CN102021153A - 人类的端粒酶催化亚单位 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了与人类端粒酶逆转录酶(hTRT)，人类端粒酶的催化蛋白质亚单位相关的组合物和方法。本发明的聚核苷酸和多肽可用于人类疾病的诊断、预测和治疗，用于改变细胞和生物体的增殖能力，和用于鉴定和筛选用于治疗疾病例如癌症的化合物和治疗药物。

Description

人类的端粒酶催化亚单位 
本申请是1997年10月1日提交的题为“人类的端粒酶催化亚单位”的中国专利申请97180256.4的分案申请。 
发明领域
本发明涉及编码端粒酶和相关的多肽的催化亚单位的新的核酸。特别是，本发明涉及人类端粒酶的催化亚单位。本发明提供了涉及医药，分子生物学，化学，药理学，和医学诊断和预测技术的方法和组合物。 
发明背景 
下面的讨论是打算将本发明领域介绍给读者。 
长期以来人们认为真核染色体末端的完全复制需要特异性的细胞成分(Watson，1972，自然，新生物学，239：197；Olovnikov，1973，理论生物学杂志，41：181)。由常规DNA聚合酶进行的线性DNA链的复制需要RNA引物，并且能够仅引导从5’到3’进行复制。当结合在真核染色体DNA链的极端的5’末端的RNA被去除时，导入了一个缺口，导致随着复制的各轮的进行，子链逐渐缩短。据认为端粒，物理结构定位于染色体末端的蛋白质-DNA结构的缩短与由于正常人类的体细胞在体外和体内的细胞的衰老或老化现象相关(参见，例如Goldstein，1990，科学249：1129；Mrtin等人，1979，实验室调研23：86；Goldstein，等人，1969，美国科学院年报64：155；和Schneider和Mitsui，1976，美国科学院年报73：3584)。 
因此端粒酶的长度和完整与细胞入老化期有关(即丧失增殖能力)。但是，细胞保持(或增加)端粒长度的能力允许细胞逃脱老化，即变 成永生。 
已经在许多系统中调研了端粒酶和端粒DNA的结构(参见，例如Harley和Villeponteau，1995，Curr.Opin.Genet.Dev.5：249)。在大多数生物体，端粒DNA由串联排列的非常简单的序列组成；对于人类和其它脊椎动物端粒DNA由成百上千的串联重复的序列TTAGGG组成。用于测定和调节细胞的端粒长度的方法描述于PCT公开WO93/23572和WO96/41016。 
端粒的维持是已知为端粒酶的端粒特异性DNA聚合酶的作用。端粒酶是核糖核蛋白质(RNP)，它利用其RNA成分的一部分作为端粒重复DNA合成的模板(Morin，1997，欧洲癌症杂志33：750；Yu等人，1990，自然344：126；Singer和Gottschl ing，1994，科学266：404；Autexier和Grei der，1994，基因发展，8：563；Gil ley等人类，1995，基因发展，9：2214；McEachern和Blackburn，1995，自然367：403；Blackburn，1992，生物化学分析和综述，61：113；Greider，1996，生物化学分析和综述，65：337)。人类和其它端粒酶的RNA成分已经被克隆和定性(参见，PCT公开WO96/01835和Feng等人，1995，科学269：1236)。但是，端粒酶的蛋白质成分的定性已经是困难。部分原因是因为纯化端粒酶RNP证明是困难的，在其被表达的细胞中RNP以非常低的水平存在。例如已经估测已知表达高水平的端粒酶活性的人类细胞每个细胞仅仅具有约100个酶分子。 
与端粒和端粒酶与细胞的增殖能力(即细胞不定期分裂的能力)的关系相一致，在永生的细胞系和非常多样化的肿瘤组织组中检测到端粒酶活性，但是在正常的体细胞培养物或与肿瘤邻接的正常的组织没有检测到(即，没有或低于测试的界限)(参见，例如美国专利5,629,154；5,489,508；5,648,215；和5,639,613；参见例如，Morin，1989，细胞， 59：521；Shay和Bacchetti1997，欧洲癌症杂志33：787；Kim等人，1994，科学266：2011；Counter等人，1992，EMBO J.11：1921；Counter等人，1994，美国科学院年报91，2900；Counter等人，1994，病毒学杂志68：3410)。但是，肿瘤中端粒酶活性的水平和患者的可能的临床结果之间的关系已经有人报道(例如，美国专利5,639,613，见上文；Langford等人类÷，1997，人类病理学28：416)。在人类的生殖细胞，增殖的茎干或祖先细胞和失活的淋巴细胞中也已经检测到端粒酶活性。在体细胞茎干或祖先细胞，和在活化的淋巴细胞中，通常端粒酶活性是非常低的或仅仅瞬间表达(参见，Chiu等人类，1996，茎干细胞14：239；Bodnar等人类，1996，Exp.Cell Res.228：58；Taylor等人类，1996，皮肤研究杂志106：759)。 
人类端粒酶是诊断和治疗与细胞增殖和老化相关的疾病，例如癌症的理想的靶。用于诊断和治疗癌症和其它端粒酶相关的人类疾病的方法描述于美国专利5,489,508，5,639,613，和5,645,986。通过监测端粒酶预测肿瘤进展的方法描述于美国专利5,639,613。人类端粒酶的催化蛋白质亚单位的发现和定性提供了额外的用于端粒酶和用于疾病诊断和治疗的有用的测试。但是，催化蛋白质亚单位的一级序列的克隆和测定允许更有效地治疗人类癌症和与细胞增殖能力和老化相关的其他疾病。 
发明简述 
本发明提供了端粒酶逆转录酶蛋白质或其变异体，或其片段的分离的，基本上纯化的，或重组蛋白质制剂。在一个实施方案中，蛋白质的特征在于具有包括下列氨基酸序列的限定的基序： 
Trp-R1-X7-R1-R1-R2-X-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X8-9-R3-R3-Arg-R4- X2-Trp 
其中X是任何氨基酸和下方角标是指连续的残基的数目，R1是亮氨酸或异亮氨酸，R2是谷氨酸或精氨酸，R3是苯丙氨酸或酪氨酸，和R4是赖氨酸或组氨酸。在一个实施方案中，该蛋白质具有人类TRT的序列。在其它实施方案中，本发明涉及与这样的蛋白质的亚序列共享基本的序列等同性的肽和多肽。 
在相关的实施方案中，本发明提供了编码端粒酶逆转录酶蛋白质的分离的，基本上纯化的或重组的核酸。在一个实施方案中，该核酸编码包括氨基酸序列的蛋白质： 
Trp-R1-X7-R1-R1-R2-X-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X8-9-R3-R3-Arg-R4-X2-Trp。在另一个实施方案中，该核酸具有编码人类TRT蛋白质的序列。在其它实施方案中，本发明提供了与这样的核酸序列共享基本序列等同性的寡聚核苷酸和多聚核苷酸。 
在一个实施方案中，本发明涉及人类端粒酶逆转录酶(hTRT)蛋白质。因此，在一个实施方案中，本发明提供了hTRT蛋白质或其变异体，或其片段的分离的，基本上纯化的，或重组蛋白质制剂。在一个实施方案中，该蛋白质的特征在于具有与附图17(SEQUENCE ID NO：2)的hTRT蛋白质或其变异体，或其片段具有至少约75％或至少约80％序列等同性的氨基酸序列。在相关的方面，hTRT蛋白质具有SEQUENCE ID NO：2的序列。在一些实施方案中，该蛋白质具有一个或多个端粒酶活性，例如催化活性。在一个实施方案中，hTRT蛋白质片段具有至少6个氨基酸残基。在其它实施方案中，hTRT蛋白质片段具有天然存在的hTRT多肽的至少约8个，至少约10个，至少约12个，至少约15个或至少约20个邻接的氨基酸残基。仍然在其它实施方案中，hTRT蛋白质片段具有至少约50或至少约100个氨基酸残基。 
本发明也提供了包括hTRT蛋白质和RNA的组合物。该RNA可以是端粒酶RNA，例如人类端粒酶RNA。在一个实施方案中，hTRT蛋白质和人类端粒酶RNA(hTR)形成具有端粒酶活性的核糖核蛋白复合物。 
在一个实施方案中，本发明提供了包括hTRT蛋白质的分离的人类端粒酶，例如包括hTRT蛋白质和包括hTR的基本上纯化的人类端粒酶。在一个实施方案中，，端粒酶是至少约95％纯化的。该端粒酶是从表达端粒酶活性的细胞，例如重组宿主细胞中分离的。 
在另一个方面，本发明提供了包括编码hTRT蛋白质的核酸序列的分离的，合成的基本上纯化的或重组的多核苷酸。在一个实施方案中，该多聚核苷酸具有编码具有附图17(SEQUENCE ID NO：2)列出的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中包括一个或多个保守的氨基酸(或密码子)替代或一个或多活性改变的氨基酸(或密码子)替代的序列的hTRT蛋白质的核苷酸序列。在相关的方面，该多聚核苷酸在严格条件下与具有附图16列出序列(SEQUENCE ID NO：1)的多聚核苷酸杂交。在另一个相关的方面，当与附图16列出核苷酸序列(SEQUENCE ID NO：1)相比时，利用具有缺席参数的BLAST算法，该多聚核苷酸的核苷酸序列具有低于约0.5的最小的总数的可能性。 
在另一个方面，本发明提供了具有可操作连接到编码hTRT蛋白质的序列的启动子序列的多聚核苷酸。该启动子可以是除了天然存在的hTRT启动子以外的启动子。在相关的方面，本发明提供了包括hTRT启动子的表达载体。 
本发明也提供了长度至少为10个核苷酸的分离的，合成的，基本上纯化的或重组的多核苷酸，它包括与天然存在的hTRT基因或hTRT mRNA的邻接序列相同或精确互补的至少10个核苷酸的邻接序列。在一些实施方案中，该多聚核苷酸是RNA，DNA，或含有一个或多个非天然存在 的，合成的核苷酸。在一个方面，该多聚核苷酸与天然存在的hTRT基因或hTRT mRNA的至少10个邻接核苷酸的邻接序列相同或精确互补。例如，该多聚核苷酸可以是反义多聚核苷酸。在一个实施方案中，反义的多聚核苷酸包括至少约20个核苷酸。 
本发明进一步提供了通过将重组hTRT蛋白质与端粒酶成分在一定的条件下接触制备重组端粒酶的方法，所述条件是便于所述的重组蛋白质和所述的端粒酶RNA成分结合以形成能够纯化核苷酸加入到端粒酶底物的端粒酶。在一个实施方案中，hTRT蛋白质具有附图17列出的序列(SEQUENCE ID NO：2)。该hTRT蛋白质可以是在体外表达系统产生的并且与端粒酶RNA混合，或在另一个实施方案中，该端粒酶RNA可以是在体外表达系统中共表达。在一个实施方案中，该端粒酶RNA是hTR。在另一个可选择的实施方案中，所述的接触出现于细胞中，例如人类细胞。在一个实施方案中，该细胞在hTRT和该RNA接触之前或在导入，例如通过转染hTRT多聚核苷酸之前不具有端粒酶活性。在一个实施方案中，端粒酶RNA由所述的细胞天然地表达。 
本发明也提供了含有本发明的重组多聚核苷酸例如具有可操作连接到一个启动子上的hTRT蛋白质编码序列的多核苷酸的细胞，例如人类细胞，鼠，或酵母细胞。在特定的方面，细胞是脊椎动物细胞，例如来自于哺乳动物，例如人类的细胞，并且相对于其它方面相同但是不具有所述的重组多聚核苷酸的细胞而言具有增加的增殖能力，或相对于其它方面相同但是不具有所述的重组多聚核苷酸的细胞而言具有增加的端粒酶活性。在一些实施方案中，所述细胞是永生的细胞。 
在相关的实施方案中，本发明提供了包括编码人类端粒酶逆转录酶多肽的多聚核苷酸的生物体和细胞，例如转基因非人类生物体例如酵母，植物，细菌或非人类动物，例如小鼠。本发明也提供了转基因动 物和细胞，其中已经缺失(敲出)了hTRT基因或进行了突变以致于该基因不表达天然存在的hTRT基因产物。因此，在另一种可选的实施方案中，转基因非人类动物具有突变的端粒酶基因，是端粒酶活性缺陷的动物，是一种其TRT缺陷是由于编码TRT的突变基因引起的动物，所述TRT与野生型的TRT相比，具有降低的端粒酶活性水平的并且是具有携带一个或多个突变包括错义突变，无义突变，插入或缺失的突变TRT基因的动物。 
本发明也提供了特异性地与hTRT蛋白质结合的分离或重组抗体，或其片段。在一个实施方案中，该抗体与以至少108M-1的亲和力结合。该抗体可以是单克隆或可以是多克隆组合物，例如多克隆抗血清。在相关的方面，本发明提供了能够分泌该抗体的细胞，例如杂交瘤。 
本发明也提供了测定化合物或治疗剂是否是端粒酶逆转录酶活性或hTRT表达的调节剂的方法。该方法涉及检测或监测在该化合物或治疗剂给药之后，在细胞，动物或包括hTRT蛋白质或多聚核苷酸的组合物中活性或表达的变化。在一个实施方案中，该方法包括步骤：提供了TRT组合物，将TRT与测试化合物接触，测量TRT的活性，其中在测试化合物存在下TRT活性的变化是所述测试化合物调节TRT活性的指示剂。在一些实施方案中，所述组合物是细胞，生物体，转基因生物体或体外系统，例如表达系统，它含有编码hTRT多肽的重组多聚核苷酸。因此，该方法的hTRT可以是体外表达产物。在各种实施方案中，可以通过检测hTRT基因产物的丰度的变化，监测核苷酸标记物掺入到端粒酶的底物，监测探针与延伸的端粒酶底物的杂交，监测延伸的端粒酶底物的扩增，监测与测试化合物接触的细胞的端粒长度，监测端粒酶与染色体结合能力的丧失，或测量端粒结构的积累或丧失而进行端粒酶活性或表达的检测。 
在一个方面，本发明提供了通过将生物学样品与特异性地与基因产物结合的探针接触而检测生物学样品中hTRT基因产物的方法，其中该探针与基因产物形成复合物，和检测该复合物，其中该复合物的存在与生物学样品中的hTRT基因产物的存在相关。该基因产物可以是RNA，DNA或多肽。可以用于检测的探针的例子包括，但不限于核酸和抗体。 
在一个实施方案中，基因产物是通过扩增该基因和检测扩增产物而检测的核酸，其中复合物或扩增产物的存在与生物学样品中的hTRT基因产物的存在相关。 
在一个实施方案中，生物学样品是来自于患者，例如人类患者。在另一个实施方案，生物学样品包括至少来自于体外细胞培养物例如人类细胞培养物的细胞。 
本发明进一步提供了检测包括人类细胞的生物学样品中至少一种永生或端粒酶阳性人类细胞的存在的方法，包括获得包括人类细胞的生物学样品；和检测该样品中具有高水平的hTRT基因产物的细胞的存在，其中具有高水平的hTRT基因产物的细胞的存在与生物学样品中一种永生或端粒酶阳性细胞的存在相关。 
本发明也提供了用于诊断端粒酶相关状况的方法，该方法包括从患者获得的细胞或组织样品；测定细胞或组织中hTRT基因产物的量；和将细胞或组织中hTRT基因产物的量与健康细胞或相同类型的组织的量进行比较，其中来自于患者和健康细胞或组织的样品的hTRT基因产物的不同量可以诊断端粒酶相关的状况。在一个实施方案中，端粒酶相关的状况是癌症和在该样品中检测到较大的hTRT基因产物的量。 
本发明进一步提供了诊断癌症患者的方法，该方法包括从患者获得生物学样品；检测患者样品中hTRT基因产物，其中样品检测到的hTRT基因产物与癌症的诊断相关。 
本发明进一步提供了诊断患癌症者的方法，该方法包括获得生物学样品；检测患者样品中hTRT基因产物的量，和将hTRT基因产物的量与正常或对照值的量进行比较，其中大于正常或对照值的患者的hTRT基因产物的量可以诊断为癌症。 
本发明也提供了诊断癌症患者的方法，该方法包括获得含有至少一个细胞的生物学样品；测定样品中细胞的hTRT基因产物的量，和将细胞的hTRT基因产物的量与细胞的正常值进行比较，其中大于正常值的hTRT基因产物的量可以诊断为癌症。在一个实施方案中，据信该样品含有至少一个恶性细胞。 
本发明也提供了预测癌症患者的方法，包括测定从患者获得的癌症细胞中hTRT基因产物的量，和将癌症细胞的hTRT基因产物的量与预测的与癌症的预测一致的hTRT的值进行比较；其中作为预测值的样品的hTRT的量提供了特定的预测。 
本发明也提供了监测降低患者的癌症细胞的增殖能力的抗癌症治疗能力的方法，该方法包括从患者的至少一个癌症细胞中第一次测量hTRT基因产物的量；从患者的至少一个癌症细胞中第二次测量hTRT基因产物的量，其中在第二次测量之前该患者以抗癌症治疗剂给药；和将第一次测量和第二次测量进行比较，其中第二次测量的较低水平的hTRT基因产物与降低患者的癌症细胞的增殖能力的抗癌症治疗相关。 
本发明也提供了用于检测hTRT基因或基因产物的试剂盒。在一个实施方案中，该试剂盒包括含有选自于hTRT核酸或其亚序列，hTRT多肽或其亚序列的分子，和抗hTRT抗体的容器。 
本发明也提供了治疗人类疾病的方法。在一个实施方案中，本发明提供了用于增加脊椎动物细胞的增殖能力的方法，该方法包括将重组多核苷酸导入到细胞，其中所述的多核苷酸包括编码hTRT多肽的序 列。在一个实施方案中，hTRT多肽具有显示于附图17的序列。在一个实施方案中，该序列可操作连接到一个启动子上。在一个实施方案中，该hTRT具有端粒酶的催化活性。在一个实施方案中，细胞是人类细胞，例如人类患者的细胞。在另一种可选的实施方案中，将细胞进行体外培养。在相关的实施方案中，将该细胞导入到人类患者。 
本发明进一步提供了用于治疗人类疾病的方法，该方法包括将重组hTRT多核苷酸导入到患者的至少一个细胞。在一个实施方案中，使用了基因治疗载体。在一个相关的实施方案中，该方法进一步由将包括编码hTR序列的多核苷酸，例如可操作连接到启动子的hTR多核苷酸导入到细胞组成。 
本发明也提供了用于增加脊椎动物细胞的增殖能力的方法，所述方法包括 
将有效量的hTRT多肽导入到细胞。在一个实施方案中，hTRT多肽具有端粒酶催化活性。本发明进一步提供了具有增加的增殖能力的细胞和细胞子代。 
本发明也提供了用于治疗与细胞内增高水平的端粒酶活性相关的状况的方法，包括将治疗有效量的所述端粒酶活性的抑制剂导入到细胞，其中所述的抑制剂是hTRT多肽或hTRT多核苷酸。在一个实施方案中，抑制剂是多肽或多核苷酸，包括至少例如显示于附图16，17或20的序列的亚序列。在其他实施方案中，多肽或多核苷酸抑制了TRT活性，例如将内源性TRT与端粒酶RNA结合。 
本发明也提供了包括hTRT多肽和佐剂的疫苗。本发明也提供了含有药物学可接受载体和选自于：hTRT多肽，编码hTRT多肽的多核苷酸，和hTRT核酸或其亚序列的分子的药物组合物。 
附图简述 
附图1显示来自于人类，粟洒裂殖酵母(tez1)，啤酒酵母(EST2)和Euplotes aediculatus(p123)的TRT基序中的高度保守的残基。用星号(*)(稍微上抬)表示相同的氨基酸，而类似的氨基酸用点(·)表示。附图的基序“0”也被称之为基序T；基序“3”也被称之为基序A。 
附图2显示端粒酶特异性的和RT特异性的端粒酶蛋白质和其它逆转录酶的序列基序的定位。盒子表示端粒酶特异性的基序T和保守的RT基序1，2和A-E的定位。开口的长方形标记的HIV-1RT描述了显示于附图3的蛋白质的部分。 
附图3显示了HIV-1逆转录酶的p66亚单位的晶体结构(Brookhaven密码1HNV)。该观点是根据右手的背部以便能够显示所有的基序。 
附图4显示了端粒酶RTs(Sp-Trt1p，粟洒裂殖酵母TRT(本文也称之为“tezlp”)；hTRT，人类TRT；Ea-p123，Euplotesp123；Sc-Est2p，啤酒酵母Est2p)和其它RT家族成员(Sc-al，来自于啤酒酵母线粒体的细胞色素氧化酶组II内含子1-编码的蛋白质，Dm-TART，来自于Drosophila melanogasterTART非-LTR可反相转座的元件的逆转录酶；HIV-1，人类免疫缺陷病毒逆转录酶)的多个序列的排列。TRT con和RT con代表用于端粒酶RTs和非端粒酶RTs的共有序列。用h，疏水；p，极性；c，带电，命名氨基酸。三角表示在端粒酶蛋白质之间保守的，但是在其它RTs中不同的残基。基序E下面的实体线突出该引物控制区域。 
附图5显示了hTRT RNA在如实施例2描述的端粒酶阴性的可灭细胞株和端粒酶阳性的不灭细胞株中的表达。 
附图6显示了端粒酶的系统树和以RNA依赖性RNA聚合酶为根部的 逆转录因子。 
附图7显示λ克隆GΦ5的限制性图谱。 
附图8显示具有标明了STS标记物D5S678(定位于hTRT基因附近)定位的染色体5p的图谱。 
附图9显示hTRT启动子报道质粒的构建。 
附图10，在2页上，显示hTRT和hTR在体外共表达以产生具有催化活性的人端粒酶。 
附图11，在2页上，显示来自于4个TRT蛋白质的序列的比较和鉴别需要的基序。TRTcon显示TRT共有序列。RTcon显示其它逆转录酶的共有残基。对于上面的情况，表示共有残基在TRT蛋白质中绝对的保守。 
附图12显示hTRT内含子的拓扑异构酶II裂解位点和NFkB结合位点基序，并且显示了对应于SEQUENCE ID NO：7的序列。 
附图13，在2页上，显示编码Euplotes123千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位(EuplotesTRT)的DNA的序列。 
附图14显示Euplotes123千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位(EuplotespTRT蛋白质)的氨基酸的序列。 
附图15，在5页上，显示粟洒裂殖酵母端粒酶催化亚单位(粟洒裂殖酵母TRT)的DNA和氨基酸序列。 
附图16，在2页上，显示hTRT c DNA的序列，并且显示了对应于SEQUENCE ID NO：1的序列。 
附图17显示由附图16的cDNA编码的hTRT蛋白质，所显示的蛋白质序列对应于SEQUENCE ID NO：2。 
附图18显示克隆712562的序列，并且显示了对应于SEQUENCE IDNO：3的序列。 
附图19显示由克隆712562的序列编码的259个残基蛋白质，所显示的序列对应于SEQUENCE ID NO：10。 
附图20，在7页上，显示具有编码Δ182变异体多肽的开放读框的核酸序列，所显示的序列对应于SEQUENCE ID NO：4。该附图也显示Δ182变异体多肽的氨基酸序列，所显示的氨基酸序列对应于SEQUENCE ID NO：5。 
附图21，在6页上，显示来自于hTRT基因组克隆的序列，所显示的序列对应于SEQUENCE ID NO：6。指明了共有基序和元件，包括拓扑异构酶II裂解位点，NFkB结合位点，和Alu序列和其它序列元件序列特性。 
附图22显示TRT基因的突变在酵母中的作用，如实施例1描述的。 
附图23显示EST AA281296的序列，对应于SEQUENCE ID NO：8。 
附图24显示缺失182碱基对的克隆712562的序列，所显示的序列对应于SEQUENCE ID NO：9。 
附图25显示用于来自于BJ细胞的端粒酶活性的测试结果，所述的细胞用编码hTRT蛋白质的表达载体(pGRN133)或对照质粒(pBBS212)转染，如实施例13描述的。 
附图26是显示结合和替代洗脱步骤的端粒酶的亲和纯化示意图。 
附图27是在如实施例1描述的纯化方案中获得的端粒酶制剂的Northern印迹的照片。泳道1含有1.5fmol的端粒酶RNA，泳道2含有4.6fmol的端粒酶RNA，泳道3含有14fmol的端粒酶RNA，泳道4含有41fmol的端粒酶RNA，泳道5含有核提取物(42fmol的端粒酶)，泳道6含有Affi-Gel-肝素-纯化的端粒酶(47fmol的端粒酶)，泳道7含有亲和纯化的端粒酶(68fmol)，和泳道8含有甘油梯度纯化的端粒酶(35fmol)。 
附图28显示经过纯化方案后的端粒酶活性。 
附图29是SDS-PAGE凝胶的照片，显示来自于Euplotesaediculatus的约123千道尔顿多肽和约43千道尔顿成对物的存在。 
附图30显示Euplotes aediculatus端粒酶的沉淀系数的图。 
附图31是具有36％的甲酰胺的聚丙烯酰胺/脲凝胶的照片，显示Euplotes端粒酶底物的应用。 
附图32显示假设的端粒酶RNA模板，和具有端粒酶RNA的肝素引物的序列比较。 
附图33是显示于附图31的凝胶的泳道25-30的照片，以较亮的曝光水平显示。 
附图34显示编码来自于Euplotes的43千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位的基因的DNA序列。 
附图35在4页上，显示来自于Euplotes的43千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位的所有的开放读框的DNA序列，以及氨基酸序列。 
附图36显示来自于Euplotes的123千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位(上面序列)和T.thermophila的80千道尔顿多肽的亚单位(底下序列)的序列比较。 
附图37显示来自于Euplotes aediculatus的123千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位(上面序列)和T.thermophi la的端粒酶多肽的95千道尔顿(底下序列)的序列比较。 
附图38显示来自于Euplotes aediculatus的43千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位的“La-区域”的一部分(上面序列)和T.thermophila的95千道尔顿亚单位的一部分(底下序列)的最适合的配合序列对比。 
附图39显示来自于Euplotes aediculatus的43千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位的“La-区域”的一部分(上面序列)和T.thermophila 的80千道尔顿亚单位的一部分(底下序列)的最适合的配合的序列对比。 
附图40显示来自于Euplotes aediculatus的123千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位的聚合酶区域和包括来自于啤酒酵母线粒体的细胞色素氧化酶组II内含子1编码的蛋白质(a1S.c.(组II))，Dong(LINE)，和酵母ESTp(L8543.12)的各种逆转录酶的聚合酶区域的序列对比和基序。 
附图41显示具有各种La蛋白质的43千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位的区域的序列对比。 
附图42显示编码T.thermophila的80千道尔顿蛋白质亚单位的核苷酸序列。 
附图43显示T.thermophila的80千道尔顿蛋白质亚单位的氨基酸序列。 
附图44显示编码T.thermophila的95千道尔顿蛋白质亚单位的核苷酸序列。 
附图45显示T.thermophila的95千道尔顿蛋白质亚单位的氨基酸序列。 
附图46显示L8543.12(“Est2p”)的氨基酸序列。 
附图47显示由Oxytricha PCR产物编码的氨基酸序列与Euplotesp123序列的的序列对比。 
附图48显示Est2的DNA序列。 
附图49显示来自于编码人类端粒酶肽基序的cDNA克隆的部分氨基酸序列。 
附图50显示来自于编码人类端粒酶肽基序的cDNA克隆的部分DNA序列。 
附图51显示tez1，也称之为粟洒裂殖酵母trt的氨基酸序列。 
附图52，在2页上，显示tez1的DNA序列，内含子和其它非编码区域显示于底下框子和外显子(即编码区域)显示于上面框子。 
附图53显示EST2p，Euplotes和Tetrahymena序列，以及共有序列的序列对比。 
附图54显示用于生产抗hTRT抗体的肽的序列。 
附图55是tez1+测序实验的概括示意图。 
附图56显示用于PCR的两个简并引物以便鉴别Euplotesaediculatus p123序列的粟洒裂殖酵母同系物。 
附图57显示利用鉴别Euplotes aediculatus p123序列的粟洒裂殖酵母同系物的两个简并引物进行PCR产生四个主要的谱带。 
附图58显示M2PCR产物与Euplotes aediculatus p123，啤酒酵母，和Oxytricha端粒酶蛋白质序列对比。 
附图59是显示用于鉴别Euplotes aediculatus p123序列的粟洒裂殖酵母同系物的3’RT PCR方案的示意图。 
附图60显示用于筛选粟洒裂殖酵母端粒酶蛋白质序列的文库的特性和显示筛选粟洒裂殖酵母端粒酶蛋白质序列的文库的结果。 
附图61显示用HindIII消化含有粟洒裂殖酵母端粒酶序列的阳性基因组克隆获得的阳性结果。 
附图62是用于获得全长粟洒裂殖酵母TRT克隆的5’RT PCR方案的示意图。 
附图63显示来自于粟洒裂殖酵母(S.p.)，啤酒酵母(S.c.)和Euplotes aediculatus(E.a.)的端粒酶催化亚单位的RT区域的序列对比。 
附图64显示来自于Euplotes(“Ea-p123”)，啤酒酵母(“Sc- Est2p”)，和粟洒裂殖酵母(“Sp-Tez1p”)的序列对比。在A组，有阴影部分的区域指示两个序列之间共享的残基。在B组，有阴影部分的区域指示所有三个序列之间共享的残基。 
附图65显示端粒酶基因一起用于粟洒裂殖酵母破碎的方案。 
附图66显示证实tez1的破碎的实验结果。 
附图67显示由于tez1破碎的粟洒裂殖酵母的端粒的逐渐缩短。 
附图68，在4页上，显示编码由EcoRI-NotI插入的克隆712562编码的约63千道尔顿的端粒酶蛋白质的ORF的DNA和氨基酸序列。 
附图69显示来自于各种来源的逆转录酶基序的序列对比。 
附图70提供了质粒pGRN121的限制性和功能图谱。 
附图71，在2页上，显示hTRT cDNA序列的初步核酸测序分析结果。 
附图72，在10页上，显示hTRT的初步核酸测序和推测的三个开放读框的ORF序列。 
附图73提供了质粒pGRN121的限制性和功能图谱。 
附图74，在8页上，显示hTRT的提纯的核酸序列和推测hTRT的ORF序列。 
附图75显示λ克隆25-1.1的限制性图谱。 
发明详述 
导言 
端粒酶是包括RNA成分和催化蛋白质成分的核糖核蛋白质复合物(RNP)。本发明涉及端粒酶催化蛋白质成分，下文称之为“TRT”(端粒酶逆转录酶)的克隆和定性。对TRT这样命名是因为该蛋白质具有RNA-依赖性DNA聚合酶(逆转录酶)的作用，它利用该端粒酶RNA成分(下 文称之为“TR”)以指导端粒DNA重复序列的合成。而且，TRT在进化上与其它逆转录酶相关(参见实施例12). 
在一个方面，本发明涉及人类端粒酶催化蛋白质成分的克隆和定性，下文称之为“hTRT”。人类TRT是特别有兴趣和价值，如上文说明的，人类(和其它哺乳动物细胞)的端粒酶活性与细胞增殖能力，细胞不灭性，和瘤形成表现型相关。例如，与可灭的细胞相比(例如大多数人类体细胞)，端粒酶活性和如在下文实施例2中证明的，人类TRT基因产物的水平在不灭的人类细胞中增高(例如恶性肿瘤细胞和不灭细胞系)。 
本发明进一步提供了可用于人类疾病和疾病状态的诊断，预测和治疗的方法和组合物，如下文的详细描述。也提供了可用于使细胞不灭(体内和体外)，产生具有所需的特性的转基因动物和许多其它用途的方法和试剂，许多在下文中描述。本发明也提供了用于制备，克隆，或再克隆来自于纤毛虫，真菌，脊椎动物，例如哺乳动物和其它生物体的TRT基因和蛋白质的方法和试剂。 
如在下文详细描述的，从纤毛虫Euplotes aediculatus纯化端粒酶之后首先对TRT定性。利用RNA亲和层析和其它方法充分地纯化Euplotes aediculatus端粒酶产生蛋白质“p123”。令人惊奇地，p123与以前认为构成端粒酶全酶(即T.thermophila的p80和p95蛋白质)的蛋白质亚单位的蛋白质不相关。p123DNA和蛋白质序列(GenBank入藏号U95964；附图13和14)的分析显示与p123的作用一致的逆转录酶(RT)的基序作为端粒酶的催化亚单位(参见，例如附图1，4和11)。但是，p123与啤酒酵母(酵母)蛋白质，Est2p相关，已知它具有在啤酒酵母中维持端粒的作用(GenBank入藏号S5396)，但是在本发明之前，它被认作为编码端粒酶催化的亚单位蛋白质(参见，例如Lendvay等人，1996，遗传学，144：1399)。 
在一个方面，本发明提供了用于鉴别和克隆新的TRTs的方法和试剂，其中利用：从所公开(例如从克隆TRT基因和cDNAs)的TRT多核苷酸产生或衍生的核酸探针和引物；特异性地识别基序或基序序列或其它TRT抗原决定基(例如表达克隆TRT基因或纯化TRT蛋白质)的抗体；通过筛选计算计数据库；或其它手段。例如，如在实施例1中描述的，用从Euplotes p123RT基序B’和C设计的简并序列引物实施粟洒裂殖酵母的DNA的PCR扩增(聚合酶链反应)。所产生的四个主要产物，一个编码与Euplotes p123和啤酒酵母Est2p同源的肽序列。利用该PCR产物作为探针，通过筛选粟洒裂殖酵母cDNA和基因组文库和通过逆转录和PCR(RT-PCR)扩增粟酒裂殖酵母RNA获得粟洒裂殖酵母TRT同系物的整个序列。粟洒裂殖酵母基因(“trt1”；GenBank入藏号AF015783；附图15)的整个序列显示与p123和Est2p的同源性在逆转录酶基序中尤其高。粟洒裂殖酵母trt1也称之为tez1。 
利用来源于端粒酶RT基序的简并引物的扩增也用于在Oxytrichatrifallax和T.thermophila中获得TRT基因序列，如实施例1描述的。 
本发明的Euplotes p123，粟洒裂殖酵母trt1和啤酒酵母Est2p核酸的序列用于利用程序BLAST(Altschul等人，1990，分子生物学杂志，215：403)在人类表达的序列标签(ESTs)的计算计化数据库中检索。用Est2p序列检索数据库没有显示匹配，但是用p123和trt1序列进行检索识别假设编码同源蛋白质的人类EST(GenBank入藏号AA281296；参见SEQUENCE ID NO：8)，如在实施例1中描述的。含有EST(下文称之为“克隆712562”，参见SEQUENCE ID NO：3)的cDNA克隆的整个测序显示存在7个RT基序。但是，该克隆不编码具有所有7个基序的邻接的人类TRT。因为基序B’，C，D和E包含于与多个 NH2末端基序不同的开放读框(ORF)。另外，基序A和B’之间的距离基本上短于三个前面定性的TRTs之间的距离。克隆712562是从I.M.A.G.E.Consortium；Lennon等人，1996，基因组33：151获得。 
从如实施例1描述的来源于人293细胞系的cDNA文库分离的编码功能hTRT(参见附图16，SEQUENCE ID NO：1)的cDNA克隆，pGRN121。将克隆712562和pGRN121比较显示克隆712562在基序A和B’之间具有182碱基对的缺失(参见附图24，SEQUENCE ID NO：9)。存在于pGRN121的另外的182个碱基对在单个开放读框放置所有的TRT基序，并且将基序A和B’区域之间的间隔增加到与其它已知的TRTs一致的距离。如在下文实施例(例如实施例7)中描述的，SEQUENCE ID NO：1编码纯化活性的端粒酶蛋白质，该蛋白质具有SEQUENCE ID NO：2的序列。SEQUENCE ID NO：2多肽具有1132个残基和约127千道尔顿(kD)的计算的分子量。 
如在下文讨论的，和在下文实施例9中描述的，在从端粒酶阳性细胞(例如，testis和293细胞)的RNA逆转录后检测到具有克隆712562的182个碱基缺失特性的TRT cDNAs。失去该182碱基对序列的hTRT RNAs通常称之为“Δ182变异体”和可以代表一个，两个或几个种类。虽然失去存在于pGRN121 cDNA的182碱基对序列的hTRT RNAs变异体不可能编码完全有活性的端粒酶催化酶，但是它们在端粒酶调节起作用，如下文讨论的，和/或具有部分端粒酶活性，例如端粒结合或hTRT结合活性，如在下文讨论的。 
因此，在一个方面，本发明提供了具有天然存在的人类TRT基因或mRNA的序列的分离的多核苷酸，包括但不限于具有附图16(SEQVENCE IDNO：1)列出的序列的多核苷酸。在相关的方面，本发明提供了编码hTRT蛋白质，片段，变异体或衍生物的多核苷酸。在另一个相关的方面，本 发明提供了结合到hTRT基因或mRNA的有意义和反义核酸。本发明进一步提供了合成的或从天然来源的纯化的hTRT蛋白质，以及特异性地与hTRT蛋白质或其片段结合的抗体和其它试剂。本发明也提供了许多新的方法，包括例如通过提供用于人类疾病的诊断和预测的测试，使用前面提到的组合物的方法，用于研制治疗剂和治疗方法，鉴别端粒酶结合的蛋白质的方法，用于筛选能够激活或抑制端粒酶活性的试剂的方法。下文提供了本发明的许多其它的方面和实施方案。 
本发明的一个方面是使用至少10个核苷酸到约10千碱基对或更多的长度的多核苷酸并且包括与天然存在的hTRT基因或hTRT mRNA的邻接序列相同或正确互补的至少10个核苷酸邻接序列，以便用于测试或筛选hTRT基因序列或hTRT mRNA，或制备重组宿主细胞。 
本发明的另一个方面是增加hTRT在制备用于治疗疾病状态的药物中的表达的药剂的应用，非强制性地该药物用于抑制老化作用，所述的状态是由于增加脊椎动物细胞的增殖能力引起的。 
本发明的另一个方面是端粒酶活性抑制剂在制备用于治疗与人类细胞内的端粒酶活性的增高的水平相关的状态的药物中的应用。 
本发明的再一方面也是提供了用作为药物的本发明的蛋白质，变异体和片段，和编码多核苷酸或片段。 
本发明进一步包括在本文定义的各种情况下蛋白质，变异体或片段，或编码其的多核苷酸或片段在制备例如用于制备用于抑制老化作用或癌症的药物中的应用。 
本发明的另一个方面是选自于下列组的多核苷酸： 
(a)具有附图16列出的序列的DNA； 
(b)与前面所述的DNA杂交的并且编码hTRT蛋白质或变异体或与编码这样的变异体的编码序列杂交的至少10个核苷酸的多核苷酸； 和 
(c)与(a)和(b)定义的DNA序列有遗传密码简并的和编码hTRT多肽或变异体的DNA序列。 
在本发明的一些实施方案中，hTRT多核苷酸是不同于SEQUENCE IDNI：8的389个核苷酸的多核苷酸和/或不同于克隆712562，含有插入物的质粒，插入物的序列显示于附图18(SEQUENCE ID NO：3)。 
以主题划分来进行下面的描述。II部分进一步描述了TRT蛋白质的氨基酸基序特性，以及编码具有这样的基序的蛋白质的TRT基因。III-VI部分特别描述了本发明的核酸，蛋白质，抗体和纯化的组合物，特别关注的是人类TRT相关的组合物。VII部分特别描述了用于治疗人类疾病的本发明的方法和组合物。XIII部分描述了不灭的人细胞系的生产和鉴定。IX部分特别描述了本发明的核酸，多核苷酸，和其它组合物用于诊断人类疾病。X部分特别描述了用于筛选和鉴别调节(例如抑制或促进)端粒酶活性或表达的药剂和治疗剂的本发明的方法和组合物。XI部分特别描述了转基因动物(例如端粒酶敲出口动物和细胞)。XII部分是用于部分I-XI的术语的汇编。部分XIII描述了涉及本发明的特定的实施方案的实施例。采用主题和亚主题方式对本发明进行描述更清晰，和不以任何方式限制。 
II.TRT基因和蛋白质 
本发明提供了分离的和/或重组基因和具有端粒酶催化亚单位蛋白质(即端粒酶逆转录酶)的蛋白质，包括但不限于这样的基因的天然存在形式和分离的或重组形式的蛋白质。通常，TRTs是大的，碱性的，具有逆转录酶(RT)和端粒酶特异性(T)氨基酸基序的蛋白质，如本文公开的。由于不同种类的生物体中这些基序是保守的，因此利用本发明的方法可以获得许多生物体的TRT基因或利用例如特异于一个或多个基 序序列的本发明的引物，核酸探针，和抗体可以鉴别。 
当与存在于其它逆转录酶中的相似时，存在于TRTs中的7个RT基序具有特定的标志。例如如附图4显示的，在TRT RT基序内，在其它RTs中许多氨基酸替代的残基是高度保守的。例如在基序C中，与其它RTs的(F/Y)xDDh(当“h’是疏水氨基酸和”x“是任何氨基酸时；参见Xiong等人，1990，EMBO J 9：3353；Eickbush，病毒演变生物学，(S.Morse，Ed.Raven出版社，纽约，第121页，1994))相比，端粒酶RTs含有的hxDD(F/Y)出现了协调活性位点金属离子(参见，Kohlstaedt等人，1992，科学256：1783；Jacobo-Molina等人，1993，美国科学院年报，90：6320；Patel等人，1995，生物化学34：5351)的两个天冬氨酸(DD)。在基序E中出现了另一个端粒酶亚单位的系统性的改变特性，其中WxGxSx是保守序列或在端粒酶蛋白质之间是高度保守的，而hLGxxh的特性是其它的RTx(Xiong等人，见上文，Eickbush，见上文)。该基序E被称之为“引物柄”，和已经报道了该区域的突变以实现RNA的启动但不是DNA的启动(Powell等人，1997，生物化学杂志，272：13262)。因为端粒酶需要DNA引物(例如染色体3’末端)，但是端粒酶不同于引物柄区域的其它RTs不是令人满意的。例如，在TRTs中基序A和B’之间的距离长于典型的其它RTs，这可以代表类似于右手的该结构的“手指”区域内的插入(附图3；参见Kohlstaedt等人，见上文，Jacobo-Molina等人，见上文；Patel等人，见上文)。 
而且，如上文所述，基序T是TRT蛋白质的另外的标志。如在附图4(W-L-X-Y-X-X-h-h-X-h-h-X-p-F-F-T-E-X-p-X-X-X-p-X-X-X-Y-X-R-K-X-X-W(X是任何氨基酸，h是疏水，p是极性))显示的该基序T包括利用通式： 
Trp-R1-X7-R1-R1-R2-X-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X8-9-R3-R3-Arg-R4- X2-Trp描述的序列， 
其中X是任何氨基酸和下标是指连续的残基数，R1是亮氨酸或异亮氨酸，R2是谷氨酸或精氨酸，R3是苯丙氨酸或酪氨酸，R4是赖氨酸或组氨酸。利用通式：Trp-R1-Xq-h-h-X-h-h-R2-p-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X-p-X3-p-X2-3-R3-R3-Arg-R4-X2-Trp也可以描述T基序， 
其中X是任何氨基酸，下标是指连续的残基数目，R1是亮氨酸或异亮氨酸，R2是谷氨酸或精氨酸，R3是苯丙氨酸或酪氨酸，R4是赖氨酸或组氨酸，h是选自于丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和甲硫氨酸的疏水氨基酸，p是选自于甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺的极性氨基酸。 
在一个实施方案中，本发明提供了分离的天然存在的和重组的TRT蛋白质，它包括一个或多个描述于附图11的基序，例如 
基序   TW-X12-FFY-X-TE-X10-11-R-X3-W-X7-I 
基序T’E-X2-V-X 
基序1  X3-R-X2-PK-X3
基序2  X-R-X-I-X 
基序A  X4-F-X3-D-X4-YD-X2
基序B’Y-X4-G-X2-QG-X3-S-X8
基序C  X6-DD-X-L-X3
当显示的TRT蛋白质含有一个以上的TRT基序时，按照(NH2＞COOH)的顺序显示于附图11。 
在一个实施方案中，本发明提供了分离的天然存在的TRT蛋白质，它包括超基序： 
(NH2)-X300-600-W-X12-FFY-X-TE-X10-11-R-X3-W-X7-I-X5-20-E-X2-V-X-X5-20-X3-R-X2-PK-X4-10-R-X-I-X-X60-80 -X4-F-X3-D-X4-YD-X2-X80-130-Y-X4-G-X2-QG-X3-S-X8-X5-35-X6-DD-X-L-X3-X10-20-X12-K 
对本领域内技术人员来说是显而易见的，利用本文提供的试剂包括本文公开的那些试剂的TRT序列和本文提供的方法和指导(包括下文描述的特异性方法)，本领域内技术人员可以获得，分离和产生重组形式的TRT基因和蛋白质。例如，提供了与编码TRT的RT和T基序特性的基因序列杂交的引物(例如简并的扩增引物)。例如基于靶生物体的密码子的使用，可以制备与编码T基序，其它TRT基序(如下文讨论的)或基序的组合的FFYXTE区域的序列或共有序列杂交的一个或多个引物或简并引物和用于扩增来自于从靶生物体制备的基因组DNA或cDNA的TRT基因序列。简并引物的使用是本领域内技术人员熟知的并且必须使用引物组，该引物组与潜在地编码靶基序的氨基酸的核酸序列组杂交，其中考虑密码子优先和靶生物体的使用，和通过利用适合于在PCR退火步骤允许碱基错配的扩增(例如PCR)条件。通常，使用两个引物组；但是单个引物(或在这种情况下，单个简并引物组)扩增系统是本领域内技术人员熟知并且可用于获得TRT基因。 
表1提供了本发明引物的示意图，所述引物可用于扩增新的TRT核酸，特别是来自于脊椎动物的那些(例如人类和其它哺乳动物)。“N”是所有4种核苷酸的等摩尔混合物，和括号内的核苷酸是特定的核苷酸的等摩尔混合物。 
表1 TRT核酸扩增的简并引物的描述 
   基序     方向        5′-序列-3’ 
a  FFYVTE   正向    TT(CT)TT(CT)TA(CT)GTNACNGA 
b  FFYVTE   反向    TCNGTNAC(GA)TA(GA)AA(GA)AA 
c  RFIPKP   正向    (CA)GNTT(CT)AT(ACT)CCNAA(AG)CC 
d  RFIPKP   反向    GG(TC)TTNGG(TGA)AT(GA)AANC 
e  AYDTI    正向    GCNTA(CT)GA(CT)ACNAT 
f  AYDTI    反向    TANGT(GA)TC(GA)TANGC 
g  GIPQG    正向    GGNAT(ACT)CCNCA(AG)GG 
h  GIPQGS   反向    (GC)(AT)NCC(TC)TGNGG(TGA)ATNCC 
i  LVDDFL   正向    (CT)TNGTNGA(CT)GA(CT)TT(CT)(CT)T 
j  DDFLLVT  反向    GTNACNA(GA)NA(GA)(GA)AA(GA)TC(GA)TC 
      优先的引物结合(y＝yes，n＝no) 
      反向 
正向 
      b  d  f  h  i
a-    n  y  y  y  y 
c-    n  n  y  y  y 
e-    n  n  n  y  y 
g-    n  n  n  n  y 
i-    n  n  n  n  n 
在一个实施方案中，将扩增的TRT核酸用作为用于与从靶生物体制备的文库(例如cDNA文库)进行菌落杂交的杂交探针，这样具有整个TRT蛋白质编码序列的核酸，或其基本序列部分是相同的和被分离或克隆。根据本文描述的方法将例如刚才描述的试剂和方法用于获得Oxytrichatrifallax和T.thermophila的TRT基因序列，如在下文详细描述的。将会认识到以前未鉴定的TRT基因进行克隆后，通过常规方法测定该序列，合成编码的多肽和测试其TRT活性，例如端粒酶催化活性(如本文描述和/或通过本领域内技术人员熟知的端粒酶测试)。 
利用许多的本发明克隆方法的任何一种可以克隆TRT基因对本领域内技术人员来说是显而易见的，因为本发明的TRT基序序列和包括这样的序列的核酸可用于各种各样的所述的方法。例如可以使用利用基于已知的TRT序列的探针与来自于靶生物体的DNA或其它核酸文库进行杂交，如在实施例1中描述的。将会认识到可以将简并PCR引物或其扩增产物例如上文描述的那些标记并且用作为杂交探针。在另一个实施方案中，使用表达克隆方法。例如，将特异性地与跨越TRT基序或其它TRT抗原决定基例如FFYXTE基序的肽结合的一个或多个抗体用于分离包括TRT蛋白质和编码它的mRNA的核糖体复合体。为了产生本发明的这样的抗体，通常肽免疫原是6到30个氨基酸之间的长度，更常见的是约10到20个氨基酸之间的长度。也可以将抗体用于探测来源于所需的生物体的cDNA表达文库以鉴别编码TRT序列的克隆。在另一个实施方案中，也可以使用计算计检索DNA数据库以寻找含有与已知的TRT保守的序列的DNA以鉴别包括TRT序列的克隆。 
在一个方面，本发明提供了包括具有天然存在的TRT蛋白质的氨基酸序列的分离的或重组的多肽的组合物。通常，天然存在的TRT具有约80,000道尔顿(D)和约150,000D之间的，最常见的是约95,000D和 130,000D之间的分子量。通常，天然存在的TRT在pH 7.0时(通常计算的pI大于9)具有静正电荷。在一个实施方案中，多肽显示如本文定义的端粒酶活性。在相关的实施方案，多肽具有TRT特异性区域(T区域)序列并且显示端粒酶活性。本发明进一步提供了这样的多肽的片段。本发明也提供了具有编码TRT蛋白质天然存在的基因的序列的分离的或重组的多聚核苷酸。本发明提供了用于从非脊椎动物(例如酵母)和脊椎动物，例如哺乳动物(例如鼠或人)分离TRT序列的试剂。分离的多聚核苷酸可以与其它天然存在的或重组的或合成的载体核酸序列结合。通常，分离的核酸小于约300千碱基对，通常小于约50千碱基对，更常见的是小于约20千碱基对，最常见的是小于约10千碱基对并且有时小于约5千碱基对或2个千碱基对的长度。在某些实施方案中，分离的TRT多聚核苷酸甚至更小，例如小于约1千碱基对或小于0.1千碱基对的基因片段，引物或探针。 
III.核酸 
A)综述 
本发明提供了具有编码端粒酶催化亚单位蛋白质(TRT)的多聚核苷酸的分离的和重组核酸，例如来源于Euplotes，Tetrahymena，粟酒裂殖酵母或人的重组TRT基因。在附图13(Euplotes)；附图15(粟酒裂殖酵母)和附图16(人，GenBank入藏号AF015950)中提供了例举的多聚核苷酸。本发明提供了具有TRT基因序列，包括探针，引物，编码TRT蛋白多聚核苷酸的质等等的有义和反义多聚核苷酸。 
B)人TRT 
本发明提供了具有来源于人的端粒酶催化亚单位的序列的(即hTRT)核酸。 
在一个方面，本发明提供了具有人TRT基因或RNA的序列或亚序列 的多聚核苷酸。在一个实施方案中，本发明的多聚核苷酸具有显示于附图16的SEQUENCE ID NO：1的序列或其亚序列。在另一个实施方案中，多聚核苷酸具有SEQUENCE ID NO：3(附图18)，SEQUENCE ID NO：4(附图20)的序列，或其亚序列。本发明也提供了具有基本上等同于本文公开的hTRT核酸序列的多聚核苷酸，包括但不限于SEQUENCE ID NO：1(附图16)，4(附图20)，6(附图21)和7。因此，本发明提供了天然存在的人TRT基因的等位基因和相对于本文公开的hTRT核酸序列具有一个或多个核苷酸缺失，插入或替代的各种多聚核苷酸序列。如下文所述，利用下文描述的重组或合成方法或采用其它手段可以产生变异的核酸。 
本发明也提供了具有人TRT基因的侧接区域的序列的分离的和重组的多聚核苷酸。这样的多聚核苷酸包括来源于hTRTmRNA的未转译的区域的基因组序列。例举的基因组序列显示于附图21(SEQUENCE ID NO：6)。如实施例4所述，SEQUENCE ID NO：6是通过将从人基因组文库分离的克隆 
Figure GSA00000069469700291
测序获得的。 
Figure GSA00000069469700292
含有包括约13000碱基5’到hTRT编码序列的15千碱基对(kbp)插入物。该克隆含有hTRT启动子序列和其它hTRT基因调节序列(例如加强子)。 
本发明也提供了具有来源于人TRT基因的内含子区域的序列的分离的和重组多聚核苷酸。例举的内含子序列显示于附图21(SEQUENCE ID NO：7；参见实施例3)。在某些实施方案中，hTRT内含子包含于“微基因”以改善hTRT蛋白质在真核细胞中的表达。 
在相关的方面，本发明提供了编码hTRT蛋白质或蛋白质片段，包括修饰的，改变的和变异的hTRT多肽的多聚核苷酸。在一个实施方案中，编码的hTRT蛋白质或片段具有如附图17提出的氨基酸序列(SEQUENCE ID NO：2)或具有保守替代的SEQUENCE ID NO：2的序列。 在一个实施方案中，编码的hTRT蛋白质或片段具有改变蛋白质的活性(例如端粒酶催化活性)的替代。 
将会认识到，由于遗传密码的简并，编码hTRT蛋白质的核酸不需要具有天然存在的hTRT基因的序列，但是，多个多聚核苷酸可以编码具有SEQUENCE ID NO：2的氨基酸序列的hTRT多肽。本发明提供了通过基于利用已知的三联体遗传密码制备的可能的密码子选择性选择结合制备的各种和每一种核苷酸序列的变异，所有这样的变异是本发明特异性的。因此，虽然在某些情况下能够与天然存在序列的核苷酸序列杂交(在合适的选定的严格条件下)的编码hTRT多肽的核苷酸序列是优选的，但是在其它情况下产生编码hTRT核苷酸序列是优选的，这些核苷酸使用基本上不同的密码子选择并且可能不与具有天然存在序列的核酸杂交。 
在特定的实施方案中，本发明提供了hTRT寡聚-和多聚核苷酸，它包括本文公开hTRT核酸的亚序列(例如SEQUENCE ID NO：1和6)。本发明的核酸通常包括例举的hTRT多聚核苷酸的至少10个，更常见的是至少约12个以上或约15的连续的碱基。常见的是，例如当计划表达多肽或全长的hTRT蛋白质，本发明的核酸将会包括较长的序列，例如至少约25个，约50个，约100，约200，或至少约500-3000碱基的长度。 
仍然在另一个实施方案中，本发明提供了具有等同于或互补于天然存在或非天然存在hTRT多聚核苷酸例如SEQUENCE ID NO：3或SEQUENCEID NO：4的序列的“Δ182hTRT”多聚核苷酸，它不含有存在于pGRN121(和在克隆712562中没有)的182个核苷酸序列(SEQUENCE IDNO：9(附图24))。这些多聚核苷酸不是需要的，部分是因为它们编码含有不同于在“全长”hTRT多肽(SEQUENCE ID NO：2)例如由pGRN121编 码的TRT基序的结合或排列的多肽。如在下文讨论的，涉及这些多肽在自然界中起着生物学作用(例如，在调节细胞的端粒酶的表达中)和/或用作为治疗剂(例如作为抑制野生型蛋白质的功能的显性阴性的产物)，或具有其它作用和用途，例如如本文描述的。 
例如，与由pGRN121编码的多肽相反，克隆712562编码具有计算的分子量约为30千道尔顿的259残基的蛋白质(下文的“712562hTRT”)。712562hTRT多肽(SEQUENCE ID NO：10(附图19))含有基序T，1，2和A，但不含有基序B’，C，D和E(参见附图4)。类似地，可以从类似于pGRN121cDNA的核酸表达具有治疗和其它活性的变异的hTRT多肽，但是失去了在克隆712562中错配的182碱基对，例如具有显示于附图20的序列(SEQUENCE ID NO：4)。该核酸(下文的“原90hTRT”)，可以通过常规的合成或重组方法合成，如下文所述的，该核酸编码807残基的蛋白质(计算的分子量为约90千道尔顿)，它与由SEQUENCE ID NO：1编码的hTRT蛋白质共享有类似的氨基末端序列，但是在羧基末端区域不同(开始的763个残基是共同的，原90hTRT的最后的44个残基不同于“全长”hTRT)。原90hTRT多肽含有基序T，1，2，和A，但不含有基序B，C，D，E，并且所以它们具有一些，但不是全部端粒酶活性。 
C)人TRT核酸的生产 
本发明的多聚核苷酸具有许多用途，包括但不限于编码hTRT或其片段的多肽的表达，用作为有义或反义探针或引物用于天然存在的hTRT基因或RNA(例如诊断或预防应用)杂交和/或扩增，用作为治疗剂(例如在反义，三联体，或核酶组合物中)。如基于公开公开的观点，这些用途将对与老化，癌症和可育性相关的人疾病的诊断和治疗以及基于细胞的产物的生长，再生产和制备具有巨大的影响是显而易见的。 如在下面的章节中描述的，利用本领域内技术人员已知的技术可以制备本发明的hTRT核酸(例如克隆，合成或扩增)。 
1)克隆，扩增和重组生产 
在一个实施方案中，利用与hTRTmRNA，cDNA或基因组DNA特异性杂交的核酸探针将hTRT基因或cDNA克隆。适用于该目的的探针是具有附图16(SEQUENCE ID NO：1)提供的整个序列或其一部分的多聚核苷酸，例如包括其亚序列的探针。通常，将靶hTRT基因组DNA或cDNA连接到载体(例如质粒，噬菌体，病毒，酵母人工染色体等等)并且可以从基因组DNA或cDNA文库分离(例如人胎盘cDNA文库)。一旦鉴别了hTRT核酸，根据本领域内技术人员已知的标准方法可以分离。实施例1中提供了筛选hTRT基因的人cDNA文库的说明性实施例；类似地，在实施例3和4中发现了筛选人基因组文库的例子。克隆方法是本领域内技术人员已知的并且在例如Sambrook等人，(1989)分子克隆：实验室手册，第2版，第1-3卷，冷泉港实验室，下文称之为“Sambrook”；Berger和Kimmel，(1987)酶学方法，第152卷：分子克隆技术的指导，San Diego：学术出版社，Ausubel等人，分子生物学的现行的方案，绿色出版社和Wiley-Interscience，纽约(1997)；Cashion等人，美国专利No.5017478和Carr，欧洲专利No.0246864中描述。 
本发明也提供了通过扩增方法，例如聚合酶链反应(PCR)分离了hTRT基因组或cDNA核酸。在一个实施方案中，利用引物5’-GTGAAGGCACTGTTCAGCG  -3’(“TCP1.1”)和5’-CGCGTGGGTGAGGTGAGGTG-3’(“TCP1.15”)从RNA或cDNA样品扩增hTRT蛋白质的编码序列(例如双链胎盘cDNA(Clontech，Palo AltoCA))。在某些实施方案中，使用了第三或第二引物对例如对于“嵌套式PCR”以增加特异性。第二引物对的实施例是5’- CTGTGCTGGGCCTGGACGATA  -3’(“bil lTCP6”)和5’-AGCTTGTTCTCCATGTCGCCGTAG-3’(“TCP1.14”)。对本领域内技术人员将是显而易见的是本发明提供了可用于扩增hTRT核酸的许多其它引物和引物的结合。 
而且，本发明提供了用于扩增hTRT基因组DNA，cDNA或RNA的任何特定的区域(例如编码区，启动子区域，和/或内含子)或亚序列的引物。例如，利用引物TCP1.57和TCP1.52(引物对1)或引物TCP1.49和TCP1.50(引物对2)可以扩增(例如用于检测基因组克隆)SEQUENCE ID NO：1的274/275位置的hTRT的内含子(参见实施例3)。(引物名称是指列于下文表2的引物)。可以单个地使用引物对或当首先使用第一组引物时进行嵌套式PCR。另一个举例的实施例涉及特异性地扩增的引物并且可以检测hTRT mRNA的5’末端或编码hTRT基因的5’末端的外显子(例如用于估测cDNA克隆的大小或完整性)。下面的引物对可用于扩增hTRT的5’末端：引物K320和K321(引物对3)；引物K320和TCP1.61(引物对4)；引物K320和K322(引物对5)。可将引物组按照第5组引物，然后第4组或第3组，或第4组或第5组，然后第3组的顺序用于嵌套式PCR。也在另一个说明性的实施例中涉及选择以扩增或特异性地检测保守的hTRT TRT基序区域的引物，该区域包括约mRNA的中间的三分之一(例如，用作为杂交探针以便从例如非人生物体鉴别TRT克隆)。下面的引物对可用于扩增hTRT核酸的TRT基序区域：引物K304和TCP1.8(引物对6)，或引物LT1和TCP1.15(引物对7)。按照组6，然后组7的引物可将顺序组可用于嵌套式PCR实验。 
合适的PCR扩增条件是本领域内技术人员已知的并且包括(但不限于)1单位的Taq聚合酶(Perkin Elmer，Norwalk CT)，各100微摩尔浓度的dNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)，1×PCR缓冲液(50毫摩尔浓 度氯化钾，10毫摩尔浓度Tris，phH 8.3，在室温下，1.5毫摩尔浓度氯化镁，0.01％明胶)和0.5微摩尔浓度引物，包括在94℃，45秒；在55℃45秒；在72℃90秒的过程进行30个扩增循环。本领域内技术人员将会认识到其它热稳定的DNA聚合酶，反应条件，和循环参数也将提供合适的扩增。用于获得hTRT合适的其它合适的体外扩增方法包括但不限于下文描述的那些。一旦扩增，如果需要，利用常规的分子生物学方法可以将hTRT核酸克隆到各种各样的载体或根据本发明的方法进行检测或其它利用。 
本领域内技术人员将会认识到利用其它方法可以制备或繁殖如上所述获得的克隆的或扩增的hTRT核酸，例如化学合成或通过转化到细菌系统，例如大肠杆菌(参见例如Ausubel等人，参见上文)，或真核，例如哺乳动物表达系统复制。类似地，利用例如含有由RNA聚合酶例如T7，T3或SP6识别的启动子的商品载体，采用体外方法，或细菌系统例如大肠杆菌可以表达hTRT RNA，或转译利用含有RNA聚合酶启动子的引物通过PCR扩增产生的DNA。 
本发明进一步提供了改变的或修饰的hTRT核酸。本领域内技术人员将会认识到采用本领域内技术人员已知的方法(例如位点特异性诱变)可以修饰(例如，截短的，衍生的，改变的)所获得的克隆的或扩增的hTRT核酸或如下所述简单地从头开始合成。改变的或修饰的hTRT核酸可用于各种各样的应用，包括但不限于有助于hTRT基因或基因产物的克隆或操作，或表达变异的hTRT基因产物。例如在一个实施方案中，将hTRT基因序列改变以致于它编码具有改变的特性或活性的hTRT多肽，如在下文详细讨论的，例如通过在保守的hTRT基序进行突变获得的特性。在另一个说明性实施例中，可以在hTRT核酸的蛋白质编码区域导入诱变以改变糖基化模式，以改变密码子优先，以产生拼 接变异体，去除蛋白酶敏感性位点，制备抗原区域，修饰特异性活性等等。在其它实施方案中，将编码hTRT的核苷酸序列和其衍生物进行改变，没有改变所编码的氨基酸序列，例如具有更令人满意的特性的RNA转录物的产生，例如与从天然存在的序列产生的转录物相比，具有增加的转译效力或较大或较短的半寿期。也在另一个实施方案，根据由宿主利用的特定密码子的频率，选择改变的密码子，以增加在特定的原核表达宿主或真核表达宿主出现的肽的表达速率。可用于制备本发明的变异的hTRT多聚核苷酸的用于体外和体内重组技术存在于Sambrook等人，和Ausubel等人，参见上文。 
如上文所解释的，本发明提供了具有hTRT基因的侧接(5’或3’)和内含子序列的核酸。由于它们含有参与hTRT调节和用于表达hTRT和其它重组蛋白质或RNA基因产物的启动子和其它调节元件。除了SEQUENCEID NO：6和7提供的核酸序列，利用常规的分子生物学技术易于获得另外的hTRT内含子和侧接序列是显而易见的。例如，可以从λGΦ5(ATCC 209024)，如上文和实施例4描述的获得其它的hTRT基因组序列。通过利用具有SEQUENCEID NO：1的序列或亚序列的hTRT核酸探针筛选人基因组文库可以获得仍然其它的hTRT基因组克隆和序列。通过利用来源于λGΦ5的标记的序列或亚克隆以探测合适的文库可以获得其它的克隆和序列(例如更进一步的上游)。用于hTRT侧接序列的进一步的定性的其它有用的方法包括由Gobinda等人，1993，PCR方法应用2：318；Triglia等人，1988，核酸研究16：8186；lagerstrom等人，1991，PCR方法应用1：111，和Parker等人，1991，核酸研究19：3055描述的常规方法。 
通过常规手段例如将hTRT基因组序列与hTRT cDNA序列(参见例如实施例3)进行比较，通过S1分析(参见Ausubel等人，见上文，第4 章)，或各种其它本领域内技术人员已知的手段可以鉴别内含子序列。内含子序列也存在于前-mRNA(即未拼接的或不完全拼接的mRNA前体)，前-mRNA可以在细胞RNA逆转录之后，进行克隆或扩增。 
当需要时，利用本领域内技术人员已知的DNA测序方法可以测定或验证克隆的，扩增的或其它的合成的hTRT或其它的TRT核酸序列(参见，例如Ausubel等人，见上文)。有用的测序方法使用了例如DNA聚合酶I的Klenow片段，测序酶(美国生物化学公司，Cleveland OH)，TaqDNA聚合酶(Perkin Elmer，Norwalk CT)，热稳定T7聚合酶(Amersham，ChicagoIL)，或重组聚合酶与校对核酸外切酶的结合例如由Gibco BRL销售的ELONGASE扩增系统(Gaithersburg MD)这样的酶。当测序或验证寡聚核苷酸的序列时(例如通过化学合成方法从头开始合成的寡聚核苷酸)，Maxam和Gilbert的方法是优选的(Maxam和Gilbert，1980，酶学方法65：499；Ausubel等人，见上文，第7章)。 
通过利用标准方法例如mRNA的逆转录将“全长”hTRT或其它cDNA克隆，随后通过将获得的cDNA克隆和测序直接测定hTRT或其它TRTmRNA的5’未转译序列。优选地用于筛选或扩增全长cDNA的寡聚(dT)引物引导的文库是优选的，其中全长cDNA已经进行了大小筛选以包含了较大的cDNA。随机引物引导的文库也是合适的并且经常包括含有基因的5’区域的克隆的较大部分。也可以使用获得5’RNA序列的其它已知的方法例如由Frohman等人，1988，美国科学院年报85：8998描述的RACE方案。如果需要，通过利用本文提供的核酸(例如具有SEQUENCE ID NO：1的序列)，采用常规方法可以测定hTRT或其它TRTmRNA的转译起始位点。一种方法是利用具有SEQUENCE ID NO：1的5’区域的序列标记的DNA进行的S1核酸外切酶分析(Ausubel等人，见上文)。 
2)核酸的化学合成 
本发明也提供了采用直接的化学合成方法生产的hTRT多聚核苷酸(RNA，DNA或修饰的)。通常化学合成方法优选地用于生产寡聚核苷酸或用于生产寡聚核苷酸和含有非链的核苷酸的多聚核苷酸(例如探针，引物和反义寡聚核苷酸)。采用本领域内技术人员已知的方法可以完成核酸的直接化学合成，例如Narang等人，1979，酶学方法68：90的磷酸三酯方法，Brown等人，敏学方法68：109(1979)的磷酸二酯方法，Beaucage等人的亚磷酰胺二酯方法，四面体通信22：1859(1981)；美国专利4458066的固相支撑的合成方法。通常化学合成产生单链寡聚核苷酸，通过与互补序列杂交，或通过用DNA聚合酶聚合和利用单链作为模板利用寡聚核苷酸引物可以将单链转变为双链DNA。本领域内技术人员将会认识到当化学合成的DNA经常限制于约100或150碱基的序列，通过连接较短的序列或采用更复杂的合成方法可以获得更长的序列。 
将会认识到利用非标准的碱基(例如除了腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤，胸腺嘧啶和尿嘧啶以外)或非标准的主架结构以提供需要的特性(例如增加的核酸酶抗性，较紧的结合，稳定性或需要的TM)可以制备本发明的hTRT(或hTR或其它)多聚核苷酸和寡聚核苷酸。用于呈现寡聚核苷酸核酸酶抗性的技术包括描述于PCT公开WO94/12633中的那些。可以生产各种各样的有用的修饰的寡聚核苷酸，包括具有肽-核酸(PNA)主架的寡聚核苷酸(Nielsen等人，1991，科学254：1497)或掺入2’-O-甲基核糖核苷酸，硫代磷酸酯核苷酸，甲基磷酸核苷酸，磷酸三酯核苷酸，硫代磷酸酯核苷酸，亚磷酰胺的寡聚核苷酸。还有其它的有用的寡聚核苷酸可以含有烷基和卤原子替代的糖成分，包括在2’位置含有下面之一：OH，SH，SCH3，F，OCN，OCH3OCH3，OCH3O(CH2)nCH3. O(CH2)nNH2或O(CH2)nCH3，其中n是从1-约10；C1到C10的低级烷基，取代的低级烷基，烷芳基，或芳烷基；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O-，S-，或N-烷基；O-，S-，或N-烯基；SOCH3，SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷基；杂环烷芳基，氨基烷基氨基；多烷基氨基；取代的甲硅烷基；RNA裂解的基团；胆甾烯基；叶酸基团；报道基团；嵌入剂；用于改善寡聚核苷酸的药物动力学特性的基团；或用于改善寡聚核苷酸的药物动态学特性的基团和具有类似的特性的其它取代可以直接偶合到，或借助于接头在任何核苷的2’部分或在3’末端或5’末端的核苷的3’或5’部分将有助于寡聚核苷酸摄取的叶酸，胆甾醇或其它基团例如脂类类似物。可以使用一个或多个这样的偶合物。寡聚核苷酸也具有模拟糖例如环丁基取代戊糖呋喃糖基。其它实施方案包括至少一个修饰的碱基形式或“通用的碱基”例如次黄苷，或包含其它的非标准碱基例如queosine和wybutosine以及乙酰基，甲基，硫代和类似的修饰的腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤，胸腺嘧啶和尿嘧啶形式，这些修饰形式不易于被内源性核酸内切酶识别。本发明进一步提供了具有主架类似物例如磷酸二酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，甲基磷酸酯，氨基磷酸酯，烷基磷酸三酯，硫酸，3’-硫代乙酰，亚甲基(methylimino)，3’-N-氨基甲酸酯，吗啉氨基甲酸酯，和手性的甲基磷酸酯，具有短链烷基或环烷基的糖间键合，短链杂原子或杂环糖间(“主架”)键合，或CH2-NH-O-CH2，CH2-N(CH3)-OCH2，CH2-O-N(CH3)-(CH2)，CH-N(CH3)-N(CH3)-CH2，和O-N(CH3)-CH2-CH2主架(其中磷酸二酯是O-P-O-CH2)，或类似的混合物的核苷。具有吗啉主架结构的寡聚核苷酸也可用(美国专利5034506)。 
有用的参考包括寡聚核苷酸，和类似物，由F.Eckstein编辑的，牛津大学出版社IRL出版(1991)的实践手册；反义方案，纽约科学院年 报，第600期，Baserga和Denhardt(NYAS 1992)；Milligan等人，1993年7月9日，医学化学杂志36(14)：1923-1937；反义研究和应用(1993，CRC出版社)，整个文献，特别是第15章，由Sanghvi发表的名称为“核酸中的杂环碱基修饰和在反义寡聚核苷酸中的应用”，反义治疗，Sudhir Agrawal编辑(Humana出版社，Totowa，新泽西州，1996)。 
D)标记的核酸 
例如当hTRT或其它寡聚核苷酸或多聚核苷酸可用作为核酸探针，标记本发明的核酸经常是有用的。采用本领域内技术人员已知的任何手段可用将标记物(参见下文)掺入。在一个实施方案中，标记了未扩增的核酸(例如，mRNA，多AmRNA，cDNA)。生产标记的核酸的手段是本领域内技术人员已知的并且包括例如缺口转译，随机引物标记，末端标记(例如利用激酶)和化学偶合(例如光生物素化)或合成。在另一个实施方案中，可以在制备核酸样品的扩增过程中同时掺入标记物。因此，例如用标记的引物或标记的核苷酸进行的聚合酶链反应(PCR)或其它核酸扩增方法将提供标记的扩增产物。在另一个实施方案中，利用标记的核苷酸(例如荧光素标记的UTP和/或CTP)的转录扩增将标记物掺入到转录的核酸。也可以或另一种可选的方法在扩增完成之后，标记扩增产物。 
E)说明性的寡聚核苷酸 
如上文说明的和下文详细讨论的，将寡聚核苷酸用于各种各样的用途，包括用作为引物，探针，治疗剂或其它反义寡聚核苷酸，三联体寡聚核苷酸和许多其它的用途，这从本文的公开是显而易见的。表2提供了可用于实施本发明的说明性的特定的寡聚核苷酸。将会认识到通过下面提供的指导，本领域内技术人员可以合成本发明的许多其它有用的寡聚核苷酸。 
表2中，“seq”是指引物已经使用，或可用于测序；“PCR”是指引物已经被使用或可用于PCR；“AS”是指引物已经被使用或可用于反义抑制端粒酶活性；“CL”是指引物已经使用的，或可用于hTRT基因或RNA克隆区域，“mut”是是引物已经使用，或可用于构建hTRT基因或基因产物的突变体。“UC”是指“上面的情况”和“lc”是指“下面的情况”。错配和插入(相对于SEQUENCE ID NO：1)由底下划线处表明；缺失由“-”表示。将会认识到在表2中没有任何指示计划用于将特定的寡聚核苷酸限制到单一的用途或几种用途。 
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IV.TRT蛋白质和肽 
A)总的说明 
本发明提供了特别可用于端粒酶活性的生产，细胞中端粒酶活性的抑制，抗hTRT免疫应答的诱导，作为治疗试剂，作为诊断测试中的标准或对照，作为能够活化或抑制hTRT或端粒酶的活性的化合物的筛选中的靶和许多本领域技术人员明了的或本文另外叙述的许多其它用途的各种各样的hTRT蛋白质。本发明的hTRT功能上包括活性蛋白质(用于，例如，在端粒酶阴性细胞中给予端粒酶活性)和变异体，失活变异体(用于例如，在细胞中抑制端粒酶活性)，hTRT多肽，和端粒酶RNP(例如，含有蛋白质的核糖核蛋白复合物)，这些蛋白质显示了一个，几个，或所有天然存在的hTRT和端粒酶的功能活性，如下面为了说明更详细的讨论。 
在一个实施方案中，本发明的hTRT蛋白质是具有附图17中阐述的序列(SEQUENCE ID NO：2)或其片断的多肽。在另一个实施方案中，hTRT多肽与SEQUENCE ID NO：2由于氨基酸残基缺失，插入，或保守替代而不同。在相关的实施方案中，本发明提供了与SEQUENCE ID NO：2基本相似的hTRT多肽。本发明进一步提供了相对于SEQUENCE ID NO：2的氨基酸序列相被修饰hTRT多肽，这些多肽是以一些方式，例如截短，突变，派生或或与其它序列融合(例如，形成融合蛋白质)而修饰的。另外，本发明提供了含有与模板RNA(例如，hTR)复合的本发明的hTRT蛋白质的端粒酶RNP。在其它实施方案中，一个或多个端粒酶相关蛋白质与hTRT蛋白质和/或hTR相关。 
本发明也提供其它天然存在hTRT种类或非天然存在变异体，如具有SEQUENCE ID NO：5[附图20]，SEQUENCE ID NO：10[附图19]，和其片断，变异体或衍生物的序列或基本相似序列和蛋白质。 
本发明仍然提供其它hTRT种类和变异体。一个hTRT变异体的例子可能来自克隆712562(SEQUENCE ID NO：3[附图18])编码的mRNA的核糖体移码突变，或SEQUENCE ID NO：4[附图20]显示的pro90变异体hTRT并且这样导致了含有所有TRT基序的hTRT多肽的合成(一个普通的例子，参见，例如，Tsuchihashi等人，1990，美国科学院年报，87：2516；Craigengen等人，1987，细胞50：1；Weiss，1990，细胞62：117)。当特异mRNA序列或次级结构引起核糖体在序列“垛叠”和朝前或向后跳过一个核苷酸时可能发生核糖体移码突变。所以，甚至在712562mRNA上的核糖体移码突变可能引起约523个氨基酸残基多肽的合成。甚至在pro90序列上的核糖体移码可以导致含有约1071个残基的蛋白质。来自核糖体移码突变的蛋白质也可以通过本发明提供的合成或重组技术表达是很明了的。 
人TRT蛋白质，肽，和功能等当蛋白质可以通过纯化，化学合成，或重组生产获得，如下面更详细的讨论。 
B)TRT蛋白质活性 
本发明的TRT多肽(包括片断，变异体，可替代等位基因，和融合蛋白质的产物)可能具有一个，或多个，或所有与天然hTRT相关的功能活性。除非另有说明，如本文使用的，如果由没有结合的RNA(例如hTR)的hTRT的或在hTRT结合的RNA(例如，hTR)复合物中显示活性，认为hTRT或其他TRT多肽具有特定活性。hTRT的hTR结合活性是与hTRT蛋白质相关的活性的例子。如上所述叙述了生产本发明的核酸(例如，hTR)的和hTRT多肽的复合物方法。 
与天然hTRT具有不同活性补充的hTRT蛋白质的修饰(例如，通过化学或重组手段，包括编码hTRT多肽的多核苷酸的突变或修饰或具有与天然多肽序列不同的序列多肽的化学合成)可以用于治疗应用或筛选 hTRT或端粒酶活性的特异调节物的筛选。另外，各种hTRT活性的测试可以特定地用于与hTRT或端粒酶相互作用以便改变端粒酶的活性的试剂(例如，活性调节剂)的鉴定，。 
如下面讨论天然hTRT的活性包括端粒酶催化活性(也可以是持续的或非持续的活性)；端粒酶的持续合成能力；常规逆转录酶活性；溶核活性；引物或底物(端粒或合成端粒酶底物或引物)结合活性；dNTP结合活性；RNA(即，hTR)结合活性；和蛋白质结合活性(例如，结合端粒酶相关蛋白质，结合端粒蛋白质，或端粒蛋白质DNA复合物)。但是，将理解的是本发明也提供没有任何特定hTRT活性但具有一些与hTRT或其它TRT蛋白质(例如，一些通常短免疫原肽，抑制肽)相关的有用活性的hTRT组合物。 
1)端粒酶催化活性 
正如本文所用，本发明的多肽具有“端粒酶催化活性”，这时该多肽通过加入部分，一个，或一个以上模板核酸(例如，hTR)编码的序列(例如TTAGGG)的重复，能够延伸功能为端粒酶底物的DNA引物。这一活性可以是持续的或非持续的。当RNP端粒酶在酶复合物释放DNA以前在引物或端粒酶中加入多重重复则出现持续的活性。当端粒酶在引物中加入部分或只有一个重复然后释放端粒酸时发生非持续活性。但是，在体内非持续反应可以通过连续循环的结合，延伸和分解加入多重重复。这同时发生在体外，通常在标准测试中观察不到，因为在标准测试条件下引物的摩尔数大大超过端粒酶。 
为了鉴定hTRT多肽是否具有非持续活性，利用有利于非持续反应的条件，例如高温(即，35-40℃，通常37℃)，低dGTP浓度(1μM或更少)，高引物浓度(5微摩尔/升或更高)，高dATP/TTP浓度(2毫摩尔浓度或更高)进行常规端粒酶反应，温度和dGTP通常具有最大效果。 为了鉴定hTRT多肽具有持续活性，利用有利于持续反应的条件，(例如，27-34℃，通常30℃)，高dGTP浓度(10微摩尔浓度/升或更高)，低引物浓度(1微摩尔浓度/升或更低)，和/或低dATP和TTP浓度(0.3-1毫摩尔浓度)，进行常规端粒酶反应通常，温度和dGTP的浓度是最关键的。可替代地，TRAP测试(用于持续或适度持续活性)或点印迹和凝胶印迹测试(用于持续活性)可以利用。本发明的hTRT多肽可以具有非持续活性，但不是持续活性(例如，如果hTRT多肽的改变减少或消除易位的能力)，可能是只是持续或可能具有两个活性。 
a)非持续活性 
非持续端粒酶催化活性可以从3’末端退火到RNA模板的位置到模板序列的5’末端延伸DNA引物，通常加入第一个G残基终止(如，例如当模板是hTR)。如表3所示，加入准确数目的核苷酸是依赖于在TTAGGG重复序列中的引物的3’终止核苷酸的位置。 
表3 
                  非持续活性 
i)---------TTAGGGttag(DNA) 
      3′-----AUCCCAAUC--------5′(RNA) 
ii)---------TTAGggttag  (DNA) 
      3′-----AUCCCAAUC--------5′(RNA) 
在DNA中，UC＝引物，lc＝加入的核苷酸 
所以，在TTAGGG引物(i)中加入4个核苷酸，而在TTAG引物(ii)中加入6个核苷酸。在持续反应中通过端粒酶加入的第一个重复与这一步骤相等；但是，在持续反应中，端粒酶进行了易位步骤，其中在 足以引导加入另一个重复的位置中的模板的3’区释放和再结合3’末端(参见，Morin，1997，欧洲癌症杂志，33：750)。 
利用单个合成引物在常规测试中完全的非持续反应仅生产一个谱带。因为，这一结果也可以通过其它酶产生，如终端转移酶活性，在一些应用中它可以如人所愿地证明该产物是端粒酶催化活性的结果。产生谱带的端粒酶(含有hTRT)可以从几个其它特征区别。加入到引物末端的核苷酸的数目应该与引物3’末端的位置一致。所以，TTAGGG引物应该具有加入的4个核苷酸，和TTAG引物应该具有6个加入的核苷酸(参见上面)。在实际上，两个或多个序列置换引物可以利用，它们具有同样完全的长度但具有不同的5’和3’终点。正如说明性例子，引物5’-TTAGGGTTAGGGTTAGGG和5’-GTTAGGGTTAGGGTTAGG的非持续延伸将产生产物，它们的绝对长度将是一个核苷酸的差异(在5’-TTAGGGTTAGGGTTAGGG中加入4个成为22个核苷酸总长度，在5’-GTTAGGGTTAGGGTTAGG中加入5个成为23个核苷酸长度)。反应与核苷酸的依赖性应该与引物终端的位置一致。所以，——TTAGGG引物产物应该需要dGTP，TTP，和dATP，但不是dCTP，和——AGGGTT引物产物应该需要dGTP和dATP，但不是TTP或dCTP。该活性应该对降解hTRT和因此去除模板的条件下的RNAase或微球菌核酸酶预处理是敏感的(参见，Morin，1989，细胞59：521)。 
b)持续活性 
在实际中，通过在常规测试，TRAP测试，或凝胶印迹测试中六个核苷酸序列梯的出现是容易观察到持续的活性的。点印迹也可以利用，但有这样的方法检测不到序列梯。在Morin，1989，细胞59：521叙述了常规测试，该文献全部引入本文用于所有目的。在美国专利号，5,629,154中叙述了TRAP测试，同时参见，PCT公开WO97/15687，PCT公开 WO95/13381；Krupp等人，核酸研究，1997，25：919；和Wright等人，1995，核酸研究，23：3794，其中每篇全部引入本文，并用于所有目的。点影印测试可以在这样的方式中使用：其中利用化合物或hTRT变异体测试不加入用于检测活性的(CCCUAA)探针稳定杂交需要的3个或更多重复的非持续活性，以便确定它是否产生持续合成能力，即，是否该探针检测预期的端粒酶底物，然后，该化合物或突变体能够改变非持续活性成为持续活性。其它持续性端粒酶催化活性的测试也可以利用，例如Tatematsu等人的伸展PCR测试，1996，癌症基因，13：2265。凝胶影印测试，常规和点影印测试的结合也可以利用。在这样变化中，利用非放射性核苷酸和高dGTP浓度(例如，0.1-2毫摩尔浓度)进行常规测试。在进行常规测试后，通过变性PAGE分离合成的DNA和转移到膜(例如，硝酸纤维膜)。然后，端粒DNA(端粒酶的产物-延伸的端粒酶引物或底物)可以通过方法例如利用标记的端粒DNA探针(例如，含有CCCTAA序列的探针，如点影印测试最所用，出处同上)杂交的方法检测，这一技术的优点是它比常规测试更敏感，并且提供关于合成片断的大小和反应的持续合成能力的信息。 
c)活性确定 
利用非纯化，部分纯化或基本纯化的hTRT多肽(例如，在hTR的结合中)，体外，或在体内表达后可以确定hTRT多肽的端粒酶活性。例如，在细胞中的端粒酶活性(例如，表达本发明的重组hTRT多肽的细胞)可以通过检测端粒的长度的增加或降低进行测试测试。通常利用与hTR复合的hTRT进行端粒酶催化活性的测试；但是，可以替代可选择的端粒酶模板RNA，或者可以进行测试以便测量另一个活性，如端粒酶引物结合。确定端粒的长度的测试是本领域已知的，并且包括探针与端粒DNA的杂交(可以包括扩增步骤)和TRF分析，即，在限制性核酸 内切酶消化后分析端粒DNA限制片断[TRFs]，参见PCT公开WO93/23572和WO96/41016；Counter等人，1992，EMBO J.11：1921；Allsopp等人，1992，美国科学院年报，89：10114；Sanno，1996，临床病理学杂志，106：16和Sanno，1997，神经内分泌学，65：299。 
以许多方法利用出处同上的测试和其它端粒酶催化活性测试可以确定hTRT多肽的端粒酶催化活性。根据一个方法，在端粒酶阴性人细胞中表达了hTRT蛋白质(例如，如下文描述)，其中hTR得到表达(即，在细胞中正常地或通过重组表达)，确定了在细胞或细胞溶菌物中存在或缺乏端粒酶活性。合适的端粒酶阴性细胞的例子是IMR90(ATCC，#CCL-186)或BJ细胞(人包皮成纤维细胞系；参见例如，Feng等人，1995，科学269：1236)。其它例子包括视黄醛色素上皮细胞(RPE)，人脐静脉内皮细胞(HUVEC；ATCC#CRL-1730)，人动脉内皮细胞(HAEC；Clonetics公司，#CC-2535)，和人哺乳动物上皮细胞(HME；Hammond等人，1984，美国科学院年报，81：5435；Stampfer，1985，组织培养方法杂志，9：107)。在可替代的实施方案中，hTRT多肽在端粒酶阳性细胞中得到表达(例如，通过利用hTRT表达载体转染)，并且与非转染对照细胞相比该细胞中端粒酶活性的提高得到检测，如果该多肽具有端粒酶催化活性的话。通常，在利用表达hTRT的适当表达载体转染的细胞中端粒酶催化活性将明显地提高，如至少提高约2倍，至少约5倍，或者甚至至少10倍到100倍或甚至1000倍地高于非转染(对照)细胞。 
在可替代的实施方案中，在细胞中表达了hTRT蛋白质(例如，端粒酶阴性细胞，其中hTR得到了表达)，它是具有可以辅助纯化的标记或表位标记”的融合蛋形式白(参见下文)。在一个实施方案中，利用特异地识别标记的抗体从细胞回收RNP。优选地标记通常是短或小的，并 且可以包括切割位点或其它特性，允许从hTRT多肽除去标记。适当的标记的例子包括XpressTM表位(Invitrogen，公司，圣地亚哥CA)，和其它成分，可以特异地通过抗体或核酸或其它相当的方法如实施例6中所述的那些结合。可选择的标记包括那些通过插入序列例如，进入ATG密码子上游的SEQUENCE ID NO：1的编码的那些，ATG密码子启动SEQUENCE ID NO：2的蛋白质的翻译，该蛋白质可能包括在上游序列中插入(新)甲硫氨酸启动密码子。 
将会认识到，当hTRT变异体在细胞中得到表达(例如，融合蛋白)和随后分离(例如，作为核糖核蛋白复合物)，其它细胞蛋白质(即，端粒酶结合蛋白)可以结合(直接或间接结合)分离的复合物。在这样的情况中，有时测试对含有hTRT，hTR和结合蛋白质的复合物的端粒酶活性是令人满意的。 
2)其它端粒酶或TRT蛋白质活性 
本发明的hTRT多肽包括缺乏端粒酶催化活性但保留一个或多个其它端粒酶的活性的变异体。这些其它活性和本发明用于测量这些活性的方法包括(但不限于)那些在下面的章节中讨论的。 
a)常规逆转录酶活性 
在例如Morin，1997，出处同上，和Spence等人，1995，科学267：988中叙述了端粒酶常规逆转录酶活性。因为hTRT含有保守的氨基酸基序，这些基序是逆转录酶催化活性所需要的，hTRT具有转录一些外源(例如，非hTR)RNA的能力。常规RT测试测量了通过延伸退火的DNA引物转录RNA模板的酶的能力。逆转录酶活性可以在许多本领域已知的方法中得到测量，例如，通过监测标记核酸引物(例如，RNA或DNA)的大小增加，或将标记dNTP的插入，参见例如，Ausubel等人，出处同上。 
因为hTRT特异地结合hTR，可以令人满意的是用于常规RT测试的DNA引物/RNA模板可以进行修饰从而具有与hTR和/或端粒DNA引物相关的特征。例如，RNA可能具有序列(CCCTAA)n，其中n至少是1，或至少是3，或至少是10或更多。在一个实施方案中，(CCCTAA)n区是在或在RNA的5’末端的附近(相似于端粒酶RNA的模板区的5’定位)。相似地，DNA引物可能具有含有TTAGGG端粒序列，例如XnTTAG，XnAGGG，Xn(TTAGGG)qTTAG，等等的部分的3’未端，其中X是非端粒序列，和n是8-20，或6-30，和q是1-4。在另一个实施方案中，DNA引物具有5’未端，它与RNA模板是非互补的，以致当引物与RNA退火，引物的5’末端保持未结合。标准逆转录测试的其它修改方法可以应用于本发明的方法，并且是本领域已知的。 
b)溶核活性 
在例如Morin，1997，出处同上，Collins和Grieder，1993，基因和发展，7：1364中叙述了端粒酶溶核活性。端粒酶具有溶核活性(Joyce和Steitz，1987，生物化学科学趋势，12：288)；但是，端粒酶活性具有确定的特征。在人和四膜虫中，当DNA的3’末端定位于DNA模板序列的5’边界时，端粒酶优选地通常只从寡核苷酸的3’未端除去一个核苷酸，这一核苷酸是端粒重复(在人中的TTAGG)的第一个G。端粒酶优选地除去G残基，但具有对其它核苷酸的溶核活性。这一活性可以进行检测。本文为了说明叙述了两个不同的方法。一个方法包括含有结合全部模板序列的引物(即，终止在模板边界；在人中的5’-TAGGGATTAG)的常规端粒酶反应。溶核活性是通过利用测试中提供的放射性标记dGTP对最后dG残基的替代进行监测的。通过凝胶电泳和放射白显影显示的起始引物的大小的谱带的出现检测该替代。 
优选的方法利用了具有不能通过端粒酶延伸的“封闭的”3’末端 的DNA引物。3’封闭引物可以用于标准端粒酶测试但将不延伸除非通过端粒酶的溶核活性除去3’核苷酸。这一方法的优点是通过任何几个标准方法可以检测端粒酶的活性，并且信号是强的和容易定量的。以几个方法可以完成引物3’未端的封闭。一个方法是利用标准低聚核苷酸合成技术在引物的3’未端加入3’脱氧d-NTP残基。这一未端具有2’OH但不是端粒酶需要的3’OH。其它封闭3’末端的方法存在例如，3’双脱氧未端，3’氨未端，和其它。hTRT溶核测试的引物的例子是5’-TTAGGGTTAGGGTTA(G3’H)，其中最后的残基是3’脱氧-鸟苷残基(Glen Research，Sterling，VA)。基于公开物的适当引物的许多其它变化是本领域技术人员已知的。 
c)引物(端粒)结合活性 
在例如，Morin，1997，出处同上；Cnllins等人，1995，细胞81：677；Harrington等人，1995，生物化学杂志，270：8893中叙述了端粒酶引物(端粒)结合活性。确认端粒酶是具有两个结合端粒DNA引物的位点的。RT基序与引物结合关系表明hTRT和/或hTRT/hTR具有DNA引物结合活性。存在几种测试引物结合活性的方法；但是，大多数方法的一个常见步骤是利用hTRT或hTRT/hTR或其它TRT/TR联合在适当的结合条件下与标记的DNA引物温育。同时，大多数方法利用的手段是将结合蛋白质的DNA与未结合的DNA分离开；这些方法包括下面内容： 
I)凝胶变动测试(同时称为电泳/迁移变动测试)，其中通过在非变性凝胶上电泳将结合蛋白质的DNA引物与未结合的DNA引物分离(Ausubel等人，出处同上)。 
ii)基质结合测试包括基本技术的几个变化，包括在用标记引物温育之前或之后，hTRT或hTRT/hTR复合物结合到基质(例如，硝酸纤 维素)。通过将hTRT结合到基质上，可以将结合引物机械地与未结合引物分离。通过在定量之前洗涤膜可以除去残留的未结合DNA。技术人员将认识到存在几个方法可以将蛋白质与这样的基质，固体支持物，和膜偶联，包括化学，光化学，UV交联，抗体/表位，和非共价(疏水，静电，等等)相互作用。 
DNA引物可以是任何具有端粒酶亲和力的DNA，例如，端粒DNA类似引物(TTAGGG)n，其中n可以是1-10，通常是3-5。3’和5’末端可以在重复序列的任何位置结束。引物也可以具有可以简化标记或检测的非端粒DNA的5’或3’延伸。引物也可以是派生，例如，有助于简化检测或分离。 
d)dNTP结合活性 
在例如，Morin，1997，出处同上；Spence等人，出处同上描述了端粒酶dNTP结合活性。端粒酶需要dNTP以合成DNA。hTRT蛋白质具有核苷酸结合活性并且可以在相似于其它核苷酸结合蛋白质的方法中测试与dNTP结合(Kantrowitz等人，1980，生物化学科学趋势5：124)。通常，标记dNTP或dNTP类似物的结合可以如本领域已知用于非端粒酶RT蛋白质的方法进行检测。 
e)RNA(即，hTR)结合活性 
在例如，Morin，1997，出处同上；Harrington等人，1997，科学275：973；Collins等人，1995，细胞81：677中叙述了端粒酶RNA(即，hTR)的结合活性。本发明的TRT蛋白质的RNA结合活性可以在相似于出处同上叙述的DNA引物结合测试，其中利用标记的RNA探针进行测试。分离结合和未结合RNA和检测RNA的方法是本领域已知的，并且可以用于在相似于DNA引物结合测试叙述的方法中进行本发明的活性测试。RNA可以是全长hTR，hTR片断或其它已证明具有端粒酶或hTRT亲和力 的RNA。参见，美国专利号5,583,016和PCT公开号96/40868。 
3)作为靶的端粒酶基序 
如前面说明的本发明，除了提供了含有全部活性互补(出处同上叙述)的重组hTRT以外，还提供了具有少于天然存在端粒酶或hTRT或其它TRT蛋白质的端粒酶活性的全部补充的hTRT多肽。将会认识到，考虑到本文公开的RT和TRT的端粒酶特异基序，保守氨基酸残基的变化或突变例如在出处同上讨论的基序序列中发现的，将导致用于治疗，药物筛选和鉴定和其它用途的活性突变体的损失。例如，在实施例1中所述，在粟酒裂殖酵母中内源TRT基因的RT区中的基序B到D的缺失产生了单倍体细胞，在这些细胞中端粒逐渐缩短成为点，其中端粒探针与端粒重复的杂交变得几乎不可检测，表明失去了端粒酶催化活性。同样，在基序E的WxGxS位点中的变化可以影响端粒酶DNA引物结合或功能。另外，在基序A，B’和C中的氨基酸的变化可以影响端粒酶的催化活性。hTRT的DD基序的突变可以明显减少或消除端粒酶活性(参见实施例16)。 
C)hTRT和其它TRT多肽的合成 
本发明提供了各种产生本文公开的hTRT和其它TRT多肽的方法。在下面的章节中，较为详细地叙述了hTRT蛋白质包括融合蛋白的化学合成和重组表达。 
1)化学合成 
本发明提供了利用本领域技术人员已知常用化学方法全部或部分合成的hTRT多肽(参见，例如，Caruthers等人，1980，核酸研究，Symp.Ser.215-223；和Horn等人，1980，核酸研究Symp.Ser.225-232)。例如，利用各种固相技术可以进行肽合成(Roberge，等人，1995，科学，269：202)，包括自动合成(例如，利用Perkin Elmer ABI431A肽合成 仪，根据制造商提供的说明)。当需要全长蛋白质时，可以通过将一个分子的氨基末端与另一个分子的羧基末端缩合形成肽键将较短的多肽融合。 
例如通过制备性的高效液相层析(例如，Creghton，蛋白质结构和分子原理，WH Freeman和Co，纽约，NY[1983])基本纯化新合成的肽。可以通过氨基酸分析或测序(例如，埃德曼降解过程；Creighton，出处同上)证明合成肽(或本发明的任何其它肽或多肽)的组成。重要的是，在直接合成和/或利用化学方法与来自其它蛋白质或其任何部分，或为了任何目的的序列结合可以改变hTRT的氨基酸序列或其任何部分，以便产生本发明的变异体多肽。 
2)hTRT和其它TRT蛋白质的重组表达 
本发明提供了用于表达hTRT多肽的方法，试剂，载体和细胞和利用体外(无细胞)，体外或体内(基于细胞或生物体)的重组表达系统的核酸。在一个实施方案中，hTRT蛋白质或其片断的表达包括在适当的表达载体(即，含有利用的表达系统需要的插入编码序列的转录和翻译的必需因子的载体)中插入编码序列。所以，在一个方面，本发明提供了序列与hTRT基因编码序列至少与本发明的hTRT cDNA的25个核苷酸基本相同的聚核苷酸，并且优选地对于许多应用基本相同的50到100个核苷酸，或更多，该聚核苷酸可操作地连接启动子形成能够表达hTRT多肽的转录单位。本领域技术人员已知的方法可以用于构建含有本发明提供的hTRT序列和适当转录或翻译控制的表达载体(参见，例如，Sambrook等人，出处同上，Ausubel等人，出处同上，和本公开物)。 
本发明提供的hTRT多肽包括含有hTRT蛋白质的hTRT多肽或片断的融合蛋白质。通常通过重组手段产生融合蛋白质，虽然它们也可以通过化学合成产生。融合蛋白质可以用于提供hTRT多肽构建体的增强 的表达，或用于生产具有其它需要的特性例如含有标记(例如酶报道基团)，结合基团，或抗体表位的hTRT多肽。举证的融合蛋白质，含有hTRT和增强的绿荧光蛋白质(EGFP)序列在实施例15中(出处同上)中叙述了。对于一个技术人普通员将能理解的是实施例15中和本文讨论的用途和应用不限于特定的融合蛋白，但说明了各种融合构建体的用途。 
本发明的融合蛋白系统也可以用于简化有效地生产和分离hTRT蛋白质或肽。例如，在一些实施方案中，融合蛋白的非hTRT序列部分含有短肽，该短肽可以特定地结合固定分子，以致融合蛋白质可以与未结合的成分分离(例如，在细胞溶菌物中的不相关的蛋白质)。一个例子是结合特异性抗体的肽序列。另一个例子是含有痕量聚组氨酸例如(His)6或组氨酸-色氨酸序列的肽，可以和含有镍或铜离子的树脂结合(即，金属螯合亲和层析)。其它例子包括蛋白质A区或片断，它允许在固定的免疫球蛋白上纯化和用于FLAGS扩展/亲和纯化系统上纯化(Immunex Corp，西雅图WA)的区域。在一些实施方案中，融合蛋白质包括切割位点以致hTRT或其它TRT多肽序列可以容易地从非hTRT肽或蛋白质序列中分离。在这种情况中，切割可以是化学(例如，溴化氰，2-(2-硝基苯suphenyl)-3-甲基-3’-溴indolene，氢氧化铵，或低pH)或酶切割的(例如，Xa因子，肠激酶)。融合和切割系统的选择可以部分地依赖正在表达的hTRT多肽的部分(即，序列)。在Ausubel等人，出处同上，第16章，Kroll等人，1993，DNA细胞生物学，12：441，和Invitrogen1997目录(invitrogen Inc，圣地亚哥，CA)一般地叙述了融合蛋白质。在下文实施例6中提供了其它举证的本发明的融合蛋白质，它们含有表位标记或标记和切割位点。 
本领域技术人员将会认识到虽然在这一部分讨论的表达系统是集中在hTRT多肽的表达，同样或相似的细胞，载体和方法可以用于表达本 发明的hTRT聚核苷酸，包括有意义和反义聚核苷酸，不一定需要产生hTRT多肽。通常，多肽的表达需要适当的起始密码子(例如，甲硫氨酸)，开放读码框架，和翻译调节信号(例如，核糖体结合位点，终止密码子)，当不需要核酸序列翻译产生蛋白质时删除转译调节信号是令人满意的。 
可以进行hTRT多肽和聚核苷酸的表达以便达到本发明提供的任何几个相关的优点。一个说明性的优点是从它们表达的细胞中随后分离的hTRT多肽的表达(例如，用于产生大量的hTRT用作疫苗或用于筛选应用以便鉴定调节端粒酶活性的化合物)。第二个说明性优点是在细胞中表达hTRT以便改变细胞的表现型(如在基因治疗应用中)。非哺乳动物细胞可以用于hTRT的表达以便纯化，而真核尤其是哺乳动物细胞(例如，人细胞)可以不仅用于分离和纯化hTRT而且用于表达hTRT，这时在细胞中表现型的改变是需要的(例如，为了实现如基因治疗应用中的增殖能力中的变化)。通过说明和非限制，具有一个或多个端粒酶活性的hTRT多肽(例如，端粒酶催化活性)可以在寄主细胞中表达从而增强细胞的增殖能力(例如，使细胞永生)和相反，hTRT反义聚核苷酸或抑制剂多肽通常可以表达以便减少细胞(例如，端粒酶阳性恶性肿瘤细胞)的增殖能力。本文叙述了许多特异的应用，例如，在本发明的下面的治疗应用的试剂和方法的用途的讨论中)。 
本发明的说明性有用的表达系统(细胞，调节因子，载体和表达)包括许多无细胞系统如网织红细胞溶菌物和麦胚系统，它们根据本领域已知的通常方法利用hTRT聚核苷酸(参见，例如Ausubel等人，出处同上，第10章)。在可替代的实施方案中，本发明提供了用于在原核或真核细胞中表达hTRT的试剂和方法。所以，本发明提供了编码hTRT聚核苷酸，蛋白质，蛋白质亚序列或融合蛋白的核酸，这些核酸可以 在细菌，真菌，植物，昆虫，和动物，包括本领域已知的人细胞表达系统，包括分离细胞，细胞系，细胞培养物，组织，和整个生物体中表达。正如那些技术人员将能够理解的，对于每个寄主或无细胞系统，导入寄主细胞或无细胞表达系统的hTRT聚核苷酸将通常可操作地连接适当的表达控制序列。 
有用的细菌表达系统包括大肠杆菌，杆菌(如枯草芽孢杆菌)，其它肠细菌科(如沙门氏菌，沙雷氏菌，和各种假单胞菌种类)或其它细菌寄主(例如，德氏乳杆菌乳亚种，德氏乳杆菌乳亚种，唾液链球菌嗜热亚种，噬柠檬酸明串珠菌，肠膜明串珠菌，嗜酸乳杆菌，德氏乳杆菌乳亚种，双歧双歧杆菌，短双歧杆菌，和长双歧杆菌)。用于原核生物中的hTRT表达构建体包括重组细菌噬菌体，质粒或柯斯质粒DNA表达载体，或诸如此类，和通常包括启动子序列。说明性的启动子包括可诱导启动子，如lac启动子，Bluescript7噬菌粒的杂合体lacZ启动子[Stratagene，La Jolla CA]或pSport1[Gibco BRL]；噬菌体λ启动子系统；色氨酸(trp)启动子系统；和ptrp-lac杂合体和诸如此类。细菌表达构建体非强制性地包括核糖体结合位点和转录终止信号调节序列。用于表达的特异载体的说明性例子包括例如pTrcHis2，(Invitrogen，圣地亚哥CA)，pThioHis A，B和C，和许多本领域技术人员已知的其它例子或可以是开发的(参见，例如，Ausubel)。细菌的有用的载体包括那些简化hTRT融合蛋白质的生产的载体。在细菌细胞中高水平表达融合蛋白质的有用的载体包括但不限于多功能大肠杆菌克隆和表达载体如Bluescript7(Stratagene)，如上面注意到的，其中编码hTRT蛋白质，和hTRT融合蛋白质或hTRT片断的序列可以连接到含有氨基末端的Met和随后的7个β半乳糖苷的残基的序列的载体的框架内，以致产生了杂合体蛋白质(例如，pIN载体；Van Heeke和Schuster，1989，生 物化学杂志，264：5503)。载体如pGEX载体(例如，pGEX-2TK；Pharmacia生物技术)也可以用于表达外源多肽，如hTRT蛋白质，如含有谷胱苷肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白。通过吸收到谷胱苷肽-琼脂糖小珠上，接着在存在游离谷胱苷肽时洗脱这样的融合蛋白可以从溶解细胞中纯化。在这样的系统中产生的蛋白质经常包括肠激酶，凝血酶，或Xa因子蛋白酶切割位点，以致需要的克隆的多肽可以从GST成分中如愿释放，正如可以用于纯化或其它应用。其它例子是含有hTRT和大肠杆菌麦芽糖结合蛋白质(MBP)或大肠杆菌硫氧还蛋白的融合蛋白。实施例6(见下文)中提供了用于细菌细胞的hTRT表达构建体的说明性例子。 
本发明进一步提供了在真菌系统中表达的hTRT多肽，如Dictyotelium和优选地，酵母，如啤酒酵母，巴斯德毕赤氏酵母，洪密氏圆酵母，脆壁糖酵母，乳酸糖酵母，多形汉逊氏酵母和假热带假丝酵母。当在酵母中表达hTRT时，许多适当的载体是可得的，包括质粒和酵母人工染色体(YAC)载体。正如所需要的，该载体通常包括表达控制序列，如组成性或可诱导启动子(例如，如α因子，乙醇氧化酶，PGH，和3-磷酸甘油酸激酶，或其它糖酵解酶)，和复制原点，终止序列和诸如此类。用于毕赤氏酵母的适当载体包括pPICZ，His6/pPICZB，pPICZα，pPIC3.5K，pPIC9K，pA0815，pGAP2A，B和C，pGAP2αA，B，和C(Invitrogen，圣地亚哥，CA)和许多本领域已知的其它载体或有待开发的。在一个实施方案中，将载体His6/pPICZB(Invitrogen，圣地亚哥，CA)用于在巴斯德毕赤氏酵母中表达His6-hTRT融合蛋白。用于酵母中的载体的例子是pYES2(Invitrogen，圣地亚哥，CA)。用于酵母中的hTRT表达构建体的说明性例子是在实施例6中出处同上提供的。 
本发明的hTRT多肽也可以在利用植物或植物病毒表达载体(例如， 椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)转染或利用细菌表达载体(例如，Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统中表达。在利用植物病毒表达载体的情况中，可以通过许多启动子驱动hTRT编码序列的表达。例如，病毒启动子如CaMV的35S和19S启动子(Brisson等人，1984，自然，310：511-514)可以单独或与来自TMV的Ω引导序列结合使用(Takamatsu等人，1987，EMBO J.6：307-311)。可选择，可以利用植物启动子如来自RUBISCO的小亚基的(Coruzzi等人，1984，EMBOJ.3：1671-1680；Broglie等人，1984，科学224：838-843)或热休克启动子(Winter和Sinibaldi，1991，Results Probl.Cell Differ.，17：85)，或储藏蛋白质基因启动子。通过直接DNA转化或致病原介导的转染这些构建体可将导入植物细胞(这样的技术的综述，参见Hobbs或Murry，1992，在科学技术McGraw Hill年书，McGraw Hill纽约NY，191-196[1992]；或Weissbach和Weissbach，1988，植物分子生物学方法，学术出版社，纽约，NY，421-463)。 
本发明提供的用于hTRT蛋白质的表达另一个表达系统是昆虫系统。优选的系统利用杆状病毒多角体启动子。在一个这样的系统中，将Autographa californica核多角体病毒(AcNPV)用作载体在Spodoptera frugiperda细胞或在Trichoplusia幼虫中表达外源基因。可以将编码需要的基因的序列克隆进入病毒的非必要区，如多角体基因，并置于多角体启动子的控制下。例如编码hTRT蛋白质的序列的成功插入将使多角体基因失活和产生缺乏包衣蛋白质的重组病毒。然后，将重组病毒用于感染S.frugiperda细胞或Trichoplusia幼虫，其中然后表达hTRT序列(参见，一般方法，Smith等人，病毒学杂志，46：584[1983]；Engelhard等人，美国科学院年报，91：3224-7[1994])。有用的杆状病毒表达载体包括pBlueBacHis2A，B和C，pBlueBac4.5， pMelBacB和许多本领域已知的其它载体或有待开发的。下文实施例6中提供了用于昆虫细胞的hTRT表达构建体的说明性例子。 
本发明同时提供了哺乳动物和哺乳动物细胞中的表达系统。如上面注意到，在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中可以表达hTRT聚核苷酸以便产生显著量的hTRT多肽(例如，用于纯化)或改变靶细胞的表现型(例如，为了基因治疗，细胞不灭，或其它)。在后来的情况中，表达的hTRT聚核苷酸可以或可以不编码具有端粒酶催化活性的多肽。那就是表达可以是有意义或反义聚核苷酸，抑制或刺激多肽，含有零，一种或多种端粒酶活性的多肽，和其它本文公开的或这一公开物的综述基础上的技术人员明了的联合和变异体。 
适当的用于表达本发明的核酸的哺乳动物寄主组织培养细胞包括任何正常的可灭或正常或不正常不灭动物或人细胞，包括SV40(COS-7，ATCC CRL1651)转化的猴肾CV1系；人胚胎肾系(193，Graham等人，基因病毒杂志，36：59(1977))；幼小仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；CHO(ATCC CCL61和CRL 9618)；小鼠足细胞(TM4，Mather，生物再生，23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL1587)；人子宫癌细胞(HeLa，ATCC CCL2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)；水牛大鼠肝细胞(Hep G2，HB8065)；人肺细胞(W138，ATCC CCL75)；人肝细胞(Hep G2，HB8065)；小鼠乳房癌(MMT060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather，等人，纽约科学院年报383：44-46(1982)；MDCK细胞(ATCC CCL34和CRL6253)；HEK293细胞(ATCC CRL1573)；和WI-38细胞(ATCC CCL75；ATCC：美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)。通常在Winnacker，从基因到克隆(VCH出版，纽约，纽约1987)中讨论了为了表达多肽而利用哺乳动物组织细胞培养物。 
对于哺乳动物寄主细胞，提供了基于病毒和非病毒表达系统。非病毒载体和系统包括质粒和附加型载体，它们通常含有表达蛋白质或RNA的表达盒，和人人工染色体(参见例如，Harrington等人，1997，NatGenet 15：345)。例如，用于表达哺乳动物细胞中(例如人)中的hTRT聚核苷酸和多肽的表达的非病毒载体包括pcDNA3.1/His，pEBVHisA，B和C(Invitrogen，圣地亚哥，CA)，MPSV载体，在Invitrogen1997目录中叙述的其它载体(Invitrogen Inc.圣地亚哥CA)，以它的全部引入本文，和许多本领域已知的其它载体。在下文实施例6中，提供了用于哺乳动物细胞中的hTRT表达构建体的说明性例子。 
有用的病毒载体包括基于逆病毒，腺病毒，腺结合病毒，疱疹病毒，基于SV40的载体，乳头状瘤病毒，HBP EB病毒，痘苗病毒载体和Semliki森林病毒(SFV)的载体。SFV和痘苗载体通常在Ausubel等人出处同上16章中讨论了。这些载体经常由两个成分组成，修饰的病毒基因组和环绕它的包衣结构(通常参见Smith，1995，微生物学年评，49：807)，虽然有时病毒载体以裸露形式或用病毒蛋白质以外的蛋白质包衣形式导入。但是，在载体中的病毒核酸可以许多方式改变，例如当设计用于基因治疗时。这些改变的目的是使病毒在靶细胞中不能生长，而维持它在载体中生长的能力在包装或辅助细胞中形成，以便在病毒基因组内提供外源DNA序列插入的空间，并且以便掺入编码和能够适当表达需要的基因的新序列。所以，载体核酸通常含有两个成分：基本顺式作用病毒序列以用于在辅助系中复制和包装，和外源基因的转录单位。在特异的包装或辅助细胞系中反式表达其它病毒功能。在例如，Rosenfeld等人，1992，细胞68：143；PCT公开WO94/12650；94/12649；和94/12629中叙述了腺病毒载体(例如，为了在人基因治疗中使用)。在腺病毒用作表达载体的情况中，编码hTRT的序列可以连接到由晚期 启动子和三分引导序列组成的腺病毒转录/翻译复合物。在病毒基因组插入非必要E1或E3区将导致能够在感染寄主细胞中表达的存活病毒(Logan和Shenk，1984，美国科学院年报81：3655)。在例如，Miller等人，1990，分子细胞生物学10：4239；Kolberg，1992，J NIH Res.4：43；和Cornetta等人1991，人基因治疗2：215中叙述了含有作为逆病毒基因组一部分的治疗性聚核苷酸序列的复制缺陷逆病毒载体。 
在哺乳动物细胞系统中，来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子经常是适当的。适当的启动子可以是组成性的，特异于细胞类型的，特异于阶段的，和/或可调节的或可控制的(例如，通过激素如糖皮质激素)。有用的启动子包括，但不限于金属硫蛋白启动子，组成性腺病毒主要晚期启动子，地塞米松可诱导MMTV启动子，SV40启动子，MRP polIII启动子，组成性MPSV启动子，四环素可诱导CMV启动子(如人即早期CMV启动子)，组成性CMV启动子，和本领域技术人员已知的启动子-增强子联合。 
其它调节因子也可以是hTRT聚核苷酸的有效表达和/或编码hTRT蛋白质的序列的翻译需要的或令人满意的。为了翻译，这些因子通常包括ATG起始密码和邻近的核糖体结合位点或其它序列。对于编码hTRT蛋白质的序列，假如它的起始密码和上游启动子序列插入表达载体，可能不需要其它翻译或其它控制信号。但是，在只插入编码序列或其部分的情况中，必需经常提供了外源转录和/或翻译控制信号(例如，启动子，核糖体结合位点，和ASTG起始密码)。另外，起始密码通常必需是在准确的读码框架中以便保证需要的蛋白质的翻译。外源转录因子和起始密码子可以是各种起源的，包括天然和合成的。另外，表达的有效性可以通过在使用中包含适于细胞系统的增强子进行增强(Scharf等人，1994，Results Probl.Cell Differ.20：125；和Bittner 等人，1987，酶学方法，153：516)。例如，可将SV40增强子或CMV增强子用于在哺乳动物寄主细胞中增强表达。 
通过在细胞中如人细胞例如端粒酶阴性细胞系中hTRT启动子或增强子的活化也可以实现(增强)hTRT基因产物的表达。以各种方法可以进行活化，包括给药外源启动子活化试剂，或阻遏hTRT基因的表达的细胞成分的抑制。将会认识到，相反地如下所述启动子功能的抑制将减少hTRT基因的表达。 
本发明提供可诱导和可阻遏hTRT多肽的表达，其中利用了如Ecdysone可诱导表达系统(Invitrogen)和来自Clontech的Tet-On和Tet-Off四环素调节系统这样的系统。ecdysone可诱导表达系统利用了类固醇激素ecdysone类似物，muristeroneA以便通过杂二聚体核受体激活重组蛋白质的表达(No等人，1996，美国科学院年报，93：3346)。在本发明的一个实施方案中，将hTRT克隆在pIND载体(Clontech)中，该载体含有最小热休克启动子上游的5个修饰的ecdysone应答因子(E/GRE)和多重克隆位点。然后，将该构建体转染进入稳定地表达ecdysone受体的细胞系。在转染后，利用muristeroneA处理细胞以便从pIND诱导细胞内表达。在本发明的另一个实施方案中，利用Tet-on和Tet-off表达系统(Clontech)表达了hTRT多肽以便提供调节的，高水平的基因表达(Gossen等人，1992，美国科学院年报，89：5547；Gossen等人，1995，科学268：1766)。 
本发明的hTRT载体可以通过各种方法导入细胞，组织，器官，病人或动物。可以通过已知的方法如氯化钙转化(细菌系统)，电穿孔，磷酸钙处理，脂质体介导的转化，注射和微注射，弹道方法，病毒体，免疫脂质体，聚阳离子：核酸共轭物，裸露DNA，人工病毒粒子，与疱疹病毒结构蛋白质VP22(Elliot和O’Hare，细胞，88：223)增强DNA 吸收的试剂，和体外转导将本发明的核酸表达载体(通常dsDNA)转移到选择的寄主细胞。在美国专利号5,049,386，美国4,946,787；和US4,897,355；PCT公开WO91/17424，WO91/16024；Wang和Huang，1987，生物化学生物生理研究通讯147：980；Wang和Huang，1989，生物化学28：9508；Litzinger和Huang，1992，Biochem.Biophys.Acta 1113：201；Gao和Huang，1991，生物化学生物物理研究通讯，179：280中叙述了有用的脂质体介导的DNA转移方法。已经叙述免疫脂质体是作为外源聚核苷酸的载体(Wang和Huang，1987，美国科学院年报，84：7851；Trubetskoy等人，1992，生物化学生物物理Acta1131：311)并且与脂质体比较可能提高了细胞类型的特异性，其中借助了假定结合特异细胞类型的表面抗原的特异抗体的参与。Behr等人，1989，美国科学院年报86：6982报道利用脂多胺作为介导本身转染的试剂，而不需要任何其它磷脂以便形成脂质体。考虑可接受的实际和调节需要(例如，用于基因治疗或用于重组蛋白质的表达的细胞系的生产)由实践者选择适当的递送方法。将会认识到上面列出的递送方法可以用于将核酸转移到细胞中以便用于基因治疗，用于转移到组织培养细胞中，和诸如此类。 
为了长期，高产量生产重组蛋白质，稳定的表达是常常需要的。例如，利用本发明的表达载体可以制备稳定表达hTRT的细胞系，这些载体含有复制的病毒原点或内源表达因子和选择性的标记基因。在导入载体后，可以允许细胞在转换到选择培养基之前在丰富培养基中生长1-2天。选择性标记的目的是给予选择抗性，并且它的存在允许成功地在选择培养基中表达导入序列的细胞的生长。利用适于细胞类型的组织培养技术可以繁殖稳定的转染细胞。根据本领域已知的方法，可以包括扩增步骤例如，通过对利用DHFR基因转染的细胞给药methyl trexate，。 
另外，可以选择具有调节插入序列的表达或以需要的方式加工表达蛋白质的能力的寄主细胞菌株。这样的多肽的修饰包括但不限于乙酰化，羧化，磷酸化，脂化和乙酰化。翻译后加工也可能对于准确插入，折叠和/或发挥功能是重要的。不同的寄主细胞对于这样的翻译后活性具有特异于每个细胞的细胞机械和特征机制并且所以可以选择特定的细胞保证导入的外源蛋白质的准确修饰和加工。 
本发明也提供表达hTRT或其它TRT聚核苷酸或多肽的转基因动物(即，人或其它TRT基因序列的转基因哺乳动物)。在一个实施方案中，将hTRT分泌进转基因哺乳动物如转基因小牛，山羊，或兔的牛奶中。例如，在Heyneker等人，PCT WO91/08216中发现这样的动物的生产方法。 
本发明的hTRT蛋白质和复合物包括那些利用本文出处同上公开的表达系统产生的，可以利用各种本领域已知的常用方法根据本发明(例如出处同上)提供的特异方法进行纯化。本领域的普通技术人员将认识到在化学合成后，生物表达，或纯化，hTRT蛋白质可能具有与天然存在的端粒酶的天然构型不同的构型。在一些情况中，对于变性(例如，包括二硫键或其它键的还原)多肽和然后导致多肽再折叠成优选的构型它可能是有帮助的或甚至是必需的。生产再折叠也可能需要hTR(或hTR片断)的存在。减少和变性蛋白质和诱导再折叠的方法是本领域技术人员已知的(参见，例如Debinski等人，1993，生物化学杂志，268：14065；Kreitman和Pastan，1993，生物共轭化学，4：581；和Buchner等人，1992，生物化学年评，205：263；和McCaman等人，1985，生物技术杂志，2：177)。同时参见PCT公开WO96/40868，出处同上。 
D)人TRT和人端粒酶RNA的复合物，端粒酶结合蛋白质，和其它由 共表达和其它方法产生的生物分子 
本发明的hTRT多肽可以在体内和体外与其它生物分子包括RNA(例如，hTR)，蛋白质(例如，端粒酶结合蛋白质)，DNA(例如，端粒DNA，[T2AG3]N)，和核苷酸，例如(脱氧)核糖核苷酸三磷酸结合。这些结合可以开发以便测试hTRT存在或功能，以便鉴定或纯化hTRT或端粒酶结合分子，和以便根据本发明的方法分析hTRT或端粒酶结构或功能。 
在一个实施方案中，本发明提供了与核酸通常是RNA复合(例如，与之结合或结合核酸)的hTRT，例如以便产生端粒酶全酶。在一个实施方案中，结合的RNA能够作为端粒酶介导的DNA合成的模板。可与hTRT多肽复合的RNA的例子包括天然存在的寄主细胞端粒酶RNA，人端粒酶RNA(例如，hTR；美国专利号5,583,016)，hTR亚序列或区，合成RNA，或其它RNA。RNA-hTRT蛋白质复合物(RNP)通常展示一个或多个端粒酶活性，如端粒酶催化活性。这些hTRT-hTR RNP(或其它hTRT-RNA复合物)可以通过各种方法产生，如下文为了说明叙述的，包括通过hTRT和hTR(或其它RNA)体外共表达(即，在无细胞系统中)体外再构成，体内再构成，或来自体内再构成。 
所以，本发明在一个实施方案中提供了通过混合分开纯化的成分体外形成hTRT-hTR复合物(或其它hTRT-RNA复合物)(“体外再构成”；参见例如美国专利号5,583,016说明再构成；同时参见Autexier等人，EMBO J.15：5928)。 
在一个可替代的实施方案，本发明提供了hTRT多肽和RNA(例如，hTR)在体外在无细胞转录-翻译系统(例如，麦胚，或兔网织红溶菌物)中共表达产生的端粒酶RNP。如实施例7所示，重组hTRT多肽和hTR的体外共表达导致产生端粒酶催化活性(如TRAP测试测量)。 
本发明另外提供的是在细胞中，例如哺乳动物细胞中通过表达hTRT 多肽产生的端粒酶RNP，其中hTR是天然表达的或其中hTR(或另一个能够与hTRT蛋白质形成的复合物的RNA)是通过重组手段导入或表达的。所以，在一个实施方案中，hTRT在端粒酶阴性人细胞中表达，其中存在hTR(例如，BJ或IMP90细胞)，允许两个分子组装进入RNP。在另一个实施方案中，hTRT在人或非人细胞中表达，其中hTR是重组表达的。hTR在细胞中表达的方法在美国专利号5,583,016中可以发现。另外，含有编码端粒酶RNA成分的cDNA的克隆已经作为pGRN33(ATCC75926)保藏于保藏中心。编码人端粒酶的RNA成分的基因组序列也以λ克隆28-1(ATCC 75925)的～15kbSauIIIA1到HindIII插入片断保藏。为了在真核细胞中表达，hTRT序列通常可操作地连接到转录起始序列(RNA聚合酶结合位点)和转录终止序列(参见例如，PCR公开WO96/01835；Feng等人，1995，科学269：1236)。 
本发明另外提供了重组产生或基本纯化的共表达和/或结合所谓的“端粒酶结合蛋白质”的hTRT多肽。所以，本发明提供了与其它蛋白质(例如，端粒酶结合蛋白质)共表达或复合的hTRT。端粒酶结合蛋白质是与人端粒酶共纯化和/或可以例如通过参与端粒酶与端粒DNA的结合调节端粒酶功能或活性的那些蛋白质。端粒酶结合蛋白质的例子包括(但不限于)下面的蛋白质和/或它们的人类似物：核仁素(参见，Srivastava等人，1989，FEBS Letts.250：99)；EF2H(延伸因子2类似物；参见Normura等人，1994，DNA研究(日本)1：27，GENBANK登记号#D21163)；TP1/TLP1(Harrington等人，1997，科学275：973；Nakayama，1997，细胞88：875)；四膜虫p95或p95自身的人同系物(Collins等人，1995，细胞81：677)；TPC2(也是端粒长度调节蛋白质；ATCC登记号97708)；TPC2(端粒酶长度调节蛋白质；ATCC登记号97707；DNA结合蛋白质B(dbpB；Horwitz等人，1994，生物化学杂志， 269：14130)；和端粒重复结合因子(TRF1和2；Chang等人，1995，科学270：1663；Chong等人，1997，人分子遗传学6：69)；EST1，3和4(Lendvay等人，1996，遗传学144：1399，Nugent等人，1996，科学274：249，Lundblad等人，1989，细胞57：633)；和End-加帽因子(Cardenas等人，1993，基因发展7：883)。 
在与hTRT蛋白质或hTRT-hTR RNP共纯化或结合的基础上鉴定端粒酶结合蛋白质。可替代地，它们可以在结合hTRT融合蛋白质例如，GST-hTRT融合蛋白质或诸如此类的基础上正如亲和纯化确定的进行鉴定(参见，Ausubel等人，第20章)。评估蛋白质-蛋白质相互作用的特别有用的技术能够应用于鉴定hTRT结合蛋白质，是Chien等人的两个杂合筛选方法(美国科学院年报，88：9578[1991]；同时参见Ausubel等人，出处同上，第20章)。这一筛选通过转录激活剂，酵母Gal4转录蛋白质的再构成体内鉴定蛋白质蛋白质的相互作用(参见，Field和Song，1989，自然，340-245)。该方法是基于酵母Gal4蛋白质的特性，该蛋白质由负责DNA结合和转录激活的可分离区组成。构建了通常是编码两个杂合体蛋白质的表达载体的聚核苷酸。一个聚核苷酸含有与待测试hTRT相互作用(例如，核仁素或EF2H)的蛋白质的多肽序列融合的酵母Gal4DNA结合区。可选择地，酵母Gal4DNA结合区与来自人细胞的cDNA融合，所以，产生与Gal4DNA结合区融合的人蛋白质以便用于筛选结合蛋白质的端粒酶。另一个聚核苷酸包括与hTRT多肽序列融合的Gal4激活区。将该构建体导入酵母寄主细胞。在表达的基础上，hTRT和测试蛋白质之间的分子内结合可以再构成含有Gal4激活区的Gal4DNA结合区。这导致了可操作地连接Gal4结合位点的报道基因(例如，lacZ，HIS3)的转录激活。通过选择或测试报道因子，可以鉴定含有hTRT相互作用蛋白质或端粒酶结合蛋白质的细胞的基因菌落。那些 本领域技术人员将满意的是存在2-杂合体筛选例如LexA系统的许多变化(Bartel等人，1993，在发展中的细胞相互作用：实践途径，Hartley，D.A.(牛津大学出版社)153-79)。 
鉴定端粒酶结合蛋白质的另一个有用的方法是三个杂合体系统(参见，例如Zhang等人，1996，生物化学年评，242：68；Licitra等人，1996，美国科学院年报93：12817)。在这一含有TRT或hTRT蛋白质和测试蛋白质的系统中可以利用端粒酶RNA成分。另一个鉴定相互作用蛋白质的有用方法特定地(即，杂合二聚化或形成更高级别的杂合多聚体的蛋白质)，是大肠杆菌/BCCP相互作用筛选系统(参见，Germino等人(1993)美国科学院年报，90：933；Guarente(1993)美国科学院年报，90：1639)。 
本发明也提供端粒结合蛋白质(可能或可能不是端粒酶结合蛋白质)和hTRT(可能或可能不是与hTR，其它RNA，或一个或多个端粒酶结合蛋白质复合)的复合物。端粒结合蛋白质的例子包括TRF1和TRF2(出处同上)；rnpA1，rnpA2，RAP1(Buchman等人，1988，分子细胞生物学8：210，Buchman等人，1988，分子细胞生物学8：5086)，SIR3和SIR4(Aparicio等人，1991，细胞66：1279)，TEL1(Greenwell等人，1995，细胞82：823；Morrow等人，1995，细胞82：831)；ATM(Savitsky等人，1995，科学268：1749)，末端加帽因子(Cardenas等人，1993，基因发展，7：883)，和相应的人同系物。可能是通过在体外或体内混合或共表达产生前面提到的复合物的，如上文描述的关于hTRT和hTR的复合物或端粒酶结合蛋白质。 
V.抗体和其它结合试剂 
在相关的方面，本发明提供了特异地与hTRT进行免疫反应的抗体包括多克隆和单克隆抗体，抗体片断，单链抗体，人和嵌合抗体，包 括与噬菌体包衣或细胞表面蛋白质融合的抗体和抗体片断和本领域已知和本文叙述其它抗体。本发明的抗体可以特定地识别和结合具有与附图17阐述的氨基酸序列(SEQUENCE IDNO：2)基本相同的氨基酸序列的多肽，或其免疫片断或由此定义的蛋白质上的表位。本发明的抗体可能显示至少107，108，109或1010/摩尔/升的hTRT的特异的结合亲和力，并且可能是多克隆，单克隆，重组或另外产生的。本发明同时提供了抗hTRT抗体，它能够识别hTRT构型表位(例如，在hTRT蛋白质或端粒酶RNP的表面上的表位)。同样，与相关的逆转录酶的构型，如p66HIV-1亚位(参见例如附图3)相比，或根据经验，如果需要，通过hTRT蛋白质序列的计算机辅助分析可以鉴定类似的构型的表位。识别构型表位的抗hTRT抗体在检测和纯化人端粒酶和在人疾病的诊断和治疗中具有特别的用途。 
为了生产抗hTRT抗体，可以利用hTRT蛋白质或保留免疫原特性的任何部分，片断或其低聚肽注射免疫接种寄主如山羊，羊，母牛，豚鼠，兔，大鼠，或鼠。在选择用于诱导抗体的hTRT多肽中，不需要保留生物活性，但是，蛋白质片断，或低聚肽必需是免疫原性的，和优选地抗原性的。通过在动物(例如，兔)中注射多肽和佐剂并且测试抗注射的多肽的抗体的出现可以确定免疫原性(参见例如，Harlow和Lane，抗体：实验室手册，冷泉港实验室，纽约(1988)，以全部引入本文，并用于所有目的，例如在第5章)。用于诱导特异抗体的肽通常具有由至少5个氨基酸优选地至少8个氨基酸，更优选地至少10个氨基酸组成的氨基酸序列。通常，它们将模仿或具有与SEQUCNCE ID NO：2的蛋白质的所有或邻近部分的氨基酸序列基本相同的序列。hTRT蛋白质氨基酸的短序列可能与另一蛋白质如钥孔戚血蓝蛋白，和产生的抗嵌合分子的抗hTRT抗体融合，根据寄主种类，为了增强免疫应答可以利 用各种佐剂。 
免疫系统中抗原的存在模式可以通过适于动物的方法确定。这些和其它参数通常是免疫学家已知的。通常，在脚趾，肌肉内，皮内，外淋巴结或腹膜内给予注射。通过常规方法包括亲和纯化可以沉淀，分离和纯化寄主产生的免疫球蛋白。 
实施例8中提供了免疫原性hTRT肽的说明性例子。另外，实施例8叙述了抗hTRT多克隆抗体的产生和使用。 
A)多克隆抗体 
根据本发明的方法利用提供由培养的连续的细胞系产生抗体分子的任何技术可以制备抗hTRT蛋白质和肽的多克隆抗体。这些技术包括但不限于，Koehler和Milstein(自然256：495[1975])最初叙述的杂交瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等人，1983，今日免疫学4：72；Cote等人，1983，美国科学院年报80：2026)，和EBV-杂交瘤技术(Cole等人，单克隆抗体和癌症治疗，Alan Rliss Inc，纽约，NY，77-96[1985])。 
在一个实施方案中，选择适当的动物，并且按照适当的免疫接种方案。生产非人单克隆抗体例如，小鼠，lagomorpha，马，是已知的，并且可能通过例如利用含有hTRT或其片断的制剂免疫接种动物完成。在一个方法中，在适当时期之后，切出动物的脾，通常融合个别脾细胞以便在适当的选择条件下使骨髓瘤细胞不灭。然后，克隆分离细胞，测试每个克隆(例如，杂交瘤)的上清液以便生产特异于抗原的需要区域的适当抗体。生产抗体的技术是本领域已知的，参见例如，Goding等人，单克隆抗体：原理和实践(第二版)，学术出版社，纽约，和Harlow和Lane，出处同上，其中每个以全部引入本文并适用于所有目的。其它适当的技术包括淋巴细胞与抗原多肽的体外接触，或可替代地用于选 择噬菌体或同样的载体(参见，见下文)中的抗体的文库。 
B)人抗体 
在本发明的另一个方面，提供了抗hTRT多肽的人抗体。抗已知抗原的人单克隆抗体也可以利用具有人免疫系统因子的转基因动物(参见例如，美国专利号5,569,825，和5,545,806，两个全部引入用于所有目的)或利用人周边血液细胞(Casali等人，1986，科学，234：476)进行生产。通过竞争性结合实验，或其它方法选择一些人抗体，它具有如特定小鼠抗体一样的表位特异性。 
在可选择的实施方案中，根据Huse等人，1989，科学246：1275，引入作为参考文献，概括的常用方案，从人B细胞筛选DNA文库可以产生抗hTRT多肽的人抗体。选择结合hTRT多肽的抗体。然后克隆和扩增编码这样的抗体(或结合片断)的序列。Huse叙述的方案经常用于噬菌体展示技术。 
C)人源化或嵌合抗体 
本发明也提供了制备成嵌合，类似人或人源化的抗hTRT抗体以便减少它们的潜在抗原性，而没有减少它们对它们的靶的亲和性。在本领域已经叙述了嵌合，类似人，和人源化抗体的制备(参见，例如，美国专利号，5,585,089和5,530,101；Queen等人，1989美国科学院年报，86：10029；和Verhoeyan等人，1988，科学239：1534；每个全部引入本文并用于所有目的)。人源化免疫球蛋白具有基本来自人免疫球蛋白的可变框架区(命名为受体免疫球蛋白)和基本来自非人(例如，小鼠)免疫球蛋白的互补确定区(称为，供体免疫球蛋白)。如果存在，恒定区也基本来自人免疫球蛋白。 
在一些应用中，如对人病人给药，本发明的人源化(以及人)抗hTRT抗体提供优于超来自小鼠或其它种类抗体的几个优点：(1)人免疫系统 
将不识别作为外源的人源化抗体的框架或恒定区，并且所以这样的抗注射抗体的抗体应答应该小于抗总外源小鼠抗体或部分外源嵌合抗体的应答；(2)因为人源化抗体的效应部分是人，利用人免疫系统的其它部分它的反应可能更好和(3)注射的人源化抗体具有与天然存在的人抗体基本相当的半生命期，允许比其它种类的抗体更小和更少的频率剂量。正如前面暗示，抗hTRT抗体在疾病的治疗中具有应用，即靶击端粒酶阳性细胞。 
D)噬菌体展示 
本发明也提供了通过噬菌体展示方法产生的抗hTRT抗体(或结合组合物)(参见，例如，Dower等人，WO91/17271和McCafferty等人，WO92/01047；和Vaughan等人，1996，自然生物技术，14：309；它们每个全部引入本文作为参考用于所有目的)。在这些方法中，产生了噬菌体的文库，其中各种成员在它们的外表面展示了不同抗体。抗体通常展示为Fv或Fab片断。含有需要的特异性的展示抗体的噬菌体可以通过富于hTRT多肽的亲和力进行选择。 
在噬菌体展示方法的变化中，可以产生含有选择的小鼠抗体的结合特异性的人源化抗体。在这一方法中，利用选择的小鼠抗体的重链或轻链可变区作为起始物质。如果，例如选择轻链可变区作为起始物质，那么构成噬菌体文库，其中各种成员展示同样的轻链可变区(即，小鼠起始物质)和不同的重链可变区。从重排的人重链可变区的文库获得重链可变区。选择显示与hTRT多肽强特异结合(例如，至少108和优选地至少109/摩尔./升)的噬菌体。然后，将来自这一噬菌体的人重链可变区作为构建其它噬菌体文库的起始物质。在这一文库中，每个噬菌体展示了同样的重链可变区(即，从第一个展示文库鉴定的区)和不同的轻链可变区。从重排的人可变区轻链区的文库获得轻链可变区。再次， 选择显示强特异结合的噬菌体。这些噬菌体展示了完全的人抗hTRT抗体的可变区。这些抗体通常具有如小鼠起始物质的同样的或相似的表位特异性。 
E)杂合抗体 
本发明同时提供了共有抗hTRT多肽的抗体特异性并且也能够特异地结合第二个成分的杂合抗体。在这样的杂合抗体中，一个重链和轻链对通常来自抗hTRT抗体，并且另一对来自抗另一个表位或蛋白质的抗体。这导致了多功能效价的特性，即，至少同时结合两个不同表位的能力，其中至少一个表位是与抗复合物抗体结合的表位。通过生产各个成分的抗体杂交瘤的融合，或通过重组技术可以形成这样的杂合体。这样的杂合体可以用于携带化合物(即，药物)到端粒酶阳性细胞(即，细胞毒性试剂递送到癌细胞)。 
本发明的免疫球蛋白也可以与来自其它基因的功能区(例如，酶)融合以便产生具有有用的特性的融合蛋白质(例如，免疫毒素)。 
F)抗个体遗传型抗体 
同样有用的是抗个体遗传型抗体，它可以通过上面的过程分离。通过例如，利用初级抗体(即，抗hTRT抗体或其hTRT结合片断)免疫接种动物可以制备抗个体遗传型抗体。对于抗hTRT抗体，选择被hTRT多肽或其片断抑制与其初级抗体的结合的抗遗传型抗体。因为抗一个体遗传型抗体和hTRT多肽或其片段都与初级免疫球蛋白结合，抗遗传型免疫球蛋白可以代表表位的“内部成象”，所以可以在测试中替代hTRT多肽，或可以用于结合(即，失活)抗hTRT抗体，例如，在病人中。抗遗传型抗体也可以与端粒酶结合蛋白质相互作用。以这样的抗体给药可以通过在结合hTRT结合蛋白质中滴定出或竞争hTRT影响端粒酶的功能。 
G)概述 
本发明的抗体可以是任何同工型，例如，IgM，IgD，I gG，IgA和IgE，IgG，IgA和IgM经常是优选的。人源化抗体可能含有来自一个以上的类别或同工型的序列。 
在本发明的另一个实施方案中，提供了上面叙述的完整抗体的片断。通常，这些片断可以竞争完整的抗体，这些片断起源于这些抗体特异地结合hTRT，这些片断具有至少107，108，109或1010/摩尔/升的亲和力结合。抗体片断包括分离的重链，轻链，Fab，Fab’F(ab’)2，Fabc，和Fv。通过完整的免疫球蛋白的酶或化学分离可以产生片断。例如，通过利用标准方法，如在Harlow和Lane，出处同上中叙述的那些，在pH3.0-3.5利用胃蛋白酶通过蛋白质消化IgG分子可以得到F(ab’)2片断。通过限制还原从F(ab’)2片断或利用木瓜蛋白酶在存在还原剂时通过消化从整个抗体可以获得Fab片断(通常参见，Paul，W.ed基础免疫学第二版Raven出版社，纽约，1989，第7章，全部引入作为参考用于所有目的)。通过重组DNA技术也可以产生片断。通过利用限制酶消化全长编码序列，或通过从头开始合成产生编码选择的片断的核酸的区段。通常，以噬菌体包衣融合蛋白质的形式表达片断。 
上面叙述的许多免疫球蛋白可以在两个可变和恒定区的进行非关键的氨基酸替代，叠加或缺失而不失去结合特异性，或效应功能，或可耐受的结合亲和力的还原(即，低于约107/摩尔/升)。通常，免疫球蛋白掺入这样的改变展示了与它们起源的参考的免疫球蛋白基本的序列同一性。可以选择具有同样的特异性并与它起源的参考免疫球蛋白相比亲和力增强的突变免疫球蛋白。噬菌体展示技术提供了选择这样的免疫球蛋白的有用技术，参见，例如，Dower等人，WO91/17271McCafferty等人，WO92/01047；和Huse，WO92/06204。 
本发明的抗体可以有或没有修饰而使用。通常，通过，共价地或非共价地与可检测的标记结合而标记抗体。作为标记结合整体，本发明的抗体特别可用于诊断应用。 
利用已知的方法可以纯化本发明的抗hTRT抗体。根据本领域的标准方法包括硫酸铵沉淀，亲和柱，柱层析，凝胶电泳，和诸如此类利用本发明的方法和试剂可以纯化本发明的整个抗体，它们的二聚体，单个轻链和重链，或其它免疫球蛋白形式(通常参见，Scopes，蛋白质纯化，原理和实践，第三版，(Springer-Verlag，纽约，1994))。至少约90到95％，或者甚至98％到99％或更高的均一性的基本纯化免疫球蛋白是优选的。 
VI.人端粒酶的纯化 
本发明提供了无前例的纯度的分离的人端粒酶。特别是，本发明提供了：重组或非重组起源的纯化的hTRT；重组，非重组，或混合起源，非强制性地包括一个或多个端粒酶结合蛋白质的纯化hTRT-hTR复合物(即，RNP)；纯化的天然存在的人端粒酶；和诸如此类。另外，本发明提供了部分，基本或高度纯化的上面的分子和复合物包括变异体，融合蛋白质，天然存在的蛋白质，和诸如此类(总称为，“hTRT和/或hTRT复合物”)的方法和试剂。 
在本公开之前，已经进行纯化端粒酶复合物到均一的尝试，取得有限的成功。在前面列出的应用中提供的该方法通过了与粗细胞提取物相比约60,000倍或更高地纯化端粒酶。本发明部分地借助于本发明的新免疫亲和试剂(例如，抗hTRT抗体)和/或试剂，细胞，和本文为了重组表达hTRT提供的方法提供了甚至更高纯度的hTRT和hTRT复合物。hTRT和hTRT复合物的重组表达简化了纯化，因为可以产生比大多数天然存在的表达细胞中发现的更高水平的需要的分子，和/或因为可 以修饰重组hTRT分子(例如，通过与表位标记融合)以致它可以容易地纯化。 
将能认识到从任何端粒酶阳性细胞可以纯化天然存在的端粒酶，可以利用任何来自体内，体内，体外或本文公开的植物，或动物表达系统，或本领域已知的其它/系统特别地进行表达和纯化重组hTRT和hTRT复合物。 
在一个实施方案中，利用免疫亲和步骤，单独或结合其它纯化步骤纯化端粒酶和其它组合物。通常，如本发明提供，固定或可固定的抗hTRT抗体与样品如细胞溶菌物接触，细胞溶菌物在抗hTRT抗体结合hTRT抗原的条件下含有需要的hTRT或含有hTRT的复合物。在通过本领域已知的方法除去样品中未结合成分后，如果需要可以从抗体中以基本纯化的形式洗脱hTRT组合物。在一个实施方案中，根据本发明的方法利用了本领域已知的免疫亲和层析方法(参见，例如Harlow和Lane，出处同上，和Ausubel，出处同上；Hermansan等人，1992，免疫亲和配体技术(学术出版社，圣地亚哥))。在另一个说明性的实施方案中，利用固定化的蛋白质A进行抗hTRT免疫球蛋白hTRT复合物的免疫沉淀。根据本发明的方法和试剂适于使用的许多变化和可选择的免疫亲和纯化方案是本领域技术人员已知的。 
在另一个实施方案中，，利用常规蛋白质纯化方法，如硫酸铵沉淀，亲和柱(例如，免疫亲和)，大小排除，阴离子，和阳离子交换层析，凝胶电泳和诸如此类可以纯化作为高水平表达的结果的重组hTRT蛋白质(通常参见，R.Scopes，蛋白质纯化，Springer-Verlag，纽约，(1982)和Deutscher，酶学方法，第182卷：蛋白质纯化的指导，学术出版社，纽约(1990))而不是或另外的免疫亲和方法。由于hTRT蛋白质的碱性pI可以特定地利用阳离子交换方法。例如，可以将固定化的磷酸用作阳 离子交换功能基团(例如，P-11磷酸纤维素，Whatman目录#4071或纤维素磷酸，西格玛目录#C3145)。对于hTRT纯化，固定化的磷酸具有两个有利的特征，它是阳离子交换树脂，和它显示了与核酸的磷酸骨架的物理相似性。这可以允许亲和层析因为hTRT结合hTR和端粒DNA。其它非特异和特异核酸亲和层析方法也可以用于纯化(例如，Alberts等人，1971，酶学方法，21：198；Arnt-Jovin等人，1975，欧洲生物化学杂志，54：411；Pharmacia目录#27-5575-02)。hTRT的这一结合功能的开发可以包括利用特异的核酸(例如，端粒酶引物或hTR)亲和层析用于纯化(Chodosh，等人，1986，分子细胞生物学6：4723；Wu等人，1987，科学238：1247；Kadonaga，1991，酶学方法208：10)；固定的Cibricon蓝染料，它显示了与核苷酸具有物理相似性，是另一个有用的hTRT纯化树脂(Pharmacia目录#17-0948-01或西格玛目录#C1285)，因为hTRT结合核酸(例如，作为DNA合成的底物)。 
在一个实施方案中，直接从体外或体内表达系统分离hTRT蛋白质，其中其它端粒酶成分不是共表达的。将认识到的是分离的hTRT蛋白质也可以例如通过分解端粒酶RNP(例如，通过与温和或其它变性剂接触)和分离RNP成分(例如通过常规手段如层析或免疫亲和层析)从纯化的人端粒酶或hTRT复合物，容易地获得。 
利用端粒酶活性测试(例如，TRAP测试，常规测试，或引物结合测试)，通过测量丰富的hTRT(例如，通过ELISA)，通过测量丰富的hTR，或本领域已知的其它方法可以鉴测端粒酶纯化。 
在一个实施方案中，本发明提供的纯化的人端粒酶，hTRT蛋白质，和hTRT复合物是高度纯化的(即，至少约90％均一性，更经常至少是约95％均一性)。通过标准手段如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和其它本领域已知的方法(参见，例如Ausubel等人，出处同上)可以确定均一 性。将能够理解的是虽然高度纯化的人端粒酶，hTRT蛋白质，或hTRT复合物有时是需要的，基本纯化(例如，至少约75％均一性)或部分纯化(例如，至少约20％均一性)人端粒酶，hTRT蛋白质，或hTRT复合物可用于许多应用，并且也是本发明提供的。例如，部分纯化的端粒酶可用于筛选测试化合物的端粒酶调节活性，和其它用途(参见，下面和出处同上；参见美国专利号5,645,986)。 
VII.治疗端粒酶相关疾病 
A)介绍 
本发明提供了用于治疗人疾病和疾病症状的hTRT多聚核苷酸，多肽，和抗体。本发明的重组和合成hTRT基因产物(蛋白质和mRNA)可以用于生产或提高细胞中的端粒酶活性，以及抑制其中不需要端粒酶活性的细胞中的端粒酶活性。所以，抑制，激活或其它方式改变细胞中端粒酶活性(例如，端粒酶催化活性，保真度，持续合成能力，端粒酶结合，等等)可以用于改变细胞的增殖能力。例如，在不灭细胞如恶性肿瘤细胞中端粒酶活性的减弱可以使细胞可灭。相反地，在可灭细胞(例如，大多数人体细胞)中端粒酶活性的增强可以增强细胞的增殖能力。例如，在表皮成纤维细胞中hTRT蛋白质的表达，从而增强端粒的长度，将导致增强成纤维细胞增殖能力；这样的表达可以减慢或逆转伤口闭合的依赖年龄的减慢(参见，例如，West，1994，Arch，Derm.130：87)。 
所以，在一个方面，本发明提供了用于治疗在细胞中存在，缺乏人端粒酶活性的量为特征的疾病和症状，并且怀疑利用本文公开的组合物和方法治疗的疾病的试剂和方法。这些疾病包括如如下更具体叙述的癌症，细胞增殖的其它疾病(特别是老化疾病)，免疫紊乱，不育性(或可育性)和其它。 
B)治疗癌症 
本发明提供了在肿瘤细胞中减弱端粒酶活性和用于治疗癌症的方法和组合物。各种组合物包括反义低聚核苷酸，肽，编码反义低聚核苷酸或改变蛋白质活性的基因治疗载体，和抗hTRT抗体。表达端粒酶活性(端粒酶阳性细胞)的癌细胞(例如恶性肿癌细胞)可以通过降低或抑制内源端粒酶活性变得可灭。另外，因为端粒酶水平与疾病特征如转移性潜力相关(例如，美国专利号5,639,613；5,648,215；5,489,508；Pandita等人，1996，Proc.Am.Ass.Cancer Res.37：559)，任何端粒酶活性的减弱可以减少癌症的恶化特性到更可管理的疾病状态(增加传统的干涉的效率)。 
本发明提供了用于治疗任何各种类型的癌症包括固体肿瘤和白血病的组合物和方法。可以治疗的癌症类型包括(但不限于)：乳腺，前列腺和结肠的腺癌；所有形式的肺的慢性起源的癌症；骨髓；黑素瘤；肝癌；成神经细胞瘤；乳头状瘤；胺前体摄取脱羧细胞瘤；绒毛膜瘤；鳃瘤；恶性类癌综合症；类癌心脏疾病；癌症(例如Walker，基本细胞，basosquamous，Brown-Pearce，导管的，埃利希-肿瘤，原位，Krebs2，Merkel细胞，粘蛋白，非小细胞肺，燕麦细胞，乳头，硬癌的，细支气管，支气管源性的鳞状细胞，和过度型细胞)，组织细胞增生紊乱，白血病(例如，B-细胞，混合细胞，无效细胞，T细胞，慢性T细胞，HTLV-II-结合，lyphocytic acute，淋巴细胞慢性，肥大细胞，和骨髓)；恶性组织细胞增生；霍奇金疾病；免疫增殖小；非霍奇金淋巴瘤；浆细胞瘤；网状内皮组织增殖；黑素瘤；成软骨细胞瘤；脊索癌；脊索瘤；软骨肉瘤；纤维瘤；纤维肉瘤；巨大细胞肿瘤；组织细胞瘤；脂肪瘤；脂肪肉瘤；间皮瘤；粘液瘤；粘液肉瘤；骨瘤；骨肉瘤；尤因肉瘤；滑膜瘤；腺淋巴瘤；癌肉瘤；脊索瘤；颅咽管瘤；无性细胞瘤；错沟瘤；中肾瘤；肌肉瘤；成釉细胞瘤；牙骨质瘤；畸胎瘤；胸 腺瘤；绒膜上皮肿瘤；腺癌；腺瘤；胆管瘤；胆脂瘤；圆柱瘤；囊腺癌；囊腺瘤；粒膜细胞肿瘤；两性胚细胞瘤；肝细胞瘤；汗腺腺瘤；岛细胞肿瘤；莱迪希氏细胞肿瘤；乳头瘤；sertoli细胞肿瘤；膜细胞肿瘤；平滑肌瘤；平滑肌肉瘤；成肌细胞瘤；肌瘤；肌肉瘤；横纹肌瘤；横纹肌肉瘤；室管膜瘤；神经节细胞瘤；神经胶质瘤；成神经管细胞瘤；脑脊膜瘤；神经鞘瘤；成神经鞘瘤；神经内皮瘤；神经纤维瘤；神经瘤；神经节细胞瘤；神经节细胞瘤nonchromaffin；血管角质瘤；具有嗜酸性的血管淋巴增生；血管瘤硬化；血管瘤病；血管球瘤；血管内皮瘤；血管瘤；血管外皮瘤；血管肉瘤；淋巴管瘤；淋巴管性肌瘤；淋巴管性肉瘤；松果体瘤；癌肉瘤；软骨肉瘤；叶状的囊性肉瘤；纤维肉瘤；血管肉瘤；平滑肌肉瘤；白血病性肉瘤；脂肪肉瘤；淋巴管性肉瘤；肌肉瘤；粘液肉瘤；卵巢癌；横纹肌肉瘤；肉瘤(例如，尤因，实验性的，卡波西，和肥大细胞)；新生瘤(例如，骨，乳房，消化系统，直肠，肝，胰，垂体，睾丸，眼眶，头和颈，中央神经系统，听觉的，骨盆的，呼吸道的，和泌尿生殖的)；神经纤维瘤病，和宫颈发育不良)。例如，通过hTRT，端粒酶，或端粒酶活性的调节失调(例如，不正常的高表达)本发明提供了用于治疗其它症状的组合物和方法，其中细胞已经变成不灭或过度增殖的，。 
本发明进一步提供预防癌的组合物和方法，包括抗hTRT疫苗，预防端粒酶活化基因治疗载体，和导致端粒酶阳性细胞特异地死亡基因治疗载体。在相关的方面，下面叙述的基因替代治疗方法可以用于“治疗”癌症的遗传偏好。 
C)治疗其它疾病 
本发明也提供用于治疗特征是端粒酶或hTRT基因产物表达不足或表达过度的疾病和疾病症状(除了癌症)的组合物和方法。例子包括： 细胞增殖的疾病，细胞衰老导致的疾病(特别是老化的疾病)，免疫紊乱，不育性，免疫功能紊乱的疾病，和其它。 
老化的一些疾病的特征是由于减少的端粒长度(与更年轻的细胞相比)，细胞中端粒酶活性缺乏(或更低的水平)导致的细胞衰老相关的变化。降低的端粒长度和降低的复制能力对疾病如下面叙述的那些起作用。端粒酶活性和端粒长度可以通过例如，细胞中hTRT基因产物(蛋白质和mRNA)的水平提高而增强。其中hTRT表达可以是治疗性的与细胞衰老相关的疾病的部分名录包括阿尔茨海默疾病，帕金森疾病，亨廷顿疾病，和中风；皮肤如皮的萎缩的年龄相关的疾病，弹力纤维松解和皮肤起皱，皮脂腺体增生，老年的色斑，头发变灰，和掉发，慢性皮肤溃疡，和与伤口愈合的年龄相关的损伤；变性的关节病，骨质疏松；年龄相关的免疫系统损伤(例如，包括细胞如B和T淋巴细胞，单核细胞，嗜中性粒细胞，嗜酸粒细胞，嗜碱粒细胞，NK细胞，和它们各自的起源)；血管系统的年龄相关的疾病(包括动脉粥样硬化，钙化，血栓形成，和动脉瘤；糖尿病，肌肉萎缩，呼吸道疾病，肝和GI道疾病，代谢疾病，内分泌疾病(例如，垂体和肾上腺腺体紊乱)，生殖疾病，和年龄相关的斑点退化。这些疾病和症状可以通过增强细胞中hTRT基因产物的水平进行治疗以便增强端粒长度，从而恢复或使细胞具有更高的复制能力而得到治疗。在体外或细胞体内培养的细胞上可以进行这样的方法。在一个实施方案中，首先处理细胞以便激活端粒酶和使端粒增长，然后，处理失活hTRT基因和端粒酶活性。在优选的实施方案中，通过本发明的载体在分化之前的胚细胞或躯干细胞中产生端粒酶活性。 
本发明同时提供了用于治疗不育性的方法和组合物。人胚系细胞(例如，精原细胞，它们的起源或祖先)能够不定地增殖并且特征是高的端 粒酶活性。不正常或减少的hTRT基因产物水平可以导致例如，不适当或不正常地产生精子，导致不育或增殖的紊乱。因此，“基于端粒酶”的不育性可以利用本文叙述的方法和组合物治疗以便增强端粒酶的水平。同样，因为端粒酶的抑制可以负面地影响精子生成，卵子发生，和精子和卵的存活，当用于减少胚系细胞中hTRT基因产物的水平时，本发明的端粒酶抑制组合物可能具有避孕效果。 
另外，本发明提供通过减弱端粒酶活性用于降低端粒酶阳性细胞如激活的淋巴细胞和生血躯干细胞的增殖潜力的方法和组合物。所以，本发明提供了产生免疫抑制的方法。相反地，本发明的方法和试剂可用于增强细胞如躯干细胞的端粒酶活性和增殖潜力，在治疗干扰之前表达了低水平的端粒酶或没有端粒酶。 
D)干扰的方式 
正如从前面的讨论中可以明了，细胞的端粒酶或端粒酶活性的水平的调节可以深远地影响细胞的增殖潜力，并且因此在疾病的治疗中具有巨大的用途。正如同样可以明了的，这一调节可以是端粒酶活性的降低或活性的增强。本发明的端粒酶调节分子可以通过许多机制作用；其中的一些在这里和下面的部分叙述了以便辅助实践者选择治疗试剂。但是，申请人不打算限制本文叙述的新治疗化合物，组合物和方法的作用的特定机制。 
端粒酶活性可以通过任何几个机制或机制的联合降低。一个机制是降低hTRT基因表达以便减弱端粒酶活性。这一降低可以是在hTRT基因转录成mRNA，加工(例如，拼接)，核运输，或mRNA的稳定性，mRNA翻译产生hTRT蛋白质，或hTRT蛋白质的稳定和功能的水平上的。另一个机制是利用抑制性核酸，多肽，或其它试剂(例如模拟物，小分子，药物，和前药物)干扰一个或多个端粒酶的活性(例如逆转录酶催化活 性，或hTR结合活性)，这可以利用本发明方法鉴定，或通过本文公开的组合物提供。其它机制包括hTR和/或端粒酶结合蛋白质的汇集，和干扰来自它的亚单位成分的端粒酶RNP的组装。在相关的机制中，hTRT启动子序列可操作地结合编码毒素的基因并导入细胞中；如果或当在细胞中表达或激活了hTRT转录激活物，毒素将被表达导致特异的细胞杀死。 
减弱细胞的增殖能力的相关方法包括导入具有低保真度的hTRT变异体(即，一个具有高的例如，大于1％，误差比例)以致合成异常的端粒重复。这些异常重复产生端粒蛋白质结合并导致染色体重排和异常和/或导致细胞死亡。 
同样地，端粒酶活性可以通过任何几个机制或机制的联合增强。这些包括增强细胞中hTRT的数量。通常，这是通过在细胞中导入编码hTRT多肽的聚核苷酸进行的(例如，包括可操作地连接启动子的hTRT序列的重组产生的多肽，或稳定hTRT mRNA)。可替代地，催化活化的hTRT多肽本身可以导入细胞或组织中，例如通过微注射或本领域已知其它方法。在其它机制中，可以增强从内源hTRT基因的表达或细胞中hTRT基因产物的稳定性。通过利用内源端粒酶抑制剂和端粒酶RNP，或内源hTRT转录阻遏物和hTRT基因的相互作用干扰；通过增强hTRT转录激活剂表达或活性；和本公开物的综述基础上本领域技术人员已知的其它方法也可以增强细胞中端粒酶的活性。 
E)干扰试剂 
1)TRT蛋白质和肽 
在一个实施方案中，本发明提供了增强或减少可以直接导入靶细胞的端粒酶活性的端粒酶调节多肽(即，蛋白质，多肽，和肽)(例如，通过注射，脂质体介导的融合，对肿瘤[例如，黑素瘤] 
表面应用水凝胶，与疱疹病毒结构蛋白质VP22融合或附着，和本文叙述的和本领域已知的其它手段)。在第二个实施方案中，通过在细胞中导入编码需要的蛋白质或肽的核酸(例如，DNA表达载体或mRNA)在细胞中表达了本发明的端粒酶调节蛋白质和肽。表达可以组成性或可诱导地依赖于载体和启动子的选择(参见下面的讨论)。当只需要短暂表达(例如，端粒酶的短暂激活)时编码hTRT的信使RNA制剂是特别有用。在细胞中导入和表达核酸的方法是本领域已知的(同时参见本说明书的其它地方，例如低聚核苷酸，基因治疗方法部分)。 
在本发明的一个方面，提供了增强细胞中端粒酶活性的端粒酶调节多肽。在一个实施方案中，多肽是能够指导人端粒DNA的合成(与RNA模板如hTR结合)的催化活性hTRT多肽。这一活性可以如上面讨论，例如利用端粒酶活性测试如TRAP测试进行测量。在一个实施方案中，多肽是具有或基本等同于SEQUENCE ID NO：2的1132个残基的序列的全长hTRT蛋白质。在另一个实施方案中，多肽是SEQUENCE ID NO：2的hTRT蛋白质的变异体，如融合多肽，派生多肽，截短多肽，保守替代的多肽，活性修饰的多肽，或诸如此类。融合体或派生蛋白质可以包括增强多肽穿过细胞膜或引起多肽优选地递送到特异的细胞类型(例如肝细胞或肿瘤细胞)或优选地递送到细胞腔室(例如，核腔室)的靶击成分。靶击成分的例子包括脂末尾，氨基酸序列如antennapoedia肽或核定位信号(NLS；例如非洲詹蝓属核质蛋白Robbins等人，1991，细胞64：615)。天然存在的hTRT蛋白质(例如，具有或基本等同于SEQUECEID NO：2的或序列)作用在细胞核中。所以，似乎是一个或多个SEQUENCEID NO：2的亚序列如残基193-196(PRRR)和残基235-240(PKRPRR)的作用是作为核定位信号。小区域似乎是基于下面的发现的NLS：许多NLS含有由碱性氨基酸(K或R)组成，或由三个碱性氨基酸(K或R)和H或P 组成的4残基3个残基跟随图谱，以P开始接着由含有4个残基中的含有3K或R残基的碱性区段的3个残基跟随图谱(参见，例如Nakai等人，1992，基因组14：897)。预期一个或两个这些序列和/或其它定位序列的缺失干扰了hTRT运输到核，和/或增强hTRT转换，并且可用于防止端粒酶接近它的核底物，和降低增殖潜力。另外，缺乏NLS的变异体hTRT多肽可以组装成RNP，这将不能维持端粒的长度，因为产生的酶不能进入核。 
特定地当用于增强细胞中端粒酶活性时，本发明的hTRT多肽将通常在靶细胞中与端粒酶RNA如hTR结合。在一个实施方案中，导入的hTRT多肽结合内源hTR以便形成催化活化的RNP(例如，含有hTR和具有SEQUENCE ID NO：2的序列的全长多肽的RNP)。这样形成的RNP也可以结合其它例如端粒酶结合蛋白质。在其它实施方案中，将端粒酶RNP(含有hTRT蛋白质，hTR和非强制性地包括其它成分)作为复合物形式导入靶细胞中。 
在相关的实施方案中，在细胞或细胞子代中导入hTRT表达载体，其中端粒酶RNA(例如，hTR)表达载体同时，随后或已经导入。在实施方案中，在细胞中，hTRT蛋白质和端粒酶RNA共表达，并且组装形成端粒酶RNP。优选的端粒酶RNA是hTR。用于在细胞中表达hTR的表达载体如出处同上所述(参见，美国专利号5,583,016)。仍然在另一个实施方案中，hTRT多肽和hTR RNA(或等当物)体外结合形成复合物，然后将复合物导入靶细胞，例如通过脂质体介导的转移。 
在另一个方面，本发明提供了用于减少细胞中端粒酶活性的hTRT多肽。如上所述，这些“抑制”多肽可以直接导入或通过在细胞中表达重组核酸。将认识到的是通常将直接导入含有非标准氨基酸的肽模拟物或多肽(即，除了遗传密码或它们的正常衍生物编码的20个氨基 酸)。 
在一个实施方案中，端粒酶活性的抑制是由准确的端粒延伸需要的成分的汇集造成的。这样的成分的例子是hTRT和hTR。所以，以结合hTR但不具有端粒酶催化活性的多肽的给药可以减弱细胞中内源端粒酶的活性。在相关的实施方案中，hTRT多肽可以结合除了hTR以外的细胞成分，如一个或多个端粒酶结合蛋白质，从而干扰细胞中端粒酶的活性。 
在另一个实施方案中，本发明的hTRT多肽干扰(例如通过竞争)内源表达的hTRT蛋白质和另一个端粒酶功能需要的细胞成分如hTR，端粒DNA，端粒酶相关蛋白质，端粒相关蛋白质，端粒，细胞周期控制蛋白质，DNA修复酶，组蛋白或非组蛋白染色体蛋白质或其它的相互作用。 
在选择本发明的影响内源表达hTRT蛋白质和其它细胞成分的相互作用的分子(例如，多肽)中，可以推荐包括如上所述的一个或多个hTRT蛋白质的保守基序的分子。这些区域的进化的保守表明这些基序作用的人端粒酶的适当功能中的重要功能，所以，这些基序通常是有用的位点可以改变hTRT蛋白质的功能以便产生本发明的变异体hTRT蛋白质。所以，在保守基序中具有突变的变异体hTRT多肽将特定地用于本发明的一些应用中。 
在另一个实施方案中，通过在细胞中导入大量的hTRT多肽(例如，通常至少是约2倍以上高于内源水平，更通常是至少约10到约100倍)阻遏内源hTRT基因的表达，这些多肽的作用是通过反馈环抑制hTRT基因的转录，hTRT前mRNA的加工，hTRT mRNA的翻译，或端粒酶RNP的组装和运输。 
2)低聚核苷酸 
a)反义构建体 
本发明提供了可以用于减少体外或体内表达hTRT基因产物的方法和反义低聚核苷酸或聚核苷酸试剂。对靶细胞给药本发明的反义试剂导致产生减弱的端粒酶活性，并且特别是对治疗高端粒酶活性为特征的疾病(例如，癌症)是有用的。没有打算限制任何特别的机制，相信反义低聚核苷酸结合有意义hTRTmRNA和干扰它的翻译。可替代地，反义分子可以使hTRTmRNA对核酸消化敏感，干扰转录，干扰RNA前体(前mRNA)的加工，定位，或其它形式，阻遏从hTRT基因转录mRNA，或通过一些其它机制作用。但是，反义分子减少hTRT表达所采用的机制不是关键。 
本发明的反义聚核苷酸含有至少7到10到通常20个或更多核苷酸的反义序列，这些核苷酸特异地与来自编码hTRT的mRNA或来自hTRT基因转录的mRNA的序列进行杂交。更经常地，本发明的反义聚核苷酸在长度上是从约10到50个核苷酸或从约14到约35个核苷酸。在其它实施方案中，反义聚核苷酸是少于约100个核苷酸或少于约200个核苷酸的聚核苷酸。通常，反义聚核苷酸应该足够长足以形成稳定的双链体，但如果需要，根据递送的方式，可足够短以便体内给药。与靶序列特异杂交需要的聚核苷酸的最小长度取决于几个因子，如G/C含量，错配碱基的定位(如果有任何的话)，与靶聚核苷酸的群体比较序列的独特性程度，和聚核苷酸的化学特性(例如，甲基磷酸骨架，肽核酸，硫代磷酸)，以及其它因子。 
通常，为了保证特异杂交，反义序列基本上与靶hTRTmRNA序列互补。在一些实施方案中，反义序列准确地与靶序列互补。但是，反义聚核苷酸也可以包括核苷酸替代，叠加，缺失，转移，易位，或修饰，或其它核酸序列或非核酸成分，只要保留与对应于hTRTRNA的相关靶序列或它的基因特异结合为聚核苷酸的功能特性。 
在一个实施方案中，反义序列是与hTRTmRNA的有关可达到序列(例如，有关避免二级结构)互补的。这可以通过利用例如MFOLD程序(遗传计算机集团，麦迪生WI)和如本领域已知体外或体内测试分析预定的RNA二级结构进行确定。可以在细胞中测试hTRT功能的反义阻遏的低聚核苷酸例子是那些能够与下面的SEQUENCE ID NO：1位置杂交的(即，基本互补)：40-60；260-280；500-520；770-790；885-905；1000-1020；1300-1320；1520-1540；2110-2130；2295-2315；2450-2470；2670-2690；3080-3110；3140-3160；和3690-3710。鉴定有效的反义组合物的另一个有用的方法利用了低聚核苷酸的结合物的排列(参见例如Milner等人，1997，自然生物技术15：537)。 
本发明同时提供了具有除了反义序列以外的反义聚核苷酸(即，除了抗hTRT有意义序列)。在这种情况中，反义序列包括在更长的序列的聚核苷酸内。在另一个实施方案中，聚核苷酸的序列基本含有或是反义序列。 
利用任何生产核酸的适当方法，例如化学合成，和本文所述的重组方法可以产生反义核酸(DNA，RNA，修饰的，类似物，和诸如此类)。在一个实施方案中，例如，本发明的反义RNA分子可以通过从头开始化学合成或通过克隆制备。例如，通过以反方向插入(连接)可操作地连到接载体(例如，质粒)中的启动子的hTRTDNA序列(例如，SEQUENCEID NO：1或其片断)可以产生与hTRTmRNA杂交的反义RNA。假如启动子和优选地终止和聚腺苷酸化信号是适当定位的，对应于非编码链的插入序列的链将被转录和作为本发明的反义低聚核苷酸。 
本发明的反义低聚核苷酸可以用于抑制无细胞提取物，细胞，和动物包括哺乳动物和人中的端粒酶活性。例如，硫代磷酸反义低聚核苷酸： 
A)5’-GGCATCGCGGGGGTGGCCGGG 
B)5’-CAGCGGGGAGCGCGCGGCATC 
C)5’-CAGCACCTCGCGGTAGTGGCT 
D)5’-GGACACCTGGCGGAAGGAGGG 
可以用于抑制端粒酶活性。每个低聚核苷酸的浓度为10摩尔时，当每天处理一次共7天时，低聚核苷酸A和B；A，B，C和D；和A，C，和D的混合物抑制293细胞中的端粒酶活性。当结合低聚核苷酸A，B，和C；A，B，和D；和A和C使用反义hTR分子时同样观察到抑制。在这样的实验中有用的对照低聚核苷酸包括： 
S1)5’GCGACGACTGACATTGGCCGG 
S2)5’GGCTCGAAGTAGCACCGGTGC 
S3)5’GTGGGAACAGGCCGATGTCCC 
为了确定用于需要的特定应用的本发明的最适反义低聚核苷酸，可以利用本发明的反义低聚核苷酸组进行扫描。一个说明性的组是跨越hTRTmRNA的30聚体低聚核苷酸的每，并且从下面15个核苷酸开始(即，ON1对应于位置1-30，并且是TCCCACGTGCGCAGCAGGACGCAGCGCTGC，ON2对应于位置16-45，并且是GCCGGGGCCAGGGCTTCCCACGTGCGCAGC，和ON3对应于位置31-60，并且是GGCATCGCGGGGGTGGCCGGGGCCAGGGCT，并且到达mRNA的末端)。可以测试这一组的每个成员如本文公开的抑制活性。然后，在各种需要的条件下显示抑制活性的低聚核苷酸鉴定需要的区域，并且可以测试对应于需要的区域(即，8聚体，10聚体，15聚体，和其它)的本发明的其它低聚核苷酸以便鉴定具有为了应用的优选的活性的低聚核苷酸。 
对于反义低聚核苷酸的相关的一般方法，参见反义RNA和DNA，(1988)D.A.Melton，Ed，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)。参见Dagle 等人，1991，核酸研究，19：1805。对于反义治疗的综述，参见例如，Uhlmann等人，化学综述，90：543-584(1990)。 
b)三联体低聚和多聚核苷酸 
本发明提供低聚和多聚核苷酸(例如，DNA，RNA，PNA或诸如此类)，这些结合双链或双倍体hTRT核酸(例如，在hTRTRNA的折叠区或在hTRT基因中)，形成含有三倍螺旋或“三联体”核酸。三链螺旋的形成通过例如防止hTRT基因的转录，因此减少或消除细胞中端粒酶的活性抑制hTRT表达。没有打算局限于任何特定的机制，可以确信三联体螺旋对放弃了双倍体螺旋打开足以结合聚合酶，转录因子或调节分子的能力的存在。 
本发明的三链体低聚和多聚核苷酸是利用三链体螺旋形成的碱基配对原则(参见例如，Cheng等人，1988生物化学杂志，263：15110；Ferrin和Camerini-Otero，1991，科学，354：1494；Ramdas等人，1989，生物化学杂志，264：17395；Strobel等人，1991，科学254：1639；和Rigas等人，1986，美国科学院年报，83：9591；每个引入本文作为参考)和利用hTRTmRNA和/或基因序列构建的。通常，本发明的形成三链体低聚核苷酸含有“互补”到hTRTRNA或基因的特异的序列的从约10到至少约25个核苷酸或更长特异序列(即，足够大形成稳定的三链体螺旋，但足够小取决于递送的方式，以便如果需要体内给药)。在本文中，“互补”指能够形成稳定的三链体螺旋。在一个实施方案中，设计低聚核苷酸特异地结合到hTRT基因的调节区(例如，hTRT5’侧接序列，启动子和增强子)，或结合到转录起始位点(例如，在转录起始位点的-10和+10之间)。利用三链体DNA的最新治疗进展的综述，参见Gee等人，在Huber和Carr，1994，分子和免疫途径，Futura出版公司，MtKisco纽约，和Rininsland等人，1997，美国科学院年报，94：5854， 两个都引入本文作为参考。 
c)核酶 
本发明同时提供用于抑制端粒酶活性的核酶。本发明的核酶结合和特异地裂解和失活hTRTmRNA。有用的核酶可以含有与hTRTmRNA互补的5’和3’未端序列，并且可以基于本文公开的hTRTmRNA序列通过一个技术人员将穹工程化(参见PCT公开WO93/23572，出处同上)。本发明的核酶包括那些具有基团I的内含子核酶(cech，1995，生物技术13：323)和其它锤头核酶的特征的那些(Edgington，1992，生物技术10：256)。 
本发明的核酶包括那些具有如GUA，GUU和GUC的裂解位点的那些。对于本发明的端粒酶活性的核酶介导的抑制的其它最适裂解位点包括PCT公开WO94/02595和WO93/23569中叙述的，两个引入本文作为参考。可以评估对应于含有裂解位点的靶hTRT基因的区域的15和20个核糖核苷酸长度之间的短RNA低聚核苷酸的二级结构特征，这些特征可以使低聚核苷酸更符合需要。通过利用核糖核酸酶保护测试对与互补低聚核苷酸的杂交的可行性进行测试，或根据本领域已知的标准方法测试体外核酶活性也可以评估裂解位点的恰当性。 
正如Hu等人，引入本文作为参考的PCT公开WO94/03596所述，反义和核酶功能可以在单个低聚核苷酸中结合。另外，如上所述结合本发明的说明性反义低聚核苷酸的说明，核酶可以含有一个或多个修饰的核苷酸或在核苷酸之间的修饰的键。 
在一个实施方案中，本发明的核酶可以体外产生并且导入细胞中或病人中。在另一个实施方案中，在靶细胞体外或体内，基因治疗方法可用于核酶的表达。 
d)低聚核苷酸的给药 
通常，本发明的治疗方法包括以低聚核苷酸的给药，功能是抑制或 刺激体内各种生理条件下的端粒酶活性，并且在这些条件下在治疗效果足够的时期是相当稳定的。如上所述，修饰的核酸可以用于给予这样的稳定性，以及靶击递送低聚核苷酸到需要的组织，器官或细胞中。 
低聚和多聚核苷酸可以直接作为药物在适当的药物配方中或通过在细胞中导入核酸的方法，包括脂质体，免疫脂质体，弹道，直接吸收入细胞，和本文所述的诸如此类进行递送。为了治疗疾病，本发明的低聚核苷酸将以治疗有效量给病人给药。治疗有效量是足以减轻疾病的症状或在靶细胞中调节端粒酶活性的量，例如，可以利用TRAP或其它端粒酶生物功能的适当测试方法测量的。在美国专利号5,272,065，引入本文作为参考中叙述了为了治疗目的用于递送低聚核苷酸的方法。下面提供了药物活性化合物给药的其它细节。在另一个实施方案中，利用基因治疗和本发明的重组DNA表达质粒可以递送低聚和多聚核苷酸。 
3)基因治疗 
基因治疗是指将外源聚核苷酸导入到其转移入的哺乳动物，该多聚核苷酸产生对通常哺乳动物细胞具有医学用途的表现型影响。在一个方面，本发明提供了基因治疗方法和治疗端粒酶结合症状的组合物。在说明性实施方案中，基因治疗包括在细胞中导入表达hTRT基因产物(如与基因SEQUENCE ID NO：2的序列的hTRT多肽基本相似的hTRT蛋白质，例如以便增强端粒酶活性，或减弱活性的抑制性hTRT多肽)，表达具有hTRT基因或mRNA序列(如反义RNA，例如减弱端粒酶活性)的核酸，表达影响hTRT基因产物(例如，涉及hTRTmRNA的核酶以便减弱端粒酶活性)的表达的多肽或聚核苷酸，或替代或裂解内源hTRT序列(例如，分别是基因替代和“基因敲出”)的载体。许多其它实施方案将是基于本文的公开本领域一个技术人员明了的。在一个实施方案中，也 导入编码hTR的载体。在另一个实施方案中，与或不与hTR的载体，编码端粒酶相关蛋白质的载体。 
用于hTRT基因治疗的载体可以是病毒的或非病毒的，并且包括出处同上叙述的，与本发明的hTRT表达系统相关那些。本领域技术人员将理解的是基因治疗载体可以含有启动子和其它调节或加工序列，如本文公开所述。通常，载体将含有启动子，和非强制性地增强子(从任何在启动子序列中含有的分离)，它们的作用是驱动低聚核糖核苷酸的转录，以及其它调节因子，它们提供附加型生存或染色体整合，和如果需要高水平转录。用于基因治疗的质粒可以含有其它功能因子，如可选择标记，可鉴定区，和其它序列。其它序列可能在细胞外和细胞内的稳定性中起作用，靶击hTRT核苷酸序列(有意义，或反义)递送到特异的器官，组织，或细胞群体，介导全部进入细胞，介导全部进入细胞的核，和/或介导整个进入核DNA。例如，apatamer状DNA结构，或其它蛋白质结合成分位点可以用于介导载体结合到细胞表面受体或结合到血清蛋白质，血清蛋白质结合受体从而增强DNA转移到细胞的效力。其它DNA位点和结构可以在核膜中直接或间接结合受体，或结合到其它进入核的蛋白质，从而简化了载体的核吸收。其它DNA序列可以直接或间接影响整合的效力。 
适当的基因治疗载体可以或可以不具有复制的原点。例如，它可用于给药病人之前为了繁殖而包含于载体中的复制原点。但是，如果载体设计成整合进入宿主染色体DNA或结合到寄主mRNA或DNA，复制的原点在给药之前经常是被除去的。在一些情况中(例如，肿瘤细胞)，稳定地整合进入转导细胞对于外源DNA可以是不需要的，因为短暂表达足以杀死肿瘤细胞。 
如上所述，本发明同时提供了基因替代治疗的方法和试剂(即，具 有重组基因的内源hTRT基因的同源重组替代)。可以使用特异地设计用于同源重组的整合的载体。最适同源重组的重要因子包括序列同一性的程度和与染色体序列的同源的长度。介导同源重组的特异序列也是重要的，因为整合在转录活化的DNA中的发生更容易。例如，Mansour等人，1988，自然，336：348；Bradley等人，1992，生物/技术，10：534，也参见，美国专利5627059，5487992，5631153和5464764叙述了构建同源靶击构建体的方法和物质。在一个实施方案中，基因替代治疗包括改变或替代所有或部分有待调节的hTRT基因的控制表达的调节序列。例如，hTRT启动子序列(例如，如SEQUENCE ID NO：6中发现的)可以被裂解(以便降低hTRT表达或消除转录控制位点)，或者是替代的外源启动子(例如，以便增强hTRT表达)。 
本发明同时提供了hTRT“基因敲出”的方法和试剂(即，利用重组产生的载体，通过内源hTRT基因同源重组缺失或裂解)。在基因敲出中，靶序列可以是调节序列(例如，hTRT启动子)，或RNA或蛋白质编码序列。美国专利号，5,272,071(和上面引证的美国专利号)，WO91/09955，WO93/09222，WO96/29411，WO95/31560，和WO91/12650，同时参见，Moynahan等人，1996，Hum，分子遗传学5：875中详细叙述了改变内源基因的表达的同源重组的用途。 
本发明进一步提供利用hTRT基因启动子调节对细胞有毒性的蛋白质的表达，特异地杀死端粒酶阳性细胞，或防止端粒酶阴性细胞转化成端粒酶阳性状态的方法。如实施例14所示，hTRT启动子序列可操作地连接报道基因以致启动子的激活导致了报道基因编码的蛋白质的表达。如果，不是报道蛋白质，编码蛋白质对于细胞是毒性的，启动子的活化导致细胞发病或死亡。在本发明的一个实施方案中，含有可操作地连接编码毒性蛋白质的基因的hTRT启动子的载体导入细胞，如人 细胞，例如人病人中的细胞，导致细胞中的细胞死亡，这些细胞中表达了hTRT启动子激活因子，如癌细胞。在相关的实施方案中，编码蛋白质本身对细胞不是毒性的，但编码使细胞敏感的其它非毒性药物的活性。例如，通过在肿瘤细胞中导入hTRT-启动子-疱疹胸苷激酶(TK)基因融合构建体，给药gancyclovir或等当物可以治疗肿瘤(参见，例如Moolton和Wells，1990，J.Nat’l Canc.Inst.82：297)。本领域技术人员根据本公开物的综述可以知道许多对本发明进行修饰和应用的其它适当毒性或潜在毒性蛋白质和系统(利用除了hTRT以外的启动子序列)。 
在细胞或组织中可以体内，来自体内或体外导入基因治疗载体。对于体外治疗，在细胞，例如躯干细胞中可以导入载体，这些细胞取自病人，并且无性繁殖用于自我移植回同一病人(参见，例如，美国专利号，5,399,493，和5,437,994，本公开物引入本文作为参考)。可能是目的在于增强靶细胞的端粒酶活性的hTRT基因治疗而靶击的细胞包括但不限于，胚胎躯干或胚细胞，特别是灵长类或人细胞，如上所述，造血躯干细胞(AIDS和化学治疗)，微管内皮细胞(心脏和大脑血管疾病)，皮肤成纤维细胞和碱性皮肤角质细胞(伤口愈合和烧伤)，软骨细胞(关节炎)，脑星形胶质细胞和小胶质细胞(阿尔茨海默疾病)，成骨细胞(骨质疏松)，视网膜细胞(眼病)和胰岛细胞(I型糖尿病)和表3，见下文列出的任何细胞，以及任何其它已知分裂的其它细胞类型。 
在本发明的一个实施方案中，将可操作地连接TRT如hTRT编码序列(或变异体)的可诱导启动子可用于调节体内或体外细胞的增殖能力。在特定的实施方案中，例如，在病人中导入在可诱导启动子的控制下利用hTRT表达载体转染的产生胰岛素的胰细胞。然后，通过在病人中给药启动子激活试剂的(例如，四环素)可以控制细胞的增殖能力， 以便使细胞能够增倍过去可能的更多。然后，可以由治疗的工作人员终止，继续，再启动细胞增殖。 
4)疫苗和抗体 
具有hTRT序列的免疫原肽或多肽可以用于引发病人中的抗hTRT免疫应答(即，作为疫苗)。在实施例6和8中出处同上叙述了举证的免疫原hTRT肽和多肽。通过递送编码需要的多肽的质粒载体也可能产生免疫应答(即，给药“裸露DNA”)。通过注射，脂质体，或给药的其它手段可以递送需要的核酸。在一个实施方案中，选择在受试者中引发抗表达端粒酶细胞的I型MHC限制的细胞毒性淋巴细胞应答的免疫接种方式。一旦免疫接种，个体或动物将引发抗高水平表达端粒酶的细胞(例如，恶性细胞)的升高的免疫应答。 
抗hTRT抗体，例如，小鼠，人，或免疫接种的单克隆抗体也可以给药病人(例如，被动免疫接种)以便产生抗表达端粒酶细胞的免疫应答。 
F)药物组合物 
在相关的方面，本发明提供含有单独hTRT低聚，和多聚核苷酸，多肽，和抗体，激动剂，拮抗物，或抑制剂或结合至少一个其它试剂，如用于稳定的化合物，稀释剂，载体，或另一个活性成分或试剂的药物组合物。 
本发明的治疗试剂可以溶于任何无菌、生物相容药物载体，包括，但不限于盐水、缓冲盐水、葡聚糖和水中给药。任何这些分子可以单独或结合其它试剂，药物或激素，成为药物组合物而给患者给药，在药物组合物中，它混合了适当的赋形剂，佐剂，和/或药物可接受载体。在本发明的一个实施方案中，药物可接受载体是药物惰性的。 
口服或肠胃外完成药物组合物的给药。肠胃外递送的方法包括局 部，动脉内(例如，直接到肿瘤)，肌肉内，皮下，髓内，鞘内，心室内，静脉内，腹膜内的，或鼻内给药。除了活性成分，这些药物组合物可以含有适当的包括赋形剂和其它简化活性化合物加工成具有药物用途的制剂的化合物的药物可接受载体。在“Remington’s药物科学”的最新版可以发现配制和给药的其它详细的技术(Maack出版公司，Easton PA)。 
利用本领域技术人员已知的药物可接受载体，以适于口服给药的剂量可以配制用于口服给药的药物组合物。这样的载体能够使药物组合物配制成药片，丸剂，糖衣药丸，胶囊，液体，凝胶，糖浆，浆，悬浮液，等等，以便适于病人消化。参见PCT公开WO93/23572。 
如果需要，在加入适当的附加化合物之后，通过将固体赋形剂与活性混合物结合，非强制性地对产生的混合物进行研磨，加工胶囊混合物以便获得药片或糖衣药片的核心，可以获得口服的用途的药物制剂。适当的赋形剂是碳水化合物，或蛋白质填充剂，包括但不限于蔗糖，包括乳糖，蔗糖，甘露醇，或山梨醇；来自玉米，小麦，水稻，土豆，或其它植物的淀粉；纤维素如甲基纤维素，羟基丙甲基纤维素，或羧甲基纤维素钠；和包括阿拉伯和西黄耆胶的胶；以及蛋白质如明胶和胶原。如果需要，可以加入分解或增溶剂，如交联聚丙基吡咯烷酮，琼脂，藻酸，或其盐，如藻酸钠。 
提供的糖衣药丸核心具有适当的包衣如浓缩的蔗糖溶液，也可以含有阿拉伯树胶，滑石粉，聚丙烯吡咯烷酮，cabopol凝胶，聚乙二醇，和/或二氧化钛，紫胶漆溶液，和适当的有机溶剂或溶剂混合物。在片剂或糖衣药丸包衣中可以加入染料或色素以便进行产物鉴定或鉴定活性化合物的量(即，剂量)。 
可以用于口服的药物制剂包括明胶以及明胶和包衣如甘油或山梨醇 组成的软，封闭的胶囊组成的推入契合胶囊。推入契合胶囊可以含有混合了填充剂或结合剂如乳糖，或淀粉，润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁，和非强制地稳定剂的活性成分。在软胶囊中，可以在适当的液体如脂肪油，液体石蜡，或有或没有稳定剂的液体聚乙二醇中溶解或悬浮活性化合物。 
肠胃外给药的药物配方包括活性化合物的水溶液。为了注射，本发明的药物组合物可以在水溶液中配制，优选地在生理相容缓冲液中，如Hank’s溶液，Ringer溶液，或生理缓冲盐中配制。水状注射悬浮液可以含有增强悬浮液粘性的物质，如羧甲基纤维素钠，山梨醇，或葡聚糖。另外，活性化合物的悬浮液可以制备成适当的油性注射悬浮液。适当的亲脂溶剂或载体包括脂肪油，如芝麻油，或合成脂肪酸酯，如乙油酸或甘油三酯，或脂质体。非强制性地，悬浮液也可以含有适当的稳定剂或增强化合物的可溶性的试剂，以便允许制备高浓度的溶液。 
为了局部或鼻内给药，在配方中利用了适于渗透特定的屏障的渗透剂。这样的渗透剂通常是本领域技术人员已知的。 
本发明的药物组合物可以相似于本领域技术人员已知的方式制造(例如，通过常规混合，溶解，颗粒化，制成糖衣药片，研磨，乳化，包囊，包埋，或冷冻干燥过程)。 
药物组合物可以提供为盐形式，并且可以与许多酸，包括但不限于盐酸，硫酸，乙酸，乳酸，酒石酸，苹果酸，琥珀酸等等形成盐。盐趋向于在对应的无碱形式的水状或其它质子溶剂中更可溶。在其它情况中，优选的制剂可以是冷冻干燥粉末，其中含有1毫摩尔-50毫摩尔/升的组氨酸，0.1％-2％蔗糖，2％-7％甘露醇，pH范围4.5到5.5中，在使用之前结合缓冲液。 
在已经制备了含有在可接受的载体中配制的本发明的化合物的药物组合物后，他们可以置于适当的容器，并标记说明适应治疗的症状。为了以人端粒酶蛋白质和核酸给药，这样的标记将包括给药的量，次数，和方法。 
适于本发明中使用的药物组合物包括组合物，其中包含有效量的活性成分以便达到打算的目的。“治疗有效量”或“药学有效量”是本领域内认识的短语。并且指有效地产生打算的药学结果的试剂的量。所以，治疗有效量是足以减轻待治疗的疾病的症状的量。在确定给定的应用(例如，治疗有效量)的有效量的一个有用的测试是测量对靶细胞中端粒酶活性的影响。真正给药的量将取决于治疗应用的个体，并且将优选地是最适量，以致达到需要的效果而没有明显的副作用。确定治疗有效剂量正好在本领域技术人员的能力范围内。 
对于任何化合物，在细胞培养测试或在任何适当的动物模型中可以初步估计治疗有效剂量。动物模型也用于获得需要的浓度范围和给药的途径。然后，这样的信息可以用于确定在人中给药的有用的剂量和途径。 
治疗有效量指减轻症状或疾病的蛋白质，多肽，肽，抗体，低聚或多聚核苷酸，激动剂，或拮抗物的量。这样的化合物的治疗效力和毒性可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学方法(例如，ED50，在50％的群体中治疗有效的剂量；和LD50，对50％的群体致死的量)进行确定。在治疗和毒性效果之间的剂量比例是治疗指标，并且它可以表达为比例ED50/LD50。显示大的治疗指标的药物组合物是优选的。将从细胞培养物测试和动物研究获得的数据用于配制人使用的剂量的范围。这样的化合物的剂量优选地位于包括ED50，具有小或没有毒性的循环浓度的范围内的。该剂量在这一范围内的变化取决于使用的剂量形 式，病人的敏感性，和给药的途径。 
通过单个医师，考虑治疗的病人选择准确的剂量。调节剂量和给药以提供足够水平的活性成分，或维持需要的效果。可以考虑的其它因子包括疾病状态的严重性(例如，肿瘤大小，和定位；病人的年龄，体重和性别；饮食，给药的时间和频率，药物结合，反应敏感性，和对治疗的耐受性/应答)。长期作用的药物组合物可以每3到4天，每星期，或每两星期一次给药，这取决于特定的配方的半衰期和清除速度。在本文献中提供了关于递送的特定的剂量和方法的指导(参见，例如美国专利号4,657,760；5,206,344；和5,225,212，本文引入作为参考)。本领域的技术人员将通常使用不同于蛋白质或它们的抑制剂的核苷酸的配方。同样地，聚核苷酸或多肽的递送可以特异于特定的细胞，症状，定位和诸如此类。 
VIII.增强不灭细胞，细胞系，和动物的增殖能力和生产 
如上所述，在培养物中有限数目分裂后(例如，50到100次分裂)大多数脊椎动物细胞开始衰老。但是，一些变异体细胞能够在培养物中不定地分裂(例如，HeLa细胞，293细胞)，并且因为这一原因，这些细胞可用于研究和工业应用。通常，或通过暴露于辐射的转化，或诱导肿瘤的病毒或化学物质这些不灭细胞系起源于自发产生的肿瘤，。不幸地，细胞系的有限的选择，尤其是代表分化的细胞功能的人细胞系，是可以获得的。另外，目前可得的不灭细胞系的特征是染色体不正常(例如，非增倍性，基因重排，或突变)。另外，许多长期确立的细胞系相对是未分化的(例如，它们不产生独特地鉴定特定组织或器官的种类的高度特异的产物)。所以，需要产生不灭细胞尤其是人细胞的新方法。不灭细胞的一个用途是产生天然蛋白质和重组蛋白质(例如，治疗多肽，如红细胞生成素，人生长激素，胰岛素，和诸如此类)，或 抗体，对于它们，稳定，遗传上正常细胞系是优选的。为了产生一些重组蛋白质，特异的细胞类型也是优选的(例如，生产人胰岛素的胰细胞)。不灭细胞或甚至具有增强的增殖能力的可灭细胞(相对于未修饰的细胞)的另一个用途是用于导入病人中进行基因治疗，或用于替代疾病或损坏细胞或组织。例如，含有或表达例如本发明的重组hTRT基因或多肽的自身免疫细胞可以用于在积极的癌症治疗例如，整个身体的辐射后的细胞替代，。不灭细胞的另一个用途是具有治疗用途的“人工”组织或器官(例如，皮肤)的来自体内生产。这样的细胞的另一个用途是筛选或证实药物，如端粒酶抑制药物，或用于生产疫苗或生物试剂。本发明的细胞的其它用途将是本领域技术人员明了的。 
本发明的不灭细胞和细胞系，以及仅仅增强复制能力的那些是通过增强细胞中的端粒酶活性产生的。可以利用本文公开的增强端粒酶活性的任何方法。所以，在一个实施方案中，通过增强细胞中hTRT多肽的量使细胞不灭。在一个实施方案中，通过在细胞中导入hTRT表达载体增强hTRT水平(有时稳定转染是优选的)。如上所述，hTRT编码序列通常可操作地连接启动子，该启动子可能是可诱导或在细胞中组成性地激活的。 
在一个实施方案中，在细胞中导入含有编码SEQUENCE ID NO：2的多肽的序列的多聚核苷酸，该序列可操作地结合启动子(例如，组成性表达的启动子，例如，SEQUENCE ID NO：6的序列)。在一个实施方案中，多聚核苷酸包括SEQ ID NO：1的序列，优选地多聚核苷酸包括多聚腺苷酸化和终止信号。在其它实施方案中，包括其它因子如增强子或其它上面讨论的。在可选择的实施方案中，多聚核苷酸不包括启动子序列，这样的序列通过靶细胞内源基因组在导入聚核苷酸整合后(例如，重组，例如同源重组)提供。多聚核苷酸可以通过任何方法包括本 文公开的任何方法，如脂转染，电穿孔，病毒体，脂质体，免疫脂质体，聚阳离子：核酸共轭物，裸露DNA导入靶细胞。 
利用本发明的方法，可以导致任何脊椎动物细胞具有增强的增殖能力或甚至是在培养物中不灭和不定地生存。在一个实施方案中，细胞是哺乳动物的，对于许多应用人细胞是优选的。可能是不灭的人细胞的例子，在表3中列出。 
将会认识到下文描述的本发明的“诊断”测试可用于鉴别和定性本发明的不灭细胞。 
表3
其中hTRT表达可能被增强的人细胞
角化上皮细胞 
表皮的角质细胞(分化的表皮细胞) 
表皮的基本细胞(躯干细胞) 
指甲和趾甲的角质细胞 
指甲床的基本细胞(躯干细胞) 
毛发轴细胞 
髓管，皮质，表皮的，发根鞘细胞，表皮，Huxley层，Henle外层；毛发基质细胞(躯干细胞) 
湿的层化栅栏上皮细胞 
舌，口腔，食管，肛管，远侧尿道，阴道的层化多鳞表皮的表面上皮细胞 
这些表皮的基本细胞(躯干细胞) 
外部角膜上皮细胞 
尿道上皮细胞(膀胱里和尿道) 
特异于外分泌的上皮细胞 
唾液腺的细胞 
粘膜细胞(分泌丰富的多糖) 
血清细胞(分泌丰富的糖蛋白酶) 
舌头的von Ebner腺体的细胞(分泌洗涤味蕾) 
乳房腺体的细胞，分泌奶 
泪腺细胞，分泌眼泪 
耳朵的盯聍腺体的细胞，分泌蜡 
外分泌汗腺细胞，分泌糖蛋白(黑细胞) 
外分泌汗腺细胞，分泌小分子(清除细胞) 
顶浆分泌汗腺细胞(有气味分泌，性激素敏感) 
眼睑中Moll的腺体的细胞(特异的汗腺) 
皮脂腺的细胞，分泌脂丰富的皮脂 
在鼻子鲍曼腺体的细胞(分泌洗涤嗅上皮) 
在十二指肠的Brunner腺体的细胞，分泌粘膜和酶的碱性溶液。 
精囊的细胞，分泌精液的成分，包括果糖(如游动的精子的燃料) 
前列腺的细胞，分泌精液的其它成分 
尿道球腺的细胞，分泌粘液 
Bartholin’s腺体细胞，分泌阴道润滑液 
Littre的腺体的细胞，分泌粘液， 
子宫的内膜的细胞，主要分泌碳水化合物 
呼吸和消化道的分离小球突细胞，分泌粘液 
胃粘膜细胞 
胃腺体的产酶细胞，分泌胃蛋白酶原 
胃腺体的壁细胞，分泌Hcl 
胰的腺泡细胞，分泌消化酶和碳酸氢盐 
小肠的帕内特细胞，分泌溶菌酶 
肺的II型肺囊细胞，分泌表面活性剂 
肺的克拉拉细胞 
特异于激素的分泌的细胞 
腺垂体的细胞，分泌生长激素，促卵泡激素，促黄体激素，促乳素，促肾上腺皮质激素，和促甲状腺激素 
垂体中间细胞，分泌促黑色素激素 
垂体后细胞，分泌催产素，加压素 
肠细胞，分泌5-羟色胺，内啡呔，促生长素抑制素，胃泌素，胰泌素，缩胆囊素，胰岛素和胰高糖素 
甲状腺的细胞，分泌甲状腺激素，降钙素 
甲状旁腺的细胞，分泌甲状旁腺激素，嗜酸细胞 
肾上腺腺体的细胞，分泌肾上腺素，去甲肾上腺素，和类固醇激素； 
盐皮质素 
糖皮质激素 
生殖腺细胞，分泌睾酮(睾丸的Leydig细胞) 
雌激素(卵泡的囊内细胞) 
孕酮(破裂卵泡的luteum体细胞) 
肾的近肾小球器的细胞 
近肾小球细胞(分泌肾素) 
牙斑细胞 
周极细胞 
血管系膜细胞 
在肠，外分泌腺体，和泌尿生殖道中的上皮吸收细胞 
肠的边界刷细胞(具有微绒毛) 
外分泌腺的条纹管细胞 
胆囊上皮细胞 
肾的近端小管的边界刷细胞 
肾的远端小管细胞 
输精小管的非毛细管 
附睾主细胞 
附睾基本细胞 
特异于代谢和储藏的细胞 
肝细胞(肝细胞) 
脂肪细胞 
白脂肪 
棕色脂肪 
肝的脂肪细胞 
首先作为栅栏功能，作为肺，肠，外分泌腺体，和尿道的里的上皮细胞 
I型肺囊细胞(肺的内空气间隔) 
胰管细胞(腺泡中央型细胞) 
汗腺、唾液腺、乳腺的平滑管细胞 
肾小球的腔壁细胞 
肾小球的足细胞 
亨勒的环的薄区段的细胞(在肾中) 
收集导管细胞(在肾中) 
精囊，前列腺的导管细胞 
内部体腔关闭的上皮细胞的里面 
血管和具膜孔的淋巴的血管上皮细胞 
连续的 
脾 
滑膜细胞(里关节腔，大量分泌透明质酸) 
浆膜细胞(腹膜里，胸膜，和围心腔) 
耳朵的衬里外淋巴空间的扁平细胞 
耳朵的衬里内淋巴空间的细胞 
扁平细胞 
内淋巴囊的柱状细胞 
具有微绒毛 
没有微绒毛 
“暗”细胞 
前庭膜细胞(组装脉络膜丛细胞) 
条纹血管基本细胞 
条纹血管缘细胞 
克劳迪乌斯细胞 
伯特歇耳细胞 
脉络丛细胞(分泌脑脊液) 
软蛛网膜平滑细胞 
眼的纤毛上皮细胞 
色素 
非色素 
角膜“内皮”细胞 
具有前冲功能的纤毛细胞 
呼吸道的 
子宫的输卵管和子宫内膜的(女性) 
睾丸网和输精小管(男性) 
中央神经系统(衬里脑腔的管室膜细胞) 
特异于分泌细胞外基质的细胞 
上皮： 
成釉细胞(分泌牙釉质) 
耳朵的前庭器的平面半月形细胞(分泌蛋白聚糖) 
皮层的器官的齿间细胞(皮层的器官的分泌耳涡“覆膜”覆盖头发细胞) 
非上皮(结缔组织) 
成纤维细胞(角膜，腱，骨髓的网状组织的各种疏松结缔组织) 
毛细血管的周细胞 
椎间盘的核肉质细胞 
成牙骨质细胞/牙骨质细胞(分泌牙根的骨状牙骨质) 
成牙质细胞/牙质细胞(分泌牙的牙质) 
透明软骨，纤维软骨，弹性软骨的软骨细胞 
成骨细胞/骨细胞 
骨祖代细胞(成骨细胞的躯干细胞) 
眼的玻璃体的hyalocyte 
耳朵的淋巴管周边空间的星状细胞 
收缩细胞 
骨骼肌肉细胞 
红(慢) 
白色(快) 
中间产物 
肌肉纺锤体-核袋 
肌肉纺锤体-核链 
卫星细胞(躯干细胞) 
心脏肌肉细胞 
普通 
节 
普肯野纤维 
光滑肌肉细胞 
虹膜的，外分泌腺的 
肌上皮细胞 
血液和免疫系统的细胞 
红血细胞 
巨核细胞 
巨嗜细胞 
单核细胞 
结缔组织巨嗜细胞(各种) 
胰岛细胞(在表皮) 
破骨细胞(在骨中) 
树突细胞(在淋巴组织中) 
小胶质细胞(在中央神经系统中) 
嗜中性细胞 
嗜酸性细胞 
嗜碱性细胞 
肥大细胞 
T淋巴细胞 
辅助T细胞 
阻遏物T细胞 
杀伤者T细胞 
B淋巴细胞 
IgM 
IgG 
IgA 
IgE 
杀伤者细胞 
血液和免疫系统的躯干细胞(各种) 
感觉转导 
光受体 
圆锥 
蓝色敏感的 
绿色敏感的 
红色敏感的 
听觉 
皮质器官的内部毛发细胞 
皮质器官的外部毛发细胞 
加速和重力 
耳朵的前庭器的I型毛发细胞 
耳朵的前庭器的II型毛发细胞 
味觉 
II型味蕾细胞 
嗅觉 
嗅觉神经元 
嗅觉上皮的基本细胞(嗅觉神经元的躯干细胞) 
血液pH 
颈动脉体细胞 
I型 
II型 
触觉 
表皮的梅克尔细胞 
特异于触觉的初级感觉神经元 
温度 
特异于温度的初级感觉神经元 
冷敏感的 
热敏感的 
疼痛 
特异于疼痛的初级感觉神经元 
在肌骨骼系统中的构型和压力 
本体感觉初级感觉神经元 
自律神经元 
胆碱能药 
类肾上腺素能药 
肽能药 
感觉器官和周边神经元的支持细胞 
皮质器官的支持细胞 
内部柱细胞 
外部柱细胞 
内部趾骨细胞 
外部趾骨细胞 
边界细胞 
亨森细胞 
前庭器的支持细胞 
味蕾的支持细胞(I型味蕾细胞) 
嗅觉上皮的支持细胞 
施旺细胞 
卫星细胞(包囊周边神经细胞体) 
肠道胶质细胞 
中央神经系统的神经元和神经胶质细胞 
神经元 
神经胶质细胞 
星形胶质细胞 
少突神经胶质细胞 
晶状体细胞 
丘脑晶状体上皮细胞 
晶状体纤维(含有晶体蛋白的细胞) 
色素细胞 
黑色素，视网膜的色素上皮细胞 
胚细胞 
卵原细胞/初级卵母细胞 
精母细胞 
精原细胞(精母细胞的主干细胞) 
护卫细胞 
卵泡细胞 
支持细胞(在睾丸中) 
胸腺上皮细胞 
主干细胞 
胚胎主干细胞 
胚胎胚细胞 
成人主干细胞 
胎盘主干细胞 
IX.诊断测试 
A)导言 
1)TRT测试 
本发明提供了各种种类的TRT，优选地hTRT和端粒酶的测试。这些测试特别地提供了敏感的，廉价的，方便的，和广泛的许多人疾病的诊断和预测的应用测试，这些疾病中，癌症是说明性的例子。如上所述，通常与大多数正常可灭细胞相比，在不灭人细胞中hTRT基因产物(蛋白质和mRNA)是升高的(即，端粒酶阴性细胞和大多数端粒酶阳性正常成人体细胞)。所以，在一个方面，本发明提供了用于检测或测量在来自或含有人或其它哺乳动物或真核细胞的样品中hTRT基因产物的存在，缺乏或定量的测试，以便鉴定细胞为不灭(如恶性肿瘤细胞)或可灭(如成人中的大多数正常体细胞)或鉴定为端粒酶阳性或阴性。 
存在或缺乏hTRT基因产物(即，蛋白质或RNA)鉴定的任何症状可以利用本文叙述的方法和材料进行诊断。这些包括如下文更完全地叙述，癌症，加速细胞增殖的其它疾病，免疫紊乱，可育性，不育性，和其它。另外，因为在癌细胞中端粒酶活性升高的程度是与肿瘤的特征如转移的潜在性相关，对hTRT，mRNA或蛋白质水平检测可以用于估计和预测肿瘤将来可能的进展。 
在一个方面，本发明的诊断和预测方法必须确定是否人TRT基因产物存在于生物样品中(例如，来自病人)。在第二个方面，确定了在生物样品(例如，来自病人)中的hTRT基因产物的丰度并且相当于对照样品(例如，正常细胞或组织)中的丰度。在第三个方面，在细胞或组织样品中确定了细胞或细胞内hTRT基因产物的定位。在第四个方面，测试寄主(例如病人)细胞以便鉴定具有不正常的hTRT基因表达(不正常量，调节，或产物)的遗传倾向的序列特征的核酸，如用于遗传筛选或遗传商议。在第五个方面，本发明的测试可用于检测抗hTRT抗体(例如，在病人血清中)的存在。在下面一些细节中叙述的方法是可以利用本文公开的序列和关系进行的有用的测试的证据。但是，这些测试的 许多变化或其它应用将是考虑本公开物后本领域的普通技术人员明了的。 
将被认识到的是，虽然在诊断和预测方法提供下面的测试，它们可以使用，不管何时检测，定量或定性hTRT基因，基因产物，或变异体。所以，例如，下面叙述的“诊断”方法可用于hTRT或人端粒酶的生产和纯化过程中hTRT或端粒酶的测试，以便鉴定起源于人细胞的细胞系(例如，鉴定不灭系)，以便鉴定细胞，非人动物，植物，真菌，细菌，或其它含有人TRT基因或基因产物(其片断)的生物体。 
如本文所用，术语“诊断”的常用意义是鉴定疾病(例如，癌症)，症状(例如，不育，活化)，或状态(例如，可育)的存在或特性，并且术语“预测”的常用意义是预测可能的发展和/或疾病和症状的后果。虽然，这两个术语有时在临床设置中的使用方式不同，但将能理解的是参考“诊断”，本文公开的任何测试或测试方式是同样适于确定预后性的，因为可以确定的是更高的端粒酶活性水平是与癌症病人更小的可治性相关，并且因为本发明提供了特异于hTRT的检测方法，hTRT的表达水平与细胞中的端粒酶活性紧密相关。 
2)癌症的诊断和预测 
上面的正常或标准范围的hTRT基因，mRNA或蛋白质水平的确定是存在端粒酶阳性细胞或不灭的细胞的证据，其中一些肿瘤细胞是例子。因为一些胚胎和胎盘细胞，以及一些成人主干细胞表达端粒酶，本发明同时提供了通过检测或分离来自母体血液的端粒酶阳性胎盘细胞，确定其它症状如怀孕的方法。这些值可以用于产生，或辅助产生诊断，甚至当这些细胞将不分类为癌的或利用传统的方法检测或分类。所以，本发明的方法允许检测或证实与至少在一些情况中，在早期具有增强现象的端粒酶相关的癌的和其它症状。本发明的测试通过提供hTRT基 因和基因产物的定量测试，允许辨别人肿瘤或其它细胞增殖疾病的不同类别和级别，从而简化适当的治疗方案和准确诊断的选择。另外，因为端粒酶的活性的水平可以用于区别良性和恶性肿瘤(例如，美国专利号5,489,508；Hiyama等人，1997，Proc.Am.Ass.CancerRes.38：637)，以便检测入侵的内在性(例如，美国专利号5,639,613；Yashima等人，1997，Proc.Am.Ass.Cancer Res.38：326)，和关系到转移的潜在性(例如，美国专利号，5,648,215；Pandita等人，1996，Proc.Am.Ass.Cancer Res.37：559)，这些测试将可用于预防，检测和治疗各种人癌症。 
为了癌症的预测(或其它升高的端粒酶为特征的疾病或症状)，如上所述确定了特定的肿瘤类型，类别，或级别的hTRT基因产物(mRNA或蛋白质)或活性的预后值。也可以确定(例如，利用本文公开的测试)在病人中的hTRT蛋白质或mRNA水平或端粒酶的活性和与预后水平比较。 
根据使用的测试方法，在一些情况中，不管何时测试检测，将认为样品中的hTRT基因产物的丰度升高。由于甚至在端粒酶阳性细胞中hTRTmRNA和蛋白质的低丰度，在正常或端粒酶阴性细胞中这些基因产物的稀少或不存在，如果在正常细胞中真正存在，检测hTRT基因产物需要敏感的测试。如果选择敏感性更小的测试，hTRT基因产物在健康的组织中将是不可检测的，而在端粒酶阳性的癌症或其它端粒酶阳性的细胞中将是可检测的。通常在升高的样品中hTRT基因产物的量至少约5，通常至少约10，更通常至少约50，非常常见的至少约100到1000倍高于端粒酶阴性对照细胞中或来自成人的健康组织的细胞中的水平，其中端粒酶阳性正常细胞的百分数是非常低的。 
本发明的诊断和预测方法可以用于任何起源的任何细胞或组织类型，并且可以用于检测任何起源的不灭或新生瘤细胞，或肿瘤组织， 或癌症。可以检测的癌症类型包括，但不限于，在hTRT的治疗应用的讨论中上面列出的所有这些。 
本发明的测试也用于检测待利用抗癌方案治疗的病人中的治疗干扰的效力。可以检测的抗癌方案包括所有目前被批准的治疗(包括，化学治疗，放射性治疗，和外科手术)并且也包括在将来待被批准的治疗，如本文叙述的端粒酶抑制或活化治疗。(参见，例如参见PCT公开号，96/01835和96/40868和美国专利号5,583,016，所有这些全部引入作为参考)。 
在另一个方面，下面叙述的测试可用于检测hTRT基因序列的一些变化(突变和遗传hTRT等位基因)，这些变化是与端粒酶活性的不正常调节相关的癌症或其它症状的偏好的证据(不育性，成熟年龄)。 
3)癌症以外的症状的诊断 
除了癌症的诊断，本发明的测试具有许多其它应用。本发明提供了细胞中端粒酶或hTRT基因产物的表达不足或过度表达为特征的症状或疾病的试剂和方法/诊断。在成人中，在正常人体细胞，例如躯干细胞，活化的淋巴细胞和躯干细胞，的有限的补充中正常发现低水平的端粒酶活性，并且是其它体细胞中缺乏的。所以，在细胞中hTRT或端粒酶活性的检测(其中细胞中通常缺乏或失活了这样的活性)，或通常以低水平存在hTRT的异常水平(即高于或低于正常)的细胞(例如主干细胞，活化的淋巴细胞和主干细胞)的检测可以诊断端粒酶相关疾病或症状，或用于鉴定或分离特异的细胞类型(即，为了分离主干细胞)。这样的疾病和症状的例子包括：细胞增殖的疾病，免疫紊乱，不育性，免疫细胞功能的疾病，怀孕，胎盘不正常，早熟老化，和其它。另外，本发明的测试可用于检测病人中或基于细胞或动物的测试中的治疗干扰的有效性(包括但不限于调节端粒酶活性的药物)。 
在一个方面，本发明提供了用于诊断不育性的测试。人生殖细胞(例如，精原细胞，它们的祖先或后代)能够不定地增殖，并且具有高端粒酶活性的特征。hTRT基因产物的不正常产物水平或产物或消失的水平可以导致精原细胞不适当或不正常的生产，导致不育或再生的紊乱。因此，本发明提供了诊断的测试和“基于端粒酶”的再生紊乱的治疗。同样，可以利用测试检测靶击或间接影响精子生成(将减少hTRT水平或端粒酶活性)避孕药(例如，男性避孕药)的效力。 
在另一个方面，本发明提供了端粒酶和hTRT水平的分析和在主干细胞，胎盘细胞，胚胎细胞，活化淋巴细胞和造血主干细胞中的功能的测试。例如，hTRT基因产物检测的测试通常可以用于检测免疫功能(例如，通过检测活化淋巴细胞的普遍性或祖先主干细胞的丰度)，以便鉴定或选择或分离活化的淋巴细胞或主干细胞(基于升高的hTRT水平)，并且检测靶击这些组织的治疗干扰的效力(例如，免疫阻遏试剂，或试图扩展主干细胞群体的治疗)。 
本发明同时提供了用于鉴定抗端粒酶和抗TRT免疫球蛋白(在来自病人的血清中发现)的测试。本文叙述的物质和测试可用于鉴定存在自身免疫抗体的病人，允许诊断和治疗与免疫球蛋白相关的症状。 
4)在培养物中检测细胞 
本文叙述的测试也用于来自体内或体外检测细胞中的hTRT基因产物的表达或细胞中hTRT基因的鉴定。因为，升高的hTRT水平是不灭细胞的特征，可以利用本发明的测试，例如筛选或鉴定不灭细胞或以便鉴定能够通过抑制hTRT表达或功能使不灭细胞可灭的试剂。例如，该测试将可用于鉴定通过增强细胞中hTRT的表达，例如通过重组hTRT的表达，或通过增强内源编码的hTRT的表达(例如通过启动子活化)成为不灭的细胞。 
同样，这些测试可用于检测转基因动物或细胞中的hTRT的表达(例如，含有hTRT基因的酵母或人细胞)。特定地，在表达本发明的hTRT的人或非人细胞中hTRT水平上的一些治疗(例如，已知的或推断的端粒酶拮抗物的应用)的效果可用于鉴定有用的药物和候选药物(例如，端粒酶活性调节药物)。 
B)正常，诊断的，和预测值 
可以进行hTRT基因产物的存在或定量的测试，以各种方式解释的结果取决于测试的方式，待测试的样品的特性，和搜索的信息。例如，hTRT基因产物的稳定状态的丰度在大多数人体组织中是低的，以致一些测试不能检测到。另外，在这些组织的细胞中，通常没有端粒酶活性，证明活性非常容易。相反地，在其它端粒酶阳性组织，例如恶性肿瘤中，hTRT蛋白质和/或hTRTmRNA或端粒酶是足够丰富的，以致利用同样的测试可以检测它们。甚至在这些体细胞类型中，通常其中端粒酶活性的低水平可以检测(例如，主干细胞，和一些活化的造血系统细胞)，hTRTmRNA和端粒酶活性的水平是不灭细胞中的水平的小部分(例如估测为约1％或更低)；所以，通过本发明的方法可以容易地区别不灭和可灭细胞。令人满意的是，当利用“较小的敏感性”的测试，在生物样品中的hTRT基因产物的稀少的测试本身可能是诊断的，没有其它分析的需要。另外，虽然下面叙述的测试可能是相当敏感的，如果需要，它们也可以更加不敏感(例如，虽然明智选择了缓冲液，洗涤条件，扩增循环的次数，试剂，和/或选择信号扩增剂)。所以，最终，可以设计任何测试，以致检测到只在生物样品中的hTRT基因产物，这些生物样品中基因产物以特定的浓度存在，例如高于健康或其它对照组织的浓度。在这一情况中，任何hTRTmRNA或蛋白质的可检测水平将认为在来自出生后的人体细胞组织的细胞(除了造血细胞和其它主干细 胞)中是升高的。 
但是，在一些情况中，如人所愿的是当使用能够检测存在于使用的正常体细胞中的非常低水平的hTRT基因产物的非常敏感的测试，可以确定hTRT基因产物表达水平的正常或基准值(或范围)。根据本领域技术人员已知的标准方法，和利用本发明的方法和试剂可以确定任何特定的群体，亚群，或生物体组的表达或正常表达水平的正常水平。通常，通过定量从正常(健康)受试者，例如人受试者获得的生物样品(例如，体液，细胞或组织)中的mRNA和/或hTRT蛋白质的量可以确定hTRT蛋白质或hTRTmRNA的基准(正常)水平。对于一些样品和目的，可以希望定量每个细胞或每个肿瘤细胞，基底上的hTRT基因产物的量。为了确定样品的细胞性，可以测量构成性表达基因产物的水平或在取样的细胞类型中表达已知水平的其它基因产物。可替代地，通过定量已知是健康的细胞或组织中hTRT蛋白质/RNA的量可以确定hTRT蛋白质或hTRTmRNA的正常值，这些细胞或组织是从收集疾病细胞的同样病人或健康个体中获得的。可替代地，在一些情况中可以定义培养物中的非不灭人体细胞中存在的水平为基准水平。正常(基底)值在不同细胞类型中(例如，在睾丸中hTRT mRNA水平将高于肾中)，或根据年龄，性别，或病人的物理症状有一些不同是可能的。所以，例如当利用测试确定癌症相关的hTRT水平的变化，用于确定hTRT基因产物表达的正常范围的细胞可以是来自相同或不同年龄的人的细胞，取决于研究的特性。用于分子遗传学的标准统计学上方法的应用允许确定表达的基准水平，以及允许鉴定来自这样的基准水平的明显偏差。 
在进行本发明的诊断和预则方法中，如上所述，称为“诊断性”和“预测值”有时是有用的。如上所述，“诊断值”指为了在样品中检测hTRT基因产物确定的值，当与hTRT基因产物的正常(或“基准”) 范围比较时，是疾病存在的证据。通过高端粒酶活性(例如，癌症)，缺乏端粒酶活性(例如，不育性)，或一些中间值可以鉴定疾病。“预后值”是指给定细胞类型(例如，恶性肿瘤细胞)中检测的hTRT基因产物的量，该量是与疾病(例如，癌症)的特定的诊断和预测一致的。将样品中检测的hTRT基因产物的量(包括零量)与细胞的预后值比较，以致值的相对比较表明存在疾病或可能的疾病(癌症)发展的后果。在一个实施方案中，例如，为了评估肿瘤预后性，收集数据以便获得不同肿瘤类别或级别与hTRT水平的统计学上的明显的关系。确定从具有已知的临床后果的受试者获得的同样的细胞或组织样品的hTRT水平的预定范围。产生足够的测量数目以便产生统计学上明显的值(或值的范围)，将该值作比较。然后，可以利用给定的细胞或组织样品的hTRT水平或活性的预定范围确定有关有利(或更少不利)的预后性(例如，在癌症情况中的“低水平”)的hTRT基因产物的水平的值或范围。同样可以确定在癌症的情况中对应于有关(或更多)不利预后性的“高水平”的范围。然后可以确定来自生物样品(例如，病人样品)的hTRT基因产物的水平，并且与低和高范围比较，并且用于预测临床后果。 
虽然上面的讨论指用于例举的癌症，将能够理解的是对于其它疾病(例如，细胞增殖的疾病)和症状也可以确定诊断和预后值，并且对于除了癌症以外的疾病或症状，“高”水平可能与需要的后果相关，“低”水平与不利的后果相关。例如，一些疾病可以主干细胞，活化淋巴细胞，或胚系细胞中端粒酶活性的缺陷(例如，低水平)为特征。在这样的情况中，与同样年龄和/或类型(例如，来自其它病人或特定的病人中的其它组织)的细胞相关的hTRT基因产物的“高”水平可能与有利的后果相关。 
令人满意的是测试方法不必定需要hTRT的绝对值的测量，除非这 样需要，因为对于本发明的方法的许多应用，相对值足够了。当需要定量时，本发明提供了试剂，以致最终可以使用任何已知的定量基因产物的方法。 
本发明的测试也可以用于评估动物研究，临床试验，或检测个别病人的治疗中的特定的治疗处理方案的效力。在这些情况中，在开始治疗之前，确定病人的基准值，并且在治疗的过程通常是规则地，重复测试一次或多次，评估是否hTRT水平作为治疗的结果是朝着需要的终点(例如，当测试是对于癌症的，减少hTRT的表达)是如人所愿的。 
一个技术人员将认识到的是，除了hTRT基因产物的量或丰度，通过比较正常表达水平和正常表达产物也可以鉴定变异体或正常表达方式(例如，RNA拼接变异体的不正常量)或变异体或不正常表达产物(例如突变转录物，截短或无意义多肽)。在这些情况中，“正常”或“基准”的确定包括鉴定健康生物体和/或组织(即，没有hTRT表达失调或赘生性生长的生物体和/或组织)和测量变异体hTRT基因产物的表达水平(例如，拼接变异体)，或测序或检测hTRT基因，mRNA，或逆转录cDNA，以便获得或检测典型(正常)序列变化。用于分子遗传学的标准统计学方法的应用允许确定来自这样的基准水平的明显偏差。 
C)TRT基因产物的检测和定量 
如本文已经强调，通常在大多数正常体细胞中，存在的hTRT基因产物的水平极端低。例如，mRNA编码hTRT蛋白质在所有迄今研究的端粒酶阴性细胞类型中极端少或缺乏。在不灭细胞如293细胞中，hTRTmRNA可以每细胞只有约100个拷贝存在，而正常体细胞中，每细胞可能具有少至一个或零个拷贝。所以，将能够明了的是，当需要hTRT基因产物的高度敏感的测试，有时在测试方式中引入信号或靶扩增技术有时是有利的。参见例如，Plenat等人，1997，病理学年评，17：17(荧光 -tyramide信号扩增)；Zehbe等人，1997，病理学杂志，150：1553(催化报道储藏)；本文列出的其它参考(例如，对于cDNA信号扩增，对于PCR和其它靶扩增方式)；和其它本领域已知的技术。 
如上所述，在本文公开的测试中定量hTRTmRNA或蛋白质经常不是必须的，因为hTRT基因产物的检测(在测试条件下，其中在对照，例如，端粒酶阴性细胞中产物是不可检测的)本身对于诊断是足够的。正如另一个实施例中，当测试(例如肿瘤)和对照(例如，健康细胞)样品中，存在的产物的水平是直接比较时，定量可能是不必要的。 
但是，当需要时，根据测量的方法和便利，以各种方式可以叙述本文叙述的测试中测量的hTRT基因产物的量。所以，hTRT蛋白质/mRNA的正常，诊断，预测，高或低的量可以表示为每个生物样品量的重量的标准单位(例如，每克组织的皮克，每1012个细胞皮克)，表示为每个生物样品量的分子的数目(例如，转录物/细胞，摩尔/细胞)，表示为每个细胞或每个其它单位量的活性单位，或通过同样的方法。hTRT基因产物的量也可以表示成与另一个分子的量相关；例子包括：在样品中的hTRT转录物的数目/在样品中的28SrRNA转录物的数目；hTRT蛋白质的纳克/总蛋白质的纳克；和诸如此类。 
当在两个(或移)不同的样品中测量hTRT基因产物时，两个样品的一个共同的比较原理有时是有用的。例如，当将正常组织和癌组织的样品比较时，可以比较等量的组织(重量，体积和细胞数，等等)。可替代地，可以利用标记分子的等当物(例如，28SrRNA，hTR，端粒酶活性，端粒长度，肌动蛋白)。例如，在含有10皮克28SrRNA的健康组织样品中的hTRT蛋白质的量可相当于含有同样量的28SrRNA的疾病组织的样品。 
同时，将认识到最终，本文叙述的任何测试可以设计成定量的。通 常，利用已知量或起源的hTRT基因产物(例如，利用本发明的方法和组合物产生的)校正测试。 
在一些实施方案中，选择测试模式，可以检测在样品中(或在代表性样品中)，每个细胞中hTRT等位基因或基因产物的存在，缺乏，或丰度。这样的方式的例子包括通过组织学(例如，具有信号增强，或靶增强扩增步骤的免疫组织化学)，或荧光活化细胞分析或细胞分拣(FACS)检测信号。当处理高度异源的细胞群体(例如，含有多重细胞类型，其中只有一种或少数几种类型的hTRT水平升高，或以不同水平表达端粒酶同样的细胞的群体，)时，这些方式是特别有利的。 
D)样品收集 
在生物样品中，优选地检测和/或定量hTRT基因或基因产物(即，mRNA或多肽)。这样的样品包括但不限于，细胞(包括完整的细胞，细胞组分，细胞提取物，和培养的细胞或细胞系)，组织(包括血液，血液细胞(例如，白细胞)，和组织样品，如细针活体组织样品(例如，来自前列腺，胸，甲状腺，等等))，体液(例如，尿，痰，羊水，血液，腹水，胸液，精液)，或收集它们的细胞(例如收集尿的膀胱细胞，收集血液的淋巴细胞)，培养基(来自培养细胞或细胞系)，和洗液(例如，来自膀胱和肺)。生物样品也可以包括组织的切片，如为了组织学目的取的冷冻切片。为了癌症诊断和预测，从癌或癌前或怀疑的癌组织或肿瘤获得的样品。冷冻生物样品以便后分析有时是符合需要的(例如，当检测药物治疗的效力)。 
在一些情况中，在分析之前可以分级分离细胞或组织。例如，在来自病人的组织活体中，可以利用细胞分拣器(例如，荧光活化细胞分拣器)根据已知的方法，按照特征如表面抗原的表达(例如，肿瘤特异抗原)分拣细胞。 
虽然样品通常取自人病人或细胞系，但是可以利用测试检测来自其它动物的样品中的hTRT同源基因或基因产物。可替代地，在表达人TRT蛋白质或核酸序列的转基因动物或生物体中可以测试hTRT基因和基因产物。 
如果需要，必须在适当的缓冲液或浓缩的稀释液中稀释，预处理样品。可以利用任何数目的标准水溶液缓冲液，它利用各种各样的缓冲液之一，如磷酸，Tris-缓冲液，或诸如此类，生理pH。 
从病人获得的“生物样品”可以指“生物样品”或“病人样品”。将会认识到的是“病人样品”的分析并不需要从病人中除去细胞或组织。例如，在病人注射适当的标记hTRT结合试剂(例如，抗体或核酸)并且利用标准成象技术(例如，CAT，NMR，和诸如此类)可见(当结合靶时)。 
E)核酸测试 
在一个实施方案中，本发明提供了检测和/或定量hTRTmRNA的表达的方法(包括拼接或序列变异体和可选择的等位基因)。在可选择的实施方案中，本发明提供了检测和分析正常或不正常hTRT基因(或其片断)的方法。这样的定性或定量的测试的形式可以包括，但不限于有或没有信号扩增的基于扩增的测试，基于杂交的测试，和扩增-杂交联合的测试。本领域技术人员将会认识到是，为了便利起见，杂交和扩增之间的区别只是：如在下面的例子中的说明，许多测试方式涉及杂交和扩增的元件，以致在一些情况中，选择目录有时是任意的。 
1)制备核酸 
在一些实施方案中，利用从细胞，组织，生物体，或待测试的细胞系中分离的核酸的样品，进行核酸测试。根据本领域技术人员已知的许多方法的任何一个可以从样品“分离”核酸(例如，基因组DNA，RNA 或cDNA)。在本文章中，“分离”指从混合物中的任何其它物质分离出待检测的种类或靶，但不必需表明靶的纯化的明显程度。一个技术人员将认识到的是，当待检测hTRT基因的拷贝数改变时，基因组DNA是待检测的靶。相反地，当待检测一个基因或几个基因的表达水平时，RNA是基于核酸的测试的靶。在一个优选的实施方案中，核酸样品是生物样品中的总mRNA(即，聚(A)+RNA)。分离核酸的方法是本领域的技术人员已知的，并且在例如，Tijssen，P，编辑，生物化学和分子生物学中的实验室技术：与核酸探针的杂交，部分I，理论和核酸制备，Elsevier，纽约(1993)第3章，引入本文作为参考中有叙述。在一个实施方案中，利用盐酸胍-酚-氯仿提取方法从给定的样品中分离总核酸，并且通过低聚dT柱层析或通过(dT)n磁性珠分离聚(A)+mRNA(参见，例如，Sambrook等人，和Ausubel等人，出处同上)。 
在可选择的实施方案中，在进行扩增，杂交或其它测试之前，不必从生物样品中分离核酸(例如，总或聚A+RNA)。当测量hTRTRNA时，这些实施方案是具有一些优点的，因为它们在分离和操作的过程中减少了失去hTRTmRNA的可能性。例如，利用渗透细胞(组织学样品和FACS分析)完全溶解的细胞，或粗细胞组分如一些细胞提取物可以进行上面定义的许多扩增技术如PCR和RT-PCR。优选地，如果需要，采取步骤保藏靶核酸的完整性(例如，mRNA)(例如，加入RNAase抑制剂)。扩增和杂交测试也可以原位进行，例如在来自活体组织样品或来自细胞单层(例如，血液细胞或分解的组织培养细胞)的薄组织切片中。在完整的整个细胞或固定细胞中也可以扩增。例如，如本领域已知，例如利用聚合酶或连接酶，引物或各种引物，和(脱氧)核糖核苷酸三磷酸(如果利用了聚合酶〕，逆转录酶和引物(如果RNA是待转录的，和cDNA是待检测的)，在固定，渗透，或微注射细胞可以原位进行PCR，RT-PCR， 或LCR扩增方法，扩增靶hTRTRNA或DNA。然后，可以检测含有需要的hTRTRNA(例如，端粒酶阳性细胞)或hTRTDNA序列的细胞。当结合显微镜，FACS分析或等当方法，使用荧光标记的dNTP，引物，或其它成分时，这一方法经常利用。 
2)基于扩增的测试 
在一个实施方案中，本发明的测试是用于检测hTRT基因或基因产物的基于扩增的测试。在基于扩增的测试中，扩增了所有或部分hTRT基因或转录物(例如，mRNA或cDNA；下文也称为“靶”)，然后直接或间接检测扩增产物。当没有基因或基因产物作为模板时，没有产生扩增产物(例如，预期大小)，或扩增是非特异的，通常不是单一的扩增产物。相反地，当存在基因或基因产物，扩增的是靶序列，提供了存在和、或定量基本的基因或mRNA的证据。基于靶扩增的测试是本领域技术人员已知的。 
本发明提供了用于检测hTRT基因和基因产物的各种各样引物和探针。这样的引物和探针与hTRT基因或基因产物足够互补以便与靶核酸杂交。通常，引物在长度上至少是6个碱基，通常在约10和约100个碱基之间，典型地在约12和约50个碱基之间，和经常在约14和约25个碱基之间。一个技术人员在参阅了本公开物之后，将能够利用常规方法，选择引物以扩增全部或部分hTRT基因或基因产物，或者将变异体基因产物，hTRT等位基因，和诸如此类区别开。表2说明性地列出了用于hTRT，或特异的hTRT基因产物或区域的PCR扩增的引物。如本领域已知，单个低聚物(例如，美国专利号5,545,522)，嵌套低聚物，或甚至低聚物的简并库可以用于扩增，例如，如出处同上所述四膜虫TRTcDNA的扩增叙述的。 
本发明提供了各种方法用于扩增和检测hTRT基因或基因产物，包 括聚合酶链式反应(包括所有的变异体，例如，逆转录酶PCR；Sunrise扩增系统(Oncor公司，GaithersburgMD)；和许多其它本领域已知的方法)。在一个说明性的实施方案中，在含有核酸样品(例如，通过hTRTRNA逆转录获得的cDNA)，各100微摩尔/升各种dNTP(dATP，dCTP，dGTP和dTTP；PharmaciaLKB生物技术，NJ)，hTRT特异性PCR引物，1单位/Taq聚合酶(Perkin Elmer，Norwalk CT)，1×PCR缓冲液(50毫摩尔/升氯化钾，10毫摩尔/升Tri s，pH8.3，在室温下，1.5毫摩尔/升MgCl2，0.01％明胶)的50微升溶液，进行扩增循环约30次，其中在94℃45秒，55℃45秒，和72℃90秒进行PCR扩增。但是，正如将认识到的是，可以产生许多变化使用于任何特定的反应的PCR扩增最佳化。 
其它适当的靶扩增方法包括连接酶链式反应(LCR；例如，Wu和Wallace，1989，基因组4：560；Landegren等人，1988，科学，241：1077，Barany，1991，美国科学院年报，88：189和Barringer，等人，1990，基因89：117)；链替代扩增(SDA；例如，Walker等人，1992，美国科学院年报，89：392-396)；转录扩增(例如，Kwoh等人，1989，美国科学院年报，86：1173)；自我维持序列复制(3SR；例如，Fahy等人，1992，PCR方法应用，1：25；Guatelli等人，1990，美国科学院年报87：1874)；基于核酸序列的扩增(NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario；；例如，Compton，1991，自然，350：91)；基于转录的扩增系统(TAS)；和自我维持序列复制系统(SSR)。前面提到的每个公开物引入本文作为参考。PCR的一个有用的变异体是PCRELISA(例如，Boehringer MannheimCat.NO.1636111)，其中将洋地黄毒苷dUTP引入PCR产物。使PCR反应混合物变性，并且与设计为与PCR产物的内部序列退化的生物素标记的低聚核苷酸杂交。在链霉抗生物素包衣的平板上固定杂交产物，并且利用抗洋地黄毒苷的抗体检测。在下面的PCR技术中可以发现足 以指导技术人员利用体外扩增的方法的技术的例子：DNA扩增的原理和应用，H.Erlich，Freeman出版社，纽约，NY(1992)；PCR方案：方法和应用的指导，Innis，Gelfland，Snisky，和White，学术出版社，圣地亚哥，CA(1990)；Mattila，等人，1991，核酸研究，19：4967；Eckert和Kunkel，(1991)PCR方法和应用，1：17；PCR，McPherson，Quirkes，和Taylor，IRL出版社，Oxford；美国专利号4,683,195，4,683,202，和4,965,188；Barringer等人，1990，基因，89：117；Lomell等人，1989，临床化学杂志，35：1826，其中每个引入本文作为参考，用于所有目的。 
例如通过如凝胶电泳确定的大小；通过固体支持物上，如小珠，膜，玻片，或条带上与固定靶核酸杂交；通过测序；免疫学地例如通过PCR-ELISA，通过荧光，磷光，或放射性信号的检测；或通过其它各种已知的手段可以直接分析扩增的产物。例如，检测方法的说明性例子利用了结合荧光素和作为淬灭剂的苯甲酸的衍生物的发夹环扩大的PCR引物，以致只有当出现未折叠的引物结合它们的靶和复制子时，才放射荧光。 
因为hTRTmRNA通常是作为极其稀少的转录物表达的，这些转录物甚至在端粒酶阳性细胞中以非常低的水平存在。经常需要的是最佳化或增强来自扩增步骤的信号。为了这样做的一个方法是增强扩增的循环的数目。例如，虽然对于在各种标准反应条件下的聚合酶链式反应的大多数mRNA的扩增，20-25次循环是恰当的，但是在许多样品中，hTRTmRNA的检测可能需要30到35次之多的循环的扩增，这取决于检测的方式和扩增的效力。将能认识到的是只有当在测试样品中存在阈值量的靶(即，只有具有高水平的hTRTmRNA的样品给出“阳性”结果)时，包括扩增循环的次数的扩增条件的明智选择可以用于设计产生扩 增产物的测试。另外，这些方法已知是能够增强靶序列扩增产生的信号。用于扩大检测扩增靶的能力的方法包括信号扩增系统如：分支的DNA信号扩增(例如，美国专利号5,124,246；Urdea，1994，生物/技术，12：926)；Tyramide信号扩增(TSA)系统(Du Pont)；催化信号扩增(CSA；Dako)；Qβ复制酶系统(Tyagi等人，1996，美国科学院年报，93：5395)；或诸如此类。 
本领域的一个技术人员将满意的是不管使用什么扩增方法，如果需要定量，可以使用本领域已知的各种定量方法。例如，当需要时，在单个样品中两个或多个聚核苷酸可以共扩增。这一方法可以用作定量样品中hTRTmRNA的量的方便的方法，因为在靶和对照聚核苷酸的同样的反应中，可以进行逆转录和扩增反应。可以利用对照的聚核苷酸的共扩增(通常以已知的浓度或拷贝数存在)使与样品中的hTRT的量比较样品中的细胞数正常化。适当的用于共扩增反应的对照聚核苷酸包括DNA，从管家基因表达的RNA，组成性表达的基因，和体外合成的RNA或加入反应混合物的DNA。内源对照聚核苷酸是那些已经在样品中存在的，而外源对照聚核苷酸是加入样品中的，产生“粗短刺”反应。说明性的对照RNA包括β肌动蛋白，GAPDH RNA，snRNA，hTR，和内源表达的28SrRNA(参见，Khan等人，1992，Neurosi，Lett.147：114)。外源对照聚核苷酸包括合成AW106cRNA，它可以作为有意义链从pAW106通过T7聚合酶合成。令人满意的是对于待使用于定量的共扩增方法，通常对照和靶聚核苷酸必需是在线性范围扩增的。定量PCR的详细方案可以在下面PCR方案中发现：方法和应用的指导，Innis等人，学术出版社，纽约(1990)和Ausubel等人，出处同上(15单元)和Diaco，R.(1995)设计定量PCR测试的实际考虑，在PCR策略中，节84-108页，Innis等人，学术出版社，纽约。 
根据内源或外源标准的序列，可以在共扩增反应中利用不同的引物系列。在一个方法中，所谓竞争性扩增，定量PCR包括利用用于靶核酸的扩增(一个2引物的对)。同样的引物同时共扩增已知量的对照序列，在可选择的实施方案中，已知为非竞争性扩增，利用不同的引物(即，2引物的2对)扩增对照序列和靶序列(例如，hTRTcDNA)。在另一个可替代的实施方案中，所谓的半竞争性扩增，利用了三个引物，其中一个是特异于hTRT的，其中一个是特异于对照的，和其中另一个能够与靶和对照序列退火。美国专利号5,629,154，引入本文作为参考中叙述了半竞争性扩增。 
3)基于杂交的测试 
a)概述 
利用核酸杂交技术的特异的DNA和RNA测量的各种方法是本领域技术人员已知的(参见，Sambrook等人，出处同上)。基于杂交的测试指其中探针核酸与靶核酸杂交的测试。通常，本发明的核酸杂交探针完全或基本上与hTRT基因或RNA序列的连接序列相同。优选地，核酸探针是至少约10个碱基，经常至少约20个碱基，和有时至少约200个碱基或更长的长度。选择核酸探针序列用于核酸杂交的方法在出处同上中Sambrook等人中讨论了。在一些方式中，至少一个靶和探针是固定的。固定的核酸可以是DNA，RNA或其它低聚或多聚核苷酸，并且可以含有天然或非天然存在的核苷酸，核苷酸类似物，或骨架。这样的测试可以是几个方式中的任何一个，包括Southern，Northern点和条带影印，高密度多聚核苷酸或低聚核苷酸排列(例如，GeneChipTMAffymetrix)，蘸条，针，片或小珠。所有这些技术是本领域技术人员已知的，并且是许多商业可得诊断试剂盒的基础。杂交技术通常在Hames等人的核酸杂交，实验途径，IRL出版社(1985)；Gall和Pardue美国 科学院年报，63：378-383(1969)；和John等人自然223：582-587(1969)中有叙述。 
各种核酸杂交方式是本领域技术人员已知的。例如，一个普通的方式是直接杂交，其中靶核酸与标记，互补探针杂交。通常，标记的核酸是用于杂交的，标记提供了可检测的信号，评估hTRT mRNA的存在，缺乏或定量的一个方法是将样品的RNA进行Nouthern转移，并且进行特异于核酸探针的标记hTRT的杂交，如实施例2说明的。如上面所述，当hTRT mRNA完全存在时，在大多数细胞中存在的量是非常低的。所以，当利用Northern杂交时，利用扩增步骤经常是需要的(或，可替代地，大量的起始RNA)。评估样品中编码hTRT蛋白质的DNA的存在，缺乏或定量的有用的方法包括将样品中DNA进行Southern转移，并且与标记的hTRT特异核酸探针杂交。 
其它常用的杂交方式包括夹心测试或竞争和替代测试。夹心测试是检测或分离核酸序列的商业有用的杂交测试。这样的测试利用了与固体支持物共价固定的“捕获”核酸，和在溶液中的标记“信号”核酸。生物的或临床的样品将提供靶核酸。“捕获”核酸和“信号”核酸探针与靶核酸杂交形成“夹心”杂交复合物。为了有效，信号核酸不能与捕获核酸杂交。 
b)基于薄法和基于玻片的测试 
本发明同时提供了用于hTRT基因产物的基于探针的杂交测试，这些基因产物利用了hTRT核酸可以杂交的固定的低聚核苷酸或多聚核苷酸的排列(即，一些，但通常不是所有，或甚至是大多数，固定的低聚或聚核苷酸)。高密度低聚核苷酸排列或多聚核苷酸排列提供了有效地检测靶核酸(例如，hTRT基因，mRNA，或cDNA)的存在和特征(例如，序列)的手段。这些技术已知是用于生产含有与定义的序列在表面的确定 位置互补的上千低聚核苷酸的排列，其中利用了光能摄象技术用于原位合成(参见，例如美国专利号5,578,832；5,556,752；和5,510,270；Fodor等人，1991，科学，251：767；Pease等人，1994，美国科学院年报，91：5022；和Lockhart等人，1996，自然生物技术14：1675)或其它快速合成的方法，和定义的低聚核苷酸的储藏(Blanchard等人，1996，生物传感器和生物电子11：687)。当使用这些方法时，已知序列的低聚核苷酸(例如，20聚体)是直接在表面如衍生的玻片上合成的。通常，产生的排列是冗余的，在特异于待检测的hTRT多聚核苷酸的薄片上具有几个低聚核苷酸探针。 
可以设计低聚核苷酸探针的联合以便检测可替代的拼接mRNA或鉴定在特定的样品中表达的各种hTRT等位基因。 
在一个说明性实施方案中，扩增了(例如，利用PCR)通过逆转录来自测试细胞的总RNA制备的cDNA。通常，例如通过掺入荧光标记的dNTP标记扩增产物。然后，将标记的cDNA与含有与各种hTRT基因的亚序列互补的低聚核苷酸探针的薄片杂交。通过本领域已知的方法确定杂交的位置(例如，根据Shalon等人，1996，基因组研究，6：639或Schena等人，1996，基因组研究6：639)，并且从杂交的模式推测序列(或其它信息)。 
在一个实施方案中，将两个cDNA样品，每个用不同的荧光基团标记，与同样的薄片杂交。然后测试每个标记样品与hTRT基因的互补位置杂交的比例。如果两个样品含有同样量的hTRT mRNA，两个荧光物质的比例将是1∶1(令人满意的是来自荧光物质的信号可能需要调节到荧光物质的摩尔敏感度中的任何差异所用的量)。相反地，如果一个样品是来自健康(或对照)组织，并且第二个样品是来自癌组织，那么在第二个样品中使用的荧光物质是占优势的。 
c)原位杂交 
检测编码hTRT蛋白质的基因的表达的可替代的手段是原位杂交。原位杂交测试是本领域技术人员已知的，并且通常在Angerer等人，酶学方法，152：649-660(1987)和Ausubel等人，出处同上中叙述了。在原位杂交测试中，将细胞或组织样品固定于固体支持物上，通常在渗透状态时，通常在玻片上。然后，将细胞与杂交溶液在中等的温度接触，以便允许完全或基本与hTRT互补的标记的核酸探针(例如，35S-标记的核探针，荧光标记的探针)退火。通过洗涤和/或核酸酶消化除去游离的探针，并且在玻片上通过放射自显影或适当的成象技术直接可见结合的探针，如本领域技术人员已知。 
4)变异体的特异检测 
如上所述，和实施例(例如，实施例9)所述，可以选择扩增引物或探针提供扩增产物，该产物跨越特异的缺失，截短，和插入，从而简化特异的变异体或hTRT mRNA中的不正常性的检测。 
可以检测的hTRT变异体基因的产物的一个例子是如上所述和实施例9中所述的产物(SEQUENCE ID NO：4)的hTRTRNA。但是，如果任何Δ182变异体的生物功能是未知的；推测变异体编码的截短的hTRT蛋白质可能包括在端粒酶活性的调节中，例如通过组装滴定端粒酶成分的非功能性端粒酶RNP。可替代地，端粒酶活性的负调节可以通过以导致全长mRNA的消失，和减少hTRTmRNA水平，和增强Δ182hTRTRNA水平的方式指导hTRT前mRNA(新生mRNA)加工来完成。对于这些和其它原因，检测Δ182变异体的能力是可用的。另外，有时在样品中是需要的，其中存在两个hTRTRNA种类(如编码全长hTRT蛋白质的Δ182hTRTRNA和hTRTRNA)，可以比较它们的相对和/或绝对丰度。 
本发明提供各种方法用于检测Δ182变异体。例如，利用跨越182个碱 基对的缺失的引物对的扩增将导致对应于缺失和未缺失的hTRT RNA的不同大小的产物，如果两类存在，可以在大小的基础上区别(例如，通过凝胶电泳)。用于扩增跨越182个碱基的缺失的区域的引物对的例子包括TCP1.14和TCP1.15(引物系列1)，或TCP1.25和bTCP6(引物组2)(参见表2)。这些引物对可以单个使用或在嵌套的PCR实验中使用，其中引物组1可首先使用。对于一个技术人员，也将明了的是利用本发明的hTRT核酸探针的杂交方法(例如，Northern杂交)或RNAse保护测试可以用于检测和区别hTRT RNA变异体。 
另一个适当的方法必需承担利用三个引物的PCR扩增(或等当物)。与出处同上，更详细叙述的半竞争性定量PCR方法的类似，一个引物特异于每个hTRT RNA种类(例如，表4说明)和一个引物是与两个种类(例如，TCP1.25(2270-2288))互补。特异于SEQUENCE ID NO：1的引物的一个例子是在182个核苷酸序列(即，SEQUENCE ID NO：1中的核苷酸2345到2526)内退火的一个，例如TCP1.73(2465-2445)。例如，特异于SEQUENCE ID NO：4的引物(Δ182变异体)是在SEQUENCE ID NO：4的核苷酸2358-2339(即，对应于SEQUENCE ID NO：1的182核苷酸插入片断的位点)退火的一个。与编码全长hTRT蛋白质的种类比较，Δ182hTRTmRNA种类的绝对丰度或它的相对丰度可以用于分析与细胞状态的关系(例如，不定增殖的能力)。将会认识的是，许多其它引物或扩增或检测方法可以基于本公开物选择。 
表4 
说明性引物 
Δ182种类(例如，SEQUENCE ID NO：4)特异引物： 
5’-GGCACTGGACGTAGGACGTG-3’ 
hTRT(SEQUENCE ID NO：1)特异引物(TCP1.73)： 
5’-CACTGCTGGCCTCATTCAGGG-3’ 
共同(正向)引物(TCP1.25)： 
5’-TACTGCGTGCGTCGGTATG-3’ 
可以检测的其它变异体hTRT基因或基因产物包括通过早熟终止密码子，缺失，替代，或插入为特征的那些。通过基因，mRNA转录物，或cDNA的大小降低可以检测缺失。通过基因，mRNA转录物或cDNA的大小增加可以检测插入片断。类似地，通过基因，mRNA转录物，或cDNA的增加的大小可以检测插入。插入和缺失也可以引起读码框架中的移动，导致过早的终止密码子和更长的开放读码框架。通过探针杂交也可以检测替代，缺失和插入。通过观察在变异体hTRT多肽的大小的变化(例如，通过Western分析)或通过杂交或特异扩增如适当也可以检测变化。可替代地，根据标准方法，通过基因或基因产物的测序也可以确定突变。另外，如上所述，可以选择扩增测试和杂交探针特异地靶击特定的异常。例如，可以选择特异地杂交或扩增包含缺失，替代或插入的各自区域的核酸探针或扩增引物。当hTRT基因含有这样的突变，探针将(1)不能杂交，或者扩增反应将不能提供特异的扩增，或引起扩增产物或杂交信号的大小的变化；或(2)探针或扩增反应包含全部的缺失或缺失的末端(缺失接合处)；或(3)同样地，可以选择特异地靶击点突变或插入的探针的扩增引物。 
5)检测突变hTRT等位基因 
hTRT基因中的突变可以负责疾病起始或可以对疾病症状起作用。hTRT的基因组DNA的变化可以影响基因转录的水平，改变hTRT蛋白质的氨基酸残基，引起产生截短的hTRT多肽，改变前mRNA的加工途径(可以改变hTRTmRNA水平)，和引起其它结果。 
在非hTRT座位中的基因组DNA的变化也可以通过改变负责调节hTRT，hTR，和端粒酶相关蛋白质表达和加工和RNA组装和运输的酶或细胞过程影响hTRT或端粒酶的表达。影响hTRT表达，加工，或RNP组装的变化可能对于癌进展，老化的疾病，DNA损坏的疾病或其它是重要的。 
根据本文的方法，以各种方法，可以完成hTRTmRNA或它的基因，和基因对照元件中的突变的检测。说明性的例子包括下面内容：可以利用命名为引物筛选的技术；设计PCR引物，它的3’末端与可能突变的样品DNA(或RNA)中的核苷酸退火。如果，通过引物扩增DNA(或RNA)，那么，3’末端匹配基因中的核苷酸；如果不扩增DNA，那么一个或两个末端不匹配基因中的核苷酸，表面存在突变。同样的引物设计可用于利用连接酶链式反应(LCR，出处同上叙述)用于测试点突变。限制性片断长度的多形性，RFLP(Pourzand，C.，Cerutti，P.(1993)突变研究288：113-121)，是另一个可以用于本发明方法的技术。利用hTRT特异探针探测利用各种限制酶消化的人基因组DNA的Southern印迹。在样品和对照之间的片断数目或大小中的差异表明实验样品的变化，通常是插入或缺失。单链构型多形性，SSCP(Orrita，M.等人(1989)PNASUSA86：2766-70)，是另一个技术，可以用于本发明的方法。SSCP是基于变性野生型和突变的单链DNA(通常PCR产生)的不同迁移。单链DNA将取三维构型，是特异于序列的。序列差异小至单个碱基的变化可以导致非变性凝胶上的迁移变换。SSCP是一个广泛使用的突变筛选方法，因为它的简单性。变性梯度凝胶电泳，DGGE(Myers，R.M.Maniatis，T.和Lerman，L.(1987)酶学方法，155：501-527)是另一个技术，可以用于本发明的方法。DGGE基于双链DNA的熔化行为鉴定突变。使用特异的变性电泳仪器用于观察实验和对照DNA的熔化方案：含有突变的DNA 将具有与在这些凝胶系统中的对照可比的不同迁移率。讨论的例子通常说明使用的技术；许多其它技术存在，它们是本领域技术人员已知的，并且可以根据本文涉及的技术应用。 
F.核型分析 
本发明进一步提供用于利用hTRT序列探针的核型或其它染色体分析，和/或检测或定位来自如病人，人细胞系，或非人细胞中的染色体中的hTRT基因序列的方法和试剂。在一个实施方案中，hTRT基因的扩增(即，拷贝数的变化)，缺失(即，部分缺失)，插入，替代，或染色体定位(例如，易位)中的变化可能与病理症状或素质的存在相关，以便发展病理症状(例如，癌症)。 
本发明人已经确定的是，在正常人细胞中，hTRT基因图谱靠近染色体5p的端粒(参见，实施例5，出处同上)。最近的STS标记是D5S678(参见图8)。可以利用定位来鉴定与hTRT基因紧密连接的标记。可以利用标记鉴定YAC，STS，柯斯质粒，BAC，λ或P1噬菌体，或其它克隆，其中含有hTRT基因组序列或对照因子。可以利用标记或基因定位扫描在正常hTRT基因定位构造，或与癌症或疾病类型的存在相关的序列中改变的人组织样品，。这一信息可以用于包含的疾病或癌症的诊断或预测方式。另外，hTRT基因的任何改变的特性可以关于细胞变成不灭的特性的信息。例如，易位事件可以表明通过用以不适当的方式指导hTRT转录的另一个启动子替代hTRT启动子，在一些情况中发生了hTRT表达的活化。这种类型的本发明的方法和试剂可以用于抑制hTRT活化。定位也可以用于在正常体细胞中确定hTRT基因的阻遏的特性，例如，是否定位是非表达异染色质的部分。核酸酶超敏感测试用于区别异染色质和常染色质，在Wu等人，1979，细胞16：797；Groudine和Weintraub，1982，细胞30：131Gross和Garrard，1988，生物化学年评， 57：159。 
在一个实施方案中，利用本领域已知的各种方法的任何一个通过核型分析，鉴定hTRT基因的变化。一个有用的技术是原位杂交(ISH)。通常，当原位杂交技术用于核型分析时，将可检测的，或可检测标记的探针与染色体样品原位杂交，以便定位hTRT基因序列。通常，ISH含有一个或多个下面的步骤：(1)待分析的组织，细胞或其它生物结构的固定，(2)生物结构的预杂交处理以便增强靶DNA的可接近(例如，利用热或碱变性)，和减少非特异结合(例如，通过封闭重复序列的杂交能力，例如，利用人基因组DNA)；(3)一个或多个核酸探针(例如，常规核酸，PNA，或含有其它核酸类似物的探针)与生物结构或组织中的核酸杂交；(4)杂交后洗涤除去在杂交中未结合的核酸片断；和(5)杂交核酸片断的检测。根据特定的应用，可以改变对于它们的使用在各个步骤和条件中使用的试剂。将会认识到意的是这些步骤可以在各种本领域技术人员已知的方式中进行改良。 
在ISH的一个实施方案中，利用荧光标记物将hTRT探针标记(原位荧光杂交；“FISH”)。通常，需要利用双重荧光原位杂交，其中利用了两个探针，每个用不同的荧光染料标记。利用一种染料标记与需要的hTRT序列杂交的测试探针，利用第二种染料标记与不同区域杂交的对照探针。与需要的染色体的稳定部分杂交的探针，如着丝粒区，可以用作对照核酸。以这种方式，可以说明样品和样品的杂交效力之间的差异。 
可以所述核酸的纳克量进行检测染色体不正常性的ISH方法(例如，FISH)。可以利用石蜡包埋的正常组织或肿瘤切片，如can fresh，或冷冻物质，组织或切片。因为FISH可以用于限制物质，也可以利用从未培养的初级肿瘤制备的接触制剂(参见，例如，Kallioniemi等人， 1992，Cytogenet.Cell Genet.60：190)。例如可以利用来自肿瘤的小生物活体组织样品用于接触制备(参见。例如，Kallioniemi等人，出处同上)。也可以分析从体液(例如，血液，尿，痰，和诸如此类)中的呼吸生物活体或细胞获得的小数目细胞。对于生育前诊断，适当的样品将包括羊膜体液，母本血液，和诸如此类。用于本文公开的方法或试剂的有用的杂交方案叙述如下：Pinkel等人，1988，美国科学院年报，85：9138；EPO公开号430，402；Choo，编辑，分子生物学中的方法，33卷，原位杂交方案，Humana出版社，Totowa，新泽西，(1994)；和Kallioniemi等人，出处同上。 
用于核型分析的其它技术，包括例如如定量的Southern影印，定量的PCR，或竞争性基因组杂交的技术(Kallioniemi等人，1992，科学258：818)，其中利用了可以用于鉴定生物样品中染色体上的hTRT序列的扩增，缺失，插入，替代或重排的本发明的hTRT探针和引物。 
G)TRT多肽测试 
1)概述 
本发明提供了检测和定量hTRT多肽的方法和试剂。这些方法包括分析的生物化学方法如电泳，质谱，凝胶移动，毛细管电泳，层析方法，如大小排除层析，高效液相层析(HPLC)，薄层层析(TLC)，超扩散层析，和诸如此类，或各种免疫方法，如液体或凝胶沉淀素反应，免疫扩散(单个或双重)，免疫电泳，放射性免疫电泳(RIA)，酶联免疫吸附测试(ELISA)，免疫荧光测试，Western影印，质谱，和其它下面所述的方法和参考本公开物本领域技术人员明了的那些。 
2)电泳测试 
在一个实施方案中，在电泳蛋白质分离中检测hTRT多肽；在一个方面，利用了二维电泳系统。利用电泳技术的检测的方法是本领域技 术人员已知的(通常参见，R.Scopes(1982)蛋白质纯化，Springer-Verlag，N.Y.；Deutscher，(1990)酶学方法，182卷，蛋白质纯化的指导，学术出版社，纽约)。 
在相关的实施方案中，利用了迁移率变动测试(例如，参见Ausubel等人，出处同上)。例如，标记的hTR将与hTRT相关，在电泳基础上，在非变性聚丙烯酰胺凝胶中和诸如此类中以改变的迁移率迁移。所以，例如，如果(非强制性标记的)hTR探针或(非强制性标记的)端粒酶引物混合了含有hTRT的样品，或与hTRT共表达(例如，在无细胞表达系统中)，样品中hTRT蛋白质的存在(或编码hTRT的聚核苷酸)将导致可检测的hTR迁移率的变化。 
3)免疫测试 
a)概述 
本发明也提供了利用一个或多个本发明的抗体试剂的hTRT多肽的检测方法(即，免疫测试)。如本文所用，免疫测试是利用特异地结合hTRT多肽或表位的抗体的测试(如本文广泛定义，和特异地包括片断，嵌合体，和其它结合试剂)。采用本领域技术人员已知的各种方法可以产生本发明的抗体，例如出处同上所述。 
适于本发明的实践的许多已经确立的免疫结合测试方式是已知的(参见例如，美国专利号4,366,241；4,376,110；4,517,288；和4,837,168)。参见例如，细胞生物学方法，第37卷，细胞生物学中的抗体Asai，编辑，学术出版社，纽约(1993)；基本和临床免疫学，第7版，Stites和Terr，编辑(1991)；Harlow和Lane，出处同上[例如，第14章]和Ausubel等人，出处同上，[例如，第11章]，每个全部引入本文作为参考，用于所有目的。通常，免疫结合测试(或免疫测试)利用“捕获试剂”特异地结合和经常固定分析物。在一个实施方案中， 捕获试剂是特异地结合hTRT多肽或亚序列的成分，如抗hTRT抗体。在可替代的实施方案中，捕获试剂可以在一定条件下结合hTRT相关蛋白质或RNA，在所述条件下hTRT相关分子仍然结合hTRT(以致如果hTRT相关分子是固定的，hTRT蛋白质同样是固定的)。将能够理解的是，在各种测试中，其中捕获hTRT相关分子，结合hTRT蛋白质将通常存在，以致，例如利用抗hTRT抗体或诸如此类可以检测。检测蛋白质的复合物的免疫测试是本领域技术人员已知的(参见，例如Harlow和Lane，出处同上，第583页)。 
通常，利用可检测的标记直接或间接检测待测试的hTRT基因产物。用于测试中的特定的标记或可检测基团通常不是本发明的关键方面，只要它不明显干扰用于测试中的抗体或各种抗体的特异结合。该标记可以共价地附着于捕获试剂(例如，抗TRT抗体)，或者可以附着于第三个成分，如另一个特异地结合例如，hTRT多肽(在不同于捕获试剂识别的表位中)，捕获试剂(例如，抗(第一个抗体)免疫球蛋白)的抗体；抗TRT抗体；结合抗TRT抗体的抗体；或抗体/端粒酶复合物(例如，通过结合相关分子，如端粒酶结合蛋白质)。也可以标记能够结合用于本测试中的抗体的其它蛋白质，如蛋白质A或蛋白质G。在一些实施方案中，利用不止一个标记分子是有用的(即，可以相互区别的)。另外，当通过捕获试剂(例如，抗hTRT抗体)结合的靶(例如，固定)是复合物(即，hTRT和TRT结合蛋白质，hTR，或其它TRT结合分子的复合物)，可以使用识别结合hTRT蛋白质的蛋白质或RNA的标记抗体。当复合物是蛋白质-核酸复合物(例如，TRT-hTR)，报道分子可能是聚核苷酸或其它识别复合物的RNA成分分子(例如，酶)。 
一些免疫测试模式不需要利用标记成分。例如，凝聚测试可以用于检测靶抗体的存在。在这种情况中，抗原包衣颗粒是通过含有靶抗体 的样品凝聚的。在这一方式中，成分不需要标记，并且通过简单可见观察可以检测靶抗体的存在。 
b)非竞争性测试的方式 
本发明提供了用于检测hTRT多肽的竞争性和非竞争性免疫测试的方法和试剂。非竞争性免疫测试是直接测量捕获分析物(在hTRT的情况中)的量的测试。一个这样的测试是利用与hTRT蛋白质上的两个非干扰表位反应的单克隆抗体的两位点，基于单克隆的免疫测试。参见，例如Maddox等人，1983，实验医学杂志，158：1211可参考背景信息。在一个优选的“夹心”测试中，捕获试剂(例如，抗TRT抗体)直接结合它固定的固体底物。然后，这些固定抗体捕获测试存在于样品中的任何hTRT蛋白质。然后，可以通过结合第二个含有标记的抗hTRT抗体标记这样固定的hTRT。可替代地，第二个抗hTRT抗体可能缺乏标记，但与特异于第二个抗体起源的种类的抗体的标记的第三个抗体结合。可替代的方式第二个抗体可替代地可以利用可检测的成分，如生物素进行修饰，该成分可以与第三个标记分子特异地结合，如酶标记链霉素抗生物素蛋白。 
c)竞争性测试方式 
在竞争性测试中，通过测量利用样品中存在的hTRT蛋白质替代或竞争去除来自捕获试剂(例如，抗TRT抗体)的加入的hTRT(外源)的量间接测量样品中存在的hTRT蛋白质的量。在一个竞争性测试中，在样品中加入已知量的标记hTRT蛋白质，并且然后使样品与捕获试剂(例如，特异地结合hTRT蛋白质的抗体)接触。结合抗体的外源(标记)的hTRT蛋白质的量与样品中存在的hTRT蛋白质的浓度成反比。在一个实施方案中，抗体固定在固体底物上。通过测量存在于TRT/抗体复合物中的hTRT蛋白质的量，或可替代地通过测量仍然未复合的TRT蛋白质 的量可以确定结合抗体的hTRT蛋白质的量。提供标记hTRT分子可以检测hTRT蛋白质的量。 
半抗原抑制测试是竞争性测试的另一个例子。在这一测试中，将hTRT蛋白质固定在固体底物上。在样品中加入已知量的抗TRT抗体，然后，将样品与固定的hTRT蛋白质接触。在这种情况中，结合固定的hTRT蛋白质的抗TRT抗体的量与样品中存在的hTRT蛋白质的量成比例。通过检测抗体的固定的部分或仍然在溶液中的抗体的部分可以检测固定的抗体的量。在这一方面，检测可以是直接的，其中抗体是标记的，或间接的，其中标记物结合特异地结合如上所述的抗体的分子。 
d)其它测试方式 
本发明同时提供了通过利用免疫影印方式(Western影印)检测和定量在样品中存在的hTRT的试剂和方法。在这种方式中，通过凝胶电泳(例如，在分子量的基础上)从其它样品成分分离样品中的hTRT多肽，将分离的蛋白质转移到适当的固体支持物上(例如，硝酸纤维滤纸，尼龙滤纸，衍生尼龙滤纸，或诸如此类)，并且利用本发明的抗TRT抗体温育支持物。在固体支持物上，抗TRT抗体特异地结合hTRT或其它TRT。这些抗体可以直接标记，或可替代地可以随后利用标记的抗体(例如，标记的羊抗小鼠抗体)或其它特异地结合抗TRT抗体的标记试剂检测。 
其它测试方式包括脂质体免疫测试(LIA)，其中利用设计结合特异的分子(例如，抗体)和释放包囊试剂或标记的脂质体。然后，释放的化学物质可以根据标准技术检测(参见，Monroe等人，1986，Amer.Clin.Prod.Rev.5：34)。 
如上所述，当在异源样品(如含有正常和恶性细胞的活体组织样品)中测量hTRT基因产物时，利用FACS(或等当仪器或方法)的测试方式具有优点。 
e)底物，固体支持物，膜，过滤器 
如上所述，根据测试，将各种成分，包括抗原，靶抗体，或抗hTRT抗体可以结合到固体表面或支持物(即，底物，膜或过滤纸)。各种固体表面的固定的生物分子的许多方法是本领域技术人员已知的。例如，固体表面可以是膜(例如，硝酸纤维膜)，微滴盘(例如，PVC，聚丙烯，或聚苯乙烯)，测试管(玻璃或塑料)，蘸条(例如，玻璃，PVC，聚丙烯，聚苯乙烯，乳汁和诸如此类)，微型离心管，或玻璃或塑料小珠。需要的成分可以共价地结合或通过非特异结合非共价地附着。 
各种各样有机和无机多聚物，天然和合成可以用作固体表面的物质。说明性的多聚物包括聚乙烯，聚丙烯，聚(4-甲基丁烯)，聚苯乙烯，聚异丁酸，聚(乙烯对苯二酸)，rayon，尼龙，聚(乙烯基丁酸)，聚偏二氟乙烯(PVDF)，硅氧烷，聚甲醛，纤维素，纤维素乙酸，硝酸纤维素，和诸如此类。可以利用的其它物质包括纸，玻璃，陶瓷，金属，非金属，半传导物质，水泥或诸如此类。另外，形成凝胶的物质如蛋白质(例如，明胶)，脂多糖，硅酸盐，琼脂糖和聚丙烯酰胺是可以利用的。形成几个水相的多聚物，如葡聚糖，聚亚烷基二醇或表面活性剂，如磷脂，长链(12-24个碳原子)烷基铵盐和诸如此类也是适当的。当固体表面是多孔的时，可以根据系统的特性利用各种孔大小。 
在制备表面中，可以利用不同物质的复数，特别是作为薄片，以便获得各种特性。例如，可以利用蛋白质包衣，如明胶，以便避免非特异结合，简化共价接合，增强信号检测或诸如此类。 
如果在混合物和表面之间的共价结合是需要的，通常表面将是多功能的或者能够成为多功能化的。可以存在于表面和用于连接的功能基团可以包括羧酸，甲醛，氨基基团，氰基基团，烯基基团，羟基，巯基基团和诸如此类。将各种化合物连接到各种表面的方法是本领域已知 的，并且在文献中充分说明了。参见，例如固定酶学，IchiroChibata，Halsted出版社，纽约，1978，和Cuatrecasas(1970)生物化学杂志，245：3059)。除了共价结合，可以利用各种非共价结合测试成分的方法。非共价结合通常是化合物非特异地吸附到表面。 
本领域的普通技术人员将认识到的是，经常需要减少免疫测试中的非特异结合。特定地，当测试包括固定在固体支持物上的抗原或抗体时，需要将与底物非特异结合的量降到最小。降低这种非特异性结合的手段是本领域技术人员熟知的。通常，这包括利用蛋白质组合物包衣底物。特定地，蛋白质组合物如小牛血清白蛋白(BSA)，非脂肪粉末牛奶，和明胶广泛地与有时优选的的奶粉一起使用。可替代地，设计表面以致它非特异地结合一个成分但不明显地结合另一个。例如，含有凝聚素如伴刀豆球蛋白A的表面将结合含有化合物但没有失去糖基化的标记的蛋白质的碳水化合物。美国专利4.447576和4254082综述了用于测试成分的非共价吸附的各种固体表面。 
H)抗TRT抗体的测试 
本发明同时提供了检测特异于hTRT免疫球蛋白的试剂和测试。在一个实施方案中，将固定的hTRT(例如，结合微测试平板孔的重组hTRT)与来自病人的血清在各种条件下一起温育，其中抗hTRT抗体，如果存在，结合了固定的hTRT。在洗涤除去非特异结合免疫球蛋白后，如果它们存在，通过加入可检测的标记的抗(人Ig)抗体可以检测结合的血清抗体(可选择的实施方案，和变化是本领域的技术人员已知的，参见，例如，Harlow，出处同上，第14章)。这些测试可用于检测任何来源包括动物或人血清或载体如盐中的抗hTRT抗体。在一个实施方案中，利用测试检测或监测病人中的hTRT蛋白质的免疫应答，特定地自我免疫(例如，抗端粒酶)应答。抗hTRT抗体可能存在于来自患有自我免疫 疾病或其它症状的病人的血清或其组织或体液中。 
I)测试联合他 
在各种联合中可以进行本文叙述的诊断和预测测试，也可以结合其它诊断或预测测试进行。例如，当存在的方法可以用于检测病人样品中癌细胞的存在时，hTRT的存在可以用于确定疾病的时期，是否特定的肿瘤似乎是入侵邻近组织或转移到远处位置，和是否似乎癌症重现了。可以提供其它信息的测试包括生物活体样品的显微镜分析，检测结合肿瘤发生相关的抗原(例如，细胞表面标记)(例如，利用组织化学，FACS，或诸如此类)，成象方法(例如，在对病人给药标记的抗肿瘤抗体)，端粒酶活性测试，端粒长度测试，hTR测试，或诸如此类。这一的联合测试可以提供关于疾病进展的有用的信息。 
将同时认识到的是测试的联合可以提供有用的信息。例如，如上所述，hTRTmRNA的测试可以结合hTR的测试(人端粒酶RNA)或端粒酶活性(即，TRAP)测试，以便提供关于端粒酶组装和功能的信息。 
J)试剂盒 
本发明也提供了用于筛选，监测，诊断和预测具有端粒酶相关的症状的病人，或确定细胞或细胞系中hTRT的表达水平的试剂盒。试剂盒包括确定hTRT基因产物(RNA或蛋白质)的存在或缺乏或定量hTRT基因的表达的一种或多种试剂。优选的试剂包括特异地结合hTRT基因，RNA，cDNA，或其一部分，的核酸引物和探针，以及蛋白质，肽，抗体，和对照引物，探针，低聚核苷酸，蛋白质，肽，和抗体。可以包括其它物质，包括酶(例如，逆转录酶，DNA聚合酶，连接酶)缓冲液，试剂(标记，dNTP)。 
可替代地试剂盒可以包括，或结合本文叙述的任何其它成分的，特异地结合hTRT多肽或其亚序列的抗体。抗体可以是单克隆或多克隆的。 抗体可以结合另一个成分，如标记和/或它可以固定在固体支持物上(底物上)。试剂盒也可以含有第二个抗体以便检测hTRT多肽/抗体复合物，或检测杂交核酸探针，以及一个或多个hTRT肽或蛋白质以便用作对照或其它试剂。 
抗体或杂交探针可以是游离的，或固定在固体支持物上的，如试管，微滴平板，蘸条和诸如此类。试剂盒也可以含有涉及在检测TRT的测试中的抗体或杂交探针的使用的说明物质。试剂盒可以含有适当的检测标记，或标记阳性和阴性对照，洗涤溶液，稀释缓冲液和诸如此类的试剂。 
在一个实施方案中，试剂盒包括扩增hTRTmRNA的引物对。这样的试剂盒也可以包括hTRT扩增DNA和/或聚合酶，缓冲液，dNTP和诸如此类的探针。在另一个实施方案中，试剂盒包括探针，非强制性地标记探针。在另一个实施方案中，试剂盒含有抗体。 
X.鉴定端粒酶活性的调节物 
A.概述 
本发明提供了调节端粒酶或端粒酶成分(例如，hTRT蛋白质)的活性或表达的化合物和治疗剂。本发明也提供了鉴定调节端粒酶活性或表达的化合物和治疗剂的测试和筛选方法(包括高生产率的筛选)。这些端粒酶活性和表达的调节物(下文称为“调节物”)包括端粒酶激动剂(增强端粒酶活性和/或表达)和端粒酶拮抗物(降低端粒酶活性和/或表达)。 
本发明的调节物具有各种用途。例如，涉及治疗人疾病的有效治疗试剂的端粒酶调节物。拮抗剂活性和转录或翻译活化剂的筛选提供了增强细胞内端粒酶活性的组合物(包括端粒依赖性的复制能力，或“部分”端粒酶活性)。这样的拮抗剂组合物提供了固定正常未转化的细胞， 包括可以表达有用的蛋白质的细胞的方法。这样的拮抗剂也可以提供控制细胞衰老的方法。相反地，拮抗物活性的筛选提供了降低端粒依赖性复制能力的组合物，从而使不灭细胞如癌细胞可灭。拮抗物活性的筛选提供了降低端粒酶活性的组合物，从而防止了展示未调节细胞生长的细胞如癌细胞的未限制的细胞分裂。本文列出了利用调节物可以治疗的说明性疾病和症状，例如，在VII和IX，出处同上部分中所述。通常，不管何时需要增强或降低细胞或生物体中的端粒酶活性，可以利用本发明的调节物。所以，除了用于疾病的治疗中，增强hTRT表达水平的调节物可以用于生产具有通常如部分VIII，出处同上所述的特性的培养人细胞系，和各种本领域技术人员将明了的各种其它用途。 
当给药化合物或治疗剂改变编码端粒酶成分(例如，编码hTRTmRNA的基因)的转录速度或水平时，调节端粒酶或端粒酶成分的“表达”的化合物或治疗剂将影响编码端粒酶成分的RNA的稳定性或转录后加工(例如，运输，拼接，多聚化，或其它修饰)，影响编码的蛋白质(例如，hTRT)的翻译，稳定性，翻译后加工，或修饰，或改变功能(例如，催化活性)端粒酶RNP的水平。当给药化合物或治疗剂改变端粒酶活性的化合物或治疗如任何部分IV(B)所述的活性，出处同上(例如，包括持续的，或非持续的端粒酶催化活性；端粒酶持续合成能力；常规逆转录酶活性；溶核活性；引物或底物结合活性；dNTP结合活性；RNA结合活性；端粒酶RNP组装；和蛋白质结合活性)时化合物或治疗剂影响端粒酶“活性”。将令人满意的是在“活性”中的变化和“表达”中的变化之间的不需要明显的表示，这些术语为了容易地讨论并不用于限制。同样令人满意的是本发明的调节物应该特异地影响端粒酶的活性或表达(例如，没有通常地改变管家蛋白如肌动蛋白的表达)，而不是， 例如通过靶细胞的非特异毒性减少端粒酶成分的表达。 
B.鉴定端粒酶调节物的测试 
本发明提供了筛选能够影响端粒酶或端粒酶成分的表达，能够修饰端粒酶的DNA复制能力，或其他修饰端粒酶和TRT蛋白质的能力以便合成端粒DNA(“全部活性”)的组合物或化合物的方法和试剂。本发明同时提供了筛选任何或全部hTRT的“部分活性”的调节物。所以，本发明提供了可以用于筛选增强端粒酶活性的试剂的测试，例如，通过引起通常不表达的细胞中hTRT蛋白质或端粒酶的表达，或通过在端粒酶阳性细胞中增强端粒酶活性水平。 
端粒酶或端粒酶亚单位蛋白质或它们的催化或免疫原性片断或其低聚肽可以用于在任何种类的药物筛选技术中筛选治疗化合物。用于这样的测试中的片断可以是在溶液中游离的，固定在固体支持物上的，包含在细胞表面上的，或细胞内定位的。可以测量在端粒酶或亚单位蛋白质和待测试的试剂之间形成的结合复合物。 
在各种实施方案中，本发明包括筛选拮抗物的方法：结合酶活性位点；抑制RNA成分，端粒酶结合蛋白质，核苷酸，或端粒DNA与端粒酶或hTRT蛋白质的结合；促进酶复合物的分解；干扰端粒酶RNA成分(例如，hTR)的转录；或抑制任何如本文所述的“部分活性”。本发明提供筛选抑制核酸和/或端粒酶结合组合物与hTRT的结合如hTRT与hTRT的结合或hTRT与人p80或p95类似物或另一个结合蛋白质的结合，或hTRT与端粒或核苷酸的结合的组合物；筛选促进酶复合物例如抗hTR抗体或hTRT的分解或促进结合(即组装)的组合物；筛选影响酶的持续合成能力的试剂；和筛选核酸和其它结合端粒酶的其它组合物，如与hTR互补的核酸的方法。本发明进一步涉及筛选增强或降低hTRT基因的转录和/或hTRT基因产物的翻译的组合物。本发明同时涉 及筛选动物中，在一个实施方案中，在动物如转基因动物中，通过再构成端粒酶活性，或抗端粒酶活性筛选端粒酶调节物的方法。本发明提供了体内测试系统，包括“敲出”模型，其中内源端粒酶，端粒酶RNA成分和/或端粒酶结合蛋白质的一个或多个单位已经缺失和受到抑制。全部或部分内源端粒酶活性可以保留或缺乏。在一个实施方案中，再构成全部或部分外源端粒酶活性。 
在本发明的一个实施方案中，提供了各种部分活性的端粒酶测试以便鉴定各种不同类别的端粒酶活性的调节物。本发明的“部分活性”测试允许鉴定端粒酶活性调节物的类别，可以不在“全部活性的”端粒酶测试中检测。一个部分活性测试包括TRT和端粒酶的非持续合成能力活性。Morin(1989)细胞，59：521-529；同时参见Prowse(1993)“鉴定来自小鼠细胞的非持续合成端粒酶活性”，美国科学院年报90：1493-1497中叙述了端粒酶的持续合成特性。本发明的另一个部分活性测试开发了端粒酶的“逆转录酶类似”活性。在这些测试中，可以测试hTRT蛋白质的逆转录酶活性。参见Lingner(1997)“端粒酶的催化亚单位中的逆转录酶基序”科学276：561-567。本发明的另一部分活性测试开发了hTRT和端粒酶的“溶核活性”，包括酶至少除去一个核苷酸，通常是鸟苷，来自引物的3’链。已经在四膜虫端粒酶中，Collins(1993)“四膜虫端粒酶催化溶核裂解和非持续的延长”基因发展7：1364-1376中观察到溶核活性。本发明的另一部分活性测试包括分析hTRT的和端粒酶的结合核苷酸的能力，该能力是作为它的酶持续DNA聚合化活性的部分。本发明的另一部分活性测试包括分析hTRT或端粒酶的结合它的用作端粒合成的模板的RNA成分，即来自人细胞的hTR的能力。本发明的另一部分活性的测试包括分析hTRT和端粒酶结合体内染色体或结合再构成系统中体外低聚核苷酸引物，或结合与 染色体结构相关的蛋白质的能力(参见，例如这样的蛋白质，Harrington(1995)生物化学杂志，270：8893-8901)。结合hTRT的染色体结构包括例如，端粒重复DNA，端粒蛋白质，组蛋白，核基质蛋白质，细胞分裂/细胞周期控制蛋白质和诸如此类。 
在一个实施方案中，鉴定调节物的测试包括将一个或多个细胞(即，测试细胞)与测试化合物接触，和确定是否测试化合物影响细胞中端粒酶(或端粒酶成分)的表达或活性。通常这一确定含有将测试细胞中的活性或表达与已经接触测试化合物的同样的细胞或各种细胞(即，对照细胞)同样的测试细胞中的活性或表达进行比较。可替代地，细胞提取物可以用于替代完整的细胞。在相关的实施方案中，对多重细胞生物体(例如，植物或动物)给药测试化合物。对细胞或多重细胞生物体，端粒酶或端粒酶成分是完全内源的(即，天然存在的内源基因编码的)，或者可以是重组细胞，或含有一个或多个重组表达端粒酶成分(例如，hTRT，hTR，端粒酶结合蛋白质)转基因生物体，或者可以具有两个内源和重组成分。所以，在一个实施方案中，对可灭细胞给药端粒酶活性调节物。在另一个实施例方案中，对不灭细胞给药端粒酶活性调节物。例如，可以通过对已知展示明显量的端粒酶活性的细胞如癌细胞，给药推断的抑制组合物，并且测量是否端粒酶活性，端粒长度降低，可以鉴定端粒酶介导的DNA复制的拮抗物，或者观察到增殖能力，所有这些是具有拮抗物活性的化合物的证据。 
在另一个实施方案中，通过检测核糖核蛋白复合物(RNP)包括TRT(例如，hTRT)和模板RNA(例如，hTR)，的端粒酶活性中的变化鉴定调节物，其中RNP在体外再构成(例如，如实施例7中所述，出处同上)。 
仍然在另一个实施方案中，通过检测细胞，动物，体外表达系统，或其它表达系统中TRT基因产物(例如，RNA或蛋白质)的表达中的变化 鉴定调节物。 
仍然在另一个实施方案中，通过改变报道基因的表达，如实施例15中所述，可以鉴定调节物，它的表达是通过天然存在TRT调节元素如启动子或增强子全部或部分调节的。在相关的实施方案中，对测试化合物结合端粒酶成分(例如，hTRT)，RNA，或基因调节序列(例如，TRT基因启动子)的能力进行测试。 
在另一个实施方案中，通过观察hTRT前mRNA加工例如，可替代地拼接产物，可选择的多聚腺苷酸化事件，RNA裂解，和诸如此类中的变化鉴定调节物。在相关的实施方案中，通过检测变异体hTRT多肽的产生可以观察到调节物的活性，其中一些可以具有优势阴性的端粒酶调节活性。 
影响蛋白质的表达和活性的化合物的鉴定测试方式是生物技术和药物工业中已知的，出处同上提供的说明性测试的许多其它测试和变化将是本领域技术人员已知的。 
通过任何适当的方法可以测量端粒酶活性或表达的变化。利用本领域技术人员已知的方法可以测试端粒酶成分(例如，hTRT蛋白质)或前体(例如，hTRTmRNA)的表达水平中的变化。其中一些如本文上面所述，例如在IX部分中，并且包括通过杂交(例如，利用本发明的TRT探针和引物)，免疫测试(例如，利用本发明的抗TRT抗体)，RNAse保护测试，扩增测试，或本文所述或本领域已知的任何其它适当的检测手段检测TRT基因产物(例如蛋白质和RNA)的水平。在样品中核酸的定量(例如，评估RNA，例如hTR或hTRTmRNA的水平)也用于评估顺式或反式转录调节物。 
同样地，利用如本文所述的方法(如在IV(B)章节，见上文)或其它端粒酶功能的测试可以测量端粒酶活性中的变化。当需要时，端 粒酶活性的定量可以通过任何方法包括那些本文公开的进行。通过检测和测量它们对端粒酶活性的体内，来自体内，或体外影响，或通过它们对端粒长度(如通过染色，利用标记杂交探针或其它手段测量或检测)的影响，或简单地，通过抑制端粒酶阳性癌细胞的细胞分裂(导致称为“危机”或M2衰老(Shay，1991)生物化学，生物活体组织，Acta1072：1-7)可以鉴定引起或加速端粒结构的丢失的端粒酶拮抗物，其中癌细胞已经通过端粒酶的活化，但在缺乏端粒酶时，将导致染色体缺失和重排导致的衰老或死亡而超过。体内人端粒酶活性的再构成提供了筛选来自任何起源的细胞或动物中的端粒酶调节物的方法。这样的拮抗剂可以在本发明的活性测试中鉴定，包括测量端粒长度中的变化。其它测量细胞中端粒酶活性的测试包括累积或丢失端粒结构的测试，TRAP测试或定量聚合酶链式反应测试。 
在一个实施方案中，本发明的测试也包括其中测试化合物产生在hTRT的活性中统计学上明显降低的方法，如通过在底物中掺入标记的核苷酸测量的，这与在缺乏测试化合物的平行反应中掺入标记的相对量比较，从而确定了测试化合物是端粒酶抑制剂。 
本发明的方法可以从科学和专利文献和本领域已知的叙述的方案修改。例如，当本发明的端粒酶或TRT蛋白质可用于鉴定作为端粒酶活性的调节物的组合物，大量的潜在用途的分子可以在单个测试中筛选。调节物可以具有对端粒酶活性具有抑制剂(拮抗物)或增强(激动剂)影响。例如，如果待筛选1000个抑制剂的小组，所有1000个抑制剂可以潜在地置于微滴孔并且同时测试。如果发现这样的抑制剂，然后可以将1000的库细分成100的10个库，重复该过程，直到单个抑制剂得到鉴定。 
在药物筛选中，检测了大量化合物，作为端粒酶调节物的能力，通 过高生产率的筛选技术大大加速了过程。本文叙述了全部或部分端粒酶活性的测试可能适于在高生产率技术中使用。那些本领域的技术人员将满意的是存在许多完成本目的的方法。 
在Geysen的“确定氨基酸序列抗原性”(Geysen，WO申请号84/03564，1984年9月13日公开，引入本文作为参考)中详细叙述了药物筛选的另一个技术，它可以用于高生产率筛选具有适当的端粒酶或端粒酶蛋白质亚单位的结合亲和力的化合物。概括地说，在固体上，底物上如塑料栓或一些其它的表面合成大量的不同小肽测试化合物。将肽测试化合物与端粒酶或端粒酶蛋白质亚单位的片断反应并且洗涤。然后，通过本领域已知的方法检测结合的端粒酶或端粒酶蛋白质亚单位。也可以将基本纯化的端粒酶或端粒酶蛋白质亚单位直接包衣在平板上，用于前面提到的药物筛选技术。可替代地，非中和抗体可以用于捕获肽并且将它固定在固体支持物。 
本发明同时涉及竞争性药物筛选测试的用途，其中能够结合端粒酶或亚单位蛋白质的中和抗体与测试化合物竞争结合端粒酶或亚单位蛋白质。抗体也可以用于检测任何肽的存在，这些肽共有一个或多个具有端粒酶或亚单位蛋白质的抗原决定簇。 
在美国专利号5,645,986，引入本文作为参考中已经叙述了鉴定端粒酶活性的调节物的其它方法。将会认识的是本发明提供了部分通过提供试剂如hTRT聚核苷酸，探针和引物，高度纯化的hTR，hTRT和端粒酶以及抗端粒酶和抗TRT抗体的试剂的对目前已知的方法的改进，所有这些可以用于测试，例如，作为对照，标准，结合或杂交试剂，或其它。 
将认识到的是本发明的重组生产的端粒酶和TRT(例如，hTRT)可以用于鉴定调节物的测试。筛选测试可以利用端粒酶活性全部或部分再 构成或现存的活性的扩大派生的端粒酶或hTRT。本发明提供的测试或筛选可以用于测试端粒酶合成端粒DNA的能力，或测试如上所述的hTRT和TRT的一个或所有“部分活性”。测试可以掺入细胞的体外修饰，这些细胞已经进行操作表达具有或没有RNA成分或结合蛋白质的端粒酶，这些可以再植入动物，这些动物可以用于体内测试。所以，本发明提供了体内测试和本文利用的转基因动物。这些体内测试系统可以利用“敲出”细胞，其中一个或几个单位的内源端粒酶复合物已经被缺失或抑制，以及利用再构成或活化外源或内源端粒酶活性的细胞。 
以位点特异的方式(位点特异变突)已经修饰端粒酶和TRT蛋白质，以便修饰或缺失任何或全部端粒酶或TRT蛋白质的功能，这些端粒酶和TRT蛋白质可以用于本发明的筛选以便发现治疗试剂。例如，可以工程化TRT以便失去它的结合底物DNA，结合它的RNA成分(如hTR)，以便催化端粒DNA的加入，以便结合脱氧核苷酸底物，以便具有溶核活性，以便结合端粒酶相关蛋白质或染色体结构，和诸如此类的能力。得到的“突变蛋白质”或“muteens”可以用于鉴定特异地调节一个，几个，或所有TRT蛋白质或端粒酶的功能或活性的化合物。 
C.举证的端粒酶调节物 
1)综述 
出处同上所指的测试化合物可以是任何的各种化合物，天然存在和合成的，有机和无机的，并且包括聚物(例如，聚肽，多肽，寡聚核苷酸，和多聚核苷酸)，小分子，抗体(如本文广泛定义的)，糖，脂肪酸，核苷酸和核苷酸类似物，天然存在的结构的类似物(例如，肽模拟物，核苷酸类似物和诸如此类)和许多其它化合物。 
本发明提供了所有类型的调节物，没有任何特别的行为机制的限制。为了说明的目的，调节物的例子包括化合物或治疗剂： 
(I)结合hTRT多肽(例如，酶的活化位点)或其它端粒酶成分，和影响端粒酶活性； 
(ii)抑制或促进含有或来自端粒酶结合蛋白质的端粒酶成分(例如hTRT或hTRT-hTRRNP)的结合，或抑制或促进分解(例如，包括那些部分IV(D)，出处同上叙述的)； 
(iii)抑制或促进含有或来自端粒酶RNA(例如hTR)的端粒酶多肽(例如，hTRT)的结合，抑制或促进分解； 
(iv)抑制或促进含有或来自染色体(例如，端粒)或染色体DNA(例如，端粒DNA)的结合，或抑制或促进分解。 
(v)增强或降低端粒酶成分基因产物(例如，hTRT基因的产物)的表达，包括通过结合基因或基因产物(例如，通过与具有影响hTRT基因或另一个端粒酶成分的因子相互作用(例如，转录调节蛋白))，改变TRT基因的转录，或翻译的速度或水平，基因产物的运输或稳定性，和诸如此类。 
2)肽调节物 
端粒酶活性的潜在调节物也包括肽(例如抑制(拮抗物)，和活化剂(拮抗剂)肽调节物)。例如，具有任意产生的序列的寡聚肽可以筛选发现端粒酶活性的肽调节物(拮抗剂或抑制剂)。这样的肽可以直接用作药物或发现可以抑制端粒酶活性的功能基团的定向或位置，依次导致小分子抑制剂的设计和测试，或变成增强药物用途的化学修饰的骨架。肽可以是结构模拟物，可以利用分子模型程序根据特征性次级结构和/或端粒酶和hTRT蛋白质的三级结构设计模拟物。这样的结构模拟物也可以用于体内治疗，作为端粒酶活性的调节物(激动剂和拮抗物)。结构模拟物也可以用作免疫原引发抗端粒酶或抗TRT蛋白质抗体。 
3)作为端粒酶活性的调节物的抑制天然化合物 
另外，在来自作为来源物质的天然产物的提取物中可以筛选许多潜在用于活性修饰的化合物。这样的提取物的来源可以是来自许多种类：真菌，放线菌，藻类，昆虫，原生动物，植物和细菌。然后，可以分析这些显示了抑制活性提取物，分离活性分子。参见例如，Turner(1996)人药理学51(1-3)：39-43；Suh(1995)抗癌研究15：233-239。 
4)抑制低聚核苷酸 
本发明提供的一个特别有用的抑制剂系列包括在预防或抑制生产功能hTRT蛋白质的情况下，能够结合编码hTRT蛋白质的mRNA或hTRT基因的低聚核苷酸。本发明的其它低聚核苷酸与端粒酶RNA成分如hTR相互作用，或能够预防端粒酶或hTRT与它的DNA靶的结合，或一个端粒酶成分与另一个或与底物的结合。这样的低聚核苷酸也可以结合端粒酶，hTRT蛋白质，或蛋白质和RNA并且抑制如上所述的部分活性(如它的持续合成活性，它的逆转录酶活性，它的溶核活性，和诸如此类)。结合可以是通过与另一个核酸的系列特异性杂交或通过一般的结合如在aptamer或两者中的。 
通过靶击具有能够结合hTRTmRNA的反义低聚核苷酸的hTRTmRNA可以抑制端粒酶活性。 
抑制剂的另一个有用的类别包括引起hTRTmRNA或hTR的失活或裂解的低聚核苷酸。那就是，低聚核苷酸是化学修饰的，或具有引起这样的裂解的酶活性，如是核酶的情况中，是EDTA粘连的低聚核苷酸，或共价结合的低聚核苷酸，如补骨脂素或其它结合低聚核苷酸的交联试剂。如上所述，可以筛选许多不同的这样的低聚核苷酸的库，筛选具有需要的活性的那些。 
抑制剂的另一个有用的类别包括结合多肽的低聚核苷酸。结合特异的的多肽靶的双链或单链DNA或双链或单链RNA分子称为“aptamers”。 通过静电作用可以介导特异的低聚核苷酸-多肽结合。例如，aptamer特异地结合阴离子结合exosites或生理学上结合多阴离子肝素的凝血酶(Bock(1992)自然355：564-566)。因为hTRT蛋白质结合hTR和它的DNA底物，并且因为本发明提供了大量纯化形式的hTRT和其它TRT蛋白质，本领域的技术人员可以容易地利用本发明的方法筛选TRT结合aptamer。 
利用SELEX(Tuerk，1997，分子生物学方法，67，2190)的技术可以产生结合端粒酶，hTRT，hTR或其部分的低聚核苷酸(例如，RNA低聚核苷酸)。在这一技术中，非常大的库的任意序列核酸结合靶(例如，hTRT)，其中利用的条件引起具有结合靶的高亲和力和低亲和力分子之间的大量区别。从未结合的分子中分离结合分子，借助于包括在它们的终端和适当的扩增试剂中的特异的核酸序列扩增结合的分子。这一过程重复了几次，直到相当小量的分子保留靶的高度结合亲和力。然后，可以测试这些分子的调节如上所述的端粒酶活性的能力。 
也可以基于hTR的抑制(Norton(1996)自然生物技术14：615-619)通过互补序列的识别或裂解，如通过核酶进行拮抗物的端粒酶介导的DNA复制。 
利用本领域已知的各种技术，可以将本发明的抑制低聚核苷酸转移到细胞中。例如，低聚核苷酸可以递送到没有特异修饰的细胞质中。可替代地，通过利用与细胞膜融合或者是被包吞的脂质体，即，通过利用附着于脂质体或直接附着于结合导致包吞的细胞的表面膜蛋白质受体的低聚核苷酸的配体可以递送它们。可替代地，可以渗透细胞增强低聚核苷酸运输进入细胞，而没有损坏寄主细胞。可以利用DNA结合蛋白质，例如HBGF-1，已知是运输低聚核苷酸进入细胞的。 
5)抑制核酶 
核酶通过核酶的靶RNA结合部分结合到靶RNA起作用，核酶保持在裂解靶RNA的核酶的酶部分的邻近区域。所以，通常通过碱基对互补，核酶识别和结合靶RNA，并且一旦结合准确的位点，酶促作用裂解和失活靶RNA。以这样的方式，靶RNA的裂解将破坏它指导编码蛋白质的合成的能力，如果裂解发生在编码序列。在核酶已经结合和裂解它的RNA靶后，它通常从RNA释放，所以可以重复结合和裂解新的靶。 
6)鉴定端粒酶结合蛋白质以用作调节物 
在本发明的一个实施方案中，可以将端粒酶用于鉴定端粒酶结合蛋白质，即，调节或补充端粒酶活性的端粒酶附属蛋白质。如上所述，这些蛋白质或其片断可以通过导致端粒酶复合物的裂解或预防端粒酶复合物的结合，预防端粒酶复合物的组装，预防hTRT结合它的核酸补体或它的DNA模板，预防hTRT结合核苷酸，或预防，扩大，或抑制任何一个，几个或所有端粒酶或hTRT蛋白质的部分活性，如上所述调节功能。 
本领域的普通技术人员可以利用本发明的方法鉴定这些端粒酶结合蛋白质中哪个部分(例如，区域)接触端粒酶。在本发明的一个实施方案中，将这些端粒酶结合蛋白质或其片断用作端粒酶活性的调节物。 
7)端粒酶结合蛋白质作为主要的阴性突变体。 
在本发明的一个实施方案中，将端粒酶结合蛋白质用作端粒酶活性的调节物。端粒酶结合蛋白质包括染色体结构，例如组蛋白，核基质蛋白质，细胞分裂和细胞周期控制蛋白和诸如此类。可以用作本发明目的的调节物的其它端粒酶结合蛋白质包括p80和p95蛋白质和它们的人类似物，如TP1和TRF-1(Chong，1995，科学270：1663-1667)。另外，根据本发明的方法通过技术人员可以鉴定这些端粒酶结合蛋白质的片断并用作端粒酶活性的调节物。 
8)显性阴性突变体 
在如上所述的不同的非人种类的TRT之间已经鉴定了8个高度保守的基序(参见，Lingner(1997)科学276：561-567)。图4显示了与粟酒裂殖酵母Trt1p，Euplotesp123和啤酒酵母Est2p比较，人TRT氨基酸序列(来自pGRN121)和RT基序的方案。本发明提供了重组和合成核酸，其中所有8个这些基序中的保守氨基酸残基的密码子的每个，单独，或结合一个或多个另外的密码子已经改变成各个其它的密码子。各种得到的编码序列表达非功能hTRT。参见例如，实施例16。所以，本发明提供了例如，各种“突变”的端粒酶和具有端粒酶的部分活性但不是全部活性的TRT蛋白质。例如，一个这样的端粒酶能够结合端粒结构，但不结合端粒酶结合RNA(即，hTR)。如果在足够高的水平表达，如端粒酶突变体可以排除必需的端粒酶成分(例如，hTR)，从而可以作为野生型端粒酶活性的抑制剂。以这种方式起作用的突变的端粒酶是拮抗物或所谓的“显性阴性”突变体。 
9)抗体 
通常，本发明的抗体可以用于鉴定，纯化，或抑制任何或所有端粒酶和hTRT蛋白质的活性。抗体可以各种方式，例如通过预防端粒酶复合物或核苷酸与它的DNA底物结合，通过预防端粒酶成分形成活性复合物，通过维持功能性(端粒酶复合物)四级结构，或通过结合一个酶活性位点或其它对活性具有变构效应的其它位点(在本说明书中详细说明了端粒酶的不同部分活性)，作为端粒酶活性的拮抗物。 
D)调节物合成 
涉及的是本发明的端粒酶调节物将利用本药学领域已知的方法产生，包括合并的方法和合理的药物设计技术。 
1)组合的化学方法 
利用组合化学中的已知技术可以进行大文库的合成分子的产生和同时筛选，例如参见van Breemen(1997)化学年评69：2159-2164；Lam(1997)抗癌药物设计12：145-167(1997)。 
如上所述，组合化学方法可以用于产生大量的低聚核苷酸(或其它化合物)，可以在这些低聚核苷酸中快速筛选特异的低聚核苷酸(或化合物)，其中这些特异低聚核苷酸具有适当的与任何靶的结合亲和力和特异性，如可以利用本发明的TRT蛋白质(一般的背景信息Gold(1995)生物化学杂志270：13581-13584)。 
2)合理的药物设计 
合理的药物设计包括完整的方法学系列，包括靶分子，合成化学，和先进的计算机工具的结构分析。当用于设计调节物时，如蛋白质靶的拮抗物/抑制剂，如端粒酶和hTRT蛋白质，合理的药物设计的目的是理解分子的三维形状和化学性质。通过X射线晶体学数据或NMR数据辅助合理的药物设计，这些数据可以根据方法和利用本发明提供的试剂确定hTRT蛋白质和端粒酶。在静电学，疏水性和溶剂可接近性上的计算也是有帮助的。参见例如Colddren(1997)美国科学院年报94：6635-6640。 
E)试剂盒 
本发明同时提供可以用于辅助确定是否测试化合物是TRT活性的调节物的试剂盒。该试剂盒通常将包括一个或多个下面成分和一个或多个容器：基本纯化的TRT多肽或多核苷酸(包括探针和引物)；当导入细胞或无细胞表达系统时表达TR(例如，hTR)(例如，hTRT)的质粒；当导入细胞无细胞表达系统，多个细胞或细胞系时，能够能够表达TRT的质粒；检测TRT活性中的变化的组合物；和涉及检测和测量TRT活性中的变化的手段的指导物质，表明在存在测试化合物时端粒酶活性 中的变化是测试化合物调节端粒酶活性的指示物。该试剂盒也可以包括手段，如TRAP测试试剂，或各种定量聚合酶链式反应测试的试剂，用于测量TRT活性中的变化。试剂盒也可以包括涉及检测和测量TRT活性中的变化的指导物质，表明在存在测试化合物时端粒酶活性中的变化是测试化合物调节端粒酶活性的指示物。 
XI.转基因生物体(端粒酶敲出细胞和动物模型) 
本发明同时提供了转基因非人多细胞生物体(例如，植物和非人动物)或含有外源TRT基因序列的单细胞生物体(例如，酵母)，可以是编码序列或调节(例如，启动子)的序列。在一个实施方案中，生物体表达了外源TRT多肽，具有人TRT蛋白质的序列。在相关的实施方案中，生物体同时表达了端粒酶RNA成分(例如，hTR)。 
本发明同时提供了单细胞和单细胞生物体(或来自其中的细胞)，其中编码端粒酶成分(例如，TRT或TR)，或者端粒酶结合蛋白质的至少一个基因突变或缺失(即，在编码或调节区)以致天然端粒酶不表达，或者在减少的水平表达或当与野生型细胞或生物体比较时具有不同的活性。这样的细胞和生物体经常被称为“基因敲出”细胞或生物体。 
本发明进一步提供细胞和生物体，其中内源端粒酶基因(例如，小鼠TRT)是存在或可非强制性地突变或缺失，并且外源端粒酶基因或突变体(例如，人TRT)被导入和表达的。这一类型的细胞和生物体就用于例如，作为鉴定hTRT活性或表达的调节物；确定在端粒酶成分基因中的突变的效应的模型系统，和其它用途如确定发展时间和端粒酶活性的组织定位(例如，当给予端粒酶调节物评估，和为了评估任何潜在的副作用)。 
多细胞生物体的例子包括植物，昆虫和非人动物，如小鼠，大鼠，兔，猴，猿，猪，和其它非人哺乳动物。单细胞生物体的例子是酵母。 
特异的基因(例如：内源性TRT基因)的变化或裂解的方法是本领域技术人员已知的，参见，例如Baudin等人，1993，核酸研究，21：3329；Wach等人，1994，酵母10：1793；Rothstein，1991，酶学方法，194：281；Anderson，1995，细胞生物学方法，48：31；Pettitt等人，1996，发展，122：4149-4157；Ramirez-Solis等人，1993，酶学方法，225：855；和Thomas等人，1987，细胞，51：503，其中每个引入本文作为参考，用于所有目的。 
本发明的“敲出”细胞和动物包括的细胞和动物，其中一个或多个单位的内源端粒酶复合物已经被缺失或抑制。端粒酶活性的再构成将挽救细胞或动物衰老，或对于癌细胞，它不能维持端粒导致细胞死亡。改变内源基因的表达的方法是本领域的技术人员已知的。通常，这样的方法包括改变或替代控制待调节的特定的基因的表达的调节序列的所有或部分。可以改变调节序列例如，天然启动子。基因的靶突变的常规技术包括将含有需要的基因的基因组DNA片断放置于载体中，接着克隆两个结合含有胸苷激酶的载体中的可选择新霉素抗性表达盒周围的靶基因的基因组臂。然后，将这一“敲出”构建体转移到适当的寄主细胞，即，小鼠胚主干(ES)细胞，随后进行阳性选择(例如G418，例如选择新霉素抗性)和阴性选择(利用，例如FIAU，排除缺乏胸苷激酶的细胞)，允许选择已经进行与敲出载体同源重组的细胞。这一途径导致需要的基因的失活。参见例如，美国专利号5,464,764；5,631,153；5,487,992，和5,627,059。 
通过利用同源重组也可以完成内源基因的“敲出”表达，以便在需要的基因的调节序列(例如，启动子)中导入异源核酸。为了预防功能酶或产物的表达，改变读码框架或裂解启动子的简单突变是适当的。为了上调表达，利用诱导高较水平转录的异源启动子替代天然启动子。 同时，将“基因陷井插入”用于裂解寄主基因，并且小鼠ES细胞可以用于生产敲出转基因动物，如上所述，例如在Holzschu(1997)转基因研究6：97-106描述。 
通过利用含有需要的结构基因的核酸序列也可以完成通过同源重组改变内源基因的表达。利用上游序列靶击异源重组构建体。利用TRT结构基因序列信息，如SEQUENCEID NO：1，一个本领域的技术人员可以只利用常规实验生产同源重组构建体。改变内源基因的表达的同源重组如美国专利号5,272,071和WO91/09955，WO93/09222，WO96/29411，WO95/31560，和WO91/12650中叙述。Azad(1996)美国科学院年报，93：4787；Baulard(1996)，细菌学杂志，178：3091；和Pelicic(1996)分子微生物学，20：919中叙述了分支杆菌中的同源重组。Moynahan(1996)人分子遗传学5：875中已经叙述的动物中的同源重组，和Offringa(1990)EMBO J.9：3077中叙述的植物中的同源重组。 
XII.词汇表 
出处同上定义的下面的术语提供了本发明的实践人员的其它指导：佐剂，等位基因(和等位序列)，氨基酸(包括疏水，极性，带电)，保守替代，控制元素(和调节序列)，衍生，可检测标记，升高的水平，表位，有利的和不利的预测，融合蛋白质，基因产物，hTR，不灭，免疫原和免疫原的，分裂，调节物，基序，核酸(和聚核苷酸)，低聚核苷酸(和低聚物)，可操作地连接，多肽，探针(包括核酸探针和抗体探针)，重组，选择系统，序列，特异的结合，严格杂交条件(和严格性)，基本相同(和基本相似)，基本纯化(和基本纯化的)，端粒酶阴性和端粒酶阳性细胞，端粒酶催化活性，端粒酶相关，和测试化合物。 
如本文所用，术语“佐剂”指任何增强对它混合的抗原的免疫应答的物质的一般意义。用于本发明的佐剂包括但不限于，弗氏，无机凝 胶如氢氧化铝，和表面活性物质如溶血卵磷脂，多聚醇，聚阴离子盐，肽，油乳剂，钥孔戚血蓝蛋白，和二硝基酚，BCG(BacillusCalmette-Guerin)和Corynebacterium parvum是潜在的有用佐剂。 
如本文所用，术语“等位基因”或“等位序列”指核酸序列的可替代形式(即，编码hTRT蛋白质的核酸)。等位基因来自突变(即，在核酸序列中的变化)，并且一般产生改变和/或不同地调节的mRNA或多肽，它的结构和/或功能可以或不可以改变。通常产生等位基因的一般突变变化叙述的是核苷酸的天然缺失，叠加，或替代，它们可能或不可能影响编码的氨基酸。这些变化的类型中的每一个可能单独发生，结合其它，或在给定基因，染色体或其它细胞核酸中的一倍或多倍出现。任何给定的基因可以没有一个或许多等位基因形式。如本文所用，术语“等位基因”指一个或两个基因或从基因转录的mRNA。 
如本文所用，“氨基酸”有时利用标准的一字母密码定义：丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)，天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)，精氨酸(R)，赖氨酸(K)，异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)，苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)，脯氨酸(P)，甘氨酸(G)，组氨酸(H)，半胱氨酸(C)。包括了合成的和非天然存在的氨基酸类似物(和/或肽键)。 
如本文所用，“疏水氨基酸”指A，L，I，V，P，F，W，和M。如本文所用，“极性氨基酸”指G，S，T，Y，C，N，和Q。如本文所用，“带电氨基酸”指D，E，H，K和R。 
如本文所用，“保守替代”，当叙述蛋白质时，指在蛋白质的氨基酸组成中基本不改变蛋白质活性的变化。所以，特定的氨基酸序列的“保守的修饰的变化”指那些不是蛋白质活性的关键的氨基酸替代或利用具有相似特性的其它氨基酸(例如，酸性，碱性，带正或负电，极性， 或非极性，等等)的氨基酸替代，以致甚至关键的氨基酸的替代基本不改变活性。提供功能相似的氨基酸的保守替代表是本领域已知的。下面的6个基团，每个含有相互保守替代的氨基酸：1)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬氨酸(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)(参见例如，Creighton(1984)蛋白质，W.H.Freeman和Company)。本领域的一个技术人员将认识的是上面鉴定的替代不是仅有的可能的保守替代。例如，可以认为所有带电的氨基酸的每个为保守替代，不管是否正电或负电。另外，在编码序列中改变，加入或缺失单个氨基酸或小百分数氨基酸的个别替代，缺失，或叠加也可以是“保守修饰变化”。在重组蛋白质中，通过利用区别于天然或野生型基因利用的密码子的一个或多个密码子也可以产生“保守替代”。在这种情况中，保守替代也包括利用相同氨基酸的不同密码子替代编码氨基酸的密码子。 
如本文所用，“控制元素”或“调节序列”包括增强子，启动子，转录终止子，复制原点，染色体整合序列，5’和3’未翻译区域，利用它们，蛋白质或其它生物分子反应进行转录和翻译。对于真核细胞，控制序列将包括启动子和优选地增强子，例如，从免疫球蛋白基因，SV40，巨细胞病毒，和聚腺苷酸化序列衍生，并且可以包括拼接供体和受体序列。根据载体系统和利用的寄主，可以利用许多适当的转录和翻译元素，包括构成性和可诱导启动子。 
如本文所用，“衍生”多聚核苷酸，低聚核苷酸或核酸指含有衍生替代的低聚，和多聚核苷酸。在一些实施方案中，替代是基本不干扰与互补聚核苷酸的杂交的。衍生低聚或多聚核苷酸已经利用附加的化学替代修饰(例如，通过已经合成的低聚或多聚核苷酸的修饰，或通过 在合成过程中掺入修饰的碱基或骨架类似物)，可以将它们导入代谢活化的真核细胞，以便与hTRT DNA，RNA，或蛋白质杂交，其中它们产生局部DNA，RNA或蛋白质的变化或化学修饰。可替代地，衍生的低聚或聚核苷酸可以作用或改变hTRT多肽，端粒酶结合蛋白质，和其它与hTRTDNA或hTRT基因产物，或改变或调节hTRT DNA，RNA或蛋白质的表达或功能的因子。说明性另附的化学替代包括：铕(III)texaphrin，交联剂，补骨脂素，金属螯合物(例如，铁/EDTA螯合剂用于铁离子催化裂解)，拓扑异构酶，内切核酸酶，外切核酸酶，连接酶，磷酸二酯酶，光动力卟啉，化学治疗试剂(例如，阿霉素，doxirubicin)，嵌入试剂，碱基修饰试剂，免疫球蛋白链，和低聚核苷酸。铁/EDTA螯合物是化学替代，经常用于需要局部裂解聚核苷酸序列的位置(Hertzberg等人，1982，美国化学文摘社杂志.104：313；Hertzberg和Dervan，1984，生物化学23：3934；Taylor等人，1984，四面体40：457；Dervan，1986，科学232：464。说明性附着的化学包括：直接键合，例如通过附加的反应氨基基团(Corey和Schultz(1988)科学238：1401，引入本文作为参考)，和其它直接的键合化学，虽然链霉抗生物素蛋白/生物素和异羟基洋地黄毒苷/抗异羟基洋地黄毒苷抗体键合方法也可以利用。在美国专利号5,135,720，5,093,245和5,055,556中提供了连接化学替代的方法，这些引入本文作为参考。其它键合化学可以在分散的实践者中应用。 
如本文所用，“可检测标记”在本领域具有一般意义，指可以用于检测(例如，由于物理或化学特性)的原子(例如，放射性核素)，分子(例如，荧光素)，或复合物，表明分子的存在，或能够结合另一个共价结合或其它结合的分子。术语“标记”也指共价结合或其它结合的分子(例如，生物分子如酶)，作用于底物产生可检测的原子，分子或复合物。 适于用于本发明的可检测标记包括通过光谱学，光化学，生物化学，免疫化学，电学，光学，或化学手段可检测的组合物。用于本发明的标记包括利用标记的链霉抗生物素蛋白共轭物，磁性小珠(例如，DynabeadsTM)，荧光染料(例如，荧光素，德克萨斯红，若丹明，荧光绿蛋白，加强绿荧光蛋白，丽沙胺，藻红蛋白，Cy2，Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy5.5，Cy7，FluorX[Amersham]，SyBR GreenI和II[分子探针]，和诸如此类)染色的生物素，放射性标记(例如，3H，125I，35S，14C，或32P)，酶(例如，水解酶，特定的磷酸酶，如碱性磷酸酶，酯酶，和糖苷酶，或氧化还原酶，特定的过氧化物酶如辣根过氧化物酶，和其它在ELISA中常用的)，底物，协同因子，抑制剂，化学荧光基团，显色剂，和光度标记，如胶质金，或染色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯，聚丙烯，乳胶，等等)小珠。涉及这样的标记的利用的专利包括美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241。检测这样的标记的手段是本领域已知的。所以，例如可以利用照相胶片或闪烁计数器检测放射性标记和化学荧光标记，利用光检测器可以检测荧光标记以便检测放射光(例如，如在荧光激活细胞分拣中)。提供酶底物和检测由酶对底物的作用产生的反应产物通常检测酶标记，并且通过简单地观察颜色标记检测颜色标记。所以，标记是通过光谱学，光化学，生物化学，免疫化学，电学，光学或化学手段可检测的任何组合物。根据本领域已知的方法，该标记可以与测试需要的成分直接或间接偶联。通过间接手段经常附着非放射性标记。通常，配体分子(例如，生物素)与该分子共价地结合。然后，配体结合抗配体(例如，链霉抗生物素蛋白)分子，该分子与信号生产系统如可检测的酶，荧光化合物，或化学荧光化合物是内在可检测的或共价结合的。可以利用许多配体和抗配体。当配体具有天然抗配体， 例如，生物素，甲状腺素，和皮质醇，它可以与标记，天然存在的抗配体结合使用。可替换地，将本抗原或抗原化合物与抗体结合使用。该分子也可以通过与酶或荧光团偶合而直接与信号生产化合物共轭。检测标记的手段是本领域的技术人员已知的。所以，例如，当标记是放射性标记，检测的手段包括闪烁计数器，照相胶片如在放射自显影中，或储藏磷光成象。当标记是荧光标记，可以通过利用适当波长的光激发荧光色素，和检测得到的荧光可以检测它。通过照相胶片，利用电子检测器如带电偶联装置(CCD)或光电倍增管和诸如此类可以检测荧光。同样，提供酶的适当底物，和检测得到的反应产物可以检测酶标记。同样，观察结合标记的颜色可以检测简单的颜色标记。将认识到的是，当在测试中利用荧光团对时，通常优选的是他们具有明显的放射方式(波长)以致他们可以容易地区别。 
短语“升高的水平”指细胞中hTRT基因产物的量(或其它特异的物质或活性)，该量比参考标准的水平例如，为了诊断，个体或没有患有症状的其它个体中的正常，端粒酶阴性细胞中的水平，和为了预测，来自各种级别或类别，例如肿瘤的肿瘤细胞中的水平升高或更高。 
如本文所用，术语“表位”具有抗体识别的抗原上的位点的一般意义。表位通常是氨基酸的区段，是全蛋白质的小部分。表位可以是构型性的(即，不连续的)。就是，他们可以由蛋白质折叠已经并列的初级序列的非邻近部分编码的氨基酸形成。 
术语“有利预测性”和“不利的预测性”是本领域已知的。对于癌症，“有利的预测性”指似乎是肿瘤的退化或病人的更长时间的生存相对于具有不利预后性的那些具有有利的预测性，而“不利预后性”指肿瘤似乎是更加发展，即生长更快和/或转移，导致不利的后果，或病人疾病发展的更快速的过程。 
如本文所用，术语“融合蛋白”指组合蛋白质，即，单个邻接氨基酸序列，与两个(或更多)不同的，异源多肽组成，它们通常与单个氨基酸序列不融合。所以，假如这些序列通常在自然界中发现不一起在单个氨基酸序列中的相同构型中，融合蛋白质可以包括含有两个完全的不同氨基酸或两个相似或相同的多肽序列的单个氨基酸序列。融合蛋白质通常可以利用重组核酸方法制备，即作为重组基因融合产物的转录和翻译的结果，这种融合含有编码本发明的多肽的区段和编码异源蛋白质的区段，或通过本领域已知的化学合成方法制备。融合蛋白质的非hTRT区域可与hTRT多肽的氨基末端或羧基末端，或两者融合，或者非hTRT区域可以插入在蛋白质序列的内部(通过成分插入或通过替代氨基酸)或可以进行前面的联合。 
如本文所用，使用“基因产物”指从基因转录的RNA分子，或基因编码或从RNA翻译的蛋白质。 
如本文所用，“hTR”(人端粒酶RNA)指人端粒酶RNA成分和任何天然存在的等位基因和变异体或重组变异体。在全部引入本文作为参考，用于所有目的的美国专利号5,583,016中详细叙述了hTR。 
如本文所用，术语“不灭”当指细胞时，在端粒酶领域具有它的正常意义，并且指明显的不受限制的复制潜力的细胞。不灭也可以指相对于它们的未修饰的部分具有增强的复制能力的细胞。不灭的人细胞的例子是恶性肿瘤细胞，胚系细胞，和体外培养的一些转化的人细胞系(例如，在转化后，通过病毒癌基因或其它已经变成不灭的细胞)。相反地，大多数人正常人体细胞是不灭的，即，具有限制的复制能力，和在有限数目的细胞分裂后变成衰老。 
如本文所用，术语“免疫原”和“免疫原的”在本领域具有它们一般的意义，即，免疫原是分子，如蛋白质或其它抗原，在注射进入人 或动物中后可以引发适当的免疫应答。 
如本文所用，“分离”当指分子或组合物时，如，例如RNP(例如，至少一部分和至少一个RNA)，指从至少一个其它化合物如蛋白质，其它RNA，或其它体内结合的污染或在它的天然存在状态中分离的分子或组合物。所以，认为当已经从任何其它它天然结合的成分，例如，细胞膜，如在细胞提取物中分离RNP时，RNP是分离的。但是，分离的组合物也可以是基本纯化的。 
如本文所用，“调节物”指可以任何方式改变端粒酶逆转录酶(TRT)的“全部”或任何“部分活性”的任何合成或天然化合物或组合物。调节物可以是激动剂或拮抗物。调节物可以是任何有机和无机化合物包括，但不限于例如，小分子，肽，蛋白质，糖，核酸，脂肪酸和诸如此类。 
如本文所用，“基序”指确定蛋白质中的特征或结构的邻接氨基酸的序列(或指编码邻接氨基酸的序列的核酸序列)，该蛋白质在确定的类别或类型的所有蛋白质中是共同的或保守的。基序或共有序列可以包括保守和非保守残基。基序序列中的保守残基表示保守残基或残基的类别(即，疏水，极性，非极性，或其它类别)通常存在于基序确定的蛋白质的类别中的各个蛋白质(或基因或mRNA)中表明的位置中。根据蛋白质的类别可以区别基序。所以，例如逆转录酶形成由一个或多个基序确定的蛋白质的类别，并且这一类别包括端粒酶。但是，端粒酶也可以确定为具有该类别的基序特征的酶的类别。本领域技术人员认为在基序中鉴定残基作为保守残基不意味着基序确定的类别每个成员在表明的位置具有表明的残基(或残基的类别)，并且该类别的一个或多个成员在保守位置具有不同的残基。 
如本文所用，术语“核酸”和“多聚核苷酸”可相互交换使用。术 语“聚核苷酸”的用途不打算排除低聚核苷酸(即，短聚核苷酸)并且也可以指合成的和/或非天然存在的核酸(即，含有核酸类似物，或修饰的骨架残基或键合)。 
如本文所用，“低聚核苷酸”或“低聚物”指可以用作引物，探针或扩增引物的约7个核苷酸或更多，多至约100个核苷酸核酸序列。低聚核苷酸通常长度在约10和50个核苷酸之间，更经常在14和约35个核苷酸之间，非常经常是在约15和约25个核苷酸之间，并且该术语低聚核苷酸或低聚物也可以指合成和/或非天然存在的核酸(即，含有核苷酸类似物或修饰的骨架残基或键合)。 
如本文所用，术语“可操作地连接”指在两个或多个核酸(即，DNA)区段之间的功能关系：例如，如果刺激适当的寄主细胞或其它表达系统中的序列的转录，则启动子或增强子可操作地连接编码序列。通常，可操作地连接的序列是邻接的，并且在信号序列的情况中是指邻接的和读码状态的。但是，增强子不需要定位于邻近它们增强转录的编码序列的附近。 
如本文所用，术语“多肽”在本文中与术语“蛋白质”相互交换使用，并且指由酰胺键连接的氨基酸残基组成的多聚物，包括其合成的，天然存在的和非天然存在的类似物(氨基酸和键合)。肽是多肽的例子。 
如本文所用，“探针”指特异地结合另一个分子的分子。探针的一个例子是“核酸探针”，它特异地结合(即，退火或杂交)基本互补的核酸。探针的另一个例子是“抗体探针”，它特异地结合相应的抗原或表位。 
如本文所用，“重组”指体外合成或其他操作的多聚核苷酸(例如，“重组多聚核苷酸”)，指利用重组多聚核苷酸在细胞中或其它生物系统中生产基因产物，或指重组多聚核苷酸编码的多肽(“重组蛋白质”)。 
如本文所用，在稳定的转化细胞系中的“选择系统”指鉴定和/或选择含有需要的重组核酸的细胞。大量的选择系统用作用于鉴定转化细胞，并且适用于本发明。例如，通过质粒上含有的基因，如已知的amp，gpt，neo和hyg基因或其它基因如可以分别在tk或aprt细胞中利用的单纯性疱疹胸苷激酶(Wigler等人，细胞，11：223-32[1977])和腺苷磷酸核糖基转移酶(Lowy等人，细胞，22：817[1980])基因给予的抗生素抗性可以选择质粒或其它载体转化的细胞。同样，抗代谢，抗生素，或除草剂抗性可以用作选择的基础，例如，dhfr给予氨甲喋呤抗性，并且用于基因扩增(Wigler等人，美国科学院年报，77：3567[1980])；npt，给予氨基糖苷新霉素和G-418抗性(Colbere-Garapin等人，分子生物学杂志，150：1[1981])，和als或pat分别给予chlorsulfuron和膦丝菌素乙酰转移酶的抗性(Murry，在McGrawHill科学和技术年书，McGraw Hill，纽约，NY，191-196[1992])。另外的可选择基因已经叙述了，例如授予潮霉素抗性的基因，trp B，允许细胞在色氨酸位置利用吲哚，或hisD，允许细胞在组氨酸位置利用histinol(Hartman和Mulligan，美国科学院年报，85：8047[1988])替代。最近，利用可见的标记已经获得这样的标记如花色素苷，β-葡糖醛酸糖苷酶和它的底物，GUS，和荧光素酶的前体，它的底物，荧光素广泛地不仅用于鉴定转化体，而且用于定量由特异的载体系统的短暂或稳定的蛋白质表达的量(Rhodes等人，分子生物学方法，55：121[1995])。 
如本文所用，基因(除非特定的说明，否则指)，核酸，蛋白质或肽的“序列”指双链DNA分子，例如，两个编码链和它的补体的序列，或单链核酸分子，的序列的一个或两个链中的核苷酸顺序，或指肽或蛋白质中的氨基酸的顺序。 
如本文所用，“特异结合”指一个分子，通常抗体或聚核苷酸甚至在存在许多其它趋异分子时接触和结合另一个特异分子的能力。例如，单链多聚核苷酸可以特异地结合序列中互补的单链多聚核苷酸，并且抗体特异地结合(或“特异地免疫反应”)它相应的抗原。 
如本文所用，“严格杂交条件”或“严格性”指在低于具有与靶准确或接近准确的互补的靶序列和探针的熔化温度(Tm)约5℃到约20℃或25℃的范围内的条件。如本文所用，熔化温度是双链核酸群体变成半分解成单链的温度。核酸的Tm的计算方法是本领域已知的(参见，例如，Berger和Kimmel(1987)酶学方法，152卷，分子克隆技术指导，圣地亚哥，学术出版社，和Sambrook，等人，(1989)分子克隆，实验室手册，第二版，1-3卷，冷泉港实验室，下文的“Sambrook”，两者都引入本文作为参考)。如标准参考指出，当核酸是1摩尔/升NaCl水溶液时，Tm值的简单估计可以通过方程：Tm＝81.5+0.41(％G+C)计算(参见例如，Anderson和Young，核酸杂交中的定量过滤杂交(1985))。其它参考包括更加复杂的计算，考虑结构以及序列特征用于计算Tm。各种因子如探针的长度和特性(DNA，RNA碱基组成)和靶的特性(DNA，RNA，碱基组成，存在于溶液中或固定的和诸如此类)，盐或其它成分(例如，甲酰胺，葡聚糖硫酸，聚乙二醇的存在或缺乏)影响杂合体的熔化温度(和由此的严格杂交条件)的浓度。这些因子的影响是已知的，并且在本领域的标准参考中讨论了，例如Sambrook，出处同上，和Ausubel等人，出处同上。通常，严格杂交条件是小于1.0摩尔/升钠离子，通常约0.01到1.0摩尔/升钠离子在pH7.0到8.3的盐浓度，温度对于短探针至少约30℃，对于长探针至少约60℃(例如，大于50个核苷酸)。如上所述，严格条件也可以利用加入去稳定剂如甲酰胺，获得，在这种情况中，可以利用更低的温度。 
如本文所用，在核酸中，“基本相同”，“基本序列同一性”或“基本相似性”指两个多聚核苷酸之间的序列相似性的量度。通过在严格条件下杂交，通过直接比较或其它手段可以确定基本序列的同一性。例如，如果它们能够特异地在严格条件下相互杂交，可以鉴定两个多聚核苷酸为具有基本的序列相似性。 
通过在不同严格的条件下杂交可以鉴定序列同一性的其它程度(例如，小于“基本”同一程度)。可替代地，可将基本序列同一性叙述为两个核苷酸(多肽)序列之间的同一性的百分数。当它们至少约60％的同一性，优选地至少约70％同一性，或至少约80％同一性，或至少约90％同一性，或至少约95％或98％到100％同一性时，认为两个序列基本相同。通过确定两个序列之间的最适序列排列和比较两个序列通常计算序列(核苷酸或氨基酸)同一性的百分数。例如，用于蛋白质表达的外源转录物可以叙述为与参考序列(例如，相应的内源序列)比较具有一定百分数的同一性或相似性。利用Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源算法，通过Needleman和Wunsch(1970)分子生物学杂志48：443的同源排列算法，通过Pearson和Lipman(1988)美国科学院年报85：2444的相似方法的研究，通过这些算法的计算机化补充(GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA于Wisconsin遗传软件包装，遗传计算机集团，575科学博士，麦迪生，WI)，或通过检查可以进行序列的最适排列。选择各种方法产生的最佳排列(即，导致最高百分数的同一性)。通常，这些算法在“比较窗口”(通常约18个核苷酸长度)比较两个序列以便鉴定和比较序列相似的局部区域，所以允许小的叠加或缺失(即，裂口)。与不含有叠加或缺失的参考序列比较，叠加和缺失通常是20％或更小的序列的长度。参考特定的的长度或区域有时需要叙述两个序列之间的序列同一性(例如，两个序列可以叙述为在至 少500碱基对的长度至少具有95％的同一性)。通常，长度将是至少约50，100，200，300，400或500碱基对，氨基酸，或其它残基。通过在比较的区域比较两个最佳排列序列，确定相同的核酸碱基(例如，A，T，C，G或U)在两个序列中存在的位置数目，以便产生匹配的位置编号，和参考比较的序列或区域比较碱基的总数确定匹配的位置的数目(或百分数)计算序列同一性的百分数。适用于确定序列相似性的其它算法是BLAST算法，这在Altschul(1990)分子生物学杂志215：403-410；和Shpaer(1996)基因组38：179-191中有叙述。进行BLAST分析的软件在国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)是公众可得的。这一算法包括当与数据库序列中同样长度的语句排列在一起时，通过在匹配或满足一些正值临界得分T的提问的序列中鉴定长度W的短语首先鉴定高得分序列对(HSPs)。T指邻近语句得分临界值(Altschul等人，出处同上)。这些起始邻近语句触发点是作为起始研究以寻找含有它们的更长的HSP的种子。语句触发点在两个方向沿着每个序列扩展，只要增强积累的排列的得分。当由于积累一个或多个负得分残基排列；积累排列得分从它的最大获得值下降了X的量；积累得分降到零或零下时，语句触发点的扩展在每个方向上终止或达到每个序列的末端。BLAST算法参数W，T和X确定了排列的敏感性和速度。BLAST程序用作违约，语句长度(字)11，BLOSUM62得分基质(参见Henikoff(1992)美国科学院年报，89：10915-10919)，算法(B)50，预期值(E)10，M＝5，N＝-4，和两条链的比较。术语BLAST指BLAST算法，进行了两个序列之间的相似性的统计分析；参见例如，Karlin(1993)美国科学院年报90：5873-5787。BLAST算法提供的相似性的一个量度是最小总数可能性(P(N))，提供了随机存在的两个核苷酸或氨基酸序列之间匹配的可能性的指示。例如，如果测试核酸与TRT 核酸的比较中的最小总数可能性小于约0.5，0.2，0.1，0.01，或0.001，可以认为核酸相似于TRT核酸。可替代地，两个核酸序列相似的另一个指示是第一个核酸编码的多肽与第二个核酸编码的多肽免疫交叉反应。 
如本文所用，在多肽文中，术语“基本同一”，“基本序列同一性”，或“基本相似性”指两个多肽之间的相似性的程度，其中多肽含有与参考序列，至少70％序列同一性，或与参考序列至少80％，或85％或高达100％的序列同一性，或者最优选地在约10-20氨基酸残基的比较窗口具有90％的同一性。如果需要，通过导入需要的裂口，通过最佳化残基匹配确定氨基酸序列的相似性或序列的同一性。参见例如，Needleham等人(1970)分子生物学杂志，48：443-453；和Sankoff等人，1983，Time Warps，String Edits，和大分子，序列比较的理论和实践，1章，Addison-Wesley，Reading，MA；和来自IntelliGenetics的软件包装，Mountain View，CA，和Wisconsin大学，遗传计算机集团，Madison，WI。正如，本领域技术人员将明了的，对于多肽或多聚核苷酸，术语“基本同一性”，“基本相似性”和“基本序列同一性”可以相互变通使用。 
如本文所用，当指具有特异的试剂的组合物，如抗体(例如，抗hTRT抗体)时，术语“基本纯化”或“基本纯化的”指特异的试剂至少约75％，或至少约90％，或至少约95％，或至少约99％，或更多的组合物(不包括例如，溶剂或缓冲液)。所以，例如，特异地结合hTRT多肽的本发明的优选的免疫球蛋白制剂是基本纯化的。 
如本文所用，“端粒酶阴性”细胞是其中不表达端粒酶的一个细胞，即，利用常规测试或用于端粒酶活性的TRAP测试没有检测到端粒酶催化活性。如本文所用，“端粒酶阳性”细胞是表达端粒酶的细胞(即， 可以检测到端粒酶活性)。 
如本文所用，“端粒酶相关”疾病或症状是与个体的细胞中不正常的高水平的端粒酶活性，可以包括大多数正常体细胞的完全是端粒酶活性相关的，或与导致正常细胞功能损伤的低水平端粒酶活性相关的受试者中的疾病或症状。端粒酶相关的症状的例子包括例如，癌症(恶性肿瘤细胞中的高端粒酶活性)和不育性(胚系细胞中的低端粒酶活性)。 
如本文所用，“测试化合物”或“试剂”指任何合成或天然化合物或组合物。该术语包括有机和无机化合物；包括例如，小分子，肽，蛋白质，糖，核酸，脂肪酸，和诸如此类。 
XIII.实施例 
下面的实施例提供用于说明本发明，不用于限制。 
在下面的章节中，应用下面的缩写：eq(等当物)；M(摩尔/升)；μM(微摩尔/升)；N(当量浓度)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；μmol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)；g(克)；mg(毫克)；μg(微克)；纳克(纳克)；l或L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(纳米)；℃(摄氏度)；RPN(核糖核蛋白)；mreN(2’-O-甲基核糖核苷酸)；dNTP(脱氧核糖核苷酸)；dH2O(蒸馏水)；DDT(二硫苏糖醇)；PMSF(苯甲基氟磺酰)；TE(10毫摩尔/升TrisHCl，1毫摩尔/升EDTA，约pH7.2)；KGlu(谷氨酸钾)；SSC(柠檬酸纳和盐的缓冲液)；SDS(十二烷基硫酸钠)；PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)；Novex(Novex，圣迭戈，CA)；BioRad(Bio-Rad实验室，Hercules，CA)；Pharmacia(Pharmacia生物技术，Piscataway，NJ)；Boehringer-Mannheim(Boehringer-Mannheim公司，Concord，CA)；Amersham(Amersham，公司，芝加哥，IL)；Stratagene(Stratagene克隆系统，La Jolla，CA)；NEB(新英格兰生物 实验室，Beverly，MA)；Pierce(Pierce化学公司，Rockford，IL)；Beckman(Beckman仪器，Fullerton，CA)；实验室工业(实验室工业公司，Berkeley，CA)；Eppendorf(Eppendorf科学，麦迪生，WI)；和分子动力学(分子动力学，Sunnyvale，CA)。 
实施例1 
端粒酶蛋白质和克隆的分离 
下面的实施例详细叙述了从各种生物体分离端粒酶蛋白质或克隆，包括euplotes p.123，hTRT，TRT和粟酒裂殖酵母TRT端粒酶cDNA克隆。 
A.背景 
I)介绍 
这一部分提供了TRT基因的纯化和克隆的观察，在这一实施例的随后部分中大量叙述了。当在纤毛虫，酵母，和哺乳动物中已经鉴定了端粒酶RNA亚单位，在本发明之前酶的蛋白质亚单位还没有鉴定。从纤毛虫原生动物Euplotes aediculatus纯化端粒酶产生的两个蛋白质，命名为p123和p43(参见，出处同上，Linger(1996)美国科学院年报，93：10712)。Euplotes sediculatus是具有约8×107端粒和约3×105端粒酶分子的大核的毛发稀少的纤毛虫。在纯化后，活化的端粒酶复合物具有的分子量约为230千道尔顿，对应于66千道尔顿RNA亚单位，和两个蛋白质约为123千道尔顿和43千道尔顿(Linger(1996)出处同上)。光交联实验表明较大的p123蛋白质包括在端粒DNA底物的特异的结合中(Lingner(1996)出处同上)。 
对p123和p43蛋白质测序并且分离编码这些蛋白质的cDNA克隆。发现Euplotes序列与Tetrahymena端粒酶结合蛋白质p80和p95未相 关。Euplotes p123的序列分析表明逆转录酶(RT)基序。另外，与其它序列的比较对Euplotes p123的序列分析表明酵母同系物，命名为Est2蛋白质(Linger(1997)科学276：561)。前面已经显示酵母Est2对于端粒的体内维持是必要的(Lendvay(1996)遗传学144：1399)，但还没有鉴定为端粒酶催化蛋白质。位点特异的诱变证明酵母Est2的RT基序是体内和体外端粒DNA合成的关键(Lingner(1997)出处同上)。 
ii)鉴定和定性粟酒裂殖酵母端粒酶 
利用从如下所述的Euplotes p123RT基序设计的简单序列引物进行粟酒裂殖酵母DNA的PCR扩增。在产生的4个突出的PCR产物中，120个碱基对谱带编码了p123和Est2同源的肽序列。这一PCR产物用作克隆杂交的探针，并且鉴定来自粟酒裂殖酵母基因组文库的两个交迭的克隆和来自粟酒裂殖酵母cDNA文库的3个克隆。序列分析表明，3个粟酒裂殖酵母cDNA克隆中没有一个是全长的，所以，RT-PCR用于获得编码蛋白质的N’末端的序列。 
这些克隆的完全测序表明推断的粟酒裂殖酵母端粒酶RT基因，trt1。trt1的完全的核苷酸序列已经储藏在基因库，登记号AF015783(参见，图15)。 
为了测试粟酒裂殖酵母trt1(作为催化亚基)，产生了两个缺失构建体。序列的分析表明trt1编码具有推测分子量116千道尔顿的基本蛋白质。发现与p123和Est2具有的同源性在7个逆转录酶基序中是特别高，下面划线和命名为基序1，2，A，B，C，D和E(参见图63)。同时发现其它端粒酶特异基序，命名为T基序，15个内含子，大小范围在36到71个碱基对之间，中断了编码序列。 
为了测试作为催化亚基的粟酒裂殖酵母trt1，产生了两个缺失构建体。一个只在RT区域除去基序B到D。第二个除去了开放读码框架 的99％。 
从两个突变体的粟酒裂殖酵母孢子生长的单倍体细胞显示了进化的端粒缩短成点，其中与端粒重复的杂交差不多变成不可检测的。trt1+/trt1-二倍体形成孢子，并且分解得到的四分体，在补充了氨基酸的酵母提取培养基上萌发(YES平板，Alfa(1993)Fission酵母的实验，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)。起源于每个孢子的菌落在32℃下生长3天，每3天连续地划线培养到新鲜的YES平板上。将来自每轮的菌落置于6毫升YES液体培养基中，32℃，和生长在静置时期。制备基因组DNA。在利用ApaI消化后，在2.3％的琼脂糖凝胶上将DNA的电泳，利用溴化乙锭染色，证明在每泳道中约相等的加载量，然后，转移到尼龙膜上，与端粒DNA探针杂交。 
在琼脂上生长的启动延迟或不能生长(通常在萌发后第四次划出)，和具有逐渐破碎的边缘的菌落(图22C显示的菌落形态学)和延长的细胞的部分逐渐高(图22C显示的)表明了衰老。在具有氯化铵替代的谷氨酸的最小培养基上(Alfa(1993)出处同上)涂布细胞，在照相之前在32℃生长两天。 
当在解剖显微镜上分离单个扩大的细胞，发现大多数没有经过进一步分裂。同样的端粒酶阴性(trt1-)细胞群体总是含有正常大小的细胞，它们连续地分裂，但经常产生非分裂的子代。端粒酶阴性生存者可以利用端粒维持的重组方式，作为发芽酵母菌株归档，它具有各种缺失的端粒复制基因(Lendvay(1996)出处同上，Lundblad(1993)细胞73：347)。 
iii)鉴定人端粒酶并对其定性 
通过dbEST(表达序列标记)Genbank数据库的BLAST研究，利用Euplotes123千道尔顿肽和核酸序列，以及裂殖酵母蛋白质和相应的 cDNA(tezl)序列鉴定了起源于人端粒酶逆转录酶(hTRT)cDNA的EST(表达序列标记)。命名为GenbankAA28196的EST是389个核苷酸长，它对应于克隆712562的1679到2076(图18)，是从I.M.A.G.E.聚生体获得的(人基因组中心，DOE，Lawrence Livermore National实验室，Livermore，CA)。这一克隆是从扁桃体细胞的流动分拣起源的胚B细胞的cDNA文库获得的。这一hTRTcDNA克隆的完全测序表明了所有8个端粒酶RT(TRT)基序。但是，这一hTRT克隆不编码TRT的邻近部分，因为RT基序B’，C，D，和E包含在不同于多个N末端的RT基序的开放读码框架中。另外，在RT基序A和B之间的距离基本比前面已知的3个TRT(非人)更短。 
为了分离全长cDNA克隆，筛选了起源于表达高水平的端粒酶活性的人293细胞系(如上所述)的cDNA文库。将来自293个细胞系的λcDNA文库分成每个约含有200,000个噬菌斑的25个库。通过利用引物对5’-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3’和5’-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3’的PCR筛选每个库。一个阳性初级库的6个亚库进一步利用同样的引物对通过PCR进一步筛选。对于初级和次级亚库筛选，扩增hTRT总共31个循环，每个循环在94℃，45秒，60℃，45秒；和72℃，90秒。作为对照，利用引物对5’-CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA-3’和5’-ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA-3’扩增管家酶GAPDH的RNA总共16个循环，每个循环94℃，45秒，55℃，45秒；和72℃，90秒。 
然后，通过利用克隆#7125625’区域的探针进行噬菌斑杂交筛选来自次级筛选的hTRT阳性亚库。阳性鉴定一个噬菌斑(命名为λ噬菌斑25-1.1，ATCC209024，于1997年5月12日保藏)。它含有约4千个碱基的插入，它作为EcoRI片断切出和亚克隆进入pBluescriptIISK+载体(Stratagene，圣迭戈，CA)的EcoRI位点。这一含有cDNA克隆的 质粒命名为pGRN121。cDNA插入总共约4千碱基对。人hTRTcDNA的完全的核苷酸序列已经保藏于Genbank(登记号AF15950)并且质粒已经保藏于ATCC(ATCC209016，保藏日1997年5月6日)。 
B.Euplotes aediculatus的生长 
在这一实施例中，从David Prescott博士，MCDB，克罗里达大学获得E.aediculatus培养物。Prescott博士最初从池塘水中分离这一培养物，虽然这一生物体也可从ATCC(ATCC#30859)获得的。如Swanton等人叙述，在无菌条件下，在含有Chlorogonium作为食物来源的15升玻璃容器中，生长培养基(Swanton等人，Chromosoma77：203[1980])。当密度达到约104个细胞/毫升时从培养物收集生物体。 
C.制备核提取物 
在这一实施例中，利用Linger等人的方法，进行最小的修改，如下所述制备了E.aediculatis的核提取物。简要地说，将在部分B中所述生长的细胞利用15微摩尔/升Nytex滤纸浓缩，并在冰上冷却。细胞沉淀再悬浮到最后体积110毫升TMS/PMSF/磷酸精胺缓冲液。通过在150毫升TMS加入0.075克磷酸精胺(USB)和0.75毫升PMSF制备储藏液TMS/PMSF/精胺磷酸缓冲液(从乙醇制备的100毫摩尔/升储备液)。TMS含有10毫摩尔/升Tris-乙酸，10毫摩尔/升MgCl2，85.5752克蔗糖/升，和0.33297克CaCl2/升，pH7.5。 
在TMS/PMSF/精胺缓冲液中再悬浮后，加入8.8毫升10％NP-40和94.1克蔗糖，将混合物置于具有附着于突出的转头的不锈钢搅拌磁头的硅化玻璃烧瓶中。搅拌混合物直到细胞完全溶解(约20分钟)。然后，在7500rpm(8950×g)，4℃离心混合物10分钟。其中利用了BeckmanJS-13甩平式转头。除去上清液，将核沉淀再悬浮于TMS/PMSF/精胺缓 冲液，再次在4℃，7500rpm(8950×g)离心5分钟。其中利用了BeckmanJS013甩平式转头。 
除去上清液，将核沉淀再悬浮于含有50毫摩尔/升Tris-乙酸，10毫摩尔/升MgCl2，10％甘油，0.1％NP-40，0.4MKGlu，5毫摩尔PMSF，pH7.5的缓冲液中，体积为每10克收集细胞0.5毫升缓冲液体积。然后，在玻璃匀浆器中利用约50冲程匀浆再悬浮的核，然后在Eppendorf离心机中，在4℃，在14,000rpm离心25分钟。收集含有核提取物的上清液，在液氮中冷冻，并储藏在-80℃直到使用。 
D.纯化端粒酶 
在这一实施例中，如上所述在部分C制备了核提取物用于纯化E.aediculatus端粒酶。在这一纯化的方案中，通过在亲和，凝胶-肝素柱上层析首先富集端粒酶，然后，通过具有反义低聚核苷酸的亲和纯化充分纯化。作为端粒酶RNA模板区可以在端粒酶RNP颗粒中进行杂交，合成反义低聚核苷酸(即，“亲和低聚核苷酸”)，合成的反义低聚核苷酸作为端粒酶的亲和性饵与这一模板区互补。生物素残基包括在低聚核苷酸的5’末端，以便固定它到抗生物素蛋白柱上。 
在端粒酶与低聚核苷酸结合后，充分洗涤，利用替代低聚核苷酸洗脱端粒酶。亲和性低聚核苷酸包括与端粒酶特异序列的5’端粒酶RNA不互补的DNA碱基。由于替代低聚核苷酸与亲和性低聚核苷酸整个长度互补，它能够形成比结合亲和性低聚核苷酸的端粒酶更加热动力稳定的双倍体。所以，加入替代低聚核苷酸导致从柱中洗脱端粒酶。 
将从45升培养物中制备的核提取物冷冻直到收集总共34毫升核提取物。这对应于630升培养物(即，约4×109个细胞)。利用缓冲液洗脱核提取物到410毫升，提供了最后浓度为20毫摩尔/升Tris-乙酸，1毫摩尔/升MgCl2，0.1毫摩尔/升EDTA，33毫摩尔/升KGlu，10％(vol/vol) 甘油，1毫摩尔/升二硫苏糖醇(DTT)，和0.5毫摩尔/升苯甲基氟磺酰(PMSF)，pH7.5。 
将稀释的核提取物加到亲和-凝胶-肝素凝胶柱上(Bio-Rad)，该柱具有230毫升床体积，和5厘米直径，在同样的缓冲液中平衡，利用2升，从33到450毫摩尔/升KGlu梯度洗脱。在4℃，流速1柱体积/小时流动柱。收集每50毫升的组分，如部分E所述测试端粒酶活性。在约170毫摩尔/升Kglu从柱洗脱端粒酶。合并含有端粒酶(约440毫升)的组分，调节到20毫摩尔/升Tris-乙酸，10毫摩尔/升MgCl2，1毫摩尔/升EDTA，300毫摩尔/升KGlu，10％甘油，1毫摩尔/升DTT，和1％Nonidet P-40。这一缓冲液命名为“WB”. 
在这一制剂中，每毫升合并液中加入各1.5纳摩尔两个竞争者DNA低聚核苷酸(5’-TAGACCTGTTAGTGTACATTTGAATTGAAGC-3’和5’-TAGACCTGTTAGGTTGGATTTGTGGCATCA-3’，50微克酵母RNA(西格玛)，和0.3纳摩尔生物素标记的端粒酶特异低聚核苷酸(5’-生物素-TAGACCTGTTA-(mreG)2-(rmeU)4-(rmeG)4-(rmeU)4-rmeG-3’。端粒酶特异的低聚核苷酸的2-O-甲基核糖核苷酸与端粒酶RNA互补；模板区域；脱氧核糖核苷酸是不互补的。竞争者的包含，非特异的DNA低聚核苷酸增强了纯化的效力，因为结合亲和低聚核苷酸或从混合物中除去端粒酶的混合物中的核酸结合蛋白质和其它成分的效果将减少。 
然后，将这一物质加入Ultralink固定的新抗生物素蛋白加(Pierce)柱物质，每毫升合并液中加入60微升悬浮液体积。柱物质预封闭两次，每次封闭15分钟，其中利用WB制剂封闭，它含有0.01％Nonidet P-40，0.5毫克BSA，0.5毫克/毫升溶菌酶，0.05毫克/毫升糖原，和0.1毫克/毫升酵母RNA。在4℃进行封闭，其中利用了转头轮完全封闭柱物质。在第一个封闭步骤后，和第二个封闭步骤之前，在200×g离心 柱物质2分钟，以沉淀基质。 
将合并柱混合物在30℃温育8分钟，然后，在4℃温育另外2小时，温育是在旋转轮上(约10rpm；实验室工业进行以)允许结合。然后，在200×g离心合并的柱混合物2分钟，除去含有未结合的物质的上清液。然后洗涤合并的柱混合物。这一洗涤过程包括利用WB在4℃漂洗合并柱混合物的步骤，利用WB在4℃洗涤混合物15分钟，利用WB漂洗，在30℃利用含有0.6K Glu不含有NaidetP-4的WB洗涤5分钟，利用WB，在25℃洗涤5分钟，并且最后，再次利用WB漂洗。在最后洗涤后剩余的体积保持小的，以便产生缓冲液与柱物质的比例为1∶1。 
通过每毫升柱物质加入1纳摩尔替代脱氧低聚核苷酸(5’-CA4C4A4C2TA2CAG2TCTA-3’)，并在25℃温育30分钟从柱物质洗脱端粒酶。在14,000rpm在微型离心机(Eppendorf)中离心物质2分钟，收集洗脱物。每次利用新鲜的替代低聚核苷酸洗脱重复洗脱过程2次以上。如上面提到的，因为替代低聚核苷酸与亲和低聚核苷酸互补，它形成了具有比P-40更加热动力稳定的具有亲和低聚核苷酸的复合物。所以，在亲和结合端粒酶中加入替代低聚核苷酸导致在天然条件下有效地洗脱端粒酶。在这一时期，端粒酶似乎是约50％纯度，正如蛋白质凝胶上分析判断的。图26显示了利用亲和纯化端粒酶和替代低聚核苷酸洗脱(组A和B)。在这一图中，黑体线表明了2’-O-甲基糖的亲和低聚核苷酸。在这一图中的黑的和阴影卵形形状打算代表本发明的蛋白质亚单位。 
利用Bradford(Bradford，生物化学分析，72：248[1976])，利用BSA作为标准确定在亲和-凝胶-肝素柱层析后获得的提取物和物质的蛋白质浓度。在甘油梯度上进一步纯化端粒酶制剂的一个部分。 
通过甘油梯度离心，如部分I所述确定了端粒酶的沉降协同系数。 
下面的表5是根据这一实施例的方法，纯化的端粒酶的纯化表。在核提取物中，与全部细胞提取物比较，端粒酶富集了12倍，回收率是80％；在提取时85％的端粒酶从核中溶解。 
表5.端粒酶的纯化 
  组分   蛋白质  (毫克)  端粒酶 (RNP的 皮摩尔)   端粒酶/蛋白  质/皮摩尔  RNP/毫克   回收率(％)   纯化因子
  核提取物   2020  1720   0.9   100   1
  肝素   125  1040   8.3   60   10
  亲和性   0.3**  680   2270   40   2670
  甘油梯度   NA*  NA**   NA*   25   NA*
*NA＝不可得 
**通过假设纯度为50％(根据蛋白质凝胶)，从端粒酶的测量的量(680皮摩尔)计算这一值。 
E.端粒酶活性 
在端粒酶的纯化的每个步骤，通过三个分离测试分析制剂，其中一个是活性，如这一实施例中所述。一般地说，在含有0.003-0.3微升核提取物，50毫摩尔/升Tris-Cl(pH7.5)，50毫摩尔KGlu，10毫摩尔/升MgCl2，1毫摩尔/升DTT，125微摩尔/升dTTP，125微摩尔浓度dGTP，和约0.2皮摩尔5’-32P标记的低聚核苷酸底物(即，约400,000cpm)的40微升中进行端粒酶测试。在加入反应混合物之前热变性低聚核苷酸引物。在冰上进行反应和在25℃温育30分钟。通过加入200微升10毫摩尔/升Tris-Cl(pH7.5)，15毫摩尔/升EDTA，0.6％SDS，和0.05毫 克/毫升蛋白酶K终止反应，并且在45℃至少温育30分钟。在乙醇沉淀后，在变性的8％PAGE凝胶上如本领域已知分析产物(参见例如Sambrook等人，1989)。 
F.端粒酶活性的定量 
在这一实施例中，叙述了通过纯化过程定量端粒酶活性。在存在dGTP和[α-32P]dTTP时，测试低聚核苷酸引物的延长完成定量。简要地说，在存在2微升[α-32P]dTTP(10毫居里/毫升，400居里/毫摩尔；1居里＝37GBq)，和如上所述的125微摩尔/升dGTP(Lingner等人，基因发展，8：1984[1994])时，在20微升反应混合物中延伸1微摩尔浓度5’-(G4T4)2-3’低聚核苷酸，并且加样到如上所述的8％的PAGE测序胶上。 
如图28显示了这一研究的结果。在泳道1中，没有端粒酶存在(即，阴性对照)；泳道2，5，8和11含有0.14fmol端粒酶；泳道3，6，9和12含有0.42fmol端粒酶；和泳道4，7，10和13含有1.3fmol端粒酶。利用磷酸成象(分子动力学)，利用制造商的说明定量活性。在这些条件下确定，在30分钟21fmol dTTP中掺入了1fmol亲和纯化的端粒酶。 
如图28所示，通过纯化过程，端粒酶的比活性没有明显改变。亲和纯化的端粒酶完全是活化的。但是，可以确定的是检测到高浓度，抑制活性，粗提取物的活性是非线性的。所以，在图28所示的测试中，粗提取物稀释了700-7000倍。通过纯化，除去了这一抑制活性，纯化的端粒酶制剂中没有检测到抑制效果，甚至在高的酶浓度。 
G.凝胶电泳和Northern影印 
如部分E所述，在纯化端粒酶的每个步骤，通过三个单独测试分析制剂。这一实施例叙述了凝胶电泳，和用于定量存在于组分中的端粒 酶RNA和分析端粒酶核糖核蛋白颗粒的整体的影印过程。 
I)变性凝胶和Northern影印 
在这一实施例中，已知浓度的合成T7转录端粒酶RNA作为标准。通过这一研究，将RNA成分用作端粒酶的量度。 
利用(PCR)，产生E.aediculatus端粒酶RNA的噬菌体T7RNA聚合酶转录的构建体。利用与基因的任一末端退火的引物扩增端粒酶RNA基因。在5’末端退火的引物编码锤头核酶序列以便在转录RNA，T7启动子序列，和用于亚克隆的EcoRI位点的裂解的基础上产生天然的5’末端。这一5’引物的序列是5’-GCGGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAAGAAACTCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACTCCACGAAAGTGGAGTAAGTTTCTCGATAATTGATCTGTAG-3’。3’引物包括天然3’末端的用于终止转录的EarI位点，和用于克隆的BamHI位点。这一引物的序列是5’-CGGGGATCCTCTTCAAAAGATGAGAGGACAGCAAAC-3’。利用EcoRI和BamHI裂解PCR扩增产物，亚克隆进入pUC19(NEB)的各个位点，给出“pEaT7”。通过DNA测序证明了这一插入片断的准确性。如Zaug等人，生物化学，33：14935[1994]所述，利用EarI线性化的质粒进行T7转录。凝胶纯化RNA，并且确定浓度(A260为1时＝40微克/毫升)。这一RNA用作标准确定存在于各种端粒酶制剂中的端粒酶RNA。 
杂交信号与端粒酶RNA的量成比例，但衍生的RNA浓度一致于但稍微高于那些天然凝胶电泳获得的。在全部细胞RNA中全部端粒酶RNA的量与已知的T7RNA转录物浓度的系列稀释的比较表明每个E.aediculatus细胞含有大约300,000端粒酶分子。 
利用如上所述的方法(Linger等人，基因发展，8：1984[1994])，通过与它的RNA成分的Northern影印杂交可以完成观察端粒酶。简要地说，在8％PAGE上分辨RNA(少于或等于0.5微克/泳道)，和电影印 到Hybond-N膜上(Amersham)，如本领域已知的(参见，例如，Sambrook等人，1989)。在10毫升的4×SSC，10×Denhardt’s溶液，0.1％SDS，和50微克/毫升变性鲸精子DNA中过夜杂交印迹。在预杂交3小时后，加入2×106cpm探针/毫升杂交溶液。任意标记的探针是覆盖整个端粒酶RNA基因的PCR产物。利用几个缓冲液变化，在45℃用2×SSC，0.1％SDS洗涤印迹30分钟，和然后在0.1×SSC和0.1％SDS洗涤1小时。 
ii)天然凝胶和Northern印迹 
在这一实施例中，在3.5％的聚丙烯酰胺和0.33％琼脂糖天然凝胶(即非变性)上，如本领域已知和所述进行纯化的端粒酶制剂电泳(Lamond和Sproat，[1994]，出处同上)。端粒酶与二甲苯氰染料一起迁移。 
天然凝胶的结果表明通过纯化方案维持端粒酶作为RNP。图27是显示在非变性凝胶上在不同组分中的端粒酶以及体外转录的端粒酶的迁移率的Northern印迹的照片。在这一图中，泳道1含有1.5fmol端粒酶RNA，泳道2含有4.6fmol端粒酶RNA，泳道3含有14fmol端粒酶RNA，泳道4含有41fmol端粒酶RNA，泳道5含有核提取物(42fmol端粒酶)，泳道6含有亲和-凝胶-肝素-纯化端粒酶(47fmol端粒酶)，泳道7含有亲和-纯化端粒酶(68fmol)，和泳道8含有甘油梯度纯化端粒酶(35fmol)。 
如图27所示，在核提取物中，将端粒酶组装成RNP颗粒，它的迁移比未组装的端粒酶RNA慢得多。通过这一方法检测到小于1％的游离RNA。但是，在提取物中有时同样检测到更慢迁移的端粒酶RNP复合物。在亲和-凝胶-肝素柱上纯化的基础上，端粒酶RNP颗粒的迁移率不改变(图27，泳道6)。但是，在亲和纯化的基础上，RNA颗粒的迁移慢慢增加(图27，泳道7)，可能表明蛋白质亚单位或片断已经失去。在甘油梯度上，亲和纯化端粒酶不改变大小，但约2％的游离端粒酶RNA 是可检测的(图27，泳道8)，表明已经发生小量的RNA颗粒的分解。 
H.端粒酶蛋白质组合物 
在这一实施例中，叙述了纯化的端粒酶蛋白质组合物的分析。 
如部分D所述获得的甘油梯度组分在4-20％聚丙烯酰胺凝胶(Novex)上分离了。在电泳后，利用考马斯亮蓝染色凝胶。图29显示了凝胶的照片。泳道1和2含有分子量标记(Pharmacia)如图29中显示的凝胶的左边上表明。泳道3-5含有甘油梯度部分合并液，如凝胶的顶部表明(即，泳道3含有组分9-14，泳道4含有组分15-22，泳道5含有组分23-32)。泳道4含有具有1皮摩尔的端粒酶RNA的合并液。在泳道6-9BSA中，在图29中的凝胶的顶部表明的浓度电泳标准物(即，泳道6含有0.5皮摩尔BSA，泳道7含有1.5皮摩尔BSA，泳道8含有4.5BSA，和道9含有15皮摩尔BSA)。 
如图29所示，具有120和43千道尔顿分子量的多肽与端粒酶共纯化。观察到43千道尔顿多肽作为双联体。注意到在泳道3中的约43千道尔顿的多肽的迁移不同于泳道4的双联体；可以是未相关的蛋白质。当比较BSA标准时，利用在大约1皮摩尔的水平的考马斯亮蓝染色每个120千道尔顿和43千道尔顿双联体。因为，这一部分含有1皮摩尔端粒酶RNA，其中所有组装进入RNP颗粒(参见，图27，道8)，似乎是两个多肽亚，是利用端粒酶RNA化学计量的。但是，也可能两个43千道尔顿蛋白质约是分离的酶亚单位。 
没有在甘油梯度上进行分级分离的亲和纯化端粒酶含有表观分子量分别为约35和37千道尔顿的其它多肽。估计这一后部分至少50％纯度。但是，存在于亲和纯化物质中的35千道尔顿和37千道尔顿多肽没有通过甘油梯度离心再生性地分离。这些多肽可以是污染，因为它们在所有含有活性的制剂中是不可见的。 
I.沉降系数 
通过甘油梯度离心确定端粒酶的沉降系数。在这一实施例中，在含有20毫摩尔/升的Tris-乙酸，1毫摩尔/升MgCl2，0.1毫摩尔EDTA，300毫摩尔KGlu，和1毫摩尔/升DTT，pH7.5的15-40％甘油梯度上分级分离核提取物和亲和纯化的端粒酶。在5毫升(13×51毫米)试管中注入甘油梯度，利用SW55Ti转头(Beckman)，在55,000rpm，4℃离心14小时。 
在平行的梯度中电泳标记蛋白质，该标记具有的沉降系数对于乙醇脱氢酶(ADH)为7.6S，对于过氧化氢酶为113S，对于apoferritin为17.3S和对于甲状腺球蛋白为19.3S。通过梯度部分的天然凝胶电泳，接着与它的RNA成分影印杂交鉴定端粒酶峰。 
图30是显示端粒酶沉降系数的照片。如图中所示，亲和纯化端粒酶与催化酶在11.5S共沉降，而在核提取物中的端粒酶稍微更快地沉降，峰在12.5S。所以，与天然凝胶中的酶的迁移率一致的是，纯化的酶似乎已经失去了蛋白裂解片断，或者疏松结合的亚单位。 
端粒酶的计算分子量，如果假设由一个120千道尔顿蛋白质亚单位，一个43千道尔顿亚单位，和一个66千道尔顿的RNA亚基组成，总共229千道尔顿。这是与232千道尔顿分子量的过氧化氢酶紧密一致的。但是，沉降系数是分子量，以及部分特异体积，和分子的部分系数的函数，两者对于Euplotes端粒酶RNP是未知的。 
J.底物利用 
在这一实施例中，研究了Euplotes端粒酶的底物需要。DNA末端复制的一个简单模型预测在DNA半保守复制后，端粒酶延长双链的，末端平齐化的DNA分子。在这一模型的变化中，通过螺旋酶或核酸酶，在复制后产生单链的3’末端。然后，通过端粒酶利用3’末端结合和 延长。 
为了确定是否端粒酶能够延长末端平齐化的分子，利用定位于它们的3’末端的端粒重复合成模型发夹。对这些引物底物进行凝胶纯化，利用聚核苷酸激酶标记5’末端，0.4微摩尔/升加热到在80℃，5分钟，然后，在热封闭中慢慢冷却到室温，允许发夹的变性和螺旋的形成。在非变性凝胶上的底物迁移表明与二聚化比较，存在非常有效的发夹形成。 
利用未标记的125微摩尔/升dGTP，125微摩尔/升dTTP，和0.02微摩尔/升5’末端标记引物(5’-32P-标记的低聚核苷酸底物)，在含有20毫摩尔/升Tris-乙酸，与10毫摩尔/升MgCl2，50毫摩尔/升KGlu，和1毫摩尔/升DTT，在pH7.5的10微笑或反应混合物中进行测试。将这些混合物在25℃温育30分钟。通过加入甲酰胺加样缓冲液(即，TBE，甲酰胺，溴甲蓝，和氰，Sambrook，1989，出处同上)终止反应。 
没有端粒酶(“-”)，用5.9fmol亲和-纯化-端粒酶(“+”)，或用17.6fmol亲和纯化端粒酶(“+++”)温育引物。在这一测试中利用的亲和纯化端粒酶利用截止分子量100千道尔顿的膜透析，以便除去替代低聚核苷酸。在含有36％甲酰胺的8％PAGE/脲凝胶上分离反应产物以便使发夹变性。在这一研究中利用的引物的序列以及它们的泳道分配如表6所示。 
表6.引物序列 
  泳道   引物序列(5’至3’)
  1-3   C4(A4C4)3CACA(G4T4)3G4
  4-6   C2(A4C4)3CACA(G4T4)3G4
  7-9   (A4C4)3CACA(G4T4)3G4
  10-12   A2C4(A4C4)2CACA(G4T4)3G4
表6.引物序列 
  13-15   C4(A4C4)2CACA(G4T4)3
  16-18   (A4C4)3CACA(G4T4)3
  19-21   A2C4(A4C4)2CACA(G4T4)3
  22-24   C4(A4C4)2CACA(G4T4)3
  25-27   C2(A4C4)2CACA(G4T4)3
  28-30   (A4C4)2CACA(G4T4)3
图31显示了凝胶结果。泳道1-15含有以4个G残基结尾的端粒重复的底物。泳道16-30含有具有以4个T残基结尾的端粒重复的底物。图32中表明了端粒酶RNA模板上推断的排列。假设引物组在图32中显示的模板中两个非常不同的位置退火(即，组A和组B)。这可能已经影响了它们的结合和/或延长速度。 
图33显示了图31中的泳道25-30的更亮的曝光。进行图33的更亮的曝光允许看见加入的核苷酸和延长产物中终止的位置。在磷酸成象上定量每个组中第三泳道中延长的底物的百分数，如图31的底部上所示。 
这些发夹的底物效率与具有不同长度的突出的双链端粒状底物比较。当它平齐化末端时(参见，泳道1-3)，以4个G残基结尾的模型底物(参见图31中的道1-15)没有延长。但是，两个碱基的突出长度中观察到轻微的延伸；当突出是至少4个碱基的长度时，延伸变得有效。以同样的方式利用端粒酶作用于以4个T残基结尾的双链底物，高效率的延长需要6个碱基的突出。在图31中，在独立于端粒酶的道10-15中的引物下面的弱带代表了在引物制剂中更短的低聚核苷酸。 
图33中泳道25-30的更亮的曝光显示了延长的产物的阶梯，具有 与模板的推断的5’边界的相关的最暗的谱带(如Linger等人，基因发展，8：1984[1994])。在模板中对应于其它位置的产物的丰度表明终止和/或分解发生在除了利用纯化的端粒酶的易位的位置外的位置。 
如图31所示，双链，末端平齐化的低聚核苷酸不是端粒酶的底物。为了确定是否这些分子将结合端粒酶，进行了竞争实验。在这一实验中，利用0.125纳摩尔/升端粒酶延伸具有序列(G4T4)2的2纳摩尔/升5’末端标记底物，或具有六个碱基突出的的发夹底物。虽然利用用于延伸的标记的底物有效地竞争同样的未标记低聚核苷酸底物，当将双链末端平齐化的发夹低聚核苷酸用作竞争者，甚至在存在100倍的过量发夹时，没有观察到减少的活性。 
这些结果表明双链，末端平齐化的低聚核苷酸不能在实施例中的测试浓度和条件下结合端粒酶。相反，单链3’末端是结合所需要的。似乎是3’末端是与端粒酶RNA模板的碱基配对所需要的。 
K.123千道尔顿多肽的克隆和测序 
在这一实施例中，叙述了Euplotes端粒酶的123千道尔顿多肽(即，123千道尔顿蛋白质亚单位)的克隆。在这一研究中，通过PCR扩增端粒酶基因的内部片断，其中利用设计匹配肽序列的低聚核苷酸引物，所述肽序列从部分D中获得的纯化多肽获得。利用本领域已知的nanoES串联质谱方法确定多肽序列，并且通过Calvio等人，RNA1：724-733[1995]叙述。用于这一实施例的低聚核苷酸引物具有下面的序列，简并的位置显示于括号--5’-TCT(G/A) 
AA(G/A)TA(G/A)TG(T/G/A)GT(G/A/T/C)A(T/G/A)(G/A)TT(G/A)TTCAT-3′，和5′-GCGGATCCATGAA(T/C)CC(A/T)GA(G/A)AA(T/C)CC(A/T)AA(T/C)GT-3′. 
50微升反应含有0.2毫摩尔dNTP，0.15微克E.aediculatis染色 体DNA，0.5微升Taq(Boehringer-Mannheim)，0.8微克每种引物，和1×反应缓冲液(Boehringer-Mannheim)。在热循环中温育反应(Perkin-Elmer)，其中利用了下面-5分钟95℃，接着30次循环，每个循环为1分钟94℃，1分钟52℃，和2分钟72℃。通过在72℃温育10分钟完成反应。 
通过在pCR-Script质粒载体图14(Stratagene)的SmaI位点克隆末端平齐化的DNA，从染色体E.aediculatusDNA制备基因组DNA文库。通过与放射性标记，凝胶纯化PCR产物菌落杂交，筛选文库。制备阳性克隆的质粒DNA，和通过二脱氧方法(Sanger等人，美国科学院年报，74：5463[1977])，或手工地，通过使用自动测序仪(ABI)测序。编码这一多肽的基因的DNA序列显示在图13。从DNA序列推断的这一序列中的起始密码定位于核苷酸位置101，开放读码框架在位置3193结尾。Euplotes的遗传密码其它生物体区别在于“UGA”密码编码了半胱氨酸残基。从DNA序列推断的多肽的氨基酸序列表示在图14，假设在翻译过程中没有特殊的氨基酸插入，和没有翻译后的修饰发生。 
L.克隆和测序43千道尔顿多肽 
在这一实施例中，叙述了43千道尔顿的端粒酶的多肽的克隆(即，43千道尔顿蛋白质亚单位)。在这一研究中，通过PCR扩增对应于端粒酶基因的内部片断，其中利用设计肽序列低聚核苷酸引物匹配，这些肽序列是从部分D中获得的纯化的多肽获得的。利用本领域已知的nanoES串联质量光谱方法确定多肽序列，并且由Calvio等人出处同上叙述。用于这一实施例中的低聚核苷酸引物具有下面的序列， 
5′-NNNGTNAC(C/T/A)GG(C/T/A)AT(C/T/A)AA(C/T)AA-3′，和5′-(T/G/A)GC(T/G/A)GT(C/T)TC(T/C)TG(G/A)TC(G/A)TT(G/A)TA-3′. 
在这一序列中，“N”表明任何四个核苷酸的存在(即，A，T，G，或 C)。 
如部分K所述进行PCR。 
如部分K所述制备和筛选基因组DNA文库。图34中显示了编码这一肽的基因的DNA序列。如图35所示，显示了用于这一序列的三个潜在的读码框架。为了清楚，在所有三个读码框架中在核苷酸序列的下面表明了氨基酸序列。这些读码框架命名为“a”，“b”，和“c”。在读码框架“c”中的核苷酸位置84编码了可能的起始密码。编码区域可以在读码框架“b”中的位置1501结束。早期终止密码在这一图中用星号表明，存在于核苷酸位置337-350之间的所有三个读码框架中。 
“La-区”用黑体类型表明。另外，下游的，蛋白质序列似乎是不同读码框架编码的，因为三个框架没有被终止密码中断的。另外，来自纯化的蛋白质的肽序列是所有三个框架中编码的。所以，这一基因似乎是含有干扰序列，或在可替代地编辑了RNA。其它的可能性包括核糖体读码移动或序列错误。但是，与La-蛋白质序列的同源性仍然是明显需要的。再次在Euplotes中，“UGA”密码子编码了半胱氨酸残基。 
M.氨基酸和核酸比较 
在这一实施例中，在各种报道序列和123千道尔顿和43千道尔顿端粒酶亚单位多肽之间进行比较。 
I)与123千道尔顿E.aediculatus端粒酶亚单位的比较 
将四膜虫80千道尔顿蛋白质亚的序列〔GenBank入藏号#U25641〕与123千道尔顿Euplotes aediculatus多肽的氨基酸序列比较以便研究它们的相似性。图42中显示了从编码这一蛋白质的基因库获得的核苷酸序列。图43中显示了从基因库获得的这一蛋白质的氨基酸序列。图36显示了123千道尔顿E.aediculatus和80千道尔顿四膜虫之间的序列比较。在这一图中，E.aediculatus是上面的序列，而四膜虫序 列是下面的序列。确定观察到的同一性是约19％，而相似性百分数约为45％，值相似于利用任何随机蛋白质序列观察到的。在图36-39中，垂直条表示了同一性，而序列之间单一的点表示相似氨基酸，和序列之间的双点表示更相似氨基酸。 
123千道尔顿Euplotes aediculatus多肽同时与四膜虫的95千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位的序列比较(基因库登记号#U25642)，以便研究它们的相似性。图44显示了从编码这一蛋白质的基因库获得的核苷酸序列。图46显示了从基因库获得的这一蛋白质的氨基酸序列。图37中显示了这一序列的比较。在这一图中，E.aediculatus序列是上面的序列，而四膜虫序列是下面的序列。确定观察到的同一性为20％，而相似性百分数约为43％，该值相似于利用任何随机蛋白质序列观察到的。 
明显地，123千道尔顿E.aediculatus多肽含有的氨基酸序列含有逆转录酶的5个基序特征。123千道尔顿多肽也与各种逆转录酶的聚合酶区域比较。图40显示了具有推断的酵母同源物的(L8543.12或ESTp)123千道尔顿多肽的排列。图46显示了从基因库获得的L8543.12的氨基酸序列。 
四个基序(A，B，C，和D)包括在这一比较中。在图40中，通过在黑色背景上的白色字母表示高度保守的残基。在其它序列中保守的E.aediculatus序列的残基用黑体表示，“h”表示疏水氨基酸的存在。定位于基序的氨基酸残基之间的数表示序列中的裂口的长度。例如基序A和B之间显示的“100”反映了在基序之间的序列中100个氨基酸裂口。 
如上所述，基因库检索鉴定了酵母蛋白质(基因库登记号#u20618)，和基因L8543.12(Est2)，它们含有或编码显示与 E.aediculatus123千道尔顿端粒酶亚单位的一些同源性氨基酸序列。根据在它们的C末端区域含有逆转录酶基序的两个蛋白质的观察；两个蛋白质在逆转录酶基序的外面的区域共享相似性；蛋白质是相似的碱性(pI＝10.1，对于E.aediculatis和pI＝10.0，对于酵母)，两个蛋白质是大的(123千道尔顿，对于E.aediculatus和103千道尔顿，对于酵母)，这些序列含有它们各自的端粒酶的催化核心。涉及的是根据在两个系统发育区别的生物体如E.aediculatus和酵母中的同源性的观察，人端粒酶将含有具有相同特征的蛋白质(即，逆转录酶基序，是碱性的和大[＞100千道尔顿])。 
ii)与43千道尔顿E.aediculatus端粒酶亚单位的比较 
将43千道尔顿Euplotes aediculatus多肽的“La-区域”的氨基酸序列与四膜虫的95千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位(如上所述)比较，以便研究它们的相似性。图38显示了这一序列比较，而四膜虫序列是下面的序列。确定观察的同一性是约23％，而相似性的百分数约为46％，这些值相似于利用任意蛋白质序列观察到的。 
将43千道尔顿的Euplotes aediculatus多肽的“La-区域”的氨基酸序列与四膜虫(如上所述)的80千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位比较，以便研究它们的相似性。图29显示了这一序列比较。在这一图中，E.aediculatus序列是上面的序列，而四膜虫序列是下面的序列。确定观察到的同一性是约26％，而相似性的百分数是约49％，这些值相似于利用任意蛋白质序列观察到的。 
将43千道尔顿E.aediculatus多肽的氨基酸序列与来自不同的其它生物体的La蛋白质比较。图41中显示了这些比较。在这一图中，利用黑底背景上的白色字母表示高度保守的残基。黑体表示了在其它序列中保守的E.aediculatus序列的残基。 
N.在另一个生物体中的端粒酶蛋白质亚单位的鉴定 
在这一实施例中，将前面的实施例中鉴定的序列用于鉴定Oxytricha trifallax的端粒酶蛋白质亚单位，该种类是与E.qediculatus非常有关的纤毛虫。根据E.sediculatus 123千道尔顿多肽的保守区域选择引物，该多肽含有逆转录酶区域基序。合成适当的引物，并且用于与来自Oxytricha的总DNA进行PCR反应。根据本领域已知的方法制备Oxytricha DNA。然后，利用本领域已知的方法克隆和测序PCR产物。 
用作引物的低聚核苷酸序列如下“ 
5′-(T/C)A(A/G)AC(T/A/C)AA(G/A)GG(T/A/C)AT(T/C)CC(C/T/A)(C/T)A(G/A)GG-3′and 5′-(G/A/T)GT(G/A/T)ATNA(G/A)NA(G/A)(G/A)TA(G/A)TC(G/A)TC-3′). 
括号中显示了简并的位置，在括号中显示了可替代的碱基，“N”代表任何的四个核苷酸的任一个。 
在PCR反应中，50微升反应混合物含有0.2毫摩尔/升dNTP，0.3微克Oxytricha trifallax染色体DNA，1微升Taq聚合酶(Boehringer-Mannheim)，各2微摩尔每种引物，1×反应缓冲液(Boehringer-Mannheim)。将反应混合物在下面的条件下在热循环中温育：5分钟95℃，包括1分钟94℃，1分钟53℃，和1分钟72℃的30循环，接着10分钟在72℃温育。凝胶纯化PCR产物和通过二脱氧方法测序(例如，Sanger等人，美国科学院年报，74：5463-5467(1977)。 
确定PCR的产物推断的氨基酸序列并且与E.aediculatus序列比较。图47显示了这些序列的排列，在顶部的一排显示了O.trifallax序列，和底部的一排显示了E.aediculatus序列。如从这一图中可以看到，在E.aediculatus多肽序列和这一实施例中鉴定的O.trifallax 多肽序列之间存在大量的同源性。所以，很清楚在本发明中鉴定的序列可用于鉴定其它真核生物体中的同源端粒酶蛋白质亚单位。确实，本发明的发展已经鉴定了多倍体，趋异种类如上所述中的同源端粒酶序列。 
O.四膜虫端粒酶序列的鉴定 
在这一实施例中，产生的四膜虫克隆与Euplotes序列和EST2p共享同源性。 
这一实验利用了针对保守基序的简并低聚核苷酸引物的PCR以便鉴定四膜虫，Euplotes和EST2p序列之间的同源性的区域。用于这一实施例中的PCR方法是设计特异地扩增来自复合混合物的稀少的DNA序列的新方法。这一方法避免了在PCR克隆方法中，利用同样的PCR引物在两个末端(即，单个引物产物)扩增DNA产物通常遇到的问题。这些单个引物产物产生不希望的背景，并且可能经常遮掩了需要的两个引物产物的扩增和检测。用于这一实验的方法优选地选择两个引物的产物。特定地，一个引物是生物素化的并且另一个不是。在几轮PCR扩增循环之后，利用链霉抗生物素蛋白磁性小珠纯化产物，并且利用热变性特异地洗脱两个引物产物。这一方法发现用于设置中，而不是这一实施例中叙述的实验中。确实，这一方法发现用于应用中，其中需要特异地扩增稀少的DNA序列，包括克隆方法如5’和3’中的初级步骤，RACE，和用于PCR中的简并引物的任何方法。 
利用本领域已知的方法分离的四膜虫模板大核DNA进行第一个PCR循环，其中还利用了具有下列序列的正向24聚体引物，序列是5’生物素-GCCTATTT(TC)TT(TC)TA(TC)(GATC)(GATC)(GATC)AC(GATC)GA-3’，命名为“K231”，对应于FFYXTE区，和具有下列序列的23聚体反向引物，序列是 
5’-CCAGATAT(GATC)A(TGA)(GATC)A(AG)(AG)AA(AG)TC(AG)TC-3’，命名为“K220”，对应于DDFL(FIL)I区。这一PCR反应含有2.5微升DNA(50纳克)，各4微升每种引物(20微摩尔/升)，3微升10×PCR缓冲液，3微升10×dNTP，2微升Mg，0.3微升Taq和11.2微升dH2O。循环混合物，共8个循环，每个循环为94℃，45秒，37℃，45秒，和72℃1分钟。 
这一PCR反应结合200微升链霉抗生物素磁性小珠，利用200微升TE洗涤，再悬浮于20微升dH2O，然后通过在100℃煮沸2分钟热变性。倒出小珠，移取洗脱物。然后，利用上面的条件随后扩增2.5微升这一洗脱物，不同的是包括0.3微升α-32P dATP，进行PCR33次循环。在5％变性聚丙烯酰胺凝胶上进行这一反应，切出凝胶上的适当区域。然后，再扩增这些产物另外34个循环，利用的条件如上面列出，不同的是利用42℃退火温度。 
利用本领域已知的方法分离的四膜虫大核DNA模板进行第二个PCR循环。利用23-聚体正向引物，具有序列5’-ACAATG(CA)G(GATC)(TCA)T(GATC)(TCA)T(GATC)CC(GATC)AA(AG)AA-3’，命名为“K228”，对应于R(LI)(LI)PKK，反向引物具有序列5’-ACGAATC(GT)(GATC)GG(TAG)AT(GATC)(GC)(TA)(AG)TC(AG)TA(AG)CA3’，命名为“K224”，对应于CYDSIPR区。这一PCR反应含有2.5微升DNA(50纳克)，各4微升每种引物(20微摩尔/升)，3微升10×PCR缓冲液，3微升10×dNTP，2微升Mg，0.3微升α-32PdATP，0.3微升Taq，和10.9微升水。在5％的变性聚丙烯酰胺凝胶上进行反应。从凝胶上切出适当的区。这些产物再扩增另外34个循环，其中利用了上面列出的条件，不同的是利用42℃退火温度。 
来自第1轮的反应产物的10微升结合200微升TE中的链霉抗生物 素蛋白包被的磁性小珠。利用200微升TE洗涤小珠，然后，在2微升水中再悬浮，热变性，除去洗脱物。然后，将来自第2轮的反应产物加入小珠，利用30微升0.5×SSC稀释。使混合物的温度从94℃到50℃。除去洗脱物，在0.5×SSC，55℃中洗涤小珠3次。然后，再悬浮小珠于20微升水，热变性，除去洗脱物，命名为“1轮洗脱”并储藏。 
为了分离四膜虫谱带，利用正向引物K228和反向引物K227，具有序列5’-CAATTCTC(AG)TA(AG)CA(GATC)(CG)(TA)(CT)TT(AGT)AT(GA)TC-3’对应于DIKSCYD区域再扩增1轮洗脱物。如上所述进行PCR反应。在5％聚丙烯酰胺凝胶上将反应产物电泳；从凝胶上切出对应于约295个核苷酸的谱带，并测序。 
将命名为168-3克隆进行测序。发现DNA序列(包括引物序列)是：GATTACTCCCGAAGAAAGGATCTTTCCGTCCAATCATGACTTTCTTAAGAAAGGACAAGCAAAAAAATATTAAGTTAAATCTAAATTAAATTCTAATGGATAGCCAACTTGTGTTTAGGAATTTAAAAGACATGCTGGGATAAAAGATAGGATACTCAGTCTTTGATAATAA ACAAATTTCAGAAAAATTTGCCTAATTCATAGAGAAATGGAAAAATAAAGGAAGACCTCAGCTATATTATGTCACTCTAGACATAAAGACTTGCTAC. 
通过PCR，利用一个独特的引物获得这一基因的其它序列，引物设计成匹配来自168-3(具有序列5’-GAGTGACATAATATACGTGA-3’的“K297”；和K231(FFYXTE)序列。从这一反应获得的片断的序列，以及168-3一起如下(没有引物序列)： 
AAACACAAGGAAGGAAGTCAAATATTCTATTACCGTAAACCAATATGGAAATTAGTGAGTAAATTAACTATTGTCAA AGTAAGAATTTAGTTTTCTGAAAAGAATAAATAAATGAAAAATAATTTTTATCAAAAAATTTAGCTTGAAGAGGAGAATTTGGAAAAAGTTGAAGAAAAATTGATACCAGAAGATTCATTTTAGAAATACCCTCAAGGAAAGCTAAGGATTATACCTAAAAAAGGATCTTTCCGTCCAATCATGACTTTCTTAAGAAAGGACAAGCAAAAAAATATTAAGTTAAATCTAAATTAAATTCTAATGGATAGCCAACTTGTGTTTAGGAATTTAAAAGACATGCTGGGATAAAAGATAGGATACTCAGTCTTTGATAATAAACAAATTTCAGAAAAATTTGCCTAATTCATAGAGAAATGGAAAAATAAAGGAAGACCTCAGCTATATTATGTCACTCTA. 
对应于这一DNA片断的氨基酸序列发现如下： 
KHKEGSQIFYYRKPIWKLVSKLTIVKVRIQFSEKNKQMKNNFYQKIQLEEENLEKVEEKLIPEDSFQKYPQGKLRIIPKKGSFRPIMTFLRKDKQKNIKLNLNQILMDSQLVFRNLKDMLGQKIGYSVFDNKQISEKFAQFIEKWKNKGRPQLYYVTL. 
然后，将这一氨基酸序列与其它端粒酶基因(EST2p，和Euplotes)排列在一起。图53显示了排列。在这一图中显示了共有序列。 
P.粟酒裂殖酵母端粒酶序列的鉴定 
在这一实施例中，鉴定粟酒裂殖酵母的tezl序列为E.aediculatusp123，和啤酒酵母Est2p的同系物。 
图55提供了这些实验的全部概要。在这一图中，顶部(组A)显示了两个交迭的基因组克隆的关系，并且测序其中5825bp部分。命名为“tezl+”的区域是蛋白质编码区，而侧接序列同时标明了，在5825bp区域下面的盒是约2kb的HindIII片断，用于产生tezl裂解构建体，如下所述。 
图55的底部一半(组B)是这一相同的DNA区域的“关闭”图解。 命名为“原始的PCR”的序列是原始的简并PCR片断，是利用简并的寡聚核苷酸引物对产生的，引物对是根据Euplotes序列基序4(B’)和基序5(C)，如上所述设计的。 
I)利用简并引物的PCR 
利用简并引物的PCR用于发现粟酒裂殖酵母中的E.aediculatusp123的同系物。图56显示了用于这一反应中的简并引物(命名为“poly4”和“poly1”)的序列。利用如上所述在前面的实施例中的同样的缓冲液基进行PCR循环(参见，例如，部分K)，利用了5分钟斜坡时间，94℃，接着30次循环，每个循环为30秒94℃，45秒50℃，和30秒72℃，和72℃7分钟，接着储藏在4℃。利用变化的条件进行PCR，(即，不同浓度的粟酒裂殖酵母DNA和MgCl2浓度)。在琼脂糖凝胶上将PCR产物电泳，利用如上所述的溴化乙锭染色。几个PCR循环导致三个带的产生(命名为“T”，“M”，和“B”)。再扩增这些谱带，利用如上所述同样的条件进行凝胶电泳。在这一再扩增之后，观察到四个谱带(“T”，“M1”，“M2”，和“B”)，如图57所示。然后，利用如上所述的同样的条件再扩增这四个谱带。鉴定在图57中的泳道的顶部的三个谱带，作为含有端粒酶蛋白质的准确序列。发现命名为M2PCR产物，其显示了与图58所示其它端粒酶蛋白质具有合理的匹配。除了显示的排列，这一图也显示了tezl的真正的序列。在这一图中，星号表示所有4个序列共有的残基(Oxytricha“Ot”；E.aediculatus“Ea-p123”，啤酒酵母，“Sc-p123；和M2)，而圆圈(即，点)表示了相似的氨基酸残基。 
ii)3’RT PCR 
为了获得其它序列信息，在图58鉴定的端粒酶候选物上进行3’和5’RT PCR。图59提供了利用的3’RT PCR方案的方案。首先，利 用低聚核苷酸引物“QT ”，(5’-CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGCTTTTTTTTTTTTTTT-3’)，从mRNA制备cDNA然后利用这一DNA作为PCR模板，与“Qo”(5’CCAGTGAGCAGAGTGACG-3’)，和根据原始简并PCR反应设计的引物(即，“M2-T”具有序列5’-GTGTCATTTCTATATGGAAGATTTGATTGATG-3’)。第二个PCR反应(即，嵌套PCR)利用“Q1”(5’GAGGACTCGAGCTCAAGC-3’)和另一个PCR引物，利用起源于起始简并PCR  反应的序列设计，或“M2-T2”(5’ACCTATCGTTTACGAAAAAGAAAGGATCAGTG-3’)用于PCR的缓冲液如上所述是相同的。利用开始94℃，5分钟，接着30次循环，30次循环是每个循环包括94℃30秒，55℃30秒，72℃3分钟，接着72℃7分钟进行的扩增。反应产物储藏在4℃直到使用。 
iii)筛选基因组和cDNA文库 
在获得其它序列信息后，筛选几个基因组和cDNA文库以便鉴定含有这一端粒酶候选物基因的文库。在图60中显示了利用的途径，以及文库和结果。在这一图中，在这一实验中测试了组A的名录和文库，组B显示了利用的区域，组C和D显示了利用这些文库获得的点影印杂交结果。然后，通过菌落杂交筛选阳性文库以便获得tezl基因的基因组和cDNA版本。在这一实验中，筛选了来自HindIII基因组文库的约3×104个菌落，鉴定6个阳性克隆(约0.01％)。然后，从两个独立的克隆(A5和B2)制备DNA。图61显示了利用HindIII消化的A5和B2阳性基因组克隆获得的结果。 
另外，利用了cDNA REP文库。筛选了约3×105个菌落，鉴定了5个阳性克隆(0.002％)。从三个独立的克隆(2-3，4-1和5-20)制备DNA。在后一实验中，确定克隆2-3和5-20含有相同的插入片断。 
iv)5’RT PCR 
由于此时产生的基因的cDNA版本是不完全的，进行5’RT-PCR以便获得全长克隆。图62图解显示了方案。在这一实验中，利用DNA低聚核苷酸引物“M2-B”(5’-CACTGATCCTTTCTTTTTCGTAAACGATAGGT-3’)和“M2-B2”(5’-CATCAATCAAATCTTCCATATAGAAATGACA-3’)制备cDNA，两个引物是从前面鉴定的tezl的已知区域设计的。然后，在这一cDNA的3’末端连接具有磷酸化5’末端(“P”)的低聚核苷酸接头PCR Adapt SfiI(P-GGGCCGTGTTGGCCTAGTTCTCTGCTC-3’，并且这一构建体用作嵌套的PCR的模板。在PCR的第一轮中，利用PCR Adapt SFI和M2-B作为引物；而PCR Adapt SfiII(5-GAG GAG GAG AAG AGC AGA GAACTA GGC CAA CAC GCC CC-3’)和M2-B2用作第二轮的引物。嵌套PCR用于增强反应的特异性。 
v)序列排列 
一旦鉴定了tezl的序列，将它与前面叙述的序列比较。图3显示了来自粟酒裂殖酵母(“S.p.Tezlp”)，啤酒酵母(“S.c.Est2p”)，和E.aediculatus p123(“E.a.p123”)的端粒酶催化亚单位的RT区的排列。在这一图中，“h”表示疏水残基，而“p”表示小的极性残基，和“c”表示带电残基。上面表示排列的氨基酸残基显示了Y.Xiong和T.H.Eickbush的基序的共有RT(Y.Xiong和T.H.Ei ckbush，EMBOJ.9：3353-3362[1992])。星号表示了对于所有三个蛋白质都是保守的残基。“基序0”在本文中得到鉴定，并且在图63中作为特异于这一端粒酶亚单位的基序，并且通常没有存在于逆转录酶中。所以，它在鉴定作为端粒酶催化亚单位的其它氨基酸序列中是有价值的。 
图64显示了来自Euplotes(“Ea-p123”)，啤酒酵母(“Sc-Est2p”)，和粟酒裂殖酵母(“Sp-Tezlp”)的全部序列的排列。在组A中，阴影 区域表示了两个序列共有的残基。在组B中，阴影区域表示了所有三个序列之间共有的残基。 
vi)tezl的遗传分解 
在这一实施例中，研究了tezl的裂解的效果。因为端粒酶参与在端粒的维持，假设如果tezl确实是端粒酶成分，tezl的裂解将引起端粒逐渐缩短。 
在这些实验中，利用同源重组特异地裂解粟酒裂殖酵母中的tezl基因。这一途径在图65中图解说明。如图65所示，利用含有ura4或LEU2标记的片断替代野生型tezl。 
通过PCR(图66)证明了tezl基因的裂解，进行Southern影印以检查端粒的长度。图67显示了用于这一实验的Southern影印的结果。因为ApaI限制性酶位点存在于紧接粟酒裂殖酵母的端粒序列的附近，粟酒裂殖酵母基因组DNA制剂的ApaI消化允许进行端粒长度的分析。所以，利用ApaI消化来自粟酒裂殖酵母的DNA，在琼脂糖凝胶上电泳消化产物，利用特异于端粒序列的探针探测，以便确定是否裂解的粟酒裂殖酵母细胞的端粒缩短。图67显示了结果。从这些结果，很清楚tezl基因的裂解引起了端粒的缩短。 
Q.人端粒酶蛋白质和cDNA的克隆和鉴定 
在这一实施例中，确定了人端粒酶的核酸和氨基酸序列信息。利用Euplotes 123千道尔顿肽和核酸序列以及裂殖酵母蛋白质和相应的cDNA(tezl)序列进行的BLAST检索首先鉴定了部分同源的序列。从部分cDNA克隆(克隆712562)鉴定了人序列(同时称为“hTCP1.1”)。来自这一克隆的序列与如前面实施例中确定的序列排列在一起。 
图1显示了Euplotes(“p123”)，裂殖酵母(“tezl”)，Est2p(即，Est2核酸序列编码的裂殖酵母蛋白质，同时本文称为“L8543.12”)的 序列比较，并且在这一比较编码中鉴定了人同系物。图51显示了tezl的氨基酸序列，而图52显示了tezl的DNA序列。在图52中，在下面的情况中显示了内含子和其它非编码区，而上面的情况中显示了外显子(即，编码区)。 
如图所示，在这些蛋白质中存在高度保守的区域。例如，如图1所示，在“基序0”，“基序1”，“基序2”，和“基序3”中存在同一性的区域。利用星号(*)表示同一的氨基酸，而通过圆点(.)表示了相似的氨基酸残基。这表明在端粒酶基序中存在的区域在各种真核生物中是保守的，这些生物的范围从酵母到纤毛虫到人。涉及的是其它生物体似乎是含有这样的序列的保守区域。图49显示了人端粒酶基序的部分氨基酸序列，而图50显示了对应的DNA序列。 
如本领域已知利用了Sanger二脱氧测序和其它方法以便获得克隆712562的完全的序列信息。在表7中显示了测序中利用的一些引物。基于与质粒骨架序列或插入在克隆中的人cDNA的序列互补的序列，设计这些引物与克隆的杂交。 
表7.引物 
  引物   序列
  TCP1.1   GTGAAGGCACTGTTCAGCG
  TCP1.2   GTGGATGATTTCTTGTTGG
  TCP1.3   ATGCTCCTGCGTTTGGTGG
  TCP1.4   CTGGACACTCAGCCCTTGG
  TCP1.5   GGCAGGTGTGCTGGACACT
  TCP1.6   TTTGATGATGCTGGCGATG
  TCP1.7   GGGGCTCGTCTTCTACAGG
  TCP1.8   CAGCAGGAGGATCTTGTAG
  TCP1.9   TGACCCCAGGAGTGGCACG
表7.引物 
  TCP1.10   TCAAGCTGACTCGACACCG
  TCP1.11   CGGCGTGACAGGGCTGC
  TCP1.12   GCTGAAGGCTGAGTGTCC
  TCP1.13   TAGTCCATGTTCACAATCG
从这些实验，确定克隆712562的EcoRI-NotI插入片断只含有人端粒酶蛋白质的开放读码框架，虽然它可以编码该蛋白质的活性片断。在克隆中的开放读码框架编码了约63千道尔顿的蛋白质。图68中显示了鉴定的最长的开放读码框架的序列。ORF开始在图中“met”表示的ATG密码子。同时显示了序列的3’末端的聚A末尾。图69显示了暂定的，来自人序列(人端粒酶核心蛋白质1“HsTCP1”)，E.aediculatusp123(“Ep p123)，粟酒裂殖酵母tez 1(“Sp Tez1”)，啤酒酵母EST2(ScEst2”)，和共有序列的端粒酶逆转录酶蛋白质的初级序列比较。在这一图中表明了各种基序。 
为了获得全长克隆，利用cDNA文库和5’-RACE的探测获得编码前面未克隆的区域的部分的克隆。在这些实验中，利用RACE(cDNA末端的快速扩增；参见例如，M.A.Frohman，“RACE：cDNA末端的快速扩增”，在Innis等人，PCR方案，方法和应用的指导[1990]，28-38，和Frohman等人，美国科学院年报，85：8998-9002[1988])生产用于序列分析的物质。产生了四个这样的克隆，并且用于提供另外的5’序列信息(pFWRP5，6，19，和20)。 
另外，利用克隆的EcoRI-NotI片断探测人cDNA文库(插入在λ)。鉴定了一个λ克隆，命名为“λ25-1.1”(ATCC209024)含有互补 序列。图75显示了这一λ克隆的限制图谱。将来自这一克隆的人cDNA插入片断作为EcoRI限制片断亚克隆进入商业可得的噬菌粒pBluescriptIISK+(Stratagene)的EcoRI位点。以便产生质粒“pGRN121”。该质粒储藏于ATCC(ATCC209016)。初级的结果表明质粒pGRN121含有编码人端粒酶蛋白质的全部开放读码框架(ORF)序列。 
利用本领域已知的技术对质粒pGRN121的cDNA插入片断测序。图70提供了基于这一初步工作鉴定的质粒pGRN121的功能图谱和限制位点。图71显示了这一初级序列分析的结果。从这一分析，和图70所示，鉴定编码区的推断的起始位点在约从EcoRI位点50个核苷酸(定位于位置707)，鉴定了特异于端粒酶基序，“FFYVTE”，“PKP”，“AYD”，“QG”和“DD”的定位，另外鉴定了核苷酸#3571的推断的终止位置(参见图72)，显示了序列中的开放读码框架的DNA和相应的氨基酸序列(“a”，“b”和“c”)。但是，由于早期测序工作的初步特性，发现各种基序的开放读码不在序列比较中。 
在pGRN121上进行了另外的分析表明质粒含有来自不存在于克隆712562上的编码序列的5’末端的明显部分。另外，发现pGRN121含有包括约182核苷酸的插入片断的变异编码序列。发现这一插入片断不存在于克隆中。正如E.aediculatus序列，在功能测试中可以测试这样的变异体，如端粒酶测试以便检测样品中功能端粒酶的存在。 
另外的序列分析分辨pGRN121的cDNA序列以便提供编码约127,000道尔顿的分子量的蛋白质和图74中显示的1132氨基酸的邻接的开放读码框架。根据这一分析的pGRN121的限制图谱，在图73中提供了。图16中表示了hTRTcDNA的其它序列分析的结果(SEQUENCE ID NO：1)。 
实施例2 
hTRT富集和细胞不灭性的关系 
在六个端粒酶阴性的可灭细胞菌株和六个端粒酶阳性的不灭细胞系中评估hTRTmRNA的相对富集(图5)。在不灭细胞系中明显增加了hTRTmRNA的稳定状态的水平，这些细胞系已经显示了具有活性端粒酶。在一些端粒酶阴性细胞系中检测了低水平的hTRT mRNA。 
在起源于下面的细胞的RNA上进行了hTRT，hTR，TP1的RT-PCR(相关四膜虫p80的端粒酶相关蛋白质[Harrington等人，1997，科学，275：973；Nakayama等人，1997，细胞88：875])和GAPDH(以便正常化等量的RNA模板)：(1)人胎盘肺成纤维细胞GFL，(2)人胎盘皮肤成纤维细胞GFS，(3)成人前列腺基质成纤维细胞31YO，(4)人胎盘漆滑液成纤维细胞HSF，(5)新生儿前皮肤成纤维细胞BJ，(6)人胎盘非成纤维细胞IMR90，和不灭细胞系；(7)黑素瘤LOXIMVI，(8)白血病U250，(9)NCIH23肺肉瘤，(10)直肠腺癌SW620，(11)胸肿瘤MCF7，(12)293腺病毒E1转化的人胚胎肾细胞系。 
利用低聚核苷酸引物LT5和LT6(表2)从cDNA扩增hTRT核酸，总共31个循环(94℃45秒，60℃45秒，72℃90秒)。利用引物KI36(5’-CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA)，和K137(5’-ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA)扩增GAPDH总共16个循环(94℃，45秒，55℃，45秒，72℃90秒)。利用引物F3b(5’-TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAG)和R3c(5’-GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAG)扩增hTR，总共22个循环(94℃45秒，55℃45秒，72℃90秒)。利用引物TP1.1和TP1.2扩增TP1mRNA，总共28个循环(相同于hTRT的循环)。在8％聚丙烯酰胺凝胶上分辨反应产物，利用SYBR绿染色(分子探针)，通过Storm860扫描可见(分子动力学)。图5显示的结果证 明hTRTmRNA水平直接与测试的细胞中的端粒酶活性的水平相关。 
实施例3 
鉴定hTRT内含子序列 
如本实施例所示，通过人基因组DNA的PCR扩增首先鉴定推断的内含子，随后通过测序基因组克隆λGφ5证明(参见实施例4)。利用反向引物TCP1.46，TCP1.48，TCP1.50，TCP1.52，TCP1.54，TCP1.56，和TCP1.58单个配对的正向引物TCP1.57进行PCR扩增(参见表2)。来自TCP1.57/TCP1.46，TCP1.48，TCP1.50，TCP1.52，TCP1.54或TCP1.56扩增的基因组DNA的产物约为100碱基对，大于pGRN121扩增的产物。在基因组或pGRN121DNA上，TCP1.57/TCP1.58扩增是相同的。这表明基因组DNA在TCP1.58和TCP1.50的位点之间含有插入片断。利用引物TCP1.39，TCP1.57，和TCP1.59直接测序TCP1.57/TCP1.50和TCP1.57/TCP1.52的PCR产物，没有亚克隆。 
如下所示，在hTRTmRNA(黑体显示)在相应于图16的碱基274和275的接合处插入104个碱基内含子序列(SEQUENCE ID NO：7)： 
参见原文218页序列 
“/”表示拼接接合处；序列显示了与人内含子的典型的共有5’和3’拼接位点好的匹配。 
内含子含有拓扑异构酶II裂解位点和NFkB结合位点的基序特征(参见图21)。这些基序是需要的，部分是因为在大多数肿瘤中拓扑异构酶的表达是上调的。它的功能是通过切割和再缠绕DNA松弛DNA，所以，增加了特定的基因的表达。已经显示了拓扑异构酶II的抑制剂作为抗肿瘤试剂。在NFkB的情况中，这一转录因子可以在终止分化过程中起调节端粒酶的作用，如在发育过程中端粒酶的早期阻遏，并且所以是 治疗干扰的另一个靶以调节细胞中端粒酶的活性。 
实施例4 
λ噬菌体Gφ5的克隆和hTRT基因组序列的鉴定 
A.λGφ5 
通过PCR和杂交筛选人基因组DNA文库以便鉴定含有hTRT RNA编码序列的基因组克隆。该文库是利用来自WI38非成纤维细胞的DNA产生的人成纤维细胞基因组文库(Stratagene，Cat#946204)。在这一文库中，将部分Sau3AI片断连接进入λFIX 
Figure GSA00000069469702191
II载体(Stratagene)的XhoI位点，插入片断的大小为9-22kb。 
将基因组文库分成各150,000噬菌体的库，通过嵌套PCR筛选每个库(外部引物对TCP1.52和TCP1.57；内部对TCP1.49和TCP1.50，参见表1)。这些引物对跨越hTRT的基因组DNA中推断的内含子(参见实施例3，出处同上)，保证PCR产物是起源于基因组来源，并且不是来自hTRTcDNA克隆的污染。进一步亚分阳性库直到获得2000个噬菌体的库。在低密度下涂布平板培养库，并且通过与包括图16的1552-2108个碱基对的DNA片断杂交进行筛选(限制位点SphI和EcoRV)。 
通过如上所述的嵌套PCR分离和再筛选两个阳性克隆；PCR后两个克隆是阳性的。利用NotI消化一个克隆(λGφ5)，表明大约20kb的插入大小。随后的图谱(参见下面)表示插入的大小为15kb，和噬菌体Gφ5含有约13kb的来自cDNA序列起始位点上游的DNA。 
通过限制酶消化并且进行DNA测序图谱定位噬菌体Gφ5。图7显示了得到的图谱。利用NcoI消化噬菌体DNA，并且将片断克隆进入pBBS167。通过PCR筛选得到的亚克隆以便鉴定含有对应于hTRTcDNA的5’区的序列的那些。部分测序含有9kb NcoI片断(具有hTRT基因 序列，和4-5kbλ载体序列)的亚克隆(pGRN140)以测定插入片段定向。利用SalI消化pGRN140以便除去λ载体序列，得到pGRN144。然后测序pGRN144。图21提供了测序的结果。hTRT mRNA的5’末端对应于图21的碱基2441。如图7所示，两个Alu序列因子定位于hTRTcDNA5’末端上游的1700碱基对，并且提供了似乎是将hTRT的启动子区域限制于上游。序列也表明在图21中的实施例3叙述的内含子3’的碱基4173位置的内含子，出处同上。 
B.其它基因组克隆 
除了如上所述的基因组克隆，作为本发明的说明性实施方案提供了两个P1细菌噬菌体克隆和一个人BAC克隆。P1插入通常是75-100kb，和BAC插入片断通常超过100kb。 
利用扩增hTRT的3’末端的引物TCP1.12和UTR2，进行PCR筛选起源于人前皮肤成纤维细胞(Shepherd等人，1994，PNAS USA91：2629)的人P1文库获得P1克隆(DMPC-HFF#1-477(F6)-GS#15371和DMPC-HEF#1-1130(H6)-GS#15372)。用于扩增hTRT的5’末端的引物进行的这些克隆都是阴性(没有扩增)。 
利用含有RT基序区的pGRN121的1143bp的Sph1/Xmn1片断(附图16；碱基1552-2695)杂交筛选BAC人基因组文库获得人BAC克隆(320E20)。确认克隆含有基因的5’末端。在这一实施例中的hTRT基因组克隆确信是含有全部hTRT基因的。 
实施例5 
hTRT基因的染色体定位 
利用整个人基因组的83RH克隆的培养基分辨StanfordG3组(在Stanford人基因组正向产生)，通过杂合体图谱定位(Boehnke等人， 1991，Am J Hum Genet49：1174；Walter等人，1994，自然遗传学，7：22)将hTRT基因定位于染色体5p。将人类淋巴母细胞系(供体，rM)与10,000rad的X射线接触，然后与非辐射仓鼠受体细胞(A3)融合。分离83个独立的体细胞杂合体克隆，每个代表被辐射供体细胞和受体仓鼠细胞之间的融合事件。G3DNA的组用于在需要的区域定位标记，以及确定这些标记之间的距离。 
用于RH图谱定位的引物是TCP1.12和UTR2，扩增条件是94℃45秒，55℃45秒，72℃45秒，45次循环，利用Boehringer Mannheim Taq缓冲液和Perkin-Elmer Taq。独立扩增83个库，对于hTRT14个(17％)的阳性克隆(出现346bp的谱带)，将扩增结果进行Stanford RH服务，然后提供图谱定位，5p，和最近的标记，STS D5S678。 
通过查询Genethon基因组作图网状位点，图谱定位鉴别了含有STS标记物D5S678：CEPH YAC780-C-3大小：390660千道尔顿的YAC。该YAC也含有染色体17标记物。该结果表明hTRT基因在染色体5上，靠近端粒的末端。在许多肿瘤中增加了5p的拷贝数。也已经对缺失该区域的Cri-du-chat症状作图。 
实施例6 
用于表达hTRT蛋白质和多聚核苷酸的载体的设计和构建hTRT在细菌中的表达 
该实施例的下面部分详细描述了表达hTRT的细菌和真核细胞表达载体的设计以产生大量的全长，生物学活性hTRT。以这种方式产生的生物学活性hTRT蛋白质可用于端粒酶重构建测试，测试端粒酶活性的调节子，分析新分离的hTRT种类的活性，鉴别和分离特异性地与hTRT结合的化合物，分析作为免疫原的hTRT变异体蛋白质的活性，所述的 蛋白质已经被进行了位点特异性诱变并且作为几个实施例。 
pThioHisA/hTRT细菌表达载体 
为了生产大量的全长hTRT，选择细菌表达载体pThioHisA(InVitrogen，San Diego，CA)作为表达系统。编码hTRT插入物包括质粒pGRN121的hTRT插入物的第707到4776位的核苷酸。该核苷酸序列包括hTRT蛋白质的完整编码序列。 
本发明的表达载体设计为可在细菌中诱导型表达。将该载体诱导以在大肠杆菌中高水平表达由可裂解的，HIS标记的硫氧还蛋白成分和全长hTRT蛋白质组成的融合蛋白质。表达系统的应用基本上按照制造商的说明。由本发明的获得的载体编码的融合蛋白质的氨基酸序列如下显示；(-*-)表示肠激酶裂解位点： 
MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAHWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLRIDHNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGDDDDK-＊-VPMHELEIFEFAAASTQRCVLLRTWEALAPATPAMPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRDCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPY MRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD 
具有pGRN121的hTRT的核苷酸3272到4177的pGEX-2TK 
本发明的该构建体可用于生产融合蛋白质以便例如生产抗hTRT蛋白质的多克隆和单克隆抗体。hTRT片段也可以用于其它目的，例如调节端粒酶活性，例如作为显性阴性的突变体或抑制端粒酶成分与其它蛋白质或核酸的结合。 
为了生产大量的hTRT蛋白质片段，选择大肠杆菌表达载体pGEX-2TK(Pharmacia Biotech，Piscataway N.J)，并且基本上按照制造商的说明使用以制备本发明的表达载体。获得的构建体含有来源于pGRN121的hTRT的核苷酸3272到4177的插入物。该载体指导在大肠杆菌中高水平表达由谷胱甘肽-S-转移酶序列(底下划线)，凝血酶裂解序列(底下划双线)，用于心脏肌肉蛋白质激酶的识别(斜体)，在括号中通过克隆导入的残基([GSVTK])和hTRT蛋白质片段(黑体)组成的融合蛋白质，如下所述： 
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSD
Figure GSA00000069469702231
[GSVTK] 
Figure GSA00000069469702232
Figure GSA00000069469702233
当融合蛋白表达时，形成了可溶的聚集体。通常按照如上所述的题目为从内含体纯化蛋白质的部分所述进行处理。特定地，在PBS(20毫摩尔浓度磷酸钠，pH 7.4，150毫摩尔浓度NaCl)中悬浮诱导细胞，并通过超声波裂解。将NP-40加到0.1％，边温和搅拌，在4℃，温育混合物30分钟。通过在4℃，以25,000g离心30分钟收集不可溶物质。用PBS中的4M的脲洗涤不可溶物质一次，通过离心收集，然后用PBS再次洗涤。估计收集的沉淀含有大于75％的融合蛋白。在快速真空中干燥这一物质，然后，悬浮于助剂中，注射进入小鼠和兔中，用于生产抗体。利用凝血酶，按照制造商的说明，通过位点特异性蛋白质裂解完成重组蛋白质与谷胱甘肽S-转移酶成分地分离。 
含有HIS-8标记的pGRN121的hTRT核苷酸2426-3274的pGEX-2TK 
为了生产大量的hTRT片段，制备了另一个大肠杆菌表达载体pGEX-2TK构建体。这一构建体含有起源于质粒pGRN121中的hTRT插入片段的核苷酸2426-3274的插入片段。该构建体同时含有编码8个连续的组氨酸残基的序列(HIS-8标记)。为了插入HIS-8TAG，利用BamHI使含有pGRN121的hTRT核苷酸2426到3274的pGEX-2TK载体线粒化。这在GST-凝血酶心肌蛋白激酶和hTRT编码序列之间的接合处打开了质粒。将含有BamHI的相容末端的双链低聚核苷酸连接进入线性质粒导致在hTRT序列的上游的框架内导入8个组氨酸残基。 
该载体指导融合蛋白在大肠杆菌中的高水平表达，该融合蛋白由谷胱苷肽-S-转移酶序列(下面划线)；凝血酶裂解序列下面划双线)；心肌蛋白质激酶的识别序列(斜体)；在括号中的克隆导入3个残基的系列和5个残基的系列([GSV]和[GSVTK])；8个连续的氨酸(也是下面 划双线)；和hTRT蛋白质片段(黑体)组成： 
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSD
Figure GSA00000069469702251
[GSV] [GSVTK] 
Figure GSA00000069469702254
本发明的每个pGEX-2TK载体可以用于产生融合蛋白以便产生抗hTRT蛋白质的多克隆和单克隆抗体。另外，这一融合蛋白可以用于亲和纯化抗TRT肽的抗体，该肽包括在融合蛋白中。根据制造商的说明通过利用凝血酶的位点特异性蛋白质水解可以完成来自谷胱苷肽S-转移酶成分的重组蛋白质分离。 
含有pGRN121的hTRT核苷酸2426-3274的 
pGEX-2TK，没有HIS8-标记 
为了生产大量hTRT片段，制备另一个大肠杆菌表达载体pGEX-2TK构建体。 
这一构建体含有起源于质粒pGRN121中的hTRT插入片段的核苷酸2426到3274的插入片段，但没有如上所述的构建体的HIS-8标记。该载体指导融合蛋白在大肠杆菌中的高水平表达，该融合蛋白由谷胱苷肽-S-转移酶(下面划线)，凝血酶裂解序列(下面划双线)，心肌蛋白激酶的识别序列(斜体)，在括号中的克隆导入的残基([GSVTK])和hTRT蛋白质片段(黑体)组成： 
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSD
Figure GSA00000069469702255
[ GSVTK] 
Figure GSA00000069469702262
含有pGRN121的hTRT核苷酸1625到2458的pGEX-2TK 
为了生产大量的TRT蛋白质片段，制备了另一个大肠杆菌表达载体pGEX-2TK构建体。 
这一构建体含有起源于质粒pGRN121中的hTRT插入片段的核苷酸1625-2458的插入片段。该载体指导大肠杆菌中高水平的融合蛋白的表达，该融合蛋白由谷胱苷肽-S-转移酶(下面划线)，凝血酶裂解序列(双线)，心肌蛋白质激酶的识别序列(斜体)，在括号中的克隆导入的残基([GSVTK])和hTRT蛋白质片段(黑体)组成： 
MSPILGYWKIKGLYQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSD
Figure GSA00000069469702263
[GSVTK] 
Figure GSA00000069469702264
Figure GSA00000069469702265
QVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRDCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRS 
含有pGRN121的hTRT核苷酸782-1636的pGEX-2TK 
为了产生大量TRT蛋白质片段，制备了另一个大肠杆菌表达载体pGEX-2TK构建体。 
这一构建体含有起源于质粒pGRN121中的hTRT插入片段的核苷酸782到1636的插入片段。载体指导大肠杆菌中高水平的融合蛋白的表 达，该融合蛋白由谷胱苷肽-S-转移酶(下面划线)，凝血酶裂解序列(下面划双线)，心肌蛋白激酶识别序列(斜体)，括号中的克隆导入的残基([GSVTK])和hTRT蛋白质片段(黑体)组成： 
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSD
Figure GSA00000069469702271
[GSVTK] 
Figure GSA00000069469702272
Figure GSA00000069469702273
含有缺乏5’非编码序列的hTRTcDNA的pT7FLhTRT 
如上所述，在一个实施方案中，本发明提供了以位点特异性的方式修饰的TRT以便简化克隆进入没有任何5’未翻译TRT序列的细菌，哺乳动物，酵母和昆虫表达载体。在一些情况中，减少非蛋白质编码序列的量到最小允许提高蛋白质生产(产量)和增高mRNA的稳定性。在本发明的这一实施方案中，在克隆进入细菌表达载体之前除去TRT基因5’非编码区。 
进行的方法是在紧接hTRT编码序列(附图16)的起始(ATG)密码上游(5’)工程化另外一个限制内切酶位点。在蛋白质的编码区的5’紧接的限制位点的产生允许有效地产生许多种类的编码融合蛋白的载体，融合蛋白如含有标记和肽TAG，用于免疫检测和纯化。 
特异性地，利用低聚核苷酸5’- 
CCGGCCACCCCCCATATGCCGCGCGCTCCC-3”如上所述修饰hTRTcDNA的hTRTcDNA核苷酸779-781，GCG到CAT。这三个核苷酸是在ATG起始密码之前的最后的核苷酸，所以它们不修饰蛋白质序列。在序列中 的变化导致在hTRTcDNA中产生独特的NdeI限制位点。将单链hTRTDNA用作位点特异性诱变的DNA来源。测序得到的质粒证明成功的诱变。 
这一修饰允许构建下面本发明的质粒，命名为pT7FLhTRT。利用Nde I和NotI消化位点特异性修饰的hTRT序列(加入NdeI限制位点)(利用Klenow片段填充以便产生末端平齐化的DNA)，以便产生编码hTRT的核酸片段。然后，将该片段克隆进入预先用NdeI和SmaI(也是末端平齐化裂解)限制消化的质粒pSL3418。pSL3418是修饰的pAED4质粒，其中FLAG序列(Immunex公司，西雅图，WA)，和肠激酶序列紧接上面提到的NdeI位点的上游插入。这一质粒命名为pT7FLhTR，允许在表达T7RNA聚合酶的大肠杆菌菌株中 
表达全长的hTRT(在它的5’末端含有Flag-Tag)。 
含有缺乏3’非编码序列的hTRTcDNA的质粒 
如上讨论，本发明提供了含有TRT编码核酸的表达载体，其中已经缺失一些或所有非编码序列。在一些情况中，减少非蛋白质编码序列的量到最小可以提高蛋白质生产(产量)和增强mRNA稳定性。在本发明的这一实施方案中，在克隆到细菌表达质粒之前将TRT的3’未翻译区缺失。 
如上讨论，首先在含有全长hTRTcDNA的质粒pGRN121中缺失所有Apa1位点。接着使含有3’UTR的MscI-HincII hTRT限制消化酶片段缺失。然后，将含有hTRT的终止密码的NcoI-XbaI限制消化片段插入pGRN121的NcoI-XbaI位点，以制备PGRN121的等同物，命名为pGRN124，不同的是缺乏3’UTR。 
利用抗生素筛选标记物的细菌表达载体 
本发明同时提供了可能含有选择标记物使转化细胞上具有可选择表现型和附加体维持和复制的编码序列的细菌表达载体，以致这些序列 不需要整合到寄主基因组。例如，该标记物可以编码抗生素抗性，特别是氯霉素抗性(参见Harrod(1997)核酸研究25：1720-1726)，卡那霉素，G418，博来霉素和潮霉素，允许选择那些含有需要DNA序列的转化细胞，参见例如，Blondelet-Rouault(1997)基因，190：315-317；和Mahan(1995)美国科学院年报92：669-673。 
在本发明的一个实施方案中，将全长的hTRT克隆到修饰的Bluescript质粒载体(Stratagene，圣地亚哥，CA)，命名为pBBS235，其中已经插入了氯霉素抗性基因。来自含有hTRT ORF的pGRN124(上面讨论)的NotI片段(亚克隆)到pBBS235的NotI位点，以致TRT ORF是在载体的Lac启动子的相反方向上。这使质粒适用于诱变质粒插入片段，如本发明的TRT核酸。将这一质粒构建体命名为pGRN125，可以用于本发明的方法包括端粒酶和TRT蛋白质 
编码序列的诱变和用于利用T7启动子的hTRT的体外转录(和利用T3启动子的反义hTRT的体外转录)。 
在本发明的另一个实施方案中，来自含有hTRT ORF的pGRN124的NotI限制片段可以亚克隆到pBBS235(如上所述)的NotI位点，以致TRTORF是在载体的Lac启动子的相同方向上。这产生的质粒命名为pGRN126，可以用于大肠杆菌中表达全长hTRT。表达产物含有载体pBBS235编码的29个氨基酸，后紧接hTRT的5’UTR编码的18个氨基酸，后面跟随全长的hTRT蛋白质。 
在本发明的另一个实施方案中，进行了pGRN125的体外诱变将hTRT起始ATG密码转化为共有Kozak和产生EcoRI和BgIII限制消化位点以便有助于克隆到表达载体。将低聚核苷酸5’TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAattCcaCcATGCCGCGCGCTCCCCGCTG-3’(在下面的情况中改变了核苷酸)用于诱变方法。得到的表达载体命名为pGRN127。 
在本发明的另一个实施方案中，将TRT“DD基序”的第二个Asp转化成丙氨酸以产生非功能端粒酶，所以产生突变TRT蛋白质用作显性/阴性变异体。利用低聚核苷酸5’CGGGACGGGCTGCTCCTGCGTTTGGTGGAcGcgTTCTTGTTGGTGACACCTCACCTCACC-3’体外诱变hTRT编码序列以便将编码第869位残基(Asp869)的天冬酰胺密码子转变成为丙氨酸(Ala)密码子。这也产生了MluI限制酶位点。得到的表达质粒命名为PGRN130，它含有共有Kozak序列如pGRN127所述。 
本发明同时提供了设计为表达hTRT的反义序列片段的载体。利用MscI和SmaI限制酶完全切割pGRN126质粒并且再连接使95％以上的hTRT ORF缺失。在该过程中再插入一个SmaI-MscI片段以再创造CAT活性。然后，利用SalI和EcoRI再消化这一未纯化质粒，将含有hTRT ORF的起始密码的片段插入pBBS212的SalI-EcoRI位点以便产生反义表达质粒，表达跨越5’UTR和hTRT ORF的73碱基对残基的反义序列(在哺乳动物细胞)。这一质粒命名为pGRN135。 
酵母中表达hTRT端粒酶 
本发明同时提供了表达TRT酵母表达载体以便产生大量的全长，生物活性hTRT。 
巴斯德毕赤氏酵母表达载体pPICZ B和全长hTRT 
为了产生大量的全长，生物活性hTRT，选择巴斯德毕赤氏酵母表达载体pPICZ B(Invitrogen，圣迭戈，CA)。hTRT-编码序列插入片段起源于质粒pGRN121的hTRT插入片段的核苷酸659-4801。这一核苷酸序列包括编码hTRT的全长序列。这一表达载体设计用于在巴斯德毕赤氏酵母中高水平可诱导表达全长，未修饰hTRT蛋白质。表达通过酵母启动子驱动，但表达序列利用了hTRT起始和终止密码。通过克隆没有导入外源密码子。将得到的pPICZ B/hTRT载体用于转化酵母。 
巴斯德毕赤氏酵母表达载体hTRT-His6/pPICZ B 
起源于pPICZ B的本发明的第二个巴斯德毕赤氏酵母表达载体也含有起源于质粒pGRN121中的hTRT插入片段的核苷酸659-4801的编码hTRT的全长序列。这一hTRT-His6/pPICZ B表达载体编码在C末端与Myc表位和His6报道标记物序列融合的全长hTRT蛋白质。通过编码Myc表位的载体序列和His6报道标记物以及终止密码可以除去和替代hTRT终止密码子。这一载体设计为在酵母中指导高水平可诱导表达下面的融合蛋白，该融合蛋白包括hTRT序列(下面划线)，括号中的载体序列([L]和[NSAVD])Myc表位(下面划双线)，和Hi s6标记物(斜体)： 
MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRDCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD[L] [ 
Figure GSA00000069469702312
SAVD] 
Figure GSA00000069469702313
在昆虫细胞中表达hTRT 
本发明同时提供表达hTRT端粒酶的昆虫表达载体，产生大量的全 长，生物活性hTRT。 
杆状病毒表达载体pVL1393和全长hTRT 
将需要的TRT编码序列克隆到杆状病毒表达载体 
pVL1393(Invitrogen，圣迭戈，CA)。这一构建体随后与来自Autograph california核型多角体病毒(Baculogold-AcMNPV)的线性DNA共转染到Spodoptera fungupeida(sf-9)细胞。随后，将获得的重组杆状病毒随后进行噬菌体纯化并根据标准方案扩展。 
这一表达载体提供了昆虫细胞中高水平表达全长TRT蛋白质。表达是通过杆状病毒多角体基因启动子驱动的。克隆没有导入外源密码子。 
杆状病毒表达载体pBlueBacHis2 B和全长hTRT 
为了生产大量全长，生物活性hTRT，选择杆状病毒表达载体pBlueBacHis2B(Invitrogen，圣迭戈，CA)作为对照因子的来源。hTRT编码插入片段由质粒pGRN121中的hTRT插入片段的核苷酸707到4776组成。 
同时构建的是含有His6和抗Xpress标记物(Invitrogen)的全长hTRT。这一载体同时含有来自质粒pGRN121的hTRT插入片段的核苷酸707到4776组成的插入片段。该载体指导昆虫细胞中高水平表达全长hTRT蛋白质，它与可切割的6-组氨酸和抗X-press标记物融合，融合蛋白的氨基酸序列在下面表示；(-*-)指肠激酶切割位点： 
MPRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDL-*-DPSSRSAAGTMEFAAASTQRCVLLRTWEALAPATPAMPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRS YLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQ ELTWKMSVRDCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD 
杆状病毒表达载体pBlueBac 4.5和全长hTRT蛋白质 
为了生产大量全长，生物活性hTRT，构建了第二个杆状病毒表达载体pBlueBac4.5(Invitrogen，圣迭戈，CA)。编码hTRT的插入片段也构成来自质粒pGRN121的hTRT核苷酸707到4776。 
杆状病毒表达载体pMelBacB和全长hTRT蛋白质 
为了生产大量全长，生物活性hTRT，构建了第三个杆状病毒表达载体pMelBacB(Invitrogen，圣迭戈，CA)。hTRT编码插入片段也由来自质粒pGRN121的hTRT插入片段的核苷酸707到4776组成。 
pMelBacB通过利用蜂毒肽信号序列的分泌途径指导昆虫细胞中的全长hTRT表达到细胞外的介质中。由此分泌高水平的全长hTRT。在分泌时蜂毒肽信号序列切割，但是部分蛋白质合并液仍然在细胞内。为了这一原因，表示在下面的序列中的圆括号中。下面显示了载体编码的融合蛋白的序列： 
(MKFLVNVALVFMVVYISYIYA)-*-DPSSRSAAGTMEFAA ASTQRCVLLRTWEALAPATPAMPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGAR RLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRDCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD 
哺乳动物细胞中表达hTRT 
本发明同时提供了在各种哺乳动物细胞系中产生大量全长，生物活性蛋白质的载体，可用于本发明的许多实施方案，如上讨论。 
MPSV-hTRT表达质粒 
本发明同时提供了用于哺乳动物细胞的表达系统，获得产生表达重组蛋白，如端粒酶，而没有真正修饰编码序列(例如，最佳化密码用途)的最大可能性。在一个实施方案中，本发明提供了能够表达本发明的TRT的MPSV哺乳动物表达质粒(来自质粒Pbbs212，利用Lin J-H(1994)基因47：287-292叙述的PMSV-TM)。MPSV质粒可以作为稳定或短暂克隆表达。 
在这一表达系统中，当hTRT编码序列本身未改变，可以将外源转录控制因子掺入载体。可以掺入骨髓增殖肉瘤病毒(MPSV)LTR(MPSV-LTR)启动子用于转录起始，得到细胞肥大病毒(CMV)启动子的加强。这一启动子同样显示在细胞系中较高水平的表达(参见，Lin J-H(1994)出处同上)。Kozak共有序列可以掺入用于转录起始(参见Kozak(1996)哺 乳动物基因组7：563-574)。所有外来5’和3’未翻译hTRT序列可以除去以便保证这些序列不干扰表达，如上讨论。含有完全的hTRT编码序列，但含有除去的所有外来序列的MPSV质粒命名为pGRN133。同时构建了对照，hTRT“反义”质粒。这一载体与pGRN133相同，不同的是，TRT插入片段是hTRT的反义序列(反义，对照可以用作载体，命名为pGRN134)。将含有具有所有其它外来序列被去除的整个hTRT编码序列和含有Kozak共有序列的MPSV命名为pGRN 1450。 
两个选择标记物，PAC(吡咯霉素-N-乙酰-转移酶＝吡咯霉素抗性)和HygB(潮霉素B＝潮霉素抗性)存在用于在转染后选择质粒(参见上面可选择标记物的讨论)。在载体多接头两边的标记物的双重选择应该增强hTRT编码序列的稳定性。包括DHFR(二氢叶酸还原酶)编码序列允许了在产生稳定克隆后的表达盒的扩增。基因扩增的其它手段也可以用于增加重组蛋白质的产量。 
本发明同时提供了含有TRT融合蛋白的MPSV哺乳动物表达质粒。在一个实施方案中，将保留5’未翻译区的TRT序列与表位旗，如IBIFLAG(国际生物技术公司(IBI)，Kodak，New Haven，CT)连接，并插入到MPSV表达质粒(命名为pGRN147)。这一特别的构建体含有Kozak翻译起始位点。该表达融合蛋白可以利用M-1抗FLAG八肽单克隆抗体纯化(IBI，Kodak，出处同上)。 
在另一个实施方案中，hTRT是位点特异改变的。诱变了一个氨基酸残基密码，改变了在位置869的天冬氨酸成为丙氨酸。这一Asp869-＞Ala hTRT变异体，保留了它的5’未翻译区，并掺入了Kozak序列，将它插入到MPSV表达质粒，命名为pGRN146。Asp869-＞Ala hTRT变异体进一步工程化含有FLAG序列，如上面讨论，并且插入片段克隆到MPSV表达质粒。这一表达质粒命名为pGRN154。特定地，对于pGRN154-I， 将来自pGRN146的Eam11051限制消化片段克隆到pGRN147(参见上面)的Eam11051位点以便产生能够表达含有Kozak序列，上面叙述的D869-＞A突变，和IBI旗的hTRT的MPSV表达质粒，pGRN146含有Kozak序列，含有hTRT的“前末端”(5’部分)。 
本发明的另一个实施方案是起源于pGRN146的表达质粒。通过从质粒pGRN146切出EcoRI片段(含有hTRT ORF)并克隆到pBBS212的EcoRI位点以便除去hTRT的5’UTR该哺乳动物表达质粒命名为pGRN152产生。hTRT的定向使它的表达受到MPSV启动子的控制。这使哺乳动物表达质粒表达了含有Kozak共有序列和D869-＞A突变的hTRT，并且使用的是MPSV启动子。 
本发明提供了哺乳动物表达载体，其中hTRT的定向使hTRT编码序列受到MPSV启动子的驱动。例如，将来自含有hTRT开放读码框架(ORF)的pGRN137的EcoRI限制消化片段克隆到pBBS212的EcoRI位点(参见下面)，从而除去hTRT的5’未翻译区(5’UTR)。通过从如下所述含有hTRT的Kozak突变的pGRN130切出SalI-Sse3871片段亚克隆到pGRN136的Sal 1-SSE83871位点，制备了含有离开MPSV启动子的Kozak共有序列表达hTRT的哺乳动物表达质粒pGRN 137。通过从含有hTRT OF的pGRN126中切出HindIII SalI片段，并克隆到质粒pBBS242的HindIIISalI片段构建质粒pGRN136，产生表达脱离MPSV启动子的hTRT的哺乳动物表达质粒。这产生了哺乳动物表达质粒，命名为pGRN145，利用MPSV启动子表达含有Kozak共有序列的hTRT。同时参见下面所述的pGRN152MPSV启动子驱动的哺乳动物表达载体。 
利用游离载体pEBVHis在293细胞中表达的hTRT 
工程化游离载体pEBVHis(Invitrogen，圣迭戈，CA)以便表达含有与N末端扩展表位标记物，Xpress-表位融合的hTRT的hTRT融合蛋白 (Invitrogen，圣迭戈，CA)(命名为pGRN122)。将来自含有hTRT ORF的pGRN121的NotIhTRT片段克隆到pEBVHisA的NotI位点，以致hTRT ORF的方向与载体的痨氏肉瘤病毒(RSV)启动子的相同。在这一方向上，His6旗与hTRT的N末端相当接近。 
同时构建的载体含有作为插入片段的hTRT的反义序列和表位标记物(该质粒命名为pGRN123，可以用作对照)。将该载体转染到293细胞，和利用特异于Xpress表位的抗体分离并鉴定的翻译hTRT。pEBVHis是潮霉素抗性EBV游离载体，表达与N末端肽融合的需要的蛋白质。选择和扩展携带载体的细胞，然后，制备核和细胞质提取物。利用抗Xpress抗体免疫沉淀这些和对照提取物，通过常规测试免疫沉淀小珠和测试端粒酶活性。 
在可灭的，正常二倍体人细胞中表达重组hTRT 
在本发明的一个实施方案中，在正常二倍体可灭细胞中可以表达重组hTRT和需要的端粒酶复合物成分以便增强它们的增殖能力或固定它们，或有助于它们的不灭。这允许人们利用获得具有其它表现型和核型的二倍体不灭细胞。如上讨论的，端粒酶的这种应用具有许多商业价值。 
将有意义hTRT(图16)和反义hTRT克隆到CMV载体。纯化这些载体，并短暂转染到两个正常，可灭，二倍体人细胞系中。人克隆是年轻的通道二倍体人BJ和IMR90细胞菌株。 
利用TRAP测试的端粒酶核型的分析(利用TRAPezeTM试剂盒(Oncor公司，Gaithersburg，MD)显示，有意义hTRT的转染但不是反义hTRT在BJ和IMR90细胞菌株中都测试端粒酶活性。 
在不灭IMR90人细胞中重组hTRT的表达 
利用克隆到CMV载体的同样的hTRT有意义构建体用于上面叙述的 二倍体人BJ和IMR90细胞菌株研究，短暂转染了不灭SW13ALT途径细胞系(IMR90细胞不灭含有SV抗原)。TRAP测试(TRAPeze Oncor公司，Gaithersburg，MD)证明在有意义构建体转染细胞中测试了端粒酶活性。 
在哺乳动物细胞中hTRT的调节表达的载体：可诱导和可阻遏表达hTRT。 
本发明提供的载体可以通过操作诱导或阻遏本发明的TRT如hTRT的表达。例如，hTRT编码序列可以克隆到来自Invitrogen的脱皮激素可诱导表达系统(圣迭戈，CA)和来自克隆技术实验室公司(Palo Alto，CA)的Tet-On和Tet-Off四环素调节系统。这样可诱导表达系统提供用于本发明的方法，其中重要的是控制转染TRT的转录水平或速度。例如，本发明提供通过hTRT的表达提供不灭的细胞系，如可以通过转录控制抑制载体表达hTRT得到“可灭性”的细胞，如那些Tet-Off系统提供的。本发明同时提供短暂表达hTRT的方法以便避免TRT的构成性表达，这种表达可以导致转染细胞中不需要的“不灭性”，如上面讨论。 
脱皮激素可诱导哺乳动物表达系统设计为允许在哺乳动物细胞中调节需要的基因的表达。该系统是通过它的严格调节机制来区分的，该机制允许几乎检测不到的基本表达，并且比哺乳动物细胞中的可诱导性大200倍。该表达系统是基于果蝇的杂二聚体脱皮激素受体的。脱皮激素可诱导表达系统使用了类固醇激素脱皮激素类似物，muri steroneA，以便通过杂二聚体核受体活化hTRT的表达。表达水平已经报道超过基本水平的200倍而没有对哺乳动物细胞生理的影响“在哺乳动物细胞和转基因小鼠中脱皮激素可诱导基因表达”(1996)美国科学院年报93：3346-3351)。一旦受体结合脱皮激素或muristerone，脱皮激素的类似物，受体激活脱皮激素应答启动子获得需要的基因的 控制表达。在脱皮激素可诱导哺乳动物表达系统中，杂二聚体受体的单体是从同一载体pVgRXR中构成性表达的。脱皮激素应答启动子最终驱动需要的基因的表达，该启动子定位于第二个载体pIND，它驱动了需要的基因的转录。 
将hTRT编码序列克隆在pIND载体中(Clontech实验室公司，PaloAlto，CA)，含有5个最小热休克启动子和多克隆位点上游的修饰脱皮激素应答因子(E/GRE)。然后，将该构建体转染到已经预先工程化稳定表达脱皮激素受体的细胞系中。在转染后，利用muristerone A处理细胞以便诱导从pIND细胞内表达。 
Tet-on和Tet-off表达系统(Clontech技术，Palo Alto，CA)达到进入调节高水平表达系统，如Gossen(1992)“四环素诱导启动子在哺乳动物细胞中紧密控制基因表达”美国科学院年报，89：5547-5551中所述的Tet-Off转录表达系统；和Gossen(1995)“在哺乳动物细胞中四环素活化转录”美国科学院年报，268：1766-1769中所述的Tet-On可诱导转录系统。在“Tet-Off”转化细胞系中，当从培养基中除去四环素(Tc)或强力霉素(“Dox”；Tc衍生物)时驱动了基因表达。相反，在Tet-On细胞系中通过在培养基中加入Tc或Dox驱动了表达。两个系统允许克隆基因的表达以便紧密调节应答各种浓度的Tc或Dox。 
这一系统利用“pTRE”作为应答质粒，可以用于表达需要的基因。质粒pTRE含有在Tet应答PhCMV*-1启动子的下游紧接的多个克隆位点(MCS)。插入在MCS的一个位点中的需要的基因或cDNA将应答Tet-Off和Tet-On系统中的tTA和rtTA调节蛋白质。PhCMV*-1含有Tet-应答因子(TRE)，含有7个拷贝的42bptet操纵子序列(tetO)。TRE因子紧接最小CMV启动子(PminCMV)的上游，缺乏在pTet质粒中的完全CMV启动子的部分的增强子。结果，PhCMV*-1在缺乏调节蛋白与tetO序列 的结合时是静止的。克隆插入片段必须具有起始密码。在有些情况中，加入Kozak共有核糖体结合位点可以提高表达水平；但是，许多cDNA已经有效地在Tet系统中表达而没有加入Kozak序列。pTRE-Gene X质粒与pTK-Hyg共转染以便允许选择稳定的转染体。 
设定Tet-Off或Tet-On表达系统通常需要两个连续的稳定转染以便产生“双倍稳定”细胞系，它含有在TRE的控制下的编码适当调节蛋白质和TRT的整合的拷贝的基因。在第一个转染中，将适当的调节蛋白通过转染“调节质粒”如pTet-Off或pTet-On载体导入到选择的细胞系中，该载体表达适当的调节蛋白质。然后，在pTRE“应答质粒”中克隆的hTRT导入在第二次转染中，产生双倍稳定的Tet-Off或Tet-On细胞系。两个系统给出非常紧密的on/off基因表达控制，调节剂量依赖诱导，和高度绝对水平的基因表达。 
含有DHFR和腺病毒序列的重组hTRT的表达 
pGRN155质粒构建体设计用于在哺乳动物细胞中表达hTRTcDNA。将Kozak共有插入hTRT序列的5’末端。hTRT插入片段没有含有3’或5’UTR。将hTRTcDNA插入p91023(B)的EcoRI位点(Wong(1985)科学，228：810-815)。hTRT插入片段是在DHFR ORF的相同方向上。 
质粒pGRN155含有SV40原点，紧接腺病毒启动子上游的增强子，四环素抗性基因，大肠杆菌原点，和腺病毒VAI和VAII基因区域。这一表达盒含有下面顺序的腺病毒主要晚期启动子；腺病毒三分引导序列；杂合内含子，包括来自第一个三分引导序列的外显子的5’拼接位点和来自小鼠免疫球蛋白基因的3’拼接位点；hTRTcDNA；小鼠DHFR编码序列；和SV40多聚腺苷酸化信号。 
已经报道腺病毒三分引导序列和VARNA能够增强翻译多聚顺反子mRNA的序列的效力。已经报道DHFR序列能够增强杂合mRNA的稳定性。 DHFR序列也可以提供选择和扩增载体序列的标记物。参见Logan(1984)美国科学院年报，81：3655)；Kaufman(1985)美国科学院年报82：689；和Kaufman(1988)焦点(生命技术公司)，10卷，3号)。这产生了特定地用于暂时表达的表达载体。 
为了说明目叙述了本发明的其它表达质粒 
pGRN121 
将含有编码hTRT蛋白质的整个cDNA的λ克隆25-1.1.6中的EcoRI片段插入pBluescriptIISK+的EcoRI位点，以致cDNA的5’末端接近载体中的T7启动子。这一载体利用的选择标记物是氨苄青霉素。 
pGRN122 
将来自含有hTRT ORF的pGRN121的NotI片段插入pEBVHisA的NotI位点以致该编码序列可操作地连接RSV启动子。这一质粒表达与hTRT蛋白质的N末端融合的His6旗组成的融合蛋白质。这一载体利用的选择标记物是氨苄青霉素或潮霉素。 
pGRN123 
将来自含有hTRT ORF的pGRN121的NotI片段插入pEBVHisA的NotI位点，以致该编码序列是在RSV启动子的相反方向上，从而表达反义hTRT。 
pGRN124 
质粒pGRN121缺失所有的ApaI位点，接着缺失含有3’UTR的MscI-HincII片段。含有hTRT编码序列的终止密码子的Nco-XbaI片段然后插入pGRN121的Nco-XbaI位点，以便产生相当于pGRN121的质粒，不同的是缺乏3’UTR，该质粒可以优选地在一些细胞中增强表达水平。 
pGRN125 
将来自含有hTRT编码序列的pGRN124的NotI片段插入pBBS235的 NotI位点，以致开放读码框架是在Lac启动子的相反方向上。这一载体利用的选择标记物是氯霉素。 
pGRN126 
将来自含有hTRT编码序列的pGRN124的NotI片段插入pBBS235的NotI位点，以致hTRT编码插入片段是在Lac启动子的相同方向上。 
pGRN127 
将低聚核苷酸5’-TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAattCCaCcATGCCGCGCGCTCCCCGCTC-3’用于pGN125的体外诱变，以便转化hTRT编码序列的ATG密码子成为Kozak共有序列并产生克隆的EcoRI和Bg1II。同时，将低聚COD2866用于转化AmpS成为AmpR(氨苄青霉素抗性)，并且将低聚核苷酸COD1941用于转化CatR(氯霉素抗性)成为CatS(氯霉素敏感)。 
pGRN128 
将低聚核苷酸5’-TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAattCCaCcATGCCGCGCGCTCCCCGCTG-3’用于体外诱变以便转化hTRT的起始ATG密码子成为Kozak共有序列和产生EcoRI和Bg1II位点用于克隆。 
同时低聚5’-CTGCCCTCAGACTTCAAGACCATCCTGGACTACAAGGACGACGATGACAAATGAATTCAGATCTGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGC-3’用于在C末端插入IBI Flag(国际生物技术公司(IBI)，Kodak，New Haven，CT)并产生EcoRI和BglII位点用于克隆。利用COD2866转化Amps成为AmpR，并且COD1941用于转化CatR成为CatS。 
pGRN129 
低聚核苷酸5’-CGGGACGGGCTGCTCCTGCGTTTGGTGGAcGcgTTCTTGTTGGTGACACCTCACCTCACC-3’用于体外诱变转化Asp869成为Ala密码子 (即，将DD基序的第二个Asp转化成为Ala以便产生显性/阴性hTRT变异体)。这也产生MluI位点。同时将低聚核苷酸5’-CTGCCCTCAGACTTCAAGACCATCCTGGACTACAAGGACGACGATGACAAATGAATTCAGATCTGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGC-3’用于在C末端插入IBI Flag和产生EcoRI和BglII位点用于克隆。同时，COD2866用于转化AmpS成为AmpR，并且将COD1941用于转化CatR成为CatS。 
pGRN130 
将低聚核苷酸5’-CGGGACGGGCTGCTCCTGCGTTTGGTGGAcGcgTTCTTGTTGGTGACACCTCACCTCACC-3’用于在体外诱变，诱变转化Asp869密码子成为Ala密码子(即，将DD基序的第二个Asp转化成为Ala以便产生显性/阴性变异体蛋白质)。这也产生了MluI位点。 
同时，将低聚核苷酸5’-TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAattCcaCcATGCCGCGCGCTCCCCGCTG-3’用于体外诱变以便转化hTRT编码序列的起始ATG密码子成为Kozak共有序列并且产生EcoRI和BglII位点用于克隆。同时，COD2866可用于转化AmpS成为AmpR，并且将COD1941用于转化CatR。 
pGRN131 
将来自含有Kozak序列和IBI Flag突变的hTRT ORF的pGRN128的EcoRI片段插入pBBS212的EcoRI位点，以致hTRT ORF脱离MPSV启动子而表达。质粒pBBS212含有MPSV启动子，CMV增强子，和SV40多聚腺苷酸化位点。 
pGRN132 
将来自含有Kozak序列和IBI Flag突变的hTRT ORF的pGRN128的EcoRI片段插入pBBS212的EcoRI位点，以致hTRT ORF的反义脱离MPSV启动子而表达。 
pGRN133 
将来自含有hTRT编码序列的pGRN121的EcoRI片段插入pBBS212的EcoRI位点，以致hTRT蛋白质在MPSV启动子的控制下表达。 
pGRN134 
将来自含有hTRT编码序列的pGRN121的EcoRI片段插入pBBS212的EcoRI位点，以致，反义hTRT编码序列在MPSV启动子的控制下表达。这一载体利用的选择标记物是Chlor/HygB/PAC。 
pGRN135 
利用MscI和SmaI完全消化质粒pGRN126并且再连接以便缺失95％的插入的hTRT编码序列。在该过程中再插入一个SmaI-MscI片段以便再创造用于选择的Cat活性。然后，利用SalI和EcoRI再消化这未纯化的质粒，并且将含有hTRT编码序列的起始密码的片段插入pBBS212的SalI-EcoRI位点。这一产生了表达反义5’UTR和73个碱基对的编码序列的反义表达质粒。用于这一载体的选择标记物是Chlor/HygB/PAC。 
pGRN136 
将来自含有hTRT编码序列的pGRN 126的HindII-SalI片段插入pBBS242的HindII-SalI位点。 
pGRN137 
将来自含有Kozak序列的pGRN 130的SalI-Sse3871片段插入pGRN136的SalI-Sse83871位点。 
pGRN138 
将来自含有hTRT没有3’UTR的pGRN124的EcoRI片段插入pEGFP-C2的EcoRI位点，以致hTRT的方向与EGFP区相同。 
pGRN139 
将低聚核苷酸5’-CTGCCCTCAGACTTCAAGACCATCCTGGACTACAAGGACGACGATGACAAATGAATTCAGATCTGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGC-3’用于在pGRN125的hTRT的C末端插入IBI Flag，并且产生EcoRI和BglII位点用于克隆。同时，利用COD2866转化AmpS成为AmpR，并且利用COD1941转化CatR成为CatS。 
pGRN140 
将含有基因组hTRT的上游序列和来自λG55的hTRT第一个内含子的NcoI片段插入pBBS167的NcoI位点。该片段的定向是hTRT的方向与Lac启动子相同。 
pGRN141 
将含有基因组hTRT的上游序列和来自λG55的hTRT的第一个内含子的NcoI片段插入pBBS167的NcoI位点。该片段的定向是hTRT的方向与Lac启动子相反。 
pGRN142 
将来自λGphi5的NotI片段插入质粒pGBS185的NotI位点。这一Not片段含有完整的～15kbp基因组插入片段，包括hTRT基因的启动子区。该片段的方向是hTRT ORF的方向与Lac启动子的方向相反。 
pGRN143 
将来自λGphi5的NotI片段插入质粒pBBS185的NotI位点，该NotI片段含有完整的～15kbp基因组插入片段，包括hTRT基因的启动子区。该片段的定向使hTRT ORF的方向与Lac启动子相同。 
pGRN144 
pGRN140缺失SAL1以便除去λ序列。 
pGRN145 
构建这一载体用于在哺乳动物细胞中表达hTRT序列。将来自含有hTRT编码序列的pGRN137的EcoRI片段插入pBBS212的EcoRI位点以便除去对应于hTRTmRNA的5’UTR的序列的部分。hTRT的编码序列的方向是它在MPSV启动子的控制下表达。这一载体的选择标记物是Chlor/HygB/PAC。 
pGRN146 
构建这一载体用于在哺乳动物细胞中表达hTRT序列。将来自hTRT的D869A突变的pGRN130的Sse83871-NotI片段插入pGRN137的Sse83871-NotI位点。用于这一载体中的选择标记物是氨苄青霉素/HygB/PAC。 
pGRN147 
将来自含有IBI Flag的pGRN139的Sse83871-NotI片段插入pGRN137的Sse83871-NotI位点。 
pGRN148 
将来自含有hTRT启动子区的pGRN144的BglII-Eco47III片段插入pSEAP2的BglII-NruI位点，以便成为hTRT启动子/报道构建体。 
pGRN149 
这一载体是用于构建hTPT融合蛋白表达载体的中间载体。通过pGRN125的体外诱变将突变的低聚5’-cttcaagaccatcctggactttcgaaacgcggccgccaccgcggtggagctcc-3’用于在hTRT的C末端加入CSP451位点。利用Csp45I位点缺失和替代hTRT的终止密码子。用于这一载体的选择标记物是氨苄青霉素。 
pGRN150 
将来自含有hTRT的启动子区的pGRN144的BglII-FspI片段插入pSEAP2的BglII-NruI位点诱变产生hTRT启动子/报道构建体。 
pGRN151 
构建这一载体用于在哺乳动物细胞中报道hTRT序列。将来自含有hTRT编码序列的pGRN147的EcoRI片段插入pBBS212的EcoRI位点以便除去对应于hTRTmRNA的5’UTR的序列部分。hTRT编码序列的方向使它的表达在MPSV启动子的控制下。用于这一载体的选择标记物是Chlor/HygB/PAC。 
pGRN152 
将来自含有hTRT编码序列的pGRN146的EcoRI片段插入pBBS212的EcoRI位点以便除去对应于hTRT的5’UTR的序列部分。HTRT编码序列的方向是它的表达在MPSV启动子的控制下。 
pGRN153 
将来自含有hTRT的D869-＞A突变(hTRT变异编码序列)的pGRN130的StyI片段插入pGRN158的StyI位点以便产生含有hTRT编码序列的质粒，在hTRT编码序列的5’末端含有Kozak共有序列，在它的3’末端是IBI FLAG序列(C末端编码区)，并含有D869…＞A突变。 
pGRN154 
将含有hTRT基因的pGRN153的EcoRI片段插入质粒pBS212的EcoRI位点，插入的方向使hTRT ORF的方向在MPSV启动子的相同方向。这产生的MPSV指导的表达质粒，表达hTRT蛋白质，该蛋白质在它的氨基酸末端含有Kozak共有序列，在它的羧基末端含有IBI FLAG，并且含有D869…＞A突变。 
pGRN155 
构建这一载体用于在哺乳动物细胞中表达hTRT序列。插入片段包括减去5’和3’UTR的hTRT全长cDNA和Kozak序列。将来自含有hTRTcDNA的pGRN145的EcoRI片段插入p91023(B)的EcoRI位点使hTRT的方向与DHFR ORF相同。hTRTcDNA含有Kozak序列，没有3’和5’UTR。这产生了hTRT的短暂表达载体。用于这一载体的选择标记物是四环素。 
pGRN156 
构建这一载体是用于在哺乳动物细胞中表达hTRT序列。将来自含有hTRTcDNA的D869A突变的pGRN146的EcoRI片段插入p91023(B)的EcoRI位点以致hTRT的定向与DHFR ORF的相同，hTRTcDNA含有Kozak共有序列而没有3’或5’UTR。这产生了hTRT的短暂表达载体。插入片段包括减去5’和3’UTR但含有D869A和Kozak序列的全长hTRT的cDNA。用于这一载体的选择标记物是四环素。 
pGRN157 
构建这一载体是用于在哺乳动物细胞中表达hTRT序列。将来自含有hTRTcDNA的pGRN147的EcoRI片段插入在p91023(B)的EcoRI位点以致hTRT的方向与DHFR ORF的相同。hTRTcDNA在C末端含有IBI FLAG并且含有Kozak共有序列而没有3’或5’UTR。这产生了hTRT的短暂表达载体。插入片段包括减去5’和3’UTR，但含有IBI FLAG序列，和Kozak序列的全长hTRT的cDNA。用于这一载体的选择标记物是四环素。 
pGRN158 
构建这一载体是用于在大肠杆菌中表达和诱变TRT序列。将来自含有hTRT ORF的pGRN151的EcoRI片段插入pBBS183的EcoRI位点使hTRTORF的方向与Lac启动子的相反。插入片段包括减去5’和3’UTR但含有IBI FLAG序列，和Kozak序列的全长hTRTcDNA。hTRT编码序列 是T7启动子驱动的。用于这一载体的选择标记物是氨苄青霉素。 
pGRN159 
构建这一载体用于在大肠杆菌中表达和诱变TRT序列。将来自含有EGFP与hTRT融合体的pGRN138的NheI-KpnI片段插入pBluescriptIIKS+的XbaI-KpnI位点。这产生了融合蛋白质的T7表达载体(编码序列由T7启动子驱动)。插入片段包括减去3’UTR的hTRT与EGFP的融合蛋白的全长cDNA。用于这一载体的选择标记物是氨苄青霉素。 
pGRN160 
构建这一载体用于在哺乳动物细胞中表达反义hTR序列。编码序列可操作地结合MPSV启动子。将来自含有全长hTR ORF的pGRN90的XhoI-NsiI片段插入pBBS295的SalI-Sse83871位点。这产生了表达hTR反义RNA的短暂/稳定载体。在载体中掺入了GPT标记物。用于这一载体的选择标记物是Chlor/gpt/PAC。 
pGRN161 
构建这一载体用于在哺乳动物细胞中表达有意义hTR序列。将来自含有全长hTR ORF的pGRN89的XhoI-NniI片段插入pBBS295的SalI-Sse83871位点。这产生了在有意义方向表达hTR的短暂/稳定载体。编码序列由MPSV启动子驱动。在载体中插入了GPT标记物。用于这一载体的选择标记物是Chlor/gpt/PAC。 
pGRN162 
将来自含有全长hTR ORF的pGRN87的XhoI-NniI片段插入pBBS295的SalI-Sse83871位点。这产生了表达在有意义方向截短的hTR(从+108到+435位置)短暂/稳定载体。 
pGRN163 
构建这一载体用于在大肠杆菌中表达和诱变TRT序列。编码序列由T7启动子驱动。将低聚核苷酸RA45(5’-GCCACCCCCGCGCTGCCTCGAGCTCCCCGCTGC-3’)用于体外诱变以便改变hTRT中的起始met成为Leu，并且在Leu的后面接着的两个密码子中导入XhoI位点。同时，利用COD1941改变CatR到CatS，并且导入BSPH1位点，并且利用COD2866改变AmpS成为AmpR。导入FSP1位点。用于这一载体的选择标记物是氨苄青霉素。 
pGRN164 
构建这一载体用于在大肠杆菌中表达hTR序列。将引物hTR+15’GGGGAAGCTTTAATACGACTCACTATAGGGTTGCGGAGGGTGGGCCTG-3’和hTR+4455’-CCCCGGATCCTGCGCATGTGTGAGCCGAGTCCTGGG-3’用于通过PCR扩增来自含有在5’末端具有T7启动子的全长hTR(正如hTR+1)的pGRN33的片段。将PCR产物的BamHI-HindIII消化物推进pUC119的BamHI-HindIII位点。编码序列可操作地连接T7启动子。用于这一载体的选择标记物是氨苄青霉素。 
pGRN165 
构建这一载体用于在大肠杆菌中表达和诱变hTRT序列。编码序列可操作地连接T7启动子。将来自含有具有Kozak前末端的hTRT ORF的pGRN145的EcORI片段插入pBluecriptIISK+的EcoRI位点，以致hTRT的方向与T7启动子的相同。用于这一载体的选择标记物是氨苄青霉素。 
pGRN166 
构建这一载体用于在哺乳动物细胞中表达和诱变TRT序列。编码序列可操作地连接T7启动子。将来自含有hTRT ORF的pGRN151的EcoRI片段插入pBluescriptIISK+的EcoRI位点，以致hTRT ORF的方向与T7 启动子的方向相同。hTRT ORF含有Kozak前末端和IBI旗后末端。插入片段包括减去5’和3’UTR，但含有FLAG序列(Immunex，Corp，西雅图，WA)，和Kozak序列的全长hTRTcDNA。用于这一载体的选择标记物是氨苄青霉素。 
pGRN167 
将来自含有5’末端的hTRT ORF的pGRN144的AvRII-StuI片段插入pBBS161的XbaI-StuI位点。 
pGRN168 
将来自含有最佳化的hTRT表达盒的pGRN145的EcoRI片段插入pIND的EcoRI位点以致hTRT编码序列的方向与最小CMV启动子的方向相同。 
pGRN169 
将来自含有最佳化hTRT表达盒的pGRN145的EcoRI片段插入pIND的EcoRI位点以致hTRT是在最小CMV启动子的相反方向上。 
pGRN170 
将来自含有最佳化hTRT表达盒的pGRN145的EcoRI片段插入pIND(spl)的EcoRI位点以致hTRT的方向与最小CMV的启动子相反。 
pGRN171 
将来自pGRN163的Eco47III-NarI片段插入pGRN167的Eco47III-NarI位点，将M1L突变放入hTRT基因组cDNA的片段中。 
pGRN172 
将来自在hTRT ORF中含有Met到Leu突变的pGRN171的BamHI-StuI片段插入pSEAP2-Basic的BglII-NruI。 
pGRN173 
将来自含有hTRT启动子区的5’末端的pGRN144的EcoRV-ECO47III片段插入pGRN172的SrfI-Eco47III位点。这产生了含有hTRT的启动 子区的启动子报道质粒，该hTRT启动子区是从hTRT ORF的起始位置的上游约2.3kb到编码序列的第一个内含子后，含有Metl-＞Leu突变 
pGRN174 
将来自含有“最佳化”hTRT表达盒的pGRN145的EcoRI片段插入pIND(spl)的EcoRI位点，以致hTRT是在最小CMV启动子的相同方向上。 
实施例7 
端粒酶活性的重构建 
A.hTRT和hTR的体外共表达 
在该实施例中，描述了利用体外无细胞表达系统共表达hTRT和hTR。这些结果证明了由pGRN121编码的hTRT多肽编码催化活性的端粒酶蛋白质和证明了利用重组表达的hTRT和hTR完成端粒酶RNP的体外重构建(IVR)。 
通过将线性化的质粒hTRT(pGRN121；用XbaI消化1微克DNA)和hTR(phTR+1；用FspI消化1微克)加入到偶合的转录-转译网状细胞裂解液系统(Promega TNTTM)重构建端粒酶活性。phTR+1是质粒，当用FspI线性化并且然后由T7RNA聚合酶转录，产生由hTR的核苷酸1+开始延伸到446位核苷酸的445个核苷酸的转录物(Autexier等人，1996，EMBO J 15：5928)。向50微升反应液中加入下面的成分：2微升TNTTM缓冲液，1微升TNTTTM T7RNA聚合酶，1微升的1毫摩尔浓度氨基酸混合物，40单位的RnasinTM RNA酶抑制剂，各1微克线性化的模板DNA，和25微升的TNTTM网状细胞裂解液。这些成分按照制造商建议的比例加入并且在30℃保温90分钟。转录是在T7启动子指导下进行的并且也可以在加入网状细胞裂解液之前加入产生类似的结果。在 保温之后，采用以前描述的TRAP(Autexier等人，见上文)，利用PCR的20循环以扩增该信号可以对5和10微升的程序化的转录-转译反应测试端粒酶活性。 
重构建的结果显示于附图10。对于所测试的各个转录/转译反应，有3个泳道：开始的2个泳道是重复测试，第三个泳道是TRAP阶段之前的加热(95℃，5分钟)变性的重复样品以排除PCR产生的膺品。 
如附图10显示的，仅仅网状细胞裂解液没有可检测的端粒酶活性(泳道6)。类似的，当单独的hTR(泳道1)或全长的hTRT基因(泳道4)加入到裂解液时没有可检测的端粒酶活性。当加热两个成分时(泳道2)，通过特征性的重复序列梯模式证实产生了端粒酶活性。当hTRT基因的羧基末端通过用NcoI消化该载体去除(“截短的hTRT”)时，端粒酶活性被去除了(泳道3)。泳道5显示单独的截短的hTRT的转译不产生端粒酶活性。泳道“R8”显示由TSR8的TRAP产生的端粒酶产物序列梯的阳性对照，具有5’-ATTCCGTCGAGCAGAGTTAG[GGTTAG]7-3’的核苷酸序列的合成的端粒酶产物。 
B.hTRT和hTR的体外混合 
通过混合也可以体外重构建端粒酶活性。如上所述转录和转译了hTRT，但是没有加入hTR质粒。然后通过将hTRT转译混合物与hTR(前面用T7RNA聚合酶转录从phTR+1-FspI产生的)按照2微升hTRT转译混合物与2微升hTR(1微克)的比例混合，然后在30℃保温90分钟完成端粒酶RNP的重构建。该hTRT/hTR重构建方法称之为“连接的重构建”或“连接的IVR”。端粒酶活性存在于该混合物(即可以检测到)。在通过DEAE层析部分纯化活性之后观察到改善的信号。在该情况下按照制造商的说明使用了Millipore Ultrafree-MC DEAE离心过滤装置。所使用的缓冲液是hypo0.1，hypo0.2，和hypo1.0，其中hypo 是20毫摩尔浓度Hepes-KOH，pH 7.9，2毫摩尔浓度的氯化镁，1毫摩尔浓度EGTA，10％甘油，0.1％NP-40，1毫摩尔浓度DTT，1毫摩尔浓度偏二亚硫酸钠，1毫摩尔浓度的苄眯，和0.2毫摩尔浓度的苯甲基氟磺酰(PMSF)，其中0.1，0.2和1.0是指0.1，0.2或1.0摩尔浓度的氯化钾。用hypo1.0预调节滤膜，然后用hypo0.1洗涤，重构建的端粒酶上样，用hypo0.1，然后用hypo0.2洗涤柱，重构建的端粒酶用上样的一半体积的hypo1.0洗脱。将该制剂冷冻存贮于-70℃并且保留活性。 
在两个步骤的程序测试端粒酶活性。在步骤1中，常规的端粒酶测试按照Morin，1989，细胞59：521的描述进行，不同的是没有使用放射性标记物。在步骤2中，采用TRAP程序测试该试样20-30个循环，如上所述。通过在30℃，包括25毫摩尔浓度Tris-HCl，pH 8.3，50毫摩尔浓度乙酸钾，1毫摩尔浓度EGTA，1毫摩尔浓度氯化镁，2毫摩尔浓度dATP，2毫摩尔浓度TTP，10微摩尔浓度dGTP，和1微摩尔浓度引物(通常M2，5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT)的40-50微升最终体积中测试1-10微升的重构建端粒酶60-180分钟完成常规的测试。通过加热到95℃，5分钟终止反应，将第一个步骤的1-10微升的混合物携带到该步骤2的TRAP反应中(50微升)。 
除了实验，通过35S-甲硫氨酸的掺入和Northern印迹试验分别监测hTRT和hTR在体外重构建过程中的合成。对于hTRT(127千道尔顿)，hTRT-Nco(85千道尔顿)和pro90hTRT(90千道尔顿)，以约互相等摩尔的量合成约预测的大小的蛋白质。Northern印迹分析表明hTR合成是正确的大小(445核苷酸)和主要是完整的。 
对重构建方案的改变，见上文对本领域内技术人员是显而易见的。可以使用例如，重构建的时间和温度，例如单共价键盐(例如氯化钠，氯 化钾，乙酸钾，谷氨酸钾等等)，二价盐(氯化镁，氯化锰，硫酸镁等等)，变性剂(脲，甲酰胺等等)，去污剂(NP-40，吐温，CHAPS等等)的成分的存在或浓度，和另一种可选的改善的纯化程序(例如免疫沉淀，亲和性或标准层析)。可以以系统的方式改变这些和其它参数以使用于特定测试或其它重构建方案的条件最佳化。 
C.利用hTRT变异体重构建和融合蛋白 
当以约野生型水平重构建端粒酶活性的EGFP-hTRT，增强的绿色荧光蛋白质与hTRT的融合(参见实施例6和15)，或表位决定基-标记的hTRT(IBIFLAG，参见实施例6)与hTR共表达时，出现端粒酶催化活性的重构建。 
相反，当使用变异体hTRT，pro90hTRT(缺失了RT基序B’，C，D和E)时，没有重构建端粒酶活性。这证明了pro90hTRT不具有全长端粒酶催化活性，虽然它可能是其它部分能力(例如RNA(即hTR)结合活性和功能如体内端粒酶显性阴性的调节子，如上所述)。 
D.利用G和凝胶印迹和常规端粒酶测试方法对体外重构建的端粒酶活性进行测试 
下面的实施例证明了利用除了基于扩增的测试方法(即TRAP)以外的常规的端粒酶测试方法可以对体外重构建(IVR)的端粒酶进行测试。利用凝胶印迹测试，利用下面的反应条件：包括25毫摩尔浓度Tris-HCl，pH 8.3，50毫摩尔浓度乙酸钾，1毫摩尔浓度EGTA，1毫摩尔浓度氯化镁，0.8毫摩尔浓度dATP，0.8毫摩尔浓度TTP，1.0毫摩尔浓度dGTP，和1微摩尔浓度引物(M2，见上文；或H3.03，5’-TTAGGGTTAGGGTTAGGG)的40微升最终体积中测试1-10微升的连接的IVR端粒酶，对IVR端粒酶部分如上所述(B)，见上文(“连接的重构建方法”)在30℃，测试180分钟，随后DEAE纯化，如上所述，见上文。 采用标准程序，在8％聚丙烯酰胺，8M脲凝胶，转移到尼龙膜，和利用用于点印迹测试的32P-(CCCTAA)n核探针探测，分离合成的端粒DNA。该探针在代表10微升IVR端粒酶的泳道上鉴别了6个核苷酸的序列梯，这相当于在通过monoQ和肝素层析纯化的5微升的天然核端粒酶中观察到的序列梯。该结果显示IVR端粒酶具有等同于天然端粒酶的循序性的端粒酶催化活性。 
采用常规的32P-dGTP掺入端粒酶测试也可以对连接的IVR端粒酶进行测试。在循序性和非循序性反应条件下对如上所述的通过连接的重构建方法，随后通过DEAE纯化制备的IVR端粒酶进行测试。测试条件是包括25毫摩尔浓度Tris-HCl，pH 8.3，50毫摩尔浓度乙酸钾，1毫摩尔浓度EGTA，1毫摩尔浓度氯化镁，2毫摩尔浓度dATP，2毫摩尔浓度TTP，10微摩尔浓度32P-dGTP(72Ci/mmol)(对于循序性条件的测试)或，1微摩尔浓度32P-dGTP(720Ci/mmol)(对于非循序性条件的测试)和1微摩尔浓度引物(即上文的H3.03)的40微升最终体积中的5-10微升的连接的IVR端粒酶在30℃(对于循序性反应)或37℃(对于非循序性反应)测试180分钟。通过标准的程序分离合成的端粒DNA并且在8％聚丙烯酰胺，8M脲测序凝胶上分离。循序性反应显示弱的6和核苷酸的序列梯，这与循序性端粒酶反应一致，非循序性反应增加了一个重复，模式等同于用天然端粒酶制剂进行的对照反应。利用IVR端粒酶的常规测试可用于筛选端粒酶调节子，如本文所述，以及可用于其它用途例如阐明端粒酶的结构和功能特性。 
E.体外重构建端粒酶识别引物3’末端 
该试验证明了IVR端粒酶识别相当于天然(纯化)端粒酶的引物3’末端。端粒酶在引物3’末端和hTR的模板区域之间形成碱基配对的双螺旋和增加一个邻接的特定的核苷酸(Morin，1989，见上文)。为了验 证IVR(重组)端粒酶具有类似的特性，引物与——GGG或——TAG3’末端(AATCCGTCGAGCAGAGGG和AATCCGTCGAGCAGATAG)的反应相当于利用上面详细描述的2个步骤的常规/TRAP测试检测的IVR和天然端粒酶的具有——GTT3’末端的引物(M2，见上文)。当与标准引物(——GTT3’末端)相比时，——GGG和——TAG引物的产物序列梯分别转移了+4和+2。用天然端粒酶观察到相同的效果。该试验证明了IVR和天然端粒酶以类似的方式识别引物末端。 
这些结果(以及显示IVR端粒酶具有循序性和非循序性催化活性的上文所述的结果)指明了IVR端粒酶与天然或纯化的端粒酶相比具有类似的结构和特性。 
实施例8 
抗-hTRT抗体的生产 
A.抗hTRT肽的抗-hTRT抗体的生产 
为了生产抗-hTRT的抗体，通过加入C(光胱氨酸)作为氨基末端残基从hTRT合成下面的肽(参见附图54)。 
S-1：FFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSK 
S-2：RQHLKRVQLRDVSEAEVRQHREA 
S-3：ARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYE 
A-3：PALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVV 
将半胱氨酸成分用于将肽固定到(即共价连接)BSA和KLH(匙孔血蓝蛋白)载体蛋白。将KLH用作为抗原。BSA-肽偶合物用作为进行ELISA的物质以便测试免疫抗血清的特异性。 
将KLH-肽偶合物注射到新西兰白兔。通过将注射点靠近液羽和腹股沟的淋巴结进行起始的注射。随后的注射通过肌肉内进行。对于起 始注射，用弗氏完全佐剂将抗原乳化；对于随后的注射，使用弗氏不完全佐剂。对于兔子，安排三星期之后进行加强注射的周期，其中在每次加强注射后10天获取产生20-25毫升的血清的血液50毫升。在Western印迹上抗4个肽中的每一个的抗血清识别重组的hTRT融合蛋白的hTRT成分或(GST-HIS8-hTRT-片段2426到3274，参见实施例6)。 
利用按照PCT申请97/06012描述的生产的来自于人293细胞的部分纯化的端粒酶组分(与核粗提取物相比约纯化1000倍)和亲和性纯化的抗-S-2抗体，在Western印迹上可以检测到130千道尔顿的双链体。可以使用敏感性的化学发光检测方法(SuperSignal化学发光底物，Pierce)，但是印迹上的信号较弱，这表明hTRT以低或非常低的丰度存在于这些不灭的细胞。观察到双链体的结果与hTRT的转译后修饰即磷酸化或糖基化是一致的。 
对于亲和性纯化，借助于其N-末端半胱氨酸残基，根据制造商方案，将S-2肽固定到SulfoLink(Pierce，Rockford IL)。将用KLH-S-2肽抗原免疫接种的兔子获得的第一批血样上样到S-2-SulfoLink，洗脱特异性结合到S-2肽的抗体。 
B.抗hTRT融合蛋白的抗hTRT抗体的生产 
按照实施例6的描述在大肠杆菌中表达GST-hTRT融合蛋白，其表达的融合蛋白为GST-hTRT片段#4(3272-4177个核苷酸)和GST-HIS8-hTRT片段#3(2426-3274个核苷酸)蛋白质形式。纯化不溶性蛋白质形式的融合蛋白，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶测试抗原的纯度并且对于GST-hTRT片段#4重组蛋白质估测为约75％纯度和对于GST-HIS8--hTRT片段#3重组蛋白估测为约75％以上的纯度。可以使用常规方法以获得纯度大于90％的这些和其它融合蛋白。使用这些重组蛋 白免疫接种兔子和小鼠，如上所述。 
在利用含有固定化的GST基质去除抗GST抗体之后测试从兔子和小鼠获取的第一批第二批血液中抗hTRT抗体的存在。通过利用固定重组GST-hTRT融合蛋白进行Western印迹，和通过利用部分纯化的天然端粒酶进行免疫沉淀测试抗血清中抗hTRT抗体。在这些较早期的血液中没有观察到信号时，而在随后的血液中，正如所预料的，抗hTRT抗体的效价增加。 
实施例9 
对应于Δ182RNA变异体的hTRT mRNA的检测 
利用RT-PCR和嵌套式引物分析来自于人睾丸和293细胞系的多A+RNA的hTRT mRNA。第一个引物组是TCP1.1和TCP1.15；第二个引物组是TCP1.14和BTCP6。各个扩增获得的两个产物有182个碱基对的不同；对来自于睾丸RNA的较大和较小的产物测序并且发现分别精确地对应于pGRN121(附图16)和712562克隆(附图18)。在来自于SW39i，OVCAR4，293和睾丸的mRNA中已经观察到变异的hTRT RNA产物。 
进行另外的试验以证明Δ182cDNA不是逆转录的假象。简单而言，通过体外转录pGRN121产生了全长hTRT RNA(即没有缺失)用作为RT-PCR的模板。利用Superscript 
Figure GSA00000069469702591
逆转录酶(Bethesda研究实验室，BethesdaMD)，和用随机引物或特异性引物，在42℃或50℃进行单独的cDNA合成反应。在15个PCR循环之后，可检测到较长的产物，然而，甚至在30个或更多的循环之后，不可检测到较小产物(即对应于缺失)。这表明RT-PCR产物不是假象。 
实施例10 
睾丸hTRT mRNA的测序 
利用ThermoSequenase放射性标记的终止子循环测序试剂盒(Amersham生命科学)，采用由PCR产生的来自于睾丸cDNA的DNA片段的直接的手工测序(marathon睾丸cDNA，Clontech，圣地亚哥CA)可以测定睾丸形成的hTRT RNA的序列。通过嵌套式PCR进行PCR步骤，如表8显示的。在所有情况中，阴性对照与引物反应，但是cDNA没有反应。在对照反应中没有产生产物证明来源于存在cDNA的反应的产物不是由于来源于pGRN121或其它细胞来源(例如293细胞)的hTRT的污染。从琼脂糖凝胶切除DNA片段以在测序之前纯化DNA。 
获得了对应于pGRN121插入序列的27到3553碱基的，含有整个hTRT ORF(56到3451碱基)的睾丸mRNA序列。在该区域睾丸和pGRN121序列之间是不同的。 
Figure GSA00000069469702611
实施例11 
通过RNA酶保护检测hTRT mRNA 
将RNA酶保护测试用于检测，监测或诊断hTRT mRNA或变异mRNA的存在。一个说明性的RNA酶保护探针是包括与hTRT mRNA序列互补的序列和另外的，非互补序列的体外合成的RNA。包含后一序列可以区分全长探针和该测试中阳性结果产生的探针的片段：在阳性测试中，将探针的互补序列保护以免受RNA酶的消化，因为它们与hTRT mRNA杂交。在RNA酶和靶互补核酸存在下从探针消化到非互补序列。 
为了说明的目的描述两个RNA酶保护探针；两个探针都可以用于该测试。这些探针的hTRT互补的序列是不同的，但是都含有相同的非互补序列，在该实施方案，来源于SV40晚期mRNA引导序列。从5’-3’，一个探针包括33个核苷酸的非互补序列和194个核苷酸的与hTRT核苷酸2513-2707互补序列，该探针全长大小为227个核苷酸。从5’-3’，第二个探针包括33个核苷酸的非互补序列和198个核苷酸的与hTRT的2837-3035的核苷酸互补的序列，该探针全长大小为231个核苷酸。为了实施该测试，探针可以与来自于测试样品的RNA，即多A+RNA杂交，然后加入T1核糖核酸外切酶和RNA酶A。在消化之后，通过凝胶电泳纯化和分析探针RNA。检测到227个核苷酸的探针的194个核苷酸片段或231个核苷酸探针的198个核苷酸片段是指示该样品中有hTRT mRNA。 
通过利用T7RNA聚合酶体外转录可以产生该实施例描述的说明性的RNA酶保护探针。可以包含放射性或其它标记的核糖核苷酸以合成标记的探针。用于体外转录反应以产生RNA探针的模板是PCR产物。在利用跨越对应于hTRT基因或mRNA的互补区域的引物对pGRN121DNA进行PCR扩增之后利用T7聚合酶可以合成这些说明性探针。另外，下游引 物含有T7RNA聚合酶启动子序列和非互补序列。 
为了产生第一个RNA酶保护探针，使用来自于下面的引物对(T701和反向01)的PCR产物： 
T7015′-GGGAGATCT TAATACGACTCACTATAG ATTCA GGCCATGGTGCTGCGCCGGC TGTCA GGCTCCC ACGACGTAGT CCATGTTCAC-3′；和反向015′-GGGTCTAGAT CCGGAAGAGTGT CTGGAGCAAG-3′. 
为了产生第二个RNA酶保护探针，使用来自于下面的引物对(T702和反向02)的PCR产物： 
T7025′-GGGAGATCT TAATACGACTCACTATAG ATTCA GGCCATGGTGCTGCGCCGGC TGTCA GGGCG GCCTTCTGGA CCACGGCATA CC-3′；和反向025′-G GTCTAGA CGATATCC ACAGGGCCTG GCGC-3′. 
实施例12 
将hTRT和其它逆转录酶比较的系统进化树的构建 
通过将由Xiong和Eickbush定义的7个RT区域(1990，EMBO J.9：3353)进行比较构建系统进化树(附图6)。在将4TRTs，67RTs和3RNA聚合酶的基序1，2和A-E进行序列比较之后，利用NJ(相邻连接)方法(Saitou和Nei，1987，分子生物学演变4：406)构建该进化树。定位于该树的相似分支的相似种类的因子简化为一个盒子。各个盒子的长度对应于该盒子内变异最大的因子。 
似乎TRT与msDNA组II内含子和非-LTR(长末端重复)反转录转座子结合的RT相关性比与LTR-反转录转座子和病毒RT的相关性更密切。端粒酶RT与逆转录因子的非-LTR分支的关系是引起兴趣的，假设这些后面的因子已经替代了端粒酶以便端粒酶保持于果蝇。但是，最明显的发现是TRT形成了不连续的亚组，与正链RNA病毒例如脊髓灰质炎病毒的RNA依赖性RNA聚合酶紧密相关性几乎与以前已知的RT的相 关性一样。认为四个端粒酶基因来自于演变上关系远的生物体-原生动物，真菌和哺乳动物——通过缺失该数据组中系统进化的变异性不能解释该单独的分组。替代的是，这种大的分歧暗示端粒酶RT是古代组，可能起源于第一个真核生物。 
用于系统进化分析的GenBank蛋白质鉴别号或入藏号是：msDNAs(94535，134069，134074，134075，134078)，组II内含子(483039，101880，1332208，1334433，1334435，133345，1353081)，线粒体质粒/RTL(903835，134084)，非-LTR反转录转座子(140023，84806，103221，103353，134083，435415，103015，1335673，85020，141475，106903，130402，U0551，903695，940390，2055276，L08889)，LTR反转录转座子(74599，85105，130582，99712，83589，84126，479443，224319，130398，130583，1335652，173088，226407，101042，1078824)，肝DNA病毒科(I18876，1706510，118894)，花椰菜花叶病毒(331554，130600，130593，93553)，反转录病毒(130601，325465，74601，130587，130601，130607，130629，130589，130631，1346746，130651，130635，1780973，130646)。利用Clustal W 1.5(J.D。Thompson，D.G.Higgins，T.J.Gibson，核酸研究22，4673(1994)和PHYLIP 3.5(J.Felsenstein，Cladisfics 5，164(1989)))分析序列比较。 
实施例13 
对照质粒和编码hTRT的质粒转染培养的人成纤维细胞(BJ) 
该实施例证明重组hTRT蛋白质在哺乳动物细胞中的表达导致产生活性端粒酶。 
用胰蛋白酶消化亚融合的BJ成纤维细胞并且以4×106细胞数/毫 升的浓度重新悬浮于新鲜培养基(含有10％胎牛小牛血清的DMEM/199)。利用BioRad基因脉冲TM电击穿仪进行电击穿转染该细胞。非强制性地，也可以利用SuperfectTM试剂(Qiagen)，根据制造商的说明转染细胞。对于电击穿方法，将500微升的细胞悬浮液置于电击穿小试管(BioRad，0.4电极间隔)。将质粒DNA(2微克)加入到小试管并且缓慢混合悬浮液，在冰上保温5分钟。对照质粒(pBBS212)在MPSV启动子后面不含有插入物并且试验质粒(pGRN133)从MPSV启动子表达hTRT。以300伏和960μFD将细胞电击穿。在释放脉冲后，在平铺到100毫米的组织培养皿的培养基之前，将小试管置于冰上约5分钟。在16小时之后，用新鲜培养基替换其中的培养基。在转染之后72小时，用胰蛋白酶消化细胞，用PBS洗涤一次，沉淀并且冷冻储藏于-80℃。采用改良的去污剂裂解方法以25000细胞数/微升的浓度制备细胞提取物(参见Bodnar等人，1996，Exp.Cell Res.228：58；Kim等人，1994，科学266：2011，和如与TRAP测试相关的专利和公开文献，见上文描述的)，利用改良的基于PCR的TRAP测试(Kim等人，1994，Bodnar等人，1996)测定细胞提取物中端粒酶活性。简单地说，在端粒酶引物延伸部分的反应中使用了5×104的细胞等同物。而通常直接从端粒酶延伸反应获取提取物进行PCR扩增，因此也可以在PCR扩增之前用苯酚/氯仿提取一次和用氯仿提取一次。在TRAP反应(约10000细胞等同物)的PCR扩增部分使用了该材料的五分之一。将TRAP反应物的一半上样到凝胶进行分析，以致于附图25的各个泳道代表来自于5000个细胞等同物的反应产物。来自于用pGRN133转染的细胞的提取物是端粒酶活性阳性的，而来自于未转染(未显示)或对照质粒转染的细胞的提取物显示没有端粒酶活性。利用RPE细胞的类似的试验获得类似的结果。 
利用其它hTRT构建体(即pGRN145，pGRN155和pGRN138)也可以进 行BJ细胞的重构建。利用这些构建体的重构建似乎导致产生比在pGRN133转染的细胞中更高的端粒酶活性。 
利用pGRN155获得最高水平的端粒酶活性。如上文讨论的，pGRN155是含有作为hTRT表达的控制因子的腺病毒主要晚期启动子的载体并且证明当转染到BJ细胞时重构建端粒酶活性。 
值得注意的是，当利用hTRT-GFP融合蛋白pGRN138(定位于核，参见实施例15，参见下文)在体外(参见实施例7)或体内(转染到BJ细胞)进行重构建时产生了端粒酶活性。通过转染到BJ细胞，例如如上所述，端粒酶活性相当于利用pGRN133或pGRN145进行的体外重构建。 
基于用本发明的hTRT表达载体转染正常的人视黄醛色素上皮细胞(RPE)获得了类似的结果。据认为REP细胞的老化导致或引起老化相关的斑点退化的疾病。与未处理的细胞相比，根据本发明的方法利用本发明的hTRT表达载体处理的RPE细胞应该显示衰老延迟，并且因此可用于移植治疗以治疗或抑制老化相关的斑点退化。 
实施例14 
启动子-报道基因构建体 
该实施例描述了其中报道基因可操作连接到含有启动子元件的hTRT上游序列的质粒的构建。该载体具有许多用途，包括体内鉴定顺式和反式转录调节因子和用于筛选能够调节(例如激活或抑制)hTRT表达的药剂(例如药物筛选)。虽然可以使用许多报道基因(例如萤火虫荧光素酶，β-葡萄糖醛酸酶，β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶，和GFP等等)，可将人分泌的碱性磷酸酶(SEAP；Clone Tech)用于起始的试验。SEAP报道基因编码截短形式的胎盘酶，该酶失去了膜锚合区域，因此允许该蛋白质有效地从转染的细胞分泌。已经证明在培养基中检测 到的SEAP活性的水平与SEAP mRNA和蛋白质的细胞内浓度的变化直接成比例(Berger等人，1988，基因66：1；Cullen等人，1992，酶学方法216：362)。 
将四个构建体(pGRN148，pGRN150，“pSEAP2Basic”(没有启动子序列＝阴性对照)和“pSEAP2对照”(含有SV40早期启动子和加强子))转染到可灭和不灭的细胞，设置3个重复。 
如附图9描述构建了pGRN148质粒。简单地说，从pGRN144消化Bgl2-Eco47III片段并且克隆到pSeap2Basic的BglII-NruI位点(Clontech，圣地亚哥，CA)。第二个报道基因-启动子，质粒pGRN150包括来自于实施例3描述的hTRT内含子的序列以使用可以存在于内含子的调节序列。将起始甲硫氨酸突变为亮氨酸，以致于启动子区域后面的第二个ATG将作为SEAP ORF的起始ATG。 
将pGRN148和pGRN150构建体(包括hTRT启动子)转染到可灭(BJ细胞)和不灭(293)细胞。所有的转染是与两个对照质粒平行进行的：一个阴性对照质粒(pSEAPBasic)和一个阳性对照质粒(含有SV40即早期启动子和SV40增强子)。 
在不灭的细胞中，pGRN148和pGRN150构建体似乎是以相同于pSEAP2阳性对照(含有SV40即早期启动子和增强子)的效力启动SEAP表达。相反，对于可灭的细胞，仅仅pSEAP2对照获得了可检测的活性。这些结果表明，如预料的hTRT启动子序列在肿瘤细胞中有活性但是在可灭细胞中没有活性。 
利用另一个正常细胞系(RPE，或视黄醛色素上皮细胞)获得类似的结果。在用pGRN150(含有2.2千道尔顿的上游基因组序列)转染的RPE细胞中，hTRT启动子区域是非活性的，而pSEAP2对照质粒是有活性的。 
如上所述，利用瞬时和稳定转染的技术，其中报道基因可操作连接到含有启动子元件的hTRT上游序列的质粒对于端粒酶活性调节试剂的鉴别和筛选是非常有用的。例如在一种方案中，根据Ausubel等人，1997，见上文，通过用真核选择性标记物(例如neo)共转染在端粒酶阴性和端粒酶阳性细胞中制备pGRN148的稳定转化体。例如通过将存在和不存在测试化合物时比较hTRT启动子启动的表达，将获得的细胞系用于筛选推测的端粒酶调节试剂。 
也可将本发明的启动子-报道基因(和其它)载体用于鉴别反式和顺式作用转录和转译调节元件。顺式作用转录和转译调节元件的例子包括端粒酶基因的启动子和增强子。顺式和反式作用调节试剂的鉴别和分离进一步提供了用于鉴别调节端粒酶的转录和转译的试剂的方法和试剂。 
实施例15 
hTRT的亚细胞定位 
按照如下所述构建具有hTRT和增强的绿色荧光蛋白质(EGFP；Cormack等人，1996，基因173：33)区域的融合蛋白质。该EGFP成分提供了可检测的标签或信号以致于易于测定融合蛋白质的存在或定位。因为EGFP-融合蛋白质定位于正确的细胞腔室，该构建体可用于测定hTRT蛋白质的亚细胞定位。 
A.pGRN138的构建 
通过将来自于pGRN124的EcoRI插入物(参见实施例6)置于pEGFP-C2的EcoRI位点(Clontech，圣地亚哥，CA)而构建用于哺乳动物细胞中表达hTRT-EGFP融合蛋白的载体。下面提供了该融合蛋白的氨基酸序列。EGFP残基用黑体表示，底下划线为由hTRT mRNA的5’未转译 区域编码的残基，并且以正常形式为表示hTRT蛋白质序列。 
Figure GSA00000069469702691
EFAAASTQRCVLLRTWEALAPATPAMPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRDCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRPSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASVTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD 
利用部分(例如截短的)hTRT编码序列可以制备其它EGFP融合构建体并且如下文所述用于鉴别hTRT多肽的特定区域的活性。 
B.pGRN138的核定位和使用 
用pGRN138转染的NIH293和BJ细胞证实了重组表达hTRT的核定位。用pGRN138(EGFP-hTRT)和用对照构建体(仅仅表达EGFP)转染细胞。通过荧光显微镜检测明显看到在两个细胞类型中EGFP-hTRT的核定位。如上所述，pGRN138hTRT-GFP融合蛋白支持了在体外转录转译系统和当转染到BJ细胞时体内的端粒酶活性的重构建。 
可以将hTRT-EGFP融合蛋白(或类似的可检测融合蛋白)用于各种各样应用。例如，在实施例中描述的融合构建体，或EGFP和hTRT的 截短形式的构建体，可用于评价hTRT和变异体进入细胞核和/或定位于染色体末端的能力。另外，可以将用pGRN138稳定或瞬时转染的细胞用于筛选化合物以鉴定端粒酶调节药物或化合物。可以将干扰核定位或端粒定位的试剂鉴定为端粒酶抑制剂。稳定表达EGFP-hTRT的肿瘤细胞系可用于该目的。可以将端粒酶的潜在的调节子给这些转染的细胞给药并且评价EGFP-hTRT的定位。另外，可将FACS或其它基于荧光的方法用于选择表达hTRT的细胞以提供用于药物筛选的均匀群体，特别是当使用瞬时转染的细胞时。 
在其它应用，可以将hTRT区域诱变以鉴定核定位需要的区域(例如残基193-196(PRRR)和235-240(PKRPRR))，它是抗端粒酶药物(端粒酶活性的调节子)的靶。其它应用包括： 
对于瞬时转染试验和当建立表达EGFP-hTRT的稳定细胞系时，融合蛋白用作为有效的细胞转染的荧光标记物； 
在不灭的细胞中表达具有诱变的核定位信号(核定位缺陷)的hTRT-EGFP融合以致于hTRT突变体-EGFP清除所有的不灭细胞的hTR，保留在细胞质并且抑制端粒的维持；和 
将标记的端粒酶用于免疫沉淀。 
实施例16 
突变对端粒酶催化活性的作用 
该实施例描述了具有改变的氨基酸和改变的端粒酶催化活性的hTRT变异蛋白质。氨基酸替代后进行功能分析是评价多肽序列的重要性和功能的手段。该实施例证明了逆转录酶(RT)和端粒酶(T)基序的变化影响端粒酶催化活性。 
将常规的命名法用于描述突变体：由一字母密码和位置鉴定的天然 分子(hTRT)的靶残基，和由一字母密码表示的突变体蛋白质的相应的残基。因此，例如，“K626A”限定了其中hTRT的626位置的赖氨酸(即在基序1)被改变为丙氨酸的突变体。 
A.hTRT FFYxTE基序的突变 
起始的试验中，生产了编码hTRT突变体蛋白质的载体“F560A”，其中利用标准的技术通过将pGRN121的定位诱变将hTRT的560位的氨基酸从苯丙氨酸(F)改变为丙氨酸(A)。该突变打断TRT FFYxTE基序。如利用无细胞网状细胞裂解液转录/转译系统，在35S-甲硫氨酸存在下评价证实的，获得的F560A突变体多聚核苷酸显示指导全长hTRT蛋白质的合成。 
当突变多肽与hTR共转译时，如实施例7所述，如通过利用20个循环的PCR进行的TRAP观察到的，没有检测到端粒酶活性，而对照hTRT/hTR共转译有重构建的活性。当在TRAP测试中进行30个循环的PCR时，对于突变体hTRT观察到端粒酶活性，但是大大低于对照(野生型)hTRT。 
B.hTRT氨基酸残基的其它的位点特异性诱变 
利用标准的位点特异性诱变技术(例如参见Ausubel，见上文)将6个RT基序的保守的氨基酸改变为丙氨酸以评价其对催化活性的作用。利用IVR端粒酶，利用实施例7详细描述的两个步骤的常规/TRAP测试，对该突变体进行测试。 
K626A(基序1)，R631A(基序2)，D712A(基序A)，Y717A(基序A)，D868A(基序C)突变体的端粒酶活性被大大降低或没有检测到，而Q833A(基序B)和G932A(基序E)突变体显示中间水平的活性。RT基序以外的两个突变体，R688A和D897A，具有等同于野生型hTRT的活性。这些结果与逆转录酶的类似物突变一致(Joyce等人，1994，生物化学 综述年报63：777)并且类似于用Est2p获得的结果(参见Lingner，1997，科学276：561)。该试验鉴定了对酶促活性是关键和不关键的RT基序的残基并且证明hTRT是人端粒酶催化蛋白质。该突变提供了具有如作为端粒酶活性的显性/阴性调节子的用途的变异的hTRT多肽。 
已知TRT的氨基酸序列比较鉴定了端粒酶特异性基序，基序T(见上文)。为了测定该基序中hTRT的催化作用，利用标准的位点特异性诱变技术(Ausubel，见上文)构建了该6个氨基酸缺失基序(Δ560-565；FFYxTE)。利用IVR端粒酶，利用实施例7详细描述的两个步骤的常规/TRAP测试，对该缺失进行测试。在25的循环的PCR之后Δ560-565突变体没有可检测的端粒酶活性，而野生型hTRT IVR端粒酶产生了强信号。以类似的方式，独立地检查基序T的各个残基的各个氨基酸；突变体F560A，Y562Y，T564，和E565A保留了端粒酶活性的中间水平，而对照突变体，F487A对活性具有最小的影响。值得注意的是，突变体F561A的端粒酶活性大大降低或没有检测到，而在“回复体”，F561A561F中保留了全部活性。F561A561F将突变的位置改变回原始的苯丙氨酸。这是对照，证明了对于考虑观察到的降低的活性的质粒没有出现其它氨基酸变化。因此，T基序是被证明对端粒酶活性绝对需要的第一个非RT基序。 
基序T可用于鉴定来自于其它生物体的TRT并且包括该基序的变异体的hTRT蛋白质可用作为端粒酶活性的显性/阴性调节子。与大多数其它RT不同，端粒酶稳定地结合和循序性拷贝单个RNA(即hTR)的一小部分，由此基序T可参与介导hTR结合，反应的循序性，或对于端粒酶RT不是独特的其它功能。 
实施例17 
利用重组表达的端粒酶成分筛选端粒酶活性 
本实施例描述了用于筛选和鉴定端粒酶活性调节子的体外重构建端粒酶。所描述的测试易于用于high-through-put方法(例如利用多个孔平板和/或机器人系统)。在该步骤的测试的许多变异根据本文公开的观点之后对本领域内技术人员来说是显而易见的。 
按照如下所述，和如上文实施例7所述，利用TNT 
Figure GSA00000069469702731
T7偶合的网状细胞裂解液系统(Promega)，如美国专利5324637，按照制造商的说明，在体外反应中转录和转译(仅仅hTRT)用于端粒酶成分(例如hTRT和hTR)的重组克隆： 
试剂                            每个反应的量(微升) 
TNT兔网状细胞裂解液                      25 
TNT反应缓冲液                            2 
TNT T7RNA Pol.                           1 
AA混合物(完全)                           1 
引物RNA酶抑制剂                          1 
无核酸酶的水                             16 
XbaI裂解的pGRN121[hTRT](0.5微克)         2 
Fsp1裂解的pGRN164[hTR](0.5微克)          2 
将反应物在30℃保温2小时。然后将产物在超游离的MC DEAE滤膜(Millipore)上纯化。 
在将溶解于DMSO(例如10微摩尔浓度-100微摩尔浓度)的多倍浓度的测试化合物存在和不存在下测试重组端粒酶产物(IVRP)。在25微升的总体积中，在2.5微升的IVRP，2.5％DMSO，和1×TRAP缓冲液 (20mMTris Hcl，pH 8.3，1.5mM氯化镁，63mM氯化钾，0.05％吐温20，1.0mM EGTA，0.1毫克/毫升牛血清白蛋白)存在下，在室温下将测试化合物预保温30分钟。在预保温之后，将25微升的TRAP测试反应混合物加入到各个样品。该TRAP测试反应混合物由1×TRAP缓冲液，50微升dNTP，2.0微克/毫升引物ACX，4微克/毫升引物U2，0.8attomol/毫升TSU2，2单位/50微升Taq聚合酶(Perkin Elmer)，和2微克/毫升(35P)5’末端标记的引物TS(3000Ci/mmol)组成。然后将反应试管置于PCR热循环仪(MJ Research)并且PCR按照如下所述进行：30℃，60分钟，{94℃，30秒，60℃，30秒，72℃，30秒}进行20个循环，72℃，1分钟，冷却到10℃。如上所述，TRAP测试的描述参见美国专利5629154。所使用的引物和底物具有序列：TS引物(5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’)；ACX引物(5’-GCGCGG[CTTACC]3CTAACC-3’)；U2引物(5’-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3’)；TSU2(5’-AATCCGTCGAGCAGAGTTAAAAGGCCGAGAAGCGAT-3’) 
在PCR步骤完成之后，将含有溴酚蓝的4微升的10×上样缓冲液加入到各个反应试管并且将产物(20微升)在12.5％非变性PAGE上，在0.5×TBE中以400伏电泳。随后将整个凝胶干燥并且用磷成象仪或放射自显影观察TRAP产物。通过将反应产物中掺入的标记物与没有该试剂的平行对照比较测定在测试化合物存在下端粒酶活性。 
描述于实施例中的下面的克隆已经保藏于美国典型培养物收集中心，Rockville，MD20852，美国： 
λ噬菌体λ25-1.1        ATCC入藏号209024 
pGRN 121                ATCC入藏号209016 
λg PHI5(λgΦ5)  ATCC98505(保藏日1997年8月14日) 
本发明提供了新的与hTRT相关的方法和材料并且端粒酶相关的疾 病的诊断和治疗。虽然已经提供了特定的实施例，但是上面的描述是说明性的并且不是限制性的。本发明的许多变异对本领域内技术人员来说根据该说明书的描述是显而易见的。因此本发明的范围应该不由本发明的说明书来决定，而是应该参照附附加的权利要求书来决定，它相当于全部的范围。 
即使各个公开文献或专利文献是单个地被引用的，但是本申请提到的所有公开物和专利全部引入本文用于所有目的。 

Claims (10)

1.人端粒酶逆转录酶(SEQ ID NO：2)的分离的免疫原性肽，其可以引起对人端粒酶逆转录酶的适应性免疫应答。
2.权利要求1的分离的免疫原性肽，其中所述肽由SEQ ID NO：2的至少8个、优选至少10个氨基酸组成。
3.人端粒酶逆转录酶(SEQ ID NO：2)的分离的肽，其包含至少10个氨基酸。
4.一种组合物，其包含前述权利要求任一项的分离的肽和佐剂。
5.一种分离或重组的多核苷酸，其包含hTRT核酸序列的亚序列，所述亚序列包含与人端粒酶逆转录酶(hTRT)(SEQ ID NO：1)相同或互补的至少12个、至少25个、优选至少50个连续碱基，条件是所述核酸序列不是SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：3。
6.一种分离或重组的多核苷酸，其包含hTRT核酸序列的亚序列，所述亚序列包含
a)与质粒pGRN121(ATCC 209016)中第1625至2458位核苷酸的人端粒酶逆转录酶(hTRT)插入序列的序列相同或互补的至少100个碱基，或
b)与质粒pGRN121(ATCC 209016)中第782至1636位核苷酸的人端粒酶逆转录酶(hTRT)插入序列的序列相同或互补的至少12个碱基、至少25个碱基。
7.权利要求5或6中限定的分离或重组的多核苷酸，其与启动子可操作地连接。
8.一种药物，其包含权利要求1-3任一项的肽或权利要求5-7任一项的多核苷酸以及药物可接受的载体。
9.权利要求1-3任一项的肽或权利要求5-7任一项的多核苷酸在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
10.一种分离的重组细胞，其包含权利要求5-7任一项的分离的多核苷酸或权利要求1-3任一项的肽。
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