CN101939633A - 荧光检测装置和荧光检测方法 - Google Patents

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Abstract

提供一种荧光检测装置和荧光检测方法，其中，接收照射激光后测量对象物所发出的被散射的前向散射光，通知测量对象物通过测量点的情况，且生成用来确定发生聚焦的前向散射光的聚焦位置的检测信号。另一方面，通过聚光透镜接收测量对象物的荧光并输出受光信号。根据所输出的受光信号和生成的检测信号输出荧光强度值。根据所生成的检测信号确定聚焦位置并利用对应于该特定位置的校正系数对受光信号进行校正。

Description

荧光检测装置和荧光检测方法
技术领域
本发明涉及朝向经过流路的测量对象物照射激光并对此时发出的荧光进行测量的荧光检测装置和荧光检测方法。
背景技术
应用于医疗、生物领域的流式细胞仪中内置有一种荧光检测装置，该荧光检测装置接收测量对象物的荧光色素通过激光照射而发出的荧光，由此识别出测量对象物的种类。
对于荧光检测装置中使用的激光强度，通常形成中心的光强度高、越接近其外侧光强度越低的高斯分布。为了以高分辨率正确测量出荧光检测装置的荧光，必须以固定的激光强度来照射测量对象物。因此，朝向测量对象物照射形成高斯分布的激光中光强度大致固定的中心部分。但是，相对于预先设置在流路内的测量点的中心，经过流路的测量对象物会发生位置偏移，因此需要进行尽可能抑制测量对象物的位置偏移的工序。另外，也可以通过扩展激光光束来扩展高斯分布中具有固定光强度的部分。
下述非专利文献1中记载有一种流式细胞仪，并指出了下述内容：在该流式细胞仪中，为了获得高的测量分辨率，激光的光强度必须稳定、必须对包括测量对象物而流动的鞘液进行调整以使其流动的直径变小，且该流动必须形成层流。
然而，为了获得高的测量分辨率且有效使用激光，仅仅使上述的激光强度稳定、鞘液的流动直径变小和该流动形成层流的方式是不够充分的。
例如，通过扩散激光光束可以对具有用来测量测量对象物的固定强度的部分进行扩散，但由于激光的外侧部分没有用于照射测量对象物，因此激光的使用效率差。
非专利文献1：http://www.bc-cytometry.com/FCM/fcmprinciple_6-6.html(2007年12月6日检索)
发明内容
因此，本发明为了解决上述问题点，其目的在于：提供一种荧光检测装置和荧光检测方法，在朝向经过流路的测量对象照射激光并对此时发出的荧光进行测量的荧光检测装置中，能够提高激光的使用效率且利用所得到的测量数据能够获得高分辨率的结果。
本发明提供一种荧光检测装置，该荧光检测装置朝向经过流路的测量对象物照射激光并对此时发出的荧光进行测量，其包括：激光光源部，朝向经过流路中的测量点的测量对象物照射激光；第一受光部，包括光学系统和检测器，其中，光学系统对发射自测量对象物的激光的前向散射光进行聚焦，检测器并列配置在与所述激光的光轴方向和所述流路中的测量对象物的流动方向呈正交的方向上，以便通过接收发生聚焦的所述前向散射光，通知测量对象物通过测量点的时间的同时对聚焦的前向散射光的聚焦位置进行检测；第二受光部，通过聚光透镜接收测量对象物被激光照射后所发出的荧光并输出受光信号；处理部，将所述第一受光部输出的检测信号作为触发信号，并根据输出自所述第二受光部的所述受光信号和所述检测信号开始进行数据处理并输出荧光强度的输出值；且所述荧光检测装置，其特征在于：所述处理部根据输出自所述第一受光部的检测信号确定前向散射光的聚焦位置，并根据该聚焦位置求出校正系数以便对输出自第二受光部的受光信号进行校正，且利用该校正系数对所述受光信号进行校正。
优选所述处理部利用照射在测量对象物上的激光强度分布信息，使用建立聚焦位置和用来校正受光信号的校正系数之间的相关关系的校正表以求出所述校正系数。
优选在所述流路和所述第一受光部之间设置用来遮蔽所述光轴附近激光的遮蔽板，以使激光的直接光无法照射在所述第一受光部。
优选进一步包括分析部，其利用被校正的受光信号制作荧光强度的频率分布。
优选进一步包括分析部，其利用生成在所述第一受光部的所述前向散射光的散射光信号强度和所述前向散射光的聚焦位置以求出测量对象物的尺寸。
本发明还提供一种荧光检测方法，该荧光检测方法朝向经过流路的测量对象物照射激光并对此时发出的荧光进行测量，其特征在于包括以下步骤：
使测量对象物按照能够通过流路中的测量点的方式进行流动，并将激光照射在测量对象物上；测量对象物通过测量点时，检测出激光的前向散射光透过光学系统进行聚焦的聚焦位置并生成检测信号；通过聚光透镜接收测量对象物被激光照射后所发出的荧光并输出受光信号；根据所述检测信号确定所述散射光的聚焦位置，并根据该聚焦位置求出校正系数以便对所述受光信号进行校正，且利用该校正系数对所述受光信号进行校正，由此计算出荧光强度。
此时优选，校正所述受光信号时，利用照射在测量对象物上的激光强度分布信息，使用建立聚焦位置和用来校正受光信号的校正系数之间的相关关系的校正表以求出所述校正系数。
优选进一步包括在流路中依次流动多个测量对象物并利用被校正的所述受光信号来制作荧光强度的频率分布的步骤。
优选进一步包括利用所述前向散射光的散射光信号强度和所述前向散射光的聚焦位置以求出测量对象物的尺寸的步骤。
在本发明的荧光检测装置和荧光检测方法中，第一受光部通过聚焦发射自测量对象物的激光的前向散射光来通知测量对象物通过测量点的时间，其包括并列配置在与激光光轴的方向和所述流路中的测量对象物的流动方向呈正交的方向上的多个检测器，以便对发生聚焦的前向散射光的聚焦位置进行检测。因此，在处理部中，可以根据输出自第一受光部的检测信号确定前向散射光的聚焦位置，并根据该聚焦位置可以求出用来校正输出自第二受光部的受光信号的校正系数，且利用该校正系数可以对受光信号进行校正。由此，即使是具有高斯分布等的光强度的激光，除了具有固定光强度的中心部以外，光强度在其外侧急剧下降的周边部也可以用来照射测量对象物，因此能够提高激光的使用效率。
另外，由于对受光信号进行校正，因此能够在分析部制成的荧光强度的频率分布中获得锐化(分散小)的频率分布。因此，在频率分布中即使存在两个峰值相接近的情况，也能够获得可判断出两个峰值程度的高分辨率的结果。
附图说明
图1为使用本发明荧光检测装置的流式细胞仪的概略构成图；
图2为表示用于本发明荧光检测装置的激光光源部的一例的概略构成图；
图3为表示用于本发明荧光检测装置的第一受光部的一例的概略构成图；
图4为表示用于本发明荧光检测装置的第二受光部的一例的概略构成图；
图5a～图5e是对本发明的荧光检测装置的校正进行说明的说明图。
附图标记
10流式细胞仪
12样品
20信号处理装置
22激光光源部
22r R光源
22g G光源
22b B光源
23a1、23a2、26b1、26b2分色镜
23c透镜系统
24、26受光部
24a聚光透镜
24b前向散射检测单元
24c遮蔽板
24d检测器
26a聚光透镜
26c1、26c2、26c3带通滤波器
27a～27c光电转换器
28处理部
29控制部
30管道
31流动池
32回收容器
34r、34g、34b激光驱动器
35功率分配器
80分析装置
具体实施方式
下面，对本发明的荧光检测装置和荧光检测方法进行详细说明。
图1为使用本发明的荧光检测装置的流式细胞仪10的概略构成图。
流式细胞仪10包括：信号处理装置(荧光检测装置)20，朝向作为测量对象的细胞等样品12照射激光并对从部分样品12中发出的荧光进行检测以进行信号处理；分析装置80，根据从信号处理装置20所获得的处理结果对样品12中的测量对象物进行分析。
信号处理装置20包括激光光源部22、受光部24、26、处理部28、控制部29、管道30和流动池31。
处理部28输出样品12的荧光强度的输出值。控制部29使激光按照规定强度进行照射并对各处理的动作进行控制管理。在管道30中，样品12以包括在形成高速流的鞘液中的方式进行流动。流动池31与管道30的端相连接以形成样品12的流动，并在该流路径上设置激光的测量点。
在流动池31的出口侧设置有回收容器32。在流式细胞仪10的构成中也可以配置细胞分类器，以便通过激光照射在短时间内分离出样品12中的特定细胞等，以将其分离于各自的回收容器。
激光光源部22是发射三种不同波长的激光的部分，例如，发射λ1＝405nm、λ2＝533nm和λ3＝650nm等激光。透镜系统按照使激光聚焦在流动池31中的规定位置的方式进行设置，该聚焦位置成为样品12的测量点。
图2为表示激光光源部22的构成一例的图。
激光光源部22的构成包括R光源22r、G光源22g、B光源22b、分色镜23a1、23a2、透镜系统23c、激光驱动器34r、34g和34b、功率分配器35。
R光源22r、G光源22g、B光源22b是波长为350nm～800nm的可视光中发射出激光的部分，其中，R光源22r以规定的强度发射以红色为主的激光R；G光源22g以规定的强度发射绿色激光G；B光源22b以规定的强度发射蓝色激光B。
分色镜23a1、23a2是对规定波段的激光进行透射而对其它波段的激光进行反射的分色镜。
透镜系统23c将由激光R、G和B构成的激光聚焦在管道30中的测量点上。激光驱动器34r、34g和34b分别驱动R光源22r、G光源22g、B光源22b。
功率分配器35将所接收到的信号分别分配给激光驱动器34r、34g和34b。
作为发射出这些激光的光源，例如使用半导体激光器。
分色镜23a1是透射激光R且反射激光G的分色镜，分色镜23a2是透射激光R和G且反射激光B的分色镜。
通过上述构成激光R、G和B被合成后形成对通过测量点的样品12进行照射的照射光。
激光驱动器34r、34g和34b与处理部28和控制部29相连接，并按照能够调整激光R、G、B的发射强度的方式构成。
R光源22r、G光源22g、B光源22b在预先确定的波段上进行振动，以使激光R、G和B通过激发荧光色素使其发射出规定波段的荧光。通过激光R、G和B而被激发的荧光色素附着在需要测量的活体物质等的样品12上，并作为测量对象物通过流动池31的测量点时，在测量点受到激光R、G和B的照射后以规定的波长发射荧光。
受光部24按照夹着管道30和流动池31与激光光源部22相对而置的方式进行配置，且具有光电转换器，其中输出样品12正在通过测量点的内容的检测信号，该信号输出是根据通过测量点的样品12而激光发生前向散射来进行。输出自该受光部24的信号被供给至处理部28和控制部29，在处理部28中，上述信号作为通知样品12正在通过管道30中的测量点的时间的触发信号来使用。
图3是表示受光部24的一例的概略构成的概略构成图。在图3中，样品12的流动方向相对于纸面呈垂直方向。
受光部24包括：聚光透镜24a，对照射在样品12发生前向散射的激光进行聚焦；多通道前向散射光检测单元24b，对聚焦的光进行检测；遮蔽板24c。
聚光透镜24a用来对照射样品12后发生前向(激光前进方向的前方，图3中的右侧方向)散射的激光进行聚焦。
前向散射光检测单元24b与激光的照射方向呈正交方向，且与样品12的流动方向(图3中，垂直于纸面的方向)呈正交的方向上并列配置有多个检测器24d。各检测器24d按照检测信号能够被输出到处理部28和控制部29的方式进行连接。检测器24d例如可使用其构成全部相同的光电二极管。如此并列配置多个检测器24d是为了获得样品12通过测量点时相对于预先设定的测量点(激光的聚焦点)中心发生位置偏移的位置偏移信息。具体来说，在图3中，样品12在X方向上发生位置偏移时，激光的前向散射光在与散射光检测单元24b的中心位置A相比靠图中下侧的位置(图3中箭头方向的位置)上进行聚焦。在图3中，样品12在X方向的反方向上发生位置偏移时，激光的前向散射光在与散射光检测单元24b的中心位置A相比靠图中上侧位置上进行聚焦。该聚焦位置随着样品12在X方向上的位置偏移量发生变化。因此，根据计量的散射光的最大强度是由哪个检测器24d被检测的来可以知道聚焦位置。由此，可以知道测量对象的样品12流过测量点时相对于测量点偏移了多少。测量出的检测器24的检测信号被供给至处理部28和控制部29。检测信号分别从各个检测器24d输出，因此通过规定表示最大值的检测信号就可以知道散射光的最大强度是在哪个检测器24d进行检测的。另外，检测信号作为触发信号来使用以便开始进行数据处理。
遮蔽板24c用来遮蔽直接光，以使被照射的激光的直接光在检测器24d处不被接收。
另一方面，受光部26配置在与发射自激光光源部22的激光光轴方向呈垂直的平面上、且与样品12的流动方向呈正交的方向，即相对于激光的照射方向呈垂直的方向上，且配置在相对于流动池31的流路中的样品12的移动方向呈垂直的方向上。而且，受光部26具有光电转换器，该光电转换器接收样品12在测量点被照射后所发出的荧光。
另一方面，受光部26配置在相对于发射自激光光源部22的激光发射方向呈垂直的方向、且相对于流动池31的流路中的样品12的移动方向呈垂直的方向上。受光部26具有光电转换器，该光电转换器接收样品12在测量点被照射后所发出的荧光。
图4表示受光部26的一例的概略构成的概略构成图。图4所示的受光部26包括：透镜系统26a，对来自样品12的荧光信号进行聚焦；分色镜26b1、26b2；带通滤波器26c1～26c3；光电倍增管等光电转换器27a～27c。
透镜系统26a按照将入射到受光部26的荧光聚焦在光电转换器27a～27c的受光面的方式构成。
分色镜26b1、26b2是对规定范围的波段的荧光进行反射而对其它荧光进行透射的分色镜。为了在带通滤波器26c1～26c3进行过滤后在光电转换器27a～27c中捕获规定波段的荧光而对分色镜26b1、26b2的反射波段和透射波段进行设定。
带通滤波器26c1～26c3被设置在各光电转换器27a～27c的受光面的前面，仅使具有规定波段的荧光透射。透射的荧光波段被设定在与荧光色素发出的荧光波段相对应的波段。
光电转换器27a～27c包括如具有光电倍增管的传感器，且为在光电面将接收到的光转换为电信号的传感器。
控制部29为以规定强度来照射激光且根据由受光部24所供给的触发信号对处理部28中各处理的动作进行控制管理的部分。
处理部28为进行规定的信号处理且将荧光强度的输出值输出至分析装置80的部分。
在处理部28中，根据由受光部24所供给的检测信号开始进行规定的数据处理。处理部28确定从受光部24所供给的检测信号中最大值是来自哪个检测器24d，由此确定前向散射光的聚焦位置并根据该特定位置求出校正系数以便对输出自受光部26的受光信号进行校正，且使用该校正系数对受光信号进行校正。
处理部28利用预先存储好的校正表进行校正，以便同时进行从检测器24d的聚焦位置求出激光强度的处理和求出对应该强度的校正系数的处理。该校正表是利用照射到样品12的激光强度分布信息，设定聚焦位置与用来校正受光信号的校正系数的相关关系的表格。
图5a～图5e是对受光信号进行校正的必要性进行说明的说明图。
在本发明中，受光信号用来判断特定荧光是否被测量出，即在后述的分析装置80中计算出相对于如图5d所示的荧光强度的样品12的频率分布，并根据该频率分布判断出特定的荧光是否被测量出。此时，若存在两种荧光则在频率分布中形成两个峰值。当该两个峰值的荧光强度相接近时，为了能够判断出该两个峰值，峰值的宽度必须要狭窄(需要分散小)。如图5e所示，一个峰值的峰值宽度较大(分散大)时，无法判断出两个峰值。图5e为没有进行上述校正时的频率分布。
如图5a所示，根据样品12通过的位置A～C等，利用该位置上具有激光强度分布的倒数分布的校正系数，并将该校正系数乘以受光信号。如图5c所示，样品12的位置虽然具有不均匀分布，但利用如上所述的校正系数对受光信号进行校正，因此相对于没有进行校正的图5e的频率分布，如图5d所示峰值的宽度变得狭窄。
由此，通过对受光信号进行校正，如图5d所示能够使峰值宽度变得狭窄，且能够在频率分布中提高分辨率。
校正是单纯地将校正系数乘以受光信号的乘法过程。这是因为优选利用了荧光强度根据所照射的激光强度而发生线性变化的部分的缘故。但是，本发明并不限定于此。只要至少荧光强度与所照射的激光强度有对应关系，且利用该对应关系来确定校正系数就可以。
分析装置80为下述一种装置，即，利用处理部28所供给的被校正的受光信号，制作如图5d所示的频率分布，且确定通过流动池31的测量点的、被包括在样品12中的活体物质种类等，并对包括在样品12中的活体物质进行分析。
在这样的荧光检测装置10中，当样品12被激光照射时，由散射光检测单元24b的检测器24d对样品12所发出的前向散射光进行检测。通过检测器24d生成的检测信号知道前向散射光的聚焦位置，因此根据该聚焦位置，且利用处理部28所具有的校正表，能够求出校正系数。将该校正系数乘以受光部26的受光信号，由此受光信号得到校正。
被校正的受光信号被供给到分析装置80后制成如图5d所示的频率分布。
在荧光检测装置10中，处理部28通过利用激光强度分布的校正表进行受光信号的校正，因此在分析装置80中能够获得峰值宽度狭窄的频率分布。另一方面，在激光中即使存在光强度分布，也利用该分布来进行校正，因此无需像以往那样仅将具有一定光强度的激光中心部分用于荧光的测量，可以将在以往测量中没有使用过的、激光中心部分的外侧部分也用于荧光的测量。因此能够有效地使用激光。
另外，也可以调整样品12的流动位置。从检测器24d的检测信号中可以知道样品12所处位置的激光强度。另一方面，前向散射光的光强度是样品12所处位置的激光强度和样品12的尺寸进行乘法后得到的结果，因此利用已知的激光强度也可以得到被测量的样品12的大概尺寸。在分析装置80中也可以进行对这种被测量的样品12的大概尺寸的计算处理。此时，利用由受光部24所生成的前向散射光的散射光信号强度和前向散射光的聚焦位置可以求出样品12的尺寸。具体来说，由于前向散射光的聚焦位置是已知的，因此从该聚焦位置可以求出样品12通过测量点时的位置偏移，且可以知道照射在发生位置偏移的样品12上的激光强度，根据该激光强度和前向散射光的散射光信号强度可以求出样品12的尺寸。
综上所述，对本发明的荧光检测装置和荧光检测方法进行了详细的说明，但本发明并不限定在上述实施例，当然可以在不脱离本发明主要内容的范围内进行各种改进或改变。

Claims (9)

1.一种荧光检测装置，该装置朝向经过流路的测量对象物照射激光并对此时发出的荧光进行测量，其特征在于，所述荧光检测装置包括：
激光光源部，朝向经过流路中的测量点的测量对象物照射激光；
第一受光部，包括光学系统和多个检测器，其中，所述光学系统对发射自测量对象物的激光的前向散射光进行聚焦，所述多个检测器并列配置在与所述激光的光轴方向和所述流路中的测量对象物的流动方向呈正交的方向上，以便通过接收发生聚焦的所述前向散射光，通知测量对象物通过测量点的时间的同时对发生聚焦的前向散射光的聚焦位置进行检测；
第二受光部，通过聚光透镜接收测量对象物被激光照射后所发出的荧光并输出该受光信号；
处理部，将所述第一受光部输出的检测信号作为触发信号，并根据输出自所述第二受光部的所述受光信号和所述检测信号开始进行数据处理并输出荧光强度的输出值；其中，
所述处理部根据输出自所述第一受光部的检测信号确定前向散射光的聚焦位置，并根据该聚焦位置求出用来对输出自所述第二受光部的受光信号进行校正的校正系数，且利用所述校正系数对所述受光信号进行校正。
2.如权利要求1所述的荧光检测装置，其特征在于：
所述处理部利用照射在测量对象物上的激光强度分布信息，使用建立聚焦位置和用来校正受光信号的校正系数的相关关系的校正表以求出所述校正系数。
3.如权利要求1或2所述的荧光检测装置，其特征在于：
在所述流路和所述第一受光部之间设置用来遮蔽所述光轴附近激光的遮蔽板，以使激光的直接光无法照射在所述第一受光部。
4.如权利要求1～3中任一项所述的荧光检测装置，其特征在于：
还包括分析部，其在流路中依次使多个测量对象物流动并利用进行校正的所述受光信号制作荧光强度的频率分布。
5.如权利要求1～4中任一项所述的荧光检测装置，其特征在于：
还包括分析部，其利用生成在所述第一受光部的所述前向散射光的散射光信号强度和所述前向散射光的聚焦位置求出测量对象物的尺寸。
6.一种荧光检测方法，该方法朝向经过流路径的测量对象物照射激光并对此时发出的荧光进行测量，其特征在于，所述荧光检测方法包括以下步骤：
使测量对象物按照能够通过流路中的测量点的方式进行流动，并将激光照射在测量对象物上；
测量对象物通过测量点时，检测出激光的前向散射光透过光学系统进行聚焦的聚焦位置并生成检测信号；
通过聚光透镜接收测量对象物被激光照射后所发出的荧光并输出受光信号；
根据所述检测信号确定所述散射光的聚焦位置，并根据该聚焦位置求出用来对所述受光信号进行校正的校正系数，且利用该校正系数对所述受光信号进行校正，由此计算出荧光强度。
7.如权利要求6所述的荧光检测方法，其特征在于：
校正所述受光信号时，利用照射在测量对象物上的激光强度分布信息，使用建立聚焦位置和用来校正受光信号的校正系数之间的相关关系的校正表以求出所述校正系数。
8.如权利要求6或7所述的荧光检测方法，其特征在于：
进一步包括在流路中依次使多个测量对象物流动并利用被校正的所述受光信号来制作荧光强度的频率分布的步骤。
9.如权利要求6～8中任一项所述的荧光检测方法，其特征在于：
进一步包括利用所述前向散射光的散射光信号强度和所述前向散射光的聚焦位置以求出测量对象物的尺寸的步骤。
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