATGACTGTGTGG
ACTGCAAGGCAGGGAGCTACCGGAAGCATCCAGATGACTTCACCTGTACTCCATGTGGCA
AGGATCAGTGGTCCCCAGAAAAAAGCACAACCTGCTTACCTCGCAGGCCCAAGTTTCTGGC
TTGGGGGGAGCCAGCTGTGCTGTCACTTCTCCTGCTGCTTTGCCTGGTGCTGGGCCTGACA
CTGGCTGCCCTGGGGCTCTTTGTCCACTACTGGGACAGCCCTCTTGTTCAGGCCTCAGGTG
GGTCACTGTTCTGCTTTGGCCTGATCTGCCTAGGCCTCTTCTGCCTCAGTGTCCTTCTGTTC
CCAGGACGACCACGCTCTGCCAGCTGCCTTGCCCAACAACCAATGGCTCACCTCCCTCTCA
CAGGCTGCCTGAGCACACTCTTCCTGCAAGCAGCCGAGATCTTTGTGGAGTCTGAGCTGCC
ACTGAGTTGGGCAAACTGGCTCTGCAGCTACCTTCGGGGCCCCTGGGCTTGGCTGGTGGTA
CTGCTGGCCACTCTTGTGGAGGCTGCACTATGTGCCTGGTACTTGATGGCTTTCCCTCCAG
AGGTGGTGACAGATTGGCAGGTGCTGCCCACGGAGGTACTGGAACACTGCCGCATGCGTT
CCTGGGTCAGCCTGGGCTTGGTGCACATCACCAATGCAGTGTTAGCTTTCCTCTGCTTTCTG
GGCACTTTCCTGGTACAGAGCCAGCCTGGTCGCTATAACCGTGCCCGTGGCCTCACCTTCG
CCATGCTAGCTTATTTCATCATCTGGGTCTCTTTTGTGCCCCTCCTGGCTAATGTGCAGGTG
GCCTACCAGCCAGCTGTGCAGATGGGTGCTATCTTATTCTGTGCCCTGGGCATCCTGGCCA
CCTTCCACCTGCCCAAATGCTATGTACTTCTGTGGCTGCCAGAGCTCAACACCCAGGAGTT
CTTCCTGGGAAGGAGCCCCAAGGAAGCATCAGATGGGAATAGTGGTAGTAGTGAGGCAAC
TCGGGGACACAGTGAATGA(SEQ ID NO 13)
rT1R3概念性翻译(SEQ ID NO.14)
MPGLAILGLSLAAFLELGMGSSLCLSQQFKAQGDYILGGLFPLGTTEEATLNQRTQPNGILCTRF
SPLGLFLAMAMKMAVEEINNGSALLPGLRLGYDLFDTCSEPVVTMKPSLMFMAKVGSQSIAA
YCNYTQYQPRVLAVIGPHSSELALITGKFFSFFLMPQVSYSASMDRLSDRETFPSFFRTVPSDRV
QLQAVVTLLQNFSWNWVAALGSDDDYGREGLSIFSGLANSRGICIAHEGLVPQHDTSGQQLG
KVVDVLRQVNQSKVQVVVLFASARAVYSLFSYSILHDLSPKVWVASESWLTSDLVMTLPNIA
RVGTVLGFLQRGALLPEFSHYVETRLALAADPTFCASLKAELDLEERVMGPRCSQCDYIMLQN
LSSGLMQNLSAGQLHHQLFATYAAVYSVAQALHNTLQCNVSHCHTSEPVQPWQLLENMYNM
SFRARDLTLQFDAKGSVDMEYDLKMWVWQSPTPVLHTVGTFNGTLQLQHSKMYWPGNQVP
VSQCSRQCKDGQVRRVKGFHSCCYDCVDCKAGSYRKHPDDFTCTPCGKDQWSPEKSTTCLPR
RPKFLAWGEPAVLSLLLLLCLVLGLTLAALGLFVHYWDSPLVQASGGSLFCFGLICLGLFCLSV
LLFPGRPRSASCLAQQPMAHLPLTGCLSTLFLQAAEIFVESELPLSWANWLCSYLRGPWAWLV
VLLATLVEAALCAWYLMAFPPEVVTDWQVLPTEVLEHCRMRSWVSLGLVHITNAVLAFLCFL
GTFLVQSQPGRYNRARGLTFAMLAYFIIWVSFVPLLANVQVAYQPAVQMGAILFCALGILATF
HLPKCYVLLWLPELNTQEFFLGRSPKEASDGNSGSSEATRGHSE(SEQ ID NO 14)
实施例4-mT1R3表达
如上所述的、SAV115包含的小鼠T1R3片段用M13正向和M13反向引物进行PCR扩增,然后用凝胶纯化。T1R3 DNA模板放置到一个体外转录标记反应体系,其中地高辛标记的UTP掺入到反义cRNA探针上。该探针与包含轮廓乳头的成年小鼠味觉组织杂交。T1R3原位杂交和检测按照Schaeren-Wiemers等,Histochemistry,100:431-400(1993)的方案进行。简单来讲,将新鲜冰冻小鼠舌切成14μm并准备杂交。200ng/mL的反义地高辛T1R3探针在72℃杂交14小时。后杂交过程包括72℃,0.2×SSC漂洗。通过与1:5000稀释的抗-DIG碱性磷酸酶抗体孵育,然后在NBT/BCIP中与磷酸酶反应12小时,进行地高辛检测试验。图1显示T1R3基因在小鼠轮廓乳头的味蕾中的表达。
实施例5-hT1R1
提供的对应大鼠味觉受体rT1R1的人的直向进化同源物(数据库登录号AL159177)为下列的SEQ ID NO 15。推测的cds用粗体显示,一些内含子序列间隔用一长串N表示。核苷酸和概念性翻译的hT1R1此处分别描述为SEQ ID NO 16和17。
hT1R1基因组DNA(SEQ ID NO 15)
GAGAATCTCGCGAGATCCCGTCGGTCCGCCCCGCTGCCCTCCCAGCTGCCGAAAAGAGGG
GCCTCCGAGCCGCCGGCGCCCTCTGCCGGCAACCTCCGGAAGCACACTAGGAGGTTCCAG
CCGATCTGGTCGAGGGGCTCCACGGAGGACTCCATTTACGTTACGCAAATTCCCTACCCCA
GCCGGCCGGAGAGAGAAAGCCAGAAACCTCGCGACCAGCCATGGGCCACCTCTCCGGAAA
AACACCGGGATATTTTTTTTCTCCTGCAGAAAAAGCTTTAGGATTGGCAGTTTAAACAAAA
CATGTCTATTTGCATACCTTCGGTTTGCATGCATTTGTTTCGAAGTGAGCAACCCTGGGTA
ACAAGGCGAAAGTATATGACAATTTGCTCAGAATCTTAATGTCAGAAAACTGGAGACTGG
GGCAGGGGGGTGTCGACTCAAAGCTGTGTCTCATTTAGTAAACTGAGGCCCAGGTAAAAA
GTTCTGAAACCTCGCAACACCCGGAGAAATTGTGTTCCAGCCTCCCACCTCGCCCCAAAAT
GCCAGAGCTCCTTTTCTAAGCCAGGTGAAGTCACAGAGCGTGGACAGAACCCACAACCGT
CCAGAGGAAGGGTCACTGGGTGCCACCTGGTTTGCATCTGTGCCTTCGTCCTGCCCAGTTC
CTGAGTGGGACCGCAGGCCCGGAATGTCAAGGCAAACAGTCCTGCTTCAGCCACTGGGCT
CCAGTCCCACCCCTTTTGGGGGCCTGAAGTTAGGAAGCATCCGGCAGCTGCCTTCTATTTA
AGCAACTGGCCTCCTTAGAGGCCACTCCTTGGCCATGCCAGGCGCGGGCATCTGGCCAGCA
TGCTGCTCTGCACGGCTCGCCTGGTCGGCCTGCAGCTTCTCATTTCCTGCTGCTGGG
CCTTTGCCTGCCATAGCACGGAGTCTTCTCCTGACTTCACCCTCCCCGGAGATTACCT
CCTGGCAGGCCTGTTCCCTCTCCATTCTGGCTGTCTGCAGGTGAGGCACAGACCCGA
GGTGACCCTGTGTGACAGGTGAGTGAGGGGCCAGCAGAGCCACACTTAGTGGGACCCCT
GGCTATAGGGCCCCTCTGGCTGCCATCCTCCAAACAGGACCTTGCCTCTGCCTTTGCCCCTT
GAACTGTCCCCAGGCCTTGTTCATCAATCCACTTGCCACCTAAGTGCTGGCTAGACCTTCCT
AGACACTTCGGCCAGTTTCCAATTATTTCACCCTTGCTGTTAGAATGTNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAATTCCTTAAACTAAATTTCTC
ACTTTCTCTCTCTCTCTGGAAAACACTGACTAATGTAGCAGGTTTCTCTGCTCCAGGACTTC
AGGACCTTTTCGATGCTAATAAGTTTCTCCATCAGGGCCAGCTTGTTCCTCCTACTGAGCTT
GAGAGCCCTTGTTGAAGTTGTGGTTTGGGGGACTGGACCGATGACCTCAAAGGTTCCCTTT
GCTCCCAAGCCTCAGAGTCTAGGAGGCCAGAGGGTCTCAGCAGGCCTTTGTCCTTCTCAGC
TGTCTCTTACTGGCTTTCTCCACAGGTCTTGTAGCTTCAATGAGCATGGCTACCACCTCT
TCCAGGCTATGCGGCTTGGGGTTGAGGAGATAAACAACTCCACGGCCCTGCTGCCCA
ACATCACCCTGGGGTACCAGCTGTATGATGTGTGTTCTGACTCTGCCAATGTGTATGC
CACGCTGAGAGTGCTCTCCCTGCCAGGGCAACACCACATAGAGCTCCAAGGAGACCT
TCTCCACTATTCCCCTACGGTGCTGGCAGTGATTGGGCCTGACAGCACCAACCGTGC
TGCCACCACAGCCGCCCTGCTGAGCCCTTTCCTGGTGCCCATGGTAAGCTGGAGCCTC
AGACCTTTGCCCATCTCCCTTCAGGCAAGTCTGGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGCCACCATGCCCGGCTAATTTTTTTGTATTTTTAG
TAGAGACGGGGTTTCACCGTGTTAGCCAGGCTGGTCGCAAACTCCTAACCTCGTGATCCAC
CCACCTCGGCCTCCCAATGTGCTGGGATTACAGGTGTGAGCCACTGCACCCGGCCATAATG
TATTAATATAATAAAATAATTATACAACTCACCATAATGTAGAATCAGTGGGAGCCCTGAG
CTTGTTTTCCTACAACTAGATGGTCCCATCTGGGGGTGATGGGAGACAGTGACAGATCATC
AGACATTAGATTCTCATAAGTAGCGTGCAACCCAGATCCCTCGCATGTGCAGTTCACAGTA
GGGTTCAAGCTCCTACAAGAATCTGATGCTGCTGCTGATCTGACAGGAGGGGAGCAGCTG
TAAATACAGATGAAGCTTCGCTTACTCACCAGCTGCTCACCTCCTCCTGTGAGGCCCGGTT
CCTAACAGGCCACTGACCTAACTTCTGCCCTGACCTACACATGCTTCTCTTCTTCCTTGCAA
ACTGCCTCCAGTGGAAGTCCCTGAAGGTCCCCAAACACACGGGACTATTTCACTCCTATGC
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hT1R1推测的cds(SEQ ID NO 16)
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TGCCTGCCATAGCACGGAGTCTTCTCCTGACTTCACCCTCCCCGGAGATTACCTCCTGGCA
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hT1R1概念性翻译(SEQ ID NO 17)
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NSTEHFQASIQDYTRRCGST(SEQ ID NO 17)
虽然前面详尽的叙述已经描述了本发明的几个实施方案,但必需认识到以上的描述只是对本发明的说明,而不是限定。本发明仅由下面的权利要求来限定。
本申请还公开了以下内容:
1.分离的核酸,其选自:
(i)基本由编码在味觉信号发生中具有活性的T1R哺乳动物G蛋白耦联受体多肽的核酸序列组成的基因组DNA序列,其中所述的核酸序列基本上由选自SEQ ID NOs 15和20的核酸序列组成;
(ii)基本由编码具有选自SEQ ID NOs 4,14和17的氨基酸序列的T1R哺乳动物G蛋白耦联受体多肽的核酸序列组成的基因组DNA序列组成;
(iii)具有与编码T1R哺乳动物G蛋白耦联受体多肽的核酸序列至少大约50%相同的基因组DNA序列,其中所述的核酸序列基本由选自SEQ IDNOs 15和20的核酸序列组成;
(iv)基本由编码T1R哺乳动物G蛋白耦联受体多肽的核酸序列组成的基因组DNA序列,所述的多肽具有与选自SEQ ID NOs 4,14和17的氨基酸序列至少大约40%相同的氨基酸序列;
(v)基本由编码T1R哺乳动物G蛋白耦联受体多肽的序列组成的基因组DNA序列,所述的多肽包含选自SEQ ID NOs 18和19中和与SEQ ID NOs18或19有至少大约75%相同性的序列的共有序列;
(vi)具有与在选自SEQ ID NOs 15和20的基因组DNA序列中的T1R哺乳动物G蛋白耦联受体编码区相同的核酸序列的cDNA序列;
(vii)编码T1R哺乳动物G蛋白耦联受体多肽的cDNA序列,所述的多肽具有选自SEQ ID NOs 4,14和17的氨基酸序列;
(viii)编码T1R哺乳动物G蛋白耦联受体多肽的cDNA序列,所述的多肽包含选自SEQ ID NOs 18和19和与SEQ ID NOs 18或19有至少大约75%相同性的序列中的共有序列;
(ix)选自SEQ ID NOs 3,13和16的cDNA序列;
(x)具有与在选自SEQ ID NOs 15和20的基因组DNA中的T1R G蛋白耦联受体多肽编码区至少大约50%序列相同性的cDNA序列;
(xi)与编码T1R哺乳动物G蛋白耦联受体多肽的序列具有至少大约50%序列相同性的cDNA序列,所述的多肽具有选自SEQ ID NOs 4,14和17的氨基酸序列;
(xii)具有与选自SEQ ID NOs 3,13和16的序列至少大约50%相同性的cDNA序列;
(xiii)选自SEQ ID NOs 3,13,15,16和20的核苷酸序列的变体,其中在编码在味觉信号发生中具有活性的T1R G蛋白耦联受体多肽的区域中包含至少一个保守性替换;
(xiv)编码T1R G蛋白耦联受体多肽的核苷酸序列的变体,所述的多肽具有选自SEQ ID NOs 4,14,和17的氨基酸序列,该变体含有至少一个位于T1R哺乳动物G蛋白耦联受体多肽编码区域内的保守性替换;和
(xv)选自SEQ ID NOs 3,13,和16的cDNA序列的变体,其中包含至少一处保守性替换。
2.分离的基因组DNA分子,其基本上由编码哺乳动物G蛋白耦联受体多肽的核酸序列组成,其中所述的核酸序列基本由SEQ ID NOs 15或20组成。
3.从项目2中分离的DNA分子转录的分离的RNA分子。
4.能够与项目2中的DNA分子在严谨条件下杂交的分离的核酸分子。
5.能够与项目2中的DNA分子在温和条件下杂交的分离的核酸分子。
6.项目2中的基因组DNA分子的至少为大约20到30个核苷酸碱基长度的分离的片段。
7.嵌合或融合核酸分子,其中所述的嵌合或融合核酸分子包含项目2的DNA分子中的至少部分编码序列,和至少部分异源编码序列,其中所述的嵌合或融合核酸分子的转录产生单一的嵌合核酸转录物。
8.项目7中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于编码不同G蛋白耦联受体的序列。
9.项目7中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是促进所述的哺乳动物G蛋白耦联受体多肽在细胞表面表达的序列。
10.项目9中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于哺乳动物视紫红质基因。
11.项目7中的嵌合或融合分子,其中所述的异源编码序列是来源于编码绿色荧光蛋白的基因或其它可检测标志物基因。
12.基本上由编码哺乳动物G蛋白耦联受体核酸序列组成的分离基因组DNA分子,所述的受体具有选自SEQ ID NOs 4,14和17的氨基酸序列。
13.从项目12中的分离的DNA分子转录产生的分离的RNA分子。
14.能够与项目12中的DNA分子在严谨条件下杂交的分离的核酸分子。
15.能够与项目12中的DNA分子在温和条件下杂交的分离的核酸分子。
16.项目12中的基因组DNA分子的、至少大约20到30个核苷酸碱基长度的分离的片段。
17.嵌合或融合核酸分子,其中所述的嵌合或融合核酸分子包含项目12的DNA分子中的至少部分编码序列,和至少部分异源编码序列,其中所述的嵌合或融合核酸分子的产生转录产生单一的嵌合核酸转录物。
18.项目17中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于编码不同G蛋白耦联受体的序列。
19.项目17中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是一个促进所述的哺乳动物G蛋白耦联受体多肽在细胞表面表达的序列。
20.项目19中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于哺乳动物视紫红质基因。
21.项目17中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于编码绿色荧光蛋白的基因或其它可检测标志物基因。
22.分离的基因组DNA分子,其基本由与编码哺乳动物G蛋白耦联受体多肽的核酸序列有至少大约50%相同性的核酸序列组成,其中所述的核酸基本由选自SEQ ID NOs 15和20的核酸序列组成。
23.从项目22中的分离的DNA分子转录产生的分离的RNA分子。
24.能够与项目22中的DNA分子在严谨条件下杂交的分离的核酸分子。
25.能够与项目22中的DNA分子在温和条件下杂交的分离的核酸分子。
26.项目22中的基因组DNA分子的、至少大约20到30个核苷酸碱基长度的分离的片段。
27.嵌合或融合核酸分子,其中所述的嵌合或融合核酸分子包含项目22中的DNA分子的至少部分编码序列,和至少部分异源编码序列,其中所述的嵌合或融合核酸分子的转录产生单一的嵌合核酸转录物。
28.项目27中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于编码不同G蛋白耦联受体的序列。
29.项目27中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是促进所述的哺乳动物G蛋白耦联受体多肽在细胞表面表达的序列。
30.项目29中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于哺乳动物视紫红质基因。
31.项目27中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于编码绿色荧光蛋白的基因或其它可检测标志物基因。
32.分离的基因组DNA分子,其基本由编码哺乳动物G蛋白耦联受体的核酸序列组成,所述的受体具有与选自SEQ ID NOs 14和17的氨基酸序列具有至少大约40%相同性的氨基酸序列。
33.从项目32中的分离的DNA分子转录产生的分离的RNA分子。
34.能够与项目32中的DNA分子在严谨条件下杂交的分离的核酸分子。
35.能够与项目32中的DNA分子在温和条件下杂交的分离的核酸分子。
36.项目32中的基因组DNA分子的、至少大约20到30个核苷酸碱基长度的分离的片段。
37.嵌合或融合核酸分子,其中所述的嵌合或融合核酸分子包含项目32中的DNA分子的至少部分编码序列,和至少部分异源编码序列,其中所述的嵌合或融合核酸分子的转录产生单一的嵌合核酸转录物。
38.项目37中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于编码不同G蛋白耦联受体的序列。
39.项目37中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是促进所述的哺乳动物G蛋白耦联受体多肽在细胞表面表达的序列。
40.项目39中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于哺乳动物视紫红质基因。
41.项目37中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于编码绿色荧光蛋白的基因或其它可检测标志物基因。
42.分离的cDNA分子,它包含与哺乳动物G蛋白耦联受体多肽编码区域序列相同的核酸序列,所述的多肽编码区域存在于基本由选自SEQID NOs 15和20的核酸序列组成的基因组DNA序列中。
43.从项目42中的分离的DNA分子转录产生的分离的RNA分子。
44.能够与项目42中的DNA分子在严谨条件下杂交的分离的核酸分子。
45.能够与项目42中的DNA分子在温和条件下杂交的分离的核酸分子。
46.项目42中的基因组DNA分子的、至少大约20到30个核苷酸碱基长度的分离的片段。
47.嵌合或融合核酸分子,其中所述的嵌合或融合核酸分子包含项目42中的DNA分子的至少部分编码序列,和至少部分异源编码序列,其中所述的嵌合或融合核酸分子的转录产生单一的嵌合核酸转录物。
48.项目47中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于编码不同G蛋白耦联受体的序列。
49.项目47中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是促进所述的哺乳动物G蛋白耦联受体多肽在细胞表面表达的序列。
50.项目49中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于哺乳动物视紫红质基因。
51.项目47中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于编码绿色荧光蛋白的基因或其它可检测标志物基因。
52.包含项目42中分离的cDNA分子、及与之可操作性地连接的或可调节的或组成性的异源启动子的核酸分子。
53.项目52中的核酸分子,其中所述的可调节的启动子在特定环境或发育状况下为可诱导的。
54.分离的cDNA分子,其包含编码具有选自SEQ ID NOs 4,14和17的氨基酸序列的G蛋白耦联受体多肽的核酸序列。
55.从项目54中的分离的DNA分子转录产生的分离的RNA分子。
56.能够与项目54中的DNA分子在严谨条件下杂交的分离的核酸分子。
57.能够与项目54中的DNA分子在温和条件下杂交的分离的核酸分子。
58.项目54中的基因组DNA分子的、至少大约20到30个核苷酸碱基长度的分离的片段。
59.嵌合或融合核酸分子,其中所述的嵌合或融合核酸分子包含项目54中的DNA分子的至少部分编码序列,和至少部分异源编码序列,其中所述的嵌合或融合核酸分子的转录产生单一的嵌合核酸转录物。
60.项目59中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于编码不同G蛋白耦联受体的序列。
61.项目59中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是促进所述的哺乳动物G蛋白耦联受体多肽在细胞表面表达的序列。
62.项目61中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于哺乳动物视紫红质基因。
63.项目59中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于编码绿色荧光蛋白的基因或其它可检测标志物基因。
64.包含项目54中分离的cDNA、及与之可操作性地连接的或可调节的或组成性的异源启动子的核酸分子。
65.项目64中的核酸分子,其中所述的可调节的启动子在特定环境或发育状况下为可诱导的。
66.分离的cDNA分子,其包含与G蛋白耦联受体多肽编码区域有至少大约50%序列相同性的核酸序列,所述的编码区域存在于基本由选自SEQ ID NOs 15和20的核酸序列组成的基因组DNA序列中。
67.从项目66中的分离的DNA分子转录产生的分离的RNA分子。
68.能够与项目66中的DNA分子在严谨条件下杂交的分离的核酸分子。
69.能够与项目66中的DNA分子在温和条件下杂交的分离的核酸分子。
70.项目66中的基因组DNA分子的、至少大约20到30个核苷酸碱基长度的分离的片段。
71.嵌合或融合核酸分子,其中所述的嵌合或融合核酸分子包含项目66中的DNA分子的至少部分编码序列,和至少部分异源编码序列,其中所述的嵌合或融合核酸分子的转录产生单一的嵌合核酸转录物。
72.项目71中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于编码不同G蛋白耦联受体的序列。
73.项目71中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是促进所述的哺乳动物G蛋白耦联受体多肽在细胞表面表达的序列。
74.项目73中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于哺乳动物视紫红质基因。
75.项目71中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于编码绿色荧光蛋白的基因或其它可检测标志物基因。
76.包含项目66中分离的cDNA、及与之可操作性地连接的或可调节的或组成性的异源启动子的核酸分子。
77.项目76中的核酸分子,其中所述的可调节的启动子在特定环境或发育状况下为可诱导的。
78.分离的cDNA分子,其包含与编码T1R G蛋白耦联受体多肽的序列有至少大约40%序列相同性的核酸序列,所述的多肽包含选自SEQ IDNOs 4,10,12,14,和17的氨基酸序列。
79.从项目78中的分离的DNA分子转录产生的分离的RNA分子。
80.能够与项目78中的DNA分子在严谨条件下杂交的分离的核酸分子。
81.能够与项目78中的DNA分子在温和条件下杂交的分离的核酸分子。
82.项目78中的基因组DNA分子的、至少大约20到30个核苷酸碱基长度的分离的片段。
83.嵌合或融合核酸分子,其中所述的嵌合或融合核酸分子包含项目78中的DNA分子的至少部分编码序列,和至少部分异源编码序列,其中所述的嵌合或融合核酸分子的转录产生单一的嵌合核酸转录物。
84.项目83中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于编码不同G蛋白耦联受体的序列。
85.项目83中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是促进所述的哺乳动物G蛋白耦联受体多肽在细胞表面表达的序列。
86.项目85中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于哺乳动物视紫红质基因。
87.项目83中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于编码绿色荧光蛋白的基因或其它可检测标志物基因。
88.包含项目78中分离的cDNA、及与之可操作性地连接的或可调节的或组成性的异源启动子的核酸分子。
89.项目88中的核酸分子,其中所述的可调节的启动子在特定环境或发育状况下为可诱导的。
90.分离的变体DNA分子,其包含基本上由选自SEQ ID NOs 15和20的核酸序列组成的核酸序列,并在具有味觉信号发生活性的G蛋白耦联受体编码区域中包含至少一个保守性替换。
91.从项目90中的分离的DNA分子转录产生的分离的RNA分子。
92.能够与项目90中的DNA分子在严谨条件下杂交的分离的核酸分子。
93.能够与项目90中的DNA分子在温和条件下杂交的分离的核酸分子。
94.项目90中的基因组DNA分子的、至少大约20到30个核苷酸碱基长度的分离的片段。
95.嵌合或融合核酸分子,其中所述的嵌合或融合核酸分子包含项目90中的DNA分子的至少部分编码序列,和至少部分异源编码序列,其中所述的嵌合或融合核酸分子的转录产生单一的嵌合核酸转录物。
96.项目95中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于编码不同G蛋白耦联受体的序列。
97.项目95中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是促进所述的哺乳动物G蛋白耦联受体多肽在细胞表面表达的序列。
98.项目97中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于哺乳动物视紫红质基因。
99.项目95中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于编码绿色荧光蛋白的基因或其它可检测标志物基因。
100.具有与项目90中的变体DNA分子编码区相同的核酸序列的cDNA分子。
101.包含项目100中的cDNA、及与之可操作性地连接的或可调节的或组成性的异源启动子的核酸分子。
102.项目101中的核酸分子,其中所述的可调节的启动子在特定环境或发育状况下为可诱导的。
103.分离的变体分子,其包含编码具有选自SEQ ID NOs 4,14和17的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列,并在编码区中含有至少一处保守性替换。
104.从项目103中的分离的DNA分子转录产生的分离的RNA分子。
105.能够与项目103中的DNA分子在严谨条件下杂交的分离的核酸分子。
106.能够与项目103中的DNA分子在温和条件下杂交的分离的核酸分子。
107.项目103中的基因组DNA分子的、至少大约20到30个核苷酸碱基长度的分离的片段。
108.嵌合或融合核酸分子,其中所述的嵌合或融合核酸分子包含项目103中的DNA分子的至少部分编码序列,和至少部分异源编码序列,其中所述的嵌合或融合核酸分子的转录产生单一的嵌合核酸转录物。
109.项目108中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于编码不同G蛋白耦联受体的序列。
110.项目108中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是促进所述的哺乳动物G蛋白耦联受体多肽在细胞表面表达的序列。
111.项目110中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于哺乳动物视紫红质基因。
112.项目108中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于编码绿色荧光蛋白的基因或其它可检测标志物基因。
113.具有与项目103中的变体DNA分子编码区相同的核酸序列的cDNA分子。
114.包含项目113中的cDNA、及与之可操作性地连接的或可调节的或组成性的异源启动子的核酸分子。
115.项目114中的核酸分子,其中所述的可调节的启动子在特定环境或发育状况下为可诱导的。
116.项目1中的分离的核酸分子,其中所述的核酸编码在大鼠、小鼠或人的味觉信号发生中有活性的G蛋白耦联受体多肽。
117.含有项目1中的分离的核酸分子的表达载体,其中所述的载体选自哺乳动物载体、细菌质粒、细菌噬菌粒、哺乳动物病毒和反转录病毒、噬菌体载体和线性或环状具有整合至宿主细胞基因组的能力的DNA分子。
118.被项目117中至少一种表达载体转染的宿主细胞,其中所述的宿主细胞能在其细胞表面表达G蛋白耦联受体多肽。
119.包含至少一种项目1中分离的核酸分子的至少大约20到30个核苷酸的核酸阵列,其中所述至少一种核酸分子共价或非共价地连接至固相支持物上。
120.筛选能活化味觉信号发生的化合物的方法,包括:
(i)将项目118中的宿主细胞与推定的味觉活化化合物接触;并
(ii)测量所述的在细胞表面表达的G蛋白耦联受体多肽的活性。
121.项目120的方法,其中所述的G蛋白耦联受体多肽活性是通过测量细胞内Ca2+水平、cAMP、cGMP和IP3、或GTPγS的G蛋白结合的变化测量的。
122.项目120的方法,其中所述的宿主细胞被至少一个另外的编码参与味觉信号发生的基团的核酸构建体转染。
123.项目122的方法,其中所述的至少一个另外的基因编码参与味觉信号传导的G蛋白。
124.项目123的方法,其中所述的G蛋白是混栖G蛋白。
125.筛选可调节味觉信号转导的化合物的方法,包括:
(i)将项目118的宿主细胞与已知的味觉活化化合物和推定的参与味觉转导调节的化合物接触;
(ii)将项目118的宿主细胞与已知的味觉活化化合物单独接触;并
(iii)比较步骤(i)中宿主细胞表面表达的所述G蛋白耦联受体多肽的活性和步骤(ii)中宿主细胞表面表达的所述G蛋白耦联受体多肽的活性,用来鉴定味觉转导的调节子。
126.项目125的方法,其中所述的调节性化合物选自活化子、抑制子、刺激子、增强子、激动剂和拮抗剂。
127.项目125的方法,其中所述的G蛋白耦联受体多肽活性是通过测量细胞内Ca2+水平、cAMP、cGMP和IP3、或GTPγS的G蛋白结合的变化测量的。
128.项目125中的方法,其中所述的宿主细胞被至少一个另外的编码参与味觉信号发生的基因的核酸构建体转染。
129.项目128的方法,其中所述的至少一个另外的基因编码参与味觉信号转导的G蛋白。
130.项目129的方法,其中所述的G蛋白是混栖G蛋白。
131.检测G蛋白耦联受体多肽基因在细胞中的表达的方法,包括:
(i)将所述的细胞与可与项目1中分离的核酸分子在严谨条件下杂交的核酸分子接触;并
(ii)检测杂交结果,以检测所述的G蛋白耦联受体多肽基因的表达。
132.编码在味觉信号发生中具有活性的G蛋白耦联受体多肽、具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的分离的核酸分子。
133.编码在味觉信号发生中具有活性的G蛋白耦联受体多肽、具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的分离的核酸分子。
134.编码在味觉信号发生中具有活性的G蛋白耦联受体多肽、具有SEQ ID NO:9的核苷酸序列的分离的核酸分子。
135.编码在味觉信号发生中具有活性的G蛋白耦联受体多肽、具有SEQ ID NO:11的核苷酸序列的分离的核酸分子。
136.具有SEQ ID NO:3核苷酸序列的分离的核酸分子。
137.具有SEQ ID NO:13核苷酸序列的分离的核酸分子。
138.具有SEQ ID NO:15核苷酸序列的分离的核酸分子。
139.具有SEQ ID NO:16核苷酸序列的分离的核酸分子。
140.编码具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽的分离的核酸分子。
141.分离的核酸分子,其编码在味觉信号发生中具有活性的具有SEQID NO:10的氨基酸序列的G蛋白耦联受体多肽。
142.分离的核酸分子,其编码在味觉信号发生中具有活性的具有SEQID NO:12的氨基酸序列的G蛋白耦联受体多肽。
143.编码具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的多肽的分离的核酸分子。
144.编码具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的多肽的分离的核酸分子。
145.分离的核酸分子,其编码在味觉信号发生中具有活性的、包含SEQ ID NO:18的共有序列或与SEQ ID NO:18序列具有至少75%相同性的共有序列的G蛋白耦联受体多肽。
146.分离的核酸分子,其编码在味觉信号发生中具有活性的、含SEQID NO:19的共有序列或与SEQ ID NO:19序列具有至少75%相同性的共有序列的G蛋白耦联受体多肽。
147.基因组DNA,其为使用至少一种具有SEQ ID NOs 5或6的核酸序列或者基本上由编码SEQ ID NO 18或19共有序列的核酸序列组成的简并引物通过PCR反应扩增出来的,其中所述的扩增的DNA包含编码在味觉信号发生中具有活性的G蛋白耦联受体多肽的序列。
148.分离包含具有味觉信号发生活性的G蛋白耦联受体多肽编码序列的基因组序列的方法,所述的方法包括将哺乳动物基因组与至少一种具有SEQ ID NOs 5或6的核酸序列或者基本上由编码SEQ ID No 18或19共有序列的核酸序列组成的简并引物接触,在聚合酶、游离核苷酸和辅因子存在的情况下扩增包含所述引物序列的所述基因组序列。
149.筛选哺乳动物基因组中具有味觉信号发生活性的G蛋白耦联受体编码序列的方法,包括:
(i)将所述的哺乳动物基因组与至少一种具有SEQ ID NOs 5或6的核酸序列或者基本上由编码SEQ ID 18或19共有序列的核酸序列组成的简并引物接触;
(ii)在聚合酶、游离核苷酸和辅因子存在的情况下扩增包含所述的引物序列的所述基因组序列;并
(iii)检测包含G蛋白耦联受体多肽基因的扩增序列的存在。
150.包含小鼠T1R3基因的SAV115质粒。
151.包含大鼠T1R3基因的SAV118质粒。
152.分离的多肽,其选自:
(i)在味觉信号发生中具有活性的G蛋白耦联受体多肽,其由包含选自SEQ ID NOs 9和11以及基本上由SEQ ID NOs 1和2组成的基因组序列的核酸序列的核酸分子编码;
(ii)G蛋白耦联受体多肽,其由包含选自SEQ ID NOs 3,13,和16以及基本上由选自SEQ ID NOs 15和20的核酸序列组成的基因组序列的核酸序列的核酸分子编码;
(iii)在味觉信号发生中具有活性的G蛋白耦联受体多肽,其包含选自SEQ ID NOs 10和12的氨基酸序列;
(iv)G蛋白耦联受体多肽,其包含选自SEQ ID NOs 4,14,和17的氨基酸序列;
(v)在味觉信号发生中具有活性的G蛋白耦联受体多肽,其由包含与选自SEQ ID NOs 9和11以及基本上由SEQ ID NOs 1和2组成的基因组序列的核酸序列具有至少大约50%相同性的核酸序列的核酸分子编码;
(vi)G蛋白耦联受体多肽,其由包含与选自SEQ ID NOs 3、13和16以及基本上由选自SEQ ID NOs 15和20的核酸序列组成的基因组序列的核酸序列具有至少大约50%相同性的核酸序列的核酸分子编码;
(vii)在味觉信号发生中具有活性的G蛋白耦联受体多肽,其包含与选自SEQ ID NOs 10和12的氨基酸序列具有至少大约40%相同性的氨基酸序列;
(viii)G蛋白耦联受体多肽,其包含与选自SEQ ID NOs 4,14和17的氨基酸序列具有至少大约40%相同性的氨基酸序列;
(ix)在味觉信号发生中具有活性的G蛋白耦联受体多肽的变体,其由包含选自SEQ ID NOs 9和11以及基本上由SEQ ID NOs 1和2组成的基因组序列的核酸序列的核酸分子编码,其中所述的变体蛋白相对于所述的核苷酸序列编码的G蛋白耦联受体包含至少一处保守性替换;
(x)G蛋白耦联受体多肽的变体,其由包含选自SEQ ID NOs 3,13,和16的核酸序列以及基本上由SEQ ID NOs 15或20组成的基因组序列的核酸序列的核酸分子编码,其中所述的变体蛋白相对于所述的核苷酸序列编码的G蛋白耦联受体包括至少一处保守性替换;
(xi)在味觉信号发生中具有活性、包含选自SEQ ID NOs 10和12的氨基酸序列的G蛋白耦联受体多肽的变体,其中包含至少一处保守性替换;和
(xii)含有选自SEQ ID NOs 4,14,和17的氨基酸序列的G蛋白耦联受体多肽的变体,其中包含至少一处保守性替换。
153.项目152所述多肽的片段,其中所述的片段包含至少大约5-7个氨基酸。
154.项目153中的片段,其中所述的片段包含T1R哺乳动物G蛋白耦联受体多肽的细胞外结构域。
155.项目154中的片段,其中所述的细胞外结构域能与参与味觉活化或调节的化合物相互作用。
156.项目154中的片段,其中所述的细胞外结构域能与参与味觉信号转导的蛋白质相互作用。
157.项目156中的片段,其中所述的参与味觉信号转导的蛋白质是G蛋白亚基。
158.项目157中的片段,其中所述的G蛋白亚基是混栖G蛋白。
159.嵌合或融合多肽,其包含项目152所述多肽的氨基酸序列的至少部分,和至少部分异源氨基酸序列。
160.项目159的嵌合或融合多肽,其中所述的异源序列是来源于不同G蛋白耦联受体的序列。
161.项目159的嵌合或融合多肽,其中所述的异源序列是来源于绿色荧光蛋白的序列。
162.筛选能够激活或调节味觉信号发生的一种或多种化合物的方法,包括将所述的一种或多种化合物与一种或多种项目152的多肽中的一种或多种片段接触,其中所述一种或多种片段长为至少大约5到7个氨基酸。
163.筛选能够与具有味觉信号发生活性的G蛋白耦联受体相互作用的一种或多种蛋白质的方法,包括以下步骤:将所述的一种或多种蛋白质与一种或多种项目152的多肽中的一种或多种片段接触,其中所述一种或多种片段长为至少大约5到7个氨基酸。
164.包含项目152中一种或多种多肽中的至少大约5到7个氨基酸区段的多肽阵列,其中所述的一个或多肽多肽区段共价或非共价地结合到固相支持物上。
165.能够与项目152中的多肽特异性结合的分离的抗体或抗体片段。
166.具有SEQ ID NO:4氨基酸序列的分离的多肽。
167.具有SEQ ID NO:10氨基酸序列的分离的多肽。
168.具有SEQ ID NO:12氨基酸序列的分离的多肽。
169.具有SEQ ID NO:14氨基酸序列的分离的多肽。
170.具有SEQ ID NO:17氨基酸序列的分离的多肽。
171.描述在一种或多种哺乳动物中一种或多种味觉感知的方法,包括以下步骤:
(i)提供代表所述的哺乳动物n个味觉受体中每一个的刺激量的X1到Xn值;并
(ii)从所述的值中产生味觉感知的定量表示法,其中至少一种所述的味觉受体是味觉受体多肽,其具有与选自SEQ ID NOs 4,10,12,14,和17的序列至少大约40%的相同性的序列;
172.项目171中的方法,其中所述的表示法由n维空间的体积或点构成。
173.项目171中的方法,其中所述的表示法由图表或图谱构成。
174.项目171中的方法,其中所述的表示法由一个定量表示法的矩阵构成。
175.项目171中的方法,其中所述的提供步骤包括将多种重组产生的味觉受体与待测组合物接触,并定量测量所述的组合物与所述的受体的相互作用。
176.预测在哺乳动物中由一种或多种分子或分子组合引起的味觉感知的方法,包括以下步骤:
(i)针对在哺乳动物中产生已知的味觉感知的一种或多种分子或分子组合,提供代表所述的哺乳动物n个味觉受体中每一个的刺激量的X1到Xn值,
(ii)从所述的值中,针对在哺乳动物中产生已知的味觉感知的所述一种或多种分子或分子组合,产生哺乳动物中味觉感知的定量表示法;
(iii)对于在哺乳动物中产生未知味觉感知的一种或多种分子或分子组合,提供代表所述的哺乳动物n个味觉受体中每一个的刺激量的X1到Xn值;
(iv)对于在哺乳动物中产生未知味觉感知的所述一种或多种分子或分子组合,从所述的值产生哺乳动物中味觉感知的定量表示法;并
(v)通过比较哺乳动物中产生未知味觉感知的一种或多种分子或分子组合的味觉感知定量表示法和哺乳动物中产生已知味觉感知的一种或多种分子或分子组合的味觉感知定量表示法,预测在哺乳动物中产生未知味觉感知的一种或多种分子或分子组合在哺乳动物中产生的味觉感知;
其中至少一种所述味觉受体是具有与选自SEQ ID NOs 4,10,12,14,和17的序列具有至少大约40%的相同性的序列的味觉受体多肽。
177.基因组DNA分子,其基本由编码具有味觉信号发生活性的哺乳动物G蛋白耦联受体多肽的核酸序列组成,所述的多肽含有选自SEQ IDNOs18和19以及与SEQ ID NOs 18或19具有至少大约75%相同性的序列的共有序列。
178.从项目177中分离的DNA分子转录产生的分离的RNA分子。
179.能够与项目177中的DNA分子在严谨条件下杂交的分离的核酸分子。
180.能够与项目177中的DNA分子在温和条件下杂交的分离的核酸分子。
181.项目177中的基因组DNA分子中的至少大约20到30个核苷酸碱基长度的分离的片段。
182.嵌合或融合核酸分子,其中所述的嵌合或融合核酸分子包含项目177中的DNA分子的至少部分编码序列,和至少部分异源编码序列,其中所述的嵌合或融合核酸分子的转录产生单一的嵌合核酸转录物。
183.项目182中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于编码不同G蛋白耦联受体的序列。
184.项目182中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是促进所述的哺乳动物G蛋白耦联受体多肽在细胞表面表达的序列。
185.项目184中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于哺乳动物视紫红质基因。
186.项目182中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于编码绿色荧光蛋白的基因或其它可检测标志物基因。
187.编码具有味觉信号发生活性的哺乳动物G蛋白耦联受体多肽的cDNA序列,所述的多肽包含选自SEQ ID NOs 18和19以及与SEQ ID NOs18或19具有至少大约75%相同性的序列的共有序列。
188.从项目187中分离的DNA分子转录产生的分离的RNA分子。
189.能够与项目187中的DNA分子在严谨条件下杂交的分离的核酸分子。
190.能够与项目187中的DNA分子在温和条件下杂交的分离的核酸分子。
191.项目187中的基因组DNA分子中的至少大约20到30个核苷酸碱基长度的分离的片段。
192.嵌合或融合核酸分子,其中所述的嵌合或融合核酸分子包含项
187中的DNA分子的至少部分编码序列,和至少部分异源编码序列,其中所述的嵌合或融合核酸分子的转录产生单一的嵌合核酸转录物。
193.项目192中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于编码不同G蛋白耦联受体的序列。
194.项目192中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是促进所述的哺乳动物G蛋白耦联受体多肽在细胞表面表达的序列。
195.项目194中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于哺乳动物视紫红质基因。
196.项目192中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于编码绿色荧光蛋白的基因或其它可检测标志物基因。
197.包含项目187中分离的cDNA、以及与之可操作性地连接的或可调节的或组成性的异源启动子的核酸分子。
198.项目197中的核酸分子,其中所述的可调节的启动子在特定环境或发育状况下为可诱导的。
199.包含选自SEQ ID NOs 3,13和16的核酸序列的cDNA分子。
200.从项目199的分离的DNA分子转录产生的分离的RNA分子。
201.能够与项目199中的DNA分子在严谨条件下杂交的分离的核酸分子。
202.能够与项目199中的DNA分子在温和条件下杂交的分离的核酸分子。
203.项目199中的基因组DNA分子中的至少大约20到30个核苷酸碱基长度的分离的片段。
204.嵌合或融合核酸分子,其中所述的嵌合或融合核酸分子包含项目199中的DNA分子的至少部分编码序列,和至少部分异源编码序列,其中所述的嵌合或融合核酸分子的转录产生单一的嵌合核酸转录物。
205.项目204中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于编码不同G蛋白耦联受体的序列。
206.项目204中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是促进所述的哺乳动物G蛋白耦联受体多肽在细胞表面表达的序列。
207.项目206中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于哺乳动物视紫红质基因。
208.项目204中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于编码绿色荧光蛋白的基因或其它可检测标志物基因。
209.包含项目199中分离的cDNA、以及与之可操作性地连接的或可调节的或组成性的异源启动子的核酸分子。
210.项目209中的核酸分子,其中所述的可调节的启动子在特定环境或发育状况下为可诱导的。
211.含有与选自SEQ ID NOs 3,13和16的核酸序列具有至少大约50%相同性的核酸序列的cDNA分子。
212.从项目211的分离的DNA分子转录产生的分离的RNA分子。
213.能够与项目211中的DNA分子在严谨条件下杂交的分离的核酸分子。
214.能够与项目211中的DNA分子在温和条件下杂交的分离的核酸分子。
215.项目211中的基因组DNA分子中的至少大约20到30个核苷酸碱基长度的分离的片段。
216.嵌合或融合核酸分子,其中所述的嵌合或融合核酸分子包含项目211中的DNA分子的至少部分编码序列,和至少部分异源编码序列,其中所述的嵌合或融合核酸分子的转录产生单一的嵌合核酸转录物。
217.项目216中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于编码不同G蛋白耦联受体的序列。
218.项目216中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是促进所述的哺乳动物G蛋白耦联受体多肽在细胞表面表达的序列。
219.项目218中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于哺乳动物视紫红质基因。
220.项目216中的嵌合或融合核酸分子,其中所述的异源编码序列是来源于编码绿色荧光蛋白的基因或其它可检测标志物基因。
221.包含项目211中分离的cDNA以及与之可操作性地连接的或可调节的或组成性的异源启动子的核酸分子。
222.项目211中的核酸分子,其中所述的可调节的启动子在特定环境或发育状况下为可诱导的。
223.项153中的片段,其中所述的片段至少包括G蛋白耦联受体的N端片段。
224.项目223中的片段,其中所述的N端片段参与配体结合。
225.项目224中的多肽片段,其中所述的片段具有至少大约100个氨基酸的长度。
226.项目224中的多肽片段,其中所述的片段具有至少大约600个氨基酸的长度。
227.用于鉴定能特异结合具有味觉信号发生活性的G蛋白耦联受体的味觉元配体的生物化学试验,包括:
(i)将一种或多种项目224的片段与一种或多种推定的味觉元配体或包含一种或多种推定的味觉元配体的组合物接触;并
(ii)检测对具有味觉信号发生活性的G蛋白耦联受体有结合特异性的味觉元配体的结合。
228.项227的试验,其中结合作用由替换放射标记的已知的结合配体来检测。
229.项目228的试验,其中所述的已知的结合配体是与所述的G蛋白耦联受体具有结合特异性的抗体或抗体片段。
230.具有SEQ ID NO 20的核酸序列的分离的核酸分子。
231.嵌合或融合多肽,其至少包括项目152中至少一种多肽的细胞外结构域,和至少部分异源氨基酸序列。
232.项目231中的嵌合或融合多肽,其中所述的异源氨基酸序列来源于不同G蛋白耦联受体。
233.项目232中的嵌合或融合多肽,其中所述的不同G蛋白耦联受体是T1R哺乳动物G蛋白耦联受体,所述的异源氨基酸序列至少包括所述T1R哺乳动物G蛋白耦联受体的细胞外结构域。
234.用于鉴定对具有味觉信号发生活性的G蛋白耦联受体具有结合特异性的味觉元配体的生物化学试验,包括:
(i)将一种或多种项目224的片段与G蛋白和GTPγS的制剂,及一种或多种推定的味觉元配体或包含一种或多种推定的味觉元配体的组合物进行接触;并
(ii)通过测量GTPγS与G蛋白的结合,检测与具有味觉信号发生活性的G蛋白耦联受体有结合特异性的味觉元配体的结合。
序列表
<110>SENOMYX,INC.
<120>T1R味觉受体及其编码基因
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<160>20
<170>PatentIn Ver.2.1
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<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
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<210>2
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<212>DNA
<213>人
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<213>人
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<213>人
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<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述:简并引物
<220>
<221>修饰的碱基
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<220>
<221>修饰的碱基
<222>(9)
<223>a,t,c,或g
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(12)
<223>a,t,c,或g
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(18)
<223>a,t,c,或g
<400>5
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述:简并引物
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(3)
<223>a,t,c,或g
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(6)
<223>a,t,c,或g
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(18)
<223>a,t,c,或g
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(21)
<223>a,t,c,或g
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<212>PRT
<213>人
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<213>人
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<213>人
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<222>(1251)..(1300)
<223>a,t,c或g
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<221>修饰的碱基
<222>(1951)..(2000)
<223>a,t,c或g
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<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述:T1R家族共有序列
<220>
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<222>(1)
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<220>
<221>MOD_RES
<222>(3)
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<220>
<221>MOD_RES
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<220>
<221>MOD_RES
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<220>
<221>MOD_RES
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<220>
<221>MOD_RES
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<220>
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<220>
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<220>
<221>MOD_RES
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述:T1R家族共有序列
<220>
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<220>
<221>MOD_RES
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<220>
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<220>
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<220>
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<400>19
<210>20
<211>3563
<212>DNA
<213>人
<400>20
Claims (41)
1.编码T1R3多肽的分离的核酸序列,所述T1R3多肽与SEQ ID NO:4中包含的人T1R3多肽或者SEQ ID NO:14中包含的大鼠T1R3多肽具有至少90%的相同性。
2.根据权利要求1的分离的核酸序列,其编码与SEQ ID NO:4或14具有至少95%的相同性的多肽。
3.根据权利要求1的分离的核酸序列,其编码与SEQ ID NO:4或14具有至少96%的相同性的多肽。
4.根据权利要求1的分离的核酸序列,其编码与SEQ ID NO:4或14具有至少97%的相同性的多肽。
5.根据权利要求1的分离的核酸序列,其编码与SEQ ID NO:4或14具有至少98%的相同性的多肽。
6.根据权利要求1的分离的核酸序列,其编码与SEQ ID NO:4或14具有至少99%的相同性的多肽。
7.编码T1R3多肽的分离的核酸序列,其能够与编码SEQ ID NO:4中包含的人T1R3多肽或者SEQ ID NO:14中包含的大鼠T1R3多肽的核酸序列在严谨杂交条件下杂交。
8.在SEQ ID NO:20、3或13中包含的编码人或大鼠T1R3的分离的核酸序列。
9.编码人T1R1多肽的分离的核酸序列,所述人T1R1多肽与SEQ IDNO:17中包含的人T1R1多肽具有至少90%的相同性。
10.编码T1R1多肽的分离的人T1R1核酸序列,所述T1R1多肽与SEQID NO:17中包含的人T1R1多肽具有至少95%的相同性。
11.编码T1R1多肽的分离的人T1R1核酸序列,所述T1R1多肽与SEQID NO:17中包含的人T1R1多肽具有至少96%的相同性。
12.编码T1R1多肽的分离的人T1R1核酸序列,所述T1R1多肽与SEQID NO:17中包含的人T1R1多肽具有至少97%的相同性。
13.编码T1R1多肽的分离的人T1R1核酸序列,所述T1R1多肽与SEQID NO:17中包含的人T1R1多肽具有至少98%的相同性。
14.编码T1R1多肽的分离的人T1R1核酸序列,所述T1R1多肽与SEQID NO:17中包含的人T1R1多肽具有至少99%的相同性。
15.编码T1R1多肽的分离的核酸序列,其能够与编码SEQ ID NO:17中包含的人T1R1多肽的核酸序列在严谨杂交条件下杂交。
16.在SEQ ID NO:15或16中包含的分离的人T1R1核酸序列。
17.与SEQ ID NO:4或14中包含的T1R3多肽具有至少90%相同性的T1R3味觉受体多肽。
18.与SEQ ID NO:4或14中包含的T1R3多肽具有至少95%相同性的T1R3味觉受体多肽。
19.与SEQ ID NO:4或14中包含的T1R3多肽具有至少96%相同性的T1R3味觉受体多肽。
20.与SEQ ID NO:4或14中包含的T1R3多肽具有至少97%相同性的T1R3味觉受体多肽。
21.与SEQ ID NO:4或14中包含的T1R3多肽具有至少98%相同性的T1R3味觉受体多肽。
22.与SEQ ID NO:4或14中包含的T1R3多肽具有至少99%相同性的T1R3味觉受体多肽。
23.由权利要求1-8任一项的核酸序列编码的T1R3味觉受体多肽。
24.具有SEQ ID NO:4或14中包含的氨基酸序列的T1R3味觉受体多肽。
25.根据权利要求17-24任一项的T1R3味觉受体多肽的变体,其包含至少一个保守性替换。
26.与SEQ ID NO:17中包含的T1R1多肽具有至少90%相同性的人T1R1味觉受体多肽。
27.与SEQ ID NO:17中包含的T1R1多肽具有至少95%相同性的人T1R1味觉受体多肽。
28.与SEQ ID NO:17中包含的T1R1多肽具有至少96%相同性的人T1R1味觉受体多肽。
29.与SEQ ID NO:17中包含的T1R1多肽具有至少97%相同性的人T1R1味觉受体多肽。
30.与SEQ ID NO:17中包含的T1R1多肽具有至少98%相同性的人T1R1味觉受体多肽。
31.与SEQ ID NO:17中包含的T1R1多肽具有至少99%相同性的人T1R1味觉受体多肽。
32.由权利要求9-16任一项的核酸序列编码的人T1R1味觉受体多肽。
33.具有SEQ ID NO:17中包含的氨基酸序列的人T1R1多肽。
34.根据权利要求26-33任一项的人T1R1味觉受体多肽的变体,其包含至少一个保守性替换。
35.重组细胞,其表达根据权利要求1-34任一项的T1R1和/或T1R3核酸序列或T1R1或T1R3多肽。
36.使用根据权利要求17-34任一项的T1R1或T1R3多肽或者根据权利要求35的重组细胞的方法,该方法是一种检测推定的味觉配体是否特异性结合和/或影响所述T1R1或T1R3多肽的活性的结合或功能试验。
37.权利要求36的方法,其中所述试验使用表达所述T1R1或T1R3多肽哺乳动物细胞。
38.权利要求37的方法,其中所述哺乳动物细胞是HEK、CHO或COS细胞。
39.权利要求37的方法,其是电生理学实验。
40.录取有趣36的方法,其检测所述配体对细胞内钙或钠水平的影响。
41.权利要求36的方法,其是检测所述配体对细胞内钙水平的影响的荧光测定试验。
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