CN101880326A - 干扰素-β复合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及干扰素-β复合物。具体地,本发明涉及具有高度生物学活性的干扰素-β和聚乙二醇之间的复合物,并且涉及高效生产所述复合物的方法。也就是说,本发明涉及生产干扰素-β复合物的方法,包括在至少一种添加剂存在的情况下,将干扰素-β结合到聚乙二醇上,所述添加剂选自具有5个或更少糖单元的寡糖、单糖、其相应的糖醇和C2-6多羟基醇,并且涉及由所述方法生产的干扰素-β复合物,其具有特异性结合位于干扰素-β氨基酸序列中第19或134位上赖氨酸的聚乙二醇。

Description

干扰素-β复合物
本申请是申请日为2004年8月24日的中国专利申请200480031301.5“干扰素-β复合物”的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种具有聚乙二醇的干扰素-β复合体,所述聚乙二醇特异性结合位于干扰素-β氨基酸序列第19或134位上的赖氨酸,并且涉及其生产方法。
背景技术
已知水溶性聚合物如聚乙二醇,当结合以蛋白质药物为典型例子的生物分子时,以带来如下效应的方式赋予临床用途,如提高的物理学和热稳定性、对蛋白酶的耐受性和溶解性,以及体内分布体积的减少和血液中滞留的增强(见Inada等,J.Bioact and CompatiblePolymers 5,343(1990);Delgado等,Critical Reviews in TherapeuticDrug Carrier Systems 9,249(1992);和Katre,Advanced DrugDelivery Reviews 10,91(1993))。
现有多种方法将天然干扰素-β或具有与天然干扰素-β相同一级结构的干扰素-β结合到水溶性聚合物聚乙二醇(PEG)上。例如,Katre等已将赖氨酸等的氨基修饰应用到干扰素-β的PEG化作用中(见美国专利号4766106和4917888和国际公开号WO87/00056)。具体地,他们报道了一种通过将具有300-100,000分子量的水溶性聚合物(PEG)结合到重组干扰素-β或IL-2上而获得的缀合物,所述结合是通过其氨基酸序列中的1-10个赖氨酸残基进行的。备选地,在“Chemically modifiedlymphokine and production thereof”中已经报道了将PEG结合到淋巴因子的氨基上的技术(见日本专利公开(Kokai)号60-226821A(1985))。不过,实际上,通过这些方法制得的结合PEG的干扰素-β具有减少到小于10%的干扰素-β活性并且不能进行实际应用。
以往尚无报道描述过将PEG选择性地结合到干扰素-β中特定赖氨酸的氨基上的技术。如果可能选择并且特异性修饰赖氨酸,使得由PEG结合引起的干扰素-β生物学活性的减弱比率最小化,则作为药物给药的蛋白质总量的减少会导致对患者更少的副作用并且进一步导致更容易的质量控制。
另一方面,还已知一种方法,其使用不涉及赖氨酸残基的还原性烷基化作用以便通过在适于所述干扰素的氨基端α氨基的选择性活化的pH下的反应,将水溶性聚合物选择性地结合到干扰素的氨基端上(见日本专利公开(Kokai)号9-25298A(1997))。  不过,实际上,通过这种方法进行的干扰素-β的PEG化作用并不给出单-PEG化作用并且在任何赖氨酸残基上或N末端都带来非选择性的PEG化作用,导致生成没有充分抗病毒活性和细胞生长抑制活性的异质混合物。
更重要的是,如Pepinsky等所报道的,还已知当PEG具有高于20,000的分子量时纯化的N末端结合PEG的干扰素-β具有显著降低的残留活性(相对于结合前干扰素-β活性的比率),并且当所述PEG具有40,000的分子量时完全缺失活性(见Pepinsky等,The Journal ofPharmacology and Experimental Therapeutics,vol.297,p1059-1066,(2001))。
对于干扰素-α,Bailon等曾生产出在赖氨酸残基上用分枝的聚合物PEG非选择性单-PEG化的干扰素-α,所述分枝的聚合物PEG具有40,000的分子量(Bailon等,Bioconjugate Chem.12,195(2001))。不过,他们报道如N末端结合PEG的干扰素-β的情形一样,结合具有高达40,000分子量的PEG的干扰素-α的残留活性显著降低,为7%。
也就是说,直接应用技术是困难的,所述技术是为了以低分子量PEG乃至高分子量PEG进行修饰而发展出来的(结合的PEG的数目和位置)。因而,需要一种新技术来生产结合一定分子量PEG的高活性干扰素-β复合物,所述PEG具有足够获得诸如延长的体内循环半寿期和减小的清除值的效应所必需的分子量(20,000或更高),所述延长的体内循环半寿期和减小的清除值带来作为药物的用途。
如上所述,到目前为止尚无对赖氨酸残基的选择的报道,所述赖氨酸残基有待进行修饰以避免结合高分子量水溶性聚合物的干扰素-β活性的减弱,以及对于为此目的的技术的报道。而且,尚无高分子量水溶性聚合物如PEG选择性结合到存在于干扰素-β中11个赖氨酸残基中的任一个上产生高度活性干扰素-β复合物的报道。
发明内容
本发明的一个目的是发现一种干扰素-β复合物的结构,即使以高分子量物质如聚乙二醇进行修饰它也没有生物学活性的损害,并且提供高效生产这种复合物的方法。特别地,本发明的一个目的是获得即使结合具有高达40,000的分子量的PEG也会保留10%或更高的干扰素-β活性的干扰素-β复合物。
本发明人已经进行了许多种研究以达到所述目的并且因此发现天然干扰素-β在第80位上具有糖链连接的天冬酰胺,使其活性的减少最小化的方法是用高分子量物质选择性地修饰位于第19或134位上的赖氨酸残基,从三维结构的观点来看所述赖氨酸残基最接近此天冬酰胺。即使当使用具有超过10,000的分子量的聚合物(例如,PEG)时,所述聚合物选择性结合到位于第19或134位上的赖氨酸也能够最小化干扰素-β活性的减弱。
以往将位于第19位上的赖氨酸残基列为应当在PEG结合到干扰素-β的氨基上时被去除的赖氨酸残基之一(见国际公开号WO01/15736)。所以,这一结合位点不能由传统技术所预期。至于位于第134位上的赖氨酸残基,到目前为止尚无报道高分子量修饰物质选择性结合到这一位点上使得干扰素-β活性的减弱最小化。
也就是说,本发明提供一种方法来生产干扰素-β复合物,包括在至少一种选自由具有5个或更少糖单元的寡糖、单糖、其相应的糖醇和C2-6多羟基醇构成的组的添加剂存在的情况下,将干扰素-β结合到聚乙二醇上。本发明还提供由所述方法生产的干扰素-β复合物,特别是一种干扰素-β复合物,其特征在于所述复合物是通过将聚乙二醇特异性结合位于干扰素-β氨基酸序列中第19或134位上的赖氨酸残基来生产的。
本发明的干扰素-β复合物具有高度血溶性、干扰素-β活性和物理学和生物学稳定性,并且可用作在干扰素-β应用到的全部症状和疾病的治疗、预防和缓解中的药物。
附图说明
图1是显示干扰素-β复合物的Poros HS柱分离和纯化的图示,所述干扰素-β复合物具有结合位于第19位上赖氨酸的氨基的聚乙二醇。在该图示中,上面的箭头表示混合的溶剂B的比例,而下面的箭头表示280nm上的吸光度;
图2是显示对通过干扰素-β复合物的Poros HS柱分离和纯化所获得的峰1-4(在附图中为(i)-(iv))的组分进行分析的结果的图示,所述干扰素-β复合物具有结合位于第19位上赖氨酸的氨基的聚乙二醇,其中所述组分通过SDS-PAGE进行分离并且随后通过银染进行分析;
图3是显示干扰素-β复合物的SP-5PW柱分离和纯化的图示,所述干扰素-β复合物具有结合位于第19位上赖氨酸的氨基的聚乙二醇;
图4是显示干扰素-β复合物的氨基酸序列以及其中预测的赖氨酰基内肽酶剪切位点的图示;
图5是显示在与具有40K分子量的PEG结合反应之后用SP-5PW柱分离的峰2-4(在附图中,用(ii)至(iv)表示)的洗脱组分的肽图谱(用赖氨酰基内肽酶处理),以及在与PEG反应之前干扰素-β的肽图谱(在附图中,用最下部分的Pre表示)的图示;
图6是显示干扰素-β在兔血液中滞留的图示,所述干扰素-β具有结合位于第19位上赖氨酸的40K分子量的PEG;
图7是显示干扰素-β在兔中诱导药效标记(2-5A合成酶活性)的时间进程的图示,所述干扰素-β具有结合位于第19位上赖氨酸的40K分子量的PEG;
图8是显示分析由TOYOPEARL CM 650柱分离干扰素-β复合物获得的峰级分的结果的图示,所述干扰素-β复合物具有结合位于第134位上的赖氨酸的氨基的聚乙二醇,其中通过SDS-PAGE分析所述级分(A),用SP-5PW柱进一步分析峰3(在附图中为(iii))的级分(B)(以洗脱的顺序从下到上列出每次层析);
图9是显示具有2个或多个PEG分子的非选择性多-PEG化的干扰素-β复合物以及具有选择性结合位于第19或134位上的赖氨酸的PEG的单-PEG化的干扰素-β复合物的活性。在该图中,用TOYOPEARL CM 650(S)柱(Tosoh)(B)获得的层析谱,相应于每种分离级分的SDS-PAGE分析的结果(A),和抗病毒活性值/每种级分的蛋白的量以及相对于PEG结合前IFN-β比活性的活性保持率(C)彼此相关地进行显示;和
图10是显示静脉内给药到兔中的结合20,000(20K)-或40,000(40K)-分子量PEG的IFN-β复合物在血液中滞留的图示。
本说明书包括在日本专利申请号2003-299850的说明书中所述的内容,其作为本申请优先权的基础而起作用。
具体实施方式
如上所述,本发明的方法能够有效地将聚乙二醇结合位于干扰素-β氨基酸序列第19或第134位上的赖氨酸并且从中分离未结合的产物和副产物。
可以将天然干扰素-β,改自天然干扰素-β的具有糖链的干扰素-β,或者有或无糖链的重组干扰素-β用作实施本发明方法的干扰素-β。在本发明的方法中,可以将商业上现有的产品用作这种干扰素-β。天然干扰素-β在第80位上具有糖链连接的天冬酰胺,从三维结构的观点来看其最接近位于第19位上的赖氨酸。当高分子量的PEG结合于其上时,优选使用无糖链的重组干扰素-β,因为可能的位阻减弱反应效率。任何具有伴随着一个或几个氨基酸的删除、取代或添加的天然干扰素-β氨基酸序列的干扰素-β都可以用作实施本发明方法的干扰素-β。
本发明的干扰素-β还包括天然干扰素-β,重组干扰素-β,及其变化形式。所述变化形式意指通过改变或修饰如上所述的天然干扰素的氨基酸序列或糖链而获得的任何形式。在本说明书中,位于第19或第134位上的赖氨酸由这种天然干扰素-β的氨基酸序列的氨基酸号码来表示(图4和SEQ ID NO:1)。所述变化形式的这种赖氨酸的氨基酸号码以对应于天然干扰素-β氨基酸序列中的赖氨酸的位置的方式改变。
任何这些形式的干扰素-β都可以通过任何方法,如从组织中提取,蛋白质合成,和利用天然或重组细胞的生物学生产来获得。遗传工程化的无糖链的干扰素-β是商业上现有的,并且这种商业上现有的干扰素-β也可以用在本发明的方法中。
聚乙二醇(PEG)对于人体是无害的,并且当作为结合到其上的干扰素-β复合物而进行施用时,在使所述复合物溶解于血液中所必需的水平上赋予水溶性。本领域已知PEG结合到生理活性物质上允许活体中的生理活性物质获得提高的物理和热稳定性,对抗酶降解的保护作用,增强的溶解性,延长的体内循环半寿期,和降低的清除值。根据这些效果,PEG可以优选用于本发明中。
在PEG末端激活中可以使用任何方法以便将PEG结合到干扰素-β中的赖氨酸残基的氨基上。例如,可以采用在末端具有氨基反应性结构如羟基琥珀酰亚胺酯或硝基苯磺酸酯结构的PEG。在本说明书中,任何这些末端结构都称作“氨基反应性官能团”,而具有任何这些末端结构的PEG都称作“用氨基反应性官能团活化的聚乙二醇”。具有任何这些结构的PEG被常规地广泛用于和氨基结合,并且可以通过公知的或商业上现有的合成方法轻易地进行生产。在本发明中,这种商业上现有的产品也可以优选地进行使用。
对所述PEG的平均分子量并不进行特别限定,不过,从允许活体中的干扰素-β获得物理和热稳定性,对抗酶降解的保护作用,增强的溶解性,延长的体内循环半寿期,和降低的清除值的观点来看,优选大约10,000-60,000,更优选大约20,000-40,000。
可以通过将干扰素-β与PEG在pH 5.0-8.5,优选pH 5.5-8.0,以及在针对干扰素-β的活性的抗还原剂存在的情况下,优选在缓冲溶液如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲溶液中反应来进行干扰素-β和PEG之间的结合反应。所述针对干扰素-β的活性的抗还原剂不仅抑制由干扰素-β被置于适于反应的pH 5.0-8.5的环境中而引发的干扰素-β的积聚,还有助于PEG与位于第19位或第134位上的靶向赖氨酸或其邻近位点的特异性结合反应。针对干扰素-β的活性以便有效地将PEG结合到预期位点并保持干扰素-β活性的抗还原剂的例子可以包括糖类等,具有5个或更少糖单元的寡糖,单糖,其对应的糖醇,C2-6多羟基醇。特别优选的是二糖或单糖如葡萄糖、甘露糖、山梨糖、蔗糖或海藻糖,其对应的糖醇,和C2-3多羟基醇如乙二醇或甘油。这些针对干扰素-β的活性的抗还原剂可以单独使用或以其中两个或多个的任意组合形式使用。
对用在本发明方法中的针对干扰素-β的活性的抗还原剂的浓度并不作特别限定,不过,相关于反应混合物的总重,大约为1-90%(当使用多种针对干扰素-β的活性的抗还原剂时为合计;下文中,以相同方式进行指定),更加优选大约1-50%,还要更加优选大约10-30%。对干扰素-β∶PEG混合物的比例并不作特别限定,不过,对于用琥珀酰亚胺酯活化的PEG来说,一般是大约1∶1-1∶400摩尔比,并且优选大约1∶4-1∶100摩尔比。适于本发明的方法的反应温度一般是4-40℃,优选4-25℃。尽管反应时间是根据反应温度等进行适当确定的,但是一般大约1小时-24小时是足够的。
通过所述反应方法可以将聚乙二醇特异性地结合位于干扰素-β氨基酸序列中第19位或第134位上的赖氨酸或其空间邻近位点。所述“其空间邻近位点”指在干扰素-β活性构象中的邻近位点,具体地,是对于位于第19位的赖氨酸来说位于第17位的半胱氨酸或位于第80位的天冬酰胺(具体是连接于其上的糖链)。另外,术语“特异性的”或“特异性地”指聚乙二醇与位于第19位或第134位上的赖氨酸或其空间邻近位点的选择性和优先性结合。这种特异性结合给出均一的单-PEG化的干扰素-β。
将在末端具有巯基反应性结构如正吡啶基(orthopyridyl)二硫化物、乙烯基砜(vinyl sulfone)、马来酰亚胺或碘乙酰胺(iodoacetamide)结构的水溶性聚合物,优选将具有马来酰亚胺结构的水溶性聚合物用在与半胱氨酸巯基的结合反应中。对于将具有特别需要的10,000-60,000分子量的PEG结合到干扰素-β氨基酸序列中的半胱氨酸残基上来说,优选使用具有小于天然糖链的糖链的干扰素-β,去除了糖链的干扰素-β,或最初没有糖链的干扰素-β。使用这种干扰素-β允许无还原性解离的结合反应以便在单一步骤中高效进行。
在结合反应后,可以通过任何方法或方法的组合去除未反应的干扰素-β和PEG以及副产物,所述方法如使用离子交换载体、凝胶过滤载体、或疏水性或亲水性载体的层析,以便纯化或浓缩具有结合位于第19或第134位上赖氨酸的PEG的所需干扰素-β复合物。
最有效纯化或浓缩具有结合位于第19或第134位上赖氨酸的PEG的干扰素-β复合物的方法之一是使用离子交换载体的层析。所用的离子交换载体优选是阳离子交换载体,更加优选将磺丙基、磺酸或羧甲基附于基底物质上的载体,任何这些离子交换载体都是商业上现有的。例如,当使用HiTrap SP HP(Amersham Pharmacia),Poros HS(Applied Biosystems),或SP-5PW(Tosoh)时,通过盐浓度梯度将痕量存在于反应溶液中的二-PEG化的干扰素-β复合物最先洗脱。随后,以全部洗脱级分的40%或更大的比例将具有结合位于干扰素-β氨基酸序列中第19位上赖氨酸的PEG的所需干扰素-β复合物洗脱,接着是具有结合N末端氨基或位于第33、46或108位上的赖氨酸作为PEG结合位点的少量异构体的复合物以及未反应的干扰素-β的洗脱和分级。在此过程中,可以同时分离具有结合位于第134位上赖氨酸的PEG的干扰素-β复合物。
通过将反应溶液调节到适于在pH3.0-8.0结合的离子强度来实施结合到阳离子交换载体上。在此情况下,所述阳离子交换载体可以加载到柱上或悬浮于反应溶液中。不过,当所述阳离子交换载体中的未反应的亲水性聚合物的积聚减小所需复合物的分离效率时,优选在悬浮和结合后将所述载体加载到柱上进行洗脱。通过用不断提高的盐浓度或pH在由柠檬酸盐、醋酸盐、磷酸盐等组成的缓冲溶液中实施逐步的梯度或无梯度洗脱可以进行由阳离子交换载体的洗脱。
如实施例3中所述,通过绘制肽图谱,接着进行获得的PEG结合片段的氨基酸分析或测序,可以分析分级和洗脱的干扰素-β复合物的PEG结合位点。
通过本领域已知的方法可以轻易测量由此产生的具有PEG的干扰素-β复合物的抗病毒活性,所述PEG结合位于第19或第134位上的赖氨酸(例如,Armstrong,J.A.,Methods In Enzymology,78,381-387,(1981);Rubinstein等,J.Virol.37,755(1981);和Borden等,Canc.Res.42,4948(1982))。具有结合位于第19位上赖氨酸的40,000分子量PEG的干扰素-β保持了结合前10%或更高的活性,这一活性等同于结合具有20,000分子量PEG的干扰素-β的活性。或者,具有结合位于第134位上赖氨酸的40,000分子量PEG的干扰素-β保持了结合前70-100%的活性。以往曾经报道过具有结合干扰素-βN末端的40,000分子量PEG的复合物的残留活性为0%(Pepinsky等,The Journal ofPharmacology and Experimental Therapeutics,vol.297,p1059-1066,(2001))。因此,这显示位于第19或134位上的赖氨酸用作干扰素-β的高分子量PEG结合位点是非常有用的。
还可以将本发明的方法应用到除了PEG之外的物质作为生产不会减弱干扰素-β活性的复合物的方法。优选地,所述除了PEG之外的物质具有氨基反应性结构,如羟基琥珀酰亚胺酯或硝基苯磺酸酯结构。这种第二分子不限于赋予体内稳定性的分子如PEG和血清蛋白并且可以是具有完全不同功能的生理活性物质,如酶、细胞因子、抗体分子或其片段。衍生自任何这些物质的复合物都可用于构建也具有干扰素-β活性的融合分子或标记试剂。
此外,可以应用本发明的方法来将干扰素-β固定到多种支持物上,例如,糖、玻璃或树脂材料的平坦表面或颗粒。也就是说,位于第19或134位上的赖氨酸用作干扰素-β和多种支持物中任一种之间的结合点允许干扰素-β的固定而不会减弱其活性。这种固定方法需要引入具有类似氨基反应性官能团的交联剂或预先将所述交联剂结合到支持物上。
可以将本发明的干扰素-β与PEG之间的复合物用于治疗多种涉及IFN生物学活性的疾病。例如,所述复合物可以用于治疗慢性活性乙型肝炎、慢性丙型肝炎和其它病毒性疾病;多种恶性瘤如成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、星细胞瘤和皮肤恶性黑素瘤;以及自身免疫疾病如发性硬化症。另外,它可以用于治疗伴随血管生成的疾病,例如,炎性疾病(例如,类风湿性关节炎或牛皮癣),眼科疾病(例如,糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、新生血管性青光眼(neovascularglaucoma)、Stevens-Johnson综合征及其相关疾病、眼类天疱疮及其相关疾病、角膜化学灼伤,或沙眼),以及癌症(例如、乳腺癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤、肾癌、脑肿瘤,或卡波西肉瘤)。
可以通过口服或肠胃外途径,将本发明的干扰素-β复合物直接给药或者作为通过将所述复合物与本领域已知的可药用载体或赋形剂相混合制备的药物组合物进行给药。不过,优选通过皮下、肌内或静脉内注射进行给药。
对于口服给药的剂型的具体例子包括片剂、丸剂、胶囊、颗粒、糖浆、乳剂和悬浮液。这些剂型是通过本领域公知的方法生产的并且包含一般用于药学领域的载体或赋形剂。
片剂的载体或赋形剂的例子包括乳糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉和硬脂酸镁。肠胃外给药的剂型的例子包括眼药水、软膏、注射剂、泥罨剂、栓剂、经鼻吸收剂、经肺吸收剂、经皮吸收剂和局部持续释放剂。
液体制品可以通过本领域已知的方法制备,例如,通过将干扰素-β复合物溶解或悬浮于一般用于注射的无菌水性溶液中或者通过干扰素-β复合物的乳化作用或包埋入脂质体。
固体制品可以通过本领域已知的方法制备,例如,通过将赋形剂如甘露糖、海藻糖、山梨糖、乳糖或葡萄糖加到干扰素-β复合物中以制成冻干产品。这种冻干产品可以进一步粉末化,或者,可以将这种粉末与聚乳酸或羟基乙酸混合和固化以便使用。
凝胶剂可以通过本领域已知的方法制备,例如,通过将干扰素-β复合物溶于增稠剂或多糖如甘油、聚乙二醇、甲基纤维素、羧甲基纤维素、透明质酸或硫酸软骨素中。任何这些制品都可以添加以人血清白蛋白、人免疫球蛋白、α2-巨球蛋白、氨基酸等作为稳定剂,并且可以添加以醇、糖醇、离子表面活性剂、非离子表面活性剂等作为在不损害IFN生物学活性范围内的分散剂或吸收促进剂。或者,可以任选地向其中加入痕量金属或有机酸盐。
根据患者的年龄和体重,要治疗的疾病或症状,给药形式和途径,PEG的分子量等适当地确定本发明的复合物的剂量。不过,通常,在一次剂量/月到一次剂量/天的范围内给药本发明的复合物,优选一次剂量/月到一次剂量/周,1,000单位-100百万单位/剂量,优选10,000单位-18百万单位/剂量。
实施例
下文中,参照实施例对本发明进行更充分地描述。
[实施例1]
添加剂对于羟基琥珀酰亚胺酯活化的聚乙二醇与重组干扰素-β的氨基的结合反应的作用:
将葡萄糖、甘油或乙二醇以每种终浓度1,5,10,和20%加入到保存于0.5M氯化钠和100mM醋酸盐缓冲溶液(pH5.0)中的重组人干扰素-β中(终浓度:200μg/ml;其是根据Goeddel等,Nucleic Acid.Res.Vol.8,4057-4074(1980)的方法用重组大肠杆菌(Escherichia coli)表达和纯化的)。用1M的磷酸氢二钠溶液将这些溶液和无添加剂的对照的pH调节到7.8。以大约10/摩尔干扰素-β的摩尔比将羟基琥珀酰亚胺酯活化的聚乙二醇(平均分子量:40K;Shearwater Polymers,INC生产,购自NOF Corp)与每种得到的溶液相混合,随后于4℃过夜进行结合反应。反应后,去除未反应的干扰素-β,测量在每种制备的反应溶液中的干扰素-β活性。
利用酶抗体技术(夹心法免疫测定)(见Eiji Ishikawa,“EnzymeImmunoassay”3rd Ed.,p.180,Igaku-shoin)进行所述活性的测量。具体地,将兔抗干扰素-β抗体固定于免疫板上,随后与样品一起向其中加入只识别活性干扰素-β结构的酶标记的小鼠单克隆抗体。在洗去未结合的产物后,向免疫板上加入着色底物以通过与标准的着色值相比较来计算样品的干扰素-β活性(确证干扰素-β活性的结果等同于由基于培养细胞的抗病毒活性的生物学活性测量方法获得的结果)。同时,以与上面相同的方式加入表面活性剂Tween 80或HCO-60抑制干扰素-β的积聚,不过,还在很大程度上抑制PEG的结合反应的进行,导致所述缀合物活性的不成功的测量。
如表1中所示,与对照(通过在缺失添加剂情况下的PEG的结合反应获得的PEG-干扰素-β复合物的活性)相比,在含有适量葡萄糖、甘油或乙二醇的反应溶液中观察到提高活性的明显效果。
[表1]
Figure G2009101426886D00111
[实施例2]
具有结合位于第19位上的赖氨酸的氨基的聚乙二醇的干扰素-β复合物的分离和纯化:
以20%的终浓度将乙二醇加入到保存于0.5M氯化钠和100mM醋酸盐缓冲溶液(pH 5.0)中的重组人干扰素-β中(终浓度:200μg/ml),随后用1M的磷酸二氢钠溶液调节pH到7.6。将羟基琥珀酰亚胺酯活化的聚乙二醇(平均分子量:40K;购自NOF Corp)与得到的溶液相混合,随后于4℃过夜进行结合反应。相对于含有10mM NaCl-0.05%Tween 20的20mM醋酸盐缓冲溶液(pH4.5)于4℃过夜透析反应溶液。将透析溶液应用到阳离子交换柱Poros HS 1.7mL-gel(由AppliedBiosystems生产)或SP-5PW(Tosoh)。通过提高与溶剂A(含有10mM NaCl的20mM醋酸盐缓冲溶液(pH 4.5-4.7))混合的溶剂B(含有1M NaCl的20mM醋酸盐缓冲溶液(pH 4.5-4.7))来进行洗脱。具体地,通过逐步将溶剂B的比例提高到Poros HS柱中的30,40,50,和100%和通过在SP-5PW柱中使用0-100%的连续梯度来进行洗脱。通过用Poros HS柱进行的洗脱获得的吸光度层析谱显示于图1中。将通过逐步提高溶剂B的比例到30,40,50,和100%洗脱的吸光度层析谱上的组分分别叫做峰1-4(在附图中为(i)-(iv))。
在SDS-PAGE分离后通过银染分析每种峰组分(1-4)的结果显示于图2中。在峰2中可以获得所需的具有结合位于第19位上的赖氨酸残基的40K分子量PEG的干扰素-β复合物。可以将不能完全被反应所控制的PEG结合位点的少量异构体(minor isomers)分离为副产物,其包括具有结合位于第33位上的赖氨酸残基的PEG的干扰素-β复合物(在峰3中),和具有结合N末端氨基或位于第108或134位上的赖氨酸残基的PEG的干扰素-β复合物(在峰4中)。在峰4和1中可以分别分离出未反应的干扰素-β和二-PEG化的干扰素-β。
通过用SP-5PW柱进行的洗脱获得的吸光度层析谱显示于图3中。所述SP-5PW柱能够进行类似于Poros HS柱的分离。作为峰2,所需的具有结合位于第19位上的赖氨酸残基的40K分子量PEG的干扰素-β复合物占蛋白质总量的大约65%(相对于除了未反应干扰素-β的全部PEG化复合物其比例为65%或更大)。
[实施例3]
重组干扰素-β的聚乙二醇结合位点的确认:
将实施例2中用SP-5PW柱分离的每种峰级分脱盐并用固相抽提柱(OASIS HLB;Waters)进行浓缩,随后用离心蒸发器进行干燥。将得到的产物溶于含有6mol/L胍的Tris缓冲溶液(pH 9)中,随后进行二硫苏糖醇的Cys还原和碘乙酰胺的酰胺甲基化作用。加入赖氨酰基内肽酶后,将得到的混合物于37℃温育5小时以进行结构特异性消化。用醋酸终止酶反应以制成预处理的样品进行分析。
将这种样品在下列条件下进行反相HPLC分析:柱:CadenzaCD-C(184.6×150);检测波长:214nm(UV);柱温度:40℃;流速:0.8mL/min;流动相A:醋酸/TFA/蒸馏水(1/0.2/1000);流动相B:醋酸/TFA/乙腈/蒸馏水(0.9/0.2/800/200);梯度:在80分钟内5%-70%的流动相B,接下来为在5分钟内的70%-100%的流动相B;分析循环:120min。
相应于PEG结合反应之前的干扰素-β的赖氨酰基内肽酶消化片段的HPLC层析谱中的峰(K1至K12)显示于图4和5-pre中。图4中的箭头表示赖氨酰基内肽酶剪切位点。由剪切产生的肽片段命名为K1到K12。图5中的符号K1到K12分别对应于图4中的肽片段K1到K12。相反地,如图5-2(在附图中为(ii);下文中,以相同方式指定)中所示,在峰2的肽图谱中观察到肽片段K1和K2的明显下降。这可能是因为PEG导入位于第19位上赖氨酸的侧链上的氨基使得这一位点阻遏赖氨酰基内肽酶消化,导致不生成肽片段K1和K2。由这一结果,估计导入PEG的位点是位于第19位上的赖氨酸。
峰3的肽图谱产生显示于图5-3中的结果,其中观察到肽片段K2的明显缺失。这可能是因为PEG导入位于第33位上赖氨酸的侧链上的氨基使得这一位点阻遏赖氨酰基内肽酶消化,导致不生成肽片段K2。由这一结果,估计导入PEG的主要位点是Lys33。
因为在如图5-4中所示的峰4中观察到肽片段K1的减少,估计存在N-末端缀合物。此外,肽片段K10减少一半,提示可能包含Lys 134或Lys 123异构体。
接下来,将作为在峰的反相HPLC分析中75分钟左右的峰出现的PEG-肽缀合物片段进行氨基酸序列分析。这一结果和由肽图谱获得的信息显示峰2,主要的反应产物,是所需的具有结合位于第19位上赖氨酸的PEG的复合物。分别在峰3和4中分离具有结合位于第33位上赖氨酸的PEG的位置异构体和具有结合位于第134或108位上赖氨酸或N端的PEG的位置异构体,作为少量副产物。
[实施例4]
具有选择性结合位于第19位上赖氨酸残基的40K或20K分子量PEG的干扰素-β复合物残留活性的测量:
通过实施例2的方法对具有选择性结合位于第19位上赖氨酸残基的40K或20K分子量PEG的重组人干扰素-β复合物进行合成、分离和纯化,随后与PEG结合之前的重组人干扰素-β进行活性比较。通过测量抗病毒活性来进行干扰素-β活性的比较。具体地,通过利用人羊水细胞FL细胞组合以辛德毕斯病毒或水泡性口炎病毒(VSV)的生物分析来进行评估(Armstrong,J.A.,Methods In Enzymology,78,381-387,(1981))。
作为结果,PEG结合前的重组人干扰素-β的活性为1.22×108MIU/mg,而具有40K PEG的缀合物则具有5.5×107 MIU/mg的抗病毒活性和高达45%的残留活性。以相同方式测量的具有20K PEG的缀合物的残留活性为38.7%。
[实施例5]
具有选择性结合位于第19位上赖氨酸残基的40K分子量PEG的干扰素-β复合物的药物动力学分析及其诱导药效标记活性的评估:
通过实施例2的方法对具有选择性结合位于第19位上赖氨酸残基的40K分子量PEG的重组人干扰素-β复合物进行合成、分离和纯化。以9 MIU/kg向兔(NZW,雄性)施用这种干扰素-β复合物。在给药前和在给药后15分钟,1.5小时,3.5小时,8小时,1天,2天,3天,4天,5天,6天,和7天由所述兔收集血液以测量血浆中的抗病毒活性和全血中的2-5A合成酶活性。抗病毒活性通过实施例1中所述的方法测量,而2-5AS合成酶活性是利用2-5A试剂盒“Eiken”(Eiken Chemical)根据特定的方案进行测量的。基于抗病毒活性测量的血液中干扰素-β残留活性的时间过程在图6中以图表形式表示。作为药效标记而起作用的2-5AS合成酶活性的时间过程在图7中以图表形式表示。具有40K分子量的PEG的结合导致血液中干扰素-β残留活性(AUC)的20.8倍的提高。  这种提高导致诱导药效标记的活性的提高(AUC由PEG的结合提高7.6倍并且超过了由未修饰的干扰素-β进行的药效标记诱导的最高值,即使在给药7天之后)。
[实施例6]
具有结合位于第134位上的赖氨酸的氨基的聚乙二醇的干扰素-β复合物的分离和纯化:
将以与实施例2中相同方式获得的重组人干扰素-β和PEG之间结合的反应溶液添加以5倍体积的10mM醋酸盐缓冲液(pH4.5),并应用到以相同缓冲溶液平衡的阳离子交换柱(TOYOPEARL CM 650(S)(Tosoh))上。
通过提高从0-65%以连续梯度混合的缓冲溶液的比例来用含有1M氯化钠的相同缓冲溶液洗脱蛋白质,并且随后进行分级。通过SDS-PAGE以及用SP-5PW柱(Tosoh)对洗脱的级分进行分析。相应结果示于图8-A和8-B中。
作为结果,如实施例2中一样获得三个峰。不过,当用SP-5PW柱单独分析第三个峰(图8-A中的峰(iii))中包含的级分时,所述级分显示为进一步分离成几种组分(图8-B)。在这些组分中,以与实施例3中相同的方式对含有组成第三个峰最高百分比的和最后洗脱的峰的级分进行分析。作为结果,从其中分离出具有结合位于第134位上的赖氨酸的PEG的干扰素-β复合物。
[实施例7]
由PEG与赖氨酸的非选择性结合反应获得的PEG干扰素-β复合物和由其选择性结合反应获得的PEG干扰素-β复合物之间活性的比较:
以20%的终浓度将乙二醇加入到保存于0.5M氯化钠和100mM醋酸盐缓冲溶液(pH5.0)中的重组人干扰素-β或天然干扰素中,随后以与实施例2中相同的方式利用1M磷酸氢二钠溶液将pH调节到5.5(反应条件1)或大约7.6(反应条件2)。以相对于一个干扰素-β分子的45倍的量将羟基琥珀酰亚胺酯活化的聚乙二醇(平均分子量:10K,20K,或40K;由Shearwater Polymers,INC生产,购自NOF Corp)与得到的溶液混合,随后于4℃过夜进行结合反应。
同时,以0.1%的终浓度将SDS加入到重组人干扰素-β或天然干扰素-β溶液中,随后将反应溶液的pH调节到9.0(反应条件3)。以相对于一个干扰素-β分子的45倍的量将羟基琥珀酰亚胺酯活化的聚乙二醇(平均分子量:10K,20K,或40K)与得到的溶液混合,随后于4℃过夜进行结合反应。
通过与实施例4中相同的抗病毒活性测量方法对反应后每种溶液中的干扰素-β活性进行评估。通过SDS-PAGE确认每种溶液中结合反应的进程。
如表2中所示,在不确保PEG与赖氨酸的结合选择性的反应条件3下,不论PEG的分子量如何,干扰素-β活性都降至10%或更低。在另一方面,在提高PEG与位于第19或134位上赖氨酸的结合选择性的反应条件1和2下,不论PEG的分子量如何,都确认至少10%或更高的干扰素-β活性得以保留。
[表2]
 FN-β类型 天然(糖链连接的)IFN-β 大肠杆菌重组IFN-β
 PEG分子量 40K    20K    10K  40K    20K     10K
 反应条件1反应条件2反应条件3 100%  86%   94%54%   29%   15%1%    2%    1%  94%   54%    61.9%48%   21%    22%2.8%  0.7%   1.5%
[实施例8]
具有2或多个PEG分子的非选择性多PEG化的干扰素-β复合物和具有选择性结合位于第19或134位上赖氨酸的PEG的单PEG化的干扰素-β复合物之间活性的比较:
在与实施例6中相同方式的PEG结合反应之后,用TOYOPEARLCM 650(S)柱(Tosoh)分离包含具有2或多个PEG分子的非选择性多PEG化的干扰素-β复合物的级分和包含具有选择性结合位于第19或134位上赖氨酸的PEG的单PEG化的干扰素-β复合物的级分以通过实施例4中所述的测量抗病毒活性的方法测量它们的干扰素-β活性。作为结果,如图9所示,具有2或多个PEG分子的非选择性多PEG化的干扰素-β复合物仅保留了大约1%的活性,而具有选择性结合位于第19或134位上赖氨酸的40K PEG的单PEG化的干扰素-β复合物则保留了10%或更多的活性。
[实施例9]
结合20,000分子量PEG的IFN-β复合物与结合40,000分子量PEG的IFN-β复合物之间在血液中滞留的比较:
用125I对结合20,000-或40,000-分子量PEG的IFN-β和非PEG化的IFN-β进行标记并向兔进行静脉给药。按照时间先后从兔中收集血液,一直持续6天。通过用γ计数器测量放射活性来测量血液中残留的每种干扰素-β的量。血液中残留的干扰素-β量的时间过程显示于图10中,给药时的放射活性为100%。在长达6天中对于结合40,000分子量PEG的IFN-β来说血液中残留的干扰素-β的量的积分是非PEG化的IFN-β的量的5.5倍。对于结合20,000分子量PEG的IFN-β来说血液中残留的干扰素-β的量的积分是非PEG化的IFN-β的量的1.5倍。这一结果显示对于血液中IFN-β复合物的滞留来说将20,000或更高分子量PEG结合到IFN-β上是重要的,活性得以保持。
在此将本文引用的所有出版物、专利和专利申请的全部内容并入作为参考。
工业实用性
根据本发明,可以将聚乙二醇特异性结合位于干扰素-β氨基酸序列中第19或134位上的赖氨酸。通过本发明的方法生产的干扰素-β复合物保持高度活性,同时在活体内具有充分的溶解性与物理和生物学稳定性以及极佳的循环半寿期和清除值。因而,本发明的干扰素-β复合物产生更少的副作用并且可以用作高效药物。
序列表
<110>Toray Industries Inc.
<120>干扰素-β复合物
<130>PH-2231-PCT
<140>
<141>
<150>JP2003-299850
<151>2003-08-25
<160>1
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>166
<212>PRT
<213>智人
<220>
<223>发明人:Narumi,Hideki
     发明人:Tsushima,Yoshiaki
     发明人:Yamashita,Koji
     发明人:Sone,Saburou
     发明人:Sato,Miyuki
<400>1
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln
  1               5                  10                  15
Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
             20                  25                  30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln
         35                  40                  45
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln
    50                  55                  60
Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
 65                  70                  75                  80
Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn
                 85                  90                  95
His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
            100                 105                 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
        115                 120                 125
Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr
    130                 135                 140
Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu
145                 150                 155                 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
                165

Claims (10)

1.干扰素-β和聚乙二醇的干扰素-β复合物,其中所述聚乙二醇特异性结合于位于干扰素-β氨基酸序列中第19或134位上的赖氨酸残基。
2.权利要求1的干扰素-β复合物,其中所述干扰素-β是天然的或重组的干扰素-β或其突变体,该突变体具有抗病毒活性,并且包含干扰素-β氨基酸序列中的一个或几个氨基酸取代、删除或添加,或者人干扰素-β糖链的改变或修饰。
3.权利要求1或2的干扰素-β复合物,其中所述聚乙二醇具有10,000-60,000的平均分子量。
4.权利要求1或2的干扰素-β复合物,其中所述干扰素-β复合物可由包括以下步骤的方法生产:在至少一种添加剂存在的情况下,将聚乙二醇特异性结合位于干扰素-β氨基酸序列中第19或134位上的赖氨酸残基,所述添加剂选自由具有5个或更少糖单元的寡糖、单糖、其相应的糖醇和C2-6多羟基醇构成的组。
5.权利要求4的干扰素-β复合体,其中所述添加剂选自由二糖、单糖、其相应的糖醇和C2-3多羟基醇构成的组。
6.权利要求4的干扰素-β复合体,其中所述添加剂选自由葡萄糖、甘露糖、山梨糖、蔗糖、海藻糖、乙二醇和甘油构成的组。
7.权利要求4的干扰素-β复合体,包括在pH 5.0-8.5将干扰素-β与聚乙二醇反应。
8.权利要求4的干扰素-β复合体,包括在pH 5.0-8.5将干扰素-β与用氨基反应性官能团活化的聚乙二醇反应,和随后利用离子交换载体将得到的反应产物进行浓缩和纯化的步骤,由此获得具有聚乙二醇的干扰素-β复合物,所述聚乙二醇特异性结合位于干扰素-β氨基酸序列中第19或134位上的赖氨酸残基。
9.权利要求8的干扰素-β复合体,包括用具有羟基琥珀酰亚胺酯或硝基苯磺酸酯结构的化合物活化聚乙二醇。
10.药物组合物,包含权利要求1-9的任一项的干扰素-β复合体。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006116948A1 (fr) * 2005-04-30 2006-11-09 Chengdu Institute Of Biological Products Conjugue de polyethylene glycol et d’interleukine-6 et son procede de preparation et son utilisation
WO2009080699A2 (en) * 2007-12-20 2009-07-02 Merck Serono S.A. Peg-interferon-beta formulations
GB0912485D0 (en) 2009-07-17 2009-08-26 Polytherics Ltd Improved conjugation method
SG11201401071YA (en) 2011-10-01 2014-08-28 Glytech Inc Glycosylated polypeptide and pharmaceutical composition containing same
MX2014010209A (es) * 2012-02-29 2014-11-21 Toray Industries Agente inhibidor para acumulacion de fluido de la cavidad corporal.
WO2014157107A1 (ja) 2013-03-29 2014-10-02 株式会社糖鎖工学研究所 シアリル化糖鎖が付加されたポリペプチド
JP2017100946A (ja) * 2014-03-28 2017-06-08 東レ株式会社 悪液質の治療剤又は予防剤

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1985003934A1 (en) 1984-03-06 1985-09-12 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein and process for its preparation
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
WO1987000056A1 (en) 1985-06-26 1987-01-15 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4917888A (en) * 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
JP4601163B2 (ja) * 1997-12-19 2010-12-22 メルク・セローノ・ソシエテ・アノニム Ifnar2/ifn複合体
CZ299164B6 (cs) * 1998-10-16 2008-05-07 Biogen Idec Ma Inc. Farmaceutická kompozice obsahující glykosylovaný interferon-beta-1a navázaný na polymer
US6513450B1 (en) * 1999-08-20 2003-02-04 Richard E. Gore Apparatus for coating meat
US6531122B1 (en) * 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
WO2001015736A2 (en) 1999-08-27 2001-03-08 Maxygen Aps Interferon-beta conjugates
EP1270642B1 (en) * 1999-12-24 2011-08-31 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Branched polyalkylene glycols
US7226903B2 (en) * 2001-10-10 2007-06-05 Neose Technologies, Inc. Interferon beta: remodeling and glycoconjugation of interferon beta
JP2004035515A (ja) * 2002-07-05 2004-02-05 Toray Ind Inc インターフェロンβ複合体の製造方法

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