CN102076400A - 用于浓缩和处理液体样品的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了处理含有微生物目标种类的液体样品，以浓缩所述目标种类并收集裂解物的方法。所述液体样品包含非目标微生物颗粒、无机颗粒和微生物目标种类。所述液体通过预过滤介质，让所述目标种类作为滤液通过并将非目标微生物产物和无机颗粒保留在其上。所述滤液与主过滤介质接触，所述主过滤介质适用于将所述目标种类作为保留物保留在其上。使所述保留物裂解，形成含有包裹在微生物目标种类中的目标材料的裂解物。所述微生物目标种类可包括细胞生物(例如细菌、藻类、真菌、原核生物等)或病毒。目标材料包括胞内核酸或在病毒样品的情况下包括所述病毒的蛋白质外壳或涂层所包裹的核酸。

Description

用于浓缩和处理液体样品的方法

发明领域

本发明涉及用于浓缩液体样品，以获得用于分析的生物核酸目标材料的方法。

发明背景

对微生物的检测和控制，在包括卫生保健、环境控制、生物战、病原体的鉴别、食物和药物测试在内的多个领域和各种各样的工业系统中都很重要。在工业中，不需要的微生物的存在降低了操作设备的效率并最终增加相关货物或服务的成本。此外，因为微生物繁殖快，微生物活性的存在也引起针对公众健康的危险。人们越来越关注病原生物污染水和处理系统并对人、动物和环境卫生产生增加的危险。

在例如冷却塔中，可能存在水源性病原微生物例如军团菌(Legionella sp.)。如果不经优选的抗微生物剂适当处理的话，含有微生物的气溶胶化颗粒可因吸入气溶胶化微生物而导致疾病(例如庞提阿克热(Pontiac fever)或有时由嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)所致的致命军团菌病)产生的重大健康问题。在开放的再循环水系统例如冷却塔的情况下，对这种微生物进行检测是困难的，因为低浓度就具有严重的健康危险，而且必需将大体积的水浓缩成较小体积的样品，以便进行所需的分析测试并获得准确而可重复的结果。

发明概述

本发明涉及液体样品的处理方法，所述液体样品中含有非目标微生物颗粒、无机颗粒和微生物目标种类(例如细胞或病毒)。微生物目标种类包括包裹于其中的目标材料。将样品通过预过滤介质，让目标种类作为滤液通过。一些非目标生物颗粒和无机颗粒被保留在预过滤介质上。使来自预过滤步骤的滤液与主过滤介质接触，所述主过滤介质适用于将生物目标种类作为保留物与其它非目标微生物一起保留在其上。使来自主过滤步骤的保留物裂解，形成含有目标材料的裂解物。

另一方面，让细胞裂解物通过主过滤介质并进一步接触过滤后介质，以将未裂解的细胞保留在其上，同时让目标材料作为滤液通过。

如有必要，可用一种或多种保留增强剂对主过滤介质进行预处理，以改进微生物目标种类在主过滤介质上的保留。在这种情况下，主过滤介质可用选自以下的一个或多个成员来处理：表面活性剂、螯合剂、盐和有机溶剂。这些处理剂既能在主过滤器捕获步骤期间维持其中的微生物目标种类(例如细胞和病毒)的完整性，又能阻止微生物目标种类不可逆的粘附在过滤器材料上。这确保了代表性样品可被裂解并产生能准确代表原材料的测试样品。

示例性实施方案的详述

一方面，本发明涉及包括过滤和裂解步骤在内的样品收集和处理方法。在一个示例性的实施方案中，所述方法的特征在于膜，所述膜通过包括预过滤步骤和主过滤步骤在内的两步法而快速过滤高体积的液体，并收集液体中的目标组分。所述方法采用浓缩后机械或非机械工具，以将所需包裹的目标材料释放到溶液中。再将样品溶液稳定化，用于下游分析。本文所用的微生物目标种类可包括细胞生物(例如细菌、藻类、真菌、原核生物等)或病毒。正如已经熟知的，在细胞材料中，目标材料核酸(例如DNA或RNA)位于细胞内。在病毒中，核酸与蛋白质外壳在一起。本文所用的“裂解”则是使细胞或蛋白质外壳破裂，以释放所需目标核酸材料。

所述方法例如可用于测定微生物内容物。可按照所述方法测定示例性的微生物，例如细菌、病毒、藻类、真菌和原核生物。按照所述方法处理的生物内容物可来自任何水或工艺系统，例如工艺用水、饮用水、市政用水、冷却水、个人保健产品制造、制药或食品和饮料工艺过程中。

在一个示例性的实施方案中，膜用于预过滤系统，以除去任何无机颗粒和大的生物颗粒。一个或多个预过滤膜不保留目标种类。这种膜可以是各种不同材料和孔径的任何膜，但优选具有以固定尺寸分离的受控孔径的膜。预过滤膜材料的非限制性实例是尼龙、不锈钢、纤维素酯、PTFE、玻璃纤维、聚丙烯、聚氯乙烯、亲水性丙烯酸共聚物、聚醚砜、聚碳酸酯和聚酯。根据所需的最终用途的应用，可使用不同孔径的膜。用于预过滤系统的膜孔径的非限制性实例为约1μm至约100μm，更优选约1μm至约50μm，但是可用作本发明方法所用预过滤器的任何膜应当执行类似功能，并应具有明确限定的孔径例如网状结构，以确保目标材料在预过滤膜上的损失最小化。

另一方面，可提供多种预过滤膜并安排在上游到下游的流动取向。一个或多个上游膜比下游膜具有更高的孔隙率。

尽管我们不希望固守任何具体的操作或功能理论，但是看来预过滤器有两个目的。首先，它捕获较大颗粒、真菌、藻类和生物膜，如果让其转移到主膜，就会与有机物和小颗粒凝集成块并阻碍流动。这导致长过滤时间或不能过滤产生代表性样品所需的总体积。第二，预过滤器捕获较大的生活型例如已知含有军团菌的阿米巴。在一个实施方案中，测试是用于浮游生物的军团菌，如果裂解的话，阿米巴将释放很大量的军团菌。

在嗜肺军团菌是所需微生物目标种类的一个示例性实施方案中，一对尼龙预过滤膜可与上游膜一起使用，其中这一对的孔径为约20μm，下游膜孔径为约10-11μm。

主过滤介质包括经设计为保留所需目标种类的膜。这样的种类可包括细胞材料或病毒。这种膜可以是不同材料或孔径的任何膜。可用作主过滤介质的膜的非限制性实例是尼龙、不锈钢、纤维素酯、PTFE、玻璃纤维、聚丙烯、聚氯乙烯、亲水性丙烯酸共聚物、聚醚砜、聚碳酸酯和聚酯。主过滤膜的功能是将目标组分作为保留物而保留在其上。同时，在本发明的另一方面，当其中含有微生物目标种类的目标材料被裂解之后，裂解物可通过主过滤介质，用于后续下游测定或其它处理。

本发明一方面，可通过在膜底部放置屏障，阻止裂解物通过主膜。可通过振摇而进行裂解作用，裂解产物可通过浓缩后的膜(例如PES0.2μm)而提取。

在裂解物能通过主膜的那些情况下，在一个实施方案中，裂解物可在封闭系统中再循环，在预定的再循环时间内多次通过主过滤器。然后，从再循环系统中裂解物可连续取出目标材料核酸，用于后续分析。

在嗜肺军团菌是所需生物目标材料的一个实施方案中，可使用玻璃纤维主过滤成员，孔径为约10nm至约3.0μm的那些可作为实例提及。更优选的是孔径为约0.7μm至约2.7μm之间的那些主过滤膜。

主膜孔径需要考虑两个特征。首先，在浓缩步骤期间，它必须将所需目标种类保留其上，同时又不允许其粘附在膜上和裂解释放出所包裹的目标材料。在这种情况下，目标材料例如核酸在浓缩步骤期间将会释放并与滤液一起通过。需要在浓缩步骤期间保持目标种类(例如细胞和病毒的)完整性，使它们可以在裂解步骤期间裂解。第二，膜应当具有足够的孔隙率，以确保可在实际用于有效样品测试的时间内过滤大体积样品。

依据本发明的一方面，主过滤膜可用化学或流体保留增强剂(例如表面活性剂、酸、碱、螯合剂、盐、有机溶剂等)来处理，以增强目标种类在主过滤介质上的保留，同时让实际样品流过膜。合适的表面活性剂包括两性离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂。

在一个实施方案中，包括预过滤介质和主过滤介质在内的过滤系统可以高流速过滤定量体积的液体样品。例如，示例性的样品体积可以是10升或以上。可通过完整的过滤系统，借助于重力或压力，过滤样品。压力过滤包括负压和正压。作为本领域的常规，可使用泵产生负压，例如真空泵、隔膜液体泵、蠕动泵等。

主过滤介质所保留的目标种类例如微生物内容物，可用于不同应用，例如物理的、化学的和生物学表征等。在处理生物内容物时，将含有所需目标细胞的主膜暴露给为产生含有核酸和蛋白质等的小体积的稳定裂解物而设计的裂解缓冲液，用于下游检测例如聚合酶链式反应(PCR)、实时PCR、逆转录实时PCR等或其它分子测试方法。如果使用合适的裂解材料，可获得从目标种类释放出的核酸的良好完整性，并且可在裂解物中，在约4℃-43℃的温度下，保持稳定72小时或以上时间。

目标种类通过细胞或蛋白质包膜破裂而发生裂解，并且可分为非机械或机械方法。非机械方法包括化学方法、热方法、酶方法等。机械方法包括使用均质机的超声破碎；使用例如法式压榨(French press)等的压榨、减压、粉碎等。

对于非机械方法，非限制性实例是化学裂解方法，包括可破坏细胞或蛋白质包膜屏障的任何合适的化学方法。去垢剂是常用于破坏液体双层膜而释放细胞内容物，并裂解膜蛋白的化学试剂的非限制性实例，合适的裂解用化学试剂的非限制性实例是十二烷基硫酸锂、CHAPS、吐温-20E、NP40、CTAB、PVPP、Triton X系列去垢剂、胆酸钠和脱氧胆酸钠、盐酸胍或苛性碱。离液剂例如胍盐也可作为裂解剂用于该系统。去垢剂和替代裂解剂的裂解效率取决于细胞种类和具体应用。酶，例如溶菌酶、变溶菌素、labiase、溶葡萄球菌素、溶细胞酶、蛋白酶K、内溶素和消色肽酶(achromopeptidase)可作为裂解剂或增强裂解的添加剂包括在内。有机溶剂，例如DMSO、DMF也可作为裂解试剂或增强裂解的添加剂包括在内。许多生物科学供应商都提供适用于细胞裂解应用的各种各样的裂解缓冲剂。各种物理方法例如振摇、加热、切割和均质等，都可用于增强裂解效率的工艺。的确，在一个实施方案中，可利用切割作用，其中细胞可被破坏并且主膜本身也将被切割。根据应用的复杂性和目标种类的特性，单一的化学裂解方法或其组合可与机械方法组合使用。

为了除去不需要的细胞裂解物和未裂解细胞的干扰，可加入一个或多个额外的膜来处理细胞裂解物，用于下游应用。膜可以是不同材料的、孔径范围为0.22μm至0.45μm的任何膜，用于细菌、酵母、真菌或硫辛酸采样。(病毒采样需要较小的孔径)。这些过滤“后”膜材料的非限制性实例是PVDF、PES、聚碳酸酯、尼龙等。该膜的主要作用是从样品中除去大材料和/或未裂解细胞，以增强裂解物在上述条件下的长期稳定性。

尽管目前的描述强调了样品浓缩和处理方法，但是显然，所述方法可用于实验室、野外应用(field application)、在线、自动化分批或离线监测系统。这种性能的扩展允许系统用于水和过程监测、以及最终工艺或产物监测。另外，该方法应当容易的用于已知对微生物生长敏感的工艺流程，和不限于水系统。处理食物、饮料和个人保健产品以及在本发明范围之内的其它系统。

在以下实施例中将会进一步描述本发明，所述实施例应视为本发明的示例，而不应视为用于限制权利要求。

程序

1.将(例如10^4CFU)嗜肺军团菌细胞和10^6CFU荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)强力浓缩(spike specific concentration)到500ml合成水或野外水中。对于野外冷却水(field cooling water)，制备无添加的500ml原水。

2.500ml水样通过尼龙20μm(Millipore NY2004700)和尼龙11μm(Millipore NY1104700)过滤，以除去任何颗粒和大的生物内容物，同时不保留目标内容物。

3.通过经表面活性剂处理的玻璃纤维2.7μm(MilliporeAPFD04700)，浓缩来自步骤2的滤液，保留目标种类内容物。

4.向步骤3的主膜加入3ml裂解缓冲液并裂解5分钟，振摇速率为100转/分钟。裂解缓冲液包含十二烷基硫酸锂、DMSO和乙氧基化壬基酚。

5.裂解物通过PES 0.22μm～0.45μm膜过滤，用于下游分析。

6.对于合成水的各过程分析，对照是通过裂解检测而未浓缩的相同量的目标内容物。

7.所有下游分析都是基于RNA的方法，不同之处在于结果表中所提及的特定的基于DNA的实时PCR分析。

实施例

实施例1-膜的筛选

作为预过滤介质或过滤介质测定各种不同膜种类，以确保它们在10分钟时间内能过滤500ml冷却水样。测试发现可接受的材料如下。

实施例2-预过滤器、主过滤器系统测试

评价了整合尼龙20μm和尼龙11μm作为预过滤膜和玻璃纤维2.7μm作为主过滤膜的组合的过滤系统的性能，以观察它是否能在10分钟内有效过滤500ml冷却水样。所得的以下结果显示通过标准的过滤对总测试次数(runs)的百分率。如结果所示，所测试的冷却水采自中国地理位置和欧洲位置。

整合尼龙20μm、尼龙11μm作为预过滤膜和玻璃纤维2.7μm作为主膜的过滤系统的性能。

500ml野外样品流速的总结(在5分钟内)

注意：无特定标记的膜是Millipore牌。括号内的数字表示相对于总样品数量，在不到10分钟内过滤的样品数量。

实施例3-预过滤测试

测试候选预过滤膜，以确保它们在允许目标材料嗜肺军团菌通过的效力。结果表示为保留在预过滤器候选者上的所需目标的百分率。

不锈钢*	0.64％
		尼龙30μm	0.31％
Millipore NY20μm	0.38％
		Millipore NY11μm	1.46％
尼龙20μm	22.93％
		PES 20μm	38.52％
PC 10μm	0.40％
		PE 10μm	0.19％
PES 10μm	14.62％
		PC 5μm	0.52％
PES 5μm	15.68％
		对照	100％

*未具体标明的供应商的膜是来自GE Osmonics。

实施例4-用于高细胞保留的主膜筛选

筛选主膜候选者，以确保它们在保留所需目标材料嗜肺军团菌中的有效性。对保留在主过滤器上的目标进行RNA测定。

通过细胞中RNA拷贝的自然对数，说明用于高细胞保留的主膜筛选。

膜	RNA Log拷贝数的平均值	RNA Log拷贝数的STD
			GF2.7	7.13	0.07
GF1.6	7.25	0.07
			GF1.2	7.02	0.15
GF0.7	7.03	0.12
			PES0.45	7.19	0.08

对照

7.15

0.03

实施例5

在上述规定的振摇速率下，在与裂解缓冲液系统接触5分钟之后，评价主膜对细胞的保留。对所保留细胞进行RNA测定，以确定％收率。

500ml-5min裂解	收率(％)	STD(％)	RSD(％)
				NY20-NY11-GF2.7	29.08％	6.69％	22.99％
NY20-NY11-GF1.6	22.32％	6.17％	27.66％
				NY20-NY11-GF1.2	30.09％	8.92％	29.66％
NY11-NY1-GF0.7	18.54％	3.48％	18.77％
				NY11-NY1-PES0.45	25.60％	3.41％	13.33％

实施例6-用于优化性能的振摇速率和裂解时间

进行一系列测试，以评价裂解液与目标材料的接触时间以及主膜与所保留目标的振摇时间。通过目标材料的RNA测定得到％收率。

测定振摇速率和裂解时间的DoE实验

测定最佳振摇速率和裂解时间。根据该数据，最佳振摇速率定为2×或100R.P.M.，总裂解液接触时间为5分钟时表现最佳。

实施例7

评价了经裂解缓冲液处理5分钟的膜的性能。进行RNA测定，以测定裂解物中嗜肺军团菌的数量。

经优化裂解缓冲液处理的膜在测定高浓度嗜肺军团菌(～10^4CFU/测定)细胞中的性能。

STM＝十二烷基硫酸锂

NP40＝壬基酚(40EtO)

DMSO＝二甲基亚砜

-＝无主过滤器预处理

+＝有主过滤器预处理

实施例8

在不同浓度的目标(嗜肺军团菌细胞)下，评价所选主过滤膜和裂解缓冲液的性能。无处理表示没有对滤器进行预处理。STM处理表示滤器用裂解缓冲液进行了预处理。

所选膜和裂解缓冲液在测定不同浓度嗜肺军团菌细胞中的重复性性能。

实施例9

整合所选膜和裂解缓冲液的装置在测试5log水平的嗜肺军团菌细胞中的重复性。

实施例10

进行测试，以确定在主过滤之后的额外过滤步骤的效果。在预过滤和主过滤以及裂解之后，裂解物通过PES 0.22μm滤器，保留未裂解的细胞并使裂解物作为滤液而通过。

                          RNA log拷贝数的平均值    RNA log拷贝数的STD

空白溶液                  阴性                     /

通过PES 0.22滤器    5.53

过滤之前            5.47  5.48                     0.05

                    5.44

通过PES 0.22滤器    5.44

过滤之后            5.40  5.41                     0.03

                    5.39

在本发明的某些示例性方面，本文所述的方法从进行样品收集以获得稳定的生物材料样品，到准备移至下游测试，需要不到15分钟的时间。在其它示例性的实施方案中，提供生物材料的稳定提取物，所述提取物在最高达约43℃的温度下保持稳定性最长达72小时。

在一个示例性的实施方案中，预过滤和主过滤步骤是最终过滤步骤。此外，在不同的实施方案中，可通过使用表面活性剂或其它保留增强剂，对主过滤介质进行预处理。存在的表面活性剂的浓度范围可以是约0.5％至约5％。此外，当螯合剂用于预处理主过滤膜时，这些试剂存在的浓度可以是约0.1mM至100mM。这些螯合剂可包括例如EDTA和EGTA等。在又一些示例性的实施方案中，可使用盐对主过滤膜进行预处理，并且这些盐可以约1-8mM溶液的量存在，在可使用有机溶剂对主过滤介质进行预处理的那些情况下，这些溶剂存在的量可以是约1-10％。

此外，为了改善裂解，可将样品在约30℃至100℃的温度下进行孵育。另外，可施加电场，以帮助释放胞内材料。还可通过使用叶轮等进行振摇、颠转或振动，作为一种或多种辅助手段帮助裂解操作。在发现振摇可用于增强裂解操作的那些情况下，可采用约10-350RPM的振摇速率，并且在任何地方裂解操作通常可进行约1分钟至3小时。

尽管，在本文中我们已经显示和描述了本发明的某些实施方案，但是这些实施方案可以进行转变，并且其中可进行任何改变或修改，而不偏离所附权利要求定义的本发明的精神和范围。

Claims (20)

1.液体样品的处理方法，所述样品中含有非目标微生物颗粒、无机颗粒和微生物目标种类，并且其中所述微生物目标种类包括包裹于其中的目标材料，所述方法包括：

(a)将所述液体样品通过预过滤介质，让所述微生物目标种类作为滤液通过，并将所述非目标生物颗粒和所述无机颗粒保留在其上；

(b)使所述滤液与主过滤介质接触，所述主过滤介质适用于将所述微生物种类作为保留物保留在其上；和

(c)裂解来自步骤(b)的所述保留物，形成含有所述目标材料的裂解物。

2.权利要求1的方法，其中所述微生物目标种类包括细胞微生物，并且其中所述目标材料是胞内核酸。

3.权利要求2的方法，其中所述细胞微生物选自细菌、藻类、真菌和原核生物。

4.权利要求1的方法，其中所述微生物目标种类包括病毒，且其中所述目标材料是所述病毒的蛋白质外壳内所包含的核酸。

5.权利要求1的方法，所述方法还包括：

(d)使所述裂解物接触过滤后介质，以将任何未裂解材料保留在其上，同时让所述裂解物作为滤液通过。

6.权利要求1的方法，其中所述液体样品是冷却水。

7.权利要求3的方法，其中所述目标种类是嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)。

8.权利要求7的方法，其中所述预过滤介质包括孔径为约1μm至约100μm的滤膜。

9.权利要求8的方法，其中所述主过滤介质包括孔径为约10nm至约3.0μm的滤膜。

10.权利要求9的方法，其中所述主过滤介质包括孔径为约0.7μm至约2.7μm的滤膜。

11.权利要求10的方法，所述方法还包括使所述裂解物接触过滤后介质，以将任何未裂解的细胞保留在其上，同时让所述裂解物作为滤液通过，并且其中所述过滤后介质包括孔径为约0.22μm至约0.45μm的滤膜。

12.权利要求1的方法，其中所述裂解物含有DNA。

13.权利要求1的方法，其中所述裂解物含有RNA。

14.权利要求1的方法，其中所述步骤(c)包括使所述保留物与裂解缓冲液接触。

15.权利要求14的方法，其中所述步骤(c)还包括振动所述保留物。

16.权利要求1的方法，其中所述步骤(c)包括使所述保留物进行超声振动。

17.权利要求1的方法，其中所述预过滤介质包括一对尼龙膜，并且所述一对尼龙膜中的第一个安排在上游流动取向，所述一对尼龙膜中的第二个安排在下游流动取向，所述第一预过滤膜的孔径大于所述第二预过滤膜的孔径。

18.权利要求14的方法，其中所述第一预过滤膜的孔径为约20μm，且所述第二预过滤膜的孔径为约10-11μm。

19.权利要求1的方法，其中所述主过滤介质包括玻璃纤维滤膜。

20.权利要求1的方法，所述方法还包括在所述步骤(c)之前，使所述主过滤介质与保留增强剂接触，所述保留增强剂包含选自以下的一个或多个成员：表面活性剂、螯合剂、盐和有机溶剂。