CN101892223A - 启动子核酸；包含其的表达盒、载体和宿主细胞；和使用该细胞表达基因的方法 - Google Patents

启动子核酸；包含其的表达盒、载体和宿主细胞；和使用该细胞表达基因的方法 Download PDF

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Abstract

提供了包括至少一种选自由SEQ ID NO：1到7组成的组的多核苷酸的启动子、包括该启动子的表达盒、包括该表达盒的载体、包括该载体的宿主细胞，和使用该宿主细胞表达基因的方法。

Description

启动子核酸；包含其的表达盒、载体和宿主细胞；和使用该细胞表达基因的方法
本申请是于2005年12月16日提出的国际申请PCT/KR2005/004338(国家申请号：2005800435515，发明名称：来自棒杆菌属细菌的新的启动子核酸、包含该启动子的表达盒和包含该表达盒的载体、包含该载体的宿主细胞和使用该细胞表达基因的方法)的分案申请。 
技术领域
本发明涉及来自棒杆菌属细菌的新的启动子核酸、包含该启动子的表达盒、包含该表达盒的载体、包含该载体的宿主细胞和使用该宿主细胞表达基因的方法。 
背景技术
棒杆菌类细菌是用于产生用于许多应用的多种化学物质的微生物，所述化学物质为如动物饲料、药品，和食品，包括L-赖氨酸、L-苏氨酸，和多种核酸。通过遗传工程和代谢工程可以开发显示出高生产力的棒杆菌菌株。为了得到显示出高生产力的棒杆菌菌株，需要在棒杆菌中表达涉及多种代谢途径的基因。为此，必须开发合适的启动子。 
通常，在棒杆菌中，基因在内在地包括在该基因中的启动子的控制下表达(见例如，Journal of Bacteriology，181(19)，6188-6191，1999)。同时，在棒杆菌细菌中表达基因的启动子序列的结构是未知的，而其他工业微生物，如大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的结构是已知的。因此，已经提出了下面的方法用来产生能够使基因在棒杆菌细菌中表达的启动子。首先，除去耐受抗生素，如氯霉素的基因的启动子区。使用合适的限制酶单独地切割从棒杆菌细菌分离的染色体DNA，并将所得片段导入除去该启动子区的基因中。然后，所得基因用于转化棒杆菌细菌以产生转化的菌株并测量所转化的菌株的抗生素抗性(见Gene，102，93-98，1991；Microbiology，142，1297-1309，1996.)。具体地，已经开发了用于Corynebacterium ammoniagenesis中的非常少数目的启动子，Corynebacterium ammoniagenesis是一种已知的生产核酸的微生物。例如，在大肠杆菌中使用比tac启动子活性高约10％的启动子(见Biotechnol.Lett. 25，1311-1316，2003.)。然而，当它用于基因的大量表达时，这种启动子显示出低效率。美国专利号5,593,781公开了一种启动子DNA，其从黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)菌株MJ-233(FERM BP-1497)分离并且具有比tac启动子更高的活性。然而，这种从短杆菌属分离的启动子DNA在其他细菌中不能工作。因此，需要开发来自通过商业途径可获得的产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)并且在其他细菌中具有高活性的启动子序列。 
因此，本发明的发明人在产氨棒杆菌中寻找强启动子序列并且发现根据本发明的启动子可以在产氨棒杆菌中以高活性表达基因。 
附图描述 
图1显示了从产氨棒杆菌细菌提取的样品的二维电泳测定的结果，其中将测定结果进行银染并显影用于鉴定； 
图2图解了根据本发明的实施方案产生p117-gfp的筛选载体的方法； 
图3图解了根据本发明的实施方案从筛选载体p117-gfp产生包括启动子序列pcj1到pcj7的重组载体的方法。 
发明详述 
技术问题 
本发明提供了在棒杆菌中具有高活性的启动子。 
本发明还提供了包括所述启动子的表达盒和包括该表达盒的载体。 
本发明还提供了包括所述载体的宿主细胞。 
本发明还提供了使用所述宿主细胞表达基因的方法。 
技术解决方案 
本发明提供了包含至少一种选自由SEQ ID NO：1到7组成的组的多核苷酸的启动子。 
根据本发明的实施方案的启动子是分离的核酸并且具有启动子活性。这里，术语“启动子”指DNA区，RNA聚合酶结合该DNA区以起始基因的转录。术语“tac启动子”指通过将从大肠杆菌的色氨酸操纵子启动子的-35区得到的序列与从大肠杆菌的乳糖操纵子启动子的-10区得到的序列 融合得到的启动子。已知tac启动子具有高启动子活性。具有选自SEQ IDNO：1、4、5、6和7的至少一种核酸的启动子在棒杆菌属细菌中具有比tac启动子更高的活性。具体地，具有选自SEQ ID NO：1和4的至少一种核酸的启动子在棒杆菌属细菌中具有比tac启动子高4到10倍的活性。 
根据本发明的实施方案的启动子除了在棒杆菌属细菌中，还在埃希氏菌(Escherichia)属细菌中具有启动子活性。具体地，含有SEQ ID NO：1的启动子甚至在埃希氏菌属细菌中也显示出比tac启动子高两倍的启动子活性。 
本发明的启动子可以在其中起作用的细胞可以是任何棒杆菌属细菌。棒杆菌属细菌的实例包括产氨棒杆菌CJHB100(KCCM-10330)和ATCC6871、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032和ATCC13060，等等。然而，谷氨酸棒杆菌属细菌不限于此。本发明的启动子可以在其中起作用的埃希氏菌属细菌的实例包括大肠杆菌。 
根据本发明实施方案的启动子的序列可以由本领域普通技术人员通过已知的诱变方法如定向进化和位点定向诱变而容易地改变。因此，本发明的范围内包括与分离的启动子序列具有例如70％或者更高同源性，优选80％或者更高同源性，更优选90％或者更高同源性并且可以在棒杆菌属细菌中作为启动子的核酸，所述分离的启动子序列包括至少一种选自SEQ IDNO.：1到7的核酸。 
本发明还提供了表达盒，其包括可操纵连接编码序列的启动子。编码序列可以是例如完整基因或者编码基因的预定区域的编码序列。这里，术语“可操纵连接(operably linked)”指出编码序列功能地连接启动子，使得启动子序列可以起始或者介导编码序列的转录。根据本发明的实施方案的表达盒可以还包括可操纵连接启动子序列的5’和3’控制序列。编码序列可以是结合代谢产物，如IMP、GMP、L-赖氨酸和L-苏氨酸的基因。 
本发明还提供了包括根据本发明的实施方案的表达盒的载体。这里，载体是不受限制的，并且可以是本领域中已知的任何载体。根据本发明的实施方案的载体的实例包括pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen Inc，USA生产)和pECCG117(KFCC-10673)。然而，载体不限于此。包括根据本发明的实施方案的表达盒的载体的实例包括p117-cj1-gfp、p 117-cj2-gfp、 p117-cj3-gfp、p117-cj4-gfp、p117-cj5-gfp、p117-cj6-gfp和p117-cj7-gfp。 
本发明还提供了包括按照本发明的实施方案的载体的宿主细胞。宿主细胞可以是棒杆菌属细菌或者埃希氏菌属细菌，但不限于此。例如，宿主细胞可以是产氨棒杆菌CJHB100(KCCM-10330)或者大肠杆菌。 
本发明还提供了通过培养宿主细胞表达异源基因的方法。根据所选的宿主细胞，可以在多种已知的培养基和多种已知的培养条件之一下培养宿主细胞。 
有益效果 
可操纵连接根据本发明的启动子的基因在大肠杆菌和产氨棒杆菌中有效表达。启动子适于用棒杆菌属细菌开发菌株。 
包括根据本发明的启动子的表达盒和包括根据本发明的表达盒的载体适于在大肠杆菌和产氨棒杆菌中有效表达外源基因。 
根据本发明的宿主细胞可以有效表达外源基因。 
通过使用根据本发明的表达基因的方法，可以有效表达外源基因。 
最佳方式 
将参考下面的实施例进一步详细描述本发明。这些实施例仅用于阐明目的，并且不意在限制本发明的范围。 
实施例
从不同培养阶段的产氨棒杆菌CJHB100(KCCM-10330)制备细菌提取物。对细菌提取物进行二维电泳以发现其中过表达的蛋白质，然后将其切割以分析肽序列。所得的肽序列用于鉴定过表达蛋白质的基因。然而，分离启动子区，并使用启动子区产生载体。接着，测量启动子在产氨棒杆菌CJHB100(KCCM-10330)和大肠杆菌中的活性。 
实施例1：培养产氨棒杆菌CJHB 100(KCCM-10330)并根据培养阶段选择过表达蛋白质 
(1)细菌的培养 
在具有糖蜜的粗糖(含有50％葡萄糖和50％果糖的混合物)的培养基中培养产氨棒杆菌CJHB100(KCCM-10330)。此时，测量细胞浓度。在早稳定期和稳定期收获培养的产氨棒杆菌CJHB100(KCCM-10330)的样品。将样品离心并除去所得的上清液。得到的细胞沉淀在崩解缓冲液中裂解以产生约100μm细菌提取物。 
(2)二维电泳测定 
从第(1)部分得到的细菌提取物用6M尿素、2M硫脲、4％CHAPS和0.4％DTT稀释以得到总体积350μl的混合物。然后，向其中加入7μl的IPT缓冲液和3μl的1％溴酚蓝(BPB)。使用immobiline pH梯度drystrip将所得溶液装载到再水化盘。再水化盘上的样品用2ml覆盖液覆盖以防止样品的蒸发和尿素的结晶，然后在室温下再水化约24小时。 
使用等电聚焦装置(Multiphor II：Amersham Bioscience，USA.生产)将再水化的条带凝胶(strip gel)进行等电聚焦：在20℃0-100V进行1小时，300V进行1小时，600V进行1小时，和在8000V下进行预定的时间，该时间经调节以进行聚焦43-97kVhr(pH 4-7：43.4kVhr，pH 4.5-5.5，pH5.5-6.7：97kVhr)。 
当等电聚焦完成时，各自的条带凝胶在含有20mM Tris-HCl、6M尿素、2％SDS、20％甘油、2.5％丙烯酰胺和5mM TBP的pH 8.8溶液中平衡15分钟。将各自平衡的条带装载到二维凝胶(9-16％浓度梯度)中然后用含有0.5％具有低沸点的琼脂和0.001％BPB的SDS溶液密封。在100V下电泳约19小时。 
电泳完成后，将凝胶在45％甲醇溶液和5％乙酸溶液中固定。用蒸馏水洗涤乙酸1小时。将凝胶用0.02％硫代硫酸钠敏化2分钟并用蒸馏水洗涤。然后，将凝胶与0.1％硝酸银反应20分钟并用蒸馏水洗涤。反应产物用含有2％(w/v)碳酸钠和0.04％(v/v)甲醛的溶液显影。当斑点具有出现的希望的强度时，用1％乙酸中止反应。凝胶用蒸馏水洗涤并在4℃下保存在密封的塑料袋中。 
当使用考马斯染色时，当电泳完成后，用30％甲醇溶液和10％乙酸溶液固定凝胶1小时，用蒸馏水洗涤，用胶体考马斯亮蓝G-250染色24小时，然后用10％甲醇溶液和7％乙酸溶液漂白4小时。 
(3)基于斑点，制备用于质谱的肽样品 
使用已知方法(Shevchenko et al.Anal.Chem.，68(5)，850-8，1996.)的改进版从斑点分离肽。 
首先，从第(2)部分制备的凝胶切除蛋白质斑点，用30mM铁氰化钾和100mM硫代硫酸钠的1∶1比例的120μl混合溶液漂白，并用蒸馏水洗涤，然后用120μl 50％乙腈/25mM碳酸氢铵(pH 7.8)洗涤10分钟。所得产物与50μl 100％乙腈反应直到白色出现约5分钟，然后真空干燥。 
向干燥的斑点加入10μl二维电泳级的胰蛋白酶(0.02μg/μl)然后在冰水反应45分钟。然后，向反应产物加入50mM碳酸氢铵缓冲液(pH 7.8)并在37℃反应12-14小时。所得产物在10μl 0.5％TFA和50％乙腈中用超声波处理3次10分钟以提取肽。 
(4)质谱法 
通过HPLC-MS/MS分析如上述提取肽。用1100系列HPLC系统(Agilient Inc，USA生产)和Finnigan LCQ DECA离子阱质谱装置(ThermoQuest，USA生产)进行HPLC-MS/MS，在该装置上安装纳喷雾离子化源。用C18显微探针反相柱进行HPLC，并以线性梯度(流速＝1μl/分钟)提供0.1％甲酸(溶剂A)和90％(v/v)乙腈和0.1％甲酸的溶液(溶剂B)以分离肽。 
使用纳喷雾电离(NSI)(喷雾电压：1.8kV；毛细管温度：200℃；毛细管电压：34V；管透镜偏移：40V；和电子倍增器：-60V)进行肽检测3次。以图心模式(centroid mode)得到测量。得到400-2000Da的完整MS扫描后，将阈值设置为1×105计数并通过高分辨率局部放大扫描分离最强的离子。然后，进行碰撞诱导解离(CID)MS/MS。使用TurboQuest软件(Thermo Finnigan Inc，USA生产)鉴定不编码的CID光谱的序列。SEQUEST搜索的结果通过互相关和ΔCn(Δ归一化相关)鉴定。 
使用Q-star Pulsar LC MS/MS(Applied Biosystems Inc，USA生产)证实和鉴定肽的氨基酸序列。 
结果，发现了50种蛋白质，并选择了50种蛋白质的7种过表达的蛋白质。图1显示了从产氨棒杆菌提取的样品的二维电泳分析的结果，其中 将测定结果银染并显影用于鉴定。在图1中，鉴定了通过CJ1到CJ7表示的7种过表达的斑点。这些7种过表达的蛋白质的功能在表1中指出。通过将肽的序列与NCBI gene bank数据库中所含的氨基酸序列比较，鉴定了这些蛋白质的功能。 
表1 
  斑点名称   蛋白质  Gene Bank检索号
  热休克蛋白hps60  AE008903.1
  5-羧基甲基-2-羟基粘康酸半醛  脱氢酶  NC-006461.1
  同型原儿茶酸2，3-二加氧酶  NC-005835.1
  暂时翻译延伸因子EF-Tu  YP-145957
  甘油醛-3-磷酸脱氢酶  AAA69094
  半胱氨酸合酶  AAV89445
  过氧化锰歧化酶  NP-940564
从7种过表达的蛋白质推定基因序列并分析以选择启动子区。结果，推定从对应于CJ1到CJ7表示的蛋白质的基因序列分离的SEQ ID NO：1到7的寡核苷酸具有启动子活性。 
实施例2：制备具有启动子序列的重组载体p117-cj1～7-qfp和在产氨棒杆菌中启动子活性的证实 
(1)从产氨棒杆菌CJHB100的基因组扩增启动子序列 
使用Eikmann等人(Gene，102，93-98，1991)提出的方法，从培育1天的25ml产氨棒杆菌CJHB100培养物分离500μg染色体DNA。分离的染色体DNA用作模板。使用引物组(SEQ ID NOS：10和11、12和13、14和15、16和17、18和19、20和21、和22和23)进行PCR，分别在94℃，在55℃，在72℃，30秒，重复30次以扩增CJ1到CJ7的启动子。结果，扩增了各自的启动子序列pcj1到pcj7。 
(2)制备筛选载体 
首先，使用pGFuv载体(Clontech Inc，USA生产)作为模板并使用 SEQ ID NOS：8和9作为引物分别在94℃30秒、55℃30秒、和72℃1分钟进行PCR。在每个温度下进行PCR 30次。结果，扩增不包括启动子区的绿色荧光蛋白(GFP)基因。然后，将所得的不包含启动子区的GFP基因克隆到pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen，USA生产)中，其然后通过PstI和EcoRI切割并导入pECCG117(KFCC-10673/KFCC-10674)的PstI和EcoRI位点中，pECCG117是穿梭载体并且可以在大肠杆菌和棒杆菌细菌中表达。结果用作筛选载体(p117-gfp)来分离启动子。图2图解了根据本发明的实施方案，产生p117-gfp的筛选载体的方法。 
(3)导入启动子序列到筛选载体中和在产氨棒杆菌CJHB100中鉴定启动子活性 
将部分(2)中得到的筛选载体用KpnI/EcoRV的限制酶切割，然后连接到通过相同的限制酶切割的pcj1到pcj7的启动子序列中以产生p117-cj1-7-gfp的重组载体，其中pcj1到pcj7的寡核苷酸从产氨棒杆菌CJHB 100分离并且具有假定的启动子活性，将所述寡核苷酸连接到GFP。图3图解了从根据本发明实施方案的筛选载体p117-gfp产生包括SEQ.IDNOS：pcj1到pcj7的重组载体的方法。 
通过van der Rest等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.，52，541-545，1999)介绍的方法将得到的重组载体导入容易转化的产氨棒杆菌CJHB 100(KCCM-10330)中。将所得转化的菌株涂布含有10μg/ml卡那霉素的CM培养基(1％蛋白胨，1％肉汤，0.25％氯化钠，1％酵母提取物，100mg/ml腺嘌呤，100mg/ml鸟嘌呤，2％琼脂(pH 7.2))上并在32℃培养3天。从菌落筛选显示生长的活菌株。然后，将对筛选的菌株用紫外线照射并选择发出荧光的菌株。 
发出荧光的菌株的筛选表明pcj1到pcj7的启动子在棒杆菌细菌中显示出启动子活性。 
同时，定量测量启动子活性。将p117-cj1-7-gfp的重组载体导入产氨棒杆菌CJHB100(KCCM-10330)中并以与上述相同的方式培养。离心培养物得到细菌沉淀。然后，将细菌沉淀悬浮在蛋白质提取缓冲液(PBS中1mMEDTA，3％甘油，1％triton-X-100溶液，pH-7.5)并通过超声处理裂解。将裂解物离心并分离含有细菌提取物的所得上层溶液。通过Bradford测定法 测量细菌提取物中含有的蛋白质的量。随后，使用Laure Gory等人(FEMSMicrobiology Letters 194，127-133，2001)描述的方法向等于上述细菌提取物的量的细菌提取物照射488nm光，并使用LS-50B分光光度计(Perkin-Elmer)测量发射的光以发现GFP基因的表达程度并且发现具有511nm的波长。 
结果在表2中显示。如表2中所示，根据本发明的实施方案的启动子指导GFP基因的有效表达。更具体地，pcj1和pcj4的启动子与其他启动子相比显示出最高的效率。 
表2 
  启动子   pcj1   pcj2   pcj3   pcj4   pcj5   pcj6   pcj7
  12309   437   479   11790   1363   5651   2493
实施例3：比较tac启动子和根据本发明的实施方案的启动子在产氨棒杆菌中的活性 
在本实验中，比较了根据本发明实施方案的启动子和常用于产氨棒杆菌中的tac启动子的活性。 
(1)制备含有tac启动子和组合的GFP基因的载体 
首先，使用pKK223-2载体(Pharmacia Biotech，USA生产)作为模板并使用SEQ ID NOS：24和25作为引物以与实施例1中相同的方式进行PCR以扩增tac启动子序列。将扩增的产物克隆到pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen，USA)中。接着，将得到的tac启动子序列用KpnI和EcoRV的限制酶切割并连接到用相同限制酶切割的p117-gfp以得到重组的表达载体(p117-tac-gfp.)。 
将重组载体以与实施例1中相同的方式转化产氨棒杆菌CJHB100，并测量GFP基因的活性。将由于tac启动子的GFP基因的活性与由于根据实施例2选择的启动子的GFP基因的活性进行比较。结果在表3中显示。 
表3 
  启动  子   pcj1   pcj2   pcj3   pcj4   pcj5  pcj6   pcj7   Ptac
  1140％   40％   44％   1092％   126％  523％   231％   100％
如表3中所示，发现根据本发明的实施方案的启动子有效表达GFP基因。此外，当根据本发明的实施方案的启动子在产氨棒杆菌中的活性与tac启动子在产氨棒杆菌中的活性比较时，pcj1、pcj4、pcj5、pcj6和pcj7启动子比tac启动子显示出更高的强度。具体地，pcj1和pcj4的启动子显示出10倍于tac启动子活性。 
实施例4：在大肠杆菌中证实根据本发明的启动子的活性 
证实根据本发明实施方案的启动子除了在棒杆菌细菌中外还在大肠杆菌中显示出活性。将大肠杆菌用在实施例1和2中使用的重组表达载体转化。 
通过与实施例1中相同的方式测量GFP基因的活性确定根据本发明实施方案的启动子是否能够在大肠杆菌中有效表达GFP。参考载体是含有tac启动子的p117-tac-gfp重组载体。表4显示了根据本发明实施方案的启动子在大肠杆菌中的启动子活性。 
表4 
  启动  子   pcj1   pcj2   pcj3   pcj4   pcj5   pcj6   pcj7   ptac
  296％   15％   20％   17％   19％   24％   24％   100％
如表4中所示，发现根据本发明实施方案的启动子在大肠杆菌中有效表达GFP基因。更具体地，pcj1启动子在棒杆菌细菌和大肠杆菌中都显示出高活性。 
实施例5：IPTG对根据本发明的启动子活性的影响 
公知tac启动子是代表性启动子，通过该启动子，在大肠杆菌中可以通过IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导基因表达。换句话说，在大肠杆菌中，tac启动子表达的基因的量根据存在或不存在IPTG而变。 
在本实验中，测量了IPTG对根据本发明实施方案的启动子对GFP基因表达的影响。为此，将含有比p117-cj1-gfp的其他启动子有更高活性的pcj1启动子的重组载体以实施例1和2中相同的方式导入大肠杆菌和产氨 棒杆菌CJHB100(KCCM-10330)中，并测量由此表达的GFP基因的量。参照物是含有tac启动子的p117-tac-gfp重组载体。结果在表5中显示。 
表5 
Figure G2009102660819D00111
如表5中所示，根据本发明实施方案的启动子在大肠杆菌和产氨棒杆菌中比tac启动子更有效地表达GFP基因，不考虑IPTG的存在。 
向pECCG117中插入上述实施例中得到的pCJ1、pCJ2、pCJ3、pCJ4、pCJ5、pCJ6和pCJ7的启动子。所得的载体用于转化大肠杆菌DH5。将所得转化体根据布达佩斯条约在2004年11月16日保藏在国际保藏组织韩国微生物培养中心(KCCM)中(保藏号：KCCM-10611、KCCM-10612、KCCM-10613、KCCM-10614、KCCM-10615、KCCM-10616和KCCM-10617)。 
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Figure G2009102660819D00181
序列表 
<110>CJ株式会社 
<120>来自棒杆菌属细菌的新的启动子核酸、包含该启动子的表达盒和包含该表达盒的载体、包含该载体的宿主细胞和使用该细胞表达基因的方法 
<130>PN05941 
<160>24 
<170>KopatentIn 1.71 
<210>1 
<211>301 
<212>DNA 
<213>产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)CJHB100 
<400>1 
caccgcgggc ttattccatt acatggaatg accaggaatg gcagggaatg cgacgaaatt     60 
gactgtgtcg ggagcttctg atccgatgct gccaaccagg agagaaaata atgacatgtg    120 
caggcacgct ggtgagctgg agatttatga tctcaagtac cttttttctt gcactcgagg    180 
gggctgagtg ccagaatggt tgctgacacc aggttgaggt tggtacacac tcaccaatcc    240 
tgccgtcgcg ggcgcctgcg tggaacataa accttgagtg aaacccaatc taggagatta    300 
a                                                                    301 
<210>2 
<211>285 
<212>DNA 
<213>产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)CJHB100 
<400>2 
aattccacca gacgttgttt agtaagtgcc cgaattctcg gttggtgcag ttgcttttcg     60 
atgaatggga gaacctcgaa tacttccgcg tctctacttt ccggtacgtg ccacacagag    120 
cagagcaatc ggtggaagag cacgacagat tagtagcgct tatcgaagcc caggcagaag    180 
atttctacat cgaatcccaa gcccgcaacc accgcctgac aaccgcaacg acctaccgcc    240 
aacgtttaaa ttccgaaaat catcacgaag aacaaggagt gcaca                    285 
<210>3 
<211>291 
<212>DNA 
<213>产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)CJHB100 
<400>3 
gctgcctaca tctggacttc tgacctgaag cgctcccaca acttcgcgca aaacgttgaa     60 
gccggcatgg tctggttgaa ctccaacaac gtccgtgacc tgcgcacccc attcggtggc    120 
gtcaaggcat ccggtctggg gcatgagggc ggctaccgct ccattgactt ctacaccgac    180 
caacaggccg tacacatcaa cttaggcgaa gtccacaacc cagtcttcgg caagcaaacc    240 
aactaattct ccctcatcca cactcccctt ttaacctcac taggagtcat c             291 
<210>4 
<211>312 
<212>DNA 
<213>产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)CJHB100 
<400>4 
actgggaggg taggggtcac gctgaattag caggtcacat cctgttgctt gagctggccg     60 
ttaccctcct aggatccgag atgattcttg tagaggacta acgtccgcac aaatcttccg    120 
cgggatgctc aaatcaccct tagctggttt gaaaaatccg tggcataaat ctaggatcgt    180 
gtaactggca cgaaaagaaa gcgtcatcgg cgcttgggaa catcttttta agatattcct    240 
caagtgccgt gacatctgtc aaccccgtgg ctgcgagagt cgtagtcaca atgaagtcca    300 
ggaggacata ca                                                        312 
<210>5 
<211>249 
<212>DNA 
<213>产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)CJHB100 
<400>5 
tcggacatat acggatttac ctgctgcaat cgcgccggcc cttgctcgaa attgcgtgaa     60 
ttttagtctg attgtgttgg aatatccgca gaatgtgtgg gtttgctttt ataaatctgc    120 
gcagtgtagg gaacctcggt actatcggca gtgtcggaga aacttcctcg atataaatct    180 
ttgaagtaat tctcccaggc aatagctttt gacgtactcc gcttcccaac tttttaggag    240 
acaactacc                                                            249 
<210>6 
<211>332 
<212>DNA 
<213>产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)CJHB100 
<400>6 
ggcttcatcg tcgtctttga tccgatgcga gtccattaac ccaaactcct taaagcccgt     60 
aaaacggggg tattccaaca cggttatcca cagtttaacc gttattcggg ggtaatccta    120 
acccaaatca ttacggaaac tccaatctgg ctcacaatat cctccatgat tctagggaca    180 
cccaatcagg tgcacccgct tcctgcgaca acgagtcaaa ctcggcaaag ccctcaacct    240 
gtcggtctag aatatatata ccgcccggtc tagtgttgtg gtgtacacta acgataaacc    300 
aacaaagttg tctattaaga ggaggccatt tc                                  332 
<210>7 
<211>318 
<212>DNA 
<213>产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)CJHB100 
<400>7 
agaaacatcc cagcgctact aatagggagc gttgaccttc cttccacgga ccggtaatcg     60 
gagtgcctaa aaccgcatgc ggcttaggct ccaagatagg ttctgcgcgg ccgggtaatg    120 
catcttcttt agcaacaagt tgaggggtag gtgcaaataa gaacgacata gaaatcgtct    180 
cctttctgtt tttaatcaac atacaccacc acctaaaaat tccccgacca gcaagttcac    240 
agtattcggg cacaatatcg ttgccaaaat attgtttcgg aatatcatgg gatacgtacc    300 
caacgaaagg aaacactc                                                  318 
<210>8 
<211>31 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>引物 
<400>8 
acgcgatatc atgagtaaag gagaagatct t                                    31 
<210>9 
<211>31 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>引物 
<400>9 
aaaactgcag ttatttgtag agctcatcca t                                    31 
<210>10 
<211>32 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>引物 
<400>10 
cggggtacca ccgcgggctt attccattac at    32 
<210>11 
<211>32 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>引物 
<400>11 
acgcgatatc ttaatctcct agattgggtt tc    32 
<210>12 
<211>33 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>引物 
<400>12 
cggggtacca attccaccag acgttgttta gta   33 
<210>13 
<211>32 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>引物 
<400>13 
acgcgatatc tgtgcactcc ttgttcttcg tg    32 
<210>14 
<211>33 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>引物 
<400>14 
cggggtaccg ctgcctacat ctgggcttct gac    33 
<210>15 
<211>31 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>引物 
<400>15 
acgcgatatc gatgactcct agtgaggtta a      31 
<210>16 
<211>29 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>引物 
<400>16 
cggggtacca ctgggagggt aggggtcac         29 
<210>17 
<211>30 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>引物 
<400>17 
acgcgatatc tgtatgtcct cctggacttc        30 
<210>18 
<211>32 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>引物 
<400>18 
cggggtacct cggacatata cggatttacc tg    32 
<210>19 
<211>31 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>引物 
<400>19 
acgcgatatc gttgtctcct aaaaagttgg g     31 
<210>20 
<211>25 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>引物 
<400>20 
cggggtaccg gcttcatcgt cgtct            25 
<210>21 
<211>30 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>引物 
<400>21 
acgcgatatc tggcctcct cttaatagac        30 
<210>22 
<211>33 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>引物 
<400>22 
cggggtacca gaaacatccc agcgctacta ata  33 
<210>23 
<211>29 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>引物 
<400>23 
acgcgatatc agtgtttcct ttcgttggg    29 
<210>24 
<211>29 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>引物 
<400>24 
cggggyaccc ggagcttatc gactgcacg    29 

Claims (6)

1.启动子，其由SEQ ID NO：5的多核苷酸组成。
2.表达盒，其包含权利要求1的启动子并且可操纵连接编码序列。
3.载体，其包含权利要求2的表达盒。
4.宿主细胞，其包含权利要求3的载体。
5.权利要求4的宿主细胞，其是属于棒杆菌属(Corynebacterium)或埃希氏菌属(Escherichia)的细菌细胞。
6.表达异源基因的方法，其包括培养权利要求4或者权利要求5的宿主细胞。
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PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20101124