CN102209777A

CN102209777A - 包含枯草蛋白酶变体的组合物和方法

Info

Publication number: CN102209777A
Application number: CN2009801449513A
Authority: CN
Inventors: L·G·卡斯康-佩雷拉; D·A·埃斯特尔; F·齐德戈伯; J·T·小凯尔特斯; A·J·保罗斯
Original assignee: Danisco USA Inc
Current assignee: Danisco USA Inc; Danisco US Inc
Priority date: 2008-11-11
Filing date: 2009-11-10
Publication date: 2011-10-05
Anticipated expiration: 2029-11-10
Also published as: CA2743123A1; AR074106A1; WO2010056671A1; EP2361300B1; US20100152087A1; MX2011004803A; US8183024B2; JP2012508032A; RU2011123903A; CN102209777B; BRPI0921827A2; EP2361300A1; KR20110095254A; JP5412523B2

Abstract

本发明提供非常适于清洁应用的枯草蛋白酶变体。具体而言，本发明提供芽孢杆菌属物种的(Bacilus sp.)枯草蛋白酶变体和包含此变体的清洁组合物。

Description

包含枯草蛋白酶变体的组合物和方法

本申请要求2008年11月11日提交的美国专利临时申请序列第61/113,552号的优先权，该申请通过引用并入本文。

发明领域

本发明提供非常适于清洁应用的枯草蛋白酶变体。具体而言，本发明提供芽孢杆菌属物种(Bacillus)枯草蛋白酶变体和包含此变体的清洁组合物。

发明背景

通常，传统的家用和工业餐具洗涤组合物依赖于高碱性洗涤剂洗涤和氯漂白的组合来清洁和消毒餐具。这类系统对于可漂白的污渍一般有很好的作用。然而，家庭、医院、自助餐厅和餐饮行业中的餐具上经常存在的含蛋白质的污物的去除是有问题的。此外，认为碱性非常高且含氯的组合物不适合消费者和环境友好的。

已进行了多种尝试来产生有效去除蛋白性污物的餐具洗涤组合物。这些组合物通常包括在碱性条件(如，pH为至少9.5)下有活性的蛋白酶。然而，此类组合物具有明显的缺点，就是它们难以配制成对于餐具洗涤剂而言消费者通常优选的液体或凝胶形式。此外，碱性餐具洗涤组合物还经常被视为是刺激物。

还进行了一些尝试来产生低pH(如，pH低于9.5)餐具洗涤组合物。这些组合物更安全、更环境友好并且能够配制成凝胶和液体形式。然而，已证明目前的低pH餐具洗涤组合物在去除蛋白性污物上是非常低效的，即便餐具洗涤组合物中配制了高浓度的酶(如蛋白酶)。

因此，本领域存在对有效去除餐具的蛋白性污物的餐具洗涤组合物的需求。此外，存在对更加环境友好和更加消费者友好且处于容易使用和成本划算的形式的餐具洗涤组合物的需求。

相似地，存在对有效去除织物的蛋白性污物的织物清洁组合物的需求。

发明概述

本发明提供特别适合用于清洁组合物的芽孢杆菌属物种的枯草蛋白酶变体。此外，本发明提供包含此枯草蛋白酶变体的清洁组合物。

本发明提供包含SEQ ID NO：5所列的氨基酸序列的枯草蛋白酶变体。在一些优选的实施方式中，本发明提供包含具有SEQ ID NO：5所列的氨基酸序列的枯草蛋白酶变体的组合物。在一些特别优选的实施方式中，所述组合物是清洁组合物。在一些优选的替代实施方式中，所述清洁组合物是衣物洗涤剂，而在一些其他优选的实施方式中，所述清洁组合物是餐具洗涤剂。在一些实施方式中，所述餐具洗涤剂是自动机洗餐具洗涤剂，而在其他实施方式中，它们是手洗餐具洗涤剂。在一些优选的实施方式中，所述清洁组合物是液体洗涤剂，而在一些其他实施方式中，所述清洁组合物是凝胶、片剂、粉末或粒状洗涤剂。在一些实施方式中，所述清洁组合物不包含磷酸盐，而在一些其他实施方式中，所述清洁组合物含有磷酸盐。在一些优选的实施方式中，所述清洁组合物还包含至少一种漂白剂。在一些又进一步优选的实施方式中，所述清洁组合物还包含至少一种其它的酶。在一些实施方式中，所述其它的酶选自半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、金属蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过氧水解酶(perhydrolases)、角质酶(cutinases)、果胶酶、果胶酸裂合酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、和淀粉酶，或其混合物。

本发明还提供清洁的方法，所述方法包括：提供待清洁的物品和包含SEQ ID NO：5所列的枯草蛋白酶变体的组合物，将所述物品与所述组合物接触。在一些进一步的实施方式中，所述方法还包括漂洗所述待清洁的物品的步骤。在一些另外的实施方式中，所述物品是餐具或织物物品。

发明详述

本发明提供非常适于清洁应用的枯草蛋白酶变体。具体而言，本发明提供芽孢杆菌属物种的枯草蛋白酶变体和包含此变体的清洁组合物。本发明还提供了与现在所使用的枯草蛋白酶相比具有可比性或更好洗涤性能的酶组合物。

除非另外指明，本发明的实施包括全部属于本领域技术的普遍用于分子生物学、微生物学、蛋白质纯化、蛋白质工程、蛋白质和DNA测序、重组DNA领域以及工业酶应用和开发的常规技术。

此外，此处提供的标题不是本发明的各个实施方式或方面的限制，本发明的各个实施方式或方面可以通过整体参考说明书而获得。因此，通过参考整个说明书而更加完全地描述下面定义的术语。无论如何，为了便于理解本发明，下面提供了一些术语的定义。

除非另外定义，此处所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员所一般理解的含义相同的含义。虽然与此处描述的方法和材料相似或相同的任何方法和材料都可以用于本发明的实施，本文中还是描述了优选的方法和材料。因此，通过整体参考本说明书而更加完全地描述下面定义的术语。并且，此处使用的单数“一个”和“所述”包括其复数指代，除非上下文另外清楚指明。除非另外指明，核酸以5′至3′的方向从左向右书写，氨基酸序列以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。应理解本发明不限于所描述的特定方法学、实验方案和试剂，因为本领域技术人员可以根据使用它们的背景而对其进行改变。

贯穿此说明书给出的每个最大数值限制应包括每个较低数值限制，如同此类较低数值限制明确写入本文。贯穿此说明书给出的每个最低数值限制将包括每个较高数值限制，如同此类较高数值限制明确写入本文。贯穿此说明书给出的每个数值范围将包括落入此类较宽数值范围的每个较窄数值范围，如同此类较窄数值范围全部明确写入本文。

此处使用的术语“相容的”意指清洁组合物材料降低本文提供的蛋白酶的酶活性的程度不至于使该蛋白酶的效力达不到正常使用情形下所期望的。下文详细示例了具体的清洁组合物材料。

此处使用的“有效量的酶”指实现具体应用中需要的酶活性必需的酶量。此类有效量是本领域普通技术人员容易确定的，并且基于许多因素，诸如使用的特定酶变体、清洁应用、清洁组合物的具体组成和是需要液体组合物还是干燥(如粒状)组合物，以及类似因素。

用于“变体蛋白酶”时，此处使用的“具有改善的性质”指蛋白酶变体相对于相应的野生型蛋白酶具有改善的性能，和/或在保留性能的同时具有改善的稳定性。在一些特别优选的实施方式中，所述改善的性质选自由以下组成的组：改善的餐具洗涤性能和/或洗衣性能、和改善的稳定性、以及改善的餐具洗涤性能和/或洗衣性能和改善的稳定性的组合。

此处使用的短语“洗涤剂稳定性”指洗涤剂组合物的稳定性。在一些实施方式中，该稳定性是在使用洗涤剂过程中评估的，而在其他实施方式中，该术语指洗涤剂组合物在储存过程中的稳定性。

术语“改善的稳定性”用于指组合物中的变体蛋白酶在储存过程中更好的稳定性和/或在肥皂水(sud)中更好的稳定性。在优选的实施方式中，变体蛋白酶表现出储存过程中在餐具洗涤剂和/或衣物洗涤剂中改善的稳定性和/或在肥皂水中改善的稳定性，这包括相对于相应的野生型针对氧化剂、螯合剂、自体分解、表面活性剂和高碱性的稳定性。

此处使用的短语“蛋白水解稳定性”指蛋白质(如酶)耐受蛋白水解的能力。不应将该术语限于使用任何特定的蛋白酶来评估蛋白质的稳定性。

此处使用的“氧化稳定性”指蛋白质在氧化条件下起作用的能力。具体而言，该术语指蛋白质在各种浓度的H₂O₂、过酸和其他氧化剂存在下起作用的能力。各种氧化条件下的稳定性可通过本领域技术人员已知的标准方法和/或通过本文描述的方法测量。氧化稳定性的实质性改变显示为相比于无氧化化合物时存在的酶活性，酶活性的半衰期至少约5％或更大的增加或降低(在大多数实施方式中，优选所述改变为增加)。

此处使用的“pH稳定性”指蛋白质在特定pH下起作用的能力。一般而言，大多数酶具有起作用的有限pH范围。除了在中间范围pH(pH7左右)起作用的酶之外，还存在能够在具有非常高或非常低的pH的条件下工作的酶。各种pH下的稳定性可通过本领域技术人员已知的标准方法和/或通过本文描述的方法来测量。pH稳定性的实质性改变显示为相比于最适pH下酶的酶活性，酶活性的半衰期至少约5％或更大的增加或降低(在大多数实施方式中，优选所述改变为增加)。然而，本发明不应限制于任何pH稳定性水平和pH范围。

此处使用的“热稳定性”和“耐热性”指蛋白质在特定温度下起作用的能力。一般而言，大多数酶具有起作用的有限温度范围。除了在温和温度范围(如室温)下工作的酶之外，还存在能够在非常高或非常低温度下工作的酶。热稳定性可通过已知的方法或通过本文描述的方法来测量。热稳定性的实质性改变显示为在暴露于给定温度时变体催化活性的半衰期至少约5％或更大的增加或降低(在大多数实施方式中，优选所述改变为增加)。然而，本发明不应限制于任何温度稳定性水平和温度范围。

此处使用的术语“化学稳定性”指蛋白质(如酶)针对可不利地影响其活性的化学品的稳定性。在一些实施方式中，此类化学品包括但不限于过氧化氢、过酸、阴离子去污剂、阳离子去污剂、非离子去污剂、螯合剂等。然而，本发明不应限制于任何特定化学稳定性水平和化学稳定性范围。

此处使用的术语“纯化的”和“分离的”指从样品中去除污染物。例如，通过去除溶液或制品内不是目的酶的污染性蛋白质和其他化合物来纯化目的酶。在一些实施方式中，重组的目的酶表达于细菌或真菌宿主细胞，并且通过去除其他宿主细胞成分来纯化这些重组的目的酶；从而增加样品中重组的目的酶多肽的百分比。

此处使用的“目的蛋白质”指所分析、鉴别和/或修饰的蛋白质(如酶或“目的酶”)。自然存在的、以及重组的(如“突变体”或“变体”)蛋白质用于本发明。此处使用的“蛋白质”指由氨基酸构成并被本领域技术人员识别为蛋白质的任何组合物。术语“蛋白质”、“肽”和多肽在本文可互换使用。当肽是蛋白质的一部分时，本领域技术人员理解该术语在上下文中的使用。

此处使用的“表达载体”指含有有效地连接至合适控制序列的DNA序列的DNA构建体，所述控制序列能够实现DNA在适宜的宿主中的表达。此类控制序列包括实现转录的启动子、任选的控制此类转录的操纵子序列、编码适宜的mRNA核糖体结合位点的序列和控制转录和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒、或简单的潜在基因组插入序列。转化进入适宜的宿主后，载体可独立于宿主基因组而复制和起作用，或在一些情况下，载体可整合到基因组本身。在本说明书中，“质粒”、“表达质粒”和“载体”经常互换使用，因为质粒是目前最常使用的载体形式。然而，本发明应包括起等同功能并且本领域已知或将知晓的那些其他形式的表达载体。

在一些优选的实施方式中，将蛋白酶基因连接到适合的表达质粒。然后使用克隆的蛋白酶基因转化或转染宿主细胞以表达该蛋白酶基因。在此质粒含有质粒复制必需的公知元件情况下，其可在宿主中复制，或可将质粒设计为整合到宿主染色体。提供有效的基因表达的必需元件(如，有效地连接至目的基因的启动子)。在一些实施方式中，这些必需元件作为可被识别(即，被宿主转录)的基因自身的同源启动子，和外源的或由蛋白酶基因的内源终止子区提供的转录终止子而提供。在一些实施方式中，还包括选择基因，诸如通过在含抗微生物剂的培养基中生长而使得含质粒的宿主细胞得以连续培养维持的抗生素抗性基因。

下面的盒式诱变方法可用于促进本发明的蛋白酶变体的构建，但也可使用其他方法。首先，如本文所述，获得编码蛋白酶的自然存在的基因，全部或部分测序。然后，扫描序列以获得期望对编码的蛋白酶的一个或多个氨基酸进行突变(如，通过缺失、插入或取代)的点。评估此点侧翼的序列中限制位点的存在，以将该基因的小区段替换为在表达时将编码不同的突变体的寡核苷酸库。此类限制位点优选为该蛋白质基因内的独特位点，以促进基因区段的替换。然而，可使用在蛋白酶基因中不过度丰富的任何方便的限制位点，只要限制酶切消化产生的基因片段可重组装成适当的序列。如果所选点的方便距离(约10个至约15个核苷酸)内不存在限制位点，则通过以不改变最终构建中的阅读框和所编码的氨基酸的方式取代该基因中的核苷酸来产生此类位点。改变基因的序列以使其符合期望的序列的突变通过用众所周知的方法进行引物延伸完成。遗传密码的冗余性、基因的限制酶图谱和大量不同的限制酶使得定位适宜的侧翼区和评估得到两个方便的限制位点序列所需的改变这一任务是常规的。注意，如果可获得一个方便的侧翼限制位点，则上述方法只需用于不含位点的侧翼区。克隆自然存在的DNA和/或合成的DNA之后，用关联限制酶消化待诱变位置侧翼的限制位点，并将多个末端互补的寡核苷酸盒连接到基因中。通过此方法简化了诱变，因为可以合成所有寡核苷酸以具有相同的限制位点，而不必用合成的连接物来创建限制位点。

此处使用的“对应于”指蛋白质或肽中列举的位置处的残基或类似、同源、或等同于蛋白质或肽中列举的位置处的残基的残基。此处使用的“对应区域”一般指沿相关蛋白质或参考蛋白质的类似位置。

术语“编码...的核酸分子”、“编码...的核酸序列”、“编码...的DNA序列”、和“编码...的DNA”指沿脱氧核糖核酸链的脱氧核糖核苷酸的顺序或序列。这些脱氧核糖核苷酸的顺序决定沿多肽(蛋白质)链的氨基酸的顺序。因此DNA序列编码氨基酸序列。

此处使用的“野生型”和“天然”蛋白质是自然界中发现的那些蛋白质。术语“野生型序列”和“野生型基因”在本文可互换使用，指天然的序列或宿主细胞中自然存在的序列。在一些实施方式中，野生型序列指作为蛋白质工程计划的起点的目的序列。编码自然存在的蛋白质的基因可根据本领域技术人员已知的一般方法获得。这些方法一般包括合成标记的探针，该探针具有编码目的蛋白质的区域的推断序列，制备表达所述蛋白质的生物体的基因组文库，和通过与探针杂交从文库中筛选目的基因。然后作图和测序阳性杂交克隆。

此处使用的术语“重组的DNA分子”指由借助分子生物学技术连接在一起的DNA区段构成的DNA分子。术语“重组的寡核苷酸”指使用分子生物学操作产生的寡核苷酸，所述操作包括但不限于连接通过限制酶切消化多核苷酸序列产生的两个或更多个寡核苷酸序列、合成寡核苷酸(如，合成引物或寡核苷酸)和类似操作。

此处使用的“等同的残基”指蛋白质共有特定的氨基酸残基。例如，等同的残基可通过在蛋白质(如蛋白酶)的三级结构水平确定同源性而鉴定，该蛋白质的三级结构已通过x-射线晶体学确定。等同的残基定义为具有推定等同残基的蛋白质和目的蛋白质的特定氨基酸残基的主链原子之两个或更多个原子的原子坐标在排比后在约0.13nm并且优选约0.1nm内。在定向和定位最佳模型以产生分析蛋白质的非氢蛋白质原子的原子坐标的最大重叠后，即实现了对齐。优选的模型是针对在可获得的最高分辨率的实验衍射数据产生最低的R因子的晶体学模型，使用晶体学和蛋白质表征/分析领域技术人员已知的方法确定。

此处使用的术语“调节元件”指控制核酸序列表达的某些方面的基因元件。例如，启动子是促进有效地连接的编码区的转录起始的调节元件。其他的调节元件包括剪接信号、多聚腺苷酸化信号和终止信号。

此处使用的“宿主细胞”一般是用载体转化或转染的原核宿主或真核宿主，所述载体使用本领域已知的重组DNA技术构建。转化的宿主细胞能够复制编码蛋白质变体的载体或表达期望的蛋白质变体。在载体编码蛋白质变体的前形式或前原形式的情形中，此类变体在表达时通常从宿主细胞分泌到宿主细胞培养基中。

术语“引入的”在将核酸序列插入到细胞上下文中意指转化、转导或转染。转化的手段包括但不限于任何本领域已知的合适方法，诸如原生质体转化、氯化钙沉淀、电穿孔、裸DNA和类似方法，如本领域已知的。(参见如，Chang和Cohen，Mol Gen Genet，168：111-115，1979；Smith等人，Appl Env Microbiol，51：634，1986；和Ferrari等人，于Harwood，Bacillus.Plenum Publishing Corporation，第57-72页，1989)。

术语“启动子/增强子”表示含有能够提供启动子和增强子两种功能的序列的DNA区段。启动子/增强子可以是“内源的”或“外源的”或“异源的”。内源的启动子/增强子是与基因组中给定的基因天然相连的启动子/增强子。外源的(异源的)启动子/增强子是通过遗传操作(即分子生物学技术)将其置于与基因并列的启动子/增强子。

表达载体上“剪接信号”的存在经常造成重组转录物的更高水平的表达。剪接信号介导内含子从初级RNA转录物的去除，并由剪接供体和受体位点组成(参见如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆试验室手册)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，第16.7-16.8页，1989)。

术语“稳定转染”或“稳定转染的”指外来DNA引入并整合到转染细胞的基因组。术语“稳定转染子”指已将外来或外源DNA稳定整合到转染细胞的基因组DNA的细胞。

此处使用的术语“选择性标记”或“选择性基因产物”指编码酶活性的基因的使用，该酶活性赋予表达选择性标记的细胞对抗生素或药物的抗性。

此处使用的术语“扩增”和“基因扩增”是指使特定的DNA序列不成比例地复制的方法，从而该扩增的基因以比原来在基因组存在的数量更高的拷贝数存在。在一些实施方式中，在药物(例如可抑制酶的抑制剂)存在下通过生长对细胞的选择导致该药物存在时编码生长所需的基因产物的内源性基因的扩增，或者编码该基因产物的外源性(例如输入的)序列的扩增，或者两者兼备。在药物(例如可抑制酶的抑制剂)存在下通过生长对细胞的选择可导致该药物存在时编码生长所需的基因产物的内源性基因的扩增，或者通过编码该基因产物的外源性(例如输入的)序列的扩增来选择，或者两者兼备。

“扩增”是指涉及模板特异性的核酸复制的特定情况。它与非特异性模板复制(即模板依赖的但是不依赖于特殊模板的复制)相反。此处的模板特异性不同于复制(即适宜的多核苷酸序列的合成)的保真度和核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)特异性。模板特异性经常以“靶”特异性来描述。靶序列是要与其他核酸区分意义上的“靶”。扩增技术已经首先设计用来这种区分。

此处使用的术语“可扩增的标记”、“可扩增的基因”和“扩增载体”指允许在适合的生长条件下扩增基因的标记、基因或编码该基因的载体。

此处使用的术语“可扩增的核酸”指可通过任何扩增方法扩增的核酸。可预期的是“可扩增的核酸”将通常包括“样品模板”。

此处使用的术语“样品模板”指来源于分析“靶”(在下文定义)存在的样品的核酸。相反，“背景模板”用于指样品模板之外的、可能存在或不存在于样品的核酸。背景模板最经常是无意的。它可能是携带造成的，或它可能是由于存在要从样品中纯化出去的核酸污染物。例如，待检测的核酸之外的生物体核酸可作为背景存在于测试样品中。

此处使用的术语“引物”是指寡核苷酸，其或者是在纯化的限制酶切消化中天然产生的或者是合成制备的，其在诱导合成了与核酸链互补的引物延伸产物的情况下(即核苷酸和诸如DNA聚合酶等诱导剂存在下，而且在适宜的温度和pH下)能够作为合成的起始点发挥作用。为了最大扩增效率，该引物优选是单链的，但也可以是双链的。如果是双链的，在用于制备延伸产物之前先处理引物以分离其链。优选该引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长，以在诱导剂的存在下引导延伸产物的合成。引物的确切长度取决于许多因素，包括温度、引物来源和方法的使用。

此处使用的术语“探针”是指寡核苷酸(即核苷酸的序列)，或者是作为纯化的限制酶切消化产物天然发生的，或者是合成、重组或PCR扩增制备的，其能够与另一个目的寡核苷酸杂交。探针可以是单链或双链的。探针用于特定基因序列的检测、鉴别和分离。设想用于本发明的任何探针都用任何“报告分子”标记，从而使其可在任何检测系统中检测到，这种标记包括但不限于酶(例如ELISA，以及基于酶的组织化学检测)、荧光、放射性和发光系统。这并不意味着本发明限于任何具体的检测系统或标记。

此处使用的术语“靶”当涉及扩增方法(如聚合酶链式反应)使用时，是指被用于聚合酶链式反应的引物所结合的核酸区域。所以，“靶”是要与其他核酸序列区分的。“区段”定义为在靶序列范围内的核酸的区域。

此处使用的术语“聚合酶链式反应和PCR是指美国专利第4,683,195号、第4,683,202号和第4,965,188号中的方法，其中包括不经克隆或纯化在基因组DNA的混合物中提高靶序列的区段浓度的方法。这些方法是本领域技术人员公知。

此处使用的术语“扩增试剂”指除引物、核酸模板和扩增酶之外的那些扩增所需试剂(脱氧核糖核苷酸三磷酸、缓冲液等)。通常，扩增试剂与其他反应成分一起放入并包含于反应容器(试管、微孔等)中。

此处使用的术语“限制性核酸内切酶”和“限制酶”是指细菌的酶，其在特异性核苷酸序列处或附近切割双链DNA。

此处使用的术语“清洁组合物”指用于清洁应用的任何组合物。该术语意图涵盖(除非另外指明)粒状或粉末状的通用的或强效洗涤剂(如衣物洗涤剂)，液体、凝胶、或糊状的通用洗涤剂(如“强效液体”洗涤剂)，液体和粉末状精细织物洗涤剂，手洗餐具洗涤剂，轻效型餐具洗涤剂(如高泡沫洗涤剂)，机器餐具洗涤剂(即“自动机洗餐具洗涤剂”)，包括家用和公共机构用的片剂、粒状、液体洗涤剂、助漂洗洗涤剂，液体清洁和消毒剂(如抗细菌手洗皂)、洗衣棒、漱口剂、假牙清洁剂、汽车香波、地毯香波、浴室清洁剂、人和其他动物用洗发香波、人和其他动物用护发素、淋浴凝胶、沐浴凝胶、泡沫浴和金属清洁剂，以及清洁助剂(如漂白添加剂、洗衣添加剂、预处理组合物，包括“去污棒(stain-stick)”或其他预处理形式)。

此处使用的术语“洗涤剂组合物”和“洗涤剂配方”指要在清洁弄脏的物品的洗涤介质中使用的混合物。在优选的实施方式中，该术语指用于清洁衣物、盘碟、刀具等的洗涤剂(如“餐具洗涤剂”)。这并不意味着本发明限于任何特定类型的洗涤剂配方或组合物。实际上，除了含有至少一种本发明的蛋白酶的洗涤剂之外，该术语涵盖了包含表面活性剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、助洗剂、漂白剂、漂白活性剂、上蓝剂和荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂、酶激活剂、抗氧化剂和增溶剂的洗涤剂。

此处使用的“餐具洗涤组合物”指用于清洁餐具包括刀具的组合物的所有形式，包括但不限于粉末、片剂、凝胶、粒状和液体形式。这并不意味着本发明限于任何特定类型的餐具组合物。实际上，本发明可用于清洁任何材料的餐具(如盘碟，包括但不限于碟、杯、玻璃杯、碗等)和刀具(如用具，包括但不限于勺、刀、叉、服务用具等)，所述材料包括但不限于陶、塑料、金属、瓷、玻璃、丙烯酸酯等。术语“餐具”在本文用于指盘碟和刀具。

术语“相关洗涤条件”在本文用于指在餐具或织物洗涤剂市场细分中家庭中实际使用的条件，特别是洗涤温度、时间、洗涤手法、肥皂水浓度、洗涤剂类型和水硬度。

术语“改善的洗涤性能”用于指相对于相应的野生型酶在相关洗涤条件下获得餐具、刀具或织物污渍去除的更好的最终结果，或指达到相同的最终结果需要按重量计更少的突变体蛋白酶。

术语“保留的洗涤性能”用于指在相关洗涤条件下按重量计的突变体蛋白酶的洗涤性能是相对于相应的野生型蛋白酶的至少约80％。

蛋白酶的洗涤性能通过在适合的测试条件测量它们去除某些代表性污渍的能力来方便地测量。在这些测试系统中，可控制其他相关因素，诸如洗涤剂组成、肥皂水浓度、水硬度、洗涤手法、时间、pH、和/或温度，以模仿在某一市场细分中(如餐具洗涤、织物清洁等)用于家庭应用的典型条件。当用于通过DNA诱变的蛋白水解酶修饰时，本文描述的实验室应用测试系统是家庭应用代表性的。因此，本文提供的方法方便测试大量不同的酶和选择那些特别适合于具体洗涤剂应用类型的酶。这样易于选择为具体应用条件“量身定制的”酶。

术语“清洁活性”是指在蛋白水解、水解、清洁或本发明的其他过程中的通行条件下，用该蛋白酶达到的清洁性能。在一些实施方式中，清洁性能通过利用针对酶敏感的污渍例如草、血液、奶或卵蛋白的多种清洁检测来测定，如在将这些污渍进行标准洗涤之后用各种层析、分光光度测量或其他定量方法测定这些污渍。示例性检测包括但不限于，WO 99/34011和美国专利第6,605,458号(其通过引入本申请作为参考)，以及实施例中包括的那些方法中记载的那些检测。

术语蛋白酶的“清洁有效量”是指在具体清洁组合物中达到所需酶活性水平的前述蛋白酶的量。这种有效量容易由本领域普通技术人员确定，并且基于许多因素，例如所使用的特殊蛋白酶、清洁用途、清洁组合物的具体组成、和需要液体、凝胶还是干的(例如粒状、棒状)组合物等。

此处使用的术语“清洁添加剂材料”是指为具体类型的所需清洁组合物和产品形式(例如液体、粒状、粉末、棒状、糊状、喷雾、片剂、凝胶或泡沫组合物)选择的任何液体、固体或气体材料，这些材料也优选与组合物中使用的蛋白酶相容。在一些实施方式中，粒状组合物是“紧密的”形式，而在其他实施方式中，液体组合物是“浓缩”形式。

此处使用的“低洗涤剂浓度”系统包括洗涤水中存在低于约800ppm洗涤剂组分的洗涤剂。日本洗涤剂通常视为低洗涤剂浓度系统，因为它们通常在洗涤水中存在大约667ppm洗涤剂组分。

此处使用的“中等洗涤剂浓度”系统包括洗涤水中存在约800ppm至约2000ppm洗涤剂组分的洗涤剂。北美洗涤剂通常视为中等洗涤剂浓度系统，因为它们通常在洗涤水中存在大约975ppm洗涤剂组分。巴西洗涤剂通常在洗涤水中存在大约1500ppm洗涤剂组分。

此处使用的“高洗涤剂浓度”系统包括洗涤水中存在大于约2000ppm洗涤剂组分的洗涤剂。欧洲洗涤剂通常视为高洗涤剂浓度系统，因为它们通常在洗涤水中存在大约3000-8000ppm洗涤剂组分。

此处使用的“织物清洁组合物”、“衣物清洁组合物”和“衣物洗涤剂”指用于清洁有污物的衣物和/或织物的组合物。这意味着本发明涵盖任何形式，包括粉末、片剂、凝胶、粒状和液体形式。这并不意味着本发明限于任何特定类型的衣物和/或织物。这些术语涵盖手洗和机洗衣物洗涤剂组合物，包括洗衣添加剂组合物和适合用于浸泡和/或预处理有污渍的织物(如布、亚麻布和其他纺织材料)的组合物。

此处使用的“非织物清洁组合物”包括非纺织表面清洁组合物，包括但不限于餐具洗涤剂组合物、口腔清洁组合物、牙齿清洁组合物和个人清洁组合物。

此处使用的术语“消毒”指去除表面的污染物，以及抑制或杀死物品表面的微生物。这并不意味着本发明限于任何特定表面、物品或待去除的污染物或微生物。

此处使用的术语“枯草蛋白酶”指在MEROPS-The Peptidase Data base(MEROPS-肽酶数据库)(Rawlings等人，MEROPS：the peptidase database(MEROPS：肽酶数据库)，Nucl Acids Res，34Database issue，D270-272，2006)中描述的S8丝氨酸蛋白酶家族的任何成员。

产生本文提供的变体蛋白酶的合适宿主菌株包括其中可实现蛋白酶的表达的可转化微生物。具体而言，从中获得蛋白酶的相同物种或属的宿主菌株是适宜的，诸如芽孢杆菌属(Bacillus)菌株，优选嗜碱性芽孢杆菌属菌株，且最优选Bacillus nov.spec.PB92或其突变体，该突变体具有大致相同的性质。另外，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)菌株是优选的菌株。其他合适和优选的宿主菌株包括在用突变体基因转化之前基本不能产生胞外蛋白水解酶的那些菌株。特别感兴趣的是蛋白酶缺陷的芽孢杆菌属宿主菌株，诸如Bacillus nov.spec.PB92的蛋白酶缺陷衍生菌株。通过使用在选择的宿主生物体中有功能的表达信号获得蛋白酶的表达。表达信号包括调节蛋白酶基因转录和翻译的DNA序列。适当的载体能够以足够高的拷贝数在选择的宿主菌株中复制，或能够通过染色体整合实现蛋白酶基因在宿主菌株中的稳定维持。

本发明的变体蛋白水解酶(即变体蛋白酶)通过以下制备：在适合的发酵条件下培养包含期望的突变体蛋白水解基因的转化的宿主菌株，然后回收产生的酶。优选地，表达的蛋白酶被分泌到培养基中，这有利于蛋白酶的回收，或在革兰氏阴性细菌宿主菌株的情形中，被分泌到周质中。为了分泌要采用适宜的氨基末端信号序列，优选原始基因编码的信号序列，如果该序列在选择的宿主菌株中有功能的话。

在一些实施方式中，将几种取代组合以增加枯草蛋白酶在洗涤剂组合物中的稳定性和/或性能。因此本发明提供以下蛋白酶变体，这些蛋白酶变体提供改善的洗涤性能(如具有N76D+N87R+G118R+S128L+P129Q+S130A+S188D+N248R的PB92变体；使用BPN’编号；“PX3”).此变体在本文成为“枯草蛋白酶蛋白酶变体”、“突变体蛋白酶”、“变体蛋白酶”、“蛋白酶变体”、“芽孢杆菌属物种蛋白酶”、“芽孢杆菌属物种枯草蛋白酶变体”和“突变体蛋白酶变体”。此变体的氨基酸序列如SEQ IDNO：5所列。

因此，本发明提供此枯草蛋白酶变体，其适合用于洗涤剂组合物和/或洗涤方法。应理解，与PB92参考枯草蛋白酶的氨基酸位置同源(并且根据与BPN’的比对编号)的位置将落入权利要求的范围。

清洁组合物

除非另外注明，本文提供的所有组分或组合物水平是指该组分或组合物的活性水平，并将杂质例如可商购的来源中可能存在的残留的溶剂或副产物排除在外。酶组分重量是基于总活性蛋白质。除非另外指明，所有百分比和比值是按重量计算。除非另外指明，所有百分比和比值是基于总组合物计算。在所示例的洗涤剂组合物中，酶水平通过按总组合物重量计的纯酶表示，并且除非另外说明，洗涤剂成分按总组合物的重量计来表示。

如本文所示，在一些实施方式中，本发明的清洁组合物还包含添加剂材料，包括但不限于表面活性剂、助洗剂、漂白剂、漂白活性剂、漂白催化剂、其他酶、酶稳定系统、螯合剂、荧光增白剂、去污聚合物、染料转移剂、分散剂、抑泡剂、染料、香料、着色剂、填料盐、水溶增溶剂、光漂剂、荧光剂、织物柔顺剂、可水解的表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗缩剂、防皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、color speckles、银护理(silvercare)、防晦暗剂和/或防腐蚀剂、碱性源、加溶剂、载体、加工助剂、色素和pH控制剂(参见如美国专利第6,610,642号、第6,605,458号、第5,705,464号、第5,710,115号、第5,698,504号、第5,695,679号、第5,686,014号和第5,646,101号，所有这些专利都通过引用并入本申请作为参考)。下面详细举例说明具体清洁组合物材料的实施方式。在清洁添加剂材料与清洁组合物中本发明的变体蛋白酶不相容的实施方式中，使用了适当方法使清洁添加剂材料和蛋白酶保持分离(即，不互相接触)，直至这两种组分适宜组合时。这种分离方法包含本领域已知的任何适宜方法(例如胶丸、包封、片剂、物理分离等)。

本发明的丝氨酸蛋白酶变体可用于配制各种洗涤剂组合物。本发明的清洁组合物可有利地用于例如洗衣应用、硬表面清洁、自动机洗餐具洗涤应用、以及美容应用诸如假牙、牙齿、头发和皮肤。本发明的变体蛋白酶可用于粒状、粉末、凝胶和液体组合物。

本发明的蛋白酶变体还可用于清洁添加剂产品。包括本发明的变体蛋白酶的清洁添加剂产品理想地适合于包含在需要另外的漂白效力的洗涤过程中。此类实例包括但不限于低温溶液清洁应用。最简单形式的添加剂产品可以是本发明提供的蛋白酶变体。在一些实施方式中，添加剂包装成剂型以添加到采用过氧(peroxygen)源并且需要增加的漂白效力的清洁过程中。在一些实施方式中，单一剂型包括丸剂、片剂、胶丸或其他单一剂量单位包括预测量的粉末和/或液体。在一些实施方式中，包括填料和/或载体材料以增加此类组合物的体积。适宜的填料或载体材料包括但不限于各种硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐以及滑石、粘土和类似材料。在一些实施方式中，用于液体组合物的填料和/或载体材料包括水和/或低分子量伯醇和仲醇，包括多元醇和二醇。此类醇的实例包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。在一些实施方式中，组合物包含约5％至约90％的此类材料。在其他的实施方式中，使用酸性填料以降低组合物的pH。在一些替代的实施方式中，清洁添加剂包括至少一种如下所述的活化过氧源和/或下文更详细地描述的添加剂成分。

本发明的清洁组合物和清洁添加剂需要有效量的本发明提供的丝氨酸蛋白酶。在一些实施方式中，需要的酶水平通过添加本发明提供的丝氨酸蛋白酶变体实现。通常，本发明的清洁组合物包含至少0.0001wt％(重量百分比)、约0.0001wt％至约10wt％、约0.001wt％至约1wt％、或甚至约0.01wt％至约0.1wt％的至少一种本发明提供的丝氨酸蛋白酶。

在一些优选的实施方式中，本文提供的清洁组合物通常是这样配制的：在含水清洁操作的应用中，洗涤水的pH值为约5.0至约11.5，或在替代的实施方式中甚至约6.0至约10.5。在一些优选的实施方式中，液体产品制剂被通常配制成具有约3.0至约9.0的净pH值，而在一些替代的实施方式中，制剂具有约3至约5的净pH值。在一些优选的实施方式中，粒状洗衣产品被通常配制成具有约8至约11的pH值。控制pH在建议的使用水平的技术包括使用缓冲剂、碱、酸等，这些技术为本领域所公知。

在一些特别优选的实施方式中，当蛋白酶变体被应用于粒状组合物或液体中时，蛋白酶变体是包封化的颗粒形式，以在存储时保护酶不与该粒状组合物的其它成分混合。此外，包封化还提供在清洁过程中控制丝氨酸蛋白酶有效性的一种方法，并可增强丝氨酸蛋白酶的性能。可预期的是本发明的包封的丝氨酸蛋白酶将可用于各种环境。这还意味着使用本领域已知的任何适宜的包封材料和方法包封丝氨酸蛋白酶。

在一些优选的实施方式中，包封材料通常包封至少部分丝氨酸蛋白酶催化剂。在一些实施方式中，包封材料是水溶性的和/或水分散性的。在一些另外的实施方式中，包封材料具有0℃或更高的玻璃化转变温度(关于玻璃化转变温度的更多信息，参见如WO 97/11151，尤其是第6页第25行至第7页第2行)。

在一些实施方式中，包封材料选自由以下组成的组：碳水化合物、天然或合成树胶、几丁质和壳聚糖、纤维素和纤维素衍生物、硅酸盐、磷酸盐、硼酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蜡和它们的组合。在包封材料是碳水化合物的一些实施方式中，包封材料选自由以下组成的组：单糖、寡糖、多糖及其组合。在一些优选的实施方式中，包封材料是淀粉(关于一些示例性适宜的淀粉的描述，参见如EP 0 922 499；和美国专利第4,977,252号、第5,354,559号、第5,935,826号)。

在其他的实施方式中，包封材料包含塑料制成的微球(如热塑性塑料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈及它们的混合物；可使用的可商购的微球包括但不限于

(Casco Products，Stockholm，瑞典)、PM 6545、PM 6550、PM 7220、PM 7228、和Q-

(PQ Corp.，Valley Forge，PA)、和

(Potters Industries，Inc.，Carlstadt，NJ和Valley Forge，PA)。

如此处所述，在一些实施方式中，本发明的蛋白酶变体可用于衣物洗涤剂中。这些应用使酶承受了各种环境压力。本发明的蛋白酶变体由于它们在各种条件下的稳定性所以比很多现在应用的酶更有优势。

的确，存在涉及洗涤的蛋白酶暴露其中的多种洗涤条件，包括不同洗涤剂配方、洗涤水容量、洗涤水温度和洗涤时间长短。另外，在不同的地理区域应用的洗涤剂配方在洗涤水中的相关成分的浓度不同。例如，在洗涤水中，欧洲洗涤剂通常含有大约4500-5000ppm洗涤剂成分，而日本洗涤剂通常含有大约667ppm洗涤剂成分。在北美尤其在美国，在洗涤水中洗涤剂通常含有约975ppm的洗涤剂成分。

低洗涤剂浓度系统在洗涤水中包含的洗涤剂要少于约800ppm洗涤剂成分。通常日本洗涤剂被认为是低洗涤剂浓度系统，因为在洗涤水中它们含有大约667ppm洗涤剂成分。

中洗涤剂浓度包括在洗涤水中包含约800ppm至约2000ppm之间的洗涤剂成分的洗涤剂。通常北美洗涤剂被认为是中等洗涤剂浓度系统，因为在洗涤水中它们大约含有975ppm洗涤剂成分。巴西通常在洗涤水中含有大约1500ppm洗涤剂成分。

高洗涤剂浓度系统在洗涤水中包含的洗涤剂浓度要大于约2000ppm洗涤剂成分。通常欧洲洗涤剂被认为是高洗涤剂浓度系统，因为在洗涤水中它们含有大约4500-5000ppm洗涤剂成分。

拉丁美洲洗涤剂一般是高泡磷酸盐助洗洗涤剂(high suds phosphate builder detergent)，而且由于在洗涤水中含有的洗涤剂成分浓度范围为1500ppm到6000ppm，所以在拉丁美洲用的洗涤剂的范围既落入中等洗涤剂浓度又落入高洗涤剂浓度范围内。如上所述，巴西通常在洗涤水中含有大约1500ppm洗涤剂成分。但是，其它高泡磷酸盐助洗洗涤剂地理区域不局限于其它拉丁美洲国家，在洗涤水中可含有高至大约6000ppm洗涤剂成分的高洗涤剂浓度系统。

根据上文所述，很明显，世界范围内通常洗涤溶液中洗涤剂组合物浓度从低于约800ppm的洗涤剂组合物(低洗涤剂浓度地理区域，如在日本，约667ppm)到约800ppm和约2000ppm之间(中等洗涤剂浓度地理区域，如在美国大约975ppm，和在巴西约1500ppm)，到高于约2000ppm(高洗涤剂浓度地理区域，如在欧洲约4500ppm到约5000ppm和在高泡磷酸盐助洗洗涤剂地理区域的大约6000ppm)。

通常的洗涤溶液浓度是由经验决定的。例如，在美国通常一个洗衣机容纳约64.4L洗涤溶液。相应地，为了在洗涤溶液中获得大约975ppm的洗涤剂浓度，必须添加大约62.97g洗涤剂组合物到64.4L的洗涤溶液中。这个量是消费者用与洗涤剂一起提供的量杯量取到洗涤水中的常用量。

作为另外的例子，不同的地理区域应用不同的洗涤温度。在日本的洗涤水温度通常低于在欧洲用的温度。例如，在北美和日本的洗涤水温度通常在10-30℃之间(例如大约20℃)，而在欧洲洗涤水温度通常在30-60℃(例如约40℃)。此外，在一些其他区域，通常使用冷水进行洗衣、以及餐具洗涤应用。在一些实施方式中，本发明的“冷水洗涤”利用在以下温度的洗涤：约10℃至约40℃、或约20℃至约30℃、或约15℃至约25℃、以及约15℃至约35℃范围的所有其他组合、和10℃至40℃内的所有范围。

作为另外的例子，不同的地理区域通常有不同的水硬度。水硬度通常按照每加仑混合Ca²⁺/Mg²⁺微粒数(grain)描述。硬度是水中含有的钙(Ca²⁺)和镁(Mg²⁺)量的一种量度。在美国大部分水是硬水，但是硬度不同。中等硬度水(60-120ppm)到硬水(121-181ppm)有60-181ppm的硬矿物质(百万分率ppm与每美国加仑微粒数的转换关系是：ppm值除以17.1等于每加仑微粒数的值)。

水	每加仑微粒数	百万分率ppm
			软	低于1.0	低于17
轻度硬	1.0-3.5	17-60
			中度硬	3.5-7.0	60-120
硬	7.0-10.5	120-180
			非常硬	高于10.5	高于180

欧洲水硬度通常高于每加仑10.5(例如10.5-20.0)个混合Ca²⁺/Mg²⁺微粒数(如大约每加仑15个混合Ca²⁺/Mg²⁺微粒数)。北美水硬度通常高于日本水硬度，但低于欧洲水硬度。例如，北美水硬度可以在3-10微粒之间、3-8微粒之间或大约6微粒。日本水硬度通常低于北美水硬度，通常低于每加仑4个混合Ca²⁺/Mg²⁺微粒数，例如3个混合Ca²⁺/Mg²⁺微粒数。

相应地，在一些实施方式中，本发明提供的蛋白酶变体至少在一套的洗涤条件(如水温度、水硬度和/或洗涤剂浓度)中提供惊人的洗涤性能。在一些实施方式中，本发明的蛋白酶变体的洗涤性能比得上其他枯草蛋白酶。在一些实施方式中，本发明的蛋白酶变体与其他现在可商购的枯草蛋白酶相比表现出加强的洗涤性能。因此，在一些本发明优选的实施方式中，此处提供的蛋白酶变体表现出加强的氧化稳定性、加强的热稳定性和/或加强的螯合剂稳定性。另外，本发明的蛋白酶变体在不包括洗涤剂成分的清洁组合物中单独或与助洗剂和稳定剂组合而发挥作用。

在本发明的一些实施方式中，清洁组合物包含按组合物重量计占该组合物约0.00001wt％至约10wt％的本发明蛋白酶变体，和按组合物重量计包含清洁添加剂材料的余量(如占该组合物的约99.999wt％至90.0wt％)。在本发明的其他方面，本发明的清洁组合物包含占该组合物的约0.0001wt％至约10wt％、约0.001wt％至约5wt％、约0.001wt％至约2wt％、约0.005wt％至约0.5wt％的蛋白酶变体，和清洁组合物的余量(如大约99.9999wt％至约90.0wt％、约99.999wt％至约98wt％、约99.995wt％至约99.5wt％)，该余量包含清洁添加剂材料。

如此处进一步所述，在一些实施方式中，优选的清洁组合物除了包含此处提供的蛋白酶变体外，还包含一种或多种提供清洁性能和/或织物护理益处的其它酶或酶衍生物。

制备和使用清洁组合物的方法

在一些优选的实施方式中，本发明的组合物被配制成任何适宜的形式，并通过配制者选择的任何方法来配制(关于一些非限制性实例，参见如美国专利第5,879,584号、第5,691,297号、第5,574,005号、第5,569,645号、第5,565,422号、第5,516,448号、第5,489,392号和第5,486,303号)。在其中期望低pH清洁组合物的一些实施方式中，通过加入酸性材料诸如HCl调节此类组合物的pH。

添加剂材料

虽然不是本发明目的必需的，但是在一些实施方式中，本文描述的添加剂的非限制性列表适合用于本发明的清洁组合物。的确，在一些实施方式中，添加剂被包括在本发明的清洁组合物中。在一些实施方式中，添加剂材料辅助和/或增强清洁性能、处理待清洁的基质、和/或修饰清洁组合物的美感(如香料、着色剂、染料等)。应理解此类添加剂是除本发明的丝氨酸蛋白酶变体之外而添加的。这些添加的成分的确切性质和加入的水平取决于组合物的物理形式和要使用该组合物的清洁操作的性质。适宜的添加剂材料包括但不限于、表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、沉积助剂、分散剂、其它的酶和酶稳定剂、催化材料、漂白活性剂、漂白剂增强剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸、聚合物分散剂、粘土污渍去除/抗再沉积剂、增白剂、抑泡剂、染料、香料、结构弹性剂、衣物柔顺剂、载体、水溶增溶剂、加工助剂和/或色素。除了本文明确提供的以外，其他实例是本领域已知的(参见如美国专利第5,576,282号、第6,306,812号和第6,326,348号)。在一些实施方式中，上述添加剂成分构成本发明清洁组合物的余量。

表面活性剂

在一些实施方式中，本发明的清洁组合物包含至少一种表面活性剂或表面活性剂系统，其中表面活性剂选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、兼性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂和其混合物。在一些低pH清洁组合物实施方式(如具有约3至约5的净pH的组合物)中，组合物通常不含乙氧基化烷基硫酸盐，原因是认为此类表面活性剂可被此类组合物的酸性内容物水解。在一些实施方式中，表面活性剂以按清洁组合物的重量计约0.1％至约60％的水平存在，而在替代的实施方式中，该水平是按清洁组合物的重量计的约1％至约50％，在又进一步的实施方式中，该水平是按清洁组合物的重量计的约5％至约40％。

助洗剂

在一些实施方式中，本发明的清洁组合物包含一种或多种助洗剂或助洗剂系统。在加入至少一种助洗剂的一些实施方式中，清洁组合物包含按清洁组合物的重量计至少约1％、约3％至约60％或甚至约5％至约40％的助洗剂。助洗剂包括但不限于多磷酸碱金属盐、多磷酸铵盐和多磷酸链烷醇铵盐、硅酸碱金属盐、碳酸碱土金属盐和碳酸碱金属盐、硅铝酸盐、聚羧酸盐化合物、醚羟基聚羧酸盐、马来酸酐与亚乙基或乙烯基甲基醚的共聚物、1，3，5-三羟基苯-2，4，6-三磺酸和羧基甲氧基琥珀酸、聚乙酸的各种碱金属盐、铵盐和取代的铵盐诸如乙二胺四乙酸和氨三乙酸、以及聚羧酸酯，例如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、氧二琥珀酸、聚马来酸、苯1，3，5-三羧酸、羧基甲氧基琥珀酸及其可溶性盐。的确，可预期的是任何适宜的助洗剂将可用于本发明的各种实施方式。

在一些实施方式中，助洗剂形成水溶性硬度离子复合物(如螯合助洗剂)，诸如柠檬酸盐和多磷酸盐(如三多磷酸钠和三多磷酸钠六水合物、三多磷酸钾、和三多磷酸混合钠钾等)。可预期的是任何适宜的助洗剂将可用于本发明，包括本领域已知的那些助洗剂(参见如EP 2 100 949)。

螯合剂

在一些实施方式中，本发明的清洁组合物含有至少一种螯合剂。适宜的螯合剂包括但不限于铜、铁和/或锰螯合剂和其混合物。在其中使用至少一种螯合剂的实施方式中，本发明的清洁组合物包含按主题清洁组合物的重量计约0.1％至约15％或甚至约3.0％至约10％的螯合剂。

沉积助剂

在一些实施方式中，本发明的清洁组合物包括至少一种沉积助剂。适宜的沉积助剂包括但不限于聚乙二醇、聚丙二醇、聚羧酸盐、去污聚合物诸如聚对苯二甲酸(polytelephthalic acid)、粘土例如高岭土、蒙脱石、凹凸棒土(atapulgite)、伊利石、膨润土、多水高岭石和它们的混合物。

抗再沉积剂

如本文所示，抗再沉积剂可用于本发明的一些实施方式。在一些优选的实施方式中，使用非离子表面活性剂。例如，在自动机洗餐具洗涤实施方式中，非离子表面活性剂可用于表面改性目的，特别是用于表面(sheeting)，以避免薄膜形成和斑化以及改善光泽。这些非离子表面活性剂还可用于防止污物的再沉积。在一些优选的实施方式中，抗再沉积剂是本领域已知的非离子表面活性剂(参见如EP 2 100 949)。

染料转移抑制剂

在一些实施方式中，本发明的清洁组合物包括一种或多种染料转移抑制剂。适宜的聚合染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚胺N-氧化物聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯基噁唑烷酮和聚乙烯基咪唑，或它们的混合物。在其中使用至少一种染料转移抑制剂的实施方式中，本发明的清洁组合物包含按清洁组合物的重量计的约0.0001％至约10％、约0.01％至约5％、或甚至约0.1％至约3％。

硅酸盐

在一些实施方式中，硅酸盐包括于本发明的组合物内。在一些此类实施方式中，可使用硅酸钠(如二硅酸钠、正硅酸钠和结晶层状硅酸盐)。在一些实施方式中，硅酸盐以约1％至约20％的水平存在。在一些优选的实施方式中，硅酸盐以按组合物的重量计约5％至约15％的水平存在。

分散剂

在一些实施方式中，本发明的清洁组合物含有至少一种分散剂。适宜的水溶性有机材料包括但不限于均聚或共聚酸或它们的盐，其中聚羧酸包括至少两个羧基集团，其通过不超过两个碳原子互相分离。

酶

在一些实施方式中，本发明的清洁组合物包含一种或多种提供清洁性能和/或织物护理和/或餐具洗涤益处的其他洗涤剂酶。适宜的酶的实例包括但不限于半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、金属蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过氧水解酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂合酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶，或其混合物。在一些实施方式中，使用酶的组合(即“混合物”)，包含联合淀粉酶的常规适用酶像蛋白酶、脂肪酶、角质酶和/或纤维素酶。

任何其他适宜的蛋白酶可用于本发明的组合物。适宜的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。在一些特别优选的实施方式中，使用微生物蛋白酶。在一些实施方式中，包括化学或遗传修饰的突变体。在一些实施方式中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例包括枯草蛋白酶，尤其是那些来源于芽孢杆菌属(如枯草蛋白酶、迟缓芽孢杆菌枯草蛋白酶(lentus)、解淀粉芽孢杆菌枯草蛋白酶(amyloliquefaciens)、枯草蛋白酶Carlsberg、枯草蛋白酶309、枯草蛋白酶147和枯草蛋白酶168)的。另外的实例包括美国专利第RE 34,606号、第5,955,340号、第5,700,676号、第6,312,936号和第6,482,628号描述的那些突变体蛋白酶，所有这些专利通过引用并入本文。另外的蛋白酶实例包括但不限于胰蛋白酶(如猪或牛来源的)和WO 89/06270描述的镰孢菌属(Fusarium)蛋白酶。优选的可商购的蛋白酶包括

MAXACAL^TM、MAXAPEM^TM、

OXP、PURAFAST^TM和EXCELLASE^TM(Genencor)；

DURAZYM^TM、

和

(Novozymes)；和BLAP^TM(Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien，Duesseldorf，德国)。各种蛋白酶描述于WO95/23221、WO92/21760和美国专利号5,801,039、5,340,735、5,500,364、5,855,625、USRE 34,606、5,955,340、5,700,676、6,312,936和6,482,628，以及各种其他专利。在一些进一步的实施方式中，金属蛋白酶可用于本发明，包括但不限于WO 07/044993中描述的中性金属蛋白酶。

此外，任何适宜的脂肪酶可用于本发明。适宜的脂肪酶包括但不限于细菌或真菌来源的那些。化学或遗传修饰的突变体涵盖在本发明内。有用的脂肪酶的实例包括绵毛状腐质菌(Humicola lanuginosa)脂肪酶(参见如EP 258 068、EP 305 216和美国专利第6,939,702号)、米赫根毛菌(Rhizomucor miehei)脂肪酶(参见如EP 238 023)、假丝酵母属(Candida)脂肪酶诸如南极假丝酵母(C.antarctica)(如南极假丝酵母脂肪酶A或B；参见如EP 214 761)、假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶诸如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)和类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)脂肪酶(参见如EP 218 272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)脂肪酶(参见如EP 331 376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)脂肪酶(参见如GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)脂肪酶、芽孢杆菌属脂肪酶(如枯草芽孢杆菌脂肪酶[Dartois等人，Biochem.Biophys.Acta 1131：253-260[1993])；嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)脂肪酶[参见如JP 64/744992]；和短小芽孢杆菌(B.pumilus)脂肪酶[参见如WO 91/16422])。

另外，在本发明的一些实施方式中，也可以使用许多克隆化的脂肪酶，其包括但不限于，卡门柏青霉(Penicillium camembertii)脂肪酶(参见Yamaguchi等，Gene 103：61-67[1991])、白地霉(Geotricum candidum)脂肪酶(参见Schimada等，J.Biochem.，106：383-388[1989])和各种根霉属脂肪酶例如德氏根霉(R.delemar)脂肪酶(参见Hass等，Gene 109：117-113[1991])、雪白根霉(R.niveus)脂肪酶(Kugimiya等，Biosci.Biotech.Biochem.56：716-719[1992])和米根霉(R.oryzae)脂肪酶。

在本发明的一些实施方式中可使用其他类型的脂解酶，例如角质酶，包括但不限于来自门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的角质酶(参见WO 88/09367)和来自豌豆根腐镰孢菌(Fusarium solani pisi)的角质酶(参见WO 90/09446)。

另外的适宜脂肪酶包括可商购的脂肪酶，例如M1 LIPASE^TM、LUMA FAST^TM和LIPOMAX^TM(Genencor)；

和

ULTRA(Novozymes)；和LIPASE P^TM″Amano″(Amano Pharmaceutical Co.Ltd.，日本)。

在本发明的一些实施方式中，本发明的清洁组合物以添加的脂肪酶占该组合物约0.00001wt％至约10wt％的水平进一步包含脂肪酶，和余量的按组合物重量计的添加剂材料。在本发明的其他方面中，本发明的清洁组合物还包括占该组合物约0.0001wt％至约10wt％、约0.001wt％至约5wt％、约0.001wt％至约2wt％、约0.005wt％至约0.5wt％的脂肪酶。

适用于碱性溶液中的任何淀粉酶(α和/或β)可用于本发明的一些实施方式中。适合的淀粉酶包括但不限于那些细菌或真菌来源的淀粉酶。在一些实施方式中，也包括化学或遗传修饰的突变体。用于本发明的淀粉酶包括但不限于来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的α-淀粉酶(参见例如GB 1,296,839)。用于本发明的可商购淀粉酶包括但不限于

STAINZYME

STAINZYME

和BAN^TM(Novozymes)，以及POWERASE^TM、

和P(Genencor)。

在本发明的一些实施方式中，本发明的清洁组合物以添加的淀粉酶占该组合物约0.00001wt％至约10wt％的水平进一步包括淀粉酶，和余量的按组合物重量计的清洁添加剂材料。在本发明的其他方面中，本发明的清洁组合物还包括按组合物的重量计占该组合物约0.0001wt％至约10wt％、约0.001wt％至约5wt％、约0.001wt％至约2wt％、约0.005wt％至约0.5wt％的淀粉酶。

在另外一些实施方式中，在本发明的清洁组合物中可使用任何适宜的纤维素酶。适合的纤维素酶包括但不限于那些细菌或真菌来源的纤维素酶。在一些实施方式中，也包括化学或遗传修饰的突变体。适宜的纤维素酶包括但不限于特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶(参见例如美国专利No.4,435,307)。特别适宜的纤维素酶是具有护色(color care)益处的纤维素酶(参见例如EP 0495257)。用于本发明的可商购纤维素酶包括但不限于

(Novozymes)和KAC-500(B)^TM(Kao Corporation)。在一些实施方式中，纤维素酶作为成熟野生型或变体纤维素酶的部分或片段加入到本发明的组合物中，其中该纤维素酶N末端部分缺失(参见例如美国专利No.5,874,276)。在一些实施方式中，本发明的清洁组合物以添加的纤维素酶占该组合物约0.00001wt％至约10wt％的水平进一步包括纤维素酶，和余量的按组合物重量计的清洁添加剂材料。在本发明的其他方面中，本发明的清洁组合物还包括按组合物重量计占该组合物约0.0001wt％至约10wt％、约0.001wt％至约5wt％、约0.001wt％至约2wt％、约0.005wt％至约0.5wt％的纤维素酶。

适用于洗涤剂组合物的任何甘露聚糖酶也可用于本发明。适合的甘露聚糖酶包括但不限于那些细菌或真菌来源的甘露聚糖酶。在一些实施方式中，也包括化学或遗传修饰的突变体。用于本发明的各种甘露聚糖酶是已知的，参见例如美国专利No.6,566,114、No.6,602,842和No.6,440,991，这些专利都合并于本申请作为参考。在一些实施方式中，本发明的清洁组合物以添加的甘露聚糖酶占该组合物约0.00001wt％至约10wt％的水平进一步包括甘露聚糖酶和按组合物重量计余量的清洁添加剂材料。在本发明的其他方面中，本发明的清洁组合物还包括按组合物重量计占该组合物约0.0001wt％至约10wt％、约0.001wt％至约5wt％、约0.001wt％至约2wt％、约0.005wt％至约0.5wt％的甘露聚糖酶。

在一些实施方式中，在本发明的组合物中，过氧化物酶与过氧化氢或过氧化氢源(例如过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐)组合使用。在一些备选的实施方式中，氧化酶与氧组合使用。这两种类型的酶用于“溶液漂白”(即，当在洗涤液体中一起洗涤织物时为了防止纺织品染料从一个染色的织物转移到另一个织物上)，优选与增强剂一起使用(参见例如WO94/12621和WO 95/01426)。适合的过氧化物酶/氧化酶包括但不限于那些植物、细菌或真菌来源的酶。在一些实施方式中，也包括化学或遗传修饰的突变体。在一些实施方式中，本发明的清洁组合物以添加的过氧化物酶和/或氧化酶占该组合物约0.00001wt％至约10wt％的水平进一步包括过氧化物酶和/或氧化酶，和按组合物重量计余量的清洁添加剂材料。在本发明的其他方面中，本发明的清洁组合物还包含占该组合物约0.0001wt％至约10wt％、约0.001wt％至约5wt％、约0.001wt％至约2wt％、约0.005wt％至约0.5wt％的过氧化物酶和/或氧化酶。

在一些实施方式中，可使用其它的酶，包括但不限于过氧水解酶(参见如WO 05/056782)。此外，在一些特别优选的实施方式中，本文涵盖上述酶的混合物，特别是一种或多种其他的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、和/或至少一种纤维素酶。的确，可预期的是这些酶的各种混合物将可用于本发明。还预期变体蛋白酶和一种或多种其它的酶的不同水平均可以独立地至约10％，清洁组合物的余量是清洁添加剂材料。清洁添加剂材料的具体选择易于通过考虑要清洁的表面、物品或织物，以及使用过程中(如通过洗涤剂使用)的清洁条件所需的组合物形式来进行。

酶稳定剂

在本发明的一些实施方式中，本发明的洗涤剂配方中使用的酶是稳定的。在一些实施方式中，酶稳定剂包括寡糖、多糖和无机二价金属盐，包括碱土金属诸如钙盐。可预期的是各种酶稳定技术将可用于本发明。例如，在一些实施方式中，本文采用的酶通过最终组合物中水溶性锌(II)、钙(II)和/或镁(II)离子源的存在来稳定，这些源向酶提供此类离子，以及其他金属离子(如钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)和钒氧基(IV)。氯化物和硫酸盐也可用于本发明的一些实施方式中。适宜的寡糖和多糖的实例(如糊精)是本领域已知的(参见如WO 07/145964)。在一些实施方式中，可使用可逆蛋白酶抑制剂，诸如含硼化合物(如硼酸盐、4-甲酰苯基硼酸)和/或三肽甲醛在需要时可用于进一步改善稳定性。

漂白剂、漂白活性剂和漂白催化剂

在一些实施方式中，漂白剂、漂白活性剂和/或漂白催化剂存在于本发明的组合物中。在一些实施方式中，本发明的清洁组合物包含无机和/或有机漂白化合物。无机漂白剂包括但不限于过氧化氢合物盐(perhydrate salts)(如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐)。在一些实施方式中，无机过氧化氢合物盐是碱金属盐。在一些实施方式中，包括结晶固体形式的无机过氧化氢合物盐而无需另外的保护，但是在一些其他实施方式中，盐是包衣的。本领域已知的任何适宜的盐可用于本发明(参见如EP 2 100 949)。

在一些实施方式中，本发明的组合物中使用漂白活性剂。漂白活性剂通常是在60℃和以下的温度下增强清洁过程中漂白作用的有机过酸前体。适合用于本文的漂白活性剂包括在过氧水解条件下产生优选具有约1至约10个碳原子、特别是约2至约4个碳原子的脂肪族过氧化氢合物盐、和/或任选地取代的过苯甲酸的化合物。其他漂白活性剂是本领域已知的并可用于本发明(参见如EP 2 100 949)。

此外，在一些实施方式中和如本文进一步描述的，本发明的清洁组合物还包含至少一种漂白催化剂。在一些实施方式中，可使用锰三氮杂环壬烷和相关复合物、以及钴、铜、锰和铁复合物。另外的漂白催化剂可用于本发明(参见如US 4,246,612、5,227,084、4,810410、WO 99/06521和EP2 100 949)。

催化金属复合物

在一些实施方式中，本发明的清洁组合物含有一种或多种催化金属复合物。在一些实施方式中，可使用含金属的漂白催化剂。在一些优选的实施方式中，金属漂白催化剂包含具有以下的催化系统：具有限定的漂白催化活性的过渡金属阳离子(如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子)，具有很少或没有漂白催化活性的辅助金属阳离子(如锌或铝阳离子)，对于催化和辅助金属阳离子具有限定的稳定常数的多价螯合物(sequestrate)，特别是乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)及其水溶性盐(参见如美国专利第4,430,243号)。在一些实施方式中，本发明的清洁组合物通过锰化合物催化。这类化合物和使用水平为本领域所公知，(参见如美国专利第5,576,282号)。在其他的实施方式中，钴漂白催化剂可用于本发明的清洁组合物。各种钴漂白催化剂是本领域已知的(参见如美国专利第5,597,936号和第5,595,967号)并且易于通过已知方法制备。

在其他的实施方式中，本发明的清洁组合物包括大多环刚性配基(macropolycyclic rigid ligand，即MRL)的过渡金属复合物。作为实用的内容，而不是为了限制，在一些实施方式中，调节本发明提供的组合物和清洁过程，以在水性洗涤介质中提供至少每亿分之一级别的活性MRL物质，和在一些优选的实施方式中，在该洗涤液中提供约0.005ppm至约25ppm、更优选约0.05ppm至约10ppm和最优选约0.1ppm至约5ppm的MRL。

在本过渡金属漂白催化剂中的优选过渡金属包括但不限于锰、铁和铬。优选的MRL还包括但不限于交叉桥接的特殊超刚性配基(如5，12-二乙基-1，5，8，12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷。适宜的过渡金属MRL易于通过已知方法制备(参见如WO 2000/32601和美国专利第6,225,464号)。

金属护理剂

在一些实施方式中，本发明的清洁组合物包含金属护理剂。金属护理剂可用于防止和/或减轻金属包括铝、不锈钢和有色金属(如银和铜)的晦暗、腐蚀、和/或氧化。适宜的金属护理剂包括EP 2 100 949、WO9426860和WO 94/26859中描述的那些。在一些实施方式中，金属护理剂是锌盐。在一些进一步的实施方式中，本发明的清洁组合物包含按重量计约0.1％至约5％的一种或多种金属护理剂。

制备和使用清洁组合物的方法

本发明的清洁组合物被配制成任何适宜的形式，用配制者选择的任何方法制备(参见如美国专利第5,879,584号、第5,691,297号、第5,574,005号、第5,569,645号、第5,565,422号、第5,516,448号、第5,489,392号、第5,486,303号、第4,515,705号、第4,537,706号、第4,515,707号、第4,550,862号、第4,561,998号、第4,597,898号、第4,968,451号、第5,565,145号、第5,929,022号、第6,294,514号和第6,376,445号)。

在一些实施方式中，本发明的清洁组合物以单位剂型提供，单位剂型包括片剂、胶囊、小药囊、小袋(pouch)和多隔室小袋(multi-compartment pouches)。在一些实施方式中，单位剂型设计为提供在多隔室小袋(或其他单位剂型)内的成分的控制释放。适宜的单位剂量和控制释放形式是本领域已知的(关于适合用于单位剂量和控制释放形式的适宜材料，参见如EP 2 100 949、WO 02/102955、美国专利第4,765,916号和第4,972,017号、以及WO 04/111178)。

使用方法

在优选的实施方式中，本发明的清洁组合物可用于清洁表面(如餐具)和/或织物。在一些实施方式中，表面和/或织物的至少一部分与处于纯形式或在洗涤水中稀释的本发明的清洁组合物的至少一种实施方式接触，然后任选地洗涤和/或漂洗表面和/或织物。对于本发明目的，“洗涤”包括但不限于擦洗和机械振摇。在一些实施方式中，织物包括在正常消费者使用条件下能够洗涤的任何织物。在优选的实施方式中，在溶液中本发明的清洁组合物以约500ppm至约15,000ppm的浓度使用。在洗涤溶剂是水的一些实施方式中，水温度通常在约5℃至约90℃范围内。在织物清洁的一些优选的实施方式中，水与织物的质量比通常是约1∶1至约30∶1。

实验

提供以下实施例以示范和进一步说明本发明的某些优选实施方式和方面，这不应解释为限制本发明的范围。

在下面的实验公开内容中，应用了以下缩写：ppm(百万分之一)；M(摩尔每升)；mM(毫摩尔每升)；μM(微摩尔每升)；nM(纳摩尔每升)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；μmol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)；gm(克)；mg(毫克)；μg(微克)；Pg(皮克)；L(升)；ml和mL(毫升)；μl和μL(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(纳米)；U(单位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(分钟)；h和hr(小时)；℃(摄氏度)；QS(足量)；ND(未做)；NA(不适用)；rpm(每分钟转数)；w/v(重量体积比)；v/v(体积体积比)；g(重力)；OD(光密度)；aa((氨基酸)；bp(碱基对)；kb(千碱基对)；kD(千道尔顿)；suc-AAPF-pNA(琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-苯丙氨酰-对硝基苯胺)；BPN’(解淀粉芽孢杆菌枯草蛋白酶)；DMSO(二甲亚砜)；cDNA(复制或互补DNA)；DNA(脱氧核糖核酸)；ssDNA(单链DNA)；dsDNA(双链DNA)；dNTP(脱氧核糖核苷酸三磷酸)；DTT(1，4-二硫-DL-苏糖醇)；H₂O(水)；dH₂O(去离子水)；HCl(盐酸)；MgCl₂(氯化镁)；MOPS(3-[N-吗啉代]丙磺酸)；NaCl(氯化钠)；PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)；PB92(克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)枯草蛋白酶)；PBS(磷酸盐缓冲盐水[150mMNaCl、10mM磷酸钠缓冲液，pH 7.2])；PEG(聚乙二醇)；PCR(聚合酶链式反应)；PMSF(苯甲基磺酰氟)；RNA(核糖核酸)；SDS(十二烷基硫酸钠)；Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)；SOC(2％细菌用胰蛋白胨、0.5％细菌用酵母提取物、10mM NaCl、2.5mM KCl)；Terrific培养基(TB；12g/l细菌用胰蛋白胨、24g/l甘油、2.31g/l KH₂PO₄和12.54g/l K₂HPO₄)；OD280(280nm下的光密度)；OD600(600nm下的光密度)；A405(405nm下的吸光度)；Vmax(酶催化的反应的最大初始速率)；HEPES(N-[2-羟乙基]哌嗪-N-[2-乙磺酸])；Tris-HCl(三[羟甲基]氨基甲烷-盐酸)；TCA(三氯乙酸)；HPLC(高压液相层析)；RP-HPLC(反相高压液相层析)；TLC(薄层层析)；Taq(Thermus aquaticus DNA聚合酶)；Klenow(DNA聚合酶I大(Klenow)片段)；EDTA(乙二胺四乙酸)；EtOH(乙醇)；SDS(十二烷基硫酸钠)；Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)；TAED(N，N，N’N’-四乙酰乙二胺)；PI(性能指数)；SR(污物或污渍去除)；MS(质谱)；AATCC(美国纺织化学师和染色师协会)；Arzberg(Arzberg-Porzellan GmbH，Schirnding，德国)；BASF(BASF Corp.，Florham Park，NJ)；BioRad(BioRad，里士满，加利福尼亚州)；Cognis(Cognis Corp，美国，辛辛那提，俄亥俄州)；Finnzymes(Finnzymes Oy，Espoo，芬兰)；Henkel(Henkel，GmbH，Dusseldorf、德国)；IKW(Industrieverband Kβrperfiege und Waschmittel，＝德国化妆品香水护理洗涤工业协会(The German Cosmetic，Toiletry，Perfumery and Detergent Association)，法兰克福，德国)；Invitrogen(Invitrogen Corp.，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)；Kontron(Kontron Instruments，Zurich，瑞士)；Macherey-Nagel(Macherey-Nagel，伊斯顿，宾夕法尼亚州)；Miele(Miele，普林斯顿，新泽西州)Merieux(Instirut Merieux，Codex，FR)；

(

Inc.，巴伦西亚，加利福尼亚州)；(Reckitt Benckiser，伯克郡，英国)；Sigma(Sigma Chemical Co.，圣路易斯，密苏里州)；Sorvall(Sorvall Instruments，DuPont Co.的子公司，Biotechnology Systems，威尔明顿，特拉华州)；和wfk Testmaterials(Testgewebe GmbH，Bruggen-Bracht，德国)。

实施例1

枯草蛋白酶变体的构建

如本文所述，通过本领域已知的融合PCR(参见如美国专利申请公布第2006/0252155号)制备枯草蛋白酶变体。表1-1提供了用于融合PCR的引物的序列。

^＊在位置76产生取代的密码子和限制酶切位点以粗体显示。

使用克劳氏芽孢杆菌PB92变体(含有以下取代N87R+G118R+S128L+P129Q+S130A+S188D+N248R；使用BPN’编号，并在本文命名为GCI-P039)的DNA模板产生还包含N76D取代的枯草蛋白酶变体(在本文命名为“PX3”)。还可通过引入N76D取代从迟缓芽孢杆菌GG36变体(含有以下取代S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A+S188D+N248R；使用BPN’编号)的DNA模板产生与PX3具有相同氨基酸序列的变体。

在第一反应中将BglII-Fw引物与N76D-Rv组合以产生第一片段，并通过在第二反应中将BglII-Rv引物与N76D-Fw引物组合制备第二片段。PCR反应中使用PHUSION^TM聚合酶(Finnzymes)。在这些实验中，向50μl体积中加入2μl的10mM正向引物和反向引物、1μl的10mM dNTP、10μl的5X HF Phusion缓冲液、1.5μl的DMSO、1单位聚合酶和1μl模板。使用以下PCR程序：在95℃下变性3min、在65℃下退火1min和在72℃下延伸1分15秒，共30个循环，然后在72℃下7min。完成后，将反应产物储存在室温下。

使用PCR纯化柱(Macherey-Nagel)从琼脂糖凝胶中纯化两次PCR反应中预期大小的DNA片段。使用BglII正向引物和反向引物以及PHUSION^TM聚合酶、用以下程序通过PCR扩增融合两个期望的片段：在95℃下变性3min、在65℃下退火1min和在72℃下延伸2min，共25个循环，然后在72℃下7min。完成后，将反应产物储存在室温下。

通过用BglII限制酶消化和从琼脂糖凝胶纯化获得融合PCR反应的DNA片段。随后将该DNA片段与BglII消化的pHPLT质粒主链连接，在40μl的终体积中使用1μl T4 DNA连接酶、8μl 5X T4连接缓冲液在14℃下连接过夜。

使用10μl连接产物转化感受态枯草芽胞杆菌细胞(表型：ΔaprE、ΔnprE、oppA、ΔspoIIE、degUHy32、ΔamyE::[xylR，pxylA-comK])，以获得蛋白酶阳性转化子，如本领域已知的(参见如WO 02/14490)。通过诱导木糖诱导型启动子控制下的comK基因制备细菌感受态(参见如Hahn等人，Mol Microbiol，21：763-775，1996)。在脱脂乳/琼脂平板上选择蛋白酶阳性克隆，对其进行分离和测序，并在摇瓶培养物中制备蛋白质以产生大量酶样品供特征检测。

实施例2

枯草芽胞杆菌中枯草蛋白酶变体的产生

通过在37℃在10ml TSB(胰蛋白胨和大豆培养基)培养基过夜培养枯草芽胞杆菌转化子产生枯草蛋白酶变体。将250μl小份的过夜培养物转移到100ml摇瓶中25ml基于MOPS的确定成分培养基，并在37℃下培养68小时。确定成分培养基的制备基本上按本领域已知的进行(参见Neidhardt等人，J Bacteriol，119：736-747，1974)，例外的是在基本培养基中省略了NH₄Cl₂、FeSO₄和CaCl₂，使用3mM K₂HPO₄，并向基本培养基补充了60mM尿素、75g/L葡萄糖和1％大豆胨(soytone)。另外，微量营养素配制成100X贮液，其在1升中含有：400mg FeSO₄.7H₂O、100mg MnSO₄.H₂O、100mg ZnSO₄.7H₂O、50mg CuCl₂.2H₂O、100mgCoCl₂.6H₂O、100mg NaMoO₄.2H₂O、100mg Na₂B₄O₇.10H₂O、10ml的1MCaCl₂和10ml的0.5M柠檬酸钠。从培养基中分离目的蛋白酶(即蛋白酶变体)。

实施例3

测定枯草蛋白酶变体纯度的分析方法

此实施例描述了用于测定从枯草芽胞杆菌培养物中获得的重组枯草蛋白酶的纯度的方法。当通过凝胶电泳和高效液相层析(HPLC)分别发现单一条带或峰时，视为蛋白酶是纯的。

十二烷基硫酸钠(SDS)存在下的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)按本领域已知的进行(Laemmli，Nature，227：680-685，1970)。但是，在将蛋白质样品变性(如在含SDS的样品缓冲液中在100℃下10min)之前，需要灭活蛋白酶活性以防止自体降解。蛋白酶灭活通过将蛋白质样品与1mM PMSF在室温孵育30min或通过用8％三氯乙酸(TCA)在冰上沉淀蛋白质30min来实现。使蛋白质样品在pH 7.45下进行非变性PAGE。凝胶缓冲液由20mM组氨酸和50mM 3-[N-吗啉代]丙磺酸(MOPS)组成，并且5％聚丙烯酰胺凝胶具有20∶1的丙烯酰胺∶双丙烯酰胺比。将蛋白质样品上样到平板凝胶的顶部，并向阴极电泳。使用相同的组氨酸/MOPS缓冲液作为电泳(槽)缓冲液，但调节至pH6.3。电泳(在350V下进行约1-2hr)后，将凝胶浸泡在8％乙酸中以固定凝胶中的蛋白质，然后用考马斯亮蓝R250染色并按本领域已知的进行脱色，以定位凝胶上的蛋白质条带。

还使用MonoS阳离子交换柱接着是TSK 2000凝胶过滤柱通过HPLC分析确认蛋白酶样品的纯度。第一个柱在10mM磷酸钠缓冲液pH 5.5中进行并使用10-300mM磷酸钠、pH 5.5的线性梯度洗脱结合的蛋白酶。凝胶过滤柱在0.25M乙酸钠pH 5.5中进行。在280nm下监测蛋白质洗脱谱以定位目的蛋白酶和确定样品的百分比纯度。

实施例4

枯草蛋白酶浓度的测定

此实施例描述用于测定枯草蛋白酶浓度的方法。在一些实验中，使用计算的消光系数(□)在280nm下进行消光测量，并使用活性位点滴定测定纯化的蛋白酶溶液中的蛋白质浓度，如下文所述。

280nm的消光系数是根据每个酶分子中的色氨酸(Trp，ε[epsilon]＝5,600M^-1.cm^-1)和酪氨酸(Tyr，ε＝1,330M^-1.cm^-1)的数目计算的。对于PB92蛋白酶，摩尔消光系数为26,100M^-1.cm^-1(3Trp+7Tyr残基)，等于280nm下测量的ε_1％＝9.7(M_r＝26,729Da)。在突变体具有改变数目的色氨酸和/或酪氨酸残基的情形下，相应地进行校正。

通过活性位点滴定获得活性酶分子浓度的估测。由于广泛使用的N-反式肉桂酰咪唑酰化方法(Bender等人，J Am Chem Soc、88：5890-5931、1966)被证明不能满意地用于PB92蛋白酶，因此开发了使用不可逆抑制剂PMSF的方法。在此方法中，将具有预计酶浓度(根据280nm吸收)的蛋白酶溶液分别与0.25、0.50、0.75、1.00和1.25当量的PMSF混合，然后允许其在室温下在10mM磷酸钠pH6.5中反应1小时。使用琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-苯丙氨酰-对硝基苯胺(suc-AAPF-pNA)作为底物通过分光光度法测量残余的蛋白酶活性。对于这些研究，PMSF的纯度(和由此的浓度)通过NMR-光谱法测定，并在异丙醇中制备PMSF的贮液。发现活性位点滴定结果与使用HPLC方法的纯度检验的蛋白质浓度结果一致。

实施例5

洗涤性能测试

此实施例描述了适合评估枯草蛋白酶变体PX3和GCI-P038参考枯草蛋白酶在可商购的餐具和衣物洗涤剂中的餐具洗涤和织物清洁性能的方法。

本文称为PX3并具有N76D+N87R+G118R+S128L+P129Q+S130A+S188D+N248R(BPN’编号)取代的成熟PB92蛋白酶变体的氨基酸序列为：

AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALDNSIGVLGVAPRAELYAVKVLGASGSG SVSSIAQGLEWAGNNRMHVANLSLGLQAPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRADFSQYGAGLDIVAPGVNVQ

成熟GCI-P037(PB92)参考枯草蛋白酶的氨基酸序列为：

AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSLSYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR(SEQ ID NO：6).

成熟GCI-P038参考枯草蛋白酶的氨基酸序列为：

AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNVMHVANLSLGLQAPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR(SEQ ID NO：7)

餐具洗涤性能

此实施例描述了测量枯草蛋白酶变体PX3和GCI-P038参考枯草蛋白酶在可商购的餐具洗涤剂中的餐具洗涤性能的方法。

在各种自动机洗餐具洗涤条件下测试变体蛋白酶的性能。餐具洗涤剂的组成显示于表5-1和5-2。这些洗涤剂是从wfk Testmaterials可商购的并按照它们的wfk Testmaterials命名来指示。这些洗涤剂是以无酶存在的形式从所述来源获得的，以允许分析蛋白酶变体。

下面提供了配制每种污渍类型(蛋黄、肉馅和鸡蛋，以及蛋奶(egg with milk))的实验方案。在将各种污物类型涂抹到测试餐具之前，彻底洗涤餐具。这是尤为必要的，因为某些顽强污渍可能仍存在于上次测试的餐具上。新的餐具在首次用于测试前也应彻底洗涤三次。

不锈钢上的蛋黄污渍的制备

将这些实验中使用的不锈钢板(10x15cm；涂刷于一侧)在95℃下在实验室洗碗机中用高碱性商业洗涤剂(如

洗涤剂；Henkel)彻底洗涤以提供干净并且无脂肪的板。在首次使用之前将这些板清理毛刺。在用蛋黄弄脏之前，将这些板在80℃在保温柜中干燥30分钟。在弄脏之前，不要触摸待涂刷的表面。另外，表面上也不允许有水污渍或绒毛。在弄脏之前将冷却的板称重。

蛋黄通过将大约10-11个鸡蛋的蛋黄(200g蛋黄)与蛋清分离来制备蛋黄。在玻璃烧杯中用叉子搅拌蛋黄，以使蛋黄悬液均匀。然后过滤蛋黄(大约0.5mm网孔)以去除粗糙颗粒和任何蛋壳碎片。

使用平刷(2.5”)将2.0±0.1g蛋黄悬液尽可能均匀地涂抹到每块不锈钢板涂刷侧140cm²的面积上，留下大约1cm宽的不弄脏的边(如果需要，使用胶带)。将弄脏的板在室温下水平干燥(防止在板的边缘形成微滴)4小时(最多24hr)。

为了使蛋黄蛋白质变性，将板在煮沸的、去离子水中浸渍30秒(如果必要，使用夹持装置)。然后将板在80℃下再次干燥30min。干燥和冷却后，将板称重。称重后，在将板用于洗涤测试之前使它们静置至少24hr(20℃、40-60％相对湿度)。为了满足测试要求，仅具有1000±100mg/140cm²(变性后的蛋黄)的板用于测试。进行洗涤测试后，将板在80℃下在保温柜中干燥30min，并在冷却后再次称重。清洁性能百分比通过以下确定：将洗涤过程中释放的蛋黄的毫克数除以涂抹的变性蛋黄的毫克数然后乘以100。

瓷托盘上的肉馅和鸡蛋污渍的制备

对于这些实验，使用符合EN 50242、表1495、第0219号的点心盘(Arzberg，直径19cm，白色，釉面瓷(glazed porcelain))。将共计225g瘦猪肉和牛肉(50∶50比值)细细剁碎，并保持冷却。将混合物在碎肉器中碎两次。避免温度超过35℃。然后将225g肉馅与75g鸡蛋(蛋清和蛋黄混在一起)混合。然后在使用前将该制品在-18℃冷冻高达3个月。如果没有猪肉，使用100％牛肉，因为这些是可互换的。

使肉馅和鸡蛋混合物(300g)升至室温并与80ml去离子水混合。然后使用厨房用手动混合器将混合物匀浆2min。用叉子将3g肉馅/鸡蛋/水混合物涂抹到每个白色的瓷托盘上，沿着边留下2cm宽的未弄脏的空白。涂抹量为11.8±0.5mg/cm²。将托盘在120℃下在预加热的保温柜中干燥2小时。待托盘冷却后即可使用。

进行餐具洗涤测试之后，用水合茚三酮溶液(在乙醇中制成1％)喷涂托盘以更好地鉴别肉馅蛋白质残留物。为了促进显色反应，将托盘在80℃下在保温柜中加热10min。通过参考IKW图片目录(IKW-德国化妆品香水护理洗涤工业协会)目测肉馅残留物的显色反应来评估洗涤性能。

不锈钢上的蛋/奶污渍的制备

将这些实验中使用的不锈钢板(10x15cm；涂刷于一侧)在95℃下在实验室洗碗机中用高碱性商业洗涤剂彻底洗涤以去除脂肪和清洁这些板。将这些板用纤维素布擦干。在弄脏之前，不要触摸待涂刷的表面。另外，表面上也不允许有水污渍或绒毛。在弄脏之前，将这些板在80℃保温柜中放置30分钟。在弄脏之前将冷却的板称重。

将完整的原始鸡蛋(3-4个鸡蛋；大约160g/鸡蛋)的蛋黄和蛋清放在碗里，用搅蛋器搅打。然后，将50ml半脱脂奶(1.5％脂肪，超高温，均质)添加到混合物中。将奶和鸡蛋混合而不产生泡沫。使用平刷将1.0±0.1g蛋/奶混合物均匀地分散到不锈钢板涂刷侧，使用天平确认分散。沿板的短侧留下大约1.0cm的空白。将弄脏的板在室温下水平干燥(防止在板的边缘形成微滴)4小时(最多24hr)。

然后将板在煮沸的、去离子水中浸渍30秒(如果必要，使用夹持装置)。之后将板在80℃下再次干燥30min。干燥和冷却后，将板称重。称重后，在将板用于洗涤测试之前使它们静置至少24hr(20℃、40-60％相对湿度)。为了满足测试要求，仅使用具有190±10mg蛋黄/奶的板。

进行洗涤测试后，将板在80℃下在保温柜中干燥30min，并在冷却后再次称重。清洁性能百分比通过以下确定：将洗涤时释放的蛋/奶的毫克数除以涂抹的蛋/奶的毫克数然后乘以100。

洗涤设备和条件

洗涤测试在自动机洗洗碗机(Miele型号G690SC)中进行，其中装有如上所述制备的弄脏的餐具和不锈钢板。使用限定量的洗涤剂。测试的温度是50℃。水硬度为21GH(德国硬度)。

如上所述，洗涤后，使用0到10的照片等级量表目测评估肉馅弄脏的托盘，其中“0”表示完全弄脏的托盘，而“10”表示干净的托盘。这些值对应于含酶的洗涤剂的污渍或污物去除(SR)能力。

通过重量测定分析洗涤的蛋黄或蛋黄/奶弄脏的不锈钢托盘，以测定洗涤后残留的污渍的量。在每次洗涤0-30mg/活性蛋白质的水平测试了枯草蛋白酶变体PX3和GCI-P038参考枯草蛋白酶。

各种餐具洗涤测试的结果提供在下面的表5-3到5-6中。在这些每个实验中，使用了每次洗涤不同的活性蛋白酶浓度。GCI-P038参考枯草蛋白酶的洗涤性能指定为值“100”，而将变体的洗涤性能与该值进行比较。例如，如果GCI-P038参考枯草蛋白酶具有45％污渍去除的结果，而变体具有52％污渍去除的结果，则枯草蛋白酶变体显示的性能指数(PI)的结果将是52/45x100＝116。因此，在测试的两种洗涤剂中，枯草蛋白酶变体PX3比GCI-P038参考枯草蛋白酶更有效或与它同等有效地去除餐具洗涤应用中的蛋白性污渍。

^＊在这些指定的条件下的污物去除为100％。

实施例6

枯草蛋白酶变体的稳定性和清洁性能

此实施例描述了评估PX3的稳定性和清洁性能的方法。

AAPF水解测定方法

丝氨酸蛋白酶变体的耐热性通过在68℃下孵育蛋白酶变体1小时后使用AAPF测定来测量蛋白酶活性而确定。在测定条件下，参考蛋白酶(如野生型GG36＝GCI-P036)的残留活性为约50％。使用的设备为：F-底MTP(Costar编号9017)、Biomek FX和/或Biomek FXp Robot(Beckman Coulter)、Spectramax Plus 384MTP读数器(Molecular Devices)、iEMS孵箱/摇床(1mm振幅)(Thermo/Labsystems)、封口带(Nunc编号236366)和冰浴。甘氨酸缓冲液通过将3.75g甘氨酸(Merck编号1.04201.1000)溶解于960mL水来制备。向此溶液中加入1ml的5％

-80(Sigma编号P-8074)和10ml的1000mM CaCl₂贮液Merck编号1.02382.1000)(29.4g溶解至200ml)。用4N NaOH调节pH至10.5，将体积补至1000ml。甘氨酸、CaCl₂和-80的最终浓度分别为：50mM、10mM和0.005％。孵箱设置为68℃(用于孵育)和25℃(用于AAPF测定)。向空白稀释和孵育板中分别加入90μl和190μl甘氨酸缓冲液。然后将10μl上清液加至稀释板，然后从稀释板取10μl加入孵育板。然后将孵育板的10μl混合物加至含有suc-AAPF-pNA底物的预保温的板。在MTP读数器在410nm读取suc-AAPF-pNA板(t＝0测量)。用封口带覆盖孵育板，并在68℃和400rpm下孵育1小时。孵育结束后，将板从孵箱取出并在冰上冷却至少5分钟。将孵育板的10μl混合物转移至含suc-AAPF-pNA底物的板，并在410nm读取板(t＝60测量)。残留活性的百分比计算为：

％残留活性：(t＝60时的mOD.min-1)/(t＝0时的mOD.min-1)x100

LAS/EDTA稳定性测定

在LAS/EDTA存在下孵育测试蛋白酶后，测量LAS/EDTA稳定性，该稳定性为使用AAPF测定确定的残留活性的函数。

在限定条件下孵育后，测量蛋白酶变体和对照蛋白酶在代表性阴离子表面活性剂(LAS＝直链烷基苯磺酸盐，十二烷基苯磺酸钠-DOBS)和EDTA二钠存在下的稳定性，并使用AAPF测定来确定残留活性。使用的试剂为：十二烷基苯磺酸钠盐(DOBS，Sigma编号D-2525)，

-80(Sigma编号P-8074)，EDTA二钠(Siegfried Handel编号164599-02)、HEPES(Sigma编号H-7523)，非应力缓冲液：50mMHEPES(11.9g/l)+0.005％

-80、pH 8.0，应力缓冲液：50mMHEPES(11.9g/l)、0.1％(w/v)DOBS(1g/l)、10mM EDTA(3.36g/l)、pH 8.0，参考蛋白酶和蛋白酶变体培养物上清液，含有200-400μg/ml蛋白质。使用的设备是V-底或U-底MTP作为稀释板(分别为Greiner 651101和650161)，F-底MTP(Corning 9017)用于非应力和LAS/EDTA缓冲液以及suc-AAPF-pNA板，Biomek FX(Beckman Coulter)，Spectramax Plus 384MTP读数器(Molecular Devices)，Thermo Electron Corporation的iEMS孵箱/摇床(1mm振幅)，封口带：Nunc(236366)。

将iEMS孵箱/摇床(Thermo/Labsystems)设置在29℃。将培养物上清液在含非应力缓冲液的板中稀释到25ppm的浓度(主稀释板)。将20μl主稀释板的样品添加到含180μl非应力缓冲液的板中以产生2.5ppm的最终孵育浓度。混合内容物并保持在室温，然后在此板上进行AAPF测定。另外将20μl主稀释板的样品添加到含180μl应力缓冲液(50mM HEPES(11.9g/l)、0.1％(w/v)DOBS(1g/l)、10mM EDTA(3.36g/l)、pH 8.0)的板中。混合溶液并立即置于29℃、400rpm的iEMS摇床30min。孵育30分钟之后，在应力板上进行AAPF测定。样品的稳定性通过计算残留AAPF活性和初始AAPF活性的比值确定，如下所示：残留活性(％)＝[mOD.min-1应力]＊100/[mOD.min-1非应力]。

烘焙蛋黄小样片测定

在微量滴定板(MTP)规模测定枯草蛋白酶变体在可商购的洗涤剂(洗涤剂[Reckitt-Benckiser]；和

洗涤剂[P&G])中的污渍去除性能。测试枯草蛋白酶变体的样品获自MTP板上37℃/300rpm/90％相对湿度下培养3天的培养物的过滤培养基。使用的设备包括：Biomek FX Robot(Beckman Coulter)、SpectraMAX MTP读数器(340型；Molecular Devices)、iEMS孵箱/摇床(Thermo/Labsystems)；F-底MTP(Costar 9017型)用于读取孵育后的反应板，和V-底MTP(Greiner 651101)用于预稀释上清液。使用获自CFT Vlaardingen的CS-38小样片(加色素蛋黄，通过加热老化)作为底物。每孔使用两个样片。使用Calgonit 5合1的ADW片剂制备洗涤剂溶液。为了灭活片剂中存在的蛋白酶活性，将21g片剂溶解于在水浴中加热至60℃温度的Milli-Q水。将溶液冷却至室温，并将水的体积调整至700mL。进一步用水稀释溶液以达到3g/l的最终浓度。通过添加1.46ml的Ca/Mg-混合物(Ca/Mg混合物[(3∶1)、1.92M CaCl₂＝282.3g/L CaCl₂.2H₂0；0.64M MgCl₂＝130.1g/L MgCl₂.6H₂O)、15000gpg]调节水硬度至21GH。酶样品在10mM NaCl、0.1mM CaCl₂、0.005％

-80溶液中预稀释，并在适合的浓度下测试。

将孵箱设置在40℃或50℃的所需温度，将72μl稀释缓冲液添加至空白V-底板(＝稀释板)，然后加入8μl上清液。然后将来自稀释板的9μl添加到含有在171μl洗涤剂溶液中孵育的小样片的板中。将小样片板(含有洗涤剂和酶)用带封口，并置于1400rpm孵箱/摇床30分钟。孵育后，将75μl的反应混合物转移至空白F-底板，并在用吹发器去泡后在MTP读数器中在405nm下读取吸光度。含有一个或两个小样片和洗涤剂而未添加含参考枯草蛋白酶的样品的空白对照也包括在测试中。

*缩写：Procter&Gamble(P&G)；和Reckitt Benckiser(RB)

血奶墨(Blood Milk Ink，BMI)小样片测定

在微量滴定板(MTP)规模测定枯草蛋白酶变体在可商购的洗涤剂中去除污渍的性能。参考枯草蛋白酶和枯草蛋白酶变体的样品获自MTP板上37℃/300rpm/90％相对湿度下培养3天的培养物的过滤培养基。使用的设备包括：96孔聚苯乙烯板(Costar编号9017，中等结合，平底)、Biomek FX和/或Biomek FXp(Beckman Coulter)、Spectramax Plus 384(Molecular Devices)、1mm振幅的iEMS孵箱/摇床(Thermo Electron Corporation)和封口带(Nunc编号236366)。使用的试剂包括：5mM HEPES、pH 8.0或5mM MOPS、pH 7缓冲液、3∶1 Ca∶Mg用于中等水硬度.(CaCl₂:MgCl₂·6H₂O)；15000个颗粒/加仑(gpg)贮液稀释至6gpg、每个板两个BMI(血/奶/墨)样片：CFT加工的EMPA-116BMI棉样片：每孔预漂洗和钻孔的两个样片，和热灭活的

2X现成的洗涤剂，已证实其中缺乏蛋白酶活性。在此测定中，蛋白酶水解底物并从底物释放色素和不溶性颗粒。

将孵箱设置在期望的温度(16℃或32℃)。首先，将～10ppm酶主稀释板的10μL样品添加至具有190μL上文所列的工作洗涤剂溶液的BMI 2-样片板。调整体积以使测定板中变体的最终浓度为0.5ppm。然后将板立即转移至iEMS孵箱并在给定温度下以1400rpm振荡30分钟。孵育后，将100μL上清液转移至新的96-孔板，并在MTP读数器中在405nm和/或600nm下测量吸光度。含有一个或两个小样片和没有添加蛋白酶样品的洗涤剂的对照孔也包括在测试中。405nm的测量结果提供更高的值并追踪色素去除，而600nm的测量结果追踪浊度和清洁。

污渍去除活性的计算：

将获得的吸光度值针对空白值(有底物，无酶)校正，提供水解活性的量度。对于每个样品(变体)，计算性能指数(PI)。性能指数比较相同蛋白质浓度下变体(实际值)和参考酶(理论值)的性能。此外，理论值可使用标准酶的朗缪尔方程参数计算。性能指数(PI)大于1(PI＞1)鉴定相比于标准(如野生型)更好的变体，而PI为1(PI＝1)鉴别与标准有相同性能的变体，而PI低于1(PI＜1)鉴定性能比标准差的变体。因此，PI鉴别胜者，以及不太适合某些情况下使用的变体。

使用小样片测定(CS-38样片)确定枯草蛋白酶变体的清洁性能。还使用上文所述的方法测定了变体的LAS/EDTA稳定性和耐热性。结果显示于表6-3。

^＊

洗涤剂；^＊＊

洗涤剂

除了这些实验之外，还提供了确定蛋白酶变体在洗衣应用中的清洁性能的实验。测试洗涤剂是热灭活的可商购衣物洗涤剂(如

2X Free[P&G；“NA HDL”]

Free[P&G；“NA HDD”])。使用0.2ppm变体在25℃下、30分钟、1400rpm振荡、200uL体积下测试BMI弄脏的小样片的清洁性能。变体的功能性用性能指数(Pi)来衡量，性能指数是变体与亲本GCI-P036蛋白质的性能的比值。

实施例7

液体衣物洗涤剂组合物

此实施例提供了各种液体衣物洗涤剂组合物配方。本发明的下列液体衣物洗涤剂组合物按下文所示制备。在每个这些配方中，以约0.0001wt％至约10wt％的浓度包括至少一种本文提供的蛋白酶变体。在一些替代的实施方式中，配制者可以根据他们的需要使用其他浓度。

#1：添加1N HCl水溶液以调节配方的净pH在约3至约5的范围内。

上面的实施例7(I)-(II)的pH为约5至约7，而7(III)-(V)的pH是约7.5至约8.5。

实施例8

手洗餐具液体洗涤剂组合物

此实施例提供了各种手洗餐具液体洗涤剂配方。本发明的下列手洗餐具液体洗涤剂组合物提供于下文。在每个这些配方中，以约0.0001wt％至约10wt％的浓度包括至少一种本文提供的蛋白酶变体。在一些替代的实施方式中，配制者可以根据他们的需要使用其他浓度。

实施例8(I)-(VI)的pH是约8至约11。

实施例9

液体自动机洗餐具洗涤剂组合物

此实施例提供了各种液体自动机洗餐具洗涤剂配方。本发明的下列手洗餐具液体洗涤剂组合物提供于下文。在每个这些配方中，以约0.0001wt％至约10wt％的浓度包括至少一种本文提供的蛋白酶变体。在一些替代的实施方式中，配制者可以根据他们的需要使用其他浓度。

实施例10

粒状和/或片剂洗衣组合物

此实施例提供了各种粒状和/或片剂衣物洗涤剂配方。本发明的以下洗衣组合物提供于下文，其可以是粒状或片剂。在每个这些配方中，以约0.0001wt％至约10wt％的浓度包括至少一种本文提供的蛋白酶变体。在一些替代的实施方式中，配制者可以根据他们的需要使用其他浓度。

^＊香料、染料、增白剂/SRP1/羧甲基纤维素钠/光漂白剂/MgSO₄/PVPVI/抑泡剂/高分子PEG/粘土。

实施例11

液体衣物洗涤剂

此实施例提供各种液体衣物洗涤剂配方。本发明的以下液体衣物洗涤剂配方提供于下文。在每个这些配方中，以约0.0001wt％至约10wt％的浓度包括至少一种本文提供的蛋白酶变体。在一些替代的实施方式中，配制者可以根据他们的需要使用其他浓度。

实施例12

高密度餐具洗涤剂

此实施例提供各种高密度餐具洗涤剂配方。本发明的以下浓缩高密度餐具洗涤剂提供于下文。在每个这些配方中，以约0.0001wt％至约10wt％的浓度包括至少一种本文提供的蛋白酶变体。在一些替代的实施方式中，配制者可以根据他们的需要使用其他浓度。

^＊增白剂/染料/SRP1/羧甲基纤维素钠/光漂白剂/MgSO₄/PVPVI/抑泡剂/高分子PEG/粘土。

实施例12(I)至(VI)的pH是约9.6至约11.3。

实施例13

片剂洗涤剂组合物

此实施例提供各种片剂洗涤剂配方。本发明的以下片剂洗涤剂组合物是通过使用标准12头轮转印刷机(rotary press)在13KN/cm2压力下压缩粒状餐具洗涤剂组合物制备的。在每个这些配方中，以约0.0001wt％至约10wt％的浓度包括至少一种本文提供的蛋白酶变体。在一些替代的实施方式中，配制者可以根据他们的需要使用其他浓度。

^＊增白剂/SRP1/羧甲基纤维素钠/光漂白剂/MgSO₄/PVPVI/抑泡剂/高分子PEG/粘土。

实施例13(I)至13(VII)的pH是约10至约11.5；13(VIII)的pH是8-10。实施例13(I)至13(VIII)的片剂重量约20克至约30克。

实施例14

液体硬表面清洁洗涤剂

此实施例提供各种液体硬表面清洁洗涤剂配方。本发明的以下液体硬表面清洁洗涤剂组合物提供于下文。在每个这些配方中，以约0.0001wt％至约10wt％的浓度包括至少一种本文提供的蛋白酶变体。在一些替代的实施方式中，配制者可以根据他们的需要使用其他浓度。

实施例14(I)至(VII)的pH是约7.4至约9.5。

本说明书中提及的所有专利和出版物是对本发明所属技术领域的技术人员水平的描述。本领域技术人员容易了解本发明容易适合于实现本发明的目的，并达到提及的终点和优势，以及其中所固有的优势。此处描述的组合物和方法是优选实施方式的代表，是示例性的，而且并不意味着对本发明范围的限制。可以对此处公开的本发明改变取代和修饰而不背离本发明的范围和精神对于本领域技术人员是容易而且明显的。

此处阐述的本发明可在缺乏未在此处具体公开的任何元件、限制的条件下实施。已经使用的术语和表述用作描述的术语而不是限制性术语，在使用这些术语和表述时没有任何意图是要排除任何其所表示或描述的特征的等同物或其部分，应理解的是各种改变在本发明要求保护的范围内是可能的。所以，应理解，虽然已经通过优选的实施方式和可选的特征具体公开了本发明，此处公开的概念的改变和修改可以被本领域技术人员所使用，这种改变或修改应认为落入此处限定的本发明的范围内。

本发明已在本文中进行了广泛和一般性地描述。落在该上位描述中的每一个较窄的下位和次上位概念也形成本发明的一部分。这包括带有从中去除任何主题的条件或负面限制的本发明的上位描述，无论该去除的主题是否在本文中曾有过具体述及。

Claims

1.一种枯草蛋白酶变体，包含SEQ ID NO：5所列的氨基酸序列。

2.一种组合物，包含权利要求1所述的枯草蛋白酶变体。

3.如权利要求2所述的组合物，其中所述组合物是清洁组合物。

4.如权利要求3所述的清洁组合物，其中所述组合物是衣物洗涤剂。

5.如权利要求3所述的清洁组合物，其中所述组合物是餐具洗涤剂。

6.如权利要求5所述的餐具洗涤剂，其中所述餐具洗涤剂是自动机洗餐具洗涤剂。

7.如权利要求3所述的清洁组合物，其中所述组合物是液体洗涤剂。

8.如权利要求3所述的清洁组合物，其中所述组合物是凝胶、片剂、粉末或粒状洗涤剂。

9.如权利要求3所述的清洁组合物，其中所述组合物不含磷酸盐。

10.如权利要求3-9中任一项所述的清洁组合物，还包含至少一种漂白剂。

11.如权利要求3-10中任一项所述的清洁组合物，还包含至少一种其它的酶。

12.如权利要求11所述的清洁组合物，其中所述至少一种其它的酶选自半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、金属蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过氧水解酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂合酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶，或其混合物。

13.一种清洁的方法，包括：提供待清洁的物品和包含SEQ ID NO：5所列的枯草蛋白酶变体的组合物，和将所述物品与所述组合物接触。

14.如权利要求13所述的方法，还包括漂洗所述待清洁的物品的步骤。

15.如权利要求13-14中任一项所述的方法，其中所述物品是餐具或织物物品。