CN101537180B - 抗体混合物的重组生产 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了从单一宿主细胞克隆生产抗体混合物的方法。此外，编码轻链的核苷酸序列和编码不同重链的核苷酸序列在重组宿主细胞中表达。本发明的混合物中的抗体相应地包含与能与轻链配对的不同重链配对、从而形成功能性抗原结合结构域的相同轻链。本发明还提供了抗体混合物。这样的混合物能被用于多种领域。

Description

抗体混合物的重组生产
发明领域：
本发明涉及医学领域，更特别地涉及抗体生产领域，更特别地涉及抗体混合物的生产。
背景技术：
免疫系统的基本功能是抵御感染。体液免疫系统用免疫球蛋白与被识别为非自身的分子，例如病原体进行斗争。这些也被称作抗体的免疫球蛋白在与被用作抗原的感染性制剂第一次接触时被特异性地引起(Roitt，EssentialImmunology，BlackwellScientificPublications，第5版，1984；在此所引用的所有参考文献均全文并入参考)。抗体是包含以链间二硫键连接的重(H)链和轻(L)链的多价分子。已知几种同种型抗体，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE和IgM。IgG包含两条重链和两条轻链。每一条链含有恒定区(C)和可变区(V)，可被分解成称为CH1、CH2、CH3、VH和CL、VL的结构域(图1)。抗体通过包含在Fab部分中的可变区结构域与抗原结合，结合后可通过恒定结构域，主要通过Fc部分与免疫系统的分子和细胞相互作用。
B淋巴细胞在暴露给例如细菌、病毒和它们的毒性产物等生物物质后会作出反应产生抗体。抗体通常是表位特异性的，并与携带这些表位的物质强烈结合。杂交瘤技术(Kohler和Milstein1975)利用B细胞生产针对特异抗原的单克隆抗体的能力，以及随后通过将来自暴露给感兴趣的抗原的小鼠的B细胞与无限增殖化的鼠浆细胞进行融合生产这些单克隆抗体。这一技术使得人们认识到，杂交瘤产生的单克隆抗体可以用于研究、诊断和治疗，用于治疗不同种类的疾病，例如癌症和自身免疫相关疾病。
由于小鼠杂交瘤所产生的抗体在人体内诱发强烈的免疫反应，本领域期望在人体内成功治疗所需要的抗体具有较小免疫原性，优选非免疫原性。为此，首先通过将鼠恒定区用人恒定区替代对鼠抗体进行工程化(称为嵌合抗体)。随后，将可变结构域中互补性决定区(CDR)之间的结构域，所谓构架区，用人的相应部分进行替代(称为人源化抗体)。人源化过程的最终阶段是生产完全的人抗体。
本领域也描述过对两种不同抗原具有结合特异性的双特异性抗体。这些通常被用于将被抗体的一个可变区识别的治疗性或诊断性部分，例如T细胞，细胞毒性引发分子或与放射性核素结合的螯和剂靶向被抗体的其它可变区所识别的细胞，例如肿瘤细胞(双特异性抗体参见Segaletal，2001)。
本领域已知获得具有所需结合特性的完全人单克隆抗体的一个非常有用的方法是使用噬菌体展示文库。这是一种体外的、以重组DNA为基础的方法，模仿体液免疫反应的关键特征(噬菌体展示方法参见，例如CFBarbasIIIetal，PhageDisplay，Alaboratorymanual，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，2001)。为了构建噬菌体展示文库，在细菌噬菌体颗粒表面通常以单链Fv(scFv)或以Fab模式表达人单克隆抗体重链和轻链可变区基因的集合(collections)。表达抗体片段的噬菌体的大文库典型地含有超过109抗体特异性，可以用免疫或非免疫的个体的B淋巴细胞中表达的免疫球蛋白V区进行装配。
或者，噬菌体展示文库可以用体外部分装配或重排的免疫球蛋白可变区进行构建，以在文库中导入额外的抗体多样性(半合成文库)(DeKruifetal，1995b)。例如，体外装配的可变区在对抗体特异性来说重要的分子区域内含有成段的合成生产的、随机化或部分随机化的DNA。编码噬菌体展示所鉴定的抗体的遗传信息可以被用来以所需模形式，例如IgG、IgA或IgM克隆抗体，以用重组DNA方法生产抗体(Boeletal，2000)。
提供完全人抗体的另外一种方法使用包含编码人免疫球蛋白所有组成成分(repertoire)的遗传物质的转基因小鼠(Fishwildetal，1996；Mendezetal，1997)。这样的小鼠可以用靶抗原进行免疫，所导致的免疫反应将产生完全人抗体。这些抗体的序列可被用于重组生产方法中。
单克隆抗体的生产常规通过使用编码宿主细胞抗体的H和L链的核酸序列的重组表达来进行(参见例如，EP0120694；EP0314161；EP0481790；USpatent4,816,567；WO00/63403)。
到目前为止，许多不同疾病正在用人源化的或完全人单克隆抗体进行治疗。以目前被许可用于人体的单克隆抗体为基础的产品包括HerceptinTM(抗-Her2/Neu)、ReoproTM(抗糖蛋白IIB/IIIA受体)、MylotargTM(抗CD33)、RituxanTM(Rituximab，抗CD20)、SimulectTM(抗CD25)、RemicadeTM(抗TNF)、SynagisTM(抗RSV)、ZenapaxTM(IL2受体)、CAMPATHTM(抗CD52)。除了这些成就之外，仍然有新抗体产品和对现有抗体产品进行相当程度的改进的空间。将单克隆抗体用于癌症治疗已经显示，可以发生所谓“抗原丧失的肿瘤变种(antigen-losstumorvariants)”，使得用单克隆抗体进行治疗的有效性降低。例如，用非常成功的单克隆抗体Rituximab(抗CD20)进行治疗显示可以发生抗原丧失的逃逸变种(escapevariants)，导致淋巴瘤复发(Massengaleetal，2002)。在本领域，通过将单克隆抗体与毒性化合物，例如放射性核素、毒素、细胞因子等融合提高了单克隆抗体的效价。然而这些方法中的每一种均有其局限性，包括技术和生产问题和/或高毒性。
此外，单克隆抗体与传统未明确定义的多克隆抗体相比在特异性上的增长所带来的成本是功效的丧失。在体内，抗体反应在本性上是多克隆的，即产生抗体的混合物，因为多种B细胞对抗原作出反应，导致在多克隆抗体混合物中存在多种特异性。多克隆抗体也可被用于治疗应用，例如用于被动接种或用于主动免疫治疗，而且目前通常源自来自免疫动物或来自疾病康复的人的混合血清(pooledserum)。混合血清被纯化成蛋白质样的或γ球蛋白级分，这样命名是因为它主要包含IgG分子。目前用于治疗的多克隆抗体包括抗猕猴多克隆抗体、用于被动免疫的γ球蛋白，抗蛇毒多克隆(CroFab)，用于同种异体移植排斥的ThymoglobulinTM，抗地高辛用来中和心脏药物地高辛，和抗狂犬病多克隆。在目前市场化的治疗用抗体中，与单克隆抗体相比具有较高功效的多克隆抗体的一个例子是用抗T细胞抗体治疗急性移植排斥。市场上的单克隆抗体(抗CD25basiliximab)的有效性不如针对胸腺细胞的兔多克隆抗体(ThymoglobulinTM)(2002年3月12日、4月29日和8月26日的新闻发布，www.sangstat.com)。然而，使用混合人血清潜在的危险是感染病毒例如HIV或肝炎、毒素例如脂多糖、蛋白质样感染性物质例如朊病毒、以及未知的感染性物质。此外，可利用的供给量有限，不足以用于普遍的人类治疗。在临床上与当前源自动物血清的多克隆抗体的应用相关的问题包括人类免疫系统针对这样的外来抗体的强免疫反应。因此，这样的多克隆抗体不适于重复治疗，或治疗前曾用来自同一动物种属的其它血清制剂进行过注射的个体。
现有技术描述了产生具有人类免疫球蛋白的所有组成成分的动物的想法，这一动物继而可被用于用抗原免疫以获得来自转基因动物的针对这一抗原的多克隆抗体(WO01/19394)。然而，仍需要克服许多技术障碍才能使这样的系统在比小鼠更大的动物上得以实际实现，而且还需要许多年的研发才能使这种系统以足够的量、并以安全和一致的方式提供多克隆抗体。此外，不管是人类还是动物来源的混合血清所产生的抗体总是包含高含量的不相关和不需要的特异性，因为特定血清中存在的抗体只有很小的百分比是针对用于免疫的抗原的。例如已知在正常，即非转基因动物中大约1-10％的循环免疫球蛋白级分是针对用来超免疫的抗原的，因此大多数循环免疫球蛋白不是特异性的。
曾描述过一种表达多克隆抗体文库的方法(WO95/20401，美国专利5,789,208和6,335,163)。用噬菌体展示载体表达Fab抗体片段的多克隆文库，然后选择对抗原的反应性。所选择的重链和轻链可变区基因组合被以连接对(linkedpairs)的方式大量转移至提供恒定区基因的真核表达载体，以获得完整多克隆抗体的子文库。这一子文库转染入骨髓瘤细胞后，稳定克隆便产生能被混合以获得多克隆抗体混合物的单克隆抗体。尽管使用这一方法通过培养转染细胞的混合群(mixedpopulation)在理论上有可能直接从一个重组生产过程中获得多克隆抗体，在混合细胞群的稳定性以及因此带来的所产生的多克隆抗体混合物的一致性方面可能存在潜在的问题。在药学上可接受的大(即工业)规模的方法中对整群不同细胞进行控制是一项艰巨的任务。例如细胞生长速率和抗体产生速率等特性似乎对非克隆群中所有单个克隆来说应保持稳定，才能使多克隆抗体混合物中的抗体比率多少保持恒定。因此，尽管在本领域可能已认识到对混合抗体的需求，还不存在可接受的解决方案以用药学可接受的方式经济地制造抗体混合物。本发明的目的是提供在重组宿主中生产抗体混合物的新的手段。
附图说明
图1：抗体的示意图。重链和轻链通过键间二硫键(虚线)配成对。重链可为α、γ、μ、δ或ε同种型。轻链为λ或κ。显示的是IgG1同种型抗体。
图2：双特异单克隆抗体的示意图。双特异抗体含有两个不同的功能性F(Ab)结构域，用VH～VL区的不同图案表示。
图3：K53、UBS-54和02-237的VL和VH的序列对比。UBS54和K53的共同VL的DNA序列为SEQ.ID.NO.1，而氨基酸序列以SEQ.ID.NO.2给出。02-237的VL和UBS54、K53和02-237的VH的DNA序列分别为SEQ.ID.NO.3、5、7和9，而氨基酸序列分别以SEQ.ID.NO.4、6、8和10给出。
图4：质粒pUBS3000Neo和pCD46_3000(Neo)的总体图。
图5：A.瞬时表达的pUBS3000Neo、pCD46_3000(Neo)和两者组合的IEF。B.上半部分显示当单一轻链和单一重链在细胞中表达导致单克隆抗体UBS-54或K53时预期分子的示意图。箭头下方的下半部分显示当重链和共同轻链一起在宿主细胞中共表达时所产生的组合的示意图，并显示当两条重链以均等水平表达和以均等效率彼此配对时的理论量。共同轻链用垂直的条纹杠显示。
图6：本发明的方法的一个可能的实施方案的示意图(见例如实施例9)。(1)将编码一条轻链和能够与共同轻链配对的三条不同的重链以生成功能性抗体的核酸序列导入宿主细胞；(2)选择稳定克隆；(3)按例如表达水平、结合筛选克隆；(4)扩增克隆；(5)抗体功能性混合物的产生。步骤2-5中的一些或全部可同时或按不同次序进行。
图7：针对CD22(克隆B28)、CD72(克隆II-2)和HLA-DR(II类；克隆I-2)的噬菌体的VH和VL序列。克隆B28、II-2和I-2的VL的DNA序列分别是SEQ.ID.NO.11、13和15，而氨基酸序列分别是SEQ.ID.NO.12、14和16。这些克隆的共同轻链的DNA序列为SEQ.ID.NO.17，而氨基酸序列是SEQ.ID.NO.18。
图8：pUBS54-IgA(编码针对EPCAM的人IgA1的pCRU-L01)的图谱。
图9：带有单一轻链(用水平条纹杠显示)的二聚体双特异性IgA。本发明的方法将产生混合形式，其中不同重链可以配对，而这一示意图中只表示了最简单的形式。显示J链连接两个单体。
图10：带有单一轻链(用水平条纹杠显示)的五聚体多特异性IgM。本发明的方法将产生许多不同形式的混合，其中不同重链可以配对，而这一示意图中只表示了当5种不同重链与单一轻链表达、而且所有5种不同重链被掺入五聚体并与相同重链配对的最简单的形式。通过掺入少于5种不同重链也可形成特异性较少的五聚体。特别是当J链不表达时，也可以得到六聚体。
图11：在单一细胞中表达由一条共同轻链组成、但具有不同结合特异性的人IgG同种型的混合物以防止双特异性抗体的形成。不同的结合特异性用VH序列的不同颜色表示。共同轻链用垂直的条纹杠表示。IgG1同种型用灰色Fc表示，IgG3同种型用黑色Fc部分表示。
图12：K53、UBS54和02-237IgG的重链和轻链可变结构域的DNA和蛋白质序列。
图13：K53、02-237和UBS54的重链可变序列的对比。用粗体显示CDR1、CDR2和CDR3区域。
图14：K53和02-237的BIACORE分析。来自LS174T细胞的亲和纯化的人CD46偶联(640RU)至CM5芯片(BIACOREBR-1000-14)。在37℃使用BIACORE3000系统监测纯化自稳定PER.C6TM来源的细胞系的1000(A)、500(B)、250(C)、125(D)、63(E)、31(F)、16(G)、8(H)或0(I)nM02-237或k53与CD46的结合。使用这一实验发现K53和02-237的Kd分别为9.1×10-7和2.2×10-8。
图15：K53和02-237与LS174T细胞的结合。与生物素缀合的系列稀释的纯化02-237(■)、K53(*)和负对照GBSIII(◇)与和正常人血清预孵育的LS147T细胞孵育以阻断Fcγ受体相互作用。在用链霉抗生物素缀和的藻红蛋白孵育后用FACS确定结合(MFI，纵坐标)。
图16：纯化的IgG级分的SDS-PAGE分析。按照厂商的建议在非还原(A)和还原(B)4-20％Nupage胶(Novex)上对3μg纯化IgG进行分析。按照厂商的建议用胶状蓝(colloidalblue)(Novex目录号LC6025)染色以显示蛋白质。在SDS-PAGE顶部指示克隆身份。每一胶含有对照，为纯化02-237或K53。NR，非还原的；R，还原的。
图17：纯化的IgG组分的IEF分析。按照厂商的建议在Isogel3-10胶(BMA)上对10μg纯化IgG进行分析。按照厂商的建议用胶状蓝(Novex目录号LC6025)染色以显示蛋白质。在IEF顶部指示克隆身份。每一胶包含对照，由02-237、K53和UBS54按1∶1∶1混合而组成。
图18：多克隆混合物241、280、282、361和402的IEF分析，与单一K53、02-237和UBS54进行比较。按照厂商的建议在Isogel3-10胶(BMA)上对10μg纯化IgG进行分析。按照厂商的建议用胶状蓝(Novex目录号LC6025)染色以显示蛋白质。在IEF顶部指示IgG身份。
图19：K53、02-237、UBS54的CDR3肽以及IgG组分Poly1-280中的两个独特轻链肽L1-K53/UBS54和L1-237的质量色谱。在每一质量色谱的右手侧，显示肽的同种型模式。在m/z1058.98的双重带电离子(Mw2115.96Da)源自肽H11-K53。在m/z1029.96的双重带电离子(Mw2057.92Da)源自肽H11-02-237。在m/z770.03的三重带电离子(Mw2307.09Da)源自肽H9-UBS54。在m/z1291.08的双重带电离子(Mw2580.16Da)源自肽L1-K53/UBS54。在m/z1278.11的双重带电离子(Mw2554.22Da)源自肽L1-02-237。
纯化的IgG溶解于溶于50mMNH4HCO3中的0.1％RapiGestTM(Waters)。二硫化物用1MDTT(1，4-二硫-DL-苏糖醇)进行还原，随后在65℃孵育30分钟。然后，为了烷基化所有硫氢基，加入1M碘乙酰胺，随后在室温于黑暗中孵育45分钟。加入1MDTT以终止烷基化。缓冲液换成25mMNH4HCO3，pH7.5。最后，通过加入新制备的溶于25mMNH4HCO3的胰蛋白酶溶液以使抗体在37℃消化过夜。肽混合物用LC-MS进行分析。LC-系统由Vydac反相C18柱组成，Vydac反相C18柱通过使用溶剂A(5/95/1乙腈，水，冰乙酸v/v/v)和溶剂B(90/10/1乙腈，水，冰乙酸v/v/v)梯度进行洗脱。LC即时与装备有在3kV下工作的电喷射源的Q-TOF2质谱仪(Micromass)偶联。在正离子模式从m/z50至1500、锥电压(conevoltage)35V下记录质谱。＞10,000的仪器分辨率能够明白无误地确定电荷值，并因此确定高达至少+7的大多数离子的质量。这样，所有肽均按照它们的分子量加以鉴定。肽的氨基酸序列用MS/MS-实验加以证实。用正离子模式从m/z50-2000、碰撞能量在20-35电子伏特(eVolts)之间记录MS/MS光谱。
图20：多克隆280的BIACORE分析。来自LS174T细胞的亲和纯化的人CD46偶联(640RU)至CM5芯片(BIACOREBR-1000-14)。在37℃使用BIACORE3000系统监测1000(A)、500(B)、250(C)、125(D)、63(E)、31(F)、16(G)、8(H)或0(I)nMPoly1-280对CD46的结合。
图21：生产抗体混合物的克隆poly1-241、poly1-280和poly1-402的亚克隆的IEF分析。
A.克隆poly1-241和poly1-280。泳道1含有pI标记(Amersham，目录号17-0471-01)。泳道2含有来自亲本克隆poly1-241(如图18中)的分离的IgG。泳道3、4、5分别含有来自通过有限稀释源自poly1-241的3个独立亚克隆的分离的IgG。泳道6含有来自亲本克隆poly1-280(如图18中)的分离的IgG。泳道7、8、9分别含有来自通过有限稀释源自poly1-280的三个独立亚克隆的分离的IgG。
B.克隆poly1-402。泳道1和7含有pI标记。泳道2含有来自亲本克隆poly1-402(如图18中)的分离的IgG。泳道3、4、5分别含有来自通过有限稀释源自poly1-402的3个独立亚克隆的分离的IgG。泳道6含有对照(02-237、K53和UBS54的1∶1∶1混合物)。
图22：poly1-241(A)、poly1-280(B)和poly1-402(C)的亚克隆产生的抗体混合物的FACS分析。用FACS分析测定抗体混合物与用CD46、EpCAM或负对照(CD38)的cDNA转染的细胞的结合，显示了各个亲本克隆和每个亲本克隆的三个独立亚克隆的平均荧光强度(MFI)。也包括对照抗体GBS-III(负对照)、抗-CD72(02-004；负对照)和单一抗体UBS54、02-237和K53。
发明简述
一方面，本发明提供了在重组宿主中生产抗体混合物的方法，所述方法包含如下步骤：在重组宿主细胞中表达编码至少一个轻链和能与所述至少一个轻链配对的至少三个不同重链的一或多个核酸序列。本发明的另一方面是通过使用预先选择的重链和轻链组合消除潜在的非功能性的轻链重链配对的产生。已经认识到，单一轻链和许多不同重链所构建成的噬菌体展示文库可以编码具有非常独特的结合特性的抗体片段。可以利用这一特征发现针对相同靶或不同靶的、具有相同轻链但不同重链的不同抗体，其中靶可以为整个抗原或其表位。这样的不同靶例如可以位于相同表面(例如细胞或组织)。噬菌体展示所获得的这样的抗体片段可以按所需要的模形式，例如IgG、IgA或IgM被克隆入载体，编码这些形式的核酸序列可以被用来转染宿主细胞。在一个方法中，H和L链可以由不同构建体编码，在转染入它们得以表达的细胞后生成完整Ig分子。当不同的H链构建体转染入带有单一L链构建体的细胞时，H和L链可被组装形成所有可能的组合。然而，与例如生产双特异性抗体这样表达不同轻链的方法形成对照的是，这一方法将只产生功能性结合区域。当宿主，例如单一细胞系，能够表达可接受水平的重组抗体，而无需在所述细胞中首先扩增编码抗体的核酸序列时这一方法将会特别有用。好处在于，只具有有限拷贝数目的所述核酸的细胞系被认为在遗传上更稳定，因为与存在多个这样的拷贝的细胞系相比，在编码重链的序列间将会有较少的重组。适合用于本发明的方法的细胞系为人细胞系PER.C6TM。使用这一方法，能以安全、可控和一致的方式从单一细胞克隆中生产具有确定特异性的抗体的混合物。
本发明提供了在重组宿主中生产抗体混合物的方法，所述方法包含如下步骤：在重组宿主细胞中表达编码至少一个轻链和能与所述至少一个轻链配对的至少三个不同重链的一或多个核酸序列。在一个优选方面，所述重组宿主细胞包含编码能与所述至少三个不同重链配对的共同轻链的核酸序列，使得所产生的抗体包含共同轻链。显然，本领域技术人员将认识到，“共同”也指氨基酸序列不一样的轻链功能等价物。存在所述轻链的许多变体，其中存在不在本质上影响功能性结合区域形成的突变(缺失、替代、添加)。
本发明进一步提供了包含重组生产的抗体的混合物的组合物，其中在所述混合物中呈现了至少三种不同重链序列。在一个具体实施方式中，这样的混合物的轻链具有共同序列。抗体的混合物可以用本发明的方法生产。优选地，抗体混合物与它所包含的单个抗体相比更有效，更优选所述混合物在功能性测定中协同作用。
本发明进一步提供了用来生产抗体混合物的重组宿主细胞，以及制备这样的宿主细胞的方法。
编码轻链和不只一条重链的核酸序列转染所获得的独立克隆可以不同水平在混合物中表达不同抗体。本发明的另一方面是用功能性测定选择克隆以得到最强有力的抗体混合物。本发明因此进一步提供了用来鉴定生产抗体混合物的至少一个宿主细胞克隆的方法，其中所述抗体混合物根据功能性测定具有所需效果，方法包含如下步骤：
i)将编码至少一个轻链的核酸序列和编码至少两个不同重链的核酸序列提供给宿主细胞，其中所述重链和轻链能够彼此配对；(ii)在有益于表达所述核酸序列的条件下培养所述宿主细胞的至少一个克隆；(iii)筛选所述宿主细胞的至少一个克隆用于生产经由功能性测定具有所需效果的抗体混合物；和(iv)鉴定至少一个生产具有所需效果的抗体混合物的克隆。如果需要，本发明的这一方法可以用高通量程序来进行。用这一方法所鉴定的克隆可以用来生产本发明的抗体混合物。
本发明进一步提供了能够表达抗体混合物的转基因非人动物和转基因植物或转基因植物细胞，以及由它们所生产的抗体混合物。
本发明进一步提供了包含重组生产的抗体的混合物和适当载体的药物组合物。
本发明进一步提供了治疗或诊断所使用的、以及用于治疗或诊断人或动物个体的疾病或紊乱所使用的药物的制备中的抗体混合物。
本发明进一步提供了生产包含来自单一宿主细胞克隆的不同同种型的抗体混合物的方法。
本发明进一步提供了在功能性测定中鉴定具有所需效果的抗体混合物的方法。
本发明进一步提供了生产能与靶结合的抗体混合物的方法，方法包括如下步骤：i)将包含抗体的噬菌体文库与包含靶的物质接触，ii)至少一个选择与所述靶结合的噬菌体的步骤，iii)鉴定至少两个包含与所述靶结合的抗体的噬菌体，其中所述至少两个抗体包含共同轻链，iv)将编码所述轻链的核酸序列和编码所述至少两个抗体的重链的一或多条核酸序列导入宿主细胞，v)在有益于表达所述核酸序列的条件下培养所述宿主细胞的克隆。
发明详述
本发明的一个目的是提供在重组宿主中生产抗体混合物的方法，该方法包含如下步骤：在重组宿主细胞中表达编码至少一个轻链和能与所述至少一个轻链配对的至少三个不同的重链的一或多条核酸序列。根据本发明，轻链和重链配对后形成功能性抗原结合结构域。功能性抗原结合结构域能特异性与抗原特异结合。
根据本发明的一个方面，生产本发明的抗体混合物的方法进一步包含从细胞或宿主细胞培养物中回收抗体以获得适于进一步使用的抗体混合物的步骤。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种生产抗体混合物的方法，该方法包含如下步骤：在重组宿主细胞中表达编码共同轻链的核酸序列和编码能与所述共同轻链配对的至少三个不同的重链的一或多条核酸序列，使得所产生的抗体包含共同轻链。在一个方面，共同轻链在每一轻链/重链对中是同样的。
本文所用术语“抗体”意味着含有一或多个与抗原上的表位结合的结构域的多肽，其中这样的结构域源自抗体的可变区或与抗体的可变区具有序列相同性。抗体结构在图1中用示意图表示。本发明的抗体的例子包括全长抗体、抗体片段、双特异性抗体、免疫缀合物等等。本发明的抗体可以是同种型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM等等，或这些的衍生物。抗体片段包括Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2片段等等。本发明的抗体可以是任何来源，包括鼠，不只一种来源，即嵌合、人源化的或完全人抗体。免疫缀合物包含抗原结合结构域和非抗体部分，例如毒素，放射性标记，酶等等。“抗原结合结构域”优选包含重链和轻链的可变区，并负责与感兴趣的抗原特异性结合。通过在宿主细胞中表达重链及轻链可以制备重组抗体。类似地，通过表达带有它们的相应轻链(或共同轻链)的两条链，其中每一重链/轻链具有自己的特异性，可以制备所谓“双特异性”抗体。“双特异性抗体”包含两个不一样的重-轻链组合(图2)，双特异性抗体的两个抗原结合区域都可以识别不同抗原或抗原上的不同表位。
本发明的“共同轻链(commonlightchain)”指相同或具有氨基酸序列差异的轻链。所述轻链可以包含当与同一重链组合时不改变抗体特异性的突变，而不偏离本发明的范围。例如有可能在本文所使用的共同轻链的定义范围内制备或发现不一样但仍然功能等价的轻链，例如通过导入和测试保守氨基酸改变，当与重链配对时不或只部分对结合特异性作出贡献的区域的氨基酸改变等等。本发明的一个方面是作为共同轻链使用一个同样的轻链来与不同重链组合以形成具有功能性抗原结合结构域的抗体。一个共同轻链的使用避免了其中轻链和重链的配对导致无功能的，换句话说不能与一或多个靶抗原结合的抗原结合结构域的异二聚体的形成。曾为一不同目的提出使用共同轻链和两条重链(Merchantetal，1998；WO98/50431)，即以抗体混合物复杂性为代价增加功能性双特异性抗体的形成。这些出版物教导了用来优先生产明确的和所需要的双特异性抗体、从而使所产生的混合物的复杂性最小化的方法。因此，Merchant明确教导了防止单特异性抗体的产生，因为这些在那些出版物所描述的双特异性抗体生产过程中是不想要的副产品。无疑地，在现有技术中没有从重组宿主细胞制备复杂的抗体混合物以避免非功能性结合结构域形成、或这样做的好处的教导，更不用说怎么做了。在本发明的方法中，表达了至少三种不同的能与共同轻链配对的重链。在其它实施方案中，本发明的宿主细胞拥有编码4、5、6、7、8、9、10个或更多个能与共同轻链配对的重链的核酸序列，以增加所产生的抗体混合物的复杂性。
本发明的“不同重链”可以在可变区不同，并具有相同的恒定区。在其它实施方案中，从上下文看清楚的是它们可以具有相同的可变区，在恒定区不同，例如属于不同的同种型。如果在人或动物体的治疗中需要动员免疫系统的不同兵种，使用具有不同恒定区，例如Fc-部分的抗体混合物可能是有利的。而在其它实施方案中，也同样从上下文看是清楚的，可变区和恒定区都可以不同。
本发明的“抗体混合物”包含至少两个不一样的抗体，但可以包含3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同抗体，在复杂性和功能性抗原结合分子的数目上可能类似多克隆或至少寡克隆(oligoclonal)抗体混合物。本发明产生的混合物通常包含双特异性抗体。如果需要，混合物中单特异性抗体的形成可能比双特异性抗体的形成有利。当n条重链和1条共同轻链根据本发明在宿主细胞中以均等水平表达时，本发明的方法产生的双特异性抗体的理论百分比是(1-1/n)*100％。本发明的方法所产生的混合物中不同抗体的总数目在理论上是n+{(n2-n)/2}，其中(n2-n/2)是双特异性抗体。不同重链表达水平比率的扭曲可能导致数值偏离理论值。如果重链不都以均等效率配对，双特异性抗体的量与这些理论值相比也可以降低。与前面Merchant所提议的相反，例如有可能工程化重链，例如通过在所选择的重链间引入特异的和互补的相互作用表面以促进同种型二聚体相对于异二聚体的配对。重链也可以被选择以将混合物中异二聚体的形成减到最少。这一实施方案的特殊形式涉及两个或更多个不同同种型(例如IgG1、IgG3、IgA)的重链。当不同同种型的重链与能与这些重链配对的一条轻链在本发明同一宿主细胞中表达时，双特异性抗体的量将降低，有可能到非常低或甚至到检测不到的水平。因此，当不太想要双特异性抗体时，有可能生产本发明的抗体混合物，其中编码一共同轻链的核酸序列和编码至少两种不同的能够与所述共同轻链配对的带有不同可变区的重链的核酸序列在一重组宿主中表达，其中所述重链进一步在它们的恒定区有足够的不同，以降低或防止在不同重链间的配对。本发明的抗体混合物可以产生自起源于单一宿主细胞的克隆，即产生自含有相同重组核酸序列的细胞群。
人们将了解到，本发明的不同重链可以编码在分离的核酸分子上，但也可以存在于包含不同区域的编码所述至少三个重链的一个核酸分子上。核酸分子通常编码表达后从宿主细胞分泌、从而被加工以生成成熟形式的轻链和/或重链的前体。在宿主细胞中表达抗体的这些和其它方面对本领域普通技术人员来说是熟知的。
本文所使用的“重组宿主细胞”是包含一个或多个所谓转基因，即在所述细胞中不是天然存在的重组核酸序列的细胞。当这些细胞在有益于所述核酸序列表达的条件下培养时，这些转基因在所述宿主细胞中表达以产生由这些核酸序列所编码的重组抗体。本发明的宿主细胞可以以来自源于转基因已经被导入其中的单一宿主细胞的克隆的培养物形式存在。为了获得编码抗体的核酸序列的表达，本领域技术人员熟知能够驱动这种表达的序列能被功能性地与编码抗体的核酸序列连接。功能性连接意谓着编码抗体片段或其前体的核酸序列被连接到能驱动表达的序列上，使得这些序列能驱动抗体或其前体的表达。有用的表达载体在现有技术中是可获得的，例如Invitrogen的pcDNA载体系列。当编码感兴趣的多肽的序列被适当地插入到有关控制所编码多肽的转录和翻译的序列时，所得到的表达盒对感兴趣的多肽的产生，称为表达，有益。驱动表达的序列可以包括启动子、增强子等，及其组合。这些应该能在宿主细胞中发挥功能，从而驱动与它们功能性连接的核酸序列的表达。启动子可以为组成型的或受调节的，可以从多种来源得到，包括病毒、原核或真核来源，或人工设计的。感兴趣的核酸的表达可以来自天然启动子或其衍生物，或来自完全异源的启动子。有些众所周知和用得很多的在真核细胞中用于表达的启动子包含源于病毒，例如腺病毒的启动子，例如E1A启动子，源于巨细胞病毒(CMV)的启动子，例如CMV立即早期(IE)启动子，源于猿猴病毒40(SV40)的启动子，等等。适当的启动子也可以源自真核细胞，例如金属硫蛋白(MT)启动子，延伸因子1α(EF-1α)启动子，肌动蛋白启动子，免疫球蛋白启动子，热休克启动子，等等。任何能在宿主细胞中驱动感兴趣的序列表达的启动子或增强子/启动子在本发明中都是合适的。在一个实施方案中，能够驱动表达的序列包含来自CMV启动子的一个区域，优选包含CMV立即早期基因增强子/启动子核苷酸-735至+95的区域。本领域技术人员会意识到，本发明中所使用的表达序列可以与能稳定或增强表达的元件，例如绝缘体、基质附着区域、STAR元件(WO03/004704)等等适当地组合，这可以增强表达的稳定性和/或水平。重组宿主细胞中的蛋白质生产已经广泛地被描述，例如CurrentProtocolsinProteinScience，1995，ColiganJE，DunnBM，PloeghHL，SpeicherDW，WingfieldPT，ISBN0-471-11184-8；Bendig，1988。细胞被培养以使其能代谢，和/或生长和/或分裂和/或产生感兴趣的重组蛋白。这可以通过本领域技术人员熟知的方法来完成，包括但不限于为细胞提供营养。该方法包含粘附于表面的生长、悬浮生长，或其组合。几种培养条件可以通过本领域熟知的方法加以最优化，以优化蛋白质生产的产量。培养可以在例如平皿、滚瓶或在生物反应器中，使用分批、补料分批、连续系统、中空纤维，等等完成。为了达到通过细胞培养大规模(连续)生产重组蛋白，在本领域中优选拥有能悬浮生长的细胞，优选拥有能在缺乏动物或人来源的血清或动物或人来源的血清成分下被培养的细胞。由于缺乏源于培养基的额外动物或人蛋白质，因而纯化更容易，安全性增强，而系统也非常可靠，因为合成培养基在再现性上是最好的。
本发明的“宿主细胞”可以是能够表达重组DNA分子的任何宿主细胞，包括细菌，例如埃希氏菌(Eschericia)(例如大肠杆菌(E.coli))、肠杆菌(Enterobocter)、沙门氏菌(Salmonalla)、芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、链霉菌(Streptomyces)，酵母，例如酿酒酵母(S.cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、毕赤酵母(P.pastoris)、假丝酵母(Candida)或yarrowia，丝状真菌，例如脉孢菌属(Neurospora)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)和黑曲霉(Aspergillusniger)，昆虫细胞，例如草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)SF-9或SF-21细胞，哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、BHK细胞，小鼠细胞，包括SP2/0细胞和NS-0骨髓瘤细胞，灵长类细胞，例如COS和Vero细胞、MDCK细胞、BRL3A细胞、杂交瘤、肿瘤细胞、无限增殖化的原代细胞，人细胞，例如W138、HepG2、HeLa、HEK293、HT1080或胚胎视网膜细胞，例如PER.C6TM等等。可选的表达系统常常涉及哺乳动物细胞表达载体和宿主使得抗体被适当地糖基化。人细胞系，优选PER.C6TM，可以被方便地使用以获得具有完全的人糖基化模式的抗体。生长或繁殖细胞的条件(见例如，TissueCulture，AcademicPress，编辑：Kruse和Paterson(1973))和重组产物表达的条件可以稍有不同，根据本领域技术人员通常已知的方法，通常进行方法的最优化以增加产物产量和/或细胞相对于彼此的生长。一般，使哺乳动物细胞培养物的生产力最大化的原理、方案和实用技术可以在MammalianCellBiotechnology：aPracticalApproach(M.Butler编辑，IRL出版社，1991)中找到。在重组宿主细胞中表达抗体在本领域中已被广泛描述(见例如EP0120694；EP0314161；EP0481790；EP0523949；美国专利4816567；WO00/63403)。编码轻链和重链的核酸分子可以作为染色体外拷贝存在，和/或稳定整合进宿主细胞的染色体。在产品的稳定性方面，优选后者。
抗体在细胞中根据本发明加以表达，并通过本领域技术人员通常已知的方法从细胞中回收或优选从细胞培养基中回收。这样的方法可以包括沉淀、离心、过滤、大小排阻层析、亲和层析、阳离子和/或阴离子交换层析、疏水相互作用层析等等。对包含IgG分子的抗体混合物来说，蛋白A或蛋白G亲和层析可以被适当地使用(见，例如，美国专利4,801,687和5,151,504)。
在一个实施方案中，至少两个来自根据本发明所产生的混合物的抗体包含具有不同特异性和/或亲和力的重链-轻链二聚体。特异性决定哪个抗原或其表位被抗体结合。亲和力是对一特殊抗原或表位的结合强度的量度。特异性结合被定义为以亲和力(Ka)至少5*10E4升/摩尔结合，更优选5*10E5，更优选超过5*10E6，还更优选5*10E7，或更多。典型地，单克隆抗体可以具有高达10E10升/摩尔，甚至更高的亲和力。本发明所产生的抗体混合物可以包含至少两个与相同抗原分子的不同表位结合的抗体，和/或可以包含至少两个与一个包含抗原的混合物中存在的不同抗原分子结合的抗体。这样的包含抗原的混合物可以为部分或全部纯化的抗原，例如毒素，膜组分和蛋白质，病毒包膜蛋白的混合物，或它可以是健康细胞，患病细胞，细胞混合物，组织或组织混合物，肿瘤，器官，完整的人或动物个体，真菌或酵母，细菌或细菌培养物，病毒或病毒原种，这些的组合等等。与仅能与单一抗原或表位结合的单克隆抗体不同，本发明的抗体混合物可以因此具有多克隆或寡克隆抗体混合物的许多优势。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的方法的宿主细胞能够高水平表达人免疫球蛋白，即至少1pg/细胞/天，优选至少10pg/细胞/天，甚至更优选至少20pg/细胞/天或更多，而无需在所述宿主细胞中扩增编码重链和轻链的核酸分子。优选地，本发明的宿主细胞在它们的基因组中包含1-10个拷贝的要被表达的每一重组核酸。在本领域，在例如CHO细胞中编码感兴趣的蛋白的核酸序列拷贝数的扩增可以被用来增加细胞重组蛋白的表达水平(见例如，Bendig，1988；Cockettetal，1990；美国专利4,399,216)。这是目前广泛使用的方法。然而，建立具有所需的高拷贝数和高表达水平的克隆需要付出很大的、同时又耗时的努力，此外携带非常高拷贝数(高达数百)的表达盒的克隆常常不稳定(例如，Kimetal.，1998)。因此本发明的一个优选实施方案是使用不需要这类针对感兴趣的抗体的高水平表达的扩增策略的宿主细胞。这样使得以一致的方式快速产生表达本发明的抗体混合物的宿主细胞的稳定克隆。我们提供了本发明的宿主细胞可以被获得、亚克隆和进一步繁殖至少大约30个细胞分裂(群体倍增)，同时在没有选择压力下，以稳定方式表达本发明的抗体混合物的证据。因此，在某些方面，本发明的方法包括培养细胞至少20、优选25、更优选30个群体倍增，在其它方面，本发明的宿主细胞已经进行了至少20、优选25、更优选30个群体倍增，而仍能表达本发明的抗体混合物。本发明还提供从单一细胞生产免疫球蛋白混合物的细胞培养物，所述混合物包含至少三个不同重链。本发明还提供了产生来自单一细胞的至少三个不同单特异性免疫球蛋白的细胞培养物。在某些优选方面，所述培养物在单一细胞中以超过20，优选超过25、更优选超过30个群体倍增生产所述混合物或所述至少三个不同单特异性免疫球蛋白。
根据本发明的方法的宿主细胞优选源自已被无限增殖化或用腺病毒E1序列转化的人视网膜细胞。根据本发明的方法的特别优选的宿主细胞是以ECACCno.96022940保藏的PER.C6TM或其衍生物。PER.C6来源的克隆可快速产生，通常包含有限数目拷贝(大约1-10)的转基因，能高水平表达重组抗体(Jonesetal，2003)。因此，这样的克隆预期在许多代后保持稳定的拷贝数，这在生物药物的生产上是一个优势。PER.C6TM细胞的特点已经被广泛描述和证明，证实了好的扩增过程、悬浮生长和生长因子非依赖性。此外，PER.C6TM可以以高度可繁殖的方式被掺入悬浮液，使得它特别适于大规模生产。在这一点上，PER.C6TM细胞系已被描述为生物反应器生长的特性，即它能生长至非常高的密度。将PER.C6TM用于抗体的重组生产已在出版物WO00/63403和Jonesetal.，2003中进行了详细描述。
本发明的另一方面是提供能通过本发明的方法得到的抗体的混合物。这样的抗体混合物预期比它所包含的单独成分更有效，类似于针对相同靶的多克隆抗体通常比单克隆抗体更有效。这样的混合物可以针对多种多样的靶抗原或表位来制备。
本发明的另一方面是提供包含编码轻链的核酸序列和编码至少三个不同的抗体重链的一或多个核酸序列的重组宿主细胞，其中所述轻链和重链能配对，优选形成功能性结合结构域。配对的重链和轻链形成针对一或多个靶抗原的功能性抗原结合区域。本发明的宿主细胞在本发明的方法中是有用的。它们可被用于生产本发明的抗体的混合物。
本发明的另一方面是提供包含重组生产的抗体的混合物的组合物，其中在重组抗体的混合物中呈现有至少三种不同的重链序列。单克隆抗体用重组方法常规生产。本发明揭示了用于多个领域中的诊断或治疗的抗体混合物。本发明的组合物包含以抗体形式与轻链配对的至少三种不同的重链的混合物。优选地，在所述混合物中的抗体的轻链具有共同轻链。混合物可以包含双特异性抗体。混合物可以由来源于单一宿主细胞的克隆，即来自包含相同重组核酸序列的细胞群产生。混合物可以通过本发明的方法得到，或由本发明的宿主细胞产生。在其它实施方案中，所述混合物中所呈现的重链数目为4、5、6、7、8、9、10或更多。为某一特定用途的最佳混合物可以通过本领域技术人员已知的方法或通过本发明所提供的方法依经验加以决定。本发明的这样的组合物可以具有多克隆抗体混合物的若干好处，而不具有多克隆抗体混合物通常与生俱来的缺点，其原因在于它们的产生方式。人们进一步期望抗体混合物比分离的单克隆抗体更有效。因此本发明的抗体混合物的剂量、以及因此所需要的生产能力可能比单克隆抗体少。
例如已有描述，虽然没有针对肉毒杆菌神经毒素(BoNT/A)的单一单克隆抗体能显著中和毒素，三种这种单克隆抗体的组合(寡克隆抗体)中和450,00050％致死剂量的BoNT/A，效价比人超免疫球蛋白高90倍(Nowakowskietal，2002)。这一结果证明，仅包含2至3种不同特异性的抗体的寡克隆混合物可以具有非常高的效价。
此外与单一单克隆抗体相比，由于靶或表位丧失导致本发明的混合物丧失其活性的机会减少。在特别的实施方案中，本发明的混合物中的2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个抗体具有不同特异性。所述不同特异性可以针对相同抗原上的不同表位和/或针对一包含抗原的混合物中的不同抗原。本发明的组合物进一步也可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多具有针对相同表位的不同亲和力的抗体。具有针对相同表位的不同亲和力的抗体可以例如通过本领域技术人员已知的亲和力成熟的方法产生。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的组合物具有的效果高于在所述组合物中的每一个单独的单特异性抗体的效果。所述效果可以在功能性测定中加以测量。本发明的“功能性测定”为能被用来在测定条件下测定抗体或抗体混合物的一种或多种所需参数的测定。合适的功能性测定可以为结合测定，凋亡测定，抗体依赖的细胞毒性(ADCC)测定，补体依赖的细胞毒性(CDC)测定，细胞生长或增殖抑制(抑制细胞的效应)测定，细胞杀死(细胞毒性)测定，细胞信号传递测定，用于测量对病原体与靶细胞的结合的抑制的测定，用来测量血管内皮生长因子(VEGF)或其它分泌的分子的分泌的测定，抑菌、杀菌活性、病毒中和测定，测量抗体结合位点对免疫系统成分的吸引的测定，包括原位杂交方法、标记方法等等。明显地，体内测定，例如动物模型，包括小鼠肿瘤模型、自身免疫疾病模型、病毒感染或细菌感染的啮齿动物或灵长类动物模型等等，也可以被用于这一目的。本发明的抗体混合物的功效可以通过本领域技术人员通常已知的方法在这样的模型中与单个抗体进行比较。
本发明的另一方面是提供鉴定至少一个生产抗体混合物的宿主细胞克隆的方法，其中所述抗体混合物具有根据功能性测定的所需效果，该方法包含下述步骤：(i)将编码至少一个轻链的核酸序列和编码至少两个不同重链的一或多个核酸序列提供给宿主细胞，其中所述重链和轻链能够彼此配对；(ii)在有益于所述核酸序列表达的条件下培养所述宿主细胞的至少一个克隆；(iii)筛选宿主细胞的所述至少一个克隆以生产通过功能性测定具有所需效果的抗体混合物；和(iv)鉴定至少一个生产具有所需效果的抗体的混合物的克隆。优选地，如上述，所述宿主细胞包含编码能够与所述至少两个不同重链配对的共同轻链的核酸序列，使得所产生的抗体包含共同轻链。在特殊的实施方案中，方法中步骤(ii)的所述培养和步骤(iìi)的所述筛选用至少两个克隆来完成。方法可任意包括测量所产生的抗体的表达水平的测定，测定可在根据所述方法的步骤(ii)期间或其后、或随后在程序中。这样的测定对本领域技术人员来说是熟知的，包括蛋白质浓度测定、免疫球蛋白特异测定，例如ELISA、RIA、DELFIA等。在本发明的方法的一个特别的实施方案中，宿主细胞包含编码至少3、4、5、6、7、8、9、10个或更多能够与所述至少一个轻链配对的重链的一或多个核酸序列。对用于本发明的方法的功能性测定可以为对凋亡、ADCC、CDC、细胞杀死、增殖抑制、病毒中和、细菌调理、受体介导的信号传递、细胞信号传递、杀菌活性的测定等等。对抗癌抗体的有用的筛选测定例如已在美国专利6,180,357中进行了描述。这样的测定也可以被用来鉴定根据本发明的方法的克隆。例如有可能用酶联免疫吸附测定(ELISA)测试抗体对它们的靶的结合。使用这样的测定，有可能筛选与靶抗原(或要被测试的抗体的混合物所针对的靶抗原的混合物)最强烈结合的抗体混合物。另一种可被探究的可能性是直接筛选细胞毒性或抑制细胞效应。有可能在这样的不同的筛选之后，而不是上面所提到的ELISA，生产抗体混合物的其它或相同克隆会被选中。可以根据本发明适宜地使用细胞杀死或癌细胞的生长停止的筛选。可以通过多种终点对细胞死亡进行测量，包括代谢缺乏或酶的变性。在本发明的一个可能的实施方案中，通过关注针对癌细胞的细胞毒性活性作为终点来进行测定。为了这一测定，活/死测定试剂盒，例如MolecularProbes生产的Viability/Cytotoxicity测定试剂盒(L-3224)可以被适当地使用。其它评估细胞生存力的方法，例如台盼蓝排除、51Cr释放、Calcein-AM、AlamarblueTM、LDH活性和类似方法也可被使用。测定也可以包括筛选抗体混合物对包含所需抗原的组织的特异性。本发明的抗体可以具有有限的组织分布。有可能将测试针对多种细胞、细胞类型或组织的抗体的混合物包括进来以筛选优选与感兴趣的细胞、细胞类型或组织结合的抗体的混合物。
不考虑前面所述的功能性测定，本发明还教导了使用例如等电聚焦(IEF)、质量光谱(MS)等等方法测定克隆所表达的抗体特性的途径。本发明的一个方面因而是提供MS和/或IEF在选择表达本发明的抗体混合物的克隆中的用途。
当单克隆抗体用重组宿主细胞生产时，通常进行筛选步骤以评估所产生的各个克隆的表达水平。添加更多重链以生产混合物增加了抗体生产的复杂性水平。当宿主细胞用编码能形成所需抗体混合物的轻链和重链的核酸分子转染时，包含相同遗传信息、然而表达水平不同的独立克隆可能出现，因此产生所编码抗体的不同比率，生成来自同一所有遗传组成成分的抗体的不同混合物。本发明的方法对鉴定生产用于某一目的的最佳混合物的克隆是有益的。
根据步骤(ii)和(iii)的培养和/或筛选可以使用分别高通量程序、任意地以自动化方式来适当地进行。克隆可以，例如培养在96孔或其它多孔板上，例如以阵列格式，并筛选所需混合物的产生。机器人技术可以为这一目的被适当地使用。实现高通量培养和测定的方法通常是可获得的，对本领域技术人员是已知的。人们将会清楚，也是为了本发明的方法，使用能高水平表达蛋白质的宿主细胞是有益的，而无需在所述细胞中扩增编码所述蛋白质的核酸。在一个实施方案中，所述宿主细胞来源于已被无限增殖化或用腺病毒E1序列转化的人胚胎成视网膜细胞。在一个优选实施方案中，所述细胞源自PER.C6TM。这一细胞系已显示易于进行包括培养在内的高通量操作(WO99/64582)。
在本发明的特殊的实施方案中，根据鉴定本发明的至少一种宿主细胞的方法，所述抗体混合物包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多具有不同特异性和/或亲和力的抗体。
这一方法的潜在好处在于允许同时探索许多可能的组合，这些组合固有地包括在所产生的混合物中存在双特异性抗体。因此，可以测试更多组合，而不仅仅是通过在这些组合中以组合数目或不同抗体存在的比率将纯化的已知单克隆抗体进行混合。
通过本发明的方法鉴定的克隆可用于生产所需的抗体混合物。因此本发明的另一方面是提供生产抗体混合物的方法，该方法包含如下步骤：培养通过鉴定至少一个生产本发明的抗体混合物的宿主细胞克隆的方法所鉴定的宿主细胞，所述培养在有益于编码至少一个轻链和至少两个不同重链的核酸分子表达的条件下进行。所生产的抗体可以从宿主细胞和/或从宿主细胞培养物，例如从培养基中回收。抗体混合物可以根据本领域技术人员已知的多种技术回收。本发明的还有一个方面是提供用前述本发明的方法得到的抗体的混合物。所述混合物可以用于多种目的，例如治疗或诊断疾病，还可以替代单克隆或多克隆抗体或除了使用单克隆或多克隆抗体之外被使用。
本发明的方法可以适宜地使用编码抗体的核酸分子，这样的核酸分子已经通过任何适宜的方法得到，包括体内，例如免疫方法或体外，例如抗体展示方法(A.Plückthunetal，InVitroselectionandevolutionofproteins.In：Adv.Prot.Chem.，F.M.Richardsetal编辑，AcademicPress，SanDiego，2001，vol55：367-403)，例如噬菌体展示，核糖体展示或mRNA展示(C.Schaffitzeletal.，InVitroselectionandevolutionofprotein-ligandinteractionbyribosomedisplay.In：Protein-ProteinInteractions.AMolecularCloningManual，E.Golemis编辑，冷泉港实验室出版社，纽约，2001，535-567页》和酵母展示(例如WO99/36569)。用噬菌体展示鉴定针对一定靶的抗体的方法是本领域技术人员已知的，其中靶可以为已知抗原或存在于抗原混合物中的未知抗原。一般地，在它们的表面表达抗原结合结构域或其衍生物的噬菌体的文库与感兴趣的抗原或抗原混合物一起孵育，其中所述抗原结合结构域由所述噬菌体中存在的遗传物质编码，然后得到展示与所需抗原结合的抗原结合位点的噬菌体亚群的结合，而非结合噬菌体则被丢弃。这样的选择步骤可以重复一次、两次或更多次以获得对感兴趣的抗原多少具有特异性的噬菌体群。为了得到抗体、其部分或衍生物的噬菌体展示方法已被广泛描述，在例如(CFBarbasIIIetal，PhageDisplay.Alaboratorymanual.冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，2001)。用于这样的筛选的文库可以通过使用一或多个轻链的遗传信息组合编码多个重链的遗传信息产生。DeKruifetal.(1995b)所描述的文库包含7个轻链。因此，在一组(apanel)可例如用DeKruifetal(见上)、美国专利6,265,150所描述的方法得到的、与靶结合的噬菌体中，呈现的不同轻链不超过7个，而且如果组足够大，可以发现具有与不相关的重链偶联的相同轻链的几个噬菌体。这样的噬菌体可以用来获得在本发明的方法中有用的核酸分子。
本发明的另一方面是提供生产针对靶的抗体的混合物的方法，该方法包括如下步骤：i)将包含抗体或抗体片段的抗体展示文库与包含靶的材料接触，ii)至少一个选择与所述靶结合的抗体或抗体片段的步骤，iii)鉴定与所述靶结合的至少两个抗体或抗体片段，其中所述至少两个抗体或抗体片段包含共同轻链，iv)将编码所述轻链的核酸序列和编码所述至少两个抗体的重链的一或多个核酸序列导入宿主细胞，v)在有益于所述核酸序列表达的条件下培养所述宿主细胞的克隆。抗体展示文库可以为噬菌体展示文库、核糖体展示文库、mRNA展示文库或酵母展示文库。步骤i)和ii)可以任选地重复一次或更多次。
编码用噬菌体展示、核糖体展示或酵母展示方法获得的抗体的核酸序列可以在将它们被导入到宿主细胞之前用本领域技术人员已知的标准分子克隆方法和手段加以转变以编码任何所需的抗体形式，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgD、IgE(例如Boeletal，2000中所描述的)。
本领域技术人员将会清楚，其中只有一条轻链被呈现的文库按照本发明是特别有用的，因为从这样的文库所能得到的所有抗体将具有在用每条重链与靶抗原结合时具有功能的共同轻链。换句话说，与本发明的方法相一致，避免了非功能性轻链-重链二聚体的形成。具有广泛的H链所有组成成分和唯一或非常少的L链序列的噬菌体抗体展示文库在本领域已经被揭示(Nissimetal，1994；Vaughanetal，1996)。一般地，抗体特异性在很大程度上似乎由它的重链决定。甚至有可能筛选和鉴定不对抗体的结合作出显著贡献的轻链，这样的轻链也可以根据本发明被适宜地使用。也有可能遵循本发明的教导，但使用一条重链、使轻链不同。然而，使用一条共同轻链和不同重链看来是优选的，下面的观察支持抗体特异性似乎受它的重链序列控制的观点。在受体编辑过程中，B细胞具有监测它们的免疫球蛋白受体是否编码潜在有害的自身抗体的机制，表达自身抗体的B细胞用另一重链替换所表达的重链而保留所表达的轻链。因此，产生了不编码自身抗体的新抗体特异性。这表明，单一轻链可以成功地与多个重链二聚化以形成不同抗体特异性(Nemazee，2000；Casellasetal，2001)。已经报道了一系列用带有不同轻链基因的单一重链基因转染的细胞系，所产生的抗体不管轻链是什么在很大程度上保持它们的特异性(Radicetal，1991)。不同抗体已经从用单一轻链构建的文库中得到(Nissimetal，1994)。我们已经从DeKruifetal(1995)所描述的文库中得到几个抗体，文库用7条轻链构建，抗体具有相同轻链但不同特异性(见例如分别在WO01/48485和WO02/18948中描述的实施例1：antibodiesbindingtoEpCAMandCD46)。除了针对靶筛选噬菌体文库外，也可能从已被证实它的价值的抗体入手，根据本领域技术人员已知的方法，例如噬菌体展示，在制备只与这一特殊轻链组合的重链文库中使用这一抗体的轻链。利用这一策略，单克隆抗体可被用来获得本发明的、功能上类似于针对相同靶的多克隆或寡克隆抗体的抗体混合物。或者，可以使用与Jespersetal(1994)所描述的用来获得以功能性啮齿类动物抗体为基础的人抗体的方法有相似之处的方法。非人来源的已知抗体的重链首先被克隆，作为模板链与人轻链的所有组成成分配对以用于噬菌体展示，随后筛选与抗原或抗原混合物结合的噬菌体。所选中的轻链随后与噬菌体上所展示的人重链的所有组成成分配对，再次选择噬菌体以发现几个当与轻链配对时能和感兴趣的抗原或抗原混合物结合的重链。这能够生成针对靶的人抗体的混合物，对此迄今为止只有非人单克隆抗体被描述过。有可能当单个抗体不具有对靶的高亲和力、而高亲和力对单克隆抗体的有效性通常是必需的时候，本发明的混合物已经具有有益的功能效果。这样的优势在于，对于本发明的方法和混合物来说，与涉及单克隆抗体的方法相比，较少的情况下需要亲和力成熟。
重链和轻链编码序列可以同时或相继被导入宿主细胞。本发明的另一方面也制备了包含编码抗体轻链的重组核酸的宿主细胞。这样的细胞可以例如通过所述核酸的转染得到，任选可以鉴定具有轻链高表达的克隆。已建立的克隆可以随后被用来加入编码本发明的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多重链遗传信息，通过将编码这些的核酸分子导入已经含有轻链的克隆的细胞进行。编码重链的核酸分子可以一同被导入所述宿主细胞。当然也可能将它们相继导入，例如通过使用不同选择标记，如果因为细胞不接纳足够拷贝的重组核酸分子而不是所有重链都能被同时导入时这会有好处。将重组核酸分子导入宿主细胞的方法是本领域技术人员熟知的，包括转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、病毒感染等等。本领域技术人员有数种可能性将具有感兴趣的核酸序列的更多载体导入相同的宿主细胞，见例如Sambrook，FritschandManiatis，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第2版，1989；CurrentProtocolsinMolecularBiology，AusubelFM，etal编辑，1987；theseriesMethodsinEmzymology，(AcademicPress，Inc.)。用来将核酸导入本发明的真核宿主细胞的适当的显性选择标记可以为G418或新霉素(遗传霉素)、潮霉素或霉酚酸、嘌呤霉素等等，对这些标记来说编码抗性的基因存在于表达载体上。更多的可能性包括例如使用含有DHFR基因或谷氨酸合酶的载体分别在DHFR-细胞中存在氨甲蝶呤或在谷氨酰胺营养缺陷体中缺乏谷氨酰胺的条件下进行选择。使用带有不同选择标记的表达载体使得继而将感兴趣的重链序列转染入已经稳定含有先前通过使用其它选择标记而被导入的其它重链的宿主细胞成为可能。也可能使用能被不止一次使用的选择标记，例如当含有突变、内含子、或致使它们浓度依赖的被弱化的启动子(例如EP0724639；WO01/32901；美国专利5,733,779)。或者，选择标记通过在使用后将它从宿主细胞删除，例如通过位点特异的重组，可以被再次使用。位于被位点特异的重组酶所识别的序列，例如lox位点或FRT位点之间的可选择标记被用来生成第一个稳定的转染子(Cre-lox位点特异的重组见WilsonandKola，2001)。随后，用匹配位点特异性重组酶，例如Cre或Flp将可选择标记从宿主细胞DNA上切割下来。随后的转染可以适宜地使用相同的选择标记物。可以制备每个包含编码不同轻链的遗传信息的不同宿主细胞克隆。如果抗体用抗体展示方法鉴定，则有可能制备几个宿主细胞，每个包含出现在抗体展示文库中的一个轻链。在用抗体展示鉴定与靶结合的抗体之后，编码重链的核酸分子可以被导入包含能与重链配对的共同轻链的宿主细胞。本发明的一个方面因而是提供制备用来生产抗体混合物的宿主细胞的方法，该方法包括如下步骤：将编码轻链的核酸分子和编码3、4、5、6、7、8、9、10或更多能与所述轻链配对的不同重链的一或多个核酸序列导入所述宿主细胞，其中所述核酸分子被相继或同时导入。当然也可能同时导入至少两条所述核酸分子，并继而导入至少另外一条所述核酸分子。在本发明的还有另一方面，提供用来制备用来生产抗体混合物的重组宿主细胞的方法，该方法包含如下步骤：将编码2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多不同重链的一或多个核酸分子导入包含编码能与至少两条所述重链配对的轻链的核酸序列的重组宿主细胞中。
为以防万一本发明的重组宿主细胞不表达足够的轻链与所有所表达的至少两个重链二聚化，编码轻链的核酸分子的额外拷贝可转染入细胞中。
除了转染后的随机整合，将转基因整合入基因组预先确定的位置而导致良好表达水平的方法也可以根据本发明被使用。这样的方法可以例如使用通过同源重组进行的位点特异性整合(见例如WO98/41645)，或使用位点特异性重组酶(GormanandBullock，2000)。
本发明的还有一个方面是提供包含编码轻链的核酸序列和编码至少两条能与所述轻链配对的不同重链的一或多个核酸序列的转基因非人哺乳动物或转基因植物，其中所述编码所述轻链和重链的核酸序列在组织特异性启动子的控制之下。植物中的启动子也可以是非组织特异性的，并且也可以使用普通的基因表达元件，例如CaMV35S启动子和胭脂氨酸合酶polyA添加位点。所述轻链根据本发明是共同轻链。在特殊的实施方案中，本发明的转基因动物或植物包含3、4、5、6、7、8、9、10个或更多重链序列。除了以细胞培养物作为重组蛋白质的生产系统外，本领域也揭示了使用转基因动物、转基因植物，和例如用转基因鸡在鸡蛋中生产蛋白质等等，来生产感兴趣的重组蛋白质(Pollocketal，1999；LarrickandThomas，2001；WO91/08216)。这些通常包含与组织特异性启动子可操作地联合的编码一或多个感兴趣的蛋白质的一或多个重组基因。例如已经表明重组抗体可以以高水平在含有位于哺乳动物乳腺特异启动子之后的编码重链和轻链的核酸的转基因动物的乳汁中产生(例如Pollocketal，1999；WO95/17085)。在这方面特别有用的是能够被挤奶以获得抗体的母牛、绵羊、山羊、猪、兔、小鼠等等。有用的启动子是酪蛋白启动子，例如β-酪蛋白启动子、αS1-酪蛋白启动子、乳清酸性蛋白(WAP)启动子、β-乳球蛋白启动子、α-乳清蛋白启动子等等。在转基因哺乳动物乳汁中生产生物制药蛋白质已经被广泛描述(例如Pollocketal，1999)。除了哺乳动物乳腺特异启动子，也可以使用其它组织特异性启动子，以指导向血液、尿液、唾液等等的表达。包含重组核酸分子的转基因动物的生成已经被广泛证明，并可包括卵母细胞的显微注射(见例如WilmutandClark，1991)、转染后的核转移(例如Schniekeetal，1997)、重组病毒感染(例如美国专利6291740)等等。针对哺乳动物细胞的核转移和克隆方法对本领域技术人员来说是已知的，在例如(Campbelletal，1996；Wilmutetal，1997；Dinnyesetal，2002；WO95/17500；WO98/39416)中描述。现在有可能克隆大多数这些动物，以生成遗传上同一的动物系，使本领域技术人员有可能在生产所需抗体混合物的个体动物被鉴定后创造这样的品系。或者，可以使用经典育种方法来产生转基因后代。产生转基因动物用来在乳汁中生产重组蛋白质的策略在Brinketal，2000中描述。
生产抗体的转基因植物或植物细胞也已被描述(Hiattetal，1989；Peetersetal，2001)，针对这一目的的有用的植物包括谷物、玉米、烟草、大豆、苜蓿、水稻等等。能例如被用于植物细胞的组成型启动子为CaMV35S和19S启动子，农杆菌启动子nos和ocs。其它有用的启动子为光可诱导启动子，例如rbcS。组织特异启动子可以例如是种子特异的，例如来自玉米醇溶蛋白、napin、β-菜豆碱、泛素的启动子，或块茎特异的、叶子特异的(例如在烟草中有用的)、根特异的等等。也可能通过同源重组转化质体细胞器，以在植物中表达蛋白质。在重组植物或其部分，或重组植物细胞培养物中表达蛋白质的方法和手段是本领域技术人员已知的，已经例如在(Giddingsetal，2000；WO01/64929；WO97/42313；美国专利5888789，6080560；实用指南见MethodInMolecularBiologyvol.49，“PlantGeneTransferAndExpressionProtocols”，JonesH，1995)中加以描述。其它用来生产重组蛋白质的转基因系统也已被描述，包括使用转基因鸟类在卵中生产重组蛋白质(例如WO97/47739)，使用转基因鱼(例如WO98/15627)，并可以与本发明的教导组合使用以获得抗体混合物。也有可能使用体外转录/翻译或体外翻译系统来表达本发明的抗体混合物。本领域技术人员将会明了，本发明的教导将允许在编码轻链和重链的重组核酸能被导入和表达的系统中生产抗体混合物。优选这样的系统能够生产由所述核酸序列编码的抗体，而无需在所述系统中对所述核酸序列进行扩增。在本发明的另一方面中，提供了来自本发明的转基因非人动物或转基因植物的细胞。这样的细胞可被用于使用本领域技术人员已知的技术，例如核转移或其它已知的从单个细胞克隆整个生物体的方法，产生本发明的动物或植物。本发明的细胞也可以通过将轻链和至少两个重链序列导入能够成为转基因动物或植物的一部分的非人动物或植物的分离细胞而得到。对这样的目的特别有用的是胚胎干细胞。这些能够加入种系，因此导入这样细胞的遗传信息可以被传递给将来的后代。此外，当用编码轻链和重链的核酸分子转化时，例如通过使用植物转化细菌根瘤土壤杆菌或通过粒子轰击、或用重组植物病毒感染后，棉花、谷物、番茄、大豆、土豆、矮牵牛和烟草的植物细胞培养物可以被用作宿主。
本发明的另一方面是提供包含重组生产的抗体混合物和适当的载体的药物组合物，其中在所述重组生产的抗体混合物中呈现至少两条不同重链。本文所用的药学上可接受的载体例如但不限于佐剂、固体载体(solidcarrier)、水、缓冲液或在本领域中用来支持治疗成分的其它载体，或其组合。在特殊的实施方案中，3、4、5、6、7、8、9、10个或更多不同重链在所述混合物中呈现。所述混合物可以通过混合重组生产的单克隆抗体得到，也可以通过本发明的方法获得。所述混合物可以因而包含对所述抗体来说的共同轻链。所述混合物可以包含双特异性抗体。所述混合物可以从源自单一宿主细胞的克隆，即从包含相同重组核酸分子的细胞群中生产。本文所用术语“重组生产”指通过生产由导入这样的宿主细胞或其组现先的重组核酸所编码的抗体的宿主细胞来生产。它因此不包括生产多克隆抗体的经典方法，其中个体用抗原或包含抗原的混合物免疫，然后这一个体所生产的抗体从个体中，例如从血液中回收。
本发明的另一方面是提供抗体混合物，其中呈现至少两条重链，用于人类或动物个体的治疗或诊断。在另一方面，本发明提供了呈现至少两个不同重链的抗体混合物在制备用于人或动物个体的疾病或紊乱的治疗或诊断的药物中的应用。在特殊的实施方案中，在所述混合物中呈现2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多的重链。所述抗体混合物可以为本发明的抗体混合物，或通过本发明的方法来得到。在所述混合物中的抗体可以优选包含共同轻链。混合物可以包含双特异性抗体，并可以从源自单一宿主细胞的克隆，即含有相同重组核酸分子的细胞群中重组生产。靶可以被用来筛选如前面所描述的抗体展示文库，以获得2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多包含与靶结合的共同轻链的抗体，生产本发明教导的这些混合物。事实上可应用单克隆抗体的任何医学领域都适于应用本发明的混合物。这可以例如包括治疗自身免疫疾病和癌症，包括脑、头颈、乳腺、前列腺、结肠、肺等等的实体肿瘤，以及血液肿瘤例如B细胞瘤。能用本发明的混合物治疗的瘤性紊乱包括白血病、淋巴瘤、肉瘤、癌、神经细胞肿瘤、鳞状上皮细胞癌、生殖细胞肿瘤、转移瘤、未分化肿瘤、精原细胞瘤、黑素瘤、骨髓瘤、成神经细胞瘤、混合细胞肿瘤、感染剂所引起的瘤形成，以及其它恶性肿瘤。抗体混合物的靶可以包括，但不限于HER-2/Neu受体，其它生长因子受体，例如VEGFR1和VEGFR2受体，B细胞标记，例如CD19、CD20、CD22、CD37、CD72等，T细胞标记，例如CD3、CD25等，其它白血球细胞表面标记，例如CD33或HLA-DR等，细胞因子，例如TNF、白细胞介素，这些细胞因子的受体，例如TNF受体家族成员，等等。预期这样的抗体混合物在癌组织或其它包含复杂多抗原的细胞，例如微生物或病毒的治疗中的应用与应用单一单克隆抗体相比将较少发生表位丧失逃逸变体。现今的几种治疗使用源自被免疫的人或动物的抗体的多克隆混合物。这些治疗可以用本发明的混合物替代。这些混合物的用途也可以包括用在移植领域已知的移植物对宿主的排斥中，例如通过使用抗胸腺细胞抗体。预期抗体的混合物在治疗复杂抗原或包含抗原的混合物例如细菌或病毒上优于单克隆抗体。因此，本发明的用途也可以包括抗细菌和真菌菌株的用途，例如在病原细菌例如多种药物耐受的金黄色葡萄球菌(S.aureus)等等，真菌例如白色假丝酵母(Candidaalbicans)和曲霉种，酵母等等所引起的感染性疾病的治疗中。本发明的混合物也可被用于针对病毒，例如狂犬病毒属成员，例如狂犬病病毒的暴露后预防，或用于针对病毒例如水痘-带状疱疹病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、人类免疫缺陷病毒、人Metapneumo病毒、流感病毒、西尼罗河病毒、引起严重急性呼吸综合症(SARS)的病毒，等等的治疗或预防。本发明的混合物也可以被用于针对细菌和病毒制剂，以及针对生物战的潜在威胁的毒性物质的保护。因此，本发明的用途也可以包括针对细菌株，例如炭疽芽孢杆菌(bacillusanthracis)、肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridiumbotulinum)毒素、产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridiumperfringens)ε毒素、鼠疫耶尔森氏菌(YersiniaPestis)、土拉热弗郎西斯氏菌(Francisellatulariensis)、伯氏考克斯氏体(Coxiellaburnetii)、布鲁氏菌(Brucella)属的种，葡萄球菌(Staphylococcus)肠毒素B、或针对病毒例如大天花、引起脑膜脑炎综合症(EEEV、VEEV和WEEV)的甲病毒属、已知引起出血热的病毒例如Ebola、马尔堡和Junin病毒、或针对病毒，例如Nipah病毒、汉坦病毒、森林脑炎病毒和黄热病病毒、或针对毒素，例如来自蓖麻(Ricinuscommunis)的蓖麻毒蛋白等等的用途。本发明的混合物的用途也可以包括针对单细胞或多细胞寄生虫的用途。本发明的抗体的重组混合物可以成为获自用于被动免疫的人血清库、或获自超免疫动物的血清的多克隆抗体的安全替代物。混合物可以在多种治疗应用，包括癌症、变态反应、病毒性疾病、慢性炎症等等中比重组单克隆抗体更有效。
已有描述，肿瘤反应性单克隆抗体的同种型二聚体化显著增加它们诱导生长停滞或肿瘤细胞凋亡的能力(Ghetieetal，1997)。有可能，当针对靶细胞，例如肿瘤细胞或感染性微生物上的受体或其它表面抗原的抗体根据本发明被生产时，本发明的混合物中存在的双特异性抗体也可以交联靶细胞表面的不同受体或其它抗原，因此这样的混合物也可以非常适于杀死这样的细胞。或者，当不太需要双特异性抗体时，本发明也提供了重组生产主要包含单特异性抗体的抗体混合物的方法。已经有描述，用RituximabTM(抗-CD20单克隆抗体)治疗的功效在加入抗CD59抗体后增加(Herjunpaaetal，2000)。因此，预期在包含以B细胞受体识别抗体形式的抗肿瘤抗体的本发明的混合物中加入抗CD59抗体增加肿瘤细胞对补体攻击的敏感性。也已经显示，抗-CD19、抗-CD22和抗-CD38-皂草素免疫毒素的三重组合鸡尾酒在免疫缺陷小鼠模型中的人B细胞淋巴瘤的治疗中比单个成分有效得多(Flavelletal，1997)。许多其它的组合也是可行的，可由本领域技术人员设计。一般地，能识别多重B细胞表位的抗体混合物的使用很可能将减少逃逸变体的发生。
另一可能的靶是由Her-2/Neu(ErbB2)原癌基因编码的跨膜酪氨酸激酶受体(抗-Her2抗体见美国专利5,772,997和5,783,186)。Her-2在30％的高度恶性乳腺癌中过表达，针对这一靶的成功抗体，以HerceptinTM(Trastuzumab)为名市场化，已被开发。已经显示，用单克隆抗体混合物靶向多重Her-2表位导致人乳腺癌细胞系体外和体内抗生长活性的改善(Spiridonetal，2002)。Her-2可以因此是本发明的抗体混合物的良好靶。对这一目的有益的抗体可以通过本发明描述的方法，包括抗体展示方法得到。
人类抗体能够通过与免疫效应细胞上的免疫球蛋白受体结合引起效应子功能。人IgG，尤其是IgG1和IgG3，固定补体以诱导CDC，并与Fcγ受体相互作用以诱导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬、胞吞、呼吸爆发的诱导和炎性介质和细胞因子的释放。人IgA与FcαR相互作用，也导致ADCC的有效激活和靶细胞的吞噬。因此，由于FcγR和FcαR在外周血细胞上的差异分布(Hulsetal.，1999)，使用针对靶和既由IgG也由IgA组成的抗体混合物将潜在地使不同免疫效应细胞的补充和激活最大化。这样的既有IgG也有IgA的混合物可以通过使用两种不同的生产细胞系在分开的生产过程中生产IgG和IgA单克隆抗体来得到，但也可以从既生产IgG也生产IgA单克隆抗体的单一细胞系中得到。这样的优势在于只需要开发一个生产程序。因此，当提到不同重链时，在恒定区有所不同的重链也包含在本发明中。使用共同轻链的原则也可以被用来生产来自宿主细胞的同种型的混合物。因而本发明的另一方面是提供生产包含来自宿主细胞的不同同种型的抗体混合物的方法，该方法包含如下步骤：在对所述核酸序列的表达有益的条件下，培养包含编码轻链的核酸序列和编码能与所述轻链配对的不同同种型的至少两条重链的核酸序列的宿主细胞。根据本发明的这一方面，不同重链可以具有同样的可变区，而只在它们的恒定区有所不同(即不同种型，具有相同特异性)。在一个特殊的实施方案中，所述同种型包含至少IgG和IgA和/或IgM，优选IgG1或IgG3和IgA。也可使用IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的其它组合。在这些实施方案中，由于可变区是相同的，双特异性抗体将不会被生产。
在根据本发明这一方面的其它实施方案中，不仅重链的恒定区可以不同，可变区也可以不同，因而产生与相同轻链配对的不同的特异性。当为一特定目的不需要双特异性抗体时，例如因为由于双特异性抗体的存在使得抗体混合物不那么有效，有可能使用本发明的与共同轻链组合的至少两条重链，其中所述重链在恒定区有足够的不同以减少或防止在不同重链之间配对，例如通过使用不同同种型，例如一个IgG1和一个IgG3的重链(示意图见图11)。如果还能配对的话，预期不同同种型的重链与相同重链相比会以较低的效率进行配对。或者，也有可能在它们的恒定区对不同重链进行工程化使得同种型二聚体化胜过异二聚体化，例如通过导入自身互补(self-complementary)相互作用(可能性见例如WO98/50431，例如“protuberance-into-cavity”策略(见WO96/27011))。因此本发明的另一方面是提供在重组宿主中生产抗体混合物的方法，该方法包括如下步骤：在重组宿主细胞中表达编码共同轻链的核酸序列和编码在可变区不同的并能与所述共同轻链配对的至少两条不同重链的核酸序列，其中所述重链进一步在它们的恒定区有足够的不同以减少或防止不同重链之间的配对。在一个实施方案中，所述重链为不同的同种型。在特殊的实施方案中，3、4、5、6、7、8、9、10个或更多不同重链被表达。用这一方法获得的抗体混合物也在本发明中实施。这样的混合物将主要包含单特异性抗体。
本发明的教导也可用于获得新的多特异性抗体或其混合物。因此，在另一方面，本发明提供在重组宿主中生产包含二聚体IgA同种型{(IgA)2}抗体的抗体混合物的方法，其中至少部分所述二聚体IgA抗体在每一IgA亚单位具有不同结合区域，该方法包含如下步骤：在重组宿主细胞中表达编码共同轻链的核酸序列和编码能够与所述共同轻链配对的IgA同种型的至少两个不同重链的核酸序列，其中所述不同重链在它们的可变区有所不同。IgA分子的二聚体化可以通过共表达J链加以提高(Yooetal，1999)。所述二聚体化的IgA抗体具有两种特异性(所生产的和混合物中存在的一种可能形式的示意图见图9)。还在另一方面，本发明提供生产包含具有至少两种不同特异性的IgM抗体的抗体混合物的方法，该方法包含在重组宿主细胞中表达编码共同轻链的核酸序列和编码IgM同种型的至少两条不同重链的核酸序列的步骤，其中所述重链能与所述共同轻链配对，并形成功能性抗原结合区域。在有J链存在下，在IgM五聚体中可以包含高达5种特异性，在缺乏J链时，在IgM六聚体中高达6种(Yooetal，1999)。因此，在特殊的实施方案中，3、4、5或6个IgM重链根据本发明的这一方面与共同轻链共表达。根据本发明的这一方面，可被生产和在混合物中存在、当五个不同重链与一个共同轻链表达的一个可能形式的示意图见图10。本发明也提供具有至少两种不同特异性的IgA二聚体、IgM五聚体或六聚体。这些分子可以从本发明的单一宿主细胞的克隆中生产。携带具有不同特异性的抗原结合区域的这样的分子可以结合相同抗原上的不同表位、一个细胞上的不同抗原、或不同细胞上的不同抗原，从而将抗原或细胞交联。
本发明的还有一个方面是提供在功能性测定中鉴定具有所需效果的抗体混合物的方法，该方法包含如下步骤：i)在功能性测定中加入抗体混合物；和ii)在所述测定中测定所述混合物的效果，其中所述抗体混合物包含具有共同轻链的抗体。在一优选的实施方案中，所述混合物包含在本发明的组合物中。
本发明还提供在单一宿主细胞中重组表达一或多种蛋白质的方法，其中在所述单一宿主细胞中至少4种不同多肽被表达。每一多肽被独立表达，并可以在异源启动子的控制之下。一或多种蛋白可以单独或作为混合物从所述宿主细胞的培养物中分离。优选地，这一实施方案的宿主细胞是人类细胞，和/或可以源于视网膜细胞，更优选在其基因组中包含腺病毒E1序列的细胞，最优选PER.C6细胞。
实施例
以下实施例被提供用于举例说明本发明，且不以任何形式解释为限制本发明的范围。除非另外指出，本发明的实施将使用免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，这些技术在现有技术范围内。参见例如Sambrook，Fritsch和Maniatis，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第二版，1989；CurrentProtocolsinMolecularBiology，AusubelFM等，1987；theseriesMethodsinEnzymology(AcademicPress，Inc.)；PCR2：APracticalApproach，MacPhersonMJ，HamsBD，TaylorGR，1995；Antibodies：ALaboratoryManual，HarlowandLane，1988。
实施例1在单细胞中用一条共同轻链和两个不同的重链可变区生产单克隆抗体混合物
通过用半合成文库(deKruif等，1995b)分别对结直肠(colorectal)细胞系SW40(Huls等，1999)和多发性骨髓瘤患者单核细胞的非均匀混合物(WO02/18948)进行选择，预先分离克隆UBS-54和克隆K53。进一步的研究显示克隆UBS-54和K53分别结合到EP-CAM同种型粘附分子(homotypicadhesionmolecule)(Huls等，1999)与膜辅因子蛋白CD46(WO02/18948)上。对这些克隆的DNA测序揭示它们在重链CDRs中是独特的，但它们含有相同的轻链序列(图3)。通过基本如(Boeletal，2000)所述方法，克隆UBS-54和K53的VH与VL被插入到含HAVT20前导序列和含κ型轻链的人IgG1恒定区的全部编码序列的表达载体中，这产生质粒pUBS3000Neo和pCD46_3000(Neo)(图4)。这些质粒单独地或组合地在PER.C6TM细胞中瞬间表达。简要地说，通过在无血清DMEM培养基中，于37℃用140μllipofectamine+10μgDNA(pUBS3000Neo或pCD46_3000(Neo)或10μg两者的混合物)孵育4小时，转染80cm2烧瓶。4小时后，用DMEM+10％FBS取代，细胞在37℃生长过夜。然后细胞用FBS洗涤，且培养基被Excell525培养基(JRHBioscience)取代。细胞被允许在37℃下生长6天，然后收集细胞培养上清。人IgG特异性ELISA分析(WO00/63403中所述)揭示对所有含有表达质粒的烧瓶来说，大约存在10μg/ml的IgG。在没有被表达质粒转染的对照烧瓶中，没有IgG1存在。随后，来自于各上清的人IgG根据厂商(AmershamBiosciences)所推荐的标准程序，采用蛋白A亲合层析纯化(HightrapProteinAHP，目录号1-040203)。洗脱后，样品在一MicroconYM30浓缩器(Amicon)中浓缩，且缓冲液换作10mM磷酸钠，pH6.7。随后在等电聚焦凝胶上分析12μg纯化的IgG(ServaPre-castIEFgels，pH范围3-10，目录号42866)。样品上样于低pH端，聚焦后用胶状蓝染色(图5)。泳道1表示瞬间表达的K53，泳道2表示瞬间表达的UBS-54，泳道3表示其中两种抗体共转染的细胞IgG样品。明显地，K53和UBS-54各自有一独特的pI图谱，且样品形成的共转染显示出其它独特的同种型，其中主要的同种型的pI在K53和UBS-54的之间。基于用Expasy主页(http://www.expasy.ch；Appel等，1994)所提供的ProtParam工具计算到的理论pI，这也被预测到了。K53和UBS-54的理论pI分别为8.24和7.65，然而代表一种由一条UBS-54重链和一条K53重链组成的异二聚体的同种型的理论pI为8.01。这样的异二聚体的装配只会发生在当单细胞不但翻译K53的重链还翻译UBS-54的重链，并将它们与共同轻链一起装配成全长IgG分子的时候。因此，本试验说明有可能在单细胞中表达两条独特的人IgG分子，且由这两种独特结合特异性组成的异二聚体也被有效地形成。
实施例2在PER.C6TM细胞系来源的克隆中生产抗人B细胞标记的抗体混合物。
本文举例说明了一种生产本发明的抗体混合物的方法，利用在重组宿主细胞中表达单条轻链和能与上述单条轻链配对的三条不同的重链以形成功能性抗体，如图6所示。编码可结合存在于人B细胞上的蛋白质，也就是CD22、CD72和II类主要组织相容性复合物(MHC)(进一步指HLA-DR)的抗体的噬菌体被预先从半合成噬菌体文库中分离出来(deKruif等，1995；vanderVuurstdeVries&Logtenberg，1999)。噬菌体克隆B28(抗CD22)、克隆I-2(抗HLA-DR)和克隆II-2(抗CD72)的VH和VL序列的DNA测序揭示除含相同CDR区的共有轻链序列(Vλ3)外，它们都包含一独特的VH序列(图7)。
克隆B28、I-1和II-2的VH和VL序列被克隆到含有重链的表达质粒的HAVT20前导序列之后。这种质粒的一个例子是pCRU-K01(含有κ重链序列，如果想要，可以被本领域技术人员很容易地用λ重链序列交换)，保藏于ECACC，保藏号为03041601。这种克隆产生对CD22、CD72和HLA-DR具有结合特异性的、编码全长人IgG1的质粒。这些质粒进一步分别是pCRU-CD22、pCRU-CD72和pCRU-HLA-DR。
稳定的PER.C6TM来源的细胞系通过本领域技术人员已知的方法生产(见例如WO00/63403)，例如，表达pCRU-CD22、pCRU-CD72或pCRU-HLA-DR上的遗传信息所编码的抗体的细胞系和表达所有三种质粒编码的抗体的细胞系。因此，PER.C6TM细胞在组织培养皿(直径10cm)或T80瓶中，以每皿大约2.5×106个细胞接种到添加了10％FBS的DMEM中，在其标准培养条件下(10％CO2浓度和37℃)保持过夜。次日，用Lipofectamine(InvitrogenLifeTechnologies)并依照厂商所提供的标准流程，在37℃于另外的培养皿中进行转染，用1-2μgpCRU-CD22、1-2μgpCRU-D72、1-2μgpCRU-HLA-DR或1μg的pCRU-CD22、pCRU-CD72和pCRU-HLA-DR的混合物。作为转染效率的对照，一些培养皿用LacZ对照载体转染，而一些培养皿不转染以用做阴性对照。
4到5小时后，用DMEM将细胞洗涤两遍，不经挑选用新鲜培养基重饲(refed)。第二天，培养基被含有500μg/mlG418的新鲜培养基替换。每2天或每3天，细胞用含有相同浓度G418的培养基更新。大约接种后20-22天，可见大量的菌落，且从每一转染中挑选至少300个并通过96孔和/或24孔、通过6孔平板到T25瓶中生长。在这一阶段，细胞被冷冻(每传代培养菌落至少1小管但通常4小管)，且重组人IgG抗体的生产水平通过人IgG1特异性的ELISA方法在上清中测定(如WO00/63403中所述)。同样，在这一阶段，G418从培养基中移除不再使用。对具有代表性的菌落，将被大量培养以根据标准程序用蛋白A亲合层析法从条件上清中纯化重组人IgG1片段。来自不同克隆的纯化的人IgG1用SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)和用在它们的细胞表面表达这些人抗原的细胞转染子结合靶CD22、CD72和HLA-DR来分析(表达CD72和HLA-DR的转染子已经被vanderVuurst-deVries和Logtenberg所描述，1999；CD22转染子已根据PER.C6TM中相似的标准程序制得)。pCRU-CD22、pCRU-CD72和pCRU-HLA-DR共转染所得菌落通过对基因组DNA的PCR来筛选这三种构建体的每一种的存在与否。PCR产物的相同性进一步通过DNA测序证实。
接下来，我们证明了克隆细胞系导致了三种结合特异性的每一种的产生，即证明单细胞能够产生多于两种功能性人IgG’s的混合物。因此，对筛选产生这三种结合特异性的每一种为阳性的少数菌落(即通过DNA水平的PCR以及针对CD22、CD72和HLA-DR的特异性结合实验)，通过荧光激活细胞分选仪(FACS)(Becton&DickinsonFACSVANTAGESE)进行单细胞分选。或者，菌落以0.3个细胞/孔接种以保证克隆生长。克隆细胞群，此后被称作亚克隆，用新鲜培养基每周更新一次。亚克隆生长并通过24孔和6孔平板从96孔转移到T25瓶中。在这一阶段，亚克隆被冷冻(每个亚克隆至少1小管，但通常为4小管)，且在上清中用人IgG1特异性ELISA测定重组人IgG1抗体的生产水平。对具有代表性的亚克隆，大量培养以根据标准程序用蛋白A亲合层析法从条件上清中纯化重组人IgG1级分。
来自不同亚克隆的纯化的人IgG1随后如上所述分析从亲本克隆中获得的人IgG1那样分析，即通过SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)和结合靶CD22、CD72和HLA-DR。亚克隆也通过基因组DNA的PCR来筛选pCRU-CD22、pCRU-CD72和pCRU-HLA-DR三种构建体中的每一种的存在与否。PCR产物的相同性进一步通过DNA测序证实。
其它方法，如Southern印迹和/或FISH也能被用以确定在克隆细胞系中这三种构建体中的每一种是否存在。
对这三种构建体中每一种来说，被证明为转基因的亚克隆被培养一段相当长时期来测定这种转基因的存在是否稳定以及抗体混合物的表达是否达保持一致，不仅仅是在表达水平方面，还在细胞分泌的不同抗体同种型之间的比例上。因此，该亚克隆培养物被保留至少25倍群体倍增时间，或作为贴壁培养物或作为悬浮培养物。在每4-6个群体倍增，用人IgG特异性ELISA进行特定的产物检测，且大量被培养以获得细胞沉淀和上清。该细胞沉淀被用以评估在基因组DNA中这三种构建体的存在，通过PCR或Southern印迹和/或FISH。上清被用以如上所述来纯化重组人IgG1级分。在不同群体倍增获得的纯化的人IgG1如前述被分析，即通过SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)和用表达这些抗原的细胞转染子结合靶CD22、CD72和HLA-DR。
实施例3在表达多种人IgG的克隆中筛选最有效的功能性人IgG混合物
抗体混合物的功能性在基于细胞的测定中来分析，以确定是否人IgG1混合物抑制例如Ramos这样的B细胞系的增殖和/或诱导凋亡。也能应用其它的细胞系。此外，分析了该抗体混合物诱导例如Ramos细胞的抗体依赖的细胞毒性和补体依赖的细胞毒性的潜力。
在以下的各个实验中，分析了抗体混合物识别靶CD22、CD72和HLA-DR的功能性，且与每一单独IgG1抗体和三种单独IgG1特异性的等摩尔组合对比。
为评估抗体混合物抑制Ramos细胞增殖的能力，这些细胞在96孔板中(0.1-1.0×105个/ml)在抗CD22、CD72和HLA-DR的抗体混合物的几个浓度下(5-20μg/ml)孵育24小时。细胞的增殖通过在另外16小时的培养期间的3H-胸苷掺入测量。对生长的抑制通过相对于未经处理细胞(作为100％参考值)3H-胸苷掺入的百分比作图测定。
为分析Ramos细胞的凋亡的介导，这些细胞在48孔板中(0.2-1.0×106个/ml)在抗靶CD22、CD72和HLA-DR的抗体混合物的几个浓度下(5-20μg/ml)被刺激24或48小时。孵育期后，分析在凋亡细胞上暴露的磷脂酰丝氨酸(KoopmanG等，1994)。因此，收获细胞，用PBS洗两遍并用100μl在膜联蛋白V结合缓冲液(Caltag)中以1∶25稀释后的FITC标记的膜联蛋白V(Caltag)在室温下孵育10分钟。在用流式细胞计量术(FACSCalibur，BectonDickinson，SanJose，CA)分析样品之前，添加终浓度5μg/ml的碘化丙锭(PI)(Sigma)从凋亡细胞(膜联蛋白V+/PI-，早期凋亡细胞；膜联蛋白V+/PI+，晚期凋亡细胞)中区分坏死细胞(膜联蛋白V-/PI+)。
在一种替代测定中，凋亡是通过在孵育期交联抗Ramos细胞的细胞表面上的CD22、CD72和HLA-DR的抗体混合物与25μg/ml的羊抗人(Fc-特异性)F(ab)2多克隆抗体(JacksonImmunoresearchLaboratories，WestGrove，PA)所诱导的。
在另一种替代测定中，凋亡是通过在抗CD22、CD72和HLA-DR的抗体混合物的几种浓度下(5-20μg/ml)孵育Ramos细胞，同时将它们与化学敏感试剂阿霉素(Calbiochem)或地塞米松(UMCU，Utrecht，荷兰)共孵育所诱导的。
抗体混合物的抗体依赖的细胞毒性是将外周血单核细胞作为效应细胞在标准的51Cr释放测定中被分析的(Huls等，1999)。为了这个目的，1-3×106个Ramos细胞用100μCi(Amersham，Buckinghamshire，UK)在37℃标记1小时。在用培养基洗涤3遍之后，Ramos靶细胞以5×103个细胞/孔铺板在U形底96孔板中。通过Ficoll-Hypaque密度梯度获自健康捐赠者的外周血单核细胞被随后添加到每孔中，效应细胞：靶细胞的比例范围从80∶1到10∶1，一式三份。这些细胞在37℃在抗体混合物的不同浓度下(5-20μg/ml)孵育，终体积200μl。孵育4小时后，收获部分上清并测量51Cr释放。特异性裂解的百分比用以下公式计算：特异性裂解％＝([实验cpm-自发cpm]/[最大cpm-自发cpm]×100％)。最大51Cr释放通过向靶细胞添加tritonX-100至终浓度为1％来测定，自发释放用培养液单独孵育靶细胞后测定。
补体依赖的细胞毒性在类似的测定中被确定。替代效应细胞，现将50μl人血清添加到靶细胞中。随后，以同样的方式进行测定。
或者，抗体混合物的ADCC和CDC用铕释放测定(Patel和Boyd，1995)或用LDH释放测定(Shields等，2001)来确定。
实施例4应用噬菌体展示分离具有抗预定义的靶(Her-2)的相同的VL序列的多种噬菌体，及在重组宿主细胞中生产能够结合该靶的抗体混合物
能够结合存在相同蛋白质，例如表皮生长因子受体Her-2上的多表位的噬菌体展示scFv片段能从半合成噬菌体文库中分离(deKruif等，1995a，b)。有可能鉴定几个这样的噬菌体并选择包含相同轻链序列的那些进一步用于本发明的用途。半合成噬菌体文库是通过混合7个亚文库而形成的，其中每一个文库含有一种不同的轻链(deKruif等，1995a，b)。因此，应用这样的含有仅一种轻链和多种重链的亚文库筛选获得有相同VL序列的多种抗体是尤其实用的，且被进一步用于表达本发明的抗体混合物。
为选择抗Her-2的噬菌体，几种融合蛋白被产生，包含被融合到人IgG1的CH2和CH3结构域的Her-2胞外结构域的不同部分。为此目的，已经构建了pCDNA3.1zeo表达载体(InVitrogen)，其多克隆区含有一XhoI限制位点，位于人IgG1的CH2和CH3结构域前读框内的铰链区。采用本领域技术人员已知的标准分子生物学技术，用Her-2cDNA克隆为模板产生PCR片段。这些片段由独特5′限制位点，起始密码子和随其后的在读框内被连接到Her-2的全部胞外(EC)结构域或Her-2的部分EC结构域的真核前导序列，及随后的读框内的XhoI限制位点组成。这些PCR片段随后在读框内用CH2-CH3IgG1区域克隆到pCDNA3.1zeo表达载体。除含有Her-2的全部EC结构域的融合蛋白外，也产生了几种含有Her-2EC结构域的非重叠片段的较小的融合蛋白。这些编码Her-2-Ig融合蛋白的构建体被用于用Lipofectamine试剂(Gibco)进行的293T细胞的瞬时转染。转染5天后，收获293T细胞的上清，且Her-2-Ig融合蛋白根据标准程序用蛋白A亲合层析法纯化。
含有Her-2EC结构域非重叠片段的Her-2-Ig融合蛋白在饱和浓度下(0.5-5μg/ml)，于37℃经2小时被包被到MaxisorpTM塑料试管(Nunc)表面上。试管在2％的溶解于PBS的无脂奶粉(MPBS)中封闭1小时。同时，500μl(大约1013cfu)半合成噬菌体展示文库(根据前面所用术语的亚文库)被添加到2倍体积的4％MPBS中，其中该文库只有一条如DeKruif等(1995a，b)和其中的参考文献中所述的那样所制备的Vκ1轻链存在。此外，人血清被添加至终浓度15％，且封闭30-60分钟。Her-2-Ig包被的试管被倒空，加入封闭的噬菌体文库。该试管被封口并慢慢地被旋转1小时，随后无旋转孵育2小时。这些试管被倒空并在含0.1％Tween-20的PBS中洗涤10次，随后在PBS中洗涤5次。加入1ml的0.05M，pH2.2的甘氨酸-HCL，且试管被慢慢地旋转10分钟。洗脱的噬菌体被添加到500μlpH为7.4的1MTris-HCl中。对该混合物，加入3.5ml指数生长的XL1-blue细菌培养物。试管在37℃不摇动地孵育30分钟。随后，细菌被铺板于含氨苄青霉素，四环素和葡萄糖的2TY琼脂平板上。平板在37℃孵育过夜后，菌落被从平板上刮落用于准备富集的噬菌体文库，基本上如DeKruif等(1995a)所述。简单地说，刮落的细菌被用于接种含氨苄青霉素，四环素和葡萄糖的2TY培养基，并在37℃下生长至OD600为～0.3。辅助噬菌体被添加并被允许感染细菌，之后培养基被改为含氨苄青霉素，四环素和卡那霉素的2TY。继续在30℃孵育过夜。第二天，细菌通过离心从2TY培养基移除，之后噬菌体用聚乙二醇6000/NaCl沉淀。最后，噬菌体在少量的PBS-1％BSA中溶解，过滤灭菌并用于下一轮选择。选择/再感染程序进行两次。第2轮的选择后，单个的大肠杆菌(E.coli)菌落被用于制备单克隆噬菌体抗体。基本上，单菌落生长至对数期并被辅助噬菌体感染，之后噬菌体抗体生产过夜。含有噬菌体抗体的上清在ELISA中检测其结合Her-2-全部EC-Ig包被的96孔板的能力。
被选择的获自上述筛选的噬菌体抗体，通过ELISA确认其特异性。为此目的，含有Her-2EC结构域非重叠片段的Her-2-Ig融合蛋白被包被到MaxisorpELISA平板上。包被后，平板在2％MPBS中封闭。被选择的噬菌体抗体在等容积的4％MPBS中孵育。平板被倒空，在PBS中洗涤一次，之后加入被封闭的噬菌体。孵育进行1小时，平板在PBS0.1％Tween-20中洗涤，结合的噬菌体用缀合到过氧化物酶的抗-M13抗体检测。这一程序进行的同时，将直接抗甲状腺球蛋白的对照噬菌体抗体(DeKruif等，1995a，b)用做阴性对照。
在另一测定中，分析了选择的噬菌体抗体结合表达Her-2的BT474人乳癌细胞的能力。为用于流式细胞计量术分析，在BT474细胞染色前，噬菌体抗体首先于4℃在等容积的4％MPBS中封闭15分钟。噬菌体抗体与细胞的结合用生物素酰化的抗-M13抗体(SantaCruzBiotechnology)继之以链霉抗生物素蛋白-藻红蛋白(Caltag)来显色。
或者，识别Her-2上多表位的噬菌体抗体用基于噬菌体与Her-2的结合和与充分特性化的鼠抗Her-2抗体HER50、HER66和HER70(Spiridon等，2002)结合之间的竞争的方法来选择。为此目的，2×106个BT474细胞在4℃与半合成噬菌体展示文库的大约1013cfu(0.5ml)孵育，该文库中仅提供一种如在前描述的那样所制备Vκ1轻链，且被2倍体积的含有10％FBS的培养基封闭。该混合物在一密闭的试管中于4℃被慢慢地旋转2小时。随后，非结合噬菌体通过用50ml含10％PBS的冷培养基洗涤两遍移除。此后，识别Her-2上多表位的噬菌体通过在含饱和浓度(5-20μg/ml)的HER50、HER66和HER70鼠抗Her-2抗体的1ml冷培养基中重悬BT474细胞洗脱。细胞置冰上10分钟，旋沉，含抗Her-2噬菌体抗体的上清如前所述的那样用于再感染XL1-Blue细胞。
从通过前述筛选产生的Her-2特异性噬菌体抗体的组中，选择3种噬菌体抗体，它们识别3种不同的Her-2蛋白上的非重叠表位。这些克隆的VH序列和独特的Vκ1轻链序列被暂时称为VK1HER2-1，VK1HER2-2和VK1HER2-3，被克隆到表达质粒pCRU-K01(ECACC保藏号03041601)或类似的表达质粒的HAVT20前导序列之后，以获得编码具有Her-2结合特异性的全长人IgG1-κ的质粒。这些质粒被分别暂时称为pCRU-VK1HER2-1，pCRU-VK1HER2-2和pCRU-VK1HER2-3。根据本领域技术人员已知的方法，生产稳定的PER.C6TM来源的细胞系，表达pCRU-VK1HER2-1或pCRU-VK1HER2-2或pCRU-VK1HER2-3上的遗传信息编码抗体的细胞系和表达被全部3种质粒编码抗体的细胞系。因此，在组织培养皿(直径10cm)或T80瓶中，PER.C6TM细胞被接种到添加了10％FBS的DMEM中，大约每皿2.5×106个细胞并在其标准培养条件下(10％CO2浓度，37℃)保持过夜。第二天，用Lipofectamine(InvitrogenLifeTechnologies)，根据制造商提供的标准程序，于37℃在另外的培养皿中用或1-2μgpCRU-VK1HER2-1、1-2μgpCRU-VK1HER2-2、1-2μgpCRU-VK1HER2-3或1μg的pCRU-VK1HER2-1、pCRU-VK1HER2-2和pCRU-VK1HER2-3的混合物进行转染。作为转染效率的对照，几个培养皿被LacZ对照载体转染，同时几个培养皿不被转染以用做阴性对照。
5小时后，细胞用DMEM洗涤两次，不加选择用新鲜的培养基重饲。第2天，培养基用含500μg/mlG418的新鲜培养基替换。每2天或每3天，细胞用含相同浓度G418的培养基更新。大约接种后20-22天，可见大量菌落，从每个转染中至少挑选300个经96孔和/或24孔经6孔平板生长到T25瓶中。在这阶段，细胞被冷冻(每一亚培养菌落至少1小管，但通常为4小管)，重组人IgG抗体产生水平在上清中用人IgG1特异性ELISA测定。同样，在这一阶段，G418从培养基移除且不再重新应用。对具有代表性的菌落，大量培养用以根据标准程序用蛋白A亲合层析法于条件上清中纯化重组人IgG1级分。来自不同克隆的纯化的人IgG1在SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)中分析，用ELISA鉴定其与Her-2-Ig融合蛋白的结合，用流式细胞计量术来分析其与BT474细胞表面的Her-2的结合。
获自pCRU-VK1HER2-1，pCRU-VK1HER2-2和pCRU-VK1HER2-3共转染的克隆通过基因组DNA的PCR来筛选这三种构建体中每种存在与否。PCR产物的相同性进一步通过DNA测序确认。
接下来，我们证明了克隆细胞系是产生三种结合特异性的每一种的原因。因此，少数被筛选为对产生三种结合特异性的每一种呈阳性的菌落(既通过DNA水平的PCR也通过抗Her-2的特异结合测定)用荧光激活细胞分选仪(FACS)(Becton&DickinsonFACSVANTAGESE)进行单细胞分选。或者，菌落以0.3个细胞/孔接种以保证克隆生长。克隆细胞群，以下称为亚克隆，用新鲜培养基每周更新一次。亚克隆从96孔经24孔和6孔平板转移到T25瓶生长。在这一阶段，亚克隆被冷冻(每亚克隆至少1小管，但通常是4小管)，重组人IgG1抗体的生产水平在上清中用人IgG1特异性ELISA测定。对具有代表性的菌落，大量培养用以根据标准程序用蛋白A亲合层析法从条件上清中纯化重组人IgG1级分。
来自不同亚克隆的纯化的人IgG1随后如同前面所述对获自亲本克隆的人IgG1分析那样进行分析，即通过SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)和结合Her-2。亚克隆也将通过基因组DNA的PCR来筛选pCRU-VK1HER2-1、pCRU-VK1HER2-2和pCRU-VK1HER2-3这3种构建体中的每一种是否存在。PCR产物的相同性进一步通过DNA测序确认。
其它方法，例如Souther印迹和/或FISH也能用以测定这3种构建体中的每一种在克隆细胞系中是否存在。
被证明对这3种构建体的每一种是转基因的亚克隆培养一段时期来测定转基因的存在是否稳定以及抗体混合物的表达是否保持一致，不仅在表达水平方面，而且在细胞分泌的不同抗体的比例上。因此，亚克隆培养物被保持至少25个群体倍增时间，或作为贴壁培养物或作为悬浮培养物。在每4-6个群体倍增，用人IgG特异性ELISA进行特定的产物检测，且大量培养以获得细胞沉淀和上清。该细胞沉淀被用以评估在基因组DNA中这三种构建体的存在，通过PCR、Southern印迹和/或FISH。上清被用以如上面所描述的那样来纯化重组人IgG1级分。在不同群体倍增获得的纯化的人IgG1被如上述分析，即通过SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)和通过ELISA与HER-2的结合和应用BT474细胞的流式细胞计量术。
抗Her-2抗体的抗体混合物的功能性在基于细胞的测定中来分析，以确定是否人IgG1混合物抑制BT474细胞的增殖和/或诱导凋亡。此外，该抗体混合物被分析了其诱导BT474细胞的抗体依赖的细胞毒性和补体依赖的细胞毒性的潜力。
在以下所描述的每个实验中，识别Her-2的抗体混合物的功能性能够被分析，且与每一个IgG1抗体及3种单特异性IgG1分子的等摩尔组合相比较。
为评估抗体混合物抑制BT474细胞增殖的能力，这些细胞在96孔板中(1.5×105个/孔)贴壁过夜，并随后在抗Her-2抗体混合物的几个浓度(5-20μg/ml)下孵育72小时。细胞的增殖通过在最后6小时的培养期间的3H-胸苷掺入测量。生长的抑制通过相对于未经处理的细胞(作为100％参考值)3H-胸苷掺入百分比作图测定。
为分析BT474细胞的凋亡诱导，这些细胞在48孔板中(2.5×105个/孔，1ml)贴壁过夜，并随后在抗Her-2抗体混合物的几个浓度下(5-20μg/ml)孵育4小时。此后细胞通过胰蛋白酶消化收获，用PBS洗涤两遍并用100μl在膜联蛋白V结合缓冲液(Caltag)中以1∶25稀释的FITC标记的膜联蛋白V(Caltag)于室温下孵育10分钟。在用流式细胞计量术(FACSCalibur，BectonDickinson，SanJose，CA)分析样品之前，添加终浓度5μg/ml的碘化丙锭(PI)(Sigma)来从凋亡细胞(膜联蛋白V+/PI-，早期凋亡细胞；膜联蛋白V+/PI+，晚期凋亡细胞)中区分坏死细胞(膜联蛋白V-/PI+)。
抗体混合物的抗体依赖的细胞毒性是在如前面所述的标准的51Cr释放测定(Huls等，1999)中，将外周血单核细胞作为效应细胞，BT474细胞作为靶细胞进行分析的。补体依赖的细胞毒性在类似的测定中被确定。用于替代效应细胞，现将50μl人血清添加到靶细胞中。随后，测定如前所述进行。
或者，抗体混合物的ADCC和CDC用铕释放测定(Patel和Boyd，1995)或用LDH释放测定来确定(Shields等，2001)。
抗Her-2的抗体混合物的功能性也用体内动物模型检验，例如Spiridon等，2002所述。
实施例5在转基因动物乳汁中表达不同功能性人IgGs
根据厂商说明书，抗存在于人B细胞上的蛋白质，即CD22(克隆B28)、CD72(克隆II-2)和HLA-DR(克隆I-2)的噬菌体的VH和VL序列(图7)被克隆到表达质粒pBC1(如在pBC1小鼠乳汁表达系统所提供的，InvitrogenLifeTechnologies)中以在转基因动物中获得这些人IgG分子的乳腺和哺乳特异性表达。这些编码抗-CD22、抗-CD72和抗-HLA-DR的抗体序列的乳腺特异性表达载体根据厂商说明书导入鼠种系。通过对尾巴分离出的DNA的PCR，筛选获得的幼畜是否存在着三种构建体中的每一种。被确认为对这3种抗体的每一种为转基因的雌性或雄性幼畜被断乳和成熟。雌性转基因鼠在6-8周龄受精，乳汁样品在孕后的几个时间点获得。雄性转基因鼠用非转基因雌鼠交配，雌性转基因后代(按照上述PCR来确定)如对上述雌性转基因建立者(transgenicfounders)那样交配和挤乳。任何需要的时候，雌性或雄性转基因建立者被交配以产生下一代，以能够获得每一起始系(founderline)足够量的转基因乳汁。转基因乳汁用人IgG特异性ELISA分析是否存在人IgG，其不与鼠IgG或其它小鼠乳汁成分交叉反应。根据标准程序应用蛋白A亲合层析法，从转基因鼠的乳汁中纯化人IgG。纯化的人IgG用SDS-PAGE、等电聚焦和结合靶CD22、CD72和HLA-DR进行分析。抗体混合物的功能性如前所述那样被分析。
实施例6抗PER.C6TM来源的克隆中预定靶的IgA/IgG混合物的生产
抗同种型粘附分子EP-CAM(Huls等，1999)的噬菌体UBS-54的VH-VL序列不仅被克隆到编码含κ轻链的人IgG1的恒定结构域的载体中(表达载体pUBS3000Neo)，而且被克隆到编码含κ轻链的人IgA1的恒定结构域的表达载体中(表达载体pUBS54-IgA，图8)。因此，pUBS3000Neo和pUBS54-IgA来源的抗体结合EPCAM的相同表位。pUBS3000Neo和pUBS54-IgA来源抗体的唯一区别在编码重链恒定结构域的序列，由此导致或IgG1或IgA1同种型。这两个载体的κ轻链序列是相同的。
表达被pUBS3000Neo和pUBS54-IgA上的遗传信息所编码的抗体的稳定的PER.C6TM来源的细胞系，根据本领域技术人员熟知的程序来制备。因此，在组织培养皿(直径10cm)或T80瓶中，PER.C6TM细胞被接种到添加了10％FBS的DMEM中，大约每皿2.5×106个细胞，并在其标准培养条件下(10％CO2浓度，37℃)保持过夜。第二天，用Lipofectamine(InvitrogenLifeTechnologies)根据制造商提供的标准程序，于37℃在另外的培养皿中用1-2μgpUBS3000Neo和pUBS54-IgA进行转染。作为转染效率的对照，几个培养皿用LacZ对照载体转染，同时几个培养皿不被转染以用做阴性对照。
4-5小时后，细胞用DMEM洗涤两次，不加选择用新鲜的培养基重饲。第2天，培养基用含500μg/mlG418的新鲜培养基替换。每2天或每3天，细胞用含相同浓度G418的培养基更新。大约接种后20-22天，可见大量菌落，从每个转染中挑选至少300个经96孔和/或24孔经6孔平板生长到T25瓶中。在这阶段，细胞被冷冻(每一亚培养菌落至少1小管但通常为4小管)，重组人IgG和人IgA抗体的产生水平在上清中用人IgG1特异性ELISA以及人IgA特异性ELISA测定。同样，在这一阶段G418从培养基移除且不再重新应用。选择有代表性的菌落，大量培养以从条件上清中纯化重组人IgG1和人IgA级分，应用例如蛋白L或LA亲合层析、阳离子交换层析、疏水相互作用层析和凝胶过滤(或其组合)。来自不同克隆的纯化的人免疫球蛋白用SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)和用有该分子高表达的细胞系结合靶EPCAM来分析。克隆也将通过基因组DNA的PCR来筛选pUBS3000Neo和pUBS54-IgA的存在与否。PCR产物的相同性进一步通过DNA测序确认。
少数被筛选为对生产EPCAMIgG1和EPCAMIgA都呈阳性的克隆用荧光激活细胞分选仪(FACS)(BectonDickinsonFACSVANTAGESE)进行单细胞分选。或者，菌落以0.3个细胞/孔接种以保证克隆生长。克隆细胞群，以下称为亚克隆，用新鲜培养基每周更新一次。亚克隆被从96孔经24孔和6孔平板转移到T25瓶生长。在这一阶段，亚克隆被冷冻(每亚克隆至少1小管，但通常是4小管)，重组人IgG1和IgA抗体的生产水平在上清中用人IgG1特异性ELISA和人IgA特异性ELISA来测定。对于有代表性的菌落，大量培养以从条件上清中纯化重组人IgG1和人IgA级分，应用例如蛋白L或LA亲合层析、阳离子交换层析、疏水相互作用层析和凝胶过滤(或其组合)。来自不同克隆的纯化的人免疫球蛋白用SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)和用有该分子高表达的细胞系结合靶EPCAM来分析。亚克隆也将通过基因组DNA的PCR来筛选pUBS3000Neo和pUBS54-IgA是否存在。PCR产物的相同性进一步通过DNA测序确认。
其它方法，例如Southern印迹和/或FISH也能够被用于测定是否两种构建体在克隆细胞系中都存在。
实施例7抗克隆PER.C6TM细胞系的多个靶位的人IgG1/IgG3混合物的生产
噬菌体克隆UBS-54和克隆K53(图3)如实施例1所述的那样获得。克隆UBS-54的VH和VL通过已描述的方法(Boeletal，2000)被插入到含HAVT20前导序列和含κ轻链的人IgG1恒定结构域的全部编码序列的表达载体中。得到的质粒被称为pUBS3000Neo(图4)。将很明显，含有任何所需的同种型的重链恒定结构域的表达载体能够用现有技术中都能得到的这些区域的序列，通过分子生物学的常规方法构建。噬菌体克隆K53的VH和VL序列基本上如同已描述的方法那样(Boel等，2000)被克隆到表达载体中，该载体含HAVT20前导序列和含κ轻链的人IgG3重链的恒定结构域的全部编码序列。该表达载体被称做pK53IgG3。
这些质粒在PER.C6TM细胞中被瞬时表达，或单独或组合。简要地说，每80cm2瓶通过用140μlLipofectamine+10μgDNA(任选pUBS3000Neo、pK53IgG3或10μg两者的混合物)在无血清DMEM培养基中于37℃孵育4小时被转染。4小时后，这被DMEM+10％FBS所取代，细胞在37℃下生长过夜。然后细胞被用FBS洗涤，且培养基被Excell525培养基(JRHBioscience)取代。细胞在37℃下生长6天，然后收集细胞培养上清。进行人IgG特异性ELISA分析，即测量所有IgG亚型，来确定在转染的和非转染的PER.C6TM细胞中的IgG浓度。获自各上清的人IgG随后根据标准程序按照(AmershamBiosciences)厂商的建议用蛋白A亲和层析法(HightrapProteinAHP，目录号1-040203)纯化。洗脱后，样品在MicroconYM30浓缩器(Amicon)中浓缩，缓冲液被换为pH6.7的10mM磷酸钠。用有这些分子高表达的细胞系，例如LS174T细胞，分析了样本与靶EPCAM和CD46的结合。12μg纯化的IgG，来自其中两种抗体被共转染的细胞的、瞬时表达的UBS-54IgG1、K53IgG3或IgG随后在等电聚焦凝胶(ServaPre-castIEF凝胶，pH范围3-10，目录号42866)上分析。样本被上样在低pH的一边，且在聚焦后被用胶状蓝染色。确定每一样品的主要同种型的pI值用以例证是否有UBS-54IgG1、K53IgG3或双特异性异二聚体的表达，这依赖于怎样转染细胞。异二聚体的鉴定将表明单细胞已翻译了K53的IgG3重链和UBS-54的IgG1重链，并将他们与共同轻链一起组装为全长IgG分子。没有双特异性异二聚体存在表明有可能在单细胞中翻译K53的IgG3重链和UBS-54的IgG1重链两者，但是这些不与共同轻链一起被组装为全长IgG分子，即IgG1和IgG3重链存在优先结合。这仍然能够通过缺乏UBS-54IgG1和K53IgG3的共表达来解释。因此，表达pUBS3000Neo与pK53IgG3两者的稳定的克隆细胞系通过本领域技术人员所熟知的程序产生。在组织培养皿(直径10cm)或T80瓶中，PER.C6TM细胞被接种到添加了10％FBS的DMEM中，大约每皿2.5×106个细胞，并在其标准培养条件下(10％CO2浓度，37℃)保持过夜。第二天，用Lipofectamine(InvitrogenLifeTechnologies)根据制造商提供的标准程序，于37℃在另外的培养皿中用1-2μgpUBS3000Neo、pK53IgG3或两者转染。作为转染效率的对照，几个培养皿被LacZ对照载体转染，同时几个培养皿不被转染以用做阴性对照。
4-5小时后，细胞用DMEM洗涤两次，不加选择用新鲜的培养基重饲。第2天，培养基用含500μg/mlG418的新鲜培养基替换。每2天或3天，细胞用含相同浓度G418的培养基更新。大约接种后20-22天，可见大量菌落，从每个转染中挑选至少300个经96孔和/或24孔经6孔平板生长到T25瓶中。在这一阶段，细胞被冷冻(每一亚培养菌落至少1小管但通常为4小管)，且重组人IgG抗体的产生水平在上清中用所有亚型人IgG特异性ELISA测定。同样，在这一阶段G418从培养基移除并不再重新使用。选择有代表性的菌落，大量培养以根据标准程序遵循厂商(AmershamBiosciences)的建议用蛋白A亲合层析法(Hightrap蛋白AHP，目录号1-040203)从条件上清中纯化重组人IgG。来自不同克隆的纯化的人免疫球蛋白用SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)和具有这些分子高表达的细胞系，如LS174T细胞结合靶EPCAM与CD46来分析。克隆也通过基因组DNA的PCR来筛选pUBS3000Neo和pK53IgG3存在与否。PCR产物的相同性进一步通过DNA测序确认。少数被筛选为对产生EPCAMIgG1和K53IgG3都是阳性的克隆，用荧光激活细胞分选仪(FACS)(BectonDickinsonFACSVANTAGESE)进行单细胞分选。或者，菌落以0.3个细胞/孔接种以保证克隆生长。克隆细胞群，以下称为亚克隆，用新鲜培养基每周更新一次。亚克隆被从96孔经24孔和6孔平板转移到T25瓶生长。在这一阶段，亚克隆被冷冻(每一亚克隆至少1小管但通常为4小管)，且重组人IgG抗体产生水平在上清中用人IgG特异性ELISA测定。对于有代表性的亚克隆，大量培养以根据标准程序遵循厂商(AmershamBiosciences)的建议用蛋白A亲合层析法(Hightrap蛋白AHP，目录号1-040203)从条件上清中纯化重组人IgG级分。来自不同克隆的纯化的人免疫球蛋白通过SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)和用具有这些分子高表达的细胞系，例如LS174T细胞结合靶EPCAM与CD46或表达这些分子的转染子来分析。亚克隆也通过基因组DNA的PCR来筛选pUBS3000Neo和pK53IgG3存在与否。PCR产物的相同性进一步通过DNA测序确认。
其它方法，例如Souther印迹和/或FISH也可以用于测定是否两种构建体都存在于克隆细胞系中。
一旦克隆的亚克隆可得到且被确认为对表达UBS-54IgG1和K53IgG3两者为阳性，功能性K53和UBS-54的存在表明有可能可以在单细胞中用不同的同种型和共有轻链产生功能性IgG′s的混合物。分析结合EpCAM与CD46两者的双特异性抗体的表达将揭示具有不同亚型的不同重链将在多大程度上配对，这将影响产生的双特异性抗体的量。预期在这种情况下，将发现没有或很低水平的双特异性抗体。
实施例8用RVGP-Ig融合蛋白选择携带单一链Fv片段、特异识别狂犬病病毒糖蛋白(RVGP)的噬菌体和针对狂犬病病毒的抗体混合物的表达。
这一实施例描述了针对作为另一潜在靶的狂犬病病毒的抗体混合物的生产。作为抗原，狂犬病病毒糖蛋白(RVGP)被选用，但其它狂犬病抗原也可以为这一目的被选择或包括。识别RVGP的几种单克隆抗体在本领域已经被描述，多克隆抗体也已被公认为在治疗狂犬病感染中有用(例如EP0402029；EP0445625)。
基本上如美国专利6,265,150和WO98/15833中所描述的，用抗体噬菌体展示文库和MAbstractTM技术选择抗体片段。除另外声明，所有程序均在室温下进行。用于克隆目的的RVGP序列对本领域技术人员来说是已获得的(例如Yelvertonetal，1983)。用PER.C6TM中表达的载体pcDNA3.1Zeo-CH2-CH3生产由用遗传融合至人IgG1的CH2和CH3结构域的完整RVGP组成的RVGP-Ig融合蛋白，并以浓度1.25μg/ml、37℃在MaxisorpTM塑料管(Nunc)表面包被2小时。管子用溶解于PBS中的2％无脂奶粉(MPBS)封闭1小时。同时，500μl(大约1013cfu)基本上按DeKruifetal(1995a，b)和文中的参考文献所述加以制备的表达单链Fv片段的噬菌体展示文库被加入到两体积的4％MPBS中。在这一实验中，仅用一种单一可变轻链基因种类所构建的最初文库(例如VK1-文库)的部分进行选择。此外，加入人血清至终浓度15％，封闭30-60分钟。将RVGP-Ig-包被的管子倒空，加入经封闭的噬菌体文库。将管子密封，缓慢旋转1小时，随后不旋转孵育2小时。将管子倒空，在含0.1％Tween-20的PBS中洗10次，随后在PBS中洗5次。加入0.05M，pH2.2的甘氨酸-HCL1ml，管子缓慢旋转10分钟。将洗脱的噬菌体加入到500μl1MTris-HClpH7.4中。向这一混合物中加入3.5ml指数生长的XL-1blue细菌培养物。管子在37℃、不摇动的条件下孵育30分钟。然后，将细菌铺在含氨苄青霉素、四环素和葡萄糖的2TY琼脂平板上。板子在37℃孵育过夜后，将菌落从板上刮下来，用于制备富集的噬菌体文库，基本上按DeKruifetal.(1995a，b)所述。简要地说，刮下来的细菌用于接种含氨苄青霉素、四环素和葡萄糖的2TY培养基，在37℃的温度下生长至OD600nm为～0.3。加入辅助噬菌体感染细菌，随后培养基换成含氨苄青霉素、四环素和卡那霉素的2TY。在30℃继续孵育过夜。第二天，通过离心将细菌从2TY培养基中去除，随后噬菌体用聚乙二醇6000/NaCl沉淀。最后，将噬菌体溶解在小体积的PBS-1％BSA中，过滤灭菌，用于下一轮选择。选择/再感染程序进行两次。第二轮选择后，单个的大肠杆菌菌落用于制备单克隆噬菌体抗体。基本上，单个菌落生长至对数期，用辅助噬菌体感染，随后让噬菌体抗体生产过夜。用ELISA检测含噬菌体抗体的上清对人RVGP-Ig包被的96孔板的结合活性。
上面所描述的筛选中所获得的选中的噬菌体抗体用ELISA验证其特异性。为此目的，用人RVGP-Ig包被MaxisorpELISA板。包被后，板子在2％MPBS中封闭。选中的噬菌体抗体在等体积的4％MPBS中孵育。倒空板子，用PBS洗一次，随后加入封闭的噬菌体。孵育1小时，用PBS0.1％Tween-20洗板子，结合的噬菌体用与过氧化物酶缀合的抗-M13抗体检测。作为对照，程序同时用针对甲状腺球蛋白的对照噬菌体抗体进行(DeKruifetal.1995a，b)，用作负对照。
继而检测与人RVGP-Ig结合的噬菌体抗体对人血清IgG的结合，以排除它们识别融合蛋白Fc部分的可能性。
在另一测定中，分析噬菌体抗体与表达RVGP的PER.C6TM细胞结合的能力。为此目的，PER.C6TM细胞用携带编码RVGP的cDNA序列的质粒或用空载体转染，用本领域技术人员已知的标准技术选择稳定转染子(例如Coligan，J.E.etal.(2001)，Currentprotocolsinproteinscience，volumeI，JohnWiley&Sons，Inc.NewYork)。为进行流式细胞计量术分析，噬菌体抗体在对RVGP和对照转染的PER.C6TM细胞染色之前先用等体积的4％MPBS在4℃封闭15分钟。将已经封闭的噬菌体加入到非标记的对照转染的PER.C6TM细胞和用亲脂染料(lipophylicdye)(PKH67，Sigma)标记为绿色的用RGVP转染的PER.C6TM细胞的混合物中。噬菌体抗体与细胞的结合用生物素酰化的抗-M13抗体(SantaCruzBiotechnology)、随后用链霉抗生物素-藻红蛋白(Caltag)显现。抗RVGPscFv选择性地对PER.C6TMRVGP转染子染色，而它们不与对照转染子结合。
筛选携带特异性识别人RVGP的单链Fv片段的噬菌体的另一种方法是通过使用RVGP转染的PER.C6TM细胞。表达膜结合的RVGP的PER.C6TM细胞如前所述生产。用这些细胞做靶，如前所述进行噬菌体选择实验。使用仅一种单一scFv种类的包含scFv-噬菌体颗粒的噬菌体文库的小部分(500μl，大约1013cfu)用2mlRPMI/10％FCS/1％NHS在室温下封闭15分钟。非转染的PER.C6TM细胞(～10*106细胞)被加入到PER.C6-RVGP细胞中(～1.0*106细胞)。这一混合物被加入到经封闭的轻链受限的噬菌体文库中，在4℃缓慢搅拌下孵育2.5小时。随后，将细胞洗两次，重悬于500μlRPMI/10％FCS，用鼠抗-RVGP抗体(BectonDickinson)、随后用藻红蛋白(PE)缀合的抗小鼠-IgG抗体(Calltag)在冰上孵育15分钟。将细胞洗一次，转移至4ml管中。用FACSvantage荧光激活细胞分选仪(BectonDickinson)进行细胞分选，RVGP(PE阳性)细胞被分选。将分选的细胞离心，保留上清，通过将细胞重悬于500μl50mM甘氨酸pH2.2、随后在室温下孵育5分钟将结合的噬菌体从细胞上洗脱。混合物用250μl1MTris-HClpH7.4中和，加入到拯救(rescued)的上清中。这些噬菌体共同用于制备如上所述的富集的噬菌体文库。选择/再感染程序进行两次。第二轮选择之后，单克隆噬菌体抗体如前所述加以制备和检测对RVGP-PER.C6TM细胞和非转染PER.C6TM细胞的结合。对RVGP转染的细胞呈阳性的噬菌体继而如前所述用ELISA检测与RVGP-IgG融合蛋白的结合。
所选中的scFv片段以人IgG1形式根据本领域已知的方法(例如Boeletal，2000)加以克隆。为此目的，所选中的scFv所共有的VL片段用加入适当限制性位点的寡核苷酸进行PCR扩增。类似程序被用于VH基因。这样修饰的基因被克隆入表达pCRU-K01(ECACC保藏号03041601)中，生成编码完整huIgG1重链和具有与原始噬菌体克隆相同特异性的完整人轻链基因的表达载体。通过这一方法，三种不同重链被克隆入各自的表达载体，而仅一种载体需要包含共同轻链序列。这些表达载体暂时被指定为pCRU-RVGP-1、pCU-RVGP-2和pCRU-RVGP-3。或者，这三种载体可以缺少编码VL区域的DNA，其可以然后被编码在不编码重链的第四个、单独的表达载体中。也可能使VL序列存在于包含不同VH序列的所有三种载体、或三种载体中的两种中。
稳定的PER.C6TM来源的细胞系按照本领域技术人员已知的方法(见例如WO00/63403)生成，例如，表达由pCRU-RVGP-1、pCRU-RVGP-2或pCRU-RVGP-3上的遗传信息所编码的抗体的细胞系和表达由所有三种质粒所编码的抗体的细胞系。因此，将PER.C6TM细胞以大约2.5×106细胞/皿接种在加10％FBS的DMEM的组织培养皿(10cm直径)或T80瓶中，在它们的正常培养条件下(10％CO2浓度和37℃)保持过夜。第二天，用1-2μgpCRU-RVGP-1、1-2μgpCRU-RVGP-2、1-2μgpCRU-RVGP-3或1μgpCRU-RVGP-1、pCRU-RVGP-2和pCRU-RVGP-3的混合物，根据厂商提供的标准方案用Lipofectamine(InvitrogenLifeTechnologies)于37℃在单独的皿中进行转染。作为转染效率的对照，几个皿用LacZ对照载体转染，而几个皿将不转染，用作负对照。
4至5小时后，细胞用DMEM洗两次，在不进行选择下再饲给新鲜培养基。第二天，培养基用含500μg/mlG418的新鲜培养基替代。细胞每2或3天用含相同浓度的G418的培养基更新。接种后大约20-22天，可见大量菌落，从每次转化中挑出至少300个，经由96孔板和/或24孔板、经6孔板、至T25瓶中生长。在此阶段，将细胞冷冻(每亚培养的克隆至少1小管，但通常4小管)，重组人IgG抗体的生产水平在上清中用特异于人IgG1的ELISA(在WO00/63403中加以描述)进行测定。此外，在此阶段，G418从培养基中除去并不再应用。选择有代表性的克隆，较大体积培养以根据标准程序用蛋白A亲和层析从条件上清中纯化重组人IgG1级分。来自不同克隆的纯化的人IgG1在SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)和使用上面所述的RVGPPER.C6转染子进行与靶RVGP的结合进行分析。
用pCRU-RVGP-1、pCRU-RVGP-2和pCRU-RVGP-3共转染所得到的菌落用基因组DNAPCR筛选三种构建体中的每一种是否存在。PCR产物的相同性进一步用DNA测序证实。
对三种结合特异性中的每一种的生产(既通过在DNA水平PCR也在针对RVGP的特异性结合测定中)筛选呈阳性的有限数量的菌落用荧光激活细胞分选仪(FACS)(Becton&DickinsonFACSVANTAGESE)进行单细胞分选。
或者，菌落以0.3细胞/孔进行接种以保证菌落长出。此后指定为亚克隆的克隆细胞群每周一次用新鲜培养基更新。生长亚克隆，并从96孔板经24孔和6孔板转移至T25瓶。在此阶段，将亚克隆冷冻(每亚克隆至少1小管，但通常是4小管)，重组人IgG1抗体的生产水平在上清中用人IgG1特异的ELISA进行测定。对于有代表性数量的亚克隆，培养较大体积以根据标准程序用蛋白A亲和层析从条件上清中纯化重组人IgG1级分。来自不同亚克隆的纯化人IgG1随后如上所述对获自亲本克隆的人IgG1一样进行分析，即通过SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)和与靶RVGP的结合。亚克隆也用基因组DNA的PCR筛选三种构建体pCRU-RVGP-1、pCRU-RVGP-2和pCRU-RVGP-3中的每一种存在与否。PCR产物的相同性进一步用DNA测序证实。
也可以使用其他方法，例如Southern印迹和/或FISH来测定三种构建体中的每一种是否在克隆的细胞系中存在。
被证实对三种构建体中的每一种是转基因的亚克隆进行长时间培养，以测定转基因的存在是否稳定，抗体混合物的表达是否保持一样，不仅在表达水平上一样，而且在细胞分泌的各种抗体同种型的比率上也一样。因此，无论贴壁培养还是悬浮培养，都将亚克隆培养物维持至少25个群体倍增时间。在每4-6个群体倍增，用人IgG特异的ELISA进行特殊的产品测试，培养更大体积以获得细胞沉淀和上清。细胞沉淀用于通过PCR、Southern印迹和/或FISH评估三种构建体在基因组DNA中的存在。上清如上所述用于纯化重组人IgG1级分。在不同群体倍增所获得的纯化人IgG1如所描述的进行分析，即通过SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)和与靶RVGP结合。
针对狂犬病的抗体混合物的功效在体外细胞培养测定中以及在被狂犬病感染的体内动物模型中进行检验，其中测量到狂犬病病毒扩散减少。这样的模型对本领域技术人员是已知的，在例如EP0402029中进行了描述。
实施例9用共同轻链和三种不同重链可变区在单一细胞中生产抗体混合物
在此例证了用在重组宿主细胞中表达单一轻链和能与单一轻链配对以形成功能性抗体的三种不同重链生产本发明的抗体混合物的方法，并在图6中用示意图说明。
在实施例1中描述了分别抗EP-CAM同种型粘附分子(Hulsetal.，1999)和膜辅因子蛋白CD46(WO02/18948)的人IgGUBS54和K53。被鉴别与辅因子蛋白CD46结合的另一克隆为克隆02-237(VH的序列列于图12中)。这一克隆的DNA序列显示，它包含与UBS54和K53相同的轻链，但具有独特的重链可变序列(见图3中的对比)。结果是，02-237的重链的CDR3在4个位置上与K53有所不同(见图13的对比)。噬菌体02-237的重链和轻链可变序列被克隆入含有IgG1抗体的重链和轻链恒定结构域的表达质粒pCRU-K01(pCRU-K01以保藏号03041601保藏在欧洲动物细胞保藏中心(EuropeanCollectionofCellCultures，ECACC))中。所得到的质粒被指定为pgG102-237。由于随后所采用的克隆策略，所得到的由pgG102-237所编码的02-237轻链的N端与分别出现在pUBS3000Neo和pCD46_3000(Neo)中的UBS54和K53的N端略有不同(图3)。质粒pgG102-237在人293(T)细胞中短暂生产，或在PER.C6细胞中稳定生产。似乎纯化的02-237IgG与K53IgG相比对纯化的CD46具有高得多的亲和力(图14)，即亲和力从K53的9.1×10-7M增加至02-237的2.2×10-8M。而且，02-237在人结肠癌LS174T细胞上与CD46的结合比K53要好很多(图15)。
表达编码人IgG02-237的质粒pUBS3000Neo、pCD46_3000(Neo)和pgG102-237的组合的稳定的PER.C6TM来源的细胞系根据本领域技术人员已知的方法生成(见例如WO00/63403)。因此，将PER.C6TM细胞以大约2.5×106细胞/皿接种在含加10％FBS的DMEM的组织培养皿(直径10cm)中，在它们的正常培养条件下(10％CO2浓度和37℃)保持过夜。第二天，在分开的皿中用Lipofectamine(InvitrogenLifeTechnologies)在37℃根据厂商提供的标准方案用2μgpUBS3000Neo、pCD46_3000(Neo)和pgG102-237的等摩尔混合物进行转染。作为选择的负对照，几皿没有转染。4-5小时后，细胞用DMEM洗两次，不选择再饲新鲜培养基。第二天，培养基用含500μg/mlG418的新鲜培养基替换。细胞每2或3天用含相同浓度G418的培养基更新。接种后大约20-22天，可见大量菌落，挑出大约300个，经96孔板和/或24孔板经6孔板至T25瓶中生长。在亚培养过程中，重组人IgG抗体的生产水平在上清中用特异于人IgG1的ELISA进行测定(在WO00/63403中描述)。所有克隆中的大约25％在这一高度特异性的测定中呈现阳性。在这一阶段测得的生产水平相当于单个IgG在PER.C6TM细胞中表达时的水平(单个IgG的表达在Jonesetal.，2003中描述)。重要的一点是要强调，这些高表达水平的获得不借助任何转基因扩增的方法，它们发生在低拷贝数转基因的条件下。
将30个最佳生产克隆冻存在小管中，选择19个最高生产克隆用于纯化IgG(表1)。将它们在T80瓶中亚培养，每一克隆的人IgG随后用蛋白A亲和层析进行纯化。因此，将15-25ml条件培养基加样至5ml蛋白AFFSepharose柱(AmershamBiosciences)上。柱子在用0.1M柠檬酸pH3.0洗脱之前用4mM磷酸缓冲盐pH7.4(PBS)洗。洗脱的级分随后在SephadexG25FineHiPrep脱盐柱(AmershamBiotech)脱盐，溶于PBS。纯化的IgG级分的浓度用吸光度测量法在280nm用系数1.4对0.1％(w/v)溶液进行测定(表1)。
纯化的IgG样品在非还原和还原的SDS-PAGE和IEF上进行分析。非还原的SDS-PAGE(图16A)显示，所有IgG样品以大约150kDa的装配的、完整IgG分子迁移，与对照K53或02-237相当。在还原的SDS-PAGE(图16B)上，IgG样品以大约50kDa的重链和25kDa的轻链迁移，与对照K53或02-237的重链和轻链相当。
在IEF上，首先将纯化的IgG级分与K53、UBS54和02-237的等量的混合物进行对比(图17)。明显地，有些样品与含有纯化的K53、UBS54和02-237的混合物相比，含有具有独特pI分布型的同种型。有些主要独特同种型一方面具有在K53和02-237的pI之间的pI，另一方面具有UBS54的pI。当用Expasy主页上(http://www.expasy.ch；Appeletal.，1994)提供的ProtParam工具进行计算时基于理论pI，这也是可预期的。K53、02-237和UBS54分别具有的理论pI为8.24、8.36和7.65，而呈现一条UBS54重链和一条K53重链的异二聚体的同种型具有的理论pI为8.01。只有当单个细胞既翻译K53的重链、也翻译UBS54的重链，并将这些与共同轻链一起装配成全长IgG分子时这样的异二聚体的装配才会发生。因此，这些结果暗示，某些克隆至少表达两种功能性抗体。为了证实有些同种型的独特特性，将最令人感兴趣的克隆的样品或者单独、或者在混合物中与K53、UBS54和02-237平行进行电泳(图18)。这进而显示有些克隆表达至少两种抗体(241，282，361)。而且，这提供了有些克隆表达所有三种功能性抗体的证据(280和402)。
为了证实克隆表达包含所有三种重链的IgG混合物，用肽谱(peptidemapping)(Gamick，1992；Gelp，1995)来分析多克隆IgG级分。我们先前用肽谱来回收99％的K53的蛋白质序列。基于图12中提供的蛋白序列，计算出理论上K53、UBS54和02-237的胰蛋白酶肽的质量(表II和III)。针对每一IgG可以鉴定出几个独特的肽，即例如具有分子量2116.05、2057.99和2307.15Da的分别针对K53、02-237和UBS54的CDR3肽。其次，制备Polyl-280的胰蛋白酶消化物，这用LC-MS进行分析(图19)。检测到具有分子量2116、2057和2308Da、分别代表K53、02-237和UBS54的独特CDR3肽的肽。这些肽的精确氨基酸序列(如表III中所列)用MS-MS分析证实(表IV、V和VI)。我们还证实分别具有分子量2580和2554Da的两种独特N端轻链肽的存在。肽谱数据清楚明白地显示包含共同轻链和三种不同重链的抗体的混合物被PER.C6TM克隆Poly1-280表达。克隆055、241和402也用肽谱筛选。克隆241和402被证实对所有三种重链序列呈阳性，而克隆055仅表现出表达K53和02-237重链，而不表达UBS54重链。这证实了IEF筛选(图18)，其中在样品055中没有见到UBS54相关条带。
用BIACORE分析Poly1-280与CD46的结合(图20)。Poly1-280对CD46的亲和力为2.1×10-8M，显示IgG混合物含有与单独的02-237IgG相同亲和力的CD46结合分子。
综合起来，这一实验显示，有可能在单一细胞中表达包含三种独特重链的功能性IgG分子的混合物，并且除了同种型二聚体之外，也可以形成由两种结合特异性组成的异二聚体。此外，表达三种不同重链的克隆的频率暗示也有可能使用相同程序获得表达至少4、5或更多重链的克隆。万一难以获得表达更高数量重链的克隆，表达本发明的至少3种重链的克隆也可被用来，例如通过使用不同的选择标记，在单独一轮转染中导入更多重链。
其次，这证明单个细胞能够生产两种以上功能性人IgG的混合物。因此，将既通过IEF也通过MS对三种IgG中的每一种的生产筛选呈阳性的克隆241、280和402进行有限稀释，即以0.3个细胞/孔接种在96孔板上以保证克隆长出。
此后指定为亚克隆的克隆细胞群每周一次用新鲜培养基更新。生长亚克隆，并从96孔板、经24和6孔板转移至T25、T80和T175瓶。在T80阶段，将亚克隆冷冻。重组人IgG1抗体的生产水平在上清中用人IgG1特异的ELISA进行测定。对每一亲本克隆，选择3个亚克隆，培养在几个T175瓶中，以获得足够的条件培养基用来如上所述用蛋白A亲和层析进行纯化。
来自亚克隆的纯化的人IgG1随后如上所述用等电聚焦(IEF)对获自亲本克隆的人IgG1进行分析。结果示于图21。来自克隆poly1-241的亚克隆每一个具有相同的模式，但与亲本克隆的区别在于它们看起来缺少某些条带。来自克隆poly1-280的亚克隆全部看起来彼此不同，并与亲本克隆不同。针对来自亲本克隆poly1-402的亚克隆用IEF得到的模式对所有三种亚克隆和亲本克隆都是同样的。从这些数据可以得出结论，克隆402稳定生产抗体混合物。这证明，从单一细胞克隆中生产本发明的抗体混合物是可行的。克隆在选择压力下从转染程序一直到第一次分析(示于图18)经历了大约25个群体倍增(细胞分裂)，从那一点起在缺乏选择压力的条件下在亚克隆程序中进一步经历大约30个群体倍增，直到收获图21中所分析的物质。因此，来自单一细胞的一个克隆的抗体混合物的生产经过至少30代仍是稳定的。
也分析来自亲本241、280和402克隆、以及亚克隆的纯化IgG1对CD46-和EpCAM抗原的结合反应性。为此，将EpCAM、CD46和对照抗原CD38的cDNA克隆入表达载体pcDNA(Invitrogen)。根据厂商提供的方案用Fugene(Roche)将这些载体转染入CHO(dhfr-)细胞。将细胞培养在含10％FBS和补加HT(Gibco)的Iscove′s培养基中。培养2天后，用胰蛋白酶消化以收获细胞，并悬浮于PBS-1％BSA(PBSB)中用于FACS分析。
将生产抗体混合物的克隆的纯化IgG1和抗-GBSIII，即一种抗-CD72抗体(02-004)的对照IgG1样品，以及来自抗-EpCAM克隆UBS54和抗-CD46克隆K53和02-237的抗体稀释在PBSB中至浓度20μgIgG1/ml。将每种20μl加入200.000个转染的细胞中，在冰上孵育1小时。其后，细胞用冰冷的PBSB洗一次。结合的IgG然后用与山羊抗人IgG-生物素孵育、随后用链霉抗生物素-PE进行检测。最后一步冲洗步骤后，将细胞悬浮于含1μg/ml碘化丙锭的PBSB中。样品在FACS(FACSvantage，BectonDickinson)上进行分析。将活细胞门化(gated)，从FACS图计算平均荧光强度(MFI)。结果示于图22。如所预期，UBS54选择性地与EpCAM转染的细胞结合，02-237和K53选择性地与CD46转染子结合，而不相关的抗体不与这些转染子结合。
结果证明，针对EpCAM和CD46的结合活性在表达本发明的抗体混合物的大多数克隆的纯化IgG1制剂中存在，证明功能性抗体的混合物由已经历超过30个细胞分裂的亚克隆生产，并是由单一细胞产生的。对CD46和EpCAM的结合模式在亚克隆280-015中与在亲本克隆poly1-280中相似，这与其他克隆形成对照。应该声明的是，这一测定的定量方面并不完全清楚。常规筛选，例如通过功能性测定，可以用来发现具有所需表达分布型的克隆。在这样的筛选中也可以包括定量方面。这样的筛选使得鉴定以定量上稳定的方式表达具有特定功能性的抗体混合物的所需克隆成为可能。
表I用于IgG纯化的克隆的概观
表II.K53/UBS54和02-237轻链可变结构域的胰蛋白酶肽
肽 第一个AA1) 最后一个AA 单同位素Mw(Da)K53/UBS54 单同位素Mw(Da)02-237
L1 1 24 2580.31(2) 2554.28(2)
L2 25 59 4039.02 4039.02
L3 60 66 700.35 700.35
L4 67 79 1302.61 1302.61
L5 80 82 374.23 374.23
L6 83 107 2810.29(2) 2810.29(2)
L7 108 111 487.30 487.30
L8 112 112 174.11 174.11
1)AA，氨基酸
2)一个半胱氨酸残基被烷化
表III.K53、02-237和UBS54重链可变结构域的胰蛋白酶肽
注解：
A：肽
B：第一个氨基酸
C：最后一个氨基酸
D：单同位素(monoisotopic)MW(Da)
备注：
1)对H1，氨基酸残基1是焦谷氨酸
2)来自K53和02-237的肽H3和H9，以及UBS54的肽H3和H8含有一个烷基化的半胱氨酸残基
3)能够被用来证实相应IgG的存在的独特的肽用粗斜体显示
表IVK53的CDR3肽(H11)的MS/MS-数据，通过双重带电的m/z1059.06的碰撞诱导的解离而得到。
离子 m/z 离子 m/z
Y″1 147.12 B1 n.d.
Y″2 248.18 B2 157.10
Y″3 335.21(1) B3 304.18
Y″4 406.25 B4 419.22
Y″5 507.30 B5 582.31
Y″6 594.33 B6 768.38
Y″7 693.40 B7 825.39
Y″8 794.46 B8 953.43
Y″9 893.54 B9 n.d.
Y″10 1006.63 B10 n.d.
Y″11 1107.67 B11 1224.65
Y″12 1164.68 B12 1323.68
Y″13 1292.81 B13 1424.79
Y″14 1349.77 B14 1523.B6
Y″15 1535.85 B15 n.d.
Y″16 1698.95 B16 n.d.
Y″17 1813.95 B17 1782.96
Y″18 1960.97 B18 n.d.
Y″19 n.d.(2) B19 n.d.
1加下划线的m/z-值是MS/MS谱中的主要峰。
2n.d.是未检测。
表V.02-237的CDR3肽(H11)的MS/MS数据，通过双重带电的m/z1030.02的碰撞诱导的解离而得到。
离子 m/z 离子 m/z
Y″1 147.12 B1 n.d.
Y″2 248.18 B2 189.09
Y″3 335.20 B3 n.d.
Y″4 406.24 B4 451.22
Y″5 493.30 B5 n.d.
Y″6 580.32 B6 n.d.
Y″7 679.40 B7 n.d.
Y″8 780.44 B8 n.d.
Y″9 879.53 B9 n.d.
Y″10 992.60 B10 n.d.
Y″11 1093.65 B11 n.d.
Y″12 1150.67 B12 n.d.
Y″13 1278.80 B13 n.d.
Y″14 1335.80 B14 n.d.
Y″15 1521.83 B15 n.d.
Y″16 1608.90 B16 n.d.
Y″17 1724.00 B17 n.d.
Y″18 n.d. B18 n.d.
Y″19 n.d. B19 n.d.
1加下划线的m/z-值是MS/MS谱中的主要峰。
2n.d.是未检测。
表VI.UBS54的CDR3肽(H9)的MS/MS数据，通过三重带电的m/z770.09的碰撞诱导的解离而得到。
离子 m/z 离子 m/z
Y″1 n.d. B1 n.d.
Y″2 248.17 B2 213.17
Y″3 335.20 B3 360.16
Y″4 406.25 B4 473.27
Y″5 507.30 B5 610.32
Y″6 594.33 B6 773.41
Y″7 693.42 B7 959.48
Y″8 794.45 B8 1016.50
Y″9 893.53 B9 1144.57
Y″10 1006.64 B10 1201.59
Y″11 1107.67 B11 1302.68
Y″12 1164.68 B12 1415.72
Y″13 n.d. B13 1514.78
Y″14 n.d. B14 n.d.
Y″15 n.d. B15 n.d.
Y″16 n.d. B16 n.d.
Y″17 n.d. B17 n.d.
Y″18 n.d. B18 n.d.
Y″19 n.d. B19 n.d.
Y″20 n.d. B20 n.d.
1加下划线的m/z-值是MS/MS谱中的主要峰。
2n.d.是未检测。
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序列表
<110>克鲁塞尔荷兰公司
<120>抗体混合物的重组生产
<130>0079WO00ORD
<160>18
<170>PatentInversion3.2
<210>1
<211>333
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>VLsequenceofUBS54(anti-EpCAM)andK53(anti-CD46)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(333)
<400>1
gaaattgagctcactcagtctccactctccctgcccgtcacccctgga48
GluIleGluLeuThrGlnSerProLeuSerLeuProValThrProGly
151015
gagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagagcctcctgcatagt96
GluProAlaSerIleSerCysArgSerSerGlnSerLeuLeuHisSer
202530
aatggatacaactatttggattggtacctgcagaagccagggcagtct144
AsnGlyTyrAsnTyrLeuAspTrpTyrLeuGlnLysProGlyGlnSer
354045
ccacagctcctgatctatttgggttctaatcgggcctccggggtccct192
ProGlnLeuLeuIleTyrLeuGlySerAsnArgAlaSerGlyValPro
505560
gacaggttcagtggcagtggatcaggcacagattttacactgaaaatc240
AspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuLysIle
65707580
agcagagtggaggctgaggatgttggggtttattactgcatgcaagct288
SerArgValGluAlaGluAspValGlyValTyrTyrCysMetGlnAla
859095
ctacaaactttcactttcggccctgggaccaaggtggagatcaaa333
LeuGlnThrPheThrPheGlyProGlyThrLysValGluIleLys
100105110
<210>2
<211>111
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>VLsequenceofUBS54(anti-EpCAM)andK53(anti-CD46)
<400>2
GluIleGluLeuThrGlnSerProLeuSerLeuproValThrProGly
151015
GluProAlaSerIleSerCysArgSerSerGlnSerLeuLeuHisSer
202530
AsnGlyTyrAsnTyrLeuAspTrpTyrLeuGlnLysProGlyGlnSer
354045
ProGlnLeuLeuIleTyrLeuGlySerAsnArgAlaSerGlyValPro
505560
AspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuLysIle
65707580
SerArgValGluAlaGluAspValGlyValTyrTyrCysMetGlnAla
859095
LeuGlnThrPheThrPheGlyProGlyThrLysValGluIleLys
100105110
<210>3
<211>333
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>VLsequenceof02-237(anti-CD46)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(333)
<400>3
gacatcgtgatgactcagtctccactctccctgcccgtcacccctgga48
AspIleValMetThrGlnSerProLeuSerLeuProValThrProGly
151015
gagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagagcctcctgcatagt96
GluProAlaSerIleSerCysArgSerSerGlnSerLeuLeuHisSer
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aatggatacaactatttggattggtacctgcagaagccagggcagtct144
AsnGlyTyrAsnTyrLeuAspTrpTyrLeuGlnLysProGlyGlnSer
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ProGlnLeuLeuIleTyrLeuGlySerAsnArgAlaSerGlyValPro
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gacaggttcagtggcagtggatcaggcacagattttacactgaaaatc240
AspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuLysIle
65707580
agcagagtggaggctgaggatgttggggtttattactgcatgcaagct288
SerArgValGluAlaGluAspValGlyValTyrTyrCysMetGlnAla
859095
ctacaaactttcactttcggccctgggaccaaggtggagatcaaa333
LeuGlnThrPheThrPheGlyProGlyThrLysValGluIleLys
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<211>111
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
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<400>4
AspIleValMetThrGlnSerProLeuSerLeuProValThrProGly
151015
GluProAlaSerIleSerCysArgSerSerGlnSerLeuLeuHisSer
202530
AsnGlyTyrAsnTyrLeuAspTrpTyrLeuGlnLysProGlyGlnSer
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ProGlnLeuLeuIleTyrLeuGlySerAsnArgAlaSerGlyValPro
505560
AspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuLysIle
65707580
SerArgValGluAlaGluAspValGlyValTyrTyrCysMetGlnAla
859095
LeuGlnThrPheThrPheGlyProGlyThrLysValGluIleLys
100105110
<210>5
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<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>VHsequenceofUBS54(anti-EpCAM)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(345)
<400>5
caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctgggtcc48
GlnValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlySer
151015
tcggtgagggtctcctgcaaggcttctggaggcaccttcagcagctat96
SerValArgValSerCysLysAlaSerGlyGlyThrPheSerSerTyr
202530
gctatcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatg144
AlaIleSerTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet
354045
ggagggatcatccctatctttggtacagcaaactacgcacagaagttc192
GlyGlyIleIleProIlePheGlyThrAlaAsnTyrAlaGlnLysPhe
505560
cagggcagagtcacgattaccgcggacgaatccacgagcacagcctac240
GlnGlyArgValThrIleThrAlaAspGluSerThrSerThrAlaTyr
65707580
atggagctgagcagcctgagatctgaggacacggctgtgtattactgt288
MetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaValTyrTyrCys
859095
gcaagagacccgtttcttcactattggggccaaggtaccctggtcacc336
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100105110
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ValSerThr
115
<210>6
<211>115
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>VHsequenceofUBS54(anti-EpCAM)
<400>6
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151015
SerValArgValSerCysLysAlaSerGlyGlyThrPheSerSerTyr
202530
AlaIleSerTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet
354045
GlyGlyIleIleProIlePheGlyThrAlaAsnTyrAlaGlnLysPhe
505560
GlnGlyArgValThrIleThrAlaAspGluSerThrSerThrAlaTyr
65707580
MetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaValTyrTyrCys
859095
AlaArgAspProPheLeuHisTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuValThr
100105110
ValSerThr
115
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<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>VHsequenceofK53(anti-CD46)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(354)
<400>7
caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcc48
GlnValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla
151015
tcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccagctat96
SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr
202530
ggtatcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatg144
GlyIleSerTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet
354045
ggatggatcagcgcttacaatggtaacacaaactatgcacagaagctc192
GlyTrpIleSerAlaTyrAsnGlyAsnThrAsnTyrAlaGlnLysLeu
505560
cagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctac240
GlnGlyArgValThrMetThrThrAspThrSerThrSerThrAlaTyr
65707580
atggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgt288
MetGluLeuArgSerLeuArgSerAspAspThrAlaValTyrTyrCys
859095
gcaaggggcatgatgaggggtgtgtttgactactggggccaaggtacc336
AlaArgGlyMetMetArgGlyValPheAspTyrTrpGlyGlnGlyThr
100105110
ctggtcaccgtctcgaca354
LeuValThrValSerThr
115
<210>8
<211>118
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>VHsequenceofK53(anti-CD46)
<400>8
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151015
SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr
202530
GlyIleSerTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet
354045
GlyTrpIleSerAlaTyrAsnGlyAsnThrAsnTyrAlaGlnLysLeu
505560
GlnGlyArgValThrMetThrThrAspThrSerThrSerThrAlaTyr
65707580
MetGluLeuArgSerLeuArgSerAspAspThrAlaValTyrTyrCys
859095
AlaArgGlyMetMetArgGlyValPheAspTyrTrpGlyGlnGlyThr
100105110
LeuValThrValSerThr
115
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<213>Artificial
<220>
<223>VHsequenceof02-237(anti-CD46)
<220>
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<222>(1)..(354)
<400>9
caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcc48
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151015
tcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccagctat96
SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr
202530
ggtatcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatg144
GlyIleSerTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet
354045
ggatggatcagcgcttacaatggtaacacaaactatgcacagaagctc192
GlyTrpIleSerAlaTyrAsnGlyAsnThrAsnTyrAlaGlnLysLeu
505560
cagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctac240
GlnGlyArgValThrMetThrThrAspThrSerThrSerThrAlaTyr
65707580
atggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgt288
MetGluLeuArgSerLeuArgSerAspAspThrAlaValTyrTyrCys
859095
gcaaggggctttccgcgtacgtcgtttgactcctggggccagggcacc336
AlaArgGlyPheProArgThrSerPheAspSerTrpGlyGlnGlyThr
100105110
ctggtgaccgtctcctca354
LeuValThrValSerSer
115
<210>10
<211>118
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>VHsequenceof02-237(anti-CD46)
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202530
GlyIleSerTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet
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GlyTrpIleSerAlaTyrAsnGlyAsnThrAsnTyrAlaGlnLysLeu
505560
GlnGlyArgValThrMetThrThrAspThrSerThrSerThrAlaTyr
65707580
MetGluLeuArgSerLeuArgSerAspAspThrAlaValTyrTyrCys
859095
AlaArgGlyPheProArgThrSerPheAspSerTrpGlyGlnGlyThr
100105110
LeuValThrValSerSer
115
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<213>Artificial
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MetAlaGluValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyValValArgPro
151015
ggagggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttgat96
GlyGlySerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheAsp
202530
gattatggcatgagctgggtccgccaagctccagggaaggggctggag144
AspTyrGlyMetSerTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGlu
354045
tgggtctctggtattaattggaatggtggtagcacaggttatgcagac192
TrpValSerGlyIleAsnTrpAsnGlyGlySerThrGlyTyrAlaAsp
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tctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcc240
SerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAlaLysAsnSer
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ctgtatctgcaaatgaacagtctgagagccgaggacacggccgtgtat288
LeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyr
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tactgtgcaagaggctttcttcgttttgcttcctcctggtttgactat336
TyrCysAlaArgGlyPheLeuArgPheAlaSerSerTrpPheAspTyr
100105110
tggggccaaggtaccctggtcaccgtctcgaga369
TrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerArg
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<210>12
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<212>PRT
<213>Artificial
<220>
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151015
GlyGlySerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheAsp
202530
AspTyrGlyMetSerTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGlu
354045
TrpValSerGlyIleAsnTrpAsnGlyGlySerThrGlyTyrAlaAsp
505560
SerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAlaLysAsnSer
65707580
LeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyr
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TyrCysAlaArgGlyPheLeuArgPheAlaSerSerTrpPheAspTyr
100105110
TrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerArg
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<210>13
<211>369
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>VHsequenceofcloneII-2(anti-CD72phage)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(369)
<400>13
atggcccaggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcct48
MetAlaGlnValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysPro
151015
ggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcacc96
GlyAlaSerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThr
202530
agctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgag144
SerTyrTyrMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGlu
354045
tggatgggaataatcaaccctagtggtggtggcacaagctacgcacag192
TrpMetGlyIleIleAsnProSerGlyGlyGlyThrSerTyrAlaGln
505560
aagttccagggcagagtcaccatgaccagggacacgtccacgagcaca240
LysPheGlnGlyArgValThrMetThrArgAspThrSerThrSerThr
65707580
gtctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtat288
ValTyrMetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaValTyr
859095
tactgtgcaagagactactatgttacgtatgattcctggtttgactcc336
TyrCysAlaArgAspTyrTyrValThrTyrAspSerTrpPheAspSer
100105110
tggggccaaggtaccctggtcaccgtctcgaga369
TrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerArg
115120
<210>14
<211>123
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>VHsequenceofcloneII-2(anti-CD72phage)
<400>14
MetAlaGlnValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysPro
151015
GlyAlaSerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThr
202530
SerTyrTyrMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGlu
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TrpMetGlyIleIleAsnProSerGlyGlyGlyThrSerTyrAlaGln
505560
LysPheGlnGlyArgValThrMetThrArgAspThrSerThrSerThr
65707580
ValTyrMetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaValTyr
859095
TyrCysAlaArgAspTyrTyrValThrTyrAspSerTrpPheAspSer
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TrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerArg
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<213>Artificial
<220>
<223>VHsequenceofcloneI-2(anti-classIIphage)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(360)
<400>15
atggccgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtacagcct48
MetAlaGluValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnPro
151015
ggcaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttgat96
GlyArgSerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheAsp
202530
gattatgccatgcactgggtccggcaagctccagggaagggcctggag144
AspTyrAlaMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGlu
354045
tgggtctcaggtattagttggaatagtggtagcataggctatgcggac192
TrpValSerGlyIleSerTrpAsnSerGlySerIleGlyTyrAlaAsp
505560
tctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcc240
SerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAlaLysAsnSer
65707580
ctgtatctgcaaatgaacagtctgagagctgaggacacggccgtgtat288
LeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyr
859095
tactgtgcaagggacctttatcttgcgcattttgactactggggccaa336
TyrCysAlaArgAspLeuTyrLeuAlaHisPheAspTyrTrpGlyGln
100105110
ggtaccctggtcaccgtctcgaga360
GlyThrLeuValThrValSerArg
115120
<210>16
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<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>VHsequenceofcloneI-2(anti-classIIphage)
<400>16
MetAlaGluValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnPro
151015
GlyArgSerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheAsp
202530
AspTyrAlaMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGlu
354045
TrpValSerGlyIleSerTrpAsnSerGlySerIleGlyTyrAlaAsp
505560
SerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAlaLysAsnSer
65707580
LeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyr
859095
TyrCysAlaArgAspLeuTyrLeuAlaHisPheAspTyrTrpGlyGln
100105110
GlyThrLeuValThrValSerArg
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<210>17
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<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>commonVLsequenceofclonesB28(anti-CD22phage)，II-2(anti-CD72phage)andI-2(anti-classIIphage)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(336)
<400>17
tcgtctgagctgactcaggaccctgctgtgtctgtggccttgggacag48
SerSerGluLeuThrGlnAspProAlaValSerValAlaLeuGlyGln
151015
acagtcaggatcacatgccaaggagacagcctcagaagctattatgca96
ThrValArgIleThrCysGlnGlyAspSerLeuArgSerTyrTyrAla
202530
agctggtaccagcagaagccaggacaggcccctgtacttgtcatctat144
SerTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProValLeuValIleTyr
354045
ggtaaaaacaaccggccctcagggatcccagaccgattctctggctcc192
GlyLysAsnAsnArgProSerGlyIleProAspArgPheSerGlySer
505560
agctcaggaaacacagcttccttgaccatcactggggctcaggcggaa240
SerSerGlyAsnThrAlaSerLeuThrIleThrGlyAlaGlnAlaGlu
65707580
gatgaggctgactattactgtaactcccgggacagcagtggtaaccat288
AspGluAlaAspTyrTyrCysAsnSerArgAspSerSerGlyAsnHis
859095
gtggtattcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtgcggccgca336
ValValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeuGlyAlaAlaAla
100105110
<210>18
<211>112
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>commonVLsequenceofclonesB28(anti-CD22phage)，II-2(anti-CD72phage)andI-2(anti-classIIphage)
<400>18
SerSerGluLeuThrGlnAspProAlaValSerValAlaLeuGlyGln
151015
ThrValArgIleThrCysGlnGlyAspSerLeuArgSerTyrTyrAla
202530
SerTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProValLeuValIleTyr
354045
GlyLysAsnAsnArgProSerGlyIleProAspArgPheSerGlySer
505560
SerSerGlyAsnThrAlaSerLeuThrIleThrGlyAlaGlnAlaGlu
65707580
AspGluAlaAspTyrTyrCysAsnSerArgAspSerSerGlyAsnHis
859095
ValValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValleuGlyAlaAlaAla
100105110
关于微生物保藏的说明(PCT细则13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月)
关于微生物保藏的说明(PCT细则13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月)

Claims (12)

1.一种药物组合物，其包含3种或更多种重组产生的不相同的抗体和适当的载体，其中所述3种或更多种不相同的抗体包含至少3种具有不同的免疫球蛋白重链序列和共同免疫球蛋白轻链序列的抗体，
其中所述具有共同免疫球蛋白轻链序列的轻链与所述具有不同的免疫球蛋白重链序列的免疫球蛋白重链配对以形成功能性抗原结合结构域，以及
其中所述3种或更多种不相同的抗体包含选自由IgG和IgA组成的一组中的一或多种同种型。
2.权利要求1的药物组合物，其中所述3种或更多种不相同的抗体包含至少一种双特异性抗体。
3.权利要求1的药物组合物，其中所述3种或更多种不相同的抗体的至少两种对于同一种靶抗原具有不同的特异性。
4.权利要求1的药物组合物，其中所述3种或更多种不相同的抗体的至少两种对于同一种靶表位具有不同的亲和力。
5.权利要求1的药物组合物，其中所述3种或更多种不相同的抗体的至少两种结合同一种靶抗原上的不同表位。
6.权利要求1的药物组合物，其中所述3种或更多种不相同的抗体的至少两种结合不同的抗原。
7.权利要求1的药物组合物，其中所述3种或更多种不相同的抗体的至少两种是不同的同种型。
8.权利要求7的药物组合物，其中所述不同的同种型包含至少IgG和IgA。
9.权利要求7的药物组合物，其中所述不同的同种型包含至少IgG1和IgG3抗体。
10.权利要求1的药物组合物，其中所述3种或更多种不相同的抗体是同种型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
11.权利要求10的药物组合物，其中所述3种或更多种不相同的抗体是同种型IgG1。
12.一种组合物，其包含3种或更多种重组产生的不相同的抗体和适当的载体，其中所述3种或更多种不相同的抗体包含至少3种具有不同的免疫球蛋白重链序列和共同免疫球蛋白轻链序列的抗体，
其中所述具有共同免疫球蛋白轻链序列的轻链与所述具有不同的免疫球蛋白重链序列的免疫球蛋白重链配对以形成功能性抗原结合结构域，以及
其中所述3种或更多种不相同的抗体包含选自由IgG和IgA组成的一组中的一或多种同种型，并且其中所述重链进一步在它们的恒定区有足够的不同从而使双特异性抗体的量与双特异性抗体的理论百分比相比降低。
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