CN101490266A

CN101490266A - 非土壤杆菌属细菌物种用于植物转化的用途

Info

Publication number: CN101490266A
Application number: CNA2007800267523A
Authority: CN
Inventors: X·叶; J·沈; E·威廉斯
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 2006-05-16
Filing date: 2007-05-16
Publication date: 2009-07-22
Anticipated expiration: 2027-05-16
Also published as: EP2803728A1; WO2007137075A2; US20150040266A1; EP3608413B1; EP2027275A2; AU2007253903A1; US20130160157A1; US20200385746A1; JP2009537150A; US10006035B2; US10724042B2; CN101490266B; CA2843961A1; US20160319289A1; US20070271627A1; CA2652377A1; US20180312854A1; EP3196311B1; EP2361986A1; WO2007137075A8

Abstract

本发明涉及用于根瘤菌介导遗传转化包括大豆、油菜、玉米和棉花细胞在内的植物细胞的方法。这些方法包括依赖VirD2和不依赖virD2的方法。使用的细菌物种包括根瘤菌(Rhizobium sp.)、中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)和中间根瘤菌菌株(Mesorhizobium spp.)的菌株。本发明还揭示了用于这样的转化的载体。

Description

非土壤杆菌属细菌物种用于植物转化的用途

发明背景

本申请要求于2006年5月16日提交的美国临时专利申请第60/800,872号的优先权，其内容以其整体在此引作参考。

1.发明领域

本发明涉及植物生物技术领域。特别地本发明涉及用于通过用非土壤杆菌细菌菌种产生转基因植物和转基因植物细胞的方法。

2.相关领域说明

根瘤菌目(Rhizobiales)成员土壤杆菌(Agrobacterium spp.)连同根瘤菌(Rhizobium spp.)、中间根瘤菌(Mesorhizobium spp.)、中华根瘤菌(Sinorhizobium spp.)和相关种属是常见的土壤细菌。荷有Ti或Ri质粒的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的许多野生型和卸甲(非致病性)菌株可用于将基因转移到植物中。位于荷有Ti或Ri质粒的野生型土壤杆菌T-DNA中的植物激素合成基因在转化后于植物细胞中表达，并视土壤杆菌(Agrobacterium)菌株或菌种而定引起肿瘤形成或发根表型。重要的是，可对土壤杆菌T-DNA进行遗传改造以用“目标基因”取代其多种毒力和致病性决定子，同时保留被转移到植物细胞并整合到植物基因组的能力。含有这样的“卸甲”Ti质粒的菌株广泛用于植物转化。

T-DNA通过土壤杆菌转移到植物细胞的机理已有充分的记载。简言之，通过两个称为右边界(right border，RB)和左边界(left border，LB)的边界区来划定T-DNA界限。毒力蛋白VirD2在所述边界制造切口，由此产生在5’末端共价连接有VirD2的单链转移DNA(“T-链”)。也包括土壤杆菌VirE2蛋白在内的蛋白-DNA复合体通过所谓的4型分泌系统(T4SS，既是毒力蛋白又是ssDNA转运蛋白)脱离土壤杆菌细胞，在土壤杆菌毒力蛋白和植物因子二者的帮助下被转移到植物细胞并整合于植物基因组。用土壤杆菌介导的载体将DNA导入植物细胞为本领域所熟知。参见例如由Fraley等(1985)、Rogers等(1987)和美国专利申请第5,563，055号(以其整体在此明确引作参考)阐述的方法。

土壤杆菌介导的转化在包括拟南芥(Arabidopsis)、烟草和番茄在内的很多双子叶植物中有效。也已经设计了用于土壤杆菌介导转化其它物种的方法(例如涉及大豆转化的美国专利申请第6,384,301号)。虽然土壤杆菌介导的转化最初仅用于双子叶植物，但土壤杆菌介导的转化技术的进步使得该技术也可应用于单子叶植物。例如，土壤杆菌介导的转化技术业已应用于水稻(Hiei等，1997；Zhang等，1997；美国专利申请第5,591,616号，以其整体在此明确引作参考)、小麦(McCormac等，1998)、大麦(Tingay等，1997；McCormac等，1998)和玉米(Ishida等，1996)。然而，很多植物物种抗拒土壤杆菌介导的转化，以及在其它物种中效率低。另外，因为根癌土壤杆菌在创伤部位进入植物组织，并不天然感染非创伤组织，所以某些组织不可用作转化靶标。

除了T4SS依赖性T-链递送系统外，土壤杆菌还具有也可转移和整合质粒的另外的质粒转移系统，例如IncQ质粒pRSF1010，其经由接合转移以较低频率在细菌细胞之间转移以及转移并整合入植物基因组(Buchanan-Wollaston等，1987；Shadenkov等，1996；Chen等，2002)。例如，接合转移蛋白MobA与RSF1010质粒的MobB和MobC蛋白一起切割oriT(转移起点)位点，连接至5’末端并将ssDNA转移到细胞中而不依赖于T4SS系统(Bravo-Angel等，1999，和其中的参考文献)。

接合转移系统广泛存在于细菌中，导致细菌细胞之间的遗传信息交换。在与土壤杆菌属在系统发生上相关但又不同的根瘤菌属(Rhizobium)中(Spaink等(编辑)，1998；Farrand等，2003)，在某些物种中已经部分表征了接合转移系统(Freiberg等，1997；Turner等，2002；Tun-Garrido等，2003；Perez-Mendoza等，2004)。结合系统需要作为切口位点的oriT和作为切割酶(nicking enzyme)的TraA或Mob，它们不同于用于T-DNA转移的常规元件(分别为VirD2以及RB和LB位点)。不象发现在其C-末端具有用于植物核靶向的植物NLS(核定位信号)的VirD2，TraA或Mob并没有明显的NLS。TraA将DNA整合入植物中的准确机制和位点尚不清楚。

已知除了土壤杆菌(Agrobacterium sp.)外的根瘤菌目成员例如根瘤菌，在专门的固氮根瘤中与植物根系共生联合(例如Long，2001)。除了在植物(尤其是豆科植物)根系宿主特异性地形成根瘤外，已知根瘤菌目成员在无根瘤形成的情况下对某些植物还有生长促进作用(例如Noel等，1996)。最近已出版的报道阐述了通过非土壤杆菌细菌来转化植物(例如Broothaerts等，2005；美国专利申请公开说明书第20050289667号；第20050289672号；Weller等，2004；Weller等，2005)。

Broothaerts等报道：限于拟南芥、烟草和水稻的根瘤菌(Rhizobiumsp.)、百脉根根瘤菌(Mesorhizobium loti)和草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)菌株的转化。Weller等(2004，2005)报告了包括根瘤菌和苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)菌株在内的荷有Ri质粒的几种细菌明显转化了水培生长的黄瓜和番茄植物，导致发根表型。然而，在某些经接种的植物中不排除存在土壤杆菌的可能性，这使得分析复杂化。尚无通过非土壤杆菌细菌菌株将DNA转移到大豆、玉米、棉花或油菜(canola)植物细胞的报道。另外，在水稻、烟草和拟南芥中用非土壤杆菌细菌菌株的转化工作迄今还受到低转化效率的阻碍。因此，一般而言，在本领域中非常需要开发允许用非土壤杆菌细菌菌株转化重要的农作物物种并改进转化效率的改进方法。

附图简述

以下附图是本说明书的部分，包括这些附图是为了进一步论证本发明的某些方面。可通过参考附图并结合本文所提供的具体实施方案的详述，来更好地理解本发明。

图1：pMON96033示意图。

图2：pMON96036示意图。

图3：pMON101316示意图。

图4：在大豆中用含任一种卸甲Ti-质粒(pTiBo542G或pTi4404kan)的百脉根根瘤菌(ML)、豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)(RL)、费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)(SF)、草木樨中华根瘤菌(SM)进行的根瘤菌介导转化的瞬时GUS分析。RL4404：含pTi4404kan的豌豆根瘤菌菌株Madison；ML542G：含pTiBo542G的百脉根根瘤菌USDA3471；ML4404：含pTi4404kan的百脉根根瘤菌USDA3471；2370LBA：含pTi4404kan的豌豆根瘤菌USDA2370；2370G：含pTiBo542G的豌豆根瘤菌USDA2370；SF4404：含pTi4404kan的费氏中华根瘤菌USDA205；SM542C：含pTiBo542G的草木樨中华根瘤菌USDA1002；ABI：根癌土壤杆菌ABI菌株对照。

图5：通过根瘤菌介导的转化在大豆中产生的gus转基因的种系传递。

图6：pMON96913示意图。

图7：pMON96914示意图。

图8：pMON96026示意图。

图9：由GUS瞬时分析所示的用若干菌株进行的根瘤菌介导的油菜转化。A)ML542C(22.4％)；B)RL2370G(33.3％)；C)RL2370LBA(20％)；D)SF542C(30.5％)；E)SF4404(20.6％)；和F)SM542C(13％)。具GUS阳性扇形面(sector)的外植体的百分率示于括号中。

图10：用若干根瘤菌菌株的稳定转基因油菜愈伤组织转化。A)ML542C(50％)；B)RL2370G(21％)；C)RL2370LBA(67％)；D)SF542C(36％)；和E)SM542C(73％)。具GUS阳性扇形面的外植体的百分率示于括号中。

图11：源自根瘤菌介导转化的油菜植物中的CP4转基因的DNA印迹检测。第1道：BN_A22株系；第2道：BN_A24株系；第3道：BN_A28株系；和第4道：BN_A35株系。

图12.含有pMON101316的根瘤菌的棉花转化：A)ML542C(47.8％)；B)RL2370G(56％)；C)RL2370LBA(31.4％)；D)SF542C(23.2％)；E)SF4404(31.5％)；和F)SM542C(44.4％)。将RL2370用作阴性对照；将根癌土壤杆菌ABI菌株用作阳性对照。GUS染色阳性外植体的百分率写入上述括号中。

图13：几种根瘤菌菌株的稳定棉花愈伤组织转化：A)ML542C；B)SF542C；C)SM542C；D)SF4404；E)RL2370LBA；和F)RL2370G。

图14：在源自根瘤菌介导转化的棉花愈伤组织中通过DNA印迹杂交检测gus转基因。RL2370LBA：含LBA4404Ti辅助质粒的豌豆根瘤菌2370；SF542：含来自AGL0菌株的pTiBo542辅助质粒的费氏中华根瘤菌205；和SF4404：含LBA4404Ti辅助质粒的费氏中华根瘤菌205。

图15：在玉米未成熟胚中通过gus基因瞬间表达所显示的根瘤菌介导的玉米转化。ABI：根癌土壤杆菌；RL2370LBA：含LBA4404Ti质粒的豌豆根瘤菌USDA2370；SM542C：含pTiBo542的草木樨中华根瘤菌USDA1002；ML542G：含pTiBo542的百脉根根瘤菌；SF4404：含LBA4404Ti质粒的费氏中华根瘤菌USDA205；SF542C：含pTiBo542的费氏中华根瘤菌USDA205。所有菌株都含有pMON96036，并在pH5.4的ATA培养基中被诱导。

图16：用根瘤菌菌株转化后的表达gfp标记的玉米愈伤组织。

图17：在源自根瘤菌介导转化的玉米植物中转基因整合的DNA印迹杂交分析。用DIG-标记的gus探针来检测转基因。第1-2道和第11-12道：用百脉根根瘤菌ML542G/pMON96036转化后得到的株系；第3-9道：用根癌土壤杆菌ABI对照转化后得到的株系；第13-17道：用费氏中华根瘤菌SF4404/pMON96033转化后得到的株系；第18-19道：用费氏中华根瘤菌SF542C/pMON96036转化后得到的株系。

发明简述

本发明一方面提供用于用于转化植物细胞的方法，该方法包括：(a)使至少第一植物细胞与非土壤杆菌的细菌接触，所述细菌包含：(i)包含Ti质粒的vir基因区的第一核酸，其中所述vir基因区用来以VirD2依赖性方式将编码目标序列的核酸导入所述植物细胞中；和(ii)包含可操作地与目标核酸连接的一个或多个T-DNA边界序列的第二核酸；和(b)选择被所述目标核酸转化的至少第一植物细胞，其中所述植物细胞为大豆、油菜、玉米或棉花植物细胞。

本发明另一方面提供用于转化植物细胞的方法，该方法包括：(a)使至少第一植物细胞与非土壤杆菌的细菌接触，所述细菌包含：(i)不依赖VirD2功能的DNA序列接合转移所需的第一核酸和(ii)包含目标核酸的第二核酸；其中所述植物细胞为大豆、油菜、玉米或棉花植物细胞，其中由接合转移所需的核酸所编码的多肽用来将目标核酸转移到所述植物细胞中；和(b)选择被所述目标核酸转化的至少第一植物细胞。在这样的方法中，所述接合转移可为traA、traI或mobA依赖性的，所述第一核酸包含oriT。所述第一核酸可缺乏左和右T-DNA边界序列。

在本发明方法中，所述细菌可为根瘤菌细胞。在某些实施方案中，根瘤菌在合适条件下培养以将根瘤菌细胞的多糖产生减到最少。根瘤菌细胞在与植物细胞接触之前可在乙酰丁香酮或诱导vir基因功能的其它化合物例如酚类化合物存在下生长。所述根瘤菌细胞可选自：根瘤菌(Rhizobium sp.)、中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)、中间根瘤菌、叶杆菌(Phyllobacterium spp.)、苍白杆菌(Ochrobactrum spp.)和慢生根瘤菌(Bradyrhizobium spp.)。在具体实施方案中，所述根瘤菌细胞为豌豆根瘤菌细胞，并可进一步为豌豆根瘤菌三叶草生物变异型(R.leguminosarumbv.trifolii)、豌豆根瘤菌菜豆生物变异型(R.leguminosarumbv.phaseoli)或豌豆根瘤菌蚕豆生物变异型(Rhizobiumleguminosarum.bv.viciae)的细胞。

在由本发明提供的转化方法的另一方面中，被转化的植物细胞可包括在来自植物种子的外植体中，例如来自幼苗、愈伤组织、细胞悬液、子叶、分生组织、叶、根或茎。外植体可包括胚分生组织外植体；愈伤组织；细胞悬液；子叶；或来自叶、根或茎的组织。

用于按照本发明转化的细菌可包含导入的核酸，例如通过电穿孔导入的核酸。所述序列可包含不依赖VirD2功能的接合转移所需的核酸。所述核酸可包括第一核酸和第二核酸。

在本发明的另一方面，本文提供的转化方法可包括在不存在选择剂时选择被目标核酸转化的植物细胞。选择被目标核酸转化的植物细胞可包括在选择剂存在下培养植物细胞，其中所述目标核酸赋予对选择剂的耐性，或可操作地连接赋予选择剂耐性的核酸。这样的选择剂实例包括草甘膦(glyphosate)、卡那霉素(kanamycin)、双丙氨膦(bialaphos)或麦草畏(dicamba)。在一个实施方案中，所述目标核酸或另外的核酸编码EPSP合成酶，在另外的实施方案中，其编码EPSP合成酶蛋白CP4。在另一实施方案中，选择剂为草甘膦。在其它实施方案中，可将目标核酸序列限定为物理上不与选择标记基因连接。例如，标记基因和目标核酸可在由被目标核酸转化的植物细胞再生的植物后代中遗传分离。

本发明细菌可包含至少第三核酸，所述第三核酸包含另外的目标核酸，其中所述植物细胞用该第三核酸转化。在本发明方法中，可由转基因植物细胞再生植株，其中所述植株包含目标序列。植株再生可包括诱导包含所述植物细胞的外植体形成一个或多个幼苗(shoot)，并将至少第一幼苗培育为可育全株。在某些实施方案中，所述植株可为玉米或棉花植株。在另外实施方案中，通过器官发生来进行再生。在其它实施方案中，所述植株为大豆或油菜植株。

本发明另一方面提供选自以下的根瘤菌的细胞：根瘤菌(Rhizobium sp.)、中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)、中间根瘤菌、叶杆菌、苍白杆菌和慢生根瘤菌，所述细胞包含(i)包含Ti质粒vir基因区的第一核酸，其中所述vir基因区用来以VirD2依赖方式将编码目标序列的核酸导入植物细胞中；和(ii)包含与编码目标序列的核酸可操作地连接的一个或多个T-DNA边界序列的第二核酸。在一个实施方案中，所述细胞进一步限定为包含选择标记。在另一实施方案中，所述根瘤菌细胞选自以下的细胞：根瘤菌(Rhizobium sp.)、根瘤菌NGR234根瘤菌(Rhizobium sp.NGR234)、豌豆根瘤菌Madison、豌豆根瘤菌USDA2370、豌豆根瘤菌USDA2408、豌豆根瘤菌USDA2668、豌豆根瘤菌2370G、豌豆根瘤菌2370LBA、豌豆根瘤菌2048G、豌豆根瘤菌2048LBA、豌豆根瘤菌菜豆生物变异型、豌豆根瘤菌菜豆生物变异型2668G、豌豆根瘤菌菜豆生物变异型2668LBA、豌豆根瘤菌RL542C、豌豆根瘤菌蚕豆生物变异型、豌豆根瘤菌三叶草生物变异型、埃特里根瘤菌(Rhizobium etli)USDA9032、埃特里根瘤菌菜豆生物变异型(Rhizobiumetli bv.phaseoli)、热带根瘤菌(Rhizobium tropici)、中间根瘤菌、百脉根根瘤菌ML542G、百脉根根瘤菌ML4404、中华根瘤菌(Sinorhizobiumsp.)、草木樨中华根瘤菌SD630、草木樨中华根瘤菌USDA1002、费氏中华根瘤菌USDA205、费氏中华根瘤菌SF542G、费氏中华根瘤菌SF4404、费氏中华根瘤菌SM542C、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)USDA6和大豆慢生根瘤菌USDA110。在具体实施方案中，所述细胞为豌豆根瘤菌细胞，可进一步为例如豌豆根瘤菌三叶草生物变异型、豌豆根瘤菌菜豆生物变异型或豌豆根瘤菌蚕豆生物变异型的细胞。

在本发明再一方面，提供能够不依赖virD2而从根瘤菌转移的能力并缺乏T-DNA边界序列的DNA构建体，所述构建体包含可操作地连接目标核酸的oriT序列和traA或mob序列。本发明进一步提供用例如权利要求35的DNA构建体转化的根瘤菌细胞，其中所述根瘤菌选自：根瘤菌、中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)、中间根瘤菌、叶杆菌、苍白杆菌和慢生根瘤菌。在一个实施方案中，所述根瘤菌细胞选自以下的细胞：根瘤菌(Rhizobium sp.)、根瘤菌NGR234、豌豆根瘤菌Madison、豌豆根瘤菌USDA2370、豌豆根瘤菌USDA2408、豌豆根瘤菌USDA2668、豌豆根瘤菌2370G、豌豆根瘤菌2370LBA、豌豆根瘤菌2048G、豌豆根瘤菌2048LBA、豌豆根瘤菌菜豆生物变异型、豌豆根瘤菌菜豆生物变异型2668G、豌豆根瘤菌菜豆生物变异型2668LBA、豌豆根瘤菌RL542C、豌豆根瘤菌蚕豆生物变异型、豌豆根瘤菌三叶草生物变异型、埃特里根瘤菌USDA9032、埃特里根瘤菌菜豆生物变异型、热带根瘤菌、中间根瘤菌、百脉根根瘤菌ML542G、百脉根根瘤菌ML4404、中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)、草木樨中华根瘤菌SD630、草木樨中华根瘤菌USDA1002、费氏中华根瘤菌USDA205、费氏中华根瘤菌SF542G、费氏中华根瘤菌SF4404、费氏中华根瘤菌SM542C、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)、大豆慢生根瘤菌USDA6和大豆慢生根瘤菌USDA110。在具体实施方案中，所述细胞为豌豆根瘤菌细胞，在另外的实施方案中，细胞可为豌豆根瘤菌三叶草生物变异型、豌豆根瘤菌菜豆生物变异型或豌豆根瘤菌蚕豆生物变异型的细胞。

发明详述

以下是为帮助本领域技术人员实施本发明而提供的本发明详细说明。本领域一般技术人员可在不偏离本发明精神或范围的情况下对本文所述实施方案进行修改和改变。

本发明提供用于通过根瘤菌对重要农作物物种的植物细胞进行有效遗传转化的方法和组合物。本发明克服了本领域的重要局限性，这些局限性包括有限的转化效率和无法适合于用非土壤杆菌菌株转化重要作物的技术。例如，尽管业已论述了用非土壤杆菌细菌转化几种植物品种，但转化频率一直低。就水稻而言，业已报道转化频率为0.6％和更低，从687个接种的愈伤组织中仅得到1个转化植株(Broothaerts等，2005)。这与用土壤杆菌的50-80％的转化频率形成对照。即使用容易被土壤杆菌转化的模式生物，转化频率也仅为通过土壤杆菌介导的转化获得的频率的一小部分。

迄今在很多情况下一直需要大量研究以将即使是已充分开发的转化方法(例如土壤杆菌介导的转化)应用到不同植物种类。不同物种的植物通常表现出显著的生理学差异，这些差异影响遗传转化的适应性。因此，转化一种植物物种的方法通常不能对其它植物发挥有效作用(倘若不是根本不发生作用)，转化植物的能力不一定预示着用同种方法转化即使是近缘物种的能力。这对于涉及所用细菌菌株与目标植物细胞之间复杂生化相互作用的细菌转化尤其如此。根瘤菌与植物在天然环境下相互作用，由此可表现宿主专一性，这种专一性对很多农作物物种的影响尚不清楚。

因此，鉴别适合于根瘤菌介导转化的植物并开发提供提高的转化效率的方法具有重大意义。有效转化尤其重要，因为任何特定转化事件表达的程度可基本上根据植物基因组中的整合位点而变化。因此，选择具有合适表达谱的转化事件的能力取决于有效产生转化株的能力。如以下在工作实施例中所阐明，本发明人转化大豆获得高至5％的瞬间转化频率(图4)，在棉花(图12)和油菜(图9)情况下分别获得56％和33％的频率。

本发明在一个实施方案中通过提供用根瘤菌转化重要作物的技术克服本领域的局限性，这些重要作物先前已知不能被根瘤菌转化，包括油菜、玉米、棉花和大豆。本发明还提供用根瘤菌有效转化植物的技术，包括已知适合于低频率根瘤菌转化的技术。本发明还提供用于转化不同于土壤杆菌转化靶的组织靶的方法。例如，土壤杆菌通常需要创伤部位来感染植物，而包括根瘤菌科(Rhizobiaceae)例如根瘤菌属(Rhizobium)在内的根瘤菌目的某些其它成员天然经由穿透植物组织的感染线而感染植物根系，便于用非愈伤组织作为转化靶。

提供以下定义以帮助本领域技术人员理解本发明的详细说明。

本文所用“植物生长调节剂”或“植物激素”指影响植物生长的化合物。植物生长调节剂包括但不限于：植物生长素(auxin)、细胞分裂素(cytokinin)、ABA、赤霉素(gibberellin)、乙烯、油菜素类固醇(brassinosteroid)和聚胺类。植物生长素在低浓度时影响幼苗和根的延伸，但在高水平时抑制生长。常用的植物生长素包括毒莠定(picloram)(4-氨基-3，5，6-三氯吡啶羧酸)、2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)、IAA(吲哚-3-乙酸)、NAA(α-萘乙酸)和麦草畏(3，6-二氯茴香酸)。细胞分裂素引起细胞分裂、细胞分化和苗分化(shoot differentiation)。常用细胞分裂素包括激动素(kinetin)、BA(6-苄氨基嘌呤)、2-ip(2-异戊烯基腺嘌呤)、BAP(6-苄氨基嘌呤)、噻苯隆(thidiazuron)(TDZ)、玉米素核苷(zeatinriboside)和玉米素(zeatin)。

“编码序列”、“编码区”或“可读框”指编码蛋白质、多肽或肽序列的连续有序的核酸三联体区域。

“双子叶植物”或“双子叶的”指具有两片子叶的植物。实例包括但不限于植物以下植物：例如紫花苜蓿、豆类、椰菜(broccoli)、卷心菜、油菜、胡罗卜、花椰菜、芹菜、棉花、黄瓜、茄子、莴苣、甜瓜、豌豆、胡椒、马铃薯、西葫芦(pumpkin)、罗卜、油菜籽、菠菜、大豆、南瓜(squash)、番茄和西瓜。

“内源性”指来源于生物体或细胞内的物质。

“外源性”指来源于生物体或细胞外的物质。本文所用外源性意欲指来自并非受体细胞或组织的来源的任何核酸，而不管相似(但不同)的核酸是否可能已经存在于受体细胞或组织中。

“外植体”指能够被转化并能随后再生为转基因植物的植物部分。实例包括胚、愈伤组织、细胞悬液、子叶、分生组织、幼苗、种子、叶、茎或根。

“单子叶植物”或“单子叶的”指具有单片子叶的植物。实例包括但不限于：洋葱、玉米、水稻、高梁、小麦、黑麦、稷、甘蔗、燕麦、小黑麦、大麦和草坪草。

“核酸”指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。

“表型”指由基因组(包括非基因组DNA和RNA，例如质粒和人造染色体)和/或生物体细胞器官中的核酸表达(或不表达)而产生的生物体所表现的性状。

术语“植物”包括任何高等植物和其后代，包括单子叶植物(例如玉米、水稻、小麦、大麦等)、双子叶植物(例如大豆、棉花、番茄、马铃薯、拟南芥、烟草等)、裸子植物(松、杉、雪松等)；并包括植物部分，包括植物生殖单位(例如种子、鳞茎、块茎、分生组织或来自可使植物繁殖的其它部分或组织)、果实和花。

“聚腺苷酸化信号”或“polyA信号”指位于编码区的3’端促进将腺苷酸加到从该编码区转录的mRNA的3’末端的核酸序列。

“启动子”或“启动区”指通常在编码序列的5’端发现的核酸序列，其通过为RNA聚合酶提供识别位点和/或为所用的其它转录相关因子提供其它识别位点以产生RNA和/或在DNA正确位点启动转录，来改变编码序列的表达。

“重组核酸载体”或“载体”或“构建体”指诸如质粒、粘粒、病毒、自主复制序列、噬菌体或线性或环状单链或双链DNA或RNA核酸片段等任何物质，它们可源自任何来源，能够进行基因组整合或自主复制，包含其中业已以功能操作方式连接一个或多个核酸序列的核酸分子。这样的重组核酸载体或构建体通常包含5’调控序列或启动区和编码所需基因产物的编码序列。载体通常设计为一旦被递送到细胞或组织中，即将所述编码序列转录为mRNA，后者任选被翻译为多肽或蛋白质。

“再生”指从植物细胞或组织培育植株的过程。

“根瘤菌”指(但不限于)可能归于根瘤菌目但并非土壤杆菌菌株的细菌属种和菌株其中包括分类学上的如下科根瘤菌科(例如根的细菌属、种和菌株，其中包括分类学上的如下科：根瘤菌科(例如根瘤菌(Rhizobium sp.)、中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.))；叶杆菌科(Phyllobacteriumceae)(例如中间根瘤菌、叶杆菌)；布鲁氏菌科(Brucellaceae)(例如苍白杆菌)；慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)(例如慢生根瘤菌)和黄色杆菌科(Xanthobacteraceae)(例如固氮根瘤菌(Azorhizobium spp.))。对本申请而言，“根瘤菌”不包括生物变异型或物种。

可根据本领域所知进行分类，例如通过比较16S rDNA序列或其它分类方法。很多根瘤菌属物种的野生型菌株通常能够在宿主植物例如豆科植物(豆科(Fabaceae))的根组织中诱导固氮根瘤的形成。然而，特定植物种使根生瘤的能力对于根瘤菌介导将DNA转移到植物种细胞中并不是必需的。

“选择标记”或“筛选标记”指这样的核酸序列，其表达所赋予的表型有助于鉴别含有该核酸序列的细胞、组织或植物。

“转录”指从DNA模板产生RNA拷贝的过程。

“转化”指将外源性核酸序列导入细胞或组织内的过程。所述转化可为瞬时转化或稳定转化。在稳定转化中，外源核酸部分或全部掺入(例如整合或稳定保留)到核基因组DNA、质体DNA中，或能在细胞核或质体中自主复制。

“转基因的”指外源核酸序列已稳定转化到其中的生物体。

在设计用于转化过程的载体时，选择将被导入到植物细胞或组织中的一种或多种遗传组分。遗传组分可包括用本发明方法被导入到植物细胞或组织中的任何核酸。遗传组分可包括非植物DNA、植物DNA或合成DNA。

在一个实施方案中，遗传组分被掺入到DNA组合物中，DNA组合物为例如包含至少一个或多个以下遗传组分类型的重组双链质粒或载体分子：(a)在植物细胞中起作用以导致产生RNA序列的启动子；(b)导致产生编码农学效用制品的RNA序列的结构DNA序列；和(c)在植物细胞中起作用以导致将多聚腺苷酰化核苷酸加到该RNA序列3’末端的3’非翻译DNA序列。

载体可含有多种遗传组分以促进植物细胞或组织的转化，并调控结构核酸序列的表达。在一个优选实施方案中，所述遗传组分被定向以便表达mRNA，在任选实施方案中该mRNA可被翻译为蛋白质。以双链形式存在的植物结构编码序列(基因、cDNA、合成cDNA或其它DNA)的表达涉及通过RNA聚合酶从DNA的一条链转录信使RNA(mRNA)，随后在细胞核内加工该mRNA的初级转录物。该加工涉及将多聚腺苷酰化核苷酸加到该mRNA的3’末端的3’非翻译区。

制备含有所期需遗传组分的质粒或载体的手段为本领域所熟知。载体通常由多种遗传组分组成，这些组分包括但不限于调控元件，例如启动子、前导区、内含子和终止子序列。调控元件还称为顺式调控元件或反式调控元件，视该元件与它们所控制的序列或基因的接近程度而定。

将DNA转录为mRNA由通常称为“启动子”的DNA区域来调控。启动区含有碱基序列，该序列向RNA聚合酶发出信号使其与该DNA结合，并用该DNA链之一作为模板制备对应的RNA互补链来启动转录mRNA。

文献中业已阐述了很多在植物细胞中有活性的启动子。这样的启动子将包括但不限于：胭脂碱合成酶(NOS)和章鱼碱合成酶(OCS)启动子，它们是根癌土壤杆菌的Ti质粒携带的启动子；花椰菜花叶病毒属(caulimovirus)启动子，例如花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)(CaMV)19S和35S启动子和玄参花叶病毒(Figwort mosaic virus)(FMV)35S启动子和增强型CaMV35S启动子(e35S)。响应环境、激素、化学和/或发育信号而受到调控的多种其它植物基因启动子也可用于在植物细胞中表达任何DNA构建体，这些启动子包括例如由以下因素调控的启动子：(1)热(Callis等，1988)；(2)光(例如豌豆RbcS-3A启动子，Kuhlemeier等，(1989)；玉米RbcS启动子，Schaffner等，(1991))；(3)激素，例如脱落酸(Marcotte等，1989)；(4)创伤(例如Wuni，Siebertz等，1989)；或其它信号或化学药品。还知道有组织特异性表达。如下所述，优选所选择的特定启动子应该能够引起充分表达从而导致有效量的目标基因产物的产生。阐述这样的启动子的实例包括但不限于：美国专利第6,437,217号(玉米RS81启动子)、美国专利第5,641,876号(水稻肌动蛋白启动子，OsAct1)、美国专利第6,426,446号(玉米RS324启动子)、美国专利第6,429,362号(玉米PR-1启动子)、美国专利第6,232,526号(玉米A3启动子)、美国专利第6,177,611号(组成型玉米启动子)、美国专利第5,322,938号、第5,352,605号、第5,359,142号和第5,530,196号(35S启动子)、美国专利第6,433,252号(玉米L3油质蛋白启动子)、美国专利第6,429,357号(水稻肌动蛋白2启动子以及水稻肌动蛋白2内含子)、美国专利第5,837,848号(根特异性启动子)、美国专利第6,294,714号(光诱导型启动子)、美国专利第6,140,078号(盐诱导型启动子)、美国专利第6,252,138号(病原体诱导型启动子)、美国专利第6,175,060号(磷缺乏诱导型启动子)、美国专利第6,635,806号(γ-coixin启动子)和美国专利第7,151,204号(玉米叶绿体醛缩酶启动子)。可应用的另外的启动子为：胭脂碱合成酶(NOS)启动子(Ebert等，1987)；章鱼碱合成酶(OCS)启动子(其由根癌土壤杆菌的肿瘤诱导质粒携带)；花椰菜花叶病毒属启动子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(Lawton等，1987)、CaMV35S启动子(Odell等，1985)、玄参花叶病毒35S-启动子(Walker等，1987；美国专利第6,051,753号；第5,378,619号)；蔗糖合酶启动子(Yang等，1990)；R基因复合体启动子(Chandler等，1989)和叶绿素a/b结合蛋白基因启动子；PC1SV(美国专利第5,850,019号)。在本发明中，如下启动子可特别有益：含增强子序列的CaMV35S(e35S；美国专利申请第5,322,938号；第5,352,605号；第5,359,142号；和第5,530,196号)、FMV35S(美国专利第6,051,753号；第5,378,619号)、花生褪绿条纹病毒(peanut chlorotic streak caulimovirus)(PC1SV；美国专利第5,850,019号)、At.Act7(登录号U27811)、At.ANT1(美国专利申请第20060236420号)、FMV.35S-EF1a(美国专利申请公开说明书第2005/0022261号)、eIF4A10(登录号X79008)和AGRtu.nos(GenBank登录号V00087；Depicker等1982；Bevan等，1983)、水稻胞液磷酸丙糖异构酶(OsTPI；美国专利申请第7,132,528号)和水稻肌动蛋白15基因(OsAct15；美国专利申请公开第2006/0162010号)。在某些情况下(例如OsTPI和OsAct15)，启动子可包含5’UTR和/或第一内含子。

还可构建启动子杂合体，以提高转录活性(美国专利申请第5,106,739号)，或以联合所期需的转录活性、诱导性和组织特异性或发育特异性。在植物中起作用的启动子包括但不限于诱导型、病毒性、合成的、如所述组成型和时间调控型、空间调控型和时空调控型的启动子。其它的组织增强型、组织特异性或发育调控型启动子是本领域已知的，并预想可用于本发明实施中。

在本发明DNA构建体(即嵌合/重组植物基因)中使用的启动子若需要可经修饰，以影响其调控特性。可借助与操纵基因区连接、随机或受制诱变等来衍生启动子。此外，可改变启动子以含有帮助提高基因表达的多重“增强子序列”。

由本发明DNA构建体产生的mRNA还可含有5’非翻译前导序列。该序列可源自选择用于表达所述基因的启动子，可经特定修饰以便增加或减少mRNA的翻译。5’非翻译区还可从病毒RNA、从合适的真核生物基因或从合成基因序列获得。为了提高或改变所得mRNA的翻译效率，这样的“增强子”序列可能是理想的。本发明并不限于其中非翻译区源自伴随启动子序列的5’非翻译序列的构建体。更合适的是，非翻译前导序列可源自不相关启动子或基因(参见例如美国专利申请第5,362,865号)。非翻译前导序列实例包括：玉米和矮牵牛热休克蛋白前导序列(美国专利申请第5,362,865号)、植物病毒外被蛋白前导序列、植物1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(rubisco)前导序列、GmHsp(美国专利第5,659,122号)、PhDnaK(美国专利申请第5,362,865号)、AtAnt1、TEV(Carrington和Freed，1990)、OsAct1(美国专利申请第5,641,876号)、OsTPI(美国专利申请第7,132,528号)和OsAct15(美国专利公开说明书第20060162010号)和AGRtu.nos(GenBank登录号V00087；Bevan等，1983)。也预想用来提高基因表达或影响基因转录或翻译的其它遗传组分作为遗传组分。

本领域已知内含子序列有助于在单子叶植物细胞中表达转基因。内含子实例包括：玉米肌动蛋白内含子(美国专利第5,641,876号)、玉米HSP70内含子(ZmHSP70；美国专利第5,859,347号；美国专利第5,424,412号)和水稻TPI内含子(OsTPI；美国专利申请第7,132,528号)，它们在本发明实施中都有益。

可通过可操作地连接重组转基因(例如目标基因、包含可筛选基因的鉴别序列或植物选择标记基因)的3′非翻译DNA序列完成转录终止。重组DNA分子的3′非翻译区含有在植物中起导致将腺苷酸加到RNA3’末端作用的聚腺苷酸化信号。可从在植物细胞中表达的各种基因获得3’非翻译区。在该性能中常用胭脂碱合成酶3’非翻译区(Fraley等，1983)。来自豌豆(Pisum sativum)RbcS2基因的聚腺苷酸化分子(Ps.RbcS2-E9；Coruzzi等，1984)、AGRtu.nos(Genbank登录号E01312)、E6(登录号U30508)、水稻谷蛋白(Okita等，1989)和TaHsp17(小麦低分子量热休克蛋白基因；GenBank登录号X13431)用于本发明可能特别有益。

在一个实施方案中，载体含有选择标记、筛选标记或可计分标记基因。这些遗传组分在本文中还被称为功能性遗传组分，因为它们产生在鉴别转化植物中起作用的产物，或产生农学效用产物。用作选择或筛选组件的DNA可在可再生的植物组织起作用，以产生赋予该植物组织对在其它情况下有毒性的化合物的抗性的化合物。本领域已知许多筛选标记或选择标记基因，它们可用于本发明中。选择标记和对其提供抗性的基因实例公开于Miki和McHugh，2004中。用作选择标记、筛选标记或可计分标记的目标基因其中将包括但不限于：gus；gfp(绿荧光蛋白)；荧光素酶(LUX)；赋予对以下抗生素具抗性的基因：例如卡那霉素(Dekeyser等，1989)、新霉素(neomycin)、卡那霉素、巴龙霉素(paromomycin)、G418、氨基糖苷类(aminoglycosides)、壮观霉素(spectinomycin)、链霉素(streptomycin)、潮霉素B(hygromycin B)、博来霉素(bleomycin)、腐草霉素(phleomycin)、磺胺类、链丝菌素(streptothricin)、氯霉素(chloramphenicol)、甲氨蝶呤(methotrexate)、2-脱氧葡萄糖、甜菜碱醛、S-氨基乙基L-半胱氨酸、4-甲基色氨酸、D-木糖、D-甘露糖、苄基腺嘌呤-N-3-葡糖苷酸酶；编码赋予对以下除草剂具抗性的酶的基因：例如草甘膦(例如5-烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)：Della-Cioppa等，1987；美国专利第5,627,061号；美国专利第5,633,435号；美国专利第6,040,497号；美国专利第5,094,945号；WO04074443和WO04009761；草甘膦氧化还原酶(GOX；美国专利第5,463,175号)；草甘膦脱羧酶(WO05003362和美国专利申请第20040177399号)；或草甘膦N-乙酰转移酶(GAT)：Castle等，美国专利公开说明书第20030083480号))、茅草枯(dalapon)(例如编码赋予对2，2-二氯丙酸(茅草枯；WO9927116)抗性的2，2-二氯丙酸脱卤酶的dehI)、溴苯腈(bromoxynil)(赋予对溴苯腈抗性的卤代芳基腈水解酶(Bxn)(WO8704181A1；US 4,810,648；WO8900193A))、磺酰除草剂(例如赋予对乙酰乳酸合酶抑制剂(例如磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶、嘧啶氧基苯甲酸盐和2-苯并[c]呋喃酮)抗性的乙酰羟酸合酶或乙酰乳酸合酶；(US 6,225,105；US 5,767,366，U.S.4,761,373；U.S.5,633,437；U.S. 6,613,963；US 5,013,659；US 5,141,870；US 5,378,824；US5,605,011))；编码ALS、GST-II)、双丙氨膦或膦丝菌素(phosphinothricin)或衍生物(例如赋予对膦丝菌素或草铵膦(glufosinate)抗性的膦丝菌素乙酰转移酶(bar)(US 5,646,024；US 5,561,236；EP 275,957；US5,276,268；US 5,637,489；US 5,273,894))、莠去津(atrazine)(编码GST-III)、麦草畏(麦草畏单加氧酶(DMO)；美国专利申请第20030115626号、第20030135879号)或稀禾定(sethoxydim)(赋予对环己二酮(稀禾定)和芳氧基苯氧基丙酸酯/盐(吡氟氯禾灵(haloxyfop))抗性的修饰型乙酰辅酶A羧化酶(U.S.6,414,222))。也可实施包括阳性选择机制(例如用大肠杆菌(E.coli)的manA基因，其允许在甘露糖存在下生长)在内的其它选择方法，这些方法仍将落在本发明范围内(还参见Miki和McHugh(2004))。

本发明可使用含有所述选择标记或筛选标记和相关调控元件、连同以足以赋予特定所期需性状的方式表达的一种或多种核酸的任何合适的植物转化质粒或载体。本发明预想的农用目的的合适结构基因实例将包括但不限于：疾病、昆虫或害虫耐性、除草剂耐性的基因；用于品质改良的基因，这些品质有例如产量、提高营养、环境耐受或逆境耐受或在植物生理、生长、发育、形态或植物制品方面的任何所期需的变化，包括淀粉生产(美国专利第6,538,181号；第6,538,179号；第6,538,178号；第5,750,876号；第6,476,295号)、改性油生产(美国专利第6,444,876号；第6,426,447号；第6,380,462号)、高油生产(美国专利第6,495,739号；第5,608,149号；第6,483,008号；第6,476,295号)、改性脂肪酸含量(美国专利第6,828,475号；第6,822,141号；第6,770,465号；第6,706,950号；第6,660,849号；第6,596,538号；第6,589,767号；第6,537,750号；第6,489,461号；第6,459,018号)、高蛋白生产(美国专利第6,380,466号)、果实成熟(美国专利第5,512,466号)、提高动物和人类营养(美国专利第6,723,837号；第6,653,530号；第6,5412,59号；第5,985,605号；第6,171,640号)、生物聚合物(美国专利第RE37,543号；第6,228,623号；第5,958,745号和美国专利公开说明书第US20030028917号)。还有环境逆境抗性(美国专利第6,072,103号)、药用肽和可分泌肽(美国专利第6,812,379号；第6,774,283号；第6,140,075号；第6,080,560号)、改良的加工特性(美国专利第6,476,295号)、改良的消化性(美国专利第6,531,648号)、低棉子糖(美国专利第6,166,292号)、工业酶生产(美国专利第5,543,576号)、改良风味(美国专利第6,011,199号)、固氮(美国专利第5,229,114号)、杂交种子生产(美国专利第5,689,041号)、纤维生产(美国专利第6,576,818号；第6,271,443号；第5,981,834号；第5,869,720号)和生物燃料生产(美国专利第5,998,700号)。如本领域技术人员考虑到本说明书应该理解到的，任一种这些或其它遗传元件、方法和转基因可用于本发明。

或者，目标DNA序列可通过例如共抑制、反义、RNAi、miRNA表达(天然或基因工程)、反式作用siRNA表达和核酶表达等基因沉默技术抑制外源基因表达来影响这些表型(参见例如美国专利申请公开说明书第20060200878号)。

可用包含在本发明中的方法导入的例示性核酸包括例如：来自另一物种的DNA序列或基因，或甚至源自或存在于同一物种、但通过基因工程方法而不是典型的繁殖或育种技术而被掺入到受体细胞的基因或序列。然而，术语“外源的”也意欲指正常情况下在待转化细胞中不存在的基因，或也许仅仅是不以在转化DNA片段或基因中发现的形式、结构等存在的基因，或正常存在但人们期望例如过表达的基因。因此，术语“外源”基因或DNA意欲指被导入到受体细胞中的任何基因或DNA片段，而不管是否相似的基因可能已经存在于这样的细胞中。包括在外源DNA中的DNA类型可包括：已经存在于植物细胞中的DNA；来自另一植物的DNA；来自不同生物体的DNA；或外部产生的DNA，例如含有基因的反义信息的DNA序列、或编码合成或修饰型基因的DNA序列。

根据本说明书，本领域技术人员显然将明了大量其它可能的选择标记或筛选标记基因、调控元件和其它目标序列。因此，前述讨论意欲为例示性，并不详尽。

对于根瘤菌介导的转化，在构建植物转化载体或构建体后，将在体外作为DNA组合物制备的核酸分子导入到合适宿主例如大肠杆菌中，并交配到另一合适宿主例如包括根瘤菌属的根瘤菌中，或直接转化(例如电穿孔)到感受态根瘤菌中。Ti或Ri质粒可天然转移到固氮根瘤菌属，并可分别诱导肿瘤或发根(Hooykaas等，1977，Weller等，2004)。作为替代，这样的Ti或Ri质粒可被“卸甲”，因而不能引起植物细胞增殖。因为根瘤菌属和土壤杆菌属具有不同的感染机理，所以在大豆转化期间一旦导入Ti或Ri辅助质粒，根瘤菌属或其它根瘤菌通过其感染线的深部感染可提高目标基因种系转化的频率。

本发明包括使用细菌菌株将一种或多种遗传组分导入到植物中。在一个实施方案中，宿主含有不含导致肿瘤发生或生根的致癌基因的卸甲Ti或Ri质粒，这些质粒的衍生物被用作载体并含有随后导入到植物中的目标基因。在另一实施方案中，细菌借助不依赖T4SS的机理(也就是oriT介导的接合转移)将DNA转移到植物细胞。不依赖T4SS的DNA转移所需的功能可存在于含有待转移DNA的质粒上，或可存在于在这样的细菌细胞中也存在的染色体或另一质粒上，包括Ti或Ri质粒。

细菌物种和菌株包括但不限于：根瘤菌(Rhizobium sp.)、根瘤菌NGR234、豌豆根瘤菌Madison、豌豆根瘤菌USDA2370、豌豆根瘤菌USDA2408、豌豆根瘤菌USDA2668、豌豆根瘤菌2370G、豌豆根瘤菌2370LBA、豌豆根瘤菌2048G、豌豆根瘤菌2048LBA、豌豆根瘤菌菜豆生物变异型、豌豆根瘤菌菜豆生物变异型2668G、豌豆根瘤菌菜豆生物变异型2668LBA、豌豆根瘤菌RL542C、豌豆根瘤菌蚕豆生物变异型、豌豆根瘤菌三叶草生物变异型、埃特里根瘤菌USDA9032、埃特里根瘤菌菜豆生物变异型、热带根瘤菌、中间根瘤菌、百脉根根瘤菌ML542G、百脉根根瘤菌ML4404、中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)、草木樨中华根瘤菌SD630、草木樨中华根瘤菌USDA1002、费氏中华根瘤菌USDA205、费氏中华根瘤菌SF542G、费氏中华根瘤菌SF4404、费氏中华根瘤菌SM542C、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)、大豆慢生根瘤菌USDA6、大豆慢生根瘤菌USDA 110。

任何合适的植物培养基皆可用于培育或维持植物组织培养物，这些培养基按需要可补充或不补充合适的胶凝剂，例如琼脂形式，例如低熔点琼脂糖或Gelrite，这些培养基适当地补充另外的植物生长调节剂，这些调节剂包括但不限于：植物生长素，例如毒莠定(4-氨基-3，5，6-三氯吡啶羧酸)、2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)和麦草畏(3，6-二氯茴香酸)；细胞分裂素，例如BAP(6-苄氨基嘌呤)和激动素；ABA；和赤霉素。其它培养基添加剂可包括但不限于：氨基酸、大量元素、铁、微量元素、肌醇、维生素和有机物、碳水化合物、不明培养基组分例如酪蛋白水解物。本领域技术人员熟悉多种组织培养基，当这些培养基被适当添加添加物时，支持植物组织生长和发育，适用于植物转化和再生。这些组织培养基可作为商业制品购买，或定制制备和改良。这样的培养基实例将包括但不限于：Murashige和Skoog(1962)、N6(Chu等，1975)、Linsmaier和Skoog(1965)、Uchimiya和Murashige(1962)、Gamborg培养基(Gamborg等，1968)、D培养基(Duncan等，1985)、McCown木本植物培养基(McCown和Lloyd，1981)、Nitsch和Nitsch(1969)、Schenk和Hildebrandt(1972)或由这些培养基添加后的派生物。本领域技术人员明了用于转化和再生的培养基和培养基添加物(例如营养素和生长调节剂)和可对特定目标品种优化的其它培养条件(例如培育期间的光强度、pH和培育温度)。

在组织培养中分离或培育可转化的植物组织后，或在植物体内(inplanta)鉴别和/或制备植物组织后，所述方法的下一步骤是将遗传组分导入到该植物组织。本文中该过程也被称为“转化”。植物细胞被转化，任选经受选择步骤。独立的转化株被称为转基因事件。业已报道使用土壤杆菌菌株的多种方法，这些方法可用于将遗传组分插入到可转化植物组织中。然而，非土壤杆菌菌种通常不用于转化植物。

本领域技术人员明了植物转化过程的典型步骤。可通过直接将甘油原种(stock)接种液体培养基例如TY或YEM培养基(Beringer等，1974)，或将来自甘油原种的细菌在固化培养基上划线，使所述细菌在合适的选择条件下生长，来制备待使用的根瘤菌。可通过在营养或培养条件(包括存在可促进转化的量的乙酰丁香酮)下生长来“预诱导”根瘤菌。本领域技术人员熟悉用于生长的程序和细菌的合适培养条件以及随后的接种程序。用于接种的细菌培养物的密度和细菌细胞数与外植体组织量的比率在不同系统间可变化，由此预期优化用于任一转化方法的这些参数。

转化过程的下一步骤是接种。在该步骤中，将合适地准备好的植物、植物组织或外植体和细菌细胞悬液混合在一起。接种的持续时间和条件以及细菌细胞密度将视植物转化系统而变化。转化细菌的生长或接种可在乙酰丁香酮或诱导位于Ti或Ri质粒的毒力基因的表达的其它已知诱导剂存在下发生。在某些实施方案中，非土壤杆菌细菌在于诱导培养基中生长期间使多糖产生最少的条件下生长。在特定实施方案中，用于使根瘤菌于诱导培养基中生长期间多糖产生最少的碳源为葡萄糖(AB-TY培养基)或L-阿拉伯糖和葡萄糖酸钾(ATA培养基)。

接种后可除去任何过量的细菌悬液，将细菌和目标植物材料共培养。共培养指接种后和转移到任选的延迟或选择培养基之前的时间。许多植物组织培养基可用于共同培养步骤。用细菌接种后的植物组织可在液体或半固体培养基中培养。通常进行约1-4天共同培养。

在与细菌共培养后，可任选将已接种的植物组织或外植体直接置于选择培养基上。或者，在与细菌共培养后，可将它们置于不含选择剂的培养基上，随后置于选择培养基上。本领域技术人员明了选择方案、培养基和生长条件的多种更改，这些可视植物系统和选择剂而变化。典型的选择剂包括但不限于：抗生素，例如遗传霉素(geneticin)(G418)、卡那霉素和巴龙霉素；或除草剂草甘膦、草铵膦和麦草畏。可将另外的合适的培养基组分加到选择或延迟培养基以抑制细菌生长。这样的培养基组分可包括但不限于抗生素，例如羧苄青霉素(carbenicillin)或头孢噻肟(cefotaxime)。

随后将培养物转移到适于转化小植株恢复的培养基中。本领域技术人员明了让转化植物恢复的多种方法。可实现多种培养基和转移需求，并使其对于植物转化和转基因植物恢复的每种植物系统优化。因此，可修改本发明揭示的这样的培养基和培养条件，或用营养上等同的组分或用于选择和恢复转基因事件的相似的过程来取代，这些仍将落在本发明范围内。

一旦接种了可转化的植物组织，就可转化组织中的植物细胞，并选择独立转化的植物细胞。独立转化株被称为转基因事件。尽管已经报道根瘤菌用于植物细胞转化仅用于烟草、拟南芥和水稻(Broothaerts等，2005)，但本领域已知用于很多单子叶植物和双子叶植物物种的土壤杆菌介导的转化和再生系统(例如Komari等，1998；Zhou等，1995；Hiei等，1994.Plant J.；6：271-282；Ishida等，1996；Rogers等，1987；Schrammeijer等，1990；美国专利第6,384,301)。在转化和再生后，鉴别转基因植物。最后，本领域技术人员会认识到，在表达盒稳定地掺入转基因植物并确证可操纵之后，可通过有性杂交将其导入其它植物。可使用多种标准育种技术中的任一种，这视待杂交的物种而定。

可随后分析所产生的转化株和其后代，以确定是否存在包含在转化载体上的特定目标核酸。分子分析可包括但不限于DNA印迹(Southern，1975)、PCR(聚合酶链反应)分析、酶活性分析、免疫诊断方法和田间评价等等(也参见例如Sambrook等，1989)。可实施这些和其它熟知的方法以确证通过所揭示的方法产生的转化植物的稳定性。

上述技术可适于任何植物，尤其可用于以下植物：例如紫花苜蓿、大麦、蚕豆、甜菜、椰菜、卷心菜、胡罗卜、油菜、花椰菜、芹菜、大白菜、玉米、棉花、黄瓜、干菜豆、茄子、茴香、四季豆、葫芦(gourd)、韭菜、莴苣、甜瓜、燕麦、秋葵、洋葱、豌豆、胡椒、西葫芦、花生、马铃薯、西葫芦、萝卜、水稻、高梁、大豆、菠菜、南瓜、甜玉米、糖甜菜、向日葵、番茄、西瓜和小麦。

实施例

本领域技术人员会认识到本发明提供的方法和组合物的很多优点。本申请包括以下实施例是为了证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该了解，以下实施例中揭示的技术代表本发明人发现的能很好实行本发明实施的技术，因此认为其构成了本发明的优选实施模式。然而，本领域技术人员根据本说明书应该了解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，在所揭示的具体实施方案中可进行很多变化，而仍可以获得同样或相似的结果。本文引用的所有参考资料以其补充、解释、提供背景或教导本文所用的方法、技术或组合物的范围在此引作参考。

实施例1

根瘤菌属和土壤杆菌属菌株

从ATCC(ATCC编号：BAA-100^TM，Lazo等，1991)获得根癌土壤杆菌AGL0。从美国威斯康星Madison的家庭花园野三叶草(weedclover)中分离了豌豆根瘤菌菌株Madison和草木樨中华根瘤菌SD630，并通过对用以下引物扩增16S rRNA的PCR产物测序得到了确证：5’GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’(Xd578；SEQ ID NO：1)和5’AAGGAGGTGATCCAGCCGCAG3’(Xd579；SEQ ID NO：2)。其它根瘤菌属菌株从USDA(美国农业部)的根瘤菌保藏中心获得(表1)。根瘤菌菌株在TY或MAG培养基中生长，土壤杆菌在LB培养基中生长。以下列出菌株，在分离的菌株中扩增的16s rRNA序列以SEQ ID No：24-30提供。

表1：土壤杆菌和根瘤菌菌株

实施例2

土壤杆菌转化

通过用冷去离子水和10％甘油洗涤LB培养基中的对数期培养物来制备土壤杆菌感受态细胞，并储存在-80℃。让50微升解冻的感受态细胞与1或2μl DNA在冰上混合，用BIO-RAD Gene

II设备(BIO-RAD，Hercules，CA)以200欧姆电阻、25μF电容和1.8kv在1mm间隙的电击杯中电穿孔

实施例3

构建具有抗生素选择标记基因的Ti质粒

为了在根瘤菌中选择Ti质粒，从相应的Ti质粒扩增同源序列并插入到卡那霉素抗性载体。该同源序列用于通过同源重组将卡那霉素抗性基因整合到Ti质粒中。

为了构建pTiBo542C质粒，用以下引物和Pfu聚合酶(STRATAGENE，La Jolla，CA)以PCR扩增来自AGL0土壤杆菌菌株的完整的virC基因(Genbank登录号AB027257)：5’ACAATAATGTGTGTTGTTAAGTCTTGTTGC3’(Xd683 SEQ IDNO：3)和5’CTCAAACCTACACTCAATATTTGGTGAG3’(Xd684SEQ ID NO：4)，并将其插入到TOPO克隆平端载体(Invitrogen Carlsbad，CA)，产生中间载体pMON67402。将该中间载体进一步与来自用PvuII/MscI消化的pCGN11206的trfA片段连接，由此产生构建体pMON96913(图6)。然后经过上述标准电穿孔将该载体导入AGL0土壤杆菌菌株，置于含50mg/l卡那霉素的LB培养基上以选择单交换事件。由于整合载体不能保留在AGL0细胞中，因此推测抗性菌落因通过同源重组载体整合到Ti质粒而产生。将得到的菌株命名为AGL0C。

同样地，为构建pTi542G质粒，用以下引物和Pfu聚合酶以PCR扩增来自AGL0土壤杆菌菌株的完整virG基因(Genbank登录号AB027257)：5’AGATCTGGCTCGCGGCGGACGCAC3’(Xd681；SEQID NO：5)和5’CGCTCGCGTCATTCTTTGCTGGAG3’(Xd682；SEQID NO：6)，并插入到pMON67402，产生构建体pMON96026(图8)。经过标准电穿孔将该载体导入AGL0菌株，置于含50mg/l卡那霉素的LB培养基上以选择单交换事件。将得到的菌株命名为AGL0G。

为了构建pTi4404kan辅助质粒，用以下引物和Pfu聚合酶以PCR扩增来自LBA4404的章鱼碱Ti质粒pAL4404(Genbank登录号NC_002377)的traI和trbCE区：5’TCAGCAGGATGACGCCGTTATCG3’(Xd695；SEQ ID NO：7)和5’TCTCGCCCGACCAATACCAACAC3’(Xd696；SEQ ID NO：8)(序列来自Genbank AF242881)，并插入到pMON67402。将该中间载体进一步与来自用PvuII/MscI消化的pCGN11206的trfA片段连接，由此产生构建体pMON96914(图7)。通过电穿孔将该质粒载体导入LBA4404，在含50mg/l卡那霉素的LB培养基上选择，以选择单交换事件。

在固体培养基上培养3天后，将kanR抗性菌落转移到含卡那霉素50mg/l的2ml液体LB培养基。根据厂商说明，用

Taq聚合酶(Stratagene)和以下引物直接扩增1毫升过夜培养物：5’GCTGACGGGCCCGGATGAATGTCAGCTACTG3’(Xd715；SEQ IDNO：9)和5’GCTCTAGAAATTGTAAGCGTTAATAATTCAGAAGAACTCGTC3’(Xd716；SEQ ID NO：10)，并确证卡那霉素抗性基因整合到Ti质粒中。将得到的菌株命名为4404TIK。

实施例4

从土壤杆菌提取Ti质粒

从分别含有相应质粒的修饰型土壤杆菌菌株AGL0C、AGL0G、4404TIK和ABI中提取修饰型Ti质粒-pTiBo542C、pTiBo542G、pTi4404kan和pTiC58(ABI)。将含卡那霉素50mg/l的LB中的5毫升过夜培养物离心，重悬浮在400μl P1缓冲液中，与400μl P2缓冲液混合，用400μl P3缓冲液(缓冲液来自QIAGEN maxi-prep试剂盒)中和。在室温孵育5分钟后，让该混合物以12g在4℃离心10分钟。让大约1200μl上清液与800μl异丙醇混合，在4℃离心10分钟。用70％乙醇洗涤沉淀一次，无需干燥重新悬浮于200μl TE中。随后将所述大质粒(megaplasmid)储存在4℃。

实施例5

根瘤菌感受态细胞和将修饰型Ti质粒导入根瘤菌

按照Garg等，1999加以改良，制备根瘤菌感受态细胞。简言之，从冷冻甘油原种中取一环根瘤菌(例如根瘤菌属)细胞使其在10ml TY肉汤中生长24小时，然后转移到500ml TY肉汤，在30℃剧烈振荡，使其生长到对数中期(OD₆₀₀＝0.4-0.6)。将培养物转移到2个250离心管中，在冰上冷却15-30分钟，于4℃以9,000rpm离心10分钟以收获细胞。用冷无菌去离子水和10％冷甘油洗涤细胞沉淀，重新悬浮于10％冷甘油中。以50μl/管等份均分细胞悬液，立即使用或立即在液氮中冷冻并储存于-80℃。

将修饰型Ti质粒电穿孔到根瘤菌菌株中：在冰上解冻50微升感受态细胞，与1或2μl已准备好的Ti质粒混合，在冰上保持30分钟。将该混合物转移到冷却的1mm缝隙的电穿孔电击杯。电穿孔参数(BIO-RAD Gene II)如下设置：2KV/400Ω电阻/25μF电容、或1.5KV/400Ω电阻/25μF电容、或1.5KV/800Ω电阻/10μF电容。电穿孔后，在加入1ml TY或MAG培养基之前让电击杯在冰上保持5-10分钟，转移到14-ml Falcon管中。于30℃培养该管3小时，在含50mg/l卡那霉素的TY或MAG固体培养基上涂平板，在30℃培养3天以恢复抗性菌落。

确证被Ti质粒转化了的根瘤菌：将卡那霉素抗性菌落转移到含50mg/l卡那霉素的3ml液体TY或MAG培养基并过夜培养。用

Taq聚合酶按照厂商说明(Stratagene)直接扩增1微升培养物。

为了检测根瘤菌菌株中的pTiBo542C或pTiBo542G，将virC引物5’ACAATAATGTGTGTTGTTAAGTCTTGTTGC3’(Xd683；SEQ IDNO：3)和5’CAATTGCATTTGGCTCTTAATTATCTGG3’(Xd684a；SEQ ID NO：11)或virG引物5’AGATCTGGCTCGCGGCGGACGCAC3’(Xd681；SEQ ID NO：5)和5’CGCTCGCGTCATTCTTTGCTGGAG3’(Xd682；SEQ ID NO：6)分别用于扩增2.35kb或1.2kb片段。

对于pTi4404kan质粒，使用引物5’GCATGCCCGATCGCGCTCAAGTAATC3’(Xd699；SEQ ID NO：12)和5’TCTAGGTCCCCCCGCGCCCATCG3’(Xd700；SEQ ID NO：13))扩增章鱼碱Ti质粒的1274bp的virD2编码序列；使用引物5’CCATGGATCTTTCTGGCAATGAGAAATC3’(Xd701；SEQ IDNO：14)和5’GTCAAAAGCTGTTGACGCTTTGGCTACG3’(Xd702：SEQ ID NO：15)扩增1602bp的virE2片段；使用引物5’ACGGGAGAGGCGGTGTTAGTTGC3’(Xd703；SEQ ID NO：16)和5’CGATAGCGACAATGCCGAGAACG3’(Xd704；SEQ ID NO：17)扩增大约0.9kb的virB1片段。

为了鉴别来自ABI菌株的pTiC58质粒，使用以下3对引物：5’ATGCCCGATCGAGCTCAAGTTATC3’(Xd685；SEQ ID NO：18)和5’TGAAAGGACACCTCTCCGTTGCTG3’(Xd686；SEQ ID NO：19)扩增1247bp的virD2片段；5’CCATGGATCCGAAGGCCGAAGGCAATG3’(Xd687；SEQ IDNO：20)和5’CTACAGACTGTTTACGGTTGGGC3’(Xd688；SEQ IDNO：21)扩增1670bp的virE2完整编码序列；5’GTGAGCAAAGCCGCTGCCATATC3’(Xd689；SEQ ID NO：22)和5’TAGAGCGTCTGCTTGGTTAAACC3’(Xd690；SEQ ID NO：23)扩增1102bp的部分repA片段。

实施例6

细菌生长用培养基

用本领域技术人员已知的标准方法，制备在用来开发转化植物的根瘤菌介导转化方案中根瘤菌生长所用的培养基。培养基配方如下：

TY培养基

每L

细菌用胰蛋白胨 5g/L

酵母抽提物 3g/L

CaCl_2·2H₂O 0.87g/L

pH7.0

对于固体TY培养基，在高压灭菌前加15g/l细菌用琼脂。

MAG培养基液体

(来自USDA根瘤菌保藏中心)

HEPES 1.3g/L

MES 1.1g/L

酵母抽提物 1g/L

L-阿拉伯糖 1g/L

葡萄糖酸钾 1g/L

KH₂PO₄ 0.22g/L

Na₂SO₄ 0.25g/L

KOH调pH6.6

高压灭菌并加入以下过滤除菌的储液：

NH₄Cl(16g/100ml) 2ml/l

FeCl₃(0.67g/100ml，FS) 1.0ml/l

CaCl₂(1.5g/100ml) 1.0ml/l

MgSO₄(18g/100ml) 1.0ml

NaMoO_4·2H₂O(1g/100ml) 1.0ml/l

NiCl_2·6H₂O(2.2g/100ml) 0.1ml/l

对于固体MAG培养基，在高压灭菌前加入15g/l细菌用琼脂。

LB培养基每升

细菌用胰蛋白胨 10g

细菌用酵母抽提物 5g

NaCl 10g

用氢氧化钠调pH到7.5

高压灭菌后，将培养基倒入培养板(25ml/板)

对于固体LB培养基，高压灭菌前加入15g/l细菌用琼脂。

AB极限培养基：

20x AB缓冲液：

K₂HPO₄ 60g/l

NaH₂PO₄ 20g/l

分别高压灭菌

20x AB盐(过滤除菌，避光保存)：

NH₄Cl 20g/l

MgSO_4·7H₂O 6g/l

KCl 3g/l

CaCl₂ 0.2g/l

FeSO_4·7H₂O 50mg/l

高压灭菌前pH到7

将50ml AB缓冲液和50ml AB盐与900ml蔗糖-水(终浓度为1升中蔗糖为0.5％)合并。

1x AB-TY诱导培养基：

葡萄糖 5g

20x AB缓冲液 50ml

20X AB盐储液 50ml

TY培养基 20ml

加无菌水到 1000ml

用100mM MES调pH5.4

加100μM乙酰丁香酮(存于DMSO中的1M储液；在细菌悬浮后加1μl储液/10ml培养基)

用于在根瘤菌中vir诱导的ATA培养基：

用阿拉伯糖和葡萄糖酸钾取代葡萄糖，改良AB-TY培养基得到ATA(AB极限培养基+TY+阿拉伯糖)培养基。在该培养基中几乎所有根瘤菌的生长率都加倍。在该培养基中细菌产生的多糖少得多，细菌沉淀更结实。

L-阿拉伯糖 1g/L

葡萄糖酸钾 1g/L

20x AB缓冲液 50ml

20x AB盐储液 50ml

TY培养基 20ml

加无菌水到 1000ml

100mM MES调pH5.4

细菌悬浮后加200μM乙酰丁香酮(存于DMSO中的1M储液)。

实施例7

用于修饰型根瘤菌菌株的作物转化载体

用本领域技术人员已知的标准分子技术构建根瘤菌属转化载体。采用质粒构建体pMON96033(图1；用于大豆和油菜转化)、pMON96036(图2；用于玉米转化)或pMON101316(图3；用于棉花转化)。三种构建体都含有pVS1复制起点以及GUS或GFP报告基因或GUS与GFP二者报告基因。通过电穿孔将重组质粒转移到各种修饰型根瘤菌菌株，通过限制酶消化小量制备的DNA得到了确证。

在构建质粒中使用的FMV CP4基因具有来自玄参花叶病毒(FMV)的启动子，其后接CP4syn基因，CP4syn基因是编码CP4EPSP合成酶的基因。参见美国专利第5,633,435号，其在此引作参考。当EPSP合成酶表达时，赋予植物细胞和由此形成的植株显著程度的草甘膦抗性。e35sGUS基因为β-葡糖苷酸酶基因，其通常位于e35S启动子之后，用作组织化学标记。FMV GUS基因为FMV启动子和GUS。NOS NPTII基因具有新霉素磷酸转移酶基因，其位于胭脂碱合成酶基因(NOS)启动子后面，赋予对卡那霉素的抗性。Act1 GFP基因具有来自水稻的肌动蛋白启动子和绿荧光蛋白基因，为筛选标记。e35s GFP基因为位于e35S启动子后面的绿荧光蛋白基因。让含有所用质粒的根瘤菌菌株的过夜培养物生长到对数期，然后稀释到最终光密度为0.3-0.6。

实施例8

根瘤菌介导的大豆转化

用Martinell等所述的器官形成方法(美国专利第7,002,058号)并加以改良来实施转化。通过电穿孔将含有GUS和CP4基因的pMON96033转移到各种修饰型根瘤菌菌株(例如根瘤菌(Rhizobium sp.)、中间根瘤菌(Mesorhizobium sp.)、中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.))。让单菌落在含50mg/l壮观霉素和50mg/l卡那霉素的MAG或TY培养基上恢复，接种到30℃ 200rpm的振荡器中的具同样选择的20-50ml液体TY培养基中。通过限制酶消化从10ml培养物小量制备的质粒证实了根瘤菌培养物中质粒的存在。剩下的液体培养物与甘油混合到终浓度20％，等分并储存于-80℃作为种子培养物。

为制备根瘤菌接种物，将0.25-1ml冷冻种子培养物接种于具有与上述相同的抗生素选择的250ml或500ml TY培养基中，在28℃以200rpm振荡生长过夜到对数生长期中期。将培养物离心，以OD₆₆₀约0.3的浓度直接悬浮于接种培养基(INO培养基)。

经诱导的根瘤菌培养物也用于大豆转化。为了诱导根瘤菌，将过夜培养物以OD₆₆₀约0.3的浓度重新悬浮于AB-TY培养基，加入乙酰丁香酮到终浓度100μM。在28℃让该培养物进一步振荡过夜，离心并重新悬浮于接种培养基(INO培养基)到OD₆₆₀约0.3的浓度。

将大豆栽培变种A3525(美国专利第7,002,058号)用于根瘤菌介导的转化。对所述方法如下改良以用于根瘤菌介导的转化。让大豆种子在室温于BGM培养基中萌发，由机器切下来自大豆成熟种子的分生组织外植体(美国申请第20050005321号)。PLANTCON lid中的大豆分生组织外植体与悬浮于INO培养基中的根瘤菌混合，在W-113超声仪(Honda Electronics Co.，Ltd，Aichi，Japan)中进行超声处理。超声处理后外植体在同一个PLANTCON中于23℃以16/8小时的光照-黑暗光周期共培养1-11天。然后将外植体转移到含有75μM草甘膦的WPM选择培养基表面。2周后将外植体再次转移到75μM草甘膦固体WPM培养基。接种6-10周后具完全伸展开的三叶苗恢复了，并在含有0.1mg/l IAA和25μM草甘膦选择的BRM培养基(任选含杀真菌剂)中生根。将生根的小植株转移到温室中让其成熟。

表2：用于大豆转化的培养基组分

将二元载体pMON96033转移到根瘤菌菌株中并与大豆分生组织外植体共培养，观察到GUS阳性结果(表3和图4)。GUS活性的小蓝色斑点证明了所示草木樨中华根瘤菌、费氏中华根瘤菌、百脉根根瘤菌和1种豌豆根瘤菌的T-DNA递送到了大豆外植体中。从用各种菌株进行的根瘤菌介导的转化实验获得了转基因大豆植株(表4)。通过转基因拷贝数测定证实了这些大豆植株的转基因特性，其中大部分转化株显示1-2拷贝的简单整合模式(表5)。

表3：在大豆分生组织外植体中采用根瘤菌介导的T-DNA转移的gus基因的瞬间表达^＊

菌株	来源	瞬间GUS测定
菌株	来源	瞬间GUS测定	RL4404	豌豆根瘤菌菌株Madison+pAL4404	+
2370LBA	豌豆根瘤菌菌株USDA2370+pTiBo542C	+	RL4404	豌豆根瘤菌菌株Madison+pAL4404	+
2370LBA	豌豆根瘤菌菌株USDA2370+pTiBo542C	+	2370G	豌豆根瘤菌菌株USDA2370+pTiBo542G	+
SF4404	费氏中华根瘤菌USDA205+pAL4404	+	2370G	豌豆根瘤菌菌株USDA2370+pTiBo542G	+
SF4404	费氏中华根瘤菌USDA205+pAL4404	+	SF542C	费氏中华根瘤菌USDA205+pTiBo542C	+
SM542C	百脉根根瘤菌USDA3471+pAL4404	+	SF542C	费氏中华根瘤菌USDA205+pTiBo542C	+
SM542C	百脉根根瘤菌USDA3471+pAL4404	+	ML4404	百脉根根瘤菌USDA3471+pAL4404	+
ML542G	百脉根根瘤菌USDA3471+pTiBo542G	+	ML4404	百脉根根瘤菌USDA3471+pAL4404	+

^*共培养时期4天后实施瞬时测定

表4：根瘤菌介导的大豆转化概述

菌株	大豆外植体	生根植株	TF
菌株	大豆外植体	生根植株	TF	RL 4404	3705	2	0.05％
SF 4404	5553	2	0.04％	RL 4404	3705	2	0.05％
SF 4404	5553	2	0.04％	SM 542C	2555	1	0.04％

表5：来自根瘤菌介导转化的转基因植物的拷贝数测定^＊

NOS拷贝	RL4404	SF4404	SM542C
NOS拷贝	RL4404	SF4404	SM542C	0拷贝	0	0	1
1-2拷贝	1	2	0	0拷贝	0	0	1
1-2拷贝	1	2	0	>2拷贝	0	0	0
植株总数	1	2	1	>2拷贝	0	0	0

^*通过INVADER法(Third Wave Technologies，Madison，WI)用nos探针来分析拷贝数并与内部基因组对照比较。

为了测试gus转基因是否被传递到种子后代，用GUS溶液对源自根瘤菌介导转化的2个大豆转基因株系的种子进行染色(图5)。通过INVADER法测定，发现GM_A9196D株系有1个连接的nos基因的拷贝。在吸涨并除掉种皮后，通过组织化学染色测定了来自该株系的12粒R1种子的GUS，9粒为GUS阳性，说明对1个拷贝插入来说分离比率为3:1。

实施例9

根瘤菌介导的油菜转化

A.根瘤菌接种物制备：

使用含pMON96033的根瘤菌菌株进行油菜转化。将来自甘油原种的含载体根瘤菌菌株接种到50ml Falcon试管中含50mg/l卡那霉素和50mg/l壮观霉素的10ml TY培养基，在28℃以200rpm振荡过夜。通过离心沉淀过夜的根瘤菌培养物，并重新悬浮于MG/L液体培养基(MG/L肉汤：甘露醇5g/l、L-谷氨酸1g/l、KH₂PO₄ 250mg/l、NaCl 100mg/l、MgSO₄·7H2O 100mg/l、生物素1μg/l、酵母抽提物2.5g/l、pH7.0)。OD₆₀₀在0.05-0.1之间。

B.油菜外植体制备和共培养：

按照美国专利第5,750,871号和Radke等，1992进行油菜转化。将约0.25g油菜种子栽培变种Ebony转移到1.5-ml Eppendorf管中，用95％乙醇润湿。为了给种子消毒，加入1ml的1％次氯酸钠溶液30分钟。用蒸馏水替换该漂白液，将种子漂洗若干次。将种子播撒到1/10MS萌发培养基中，在Percival培养箱中于24℃保持16小时光照周期。

种子萌发培养基(1/10MS培养基)：1/10X MS极限有机物培养基(Gibco BRL；最终蔗糖0.3％)、吡哆醇50μg/l、烟酸50μg/l、甘氨酸200μg/l、PHYTAGR(Gibco Invitrogen)6g/l、pH5.8；20)。将来自7-14日龄培养物的黄化幼苗用作外植体来源。

以1x10⁸个细菌/ml接种外植体。撤走根瘤菌悬液，将已接种的外植体置于共培养平板上的滤纸上面，在连续光照中于24℃孵育约2天。测定共培养外植体的gus表达，发现含有表明油菜细胞转化的蓝色斑点(图9)。

共培养基(MS-1)：MS盐(Caisson Laboratories，Logan，UT)、肌醇100mg/l、硫胺-HCl1.3mg/l、KH₂PO₄200mg/l、2，4-D1mg/l、蔗糖3％、PHYTAGAR(Gibco Invitrogen)7g/l、pH5.8。

C.愈伤组织诱导：

将经共培养的外植体转移到愈伤组织诱导(B5-1)培养基。以～100μE/m²/s连续光照于24℃6天。来自百脉根根瘤菌、豌豆根瘤菌、费氏中华根瘤菌和草木樨中华根瘤菌的5个菌株显示基因有效转移到油菜外植体中，且gus阳性外植体的频率介于21％-73％之间(图10)。

愈伤组织诱导培养基(B5-1)：Gamborg’s B5盐(Caisson Labs)、B5维生素(1mg/l烟酸、1mg/l吡哆醇-HCl、10mg/l硫胺-HCl)、100mg/l肌醇、1mg/l 2，4-D、蔗糖3％、最终效价调整到325mg/l的羧苄青霉素(PhytoTechnology，Shawnee Mission，KS)、50mg/l特美汀(Timentin)、7g/l PHYTAGAR(Gibco Invitrogen)、pH5.8。

D.苗再生和选择：

将具有愈伤组织的外植体转移到含AgNO₃的苗再生培养基(B5BZ)，在24℃以100μE/m²/s连续光照孵育14天。接着将外植体转移到不含AgNO₃的苗再生培养基(B5BZ)。约每2周收获再生自经草甘膦选择的愈伤组织的苗。显示gus表达的早期苗实例示于图11中。

含硝酸银的苗再生培养基(B5BZ+3Ag)：Gamborg’s B5盐(CaissonLabs)、B5维生素(1mg/l烟酸、1mg/l吡哆醇-HCl、10mg/l硫胺-HCl)、100mg/l肌醇、BAP 3mg/l(Sigma)、玉米素1mg/l(Sigma)、AgNO₃ 3mg/l(Sigma)、45mg/l草甘膦(Monsanto，96.5％干燥酸)、蔗糖1％、最终效价调整到325mg/l的羧苄青霉素(PhytoTechnology)、50mg/l特美汀、PHYTAGAR(Gibco Invitrogen)7mg/l、pH5.8。

苗再生培养基(B5BZ)：Gamborg’s B5盐(Caisson Labs)、B5维生素(1mg/l烟酸、1mg/l吡哆醇-HCl、10mg/l硫胺-HCl)、100mg/l肌醇、BAP3mg/l(Sigma)，玉米素1mg/l(Sigma)、45mg/l草甘膦、蔗糖1％、最终效价调整到325mg/l的羧苄青霉素(PhytoTechnology)、特美汀50mg/l、PHYTAGAR(Gibco Invitrogen)7mg/l、pH5.8。

E.苗收获：

将至少0.5cm长的绿色苗修整以分离主茎。将修整的苗置于苗收获培养基(B5-0)。2周后将苗转移到生根培养基。

苗收获培养基(B5-0)：Gamborg’s B5盐(Caisson Labs)、B5维生素(1mg/l烟酸、1mg/l吡哆醇-HCl、10mg/l硫胺-HCl)、100mg/l肌醇、最终效价调整到195mg/l的羧苄青霉素(PhytoTechnology)、蔗糖1％、PHYTAGAR(Gibco Invitrogen)6g/l、pH5.8。

F.苗生长和生根：

将绿色苗转移到生根培养基(B5-0+2IBA)。将苗保持在生根培养基上直到其形成根。苗于24℃以～100uE/m²/s的16小时光照/天下保持。

生根培养基(B5-0+2IBA)：Gamborg’s B5盐(Caisson Labs)、B5维生素(1mg/l烟酸、1mg/l吡哆醇-HCl、10mg/l硫胺-HCl)、100mg/l肌醇、IBA 2mg/l(吲哚-3-丁酸，Sigma)、150mg/l头孢噻肟(PhytoTechnology)、蔗糖1％、PHYTAGAR(Gibco Invitrogen)6g/l、pH5.8。

G.转基因检测和转化频率：

从温室生长的油菜植株提取总基因组DNA，用单一切点酶BglII消化，与DIG-标记的CP4探针杂交。确证了4个株系为转基因(图11)。转化频率在表6中概述。

表6：用根瘤菌菌株的油菜转化频率(TF)

菌株	外植体	GUS/CP4阳性	TF
菌株	外植体	GUS/CP4阳性	TF	RL 2370G	150	2	1.33
SF 542	120	1	0.83	RL 2370G	150	2	1.33
SF 542	120	1	0.83	SM 542C	120	1	0.83

实施例10

通过胚胎形成的根瘤菌介导棉花转化

A.根瘤菌接种物制备：

将pMON101316电穿孔到根瘤菌菌株中，通过限制酶消化小量制备的DNA得到了证实并储存于-80℃。将来自甘油原种的含载体根瘤菌菌株接种到于50ml Falcon试管内的10ml含卡那霉素(50mg/l)和壮观霉素(50mg/l)的TY培养基中，于28℃以200rpm振荡过夜。通过离心沉淀过夜的根瘤菌培养物，重新悬浮于20ml的MS0液体培养基中，再次离心。将沉淀重新悬浮于20ml的MS0培养基中。用MS0稀释洗涤过的根瘤菌到OD₆₆₀约1.0用于接种。

B.外植体制备：

基本上按照美国公开说明书第2004087030号进行棉花转化。在幼苗萌发后7天，从暗Percival培养箱取出来自栽培变种Coker的黄化棉花幼苗。收获来自PHYTATRAY的胚轴，置于含有无菌MSO的无菌培养皿中以防止组织枯萎。将胚轴切为小外植体。

C.接种和共培养：

用无菌镊子将外植体转移到无菌培养皿中，加入根瘤菌接种物。将外植体留在无菌罩中20分钟，旋涡振荡以确保所有外植体与根瘤菌接种物很好地接触。然后吸出根瘤菌接种物溶液，用无菌滤纸轻轻吸干外植体。将接种过的胚轴块置于培养平板上。用塑料袋盖上的外植体平板在设置为约22-24℃、10小时光照/14小时黑暗的光周期的Percival培养箱中共培养2天。

D.通过胚胎形成的稳定转化：

接种后2天用X-gluc染色棉花外植体块，以检测GUS瞬间表达(图12)。胚轴中的蓝色斑点指示gus基因表达和棉花细胞转化。为了获得稳定转化的植物，将胚轴外植体转移到含有UMSEL1629选择培养基(含有合适选择剂)的平板中。然后用PARAFILM覆盖该平板，在28℃以16/8小时(日/夜)光周期培养。

4周后在选择培养基上通过X-Gluc染色确证了稳定转化的愈伤组织的gus表达(图13)。在初次转移到选择培养基4周后，将所有胚轴转移到UMSEL 1788培养基，用PARAFILM覆盖，培养7天。然后将外植体转移回UMSEL1629于28℃以16/8小时(日/夜)光周期培养4周。

在第二次转移到UMSEL1629上后大约4周，这要视愈伤组织的生长速率而定，让愈伤组织块恢复并转移到UMO平板。然后标记单个平板，用PARAFILM覆盖，在28℃连续黑暗中培养。

在愈伤组织位于UMO上后6-8周，让愈伤组织在新鲜UMO培养基上传代培养，于28℃连续黑暗中培养。在UMO上6-10周后，准备从UMO上的独立愈伤组织株系收获胚胎发生性愈伤组织(EC)，并转移到TRP+培养基。大约3个月内每3-5周将TRP+平板上的活跃生长的组织和小胚转移到新鲜TRP+培养基中，并在28℃以连续黑暗培养。将胚转移到培养皿中的SHSU培养基，用PARAFILM覆盖。使平板在Percival中于28℃以16/8(日/夜)光照周期且用最大光照(架上的光和侧光)培养。胚可在相同的培养基上传代培养一次以上直到发芽。恢复的小植株在Percival或温室中于28℃以16/8(日/夜)光周期培养。

E.源自根瘤菌介导转化的棉花愈伤组织的转基因特性的分子分析：

从愈伤组织提取基因组DNA，用单一切点酶BamHI消化，在1％琼脂糖凝胶中分级分离，转移到Hybond^TM膜(例如Appligen-Oncor，Illkirch，France；或Amersham-Pharmacia Biotech)上。用DIG标记的gus探针来检测作为转化指示的转基因是否存在。发现源自用Ti辅助质粒j进行的苜蓿中华根瘤菌(S.meliloti)、费氏中华根瘤菌和豌豆根瘤菌转化的6个棉花愈伤组织株系含有gus基因(图14)。

F.用于棉花培养的培养基：

1 L UMSEL的配方-4.33g MS盐、2ml 500X B5维生素、0.1ml2，4-D(1mg/ml)、1ml激动素(0.5mg/ml)、30g葡萄糖、pH5.8、2.5gPHYTAGEL、1.7ml羧苄青霉素(250mg/ml)、1ml头孢噻肟(100mg/ml)、加选择剂：卡那霉素40mg/L终浓度。在高压灭菌后加入羧苄青霉素、头孢噻肟和选择剂。

1 L UMSEL1788的配方：-4.33g MS盐、2ml 500X B5维生素、0.1ml 2，4-D(1mg/ml)、1ml激动素(0.5mg/ml)、30g葡萄糖、pH5.8、2.5g PHYTAGEL、1.7ml(250mg/ml)羧苄青霉素、1ml(100mg/ml)头孢噻肟、加选择剂：卡那霉素40mg/L终浓度和0.1g蔗糖溶于100ml水中。在高压灭菌后加入羧苄青霉素、头孢噻肟和选择剂。

1 L UMSEL1629的配方：-4.33g MS盐、2ml500X B5维生素、0.1ml2，4-D(1mg/ml)、1ml激动素(0.5mg/ml)、30g葡萄糖、pH5.8、2.5g PHYTAGEL、1.7ml(250mg/ml)羧苄青霉素、1ml(100mg/ml)头孢噻肟、加选择剂：卡那霉素40mg/L终浓度。在高压灭菌后加入羧苄青霉素、头孢噻肟和选择剂。

1 L UMO的配方-4.33g MS盐、2ml 500X B5维生素、30g葡萄糖、pH5.8、3.5g GELRITE、1.7ml(250mg/ml)羧苄青霉素、1ml(100mg/ml)头孢噻肟、100mg/l抗坏血酸、加选择剂：卡那霉素50mg/L终浓度。

1 L TRP+的配方-4.33g/l MS盐、2ml 500X B5维生素、1.9g/lKNO₃、30g/l葡萄糖、0.1g/l酪蛋白水解物、3.5g GELRITE、pH5.8。

1 L SHSU的配方-100ml Stewart & Hsu Majors(10x)、10mlStewart & Hsu Minors(100x)、1.5ml铁(100x)、10ml Stewart & HsuOrgranics(100x)、5g葡萄糖、50mg/l benlate、2.2g GELRITE、pH6.8(Stewart & Hsu，1977)。

实施例11

根瘤菌介导的玉米转化

A.根瘤菌接种物制备和培养基组成：

将含有CP4、GUS和gfp表达盒的pMON96036用于玉米转化。将载体电穿孔到各种修饰型根瘤菌菌株中，得到了证实并储存于-80℃。将含载体根瘤菌的甘油原种在添加抗生素(卡那霉素40mg/L和壮观霉素31mg/L)的固体TY培养基上划线，在28℃孵育2天。

在将根瘤菌接种玉米未成熟胚之前2天，从根瘤菌培养平板取一环细胞接种到250mL培养瓶内的25mL添加62mg/L壮观霉素和40mg/L卡那霉素的液体TY培养基中。将培养瓶置于振荡器上以大约150-200rpm和27-28℃过夜。然后用同样的液体培养基稀释(1比5)根瘤菌培养物，放回到振荡器中。几小时后，在接种之前1天，以3500rpm将根瘤菌细胞离心15分钟。将细菌细胞沉淀重新悬浮于含200μM乙酰丁香酮和50mg/L壮观霉素和25mg/L卡那霉素的AB-TY或ATA诱导肉汤中，将细胞密度调整到OD₆₆₀为0.2。然后将细菌细胞培养物(每一250mL培养瓶中50mL)放回振荡器中并过夜生长。在接种当天早上，将细菌细胞离心，用添加200μM乙酰丁香酮的液体1/2MS VI培养基(美国公开说明书第20040244075号)洗涤。让该细菌培养物离心，将细胞沉淀重新悬浮于含200μM乙酰丁香酮的1/2MS PL培养基(美国公开说明书第20040244075号)，将细胞密度调整到OD₆₆₀为1.0用于接种。试剂可市购并可购自多家供应商(参见例如Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)。

B.玉米胚分离和根瘤菌共培养：

为了进行根瘤菌介导的转化，将含有玉米(Zea mays)未成熟胚的花穗分离，并通过细菌共培养转化，除了未成熟胚分离自表面消毒的花穗并直接置于已制备的根瘤菌细胞悬液中之外，其大体如Cai等(美国专利申请公开说明书第20040244075号)所述。在除掉根瘤菌细胞悬液后，将未成熟胚转移到共培养培养基(美国公开说明书第20040244075号)。

为了调查GFP瞬间表达，将共培养的玉米胚直接置于荧光显微镜下用于观察GFP。或者，在共培养后将10个随机挑选的胚转移到1.5ml Eppendorf管中，用X-gluc溶液在37℃染色过夜以检查gus瞬间表达。图15代表与用根癌土壤杆菌菌株ABI转化相比较，采用用ATA诱导培养基的用豌豆根瘤菌、百脉根根瘤菌、费氏中华根瘤菌和草木樨中华根瘤菌的5种根瘤菌菌株转化，的玉米未成熟胚的GUS瞬间表达。

注意到用于土壤杆菌生长和诱导的常规AB极限培养基不能有效支持根瘤菌生长。根瘤菌接种物在没有任何选择的AB极限培养基中于28℃以220rpm振荡1周后并未显示出显著生长。在AB极限培养基包含20ml TY培养基显著改善根瘤菌生长速率；同时用ATA培养基中的L-阿拉伯糖和葡萄糖酸钾取代AB-TY培养基中的葡萄糖减少多糖产生，导致沉淀更紧密。诱导培养基中碳源的改变显著改进玉米中根瘤菌菌株的gus瞬间表达。

C.愈伤组织诱导和转基因植株再生：

在共培养后，基本上如美国公开说明书第20040244075号所述且适当地改良选择条件继续进行转化。将胚转移到改良的添加250mg/L羧苄青霉素和0.1mM草甘膦的MS培养基(美国公开说明书第20040244075号)中。在该阶段，由瞬时测定中所用的百脉根根瘤菌、费氏中华根瘤菌和草木樨中华根瘤菌菌株观察到具gfp表达的稳定转化的愈伤组织(图16)。代表性转化频率示于表7中。

表7：用不同根瘤菌菌株的玉米转化频率

D.源自根瘤菌介导转化的转基因植株的分子分析：

从温室生长的玉米植株中分离总基因组DNA，用单一切点酶BamHI消化以评估转基因拷贝数。用DIG标记的gus探针与基因组DNA杂交。除了1株外所有株系的推定的转化组织的转基因特性都得到确证(图17)。

E.转基因玉米植株中转基因的品系转移：

让开花的转基因玉米植株自花授精或与用于转化的玉米基因型的亲本株系(LH244株系)异型杂交。为了gus染色让干种子于水中吸水1天，或为了gfp计数吸水2天。在转基因R1种子中确证了gus或gfp的表达和分离(表8)。

表8：在转基因玉米R1种子中的转基因表达

转基因株系	种子#	GFP+种子/检测的种子	Gus+种子/检测的种子	根瘤菌菌株
转基因株系	种子#	GFP+种子/检测的种子	Gus+种子/检测的种子	根瘤菌菌株	ZM_A8232	112	9/20	6/7	ML542G
ZM_A8232/LH244	112	4/20		ML542G	ZM_A8232	112	9/20	6/7	ML542G
ZM_A8232/LH244	112	4/20		ML542G	ZM_A8234	48	0/10	0/20	ML542G
ZM_A8246	133	12/20	5/5	ML542G	ZM_A8234	48	0/10	0/20	ML542G
ZM_A8246	133	12/20	5/5	ML542G	ZM_A8247	148	4/20	1/3	SF4404
LH244/ZM_A8247	150		13/20	SF4404	ZM_A8247	148	4/20	1/3	SF4404
LH244/ZM_A8247	150		13/20	SF4404	ZM_A8248	75	0/20	4/6	SF4404
LH244/ZM_A8249	104		13/20	SF4404	ZM_A8248	75	0/20	4/6	SF4404
LH244/ZM_A8249	104		13/20	SF4404	LH244/ZM_A8249	275		9/20	SF4404
LH244/ZM_A8251	148		7/20	SF4404	LH244/ZM_A8249	275		9/20	SF4404
LH244/ZM_A8251	148		7/20	SF4404	LH244/ZM_A8251	123		5/20	SF4404
LH244/ZM_A8251	108		4/20	SF4404	LH244/ZM_A8251	123		5/20	SF4404
LH244/ZM_A8251	108		4/20	SF4404	ZM_A8252	137	9/20	4/6	SF4404
ZM_A8255	78	10/20		SM542C	ZM_A8252	137	9/20	4/6	SF4404
ZM_A8255	78	10/20		SM542C	LH244/ZM_A8245	31		2/10	ML542G
LH244/ZM_A8253	138		10/20	SF542C	LH244/ZM_A8245	31		2/10	ML542G
LH244/ZM_A8253	138		10/20	SF542C	LH244/ZM_A8253	67		5/20	SF542C
LH244/ZM_A8254	72		8/20	SF542C	LH244/ZM_A8253	67		5/20	SF542C
LH244/ZM_A8254	72		8/20	SF542C	LH244/ZM_A8254	100		6/20	SF542C
					LH244/ZM_A8254	100		6/20	SF542C
					LH244/ZM_A8235	81		12/20	ABI
LH244/ZM_A8235	116		13/20	ABI	LH244/ZM_A8235	81		12/20	ABI
LH244/ZM_A8235	116		13/20	ABI	LH244/ZM_A8235	161		8/20	ABI
ZM_A8237/LH244	294	7/20	5/7	ABI	LH244/ZM_A8235	161		8/20	ABI
ZM_A8237/LH244	294	7/20	5/7	ABI	ZM_A8244/LH244	250	4/20		ABI
ZM_A8240	14		3/4	ABI	ZM_A8244/LH244	250	4/20		ABI
ZM_A8240	14		3/4	ABI	ZM_A8240/LH244	86	7/20		ABI
ZM_A8238	31		10/10	ABI	ZM_A8240/LH244	86	7/20		ABI
ZM_A8238	31		10/10	ABI	LH244/ZM_A8238	90		10/20	ABI
ZM_A8256	53	3/10		ABI	LH244/ZM_A8238	90		10/20	ABI
ZM_A8256	53	3/10		ABI	LH244/ZM_A8256	55		8/20	ABI

实施例12

通过接合转移系统的根瘤菌介导的作物转化

在根瘤菌属和近缘物种中oriT-依赖性质粒接合转移系统也可用于将目标基因(GOI)递送到植物细胞中，并随后整合到植物基因组。同源或异源接合转移系统可用于该基因转移。然后可用选择标记通过已建立的组织培养系统来再生转基因植株。根瘤菌菌株其中可包括中华根瘤菌、百脉根根瘤菌、豌豆根瘤菌和根瘤菌NGR234。

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序列表

<110>YE，XUDONG

SHEN，JUNJIANG

WILLIAMS，EDWARD

<120>非土壤杆菌属细菌物种用于植物转化的用途

<130>MONS：100US

<140>UNKNOWN

<141>2007-05-16

<150>60/800,872

<151>2006-05-16

<160>30

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>21

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<213>人工序列

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<223>人工序列的描述：合成引物

<400>1

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<223>人工序列的描述：合成引物

<400>23

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<211>1490

<212>DNA

<213>A.tumefaciens

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<210>25

<211>1366

<212>DNA

<213>Rhizobium leguminosarum

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<211>1323

<212>DNA

<213>Rhizobium leguminosarum

<400>26

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<211>1341

<212>DNA

<213>Rhizobium leguminosarum

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<212>DNA

<213>Mesorhizobium loti

<400>28

<210>29

<211>1339

<212>DNA

<213>S.Fredii

<400>29

<210>30

<211>1368

<212>DNA

<213>Bradyrhizobium sp.

<400>30

Claims

1.用于转化植物细胞的方法，该方法包括：

(a)让至少第一植物细胞与非土壤杆菌(Agrobacterium sp.)的细菌接触，所述细菌包含：(i)包含Ti质粒vir基因区的第一核酸，其中所述vir基因区用于以VirD2依赖方式将目标核酸导入所述植物细胞；和(ii)包含可操作地连接目标核酸的一个或多个T-DNA边界序列的第二核酸；和

(b)选择被目标核酸转化的至少第一植物细胞，其中所述植物细胞为大豆、油菜、玉米或棉花植物细胞。

2.用于转化植物细胞的方法，该方法包括：

(a)使至少第一植物细胞与非土壤杆菌的细菌接触，所述细菌包含：(i)为不依赖VirD2功能的DNA序列接合转移所需的第一核酸，和(ii)包含目标核酸的第二核酸；其中所述植物细胞为大豆、油菜、玉米或棉花植物细胞，其中由接合转移所需核酸编码的多肽起着将所述目标核酸转移到所述植物细胞中的作用；和

(b)选择被所述目标核酸转化的至少第一植物细胞。

3.权利要求2的方法，其中所述接合转移为traA、traI或mobA依赖性的。

4.权利要求2的方法，其中所述第一核酸包含oriT。

5.权利要求2的方法，其中所述第一核酸缺乏左T-DNA边界序列和/或右T-DNA边界序列。

6.权利要求1或2的方法，其中所述细菌为根瘤菌细胞。

7.权利要求6的方法，其中所述根瘤菌细胞在与所述植物细胞接触之前，在乙酰丁香酮或诱导vir基因功能的其它化合物存在下生长。

8.权利要求6的方法，其中所述根瘤菌细胞选自：根瘤菌(Rhizobium spp.)、中华根瘤菌(Sinorhizobium spp.)、中间根瘤菌(Mesorhizobium spp.)、叶杆菌(Phyllobacterium spp.)、苍白杆菌(Ochrobactrum spp.)和慢生根瘤菌(Bradyrhizobium spp.)。

9.权利要求8的方法，其中所述根瘤菌细胞为豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)。

10.权利要求9的方法，其中所述根瘤菌细胞为豌豆根瘤菌三叶草生物变异型(R.leguminosarum bv.trifolii)、豌豆根瘤菌菜豆生物变异型(R.leguminosarum bv.phaseoli)或豌豆根瘤菌蚕豆生物变异型(Rhizobium leguminosarum.bv.viciae)。

11.权利要求1或2的方法，其中所述植物细胞包含在来自植物种子、幼苗、愈伤组织、细胞悬液、子叶、分生组织、叶、根或茎的外植体中；并且让所述外植体与所述细菌接触。

12.权利要求11的方法，其中所述外植体包括胚分生组织；愈伤组织；细胞悬液；子叶；或来自叶、根或茎的组织。

13.权利要求2的方法，其中所述不依赖VirD2功能的接合转移所需要的核酸通过电穿孔导入所述细菌中。

14.权利要求1或2的方法，其中所述第一核酸和第二核酸通过电穿孔导入所述细菌中。

15.权利要求1或2的方法，其中选择被所述目标核酸转化的植物细胞在缺乏选择剂时进行。

16.权利要求1或2的方法，其中选择被所述目标核酸转化的植物细胞包括在选择剂存在下培养所述植物细胞，其中所述目标核酸赋予对所述选择剂的耐性，或可操作地连接另外的赋予对所述选择剂耐性的核酸。

17.权利要求16的方法，其中所述选择剂为草甘膦、卡那霉素、双丙氨膦或麦草畏。

18.权利要求17的方法，其中所述目标核酸或另外的核酸编码EPSP合酶。

19.权利要求18的方法，其中所述EPSP合酶蛋白为CP4。

20.权利要求16的方法，其中所述选择剂为草甘膦。

21.权利要求1或2的方法，其中所述目标核酸物理上不与选择标记基因连接。

22.权利要求21的方法，其中所述标记基因和所述目标核酸在由被所述目标核酸转化的植物细胞再生的植株的后代中遗传分离。

23.权利要求1或2的方法，其中所述细菌包含至少第三核酸，所述第三核酸包含另外的目标核酸，其中所述植物细胞用所述第三核酸转化。

24.权利要求1或2的方法，其进一步包括从所述植物细胞再生植株，其中所述植株包含所述目标核酸。

25.权利要求24的方法，其中从所述植物细胞再生植株包括诱导从包含所述植物细胞的外植体形成一株或多株苗，并将至少第一苗培养为可育的全株。

26.权利要求24的方法，其中再生通过器官形成发生。

27.权利要求24的方法，其中所述植物或植株选自：玉米植物或植株、棉花植物或植株、大豆植物或植株和油菜植物或植株。

28.选自以下的根瘤菌细胞：根瘤菌(Rhizobium sp.)、中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)、中间根瘤菌、叶杆菌、苍白杆菌和慢生根瘤菌，所述细胞包含：(i)包含Ti质粒的vir基因区的第一核酸，其中所述vir基因区用来以VirD2依赖方式将编码目标序列的核酸导入植物细胞；和(ii)包含可操作地连接编码目标序列的核酸的一个或多个T-DNA边界序列的第二核酸。

29.权利要求28的根瘤菌，其进一步限定为包含选择标记。

30.权利要求28的根瘤菌，其中所述根瘤菌细胞选自：根瘤菌(Rhizobium sp.)、根瘤菌NGR234(Rhizobium sp.NGR234)、豌豆根瘤菌(R.leguminosarum)Madison、豌豆根瘤菌USDA2370、豌豆根瘤菌三叶草生物变异型USDA2408、豌豆根瘤菌菜豆生物变异型USDA2668、豌豆根瘤菌2370G、豌豆根瘤菌2370LBA、豌豆根瘤菌2048G、豌豆根瘤菌2048LBA、豌豆根瘤菌菜豆生物变异型、豌豆根瘤菌菜豆生物变异型2668G、豌豆根瘤菌菜豆生物变异型2668LBA、豌豆根瘤菌RL542C、豌豆根瘤菌蚕豆生物变异型、豌豆根瘤菌三叶草生物变异型、埃特里根瘤菌(Rhizobium etli)USDA9032、埃特里根瘤菌菜豆生物变异型(Rhizobium etli bv.phaseoli)、热带根瘤菌(Rhizobiumtropici)、中间根瘤菌、百脉根根瘤菌(Mesorhizobium loti)ML542G、百脉根根瘤菌ML4404、中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)、草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)SD630、草木樨中华根瘤菌USDA1002、费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)USDA205、费氏中华根瘤菌SF542G、费氏中华根瘤菌SF4404、费氏中华根瘤菌SM542C、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)USDA6和大豆慢生根瘤菌USDA110。

31.权利要求30的根瘤菌细胞，其中所述细胞为豌豆根瘤菌细胞。

32.权利要求31的根瘤菌细胞，其中所述细胞为豌豆根瘤菌三叶草生物变异型、豌豆根瘤菌菜豆生物变异型或豌豆根瘤菌蚕豆生物变异型的细胞。

33.能够用于从根瘤菌进行不依赖virD2转移并缺乏T-DNA边界序列的DNA构建体，所述构建体包含可操作地连接目标核酸的oriT序列。

34.权利要求33的DNA构建体，其进一步包含traA或mob序列。

35.用权利要求33的DNA构建体转化的根瘤菌细胞，其中所述根瘤菌选自：根瘤菌(Rhizobium spp.)、中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)、中间根瘤菌、叶杆菌、苍白杆菌和慢生根瘤菌(Bradyrhizobium spp.)。

36.权利要求35的根瘤菌细胞，其中所述根瘤菌细胞选自：根瘤菌(Rhizobium spp.)、根瘤菌NGR234、豌豆根瘤菌Madison、豌豆根瘤菌USDA2370、豌豆根瘤菌三叶草生物变异型USDA2408、豌豆根瘤菌菜豆生物变异型USDA2668、豌豆根瘤菌2370G、豌豆根瘤菌2370LBA、豌豆根瘤菌2048G、豌豆根瘤菌2048LBA、豌豆根瘤菌菜豆生物变异型、豌豆根瘤菌菜豆生物变异型2668G、豌豆根瘤菌菜豆生物变异型2668LBA、豌豆根瘤菌RL542C、豌豆根瘤菌蚕豆生物变异型、豌豆根瘤菌三叶草生物变异型、埃特里根瘤菌USDA9032、埃特里根瘤菌菜豆生物变异型、热带根瘤菌、中间根瘤菌、百脉根根瘤菌ML542G、百脉根根瘤菌ML4404、中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)、草木樨中华根瘤菌SD630、草木樨中华根瘤菌USDA1002、费氏中华根瘤菌USDA205、费氏中华根瘤菌SF542G、费氏中华根瘤菌SF4404、费氏中华根瘤菌SM542C、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)、大豆慢生根瘤菌USDA 6和大豆慢生根瘤菌USDA 110。

37.权利要求36的根瘤菌细胞，其中所述细胞为豌豆根瘤菌细胞。

38.权利要求36的根瘤菌细胞，其中所述细胞为豌豆根瘤菌三叶草生物变异型、豌豆根瘤菌莱豆生物变异型或豌豆根瘤菌蚕豆生物变异型的细胞。

39.权利要求1或2的方法，其进一步包括让所述非土壤杆菌细菌在于诱导培养基中生长期间在使多糖产生最小化的条件下生长。

40.权利要求39的方法，其中所述在于诱导培养基中生长期间用于使多糖产生最小化的碳源为AB-TY培养基中的葡萄糖或ATA培养基中的L-阿拉伯糖和葡萄糖酸钾。