CN102260703B - 提高植物非生物胁迫耐受性和/或生物量的方法以及因此产生的植物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及提高植物非生物胁迫耐受性和/或生物量的方法以及因此产生的植物。提供了多核苷酸序列和使用其提高植物对非生物胁迫的耐受性和/或提高植物生物量，活力和/或产量的方法。

Description

提高植物非生物胁迫耐受性和/或生物量的方法以及因此产生的植物
本申请是申请日为2006年8月15日、申请号为200680038391.X、发明名称为“提高植物非生物胁迫耐受性和/或生物量的方法以及因此产生的植物”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及提高植物中非生物胁迫耐受性和/或生物量的方法，更特别地，涉及表达外源非生物胁迫耐受性基因的植物。
背景技术
非生物胁迫(也称为“环境胁迫”)条件，如盐度，干旱，洪水，次佳温度和有毒化学物质污染，对农业植物引起实质性的损害。大部分植物已经进化出策略来保护它们自身以对抗这些条件。然而，如果胁迫条件的严重程度和持续时间太大，对大多数作物的植物发育，生长和产量的影响是意味深长的。此外，大部分植物对非生物胁迫(ABS)非常敏感，并因此需要用于商业作物产量的最佳生长条件。连续暴露于胁迫引起植物代谢的主要改变，其最终导致细胞死亡，并且随后产量损失。因此，尽管大范围的研究以及使用复杂而深入的作物-保护方法，由于非生物胁迫条件引起的损失每年仍然为数十亿美元(1，2)。
以下概述了示例性非生物胁迫条件的含义。
与干旱相关的问题。干旱是一段时间的异常干燥天气，持续足够长的时间以致产生了严重的水文不平衡(例如，作物损害，给水短缺等)。而我们经历的大部分天气是短暂的，干旱是更渐进的现象，缓慢占有区域和拉紧对时间的控制。在严重的情况中，干旱可以持续很多年并对农业和水供给具有毁灭性的影响。随着发展中的人口和可用新鲜水的慢性短缺，干旱不仅是农业中天气相关问题的数字，而且还列为全部时间的主要自然灾难之一，不仅引起经济损失，而且引起人类生命的失去。例如，由1988年的US干旱引起的损失超过$400亿元，超过1992年飓风安德鲁，1993年的密西西比河洪水和1989年的旧金山地震引起的损失。在世界的一些区域，干旱的情况更严重。在非洲的Horn，1984-1985年的干旱导致饥荒，使750,000人死亡。
对于植物由低的水可用性引起的问题包括由细胞水分离引起的机械应力。干旱还使植物变得更易患上各种疾病(Simpson(1981)“TheValue of Physiological Knowledge of Water Stress in Plants”(植物中水应力的生理知识的价值)(Simpson，G.M.编辑)，Praeger，N.Y.pp.235-265)。
除了对大部分否则全部作物太干旱的世界许多陆地区域，可用水的过度使用和过度利用导致农业可用陆地的日益减少，该过程达到极端将导致沙漠化。土壤中日益增加的盐累积进一步使问题复杂化，如上所述，这增加了土壤中可用水的损失。
与高盐水平相关的问题。五分之一公顷的灌溉地受到盐的损害，古代耕地社会群落下降的一个重要历史因素。预期这种情况只会恶化，进一步降低可耕地的可用性和作物生产，因为最常见的五种粮食作物(小麦，玉米，水稻，土豆和大豆)中没有一种可以耐受过度的盐。
盐对植物的有害影响是导致渗透应力(与干旱胁迫相似)的缺水的结果和过量钠离子对关键生化过程的影响。与冰冻和干旱相同，高盐导致缺水；高盐的存在使植物根部难以从其环境吸取水(Buchanan等(2000)在Biochemi stry and Molecular Biology of Plants中，AmericanSociety of Plant Physiologists，Rockville，Md.)。因此土壤盐度是决定哪里植物可以茁壮成长的多个重要变量之一。在世界的许多部分，由于天然的高土壤盐度，相当大的土地区域是无法耕作的。为了使该问题更复杂，用于农业生产的土壤的盐化是主要依赖于农业的区域中的重要且日益增加的问题。过度利用，过度施肥和水短缺使后者复杂化，通常由气候改变和递增人口的需求引起。盐耐受性在植物生命周期的早期特别重要，因为从土壤表面的蒸发引起向上的水移动，并且盐累积在放置种子的上层土壤中。因此，发芽通常发生在比整个土壤分布中平均盐水平高得多的盐浓度。
与过度热相关的问题。许多作物的发芽对温度非常敏感。提高热条件中发芽的基因对于种植于季节后期或热气候中的作物是有用的。当蒸腾作用不足以克服热应力时，暴露于过度热的秧苗和成熟植物可能经历热休克，其发生于各种器官中，包括叶子，特别是果实。热还损害细胞结构，包括细胞器和细胞骨架，并损害膜功能[Buchanan等，(2000)在Biochemistry and Molecular Biology of Plants中，AmericanSociety of Plant Physiologists，Rockville，Md.]。热休克可以产生全部蛋白合成的降低，伴随热休克蛋白的表达。热休克蛋白作为伴侣蛋白并涉及热变性的重折叠蛋白。
热应力通常伴随低的水可用性的条件。将热自身看作相关的应力并增加由缺水条件引起的有害影响。蒸发的需求随着白天温度的提高呈现出接近指数增加，并可以导致高的蒸腾速度和低的植物水势[Hall等(2000)Plant Physiol.123：1449-1458]。对花粉的高温损害几乎通常结合干旱胁迫发生，很少在充分灌水的条件下发生。因此，分离热和干旱胁迫对授粉的影响是困难的。结合的应力可以以新的方式改变植物代谢；因此理解不同应力之间的相互作用对于通过遗传操作提高应力耐受性的策略研发是重要的。
与过度激冷条件相关的问题。术语“激冷敏感性”用来描述在低温但是高于冷冻温度产生的许多类型的生理损害。大部分热带来源的作物，如大豆，水稻，玉米和棉花，容易受到激冷的损害。典型的致冷损害包括萎蔫，坏死，萎黄或从细胞膜渗出离子。还没有完全理解激冷敏感性的基础机理，但是可能涉及膜饱和度的水平和其他生理缺陷。例如，光合作用的光抑制(由于高的光强度引起的光合作用的破坏)通常发生在晚夏/秋夜冷之后的晴朗天气条件下。例如，激冷可以通过玉米延迟的成熟导致产量损失和降低产品质量。生长差的另一个后果是春天玉米地相当差的植被，通常导致水土流失，提高的杂草丛生和降低的营养吸收。矿物质氮延迟的吸收还可能导致提高的硝酸盐流失至地下水中。通过一些估算，激冷占美国(US)的金钱损失只在干旱和洪水之后。
缺水是许多植物胁迫的常见组成部分。当整个植物的蒸腾作用速度超过水吸收时，植物细胞中发生缺水。除了干旱，其他胁迫，如盐度和低温，产生细胞脱水(McCue和Hanson(1990)Trends Biotechnol.8：358-362)。
盐和干旱胁迫信号传导由离子和渗透体内平衡信号途径构成。盐应力的离子方面通过SOS途径来发出信号，在该途径中钙-应答性SOS3-SOS2蛋白激酶复合物控制离子转运者SOS1的表达和活性。Xiong和Zhu(2002)Plant Cell Environ.25：131-139最近综述了调节应答盐胁迫的离子体内平衡的途径。
盐胁迫的渗透组成部分涉及与干旱和/或冷应力应答重叠的复杂植物反应。
Xiong和Zhu(2002)上文最近综述了干旱、冷和盐胁迫应答的常见特征。这些包括：
(a)在信号情况非常早的时候细胞质钙水平的瞬时改变(Knight，(2000)Int.Rev.Cytol.195：269-324；Sanders等(1999)Plant Cell11：691-706)；
(b)通过促细胞分裂剂激活的和/或钙依赖性蛋白激酶(CDPK；参见Xiong等，2002)和蛋白磷酸酶(Merlot等(2001)Plant J.25：295-303；Tahtiharju和Palva(2001)Plant J.26：461-470)的信号传导；
(c)应答应力的脱落酸水平的提高，该应力引发应答的子集(Xiong等(2002)上文，并在此参考)；
(d)作为信号分子的肌醇磷酸酶(至少对于应力应答性转录改变的子集(Xiong等(2001)Genes Dev.15：1971-1984)；
(e)磷酸脂酶的激活，其随后产生不同阵列的第二信使分子，其中一些可能调节应力应答性激酶的活性(ABA独立性途径中的磷酸脂酶D功能，Frank等(2000)Plant Cell12：111-124；[0026]
(f)胚胎发育后期丰富(LEA)型基因的诱导，包括CRT/DRE应答性COR/RD基因(Xiong和Zhu(2002)上文)；
(g)提高的抗氧化剂和相容性渗透调节物质如脯氨酸和可溶性糖的水平(Hasegawa等(2000)Annu.Rev.Plant.Mol.Plant.Physiol.51：463-499)；和[0028]
(h)活性氧物质如过氧化物，过氧化氢和羟基自由基的累积(Hasegawa等(2000)上文)。
脱落酸生物合成在多个步骤受到渗透胁迫的调节。ABA-依赖性和-独立性渗透胁迫信号首先在组成上修饰表达的转录因子，导致早期应答转录激活剂的表达，其然后激活下游胁迫耐受性效应基因。
基于冷，干旱和盐胁迫应答的许多特征的共同性，可以推断提高对冷或盐胁迫耐受性的基因也可以提高干旱胁迫保护。实际上，对于转录因子(在AtCBF/DRB1的情况中)和其他基因如OsCDPK7(Saijo等(2000)Plant J.23：319-327)或AVP1(液泡焦磷酸酶-质子-泵，Gaxiola等(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA98：11444-11449)已经证明了这种情况。
产生耐胁迫植物是一种策略，其具有解决或调节这些问题中至少一些的潜能。然而，用来产生呈现出耐ABS的新植物系的传统植物育种策略相对无效，因为它们是冗长而费时的，且结果是不可预测的。此外，用于耐胁迫的有限种质来源和关系远的植物物种之间的杂交不相容性代表了常规育种中遇到的显著问题。此外，导致ABS耐受性的细胞过程在性质上是复杂的并涉及细胞适应的多个机理和各种代谢途径(4-7)。
现有技术中已经描述了针对给予转基因作物非生物胁迫耐受性的遗传工程尝试。Apse和Blumwald(Curr Opin Biotechnol.13：146-150，2002)，Quesada等(Plant Physiol.130：951-963，2002)，Holmstrom等(Nature379：683-684，1996)，Xu等(Plant Physiol110：249-257，1996)，Pilon-Smits和Ebskamp(Plant Physiol107：125-130，1995)和Tarczynski等(Science259：508-510，1993)的研究都尝试了产生耐胁迫植物。
此外，几个U.S.专利和专利申请还描述了与耐胁迫相关的多核苷酸及其在产生耐胁迫植物中的用途。U.S.专利No.5,296,462和5,356,816描述了用编码拟南芥(Arabidopsis thaliana)冷适应中涉及的蛋白质的多核苷酸转化植物，因此促进转化植物中的耐冷性。
U.S.专利No.6,670,528描述了用编码结合胁迫应答性序列的多肽的多核苷酸转化植物，因此促进转化的植物对非生物胁迫的耐受性。
U.S.专利No.6,720,477描述了用编码信号转导胁迫相关蛋白的多核苷酸转化植物，能够提高转化的植物对非生物胁迫的耐受性。
U.S.申请系列No.09/938842和10/342224描述了非生物胁迫相关的基因及其给予植物对非生物胁迫耐受性的用途。
U.S.申请系列No.10/231035描述了植物中钼辅因子硫化酶的超表达，因此提高它们对非生物胁迫的耐受性。
尽管上述研究在产生耐胁迫植物中至少部分是成功的，但仍然需要可以用来产生耐各种非生物胁迫条件的植物的耐胁迫基因。
同时简化本发明来实践，本发明人已经通过生物信息和实验室研究鉴定了几个新的非生物胁迫耐受性基因，其可以用来提高植物对非生物胁迫的耐受性和/或生物量，活力和产量。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供了提高植物对非生物胁迫的耐受性的方法，所述方法包括在植物内表达编码多肽的外源多核苷酸，该多肽具有与SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，13-56，58-63，66-121，141-156或157至少90％同源的氨基酸序列，因此提高植物对非生物胁迫的耐受性。
根据所述优选实施方案中的再一特征，非生物胁迫选自盐度，缺水，低温，高温，重金属毒性，缺氧，营养不足，营养过剩，大气污染和UV照射。
根据本发明的另一个方面，提供了提高植物生物量，活力和/或产量的方法，所述方法包括在植物内表达编码多肽的外源多核苷酸，该多肽具有与SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，13-56，58-63，66-121，141-156或157至少90％同源的氨基酸序列，因此提高植物的生物量，活力和/或产量。
根据所述优选实施方案中的再一特征，通过以下来实现表达：
(a)用外源多核苷酸转化植物的细胞；
(b)从细胞产生成熟植物；和
(c)在适于在成熟植物内表达外源多核苷酸的条件下栽培成熟植物。
根据所述优选实施方案中的再一特征，通过将核酸构建体引入植物细胞中来实现转化，核酸构建体包括外源多核苷酸和至少一个能够指导外源多核苷酸在植物细胞中转录的启动子。
根据本发明的再一方面，提供了核酸构建体，其包括与选自SEQ IDNO：1，3，5，7，9，11，158，159，160，161，162-204，206-211，214-287的核苷酸序列至少90％相同的核酸序列和能够指导核酸序列在宿主细胞中转录的启动子。
根据所述优选实施方案中的再一特征，启动子是组成型启动子。
根据所述优选实施方案中的再一特征，组成型启动子是CaMV35S启动子。
根据所述优选实施方案中的再一特征，组成型启动子是At6669启动子。
根据所述优选实施方案中的再一特征，启动子是诱导型启动子。
根据所述优选实施方案中的再一特征，诱导型启动子是非生物胁迫可诱导启动子。
根据所述优选实施方案中的再一特征，宿主细胞是植物细胞。
根据所述优选实施方案中的再一特征，植物细胞形成双子叶植物细胞的一部分。
根据所述优选实施方案中的再一特征，植物细胞形成单子叶植物细胞的一部分。
根据本发明的再一方面，提供了分离的多肽，其包括与由选自SEQID NO：1，3，5，7，9，11，158，159，160，161，162-204，206-211，214-287的多核苷酸编码的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列。
根据所述优选实施方案的再一特征，氨基酸序列与SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，13-56，58-63，66-121，141-156或157至少90％同源。
根据本发明的其他方面，提供了包括编码多肽的外源多核苷酸的植物细胞，该多肽具有与SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，13-56，58-63，66-121，141-156或157至少90％同源的氨基酸序列，因此提高植物对非生物胁迫的耐受性。
根据所述优选实施方案的再一特征，植物细胞形成植物的一部分。
通过提供利用新的耐非生物胁迫基因来提高植物对非生物胁迫的耐受性和/或生物量的方法，本发明成功地解决了目前已知构造的缺点。
除非另外限定，在此使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同意思。尽管与在此所述的那些相似或等价的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但以下描述了合适的方法和材料。在冲突的情况中，以专利说明书，包括定义为准。此外，材料，方法和实施例只是说明性的并不是用来限制。
附图说明
在此参照附图说明了本发明，但只是举例来说。现在详细地参照附图，其强调了所示的特定内容是举例说明并只是用于本发明优选实施方案的说明性讨论的目的，并且是为了提供认为是本发明的原理和概念方面的最有用和容易理解的描述而呈现的。在这点上，没有进行尝试来显示比本发明基础性理解更详细的本发明的结构细节，对附图进行的描述使本领域技术人员更清楚本发明的几个形式在实践中怎样具体进行。
图1是用来测量植物大小的方法简图。使用均匀的光照度和设定恒定距离的三脚架来拍取数码照片。使用“基于绿色的”滤器处理获得的数码照片，该滤器除去照片的“非绿色部分”，只留下用于定量的植物玫瑰花结区域。玫瑰花结区域定量后，将结果输出至表格处理软件并使用统计软件来分析。
图2A-B是给予非生物胁迫耐受性基因(SEQ ID158)的代表性结果，该耐受性是根据本发明的教导未揭示的。图2A-将在非胁迫条件下生长7-10天的植物转移至高渗压剂条件并使用数码成像追踪它们的生长12天。显示了在第0天，第5天和第12天拍取的照片的处理过的图像。注意每个平板上部中心中的对照植物和对照植物周围的独立转基因情况。图2B是描述了随时间函数的植物生长面积的图，使用图A中所示的图像。所示五个情况中的四个在相同条件下比野生型对照植物显著生长得快。结果的统计学分析显示于以下的表5中1-5行。
具体实施方式
本发明是通过利用新的非生物胁迫耐受性基因提高植物对非生物胁迫的耐受性和/或生物量的方法以及呈现出提高的耐胁迫条件和/或提高的累积生物量能力的植物。
参照附图和附带的描述可以更好地理解本发明的原理和操作。
在详细地解释本发明的至少一个实施方案之前，理解本发明不限于对以下描述中列出的或附图中说明的构建体和成分排列的详细内容的应用。本发明能够是其他实施方案或以各种方式实施或进行。此外，理解在此所用的措辞和术语是用于描述的目的并且不应当认为是限制。
同时简化本发明来实践，本发明人同时使用生物信息技术，鉴定了编码推定的非生物胁迫耐受性(ABST)蛋白的多核苷酸序列(实施例1)。分离选定的序列(实施例2)，克隆至表达载体中(实施例3-4)并引入拟南芥植物中(实施例5-6)。将这些植物生长于盐度胁迫条件下，或正常条件下，并检测与没有携带外源ABST基因的相似对照植物相比较提高的生物量。如从实施例8中所示的结果可明显看出的，根据本发明的教导选择的核酸序列显示出与对照植物相比较能提高用其转染的转基因植物对非生物胁迫的耐受性。
因此，根据本发明的一个方面，提供了提高植物对非生物胁迫的耐受性和/或植物生物量的方法。该方法包括在植物内表达编码多肽的外源多核苷酸，该多肽具有与SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，13-56，58-63，66-121，141-156或157至少90％同源的氨基酸序列。
根据本发明这方面的一个优选实施方案，所示的分离多核苷酸是SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11，158，159，160，161，162-204，206-211，214-287。
或者，本发明的外源多核苷酸编码具有如下进一步所述的氨基酸序列的多肽。与选自SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，13-56，58-63，66-121，141-156或157的氨基酸序列至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约81％，至少约82％，至少约83％，至少约84％，至少约85％，至少约86％，至少约87％，至少约88％，至少约89％，至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，或更高即100％同源。
在此所用的短语“非生物胁迫”指的是对植物的代谢，生长，再生和/或生活力的任何不利影响。因此，可以通过次佳环境生长条件，例如，盐度，缺水，洪水，冷冻，低或高温，重金属毒性，缺氧，营养不足，大气污染或UV照射，来诱导非生物胁迫。在背景部分中讨论了非生物胁迫的意义。
如在此所用的短语“非生物胁迫耐受性”指的是植物承受非生物胁迫而代谢，生长，生产力和/或生活力没有遭受实质性改变的能力。优选，本发明的遗传工程化植物呈现出比非转基因植物至少高约2％，高5％，高10％，高20％，高30％，高40％，高50％，高60％，高70％，高80％，高90％或甚至更高的耐受性。
如在此所用的，术语“外源多核苷酸”指的是不是在植物内天然表达的但以稳定或瞬时的方式引入植物中时产生至少一个多肽产物的核酸序列。
可以使用任何同源性比较软件测定同源性(例如，百分比同源性)，软件包括例如国立生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件，如使用缺省参数。
可以使用任何同源性比较软件测定同一性(例如，百分比同源性)，软件包括例如国立生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件，如使用缺省参数。
本发明的多核苷酸指的是分离的单链或双链核酸序列，并以RNA序列，互补多核苷酸序列(cDNA)，基因组多核苷酸序列和/或复合的多核苷酸序列(例如，以上的组合)的形式提供。
如在此所用的，短语“互补多核苷酸序列”指的是使用逆转录酶或任何其他RNA依赖性DNA聚合酶从信使RNA的逆转录产生的序列。随后可以使用DNA依赖性DNA聚合酶在体内或在体外扩增这样序列。
如在此所用的，短语“基因组多核苷酸序列”指的是源自(分离自)染色体的序列，并因此表示染色体的邻接部分。
如在此所用的，短语“复合的多核苷酸序列”指的是至少部分互补和至少部分基因组的序列。复合序列可以包括编码本发明的多肽需要的一些外显子序列，以及插入其中的一些内含子序列。内含子序列可以是任何来源的，包括其他基因，通常将包括保守的剪接信号序列。这样的内含子序列可以进一步包括顺式作用的表达调控序列。
可以将本发明多核苷酸的核酸序列最佳化来用于表达。在SEQ IDNO：158，159，160和161中提供了这样的最佳化序列。这样序列修饰的实例包括，但不限于，改变G/C含量至更接近目标植物物种中通常发现的，和除去通常在植物物种中发现的密码子，通常称为密码子最佳化。
短语“密码子最佳化”指的是选择合适的DNA核苷酸用于接近目标植物内密码子使用的结构基因或其片段内。因此，最佳化的基因或核酸序列指的是为了利用植物内统计学上优选或统计学上偏好的密码子已经将其中天然或天然产生的基因的核苷酸序列进行了修饰的基因。通常在DNA水平检测核苷酸序列并使用合适的方法测定植物物种中为了表达最佳化的编码片段，这些方法如Sardana等(1996，Plant CellReports15：677-681)中所述的。在该方法中，可以计算密码子使用的标准偏差，密码子偏好的一种测量，首先发现天然基因每个密码子的使用相对于高表达的植物基因的比例方差，接着计算均方差。所用的公式是：1SDCU＝n＝1N[(Xn-Yn)/Yn]2/N，其中Xn指的是高表达植物基因中的密码子使用频率n，其中Yn指的是目标基因中的密码子使用频率n，N指的是目标基因中的密码子总数。使用Murray等的数据(1989，Nuc Acid Res.17：477-498)编辑了双子叶植物的高表达基因的密码子使用表。
根据特定植物细胞类型的优选密码子使用最佳化核酸序列的一种方法是基于密码子最佳化表的直接使用，没有进行任何额外的统计学计算，密码子最佳化表如通过日本的NIAS(农业生物科学研究所)DNA库在密码子使用数据库在线提供的那些(http：//www.kazusa.or.jp/condon/)。密码子使用数据库含有用于各种不同物种的密码子使用表，已经基于Genbank中呈现的数据库在统计学上测定了每个密码子使用表。
使用以上的表来测定特定物种(例如，水稻)中每个氨基酸的最优选或最偏好的密码子，编码目标蛋白的天然产生的核苷酸序列对于该特定植物物种是密码子最佳化的。用关于氨基酸在统计学上更偏好的相应密码子替代特定物种基因组中具有低统计学发生率的密码子来实现这。然而，可以选择一个或多个不太偏好的密码子来删除现有的限制位点，以在潜在有用的连接处形成新的限制位点(5’和3’端至添加信号肽或终止盒，可以用来切割或剪接片段来产生正确的全长序列的内部位点)，或消除负面影响mRNA稳定性或表达的核苷酸序列。
在任何修饰之前，天然产生的编码核苷酸序列可能已经含有多个对应于特定植物物种中统计学上偏好的密码子。因此，天然核苷酸序列的密码子最佳化可以包括测定天然核苷酸序列内哪个密码子对于特定的植物不是统计学上偏好的，并根据特定植物的密码子使用表改变这些密码子来产生密码子最佳化的衍生物。改变的核苷酸序列对于植物密码子使用可以是全部或部分最佳化的，只要以高于相应天然产生的或天然的基因编码的蛋白质的水平产生由改变的核苷酸序列编码的蛋白质。通过改变密码子使用构建合成基因描述于例如PCT专利申请93/07278中。
因此，本发明包括以上所述的核酸序列；其片段，与其杂交的序列，与其同源的序列，编码具有不同密码子使用的相似多肽的序列，特征在于突变的改变序列，突变如一个或多个核苷酸的删除，插入或置换，天然产生的或人工诱导的，随机或以有目标的方式。
上述的多核苷酸还编码之前未表征过的多肽。
因此，本发明提供了具有如下进一步所述的氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，13-56，58-63，66-121，141-156或157的氨基酸序列至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约81％，至少约82％，至少约83％，至少约84％，至少约85％，至少约86％，至少约87％，至少约88％，至少约89％，至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，或更高即100％同源。
本发明还包括上述多肽和具有突变的多肽的片段，突变如一个或多个氨基酸的删除，插入或置换，天然产生的或人工诱导的，随机或以有目标的方式。
使用本发明方法的合适植物可以是任何单子叶或双子叶植物，包括但不限于，玉米，小麦，大麦，黑麦，燕麦，水稻，大豆，花生，豌豆，扁豆和苜蓿，棉花，油菜，双低油菜(canola)，胡椒，向日葵，土豆，烟草，番茄，茄子，桉树，乔木，观赏植物，多年生禾草和饲料作物。
可以通过用外源多核苷酸转化一个或多个植物细胞，接着从转化的细胞产生成熟的植物并在适于在成熟植物内表达外源多核苷酸的条件下栽培成熟植物来实现在植物内表达本发明的外源多核苷酸。
优选，通过将核酸构建体引入植物细胞中来实现转化，该构建体包括本发明的外源多核苷酸和至少一个能够指导外源多核苷酸在植物细胞中转录的启动子。下文中提供了合适的转化方法的更详细内容。
如在此所用的，术语“启动子”指的是位于基因转录启动位点上游的DNA片段，RNA聚合酶结合该转录启动位点来启动RNA的转录。启动子控制在哪里(例如，植物的哪个部分，动物内的哪个器官等)和/或在什么时候(例如，生物体生命周期中的哪个阶段或条件)来表达基因。
可以通过本发明的核酸构建体来使用任何合适的启动子序列。优选，启动子是组成型启动子，组织特异性的，或非生物胁迫-可诱导的启动子。
合适的组成型启动子包括，例如，CaMV35S启动子(SEQ ID NO：122；Odell等，Nature313：810-812，1985)；拟南芥At6669启动子(SEQID NO：123；专利No WO2004/104162)；玉米Ubi1(Christensen等，Plant Sol.Biol.18：675-689，1992)；水稻肌动蛋白(McElroy等，PlantCell2：163-171，1990)；pRMU(Last等，Theor.Appl.Genet.81：581-588，1991)；和Synthetic Super MAS(Ni等，The Plant Journal7：661-76，1995)。其它组成型启动子包括U.S.专利No.5,659,026，5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；和5,608,142。
合适的组织特异性启动子包括，但不限于，叶子特异性启动子，如例如以下所述的，Yamamoto等，Plant J.12：255-265，1997；Kwon等，Plant Physiol.105：357-67，1994；Yamamoto等，Plant Cell Physiol.35：773-778，1994；Gotor等，Plant J.3：509-18，1993；Orozco等，Plant Mol.Biol.23：1129-1138，1993；和Matsuoka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：9586-9590，1993。
合适的非生物胁迫可诱导启动子包括，但不限于，盐可诱导的启动子，如RD29A(Yamaguchi-Shinozalei等，Mol.Gen.Genet.236：331-340，1993)；干旱可诱导启动子，如玉米rab17基因启动子(Pla等，Plant Mol.Biol.21：259-266，1993)，玉米rab28基因启动子(Busk等，Plant J.11：1285-1295，1999)；和玉米Ivr2基因启动子(Pelleschi等，Plant Mol.Biol.39：373-380，1999)；和热可诱导的启动子，如来自番茄的热番茄hsp80-启动子(U.S.专利No.5，187,267)。
本发明的核酸构建体优选进一步包括合适的选择标记和/或复制起点。优选，所用的核酸构建体是穿梭载体，其可以在大肠杆菌(E.coli)(其中构建体包括合适的选择标记和复制起点)中繁殖，并与细胞中的繁殖相容。根据本发明的构建体可以是，例如，质粒，bacmid，噬粒，粘粒，噬菌体，病毒或人造染色体。
可以使用本发明的核酸构建体来稳定或瞬时转化植物细胞。在稳定转化中，将本发明的外源多核苷酸整合至植物基因组中，因此表示稳定且遗传的特征。在瞬时转化中，通过转化的细胞表达外源多核苷酸，但是没有整合至基因组中，因此表示瞬时的特征。
存在多种将外源基因引入单子叶和双子叶植物中的方法(Potrykus，I.，Annu.Rev.Plant.Physiol.，Plant.Mol.Biol.(1991)42：205-225；Shimamoto等，Nature(1989)338：274-276)。
使外源DNA稳定整合至植物基因组DNA中的原理方法包括两个主要的手段：
(i)农杆菌(Agrobacterium)介导的基因转移：Klee等(1987)Annu.Rev.Plant.Physiol.38：467-486；Klee和Rogers，在Cell Cultureand Somatic Cell Genetics ofPlant(植物的细胞培养和体细胞遗传学)，Vol.6，Molecular Biology of Plant Nuclear Genes(植物核基因的分子生物学)，编辑Schell，J.，和Vasil，L.K.，Academic Publishers，San Diego，Calif.(1989)p.2-25；Gatenby，在Plant Biotechnology(植物生物技术)，编辑Kung，S.和Arntzen，C.J.，Butterworth Publishers，Boston，Mass(1989)p.93-112。
(ii)直接DNA吸收：Paszkowski等，在Cell Culture and SomaticCell Genetics of Plants(植物的细胞培养和体细胞遗传学)，Vol.6，Molecular Biology of Plant Nuclear Genes(植物核基因的分子生物学)，编辑Schell，J.，和Vasil，L.K.，Academic Publishers，San Diego，Calif.(1989)p.52-68；包括DNA直接吸收至原生质体中的方法，Toriyama，K.等(1988)Bio/Technology6：1072-1074。通过植物细胞的简短电轰击诱导的DNA吸收：Zhang等，Plant Cell Rep.(1988)7：739-384。Fromm等，Nature(1986)319：791-793。通过颗粒轰击将DNA注射至植物细胞或组织中，Klein等，Bio/Technology(1988)6：559-563；McCade等，Bio/Technology(1988)6：923-926；Sanford，Physiol.Plant.(1990)79：206-209；使用微量吸移管系统：Neuhaus等，Theor.Appl.Genet.(1987)75：30-36；Neuhaus和Spangenberg，Physiol.Plant.(1990)79：213-217；细胞培养物，胚胎或愈伤组织的玻璃纤维或碳化硅晶须转化，U.S.专利No.5464765或用发芽的花粉直接孵育DNA，DeWet等，在Experimental Manipulation of Ovule Tissue(胚珠组织的实验操作)，编辑Chapman，G.P.和Mantell，S.H.和Daniels，W.Longman，London(1985)p.197-209；和Ohta，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83：715-719。
农杆菌系统包括使用质粒载体，该载体含有整合至植物基因组DNA中的限定DNA片段。接种植物组织的方法根据植物物种和农杆菌传送系统而不同。广泛使用的方法是叶圆盘方法，可以使用提供启动整个植物分化良好来源的任何组织外植体来进行该方法。Horsch等，在Plant Molecular Biology Manual A5(植物分子生物学手册A5)，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht(1988)p.1-9。补充方法使用农杆菌传送系统结合真空侵入。农杆菌系统在转基因双子叶植物的形成中特别可行。
存在多种将DNA直接转移至植物细胞中的方法。在电穿孔中，将原生质体简短暴露于强烈的电场。在微注射中，使用非常小的微量吸移管将DNA直接机械注射至细胞中。在微粒轰击中，将DNA吸收在微粒上，如硫酸镁晶体或钨颗粒，并将微粒在物理上加速至细胞或植物组织中。
稳定转染后，实施植物繁殖。植物繁殖的最常见方法是通过播种。然而，通过种子繁殖的再生具有由于杂合性引起的缺陷，作物缺少均一性，因为种子是由根据孟德尔规律控制的遗传方差的植物产生的。基本上，每个种子在遗传上是不同的，并且每个将具有其自身特定的性状而生长。因此，优选可以产生转化的植物，使得再生的植物具有相同的性状和亲本转基因植物的特征。因此，优选可以通过提供转化植物快速，一致再生的微繁殖来再生转化的植物。
微繁殖是从已经从选定的亲本植物或栽培植物切除的单片组织生长新一代植物的过程。该过程允许具有表达融合蛋白的优选组织的植物大量繁殖。产生的新一代植物在遗传上与最初的植物相同，并具有最初植物的全部特征。微繁殖允许优质植物材料在短期内大量产生并使选定的栽培植物快速繁殖并保持最初转基因或转化植物的特征。克隆植物的优势是植物繁殖的速度以及所产生的植物的质量和均一性。
微繁殖是需要在阶段中间改变培养基或生长条件的多步骤方法。因此，微繁殖方法涉及四个基本的阶段：阶段一，最初的组织培养；阶段二，组织培养繁殖；阶段三，分化和植物形成；和阶段四，温室培养和加固。在阶段一的过程中，最初的组织培养，建立组织培养并证实是无污染的。在阶段二的过程中，繁殖最初的组织培养直至产生足量的组织样品来满足生产目的。在阶段三的过程中，分裂在阶段二中生长的组织样品并生长成单个的植物幼苗。在阶段四，将转化的植物幼苗转移至用于固化的温室，在那里逐渐提高植物对光的耐受性，使得可以将其生长于自然环境中。
优选，进一步选择如上所述产生的成熟转化植物的非生物胁迫耐受性。因此，将转化和非转化的(野生型)植物暴露于非生物胁迫条件，如缺水，次佳温度，营养不足，或优选盐胁迫条件。可以以各种方式来实现盐胁迫，如例如，用高渗溶液灌溉植物，在高渗生长溶液(例如，Hoagland溶液)中通过水栽来栽培植物，或在高渗生长培养基(例如，MS培养基)中培养植物。因为不同的植物对盐度的耐受性非常不同，因此优选根据特定植物栽培品种或变种的特定特征来调节灌溉水，生长溶液或生常培养基中的盐浓度，使得对植物的生理和/或形态产生温和或适度的影响(关于合适浓度的指导请参见，Bernstein和Kafkafi，Root Growth Under Salinity Stress(盐度胁迫下的根部生长)，在：Plants Roots，The Hidden Half(植物根部，隐藏的一半)，第3版，Waisel Y，Eshel A和Kafkafi U(编辑)，Marcel Dekker Inc.，New York，2002，和其中的参考文献)。暴露于胁迫条件后，经常监控植物直至野生型植物中出现实质性的生理和/或形态影响。随后，将没有呈现出实质性生理和/或形态影响的转化植物或呈现出生物量高于野生型植物的转化植物鉴定为非生物胁迫耐受性植物。
尽管目前优选稳定的转化，但本发明也设想了叶细胞，分生细胞或完整植物的瞬时转化。
可以通过上述的任一种直接DNA转移方法或使用修饰的植物病毒的病毒感染来实现瞬时转化。
已经显示出对植物宿主的转化有用的病毒包括CaMV，TMV和BV。使用植物病毒的植物转化描述于U.S.专利No.4,855,237(BGV)，EP-A67,553(TMV)，日本公开申请No.63-14693(TMV)，EPA194,809(BV)，EPA278,667(BV)；和Gluzman，Y等，Communication inMolecular Biology：Viral Vectors(分子生物学中的信息传递：病毒载体)，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，pp.172-189(1988)。用于在许多宿主包括植物中表达外源DNA的假病毒描述于WO87/06261中。
优选，本发明的病毒是无毒力的，因此不会引起严重的症状，如降低的生长率，花叶病，环斑病，卷叶病，黄化病，条纹病，形成痘，形成肿瘤和斑点状腐蚀。合适的无毒力病毒可以是天然产生的无毒力病毒或人造的减毒病毒。可以使用本领域公知的方法来实现病毒减毒，包括但不限于，亚致死的热处理，化学处理或定向诱变技术，如所述的，例如，Kurihara和Watanabe(Molecular Plant Pathology4：259-269，2003)，Gal-on等(1992)，Atreya等(1992)和Huet等(1994)。
可以从可用的来源如例如美国典型培养物中心(ATCC)或从感染的植物分离来获得合适的病毒株。可以通过本领域公知的技术实现从感染的植物组织分离病毒，如所述的，例如Foster和Tatlor编辑，“PlantVirology Protocols：From Virus Isolation to Transgenic Resistance(植物病毒学实验方案：从病毒分离至转基因抗性)(Methods in MolecularBiology(Humana Pr)，Vol81)”，Humana Press，1998。简而言之，认为受感染植物的组织含有高浓度的合适病毒，优选幼叶和花瓣，在缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲溶液)中研磨来产生病毒感染的浆液，其可以用于随后的接种中。
通过上述参考文献以及Dawson，W.O.等，Virology(1989)172：285-292；Takamatsu等，EMBO J.(1987)6：307-311；French等，Science(1986)231：1294-1297；和Takamatsu等，FEBS Letters(1990)269：73-76证明了用于植物中引入和表达非病毒外源多核苷酸序列的植物RNA病毒的构建。
当病毒是DNA病毒时，可以对病毒自身进行合适的修饰。或者，首先将病毒克隆至细菌质粒中，为了易于使用外源DNA构建所需的病毒载体。然后从质粒切除病毒。如果病毒是DNA病毒，可以将细菌复制起点连接病毒DNA，然后通过细菌来复制。该DNA的转录和翻译将产生外壳蛋白，其将包裹病毒DNA。如果病毒是RNA病毒，通常将病毒克隆为cDNA并插入质粒中。然后使用质粒来制备所有的构建。然后通过转录质粒的病毒序列来产生RNA病毒，并且病毒基因的翻译产生包裹病毒RNA的外壳蛋白。
通过以上的参考文献以及U.S.专利No.5,316,931证明了用于植物中引入和表达非病毒外源多核苷酸序列如本发明构建体中包括的那些的植物RNA病毒的构建。
在一个实施方案中，提供了植物病毒多核苷酸，其中已经从病毒多核苷酸删除了天然外壳蛋白编码序列，插入了非天然植物病毒外壳序列和非天然启动子，优选非天然外壳蛋白编码序列的亚基因启动子，能够在植物宿主中表达，包装重组植物病毒多核苷酸，并确保通过重组植物病毒多核苷酸的宿主系统感染。或者，可以通过在其内插入非天然多核苷酸序列使外壳蛋白基因失活，使得产生蛋白。重组植物病毒多核苷酸可以含有一个或多个其他的非天然亚基因启动子。每个非天然亚基因启动子能够在植物宿主中转录或表达邻接的基因或多核苷酸序列，并且不能相互重组或与天然亚基因启动子重组。如果包括多于一个的多核苷酸序列，可以邻接天然植物病毒亚基因启动子或天然和非天然植物病毒亚基因启动子插入非天然(外源)多核苷酸序列。非天然多核苷酸序列在亚基因启动子的控制下可以在宿主植物中得到转录或表达以产生所需的产物。
在第二个实施方案中，和第一个实施方案一样提供了重组植物病毒多核苷酸，除了邻接非天然外壳蛋白亚基因启动子放置天然外壳蛋白编码序列，替代了非天然外壳蛋白编码序列。
在第三个实施方案中，提供了重组植物病毒多核苷酸，其中天然外壳蛋白基因邻接其亚基因启动子，并且已经将一个或多个非天然亚基因启动子插入病毒多核苷酸中。插入的非天然亚基因启动子能够在植物宿主中转录或表达邻接的基因，并且不能相互重组或与天然亚基因启动子重组。可以邻接非天然亚基因植物病毒启动子插入非天然多核苷酸序列，使得序列在亚基因启动子的控制下在宿主植物中得到转录或表达来产生所需的产物。
在第四个实施方案中，和第三个实施方案一样提供了重组植物病毒多核苷酸，除了由非天然外壳蛋白编码序列替代天然的外壳蛋白编码序列。
通过由重组植物病毒多核苷酸编码的外壳蛋白包裹病毒载体，来产生重组植物病毒。使用重组植物病毒多核苷酸或重组植物病毒来感染合适的诉诸植物。重组植物病毒多核苷酸能够在宿主中复制，在宿主中全身传播，并在宿主中转录或表达外源基因(外源多核苷酸)，来产生所需的蛋白。
将病毒接种于植物的技术可以在以下找到，Foster和Tatlor编辑，“Plant Virology Protocols：F rom Virus Isolation to Transgenic Resistance(植物病毒学实验方案：从病毒分离至转基因抗性)(Methods inMolecular Biology(Humana Pr)，Vol81)”，Humana Press，1998；Maramorosh和Koprowski编辑，“Methods in Virology”(病毒学中的方法)，7vol，Academic Press，New York1967-1984；Hill，S.A.“Methodsin Plant Virology”(植物病毒学中的方法)，Blackwell，Oxford，1984；Walkey，D.G.A.“Applied Plant Virology”(应用植物病毒学)，Wiley，New York，1985；以及Kado和Agrawa编辑，“Principles and Techniquesin Plant Virology”(植物病毒学中的原理和技术)，VanNo strand-Reinhold，New York。
除了以上的，也可以将本发明的多核苷酸引入叶绿体基因组中，因此能够叶绿体表达。
将外源多核苷酸序列引入叶绿体的基因组的技术是已知的。该技术涉及以下的程序。首先，将植物细胞化学处理，使得将每个细胞的叶绿体数目降低至约一个。然后，通过颗粒轰击将外源多核苷酸引入细胞中，目的在于将至少一个外源多核苷酸分子引入叶绿体中。选择外源多核苷酸使其通过同源重组可整合至叶绿体的基因组中，这可以通过叶绿体内在的酶容易地实现。为此，除了目标基因，外源多核苷酸包括至少一个源自叶绿体基因组的多核苷酸片段。此外，外源多核苷酸包括选择标记，其通过连续的选择程序来起作用，以确定所有或基本上所有的叶绿体基因组拷贝在这样的选择后将包括外源多核苷酸。关于该技术的更多详细内容在U.S.专利No.4,945,050；和5,693,507中找到，在此将其引入作为参考。因此，可以通过叶绿体的蛋白表达系统来产生多肽，并变得整合至叶绿体内膜中。
因为植物中的非生物胁迫耐受性可以涉及多个累积或协同作用的基因(参见，例如，在Quesda等，Plant Physiol.130：951-063，2002)，本发明还设想在单个宿主植物中表达多个外源多核苷酸，因此获得优良的非生物胁迫耐受性。
可以通过将多个核酸构建体共同引入单个植物细胞中来实现在单个宿主植物中表达多个外源多核苷酸，每个构建体包括不同的外源多核苷酸。然后可以使用上文中所述的方法将转化的细胞再生成成熟植物。
或者，可以将包括多个不同外源多核苷酸的单个核酸构建体共同引入单个植物细胞中来实现在单个宿主植物中表达多个外源多核苷酸。可以用单个启动子序列来设计这样的构建体，该启动子序列可以转录多顺反子信息，包括所有不同的外源多核苷酸序列。为了使由多顺反子信息编码的不同多肽能够共同翻译，可以通过内部核糖体进入位点(IRES)序列内部连接多核苷酸序列，该内部核糖体进入位点促进置于IRES序列下游的多核苷酸序列的翻译。在这种情况中，上述编码不同多肽的转录的多顺反子RNA分子将从多顺反子RNA分子的加帽5’端和两个内部IRES序列开始翻译，因此在细胞内产生所有不同的多肽。或者，构建体可以包括几个启动子序列，每个连接不同的外源多核苷酸序列。
用包括多个不同外源多核苷酸的构建体转化的植物细胞可以再生成成熟植物，使用上文中所述的方法。
或者，可以通过将包括不同外源多核苷酸的不同核酸构建体引入多个植物中来实现在单个宿主植物中表达多个外源多核苷酸。然后使用常规植物育种技术，将再生的转化植物杂交，并选择所得到后代的优良非生物胁迫耐受性和/或生物量性状。
因此，本申请提供了以安全且成本效率的方式使用新的非生物胁迫耐受性基因来提高各种经济植物对非生物胁迫耐受性和/或生物量的方法。
使植物接受各种环境挑战。这些中的几种，包括盐胁迫，一般的渗透胁迫，干旱胁迫和冷冻胁迫，具有影响整个植物和细胞水可用性的能力。因而没有出人意料，植物对这组胁迫的应答是相关的。在最近的综述中，Zhu注意到“对水胁迫信号的大部分研究聚焦于盐胁迫，主要是因为植物对盐和干旱的应答是密切相关的并且是机制重叠的”(Zhu(2002)Ann.Rev.Plant Biol.53：247-273)。已经证明了对该组胁迫的相似应答和途径的许多实例。例如，已经表明CBF转录因子能调节对盐，冷冻和干旱的抵抗力(Kasuga等(1999)Nature Biotech.17：287-291)。应答盐和脱水胁迫诱导了拟南芥rd29B基因，这是很大程度上通过ABA信号转导过程介导的过程(Uno等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：11632-11637)，导致结合rd29B启动子内上游序列的转录因子的活性改变。在冰叶日中花(Mesembryanthemum crystallinum)(冰花)中，Patharker和Cushman已经表明通过暴露于干旱和盐胁迫诱导了钙依赖性蛋白激酶(McCDPK1)(Patharker和Cushman(2000)Plant J.24：679-691)。胁迫诱导的激酶还显示出磷酸化转录因子，大概改变了其活性，尽管目标转录因子应答盐或干旱胁迫的转录水平没有改变。相似地，Saijo等证明了水稻盐/干旱诱导的钙调蛋白依赖性蛋白激酶(OsCDPK7)在超表达时给予了水稻提高的盐和干旱耐受性(Saijo等(2000)Plant J.23：319-327)。
暴露于脱水在植物中引起了相似的存活策略，冷冻胁迫也是如此(参见，例如，Yelenosky(1989)Plant Physiol89：444-451)，并且干旱胁迫诱导了冷冻耐受性(参见，例如，Siminovitch等(1982)PlantPhysiol69：250-255；和Guy等(1992)Planta188：265-270)。除了冷适应性蛋白的诱导，允许植物在低水条件下存活的策略包括，例如，降低的表面积，或表面油或蜡产生。
将认识到对一种胁迫的抵抗力中涉及的一些途径(如上所述)，也将涉及对其他胁迫的抵抗力，受到相同或同源基因的调控。当然，全部的抵抗途径是相关的，不是相同的，因此不是所有控制对一种胁迫的抵抗力的基因将控制对其他胁迫的抵抗力。尽管如此，如果基因调节对这些胁迫之一的抵抗力，本领域技术人员将清楚测试对这些相关胁迫的抵抗力。以下的实施例部分进一步提供了测定胁迫抵抗力的方法。
本发明的多核苷酸序列能够提高植物的生物量。将认识到本发明的多肽提高植物产量/生物量/活力的能力是它们促进植物细胞大小提高的能力固有的(如实施例8和图2中所示的)。
因此，本发明还设想提高植物生物量/活力/产量的方法(松柏类植物，苔藓，藻类，单子叶植物或双子叶植物，以及http：//www.nationmaster.com/encyclopedia/Plantae中所列的其他植物)。
如在此所用的，短语“植物生物量”指的是从生长季节中植物产生的组织量或质量，其还可以决定或影响植物产量或每生长面积的产量。
如在此所用的，短语“植物活力”指的是从给定时间的植物产生的组织量或质量。因此，提高活力将决定或影响植物产量或每生长时间或生长面积的产量。
如在此所用的，短语“植物产量”指的是作为植物产生的产物产生和收集的组织量或质量。因此，提高产量将影响从特定生长区域和/或特定生长时间的植物获得的经济效益。
优选，本发明的遗传工程植物呈现出比非转基因植物至少约高2％，高5％，高10％，高20％，高30％，高40％，高50％，高60％，高70％，高80％，高90％或甚至更高的生物量，活力和/或产量。
测定植物活力，产量和生物量的方法是本领域公知的(参见实施例10)。
因此，本发明对于促进商业所需作物的产量是高农业价值的(例如，营养体器官如白杨木质部的生物量，或生殖器官的生物量，如种子的数量或种子生物量)。
如在此所用的，术语“约”指的是±10％。
本领域技术人员在检验以下的非限制性实施例时将清楚本发明的其他目的，优势和新的特征。此外，如上所述以及如以下权利要求部分中所要求的本发明的每个实施方案和方面在以下的实施例中找到了实验支持。
实施例
现在参考以下的实施例，这些实施例和以上的描述一起以非限制性的方式说明了本发明。
通常，在此所用的术语和本发明中所用的实验方法包括分子，生化，微生物和重组DNA技术。这样的技术在文献中得到了彻底的解释。参见，例如，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”(分子克隆：实验室手册)Sambrook等(1989)；“Current Protocols in MolecularBiology”(分子生物学中的通用实验方案)，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guide to MolecularCloning”(分子克隆实践指南)John Wiley&Sons，New York(1988)；Watson等“Recombinant DNA”(重组DNA)，Scientific American Books，New York；Birren等(编辑)“Genome Analysis：A Laboratory ManualSeries”(基因组分析：实验室手册系列)Vol.1-4，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York(1998)；U.S.专利No.4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所列的方法；“Cell Biology：ALaboratory Handbook”(细胞生物学：实验室手册)，I-III卷，Cellis，J.E.编辑(1994)；“Current Protocols in Immunology”(免疫学中的通用实验方案)I-III卷Coligan J.E.编辑(1994)；Stites等(编辑)，“Basic andClinical Immunology”(基础和临床免疫学)(第8版)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(编辑)，“Selected Methodsin Cellular Immunology”(细胞免疫学中选择的方法)，W.H.Freeman和Co.，New York(1980)；可用的免疫测试在专利和科学文献中有大量描述，参见，例如，U.S.专利No.3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；“Oligonucleotide Synthesis”(寡核苷酸合成)Gait，M.J.编辑，(1984)；“Nucleic Acid Hybridization”(核酸杂交)Hames，B.D.和Higgins S.J.编辑(1984)；“Animal Cell Culture”(动物细胞培养)Freshney，R.I.编辑(1986)；“Immobilized Cells and Enzymes”(固定细胞和酶)IRL Press，(1986)；“A Practical Guide to Molecular Cloning”(分子克隆实践指南)Perbal，B.(1984)和“Methods in Enzymology”(酶学中的方法)Vol.1-317，Academic Press；“PCR Protocols：A GuideTo Methods And Applications”(PCR实验方案：方法和应用指南)，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等，“Strategies forProtein Purifi cation and Characteri zation-A Laboratory Course Manual”(蛋白纯化和表征的策略-实验室过程手册)CSHL Press(1996)；将所有的引入作为参考，如同在此全部列出一样。在该文件中提供了其他常规的参考文献。认为其中的方法是本领域公知的并给阅读者提供了方便。
除非另外指出，在此所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同意思。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与在此所述的那些相似或等价的方法和材料，但以下描述了合适的方法和材料。
实施例1
鉴定来自单子叶植物的推定非生物胁迫耐受性基因
按照属于本发明专利受让人的之前所述的WO2004/104162，在体内鉴定并证实非胁迫耐受性(ABST)基因。从双子叶植物鉴定各种ABS基因和由此编码的多肽(各自为SEQ ID NO.124-128和129-133)。在单子叶植物基因组数据库，玉米，高梁，水稻和大麦的NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)和TIGR(http：//www.tigr.org)数据库中进行直系同源(orthologous)序列的筛选。
使用LEADS TM软件(Compugen)将表达序列标签(EST)和cDNA序列成簇和装配，并与上述单子叶植物的TIGR(http：www.tigr.org/)数据库进行比较。总地，372,000个玉米EST的成簇形成41,990个簇，其中19,870个是单个的。在高梁中，约190,000个EST成簇成39,000个簇，而在大麦中，370,500个EST产生50,000个不同的簇，每个表示不同的基因。在水稻基因组数据库中发现相似数量的序列和成簇的基因。
根据包括簇的序列记录中的所有关键部分编辑每个簇的数字表达特征概述。数字表达，也称为电子RNA印迹，是基于形成基因簇的EST序列呈现出实际表达特征的工具。就植物解剖学(基因在哪个组织/器官中得到表达)，发育阶段(可以在哪个发育阶段找到基因)和处理特征(提供在哪个生理条件下基因得到表达，如干旱，冷，病原体感染等)而言，该工具可以提供簇的表达特征。假定不同簇中EST的随机分布，数据表达提供了概率值，该概率值描述了具有总N EST至含有来自特定文库集合的X EST的簇的概率。对于概率计算，将考虑：a)簇中的EST数量，b)涉及的和相关文库的EST数量，c)表示物种的可获得EST的全部数量。因此用来自表示特定表达的目标文库组的EST高度富集具有低概率值的簇。
已经将直系同源(orthology)和旁系同源(paralogy)的概念应用于整个基因组比较规模上的功能表征和分类。直系同源物和旁系同源物构成两个主要类型的同源物：第一个通过特化从共同的祖先演化而来，后者通过复制情况而相关。假定由老式的复制情况产生的旁系同源物很可能在功能上已经分叉了，而真实的直系同源物随着进化的时间很可能保持相同的功能。
为了进一步研究和鉴定来自单子叶植物物种的ABST假定直系同源基因，结合了两个计算方法：
(i)直系同源序列比对的方法-通过构建覆盖多个真核分类群的直系同源组，使用改进的Markov簇算法将推定的直系同源物和旁系同源物分组。将这些推定的直系同源物依据系统演化树来进一步组织，系统演化树是假定为基因系统发育估算的分支图(树)。
(ii)产生基因表达特征“数字表达”的方法-本发明人已经针对annotating序列相当多的工作。分析表达数据并使用俗语的固定词汇如实验处理将EST文库分类。通过比较它们在簇中的频率与数据库中的丰度在统计学上分析来自所有成簇的EST对基因的注释，允许构建该基因的数字和图像表达特征，将这称为“数字表达”。
使用这两种互补方法的基本原理是基于真实的直系同源物很可能随着进化的时间保持相同功能的假设。这两种方法(序列和表达模式)对两个同源基因之间的功能相似性提供了两组不同的指示，序列水平的相似性-蛋白质结构域中相同的氨基酸和表达特征的相似性。
同时比较了来自单子叶植物的序列与番茄ABST基因，番茄基因及其来自单子叶植物的最佳直系同源基因之间的同源性水平显著不同，为45％至88％。此外，单子叶植物基因的in silico表达特征通常与ABS耐受性中涉及的基因不匹配。因此，对每个番茄基因(SEQ ID NO：124-133)的单子叶植物功能直系同源物进行了广泛的研究。
尝试鉴定番茄ABST基因的最佳直系同源物，进行了两组分析。首先，将5个番茄ABST基因的序列(SEQ ID NO：124-128)及其推导出的多肽序列(SEQ ID NO：129-133)与上述基因簇的DNA序列编码的所有单子叶植物的推定蛋白相比较。在蛋白质水平上进行比较，沿着整个蛋白质序列寻找高于45％的同一性。
以下的表1显示了最佳的同源基因及其与番茄ABST蛋白的同一性水平。接着，基于它们在几种单子叶植物物种的发育过程中的表达模式筛选源自不同单子叶植物物种(大麦，高梁和玉米)的这些单子叶植物蛋白。该筛选是基于基因的数字表达，如上所述。数字表达表示包括每个in silico基因的EST的分布以及实际分布与随机分布的偏差。基于三个标准选择了基因：在根部具有较高表达的基因，根部和叶子和/或由表示土壤胁迫条件(干旱，盐度，土壤贫瘠)的处理诱导的基因。只在高于2倍的情况中认为是表达提高的(相对于随机EST分布)，具有低于0.05显著性概率时提高是明显的。以下的表2概括了不同器官或组织中的基因表达特征，以及引起表达水平显著升高的处理。
表1：番茄ABST基因及其来自单子叶植物的同源基因之间的同源性水平
Figure GDA0000452423870000261
表2：ABST同源in silico基因的表达特征，如通过EST分布的统计学分析所表示的
Figure GDA0000452423870000271
无*-没有一种具有数字表达显著升高的处理可以认为是土壤胁迫处理。
如以上表1和表2中所述筛选的结合揭示了最后列出的五个单子叶植物基因被预测为与番茄ABST基因最相关(SEQ ID NO.1，3，5，7，9)。
使用载体NTI组(InforMax，U.K.)版本6(Hasting Software，Inc：www.generunner.com/)分析选定的多核苷酸序列(以下的表3)的ORF存在。将这些多核苷酸序列每一个中鉴定的ORF与Genbank数据库序列相比较，使用Blast(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)；为了鉴定ATG起始密码子，将呈现出与GenBank序列最高同源性的ORF作图。然后将该ORF的ATG起始密码子的位置与鉴定的多核苷酸序列的相比较，以便证实在此所述五个序列中的每一个都包括全长ORF和ATG起始密码子(因此获得“推定的单子叶植物ABST基因”的资格)。
表3
单子叶植物ABST基因
Figure GDA0000452423870000281
*-在以下实施例2中进一步描述。
已经使用BLAST软件从NCBI数据库鉴定具有与单子叶植物ABST基因显著同源性的多肽(表4)。
表4
ABST同源物
Figure GDA0000452423870000291
Figure GDA0000452423870000301
Figure GDA0000452423870000311
Figure GDA0000452423870000321
实施例2
产生推定的单子叶植物ABST基因
通过GeneArt(http：//www.geneart.com)合成单子叶植物ABST基因的DNA序列。基于编码的单子叶植物ABST基因的氨基酸序列(SEQID NO2，4，6，12)并使用从植物转录组计算的密码子使用表(这样的表实例可以在http：//www.kazusa.or.jp/condon/在线可获得的密码子使用数据库中找到)，in silico设计合成的DNA。以没有将改变引入编码的氨基酸序列的方式来设计最佳化的编码序列，同时使用对于在双子叶植物(主要是番茄和拟南芥)和单子叶植物如玉米中的表达是优选的密码子。与直系同源单子叶植物序列相比较，在序列中每20个核苷酸碱基对引入至少一个沉默突变，以避免在单子叶植物物种如玉米中超表达基因时可能的沉默。将以下的限制酶位点加入最佳化的序列-5’端SalI，XbaI，BamHI，SmaI，3’端SacI。将供应商(GeneArt，Gmbh)合成的序列在pCR-Script质粒中克隆。所得到的序列是SEQ ID No.158，159，160，161；各自表示最初的单子叶植物ABST SEQ ID No.1，3，5，11，如以上的表3中所述。
实施例3
克隆推定的ABST基因
用限制性核酸内切酶XbaI和SacI(Roche)消化带有合成的，基于单子叶植物的ABST基因的PCR Script质粒。使用凝胶提取试剂盒(Qiagen，Germany)纯化所得到的片段，并使用T4DNA连接酶(Roche)连接成植物表达载体pKG(NOSter)，(SEQ ID NO138)，用相同的酶切除。pKG基因是基于PCR Script骨架，在多连接物位点具有几个改变来促进适于在植物细胞中表达的启动子下游和终止子上游的目标基因的克隆。结果，插入的基因，可以与启动子和终止子一起容易地转移至二元载体。
将所得到的带有推定单子叶植物ABST基因的pKG(NOSter)通过电穿孔引入大肠杆菌DH5感受态细胞中，使用MicroPulser电穿孔仪(Biorad)，0.2cm比色皿(Biorad)和EC-2电穿孔程序(Biorad)。将处理过的细胞在LB液体培养基中37℃培养1h，然后涂布于补充氨苄青霉素(100mg/L)的LB琼脂上并在37℃孵育16h。通过PCR分析在选择培养基上产生的菌落，使用SEQ ID NO134和SEQ ID NO135的引物，将其设计来横跨pKG质粒中插入的序列。将所得到的PCR产物在1％琼脂糖凝胶上分离，将“PCR-阳性”的菌落标记并进一步生长。使用(Qiagen)分离来自阳性菌落的DNA并使用ABI377测序仪(Amersham Biosciences Inc)测序来证实最后序列中突变的缺失。
使用限制酶HindIII和SalI(Roche)在所有带有推定单子叶植物ABST基因的pKG(NOSter)质粒中插入At6669启动子序列(SEQ IDNO：123所示)。通过PCR使用引物SEQ ID NO：140和SEQ ID NO：135分析克隆。如上所述鉴定，分离并测序阳性质粒。
实施例4
产生包括推定的单子叶植物ABST基因和用于驱动其表达的植物启动子的二元载体
产生包括At6669启动子的二元载体：为了切除表达盒，表达盒连接用相同的核酸内切酶消化的pGI质粒，用HindIII和EcoRI(Roche)消化四个pKG(At6669+NOSter)构建体，这些构建体带有At6669启动子序列(SEQ ID NO：123所示)下游和Nopaline合酶(NOS)终止子上游的推定单子叶植物ABST基因。总而言之，产生四个pGI构建体，每个包括置于推定的单子叶植物ABST基因上游的At6669启动子，ABST基因具有SEQ ID NO：1，3，5，11中所示的序列。
通过将源自pGL3基础质粒载体(Promega，Acc No U47295；bp4658-4811)的合成poly-(A)信号序列插入二元载体pB1101.3(Clontech，Acc.No.U12640)的HindIII限制位点中来构建质粒pPI。在一些情况中，所用的骨架二元质粒是pGI，其于pPI相似，但由GUS-内含子基因体改GUS基因(Vancanneyt.G等，MGG220，245-50，1990)。
通过PCR扩增使用SEQ ID NO：136和135中所示的引物从拟南芥var Co10基因组DNA分离At6669启动子。纯化(Qiagen，Germany)并用限制性核酸内切酶HindIII和SalI(Roche)消化PCR产物。将所得到的启动子序列引入用相同的酶消化的开放二元pPI载体中，来产生pPI+At6669质粒。
实施例5
用带有推定的单子叶植物ABST基因的二元载体转化拟南芥细胞
将以上实施例4中所述的每个二元载体用来转染拟南芥细胞。将两个其他的二元构建体用作阴性对照，这两个构建体具有替代单子叶植物ABST基因(置于35S或At6669启动子的下游)的荧光素酶报告基因。
通过电穿孔将二元载体引入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV301，或LB4404感受态细胞中(约109细胞/mL)。使用MicroPulser电穿孔仪(Biotad)，0.2cm比色皿(Biorad)和EC-2电穿孔程序(Biorad)实现电穿孔。将处理过的细胞在LB液体培养基中28℃培养3h，然后涂布在补充庆大霉素(50mg/L；用于农杆菌菌株GV301)或链霉素(300mg/L；用于农杆菌菌株LB4404)的LB琼脂上，在28℃48h。通过PCR使用SEQ ID NO：134和135所示的引物分析在选择培养基上产生的农杆菌菌落，将引物设计来横跨pPI质粒中插入的序列。如以上实施例4中所述的将所得到的PCR产物分离并测序，来证实将正确的ABST序列适当地引入了农杆菌细胞中。
实施例6
用推定的单子叶植物ABST基因转化拟南芥
使用Clough和Bent(10)以及Desfeux等(11)所述的Floral Dip方法转化拟南芥哥伦比亚植物(T0)植物，使用了较少的改进。简而言之，将T0植物播种于250ml装满湿泥炭基生长混合物的罐中。将罐覆盖铝箔和塑料圆顶，保持在4℃3-4天，然后取掉覆盖物并在生长室中在16/8h光/暗循环下18-24℃培养。在开花前六天将T0植物准备用于转化。
如以上实施例5中所述的产生携带二元构建体的农杆菌的单个菌落。将菌落在补充卡那霉素(50mg/L)和庆大霉素(50mg/L)的LB培养基中培养。将培养物在强烈振荡下在28℃培养48h，然后在4000rpm离心5分钟。将包括农杆菌细胞的沉淀物重悬浮于在重蒸水中含有半强度(2.15g/L)Murashige-Skoog(Duchefa)；0.44μM苄基氨基嘌呤(Sigma)；112μg/L B5Gambourg维生素(Sigma)；5％蔗糖；和0.2ml/L Silwet L-77(OSI Specialists，CT)的转化培养基中，pH为5.7。
通过将每个植物颠倒至农杆菌悬浮液中来实现T0植物的转化，使得将超出地面的植物组织浸渍3-5秒。将每个接过种的T0植物立即放入塑料盘中，然后覆盖干净的塑料圆顶来维持湿度，并在室温下保持黑暗18小时，来促进感染和转化。然后将转化的(转基因)植物取掉覆盖物并转移至温室，用于恢复和成熟。将转基因T0植物在温室中生长3-5周直至长角果变成褐色并干燥。从植物收集种子并保存在室温直至播种。
为了产生带有基因的T1和T2转基因植物，通过浸泡在70％乙醇中1分钟，接着浸泡在5％次氯酸钠和0.05％曲通中5分钟，将从转基因T0植物收集的种子表面灭菌。将表面灭过菌的种子在无菌蒸馏水中彻底洗涤，然后置于含有半强度Murashige-Skoog(Duchefa)；2％蔗糖；0.8％植物琼脂；50mM卡那霉素和200mM carbenicylin(Duchefa)的培养平板上。将培养平板在4℃培养48小时，然后转移至25℃的生长室，持续再一周的培养。将活的T1拟南芥植物转移至新鲜培养平板中，持续另一周的培养。培养后，从培养平板移出T1植物并种植于250ml罐中含有的生长混合物中。使转基因植物在温室中生长至成熟。将从T1植物收集的种子在用于培养和生长T1植物的相同条件下培养并生长至成熟，作为T2植物。
实施例7
评价在非生物胁迫条件下栽培的转基因植物的发芽
对盐度或渗透胁迫的耐受性的目的在于鉴定在高盐，干旱或这些或其他环境胁迫的组合中给予更好的发芽，秧苗活力或生长的基因。根据它们的发育阶段，植物对盐(NaCl)的耐受性是不同的，因此评价了种子发芽，秧苗活力和植物生长应答。
通过取不同发育阶段的植物并用递增浓度的NaCl(例如，50mM，100mM，200mM，400mM)灌溉来进行典型的盐度耐受性测试。比较转基因植物与对照植物在对照植物抑制浓度的外部表型外观，萎蔫的程度，以及达到成熟和产生后代的整体成功。就之前情况而言，所测量的耐受性的定量参数是每个植物的平均湿重和干重，和所产生的种子重量，平均种子大小和所产生的种子数量。进行渗透胁迫测试(包括NaCl和甘露醇测试)来测定渗透胁迫耐受性表型是否是NaCl特异性的或是否是一般的渗透胁迫相关的表型。植物对渗透胁迫的耐受性通常比对干旱，盐度和冷冻条件的耐受性更高，因此就农艺学性状而言具有高度价值。
方法：
用来测试植物提高的非生物胁迫耐受性的方法包括不利条件如高盐度和高渗压剂下的发芽和秧苗生长的测试。
发芽测试-发芽测试比较来自能完成发芽过程(从种皮的胚根伸出和子叶的完全展开)的转基因植物的种子百分比与来自以相似的方式处理的对照植物的种子百分比。在种植后对发芽和秧苗活力的评价进行三周。为了测量发芽和秧苗生长，将来自T2植物的种子表面灭菌并单个播种于正方的琼脂平板上，该平板含有例如补充高盐度(例如，50mM，100mM，200mM，400mM)或高渗压剂(例如，50mM，100mM，200mM，400mM甘露醇)的固化基础培养基。基础培养基是补充0.8％植物琼脂作为固化剂的50％Murashige-Skoog培养基(MS)+维生素。播种后，将平板在4℃转移2-3天，用于层形成，然后生长三周。
为了跟踪不利条件下的发芽和生长，人工或自动筛选平板，并测定植物大小。从每个构建体分析五至十个独立的转化情况。将表达来自本发明的基因的植物与相同条件下播种在相同平板上的对照植物相比较，或与所有构建体，种子和播种情况的平均测量相比较。
实施例8
评价在非生物胁迫条件下的转基因植物生长
方法：
胁迫耐受性和分析-使用秧苗进行的补充实验按照植物对不利条件的耐受性。在卡那霉素的存在下(用于转基因植物)或不存在下(用于野生型对照植物)，将表面灭过菌的种子播种于基础培养基中[补充0.8％植物琼脂作为固化剂的50％Murashige-Skoog培养基(MS)+维生素]。播种后，将平板在4℃转移2-3天，用于层形成，然后在每日23-小时亮1-小时暗循环下在25℃生长7至10天。在这个时间点，将随机选择的秧苗小心地转移至含有高盐度条件(150mM)或表示干旱过程中发现的高渗透压条件(210mM甘露醇)的平板。植物生长按照时间的函数，使用数字成像。为了跟踪不利条件下的植物生长，在转移至胁迫条件的那天(第0天)将植物拍照。随后在植物转移至胁迫条件后每隔几天拍照并直至转移后12天。从拍取的数码照片测定植物大小。图像J软件用于定量来自数码照片的植物大小(http：//rsb.info.nih.gov/ij/)。设计了专利方案(proprietary script)来分析单个植物随时间函数的大小。图1显示了用于反映面积定量的方法。分析每个构建体五至十个独立的转化情况并在每个胁迫实验中分析每个情况至少6个随机选择的植物。将表达来自本发明的基因的植物与播种于相同胁迫诱导平板上的对照植物(内部对照)相比较或与相同实验中所用的全部对照植物的平均测量(全部对照)相比较。
统计学分析-为了鉴定给予植物显示出显著差异的耐受性的基因，使用JMP统计程序(版本5.2.1，SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA)分析植物面积数据。为了检测不同基因(单独情况的群体)和对照植物之间的变化并鉴定显示出统计学差异的显著性能的构建体和情况，使用one-way ANOVA(方差分析)。对于基因对对照的分析，使用了Students t-检验，使用p<0.05的显著性。为了发现具有提高的植物面积的显著不同的独立转化情况，使用了Tukey’s HSD(HonestlySignificantly Different)测试，使用p<0.05的显著性。使用Two-wayANOVA来鉴定在特定时间点与在相同平板或相同实验的所有平板中生长的对照植物的平均面积相比较显示出植物面积显著差异的情况。使用Student's t-检验来比较独立转化情况与对照植物。
结果：
为了鉴定提供盐度或渗压剂耐受性的基因，从每个构建体的5至10个独立转基因情况产生T2植物。从T2植物收集种子并分析从其产生的植物。如以上详述的，将植物播种于选择培养基上，转基因植物在其中能够斗争(卡那霉素)，并在7-10后(4-6叶阶段)将植物转移至产生胁迫的培养基：高盐度(150mM)或高渗压剂(210mM甘露醇)。从转移那天直至之后的12天分析植物大小。使用Student't t-检验和Tukey HSD测试来鉴定与野生型植物相比较显示出显著性能的情况。
显示了表达SEQ ID No158，159，160，161的转基因植物在At6669启动子(Seq ID123)下的结果；这四个序列各自表示最初的单子叶植物ABST SEQ ID No1，3，5，11，如以上的表4中所述的。发现转基因植物在高盐度胁迫和/或高渗压剂胁迫存在下生长能力的显著差异。以下的表5概括了与对照植物相比较给予渗透胁迫耐受性的显著情况的发现。本申请中包括的各种构建体提供了具有提高的抗非生物胁迫能力的转基因植物。
如所示的，表达SEQ ID158的5个转化情况中的4个显示出显著提高的渗压剂耐受性，如通过转基因植物在高渗压剂浓度下还持续发育的能力所判断的(参见表5，1-5行)。图2中也显示了对SEQ ID158获得的结果。在A图中显示了在第0，5和12天从含有转基因和对照植物的平板拍取的处理过的图像。图B显示了不同时间点的不同情况的平均植物面积。情况1，2，3和4对渗压剂的耐受性显著更高(p<0.05)。本申请的其他构建体也保护了植物免受高渗压剂的影响。再者，表达SEQ ID161的五个独立转化情况中的四个显示出在高渗压剂下显著提高的生长能力(以下的表5，6-10行)。此外，表达SEQ ID160的情况之一对高渗压剂显示出比其相应的对照植物显著高的耐受性。
表5
在210mM甘露醇的存在下生长的T2转基因拟南芥植物的LS平均值
Figure GDA0000452423870000401
以下的表6中概括了盐度耐受性测试的结果。如表6中详述的(1-4行)，使用含有SEQ ID158的构建体的三个独立转基因情况呈现出比实验中对照植物显著更高的盐度胁迫耐受性(p<0.05)。使用表达SEQID161的植物获得相似的结果。以及在这种情况中，三个不同的转基因情况显示出比它们相对的对照植物相比较显著提高的盐度胁迫耐受性(参见表6，5-9行)。
表6
在150mM NaCl的存在下生长的T2转基因拟南芥植物的LS平均值
Figure GDA0000452423870000411
作为本研究的一部分进行了测定构建体提供盐度和高渗压剂耐受性的能力的独立实验。发现了保护转基因植物对抗两种胁迫的有害影响的基因。作为一个整体来看，该结果清楚地证明了本申请中包括的基因和构建体提供非生物胁迫耐受性的能力。
实施例9
评价由单子叶植物ABST基因的表达引起的根部构造的改变
许多现代农业中的关键性状可以通过根部构造的改变来解释。根部大小和深度与干旱耐受性和肥料利用率相关。越深的根部系统可以接近存储在更深土壤层中的水。相似地，高度分支的根部系统提供了更好的土壤覆盖，并因此可以有效地吸收所有可用的大量营养素和微量营养素，导致提高的肥料利用率。为了测试是否转基因植物产生了不同的根部结构，将植物生长于垂直放置的琼脂平板中。每隔几天将平板拍照，并测定植物根部覆盖的大小，长度和面积。从每个形成的构建体，检查几个单独的转化情况。为了测定根部特征之间的显著差异，可以使用单因素和双因素ANOVA，使用Students t-检验或TukeyHSD测试来鉴定显示出显著根部特征的情况以及给发现提供统计学分数(参见以上的实施例8)。
实施例10
本发明转基因植物提高的生物量
将如上所述产生的T1或T2转基因植物单独移植至含有泥炭和蛭石(各自体积比3∶2)的生长混合物的罐中。将罐覆盖24hr用于固化，然后以完全随机的次序置于温室中，并用自来水浇灌七天(每3-5天从罐底部提供)。此后，用盐溶液(100mM NaCl和5mM CaCl2)浇灌一半植物来诱导盐度胁迫(胁迫条件)。将另一半植物继续用自来水灌溉(正常条件)。将所有植物生长于100％RH下28天，然后收割(地上组织)并称重(立即或在50℃烘箱中干燥24小时后)。
认识到为了清楚在分开的实施方案的内容中描述的本发明的特定特征也可以在单个实施方案的组合中提供。相反，为了简洁在单个实施方案中描述的本发明的各个特征也可以分开或在任何合适的亚组合中提供。
尽管已经结合特定的实施方案描述了本发明，清楚的是许多替换，改变和变化是本领域技术人员显而易见的。因此，确定包括落入所附权利要求的精神和宽范围内的所有这样的替换，改变和变化。本说明书中提及的所有出版物，专利，专利申请以及由其登录号识别的序列在此以其整体引入说明书中作为参考，至如同每个单个出版物，专利或专利申请或由其登录号识别的序列特意并单独引入作为参考一样的程度。此外，本申请中任何参考文献的引用或鉴定不应当构成允许这样的参考文献用作本发明的现有技术。
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Claims (13)

1.提高植物对非生物胁迫的耐受性、生物量、活力和/或产量的方法，所述方法包括在植物内表达编码SEQ ID NO：12所示的多肽的外源多核苷酸，其中所述非生物胁迫选自盐度和高渗压剂，其中所述生物量是生长季节中产生的植物组织的数量或量，其中所述活力是给定时间内产生的植物组织的数量或量，因此提高植物对非生物胁迫的耐受性、生物量、活力和/或产量。
2.权利要求1的方法，所述方法还包括在非生物胁迫下生长表达所述外源多核苷酸的植物。
3.权利要求1或2的方法，其中所述多核苷酸如SEQ ID NO：11所示。
4.核酸构建体，所述构建体包含核酸序列以及能够指导所述核酸序列在宿主细胞中转录的启动子，所述核酸序列编码SEQ ID NO：12所示的多肽。
5.权利要求4的核酸构建体，其中所述核酸序列如SEQ ID NO：11所示。
6.权利要求4或5的核酸构建体，其中所述启动子为组成型启动子。
7.权利要求4或5的核酸构建体，其中所述启动子为诱导型启动子。
8.权利要求4或5的核酸构建体，其中所述核酸序列如SEQ ID NO：11所示。
9.提高植物的生物量、活力、产量或对非生物胁迫的耐受性的方法，所述方法包括用权利要求4、5、6、7或8的核酸构建体转化所述植物的细胞，其中所述非生物胁迫选自盐度和高渗压剂，其中所述生物量是生长季节中产生的植物组织的数量或量，其中所述活力是给定时间内产生的植物组织的数量或量，因此提高植物的生物量、活力、产量或对非生物胁迫的耐受性。
10.权利要求9的方法，所述方法还包括从所述转化的细胞产生成熟的植物。
11.分离的多肽，其如SEQ ID NO：12所示。
12.植物细胞，其包含编码SEQ ID NO：12所示的多肽的外源多核苷酸。
13.植物细胞，其包含外源多核苷酸，所述多核苷酸如SEQ ID NO：11所示。
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