CN101454024A - 可溶性脂连蛋白受体肽的检测以及在诊断和治疗中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及脂连蛋白受体的可溶性C－末端片段及其在病症的诊断和管理中的用途。

Description

可溶性脂连蛋白受体肽的检测以及在诊断和治疗中的用途

与相关申请的交叉参照

本申请要求于2005年12月7日提交的美国临时申请号60/748,305的利益。

领域

本发明涉及脂连蛋白受体的可溶性C-末端片段及其在病症的诊断和处理中的用途。

发明背景

带有慢性炎症的肥胖具有巨大和增加的群体。这个群体明显具有高心血管和糖尿病危险且经常发展具有胰岛素抵抗的代谢综合征。近期已发现了脂连蛋白和其他脂肪因子(adipokines)作为控制葡萄糖代谢的脂肪细胞激素。脂肪细胞的类型和定位都很重要。肥胖产生将脂连蛋白分泌到血液内从而帮助肌细胞代谢脂肪和葡萄糖的另外脂肪细胞。某些超重患者变得胰岛素抵抗。在这种情况下，脂肪细胞终止生产脂连蛋白。血液中的脂连蛋白水平在肥胖、胰岛素抵抗和2型糖尿病的情况下减少。存在用于测量受试者中的脂连蛋白水平的方法以用于预测这些和其他疾病状态。然而，脂连蛋白水平的测量已证明是弱疾病指示物。存在关于监控与异常脂肪细胞活性相关的疾病状态的更佳方法的需要。本发明提供在这个和其他需要。

概述

本发明人已发现，脂连蛋白受体的C-末端片段是可溶的且可以在体液中检测到。因此，本发明除了许多其他方面外提供了片段，检测其的方法，使用其的方法和能够与其结合的抗体。

用于检测得自受试者的生物流体样品中脂连蛋白受体的断裂的方法可以包括测定脂连蛋白受体的至少一种可溶性C-末端片段的存在或不存在的步骤。在某些实施方案中，测定生物样品中C-末端片段的总浓度。

本文提供了用于检测受试者中的脂连蛋白受体的表达水平的方法。这些方法可以包括测定生物流体样品中脂连蛋白受体的至少一种C-末端片段的水平，和使C-末端片段的水平与脂连蛋白受体的表达水平关联的步骤。在某些实施方案中，测定生物样品中C-末端片段的总浓度。

本文提供了用于检测受试者中的脂连蛋白的表达水平的方法。这些方法可以包括测定生物流体样品中脂连蛋白受体的至少一种C-末端片段的水平，和使C-末端片段的水平与脂连蛋白的表达水平关联的步骤。在某些实施方案中，测定生物样品中C-末端片段的总浓度。

本发明包含了用于确定状况的进展、状况的发作即诊断、或治疗的功效即个体对用特定药物治疗的应答性的方法。优选地，该状况将是与脂连蛋白受体的异常断裂模式相关的状况。这些方法可以包括测定生物流体样品中脂连蛋白受体的至少一种C-末端片段的水平，和使C-末端片段的水平与状况的进展、状况的发作、或治疗的功效关联的步骤。在某些实施方案中，测定生物样品中C-末端片段的总浓度。

在本发明的方法中，可以检测脂连蛋白受体的一种或多种(即至少一种)可溶性C-末端片段。例如可以检测AdipoR1和/或AdipoR2的片段1-22的任何组合。在某些实施方案中，可以检测AdipoR1和/或AdipoR2的片段1-22并且通过其质量加以区别。因此，本发明提供了测定具有例如约1kDa-约3kDa的质量，包括例如约2kDa的质量(例如，由SEQ ID NOS.3、12-22、25和34-44表示的片段)的片段，或具有约3.5kDa-约4.2kDa的质量，包括例如约3.9kDa的质量(例如，由SEQ ID NOS.1、2、4-11、23、24和26-33表示的片段)的片段的水平的方法。这些大小的片段一般作为单体呈现。本发明还提供了检测具有下述质量的片段的水平的方法，例如约2kDA-约6kDA的质量，包括例如约4kDa的质量，或约7kDa-约8.4kDa的质量，包括例如约7.8kDa的质量。这些大小的片段一般作为二聚体呈现。

在本发明的方法中，当与载体蛋白质结合时，可以检测脂连蛋白受体的一种或多种可溶性C-末端片段(例如，SEQ ID NOS.1-44)。例如，当与载体蛋白质附着时，可以检测AdipoR1和/或AdipoR2的片段1-22的任何组合。因此，在某些实施方案中，本发明提供了测定具有约4.5-6.9、7-8.2、9-11、13-15、17-19、27-29或30-34kDa的质量的片段的水平的方法。在某些实施方案中，载体蛋白质是脂连蛋白，包括脂连蛋白片段。在某些实施方案中，具有结合的脂连蛋白的组合脂连蛋白受体片段具有约3-5、4-8、7-11、13-17、22-26或28-32kDa的质量。本发明提供了检测这些片段的方法。

本发明还提供了与具有SEQ ID NOs：1-44的序列的片段基本上等同的多肽和与这些片段对应的核酸序列。还包括了与本文提供的脂连蛋白受体的至少一种C-末端片段特异性结合的抗体。

本发明提供了用于确定具有本文所述任何病症的个体的治疗策略的试剂盒，其包括用于检测本文描述的至少一种片段的装置；和任选地使用和试剂盒结果解释的说明书。该试剂盒还可以包括例如用于从个体获得生物样品的装置。

举例说明性实施方案的详述

I.前言

本发明人已发现，脂连蛋白受体的C-末端片段是可溶的且可以在体液中检测到。此外，本发明人已观察到体液中脂连蛋白受体的某些可溶性片段的存在或不存在是疾病的预示，且体液中总可溶性脂连蛋白受体片段的水平即浓度是疾病的预示。

应当理解本文描述的本发明不限于具体方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，其当然可以改变。还应当理解本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并且不意欲是限制性的。如说明书和附加权利要求中使用的，除非内容中另有明确说明，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数参照。因此，例如，提及“细胞”包括2种或更多细胞的组合等。

如本文所使用的，当提及可测量的值，如量、持续时间等时，术语“约”意欲包含距离指定值±20％或±10％的变化，更优选地±5％，甚至更加优选地±1％，和再更优选地±0.1％，因为此类变化对于执行公开的方法是适当的。

II.脂连蛋白受体及其片段

脂连蛋白受体是首先由Yamauchi等人(Nature，2003，423(6941)，762-9)描述的跨膜受体，并且具有几种类型。已鉴定了3种脂连蛋白受体类型：脂连蛋白受体1(也称为AdipoR1)、脂连蛋白受体2(也称为AdipoR2)和脂连蛋白受体3(也称为AdipoR3)。脂连蛋白受体与脂连蛋白特异性结合且由其调节，所述脂连蛋白是在肌肉和肝的脂质和葡萄糖代谢中起重要作用的脂肪细胞衍生因子。

人脂连蛋白受体1和2的核酸和氨基酸序列在公众数据库(例如，参见Genbank登记号NM_015999、AK222503、AK025085、AK222503、NM_024551、Q96A54和Q86V24)中可获得并且在本文中提供。人脂连蛋白受体3的核酸和氨基酸序列在美国公开号20050032166中提供，所述专利整体引入本文作为参考。将理解如本文所使用的，术语脂连蛋白受体不仅包含具有本文描述的序列的脂连蛋白受体，还包括例如脂连蛋白受体的天然存在的截短形式、天然存在的变体形式(例如，可变剪接形式)、保守修饰的变体和天然存在的等位基因变体。

“保守修饰的变体”应用于氨基酸和核酸序列。就特定核酸序列而言，保守修饰的变体指编码等同或基本上等同的氨基酸序列的那些核酸，或当核酸不编码氨基酸序列时指基本上等同的序列。因为遗传密码的简并性，大量功能上等同的核酸编码任何给定蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU全都编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子指定的每个位置上，密码子可以改变成所述的任何相应密码子而不改变编码的多肽。此种核酸变异是“沉默变异”，这是保守修饰的变异的一个种类。本文的编码多肽的每个核酸序列还描述核酸的每个可能的沉默变异。技术人员将认识到核酸中的每个密码子(除了AUG外，其一般是用于甲硫氨酸的唯一密码子，和除了TGG外，其一般是用于色氨酸的唯一密码子)可以进行修饰以产生功能上等同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异就表达产物而言，而不是就实际探针序列而言内含于每个所述序列。

关于氨基酸序列，技术人员将认识到在编码的序列中改变、添加或删除单个氨基酸或小百分比氨基酸的针对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别置换、缺失或添加是“保守修饰的变体”，当所述改变导致由化学上相似的氨基酸置换氨基酸时。提供功能上相似的氨基酸的保守置换表是本领域众所周知的。此种保守修饰的变体是加上且不排除本发明的多态变体、物种间同源物和等位基因。

下述8个组各自包含彼此为保守置换的氨基酸：1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(参见，例如，Creighton，Proteins(1984))。

特定核酸序列还暗示包含“剪接变体”。类似地，由核酸编码的特定蛋白质暗示包含由那种核酸的剪接变体编码的任何蛋白质。如名称所暗示的，“剪接变体”是基因的可变剪接的产物。转录后，起始核酸转录物可以进行剪接，从而使得不同的(可变的)核酸剪接产物编码不同多肽。用于生产剪接变体的机制可变化，但包括外显子的可变剪接。这个定义还包含了通过连读转录衍生自相同核酸的可变多肽。剪接反应的任何产物，包括剪接产物的重组形式包括在这个定义中。

短语“脂连蛋白受体的可溶性C-末端片段”指来自脂连蛋白受体的C末端的片段，所述片段从脂连蛋白受体脱落且在体液中是可溶的。多种体液可以用于实践本发明的方法，包括例如血液、血清、血浆、尿、唾液、腹水等。

脂连蛋白在本领域众所周知的是作为由具有胰岛素致敏、抗动脉粥样硬化、和抗炎性质的脂肪细胞分泌的激素。脂连蛋白水平在某些状况下减少，包括肥胖、胰岛素抵抗和糖尿病。脂连蛋白的活性由其受体介导。脂连蛋白可以作为全长或作为较小的球状片段存在。存在4个不同的脂连蛋白区域。第一个是使激素靶向细胞外分泌的短信号序列，下一个是在物种间可变的小区域；第三个是与胶原蛋白质具有相似性的区域；且最后一个是球状结构域。关于脂连蛋白预测的单体质量为26kDa，其范围为约17-约33kDa。脂连蛋白的寡聚体形成依赖于由内部半胱氨酸残基介导的二硫键形成。脂连蛋白在血浆中以广泛范围的多聚体复合物存在，并且经由其胶原结构域组合以产生3种主要寡聚形式：低、中和高分子量形式。丝氨酸蛋白酶如弹性蛋白酶和胰蛋白酶具有用于切割脂连蛋白的多个位点。在约16kDa的平均分子量处的球状脂连蛋白的释放已知在患者中发生。其余的非球状脂连蛋白具有10kDA的平均分子量。经由胰蛋白酶型丝氨酸蛋白酶的脂连蛋白切割可以例如在氨基酸101处发生，从而导致产生16.5kDA的球状脂连蛋白，或经由弹性蛋白酶(elestase)型丝氨酸蛋白酶在氨基酸108处切割从而导致产生15.8kDa的球状脂连蛋白。在氨基酸88-108中存在多个潜在的切割位点，从而产生对于球状脂连蛋白约17.8kDa-约9.7kDa的质量范围。非球状脂连蛋白的另外蛋白酶切割可以产生小至3kDa的片段。

不希望被理论束缚，认为脂连蛋白受体的c-末端尾部用于捕获全长脂连蛋白。结合被认为在脂连蛋白蛋白质的非球状部分和脂连蛋白受体的脂连蛋白尾部结合结构域之间发生。在经由蛋白酶切割后，非球状脂连蛋白被认为仍与脂连蛋白受体的c-末端区域结合。游离的球状脂连蛋白被认为与受体上的另一个区域相互作用，以引起进一步的激活。在不存在非球状脂连蛋白的情况下，认为不发生与c-末端的结合。

本发明人已发现脂连蛋白受体的C-末端部分与受体断开，并且存在于体液中。非球状脂连蛋白的存在或水平可以影响脂连蛋白受体的c-末端的断裂模式。本发明人已在体液中检测到脂连蛋白受体1和2的片段。给定脂连蛋白受体是整合膜蛋白的事实，脂连蛋白受体可以在体液中检测到且提供疾病状态的可靠和实际指示物的观察和结论是特别令人惊讶的。同样令人惊讶的是某些片段倾向于在疾病中不存在，并且受体片段的总数目或浓度中的增加在疾病状态中发生，已知脂连蛋白水平伴随疾病减少。

本发明尤其提供了AdipoR1的脂连蛋白受体片段1-22(SEQ IDNOS：1-22)。AdipoR1的片段1具有34个氨基酸，对应于AdipoR1上的氨基酸361-375。氨基酸1-14是丝氨酸蛋白酶切割结构域；氨基酸15-22是adipoR2样结构域；且氨基酸23-34是脂连蛋白结合结构域。AdipoR1的片段1的序列是vlvvaaafvh fygvsnlqef rygleggctd dtll(SEQ ID NO：1)。这个片段可以在任何氨基酸处进一步断裂，并且特别地在丝氨酸蛋白酶切割结构域、adipoR1样结构域或脂连蛋白结合结构域内的任何氨基酸处。存在于体液中的某些关键片段是具有序列lvvaaafvh fygvsnlqef rygleggctd dtll(SEQ ID NO：2)的片段2和具有序列snlqef rygleggctd dtll(SEQ ID NO：3)的片段3，但至少可以发现下述片段：vvaaafvh fygvsnlqef rygleggctd dtll(SEQ ID NO：4)、vaaafvh fygvsnlqef rygleggctd dtll(SEQ ID NO：5)、aaafvh fygvsnlqefrygleggctd dtll(SEQ ID NO：6)、aafvh fygvsnlqef rygleggctd dtll(SEQID NO：7)、afvh fygvsnlqef rygleggctd dtll(SEQ ID NO：8)、fvhfygvsnlqef rygleggctd dtll(SEQ ID NO：9)、vh fygvsnlqef rygleggctd dtll(SEQ ID NO：10)、h fygvsnlqef rygleggctd dtll(SEQ ID NO：11)、fygvsnlqef rygleggctd dtll(SEQ ID NO：12)、ygvsnlqef rygleggctd dtll(SEQ ID NO：13)、gvsnlqef rygleggctd dtll(SEQ ID NO：14)、vsnlqefrygleggctd dtll(SEQ ID NO：15)、nlqef rygleggctd dtll(SEQ ID NO：16)、lqef rygleggctd dtll(SEQ ID NO：17)、qef rygleggctd dtll(SEQ IDNO：18)、ef rygleggctd dtll(SEQ ID NO：19)、f rygleggctd dtll(SEQID NO：20)、rygleggctd dtll(SEQ ID NO：21)和ygleggctd dtll(SEQID NO：22)。

本发明尤其提供了AdipoR2的脂连蛋白受体片段1-22(SEQ IDNOS：23-44)。AdipoR2的片段1具有34个氨基酸，对应于AdipoR2上的氨基酸353-386。氨基酸1-14是丝氨酸蛋白酶切割结构域；氨基酸15-22是adipoR2样结构域；且氨基酸23-34是脂连蛋白结合结构域。AdipoR2的片段1的序列是ifvvagafvh fhgvsnlqefrfmigggcse edal(SEQ ID NO：23)。这个片段可以在任何氨基酸处进一步断裂，并且特别地在丝氨酸蛋白酶切割结构域、adipoR2样结构域或脂连蛋白结合结构域内的任何氨基酸处。存在于体液中的关键片段是具有序列vagafvh fhgvsnlqef rfmigggcse edal(SEQ ID NO：24)的片段2和具有序列snlqef rfmigggcse edal(SEQ ID NO：25)的片段3，但至少还可以发现下述片段：fvvagafvh fhgvsnlqef rfmigggcseedal(SEQ ID NO：26)、vvagafvh fhgvsnlqef rfmigggcse edal(SEQ IDNO：27)、agafvh fhgvsnlqef rfmigggcse edal(SEQ ID NO：28)、gafvhfhgvsnlqef rfmigggcse edal(SEQ ID NO：29)、afvh fhgvsnlqefrfmigggcse edal(SEQ ID NO：30)、fvh fhgvsnlqef rfmigggcse edal(SEQID NO：31)、vh fhgvsnlqef rfmigggcse edal(SEQ ID NO：32)、hfhgvsnlqef rfmigggcse edal(SEQ ID NO：33)、fhgvsnlqef rfmigggcseedal(SEQ ID NO：34)、hgvsnlqef rfmigggcse edal(SEQ ID NO：35)、gvsnlqef rfmigggcse edal(SEQ ID NO：36)、vsnlqef rfmigggcse edal(SEQ ID NO：37)、nlqef rfmigggcse edal(SEQ ID NO：38)、1qefrfmigggcse edal(SEQ ID NO：39)、qef rfmigggcse edal(SEQ ID NO：40)、ef rfmigggcse edal(SEQ ID NO：41)、f rfmigggcse edal(SEQ IDNO：42)、rfmigggcse edal(SEQ ID NO：43)和fmigggcse edal(SEQID NO：44)。

在某些情况下，体内存在的脂连蛋白受体并不具有如本文所描述的确切序列，而作为天然存在的变体形式存在。例如，脂连蛋白受体可以置换其至少最高达5％或甚至最高达10％的氨基酸，而不丧失功能。因此，SEQ ID NOS.1-44中的至少2个氨基酸可以用其他氨基酸进行置换。因此，本发明不仅包含AdipoR1和AdipoR2的片段1-22，而且还包含与本文描述的片段具有相当大同一性的片段。相当大同一性在本文中描述为与片段具有约75％或80％或更大的同一性。因此，片段可以与SEQ ID NOS 1-44具有约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％或约98％。

同一性百分比可以通过在比较窗上比较2个最佳比对的序列来测定，其中对于2个序列的最佳比较，与参考序列(其不包含添加或删除)相比较，比较窗中的多肽序列的部分可以包含添加或删除(即，缺口)。百分比通过下述进行计算：测定在其上相同的氨基酸残基存在于2个序列中的位置数目，以产生匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以比较窗中的位置总数目，并且将结果乘以100以产生序列同一性百分比。同一性使用本领域已知的各种序列比较算法和程序中的任何一种进行估计。此种算法和程序包括但决不限于，TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA、CLUSTALW、FASTDB，其公开内容整体引入作为参考。Pearson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85：2444-2448，1988；Altschul等人，J.Mol.Biol.，215：403410，1990；Thompson等人，Nucleic Acids Res.，22：4673-4680，1994；Higgins等人，Meth.Enzymol.，266：383402，1996；Altschul等人，NatureGenetics，3：266-272，1993；Brutlag等人，Comp.App.Biosci.，6：237-24，1990。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于指氨基酸残基的聚合物。该术语应用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。

如本文所使用的，术语“多核苷酸”意指长度为至少约10个碱基或碱基对的核苷酸的聚合形式，核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式，并且意欲包括单链和双链形式的DNA。

本文描述的脂连蛋白受体片段可以通过片段的c末端附近存在的半胱氨酸氨基酸(SEQ ID NO：1和16中的第28位)二聚化。因此，这些片段可以作为二聚体存在于体液中。

SEQ ID NOS：1-44中存在的几个氨基酸是用于翻译后修饰的潜在位点。例如，存在于片段中的甘氨酸(SEQ ID NO：1和23中的第26位)是潜在的N-豆蔻酰化位点，精氨酸(SEQ ID NO：1和23中的第21位)是潜在的N-聚糖位点，且丝氨酸(SEQ ID NO：1和23中的第15位)是潜在的O-聚糖位点。因此，由于翻译后修饰，片段可以具有另外的质量。

本发明的一个方面提供了本文描述的片段。因此，本发明提供了与SEQ ID NOS：1-44具有相当大同一性的分离的片段。分离的片段是已从生物来源中进行纯化或已通过重组或合成方法进行制备的那些。实现这点的方法是本领域众所周知的并且因此在本文中未描述。

本发明的另一个方面是在生物流体样品中检测本文描述的片段。

本发明人已发现脂连蛋白受体-跨膜受体的片段可以在生物流体样品中通过测定生物流体中受体的c-末端区域的存在进行检测。

还已发现组织中脂连蛋白受体的表达水平可以通过下述进行测定：测定生物流体样品中脂连蛋白受体的至少一种C-末端片段的水平，并比较至少一种C-末端片段的水平与对照样品中相同片段的水平。

还已发现受试者中脂连蛋白的表达水平可以通过下述进行测定：测定生物流体样品中脂连蛋白受体的至少一种C-末端片段的水平，并比较至少一种C-末端片段的水平与对照样品中相同片段的水平。

脂连蛋白受体的片段可以在患病和非患病个体的体液中发现。然而，脂连蛋白的存在或水平可以影响脂连蛋白受体的c-末端的断裂模式。受试者中脂连蛋白的水平和类型也可以影响受试者中存在的脂连蛋白受体的水平。

本发明人已发现在具有正常水平的全长脂连蛋白的正常受试者(即，非患病)中，在生物流体中发现较大的脂连蛋白受体片段，即长度为25-34个氨基酸的片段(即，SEQ ID NOS：1、2、4-11、23、24和/或26-33)。这些片段一般是未结合的。这些较大片段中的许多在患有脂连蛋白相关疾病的受试者中不存在或以明显更低的水平存在(即，片段在患病患者中以非患病患者中的1/2、1/5、1/10、1/20、1/50、1/100或低于1/100的水平存在)。未结合的片段意指不与载体蛋白质即脂连蛋白结合的片段。

本发明人已发现在患病受试者中，在生物流体中发现较小的脂连蛋白片段，即长度为约13-24个氨基酸的片段(即，SEQ ID NOS：3、12-22、25和/或34-44)。这些片段可以是结合或未结合的。这些片段也在正常受试者中发现，但一般与患病受试者中的水平不同(即，片段在患病患者中以非患病患者中的1.5x、2x、2.5x、4x、5x、6x、7x、8x、9x或10x的水平存在)。

本发明人已发现在正常和患病受试者中，观察到与脂连蛋白结合的c-末端脂连蛋白受体片段。这些结合的受体片段可以是较大或较小的片段。在许多情况下，这些片段与无论是部分断裂还是全长的脂连蛋白的非球状部分结合。结合的脂连蛋白受体片段的水平在具有疾病的受试者中增加。

因此，未结合和结合片段以及较小和较大片段的存在和/或水平可以用于确定个体中脂连蛋白和脂连蛋白受体的表达水平以及个体中的疾病状态。

III.脂连蛋白受体的可溶性C-末端片段的检测

本发明提供了用于测定体液中脂连蛋白受体的至少一种可溶性C-末端片段的存在或不存在和/或测定其水平的方法。短语“测定水平”意指检测样品中分析物的存在或不存在，或以相对或绝对条件定量其量。相对量可以是例如高、中或低。绝对量可以反映测量的信号强度，或这种信号强度转变成另一种定量形式，例如微克/ml。

C-末端片段可以通过任何合适的方法进行检测。可以应用的检测范例包括例如，光学方法、电化学方法(伏安法和电流分析法技术)、原子力显微术、和射频法，例如多极共振分光术。光学方法包括例如比色测定，电子阻抗分光术，荧光、发光、化学发光、吸光度、反射比、透射比和双折射或折光指数的共焦和非共焦显微镜术检测(例如，表面等离子体共振、椭圆对称法、共振镜法、光栅耦合器波导法或干涉分析法)。

在某些优选实施方案中，表达水平，包括脂连蛋白受体的至少一种可溶性C-末端片段的存在或不存在通过免疫测定进行测定。技术人员应认识到在其最广泛的背景中，“免疫测定”包括使测试样品与一种或多种对靶特异的免疫相互作用(immunointeractive)分子以足以与其结合且检测所述结合的时间和条件温育。如本文所使用的，术语“靶”指探针设计为与之结合的分析物。在某些优选实施方案中，免疫相互作用分子将是抗体。用于使抗体与测试样品温育的条件依赖于测定中使用的形式、应用的检测法以及测定中使用的抗体分子的类型和性质而变。技术人员将认识到常用的免疫测定形式中的任何一种，例如放射免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫比浊法(tubimetric)、免疫浊度测定法(immunonephrometric)、磁性免疫粒子分离、免疫层析、免疫微观流体、免疫离心、基于扩散的Ouchterlony、火箭凝胶免疫电泳或原位免疫测定可以容易地适合于该目的。

免疫测定用于定量测试样品中脂连蛋白受体的至少一种可溶性C-末端片段，特别是与非患病个体中可检测的正常水平相比较，确定至少一种可溶性C-末端片段的水平是否改变。因此，此种免疫测定在确定患者是否可能具有疾病或疾病素因中特别有用。免疫测定还可以具有其他用途，例如在监控疾病进展或监控针对治疗干预的应答中的用途。本文描述的本发明扩展至免疫相互作用分子的所有此种用途和需要所述免疫测定用于其性能的诊断测定。

仅作为例子，在某些实施方案中，将针对片段产生的抗体固定化在固体基质上以形成第一复合物，并且使来自患者的生物测试样品与结合分子接触。合适的温育时间段后，足以允许抗体-第二复合物形成的时间段，随后添加用能够产生可检测信号的报道分子标记的第二抗体，并进行温育，允许第三复合物形成的充足时间。将任何未反应的材料洗掉，并且通过观察由报道分子产生的信号测定第三复合物的存在。结果可以是通过可见信号的简单观察定性的，或可以通过与包含已知量半抗原的对照样品相比较进行定量。这种测定的变化包括其中将样品和标记的抗体同时加入结合抗体中的同时测定，或其中首先将标记的抗体和待检测的样品组合、温育且随后同时加入结合抗体中的反向测定。这些技术是本领域技术人员众所周知的，并且变化的可能性将是显而易见的。

如本说明书中使用的，“报道分子”意指通过其化学性质产生经分析可鉴定的信号的分子，所述信号允许检测抗原-结合的抗体。检测可以是定性或定量的。这种类型的测定中最常用的报道分子是有色胶乳颗粒、金属颗粒、酶、荧光团或包含放射性核素的分子(即放射性同位素)。

固体基质一般是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、硝化纤维素、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固体支持体可以是条、盒、管、珠、盘或微量培养板、或适合于进行免疫测定的任何其他表面的形式。结合方法是本领域众所周知的，并且一般由分子与不溶性载体的交联共价结合或物理吸附组成。

多种免疫测定形式，包括例如竞争和非竞争免疫测定形式、抗原捕获测定和双抗体夹心测定可以在本发明的方法中使用(Self和Cook，Curr.Opin.Biotechnol.7：60-65(1996))。在抗原捕获测定中，抗体与固相结合，并且添加样品，从而使得可溶性脂连蛋白受体C末端片段抗原由抗体结合。抗体可以对一种或两种或更多种可溶性C末端片段特异。通过洗涤去除未结合的蛋白质后，如需要，结合抗原的量可以使用例如放射性测定(Harlow和Lane，Antibodies A Laboratory ManualCold Spring Harbor Laboratory：New York，1988))进行定量。免疫测定可以在抗体过量的条件下进行，或作为抗原竞争，以定量抗原的量，并因此测定可溶性脂连蛋白受体C末端片段的水平。

酶联免疫吸附测定(ELISAs)可以用于本发明的某些方法中。在酶免疫测定的情况下，酶一般借助于戊二醛或高碘酸盐与等二抗体缀合。然而，如将容易理解的，存在对于本领域技术人员可容易获得的广泛多样的不同缀合技术。常用的酶尤其包括，例如辣根过氧化物酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。与特定酶一起使用的底物一般选择用于在通过相应的酶水解后产生可检测的颜色变化。还可能使用例如产生荧光产物的荧光底物。酶例如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶或脲酶，可以例如与抗脂连蛋白受体C-末端片段或第二抗体连接，以在本发明的方法中使用。辣根过氧化物酶检测系统可以例如与显色底物四甲基联苯胺(TMB)一起使用，所述TMB在过氧化氢的存在下产生在450nm处可检测的可溶产物。其他方便的酶联系统包括例如碱性磷酸酶检测系统，其可以例如与显色底物磷酸对硝基苯酯一起使用，以产生在405nm处可容易检测的可溶产物。类似地，β-半乳糖苷酶检测系统可以与例如显色底物邻-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖糖苷(ONPG)一起使用，以产生在410nm处可检测的可溶产物，或脲酶检测系统可以与例如底物如尿素-溴甲酚紫(Sigma Immunochemicals，St.Louis，Mo.)一起使用。有用的酶联第一抗体和第二抗体可以得自许多商业来源，例如JacksonImmuno-Research(West Grove，Pa.)。

在某些实施方案中，可溶性C-末端片段可以使用化学发光检测进行检测且测量。例如，在某些实施方案中，脂连蛋白受体C-末端片段特异性抗体用于捕获生物样品中存在的片段，并且对特异性抗体特异且用化学发光标记进行标记的抗体用于检测样品中存在的片段。任何化学发光标记和检测系统都可以用于本方法中。化学发光第二抗体可以在商业上从各种来源如Amersham获得。检测化学发光第二抗体的方法是本领域已知的并且在本文中不详细讨论。

荧光检测也可以在本发明的某些方法中用于检测脂连蛋白受体片段。有用的荧光染料包括例如DAPI、荧光素、镧系元素金属、Hoechst33258、R-藻蓝蛋白、B-藻红蛋白、R-藻红蛋白、罗丹明、德克萨斯红和丽丝胺。荧光素或罗丹明标记的α2-MG-、HA-、TIMP-1-或YKL-40-特异性结合剂例如抗-α2-MG、抗-HA、抗-TIMP-1或抗-YKL-40抗体，或荧光素或罗丹明标记的第二抗体可以在本发明中使用。有用的荧光抗体可以在商业上例如从Tago Immunologicals(Burlingame，Calif.)获得，如下文进一步描述的。荧光化合物可以与抗体进行化学偶联，而不改变其结合能力。当通过用特定波长的光照射激活时，荧光染料标记的抗体吸附光能，从而诱导分子中的激发性状态，随后为用光学显微镜可视觉检测的特征性颜色处的光发射。

放射免疫测定(RIAs)也可以在本发明的某些方法中使用。此种测定是本领域众所周知的。放射免疫测定可以例如用¹²⁵I标记的第一抗体或第二抗体(Harlow和Lane，同上，1988)来进行。

来自可检测试剂的信号可以使用下述进行分析，例如分光光度计以检测来自显色底物的颜色；辐射计数器以检测辐射，例如γ计数器用于检测¹²⁵I；或荧光计以检测在某一波长的光的存在下的荧光。当使用酶联测定时，可溶性脂连蛋白受体片段的量的定量分析可以使用分光光度计例如EMAX Microplate Reader(Molecular Devices；MenloPark，Calif.)依照制造商的说明书来进行。本发明的测定可以是自动化的或如需要自动地进行，并且来自多重样品的信号可以同时进行检测。

本发明的方法还包含基于毛细管电泳的免疫测定(CEIA)的使用，如需要所述CEIA可以是自动化的。免疫测定还可以与激光诱导的荧光结合使用，如例如Schmalzing和Nashabeh，Electrophoresis 18：2184-93(1997)，以及Bao，J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.699：463-80(1997)中描述的。脂质体免疫测定，例如流动注射脂质体免疫测定和脂质体免疫传感器，也可以根据本发明的某些方法用于检测可溶性C末端脂连蛋白片段，或测定C末端脂连蛋白片段的水平(Rongen等人，J.Immunol.Methods 204：105-133(1997))。

夹心酶免疫测定也可以在本发明的某些方法中使用。在双抗体夹心测定中，第一种抗体与固体支持体结合，并且允许抗原与第一抗体结合。可溶性C末端脂连蛋白片段的量可以通过测量与之结合的第二抗体的量进行定量。

定量蛋白质印迹也可以在本发明的方法中用于测定可溶性C末端脂连蛋白片段的水平。蛋白质印迹法可以通过众所周知的方法如光密度扫描法进行定量。例如，蛋白质样品可以在10％ SDS-PAGE Laemmli凝胶上进行电泳。第一鼠单克隆抗体与印迹反应，并且使用预备狭线印迹实验证实抗体结合是线性的。山羊抗小鼠辣根过氧化物酶偶联的抗体(BioRad)用作第二抗体，且信号检测使用化学发光来进行，例如使用Renaissance化学发光试剂盒(New England Nuclear；Boston，Mass.)根据制造商的说明书。印迹的放射自显影图使用光密度扫描仪(Molecular Dynamics；Sunnyvale，Calif.)进行分析，并且对于阳性对照进行标准化。值例如报告为实际值与阳性对照(光密度测定指数)之间的比。此种方法是本领域众所周知的，如例如在Parra等人，J.Vasc.Surg.28：669-675(1998)中描述的。

脂连蛋白受体片段的水平也可以使用蛋白质微阵列进行测定。产生可以适合于检测临床样品中的蛋白质水平的蛋白质微阵列的方法在本领域中得到描述(参见例如Xiao等人(2005)Mol Cell Endocrinol.；230(1-2)：95-10；Protein Microarrays(2004)Mark Schena(Ed)Jones& Bartlett Publishers，Inc.)。美国专利公开2003/0153013描述了检测蛋白质例如抗原或抗体的方法，其通过使抗体固定化在膜上的蛋白质微阵列中并且使微阵列与检测蛋白质接触，所述检测蛋白质可以与蛋白质结合以形成蛋白质复合物。类似地，美国专利公开2004/0038428描述了构建蛋白质微阵列的方法。

在某些优选实施方案中，样品借助于生物芯片进行分析。生物芯片一般包含固体基质，且具有捕获试剂(也称为吸附剂或亲和试剂)与之附着的一般平面性表面。通常，生物芯片的表面包含多个可寻址位置，所述位置各自具有在其上结合的捕获试剂。

蛋白质生物芯片是适合于捕获肽的生物芯片。许多蛋白质生物芯片在本领域中得到描述。这些包括例如由Ciphergen Biosystems，Inc.(Fremont，CA)、Packard BioScience Company(Meriden CT)、Zyomyx(Hayward，CA)、Phylos(Lexington，MA)和Biacore(Uppsala，瑞典)生产的蛋白质生物芯片。此种蛋白质生物芯片的例子在下述专利和公开的专利申请中得到描述：美国专利号6,225,047；PCT国际公开号WO 99/51773；美国专利号6,329,209，PCT国际公开号WO 00/56934和美国专利号5,242,828，所述专利整体且为了所有目的引入本文作为参考。

对于本文的用途，测定方法可以包括在固体基质上捕获C-末端脂连蛋白受体片段。一般地它们将使用生物特异性捕获试剂如抗体，且特别是免疫测定中使用的抗体进行捕获。生物特异性捕获试剂包括以例如至少10^-9M、10^-10M、10^-11M或10^-12M的亲和力与靶分析物结合的那些分子。这些分子还可以用非特异性方法如层析材料进行捕获。

在本发明的某些实施方案中，脂连蛋白受体的至少一种C-末端片段将通过质谱法进行检测。质谱仪的例子是飞行时间、扇形磁场、四极滤器、离子阱、离子回旋共振、扇形静电分析仪(electrostatic sectoranalyzer)及其混合。

用于在本发明中使用的优选质谱技术是“表面增强激光解吸和电离”或“SELDI”，如例如给予Hutchens和Yip的美国专利号5,719,060和6,225,047中描述的，所述专利各自整体且为了所有目的引入本文作为参考。这指解吸/电离气相离子光谱测定法的方法(例如，激光解吸/电离质谱法)，其中分析物捕获在SELDI探针的表面上，所述SELDI探针接合质谱仪的探针界面。

一种形式的SELDI称为“亲和质谱法”。这种形式涉及包含吸收剂表面的探针(“亲和质谱法探针”)的使用。在这个背景中，“探针”指适合于接合探针界面且将分析物呈递给电离能用于电离和引入质谱仪内的装置。探针一般包括柔性或刚性的固体基质，其具有样品呈递表面，在所述表面上将分析物呈递给电离能源。

另一种形式的SELDI是表面增强净解吸(“SEND”)，其涉及包含与探针表面附着的能量吸收分子的探针(“SEND探针”)的使用。短语“能量吸收分子”(EAM)表示能够从激光解吸/电离源吸收能量，且其后促进与之接触的分析物分子的解吸和电离的分子。EAM类别包括在MALDI中使用的分子，通常称为“基体”，且由肉桂酸衍生物、芥子酸(SPA)、氰基-羟基肉桂酸(CHCA)和二羟基苯甲酸、阿魏酸和羟苯乙酮衍生物例示。在某些实施方案中，将能量吸收分子掺入线性或交联聚合物内，例如聚甲基丙烯酸酯。例如，组合物可以是a-氰基-4-甲基丙烯酰氧肉桂酸和丙烯酸酯的共聚物。在另一个实施方案中，组合物是a-氰基-4-甲基丙烯酰氧肉桂酸、丙烯酸酯和甲基丙烯酸3-(三乙氧基)甲硅烷基丙酯的共聚物。在另一个实施方案中，组合物是a-氰基-4-甲基丙烯酰氧肉桂酸和十八基甲基丙烯酸酯的共聚物(“C18SEND”)。SEND在美国专利号6,124,137中进一步描述，所述专利整体且为了所有目的引入本文作为参考。

“选择性表面”可以用于捕获用于SELDI分析的片段。选择性表面具有与表面附着的“吸附剂”，也称为“结合部分”或“捕获试剂”。“吸附剂”或“捕获试剂”或“结合部分”可以是能够结合分析物的任何材料。捕获试剂可以直接与选择性表面的基质附着，或基质可以是携带“反应部分”的“反应表面”，所述“反应部分”能够与捕获试剂结合，例如，通过形成共价或配位共价键的反应。环氧化物和碳二咪唑是有用的反应部分，以共价结合多肽捕获试剂例如抗体或细胞受体。次氮基乙酸和亚氨基二乙酸是有用的反应部分，其充当螯合剂以结合与包含组氨酸的肽非共价相互作用的金属离子。

在某些实施方案中，用于捕获C-末端脂连蛋白受体片段的吸附剂包含生物特异性捕获试剂。“生物特异性吸附剂”指以至少10^-9M、10^-10M、10^-11M或10^-12M的亲和力与分析物结合的吸附剂。优选的生物特异性捕获试剂是抗体或其结合片段。这包括完整的免疫球蛋白以及本领域众所周知的其变体和部分，例如Fab′片段、F(ab)’2片段和scFv蛋白质。其他生物特异性捕获试剂包括亲和体(affibodies)(Affibody，Teknikringen 30，floor 6，Box 700 04，Stockholm SE-10044，Sweden，美国专利号：5,831,012；还参见Surface Logix，Inc.，50 Soldiers FieldPlace，Brighton，MA 02135和Hodneland，C.D等人，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.99：5048-5052)。

本发明的片段可以捕获在层析吸附剂上。“层析吸附剂”指一般在层析中使用的吸附剂材料。层析吸附剂包括例如硝酸纤维素膜、离子交换材料、金属螯合剂(例如次氮基乙酸或亚氨基二乙酸)、固定化金属螯合物、疏水作用吸附剂、亲水作用吸附剂、染料、简单生物分子(例如，核苷酸、氨基酸、单糖和脂肪酸)和混合模式吸附剂(例如疏水性吸引/静电排斥吸附剂)。

在某些实施方案中，使具有吸附剂的基质与样品例如患者血清接触足以允许可能存在的靶分析物与吸附剂结合的时间段。温育时间段后，洗涤基质以去除未结合的材料。可以使用任何合适的洗涤溶液；优选地，使用水溶液。分子保持结合的程度可以通过调整洗涤的严格性进行处理。洗涤溶液的洗脱特征可以取决于例如pH、离子强度、疏水性、离液(chaotropism)程度、去污剂强度和温度。除非探针具有SEAC和SEND性质，随后将能量吸收分子应用于具有结合的靶分析物的基质。

与底物结合的生物分子可以在气相离子分光计例如飞行时间质谱仪中进行检测。靶分析物可以通过电离源如激光进行电离，产生的离子通过离子光学装置进行收集，并且随后质量分析器分散且分析经过的离子。检测器随后将检测到的离子的信息转变成质荷比。靶分析物的检测一般将包括信号强度的检测。因此，可以测定靶分析物的数量和质量。

在另一种质谱法中，靶分析物可以首先捕获在具有层析性质的层析树脂上，所述层析树脂与靶分析物例如一种或多种抗体结合。在这个例子中，这可以包括免疫层析树脂，其包含结合C-末端脂连蛋白受体片段的抗体。未结合的材料可以从树脂洗掉。随后靶分析物可以从树脂洗脱。最后，洗脱的靶分析物可以通过MALDI或通过SELDI进行检测。

通过飞行时间质谱法分析分析物产生飞行时间谱。最终分析的飞行时间谱一般不表示针对样品来自电离能的单脉冲的信号，而表示来自多次脉冲的信号总和。这减少了噪声且增加了动态范围。随后对这种飞行时间数据实施数据处理。

通过靶分析物的解吸和检测产生的数据可以借助于可编程的数字计算机进行分析。计算机程序分析数据以指出检测到的蛋白质的数目、以及任选地信号强度和对于检测到的每种靶分析物确定的分子量。数据分析可以包括确定靶分析物的信号强度且去除偏离预定统计学分布的数据的步骤。例如，观察到的峰可以通过计算每个峰相对于某些参考的高度进行标准化。参考可以是由仪器和在等级中设定为零的化学药品如能量吸收分子产生的背景噪声。

分析一般涉及鉴定表示来自分析物的信号的谱中的峰。峰选择可以视觉上进行，但可以自动检测峰的软件是可获得的。一般而言，这种软件通过鉴定具有超过所选阈值的信噪比的信号且标记在峰信号的质心处峰的质量来起作用。在一种有用的应用中，比较许多质谱以鉴定质谱的某些选择百分比中存在的相同峰。这种软件的一个版本使限定质量范围内各种谱中出现的所有峰成簇，并对接近质量(M/Z)簇的中点的所有峰指定质量(M/Z)。

用于分析数据的软件可以包括将算法应用于信号分析的代码，以确定信号是否表示对应于根据本发明的靶分析物的信号中的峰。该软件还可以将关于观察到的靶分析物峰的数据提交给分类树或ANN分析，以确定是否存在指示心血管疾病状态的靶分析物峰或靶分析物峰的组合。数据的分析可以“适合于”从样品的质谱分析中直接或间接获得的多种参数。这些参数包括但不限于，一个或多个峰的存在或不存在、峰或峰组的形状、一个或多个峰的高度、一个或多个峰的高度的对数、和峰高度数据的其他算术操作。

IV.抗体

本发明进一步提供了与脂连蛋白受体的C-末端片段特异性结合的抗体。制备对选择肽具有结合特异性的抗体的方法是本领域众所周知的。例如，此种抗体可以通过下述进行选择：用靶分子免疫动物、产生抗体、且测试抗体以鉴定特定抗体是否与靶分子结合。可以选择与靶分子结合的抗体。例如，人们可以产生针对这些分子的单克隆抗体。

短语“特异性结合”指在其他生物制品的异质群体的存在下决定靶的存在的结合反应。因此，在指定的测定条件下，特异性结合区域优先与特定靶结合，并且不以显著的量与测试样品中存在的其他组分结合。在此种条件下与靶特异性结合可以要求就其对于特定靶的特异性选择的结合部分。多种测定形式可以用于选择与特定分析物特异性反应的结合区域。一般地特异性或选择性反应将是至少是背景信号或噪声的2倍并且更一般地为背景的超过10倍。

术语“抗体”以最广泛的含义使用并且特别地包含单克隆抗体，多克隆抗体，具有多表位特异性的抗体组合物，双特异性抗体，双抗体，嵌合、单链和人源化抗体，以及抗体片段(例如，Fab、F(ab’)₂和Fv)，只要它们显示所需生物活性。抗体可以进行标记以用于在生物测定(例如，放射性同位素标记、荧光标记)中使用以帮助抗体的检测。

抗体可以进行标记/与报道分子缀合以用于在生物测定(例如，放射性同位素标记、荧光标记)中使用，以帮助检测本文描述的片段。

如本文所使用的，术语“单克隆抗体”指得自基本上同质的抗体群体的抗体，即构成群体的个别抗体是相同的，除了可以以较少量存在的可能天然存在的突变外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原部位。此外，与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂形成对照，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了其特异性外，单克隆抗体是有利的，因为它们通过杂交瘤培养进行合成，未被其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”指示抗体的特征为得自基本上同质的抗体群体，并且不应被解释为需要通过任何具体方法生产抗体。例如，依照本发明使用的单克隆抗体可以通过首先由Kohler等人，Nature，256：495，1975描述的杂交瘤法进行制备，或可以通过重组DNA法(参见，例如，美国专利号4,816,567，Cabilly，等人)进行制备。“单克隆抗体”还可以由噬菌体抗体文库进行分离，其中使用例如Clackson等人，624-628，1991；Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581-597，1991中描述的技术。

本文的单克隆抗体特别地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重和/或轻链的部分与衍生自特定物种或者属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相应序列等同或同源，而一条或多条链的其余部分与衍生自另一个物种或者属于另一个抗体种类或亚类的抗体中的相应序列等同或同源，以及此种抗体的片段，只要它们显示所需生物活性(Cabilly等人，同上；Morrison等人，Proc.Natl.Acad..Sci.U.S.A.，81：6851-6855，1984)。

单克隆抗体可以通过本领域技术人员熟悉的各种技术来获得。简言之，来自用所需抗原免疫的动物的脾细胞通常通过与骨髓瘤细胞融合进行无限增殖化(参见，Kohler等人，Eur.J.Immunol.，6：511-519，1976)。无限增殖化的可替代方法包括用EB病毒、癌基因或逆转录病毒、或本领域众所周知的其他方法转化。起于单一无限增殖化细胞的菌落就对于抗原的所需特异性和亲和力的抗体生产进行筛选，并且由此种细胞生产的单克隆抗体的得率可以通过各种技术得到增强，包括注射入脊椎动物宿主的腹膜腔内。可替代地，根据由Huse等人，Science，246：1275-1281，1989概述的一般规程，人们通过筛选来自人B细胞的DNA文库，可以分离编码单克隆抗体或其结合片段的DNA序列。

可以收集单克隆抗体和多克隆血清且针对免疫测定中的免疫原蛋白质进行滴定，例如具有固定化在固体支持体上的免疫原的固相免疫测定。一般地，具有10⁴或更大的滴度的多克隆抗血清可以就其针对使用竞争性结合免疫测定的交叉反应性进行选择和测试。特异性多克隆抗血清和单克隆抗体通常将以至少约0.1mM的K_d结合，更通常地至少约1μM，优选地至少约0.1μM或更佳，且最优选地0.01μM或更佳。

“人源化”形式的非人(例如，鼠)抗体是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)₂或抗体的其他抗原结合子序列)，其包含衍生自非人免疫球蛋白的最低限度的序列。在极大程度上，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基由来自具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(供体受体)例如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基替换。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基由相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体和输入CDR或构架序列中都未发现的残基。进行这些修饰以进一步精制和最优化抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、和一般地2个可变结构域中的基本上全部，其中全部或基本上全部CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些，且全部或基本上全部FR区是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体最佳地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少部分，一般地人免疫球蛋白的那种。关于进一步的细节，参见Jones等人，Nature，321：522-525，1986；Reichmann等人，Nature，332：323-329，1988；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596，1992。人源化抗体包括Primatized^TM抗体，其中抗体的抗原结合区衍生自通过用目的抗原免疫猕猴产生的抗体。

包含本文描述的片段的部分的许多免疫原可以用于生产与片段特异性反应的抗体。例如，本发明的片段可以使用本领域已知的技术进行分离。重组蛋白质可以如上所述在真核或原核细胞中进行表达，并如上文一般描述的进行纯化。重组蛋白质是用于生产单克隆或多克隆抗体的优选免疫原。可替代地，衍生自本文公开的序列且与载体蛋白质缀合的合成肽可以用作免疫原。天然存在的蛋白质也可以以纯或不纯的形式使用。随后将产物注射入能够生产抗体的动物内。可以产生单克隆或多克隆抗体，用于随后在免疫测定中用于测量蛋白质。

多克隆抗体的生产方法是本领域技术人员已知的。近交品系小鼠(例如BALB/C小鼠)或兔用蛋白质进行免疫，其中使用标准佐剂例如弗氏佐剂和标准免疫规程。动物针对免疫原制剂的免疫应答通过获取测试放血且测定对于β亚单位的反应性的滴度进行监控。当获得针对免疫原的适当高滴度的抗体时，从动物中收集血液且制备抗血清。如需要，可以进行抗血清的进一步分级分离以富集对蛋白质反应的抗体(参见，Harlow & Lane，同上)。

在进一步的实施方案中，抗体或抗体片段可以从抗体噬菌体文库进行分离，所述抗体噬菌体文库使用McCafferty等人，Nature，348：552-554，1990；Clackson等人，Nature，352：624-628，1991；Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581-597，1991中描述的技术产生，所述参考文献分别描述了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。随后的出版物描述了通过链改组(Mark等人，Bio/Technology，10：779-783，1992)，以及组合感染和体内重组作为用于构建非常大噬菌体文库的策略(Waterhouse等人，Nuc.Acids.Res.，21：2265-2266，1993)来生产高亲和力的(nM范围)人抗体。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代技术。

在某些实施方案中，选择抗体以区别C-末端脂连蛋白受体的一种片段与另一种，即选择在相同测定条件下与一种形式但不与另一种特异性结合的抗体。

因此，本发明提供了与具有SEQ ID NO：1的脂连蛋白受体片段的表位特异性结合的抗体。在某些实施方案中，抗体将与脂连蛋白结合结构域外的SEQ ID NO：1的区域特异性结合，即，抗体将与SEQID NO：1的残基1-22内的表位特异性结合。在某些实施方案中，抗体将与SEQ ID NO：1的残基1-14、2-14、2-14、3-14、4-14、5-14、6-14、7-14、8-14、9-14、10-14、14-22内，或残基23-34内的表位特异性结合。在某些实施方案中，抗体将与SEQID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22之一上存在的表位结合。在某些实施方案中，抗体将与脂连蛋白结合结构域外的SEQ ID NO：1-12的区域特异性结合。

本发明还提供了与具有SEQ ID NO：23的脂连蛋白受体片段的表位特异性结合的抗体。在某些实施方案中，抗体将与脂连蛋白结合结构域外的SEQ ID NO：23的区域特异性结合，即，抗体将与SEQ ID NO：23的残基1-22内的表位特异性结合。在某些实施方案中，抗体将与SEQ ID NO：23的残基1-14、2-14、2-14、3-14、4-14、5-14、6-14、7-14、8-14、9-14、10-14、14-22内，或23-34残基内的表位特异性结合。在某些实施方案中，抗体将与SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44之一上存在的表位结合。在某些实施方案中，抗体将与脂连蛋白结合结构域外的SEQ ID NO：23-44的区域特异性结合。

V.脂连蛋白受体片段与疾病状态的关联

对于本文描述的某些方法，至少一种可溶性脂连蛋白受体片段的水平在需要诊断或预后信息的不同患者样品中进行测定以提供概况。特定样品的概况基本上是样品的状态的“指纹”。正常状态可以区别于疾病状态，且在疾病状态内，可以确定不同的预后状态(例如，好或差的长期存活期望)。诊断可以通过比较患者样品与已知概况来进行或证实。通过评价在疾病进展期间不同时间的可溶性脂连蛋白受体片段的进展，可以确定疾病状态以及可能的预后。

诊断测试的原则是操作结果与特定临床参数的关联。该关联必然涉及由临床参数区别的2个或更多组之间的比较。临床参数可以是例如疾病的存在或不存在、疾病危险、疾病病期、疾病严重性、疾病类别或对疾病治疗的应答。因此，诊断医生使用这种关联以就临床参数而言定性受试者的状态。即，诊断医生使用关于受试者的操作结果以就临床参数而言分类或诊断受试者状态，诊断/分类的可信度与测试中使用的病征或症状的分类或分离能力相关。

本文描述的用于定性或定量可溶性脂连蛋白受体片段的方法提供了尤其可以与病理状况、疾病素因、治疗监控、危险分层相关的信息。

本发明方法对于诊断状况、评估某些药物是否将具有所需作用和确定预后特别有用。本发明方法可以用于疾病的早期检测以及用于治疗规程的最优化。优选地状况即疾病状态将是与脂连蛋白受体的异常断裂模式相关的状况。

对于本文的用途，“诊断状况”指确定受试者是否具有患指定状况的增加的可能性。用于诊断状况的测试，例如本文描述的测定，在某些情况下可能不能独立地诊断状况，而是与其他测试组合用于诊断状况。因此，“诊断状况”意欲包括同样帮助状况诊断的任何方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于监控患者中疾病状态的进展的方法。该方法一般包括下述步骤：提供来自患者的第一种生物样品，优选地尿、血浆、血清和/或全血样品，测量在第一个时间点上第一种生物样品中的至少一种可溶性脂连蛋白受体片段，提供来自患者的第二种生物样品，测量在第二个时间点上第二种生物样品中的可溶性受体片段，以及基于脂连蛋白受体片段的量中的改变或基于与来自对照群体的测量的比较，确定患者中疾病状态的进展。通过测量患者样品中随着时间过去的可溶性受体片段，临床医生将能够确定疾病状态是恶化还是改善。临床医生因此可以利用这些测量用于适当地修改治疗。包括确定至少一种可溶性C-末端片段的水平的用于监控疾病状态的进展的方法可以与其他测试组合以监控疾病状态的进展。

本发明人已发现具有脂肪细胞失调的受试者在血液中具有与正常受试者不同模式的脂连蛋白受体片段。本发明因此提供了确定受试者是否具有脂肪细胞失调的方法，其通过确定来自受试者的体液样品中至少一种脂连蛋白受体片段的水平来实现。

例如，为了确定受试者是否具有脂肪细胞失调，可以测定本文描述的片段的水平。在某些实施方案中，不存在或存在仅仅非常低水平的某些片段，即长度为25-34个氨基酸(即，SEQ ID NOS：1、2、4-11、23、24和26-33)且一般未结合的片段，将指示具有脂肪细胞失调的可能性增加。相反地，这些片段的正常水平的存在将指示正常的脂肪细胞平衡。在某些实施方案中，某些较小片段，即长度为13-24个氨基酸的未结合的片段(即，SEQ ID NOS：3、12-22、25和34-44)的增加量的存在，将指示具有脂肪细胞失调的可能性增加。相反地，这些片段的正常水平的存在将指示正常的脂肪细胞平衡。脂连蛋白受体片段的增加的总水平的存在，即脂连蛋白受体片段的总浓度将指示具有脂肪细胞失调的各自可能性。

随着脂连蛋白的血液水平降低，具有疾病的患者的百分比增加。在具有小于约4.0μg/mL的脂连蛋白的血液水平的患者中，诊断具有代谢综合征的患者的数目显著增加，并且关于冠状动脉疾病的危险同样增加。例如，与具有超过4.0μg/mL的脂连蛋白的血液水平的受试者比较，具有小于或等于约4.0μg/mL的脂连蛋白的血液水平的受试者具有冠状动脉疾病的机率增加(优势比(odds ratio)对于男性和女性为大于3.0，或在男性中大于1.7和在女性中大于10)。术语脂连蛋白指测量的总脂连蛋白，包括全长、球状和非球状部分的单体以及脂连蛋白的寡聚体。阈值可以对于能够测量个别形式的具体测定进行调整。

通过测量在不同时间点上得自受试者的生物流体样品中这些片段的水平，可以确定脂肪细胞失调是改善还是恶化。类似地，通过测量治疗干预之前和之后这些片段的水平，可以确定治疗是否有效。

脂连蛋白是牵涉于许多疾病状态的脂肪细胞，包括例如肥胖、胰岛素抵抗、II型糖尿病、代谢综合征、血脂异常、心血管疾病和高血压。对于本文的用途，与正常受试者比较，具有低脂连蛋白血症(hypoadiponectinemia)的受试者具有减少的血浆脂连蛋白浓度。具有低脂连蛋白血症的受试者可以使用本发明方法进行鉴定。本发明方法可以用于确定受试者中低脂连蛋白血症的发作、低脂连蛋白血症的进展和/或低脂连蛋白血症的治疗功效。类似地，本发明方法可以用于确定受试者中特征在于低脂连蛋白血症的状况的发作、特征在于低脂连蛋白血症的状况的进展、和/或特征在于低脂连蛋白血症的状况的治疗功效。

例如，为了确定受试者是否具有低脂连蛋白血症，人们可以测定本文描述的片段的水平。在某些实施方案中，不存在或存在增加水平的某些片段，即长度为约13-24个氨基酸的一般未结合的片段(即，SEQ ID NOS：3、12-22、25和/或34-44)，将指示具有低脂连蛋白血症的可能性增加。在某些实施方案中，某些较大片段，即长度为25-34个氨基酸的一般未结合的片段(即，SEQ ID NOS：1、2、4-11、23、24和/或26-33)的减少量的存在，将指示具有低脂连蛋白血症的可能性增加。与载体蛋白质即脂连蛋白未结合或结合的总脂连蛋白受体片段的增加水平的存在，通常将指示具有低脂连蛋白血症的各自可能性。

通过测量在不同时间点上取自受试者的生物流体样品中这些片段的水平，可以确定低脂连蛋白血症是改善还是恶化。类似地，通过测量治疗干预之前和之后这些片段的水平，可以确定治疗是否有效。

当胰岛素引起脂肪细胞生产脂连蛋白时，导致正常胰岛素敏感性。全长脂连蛋白聚集成多聚体，一般称为LMW、MMW和HMW形式。脂连蛋白在肝中与脂连蛋白受体2且在肌肉中与脂连蛋白受体1相互作用，以终止葡萄糖生产且引起糖酵解和脂肪酸氧化。脂连蛋白受体1与称为球状脂连蛋白的脂连蛋白的切割形式反应，而脂连蛋白受体2与全长脂连蛋白反应。球状脂连蛋白最近由其他人显示通过血液弹性蛋白酶作用而形成。

当脂肪细胞变成肥大且响应胰岛素生产较少的脂连蛋白时，胰岛素抵抗发生。在这种状态下，细胞变得更多细胞凋亡，并且细胞分裂减慢。因此血浆脂连蛋白水平下降。胰岛素水平在引起细胞释放更多的脂连蛋白的努力中上升。然而，随着胰岛素抵抗恶化，产生更多的胰岛素和更少的脂连蛋白。更少的脂连蛋白导致肌肉中更少的糖酵解和脂肪酸氧化且阻止肝葡萄糖生产终止。

对于本文的用途，胰岛素抵抗指个体中的体内胰岛素的生物作用的减少，如通过来自血流的葡萄糖处置率评估的(例如，进入胰岛素敏感组织内，例如肌肉、脂肪和肝)。

糖尿病被定义为由于有缺陷的胰岛素分泌和/或作用的慢性高血糖症。该疾病的2个主要分类是涉及通常经由自身免疫过程的胰β细胞破坏的I型，和胰岛素受损的生理学效力即胰岛素抵抗的II型。糖尿病通常首先经由高血糖症的证实进行诊断，其通过使用随机或空腹血糖测定实现，或经由经口葡萄糖耐量测试进行诊断。葡萄糖耐量测试不测量胰岛素抵抗。

一旦糖尿病被诊断，关于胰岛素和C-肽的测定就可以用于区别I型和II型糖尿病，并且在II型糖尿病中，用于区别需要胰岛素治疗的那些与可以用饮食改变和锻炼模式进行处理的那些。区别需要胰岛素治疗的那些与可以用饮食改变和锻炼模式进行处理的可疑病例是困难的。

胰岛素是由胰β细胞释放的多肽激素，以通过促进葡萄糖的细胞摄取和抑制内源性葡萄糖而减少血糖水平。胰岛素的直接前体是胰岛素原(MW，9kDa)，由具有3个二硫键的86个氨基酸组成的单链多肽。蛋白酶剪切产生由下述组成的胰岛素(MW，6kDa)：在2条链中由2个二硫键连接的51个氨基酸；和连接肽(C-肽；MW，3kDa)，包含31个氨基酸的单条多肽链。等摩尔量的胰岛素和C-肽随后被分泌到循环内。由于C-肽长得多的半衰期，循环C-肽浓度为胰岛素的浓度的约5-10倍。C-肽因此是身体的天然胰岛素生产的测量并且可以在静脉内的合成胰岛素的存在下进行测量。

用于测量胰岛素抵抗的黄金标准是葡萄糖钳法(M值)，以测量通过胰岛素输注率(IIR)调整以维持血糖水平的葡萄糖输注率(GIR)。第二种常见测量法是空腹葡萄糖和胰岛素(HOMA-IR)。已报道与脂连蛋白的血液水平关联的M值(如通过葡萄糖钳法测定的，黄金标准)显示脂连蛋白可以是胰岛素抵抗的指示剂。另外的关联是通过脂连蛋白校正的空腹葡萄糖和胰岛素血液水平的测量(FBS×FIRI/AND)(空腹血糖×空腹胰岛素水平/脂连蛋白)。

本发明方法可以用于鉴定具有胰岛素抵抗的受试者。此外，本发明方法可以用于确定糖尿病受试者中胰岛素抵抗的严重性且推荐合适的治疗。

例如，为了确定受试者是否具有胰岛素抵抗，人们可以测定本文描述的片段的水平。在某些实施方案中，不存在或存在减少水平的某些片段，即长度为25-34个氨基酸且一般未结合的片段(即，SEQ IDNOS：1、2、4-11、23、24和/或26-33)，将指示具有胰岛素抵抗的可能性增加。相反地，这些片段的正常水平的存在将指示正常状态。在某些实施方案中，某些较小片段，即长度为13-24个氨基酸的未结合的片段(即，SEQ ID NOS：3、12-22、25和/或34-44)的增加水平的存在，将指示具有胰岛素抵抗的可能性增加。相反地，这些片段的正常水平的存在将指示正常状态。与载体蛋白质即脂连蛋白(结合或未结合)的脂连蛋白受体片段的总浓度中的增加，一般指示具有胰岛素抵抗的可能性增加。

通过测量在不同时间点上取自受试者的生物流体样品中这些片段的水平，可以确定胰岛素抵抗是改善还是恶化。类似地，通过测量治疗干预之前和之后这些片段的水平，可以确定治疗是否有效。

代谢综合征已与减少的血浆脂连蛋白水平相关，并且可以使用本发明的方法进行监控。代谢综合征也称为X综合征是一簇危险因素，其应对超重和肥胖患者以及具有2型糖尿病的患者中过量的心血管疾病发病率负责。

世界卫生组织和国家胆固醇教育计划-成人治疗患者(NationalCholesterol Education Program-Adult Treatment Patent)(NCEP-ATPIII)已阐述了关于代谢综合征的诊断标准。对于在本发明中的用途，代谢综合征由如下提供的WHO诊断标准限定(Darwin Deen，AmericanFamily Physician，69(12)(2004)2875-2882)。

表1

根据WHO关于代谢综合征的诊断标准

 

组分	WHO诊断标准(胰岛素抵抗*加下述中的2个)
		腹部/向心性肥胖	腰臀比：>0.90(男性)，>0.85(女性)或BMI>30kg/m2
高甘油三酯血症	≥150mg/dL(≥1.7mmol/L)
		低HDL胆固醇	对于男性<35mg/dL(<0.9mmol/L)，对于女性<39mg/dL(<1.0mmol/L)
高血压	≥140/90mm Hg或证明使用抗高血压治疗
		高空腹葡萄糖	葡萄糖耐量降低，空腹葡萄糖受损，胰岛素抵抗或糖尿病
微白蛋白尿	尿白蛋白与肌酸酐比：30mg/g或白蛋白排泄率：20mcg/分钟

WHO＝世界卫生组织；ATP＝成人治疗实验组；BMI＝体重指数；HDL＝高密度脂蛋白。

*--胰岛素抵抗通过2型糖尿病或空腹葡萄糖受损鉴定。

本发明人已发现体液中的可溶性脂连蛋白受体片段的水平是受试者中代谢综合征的指示剂。因此，本发明方法可以用于鉴定具有代谢综合征的受试者。这些方法可以与用于鉴定代谢综合征的其他诊断标准中的任何一种组合使用。

例如，为了确定受试者是否具有代谢综合征，人们可以测定本文描述的片段的水平。在某些实施方案中，不存在或存在减少水平的某些片段，即长度为25-34个氨基酸(即，SEQ ID NOS：1、2、4-11、23、24和/或26-33)且一般未结合的片段，将指示具有代谢综合征的可能性增加。相反地，这些片段的正常水平的存在将指示正常状态。在某些实施方案中，某些较小片段，即长度为13-24个氨基酸的片段(即，SEQ ID NOS：3、12-22、25和/或34-44)的增加量的存在，将指示具有代谢综合征的可能性增加。与载体蛋白质即脂连蛋白未结合或结合的脂连蛋白受体片段的总浓度中的增加，一般指示具有代谢综合征的可能性增加。

急性冠状血管综合征(ACS)已应用于起因于对心脏的局部缺血性损伤的一群冠状血管病症。急性冠状血管综合征被定义为通过血管造影照片评估超过60％的血管阻塞，伴随或不伴随心脏状况。

本发明人已发现体液中的可溶性脂连蛋白受体片段的水平是受试者中血管阻塞的指示剂。因此，本发明方法可以用于鉴定具有血管阻塞的受试者。这些方法可以与用于鉴定血管阻塞的其他诊断标准中的任何一种组合使用。

例如，为了确定受试者是否具有血管阻塞，人们可以测定本文描述的片段的水平。在某些实施方案中，不存在或存在减少水平的某些片段，即长度为25-34个氨基酸(即，SEQ ID NOS：1、2、4-11、23、24和/或26-33)且一般未结合的片段，将指示具有血管阻塞的可能性增加。相反地，这些片段的正常水平的存在将指示正常状态。在某些实施方案中，某些较小片段，即长度为13-24个氨基酸的片段(即，SEQ ID NOS：3、12-22、25和/或34-44)的增加量的存在，将指示具有血管阻塞的可能性增加。相反地，这些片段的正常水平的存在将指示正常状态。与载体蛋白质即脂连蛋白未结合或结合的脂连蛋白受体片段的总浓度中的增加，一般指示具有血管阻塞的可能性增加。

心脏状况也称为心血管疾病状况，一般意指起因于心血管机能不全的疾病，包括但不限于，冠心病(其进一步包括心肌梗死和心绞痛)或冠状动脉疾病、中风、先天性心力衰竭和充血性心力衰竭、先天性心力衰竭和高血压。冠心病还包括心肌梗死和心绞痛。心血管疾病一般特征在于对心脏或其他靶器官受损的血液供应。“心力衰竭”指其中心脏不以代谢组织需求所需的速率泵血的心脏功能异常。心力衰竭可以由许多因素引起，包括局部缺血、先天性、风湿性或特发性形式。

冠心病(CHD)由冠状动脉的内壁增厚引起。这种增厚过程称为动脉粥样硬化，使血液可以流经的空间变窄，从而减少且有时完全切断对心脏的氧和营养物供应。动脉粥样硬化通常当人在血液中具有高水平的胆固醇时发生。在血液中循环的胆固醇和脂肪在动脉壁上积累。积累使动脉变窄，且可以减缓或阻塞血流。当血液中的胆固醇水平很高时，它将沉积在动脉壁上的机率极大。这个过程在大多数人中在儿童期和少年时开始，并且随着他们长大而恶化。

充血性心力衰竭或(CHF)是进行性病理状态，其中心脏越来越不能供应足够的心输出量(随着时间过去由心脏泵出的血量)以将含氧血递送给外周组织。随着CHF进展，结构和血流动力学损害发生。尽管这些损害具有多种表现，但一种特征性症状是心室肥大。CHF是许多各种心脏病症的共同最后结果。

心肌梗死通常起因于冠状动脉的动脉粥样硬化，通常伴随叠加的冠状血管血栓形成。它可以分成2个主要类型：透壁性梗死，其中心肌坏死涉及心室壁的全部厚度，和心内膜下(非透壁性)梗死，其中坏死涉及心内膜下、壁内心肌或二者，而不通过心室壁一直延伸至心外膜。心肌梗死已知引起血流动力学效应中的变化以及心脏受损和健康区带结构中的改变。因此，例如，心肌梗死减少心脏的最大心输出量和每博输出量。还与心肌梗死相关的是在间隙中发生的DNA合成的刺激以及未受影响的心脏区域中的胶原形成中的增加。

心绞痛(“绞痛”)是当心脏的某部分未接受到足够血液时发生的胸中的复发性疼痛或不适。它是冠心病(CHD)的常见症状，这在由于动脉粥样硬化将血液带到心脏的血管变得狭窄和阻塞时发生。

本发明包含了所有这些疾病经由本发明方法的诊断和监控。

例如，本发明人已发现体液中的可溶性脂连蛋白受体片段的水平是受试者，特别是已患有动脉硬化的受试者是否可能发展或具有充血性心力衰竭、心肌梗死或局部缺血的指示物。因此，本发明方法可以用于鉴定具有充血性心力衰竭、心肌梗死或局部缺血的受试者。这些方法可以与用于鉴定这些状况的其他诊断标准中的任何一种组合使用。

例如，为了确定受试者是否具有或可能发展充血性心力衰竭、心肌梗死或局部缺血，人们可以测定本文描述的片段的水平。在某些实施方案中，不存在或存在减少水平的某些片段，即长度为25-34个氨基酸(即，SEQ ID NOS：1、2、4-11、23、24和/或26-33)且一般未结合的片段，将指示具有充血性心力衰竭、心肌梗死或局部缺血的可能性增加。相反地，这些片段的正常水平的存在将指示正常状态。在某些实施方案中，某些较小片段，即长度为13-24个氨基酸的未结合的片段(即，SEQ ID NOS：3、12-22、25和/或34-44)的增加量的存在，将指示具有充血性心力衰竭、心肌梗死或局部缺血的可能性增加。相反地，这些片段的正常水平的存在将指示正常状态。与载体蛋白质即脂连蛋白未结合或结合的脂连蛋白受体片段的总浓度中的增加，一般指示具有充血性心力衰竭、心肌梗死或局部缺血的可能性增加。

类似地，本发明方法可以用于鉴定具有高血压、肥胖、脂血症或炎症的受试者。这些方法可以与用于鉴定这些状况的其他诊断标准中的任何一种组合使用。在所有这些状况中，在某些实施方案中，不存在或存在减少水平的某些片段，即长度为25-34个氨基酸(即，SEQ IDNOS：1、2、4-11、23、24和/或26-33)且一般未结合的片段，将指示具有状况的可能性增加。相反地，这些片段的正常水平的存在将指示正常状态。在某些实施方案中，某些较小片段，即长度为13-24个氨基酸的未结合的片段(即，SEQ ID NOS：3、12-22、24和/或34-44)的增加量的存在，将指示具有状况。相反地，这些片段的正常水平的存在将指示正常状态。与载体蛋白质即脂连蛋白未结合或结合的脂连蛋白受体片段的总浓度中的增加，一般指示具有状况的可能性增加。

本发明提供了使用本文所述至少一种片段的特异性测量的诊断、预后和治疗法。该方法包括首先提供脂连蛋白受体片段的测量且随后使测量与疾病状态关联。通过使测量关联，人们能够定性就所研究中的具体临床参数而言的受试者状态。在优选实施方案中，测量通过如上所述的亲和质谱法来进行。

诊断测试正确预测状态的能力通常测量为测定的灵敏性、测定的特异性或受试者工作特性(“ROC”)曲线下面积。灵敏性是由测试预测为阳性的真阳性百分比，而特异性是由测试预测为阴性的真阴性百分比。ROC曲线提供了作为1-特异性函数的测试的灵敏性。ROC曲线下面积越大，测试的预测值越有力。测试效用的其他有用的测量是阳性预测值和阴性预测值。阳性预测值是测试为阳性的实际阳性百分比。阴性预测值是测试为阴性的实际阴性百分比。

本文描述的片段独立地或组合的用于帮助确定疾病状态。在某些实施方案中，首先，所选择的生物标记即特定片段在受试者样品中进行测量，其中使用本文描述的方法，例如捕获在SELDI生物芯片上随后通过质谱法检测。随后，测量与区别一种诊断参数和另一种，例如阳性胰岛素抵抗参数与阴性胰岛素抵抗参数的诊断量或截止进行比较。诊断量表示生物标记的测定量，高于或低于所述量则受试者分类为具有特定疾病。例如，如果与疾病状态中正常的比较，片段上调，那么高于诊断截止的测定量提供疾病的诊断。可替代地，如果生物标记在疾病中下调，那么低于诊断截止的测定量提供疾病的诊断。如本领域众所周知的，通过调整测定中使用的特定诊断截止，取决于诊断医生的优先选择，人们可以增加诊断测定的灵敏性或特异性。

在某些实施方案中，特定片段的仅仅存在或不存在而不定量片段的量是有用的，并且可以与疾病即胰岛素抵抗的大概诊断关联。因此，受试者中这些标记各自检测到的存在或不存在可以指示受试者具有患胰岛素抵抗的较高可能性。

在定性疾病状态的方法的某些实施方案中，该方法进一步包括基于状态管理受试者治疗。此种管理描述了医生或临床医生确定疾病状态后的行为。例如，如果医生进行了疾病的诊断，那么随后将是某一治疗方案。例如，对于许多人，心血管心脏病用生活方式改变和药疗法进行管理。具有严重心血管心脏病的其他人可能需要手术。无论如何，一旦心血管心脏病发展，它就需要终身管理。可替代地，无冠心病状态或其他心血管疾病状态的诊断随后可能无治疗。如果诊断测试给出关于冠心病状态的非结论性结果，那么可能需要进一步的测试。

尽管个别生物标记是有用的诊断标记，但已发现生物标记的组合可以提供比单独的单一标记更大的特定状态的预测值。特别地，样品中多个标记的检测可以增加真阳性和真阴性诊断的百分比，且减少假阳性或假阴性诊断的百分比。因此，在某些实施方案中，本发明方法涉及检测本文描述的多种片段。

因此，在一个方面，本发明提供了用于发现脂连蛋白受体片段的模式的方法，所述模式与目的临床参数关联。

在某些实施方案中，本发明提供了用于测量对治疗的应答的方法，其包括下述步骤：提供第一种生物样品，优选地尿和/或血浆样品，测量在第一个时间点上第一种生物样品中的至少一种可溶性脂连蛋白受体片段的量，提供来自患者的第二种生物样品，测量在第二个时间点上第二种生物样品中的片段，以及基于片段的量中的改变或基于与对照群体的比较，确定患者中的应答。受试者可以是阳性应答者、弱应答者或无应答者。对于本文的用途，阳性应答者是对治疗积极响应的受试者，即经历状况的成功改善的受试者，包括任何客观或主观参数例如消除；减轻；症状的减小或使得状况对于患者更可耐受；减缓退化或衰退速度；使得退化的终点较不虚弱；或改善受试者的身体或精神良好状态。阳性应答者是其中在临床观点下治疗上有利的作用超过生物活性试剂的任何毒性或有害副作用的应答者。无应答者是不响应治疗或不响应至满意水平的受试者。弱应答者是响应治疗但不在阳性应答者水平的受试者。

在某些实施方案中，其中疾病状态是胰岛素抵抗或与胰岛素抵抗相关的另一种状况，如糖尿病或代谢综合征，治疗性处理一般包括施用有效量的一种或多种胰岛素致敏药物的步骤。胰岛素致敏药物是本领域已知的，并且包括例如PPAR激动剂如噻唑烷二酮(也称为TZD)；或PPARγ不全激动剂，也称为选择性PPARγ调节剂(SPPARM′s)、PPARα-γ双重不全激动剂(选择性PPARα-γ双重选择性调节剂)和PPAR全激动剂(pan-agonist)。具有TZD结构的PPARγ激动剂包括吡格列酮、罗格列酮、环格列酮、达格列酮(darglitazone)、恩格列酮、巴格列酮(balaglitazone)、isaglitazone、曲格列酮、萘格列酮(netoglitazone)、MCC-555和BRL-49653。其中某些具有TZD结构的其他PPARγ激动剂包括CLX-0921、5-BTZD、GW-0207、LG-100641、LY-300512、NN-2344、LY 818、GW-677954、GW-7282和T-131。PPARα/γ双重激动剂显示出α和γ激动作用且可以用于治疗2型糖尿病和减少脂质。PPARα/γ激动剂包括KRP-297(MK-0767)、莫格列他(muraglitazar)(BMS-298585)、法格列酮(farglitazar)、罗格里扎(ragaglitazar)、替赛格列他(tesaglitazar)(AZ-242)、JT-501、GW-2570、GI-262579、CLX-0940、GW-1536、GW1929、GW 2433、L-796449、LR-90、SB-219994、LY-578、LY-4655608、LSN-862、LY-510929和LY-929。

本文描述的方法可以用于确定患者是否可能是用任何药物的治疗的应答者，所述任何药物用于治疗2型糖尿病或胰岛素抵抗，包括例如双胍(例如，二甲双胍)；磺酰脲；除磺酰脲外的另一个化学药品种类的胰岛素促分泌素，例如氯茴苯酸；胰岛素(其可以配制用于皮下或肌内注射、或用于避免注射需要的制剂中，例如经口、口腔含化或经鼻)；DP-IV抑制剂；PTP-1B抑制剂；GLP-1类似物；糖原磷酸化酶抑制剂；胰高血糖素受体拮抗剂；羟基固醇脱氢酶(HSD-1)抑制剂；葡糖激酶活化剂；或TZD或非TZD PPARγ激动剂；或其任何治疗组合。

本文描述的方法可以用于确定患者是否可能是用任何药物的治疗的应答者，所述任何药物用于治疗还具有2型糖尿病或胰岛素抵抗的肥胖患者中的肥胖，包括例如ibutramine、奥利司他、苯丁胺、Mc4rI激动剂、大麻素受体1(CB-1)拮抗剂/逆激动剂、33肾上腺素能受体激动剂；或TZD或非TZD PPARγ激动剂；或其任何治疗组合。

本文描述的方法可以用于确定患者是否可能是用任何药物的治疗的应答者，所述任何药物用于减少总胆固醇或LDL-胆固醇和/或增加HDL-胆固醇，包括例如HMG-CoA还原酶抑制剂(洛伐他汀、辛伐他汀、罗伐他汀(rosuvastatin)、普伐他汀、氟伐他汀、阿伐他汀、rivastatin、匹伐他汀(pitavastatin)、ZD-4522及其他stating；尼克酸；胆固醇吸收抑制剂(依泽替米贝(ezetimibe))；CETP抑制剂(托彻普(torcetrapib))；PPARα激动剂(非诺贝特、吉非贝齐、氯贝丁酯、或苯扎贝特)；ACAT抑制剂(阿伐麦布(avasimibe))；抗氧化剂(丙丁酚)；或胆汁酸多价螯合剂(消胆胺)，或TZD或非TZD PPARγ激动剂；或其任何治疗组合。

在某些实施方案中，脂连蛋白受体片段的水平在治疗开始前和随后治疗已进行后进行测定，所述治疗的时间长度足够片段的水平或模式中的变化反映患者是否将响应治疗。治疗已进行后，可能是治疗的应答者的患者将具有增加水平的某些片段，即长度为25-34个氨基酸(即，SEQ ID NOS：1、2、4-11、23、24和/或26-33)且一般未结合的片段，和减少量的某些较小片段，即长度为13-24个氨基酸的片段(即，SEQ ID NOS：3、12-22、24和/或34-44)。

在某些实施方案中，差异将在治疗开始后4周内观察到，优选地在治疗开始后2周内，且最优选地在治疗开始后1周内。

VI.另外的生物标记

在某些实施方案中，与得自单独的脂连蛋白受体片段的测量的那种相比较，将一种或多种另外的标记的评估组合以增加分析的预测值。例如，关于疾病状态的一种或多种标记可以连同脂连蛋白受体片段一起测量以增强所述方法的预测值，所述疾病状态即脂肪细胞失调、胰岛素抵抗、糖尿病、代谢综合征、急性冠状血管综合征(即，血管阻塞)、心血管心脏病、中风、先天性心力衰竭、充血性心力衰竭、高血压、绞痛、心肌梗死、局部缺血、动脉粥样硬化、肥胖、脂血症或炎症。可以与本发明方法组合使用的生物标记包括例如脂肪细胞因子，例如脂连蛋白、瘦蛋白、内脏脂肪素(visfatin)、klotho、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、DDPIV、抵抗素、生长素释放肽、AMP-激活性蛋白激酶(AMPK)、Sirt1、PPAR激动剂、ARNT(芳香烃受体核易位体)、HIF1B、C-肽、Foxa2、胰岛素或葡萄糖，包括其片段、肽和变体，和/或炎症标记，例如RBF-4、C-反应蛋白(CRP)、抵抗素、MCP-1、IL-6、TNF-α、IL-1β、PAI-1、尿抑胰酶素、自身免疫因子、针对谷氨酸的自身抗体、胰岛细胞自身抗体、胰岛素自身抗体、针对IL-2的自身抗体、针对IA-2的自身抗体、肠降血糖素、以及其他自身免疫因子及其片段、肽或变体。

本文描述的方法可以与任何其他测试组合使用，所述任何其他测试将帮助疾病的诊断、疾病进展的确定、或疾病的治疗功效的确定。

在某些实施方案中，脂连蛋白水平还将在受试者中进行测量。测量脂连蛋白和使脂连蛋白水平与疾病状态关联的方法是本领域已知的，参见例如，美国专利号6,461,821，美国公开号US 20050054005和US 20050048565，以及国际公开号WO2004086040、WO2005046734、WO2005038457和WO2004022596，所述专利各自整体且为了所有目的引入本文作为参考。对于本文的用途，术语脂连蛋白包括其具有脂连蛋白活性的变体。在某些实施方案中，总脂连蛋白的量、低分子量的量、高分子量脂连蛋白的量或这些数目之间的比将与本发明的方法组合使用。因此，本发明方法可以包括下述步骤：测量来自受试者的生物样品中的脂连蛋白(总脂连蛋白、高分子量脂连蛋白、低分子量脂连蛋白、或其他形式的脂连蛋白，包括其片段和变体)的水平，并且使量与疾病状态的存在、与疾病的进展、或治疗的功效关联。减少量的脂连蛋白指示疾病以及高分子量脂连蛋白与总或低分子量脂连蛋白的较小比。

在某些实施方案中，瘦蛋白水平将在受试者中进行测量。测量瘦蛋白包括其变体和使瘦蛋白水平与疾病状态关联的方法是本领域已知的。(参见例如，Gorden和Gavrilova，Current Opinon in Pharmacology，(2003)3：655-659，所述参考文献整体且为了所有目的引入本文作为参考)。

在某些实施方案中，可以测量脑钠肽(BNP)水平以帮助血管阻塞和心血管疾病的诊断或进展。测量BNP水平和使它们与疾病状态关联的方法是本领域已知的。参见，例如，Frank Peacock，Cleveland ClinicJournal of Medicine(2002)，69(3)243-251，所述参考文献整体且为了所有目的引入本文作为参考。

本发明方法可以用于鉴定具有炎症和特征在于过量炎症的某些疾病的受试者。这些方法可以与确定受试者中的炎症水平的已知方法组合使用。

在某些实施方案中，尿抑胰酶素和/或乌司他丁(uristatin)水平将在受试者中进行测量。尿抑胰酶素表示间-α-胰蛋白酶抑制剂蛋白质的抑制性轻链。它是蛋白酶抑制剂，已知在具有炎性疾病的患者的尿中升高且被视为急性期蛋白质。对于本文的用途，术语尿抑胰酶素包括其具有尿抑胰酶素活性的变体。乌司他丁是存在于尿中的胰蛋白酶抑制剂，其在具有细菌或病毒感染的大多数患者以及具有炎性病症的许多患者中增加。测量尿抑胰酶素或乌司他丁包括其变体，和使尿抑胰酶素或乌司他丁水平与疾病状态关联的方法是本领域已知的。乌司他丁是存在于尿中的胰蛋白酶抑制剂，其在具有细菌或病毒感染的大多数患者以及具有炎性病症的许多患者中增加。(Pugia和Lott，Clin.Chem Lab Med 2005 43(1)：1-16，国际公开号WO200504022，所述参考文献各自整体且为了所有目的引入本文作为参考)。

在某些实施方案中，C反应蛋白水平将在受试者中进行测量。测量C反应蛋白包括其变体，和使C反应蛋白水平与疾病状态关联的方法是本领域已知的。例如C反应蛋白在急性炎症或感染的发作期间存在于血清中。约1mg/dL的CRP水平对于CRP通常视为是高的，并且大多数感染和炎症导致超过10mg/dL的CRP水平。对于本文的用途，术语C反应蛋白包括其具有C反应蛋白活性的变体。(Pugia和Lott，Clin.Chem Lab Med 2005 43(1)：1-16，所述参考文献整体且为了所有目的引入本文作为参考)。

在某些实施方案中，白细胞计数可以与本文描述的方法组合进行。测量白细胞和使白细胞水平与疾病状态关联的方法是本领域已知的。白细胞(WBC)计数，或血液中的白细胞的测量是可靠和广泛使用的标记，其反映遍及身体的炎症。WBC计数还与其他慢性状况关联，包括心血管疾病、高血压和糖尿病。

在某些实施方案中，空腹葡萄糖、葡萄糖耐量测量和/或胰岛素和胰高血糖素刺激的C-肽水平将在受试者中进行测量。测量胰岛素和C-肽包括其变体，和使胰岛素和C-肽水平与疾病状态关联的方法是本领域已知的。例如，超过约1.8ng/mL的胰高血糖素刺激的C-肽水平已报道鉴定可以无需胰岛素治疗进行管理的2型糖尿病患者。一般地，3.0ng/mL用作指示高胰岛素血症或胰岛素抵抗的上限。相比之下，小于约0.5ng/mL的水平据报道鉴定由于血内胰岛素不足需要胰岛素治疗的1型患者。关于正常成人的正常参考范围为0.5-2ng/mL。

在其中一种或多种标记与脂连蛋白受体片段组合使用以增加分析的预测值的实施方案中，另外的标记的水平可以在来自受试者的相同生物样品或可以是相同类型或不同类型的另一种生物样品中进行测量。例如，脂连蛋白受体片段的水平可以在血浆样品中进行测量，而另外的标记的水平可以在血浆的相同样品、血浆的不同样品、或来自受试者的血清或尿样品中进行测量。

VII.另外的疾病状态

脂连蛋白涉及身体内的许多过程和途径。因此，脂连蛋白受体片段的断裂模式的检测可以用于确定许多疾病状态的发作、监控其进展和/或确定其药物治疗的功效。特别地，可溶性脂连蛋白受体片段的检测可以与其他诊断方法和工具组合使用，用于确定许多疾病状态的发作、监控其进展和/或确定其药物治疗的功效。特别地，可溶性脂连蛋白受体片段的检测可与血管生成、致动脉粥样化和细胞的巨噬细胞转化相关。脂连蛋白受体1通过与由脂肪酸激活的LXR核受体结合得到上调，且LXR受体对于巨噬细胞转化是必需的。脂连蛋白受体1表达也已显示在单核细胞转化期间增加。

因此，引起身体组织的炎症且随后产生急性或慢性炎症状况的炎性疾病，即由免疫系统或组织的细胞或非细胞介质触发的疾病，可以使用本发明方法进行检测和监控。此种疾病的例子包括例如I-IV型超敏反应，例如肺的超敏反应疾病包括哮喘，特应性疾病，变应性(allegic)鼻炎或结膜炎，眼睑的血管性水肿，遗传性血管性水肿(agioedema)，抗受体超敏反应和自身免疫疾病，Hashimoto氏甲状腺炎，全身性红斑狼疮，Goodpasture氏综合征，天疱疮，重症肌无力，Grave氏和Raynaud氏疾病，类风湿性关节炎，牛皮癣，Crohn氏病，硬皮病，混合型结缔组织病，多肌炎，肉样瘤病，尿道感染，IgA肾病，肾小球肾炎，急性或慢性宿主移植物反应。

癌症也可以使用本发明方法进行检测和监控。癌症指许多疾病中的任何一种，所述疾病的特征在于不受控制的、异常的细胞增殖，受影响的细胞局部或通过血流和淋巴系统扩散至身体的其他部分(即转移)的能力，以及许多特征性结构和/或分子特征中的任何一种。术语癌症包括但不限于，女性生殖器官癌症，包括但不限于，卵巢癌、子宫颈癌和子宫癌；肺癌；乳腺癌；肾细胞癌；何杰金氏淋巴瘤；非何杰金氏淋巴瘤；生殖泌尿系统癌症包括但不限于，肾癌，前列腺癌，膀胱癌和尿道癌；头和颈癌；肝癌；胃肠系统癌症包括但不限于，胃癌，食管癌，小肠癌或结肠癌；胆分支癌症；胰癌；男性生殖系统癌症包括但不限于，睾丸癌；妊娠性滋养层细胞病；内分泌系统癌症包括但不限于，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，类癌瘤，胰岛素瘤和PNET肿瘤；肉瘤，包括但不限于，Ewing氏肉瘤，骨肉瘤，脂肪肉瘤，平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤；间皮瘤；皮肤癌症；黑素瘤；中枢神经系统癌症；儿科癌症；和造血系统癌症包括但不限于，所有形式的白血病，骨髓异常增生综合征、骨髓增生病和多发性骨髓瘤。

VIII.试剂盒

对于在上文描述或建议的应用中的用途，本发明还提供了试剂盒。此种试剂盒可以例如包含区室化的载体装置，以接受在紧密限制中的一种或多种容器装置，如条、盒、微观流体芯片、小瓶、管等，容器装置各自包含在方法中使用的分开元件之一。例如，容器装置之一可以包含是或可以可检测地标记的探针。此种探针可以是对可溶性C-末端受体片段特异的抗体或多核苷酸。

此外，试剂盒可以包括说明材料，所述说明材料包含用于实践本发明的方法的指导(即，规程)。尽管说明材料一般包含书面或印刷材料，但它们并不限于此种。本发明预期了能够存储此种说明书且将它们传达给最终用户的任何介质。此种介质包括但不限于，电子储存介质(例如，磁盘、磁带、盒式存储器、芯片等)、光学介质(例如，CD ROM)等。此种介质可以包括提供此种说明材料的因特网站点的地址。

试剂盒还可以包含例如用于从个体获得生物样品的装置。用于从个体获得生物样品的装置是本领域众所周知的，例如导管、注射器等，并且在本文中不详细讨论。

用于执行本发明的具体方面的下述示例性实施方案仅为了举例说明性目的而提供，并且不意欲以任何方式限制本发明的范围。

实施例

实施例1-糖尿病个体中C-末端片段的检测

116个患者通过医疗史进行评估。50个没有糖尿病史，或根据WHO定义代谢危险因素(脂质、高血压、肥胖)未诊断为代谢综合征。69个具有1型或2型糖尿病史。胰岛素抵抗在所有患者中通过葡萄糖测量、c-肽和血红蛋白A1c进一步进行评估。

脂连蛋白、c-肽、胰岛素和HMW脂连蛋白使用商业ELISA试剂盒进行测量。HbA1c通过DCA 2000+仪器(Bayer)和葡萄糖通过YSI进行测量。下述AdipoR1 ELISA测定用于测量无论是结合还是未结合的所有C-末端片段。

关于C-末端片段AdipoR1的ELISA测定的材料包括微量滴定板(Costar PN 3690，高结合)，Tris缓冲盐水(TBS)(Pierce产品号28376)，脂连蛋白受体1(AdipoR1)肽(肽16-34)(PhoenixPharmaceuticals，Inc.，产品号001-44)，溶于TBS的Super Block(Pierce产品号37535)，TBS/TW-包含0.05％ Tween 20的Tris缓冲盐水(Tween20-Pierce产品号-P8341)，兔抗AdipoR1抗体(PhoenixPharmaceuticals，Inc.，产品号G-001-44)，ALP-山羊抗兔IgG(Sigma产品号A 3687)，1-Step PNPP(Pierce产品号37621)和2N NaOH。

试剂如下进行制备。如所示的AdipoR1肽(PhoenixPharmaceuticals，Inc.，产品号001-44)的贮存液通过将100ug肽溶解于包含0.1％ TFA的100uL 60％乙腈中进行制备。用nanopure水将这种1.0mg/mL溶液进一步稀释到10mL，从而得到10ug/mL贮存液。将这种溶液进行等分试样，500uL/小瓶于-70℃进行冷冻贮存。溶于TBS的0.10ug/mL AdipoR1肽用于包被板且通过下述进行制备：将溶于TBS(上文A)的100uL 10ug/mL AdipoR1肽加入9900uL TBS中，且充分混合。如所示的兔抗AdipoR1(Phoenix Pharmaceuticals，Inc.，产品号G-001-44)的贮存液通过将200uG抗体溶解于200uL nanopure水中进行制备。这产生1.0mg/mL抗体溶液。等分试样成50uL等分试样且于-70℃冷冻贮存。溶于Super Blocker的6.0ug/mL兔抗AdipoR1溶液通过下述进行制备：将18.0uL原液抗AdipoR1加入2982uL Super Blocker中，且充分混合。溶于Super Blocker(用于5倍稀释血浆样品；对于其他稀度改变浓度)的3.75ug/mL兔抗AdipoR1溶液通过下述进行制备：将56.25uL原液抗AdipoR1(C)加入15,000uL Super Blocker中，且充分混合。ALP-山羊抗兔IgG的1/2000稀释物通过下述进行制备：将7.5uL ALP-山羊抗兔IgG(Sigma，产品号A3687)加入15.0mLSuperblocker内，且充分混合。

校准器(calibrator)的制备使用溶于包含3.0ug/mL兔抗AdipoR1的superblocker中的AdipoR1肽来进行，以达到5.0、2.5、1.25、6.25、0.312、0.156、0.078和0ug/mL的AdipoR1肽浓度。

用于AdipoR1 ELISA测定的方法通过下述来完成：用50uL/孔溶于TBS的0.10ug/mL AdipoR1肽包被微量滴定板，且贮存于4℃最低限度72小时，从冰箱中取出包被的微量滴定板，并且倒空板且用200uL/孔TBS洗涤3次。这随后为向每个孔中加入150uL Super Block缓冲液(Pierce PN 37535)且使板于25℃振荡30分钟。将板倒空且用TBS/TW洗涤5次。这随后为添加包含5000、2500、1250、625、312、156、78和0ng/mL AdipoR1肽的制备的校准器或用阻断剂缓冲液5倍稀释的样品。所有样品和校准器均包含3.0ug/mL兔抗AdipoR1。样品或校准器以50uL/孔添加且在冰箱中于5℃温育过夜。这随后为将板倒空且用TBS/TW洗涤5次。

在ELISA Template中向所有孔中以50uL/孔添加溶于Super Blocker的1/2000稀度的ALP-山羊抗兔IgG。这于25℃在Jitterbug Shaker上以振荡器设定#2温育2小时。将板倒空且用TBS/TW洗涤5次。向每个孔中加入50uL 1-Step PNPP(Pierce PN 37621)。板于25℃在JitterbugShaker上温育30分钟。向每个孔中加入25uL 2N NaOH以终止酶反应。在405nm处读数之前允许板静置至少5分钟。进行校准器数据与标准曲线的拟合和未知量的计算(单相指数式衰减通常给出最佳拟合)以计算样品中的值。

脂连蛋白伴随2型糖尿病减少。脂连蛋白伴随1型糖尿病不改变。与2型相比较，脂连蛋白在正常对照和1型患者中更高(参见表2)。脂连蛋白伴随HbA1c减少且随后增加。所有差异是小的且在低于1.4的T值不是非常显著(概率<80％显著性)。脂连蛋白差异不是BMI(体重指数)的预示。

HMW/脂连蛋白总数比的使用改善在群体中的差异且维持用脂连蛋白可见的相同趋势。该比伴随疾病增加。HMW/总脂连蛋白伴随高HbA1c减少(参见表3)。再次，1型诊断与较高HMW/总脂连蛋白的关联比2型诊断更低。然而，1型糖尿病诊断产生比正常对照更高的比。

可溶性C末端AdipoR1的总水平伴随糖尿病病理学(例如，2型糖尿病或胰岛素抵抗)增加。这些差异比对于脂连蛋白或HMW比的差异显著得多(T值>3.8，概率>99.9％显著性)(参见表4)。令人惊讶的是，AdipoR1伴随1型糖尿病增加，从而指出受体也与1型关联。这些患者还将预期患有脂肪细胞失调，但也具有β细胞丧失。AdipoR1伴随更高的HbA1c比脂连蛋白增加更多。总之，AdipoR1比脂连蛋白和HMW比更灵敏。AdipoR1和脂连蛋白在数学关系中的组合在预测糖尿病病理学方面比单独的脂连蛋白更佳。AdipoR1和c-肽在数学关联中的组合在预测糖尿病病理学方面也比单独的c-肽更佳。

表2.脂连蛋白

 

	总计数	脂连蛋白(ug/mL)血浆
							平均值	SD	T-值
通过医疗史正常	50	7.8	4.7
					HbA1c<7(仅糖尿病)	40	8.2	10.0	-0.1
HbA1c 7-10(仅糖尿病)	26	6.8	5.2	0.9
					HbA1c>10(仅糖尿病)	3	8.4	1.4	-0.1
通过诊断1型	13	10.0	7.1	-1.3
					通过诊断2型	56	7.1	8.3	0.6

表3.HMW/脂连蛋白

 

	总计数	HMW/总脂连蛋白(ug/ug)
							平均值	SD	T-值
通过医疗史正常	50	0.390	0.266
					HbA1c<7(仅糖尿病)	40	0.926	2.553	-1.3
HbA1c 7-10(仅糖尿病)	26	0.551	0.342	-1.8
					HbA1c>10(仅糖尿病)	3	0.607	0.281	-1.2
通过诊断1型	13	0.529	0.277	-1.7
					通过诊断2型	56	0.830	2.137	-1.4

表4.可溶性AdipoR1

 

	总计数	sADIPOR1(相对单位)
							平均值	SD	T-值
通过医疗史正常	50	16.2	4.3
					HbA1c<7(仅糖尿病)	40	22.4	6.0	-5.0
HbA1c 7-10(仅糖尿病)	26	20.6	5.1	-3.5
					HbA1c>10(仅糖尿病)	3	28.1	6.0	-4.3
通过诊断1型	13	23.7	5.5	-5.3
					通过诊断2型	56	21.3	5.7	-5.2

实施例2-在具有代谢综合征以及其他心血管和冠状血管疾病的个体中C-末端片段的检测

另一组188个患者通过各种诊断测试和血管造影照片就心血管状况和危险进行充分表征。无代谢综合征、糖尿病、急性冠状血管综合征(ACS)、AMI或CHF的那些视为正常(n＝113)。来自188个的组的患者置于关于代谢综合征、炎症标记、ACS、AMI和CHF、高血压、肥胖、脂血症、炎性应答和抗炎应答的受影响组内。急性冠状血管综合征被定义为通过血管造影照片评估阻塞>60％，伴随或不伴随急性心脏状况。代谢综合征通过胰岛素抵抗或通过WHO定义超过2种代谢危险因素进行限定。胰岛素抵抗通过诊断和糖尿病药疗法进行评估。代谢危险因素包括高血压、脂血症和肥胖。肥胖通过体重指数(BMI)进行评估。高血压通过血压或药疗法进行评估。脂血症通过脂质比或脂质降低药疗法进行评估。炎症通过白细胞计数或CRP进行评估。抗炎状态通过关于血液和尿中的尿胰蛋白酶抑制剂的免疫测定(尿抑胰酶素和乌司他丁免疫测定测量)进行评估。所有患者通过医疗史和药疗法进行另外评估且因而表征到受影响组内。

脂连蛋白和HMW脂连蛋白使用商业ELISA试剂盒进行测量。心脏标记使用Centaur仪器(Bayer)进行测量。实施例1中描述的AdipoR1ELISA测定用于测量无论是结合还是未结合的所有C-末端片段。

脂连蛋白伴随ASC和代谢综合征减少，但值的显著性小于对于99.9％可靠(certain)预期的(参见表5)。脂连蛋白伴随CHF和MI增加，这将干扰评估。脂连蛋白与炎症状态并不非常相关。

血清中的可溶性AdipoR1的总水平伴随ASC和代谢综合征增加，且值的显著性高度显著(99.9％可靠)且比对于脂连蛋白观察到的那种显著得多(参见表6)。令人惊讶的是，随着状况变得更急性并且随着炎性和抗炎应答增加，AdipoR1增加。AdipoR1进一步预示代谢综合征。可溶性AdipoR1也在尿和血浆中发现与代谢综合征关联。

表5.脂连蛋白

 

	总计数	脂连蛋白(ug/mL)血浆平均值	SD	T-值(2)
					正常	113	10.3	7.0
ACS或代谢综合征	24	5.7	2.7	3.2
					代谢综合征	29	6.1	3.5	3.2
ACS以及无AMI或CHF	36	7.1	6.7	2.5
					通过诊断或TnI的MI	8	15.9	12.6	2.1
通过诊断或BNP的CHF	9	22.2	15.2	4.4
					通过血管造影照片0-30％阻塞(1)	32	7.8	8.0	1.7
通过血管造影照片30-60％阻塞(1)	15	9.6	8.2	0.4
					通过血管造影照片60-100％阻塞(1)	40	7.6	7.8	2.1
高血压	52	9.0	7.9	1.1
					肥胖	60	7.1	6.0	3.1
脂血症	17	5.5	2.5	2.8
					炎性应答	31	7.7	7.3	1.8
抗炎应答	33	8.7	8.2	1.2

(1)包括具有AMI和CHF的患者

(2)显著性为99.9％ prob或0.01双尾，当T值>3.8时

表6.可溶性AdipoR1

 

	总计数	脂连蛋白(ug/mL)血浆	SD	T-值(2)
					正常	113	16.5	4.0
ACS或代谢综合征	24	24.6	5.4	8.3
					代谢综合征	29	29.9	10.0	11.2
ACS以及无AMI或CHF	36	24.1	5.3	9.0
					通过诊断或TnI的MI	8	30.5	8.1	8.7
通过诊断或BNP的CHF	9	22.0	4.2	3.9
					通过血管造影照片0-30％阻塞(1)	32	20.8	3.7	5.3
通过血管造影照片30-60％阻塞(1)	15	27.4	5.4	9.4
					通过血管造影照片60-100％阻塞(1)	40	29.3	8.9	12.1
高血压	52	23.3	5.6	8.8
					肥胖	60	23.3	6.8	8.3
脂血症	17	25.5	8.2	7.2
					炎性应答	31	23.4	8.9	6.2
抗炎应答	33	22.0	4.8	6.5
					正常	113	16.5	4.0

包括AMI和CHF>2.4为约99％ prob或0.01双尾，>3.8为约99.9％ prob或0.001双尾

实施例3-阐述生物化学途径

当胰岛素引起脂肪细胞生产脂连蛋白时，导致正常胰岛素敏感性。全长脂连蛋白聚集成多聚体，一般称为LMW、MMW和HMW形式。脂连蛋白在肝中与脂连蛋白受体2且在肌肉中与脂连蛋白受体1相互作用，以终止葡萄糖生产且引起糖酵解和脂肪酸氧化。脂连蛋白受体1与称为球状脂连蛋白的脂连蛋白的切割形式反应，而脂连蛋白受体2与全长脂连蛋白反应。球状脂连蛋白最近由其他人显示通过血液弹性蛋白酶作用而形成。

当脂肪细胞变成肥大且响应胰岛素生产较少的脂连蛋白时，胰岛素抵抗发生。在这种状态下，细胞变得更多细胞凋亡，并且细胞分裂减慢。因此血浆脂连蛋白水平下降。胰岛素水平在引起细胞释放更多的脂连蛋白的努力中上升。然而，随着胰岛素抵抗恶化，产生更多的胰岛素和更少的脂连蛋白。更少的脂连蛋白导致肌肉中更少的糖酵解和脂肪酸氧化且阻止肝葡萄糖生产终止。

证实炎症弹性蛋白酶和白细胞在糖尿病患者中明显升高。文献综述承认人造胰岛素和天然胰岛素在糖尿病中增加白细胞。随着弹性蛋白酶在炎症中增加，产生更高百分比的球状脂连蛋白。多聚体的缺乏造成对肝更少的作用。证实抗炎蛋白酶抑制剂(Uri和Bik)在糖尿病中明显升高。这些抑制剂由弹性蛋白酶形成，并且最近在我们的细胞模型中显示在正常细胞系中诱导肥大性细胞凋亡。

弹性蛋白酶暴露后的受体片段被提议为用于在患者样品中形成可溶性片段的机制。这使用亲和质谱法进行测试，其中使用针对AdipoR1C末端的多克隆抗体和患者样品。

AdipoR1通过质谱证实在血液中具有34、28-29、19-18、15-13、9.5-9.0、7.9、6.6、6.5、5.2、4.0-3.8和1-2kDa的质量。这个数据证实1)AdipoR1片段在患者和对照中发现，2)AdipoR1片段形成二聚体(dimmers)，和3)AdipoR1片段与脂连蛋白结合。最后一点通过用针对脂连蛋白的多克隆抗体重复亲和质谱法得到证明。

在胰岛素抵抗期间多聚体脂连蛋白的缺乏进一步提议为患者和正常之间的断裂模式中的差异的可能原因。事实上3.9和7.8质量形式的消失在糖尿病中发生，但在所有正常中都存在。在下文数据中，所有5个患者都缺乏这些质量，并且所有5个正常都具有3901和7814Da质量(参见图解数据)。因此，不同的质量被认为是由于蛋白酶剪切位点的暴露，当存在用于结合的多聚体的可用性时。

实施例4-单克隆抗体的制备

BALB/c小鼠用100μg/小鼠的合成AdipoR1肽免疫原组合物进行免疫。1个月后，从每只小鼠获得眼睛放血，并且通过ELISA针对免疫原进行滴定以评估免疫应答。显示出最佳应答的小鼠通过用免疫原100μg/小鼠的注射进行加强。4天后，处死小鼠并且根据Kohler和Milstein，Nature 256：495(1975)的方法将其脾用于融合。使用PEG(聚乙二醇)溶液将脾细胞与SP2-0 Ag 14骨髓瘤细胞融合，其中脾细胞与骨髓瘤细胞的比为5:1，并且使用50％ PEG/HAT生长培养基铺平板到96孔板内。于37℃温育7-10天后，通过每3-4天补料就生长监控融合培养物，其中利用HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷)选择法，随后与HAT生长培养基一起传代培养。

2-3周后，具有杂交瘤集落生长的孔通过ELISA进行测试，以确定哪些生长物产生针对肽的抗体免疫应答。96孔板培养物用乌司他丁肽以1ug/mL包被的板进行测试。于2-8℃过夜包被板后，所有板均进行洗涤和封闭。随后在室温下应用100μl/孔细胞培养物上清液1小时。洗涤板后，以100uL/孔应用1:2000稀度的山羊抗小鼠IgG辣根过氧化物酶1小时。板再洗涤一次，随后为OPD(邻苯二胺二盐酸化物)底物且在Spectra Max板阅读器上在490nm处读数。

将产生阳性应答的集落转移至24孔板用于进一步扩增，且再次测试以证实阳性结果。测试阳性的集落在6孔板中在含有10％胎牛血清(FBS)的Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基(Iscove′s ModifiedDulbecco′s Medium)(IMDM)中进一步扩增。扩增后，将集落冷冻于-70℃且随后转移至液氮用于长期贮存。基于使用纯化的肽的ELISA结果，各种克隆在IMDM、10％ FBS中进一步扩增且进行冷冻。

实施例5-用SELDI表征单克隆抗体

测量患者样品中的特异性adipoR1片段的方法使用单克隆抗体来进行，并且兔多克隆抗体用可溶性AdipoR标准和患者的血浆在芯片表面上进行测试。结合通过表面增强激光解吸/电离(SELDI)分析在SELDI PBS II飞行时间质谱仪(Ciphergen，Fremont，California)上进行评估，以测定关于与抗体结合的蛋白质的质荷比(m/z)。来自患者的10个血浆样品进一步进行测试：5个患者对于糖尿病是阳性的；5个患者对于糖尿病是阴性的。结合在2种类型的表面(PS20和RS100)上使用标准温育程序进行测量。关于每种质量测量的信号与背景噪声进行比较，以获得信噪比(S/N)。只接受具有超过10的S/N比的质量。

SELDI程序如下：将3微升50mmol/L NaHCO₃(pH 8.0)加入蛋白质芯片上的每个斑点，且用板(即，生物处理器)进行覆盖以形成样品孔，随后向每个斑点中添加1μL抗体(1mg/mL)且伴随振荡在湿度受控室中在室温下温育2小时。来自每个斑点的溶液在那时用5μL洗涤缓冲液(磷酸缓冲盐水(PBS)+0.5％ Triton去污剂)洗涤2次。未结合的位点用5μL 2mg/mL BSA(牛血清清蛋白)或1mol/L乙醇胺进行封闭。在室温下温育后，弃去BSA或乙醇胺，并且斑点用5μL洗涤缓冲液(PBS+0.5％ Triton)洗涤2次。向每个斑点中加入5μL PBS且将芯片置于生物处理器内。向每个孔中加入另外10μL PBS以及10μL待测试的样品(或PBS作为对照)，随后使密封的孔于4℃振荡18小时。孔随后用洗涤缓冲液和PBS进行洗涤，且再次在室温下振荡2分钟。孔用300μL由芥子酸饱和的去离子水漂洗2次；这在与抗体结合的蛋白质的质子化期间充当能量吸收分子。后者与芯片表面附着。包含抗体结合的样品的芯片就结合质量进行分析，其中根据制造商的说明书使用SELDI质谱仪。

实施例6-糖尿病患者中的可溶性C-末端片段

表6显示关于5个正常患者7812的脂连蛋白受体片段质量的检测和不含相同质量的5个糖尿病患者的多重测定的结果。对于3901的质量发现类似的分离。这2种质量存在于正常受试者中，但在具有本文提供的疾病条件的受试者中不存在或以极低水平即减少的水平存在。

表6.在7812和3901道尔顿处的SELDI结果

 

患者状况	患者数目	具有在3901处的质量的患者数目	具有在7812处的质量的患者数目
				糖尿病	5	0	0
非糖尿病	5	5	5

表7显示关于5个正常和糖尿病患者具有4.5-6.9、7-8.2、9-11、13-15、17-19、27-29或30-34的质量的脂连蛋白受体片段的检测和不含相同质量的5个糖尿病患者的多重测定结果。

表7.在4.5-6.9、7-8.2、9-11、13-15、17-19、27-29或30-34KDa道尔顿处的SELDI结果

 

患者状况	患者数目	具有4.5-6.9、7-8.2、9-11、13-15、17-19、27-29或30-34KDa的患者数目	在4.5-6.9、7-8.2、9-11、13-15、17-19、27-29或30-34KDa的量中具有增加的患者数目
				糖尿病	5	5	5
非糖尿病	5	5	5

实施例7-丝氨酸蛋白酶

胰蛋白酶家族丝氨酸蛋白酶在炎症期间增加，并且包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、激肽释放酶、纤溶酶、补体D、凝血酶以及因子IXa、Xa、XIa和XIIa。全部具有切割Arg-Xaa或Lys-Xaa的类胰蛋白酶基本亲和力。由免疫细胞释放的另外的胰蛋白酶(rrypsin)家族丝氨酸蛋白酶包括弹性蛋白酶、粒酶(A、B、H、M)、类胰蛋白酶2和肥大细胞蛋白酶1。关键的弹性蛋白酶同源物包括组织蛋白酶G、蛋白酶3、天青杀素(azurocidin)和mycolobastin具有Val-Xaa>Ala-Xaa切割亲和力。粒酶A和K具有类胰蛋白酶切割亲和力。粒酶B具有用于Asp-Xaa的天冬裂酶切割亲和力。粒酶M具有用于Met-Xaa或Leu-Xaa的甲硫氨酸裂解酶(metase)切割亲和力。粒酶H和肥大细胞蛋白酶1具有用于切割Phe-Xaa、Tyr-Xaa或Trp-Xaa的糜蛋白酶切割亲和力。

关于脂连蛋白和脂连蛋白受体片段的断裂模式的分析使用胰蛋白酶和弹性蛋白酶作为示例性炎症蛋白酶进行测定。长度为29-34个氨基酸的片段(即，SEQ ID NOS：1、2、4-11、16、17和/或19-26)预测经由弹性蛋白酶切割。长度为20-25个氨基酸的片段(即，SEQ IDNOS：3、12-15、18和/或27-30)预测经由一般胰蛋白酶家族丝氨酸蛋白酶或粒酶切割。

实施例8-设定灵敏性与特异性

样品分成正常和异常的。结果对于全体进行收集，并且观察到的adipoR1值针对指定的adipoR1阈值进行判断。阈值是低于其的所有结果均视为正常和高于其的结果视为阳性的值。阈值从低数目到高数目变化，并且结果的预测值使用发现的真阳性、假阳性、真阴性和假阴性数目进行计算。对于测试的每个阈值计算灵敏性(TP/TP+FP)和特异性(TN/TN+FN)。具有最高灵敏性与特异性的阈值给出最佳预测值。(100％将是理想的)。

实施例9-脂连蛋白受体片段阈值

下述是使用实施例1显示的患者和方法设定阈值的例子。在下表中，高于其的AdipoR1结果视为阳性的阈值从15到21ug/mL变化。在这个例子中，较高的值视为阳性。真阴性或正确鉴定的无诊断的糖尿病的患者数目连同假阳性、假阴性和真阳性数目一起进行计算。理想地，测定将无假阳性或100％的特异性，和无假阴性或100％灵敏性。如从数据中可见的，阈值15对于灵敏性更佳，而阈值21对于特异性更佳。阈值和范围取决于检测的片段和使用的分析法。在这个例子中，总测定范围为5-30ug/mL或约6X。因此，浓度单位和范围随检测的片段和使用的分析法(SELDI对ELISA)而变化。例如，对于在实施例6和表7中测试的片段，正常和糖尿病之间的差异通常为100X。如预期的，关于1种特异性片段的浓度小于所有片段的浓度。使用的样品类型，无论是尿、血浆还是血清同样影响片段的浓度。尿和血清具有为血浆的约1/10的片段浓度。一旦选择了测定和片段，阈值就进行调整以最好地达到所需的临床一致，其中使用显示的方法。

表8

实施例10-用于脂肪细胞失调测定的实验对象组的使用

下述是使用另外的且与AdipoR1结果相关的生物标记以改善糖尿病病症的预测的例子。使用实施例1中显示的糖尿病和正常患者以及方法。在下表中，3种分析物就其检测糖尿病的能力进行比较。使用的阈值提供可比较的TN。如预测的，ADIPOR1检测到比其他分析物更多的真阳性。

表9

 

分析物	用于限定阳性的阈值	TN	FP	TP	FN	1型neg	1型pos
								脂连蛋白	<＝4ug/mL	46	4	24	45	21	4
c-肽	<300pmol/L	41	9	10	59	6	19
								c-肽	>2700pmol/L	48	2	21	48	23	2
AdipoR1	>＝21ug/mL	44	6	37	32	15	10

69个糖尿病中的25个是1型。分析物同样就对于1型糖尿病是阳性的能力进行比较。25个1型糖尿病中只有4个具有异常低的脂连蛋白。C-肽使用2个阈值，1个用于异常低的和1个用于异常高的水平。异常低的c-肽指出缺乏胰岛素，和如预期的，25个1型糖尿病中的23个具有异常低的c-肽。1型糖尿病也通常具有AdipoR1片段。少数1型糖尿病具有异常高的c-肽。

这些分析物检测不同的患者。这可能由病理学中的差异进行解释，因为每种分析物测量失调的不同部分。例如，认为影响c-肽的胰岛素的缺乏是由于胰岛细胞，而脂连蛋白的缺乏是由于脂肪细胞不能生产激素。这个例子中adipoR1片段的存在被认为是由于肌细胞因过度使用而脱落受体。

这个数据证实分析物共同的组合可以比单独的任何一种更好。在下表中，最简单的关系通过考虑阳性的实验对象组中的任何一个进行测试，以意指结果是异常的。因此所有分析物必须是阴性的以被视为正常结果。如上所述，阈值进行调整以达到最佳结果。

表10

 

ADIPOR1	C-肽高异常	C-肽低异常	脂连蛋白	TN	FP	TP	FN
								>＝21	>＝2700	未使用	未使用	43	7	47	22
>＝21	>＝2700	<＝300	未使用	34	5	37	18
								>＝21	未使用	未使用	<＝4	34	16	50	19
>＝21	>＝2700	未使用	<＝4	41	9	53	16

对于c-肽、脂连蛋白和adipoR1的组合使用获得最高数目的真阳性。对于c-肽和adipoR1的组合使用或通过使用c-肽、脂连蛋白和adipoR1获得最高数目的真阴性。在2种情况下，真阴性数目与adipoR1可比较。

实施例11-CAD患者的血浆中的可溶性脂连蛋白受体1水平

下述是使用另外的且与AdipoR1结果相关的生物标记以改善心血管病症的预测的例子。使用实施例2中显示的心血管病症和正常患者以及方法。影响患者是通过血管造影照片或通过符合代谢综合征定义的高危险性具有ACS的那些。具有预先存在的心血管状况例如AMI和CHF的患者被排除，因为诊断可能已通过TnI或BNP测定或其他诊断评估来进行。

脂连蛋白受体1可溶性C-末端片段如实施例1中所示通过ELISA进行测量。结果与血管阻塞程度良好关联(表11)。心血管病症的危险也通过关于促炎和抗炎应答以及脂连蛋白的另外标记进行评估。关于促炎和抗炎应答的分析物与adipor1进行比较。异常的AdipoR结果比脂连蛋白、乌司他丁、尿抑胰酶素、WBC或CRP更可能存在于具有血管阻塞的患者中。更高的灵敏性支持脂连蛋白受体1对于由于动脉粥样硬化的血管阻塞的诊断关联。

表11

脂连蛋白受体1可溶性片段关于动脉粥样硬化的灵敏性

 

标记	特异性(％)	灵敏性(％)
			尿抑胰酶素	95	25
乌司他丁	95	25
			CRP	95	15
WBC-总	80	25
			WBC-gran	85	25
尿抑胰酶素和乌司他丁	90	45
			脂质危险比	95	20
脂连蛋白	85	20
			血浆中的可溶性AdipoR1	85	75

促炎和抗炎应答以及脂肪细胞标记的实验对象组的使用就其检测心血管病症的能力进行比较。对于尿抑胰酶素、乌司他丁、CRP、WBC、脂连蛋白和adipoR1的组合使用获得最高数目的真阳性。对于脂连蛋白和adipoR1的组合使用获得最高数目的真阴性。

每种所述范围包括范围的所有组合和亚组合，以及其中包含的具体数字。

本说明书中引用的所有出版物和专利申请整体且为了所有目的引入本文作为参考，如同每个单个出版物或专利申请特别且个别指出为了所有目的引入作为参考一样。

尽管为了清楚理解的目的已经由举例说明和实施例相当详细地描述了前述发明，但根据本发明的教导对于本领域普通技术人员将显而易见的是，可以在不背离附加权利要求的精神或范围的情况下，对其进行某些改变和修改。

序列表

SEQ ID NO：1：脂连蛋白受体1的片段1

SEQ ID NO：2：脂连蛋白受体1的片段2

SEQ ID NO：3：脂连蛋白受体1的片段3

SEQ ID NO：4：脂连蛋白受体1的片段4

SEQ ID NO：5：脂连蛋白受体1的片段5

SEQ ID NO：6：脂连蛋白受体1的片段6

SEQ ID NO：7：脂连蛋白受体1的片段7

SEQ ID NO：8：脂连蛋白受体1的片段8

SEQ ID NO：9：脂连蛋白受体1的片段9

SEQ ID NO：10：脂连蛋白受体1的片段10

SEQ ID NO：11：脂连蛋白受体1的片段11

SEQ ID NO：12：脂连蛋白受体1的片段12

SEQ ID NO：13：脂连蛋白受体1的片段13

SEQ ID NO：14：脂连蛋白受体1的片段14

SEQ ID NO：15：脂连蛋白受体1的片段15

SEQ ID NO：16：脂连蛋白受体1的片段16

SEQ ID NO：17：脂连蛋白受体1的片段17

SEQ ID NO：18：脂连蛋白受体1的片段18

SEQ ID NO：19：脂连蛋白受体1的片段19

SEQ ID NO：20：脂连蛋白受体1的片段20

SEQ ID NO：21：脂连蛋白受体1的片段21

SEQ ID NO：22：脂连蛋白受体1的片段22

SEQ ID NO：23：脂连蛋白受体2的片段1

SEQ ID NO：24：脂连蛋白受体2的片段2

SEQ ID NO：25：脂连蛋白受体2的片段3

SEQ ID NO：26：脂连蛋白受体2的片段4

SEQ ID NO：27：脂连蛋白受体2的片段5

SEQ ID NO：28：脂连蛋白受体2的片段6

SEQ ID NO：29：脂连蛋白受体2的片段7

SEQ ID NO：30：脂连蛋白受体2的片段8

SEQ ID NO：31：脂连蛋白受体2的片段9

SEQ ID NO：32：脂连蛋白受体2的片段10

SEQ ID NO：33：脂连蛋白受体2的片段11

SEQ ID NO：34：脂连蛋白受体2的片段12

SEQ ID NO：35：脂连蛋白受体2的片段13

SEQ ID NO：36：脂连蛋白受体2的片段14

SEQ ID NO：37：脂连蛋白受体2的片段15

SEQ ID NO：38：脂连蛋白受体2的片段16

SEQ ID NO：39：脂连蛋白受体2的片段17

SEQ ID NO：40：脂连蛋白受体2的片段18

SEQ ID NO：41：脂连蛋白受体2的片段19

SEQ ID NO：42：脂连蛋白受体2的片段20

SEQ ID NO：43：脂连蛋白受体2的片段21

SEQ ID NO：44：脂连蛋白受体2的片段22

SEQ ID NO：45-脂连蛋白受体1的核酸序列

SEQ ID NO：46-脂连蛋白受体1的氨基酸序列

SEQ ID NO：47-变体脂连蛋白受体1的核酸序列

SEQ ID NO：48-变体脂连蛋白受体1的氨基酸序列

SEQ ID NO：49-脂连蛋白受体2的核酸序列

SEQ ID NO：50-脂连蛋白受体2的氨基酸序列

Claims (37)

1.一种用于检测受试者中的脂连蛋白受体的断裂的方法，其包括测定得自所述受试者的生物流体样品中所述脂连蛋白受体的至少一种可溶性C-末端片段的存在或不存在的步骤。

2.权利要求1的方法，其中所述至少一种C-末端片段与载体蛋白质结合。

3.权利要求2的方法，其中所述载体蛋白质是脂连蛋白。

4.权利要求1的方法，其中所述脂连蛋白受体的至少一种C-末端片段通过抗体进行检测。

5.权利要求2的方法，其中与载体蛋白质结合的所述至少一种C-末端片段通过抗体进行检测。

6.权利要求1的方法，其中测定所述生物流体中所述脂连蛋白受体的至少一种C-末端片段的存在的步骤包括使所述样品与对所述脂连蛋白受体的至少一种C-末端片段特异的结合剂接触。

7.权利要求6的方法，其中所述结合剂包含抗体。

8.权利要求7的方法，其中所述抗体用报道分子进行标记。

9.权利要求6的方法，其中测定所述生物流体中所述脂连蛋白受体的至少一种C-末端片段的存在的步骤进一步包括使所述样品与对所述第一种结合剂特异的第二种结合剂接触。

10.权利要求9的方法，其中所述第二种结合剂是抗体。

11.权利要求10的方法，其中所述第二种结合剂用报道分子进行标记。

12.权利要求2的方法，其中测定所述生物流体中所述脂连蛋白受体的至少一种C-末端片段的存在的步骤包括使所述样品与对载体蛋白质特异的结合剂接触，所述载体蛋白质与所述至少一种脂连蛋白受体片段结合，且所述方法进一步包括测定所述载体蛋白质是否与所述至少一种脂连蛋白受体片段结合的步骤。

13.权利要求1的方法，其中所述体液是血浆或全血。

14.权利要求1的方法，其中所述体液是尿。

15.一种检测受试者中的脂连蛋白受体的表达水平的方法，其包括测定生物流体样品中所述脂连蛋白受体的至少一种C-末端片段的水平，和使所述至少一种C-末端片段的水平与所述脂连蛋白受体的表达水平关联的步骤。

16.一种检测受试者中的脂连蛋白的表达水平的方法，其包括测定生物流体样品中脂连蛋白受体的至少一种C-末端片段的水平，和使所述至少一种C-末端片段的水平与所述脂连蛋白的表达水平关联的步骤。

17.一种用于确定特征在于受试者中的脂肪细胞失调的状况的进展、状况的发作、或状况的治疗功效的方法，其包括测定得自所述受试者的体液样品中存在的脂连蛋白受体的至少一种可溶性C-末端片段的水平，和使所述水平与所述状况的进展、所述状况的发作、或所述状况的治疗功效关联。

18.权利要求17的方法，其中所述至少一种可溶性C-末端片段与载体蛋白质结合。

19.权利要求17的方法，其中所述至少一种可溶性C-末端片段是未结合的。

20.权利要求17的方法，其进一步包括测定得自所述受试者的生物样品中的脂连蛋白水平，和使所述脂连蛋白水平与所述状况的进展、所述状况的发作、或所述状况的治疗功效关联。

21.权利要求17的方法，其进一步包括测定得自所述受试者的生物样品中的尿抑胰酶素水平，和使所述尿抑胰酶素水平与所述状况的进展、所述状况的发作、或所述状况的治疗功效关联。

22.权利要求17的方法，其进一步包括测定得自所述受试者的生物样品中的C-反应蛋白水平，和使所述C-反应蛋白水平与所述状况的进展、所述状况的发作、或所述状况的治疗功效关联。

23.权利要求17的方法，其进一步包括测定得自所述受试者的生物样品中的白细胞水平，和使所述白细胞水平与所述状况的进展、所述状况的发作、或所述状况的治疗功效关联。

24.权利要求17的方法，其进一步包括测定得自所述受试者的生物样品中的c-肽水平，和使所述c-肽水平与所述状况的进展、所述状况的发作、或所述状况的治疗功效关联。

25.权利要求17的方法，其中所述方法用于确定特征在于脂肪细胞失调的状况的发作。

26.权利要求17的方法，其中所述方法用于确定特征在于脂肪细胞失调的状况的进展。

27.权利要求17的方法，其中所述方法用于确定特征在于脂肪细胞失调的状况的治疗功效。

28.权利要求27的方法，其中所述治疗是施用PPARγ激动剂。

29.权利要求17的方法，其中所述状况是代谢综合征。

30.权利要求17的方法，其中所述状况是血管阻塞。

31.权利要求17的方法，其中所述状况是I型糖尿病或II型糖尿病。

32.权利要求17的方法，其中所述状况是动脉硬化。

33.权利要求17的方法，其中所述状况是心血管疾病。

34.权利要求33的方法，其中所述心血管疾病是充血性心力衰竭、急性心肌梗死、冠状动脉疾病、动脉粥样硬化或局部缺血。

35.权利要求17的方法，其中所述状况是胰岛素抵抗。

36.一种用于确定具有动脉硬化的受试者是否可能发展心血管疾病的方法，其包括测定得自所述受试者的生物流体样品中存在的所述脂连蛋白受体的至少一种可溶性C-末端片段的水平，和使所述水平与发展心血管疾病的可能性关联。

37.权利要求36的方法，其中所述心血管疾病是充血性心力衰竭、急性心肌梗死或局部缺血。