CN101792738B - 一种环丙沙星单克隆抗体细胞株及其单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种环丙沙星单克隆抗体细胞株及其单克隆抗体，所得到的单克隆抗体可用于制备环丙沙星的快速检测酶联免疫(ELISA)试剂盒，实现在水产品中快速检测残留的环丙沙星。在本发明中，首先采用了碳二亚胺一步法，制备了免疫原——环丙沙星与牛血清白蛋白的偶联物(CIP-BSA)，及包被原——环丙沙星与鸡卵血清白蛋白的偶联物(CIP-OVA)。用CIP-BSA免疫Balb/c小鼠，将免疫后的Balb/c小鼠的脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。采用间接ELISA法对阳性克隆进行筛选，经过多次的亚克隆，获得了稳定分泌的针对环丙沙星的单克隆抗体细胞株；采用动物体内诱生法制备腹水，腹水经纯化后得到单克隆抗体。

Description

一种环丙沙星单克隆抗体细胞株及其单克隆抗体

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，涉及环丙沙星单克隆抗体细胞株，及其生产的单克隆抗体。 

背景技术：

环丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)又名环丙氟哌酸，属于第三代氟喹诺酮类药物。环丙沙星通过抑制细菌DNA螺旋酶的合成，起到杀菌作用。作为广谱抗菌药，环丙沙星具有极强的杀菌能力，因此环丙沙星被广泛的应用在人和水产动物的疾病治疗上。由于环丙沙星在水产品中的残留直接威胁了公共卫生安全，因此环丙沙星已经被欧盟、美国、中国等列为了水产养殖禁用药物。 

目前，环丙沙星的检测方法主要包括微生物法、高效液相色谱法、毛细电泳法等。这些检测方法不仅需要以实验室平台为依托，还需要有专门的实验人员进行操作。其中微生物法虽然要求不高，但是检测的灵敏度达不到国家标准。高效液相色谱法、毛细电泳法虽然灵敏度高，能够进行大规模检测，但是所花费的时间长、购买仪器的费用也非常的高一般在30万元以上。酶联免疫竞争法(ELISA)具有灵敏度高、操作简单、成本低、检测速度快等特点，因此利用酶联免疫竞争法(ELISA)建立灵敏度高、操作简单、能快速检测水产品中环丙沙星的试剂盒将有着十分广泛的应用前景。为了制备检测试剂盒，得到环丙沙星的单克隆抗体细胞株，及针对环丙沙星的单克隆抗体是关键。 

发明内容：

本发明的目的是提供一种环丙沙星单克隆抗体细胞株，由骨髓瘤细胞与产生抗环丙沙星抗体的脾细胞融合制备而成，命名为杂交瘤细胞株JY-1。该细胞株已于2009年7月6日提交位于中国湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，编号为C200947。 

所述的脾细胞得自以环丙沙星与牛血清白蛋白偶联物免疫的动物。 

所述的偶联物制备过程如下： 

(1)先将牛血清白蛋白水溶液、环丙沙星水溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐水溶液以摩尔比为1∶503∶10433的比例混合，在室温下反应2小时； 

(2)将反应后的液体装入透析袋内，再放入1L磷酸缓冲液中透析48小时，每24小时换液一次； 

(3)收集透析袋内的液体，在-20℃预冷冻2小时，然后在-50℃下冷冻干燥，制成环丙沙星免疫原白色固体粉末。 

所述的融合制备过程如下： 

(1)环丙沙星与牛血清白蛋白偶联物免疫Balb/c小鼠； 

(2)免疫小鼠的脾细胞与SP2/0按照2～5∶1的比例混合，在1分钟内逐滴加入聚乙二醇，静置5min后，加入RPMI1640培养基离心，细胞加入含有HAT和小鼠胸腺细胞的1640培养液，混合均匀后每孔100μL滴加到4个96孔板内；培养于CO₂浓度为4.5％和37℃恒温恒湿 条件下的CO₂培养箱中； 

(3)用环丙沙星与鸡卵血清白蛋白偶联物包被酶标板，筛选阳性杂交瘤细胞； 

(4)阳性克隆的杂交瘤细胞注入降植烷处理的Balb/c小鼠腹腔，进行单克隆抗体的制备。 

所述的包被酶标板的包被原环丙沙星与鸡卵血清白蛋白偶联物，制备过程如下： 

(1)先将鸡卵血清白蛋白水溶液、环丙沙星水溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐水溶液以摩尔比为1∶340∶7043混合，在室温下反应2小时； 

(2)将反应后的液体装入透析袋内，再放入1L磷酸缓冲液中透析48小时，每24小时换液一次；所述的磷酸缓冲液PH为5.0，浓度为0.01mol/L；所述的透析袋半周长为22mm，截留分子量为14000； 

(3)收集透析袋内的液体，在-20℃预冷冻2小时，然后在-50℃下冷冻干燥，制成环丙沙星包被原白色固体粉末。 

所述的筛选阳性杂交瘤细胞过程如下：用环丙沙星与鸡卵血清白蛋白偶联物包被酶标板，用酶联免疫间接法对细胞上清液进行鉴定；将阳性值大于阴性值2倍，且阳性值大于0.5以上的细胞孔；及时进行克隆。 

本发明的又一目的是提供一种环丙沙星单克隆抗体，由所述的CCTCC NO：C200947产生，对环丙沙星具有特异性。所述的抗体与恩诺沙星存在90％的交叉反应，而与氧氟沙星、双氟沙星、沙拉沙星、氯霉素、孔雀石绿均无交叉反应。 

本发明提供的环丙沙星单克隆抗体细胞株及其产生的单克隆抗体，具有如下优点： 

1、用本发明制备的细胞株所生产的单克隆抗体可以稀释30000-200000倍使用，与以往单克隆抗体稀释倍数比较，提高了10倍以上，从而节约了成本。 

2、利用本发明提供的单克隆抗体的IC₅₀为3.45ng/mL，灵敏度较高。 

3、利用本发明提供的单克隆抗体的特异性强。仅与恩诺沙星存在交叉反应，但与氧氟沙星、双氟沙星、沙拉沙星、氯霉素、孔雀石绿均不存在交叉反应。 

综上所述，本发明提供细胞株所生产的的单克隆抗体具有灵敏度高、特异性强的特性。本发明成功地制备了单克隆抗体，为环丙沙星在水产品中残留的快速检测提供了关键技术。 

附图说明：

图1为环丙沙星偶联物紫外扫描图。 

图2为杂交瘤细胞染色体图。 

图3为JY-1抗体亲和力常数测定曲线。 

图4为IC₅₀的测定曲线。 

具体实施方式：

(1)本发明所用试剂：环丙沙星，含量≥98.5％，购自浙江国邦药业有限公司；牛血清蛋 白(BSA)、鸡卵血清白蛋白(OVA)购于鼎国生物公司；乙基碳二亚胺(EDC)，纯度≥99.3％，购自上海延长生化科技发展有限公司；1640培养基(购自GIBCO公司)；胎牛血清(购自HYCLONE公司)；HAT(购自GIBCO公司)；；小牛血清(购自HYCLONE公司)；二甲亚砜(购自SIGMA公司)，其它化学试剂购于上海国药有限公司。 

(2)Balb/c小鼠，购自上海实验动物中心；SP2/0骨髓瘤细胞，购自中科院细胞库。 

实施例一：免疫原——环丙沙星与牛血清白蛋白偶联物(CIP-BSA)的制备 

1、称取8.5g的氯化钠、2.85g磷酸氢二钠、0.2g氯化钾，0.27g磷酸二氢钾加入950mL的蒸馏水，滴加盐酸调节PH(酸碱度)至5.0，再加入50mL的蒸馏水，配置成1000mL，浓度为0.01mol/L的磷酸缓冲液。 

2、称取40mg的牛血清白蛋白加入5mL的磷酸缓冲液(PH为5.0，含量为0.01mol/L)制成8mg/mL(0.12μmol/L)的牛血清白蛋白水溶液。 

3、称取100mg的环丙沙星加入5mL的磷酸缓冲液(PH为5.0，含量为0.01mol/L)制成20mg/mL(60.4μmol/L)的环丙沙星水溶液。 

4、称取960mg碳二亚胺加入4mL磷酸缓冲液(PH为5.0，含量为0.01mol/L)制成240mg/mL(1251.9μmol/L)的水溶液。 

5、在1.5mL的离心管中分别加入8mg/mL(0.12μmol/L)的牛血清白蛋白水溶液、20mg/mL(60.4μmol/L)的环丙沙星水溶液、240mg/mL(1251.9μmol/L)的碳二亚胺水溶液各0.25mL，再加入0.25mL的磷酸缓冲液(PH为5.0，含量为0.01mol/L)，在室温下反应2小时。 

6、将反应好的液体加入透析袋(半周长22mm，截留分子量14000)中再放入装有1L磷酸缓冲液(PH为5.0，含量为0.01mol/L)的烧杯中，透析48小时，每24小时换液一次。 

7、将透析好的液体，在-20℃预冷冻2小时，然后在-50℃下冷冻干燥，制成免疫原白色固体粉末。 

实施例二：包被原——环丙沙星与鸡卵血清白蛋白偶联物(CIP-OVA)的制备 

1、称取8.5g的氯化钠、2.85g磷酸氢二钠、0.2g氯化钾，0.27g磷酸二氢钾加入950mL的蒸馏水，滴加盐酸调节PH(酸碱度)至5.0，再加入50mL的蒸馏水，配置成1000mL，浓度为0.01mol/L的磷酸缓冲液。 

2、称取40mg的鸡卵血清白蛋白加入5mL的磷酸缓冲液(PH为5.0，含量为0.01mol/L)制成8mg/mL(0.178μmol/L)的鸡卵血清白蛋白水溶液。 

3、称取100mg的环丙沙星加入5mL的磷酸缓冲液(PH为5.0，含量为0.01mol/L)制成20mg/mL(60.4μmol/L)的环丙沙星水溶液。 

4、称取960mg碳二亚胺加入4mL磷酸缓冲液(PH为5.0，含量为0.01mol/L)制成240mg/mL(1251.9μmol/L)的水溶液。 

5、在1.5mL的离心管中分别加入8mg/mL(0.178μmol/L)的鸡卵血清白蛋白水溶液、20mg/mL(60.4μmol/L)的环丙沙星水溶液、240mg/mL(1251.9μmol/L)的碳二亚胺水溶液各0.25mL，再加入0.25mL的磷酸缓冲液(PH为5.0，含量为0.01mol/L)，在室温下反应2 小时。 

6、将反应好的液体加入透析袋(半周长22mm，截留分子量14000)中再放入装有1L磷酸缓冲液(PH为5.0，含量为0.01mol/L)的烧杯中，透析48小时，每24小时换液一次。 

7、将透析好的液体，在-20℃预冷冻2小时，然后在-50℃下冷冻干燥，制成包被原白色固体粉末。 

实施例三：单克隆抗体的制备和纯化 

一、免疫 

将免疫原CIP-BSA粉末用磷酸缓冲液(PH为5.0，含量为0.01mol/L)稀释成为2mg/mL免疫原溶液，取100μL免疫原溶液(2mg/mL)加入100μL福氏完全佐剂，充分混匀后，取4周龄的Balb/c小鼠，采用腹部注射，进行免疫。 

免疫两周后，取100μL免疫原溶液(2mg/mL)加入100μL福氏不完全佐剂，充分混匀后，采用腹部注射，进行免疫。 

一周后，取100μL免疫原溶液(2mg/mL)进行尾静脉加强免疫。 

十天后，取50μL免疫原溶液(2mg/mL)进行尾静脉注射，进行加强免疫。 

二、细胞融合 

1、骨髓瘤细胞的复苏及培养： 

融合前10天，将冷冻的SP2/0骨髓瘤细胞从-70℃冰箱中取出，立即放入37℃水浴融化，1000转/分钟离心3分钟，加入1640(含10％胎牛血清)培养液，置4.5％CO₂培养箱内培养。处于对数生长期的瘤细胞浑圆，透亮，大小均一，排列整齐，呈半致密分布，取处于对数生长期的骨髓瘤细胞供细胞融合用。 

2、融合： 

(1)在Balb/c小鼠最后一次免疫的第三天，无菌取脾脏过100目网筛，用RPMI1640(-)吹下形成单细胞悬液，用于细胞融合。 

(2)Balb/c小鼠，无菌取出胸腺后，过100目网筛，用RPMI1640(-)吹下形成单细胞悬液。 

(3)将脾细胞悬液和胸腺细胞悬液分别离心3分钟，1000转/分钟，弃去上清液，脾细胞沉淀用预热到37℃的RPMI1640(-)重悬，胸腺细胞沉淀用少量预热到37℃的含1％HAT的1640(含10％胎牛血清)选择性细胞培养液重悬。 

(4)取3×10⁷个处于对数生长期的骨髓瘤细胞，1000转/分钟离心3分钟，去上清液后，沉淀用RPMI1640(-)重悬。 

(5)将脾细胞悬液与瘤细胞悬液混合均匀后，1000转/分钟离心3分钟，完全吸去上清液，轻弹离心管底，使两种细胞沉淀充分混匀。 

(6)将离心管置于37℃水浴中预热的盛水烧杯中，用吸管吸已经预热到37℃的聚乙二醇溶液1mL，将管尖插入管底，轻轻搅动细胞沉淀，并缓缓滴加聚乙二醇，在1分钟内加完。然后在37℃水浴中静置5分钟。 

(7)滴加已经预热到37℃的RPMI1640(-)液40mL，前缓后快，然后1000转/分钟离心5分钟，弃去上清液。 

(8)将细胞沉淀用3mL预热到37℃的1640(含10％胎牛血清)细胞培养液重悬，取2mL冻存于-70℃(9份1640(含10％胎牛血清)+1份二甲亚砜)，余细胞悬液里补加含有1％HAT的1640(含10％胎牛血清)选择性细胞培养液和小鼠胸腺细胞40mL，混合均匀后每孔100μL滴加到4个96孔板内。培养于CO₂浓度为4.5％和37℃恒温恒湿条件下的CO₂培养箱中。 

三、阳性细胞株的筛选与克隆 

1、检测筛选： 

细胞融合2周后，杂交瘤细胞群落长到占96孔培养板的孔底1/3时开始检测，用间接酶联免疫法检测融合细胞的阳性孔。 

(1)取二中制备的包被原——环丙沙星与鸡卵血清蛋白偶联物(CIP-OVA)包被96孔酶标板。每孔包被100μL(100ng/mL)。37℃孵育1小时。 

(2)取(1)中处理过的酶标板，倒扣于滤纸上，去多余液体。然后加入含有5％牛奶的磷酸缓冲液(PH为7.4，含量为0.01mol/L)，200μL/孔，37℃孵育1小时或4℃过夜。 

(3)取(2)中处理过的酶标板，倒扣于滤纸上，去多余液体，将上述酶标板用含0.05％吐温-20磷酸盐缓冲液(PBST)洗三次，每次3分钟。 

(4)取(3)中处理过的酶标板，倒扣于滤纸上，去多余液体，加入的细胞上清液，100μL/孔，37℃孵育1小时。空白对照为100μL/孔的磷酸缓冲液(PH为7.4，含量为0.01mol/L)，阴性对照为小鼠未免疫之前的血清。 

(5)取(4)中处理过的酶标板，倒扣于滤纸上，去多余液体，将上述酶标板用含0.05％吐温-20磷酸盐缓冲液(PBST)洗三次，每次3分钟。 

(6)取(5)中处理过的酶标板，倒扣于滤纸上，去多余液体。每孔加入100μL过氧化物酶标羊抗鼠IgG(体积比：1∶6000)。37℃孵育0.5小时。 

(7)取(6)中处理过的酶标板，倒扣于滤纸上，去多余液体，，将上述酶标板用含0.05％吐温-20磷酸盐缓冲液(PBST)洗三次，每次3分钟。 

(8)取(7)中处理过的酶标板，倒扣于滤纸上，去多余液体，每孔加入100μL的TMB显色液(TMB∶H₂O₂∶NAAC的体积比为1∶5∶4)，37℃孵育10分钟. 

(9)每孔加入2mol/L的硫酸50μL终止反应。 

(10)选取阳性值大于阴性值2倍，且阳性值大于0.5以上的细胞孔进行克隆。 

2、克隆：采用有限稀释法对检测出的阳性杂交瘤细胞进行克隆 

(1)乙醚麻醉小鼠，无菌取出胸腺细胞(作为饲养细胞)后，在100目网筛上研磨，用RPMI1640(-)吹下形成单细胞悬液。 

(2)1000转/分钟离心3分钟，弃去上清液，胸腺细胞沉淀用30mL1640(含10％胎牛血清)细胞完全培养液重悬。 

(3)阳性细胞孔中的细胞用血球计数板计数，然后用1640(含10％胎牛血清)培养液以10的整次倍稀释，取450个杂交瘤细胞，放入22.5mL的胸腺细胞1640(含10％胎牛血清)悬 液中，用滴管吹打均匀后，滴一个96孔板，150μL/孔，即每孔含有三个杂交瘤细胞。 

(4)剩余的细胞悬液7.5mL与预留出的7.5mL胸腺细胞混合均匀，滴一个96孔板，平均每个孔滴加150μL，即含有一个杂交瘤细胞。 

取阳性杂交瘤细胞转孔并扩增，收集细胞培养上清。 

四、单克隆抗体的产生与纯化 

取7周的Balb/c小鼠，每只注射0.5mL的降植烷。一周后腹腔接种用无血清培养基稀释处于对数生长期的杂交瘤细胞，每只注射细胞数为5×10⁶个，间隔4天后，观察小鼠腹水情况，待小鼠腹部膨大，精神变差，濒临死亡时，采集腹水。将腹水离心，取上清液，测定效价，分装保存在-70℃。用硫酸铵沉淀法进行纯化，得到环丙沙星单克隆抗体。 

实施例四：特性鉴定 

为了验证本发明的有效性，进行了以下测定。 

一、免疫原、包被原的偶联鉴定 

通过紫外分光光度法对免疫原(CIP-BSA)及包被原(CIP-OVA)进行鉴定。在250nm-350nm间对CIP、BSA、CIP-BSA、OVA、CIP-OVA进行紫外扫描。结果发现CIP的峰值在270nm，BSA的峰值在279nm，CIP-BSA的峰值出现在275nm，OVA的峰值出现在278nm，CIP-OVA的峰值出现在274nm，通过对比发现偶联物的峰值发生了迁移，从而证明了偶联的成功。见图1为环丙沙星偶联物紫外扫描图。 

二、阳性克隆细胞株及其产生抗体的鉴定。 

经过三次的亚克隆，获得了一株分泌稳定的杂交瘤细胞株，命名为JY-1。在CCTCC的保藏编号为C200947。 

(1)杂交瘤细胞染色体鉴定 

利用秋水仙素阻断法，经氯化钾低渗处理、甲醇乙酸固定、吉姆萨染色。在油镜下随机选取100个完整的分裂中期细胞，计数其染色体条数，计算杂交瘤细胞染色体众数。SP2/0细胞染色体数为72条，脾细胞染色体为40条，杂交瘤细胞株JY-1染色体计数见图2，其染色体数目为84～97，均大于亲本细胞，说明SP2/0与脾细胞融合成功。 

(2)JY-1抗体亲和力常数测定 

利用非竞争性酶免疫法测定JY-1抗体的亲和力。将包被原按200、100、50、25ng/mL包被酶标板，100μL/孔，37℃，1h；含5％牛奶的PBS封闭后，将单抗从1000倍开始倍比稀释，其余同间接ELISA检测方法。 

以抗体稀释倍数的对数值为横坐标，以其对应的A值为纵坐标，可在一个坐标系内作出4条S形曲线。见图3，为JY-1抗体亲和力常数测定曲线。找出S曲线的顶部，设定为Amax。在曲线中分别找出4条曲线各自50％Amax对应的抗体浓度。将4个浓度两两一组，根据公式1计算单抗的亲和常数，并取平均值。 

$\mathrm{Ka}=\frac{n-1}{2\×n({\left[{\mathrm{Ab}}^{\′}\right]}_t-{\left[\mathrm{Ab}\right]}_t)}$

其中：n为每组中两个包被原浓度的倍数，[Ab’]_t，[Ab]_t分别为每组中两个50％ODmax对应的抗体浓度(mol/L).通过计算得到的JY-1抗体的亲和力常数分别为4.37×10⁹L/mol，3.06×10⁹L/mol，2.55×10⁹L/mol，2.66×10⁹L/mol，2.38×10⁹L/mol，2.26×10⁹L/mol，取其平均值2.88×10⁹L/mol为JY-1的亲和力常数。 

(3)JY-1抗体的特异性鉴定 

系列稀释恩诺沙星、氧氟沙星、双氟沙星、沙拉沙星、氯霉素、孔雀石绿，用阻断法检测JY-1抗体与其的交叉反应。 

取100ng/mL的CIP-OVA包被酶标板，37℃，1小时。加入5％牛奶的磷酸缓冲液37℃封闭1小时。同时加入检测药物、JY-1抗体(稀释1∶50000)各50μL，37℃，1小时，洗板三次。加入酶标二抗100μL，37℃，0.5小时，洗板三次。加入显色液TMB，显色10分钟，加入浓硫酸终止反应，酶标仪D₄₅₀nm读数。分别作抑制曲线，根据拟合曲线计算半数抑制浓度。依据公式计算： 

交叉反应率＝IC₅₀环丙沙星/IC₅₀被测组药物×100％ 

结果表明：恩诺沙星与环丙沙星存在90％的交叉反应，而氧氟沙星、双氟沙星、沙拉沙星、氯霉素、孔雀石绿与环丙沙星均无交叉反应。 

与其它药物的交叉反应表 

(4)JY-1抗体的竞争抑制曲线测定 

取100ng/mL的CIP-OVA包被酶标板，37℃，1小时。加入5％牛奶的磷酸缓冲液37℃封闭1小时。同时加入倍比稀释的环丙沙星标准品(0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL)、JY-1抗体(稀释1∶50000)各50μL，37℃，1小时，洗板三次。加入酶标二抗100μL，37℃，0.5小时，洗板三次。加入显色液TMB，显色10分钟，酶标仪D₄₅₀nm读数。 

结果见图4，为IC₅₀的测定曲线，表明：IC₅₀为3.45ng/mL；线性方程为y＝-23.1x+80.3，R₂＝0.9811，为下一步试剂盒组装奠定了良好的基础。 

Claims (8)

1.一种环丙沙星单克隆抗体细胞株，由骨髓瘤细胞与产生抗环丙沙星抗体的脾细胞融合制备而成，在CCTCC的保藏编号为C200947。

2.如权利要求1所述的细胞株，其特征在于，所述的脾细胞得自以环丙沙星与牛血清白蛋白偶联物免疫的动物。

3.如权利要求2所述的细胞株，其特征在于，所述的偶联物制备过程如下：

(1)先将牛血清白蛋白水溶液、环丙沙星水溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐水溶液以摩尔比为1∶503∶10433的比例混合，在室温下反应2小时；

(2)将反应后的液体装入透析袋内，再放入1L磷酸缓冲液中透析48小时，每24小时换液一次；

(3)收集透析袋内的液体，在-20℃预冷冻2小时，然后在-50℃下冷冻干燥，制成环丙沙星免疫原白色固体粉末。

4.如权利要求1所述的细胞株，其特征在于，所述的融合制备过程如下：

(1)环丙沙星与牛血清白蛋白偶联物免疫Balb/c小鼠；

(2)免疫小鼠的脾细胞与SP2/0按照2～5∶1的比例混合，在1分钟内逐滴加入聚乙二醇，静置5min后，加入RPMI1640培养基离心，细胞加入含有HAT和小鼠胸腺细胞的1640培养液，混合均匀后每孔100μL滴加到4个96孔板内；培养于CO₂浓度为4.5％和37℃恒温恒湿条件下的CO₂培养箱中；

(3)用环丙沙星与鸡卵血清白蛋白偶联物包被酶标板，筛选阳性杂交瘤细胞；

(4)阳性克隆的杂交瘤细胞注入降植烷处理的Balb/c小鼠腹腔，进行单克隆抗体的制备。

5.如权利要求4所述的细胞株，其特征在于，所述的包被酶标板的包被原环丙沙星与鸡卵血清白蛋白偶联物，制备过程如下：

(1)先将鸡卵血清白蛋白水溶液、环丙沙星水溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐水溶液以摩尔比为1∶340∶7043混合，在室温下反应2小时；

(2)将反应后的液体装入透析袋内，再放入1L磷酸缓冲液中透析48小时，每24小时换液一次；所述的磷酸缓冲液PH为5.0，浓度为0.01mol/L；所述的透析袋半周长为22mm，截留分子量为14000；

(3)收集透析袋内的液体，在-20℃预冷冻2小时，然后在-50℃下冷冻干燥，制成环丙沙星包被原白色固体粉末。

6.如权利要求4所述的细胞株，其特征在于，所述的筛选阳性杂交瘤细胞过程如下：用环丙沙星与鸡卵血清白蛋白偶联物包被酶标板，用酶联免疫间接法对细胞上清液进行鉴定；将阳性值大于阴性值2倍，且阳性值大于0.5以上的细胞孔及时进行克隆。 

7.一种环丙沙星单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的CCTCC NO：C200947产生，对环丙沙星具有特异性。

8.如权利要求7所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的抗体与恩诺沙星存在90％的交叉反应，而与氧氟沙星、双氟沙星、沙拉沙星、氯霉素、孔雀石绿均无交叉反应。 

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