CN102036688A - 使用人脐带组织来源的细胞进行肾脏组织的修复和再生 - Google Patents
使用人脐带组织来源的细胞进行肾脏组织的修复和再生 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102036688A CN102036688A CN2008801191846A CN200880119184A CN102036688A CN 102036688 A CN102036688 A CN 102036688A CN 2008801191846 A CN2008801191846 A CN 2008801191846A CN 200880119184 A CN200880119184 A CN 200880119184A CN 102036688 A CN102036688 A CN 102036688A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- umbilical cord
- kidney
- treatment
- tissue
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/44—Vessels; Vascular smooth muscle cells; Endothelial cells; Endothelial progenitor cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0605—Cells from extra-embryonic tissues, e.g. placenta, amnion, yolk sac, Wharton's jelly
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
Abstract
提供了用于治疗至少一个肾脏患病或受损伤的患者的方法。所述方法包括给药从人脐带组织获得的细胞，或给药包括所述细胞或从所述细胞制备的药物组合物。给药时，所述细胞促进或支持患者患病的或受损伤的肾脏组织的修复和再生。也提供了用于本发明方法的药物组合物，以及用于实践所述方法的试剂盒。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2007年10月5日提交的美国临时专利申请号60/977775的优先权，在此通过引用并入其整体内容。
技术领域
本发明概括地涉及基于细胞的疗法领域。更具体而言，本发明涉及脐带组织来源的细胞在修复和再生患病的或受损伤的肾脏中的用途。
技术背景
本说明书通篇引用了多种出版物，包括专利、公开的申请、技术文章和学术文章。在此通过引用并入所有这些所引用的出版物整体，并用于多种目的。
肾脏疾病是一种严重的、医疗条件不能满足的疾病，每年美国的花费负担超过270亿美元。目前，超过4000万美国人濒临肾脏疾病的风险或患有肾脏疾病，且其发病率正以每年6％的令人担忧的速率增加。因此，到2020年，估计每四个人中就有一人将患有需要透析或肾脏移植的晚期肾脏疾病(ESRD)。为了减轻这些经济上的和医疗上的挑战，用于治疗急性肾功能衰竭(ARF)和慢性肾脏疾病(CKD)两种疾病的新颖的、转化的技术是必需的。
急性肾功能衰竭，也称作急性肾小管坏死，是一种影响高达7％的所有住院患者的常见综合征(Kelly et al.(2000)Semin.Nephrol.1：4-19)。ARF是肾脏排泄废物、浓缩尿液和保存电解质能力的突然丧失。ARF最常发生在个体被暴露于对肾脏有害的药物或缺血-再灌注事件之后。其他原因包括感染、尿路梗阻和某些血液和自身免疫紊乱。这些损害引起对肾脏的功能组件--肾单位的损伤。更具体而言，近端小管细胞变成坏死的。然后所述小管细胞从肾小管基底膜脱离，阻塞肾小管管腔。这种阻塞导致肾小管内压的增加，引起滤液从肾单位渗漏进入周围肾实质。肾单位功能的降低和肾脏组织中滤液的累积导致肾小球滤过率的降低，最终发生肾衰竭。尽管ARF是严重的、威胁生病的紊乱，但它是可逆的。
已经提出了几种治疗方法，目的在于减少或消除ARF。最值得注意的是，先进的透析技术被频繁地使用。尽管如此，经透析治疗的ARF患者中的死亡率仍然保持30-80％，表明透析在治疗ARF中具有小的治疗价值(Morigi et al.(2004)J.Am.Soc.Nephrol.15：1794-804)。此外，基于药理学的疗法诸如多巴胺、furosmide、甘露醇或心房钠尿肽给药在临床研究中已经失败了(Haug et al.(1993)Transplantation 55：766-772；Lieberthal andNigam(2000)Am.J.Physiol.Renal Physiol.278：F1-F12)。这些数据表明，传统的策略对开发ARF疗法而言是不充分的，必须应用新理论。
ARF之后肾功能的恢复取决于坏死的肾小管细胞被有功能性肾小管上皮的替换。损伤之后，肾小管能够自我修复，形成新的近端小管细胞以替换失败的或坏死的细胞。产生新肾小管细胞的祖细胞的起源是未知的。
然而，有可能的是，肾小管再生遵循所述的干细胞/短暂扩增细胞范例用于更快速的再生器官系统。
最近的研究已经证实，骨髓来源的间质干细胞(MSCs)是向肾的，并帮助修复药物和缺血引起的ARF之后的肾脏(Morigigi et al.2004)。最近也已经显示，对患有缺血/再灌注损伤的每只大鼠颈内动脉给药1×106MSCs导致显著改善的肾功能(Togel et al.(2005)Am.J.Physiol.Renal Physiol.289(1)：F31-42)。进一步显示，MSCs的保护作用是不依赖干细胞分化的，反而其保护作用是保护肾脏的营养因子分泌的结果。
不同于ARF，慢性肾脏疾病(CKD)是肾脏功能逐步的和渐进的损失。它通常是不可逆的，并最终导致晚期肾脏疾病。在美国，CKD正在变得日益常见，并且它是与不幸的健康结果和高的医疗费用相关的。国家肾脏基金会(National Kidney Foundation)估计2000万美国人患有CKD，并且至少另外的2000万人处于发展CKD的风险之中。如果不进行治疗，CKD可导致显著的贫血、电解质失衡、骨病、心血管疾病和肾功能衰竭的发病率和死亡率。
渐进的肾脏疾病起因于最初的疾病损失(例如，高血压)、随后对该损伤的不适合的肾脏响应的组合。所述响应包括促炎症反应和促纤维化的细胞因子和生长因子的产生。因此，减缓CKD进程的一种策略是改善炎症性和纤维化响应以及修复或逆转现存的肾脏损伤。已经表明了，生长因子给药可减缓CKD进程。例如，骨变形蛋白-7(BMP-7)在患有单向输尿管梗阻的大鼠中预防肾小管萎缩、间质性炎症和纤维化。相似地，BMP-7给药在狼疮性肾炎的MRL lpr/lpr小鼠模型中减少肾小管间质性纤维化和肾小球硬化。此外，已经表明肝细胞生长因子在多种肾脏损伤的动物模型中具有潜在的抗炎和抗纤维化效能。已经表现出治疗前途的其他因子包括转化生长因子-β1、血管内皮生长因子(VEGF)、结缔组织生长因子、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、白介素、肿瘤坏死因子和单核细胞趋化蛋白-1。这些研究均证实，生长因子给药对CKD的预防治疗而言是有前途的治疗方法。
尽管现存的医疗治疗选项，死亡率仍然非常高，并且肾脏疾病的发病率仍在上升。因此，本领域存在改善的、潜在的治愈性疗法的需要。现在，没有治疗介入试图使肾脏疾病的进程停止或甚至逆转。本发明提供表现极大的肾脏保护前途的治疗方法，它促进内源性肾脏再生、替换坏死的肾脏细胞并最终防止ESRD。
发明概述
根据一个方面，本发明提供了用于治疗至少一个肾脏患病或受损伤的患者的方法。例如，对肾脏的损伤可包括由年龄、创伤、毒素暴露、药物暴露、射线暴露、氧化、免疫复合物沉积或移植排斥引起的损伤。所述方法包括为所述患者给药治疗疾病或损伤有效量的脐带组织来源的细胞。从中获得所述细胞的脐带组织优选为基本没有血的。所述脐带组织来源的细胞优选能够在培养中自我更新和扩增，并具有分化的潜能，例如分化成肾脏表型；需要L-缬氨酸用于生长；可在至少约5％氧气中生长；不产生CD117或HLA-DR；表达α平滑肌肌动蛋白；并相对于人成纤维细胞、间质干细胞、或髂嵴骨髓细胞表达氧化水平增加的低密度脂蛋白受体1、白介素8或浆膜蛋白(reticulon)1。在一些实施方式中，所述脐带组织来源的细胞表达氧化低密度脂蛋白受体1、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3、和/或粒细胞趋化蛋白2。在优选的方面，所述脐带组织来源的细胞表达CD10、CD13、CD44、CD73和CD90。在一些实施方式中，所述脐带组织来源的细胞在给药患者之前，在体外被诱导分化成肾谱系细胞。所述脐带组织来源的细胞可通过遗传工程表达促进肾脏组织修复和/或再生的基因产物。在本发明的一些实施方式中，所述脐带组织来源的细胞是与至少一种其他细胞类型一起给药的，所述其他细胞类型包括但不限于近端小管上皮细胞、享勒袢上皮细胞、远端小管细胞、集合管细胞、肾小球壁细胞、肾小球足细胞、肾小球膜细胞、血管内皮细胞、间质细胞(intersticial cell)或其他多能的或多能干细胞。所述至少一种其他细胞类型可与所述脐带组织来源的细胞同时、或其之前、或其之后给药。在本发明的一些方面，所述脐带组织来源的细胞是与至少一种药物一起给药的。所述药物可与所述脐带组织来源的细胞给药的同时、其之前或其之后给药。在本发明的一些优选方面，所述脐带组织来源的细胞对患者的肾脏发挥营养作用。根据本发明的一些方面，所述细胞可通过注射或输注给药。在一些实施方式中，可将所述细胞封装于可植入装置中给药。在本发明的一些实施方式中，所述细胞可通过植入包括所述细胞的装置给药。
根据本发明的另一方面，本发明提供了治疗至少一个肾脏患病或受损伤的患者的方法，其包括为所述患者给药包括可溶性细胞碎片、裂解物、细胞外基质或从脐带组织来源的细胞制备的条件培养基的组合物，其中所述脐带组织基本上不含血，且其中所述细胞能够在培养中自我更新和扩增，并具有分化的潜能；需要L-缬氨酸用于生长；可在至少约5％氧气中生长；不产生CD117或HLA-DR；表达α平滑肌肌动蛋白；并相对于人成纤维细胞、间质干细胞、或髂嵴骨髓细胞表达水平增加的氧化低密度脂蛋白受体1、白介素8或浆膜蛋白1。
根据另一方面，本发明提供了用于治疗至少一个肾脏患病或受损伤的患者的药物组合物，所述组合物包括药学上可接受的载体和治疗所述疾病或损伤有效量的脐带组织来源的细胞，其中所述脐带组织基本上不含血，且其中所述细胞能够在培养中自我更新和扩增，并具有分化的潜能；需要L-缬氨酸用于生长；可在至少约5％氧气中生长；不产生CD117或HLA-DR；表达α平滑肌肌动蛋白；并相对于人成纤维细胞、间质干细胞、或髂嵴骨髓细胞表达水平增加的氧化低密度脂蛋白受体1、白介素8或浆膜蛋白1。在一些实施方式中，对肾脏的损伤可由年龄、创伤、毒素暴露、药物暴露、射线暴露、氧化、免疫复合物沉积或移植排斥引起。在一些实施方式中，所述脐带组织来源的细胞在所述组合物制成制剂之前，在体外被诱导分化成肾谱系细胞。在一些实施方式中，所述脐带组织来源的细胞通过遗传工程表达促进肾脏组织修复和/或再生的基因产物。在一些实施方式中，所述药物组合物包括至少一种其他细胞类型。所述至少一种其他细胞类型可为但不限于近端小管上皮细胞、享勒袢上皮细胞、远端小管细胞、集合管细胞、肾小球壁细胞、肾小球足细胞、肾小球膜细胞、血管内皮细胞、间质细胞或其他多能的或多能干细胞。在一些优选实施方式中，所述药物组合物进一步包括至少一种药物。在一些优选实施方式中，所述药物组合物被制成用于注射或输注给药的剂型。在本发明所述药物组合物的一些优选实施方式中，可将所述脐带组织来源的细胞封装于可植入装置中。在本发明所述药物组合物的一些优选实施方式中，所述细胞被接种于基质中。
根据另一方面，本发明提供了用于治疗至少一个肾脏患病或受损伤的患者的药物组合物，其包括药学上可接受的载体和裂解物、细胞外基质或从脐带组织来源的细胞制备的条件培养基，其中所述脐带组织基本上不含血，且其中所述细胞能够在培养中自我更新和扩增，并具有分化的潜能；需要L-缬氨酸用于生长；可在至少约5％氧气中生长；不产生CD117或HLA-DR；表达α平滑肌肌动蛋白；并相对于人成纤维细胞、间质干细胞、或髂嵴骨髓细胞表达水平增加的氧化低密度脂蛋白受体1、白介素8或浆膜蛋白1。
根据另一方面，本发明提供了用于治疗至少一个肾脏患病或受损伤的患者的试剂盒，其包括药学上可接受的载体、治疗所述疾病或损伤有效量的脐带组织来源的细胞，其中所述脐带组织基本上不含血，且其中所述细胞能够在培养中自我更新和扩增，并具有分化的潜能；需要L-缬氨酸用于生长；可在至少约5％氧气中生长；不产生CD117或HLA-DR；表达α平滑肌肌动蛋白；并相对于人成纤维细胞、间质干细胞、或髂嵴骨髓细胞表达水平增加的氧化低密度脂蛋白受体1、白介素8或浆膜蛋白1，以及在治疗至少一个肾脏患病或受损伤的患者的方法中使用所述试剂盒的指导。在一些实施方式中，所述试剂盒包括用于培养所述细胞的至少一种试剂和指导。在一些实施方式中，所述试剂盒包括至少一种其他细胞类型的群。在一些实施方式中，所述试剂盒包括至少一种药物。
本发明同样提供了用于治疗至少一个肾脏患病或受损伤的患者的试剂盒，其包括药学上可接受的载体、裂解物、细胞外基质或由从人脐带组织获得的脐带组织来源的细胞制备的条件培养基，其中所述脐带组织基本上不含血，且其中所述细胞能够在培养中自我更新和扩增，并具有分化的潜能；需要L-缬氨酸用于生长；可在至少约5％氧气中生长；不产生CD117或HLA-DR；表达α平滑肌肌动蛋白；并相对于人成纤维细胞、间质干细胞、或髂嵴骨髓细胞表达水平增加的氧化低密度脂蛋白受体1、白介素8或浆膜蛋白1，以及在治疗至少一个肾脏患病或受损伤的患者的方法中使用所述试剂盒的指导。
本发明的前述和其他特征和优点将从下面的、本发明优选实施方式的更具体描述中变得明白，如在附图中图解说明的。
附图简述
图1显示执行肾脏损伤和修复实验的时间线。黑箭头指示注射顺铂、细胞或HBSS溶媒的时间，以及抽血和尸检发生的时间。
图2显示诱导肾脏损伤和脐带组织来源的细胞移植后的动物存活率。治疗组动物数显示在x-轴上。
图3显示小鼠的BUN测量。在细胞移植后的第1、3、5和7天时收集血清样品并测量BUN。误差棒代表SEM。
图4显示来自血清肌酸酐测量的结果。误差棒代表平均值的标准误差。(*)P＜0.03。
图5显示代表性的组织学图像。根据肾小管变性程度对组织切片打分A)溶媒治疗组。B)hUTC(0.2e6细胞剂量)治疗组。代表性的肾小管具有显著的变性。
图6显示大鼠的BUN分析。误差棒代表平均值的标准误差。**p值＜0.005。*p值＜0.03。
图7显示大鼠的SCr分析。误差棒代表平均值的标准误差。**p值＜0.005。*p值＜0.03。
图8显示大鼠的CrC1分析。误差棒代表平均值的标准误差。*p值＜0.03。
发明详述
本说明书和权利要求书通篇使用了涉及本发明的方法和其他方面的多种术语。除另有说明外，所述术语是以它们在本领域的普通含义给出的。其他特别定义的术语将以与在此提供的定义一致的方式进行解释。
如说明书和所附的权利要求书中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数指示物，除非内容给出了清楚的指示。因此，例如，提到“细胞”包括两个或更多细胞的组合，等等。
在此所用的术语“约”，当指测量数值诸如量、短暂的持续时间等时，意味着包括偏离指定数值的±20％或±10％的变异，更优选±5％，甚至更优选±1％，还更优选±0.1％，像这样的变异适合于进行本公开的方法。
所用“来源的”是指已经从它们的生物来源获得并在培养中生长、扩增，永生的，或以其他方式在体外操作的细胞。
“经分离的”是指“通过人工”从天然状态改变的。如果分子或组合物是天然存在的，如果它已经改变了或远离了它的原始环境，或者两种情况均存在，则它已经“经分离”了。
术语核酸分子或基因的“表达”“表达了”或“表达”是指基因产物的生物合成，例如，多肽的生物合成。
“营养因子”是促进细胞存活、生长、分化、增殖和/或成熟、或刺激细胞增加的生物活性的物质。
“损伤”是指对肾脏的任何身体伤害、损害、变性或创伤。
“病理学”是指细胞、组织、器官或系统偏离正常状态的任何结构的或功能的标记，如通过适合于本领域的任何方法所测量的。
“疾病”是指细胞、组织、器官、系统或生物体整体在健康、状态或功能方面的任何偏离或病损。
肾脏的“原发病”是指起源于肾脏，以肾脏为专有靶标、基本专有靶标或基本靶标的任何疾病。
肾脏的“继发病”是指肾脏不是原发病的任何疾病。经由实例但不是限制性的，所述疾病可能以肾脏为非专有靶标、偶然靶标，扩散于肾脏或以别的方式影响肾脏。该术语包括源于感染或身体其他器官或系统疾病的肾脏疾病，或源于引起、支持或增强肾脏病理学的全身性疾病的肾脏疾病。
“肾脏”是指或涉及一个或更多肾脏。
“治疗”是指在疾病、损伤或状况的弱化或改善方面的任何成功或成功的标记，包括任何客观的或主观的参数诸如症状的减轻、缓和、减少，或使得疾病、损伤或状态对患者而言更能耐受，减缓恶化或衰弱的速率，使得恶化的终点更衰弱，改善受试者的身体或精神的健康，或延长存活的长度。症状的治疗或改善可基于客观的或主观的参数；包括体检的结果、神经系统检查和/或精神病学评价。
“有效量”或“治疗有效量”在此可互换使用，并是指在此所述的化合物、材料或组合物对达到特定的生物学结果有效的量，所述特定的生物学结果诸如，但不限于，在此公开的、描述的或举例说明的生物学结果。所述结果可包括，但不限于，受试者中肾脏疾病或损伤的治疗，如通过适合于本领域的任何方法所测量的。
“药学上可接受的”是指从药理学/毒理学角度能够为患者所接受以及从关于组合物、处方、稳定性、患者的接受性和生物利用度的物理/化学角度能够为制药化学家所接受的那些性质和/或物质。“药学上可接受的载体”是指不干扰活性成分生物活性的有效性并且对给药的宿主没有毒性的媒介。
根据本发明已经发现，受损的肾脏可通过给药脐带组织来源的细胞而得以修复和再生，从而逆转急性肾功能衰竭并增强已经患有肾脏损害的动物存活。也已经进一步地发现了，将所述细胞给药所述动物将受损害动物的血尿素氮和血清肌酸酐水平正常化。相应地，本发明描述了用于治疗至少一个肾脏患病或受损伤的受试者的方法的特征。一般而言，所述方法包括将治疗有效量的脐带组织来源的细胞给药所述受试者，从而发生受折磨的肾脏的修复和/或再生。
哺乳动物的脐带可在足月妊娠或早产妊娠的终点时或终点之后立刻回收，例如在分娩娩出或剖宫产术手术移除之后。在细胞分离之前，除去脐带组织中的血和碎片，例如通过采用任何适宜的媒介或缓冲液清洗。
可通过机械力或通过酶消化将细胞从脐带组织中分离出来。优选的酶是金属蛋白酶、中性蛋白酶和粘液溶解性蛋白酶。例如，可使用胶原酶、分散酶和透明质酸酶的多种组合以将细胞从脐带组织分离出来。技术人员将理解，用于从多种组织来源分离细胞的许多这样的酶处理在本领域是已知的。例如，
Blendzyme(Roche)系列的酶组合适用于本方法。酶的其他来源是已知的，技术人员也可直接从它们的天然来源获得这样的酶。技术人员也是充分装备的以获得新的或另外的酶或酶组合，为了它们在分离本发明细胞中的效用。优选的酶处理是0.5、1、1.5或2小时或更长时间。
经分离的细胞可被用于开始细胞培养。将经分离的细胞转移至无菌的组织培养容器中，不覆盖或覆盖有细胞外基质或配体诸如层粘连蛋白、胶原(天然的、变性的或交联的)、明胶、纤连蛋白和其他细胞外基质蛋白质。将脐带组织来源的细胞培养于能够维持所述细胞生长的任何培养基中，所述培养基诸如，但不限于，DMEM(高或低葡萄糖)、高级DMEM、DMEM/MCDB 201、Eagle′s基础培养基、Ham’s F10培养基(F10)、Ham′s F-12培养基(F12)、Hayglick培养基、Iscove改良的达尔贝科培养基、间质干细胞生长培养基(MSCGM)、DMEM/F12、RPMI 1640和CELL-GRO-FREE。
所述培养基可采用一种或更多组分进行补充，所述组分包括，例如胎牛血清(fetal bovine serum)，优选约2-15％(v/v)；马血清；人血清；胎牛血清(fetalcalf serum)；β-巯基乙醇，优选约0.001％(v/v)；一种或更多生长因子，例如，血小板来源的生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、白细胞抑制因子(LIF)和促红细胞生成素(erythropoietin)；氨基酸，包括L-缬氨酸；以及一种或更多抗生素和/或抗霉菌剂以控制微生物污染，诸如，例如青霉素G、硫酸链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素，单独使用或组合使用。
将所述细胞以允许细胞生长的密度接种于培养容器中。在一个实施方式中，所述细胞在空气中CO2的体积百分数为约0至约5下培养。在一些实施方式中，所述细胞在空气中O2的百分数为约2至约25下培养，优选空气中O2的百分数为约5至约20。所述细胞优选在约25℃至约40℃下培养，更优选在37℃下培养。所述培养容器中的培养基可为静态的或搅动的，例如使用生物反应器。脐带组织来源的细胞优选在低氧化性应激(例如，添加有谷胱甘肽、维生素C、过氧化氢酶、维生素E、N-乙酰半胱氨酸)下生长，意味着对所培养的细胞没有或最小的游离基损伤。
可将脐带组织来源的细胞传代或移动至另外的培养容器中，所述另外的培养容器含有与最初使用的相同或不同类型的新鲜培养基，在所述另外的培养容器中所述细胞群可进行有丝分裂扩增。本发明的所述细胞可在介于0代和衰老之间的任何点使用。优选将所述细胞传代约3至约25次，更优选传代约4至约12次，并优选传代10或11次。可进行克隆和/或亚克隆以证实已经分离得到细胞的克隆易群。
可将脐带组织中存在的不同细胞类型分为亚群。这可通过使用用于细胞分离的标准技术来完成，所述标准技术包括，但不限于，酶处理；克隆和具体细胞类型的选择，例如但不限于基于形态学和/或生化标记物的选择；所需细胞的选择性生长(阳性选择)，不需要的细胞的选择性破坏(阴性选择)；基于在混合的细胞群中有差别的细胞可凝集性的分离，例如，采用大豆凝集素；冻融程序；在混合的细胞群中有差别的细胞粘附性质；过滤；常规的和区带离心法；离心冲洗(逆流离心)；单位重力分离；反流分布法；电泳；荧光激活细胞分选术(FACS)；等。
从脐带组织中分离的细胞的实例于2004年6月10日保藏在theAmerican Type Culture Collection，并指定了如下的ATCC登录号：(1)将菌株名称UMB 022803(P7)指定为登录号PTA-6067；以及(2)将菌株名称UMB 022803(P17)指定为登录号PTA-6068。
脐带组织来源的细胞可通过如下途径来鉴定，例如，通过生长特性(例如，群体倍增能力、倍增时间、传代至衰老)、核型分析(例如，正常核型、母源谱系或新生儿谱系)、流式细胞术(例如，FACS分析)、免疫组织化学和/或免疫细胞化学(例如，用于检测表型)、基因表达谱(例如，基因芯片阵列、聚合酶链反应(例如，逆转录酶PCR、实时PCR和常规PCR))、蛋白质阵列、蛋白质分泌(例如，通过血浆凝固试验或PDC条件培养基的分析，例如通过酶联免疫吸附试验(ELISA))、混合淋巴细胞反应(例如，作为PBMCs的刺激的测量)，和/或本领域已知的其他方法。
在多个方面，所述脐带组织来源的细胞具有下列生长特征中的一个或更多：在培养物中需要L-缬氨酸用于生长，能够在含约5％至至少约20％的氧气的气氛中生长，在达到衰老之前具有在培养物中至少倍增约40倍的潜能，并且在覆盖的或无覆盖的组织培养瓶中粘附和扩增，其中所述覆盖的组织培养瓶包括明胶、层粘连蛋白、胶原、多鸟氨酸、玻连蛋白或纤连蛋白。
在某些实施方式中，所述细胞具有正常核型，随着细胞的传代核型保持。核型分析对鉴别和区分来自基于胎盘的母细胞的新生儿细胞是特别有用的。核型分析的方法是可用的并且是本领域的技术人员已知的。
在其他实施方式中，所述细胞的特征可为某些蛋白质的产生，包括组织因子、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白中至少一种的产生，以及CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、PD-L2和HLA-A、B、C细胞表面标记物中至少一种的产生，如通过流式细胞术检测的。在其他实施方式中，所述细胞的特征可为缺乏CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G和HLA-DR、HLA-DP和/或HLA-DQ细胞表面标记物中至少一种的产生，如通过任何适宜的方式诸如流式细胞术检测的。特别优选的是产生组织因子、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白中至少两种的细胞。更优选的是产生蛋白质组织因子、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白中所有三种的那些细胞。
在其他实施方式中，相对于作为成纤维细胞、间质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞，所述细胞具有编码白介素8、浆膜蛋白1、趋化因子(C-X-C基序)配体1(黑色素瘤(melonoma)生长刺激活性，α)、趋化因子(C-X-C基序)配体6(粒细胞趋化蛋白2)、趋化因子(C-X-C基序)配体3、肿瘤坏死因子、α-诱导蛋白3、C-型凝集素超家族成员2、Wilms瘤1、醛脱氢酶1家族成员A2、肾素、氧化低密度脂蛋白受体1、智人克隆IMAGE：4179671、蛋白激酶Cζ、假设的蛋白质DKFZp564F013、卵巢癌中下调的1和来自克隆DKFZp547k1113的智人基因中至少一种的基因的增强的表达。
在另一些其他实施方式中，相对于作为成纤维细胞、间质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞，所述细胞具有编码下列中至少一种的基因的减少的表达：身材矮小症同源框2、热休克27kDa蛋白2、趋化因子(C-X-C基序)配体12(间质细胞来源的因子1)、弹性蛋白(瓣膜上主动脉狭窄，Williams-Beuren综合征)、智人mRNA、cDNA DKFZp586M2022(来自克隆DKFZp586M2022)、间充质同源域编码框2(生长停止特异的同源域编码框)、sine oculis同源框同系物1(果蝇属)、晶状体蛋白、αB、形态发生的散乱的关联活化剂2、DKFZP586B2420蛋白、类似于neuralin 1、四连接素(纤溶酶原结合蛋白)、src同源三(SH3)和半胱氨酸富集结构域、胆固醇25-羟化酶、runt-相关的转录因子3、白介素11受体α、前胶原C-内肽酶增强子、翻毛同系物7(果蝇属)、假设的基因BC008967、类型VIII α1胶原、腱糖蛋白C(六聚臂蛋白)、依洛魁族人同源框蛋白5、亚铁氧化酶(hephaestin)、整联蛋白β8、突触囊泡糖蛋白2、神经母细胞瘤致瘤性1的抑制、胰岛素样生长因子结合蛋白2(36kDa)、智人cDNA FLJ12280 fis克隆MAMMA1001744、细胞因子受体样因子1、钾中间的/小的传导力钙-活化的传代亚家族N成员4、整联蛋白β7、含PDZ-结合基序的转录辅激活因子(TAZ)、sine oculis同源框同系物2(果蝇属)、KIAA1034蛋白、囊泡相关的膜蛋白5(myobrevin)、含EGF的腓骨蛋白(fibulin)-样细胞外基质蛋白1、早期生长响应3、远端较小的同源域编码框5、假设的蛋白FLJ20373、醛酮还原酶家族1成员C3(3-α羟基固醇脱氢酶类型II)、二聚糖、含PDZ结合基序的转录辅激活因子(TAZ)、纤连蛋白1、前脑啡肽、整联蛋白β-样1(含EGF-样重复结构域)、智人mRNA全长插入片段cDNA克隆EUROIMAGE 1968422、EphA3、KIAA0367蛋白、钠尿肽受体C/鸟苷酸环化酶C(房钠尿肽受体C)、假设的蛋白FLJ14054、智人mRNA、cDNA DKFZp564B222(来自克隆DKFZp564B222)、BCL2/腺病毒E1B19kDa干扰蛋白3-样、AE结合蛋白1和细胞色素c氧化酶亚基VIIa多肽1(肌肉)。
在一些实施方式中，所述细胞的特征为MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1a、RANTES和TIMP1中至少一种的分泌。在一些实施方式中，所述细胞的特征为缺乏TGF-β2、ANG2、PDGFbb、MIP1b、I309、MDC和VEGF中至少一种的分泌，如通过ELISA检测的。
在优选的实施方式中，所述细胞包括上面所列生长、蛋白质/表面标记物的产生、基因表达或物质分泌特征中的两种或更多。更优选的是包括三、四或五或更多种所述特征的那些细胞。甚至更优选的是包括六、七或八种所述特征的那些细胞。甚至更优选的是包括所有上述特征的那些细胞。
在优选用于本发明多个方面的细胞中，是具有上述特征的细胞，更特别的是那些其中所述细胞具有正常核型并随着传代保持正常核型的细胞，并且此外，其中所述细胞表达标记物CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A、B、C中的每一种，其中所述细胞产生免疫可检测的蛋白，所述蛋白相应于所列的标记物。还更优选的是除前述外不产生相应于标记物CD31、CD34、CD45、CD117、CD141或HLA-DR、DP、DQ中任一种的蛋白质的那些细胞，如通过本领域任何适宜的方式诸如流式细胞术检测的。高度优选的是不表达CD117或HLA-DR的细胞。
在高度优选的方面，所述方法包括为需要治疗至少一个患病的或受损伤的肾脏的受试者给药从人脐带组织获得或分离的细胞，其中所述细胞能够在培养中自我更新和扩增，需要L-缬氨酸用于生长，可在至少约5％氧气中生长，不产生CD117或HLA-DR，表达α平滑肌肌动蛋白，并相对于人成纤维细胞、间质干细胞、或髂嵴骨髓细胞表达水平增加的氧化低密度脂蛋白受体1、白介素8或浆膜蛋白1。可在给药之前，将从人脐带组织分离出的细胞在培养中进行扩增。在一些实施方式中，从人脐带组织获得的所述细胞具有分化为至少一个肾脏表型的细胞的潜能。可使用Pax-2的表达，由肾上皮祖细胞表达的转录因子，鉴别脐带组织来源的细胞向肾脏表型或肾细胞谱系的分化。同样可通过三维胶原凝胶中的血管生成和分支形态发生来证实脐带组织来源的细胞的肾细胞分化。
某些细胞具有沿着导致多种表型的细胞系分化的潜能，它们是不稳定的，因此它们可自发地分化。目前优选用于本发明的是不自发分化的细胞，例如沿着肾脏细胞系。优选的细胞，当在生长培养基中生长时，就在它们表面产生的细胞标记物和多种基因的表达模式而言，是基本稳定的，例如使用基因表达谱测定的，例如，通过使用核酸或多肽阵列。所述细胞基本保持恒定，例如传代期间、经过倍式群体倍增过程中它们的表面标记物物特征。
在本发明方法中，所述脐带组织来源的细胞可与其他治疗细胞和/或生物活性剂诸如抗血栓形成剂、抗细胞凋亡剂、抗炎剂、免疫抑制剂(例如，环孢菌素、雷帕霉素)、抗氧化剂或本领域常用于治疗肾脏损伤或疾病的其他药物诸如伊罗地塞(eprodisate)和雷公藤内酯联合给药。脐带组织来源的细胞可与HMG-CoA还原酶抑制剂联合给药，所述HMG-CoA还原酶抑制剂包括但不限于辛伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀、氟伐他汀、西立伐他汀和阿托伐他汀。所述脐带组织来源的细胞可与其他细胞或药物顺序给药或同时给药。适当时也可为患者给药裂解物、可溶性细胞碎片、膜浓缩的细胞碎片、细胞培养基(例如，条件培养基)或来源于脐带组织来源的细胞的细胞外基质，包括与脐带组织来源的细胞本身和另外的细胞或药物同时给药。所选择的特定药物可由直接治疗患者的医学技术人员决定，并可根据特定需要或患者的状况而发生变化。所选择的药物可被用于多种目的诸如，但不限于，促进所述细胞的给药，改善肾脏的修复和/或再生，改善患者的整体健康，减轻疼痛，减轻或防止所移植的细胞的排斥等。
肾脏组织修复和再生的易化可经由脐带组织来源的细胞分泌的营养因子。例如，保护肾脏的效能可参照经由脐带组织来源的细胞旁分泌或营养因子介导的机理。所述因子包括，例如，肝细胞生长因子(HGF)、骨变形蛋白-7(BMP-7)、转化生长因子β(TGF-β)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。脐带组织来源的细胞给药可提供一种或更多保护肾脏的因子的持续释放。由脐带组织来源的细胞提供的保护肾脏的因子的营养支持或释放可被用于代替一种或更多保护肾脏的因子的给药，或在一种或多种保护肾脏的因子给药之外使用。
所述方法具有治疗肾脏损伤的实用性。所述方法具有治疗肾脏损伤包括急性肾功能衰竭或损害或导致病态或缩短预期寿命的慢性肾脏疾病。可通过本发明修复并逆转的损伤的一些非限制性实例包括手术除去肾脏的任何部分(或所有部分)、药物诱导的损伤、毒素诱导的损伤、辐射诱导的损伤、环境暴露诱导的损伤、声波损伤、热损伤、缺氧性损伤、氧化损伤、病毒损伤、年龄或老化相关的损伤、炎症诱导的损伤、免疫细胞诱导的损伤，例如，移植排斥、免疫复合物诱导的损伤等。与肾脏病理学相关的五种主要药物类别是靶向血液动力学、代谢、纤维变性、炎症或免疫调节过程的药物。脐带组织来源的细胞可通过作用于一种或更多的这些生理过程而发挥它们的作用。
所述细胞可以药物/治疗细胞组合物的形式给药，其包括药学上可接受的载体和在此所述和例证说明的脐带组织来源的细胞。治疗细胞组合物可包括被诱导沿着肾脏细胞途径或谱系分化的脐带组织来源的细胞。所述治疗细胞组合物可包括刺激患者肾脏中的细胞分裂、分化的细胞或细胞产物，或同时包括这样的细胞或细胞产物。优选给药时诱导、促进或支持患者的肾脏修复和/或再生的治疗细胞组合物。
所述细胞可通过注射为患者给药。例如，所述细胞可被直接注射患者的一个或两个肾脏，或可在肾脏的表面注射进入邻近区域或甚至随后迁移至患者肾脏的更远区域。在一些优选的方面，所述细胞可回归至患病的或受损伤的区域。特别优选的是可静脉注射并适当地定位于预期的作用位点的细胞，例如肾脏细胞或它们的前体优选能够定位并回归至肾脏或其结构或亚结构。
所述细胞也可以装置诸如基质-细胞复合物的形式给药。装置材料包括但不限于生物吸收性材料诸如胶原、35/65聚(ε-己内酯)(PCL)/聚(乙醇酸)(PGA)、PanacrylTM生物吸收性构成物、VicrylTM羟基乳酸聚合物910和自组装肽以及非吸收性材料诸如氟聚合物(例如，
氟聚合物)、塑胶和金属。基质包括生物相容性支架、格子、自组装结构等，不论生物吸收性或非生物吸收性的液体、凝胶或固体。所述基质在治疗学细胞治疗、手术修复、组织工程和伤口愈合领域是已知的。优选地，所述基质是采用所述治疗学细胞预处理的。更优选地，所述基质是和与基质或其空间密切相关的细胞一起居住的。所述细胞可附着于所述基质或可被俘获或包含于所述基质空间之内。最优选的是基质-细胞复合物，在其中所述细胞的生长与所述基质密切相关，并且当用于治疗时，患者自己的肾脏细胞的生长、修复和/或再生被刺激和支持，适当的血管发生被相似地刺激或支持。所述基质-细胞组合物可以本领域已知的任何方式被引入患者体内，包括但不限于植入、注射、手术附着、与其他组织一起移植等。在一些实施方式中，根据本发明可使用体内的基质形式、或甚至更优选原位，例如原位可聚合的凝胶。所述凝胶的实例是本领域已知的。
可将本发明的所述细胞接种于这样的三维基质中，诸如支架和被植入体内的，其中所接种的细胞可在框架上或框架中增殖，或有助于建立体内置换组织，与其他细胞协同或不与其他细胞协同。脐带组织来源的细胞在三维框架上的生长导致三维组织的形成或建立，这可被体内利用，例如用于修复和/或再生受损伤的或患病的组织。例如，可使用三维支架以形成管状结构，例如用于肾脏血管的修复，或肾脏系统或肾脏结构的多种其他方面。
可将所述细胞接种于三维框架或基质上，诸如支架、泡沫状物或水凝胶，并相应地给药。可将所述框架塑造成多种形状，诸如大体上扁平的、大体上圆柱状的或管状的形状，或可为完全自由的形式，因为可要求或期望所述框架用于在考虑中的矫正结构。可将两个或更多大体上扁平的框架放置于另一个的顶上并一起固定以产生多层框架。
在一些方面，所述细胞生长于所述三维结构上，在一些方面，所述细胞只能存活或甚至死亡，尽管如此它们仍可刺激或促进肾脏组织的修复和再生，例如，优选地促进或支持血管形成。
在这样的三维框架上，所述细胞可与其他肾脏细胞类型或其他软组织类型前体包括干细胞同时给药。当在这样的三维系统中生长时，增殖的细胞成熟并适当地分离以形成类似于体内天然形成的成熟组织的组分。
可将在此所描述和例证说明的基质如此设计，所述基质结构支持脐带组织来源的细胞，而没有随后的降解，从接种的时间直至组织移植物被宿主组织改型均支持所述细胞，或允许所接种的细胞附着、增殖并发展成组织结构，所述组织结构具有足够的机械完整性以在体外支持其自身，在该时间点，所述基质退化。
在此考虑使用的基质、支架、泡沫状物和自组装系统可与任何一种或多种细胞、生长因子、药物或其他组分组合植入，所述其他组分诸如促进愈合、再生、修复、或组织的向内生长、或刺激血管形成或其神经支配或在其他方面增强或改善本发明的治疗结果或实践，除本发明的细胞外。在一个优选的方面，将包括一种或更多HMG CoA还原酶抑制剂的装置与脐带组织来源的细胞一起接种。可将所述HMG CoA还原酶抑制剂泵入到所述装置中。可将一种或更多HMG CoA还原酶抑制剂并入到所述装置中。
在一些实施方式中，将与本发明细胞一起被接种的装置用一种或更多HMG CoA还原酶抑制剂处理。可将所述装置进行体内植入。
所述细胞可在培养中自由地生长、从培养中除去并被接种于三维框架中。含一定浓度细胞的三维框架的接种，例如，大约106至5×107细胞每毫升，优选地导致所述三维支持物在相对较短的时间周期内建立。此外，在一些应用中，可优选使用更大或较小数目的细胞，取决于期望的结果。
在一些方面，在培养中重新形成在体内发现的细胞微环境是有用的，如此以来，所述细胞在植入体内之前生长或用于体外的程度可发生变化。可在细胞形成期望用于植入的形状(例如，绳、导管、细丝等)之前或之后，将所述细胞接种于所述框架中。在将所述细胞接种于所述框架之后，优选将所述框架在适宜的生长培养基中孵育。在孵育期，所接种的细胞将生长并包封所述框架，并可例如架桥或在其中的任何细胞间隙部分架桥。优选但不是要求的，使细胞生长至反映正在被修复或再生的肾脏组织体内细胞密度的适宜程度。在其他实施方式中，所述细胞的存在，即使在框架中以较低的数目存在，助长内源健康细胞的向内生长以促进例如受损伤或受损害的组织的愈合。
基质的实例，例如可被用于本发明方面的支架，包括垫子(编织的、针织的，更优选非编织的)多孔或半多孔泡沫状物、自组装肽等。非编织的垫子，例如，可使用包括天然或合成聚合物的纤维来形成。在一个优选的实施方式中，使用了乙醇酸和乳酸(PGA/PLA)的可吸收共聚物(以商品名
(Ethicon，Inc.，Somerville，NJ)出售)以形成垫子。如美国专利号6355699中所讨论的，通过诸如冷冻-干燥或冻干工艺形成的泡沫状物，包括例如聚(ε-己内酯)(PCL)/聚(乙醇酸)(PCL/PGA)共聚物，也可用作支架。凝胶也可形成适宜的基质，如在此所用的。实例包括原位可聚合的凝胶和水凝胶，例如包括自组装肽。这些材料经常被用作组织生长的支持物。原位形成的可降解网状物也适用于本发明(参见，例如，Anseth，K.S.et al，2002，J.Controlled Release 78：199-209；Wang，D.等人2003，Biomaterials 24：3969-3980；美国专利出版物2002/0022676to He等人)。将这些材料制成适宜用于注射的液体，然后可通过多种方法(例如，温度、pH的变化，暴露于光)诱导在原位或体内形成可降解的水凝胶网络状物。
所述框架可为毡垫圈，它可包括由生物吸收性材料制成的复丝(multifilament yarn)，例如，PGA、PLA、PCL共聚物或掺和物，或透明质酸。使用标准的纺织工艺技术将所述丝制成毡垫圈，所述技术由卷曲、切割、梳理和针刺。可将本发明细胞接种于泡沫状支架上，所述支架可为复合材料结构。此外，可将所述三维框架塑造成有用的形状，诸如在待修复、替换或增强的肾脏内或周围的特殊结构。
在接种本发明的细胞之前，可将所述框架进行处理以增强细胞附着。例如，在接种本发明的细胞之间，可将尼龙基质用0.1摩尔的醋酸处理并在聚赖氨酸、PBS和/或胶原中孵育以覆盖尼龙。可使用硫酸对聚苯乙烯进行相似地处理。
此外，可对所述三维框架的外表面进行改良以改善细胞的附着或生长以及组织的分化，诸如通过血浆覆盖框架或添加一种或更多蛋白质(例如，胶原、弹性纤维、网状纤维)、糖蛋白、葡糖氨基聚糖(例如，硫酸肝素、软骨素-4-硫酸盐、软骨素-6-硫酸盐、硫酸皮肤素、硫酸角质素)、细胞基质和/或其他材料，诸如但不限于，明胶、藻酸盐、琼脂、琼脂糖和植物胶，在其他材料之中。
所述支架可包括赋予其非血栓形成性的材料或采用这样的材料对其进行处理。这些处理和材料也可促进并支持内皮生长、迁移和细胞外基质沉积。这些材料和处理的实例包括但不限于天然材料诸如基膜蛋白诸如层粘连蛋白和IV型胶原、合成材料诸如ePTFE，以及分节的聚氨酯脲硅酮，诸如
(聚合物技术集团，Inc.，Berkeley，CA)。可将这些材料进行进一步处理以赋予所述支架非血栓形成性。这样的处理包括抗血栓药诸如肝素，以及改变所述材料表面电荷的处理诸如血浆覆盖。
多种类型胶原的不同比例，例如，沉积于框架中的、可能影响组织特异的或其他细胞的生长，以后可将这些细胞接种于框架中或可能在体内结构中生长。备选地，可采用细胞的混合物对框架进行接种，所述混合物合成期望的适当的胶原类型。取决于待培养的组织，可选择待接种于框架中的适当的胶原类型或由接种于其中的细胞产生的适当的胶原类型。例如，框架中存在的胶原纤维和弹性纤维的相对量可通过控制最初接种物中产生胶原的细胞与产生弹性蛋白的细胞的比率来调制。例如，由于动脉的内壁富含弹性蛋白，因此动脉支架应包含分泌弹性蛋白的平滑肌细胞的共培养。
接种过或接种过的本发明三维框架可用于从基质获得的培养细胞或体内培养的基质本身的移植或植入。根据本发明，所述三维支架可用于替换或增大现存的组织、引入新的或改变了的组织、修正人工假体或链接生物组织或结构。例如，但不是限制性的，所述三维框架可用于在体外构造单层和多层管状组织，所述管状组织可在体内用作受损伤的或患病的管状组织的替代物。
支架可被切割成长条(例如，矩形形状)，所述长条的宽度大约等于管状器官的内部周长，所述管状器官例如肾盏或输尿管，所述长条最终将被插入到所述管状器官中。可将所述细胞接种于所述支架上并通过漂浮或混悬于液体培养基中进行孵育。在融合的适当阶段，可通过将长边连接起来而将所述支架卷入小管中。通过使用适宜材料、适当直径的纤维将两边缝合而闭合接口处。
根据本发明，可将支架形成小管，与脐带组织来源的细胞一起接种，并混悬于位于孵育箱中的培养基中。为了防止细胞从管腔流出，可将管状框架的一个开放端附着于喷嘴。可将液体培养基通过该喷嘴从连接于孵育箱的源箱中压入以创造穿过所述管状框架内部的液体流。可将另一开放端附着于一个导入收集箱的流出孔，在该收集箱中所述培养基可被再循环穿过所述源箱。当孵育完成时，所述小管可与喷嘴和流出孔分离。该方法在Ballermann，B.J.等人的国际申请号WO 94/25584和美国申请系列号08/430768中进行了描述，在此通过引用并入二者整体作为参考。
一般而言，根据本发明使用任何下述方法，可将两个三维框架组合成小管。可将两个或更多扁平的框架放置在另一个顶上并缝合起来。然后可将该两层薄片卷起来并如上所述连接起来并固定。
可将用作内层的一个管状支架与脐带组织来源的细胞一起接种并孵育。第二支架可作为扁平长条生长，其宽度稍微大于所述管状框架的外部周长。在达到适当的生长后，可将扁平框架环绕在所述管状支架的外面，随后通过闭合所述扁平框架两边的接口处，优选地，将扁平框架固定于内部的小管。
直径稍微不同的两个或更多管状网孔可分别生长。可将具有较小直径的框架插入到具有较大直径的框架内并固定。
对于这些方法中的每一种而言，可通过将该方法再应用于双层小管而添加更多的层。可将所述支架在脐带组织来源的细胞生长的任何阶段进行组合，在需要时可将组合的支架继续孵育。
管状构造的内腔方面可包括赋予所述管状支架的内腔表面非血栓形成性的材料，或用这些材料处理所述管状构造的内腔方面。这些处理和材料也可促进并支持内皮生长、迁移和细胞外基质沉积。这些材料和处理的实例包括但不限于天然材料诸如基膜蛋白诸如层粘连蛋白和IV型胶原、合成材料诸如ePTFE，以及分节的聚氨酯脲硅酮，诸如(聚合物技术集团，Inc.，Berkeley，CA)。可将这些材料进行进一步处理以赋予所述管状支架非血栓形成性。这样的处理包括抗血栓药诸如肝素，以及改变所述材料表面电荷的处理诸如血浆覆盖。
在一些目前优选的实施方式中，所述方法包括诱导治疗学的产后来源的细胞沿着肾脏细胞途径分化，朝着肾脏细胞表型或前体或前述更原始的相关物(relatives)分化。所述治疗学细胞组合物可并入患者的肾脏，或备选地，可为天然存在的肾脏干细胞提供支持用于生长或刺激以进行分化。治疗学细胞可与细胞裂解物，或与其他同种异体的、同基因的或自体的细胞一起给药。以给药治疗学细胞组合物方式递送的细胞的存活不是成功或它们的用途结果的决定性因素，倒不如肾脏健康的改善或整体的患者健康是结果决定性的。因此，所述细胞不需要与患者的肾脏结合，或甚至并入血管，但治疗前和治疗后患者肾脏健康的改善标记包括肾脏健康的至少一种客观测量，所述客观测量诸如但不限于，血清或关于肌酸酐、尿素、蛋白、血尿素氮(BUN)的尿分析，渗透性化验以及患者情况的主观评价(包括自评价)方面的改善。
因此成功的治疗可包括采用包含脐带组织来源的细胞的治疗学细胞组合物对具有肾脏疾病、病状或创伤的患者进行治疗，在另一种细胞类型的存在下或不存在另一种细胞类型。例如，但不是限制性的，所述细胞优选至少部分并入患者、在患者中繁殖或存活。在其他优选的实施方式中，患者经历来自治疗的益处，例如来自所述细胞支持其他细胞生长的能力，包括肾脏中存在的干细胞或前体细胞，来自组织向内生长或组织的血管形成，以及来自有益细胞的因子、炎症趋化因子、细胞因子等的存在，但所述细胞不并入患者或在患者中繁殖。在一些方面，患者受益于采用所述细胞进行的治疗学治疗，但所述细胞不在患者中长时间存活。例如，在一个实施方式中，所述细胞在数量、生存力或生化活性方面逐渐衰退。在其他实施方式中，细胞的所述衰退可被活性周期领先，例如生长、分裂或生活活性。在其他实施方式中，衰老的、不能生存的或甚至死亡的细胞能够具有有益的治疗学作用。
给药优选在体内通过移植、植入、注射、输注、经由导管递送、或作为基质-细胞复合物提供、或本领域已知的任何其他方式提供细胞治疗。
在一些方面，本发明方法可进一步包括评价患者的肾脏结构和/或功能的改善，或整体健康的改善。所述评价可根据适用于本领域的任何方式进行，包括在此描述并例证说明的那些方式。
根据本发明同样描述了用于实践本发明方法的试剂盒的特征。在一个方面，提供了用于治疗至少一个肾脏患病或受损伤的患者的试剂盒。所述试剂盒包括药学上可接受的载体、治疗所述疾病或损伤有效量的从人脐带组织获得的细胞，诸如在此描述并例证说明的那些细胞，以及在治疗至少一个肾脏患病或受损伤的患者的方法中使用所述试剂盒的指导。所述试剂盒可进一步包括至少一种试剂和用于培养所述细胞的指导。所述试剂盒可进一步包括至少一种其他细胞类型的群，和/或至少一种药物。
在一些方面，所述试剂盒包括药学上可接受的载体、裂解物、细胞外基质或由从人脐带组织获得的细胞制备的条件培养基，其中细胞具有在此描述并例证说明的特征。所述试剂盒具有促进受损伤的或患病的肾脏修复和/或再生的效用。
提供了下面的实施例以更详细地描述本发明。它们是说明性的，不限制本发明。
实施例1
脐带组织来源的细胞的分离
脐带是从National Disease Research Interchange(NDRI，Philadelphia，PA)获得的。这些组织是在正常分娩之后获得的。细胞分离方案是在层流洁净工作台中在无菌条件下进行的。为了除去血液和碎片，将脐带在磷酸盐缓冲盐水(PBS；Invitrogen，Carlsbad，CA)中在抗真菌药和抗生素(100单位/毫升青霉素，100微克/毫升链霉素，0.25微克/毫升两性霉素B)存在下洗涤。然后将这些组织在150cm2组织培养皿中在50毫升培养基(DMEM-低葡萄糖或DMEM-高葡萄糖，Invitrogen)存在下进行机械离解，直至该组织被绞碎成细浆。将该剁碎的组织转移至50毫升锥形管中(大约每管5克组织)。然后将该组织在DMEM-低葡萄糖培养基或DMEM-高葡萄糖培养基中消化，每一种培养基中均含有如上所述的抗真菌药和抗生素。在一些实验中，使用了胶原酶和分散酶的酶混合物(“C∶D；”胶原酶(Sigma，St Louis，MO)，500单位/毫升；以及分散酶(Invitrogen)，50单位/毫升，于DMEM：-低葡萄糖培养基中)。在其他实验中，使用了胶原酶、分散酶和透明质酸酶(“C∶D∶H”)的混合物(胶原酶，500单位/毫升；分散酶，50单位/毫升；以及透明质酸酶(Sigma)，5单位/毫升，于DMEM：-低葡萄糖中)。将含有组织、培养基和消化酶的锥形管在37℃在定轨振荡器(Environ，Brooklyn，NY)上225rpm下孵育2小时。
消化后，将该组织在150×g下离心5分钟，吸出上清液。将沉淀再次混悬于20毫升生长培养基(DMEM：低葡萄糖(Invitrogen)，15％(v/v)胎牛血清(FBS，定义为牛血清，Lot#AND18475，Hyclone，Logan，UT)、0.001％(v/v)2-巯基乙醇(Sigma)、1ml/100ml的如上所述的抗生素/抗真菌药中。将该细胞混悬物过滤通过70-微米尼龙细胞过滤网(BD Biosciences)。使包含生长培养基的另外5毫升漂洗液通过该过滤网。然后将该细胞混悬物通过40-微米尼龙细胞过滤网(BD Biosciences)，并追加另外5毫升的生长培养基。
将该滤液再次混悬于生长培养基(总体积50毫升)中并在150×g下离心5分钟。吸出上清液并将细胞再次混悬于50毫升的新鲜生长培养基中。将该过程再重复两次。
在最后离心时，吸出上清液并将细胞沉淀再次混悬于5毫升新鲜生长培养基中。使用锥虫蓝染色测定存活细胞的数目。然后将细胞在标准条件下培养。
将从脐带分离出的细胞以5000细胞/cm2的密度在明胶-覆盖的T-75cm2培养瓶(Corning Inc.，Corning，NY)中接种于含如上所述的抗生素/抗真菌药的生长培养基中。2天(在不同实验中，将细胞孵育2-4天)后，从培养瓶中吸出用过的培养基。将细胞用PBS洗涤三次以除去碎片和血液来源的细胞。然后将细胞再次充满生长培养基并使其生长至融合(从0代起约10天)至1代。在随后的传代(从1代至2代等)中，细胞在4-5天内达到亚融合(75-85％融合)。对这些随后的传代而言，将细胞以5000细胞/cm2的密度接种。使细胞在含5％二氧化碳和大气氧的增湿培养箱中在37℃生长。
实施例2
通过流式细胞术进行的人产后来源的细胞表面标记物的评价
使用流式细胞术鉴定脐带组织以提供用于从中获得的细胞鉴别的图谱。
将细胞在含青霉素/链霉素的生长培养基(Gibco Carlsbad，CA)中培养。将细胞培养在血浆处理过的T75、T150和T225组织培养瓶(CorningCorning，NY)中直至融合。通过将2％(w/v)明胶(Sigma，St.Louis，MO)在室温孵育20分钟而将培养瓶的生长表面覆盖上明胶。
将培养瓶中的贴壁细胞在PBS中洗涤并用胰蛋白酶/EDTA分离。收集细胞、离心并以1×107每毫升的细胞浓度再次混悬于于PBS中3％(v/v)的FBS中。根据生产商的说明书，将目标细胞表面标记物的抗体(参见下面)加入到一百微升细胞混悬液中，并将该混合物在暗处、在4℃孵育30分钟。孵育后，将细胞用PBS洗涤并离心以除去未结合的抗体。将细胞再次混悬于500微升PBS中并通过流式细胞术分析。流式细胞术分析是采用FACScalibur仪器(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行的。
使用了细胞表面标记物的下列抗体。
抗体 生产商 目录号
CD10 BD Pharmingen(San Diego，CA) 555375
CD13 BD Pharmingen 555394
CD31 BD Pharmingen 555446
CD34 BD Pharmingen 555821
CD44 BD Pharmingen 555478
CD45RA BD Pharmingen 555489
CD73 BD Pharmingen 550257
CD90 BD Pharmingen 555596
CD117 BD Pharmingen 340529
CD141 BD Pharmingen 559781
PDGFr-α BD Pharmingen 556002
HLA-A，B，C BD Pharmingen 555553
HLA-DR，DP，DQ BD Pharmingen 555558
IgG-FITC Sigma(St.Louis，MO) F-6522
IgG-PE Sigma P-4685
将细胞在8、15和20代时进行分析，并将来自不同供体的脐带组织来源的细胞进行相互比较。此外，将在明胶覆盖的培养瓶中培养的细胞和在不覆盖的培养瓶中培养的细胞进行比较。
脐带组织来源的细胞显示CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A、B、C的阳性表达，这是由相对于IgG对照增加的荧光数值表征的。这些细胞对CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ的可检测表达而言是阴性的，这是由与IgG对照可比的荧光数值表征的。对阳性曲线荧光数值的变异进行了说明。阳性曲线的平均值(即，CD13)和范围(即，CD90)显示一些变异，但这些曲线看起来是正常的，证实了同源细胞群。两条曲线均各自地显示大于IgG对照的数值。
8、15和20代的细胞均表达CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A、B、C，这是由相对于IgG对照增加的荧光数值表征的。这些细胞对CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ是阴性的，这是由与IgG对照一致的荧光数值表征的。
来自单独供体的分离物均显示CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A、B、C的阳性表达，这是由相对于IgG对照增加的荧光数值反映的。这些细胞对CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ的表达而言是阴性的，它们具有与IgG对照一致的荧光数值。
在明胶覆盖的和不覆盖明胶的培养瓶中扩增的细胞对CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A、B、C的表达而言均是阳性的，它们具有相对于IgG对照增加的荧光数值。这些细胞对CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ而言是阴性的，它们具有与IgG对照一致的荧光数值。
因此，脐带组织来源的细胞对CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A、B、C而言是阳性的，对CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ而言是阴性的。该鉴别变量的变异之间是一致的，所述变量包括供体、传代和培养容器表面覆盖层。在个体荧光数值直方图中观察到了平均值和范围的一些变异，但在所有所测试条件下的所有阳性曲线是正常的并表达大于IgG对照的荧光数值，从而证实了所述细胞包括具有所述标记物阳性表达的同源细胞群。
实施例3
细胞表现型的免疫组织化学鉴定
将人脐带组织收集并浸没固定于4％(w/v)低聚甲醛中在4℃过夜。使用直接对抗下列表位的抗体进行免疫组织化学：波形蛋白(1∶500；Sigma，St.Louis，MO)、结蛋白(1∶150，对抗家兔增高的；Sigma；或1∶300，对抗小鼠增高的；Chemicon，Temecula，CA)、α-平滑肌肌动蛋白(SMA；1∶400；Sigma)、细胞角蛋白18(CK18；1∶400；Sigma)、von Willebrand因子(vWF；1∶200；Sigma)和CD34(人CD34III类，1∶100，DAKOCytomation，Carpinteria，CA)。此外，测试了下列标记物：抗人GROα-PE (1∶100；Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)、抗人GCP-2(1∶100；Santa Cruz Biotech，Santa Cruz，CA)、抗人氧化的LDL受体1(ox-LDL R1；1∶100；Santa Cruz Biotech)和抗人NOGO-A(1∶100；Santa Cruz Biotech)。将固定的样本用解剖刀修剪并将其放置于含乙醇的干冰浴上的OCT埋封胶(Tissue-Tek OCT；Sakura，Torrance，CA)内。然后使用标准低温恒温器(Leica Microsystems)将冰冻块切开(10μm厚)并装在载玻片上用于染色。
类似于之前的研究(Messina等人(2003)Exper.Neurol.184：816-29)进行免疫组织化学。简单而言，将组织切片用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤并将其暴露于含PBS、4％(v/v)山羊血清(Chemicon，Temecula，CA)和0.3％(v/v)Triton(Triton X-100；Sigma)的蛋白质阻断溶液中1小时以接近细胞内抗原。在目标表位将被定为于细胞表面(CD34、ox-LDL R1)的情况中，在操作的所有步骤中省略Triton以防止表位损失。此外，在第一抗体对抗山羊增高的(GCP-2，ox-LDL R1，NOGO-A)的情况中，在整个操作过程中使用3％(v/v)驴血清代替山羊血清。将第一抗体在阻断溶液中稀释，然后将其加载到切片，在室温保持4小时。除去第一抗体溶液，并在加载含有连同山羊抗-小鼠IgG-Texas Red(1∶250，分子探针，Eugene，OR)和/或山羊抗-家兔IgG-Alexa 488(1∶250，分子探针)或驴抗-山羊IgG-FITC(1∶150；SantaCruz Biotech)一起的阻断的第二抗体溶液(在室温1小时)之前，将培养物用PBS洗涤。洗涤培养物，并加载10微摩尔DAPI(分子探针)持续10分钟以使细胞核可见。
使用适当的荧光滤镜在Olympus倒置表面荧光显微镜(Olympus，Melville，NY)下使荧光可见。阳性染色是由高于对照染色的荧光信号代表的。使用数字彩色摄像机和ImagePro软件(Media Cybernetics，Carlsbad，CA)获取代表性图像。对三重染色的样品而言，一次只使用一个发射滤镜采集每一份图像。
一组存在于脐带中的细胞表达波形蛋白、结蛋白、SMA、CK18、vWF和CD34标记物。特别地，vWF和CD34表达局限于包含于脐带内的血管。CD34+细胞位于最内层(内腔侧)。在基质和脐带的血管中均发现了波形蛋白表达。SMA限于基质和动脉&静脉的外壁，但不包含于血管本身。只在血管内观察到了CK18和结蛋白，结蛋白局限于中间层和外层。在脐带组织内未观察到GROα、GCP-2、ox-LDL R1和NOGO-A的表达。
实施例4
寡核苷酸阵列分析
使用了Affymetrix
阵列以比较脐带组织来源的细胞和成纤维细胞、人间质肝细胞以及人骨髓来源的另一细胞系的基因表达谱。该分析提供了产后来源的细胞的鉴定，并鉴别了这些细胞的独特分子标记物。
人脐带是从National Disease Research Interchange(NDRI，Philadelphia，PA)获得的，来自患者知情同意的正常足月分娩。接收了这些组织，并如上所述分离了细胞。将细胞培养于生长培养基(使用DMEM-LG)中，在明胶覆盖的组织培养塑胶培养瓶中。将该培养物在37℃、在5％CO2下孵育。
人真皮成纤维细胞购买自Cambrex Incorporated(Walkersville，MD，批号9F0844)和ATCC CRL-1501(CCD39SK)。将两个细胞系均培养于含10％(v/v)胎牛血清(Hyclone)和青霉素/链霉素(Invitrogen)的DMEM/F12培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。使这些细胞生长于标准组织处理过的塑胶上。
人间质干细胞(hMSC)购买自Cambrex Incorporated(Walkersville，MD，批号2F1655、2F1656和2F1657)，并根据生产商的说明书将其培养于MSCGM培养基(Cambrex)中。使这些细胞在37℃、在5％CO2下生长于标准组织培养过的塑胶中。
人髂嵴骨髓来自NDRI，具有患者的知情同意。将骨髓根据Ho等人(WO03/025149)提出的方法进行处理。将骨髓与溶菌缓冲液(155mM NH4Cl，10mM KHCO3和0.1mM EDTA，pH 7.2)以1份骨髓对20份溶菌缓冲液的比率混合。将该细胞混悬液进行涡旋，在室温孵育2分钟，并在500×g下离心10分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀再次混悬于补充有10％(v/v)胎牛血清和4mM谷氨酰胺的最低必需培养基-α(Invitrogen)中。将该细胞再次离心，并将细胞沉淀再次混悬于新鲜培养基中。使用锥虫蓝拒染法(Sigma，St.Louis，MO)对存活的单核细胞进行计数。将该单核细胞以5×104细胞/cm2的密度接种于组织培养过的塑胶培养瓶中。将该细胞在37℃、在5％CO2下、在标准大气O2或5％O2下孵育。将细胞培养5天，而不更换培养基。在5天的培养之后除去培养基和非贴壁细胞。将贴壁细胞保持在培养中。
使用于冷PBS中的细胞刮棒将细胞的活性生长培养物从培养瓶中除去。将该细胞在300×g下离心5分钟。除去上清液，并将该细胞再次混悬于新鲜PBS中并再次离心。除去上清液，并将细胞沉淀立即冷冻并保存在-80℃下。提取细胞mRNA并将其转录为生物素标记的cDNA，然后将该cDNA转录为cRNA。将该生物素标记的cRNA与HG-U133A基因芯片寡核苷酸阵列(Affymetrix，Santa Clara CA)杂交。该杂交和数据采集是根据生产商的说明书进行的。分析是使用“微阵列的显著性分析”(SAM)版本1.21计算机软件(斯坦福大学，Tusher等人(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA98：5116-21)进行的。
分析了十四个不同的细胞群。在表1中列出了这些细胞和传代信息、培养底物和培养基。
表1
通过微阵列研究分析的细胞。通过识别码列出了细胞系、分析时的传代、细胞生长底物和生长培养基。
| 细胞群 | 传代 | 底物 | 培养基 |
| 脐带(022803) | 2 | 明胶 | DMEM，15％FBS，2-ME |
| 脐带(042103) | 3 | 明胶 | DMEM，15％FBS，2-ME |
| 脐带(071003) | 4 | 明胶 | DMEM，15％FBS，2-ME |
| ICBM(070203)(5％O2) | 3 | 塑胶 | MEM，10％FBS |
| ICBM(062703)(std.O2) | 5 | 塑胶 | MEM，10％FBS |
| ICBM(062703)(5％O2) | 5 | 塑胶 | MEM，10％FBS |
| hMSC(批号2F1655) | 3 | 塑胶 | MSCGM |
| hMSC(批号2F1656) | 3 | 塑胶 | MSCGM |
| hMSC(批号2F1657) | 3 | 塑胶 | MSCGM |
| 人成纤维细胞(9F0844) | 9 | 塑胶 | DMEM-F12，10％FBS |
| 人成纤维细胞(CCD39SK) | 4 | 塑胶 | DMEM-F12，10％FBS |
通过主成分分析对所述数据进行了评价，分析了在所述细胞中差异表达的290个基因。该分析能够对细胞群之间相似性进行相对比较。表2显示了对所述细胞对的比较而计算的欧几里德距离。该欧几里德距离基于所述细胞在所述细胞型之中差异表达的290个基因的比较。该欧几里德距离与290个基因表达之间的相似性成反比(即，距离越大，存在的相似性越小)。
表2
细胞对的欧几里德距离
| 细胞对 | 欧几里德距离 |
| ICBM-hMSC | 24.71 |
| 胎盘-脐 | 25.52 |
| ICBM-成纤维细胞 | 36.44 |
| ICBM-胎盘 | 37.09 |
| 成纤维细胞-MSC | 39.63 |
| ICBM-脐 | 40.15 |
| 成纤维细胞-脐 | 41.59 |
| MSC-胎盘 | 42.84 |
| MSC-脐 | 46.86 |
| ICBM-胎盘 | 48.41 |
下面的表3和表4显示了在脐带组织来源的细胞中增强的(表3)和在脐带组织来源的细胞中降低的(表4)基因表达。标题为“探针组ID”的栏是指位于芯片特殊位点的几个寡核苷酸探针组的生产商的识别码，所述探针组杂交成命名的基因(“基因名称”栏)，包括可在NCBI(GenBank)数据库中在指定的登记号(“NCBI登记号”栏)下找到的序列。
表3
与所测定的其他细胞系相比，脐带组织来源的细胞中显示具有特别增强表达的基因。
表4
与所测定的其他细胞系相比，显示在脐带组织来源的细胞中具有降低表达的基因。
表5、6和7显示人成纤维细胞(表5)、ICBM细胞(表6)和MSCs(表7)中增强的基因表达。
表5
与所测定的其他细胞系相比，显示在成纤维细胞中具有增强的表达的基因。
| 成纤维细胞中增强的基因 |
| 双特异性磷酸酶2 |
| KIAA0527蛋白 |
| 智人cDNA：FLJ23224 fis，克隆ADSU02206 |
| 动力蛋白，细胞质的、中间体多肽1 |
| 锚蛋白3，郎飞结(锚蛋白G) |
| 抑制素，βA(激活素A、激活素ABα多肽) |
| Ectonucleotide焦磷酸酶/磷酸二酯酶4(推定的功能) |
| KIAA1053蛋白 |
| 微管相关蛋白1A |
| 锌指蛋白41 |
| HSPC019蛋白 |
| 智人cDNA：FLJ23564 fis，克隆LNG10773 |
| 智人mRNA；cDNA DKFZp564A072(来自克隆DKFZp564A072) |
| LIM蛋白(类似于大鼠蛋白激酶C-结合enigma) |
| B-细胞中的κ光多肽基因增强子的抑制剂，激酶复合物相关蛋白 |
| 假设的蛋白FLJ22004 |
| 人(克隆CTG-A4)mRNA序列 |
| ESTs，适度相似于细胞因子受体样因子2；细胞因子受体CRL2前体[智人] |
| 转化生长因子β2 |
| 假设的蛋白MGC29643 |
| 通过单克隆抗体MRC OX-2鉴定的抗原 |
| 推定的X-连接的视网膜病变蛋白 |
表6
与所测定的其他细胞系相比，显示在ICBM来源的细胞中具有增强表达的基因。
| ICBM细胞中增强的基因 |
| ·心脏锚蛋白复制蛋白 |
| ·MHC I类ORF区 |
| ·整联蛋白，α10 |
| ·假设的蛋白FLJ22362 |
| ·UDP-N-乙酰基-α-D-半乳糖胺：多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶3(GalNAc-T3) |
| ·干扰素诱导的蛋白44 |
| ·SRY(性别决定区Y)-盒9(躯干发育异常，常染色体的性逆转) |
| ·角蛋白相关蛋白1-1 |
| ·海马钙结合蛋白样1 |
| ·jagged 1(Alagille综合征) |
| ·蛋白聚糖1，分泌颗粒 |
表7
与所测定的其他细胞系相比，显示在MSC细胞中具有增强表达的基因。
| MSC细胞中增强的基因 |
| ·白介素26 |
| ·麦芽糖酶-葡糖淀粉酶(α-葡萄糖苷酶) |
| ·核受体亚家族4，组A，成员2 |
| ·v-fos FBJ鼠骨肉瘤病毒癌基因同系物 |
| ·假设的蛋白DC42 |
| ·核受体亚家族4，组A，成员2 |
| ·FBJ鼠骨肉瘤病毒癌基因同系物B |
| ·WNT1可诱导的信号通路蛋白1 |
| ·MCF.2细胞系来源的转化序列 |
| ·钾通道，亚家族K，成员15 |
| ·软骨对-类同源异型蛋白1 |
| ·智人cDNA FLJ12232fis，克隆MAMMA1001206 |
| ·智人cDNA FLJ34668fis，克隆LIVER2000775 |
| ·jun B原癌基因 |
| ·B-细胞CLL/淋巴瘤6(锌指蛋白51) |
| ·锌指蛋白36，C3H类型，同系物(小鼠) |
前述分析包括来源于三份不同的脐带和两个不同系的真皮成纤维细胞、三个系的间质干细胞和三个系的髂嵴骨髓细胞。使用含有针对22000个基因的探针的寡核苷酸阵列分析了由这些细胞表达的mRNA。结果显示在这些五种不同的细胞类型中，290个基因是差异表达的。这些基因包括在脐带组织来源的细胞中特别增强的七个基因。发现五十四个基因在脐带组织来源的细胞中具有特别较低的表达水平，与其他细胞类型相比。已经通过PCR证实了所选择的基因的表达。这些结果表明脐带组织来源的细胞具有清楚的基因表达谱，例如，与骨髓来源的细胞和成纤维细胞相比。
实施例5
脐带组织来源的细胞中的细胞标记物
如上所证明的，对脐带组织来源的细胞鉴别了六个“签名”基因：氧化的LDL受体1、白介素-8、凝乳酵素、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3(CXC配体3)和粒细胞趋化蛋白2(GCP-2)。这些“签名”基因在产后来源的细胞中以相对高的水平表达。
实施该实施例中所述的这些操作是为了验证微阵列数据并发现基因和蛋白质表达之间的一致性/不一致性，以及为了建立一系列可靠的测定用于检测脐带组织来源的细胞的独特标识符。
使脐带组织来源的细胞(四份分离物)和正常的人真皮成纤维细胞(NHDF，新生儿的和成人的)在明胶覆盖的T75培养瓶中生长于含青霉素/链霉素的生长培养基中。使间充质干细胞(Mesechymal Stem Cells)(MSCs)生长于间充质干细胞生长培养基Bullet试剂盒(MSCGM；Cambrex，Walkerville，MD)中。
对IL-8方案而言，将细胞从液氮中解冻并以5000细胞/cm2的密度置于明胶覆盖的培养瓶中，在生长培养基中生长48小时，然后在10毫升血清饥饿培养基[DMEM-低葡萄糖(Gibco，Carlsbad，CA)，青霉素/链霉素(Gibco，Carlsbad，CA)和0.1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA；Sigma，St.Louis，MO)]中再生长8小时。在该处理之后，提取RNA并将上清液在150×g下离心5分钟以除去细胞碎片。然后将上清液在-80℃下冷冻用于ELISA分析。
将来源于脐带的产后细胞以及来源于人新生儿包皮的人成纤维细胞在明胶覆盖的T75培养瓶中培养于生长培养基中。将11代细胞在液氮中冷冻。将细胞解冻并转移至15毫升离心管中。在150×g下离心5分钟后，弃去上清液。将细胞再次混悬于4毫升培养基中并计数。使细胞以375000细胞/培养瓶的密度在含15毫升生长培养基的75cm2培养瓶中生长24小时。将该培养基更换为血清饥饿培养基持续8小时。在孵育结束时收集血清饥饿培养基，在14000×g下离心5分钟(并保存在-20℃)。
为了估算每一培养瓶中的细胞数目，将2毫升胰蛋白酶/EDTA(Gibco，Carisbad，CA)加入到每一培养瓶中。在细胞从培养瓶分离后，采用8毫升生长培养基中和胰蛋白酶活性。将细胞转移至15毫升离心管中并在150×g下离心5分钟。除去上清液并将1毫升生长培养基加入到每一管中以再次混悬细胞。使用血细胞计数器估算细胞数目。
使用ELISA测定(R&D系统，Minneapolis，MN)分析由所述细胞分泌的进入血清饥饿培养基的IL-8量。所有测定是根据生产商提供的指导进行的。
从融合的脐带组织来源的细胞和成纤维细胞中提取RNA，或用于来自如上处理的细胞的IL-8表达。根据生产商的指导(RNeasy Mini Kit；Qiagen，Valencia，CA)，将细胞用350微升含β-巯基乙醇(Sigma，St.Louis，MO)的缓冲RLT溶解。根据生产商的指导(RNeasy Mini Kit；Qiagen，Valencia，CA)提取RNA，并进行DNase处理(2.7U/样品)(Sigma St.Louis，MO)。将RNA用50微升DEPC处理过的水稀释并保存在-80℃。
同样，从人脐带组织提取RNA。将组织(30毫克)混悬于700微升含2-巯基乙醇的缓冲RLT中。将样品机械均质化，并按照生产商的说明书进行RNA提取。采用50微升DEPC处理过的水提取RNA并保存在-80℃。
使用含TaqMan逆转录试剂(Applied Biosystems，Foster City，CA)的随机六聚物将RNA进行逆转录，在25℃持续10分钟、在37℃持续60分钟，以及在95℃持续10分钟。将样品保存在-20℃。
使用实时PCR和常规PCR对通过cDNA微阵列鉴定为在产后细胞中独特调节的基因(签名基因-包括氧化的LDL受体、白介素-8、凝乳酵素和浆膜蛋白)进行进一步的研究。
使用Assays-on-DemandTM基因表达产物对cDNA进行了PCR：根据生产商的指导(Applied Biosystems，Foster City，CA)使用配有ABI Prism 7000SDS软件(Applied Biosystems，Foster City，CA)的7000序列检测系统将氧化的LDL受体(Hs00234028)、凝乳酵素(Hs00166915)、浆膜蛋白(Hs00382515)、CXC配体3(Hs00171061)、GCP-2(Hs00605742)、IL-8(Hs00174103)和GAPDH(Applied Biosystems，Foster City，CA)与cDNA和TaqMan通用PCR主混合物混合。热循环条件为最初50℃持续2分钟和95℃持续10分钟，随后40个循环的95℃持续15秒和60℃持续1分钟。
根据生产商的指导(来自Applied Biosystems用于ABI Prism 7700序列检测系统的#2使用者公告)分析PCR数据。
使用ABI PRISM 7700(Perkin Elmer Applied Biosystems，Boston，Massachusetts，USA)进行常规PCR以证实来自实时PCR的结果。PCR是使用2微升cDNA溶液、1×AmpliTaq Gold通用混合PCR反应缓冲液(Applied Biosystems，Foster City，CA)和在94℃最初变性5分钟进行的。对每一引物组进行了扩增优化。对IL-8、CXC配体3、和浆膜蛋白(94℃持续15秒，55℃持续15秒和72℃持续30秒，持续30个循环)；对凝乳酵素(94℃持续15秒，53℃持续15秒和72℃持续30秒，持续38个循环)；对氧化的LDL受体和GAPDH(94℃持续15秒，55℃持续15秒和72℃持续30秒，持续33个循环)。用于扩增的引物在表8中列出。在最终的PCR反应混合物中引物的浓度是1微摩尔，除GAPDH为0.5微摩尔外。GAPDH引物与实时PCR相同，除未将生产商的TaqMan探针加入到最终的PCR反应混合物中外。将样品在2％(w/v)琼脂糖凝胶中运行，并用溴乙啶(Sigma，St.Louis，MO)染色。使用667 Universal Twinpack胶片(VWR International，South Plainfield，NJ)和焦距立拍立现照相机(VWR International，SouthPlainfield，NJ)捕获图像。
表8
所使用的引物
| 引物名称 | 引物 | |
| 氧化的LDL受体 | S：5′-GAGAAATCCAAAGAGCAAATGG-3′ | (SEQ ID NO：1) |
| 肾素 | A：5′-AGAATGGAAAACTGGAATAGG-3′S：5′-TCTTCGATGCTTCGGATTCC-3′A：5′-GAATTCTCGGAATCTCTGTTG-3′ | (SEQ ID NO：2)(SEQ ID NO：3)(SEQ ID NO：4) |
| 浆膜蛋白 | S：5′-TTACAAGCAGTGCAGAAAACC-3′A：5′-AGTAAACATTGAAACCACAGCC-3′ | (SEQ ID NO：5)(SEQ ID NO：6) |
| 白介素-8 | S：5′-TCTGCAGCTCTGTGTGAAGG-3′A：5′-CTTCAAAAACTTCTCCACAACC-3′ | (SEQ ID NO：7)(SEQ ID NO：8) |
| 趋化因子(CXC)配体3 | S：5’-CCCACGCCACGCTCTCC-3’A：5’-TCCTGTCAGTTGGTGCTCC-3’ | (SEQ ID NO：9)(SEQ ID NO：10) |
将细胞用冷的4％(w/v)低聚甲醛(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)在室温固定10分钟。使用了0代(P0)的一份分离物(分离后直接使用)和11代(P11)的两份分离物以及成纤维细胞(P11)。使用直接对抗下列表位的抗体进行免疫细胞化学：波形蛋白(1∶500，Sigma，St.Louis，MO)、结蛋白(1∶150；Sigma-对抗家兔增高的；或1∶300；Chemicon，Temecula，CA-对抗小鼠增高的)、α-平滑肌肌动蛋白(SMA；1∶400；Sigma)、细胞角蛋白18(CK18；1∶400；Sigma)、von Willebrand因子(vWF；1∶200；Sigma)、和CD34(人CD34III类；1∶100；DAKOCytomation，Carpinteria，CA)。此外，对11代产后细胞测定了下列标记物：抗人GRO α-PE(1∶100；Becton Dickinson，FranklinLakes，NJ)、抗人GCP-2(1∶100；Santa Cruz Biotech，Santa Cruz，CA)、抗人氧化的LDL受体1(ox-LDL R1；1∶100；Santa Cruz Biotech)和抗人NOGA-A(1∶100；Santa Cruz，Biotech)。
将培养物用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，并将其暴露于含PBS、4％(v/v)山羊血清(Chemicon，Temecula，CA)和0.3％(v/v)Triton(Triton X-100；Sigma，St.Louis，MO)的蛋白质阻断溶液中30分钟以接近细胞内抗原。在目标表位被定位于细胞表面(CD34、ox-LDL R1)的情况中，在操作的所有步骤中省略Triton X-100以防止表位损失。此外，在第一抗体对抗山羊增高(GCP-2、ox-LDL R1、NOGO-A)的情况中，在整个操作过程中使用3％(v/v)驴血清代替山羊血清。将第一抗体在阻断溶液中稀释，然后将其加载到培养物中，在室温保持4小时。除去第一抗体溶液，并在加载含有连同山羊抗-小鼠IgG-Texas Red(1∶250，分子探针，Eugene，OR)和/或山羊抗-家兔IgG-Alexa 488(1∶250，分子探针)或驴抗-山羊IgG-FITC(1∶150；SantaCruz Biotech)一起的阻断的第二抗体溶液(在室温1小时)之前，将培养物用PBS洗涤。然后洗涤培养物，并加载10微摩尔DAPI(分子探针)持续10分钟以使细胞核可见。
在免疫染色后，使用适当的荧光滤光片在Olympus倒置表面荧光显微镜(Olympus，Melville，NY)下直视荧光。在所有的情况中，阳性染色代表高于对照染色的荧光信号，在对照染色中遵循上面概述的整个操作，除了加载第一抗体溶液外。代表性图像是使用数字彩色摄像机和ImagePro软件(Media Cybernetics，Carlsbad，CA)捕获的。对三重染色的样品而言，每一张图像均是使用一次仅一个发射滤光片采集的。然后使用Adobe Photoshop软件(Adobe，San Jose，CA)制备分层的蒙太奇。
将培养瓶中的贴壁细胞在磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Gibco，Carlsbad，CA)中洗涤，并用胰蛋白酶/EDTA(Gibco，Carlsbad，CA)进行分离。将细胞收集、离心并以1×107每毫升的细胞浓度再次混悬于于PBS中的3％(v/v)FBS中。将一百微升等分部分递送至锥形管中。将针对细胞内抗原染色的细胞用Perm/洗涤缓冲液(BD Pharmingen，San Diego，CA)进行可渗透化。按照生产商的说明书将抗体加入到等分部分中，并将所述细胞在暗处、在4℃孵育30分钟。孵育后，将细胞用PBS洗涤并离心以除去过量的抗体。将需要第二抗体的细胞再次混悬于100微升3％PBS中。按照生产商的说明书加入第二抗体并将所述细胞在暗处、在4℃孵育30分钟。孵育后，将细胞用PBS洗涤并离心以除去过量的第二抗体。将洗涤过的细胞再次混悬于0.5毫升PBS中，并通过流式细胞术进行分析。使用了下列抗体：氧化的LDL受体1(sc-5813；Santa Cruz，Biotech)、GROa(555042；BD Pharmingen，Bedford，MA)、小鼠IgG1κ，(P-4685和M-5284；Sigma)、驴抗山羊IgG(sc-3743；Santa Cruz，Biotech.)。流式细胞术分析是采用FACScalibur(Becton Dickinson San Jose，CA)进行。
将从实时PCR获得的数据通过ΔΔCT方法进行分析并以对数标度表达。与其他细胞相比，在脐带组织来源的细胞中浆膜蛋白和氧化的LDL受体表达的水平较高。产后来源的细胞和对照之间未发现CXC配体3和GCP-2表达水平的显著差异。通过常规PCR证实了实时PCR的结果。PCR产物的测序进一步验证了这些观察。产后来源的细胞和使用上面所列的常规PCR CXC配体3引物的对照之间未发现CXC配体3表达水平的显著差异。
细胞因子、IL-8的产生在生长培养基培养的和血清饥饿的产后来源的细胞中均提高。采用常规PCR并通过测序PCR产物验证了所有的实时PCR数据。
当对生长于无血清的培养基中的细胞上清液检查IL-8的存在时，在来源于脐带细胞和胎盘细胞的一些分离物的培养基中检测到了最大量(表9)。在来源于人真皮成纤维细胞的培养基中未检测到IL-8。
表9
通过ELISA测量的IL-8蛋白量
数值：皮克/百万细胞，n＝2，sem；ND＝未检测到。
将来源于人脐带组织的0代细胞用作探针通过免疫细胞化学分析探测所选择的蛋白质的产生。在分离(0代)后立即将细胞用4％低聚甲醛固定并将其暴露于针对六种蛋白质的抗体：von Willebrand因子、CD34、细胞角蛋白18、结蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白。脐带组织来源的细胞对α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白是阳性的，采用至11代一致的染色模式。
已经对四个基因建立了通过微阵列和PCR(实时和常规两种)测量的基因表达水平之间的一致性：氧化的LDL受体1、凝乳酵素、浆膜蛋白和IL-8。
这些基因的表达在PPDCs中在mRNA水平是差异地调节的，IL-8在蛋白质水平也差异地调节。将来源于人脐带组织的0代细胞用作探针探测α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白的表达，它对两种均是阳性的。该染色模式一致保持至11代。
实施例6
产后来源的细胞的体外免疫学评价
在体外评价产后来源的细胞(PPDCs)的免疫学特征以预言免疫学响应，如果有，这些细胞将引出体内移植。通过流式细胞术对PPDCs测定了HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ、CD80、CD86和B7-H2的存在。这些蛋白质是由抗原提呈细胞(APC)表达的，并要求
CD4+T细胞的直接刺激(Abbas&Lichtman，CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY，5th Ed.(2003)Saunders，Philadelphia，p.171)。也通过流式细胞术分析了该细胞系的HLA-G(Abbas&Lichtman，2003，supra)、CD 178(Coumans等人，(1999)Journal of Immunological Methods 224，185-196)和PD-L2(Abbas&Lichtman，2003，supra；Brown等人，(2003)The Journal of Immunology 170，1257-1266)的表达。由残留于胎盘组织中的细胞进行的这些蛋白质的表达被认为在子宫内介导胎盘组织的免疫特许状态。为了预言胎盘-和脐带组织来源的细胞系在体内引出免疫响应的程度，在单因素混合淋巴细胞反应(MLR)中测定了该细胞系。
在覆盖有2％明胶(Sigma，St.Louis，MO)的T75培养瓶(Corning，Corning，NY)中，将细胞在含青霉素/链霉素的生长培养基中培养至融合。
将细胞在磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Gibco，Carlsbad，CA)中洗涤，并用胰蛋白酶/EDTA(Gibco，Carlsbad，MO)进行分离。将细胞收集、离心并以1×107每毫升的细胞浓度再次混悬于于PBS中的3％(v/v)FBS中。按照生产商的说明书，将抗体(表10)加入到一百微升的细胞混悬液中并将其在暗处、在4℃孵育30分钟。孵育后，将细胞用PBS洗涤并离心以除去未结合的抗体。将细胞再次混悬于五百微升PBS中，并通过流式细胞术使用FACSCalibur仪器(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行分析。
表10
抗体
| 抗体 | 生产商 | 目录号 |
| HLA-DRDPDQ | BD Pharmingen(San Diego，CA) | 555558 |
| CD80 | BD Pharmingen(San Diego，CA) | 557227 |
| CD86 | BD Pharmingen(San Diego，CA) | 555665 |
| B7-H2 | BD Pharmingen(San Diego，CA) | 552502 |
| HLA-G | Abcam(Cambridgeshire，UK) | ab 7904-100 |
| CD 178 | Santa Cruz(San Cruz，CA) | sc-19681 |
| PD-L2 | BD Pharmingen(San Diego，CA) | 557846 |
| 大鼠IgG2a | Sigma(St.Louis，MO) | F-6522 |
| 大鼠IgG1κ | Sigma(St.Louis，MO) | P-4685 |
将冷藏保存的标记为细胞系A的10代脐带组织来源的细胞的小瓶在干冰中转送至CTBR(Senneville，Quebec)以使用CTBR SOP号CAC-031进行混合淋巴细胞反应。从多名男性和女性志愿者供体收集外周血单核细胞(PBMCs)。将刺激物(供体)同种异体PBMC、自体PBMC和产后细胞系用丝裂霉素C处理。将自体的和丝裂霉素处理过的刺激物细胞加入到响应者(接受者)PBMCs中并培养4天。孵育后，向每一份样品中加入[3H]胸苷并培养18小时。收集细胞后，提取放射性标记的DNA，并使用闪烁计数器测量胸苷[3H]-胸苷的并入。
同种异体供体(SIAD)的刺激指数是这样计算的：加丝裂霉素C处理的同种异体供体的接受者的平均增殖除以接受者的基础增殖。PPDCs的刺激指数是这样计算的：加丝裂霉素C处理的产后细胞系的接受者的平均增殖除以接受者的基础增殖。
筛选了六例人志愿者血液供体以鉴别将在与其他五例血液供体的混合淋巴细胞反应中显示稳健的增殖响应的单个同种异体供体。选择该供体作为同种异体阳性对照供体。选择其余五例血液供体作为接受者。该同种异体阳性对照供体和胎盘细胞系是用丝裂霉素C处理过的，并在混合淋巴细胞反应与所述五例个体同种异体接受者一起培养。使用两个细胞培养皿(每个培养皿具有三例接受者)平行三份进行反应(表11)。平均刺激指数的范围为6.5(培养皿1)至9(培养皿2)，同种异体供体阳性对照的范围为42.75(培养皿1)至70(培养皿2)(表12)。
表11
混合淋巴细胞反应数据-细胞系A(脐带)
用于增殖测定的DPM
培养皿ID：培养皿1
培养皿ID：培养皿2
表12
脐带组织来源的细胞和同种异体供体在具有五个个体同种异体接受者的混合淋巴细胞反应中的平均刺激指数。
通过流式细胞术分析的脐带组织来源的细胞的直方图显示HLA-DR、DP、DQ、CD80、CD86和B7-H2的阴性表达，如通过与IgG对照一致的荧光数值所记录的，表明缺乏细胞表面分子的脐带细胞系要求直接刺激CD4+T细胞。通过流式细胞术分析的脐带组织来源的细胞的直方图显示PD-L2的阳性表达，如通过相对于IgG对照增加的荧光数值所记录的，并显示CD 178和HLA-G的阴性表达，如通过与IgG对照一致的荧光数值所记录的。
在采用脐带组织来源的细胞系进行的混合淋巴细胞反应中，平均刺激指数的范围是6.5至9，同种异体阳性对照的平均刺激指数的范围是42.75至70。脐带组织来源的细胞系对刺激蛋白HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ、CD80、CD86和B7-H2的表达是阴性的，如通过流式细胞术所测量的。脐带组织来源的细胞系对免疫调节蛋白HLA-G和CD 178是阴性的，对PD-L2的表达是阳性的，如通过流式细胞术所测量的。同种异体供体PBMCs包含表达HLA-DR、DO、CD8、CD86和B7-H2的抗原提呈细胞，从而允许对
CD4+T细胞的刺激。胎盘和脐带组织来源的细胞上抗原提呈细胞表面分子的缺失要求
CD4+T细胞的直接刺激，PD-L2(一种免疫调节蛋白)的存在可解释与同种异体对照相比，在MLR中由这些细胞表现的低刺激指数。
实施例7
由脐带组织来源的细胞进行的营养因子的分泌
测量了来自脐带组织来源的细胞的所选择的营养因子的分泌。所选择的用于检测的因子包括：(1)已知具有血管生成活性的那些因子，诸如肝细胞生长因子(HGF)(Rosen等人，(1997)Ciba Found.Symp.212：215-26)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)(Salcedo等人，(2000)Blood 96；34-40)、白介素-8(IL-8)(Li等人，(2003)J.Immunol.170：3369-76)、角质化细胞生长因子(KGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)(Hughes等人，(2004)Ann.Thorac.Surg.77：812-8)、基质金属蛋白酶1(TIMP1)、血管生成素2(ANG2)、血小板来源的生长因子(PDGF-bb)、血小板生成素(TPO)、肝素结合的表皮生长因子(HB-EGF)、间质来源的因子1α(SDF-1α)；(2)已知具有神经营养/神经保护活性的那些因子，诸如脑来源的神经营养因子(BDNF)(Cheng等人，(2003)Dev.Biol.258；319-33)、白介素-6(IL-6)、粒细胞趋化蛋白-2(GCP-2)、转化生长因子β2(TGFbeta2)；以及(3)已知具有趋化因子活性的那些因子，诸如巨噬细胞炎性蛋白质1α(MIP1a)、巨噬细胞炎性蛋白质1β(MIP1b)、单核细胞化学引诱物-1(MCP-1)、Rantes(调节激活，正常T细胞表达和分泌)、I309、胸腺和活化调节的趋化因子(TARC)、嗜酸细胞活化趋化因子、巨噬细胞来源的趋化因子(MDC)、IL-8。
将来自脐带的细胞以及来自人新生儿包皮的人成纤维细胞在明胶覆盖的T75培养瓶中培养于含青霉素/链霉素的生长培养基中。将细胞冷藏保存在11代并保存在液氮中。在细胞解冻后，将生长培养基加入到该细胞中，随后将其转移至15毫升离心管中并在150×g下离心5分钟。弃去上清液。将细胞沉淀再次混悬于4毫升生长培养基中，并对细胞进行计数。将细胞以375000细胞/75cm2的密度接种于含15毫升生长培养基的培养瓶中，并培养24小时。将该培养基更换为无血清培养基(DMEM-低葡萄糖(Gibco)、0.1％(w/v)牛血清白蛋白(Sigma)、青霉素/链霉素(Gibco))持续8小时。在孵育结束时通过在14000×g下离心5分钟收集条件的无血清培养基，并保存在-20℃。为了估算每一培养瓶中的细胞数目，将细胞用PBS洗涤，并使用2毫升胰蛋白酶/EDTA进行分离。通过加入8毫升生长培养基抑制胰蛋白酶活性。将细胞在150×g下离心5分钟。除去上清液，并将细胞再次混悬于1毫升生长培养基中。使用血细胞计数器估算细胞数目。
使细胞在37℃、在5％二氧化碳和大气氧下生长。同样使胎盘来源的细胞(批号101503)生长于5％氧气或β-巯基乙醇(BME)中。通过ELISA测定(R&D系统，Minneapolis，MN)测量每一份细胞样品产生的MCP-1、IL-6、VEGF、SDF-1α、GCP-2、IL-8和TGF-β2的量。所有的测定是根据生产商的指导进行的。
使用
蛋白质组阵列(Pierce Biotechnology Inc.)测量了炎症趋化因子(MIP1a、MIP1b、MCP-1、Rantes、I309、TARC、Eotaxin、MDC、IL-8)、BDNF和血管生成因子(HGF、KGF、bFGF、VEGF、TIMP1、ANG2、PDGF-bb、TPO、HB-EGF)。该蛋白质组阵列是用于每孔二至16种蛋白质的定量测量的多重夹心ELISAs。该阵列是通过将2×2、3×3或4×4模式的四至16种不同的捕获抗体点状分布于96孔板的每一孔中而产生的。按照夹心ELISA操作，得到整个板的图像以捕获该板的每一孔内每一点产生的化学发光信号。每一点产生的信号量与最初标准品或样品中靶蛋白的量成比例。
MCP-1和IL-6是由脐带组织来源的细胞和真皮成纤维细胞分泌的(表13)。SDF-1α是由成纤维细胞分泌的。GCP-2和IL-8是由在NME或5％氧气存在下培养的脐带组织来源的细胞分泌的。GCP-2也是由人成纤维细胞分泌的。TGF-β2通过ELISA测定是不可检测的。
表13
ELISA试验结果
| MCP-1 | IL-6 | VEGF | SDF-1 | GCP-2 | IL-8 | TGF-β2 | |
| 成纤维细胞 | 17±1 | 61±3 | 29±2 | 19±1 | 21±1 | ND | ND |
| 脐带(022803) | 1150±74 | 4234±289 | ND | ND | 160±11 | 2058±145 | ND |
| 脐带(071003) | 2794±84 | 1356±43 | ND | ND | 2184±98 | 2369±23 | ND |
数值是以皮克/毫升/百万细胞给出的(n＝2，sem)；ND＝未检测到。
TIMP1、TPO、KGF、HGF、FGF、HBEGF、BDNF、MIP1b、MCP1、RANTES、I309、TARC、MDC和IL-8是从脐带组织来源的细胞分泌的(表14和表15)。未检测到Ang2、VEGF或PDGF-bb。
表14
| TIMP1 | ANG2 | PDGFbb | TPO | KGF | HGF | FGF | VEGF | HBEGF | BDNF | |
| Hfb | 19306.3 | ND | ND | 230.5 | 5.0 | ND | ND | 27.9 | 1.3 | ND |
| U1 | 57718.4 | ND | ND | 1240.0 | 5.8 | 559.3 | 148.7 | ND | 9.3 | 165.7 |
| U3 | 21850.0 | ND | ND | 1134.5 | 9.0 | 195.6 | 30.8 | ND | 5.4 | 388.6 |
hFB＝人成纤维细胞，U1＝脐带组织来源的细胞(022803)，U3＝脐带组织来源的细胞(071003)，ND＝未检测到。
表15
| MIP1a | MIP1b | MCP1 | RANTES | I309 | TARC | Eotaxin | MDC | IL8 | |
| hFB | ND | ND | 39.6 | ND | ND | 0.1 | ND | ND | 204.9 |
| P1 | 79.5 | ND | 228.4 | 4.1 | ND | 3.8 | 12.2 | ND | 413.5 |
| U1 | ND | 8.0 | 1694.2 | ND | 22.4 | 37.6 | ND | 18.9 | 51930.1 |
| P3 | ND | ND | 102.7 | ND | ND | 0.4 | ND | ND | 63.8 |
| U3 | ND | 5.2 | 2018.7 | 41.5 | 11.6 | 21.4 | ND | 4.8 | 10515.9 |
hFB＝人成纤维细胞，U1＝脐带组织来源的细胞(022803)，U3＝脐带组织来源的细胞(071003)，ND＝未检测到。
脐带组织来源的细胞分泌许多营养因子。这些营养因子中的一些，诸如HGF、bFGF、MCP-1和IL-8在血管发生中扮演重要角色。其他营养因子，诸如BDNF和IL-6在神经再生中扮演重要角色。
实施例8
HMG-CoA还原酶抑制剂对扩增的人脐带组织来源的细胞中IFN-γ-诱导的
HLA-DR、DP、DQ表达的抑制
将培养物-扩增的人脐带组织来源的细胞(022803 P4)接种于6-孔组织培养皿中，并在达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)-低葡萄糖、15％胎牛血清(FBS)、青霉素/链霉素(P/S)、β巯基乙醇(BME)中培养至大约70％融合。然后将该细胞用含10μM各自的HMG-CoA还原酶抑制剂(Simvastatic acid(Alexis Biochemicals，Lausen，Switzerland)制成于DMSO中的10mM储备试剂)或DMSO溶媒-0.1％(Sigma，St.Louis，MO)的培养基处理并孵育过夜。通过吸出除去培养基，并用含500U/ml rhIFN-γ(BDPharmingen，Franklin Lakes，NJ)和10μM各自的HMG-CoA还原酶抑制剂的培养基代替，并培养3天。在第三天时，用胰蛋白酶收集细胞。
将所收集的细胞用PBS洗涤一次，并再次混悬于含20μl FITC-标记的HLA-DR、DP、DQ(BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ)或FITC-标记的IgG抗体(BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ)的100μl于PBS中的3％FBS中，并孵育一小时。将细胞用PBS洗涤一次，并再次混悬于500μl PBS中，并在FACSCalibur流式细胞仪(BS Biosciences，Franklin Lakes，NJ)上进行分析。
表16
通过FITCh荧光强度数值测量的hUTC中的HLA-DR、DP、DQ表达，hUTC是采用HMG-CoA还原酶抑制剂预处理并采用炎症细胞因子IFN-γ进一步处理的
如表16中所显示的，采用炎症细胞因子IFN-γ孵育的未处理的和0.1％DMSO溶媒对照人脐带组织来源的细胞显示HLA-DR、DP、DQ表达的增加，如通过流式细胞术检测到的增加的荧光所看到的。采用HMG-CoA还原酶抑制剂预处理并随后采用IFN-γ孵育的人脐带组织来源的细胞显示与未处理的和溶媒对照相似的HLA-DR、DP、DQ表达。
该数据表明，在人脐带组织来源的细胞中HMG-CoA还原酶抑制炎症细胞因子介导的HLA-DR、DP、DQ的表达。
实施例9
人脐带组织来源的细胞在药物诱导的急性肾功能衰竭的啮齿动物模型中
的肾脏保护效能
五十八只雌性C57BL/6J小鼠购买自Jackson实验室(Bar Harbor，Maine)。表17描述了本研究中应用的实验设计。
表17
实验设计，小鼠间充质干细胞(mMSC)，人间充质干细胞(hMSCs)，汉克平衡盐溶液溶媒对照(HBSS)，注射的存活细胞数目(细胞剂量)，人脐带组织来源的细胞(hUTC)
| 治疗组 | 动物数目 | 性别 | 试验材料 | 细胞剂量 |
| 1 | 14 | 雌性 | HBSS | NA |
| 2 | 10 | 雌性 | mMSC | 0.2x106 |
| 3 | 10 | 雌性 | hMSC | 0.2x106 |
| 4 | 10 | 雌性 | hUTC | 0.2x106 |
| 5 | 14 | 雌性 | hUTC | 0.4x106 |
急性肾功能衰竭在小鼠中是这样诱导的：使用两次皮下注射顺式-二氨二氯铂(顺铂)(Sigma Co.Cat#P4394)，每次浓度为10mg/kg，然后通过在初次顺铂注射后输注细胞或Hanks平衡盐溶液(HBSS)，不含Ca++/Mg++(Invitrogen，Cat#14025，Lot#1300696)二十四至四十八小时。图1显示用于执行该研究的事件序列。
将10代hUTCs(批#120304)进行分离并扩增，并冷藏保存在＜-120℃(液氮蒸气相)。按照生产商的指导，使hMSCs(Cambrex(Lonza)，Walkersville，MD)Cat#PT-2501，批#4F1560)扩增至6代，然后冷藏保存。将小鼠MSC(mMSC)进行新鲜分离并扩增。简单而言，使用25-计量注射针将C57BL/6J小鼠骨髓从胫骨和股骨中驱逐出去。将骨髓以1-2×106细胞/cm2的密度培养于补充有10％胎牛血清的Iscove′s改良达尔贝科培养基中。除去非贴壁细胞，并在接种后48-72小时时以及此后的每四天更换培养基。当该组织培养瓶接近融合时，对mMSCs进行酶处理以将其从培养瓶中除去。两次传代后，收集mMSCs并准备用于移植。UTC和hMSCs均表现正常核型并且没有病原体或支原体污染。
在细胞注射时，将hUTCs和hMSCs在37℃解冻并用HBSS洗涤两次。使用血细胞计数器对细胞进行计数并通过锥虫蓝染料拒染法测定细胞存活率。将细胞以0.2×106/200μl HBSS或0.4×106细胞/200μl HBSS的浓度重溶。使用配有27-计量注射针的1mL注射器将混悬于HBSS中的细胞或HBSS单独地(作为阴性对照)注射入面前静脉中。
为了测定动物存活率，将细胞移植后第7天时活着的动物数目除以治疗组最初的动物数目。如表18和图2所显示的，HBSS溶媒治疗导致在细胞移植后第7天时只有43％的动物存活。然而，mMSC和hMSC二者的治疗导致90％的动物存活。hUTCs的较低剂量(0.2×106细胞)注射导致在第7天时70％的动物存活，较高剂量(0.4×106细胞)hUTC治疗导致只有50％的动物存活。
表18
存活率。细胞移植后第7天，测定了存活动物的百分数。
| 治疗 | 剂量 | 存活百分数 |
| 1 | NA | 43 |
| 2 | 0.2x106 | 90 |
| 3 | 0.2x106 | 90 |
| 4 | 0.2x106 | 70 |
| 5 | 0.4x106 | 50 |
在顺铂注射之前(第-1天)和细胞移植后第3、5和7天时，从尾静脉收集血液样品(50μl)。从血液样品制备血清并在-80℃下保存在EDTA处理过的管中直至分析。在采集血液样品之前对所有动物除去食物，过夜。使用COBAS Mira化学分析器(罗氏，瑞士)进行血液-尿素-氮(BUN)测量。使用Advia 1650化学分析器(拜耳，Pittsburgh，PA)分析血清肌酸酐(SCr)。
在损害之前，HBSS、mMSC、hMSC、较低剂量hUTC和较高剂量hUTC均显示正常的BUN数值，分别为16.89mg/dl、17.19mg/dl、17.21mg/dl、17.47mg/dl、17.33mg/dl(表19，图3)。然而，在第五天时，所有治疗组显示升高的BUN水平。HBSS治疗得到64.37mg/dl的平均BUN，mMSC治疗58.96mg/dl。然而，hMSC和较低剂量hUTC治疗均导致降低的BUN数值，分别为40.44mg/dl和51.32mg/dl，而较高剂量hUTC治疗显示97.28mg/dl的升高的BUN。在溶媒和治疗组之间未观察到统计学差异。这是由在BUN测量中典型可见的变异性造成的。第7天的测量显示相似趋势的数据，然而，在溶媒组观察到BUN数值的戏剧性降低。这使得准确地评价细胞治疗在移植后第7天时对肾功能的作用变得困难。
表19
BUN测量
治疗组：1 治疗组：2
治疗组：3 治疗组：4
治疗组5
表20和图4显示来自第5天血清样品的SCr测量。HBSS和mMSC治疗分别导致0.74mg/dl和0.66mg/dl的平均肌酐酸数值。在hMSC或较低剂量hUTC处理之后观察到了统计学上显著的降低(P＜0.03)。hMSC治疗导致0.47mg/dl的平均SCr数值，较低剂量hUTC治疗导致0.57mg/dl的平均SCr数值。
表20
血清肌酸酐。在细胞移植后第5天测定了SCr。标准偏差(std)。平均值的标准误(SEM)
| 治疗组 | 试验材料 | 肌酸酐mg/dl | 均值 | Std | SEM | P-值 |
| 1 | HBSSHBSSHBSSHBSSHBSS | 0.640.720.720.890.73 | 0.74 | 0.09 | 0.04 | na |
| 2 | mMSCmMSCmMSCmMSCmMSC | 0.640.720.720.480.72 | 0.66 | 0.10 | 0.05 | 0.213 |
| 3 | hMSChMSChMSChMSC | 0.240.270.560.56 | 0.47 | 0.21 | 0.09 | 0.008 |
| 4 | hUTChUTChUTChUTC | 0.640.450.560.64 | 0.57 | 0.08 | 0.03 | 0.028 |
| 5 | hUTChUTChUTChUTC | 1.280.260.480.72 | 0.68 | 0.38 | 0.17 | 0.789 |
将每个治疗组的两只小鼠在细胞移植后第7天时处死，并通过经心脏灌注盐水、随后灌注并浸没于4％低聚甲醛(paraformaldelhyde)中将组织固定。将肾脏从小鼠中取出并进行处理用于组织学。然后评价H&E染色的切片的组织损伤。两位受过训练的病理学家进行无分别地评价并对肾小管变性的程度打分。
对来自HBSS、hMSC和较低剂量hUTC治疗的动物的组织切片进行了肾小管坏死的定量测量。肾小管变性的打分刻度范围为从1至4(1＝最小损伤，2＝轻微损伤，3＝中等损伤，4＝严重损伤)。如表21和图5中所显示的，溶媒和hMSC治疗均导致轻微的肾小管变性，平均损伤得分为2.5。然而，较低剂量hUTC治疗导致最小的肾小管损伤，平均损伤得分为1.9，预示hUTC的肾脏保护潜能。
表21
组织学损害评价。由两位病理学家(病理学家A、B)独立地对肾小管变性的程度进行了打分。病理学家不知道治疗组分配。
| 溶媒 | hMSC | hUTC(低剂量) | |
| 动物编号 | 12 | 34 | 56 |
| 病理学家A | 33 | 32 | 2.52 |
| 病理学家B | 22 | 32 | 12 |
| 平均得分 | 轻微的(2.5) | 轻微的(2.5) | 最小的(1.9) |
代表损害得分的数值使用下面的评价等级，1＝最小的，2＝轻微的，3＝中等的，4＝严重的。
该数据显示hUTCs和hMSCs均保护肾脏避免顺铂诱导的肾毒性。该研究利用非常高浓度的顺铂，因此代表了严重肾毒性的模型。将来的研究将利用较低、亚致死剂量的顺铂。该较低剂量肾毒性模型将更能代表在人体观察到的损害类型。此外，hUTCs静脉给药将发生在顺铂输注后的至少二十四小时时。这将确保顺铂的血液水平非常低，且不太可能对hUTCs发挥负面影响。
与溶媒治疗的动物相比，采用0.2×106hUTC治疗受损害的小鼠导致存活率增加，Scr降低23％以及降低的肾小管变性。这些显著的发现表明，hUTC可能保护肾脏避免药物诱导的急性肾功能衰竭。
实施例10
人脐带组织来源的细胞在顺铂诱导肾毒性的大鼠模型中肾脏保护效能的
评价
在三十九只雄性Sprague Dawley中诱导肾毒性。在细胞给药之前二十四小时，将顺式-二氨二氯铂(顺铂)(Sigma Co.Cat#P4394，批#076K1697)经腹膜内(IP)注射给药(6mg/kg)。给药动物的剂量为5mL/kg的体积，剂量水平是基于最近收集的体重的。
将10代hUTC(批#Q091506)进行分离、扩增并冷藏保存在＜-120℃(液氮蒸气相)。hUTC表现正常核型并且没有病原体和支原体污染。
在细胞移植时，将hUTC在37℃解冻，用HBSS洗涤两次并以适当的浓度再次混悬于HBSS中。对动物给药一次，顺铂给药后二十四小时，在第1天时经静脉(IV)注射溶媒(Hanks平衡盐溶液(HBSS)，不含Ca++/Mg++(Invitrogen，Cat#14025，批#1226569))或hUTC，以2mL的体积和两分钟的大约输注速率。参见表22的治疗组分配。组1只接受溶媒，组2-4接受每只动物0.3×106、1×106和3×106细胞水平的hUTC。这些动物在给药时大约7-8周龄。
表22
实验设计
| 治疗组 | 动物数目 | 性别 | 试验材料 | 细胞剂量 |
| 1234 | 1010910 | 雄性雄性雄性雄性 | 溶媒hUTChUTChUTC | NA0.3x1061.0x063.0x06 |
在细胞或溶媒治疗(第1天)之前和顺铂治疗后第4、6和8天时，通过尾静脉穿刺收集血液样品。将血液样品进行处理得到血清，然后使用Olympus AU640化学免疫分析器测量BUN和SCr二者。
在第1、4、6和8天时评价血液样品的BUN和SCr(表23、图6、图7)。对所有动物给药了顺铂(组1-4)，且它们显示相似的基线水平，从第1天至第4天，所有组的平均BUN和SCr水平均显著增加。所有治疗组显示BUN和SCr二者水平的显著增加，治疗组平均水平的范围为：从第1天时的12-13mg/dL(Bun)和0.3mg/dL(SCr)至第4天时的62-68mg/dL(Bun)和1.8-2.2mg/dL(SCr)。然而，溶媒对照动物(组1)到第6天时显示降低的平均BUN和SCr(分别为34±10.4mg/dL和0.8±0.2mg/dL)，这在第8天时进一步降低，接近基线水平(分别为19±4.1mg/dL和0.5±0.1mg/dL)。这表明，肾毒性是短暂的，到第6天时开始逆转，到第8天时BUN和SCr水平接近基线。同样地，给药hUTC的动物(组2-4)的BUN和SCr与溶媒对照动物(组1)的那些数值是可比的或轻微地低于溶媒对照动物(组1)的那些数值。0.3×106(组2)和1×106细胞/动物(组3)剂量水平的细胞治疗在第6天和第8天时看起来几乎没有效果。然而，3×106细胞/动物(组4)剂量水平的hUTC治疗导致第6天时平均BUN和SCr数值均显著降低(分别为20±6.1mg/dL和0.5±0.12mg/dL)。
表23
血清化学分析
BUN
SCr
在细胞治疗之前和第4、6和8天(尸检之前)时，将动物置于代谢笼中，并在大约8-10小时的持续时间后，将尿液样品收集在刨冰上。测量尿液体积并记录尿液收集期间的总持续时间。然后使用Olympus AU640化学免疫分析器分析尿液样品的肌酸酐。使用下列方程测定肌酸酐清除率(CrCl)：CrCl＝尿液肌酸酐(mg/dL)×尿液体积(mL/小时)/[血清肌酸酐(mg/dL)×体重(kg)]。
在第1、4、6和8天时评价了尿液样品的SCr，然后计算了CrCl(表24、图8)。对所有动物给药了顺铂，它们显示相似的基线水平，从第1天至第4天，所有组的平均CrCl数值戏剧性地降低。所有治疗组显示CrCl显著增加，平均水平范围为从第1天的2.304-2.595ml/min至第4天的0.381-0.459ml/min。溶媒对照动物在第6天时显示CrCl增加(1.290ml/min)，这在第8天时进一步增加，接近基线水平(1.802ml/min)。这证实肾毒性损害的短暂性质，因为到第6天时肾功能开始改善，到第8天时CrCl水平接近基线。同样地，给药hUTC的动物(组2-4)的CrCl与溶媒对照动物的那些数值是可比的或轻微地低于溶媒对照动物的那些数值。与溶媒对照相比，3×106细胞/动物(组4)剂量水平的hUTC治疗在第6天时显示改善的CrCl(1.792ml/min对溶媒对照中的1.290mL/min).
表24
CrCl分析
描述了hUTC在顺铂诱导肾毒性的大鼠模型中的肾脏保护作用。与溶媒对照治疗相比，给药3.0e6hUTC导致BUN、SCr的中等降低和CrCl的增加。顺铂是恶性肿瘤化疗中最常使用的抗肿瘤药之一。因此，给药hUTC保护肾脏避免肾中毒性损害，最终改善经受化疗的癌症患者的结果和生命质量。此外，hUTC治疗可降低急性肾小管坏死的严重程度，并且甚至预防与其他医疗干预有关的ARF，诸如那些在心血管外科手术后以及在接受抗维生素药物、碘化物造影剂、麻醉药、免疫抑制剂和镇痛药的一些患者中所观察到的。
实施例11
人脐带组织来源的细胞在梗阻性肾病啮齿模型中肾脏保护效能的评价
该预言性实施例的目的是评价人脐带组织来源的细胞(hUTC)在肾脏损害的单向输尿管梗阻(UUO)模型中的肾脏保护作用。该UUO模型对短期、梗阻性肾病和肾小管间质性纤维化而言是一种有效的模型。为了评价肾脏保护效能，在细胞移植后十二天时，将评价受损伤的小鼠的细胞生物分布、血液-尿素-氮(BUN)、血清肌酸酐(SCr)和组织学损害。
将雌性C57BL/6J小鼠(Jackson实验室，Bar Harbor，Maine)用1-3％异氟烷进行麻醉。剃刮每只动物的腹部并用70％乙醇、随后用聚维酮碘清洁。制成中线的、腹部切口。将腹壁打开，将肠移除胸腔并用湿纱布保护。将左侧肾脏进行定位，并解剖输尿管使之没有脂肪。将两个8-0非吸收性结置于输尿管上。然后将肠放回腹部，并将一立方厘米的温盐水置于腹腔。将肌肉层用4-0Dexon缝合，并将皮肤用肘钉缝合。异氟烷将被中断，并将使小鼠在100％氧气中、在加热板上恢复直至能走动。
在动物从手术恢复后，立即将hUTC在37℃解冻，在Hanks平衡盐溶液w/o Ca++/Mg++(HBSS)中洗涤两次，并再次混悬于一毫升HBSS中。然后使用血细胞计数器对细胞进行计数，并通过锥虫蓝染料拒染法测量细胞存活率。将细胞以1.0×106存活/毫升的浓度在HBSS中重溶。然后，使用配有27-计量注射针的一毫升注射器，将混悬于200微升HBSS中的细胞经由尾静脉注射移植。
通过二氧化碳窒息将所有动物在细胞移植后第12天时处死。从每只动物中取出肾脏、肺脏、脑和心脏。然后将每个肾脏的一半在10％中性缓冲福尔马林中固定用于组织学分析。将剩余的一半肾脏和所有其他器官快速冷冻于液氮中。然后使用配有7mm一次性转子-定子发动器探针的OmniTH匀浆器(Omni International，Inc.，Marietta，GA)将所有冷冻的器官匀浆化。然后使用RNeasy Plus Mini试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)提取总RNA。将RNA用50μL DEPC-处理过的水洗脱，并使用NanoDrop 1000(NanoDropTechnologies，Wilmington，DE)进行定量。使用随机六聚物和Taqman逆转录试剂(Applied Biosystems，Foster City，CA)将RNA进行逆转录。使用人特异的β2微球蛋白引物探针(目录号4310886E，Applied Biosystems，FosterCity，CA)对cDNA样品进行PCR反应。将使用ABI Prism 7900HT序列检测系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行PCR。
在尸检时，将收集全部的血液，使其凝结，将其置于微量离心管中，并在2500rpm下离心15分钟以将血清与其他血液组分分开。然后将使用VetAce化学分析器(Alpha Wassermann Diagnostic Technologies，LLC，WestCaldwell，NJ)分析血清样品。
将固定的肾脏组织埋入石蜡中，切片(5μm-厚)并用苏木素/曙红(H&E)和Masson’s Trichrome染色。然后使用范围为1至4的打分指数(1＝最小的，2＝轻微的，3＝中等的，4＝严重的)，对切片的肾小管损害(肾小管坏死、膨胀、间质细胞浸润)和间质性纤维化(胶原沉积)进行打分。评价者将不知道治疗组分配。
期望给药人脐带组织来源的细胞将导致肾小管损害全部内容的降低，如通过组织学评价所评定的。
实施例12
局部人脐带组织-来源的细胞移植在慢性肾脏疾病5/6残余模型中肾脏保护
效能的评价
该预言性实施例的目的是测定hUTC的局部、被膜下植入在慢性肾脏疾病的啮齿模型中的肾脏保护作用。
最初重量为200-250g的SD大鼠(n＝30，8周龄，雄性)将用于这些实验。采用腹膜内注射(5mg/kg)盐酸氯胺酮和盐酸赛拉嗪的4∶1溶液将这些大鼠麻醉。将通过两阶段的肾脏切除术操作诱导肾功能衰竭。在保留副肾的同时，将使用结扎丝线将左侧肾脏的上和下部分(一个肾脏的三分之二)切除。十天后，将右侧肾脏移除，剩下总肾脏质量的约1/6(5/6肾脏切除术)。将采用甲基纤维素施加软压力止血，采用可吸收的4-O Vicryl缝线将腹膜和皮肤分层缝合。
5/6-肾脏切除术操作后五周，使用纤维蛋白凝胶基质将hUTC移植入肾功能衰竭大鼠剩余组织的被膜中。将配制含hUTC(60百万细胞)和凝血酶溶液(1.0mL)的纤维蛋白原溶液(1.0mL)。大鼠将被麻醉，并通过中线剖腹术将残留的肾脏暴露。通过计划用于纤维蛋白和凝血酶溶液同时注射的注射器，将0.1mL含细胞的凝血酶和纤维蛋白原溶液的1∶1(体积比)混合物通过18-计量皮下注射针注射被膜下空间。作为对照，对5/6肾切除的大鼠只注射纤维蛋白基质。
血清样品将在第0天(5/6肾脏切除术之前)和第1天(细胞移植的当天)、第7、14、21、28和35天(尸检的当天)时获得。将使用VetAce化学分析器(Alpha Wassermann Diagnostic Technologies，LLC，West Caldwell，NJ)对血尿素氮和肌酸酐进行定量。
将通过二氧化碳窒息将所有组的动物在细胞移植后五周时处死。将取出肾脏用于组织学和转录分析。将每一个肾脏的一半快速冷冻于液氮中用于RT-PCR分析。通过研究协调器从冷冻的肾脏组织中分离信使RNA，并利用含促纤维化和炎症性基因的低密度微阵列卡片将所述信使RNA进行转录分析。将剩余的角膜肾脏切片固定于10％中性缓冲福尔马林中用于下游组织学分析。
将固定用于组织学的肾脏组织进行组织学处理、切片(5μm-厚)并用苏木素/曙红染色。将通过兽医病理学对肾小管损害进行评价和打分。
在本研究中，期望埋入纤维蛋白中的6.0e6hUTC被膜下移植减缓5/6肾切除啮齿类肾脏损害的进程。期望与对照动物相比，在hUTC治疗的动物中血清肌酸酐和血尿素氮数值均将显著地降低。此外，组织学损伤评价将显示在治疗的动物中肾小管坏死和肾小管膨胀的降低。也期望观察到，相对于对照组肾脏，在hUTC治疗的啮齿肾脏中炎症性基因表达的整体程度降低。
序列表
<110>COLTER，DAVID
GOSIEWSKA，ANNA
<120>使用人脐带组织来源的细胞进行肾脏组织的修复和再生
<130>026038.0221PLUS
<140>
<141>
<150>60/977,775
<151>2007-10-05
<160>10
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成引物
<400>1
gagaaatcca aagagcaaat gg 22
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成引物
<400>2
agaatggaaa actggaatag g 21
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成引物
<400>3
tcttcgatgc ttcggattcc 20
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成引物
<400>4
gaattctcgg aatctctgtt g 21
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成引物
<400>5
ttacaagcag tgcagaaaac c 21
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成引物
<400>6
agtaaacatt gaaaccacag cc 22
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成引物
<400>7
tctgcagctc tgtgtgaagg 20
<210>8
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成引物
<400>8
cttcaaaaac ttctccacaa cc 22
<210>9
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成引物
<400>9
cccacgccac gctctcc 17
<210>10
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成引物
<400>10
tcctgtcagt tggtgctcc 19
Claims (25)
1.一种治疗至少一个肾脏患病或受损伤的患者的方法，其包括为所述患者给药治疗疾病或损伤有效量的从人脐带组织获得的细胞，其中所述脐带组织基本上不含血，且其中所述细胞能够在培养中自我更新和扩增，并具有分化的潜能；需要L-缬氨酸用于生长；可在至少约5％氧气中生长；不产生CD117或HLA-DR；表达α平滑肌肌动蛋白；并相对于人成纤维细胞、间质干细胞、或髂嵴骨髓细胞表达水平增加的氧化低密度脂蛋白受体1、白介素8或浆膜蛋白1。
2.根据权利要求1的方法，其中所述细胞表达氧化低密度脂蛋白受体1、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3和/或粒细胞趋化蛋白2。
3.根据权利要求1的方法，其中所述细胞表达CD10、CD13、CD44、CD73和CD90。
4.根据权利要求1的方法，其中所述细胞是通过注射或输注给药的。
5.根据权利要求1的方法，其中所述细胞是封装于可植入的装置中给药的。
6.根据权利要求1的方法，其中所述细胞是通过植入包括所述细胞的基质给药的。
7.根据权利要求1的方法，其中所述细胞是与至少一种其他细胞类型给药的。
8.根据权利要求7的方法，其中所述至少一种其他细胞类型是与从人脐带组织获得的细胞同时、或其之前、或其之后给药的。
9.根据权利要求1的方法，其中所述细胞是与至少一种药物给药的。
10.根据权利要求9的方法，其中所述至少一种药物是与从人脐带组织获得的细胞同时、其之前、或其之后给药的。
11.根据权利要求1的方法，其中所述细胞对患者的肾脏发挥营养作用。
12.根据权利要求1的方法，其中所述对肾脏的损伤是由年龄、创伤、毒素暴露、药物暴露、放射暴露、氧化、免疫复合物沉积或移植排斥引起的。
13.一种用于治疗至少一个肾脏患病或受损伤的患者的药物组合物，其包括药学上可接受的载体和治疗疾病或损伤有效量的从人脐带组织获得的细胞，其中所述脐带组织基本上不含血，且其中所述细胞能够在培养中自我更新和扩增，并具有分化的潜能；需要L-缬氨酸用于生长；可在至少约5％氧气中生长；不产生CD117或HLA-DR；表达α平滑肌肌动蛋白；并相对于人成纤维细胞、间质干细胞、或髂嵴骨髓细胞表达水平增加的氧化低密度脂蛋白受体1、白介素8或浆膜蛋白1。
14.根据权利要求13的药物组合物，其中所述对肾脏的损伤是由年龄、创伤、毒素暴露、药物暴露、放射暴露、氧化、免疫复合物沉积或移植排斥引起的。
15.根据权利要求13的药物组合物，其进一步包括至少一种其他细胞类型。
16.根据权利要求13的药物组合物，其进一步包括至少一种药物。
17.根据权利要求13的药物组合物，其被制成用于注射或输注给药的剂型。
18.根据权利要求13的药物组合物，其中所述细胞封装于可植入装置中。
19.根据权利要求13的药物组合物，其中所述细胞被接种于基质中。
20.一种用于治疗至少一个肾脏患病或受损伤的患者的试剂盒，其包括药学上可接受的载体、治疗疾病或损伤有效量的从人脐带组织获得的细胞，其中所述脐带组织基本上不含血，且其中所述细胞能够在培养中自我更新和扩增，并具有分化的潜能；需要L-缬氨酸用于生长；可在至少约5％氧气中生长；不产生CD117或HLA-DR；表达α平滑肌肌动蛋白；并相对于人成纤维细胞、间质干细胞、或髂嵴骨髓细胞表达水平增加的氧化低密度脂蛋白受体1、白介素8或浆膜蛋白1，以及在治疗至少一个肾脏患病或受损伤的患者的方法中使用所述试剂盒的指导。
21.根据权利要求20的试剂盒，其进一步包括用于培养细胞的至少一种试剂和指导。
22.根据权利要求20的试剂盒，其进一步包括至少一种其他细胞类型的群。
23.根据权利要求20的试剂盒，其进一步包括至少一种药物。
24.一种治疗至少一个肾脏患病或受损伤的患者的方法，其包括为所述患者给药包括可溶性细胞碎片、裂解物、细胞外基质或由从人脐带组织获得的细胞制备的条件培养基的组合物，其中所述脐带组织基本上不含血，且其中所述细胞能够在培养中自我更新和扩增，并具有分化的潜能；需要L-缬氨酸用于生长；可在至少约5％氧气中生长；不产生CD117或HLA-DR；表达α平滑肌肌动蛋白；并相对于人成纤维细胞、间质干细胞、或髂嵴骨髓细胞表达水平增加的氧化低密度脂蛋白受体1、白介素8或浆膜蛋白1。
25.一种用于治疗至少一个肾脏患病或受损伤的患者的药物组合物，其包括药学上可接受的载体和裂解物、细胞外基质或由从人脐带组织获得的细胞制备的条件培养基，其中所述脐带组织基本上不含血，且其中所述细胞能够在培养中自我更新和扩增，并具有分化的潜能；需要L-缬氨酸用于生长；可在至少约5％氧气中生长；不产生CD117或HLA-DR；表达α平滑肌肌动蛋白；并相对于人成纤维细胞、间质干细胞、或髂嵴骨髓细胞表达水平增加的氧化低密度脂蛋白受体1、白介素8或浆膜蛋白1。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US97777507P | 2007-10-05 | 2007-10-05 | |
| US60/977775 | 2007-10-05 | ||
| US60/977,775 | 2007-10-05 | ||
| PCT/US2008/078800 WO2009046335A1 (en) | 2007-10-05 | 2008-10-03 | Repair and regeneration of renal tissue using human umbilical cord tissue-derived cells |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102036688A true CN102036688A (zh) | 2011-04-27 |
| CN102036688B CN102036688B (zh) | 2014-07-02 |
Family
ID=40523441
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200880119184.6A Expired - Fee Related CN102036688B (zh) | 2007-10-05 | 2008-10-03 | 使用人脐带组织来源的细胞进行肾脏组织的修复和再生 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8034329B2 (zh) |
| EP (1) | EP2203186B1 (zh) |
| JP (1) | JP5323845B2 (zh) |
| CN (1) | CN102036688B (zh) |
| AU (1) | AU2008308531B2 (zh) |
| BR (1) | BRPI0818183A2 (zh) |
| CA (1) | CA2701435C (zh) |
| ES (1) | ES2525718T3 (zh) |
| UA (1) | UA99152C2 (zh) |
| WO (1) | WO2009046335A1 (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104837987A (zh) * | 2011-12-23 | 2015-08-12 | 德普伊新特斯产品有限责任公司 | 人脐带组织来源的细胞的检测 |
| CN112569408A (zh) * | 2020-12-01 | 2021-03-30 | 暨南大学 | 组织工程补片及其制备方法 |
Families Citing this family (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090169597A1 (en) * | 2007-12-27 | 2009-07-02 | Ethicon, Incorporated | Treatment of intervertebral disc degeneration using human umbilical cord tissue-derived cells |
| US8518390B2 (en) | 2003-06-27 | 2013-08-27 | Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc | Treatment of stroke and other acute neural degenerative disorders via intranasal administration of umbilical cord-derived cells |
| US9572840B2 (en) | 2003-06-27 | 2017-02-21 | DePuy Synthes Products, Inc. | Regeneration and repair of neural tissue using postpartum-derived cells |
| US9592258B2 (en) | 2003-06-27 | 2017-03-14 | DePuy Synthes Products, Inc. | Treatment of neurological injury by administration of human umbilical cord tissue-derived cells |
| US8703121B2 (en) | 2003-06-27 | 2014-04-22 | DePuy Synthes Products, LLC | Postpartum-derived cells for use in treatment of disease of the heart and circulatory system |
| US8491883B2 (en) * | 2003-06-27 | 2013-07-23 | Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc | Treatment of amyotrophic lateral sclerosis using umbilical derived cells |
| US8790637B2 (en) | 2003-06-27 | 2014-07-29 | DePuy Synthes Products, LLC | Repair and regeneration of ocular tissue using postpartum-derived cells |
| US7875272B2 (en) * | 2003-06-27 | 2011-01-25 | Ethicon, Incorporated | Treatment of stroke and other acute neuraldegenerative disorders using postpartum derived cells |
| US9125906B2 (en) | 2005-12-28 | 2015-09-08 | DePuy Synthes Products, Inc. | Treatment of peripheral vascular disease using umbilical cord tissue-derived cells |
| US8236538B2 (en) | 2007-12-20 | 2012-08-07 | Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc | Methods for sterilizing materials containing biologically active agents |
| WO2010021714A2 (en) | 2008-08-20 | 2010-02-25 | Anthrogenesis Corporation | Improved cell composition and methods of making the same |
| MX2011001992A (es) | 2008-08-22 | 2011-03-29 | Anthrogenesis Corp | Metodos y composiciones para el tratamiento de defectos oseos con poblaciones de celulas placentarias. |
| RU2015130665A (ru) | 2008-11-19 | 2018-12-24 | Антродженезис Корпорейшн | Амниотические адгезивные клетки |
| AU2009327383B2 (en) * | 2008-12-19 | 2014-08-28 | DePuy Synthes Products, LLC | Regeneration and repair of neural tissue following injury |
| AU2009327384B2 (en) | 2008-12-19 | 2014-07-10 | DePuy Synthes Products, LLC | Treatment of lung and pulmonary diseases and disorders |
| US10179900B2 (en) | 2008-12-19 | 2019-01-15 | DePuy Synthes Products, Inc. | Conditioned media and methods of making a conditioned media |
| EP2411504B1 (en) | 2009-03-26 | 2017-05-10 | DePuy Synthes Products, Inc. | Human umbilical cord tissue cells as therapy for alzheimer's disease |
| US8796315B2 (en) | 2009-06-25 | 2014-08-05 | Darlene E. McCord | Methods for improved wound closure employing olivamine and human umbilical vein endothelial cells |
| US20130052198A1 (en) * | 2010-03-29 | 2013-02-28 | The General Hospital Corporation | Anti-inflammatory factors |
| CN102933221A (zh) | 2010-04-08 | 2013-02-13 | 人类起源公司 | 使用胎盘干细胞治疗结节病 |
| LT2576768T (lt) | 2010-06-01 | 2017-08-25 | Auxocell Laboratories, Inc. | Gamtinės wharton`s jelly kamieninės ląstelės ir jų gryninimas |
| WO2012092485A1 (en) | 2010-12-31 | 2012-07-05 | Anthrogenesis Corporation | Enhancement of placental stem cell potency using modulatory rna molecules |
| MX357749B (es) | 2011-06-01 | 2018-07-23 | Anthrogenesis Corp | Tratamiento contra el dolor utilizando células madre placentarias. |
| US20150284689A1 (en) * | 2012-10-26 | 2015-10-08 | The Regents Of The University Of California | Strategy for engineering various 3d tissues, organoids and vasculature |
| CA2892375A1 (en) | 2012-11-30 | 2014-06-05 | Darlene E. MCCORD | Hydroxytyrosol and oleuropein compositions for induction of dna damage, cell death and lsd1 inhibition |
| WO2014159826A1 (en) * | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Antrhogenesis Corporation | Use of placental stem cells in treatment of acute kidney injury |
| WO2016068867A1 (en) | 2014-10-28 | 2016-05-06 | Cummins Emission Solutions, Inc. | Scr conversion efficiency diagnostics |
| CN109477067A (zh) * | 2016-11-15 | 2019-03-15 | 再生生物科学私人有限公司 | 制备颊上皮细胞悬液的方法及其用途 |
| WO2019139137A1 (ja) | 2018-01-12 | 2019-07-18 | 国立大学法人大阪大学 | 重層扁平上皮細胞の正常分化・成熟促進剤、上皮疾患治療剤及び重層扁平上皮細胞の正常分化・成熟促進方法 |
Family Cites Families (156)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4352883A (en) | 1979-03-28 | 1982-10-05 | Damon Corporation | Encapsulation of biological material |
| US4963489A (en) | 1987-04-14 | 1990-10-16 | Marrow-Tech, Inc. | Three-dimensional cell and tissue culture system |
| US5863531A (en) * | 1986-04-18 | 1999-01-26 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework |
| US5902741A (en) | 1986-04-18 | 1999-05-11 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | Three-dimensional cartilage cultures |
| US5266480A (en) | 1986-04-18 | 1993-11-30 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | Three-dimensional skin culture system |
| JPS642643A (en) | 1987-06-26 | 1989-01-06 | Bio Material Yunibaasu:Kk | Artificial skin |
| NZ226750A (en) | 1987-10-29 | 1990-09-26 | Amrad Corp Ltd | Immortalisation of neural precursor cells by introducing a retrovirus vector containing a myc-oncogene |
| US5192553A (en) * | 1987-11-12 | 1993-03-09 | Biocyte Corporation | Isolation and preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood and methods of therapeutic use |
| US5004681B1 (en) * | 1987-11-12 | 2000-04-11 | Biocyte Corp | Preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood |
| US20030032178A1 (en) * | 1988-08-04 | 2003-02-13 | Williams Robert Lindsay | In vitro propagation of embryonic stem cells |
| US5437994A (en) | 1989-06-15 | 1995-08-01 | Regents Of The University Of Michigan | Method for the ex vivo replication of stem cells, for the optimization of hematopoietic progenitor cell cultures, and for increasing the metabolism, GM-CSF secretion and/or IL-6 secretion of human stromal cells |
| US5840580A (en) | 1990-05-01 | 1998-11-24 | Becton Dickinson And Company | Phenotypic characterization of the hematopoietic stem cell |
| US5342761A (en) | 1990-10-01 | 1994-08-30 | Research Development Foundation | Oncofetal gene, gene product and uses therefor |
| US5486359A (en) * | 1990-11-16 | 1996-01-23 | Osiris Therapeutics, Inc. | Human mesenchymal stem cells |
| US5811094A (en) | 1990-11-16 | 1998-09-22 | Osiris Therapeutics, Inc. | Connective tissue regeneration using human mesenchymal stem cell preparations |
| US5286632A (en) * | 1991-01-09 | 1994-02-15 | Jones Douglas H | Method for in vivo recombination and mutagenesis |
| US6399369B1 (en) * | 1991-07-08 | 2002-06-04 | Neurospheres Holdings Ltd. | Multipotent neural stem cell cDNA libraries |
| AU4543193A (en) | 1992-06-22 | 1994-01-24 | Henry E. Young | Scar inhibitory factor and use thereof |
| US5320962A (en) * | 1992-07-22 | 1994-06-14 | Duke University | DNA encoding the human A1 adenosine receptor |
| US5589376A (en) | 1992-07-27 | 1996-12-31 | California Institute Of Technology | Mammalian neural crest stem cells |
| AU673865B2 (en) | 1992-10-29 | 1996-11-28 | Australian National University, The | Angiogenesis inhibitory antibodies |
| US5955343A (en) | 1992-12-28 | 1999-09-21 | Massachusetts Institute Of Technology | Stable macroscopic membranes formed by self-assembly of amphiphilic peptides and uses therefor |
| US5670483A (en) | 1992-12-28 | 1997-09-23 | Massachusetts Insititute Of Technology | Stable macroscopic membranes formed by self-assembly of amphiphilic peptides and uses therefor |
| US5707643A (en) * | 1993-02-26 | 1998-01-13 | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | Biodegradable scleral plug |
| IL110589A0 (en) | 1993-08-10 | 1994-11-11 | Bioph Biotech Entw Pharm Gmbh | Growth/differentiation factor of the TGF- beta family |
| US6686198B1 (en) * | 1993-10-14 | 2004-02-03 | President And Fellows Of Harvard College | Method of inducing and maintaining neuronal cells |
| US6432711B1 (en) | 1993-11-03 | 2002-08-13 | Diacrin, Inc. | Embryonic stem cells capable of differentiating into desired cell lines |
| US5698518A (en) | 1994-03-30 | 1997-12-16 | Oklahoma Medical Research Foundation | Method for regulating inflammation and tumor growth with calmodulin, calmodulin analogues or calmodulin antagonists |
| US5834308A (en) | 1994-04-28 | 1998-11-10 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | In vitro growth of functional islets of Langerhans |
| US6001647A (en) | 1994-04-28 | 1999-12-14 | Ixion Biotechnology, Inc. | In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof |
| US6703017B1 (en) * | 1994-04-28 | 2004-03-09 | Ixion Biotechnology, Inc. | Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures |
| US5725493A (en) * | 1994-12-12 | 1998-03-10 | Avery; Robert Logan | Intravitreal medicine delivery |
| US5843780A (en) * | 1995-01-20 | 1998-12-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Primate embryonic stem cells |
| US5736396A (en) | 1995-01-24 | 1998-04-07 | Case Western Reserve University | Lineage-directed induction of human mesenchymal stem cell differentiation |
| US5906934A (en) * | 1995-03-14 | 1999-05-25 | Morphogen Pharmaceuticals, Inc. | Mesenchymal stem cells for cartilage repair |
| US5869079A (en) * | 1995-06-02 | 1999-02-09 | Oculex Pharmaceuticals, Inc. | Formulation for controlled release of drugs by combining hydrophilic and hydrophobic agents |
| US5641750A (en) * | 1995-11-29 | 1997-06-24 | Amgen Inc. | Methods for treating photoreceptors using glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product |
| US6200606B1 (en) * | 1996-01-16 | 2001-03-13 | Depuy Orthopaedics, Inc. | Isolation of precursor cells from hematopoietic and nonhematopoietic tissues and their use in vivo bone and cartilage regeneration |
| US5842477A (en) | 1996-02-21 | 1998-12-01 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | Method for repairing cartilage |
| ATE259419T1 (de) | 1996-03-15 | 2004-02-15 | Munin Corp | Humanes cyr61, ein signalmolekül der extrazellulaeren matrix |
| WO1997041208A1 (en) | 1996-04-26 | 1997-11-06 | Case Western Reserve University | Skin regeneration using mesenchymal stem cells |
| US6787355B1 (en) * | 1996-08-26 | 2004-09-07 | Mcgill University | Multipotent neural stem cells from peripheral tissues and uses thereof |
| US5919702A (en) * | 1996-10-23 | 1999-07-06 | Advanced Tissue Science, Inc. | Production of cartilage tissue using cells isolated from Wharton's jelly |
| JP4132089B2 (ja) * | 1997-05-30 | 2008-08-13 | オステオバイオロジックス，インコーポレイテッド | 繊維強化多孔性生体分解性移植デバイス |
| US5902598A (en) * | 1997-08-28 | 1999-05-11 | Control Delivery Systems, Inc. | Sustained release drug delivery devices |
| CA2312847C (en) * | 1997-12-02 | 2014-09-30 | Zen Bio, Inc. | Differentiation of adipose stromal cells into osteoblasts and uses thereof |
| US6291240B1 (en) | 1998-01-29 | 2001-09-18 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | Cells or tissues with increased protein factors and methods of making and using same |
| JP4441115B2 (ja) * | 1998-03-13 | 2010-03-31 | オシリス セラピューティクス，インコーポレイテッド | ヒト非自己間葉幹細胞を使用する方法と利用 |
| US6171610B1 (en) * | 1998-04-24 | 2001-01-09 | University Of Massachusetts | Guided development and support of hydrogel-cell compositions |
| JP2002513545A (ja) * | 1998-05-07 | 2002-05-14 | ザ ユニヴァーシティー オブ サウス フロリダ | 脳および脊髄修復のためのニューロン源としての骨髄細胞 |
| DE69936720T2 (de) * | 1998-05-29 | 2008-04-30 | Osiris Therapeutics, Inc. | Menschliche cd45+ und/oder fibroblasten+ mesenchymale stammzellen |
| US6323188B1 (en) | 1998-07-01 | 2001-11-27 | Donald L. Weissman | Treatment and prevention of cardiovascular diseases, heart attack, and stroke, primary and subsequent, with help of aspirin and certain vitamins |
| US20040037818A1 (en) * | 1998-07-30 | 2004-02-26 | Brand Stephen J. | Treatment for diabetes |
| US5958767A (en) * | 1998-08-14 | 1999-09-28 | The Children's Medical Center Corp. | Engraftable human neural stem cells |
| US6284245B1 (en) | 1998-08-25 | 2001-09-04 | Diacrin, Inc. | Neural retinal cells and retinal pigment epithelium cells and their use in treatment of retinal disorders |
| US6444205B2 (en) | 1998-09-30 | 2002-09-03 | Diacrin, Inc. | Transplantation of neural cells for the treatment of chronic pain or spasticity |
| US6610540B1 (en) * | 1998-11-18 | 2003-08-26 | California Institute Of Technology | Low oxygen culturing of central nervous system progenitor cells |
| AU781750B2 (en) | 1999-02-04 | 2005-06-09 | Mcgill University | Platform for the differentiation of cells |
| AU780794B2 (en) | 1999-02-10 | 2005-04-14 | Es Cell International Pte Ltd | Pancreatic progenitor cells, methods and uses related thereto |
| US20030007954A1 (en) * | 1999-04-12 | 2003-01-09 | Gail K. Naughton | Methods for using a three-dimensional stromal tissue to promote angiogenesis |
| CA2370330C (en) * | 1999-04-16 | 2009-01-20 | Wm. Marsh Rice University | Biodegradable poly(propylene fumarate) networks cross linked with poly(propylene fumarate)-diacrylate macromers |
| US6372494B1 (en) * | 1999-05-14 | 2002-04-16 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | Methods of making conditioned cell culture medium compositions |
| US6287340B1 (en) * | 1999-05-14 | 2001-09-11 | Trustees Of Tufts College | Bioengineered anterior cruciate ligament |
| US7621606B2 (en) * | 2001-08-27 | 2009-11-24 | Advanced Cell Technology, Inc. | Trans-differentiation and re-differentiation of somatic cells and production of cells for cell therapies |
| US6333029B1 (en) * | 1999-06-30 | 2001-12-25 | Ethicon, Inc. | Porous tissue scaffoldings for the repair of regeneration of tissue |
| US6355699B1 (en) * | 1999-06-30 | 2002-03-12 | Ethicon, Inc. | Process for manufacturing biomedical foams |
| US6429013B1 (en) | 1999-08-19 | 2002-08-06 | Artecel Science, Inc. | Use of adipose tissue-derived stromal cells for chondrocyte differentiation and cartilage repair |
| US6555374B1 (en) * | 1999-08-19 | 2003-04-29 | Artecel Sciences, Inc. | Multiple mesodermal lineage differentiation potentials for adipose tissue-derived stromal cells and uses thereof |
| US6331313B1 (en) | 1999-10-22 | 2001-12-18 | Oculex Pharmaceticals, Inc. | Controlled-release biocompatible ocular drug delivery implant devices and methods |
| US20030129745A1 (en) * | 1999-10-28 | 2003-07-10 | Robl James M. | Gynogenetic or androgenetic production of pluripotent cells and cell lines, and use thereof to produce differentiated cells and tissues |
| US20020164307A1 (en) | 1999-12-06 | 2002-11-07 | Habener Joel F. | Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus |
| US20030082155A1 (en) * | 1999-12-06 | 2003-05-01 | Habener Joel F. | Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus |
| US6866843B2 (en) | 1999-12-06 | 2005-03-15 | Viacell, Inc. | Method of transplanting in a mammal and treating diabetes mellitus by administering a pseudo-islet like aggregate differentiated from a nestin-positive pancreatic stem cell |
| US7785882B2 (en) | 2000-01-18 | 2010-08-31 | Cornell Research Foundation, Inc. | Neuronal progenitor cells from hippocampal tissue and a method for isolating and purifying them |
| US7544509B2 (en) * | 2000-01-24 | 2009-06-09 | Mcgill University | Method for preparing stem cell preparations |
| US6610535B1 (en) | 2000-02-10 | 2003-08-26 | Es Cell International Pte Ltd. | Progenitor cells and methods and uses related thereto |
| CA2399434C (en) | 2000-02-11 | 2010-10-19 | The Schepens Eye Research Institute, Inc. | Isolation and transplantation of retinal stem cells |
| JP2003521935A (ja) | 2000-02-11 | 2003-07-22 | フイラデルフイア・ヘルス・アンド・エデユケーシヨン・コーポレーシヨン | 骨髄細胞のニューロン細胞への分化およびそのための使用 |
| IL151650A0 (en) * | 2000-03-09 | 2003-04-10 | Saneron Ccel Therapeutics Inc | Human cord blood as a source of neural tissue for repair of the brain and spinal cord |
| US6436704B1 (en) | 2000-04-10 | 2002-08-20 | Raven Biotechnologies, Inc. | Human pancreatic epithelial progenitor cells and methods of isolation and use thereof |
| US6673606B1 (en) * | 2000-04-12 | 2004-01-06 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Therapeutic uses for mesenchymal stromal cells |
| US6375972B1 (en) * | 2000-04-26 | 2002-04-23 | Control Delivery Systems, Inc. | Sustained release drug delivery devices, methods of use, and methods of manufacturing thereof |
| WO2001088103A2 (en) | 2000-05-12 | 2001-11-22 | University Of Utah Research Foundation | Compositions and methods for tissue dedifferentiation and regeneration |
| US8273570B2 (en) | 2000-05-16 | 2012-09-25 | Riken | Process of inducing differentiation of embryonic cell to cell expressing neural surface marker using OP9 or PA6 cells |
| US6759039B2 (en) * | 2000-06-30 | 2004-07-06 | Amcyte, Inc. | Culturing pancreatic stem cells having a specified, intermediate stage of development |
| US6984522B2 (en) | 2000-08-03 | 2006-01-10 | Regents Of The University Of Michigan | Isolation and use of solid tumor stem cells |
| AU2001293586A1 (en) | 2000-09-29 | 2002-04-08 | Vincent Tropepe | Primitive neural stem cells and method for differentiation of stem cells to neural cells |
| US20020098584A1 (en) * | 2000-11-06 | 2002-07-25 | Palmer Theo D. | Postmortem stem cells |
| KR20030088022A (ko) | 2000-11-30 | 2003-11-15 | 스템론 인크. | 단리된 동종접합 간세포, 그로부터 유래된 분화 세포 및이들을 제조 및 사용하기 위한 물질 및 방법 |
| US7311905B2 (en) | 2002-02-13 | 2007-12-25 | Anthrogenesis Corporation | Embryonic-like stem cells derived from post-partum mammalian placenta, and uses and methods of treatment using said cells |
| IL156303A0 (en) | 2000-12-06 | 2004-01-04 | Robert J Hariri | Method of collecting placental stem cells |
| US6599323B2 (en) * | 2000-12-21 | 2003-07-29 | Ethicon, Inc. | Reinforced tissue implants and methods of manufacture and use |
| US7449180B2 (en) | 2001-02-06 | 2008-11-11 | John Kisiday | Macroscopic scaffold containing amphiphilic peptides encapsulating cells |
| EP2316463B1 (en) | 2001-02-14 | 2017-04-12 | Anthrogenesis Corporation | Tissue matrices comprising placental stem cells, and methods of making them |
| EP2314673B1 (en) * | 2001-02-14 | 2013-07-24 | Anthrogenesis Corporation | Post-partum mammalian placenta, its use and placental stem cells therefrom |
| CA2442177A1 (en) | 2001-03-29 | 2002-10-10 | Ixion Biotechnology, Inc. | Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic differentiation pathway |
| US20030211605A1 (en) | 2001-05-01 | 2003-11-13 | Lee Sang-Hun | Derivation of midbrain dopaminergic neurons from embryonic stem cells |
| US20030022369A1 (en) * | 2001-05-18 | 2003-01-30 | Helen Fillmore | Differentiation of specialized dermal and epidermal cells into neuronal cells |
| CA2451838A1 (en) * | 2001-05-25 | 2002-12-05 | Cythera, Inc. | Stem cell differentiation |
| CN1349845A (zh) * | 2001-06-22 | 2002-05-22 | 高大勇 | 分离脐血干细胞防冻剂的透析方法及透析装置 |
| EP1423504B1 (en) * | 2001-08-08 | 2009-09-23 | Levesque Biosciences, Inc. | Compositions and methods for isolation, propagation, and differentiation of non-embryonic human stem cells and uses thereof |
| US20030211603A1 (en) | 2001-08-14 | 2003-11-13 | Earp David J. | Reprogramming cells for enhanced differentiation capacity using pluripotent stem cells |
| US20030104997A1 (en) * | 2001-09-05 | 2003-06-05 | Black Ira B. | Multi-lineage directed induction of bone marrow stromal cell differentiation |
| CN1195055C (zh) | 2001-09-06 | 2005-03-30 | 周胜利 | 从胎盘组织中提取造血干细胞用于建立造血干细胞库的新方法 |
| EP1444345A4 (en) * | 2001-10-18 | 2004-12-08 | Ixion Biotechnology Inc | TRANSFORMATION OF STEM CELLS AND LIVER PROGENITORS INTO FUNCTIONAL CELLS OF PANCREAS |
| US7129034B2 (en) * | 2001-10-25 | 2006-10-31 | Cedars-Sinai Medical Center | Differentiation of whole bone marrow |
| EP1453954A4 (en) * | 2001-11-09 | 2004-12-15 | Artecel Sciences Inc | ENDOCRINE PANCREATIC DIFFERENTIATION OF STROMAL CELLS DERIVED FROM FATTY TISSUE AND USE OF SAID CELLS |
| JP3728750B2 (ja) * | 2001-11-22 | 2005-12-21 | ニプロ株式会社 | 培養皮膚及びその製造方法 |
| US20030109036A1 (en) * | 2001-12-06 | 2003-06-12 | The Regents Of The University Of California | Method for differentiating islet precursor cells into beta cells |
| US7033831B2 (en) * | 2001-12-07 | 2006-04-25 | Geron Corporation | Islet cells from human embryonic stem cells |
| JP3934539B2 (ja) | 2001-12-12 | 2007-06-20 | 独立行政法人科学技術振興機構 | 胎盤等由来の成体又は生後組織の前駆細胞 |
| US20030113910A1 (en) * | 2001-12-18 | 2003-06-19 | Mike Levanduski | Pluripotent stem cells derived without the use of embryos or fetal tissue |
| US7101546B2 (en) | 2001-12-21 | 2006-09-05 | Amcyte, Inc. | In situ maturation of cultured pancreatic stem cells having a specified, intermediate stage of development |
| AU2002350352A1 (en) * | 2001-12-21 | 2003-07-15 | Mount Sinai Hospital | Cellular compositions and methods of making and using them |
| CA2473503C (en) | 2002-01-14 | 2010-01-05 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Use of modified pyrimidine compounds to promote stem cell migration and proliferation |
| US20030162290A1 (en) * | 2002-01-25 | 2003-08-28 | Kazutomo Inoue | Method for inducing differentiation of embryonic stem cells into functioning cells |
| WO2003070189A2 (en) | 2002-02-15 | 2003-08-28 | Cornell Research Foundation, Inc. | Enhancing neurotrophin-induced neurogenesis by endogenous neural progenitor cells by concurrent overexpression of brain derived neurotrophic factor and an inhibitor of a pro-gliogenic bone morphogenetic protein |
| US7736892B2 (en) * | 2002-02-25 | 2010-06-15 | Kansas State University Research Foundation | Cultures, products and methods using umbilical cord matrix cells |
| US20030161818A1 (en) * | 2002-02-25 | 2003-08-28 | Kansas State University Research Foundation | Cultures, products and methods using stem cells |
| US7150990B2 (en) | 2002-03-06 | 2006-12-19 | Reprocell, Inc. | Self-renewing pluripotent hepatic stem cells |
| US7498171B2 (en) | 2002-04-12 | 2009-03-03 | Anthrogenesis Corporation | Modulation of stem and progenitor cell differentiation, assays, and uses thereof |
| JP4136434B2 (ja) | 2002-04-17 | 2008-08-20 | 進 清野 | インスリン産生細胞の誘導 |
| AU2003239159A1 (en) | 2002-04-19 | 2003-11-03 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | Placental derived stem cells and uses thereof |
| CA2484223A1 (en) | 2002-04-25 | 2003-11-06 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Use of human neural stem cells secreting gdnf for treatment of parkinson's and other neurodegenerative diseases |
| US20040029269A1 (en) * | 2002-05-07 | 2004-02-12 | Goldman Steven A | Promoter-based isolation, purification, expansion, and transplantation of neuronal progenitor cells, oligodendrocyte progenitor cells, or neural stem cells from a population of embryonic stem cells |
| WO2003094965A2 (en) * | 2002-05-08 | 2003-11-20 | Neuronova Ab | Modulation of neural stem cells with s1p or lpa receptor agonists |
| US7410797B2 (en) * | 2002-06-11 | 2008-08-12 | Ogle Roy C | Meningeal-derived stem cells |
| US7285415B2 (en) * | 2002-07-11 | 2007-10-23 | The Regents Of The University Of California | Oligodendrocytes derived from human embryonic stem cells for remyelination and treatment of spinal cord injury |
| US20050249731A1 (en) | 2002-07-16 | 2005-11-10 | Hadi Aslan | Methods of implating mesenchymal stem cells for tissue repair and formation |
| US7390659B2 (en) * | 2002-07-16 | 2008-06-24 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for inducing differentiation of embryonic stem cells and uses thereof |
| EP1543111A4 (en) * | 2002-08-28 | 2006-09-13 | Univ Florida | NEUROGENESIS FROM HEPATIC STEM CELLS |
| US9969977B2 (en) * | 2002-09-20 | 2018-05-15 | Garnet Biotherapeutics | Cell populations which co-express CD49c and CD90 |
| US20090169597A1 (en) | 2007-12-27 | 2009-07-02 | Ethicon, Incorporated | Treatment of intervertebral disc degeneration using human umbilical cord tissue-derived cells |
| JP4571387B2 (ja) | 2003-02-07 | 2010-10-27 | 宣男 櫻川 | ヒト羊膜由来サイドポピュレーション細胞及びその用途 |
| BRPI0407221A (pt) * | 2003-02-11 | 2006-01-31 | John E Davies | Extrato de geléia de wharton, método para a obtenção de uma célula progenitora humana, métodos para a produção de uma população de células, populações de células e método para a produção de tecido ósseo |
| US7875272B2 (en) * | 2003-06-27 | 2011-01-25 | Ethicon, Incorporated | Treatment of stroke and other acute neuraldegenerative disorders using postpartum derived cells |
| US8703121B2 (en) * | 2003-06-27 | 2014-04-22 | DePuy Synthes Products, LLC | Postpartum-derived cells for use in treatment of disease of the heart and circulatory system |
| US8039258B2 (en) * | 2004-09-28 | 2011-10-18 | Ethicon, Inc. | Tissue-engineering scaffolds containing self-assembled-peptide hydrogels |
| US20060153815A1 (en) * | 2004-12-21 | 2006-07-13 | Agnieszka Seyda | Tissue engineering devices for the repair and regeneration of tissue |
| US20060171930A1 (en) | 2004-12-21 | 2006-08-03 | Agnieszka Seyda | Postpartum cells derived from umbilical cord tissue, and methods of making, culturing, and using the same |
| WO2006083394A2 (en) | 2004-12-21 | 2006-08-10 | Ethicon, Inc. | Postpartum cells derived from placental tissue, and methods of making, culturing, and using the same |
| JP5340599B2 (ja) * | 2004-12-23 | 2013-11-13 | エシコン・インコーポレイテッド | 臍帯組織由来産褥細胞ならびにその製造方法および使用方法 |
| CA2589063C (en) * | 2004-12-23 | 2016-08-09 | Ethicon Incorporated | Treatment of parkinson's disease and related disorders using postpartum derived cells |
| US9175261B2 (en) | 2005-12-16 | 2015-11-03 | DePuy Synthes Products, Inc. | Human umbilical cord tissue cells for inhibiting adverse immune response in histocompatibility-mismatched transplantation |
| ES2391034T3 (es) * | 2005-12-19 | 2012-11-20 | Ethicon, Inc. | Expansión in vitro de células derivadas postparto en frascos rotatorios |
| US20070160588A1 (en) | 2005-12-28 | 2007-07-12 | Ethicon, Incorporated | Treatment Of Peripheral Vascular Disease Using Postpartum-Derived Cells |
| PT2471905T (pt) | 2005-12-29 | 2019-01-11 | Celularity Inc | Populações de células estaminais placentárias |
| CA2673521C (en) * | 2006-10-12 | 2017-01-17 | Ethicon, Inc. | Kidney-derived cells and methods of use in tissue repair and regeneration |
| ES2524443T3 (es) | 2006-11-13 | 2014-12-09 | DePuy Synthes Products, LLC | Expansión in vitro de células postparto usando microportadores |
| US20080305148A1 (en) | 2007-03-19 | 2008-12-11 | National Yang Ming University | Treatment of spinal injuries using human umbilical mesenchymal stem cells |
| US8236538B2 (en) | 2007-12-20 | 2012-08-07 | Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc | Methods for sterilizing materials containing biologically active agents |
| AU2009327383B2 (en) * | 2008-12-19 | 2014-08-28 | DePuy Synthes Products, LLC | Regeneration and repair of neural tissue following injury |
| US10179900B2 (en) * | 2008-12-19 | 2019-01-15 | DePuy Synthes Products, Inc. | Conditioned media and methods of making a conditioned media |
| AU2009327384B2 (en) * | 2008-12-19 | 2014-07-10 | DePuy Synthes Products, LLC | Treatment of lung and pulmonary diseases and disorders |
| DK2379087T3 (da) * | 2008-12-19 | 2014-11-10 | Depuy Synthes Products Llc | Celler, der stammer fra navlestrengsvæv, til behandling af neuropatisk smerte og spasticitet |
| EP2411504B1 (en) | 2009-03-26 | 2017-05-10 | DePuy Synthes Products, Inc. | Human umbilical cord tissue cells as therapy for alzheimer's disease |
-
2008
- 2008-10-03 CN CN200880119184.6A patent/CN102036688B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2008-10-03 US US12/245,571 patent/US8034329B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-10-03 CA CA2701435A patent/CA2701435C/en active Active
- 2008-10-03 AU AU2008308531A patent/AU2008308531B2/en not_active Ceased
- 2008-10-03 WO PCT/US2008/078800 patent/WO2009046335A1/en active Application Filing
- 2008-10-03 BR BRPI0818183A patent/BRPI0818183A2/pt active Search and Examination
- 2008-10-03 EP EP08835175.4A patent/EP2203186B1/en not_active Not-in-force
- 2008-10-03 JP JP2010528176A patent/JP5323845B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2008-10-03 ES ES08835175.4T patent/ES2525718T3/es active Active
- 2008-10-03 UA UAA201005280A patent/UA99152C2/ru unknown
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104837987A (zh) * | 2011-12-23 | 2015-08-12 | 德普伊新特斯产品有限责任公司 | 人脐带组织来源的细胞的检测 |
| CN104837987B (zh) * | 2011-12-23 | 2018-10-02 | 德普伊新特斯产品公司 | 人脐带组织来源的细胞的检测 |
| CN112569408A (zh) * | 2020-12-01 | 2021-03-30 | 暨南大学 | 组织工程补片及其制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US8034329B2 (en) | 2011-10-11 |
| CA2701435C (en) | 2017-06-20 |
| EP2203186B1 (en) | 2014-09-24 |
| WO2009046335A1 (en) | 2009-04-09 |
| ES2525718T3 (es) | 2014-12-29 |
| UA99152C2 (ru) | 2012-07-25 |
| AU2008308531A1 (en) | 2009-04-09 |
| BRPI0818183A2 (pt) | 2019-07-16 |
| US20090092653A1 (en) | 2009-04-09 |
| CA2701435A1 (en) | 2009-04-09 |
| AU2008308531B2 (en) | 2014-04-24 |
| EP2203186A4 (en) | 2011-03-16 |
| JP2010540662A (ja) | 2010-12-24 |
| EP2203186A1 (en) | 2010-07-07 |
| JP5323845B2 (ja) | 2013-10-23 |
| CN102036688B (zh) | 2014-07-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102036688B (zh) | 使用人脐带组织来源的细胞进行肾脏组织的修复和再生 | |
| JP5518893B2 (ja) | 肺ならびに肺の疾患および障害の治療 | |
| CN102498204B (zh) | 人脐带组织细胞作为用于阿尔茨海默病的疗法 | |
| CN101374946B (zh) | 用于在组织相容性不匹配的移植中抑制有害的免疫反应的组合物和方法 | |
| CN102481321B (zh) | 用于治疗神经病性疼痛和痉挛状态的脐带组织来源的细胞 | |
| ES2625041T3 (es) | Tratamiento de degenaration de disco intervertebral usando células derivadas de tejido del cordón umbilical e hidrogel | |
| JP6095893B2 (ja) | 傷害後の神経組織の再生および修復 | |
| JP5599568B2 (ja) | 分娩後由来細胞を用いた末梢血管疾患の治療 | |
| JP4948164B2 (ja) | 分娩後由来細胞を用いた軟部組織の修復と再生 | |
| RU2668389C2 (ru) | МОДУЛЯЦИЯ hUTC ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ МЕДИАТОРОВ ЛЕГОЧНЫХ И ПУЛЬМОНАЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И РАССТРОЙСТВ | |
| EP2237789A1 (en) | Treatment of intervertebral disc degeneration using human umbilical cord tissue-derived cells | |
| CN107206028A (zh) | 使用祖细胞治疗眼部病症 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140702 |