CN102177173A - 胶原肽,二肽及疾病抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明以提供对于骨质疏松症，变形性关节症，褥疮等的各种疾病的抑制有效的肽分子的本体，尤其是向肠管的体内的吸收容易的二肽，含有上述二肽作为必须的二肽的胶原肽及含有上述二肽作为必须的有效成分的疾病抑制剂作为课题，且作为解决涉及的课题的手段，而本发明涉及的胶原肽以包含具有Hyp-Gly的结构的二肽作为必须的二肽作为特征。本发明涉及的二肽以有Hyp-Gly的结构作为特征。本发明涉及的疾病抑制剂以包含具有Hyp-Gly的结构的二肽作为必须的有效成分作为特征。

Description

胶原肽,二肽及疾病抑制剂
【技术领域】
本发明涉及胶原肽，二肽及疾病抑制剂。详细是涉及含有有特定的结构的二肽作为必须的二肽的胶原肽，有新颖的结构的二肽，以上述二肽作为必须的有效成分的，对于骨质疏松症，变形性关节炎，褥疮等的抑制(在本发明，而所说的用语“抑制”含作为抑制症状的发症的”预防”的意味，抑制发症的症状的“治疗”作为的意味的双方。)有效的疾病抑制剂。
【背景技术】
骨质疏松症是指虽然发生骨的绝对量的减少，但不伴随骨的质的变化的状态。骨不断被吸收，形成，且吸收率与形成率产生差，且骨形成成为负的平衡，则发生骨质疏松。骨的吸收由破骨细胞进行，且破骨细胞的分化及活化越是显著，骨的吸收率越变高。另一方面，骨的形成由成骨细胞进行，且成骨细胞的分化及活化越是显著，骨的形成率越变高。
变形性关节炎是关节同时发生慢性的退行性变化及增殖性变化，且关节的形态变化的疾病。关节软骨渐渐磨耗或缺损，且骨露出。关节软骨不存在血管系统，且特别是，关节摺动部软骨细胞及肋软骨组织的修复·再生与存在血管的骨组织相比困难。特别是，支持关节软骨的骨组织变疏(骨质疏松症)，则导致关节部的功能障碍，且作为结果，而变形性关节炎(Osteoarthritis)发症。
褥疮是指，长时间卧床时，骨的突出的部位的皮肤及软部组织，由于骨与病床之间长时间的压迫，引起循环障碍，且成坏死的状态。
作为对于如上所述的症状的肽的效能而言，对于变形性关节炎的效能被报告，且例如，已知作为有效成分含胶原肽，葡萄糖胺盐，且pH2～5的关节强化饮料(专利文献1参照)，由用胶原酶分解胶原成分或明胶成分被得到，以氨基酸序列Gly-X-Y的三肽作为有效成分的慢性类风湿性关节炎或变形关节症的改善剂(专利文献2参照)，以含有从胶原及胶原肽可选的至少1种，从氨基糖，粘多糖类及糖醛酸可选的至少1种作为特征的经口关节障碍治疗剂或功能性食品(专利文献3参照)等。
【专利文献1】特开2002-125638号公报
【专利文献2】特开2002-255847号公报
【专利文献3】特开2003-48850号公报
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
但是，上述以往的技术仅示对于变形性关节炎的预防至治疗，胶原或，是各种各样的肽分子的混合物的胶原肽，或特定的三肽有效，且对于预防至治疗不仅是变形性关节炎，且也含骨质疏松症，褥疮等的广的意味的疾病有效的肽结构至今未知。
从而，作为本发明要解决的课题在于，变以往的着眼点，找出对于骨质疏松症，变形性关节症，褥疮等的各种疾病的抑制有效的肽分子的本体，尤其是，向肠管的体内的吸收容易而新颖的二肽，且提供含有上述二肽作为必须的有效成分的疾病抑制剂及含有上述二肽作为必须的二肽的胶原肽。
【解决课题的技术方案】
本发明人为了解决上述课题而进行锐意研究。其结果，本发明人发现新颖发现的有Hyp-Gly的结构的二肽，在肠管的体内吸收容易，并且，作为疾病抑制剂的有效成分起作用，具体而言，例如，抑制破骨细胞的分化与活化，且亢进成骨细胞的分化与活化，且抑制软骨细胞的变性而调节其分化，且发现对于骨质疏松症，变形性关节症的抑制有效的同时，发现此二肽使皮肤真皮中的原胶原量恢复，也抑制褥疮，且确认这些事实，而完成本发明。
即，本发明涉及的胶原肽以包含具有Hyp-Gly的结构的二肽作为必须的二肽作为特征。
本发明涉及的二肽以有Hyp-Gly的结构作为特征。
本发明涉及的疾病抑制剂以包含具有Hyp-Gly的结构的二肽作为必须的有效成分作为特征。
【发明效果】
由本发明可有效抑制骨质疏松症，变形性关节症，褥疮等的症状。
【实施方式】
以下，虽然对于本发明涉及的胶原肽，二肽及疾病抑制剂详细说明，但本发明的范围不被这些说明约束，而对于以下的例示以外，在不损害本发明的趣旨的范围内可适宜实施变更。
〔二肽，胶原肽〕
本发明涉及的二肽有Hyp-Gly的结构。
本发明涉及的胶原肽含有上述二肽作为必须的二肽。例如，可如后述由酶处理胶原或明胶得到。
有Hyp-Gly的结构的二肽，羟基脯氨酸单位及/或甘氨酸单位被化学修饰也可，而对于羟基脯氨酸单位而言，羟基被化学修饰也可。
以上，在本发明而言，“有Hyp-Gly的结构的二肽”是指含化学修饰的，也含未化学修饰的。另外，以下中，有将“有Hyp-Gly的结构的二肽”单表示为“Hyp-Gly”时(对于其他肽也同样)。
Hyp-Gly被化学修饰时，可在从弱酸性到中性溶解，且也可期待与后述的其他有效成分的相溶性升高等。具体而言，对于羟基脯氨酸残基的羟基而言，可举O-乙酰化等的化学修饰，对于甘氨酸残基的α-羧基而言，可举酯化，酰胺化等的化学修饰。对应于后述的其他有效成分的种类等，而选择适宜的化学修饰即可。
上述Hyp-Gly，例如，如后述，可由将胶原或明胶分成2阶段酶处理，或从氨基酸合成得到，且对于化学修饰而言，可举如后述的公知的手段。但是，本发明涉及的二肽也可通过这些方法以外的方法得到，而例如，代替下述2阶段酶处理法，而省略1次酶处理的方法或，同时进行1次酶处理及2次酶处理的方法也可。
<胶原或明胶的2阶段酶处理>
将胶原或明胶通过一般的方法1次酶处理之后，作为2次酶处理，由使用有羟基氨酰基脯氨酸二肽酶活性的酶反应的2阶段酶处理，而可得含Hyp-Gly的胶原肽。
由此2阶段酶处理，则由1次酶处理，而有用于介经口免疫宽容机制的骨·软骨组织的炎症缓和的分子量比较大的肽生成，且由2次酶处理，而例如，是有x-Hyp-Gly的结构的肽(x表示脯氨酸以外的氨基酸残基。)，则Hyp-Gly残基与x残基间的肽结合(Hyp的氨基与x的羧基源于的肽结合)被切断而Hyp-Gly生成。
作为上述胶原而言，虽然当然不是特别限定，但可举例如，牛或猪等的哺乳动物来源的胶原或鲨或鲷等的鱼类来源的胶原，且这些从上述哺乳动物的骨，皮部分或上述鱼类的骨，皮，鳞部分等可得。具体而言，对上述骨，皮，鳞等实施脱脂·脱灰处理，提取处理等的以往公知的处理即可。
上述明胶由将上述胶原通过热水提取等的以往公知的方法处理可得。
作为上述胶原或明胶的2阶段酶处理中用的酶而言，虽然不特别限定，但考虑将得到的二肽在特定保健用食品中利用的情况等，则优选用病原性微生物来源的酶以外的酶。
作为1次酶处理的处理条件而言，例如，可对于胶原或明胶100重量份用酶0.1～5重量份，且于30～65℃处理1～72小时。
由上述胶原或明胶的1次酶处理得到的胶原肽的平均分子量优选为200～2000，更优选为200～1800。平均分子量在上述范围，则可认为充分生成分子量比较大的肽。
1次酶处理后，应必要使酶失活也好，作为这时的失活温度而言，例如，是70～100℃。
作为用于上述1次酶处理的酶而言，是可切断胶原或明胶的肽结合的酶，则不特别限定，而通常，可用被称为蛋白分解酶或蛋白酶的酶。具体而言，可举例如，胶原酶，巯基蛋白酶，丝氨酸蛋白酶，酸性蛋白酶，碱性蛋白酶，金属蛋白酶等，且可将这些单独地，或多个组合使用。作为上述巯基蛋白酶而言，已知植物来源的木瓜凝乳蛋白酶，木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶，无花果蛋白酶，动物来源的组织蛋白酶，钙依赖性蛋白酶等。另外，作为上述丝氨酸蛋白酶而言，已知胰蛋白酶，组织蛋白酶D等，作为上述酸性蛋白酶而言，已知胃蛋白酶，胰凝乳蛋白酶等。
而且，2次酶处理中，例如，作为酶，而用曲霉属来源的有羟基氨酰基脯氨酸二肽酶活性及氨酰基脯氨酸二肽酶活性的酶的酶反应进行。由此反应，1次酶处理物中未被含的Hyp-Gly生成。
作为2次酶处理的处理条件而言，例如，可对于1次酶处理物100重量份用酶0.01～5重量份，且于30～65℃处理1～72小时。
由上述2次酶处理得到的胶原肽的平均分子量优选为200～1500，更优选为200～900。此2次酶处理以Hyp-Gly的生成作为主要目的，且优选由1次酶处理得到的胶原肽中，比较大的肽不被过量水解完地，成上述平均分子量的范围地进行2次酶处理。
2次酶处理后有必要使酶失活，而作为失活温度而言，是例如，70～100℃。
由于由上述2阶段酶处理得到的水解物，或由上述2阶段酶处理及发酵得到的发酵生成物是也含Hyp-Gly以外的氨基酸或肽成分的混合物，所以得Hyp-Gly或者其盐时，则应必要，也可使如进行分级分离、纯化。作为分级分离·纯化的方法而言，不特别限制，而使例如，超滤或，凝胶过滤层析，离子交换层析，逆相层析，亲和层析等的各种液相层析或，使这些组合的方法等的以往公知的方法即可。具体而言，例如，可如以下分级分离·纯化。即，首先，将上述水解物或发酵生产物的约2g/10mL分成2次负荷到离子交换柱(例如，DEAE TOYOPEARL 650M柱(东ソ一社制)或SP TOYOPEARL 650M柱(东ソ一社制)等)，而回收被用蒸留水洗脱的空体积级分。接下来，将回收的级分负荷于有与上述离子交换柱相反的离子交换基的柱(例如，SP TOYOPEARL 650M柱(东ソ一社制)或DEAE TOYOPEARL 650M柱(东ソ一社制)等)，而回收被用蒸留水洗脱的空体积级分。接下来，将此级分负荷于凝胶过滤柱(例如，SEPHADEX LH-20柱(Pharmacia社制)等)，且用30％甲醇水溶液洗脱与是化学合成品的Hyp-Gly洗脱的位置相当的级分回收。对于本级分而言，供于装填逆相柱(例如，μBondasphere 5μC18
Figure BPA00001324972400061
柱(Waters社制)等)的高效液相色谱(HPLC)，且由含0.1％三氟醋酸的32％以下的乙腈水溶液的直线浓度梯度分级分离。然后，将回收的Hyp-Gly级分由减压干燥，而可得高纯度的Hyp-Gly。
<从氨基酸的合成>
可从氨基酸合成Hyp-Gly。
作为Hyp-Gly的合成法而言，一般有(1)固相合成法与(2)液相合成法(例如，特开2003-183298号公报参照)，且前者的情况中，再已知(A)Fmoc法与(B)Boc法的方法，而Hyp-Gly通过任何方法合成也可。
以下以固相法作为一例详细说明。
可将羟基脯氨酸固定于载质聚苯乙烯，且由作为氨基的保护使用Fmoc基或Boc基的公知的固相合成法合成。即，将表面用氨基修饰的直径0.1mm左右的聚苯乙烯高分子凝胶的珠作为固相使用，且由作为缩合剂用二异丙基碳二亚胺(DIC)的脱水反应，向Fmoc(fluorenyl-methoxy-carbonyl)基保护氨基的羟基脯氨酸结合甘氨酸(肽结合)之后，将固相用溶剂洗好，且除去残留的甘氨酸等。此后，由除去与固相结合的羟基脯氨酸残基的保护基(脱保护)，可合成Hyp-Gly。
<化学修饰>
Hyp-Gly可被施化学修饰。化学修饰的具体的手段或处理条件可适用通常的肽的化学修饰技术。
对于羟基脯氨酸残基的羟基的化学修饰而言，可例如，O-乙酰化是由在水溶剂中或非水溶剂中使无水醋酸作用等进行。
甘氨酸残基的α-羧基的化学修饰对于，例如，酯化可由向甲醇的在悬浊后通气干燥氯化氢气体等进行，且酰胺化可由使碳二亚胺等作用来进行。
作为化学修饰的其他具体例，可适用特公昭62-44522号公报或特公平5-79046号公报等中记载的化学修饰技术。
〔疾病抑制剂〕
本发明涉及的疾病抑制剂作为必须的有效成分包含具有Hyp-Gly的结构的二肽。作为疾病抑制剂而言，可适宜举骨质疏松症抑制剂，变形性关节炎抑制剂，褥疮抑制剂等。
本发明涉及的疾病抑制剂除了含本发明涉及的二肽作为有效成分之外，以本发明涉及的胶原肽含的本发明涉及的二肽作为有效成分也可。然后，在这时，上述疾病抑制剂不仅是，含有从氨基酸化学合成的Hyp-Gly或，从是胶原或明胶的水解物的胶原肽单离的Hyp-Gly的实施方式，而也可是不从上述胶原肽单离Hyp-Gly地直接以胶原肽的形含有的实施方式。本发明涉及的疾病抑制剂，如此，也含使直接以胶原肽含有的形态，而是以本发明涉及的二肽作为有效成分，且也可包括将这些二肽在胶原肽的形中用的情况而联用。
对于上述本发明涉及的疾病抑制剂全量，优选将上述Hyp-Gly以0.001重量份以上的比例配合。更优选以0.01重量份以上的比例配合。不足0.001重量份，则有本发明的效果不被充分表达的担忧。
而且，将本发明涉及的疾病抑制剂直接注入患部而用时，上述Hyp-Gly的含量优选是1mmol/L以上。
本发明涉及的疾病抑制剂也可将Hyp-Gly在生理盐水等中稀释，而可充分得本发明的效果，而上述Hyp-Gly以外，在不损害本发明的效果的范围，也可使含有适宜其他有效成分或制剂用的成分。
作为上述其他有效成分而言，葡萄糖胺及/或其盐，可举软骨素硫酸等，且可将这些以1种或2种以上组合使用。其中也是，葡萄糖胺及/或其盐由于有使由Hyp-Gly的疾病抑制效果升高的作用而优选。
另外，作为上述其他有效成分，而也可含Hyp-Gly以外的肽或氨基酸，而例如，分子量比较大的肽，对于慢性类风湿性关节炎等，由于奏被称缓和由经口免疫宽容机制的骨·软骨组织的炎症的效果，所以有用。为了使含有Hyp-Gly以外的肽或氨基酸，则水解胶原或明胶而得到含有Hyp-Gly的胶原肽之后，将此胶原肽不单离Hyp-Gly地直接使用即可。
而且，作为上述其他有效成分，以促进骨盐沉着的目的，可用钙或糖转移橙皮苷等，且以胶原的合成、沉着促进等的目的，也可用维生素C等。
作为上述其他有效成分的配合量而言，对于疾病抑制剂全量，优选以0.001～20重量份用，而更优选以0.01～20重量份的比例用。特别是，将葡萄糖胺及/或其盐的配合量，对于疾病抑制剂全量，优选作为5～15重量份。不足5重量份，则有使Hyp-Gly的效果升高的效果不被充分发挥的担忧，且超15重量份，则被排出到尿或粪中，且有成过量摄取的担忧。
作为用于制剂化的成分而言，例如，可用结晶性纤维素等的赋形剂等，且对应于其形态等设定适宜的量即可。
作为本发明涉及的疾病抑制剂的使用形态而言，可举例如，由经口施用摄取，或者向患部直接注入，或者所说的形态。Hyp-Gly，由于在肠管迅速被吸收，且向氨基酸的分解也几乎不发生，适宜由经口施用的摄取。
经口施用的情况中，则将Hyp-Gly与上述其他有效成分或制剂用的成分混合而通过以往公知的方法，由打锭成型作为锭剂，或者也可以其他，颗粒剂，散剂，胶囊剂等的固态剂，溶液剂，悬浊剂，乳剂等的液剂，冷冻干燥制剂等的任意的形态制备。
向患部直接注入时，则将Hyp-Gly用生理盐水等稀释而使用，而应必要，而且，也可用上述其他有效成分，而作为其浓度而言，如上述，优选将Hyp-Gly的含量作为1mmol/L以上。
在本发明涉及的疾病抑制剂中作为必须的有效成分含有的二肽有Hyp-Gly的结构，与有氨基酸，Hyp-Gly以外的结构的二肽，向Hyp-Gly结合其他氨基酸的三肽以上的肽等则相异。通过使包含上述具有Hyp-Gly的结构的二肽，表达出优良的疾病抑制效果(骨质疏松症，变形性关节炎，褥疮等的症状的抑制效果)。
以上者将在后述的实施例中的性能评价试验中被具体立证。
〔与其他二肽的联用〕
Hyp-Gly的疾病抑制效果有可通过与其他二肽联用协同提高的情况。
例如，通过将Hyp-Gly与Pro-Hyp联用，可协同提高Hyp-Gly的疾病抑制效果。
而且，例如，对于变形性关节炎等的疾病而言，通过联用Ala-Hyp，可协同提高其效能。
作为本发明涉及的胶原肽，例如，为了得共同含Hyp-Gly与Pro-Hyp的胶原肽，基本上，通过与对于Hyp-Gly说明的2阶段酶处理法同样的方法，仅变更2次酶处理中用的酶的种类即可。作为这样的酶而言，可举例如，有曲霉属等来源的氨酰基脯氨酸二肽酶活性及羟基氨酰基脯氨酸二肽酶活性的酶。
在本发明涉及的疾病抑制剂中，而将Hyp-Gly与Pro-Hyp联用时，两者的含有比率的优选的范围是，两者的合计作为100重量％时，Hyp-Gly 50～90重量％，Pro-Hyp 10～50重量％。
另外，将Hyp-Gly与其他二肽联用时，对于上述本发明涉及的疾病抑制剂全量的二肽的配合比例优选例如，二肽的合计量，0.001重量份以上的比例。更优选以0.01重量份以上的比例配合。而且，将本发明涉及的疾病抑制剂直接注入患部使用时，二肽的合计含量优选是10μmol/L以上。
对于由联用其他二肽的协同效果，以本发明的疾病抑制剂可抑制的代表的上述症状，即，骨质疏松症，变形性关节炎，褥疮作为例而具体说明。
骨质疏松症是，如前述，骨的吸收由破骨细胞进行，且破骨细胞的分化及活化越是显著，骨的吸收率越变高的同时，另一方面，骨的形成由成骨细胞进行，且成骨细胞的分化及活化越是显著，骨的形成率越变高。因此，通过抑制破骨细胞的分化及活化，且亢进成骨细胞的分化及活化，可抑制骨质疏松症。然后，根据本发明人的了解，则Hyp-Gly，Pro-Hyp在破骨细胞，成骨细胞的分化及活化中示如下的作用。
即，首先，对于破骨细胞的分化及活化的机制说明，则首先，(i)多个前体破骨细胞融合而分化成多核巨细胞。催化此分化的酶是TRAP(Tertaric Acid Resistant Acid Phosphatase：酒石酸抗性酸性磷酸酯分解酶)。接下来，(ii)将上述多核巨细胞(破骨细胞)骨组织溶解、分解。在上述机制，Hyp-Gly作为主要而抑制(i)，且Pro-Hyp抑制(i)，(ii)的两方。因此提示，由联用Hyp-Gly，Pro-Hyp，这些协同作用，而发挥更优良的效果。
另外，成骨细胞合成、分泌骨基质(I型胶原)，且由ALP(Alkaline Phosphatase：碱性磷酸酯分解酶)石灰化(Ca10(PO4)6(OH)2：氢氧化磷灰石)此骨基质，亢进骨化。此时，Hyp-Gly，亢进上述ALP活性，且通过再联用Pro-Hyp，由协同效果促进Hyp-Gly的亢进效果，且可使表达相比单独地用分别的二肽都优良的亢进效果。
变形性关节炎依次分成，(i)细胞增殖期，(ii)软骨细胞分化/成熟期，(iii)向肥大化软骨细胞的分化(变性)期，(iv)石灰化及经此之后的凋亡(程序化的细胞死亡)的4期，而在(i)，(ii)而言，主要Pro-Hyp亢进向软骨细胞的分化及贡献于其维持，且再(ii)，调节Hyp-Gly前体关节软骨细胞的分化，且催化向肥大化软骨细胞的分化(变性)，并且，由抑制也是特异标记物的ALP(Alkaline Phosphatase：碱性磷酸酯分解酶)的活性，抑制向(iii)的移行。其中，根据本发明人的见解，则通过再联用Ala-Hyp，在(ii)的Hyp-Gly的作用，即，前体关节软骨细胞的分化的调节，和ALP活性的抑制协同升高。如此提示，通过联用Hyp-Gly、Pro-Hyp，且再优选也联用Ala-Hyp，抑制协同软骨细胞的变性，且由使维持关节细胞的表现型，贡献于变形性关节症的抑制。
褥疮的发症与治愈过程依次分成(i)炎症反应期，(ii)增殖期(肉芽形成期)，(iii)稳定期的3期。
即，接受皮肤损伤，则在(i)的炎症反应期发生组织的断裂与血管的断裂，且局部出血，而由血液中的凝固因子等的作用与血管的收缩止血。接下来，淋巴细胞，单核细胞等作为浸出液从血管渗出，且向伤口移动(细胞迁移)。其中，Pro-Hyp发挥促进淋巴细胞及单核细胞的细胞迁移的功能。单核细胞成为巨噬细胞，且这再放出各种各样的化学物质，而成以下信号的发生源。另外，由内因性胶原酶(例如，MMP-13)而皮肤真皮中的胶原线维被分解。
接下来，在(ii)的增殖期，由巨噬细胞的作用被释放的化学物质或由前述的内缘性胶原酶发生的胶原分解片段肽(例如，Pro-Hyp与Hyp-Gly)被刺激，且成纤维细胞被募集，且胶原线维(胶原：原胶原主成分)生成。成纤维细胞，毛细血管，胶原进行共同作业，且向伤口进出，且封缺损面，且愈合创面(肉芽组织形成)。其中，Pro-Hyp与Hyp-Gly的两者协同亢进胶原合成，而促进肉芽组织形成，而特别是，(ii)的增殖期的初期过程中主要Pro-Hyp发挥生理功能，且在后期过程，主要Hyp-Gly发挥生理功能。肉芽组织被形成，则基底层以外的非增殖细胞移动而形成一层的上皮细胞层。然后，在此层下，从创缘基底层的细胞移动、增殖，且形成多层的上皮的结果，完成上皮化。
最后，(iii)的过程中，成纤维细胞的活性回到平常，且胶原的生成变少，且保持生成量与分解量平衡的同时，以定常状态移行，而完成治愈。
含于本发明涉及的胶原肽的二肽的上述的作用从在后述的实施例中的性能评价试验的各种效果的证实也被提示。
〔Pro-Hyp〕
上述的Pro-Hyp不仅在与Hyp-Gly联用时，而在单独地用时，也有抑制骨质疏松症，变形性关节炎，褥疮等的症状的作用。
以下中，对于此Pro-Hyp详细说明，而由于与关于Hyp-Gly的上述的说明重复的内容多，对于主要差异点说明。
Pro-Hyp也可脯氨酸单位及/或羟基脯氨酸单位被化学修饰，而特别是，对于羟基脯氨酸单位而言，羧基与羟基的任何，或，两方被化学修饰也可。
以上，在本说明书，“有Pro-Hyp的结构的二肽”，或，将其略记而称为“Pro-Hyp”时，此包括化学修饰的，也包括未化学修饰的。
Pro-Hyp被化学修饰时，可在从弱酸性到中性溶解，且也可期待与其他有效成分的相溶性升高等。具体而言，对于脯氨酸残基的α-氨基而言，可举聚肽基化，琥珀酰化，马来酰化，乙酰化，脱氨基化，苯甲酰化，烷基磺酰基化，烯丙基磺酰基化，二硝基苯基化，三硝基苯基化，氨甲酰化，苯基氨甲酰化，巯基化等的化学修饰；对于羟基脯氨酸残基的α-羧基而言，可举酯化，酰胺化等的化学修饰；对于羟基脯氨酸残基的羟基而言，可举O-乙酰化等的化学修饰。对应于其他有效成分的种类等，而选择适宜的化学修饰即可。
将上述Pro-Hyp配合到疾病抑制剂的比例或，而且，对于在将此疾病抑制剂作为向关节局部的注入用而使用时的Pro-Hyp的含量而言，与Hyp-Gly中述的比例或含量同样即可。
上述Pro-Hyp与Hyp-Gly同样，由例如，将胶原，明胶分成2阶段酶处理，或从氨基酸合成可得，且对于化学修饰而言，可举如后述的公知的手段。
作为用于得到Pro-Hyp的酶处理法而言，基本上，通过与对于Hyp-Gly说明的2阶段酶处理法同样的方法即可，而2次酶处理中，使如使用例如，有曲霉属等来源的氨基肽酶P及氨酰基脯氨酸二肽酶活性的酶。
Pro-Hyp，与Hyp-Gly同样，可从氨基酸合成，而这时，在以上说明的Hyp-Gly的合成法中，单，代替羟基脯氨酸用脯氨酸，且代替甘氨酸用羟基脯氨酸即可。
如前述，Pro-Hyp也可被施化学修饰。化学修饰的具体的手段或处理条件可适用通常的肽的化学修饰技术。
对于脯氨酸残基的α-氨基的化学修饰，例如，聚肽基化由与N-碳酸酐等的反应，琥珀酰化或马来酰化由使在pH8附近与琥珀酸酐或马来酸酐等反应，乙酰化由使在中性附近与N-羟基琥珀酰亚胺乙酸酯等反应，脱氨基化由使亚硝酸等作用，苯甲酰化由使苯甲酰氯或安息香酸酐等作用，烷基磺酰基化或烯丙基磺酰基化由使与苯磺酰基氯，p-甲苯磺酰基氯，甲磺酰基氯等反应，二硝基苯基化或三硝基苯基化由使2，4-二硝基氟苯，2，4，6-三硝基苯磺酸等作用，氨甲酰化或苯基氨甲酰化由使氰酸等作用，巯基化由使N-乙酰高胱氨酸硫代内酯，S-乙酰巯基琥珀酸酐，硫代仲康酸，S-乙酰硫代衣苹酸酐等作用来进行即可。
对于羟基脯氨酸残基的α-羧基的化学修饰，例如，酯化由向甲醇通气悬浊后干燥氯化氢气体等，酰胺化由使碳二亚胺等作用来进行即可。
对于羟基脯氨酸残基的羟基的化学修饰而言，例如，O-乙酰化由在水溶剂中或非水溶剂中使醋酸酐作用等来进行即可。
作为化学修饰的其他具体例，而可适用特公昭62-44522号公报或特公平5-79046号公报等中记载的化学修饰技术。
对于作为有效成分含Pro-Hyp的疾病抑制剂的详细而言，由于与关于作为有效成分含Hyp-Gly的疾病抑制剂的叙述相同，所以省略说明。
〔Ala-Hyp〕
上述的Ala-Hyp，不仅在与Hyp-Gly联用时，而在单独使用时，也有抑制变形性关节炎等的症状的作用。
以下中，对于此Ala-Hyp详细说明，而由于与关于Hyp-Gly或Pro-Hyp的上述的说明重复的内容多，对于主要差异点说明。
Ala-Hyp也可丙氨酸单位及/或羟基脯氨酸单位被化学修饰，而特别是，对于羟基脯氨酸单位而言，羧基与羟基的任何，或，两方被化学修饰也可。
以上，在本说明书中，“有Ala-Hyp的结构的二肽”，或，将其略记为“Ala-Hyp”时，此包括化学修饰的，也包括未化学修饰的。
Ala-Hyp被化学修饰时，可在从弱酸性到中性溶解，且也可期待与其他有效成分的相溶性升高等，基本上，与上述的Pro-Hyp同样的化学修饰即可。即，对于丙氨酸残基的α-氨基而言，与在上述的Pro-Hyp的脯氨酸残基的α-氨基同样的化学修饰，对于羟基脯氨酸残基的α-氨基及羟基而言，与在上述的Pro-Hyp的羟基脯氨酸残基的α-氨基及羟基同样的化学修饰即可。对应于其他有效成分的种类等，而选择适宜的化学修饰即可。
对于将上述Ala-Hyp配合到疾病抑制剂的比例或，而且，在将此疾病抑制剂作为向关节局部的注入用而使用时的Ala-Hyp的含量而言，与Hyp-Gly中述的比例或含量同样即可。
上述Ala-Hyp，与Hyp-Gly同样，由例如，将胶原，明胶分成2阶段酶处理，或从氨基酸合成可得，且对于化学修饰而言，可举如后述的公知的手段。
作为用于得到Ala-Hyp的酶处理法而言，基本上，通过与对于Hyp-Gly说明的2阶段酶处理法同样的方法即可，而2次酶处理中，使用例如，有曲霉属等来源的蛋白酶活性及羟基氨酰基脯氨酸二肽酶活性的酶。
Ala-Hyp，与Hyp-Gly同样，可从氨基酸合成，而这时，在以上说明的Hyp-Gly的合成法中，单，代替羟基脯氨酸用丙氨酸，且代替甘氨酸用羟基脯氨酸即可。
如前述，且Ala-Hyp也可被施化学修饰。化学修饰的具体的手段或处理条件可适用通常的肽的化学修饰技术。对于丙氨酸残基的α-氨基而言，与在上述的Pro-Hyp的脯氨酸残基的α-氨基同样，对于羟基脯氨酸残基的α-氨基及羟基而言，与在上述的Pro-Hyp的羟基脯氨酸残基的α-氨基及羟基同样化学修饰即可。
对于作为有效成分含Ala-Hyp的疾病抑制剂的详细而言，由于与关于作为有效成分含Hyp-Gly的疾病抑制剂的叙述相同，所以省略说明。
【实施例】
以下，由本发明涉及的二肽或将其含的胶原肽的性能评价试验，以上述二肽作为有效成分的疾病抑制剂的配合例，而更具体说明本发明，而本发明不限定于这些。以下中，为方便，将“重量份”简称为“份”，将“重量％”简称为“％”。
〔二肽〕
<实施例1>
由前述的固相法合成Hyp-Gly。
即，由将表面用氨基修饰的直径0.1mm左右的聚苯乙烯高分子凝胶的珠作为固相用，且作为缩合剂用二异丙基碳二亚胺(DIC)10份的脱水反应，使向用Fmoc(fluorenyl-methoxy-carbonyl)基保护氨基的羟基脯氨酸45份结合甘氨酸45份(肽结合)之后，将固相用溶剂(乙醇)洗好，且除去残留的甘氨酸等。此后，通过将与固相结合的羟基脯氨酸残基的保护基由三氟醋酸的温育除去(脱保护)合成Hyp-Gly。
此二肽合成中，使用Liberty肽合成系统(CEM社制)。
<实施例2>
实施例1的Hyp-Gly，及后述的参考例1-1的Pro-Hyp的1∶1混合物(重量基准)作为实施例2。
<实施例3>
实施例1的Hyp-Gly，后述的参考例1-1的Pro-Hyp，及后述的参考例1-2的Ala-Hyp的1∶1∶1混合物(重量基准)作为实施例3。
<参考例1-1>
在上述Hyp-Gly的合成法，将羟基脯氨酸变更为脯氨酸，甘氨酸变更为羟基脯氨酸的以外，同样地合成Pro-Hyp，且将其作为参考例1-1。
<参考例1-2>
在上述Hyp-Gly的合成法，将羟基脯氨酸变更为丙氨酸，甘氨酸变更为羟基脯氨酸变更为的以外，同样地合成Ala-Hyp，且将其作为参考例1-2。
<比较例1>
在上述Hyp-Gly的合成法中，将羟基脯氨酸变更为亮氨酸，甘氨酸变更为羟基脯氨酸以外，同样地合成Leu-Hyp，且将其作为比较例1。
<比较例2>
在上述Hyp-Gly的合成法中，将羟基脯氨酸变更为苯丙氨酸，甘氨酸变更为羟基脯氨酸以外，同样地合成Phe-Hyp，且将其比较例2作为。
<比较例3>
在上述Hyp-Gly的合成法中，将羟基脯氨酸变更为丝氨酸，甘氨酸变更为羟基脯氨酸以外，同样地合成Ser-Hyp，且将其作为比较例3。
〔三肽〕
<比较例4>
在上述Hyp-Gly的合成法中，将羟基脯氨酸变更为脯氨酸，甘氨酸变更为实施例1中合成的Hyp-Gly以外，同样地合成Pro-Hyp-Gly，且将其作为比较例4。
〔氨基酸〕
<比较例5，6>
是氨基酸的脯氨酸作为比较例5，羟基脯氨酸作为比较例6。
〔胶原肽〕
<实施例4>
根据示于以下的方法，而得到含有Hyp-Gly的猪皮来源的胶原肽(PC)，且将其作为实施例4。
使是猪皮来源胶原的热变性物的明胶(I型胶原)1kg溶解于75℃的温水4L，且温度调节到60℃之后，作为1次反应，而添加黄色曲霉来源蛋白酶10g，且由pH5.0～6.0，于温度45～55℃保持120分钟酶来进行水解处理。接下来，作为2次酶反应，向其中添加有羟基氨酰基脯氨酸二肽酶活性的米曲霉提取酶至终浓度1.5％，且将其可溶化之后，使于50℃反应6小时。反应后，此反应液在100℃加热处理10分钟，且之后，冷却至60℃，且用活性炭与过滤助剂(硅藻土)过滤，且对得到的母液于120℃高温杀菌处理3秒钟。然后，将杀菌后的母液喷雾干燥，且得到猪皮来源的胶原肽(PC)。
将此PC供于薄层层析(TLC)。即，向TLC板(商品名“Cellulose F”，Merck社制)滴下10μg可溶化于水的PC(斑原点)，使干燥之后，用溶剂(n-丁醇∶醋酸∶水＝4∶1∶2)展开。将此板风干之后，由将靛红-醋酸锌发色液(将靛红1g，醋酸锌1.5g加温溶解于异丙醇100mL，且冷却后加醋酸1mL调节)喷雾到同板，确认上述中得到的PC的蓝色的斑的Rf值([从斑原点至发色斑的距离]÷[从斑原点至溶剂展开前沿的距离])，与是点斑到相同板的内部标记物的Hyp-Gly与Pro-Hyp中Hyp-Gly的蓝色斑的Rf值一致，即，此PC含Hyp-Gly。
再有，计数氨基酸序列已知的猪皮来源的I型胶原(重量(X)g)中含的Hyp-Gly的序列的和(Y)，且由下述式求出该I型胶原全体中的理论含有量时，是20.0重量％。
((Hyp-Gly的数(Y))×(Hyp-Gly的重量(分子量)))/(全序列的重量(X))
从以上来看，上述PC理论上含Hyp-Gly最大20.0重量％。
<实施例5>
用鱼鳞来源明胶以外，由与上述PC的制备同样的操作，得到含有Hyp-Gly的鱼鳞来源的胶原肽(FC)，且将其作为实施例5。
将此FC与上述PC的情况中同样由TLC分析时，确认出Hyp-Gly的存在。
再有，计数氨基酸序列已知的鱼鳞来源的I型胶原(重量(X)g)中含的Hyp-Gly的序列的和(Y)，且由下述式求出该I型胶原全体中的理论含有量时，是23.5重量％。
((Hyp-Gly的数(Y))×(Hyp-Gly的重量(分子量)))/(全序列的重量(X))
从以上来看，上述FC理论上含Hyp-Gly最大23.5重量％。
<实施例6>
根据示于以下的方法，得到含有Hyp-Gly的猪皮来源的胶原肽(PC-CP)，且将其作为实施例6。
使猪皮来源胶原的热变性物是的明胶(I型胶原)1kg向20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)4L在加温的同时溶解之后，冷却至40℃，且作为1次酶反应，而添加1g的胶原酶(新田明胶社制，Collagenase N2)后，由pH7.0～7.8，于40℃保持24小时进行酶分解处理。接下来作为2次酶反应，而向此反应液添加有羟基氨酰基脯氨酸二肽酶活性的黑曲霉提取酶至终浓度1.0％，且将其可溶化之后，使于pH4.0，50℃反应6小时。反应后，将此反应液在100℃加热处理10分钟，且之后，冷却至60℃，且用活性炭与过滤助剂(硅藻土)过滤，且对得到的母液于120℃高温杀菌处理3秒钟。然后，将杀菌后的母液喷雾干燥，得到PC-CP。
另外，将此PC-CP与上述PC的情况中同样由TLC分析时，确认出Hyp-Gly的存在。
再有，计数氨基酸序列已知的猪皮来源的I型胶原(重量(X)g)中含的Hyp-Gly的序列的和(Y)，且由下述式求出该I型胶原全体中的理论含有量时，是20.0重量％。
((Hyp-Gly的数(Y))×(Hyp-Gly的重量(分子量)))/(全序列的重量(X))
从以上来看，上述PC-CP理论上含Hyp-Gly最大20.0重量％。
<实施例7>
根据示于以下的方法，得到含有Hyp-Gly及Pro-Hyp的猪皮来源的胶原肽(PC-PH)，且将其作为实施例7。
使是猪皮来源胶原的热变性物的明胶(I型胶原)1kg溶解于75℃的温水4L，且将温度调节到60℃之后，作为1次酶反应，而添加黄色曲霉来源蛋白酶10g，且由pH5.0～6.0，于温度45～55℃保持120分钟酶进行水解处理。接下来，作为2次酶反应，而向其中添加有氨酰基脯氨酸二肽酶活性及羟基氨酰基脯氨酸二肽酶活性的黑曲霉提取酶至终浓度1.5％，且将其可溶化之后，使于pH4.5～5.5，温度45～50℃反应6小时。反应后，此反应液在100℃加热处理10分钟，且之后，冷却至60℃，且用活性炭与过滤助剂(硅藻土)过滤，且将得到的母液于120℃高温杀菌处理3秒钟。然后，将杀菌后的母液喷雾干燥，得到PC-PH。
另外，将此PC-PH与上述PC的情况中同样由TLC分析时，确认出PC-PH的蓝色斑的Rf值与Hyp-Gly及Pro-Hyp的各蓝色斑的Rf值一致，且共含PC-PHHyp-Gly及Pro-Hyp。
<比较例7>
仅进行在上述的PC-CP的制备的1次酶反应，而得到均不含有Hyp-Gly，Pro-Hyp的胶原肽(PC-CP-Cont)，且将其作为比较例7。
即，使猪皮来源胶原的热变性物是的明胶(I型胶原)1kg加温的同时溶解在20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)4L中之后，冷却至40℃，且作为1次酶反应，而添加1g的胶原酶(新田明胶社制，Collagenase N2)后，由pH7.0～7.8，于40℃保持24小时进行酶分解处理。接下来，将酶水解处理中得到的溶液在100℃加热处理10分钟，且之后，冷却至60℃，且用活性炭与过滤助剂(硅藻土)过滤，且对得到的母液于120℃高温杀菌处理3秒钟。然后，将杀菌后的母液喷雾干燥，且PC-CP-Cont得到。
另外，将此PC-CP-Cont与上述PC的情况中同样由TLC分析时，无法确认Hyp-Gly，Pro-Hyp的任何存在。
〔性能评价试验〕
用上述实施例1～7，参考例1-1、1-2、比较例1～7涉及的各二肽，三肽，氨基酸，胶原肽进行的各性能评价试验的详细示于以下。
<评价试验1-1：破骨细胞的分化及活化的抑制>
基于Kobayashi Y.等的破骨细胞分化培养法[J.Bone Miner.Metab.(2004)22：p.318-328]评价。
即，用Hyp-Gly、Hyp-Gly及Pro-Hyp的1∶1混合物，且将各自添加到小鼠初代骨髓细胞培养液至终浓度625μM，且从培养6天后研究是标记物酶的酒石酸抗性酸性磷酸酯水解酶(TRAP)的各抑制活性。同样地，研究用其他二肽(Pro-Hyp、Ala-Hyp、Leu-Hyp、Phe-Hyp、Ser-Hyp)，三肽(Pro-Hyp-Gly)，氨基酸(Pro、Hyp)时的TRAP抑制活性。而且，也研究作为对照，而未添加肽(空白)之时的TRAP抑制活性。
另外，而且，各种肽，由氨基酸的破骨细胞的分化及活化的抑制度，以下由Pit测定评价。即，将破骨细胞在象牙片上培养的Pit测定基于Kakudo S，et al(1996).J.Bone Miner.Metab.14：129-136实施。具体而言如下。
若令含有小鼠肠管骨来源的破骨细胞的前体细胞与骨髓间质细胞的悬浮液在10％DMSO存在下，于-80℃冷冻保存，而使成熟破骨细胞死亡。
将此细胞2.0×105接种于设置象牙片的96孔板的各孔，且将各被验肽添加到培养液，于37℃，5％CO2培养约1周。之后，用硅制橡胶POLICEMAN从象牙片除去细胞之后，用酸苏木精溶液染色象牙片数分钟。此时，由TRAP染色测量TRAP染色阳性多核巨细胞(破骨细胞)数，且算出对照(空白)的对于其细胞数的相对数。之后，在显微镜下测量由破骨细胞的Pit数(吸收窝的数)，且由对于空白(对照)的相对比表示各被验肽的破骨细胞的活性抑制度。
结果示于表1。
[表1]
试验数：n＝6
注)**：与对照相比有统计显著差异(p＜0.01)
*：与对照相比有统计显著差异(p＜0.05)
<评价试验1-2：成骨细胞的分化及活化的亢进>
向成骨细胞株MC3T3-E1培养液分别加地塞米松(终浓度1nmol/L)，β-甘油磷酸(终浓度5mmol/L)，抗坏血酸(终浓度100μg/mL)之后，用Hyp-Gly、Hyp-Gly及Pro-Hyp的1∶1混合物，且将这些添加到上述培养液至终浓度2.5mmol/L，且从培养10天后研究成骨细胞的分化及是石灰化的标记物酶的碱性磷酸酶(ALP)的各亢进活性。同样地，研究用其他二肽(Pro-Hyp、Ala-Hyp、Leu-Hyp、Phe-Hyp、Ser-Hyp)，三肽(Pro-Hyp-Gly)，氨基酸(Pro、Hyp)时的ALP亢进活性。而且，也研究对照作为，而未添加肽(空白)之时的ALP亢进活性。结果示于表2。
[表2]
Figure BPA00001324972400221
试验数：n＝6
注)**：与对照相比有统计显著差异(p＜0.01)
<评价试验1-3：软骨细胞的变性的抑制>
用Hyp-Gly、Hyp-Gly及Pro-Hyp的1∶1混合物，Hyp-Gly、Pro-Hyp及Ala-Hyp的1∶1∶1混合物，且将各二肽添加到前体软骨细胞株ATDC5培养液至终浓度2.5mmol/L，且从培养5天后研究肥大化软骨及是石灰化的标记物酶的碱性磷酸酶(ALP)的各抑制活性。同样地，研究用其他二肽(Pro-Hyp、Ala-Hyp、Leu-Hyp、Phe-Hyp、Ser-Hyp)，三肽(Pro-Hyp-Gly)，氨基酸(Pro、Hyp)时的ALP活性。而且，也研究作为对照，而未添加肽(空白)之时的ALP活性。结果示于表3。
[表3]
Figure BPA00001324972400222
试验数：n＝6
注)**：与对照相比有统计显著差异(p＜0.01)
*：与对照相比有统计显著差异(p＜0.05)
<评价试验1-4：皮肤真皮中的原胶原量的恢复>
给Wister系雄大鼠(140g)由市售固态食(TypeMF，ORIENTAL酵母社制)预备饲育3天之后，换成酪蛋白食，且3天后使皮肤创伤发症。
上述皮肤创伤是，由在大鼠的腹部施除毛处理3天使发症，且具体而言，给大鼠将Nembutal(4mg/0.08mL/100gBW)腹腔内施用麻醉之后，对于腹部(约3×5cm)进行由毛剪的剪毛。而且，涂覆市售的除毛剂(Epilat除毛霜，Kanebo社制)，且放置5分钟之后，用剃刀小心剃。此处理，从皮肤样品的采取开始的3天前1天1次进行连续3天。
将试验组分成酪蛋白食组，Hyp-Gly组、(Hyp-Gly)+(Pro-Hyp)组(Hyp-Gly及Pro-Hyp的1∶1混合物)、PC组、FC组、PC-CP组、PC-PH组，且对各组，在除毛处理当日(除毛处理后第0天)，在从除毛处理1天后，从除毛处理2天后，从除毛处理4天后，测定皮肤创伤恢复过程的皮肤胶原量的推移(每总胶原量的比率)。
各组的食饵组成示于表4。
[表4]
Figure BPA00001324972400231
使如使用上述食饵组成饲育大鼠，且贯穿饲育期间食饵及水作为自由摄取。
而且，Hyp-Gly组、(Hyp-Gly)+(Pro-Hyp)组(Hyp-Gly及Pro-Hyp的1∶1混合物)、PC组、FC组、PC-CP组、PC-PH组中，精秤与配合于食饵的各Hyp-Gly、PC、FC、PC-CP、PC-PH相同者10g，且用蒸留水20mL保温溶解而给各试验组的大鼠，1天1次在正午用ゾンデ胃内施用。
各组的皮肤创伤恢复过程的皮肤胶原量的推移(每总胶原量的比率)的测定结果示于表5。
[表5]
Figure BPA00001324972400241
被验动物数：n＝4
注)相异的字母间有统计显著差异(p＜0.05)
●(注释)：皮肤原胶原比率(％)＝①÷[①+②+③]×100
①：0.45M NaCl水溶液可溶性胶原量：原胶原量
②：0.5M醋酸水溶液可溶性胶原量：酸可溶性胶原量
③：0.5M醋酸水溶液不可溶性胶原量：(酸不溶性胶原＝架桥化胶原量)
其中，皮肤可溶性胶原的定量如下进行。
将皮肤下的脂肪尽可能除去的同时修整处理皮肤与未处理皮肤。用解剖用剪仔细细切，且精秤约0.2～0.3g，且采集到14mL离心管。向其中加冷0.45M氯化钠溶液4mL，用POLYTRON匀浆机(speed No4)冷却的同时匀浆20秒钟。而且，加冷0.45M氯化钠溶液2mL，而在冷藏室内用旋转搅拌机(TAITEC社制)进行24小时的提取。将提取液用冷却离心机以采取20,000g，20分钟离心上清液，且作为中性盐可溶性胶原级分。向离心残渣加冷0.5M醋酸6mL，且同样进行24小时的提取。将0.5M醋酸提取液用冷却离心机以20,000g，20分钟离心采取上清液，且作为酸可溶性胶原级分。其离心残渣作为不溶性胶原级分。
向中性盐可溶性胶原级分与酸可溶性胶原级分的各5mL中加相同容积的浓盐酸5mL，且向不溶性胶原级分中加浓盐酸1mL，使于60℃加温溶解5分钟，且再用6N盐酸2mL清洗3次的同时移到玻璃制水解用试管，且于110℃进行水解24小时。
然后，由将各胶原级分的水解液中含的羟基脯氨酸量比色定量，进行各胶原级分的定量，且算出对于这些各胶原级分的总和的上述中性盐可溶性胶原级分的相对比。
上述羟基脯氨酸量的比色定量由Firschein和Shill法进行，且具体而言，如下进行。
向样品溶液2mL加2-丙醇2mL，且充分搅拌。向其中加是氧化剂的氯胺T液0.5mL，精确放置4分钟之后，冰冷。向其中加p-二甲基氨基苯甲醛溶液5mL，而充分搅拌之后，沸腾水浴中精确加热2分钟。之后，直接冰冷，且放置1小时之后，以波长575nm进行比色定量。
再有，氯胺T液是将氯胺T(5g)溶解调节于蒸留水50mL，且冷藏保存，且使用直前用醋酸缓冲液(pH6.0)以1∶4稀释。另外，p-二甲基氨基苯甲醛溶液(Ehrlich溶液)是向p-二甲基氨基苯甲醛粉末20g加浓盐酸22mL而在沸腾水中加热溶解，且直接在冰水中冷却，且加2-丙醇122mL而搅拌溶解制备。
<评价试验1-5：肠管吸收性>
使Wister系雄大鼠(170g)一晚绝食供于实验。检体样品中，将Hyp-Gly、Pro-Hyp、Ala-Hyp、Ser-Hyp用各215nmol/10mL胃内施用。
作为试验方法而言，在大鼠的心脏与门脉安装套管而进行单向灌流。作为灌流液而言，向含NaCl 9.0g，5.75％KCl 8mL，10.55％KH2PO42mL，19％MgSO4 2mL，NaHCO3 2.73g，葡萄糖3.43g，水1255mL的Krebs-Ringer重碳酸液(KRB液、pH7.4)，对于上述KRB液500mL，加牛血清白蛋白10g，地塞米松(0.123mg/mL)0.5mL，去甲肾上腺素(0.024mg/mL)0.5mL而使用。
向从门脉采取的灌流样品溶液5.0mL加30％磺基水杨酸0.5mL，且剧烈搅拌，且在冰箱放置一晚。将此样品以3000rpm离心分离10分钟，且进行除蛋白。对于离心上清液，由比色定量其0.5mL中的羟基脯氨酸量，得到游离型Hyp量。
而且，在螺旋盖试管秤取上述离心上清液3.0mL，且向其中加当量的浓盐酸，且于110℃水解24小时。用蒸发器浓缩干燥，且除去盐酸，且溶解于5mL的蒸留水，且加数滴饱和氢氧化锂溶液调节到pH5～7，且定容至10mL。对于此溶液2mL，由比色定量羟基脯氨酸量，得到总Hyp量。从水解后的总Hyp量减去水解前的游离型Hyp量而得到的值作为肽态Hyp量。从此肽态Hyp量，首先确认检体样品的各二肽大鼠门脉灌流液中被吸收的定量值。
在上述，而羟基脯氨酸量的比色定量由在评价试验1-4具体说明的Firschein和Shill法进行。
而且，大鼠门脉灌流液中回收到的二肽，即，肠管被吸收的各Hyp-Gly、Pro-Hyp、Ala-Hyp、Ser-Hyp的鉴定，定量由下述的HPLC分析及质谱分析(LC/MS/MS)进行。
(HPLC分析)
灌流液中的二肽的分析由逆相HPLC分析进行。HPLC装置作为而言，用由送液泵，デカツサ，自动采样机，柱炉，紫外部分光光度计，打印机，系统控制器构成的日本分光社制的LCSS-905系统。逆相柱用Nova Pak C18(3.9×150mm)。
用含有0.1％TFA的乙腈-水系统的线性梯度移动层，且样品注入量是70μL，流速是1mL/min。
(LC/MS/MS分析)
作为HPLC装置则用U980HPLC(日本分光社制)，且此装置安装ODS(C18)柱(Mightysil RP-18、2×250mm，Kanto Chemical Co Ltd社制)。作为移动相溶剂而言，作为含有0.2％蚁酸的乙腈-水系统，且由线性梯度使从0％升高到40％乙腈浓度40分钟，且用100％乙腈进行10分钟清洗。样品注入量是10μL，且柱温度是40℃。
MS分析通过由4通道的Multiple Reaction Monitoring法的Quattro LC质量分光光度计(Micromass、Manchester、UK)的MS/MS方式进行。即，从HPLC的洗脱液监控是[M+H]+的m/z与其片段离子种的m/s。对于Pro-Hyp则用[M+H]+m/z：229.1＞132.1，对于Ser-Hyp则用[M+H]+m/z：219.1＞132.1，对于Ala-Hyp则用[M+H]+m/z：203.1＞132.1，对于Hyp-Gly则用[M+H]+m/z：189.1＞86.1监控。
灌流液用最终浓度3％的磺基水杨酸处理，且进行除蛋白。将上清液冷冻干燥，且干燥粉末10mg溶解于蒸留水，且用阳离子交换树脂柱处理，得到氨洗脱级分。除去此级分的溶剂，且溶解于蒸留水，进行LC/MS/MS分析。
结果如表6所示。
[表6]
Figure BPA00001324972400271
<评价试验1-6>
给10周龄的C57BL/6J小鼠，使以示于下述表7的组成经口摄取各种饲料。
[表7]
Figure BPA00001324972400281
在此试验而言，表7中，作为Hyp-Gly添加组，用Hyp-Gly([Hyp-Gly]组)，且作为[(Hyp-Gly)+(Pro-Hyp)]添加组，而用Hyp-Gly与Pro-Hyp的1∶1混合物([(Hyp-Gly)+(Pro-Hyp)]组)。小鼠3周后处死，且从各组的大腿骨·胫骨关节部的μCT(台式微CT扫描仪SKYSCAN1172，SKYSCAN社制)像测定关节腔的宽度，且从非脱灰苏木精染色切片进行基质结构评价及评价细胞状态。为了比较，作为表7中的(Pro+Hyp)添加组，使用用脯氨酸与羟基脯氨酸的游离氨基酸混合物的游离氨基酸混合物添加组([Pro+Hyp]组)，而进行同样的操作，评价。
结果示于表8。
[表8]
被验动物数：n＝4
注)(*)：与N组相比有统计显著差异(p＜0.05)
<评价试验1-7>
对于Hyp-Gly单独([Hyp-Gly]组)，Hyp-Gly与Pro-Hyp的1∶1混合物([(Hyp-Gly)+(Pro-Hyp)]组)的各自，可溶化到生理盐水至终浓度5mmol/L之后，过滤灭菌。将这些溶液0.5ml，给10周龄的C57BL/6J小鼠，对于以上述表7的组成给3周饲料的C组，注射到其左大腿骨、胫骨关节腔。1周后处死，且作成左右的大腿骨-胫骨关节腔部的非脱灰Mayer苏木精染色切片，及病理评价。同样地注射之后，对于3周后处死的情况也，作成左右的大腿骨-胫骨关节腔部的非脱灰Mayer苏木精染色切片，且与上述评价试验1-6的N组的病理切片相比病理评价。
结果示于表9。
[表9]
被验动物数：n＝4
<性能评价试验的结果的考察>
如上述结果所示，从与对照(空白)的比较，Hyp-Gly抑制破骨细胞的分化与活化(表1)，亢进成骨细胞的分化与活化(表2)，抑制软骨细胞的变性，调节其分化(表3)，使皮肤真皮中的原胶原量恢复(表5)。然后，其效果相比比较例涉及的其他肽，氨基酸，三肽都优良。
另外知，Hyp-Gly与Ser-Hyp、Ala-Hyp相比，极其迅速且稳定地(不被分解成氨基酸地)被肠管吸收(表6)。
然后，从示于表8、9的结果知，在是本发明涉及的二肽的Hyp-Gly单独的情况中或与Pro-Hyp的联用的情况中，抑制关节软骨的变性，或促进关节软骨的再生。
而且，将Hyp-Gly与Pro-Hyp联用时，知发挥从各自单独的效果可期待的以上的效果，且认定其协同效果(表1～3、5)。特别是，在成骨细胞的活化的亢进(表2)，软骨细胞的变性抑制(表3)而言，发挥与Hyp-Gly单独，Pro-Hyp单独的任何相比都优良的效果。
对于软骨细胞的变性抑制(表3)而言，在Hyp-Gly，Pro-Hyp及Ala-Hyp的3者联用的情况示与其他任何相比都优良的结果，且由也联用Ala-Hyp认定显著的协同效果。
再有，Pro-Hyp，在表1的塑料培养皿上的评价，或表2的“ALP的相对值(％)”的评价中，未被认定如Hyp-Gly的显著的效果，而从在表1的象牙片上的评价，明了抑制破骨细胞的分化及活化，因此知，对于骨质疏松症的抑制有效。而且，Pro-Hyp，如表3所示知，抑制软骨细胞的变性的效果也优良。
从示于表3的结果也知，Ala-Hyp，单独地对于软骨细胞的变性抑制有效。
另外知，Pro-Hyp与Hyp-Gly同样，与Ser-Hyp、Ala-Hyp相比，极其迅速且稳定(不被分解成氨基酸地)被肠管吸收(表6)。
〔疾病抑制剂〕
用如上所述的本发明涉及的二肽或胶原肽，得到本发明涉及的疾病抑制剂。它们的配合例如下所述。
<实施例8～13>
以示于表10的配合，混合各材料，以对表10中记载的配合整体10份的比例用作为赋形剂的结晶性纤维素，通过由常法打锭成形，作为经口用使用，得到实施例8～13涉及的疾病抑制剂。再有，在表10的Hyp-Gly是实施例1，Pro-Hyp是参考例1-1的合成二肽，且PC、FC、PC-CP、PC-PH分别是实施例4～7，PC-CP-Cont是比较例7的胶原肽。
[表10]
Figure BPA00001324972400311
<实施例14>
用上述实施例4的PC制备咀嚼型的片。
具体而言，将下述配合成分混合，且用打锭成型器，制备一粒0.8g的咀嚼型的片。此咀嚼型的片是，将全量作为100重量％时，含有约10.0重量％的Hyp-Gly作为有效成分。
  PC   50.0kg
  抗坏血酸   10.0kg
  MICROCALMAG S(SK Foods社制)   4.6kg
  MABIT(林原社制)   19.0kg
  结晶纤维素   10.0kg
  乳化剂   3.2kg
  阿司帕坦   0.5kg
  发酵乳粉末   1.4kg
  粉末香料   1.0kg
  柠檬酸   0.3kg
<实施例15>
用实施例4的PC，且混合下述配合成分，使溶解于100～140mL的热水而制备饮用的粉末清炖肉汤(1袋6.0g)。此粉末清炖肉汤是，将全量作为100重量％时，含有约7.0重量％的Hyp-Gly作为有效成分。
  PC   35.0kg
  鸡精粉末   25.0kg
  食盐   18.0kg
  葡萄糖   7.7kg
  乳酸钙   7.0kg
  谷氨酸钠   4.0kg
  洋葱提取物粉末   1.0kg
  HVP   1.0kg
  牛肉调味料   0.5kg
  5’-核糖核苷酸2钠   0.5kg
  白胡椒   0.2kg
  姜黄   0.1kg
<实施例16>
用实施例4的PC，且混合下述配合成分，使溶解于100～150mL的水而制备饮用的粉末汁(1袋13.0g)。此粉末汁是，将全量作为100重量％时，含有约8.0重量％的Hyp-Gly作为有效成分。
  PC   40.4kg
  抗坏血酸钠   1.2kg
  赤藓糖醇   52.0kg
  乙酰舒泛K   0.1kg
  阿司帕坦   0.1kg
  柠檬酸钠   0.8kg
  柠檬酸(结晶)   4.6kg
  麝香葡萄酒调味料   0.8kg
<实施例17>
用实施例4的PC，且根据下述配合成分，且向纯化水溶解其他配合成分，且制备成pH3.5，B’×9.0％之后，于110℃施加热杀菌处理30秒，且冷却至10℃后无菌填充到纸包装，而制备清凉饮料水(1包装125mL)。此清凉饮料水是，将全量作为100重量％时，含有约0.5重量％的Hyp-Gly作为有效成分。
  PC   2.5kg
  维生素混合物DN(BASF日本社制)   0.1kg
  赤藓糖醇   5.5kg
  乙酰舒泛K   0.015kg
  阿司帕坦   0.005kg
  柠檬酸   约0.6kg
  水果混合物调味料   0.16L
  荔枝调味料   0.04L
  纯化水   残量(设定至合计100.0kg)
<实施例18>
首先，向下述配合成分中的纯化水(B)浸渍实施例4的PC及明胶而使膨润30分钟之后，达80℃的温度加热30分钟使完全溶解，且作为明胶溶液。接下来，向下述配合成分中的纯化水(A)中使溶解乳寡糖，粉末麦芽还原糖，赤藓糖醇，及难消化性糊精，且煮后，添加阿司帕坦，上述明胶溶液，预先使溶解于纯化水(A)之一部分的柠檬酸(结晶)，胡椒薄荷调味料，薄荷调味料，柠檬调味料，及红花黄染料，且制成B’×79～81％之后消泡，且填充到淀粉模型使于室温干燥24小时，而制备胶冻(1粒4g)。此胶冻是，将全量作为100重量％时，含有约1.0重量％的Hyp-Gly作为有效成分。
  PC   5.0kg
  乳寡糖   41.0kg
  粉末麦芽还原糖   31.0kg
  赤藓糖醇   5.0kg
  难消化性糊精   5.0kg
  阿司帕坦   0.05kg
  明胶(APH250，新田明胶社制)   7.0kg
  柠檬酸(结晶)   1.2kg
  胡椒薄荷调味料   0.6L
  薄荷调味料   0.2L
  柠檬调味料   0.7L
  红花黄染料   适量
  纯化水(A)   20.0L
  纯化水(B)   18.0L
<实施例19>
通过将实施例1的Hyp-Gly用灭菌结束的生理的盐水可溶化至2.5mM的浓度，可作为向患部的注入用使用，得到实施例19涉及的疾病抑制剂。
—Pro-Hyp关于的参考数据—
以下中，作为参考，而示对于含有Pro-Hyp的胶原肽或Pro-Hyp的效果。
首先，对于用于性能评价试验的含有Pro-Hyp的胶原肽说明。胶原肽是含Pro-Hyp的2种的猪皮来源的胶原肽(以下中，分别简写为“PC”，“PC-CA”。)，为了与含本发明涉及的Pro-Hyp的鱼鳞来源的胶原肽(以下中，简写为“FC”。)比较，准备不含Hyp-Gly及Pro-Hyp的2种的猪皮来源的胶原肽(以下中，分别简写为“PC-Cont”，“PC-CA-Cont”。)。
<PC>
使是猪皮来源胶原的热变性物的明胶(I型胶原)1kg溶解于75℃的温水4kg，且温度调节到60℃之后，作为1次酶反应，添加黄色曲霉来源蛋白酶10g，且通过于pH5.0～6.0，温度45～55℃保持120分钟酶进行水解处理。接下来，作为2次酶反应，向其中添加有氨基肽酶P及氨酰基脯氨酸二肽酶活性的米曲霉提取酶至终浓度0.5％，且将其可溶化之后，使于50℃反应6小时。反应后，将此反应液在100℃加热处理10分钟，之后，冷却至60℃，且用活性炭和过滤助剂(硅藻土)过滤，且对得到的母液于120℃高温杀菌处理3秒钟。然后，将杀菌后的母液喷雾干燥，得到PC。
将此PC供于薄层层析。即，向薄膜层析板(商品名“CelluloseF”，Merck社制)滴下10μg可溶化于水的PC之后，用溶剂(n-丁醇∶醋酸∶水＝4∶1∶2)展开。将此板风干而喷雾靛红·醋酸锌试剂之后，由蓝色的斑确认N末端存在是Pro的肽的同时，上述中得到的PC的蓝色斑的Rf值([从斑原点至发色斑的距离]÷[从斑原点至溶剂前沿的距离])与是点斑到相同板的内部标记物的Hyp-Gly与Pro-Hyp中，Pro-Hyp的各蓝色斑的Rf值一致，即确认，此PC含Pro-Hyp。
<FC>
用鱼鳞来源的明胶以外，由与上述PC的制备同样的操作得到FC。
另外，将此FC与上述PC同样由薄膜层析分析时，确认出Pro-Hyp的存在。
<PC-CA>
使是猪皮来源胶原的热变性物的明胶(I型胶原)1kg加温的同时溶解到75℃的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)4L中之后，冷却至40℃，且作为1次酶反应，添加1g的胶原酶(新田明胶社制，Collagenase N-2)后，由pH7.0～7.8，于40℃保持24小时进行酶分解处理。接下来作为2次酶反应，向此反应液添加有氨基肽酶P及氨酰基脯氨酸二肽酶活性的黑曲霉提取酶至终浓度0.25％，使于pH4.0，50℃反应6小时。反应后，将此反应液于100℃加温处理10分钟，之后，冷却至60℃，且用活性炭与过滤助剂(硅藻土)过滤，且对得到的母液于120℃施高温杀菌处理3秒钟。然后，将杀菌后的母液喷雾干燥，而得到PC-CA。
使上述干燥重量2g的PC-CA溶解于10mL的水而分成2次负荷到柱(“DEAE TOYOPEARL 650M”，东ソ一社制；16×650mm)，而回收用蒸留水洗脱出的空体积级分。接下来，将回收的级分负荷于柱(“SP TOYOPEARL 650M”，东ソ一社制；16×650mm)，且回收用蒸留水洗脱出的空体积级分。接下来，将此级分负荷于柱(“SEPHADEX LH-20”，Pharmacia社制；26×900mm)，且用30％甲醇水溶液洗脱。以9mL/级分分级分离，且回收与是化学合成品的Pro-Hyp洗脱的位置相当的级分。将得到的级分以用柱(“μBondasphere 5μC18 
Figure BPA00001324972400351
”，Waters社制；3.9×150mm)的HPLC，由含0.1％三氟醋酸的0～32％以下的乙腈水溶液的直线浓度梯度洗脱(流速1mL/min，将0～32％的梯度以18分钟进行)分级分离，且分取在与是化学合成品的Pro-Hyp洗脱的位置相当的保持时间被洗脱的顶峰部分。然后，将分取液由减压干燥，得到白色粉末。将得到的白色粉末的结构通过由Edman法的蛋白结构解析装置(“蛋白测序仪491型”，Applied Biosystems社制)解析时，确认出Pro-Hyp的存在。
<PC-Cont>
仅进行在上述的PC的制备的1次酶反应，而得到PC-Cont。
即，使是猪皮来源胶原的热变性物的明胶(I型胶原)1kg溶解于75℃的温水4kg，且将温度调节到60℃之后，添加黄色曲霉来源蛋白酶10g，且通过于pH5.0～6.0，温度45～55℃保持120分钟酶进行水解处理。接下来，将酶水解处理中得到的溶液于85℃加热10分钟使酶失活，之后，冷却至60℃，且用活性炭与过滤助剂(硅藻土)过滤，及对得到的母液于120℃施高温杀菌处理3秒钟。然后，将杀菌后的母液由喷雾干燥，得到粉末化的PC-Cont。
将此PC-Cont与PC同样由薄膜层析分析时，确认不出蓝色的斑，且也未可确认Hyp-Gly，Pro-Hyp的任何存在。
<PC-CA-Cont>
仅进行在上述的PC-CA的制备的1次酶反应，而得到PC-CA-Cont。
即，使是猪皮胶原的热变性物的明胶(I型胶原)1kg向75℃的20mM tris-HCl缓冲液(pH7.5)4L在加温的同时溶解，冷却至40℃之后，添加1g的胶原酶(新田明胶社制，Collagenase N-2)后，由pH7.0～7.8，于40℃保持24小时进行酶分解处理。接下来，将酶水解处理中得到的溶液于85℃加热10分钟使酶失活，且之后，用活性炭与过滤助剂(硅藻土)过滤，且对得到的母液于120℃施高温杀菌处理3秒钟。然后，将杀菌后的母液由喷雾干燥，得到粉末化的PC-CA-Cont。
将此PC-CA-Cont与PC同样由薄膜层析分析时，确认不出蓝色的斑，且也未可确认Hyp-Gly，Pro-Hyp的任何存在。
<评价试验2-1>
用上述PC(PC组)，FC(FC组)及PC-CA(PC-CA组)，且将各胶原肽添加到前体软骨细胞株ATDC5培养液至终浓度0.1％，且从培养5天后研究肥大化软骨及是石灰化的标记物酶的碱性磷酸酶(ALP)的各抑制活性。为了比较，也研究未添加肽(N组)之时的ALP抑制活性，用终浓度0.1％的胨(Pe组)时的ALP抑制活性，用上述PC-Cont(PC-Cont组)，PC-CA-Cont(PC-CA-Cont组)时的ALP抑制活性。结果示于表11。
[表11]
*)与N组相比认定统计显著差异(p＜0.05)
<评价试验2-2>
用由固相法合成的二肽Pro-Hyp(P·H·日本社制)([Pro-Hyp]组)，且添加量作为2.5mM，且作为比较，用未添加肽(N组)，是游离氨基酸的甘氨酸(Gly组)，脯氨酸(Pro组)，羟基脯氨酸(Hyp组)，脯氨酸与羟基脯氨酸的游离氨基酸混合物([Pro+Hyp]组)，甘氨酸与脯氨酸与羟基脯氨酸的游离氨基酸混合物([Gly+Pro+Hyp]组)，由固相法合成的三肽Pro-Hyp-Gly(P·H·日本社制)([Pro-Hyp-Gly]组)以外，与评价试验2-1同样地研究ALP的抑制活性。结果示于表12。
[表12]
Figure BPA00001324972400371
*)与N组相比认定统计显著差异(p＜0.05)
**)P·H·日本社制
<评价试验2-3>
给10周龄的C57BL/6J小鼠，以示于表13的组成使经口摄取各种饲料。在此试验而言，表13中，作为胶原肽添加组，用上述PC(PC组)，FC(FC组)及PC-CA(PC-CA组)的同时，作为比较，而用上述PC-Cont(PC-Cont组)，PC-CA-Cont(PC-CA-Cont组)。将小鼠在3周后处死之后，从各组的大腿骨、胫骨关节部的非脱灰苏木精染色切片，基质结构评价及评价细胞状态，且测定关节腔的宽度。
结果示于表14，表16。将示于表14的值(病理学分值)以示于表15的基准评价各小鼠的关节软骨的基质结构及细胞状态，且是将它们的值平均的值。
[表13]
  N组   C组   胶原肽添加组  Pro-Hyp添加组  (Pro+Hyp)添加组
  酪蛋白   200   200   150  200  200
  猪油   58.3   58.3   58.3  58.3  58.3
  玉米油   11.7   11.7   11.7  11.7  11.7
  矿物混合物   35   35   35  35  35
  维生素混合物   10   10   10  10  10
  蔗糖   100   100   100  100  100
  玉米淀粉   529.5   470.45   470.45  517.45  517.45
  纤维素   50   50   50  50  50
  L-胱氨酸   3   3   3  3  3
  磷酸钾   -   59.05   59.05  59.05  59.05
  胶原肽   -   -   50  -  -
  Pro-Hyp   -   -   -  3  -
  Pro+Hyp   -   -   -  -  3
[表14]
*)与N组相比认定统计显著差异(p＜0.05)
[表15]
 基质的结构  细胞状态
 0正常  0正常
 1表面异常  2有缺损
 3表面的纤维挛缩  5有强的缺损
 6有深的裂纹  8软骨及细胞全体缺损
 8软骨的完全的缺损
[表16]
Figure BPA00001324972400382
*)与N组相比认定统计显著差异(p＜0.05)
而且，对于上述N组，C组及PC组，进行由CT装置(X线CTLatheta，ALOKA社制)的骨测量。结果示于表17。
[表17]
Figure BPA00001324972400383
<评价试验2-4>
给10周龄的C57BL/6J小鼠，使以示于上述表13的组成经口摄取各种饲料。在此试验而言，表13中，作为Pro-Hyp添加组，而用是化学合成试剂的二肽Pro-Hyp(BACHEM社制)([Pro-Hyp]组)。将小鼠3周后处死，且从各组的大腿骨、胫骨关节部的μCT(台式微CT扫描仪SKYSCAN1172，SKYSCAN社制)像测定关节腔的宽度，且从非脱灰苏木精染色切片评价基质结构及评价细胞状态。另外，为了比较，作为表13中的(Pro+Hyp)添加组，而用使用脯氨酸与羟基脯氨酸的游离氨基酸混合物的游离氨基酸混合物添加组([Pro+Hyp]组)，而进行同样的操作，评价。
结果示于表18。
[表18]
Figure BPA00001324972400391
被验动物数：n＝4
注)(*)：与N组相比有统计显著差异(p＜0.05)
<评价试验2-5>
将由固相法合成的二肽Pro-Hyp(P·H·日本社制)([Pro-Hyp]组)，可溶化于生理盐水至终浓度5mmol/L之后，过滤灭菌。将此溶液0.5ml，给10周龄的C57BL/6J小鼠，对于以上述表13的组成给饲料3周的C组，而注射于其左大腿骨、胫骨关节腔。1周后处死，且作成左右的大腿骨-胫骨关节腔部的非脱灰Mayer苏木精染色切片，且病理评价。同样地注射之后，对于3周后处死的情况也，作成左右的大腿骨-胫骨关节腔部的非脱灰Mayer苏木精染色切片，且与上述评价试验2-4的N组的病理切片相比进行病理评价。
结果示于表19。
[表19]
Figure BPA00001324972400392
被验动物数：n＝4
<性能评价试验的结果的考察>
从上述评价试验2-1，2-3的结果(表11，14及16)知，含Pro-Hyp的PC，FC，PC-CA相比均不含Hyp-Gly及Pro-Hyp的PC-Cont，PC-CA-Cont，也表达优良的关节软骨再生促进效果。
另外，评价试验2-2，2-4中，是合成二肽的Pro-Hyp单独地示优良的关节软骨再生促进效果，且另一方面，脯氨酸，羟基脯氨酸，甘氨酸或它们的混合物及Pro-Hyp-Gly，则未被认定关节软骨再生促进效果(表12，18)。
在评价试验2-5也，是合成二肽的Pro-Hyp单独地示优良的关节软骨再生促进效果(表19)。
〔疾病抑制剂〕
用如上所述的Pro-Hyp或将其含有的胶原肽，而得到疾病抑制剂。作为参考，它们的配合例如下所述。
<参考例2-1～2-3>
以示于表20的配合混合各材料，且将作为赋形剂的结晶性纤维素，以对表20中记载的配合整体10份的比例用，而通过由常法打锭成形，可作为经口用使用，得到参考例2-1～2-3涉及的疾病抑制剂。再有，在表20的Pro-Hyp是上述性能评价试验中使用的BACHEM社制的合成二肽，且PC，PC-Cont，PC-CA-Cont是上述性能评价试验中使用的各胶原肽。
[表20]
Figure BPA00001324972400401
<参考例2-4>
在实施例14，而代替实施例4的含Hyp-Gly的胶原肽(PC)，而用含上述性能评价试验中使用的Pro-Hyp的胶原肽(PC)以外，与实施例14同样地制备一粒0.8g的咀嚼型的片。此咀嚼型的片是，将全量作为100重量％时，含有约4.5重量％的Pro-Hyp作为有效成分。
再有，计数已知氨基酸序列的猪皮来源的I型胶原(重量(X)g)中含的Pro-Hyp的序列的和(Y)，且由下述式求出该I型胶原全体中的理论含有量时，是9.0重量％。
((Pro-Hyp的数(Y))×(Pro-Hyp的重量(分子量)))/(全序列的重量(X))
从以上来看，上述PC理论上含Pro-Hyp最大9.0重量％。
下述参考例2-5～2-8也是，与本参考例2-4同样，将含Pro-Hyp最大9.0重量％的上述PC用于各种用途时的配合例。
<参考例2-5>
在实施例15，代替实施例4的含Hyp-Gly的胶原肽(PC)，而用含上述性能评价试验中使用的Pro-Hyp的胶原肽(PC)以外，与实施例15同样地使溶解于100～140mL的热水而制备饮用的粉末清炖肉汤(1袋6.0g)。此粉末清炖肉汤是，将全量作为100重量％时，含有约3.2重量％的Pro-Hyp作为有效成分。
<参考例2-6>
在实施例16，代替实施例4的含Hyp-Gly的胶原肽(PC)，而用含上述性能评价试验中使用的Pro-Hyp的胶原肽(PC)以外，与实施例16同样地使溶解于100～150mL的水而制备饮用的粉末汁(1袋13.0g)。此粉末汁是，将全量作为100重量％时，含有约3.6重量％的Pro-Hyp作为有效成分。
<参考例2-7>
在实施例17，代替实施例4的含Hyp-Gly的胶原肽(PC)，而用含上述性能评价试验中使用的Pro-Hyp的胶原肽(PC)以外，与实施例17同样地制备清凉饮料水(1包装125mL)。此清凉饮料水是，将全量作为100重量％时，含有约0.2重量％的Pro-Hyp作为有效成分。
<参考例2-8>
在实施例18，代替实施例4的含Hyp-Gly的胶原肽(PC)，而用含上述性能评价试验中使用的Pro-Hyp的胶原肽(PC)以外，与实施例18同样地制备胶冻(1粒4g)。此胶冻是，将全量作为100重量％时，含有约0.45重量％的Pro-Hyp作为有效成分。
<参考例2-9>
在示于表20的参考例2-1的配合中，未用PC-Cont，钙及维生素C以外，以同样的配合混合各材料，且通过将其用生理盐水稀释成5mmol/L，可作为向关节局部的注入用使用，得到参考例2-9涉及的疾病抑制剂。
【工业实用性】
本发明涉及的胶原肽由于含有成为用于预防至治疗例如，骨质疏松症，变形性关节炎，褥疮等的症状的疾病抑制剂的有效成分的二肽，所以可作为有这样的效能的健康食品，药品等适宜使用。

Claims (10)

1.胶原肽，其包含具有Hyp-Gly的结构的二肽作为必须的二肽。
2.二肽，其具有Hyp-Gly的结构。
3.疾病抑制剂，其包含具有Hyp-Gly的结构的二肽作为必须的有效成分。
4.权利要求3中所述的疾病抑制剂，其中成为上述有效成分的二肽作为胶原肽被含有。
5.权利要求3或4中所述的疾病抑制剂，其中作为有效成分也含葡萄糖胺及/或其盐。
6.权利要求3～5中任一项所述的疾病抑制剂，其是骨质疏松症抑制剂。
7.权利要求3～5中任一项所述的疾病抑制剂，其是变形性关节炎抑制剂。
8.权利要求3～5中任一项所述的疾病抑制剂，其是褥疮抑制剂。
9.权利要求3～8中任一项所述的疾病抑制剂，其是经口用抑制剂。
10.权利要求3～8中任一项所述的疾病抑制剂，其是向关节局部的注入用抑制剂。
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