CN102317448B - 多能细胞/多潜能细胞及方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述了多能干细胞例如人类和其它哺乳动物的多能干细胞和相关方法。

Description

多能细胞/多潜能细胞及方法
交叉参考
本申请要求于2007年6月15日提交的日本专利申请JPO2007-159382、2007年11月20日提交的PCT/EP2007/010019和2008年3月28日提交的美国临时申请61/040,646的优先权，它们完整引入本文作为参考。 
发明背景 
再生医学领域包括旨在帮助修复、更换或再生受损的细胞、组织或器官的治疗。再生医学的一个分支包括依赖具有产生各种不同类型细胞的潜能的胚胎干细胞(ES)的细胞疗法。基于ES的细胞疗法具有治疗各种健康状况包括阿尔茨海默病、帕金森氏症、中风、脊髓损伤、心脏病发作、肾功能衰竭、骨质疏松、I型糖尿病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、烧伤和创伤的前景。然而，这些疗法的进展受到多种因素的阻碍，包括来自与受体免疫不相容的供体的ES细胞发生免疫排斥的可能性。 
发明概述 
本公开内容包括人类干细胞，它们在某些情况下是多潜能性的(pluripotent)，在某些情况下是多能性的(multipotent)。本公开内容进一步包括产生这些人类干细胞的方法、使用这些干细胞的方法以及相关组合物。 
因此，一方面，本发明提供了多潜能的、体细胞性的、非胚胎的并具有长期自我更新特性的人类干细胞。在某些实施方案中，这些人类干细胞包含外源基因，包括编码Oct3/4多肽的第一外源基因、编码Sox2多肽的第二外源基因和编码Klf4多肽的第三外源基因。在一种实 施方案中，包含外源基因的人类干细胞包含3种且只有3种外源基因，其中，第一外源基因编码Oct3/4多肽，第二外源基因编码Sox2多肽，且第三外源基因编码Klf4多肽。在进一步的实施方案中，外源基因基本上由以上提到的第一、第二和第三外源基因组成。在另一实施方案中，外源基因包括编码Oct3/4多肽的第一外源基因、编码Sox2多肽的第二外源基因、编码Klf4多肽的第三外源基因和编码小鼠来源的阳离子氨基酸转运体(mCAT)(例如mCAT1)的氨基酸序列的第四外源基因。在另一种实施方案中，包含外源基因的人类干细胞包含4种且只有4种外源基因，其中，第一外源基因编码Oct3/4多肽，第二外源基因编码Sox2多肽，第三外源基因编码Klf4多肽，且第四外源基因编码c-Myc多肽。在进一步的实施方案中，外源基因基本上由以上提到的第一、第二、第三和第四外源基因组成。在某些实施方案中，外源基因不包括编码c-Myc多肽的基因。在进一步的实施方案中，包含外源基因的人类干细胞不包含外源性c-Myc多肽。在其它实施方案中，外源基因包括编码c-Myc多肽的基因。在其中外源基因包括编码c-Myc多肽的基因的一种实施方案中，外源基因包括编码小鼠来源的阳离子氨基酸转运体(mCAT)的氨基酸序列的第五外源基因。在某些实施方案中，外源基因不包括编码TERT多肽的基因。在某些实施方案中，外源基因不包括编码HPV16 E6多肽或HPV16E7多肽的基因。在进一步的实施方案中，外源基因不包括编码TERT多肽、SV40大T抗原多肽、HPV16 E6多肽或Bmi 1多肽中的任一种的基因。在其它的实施方案中，包含外源基因的人类干细胞不包含能够诱导癌症的外源基因。在其它的实施方案中，人类干细胞包含编码3种或多种以下多肽的外源基因：Oct3/4多肽、Sox2多肽、Klf4多肽和c-Myc多肽。 
在另一方面，本发明提供了干细胞，其是体细胞性的、非胚胎的、碱性磷酸酶阳性的，并且表达TDGF 1、Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26al、TERT、zfp42、Sox2、Oct3/4和Nanog中的2种或多种基因。在某些实施方案中，这些干细胞是多潜能性的。 
在相关方面，本发明提供了人类干细胞，其在1至1000种基因(例 如，1至700种基因、1至500种基因、1至300种基因、1至200种基因、1至100种基因、1至50种基因、3至20种基因、5至20种基因、5至50种基因、10至50种基因、20至50种基因、30至100种基因或50至100种基因)方面具有比人类胚胎干细胞更高的基因表达水平。在某些实施方案中，这些人类干细胞是碱性磷酸酶阳性的，并且表达选自TDGF1、Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26a1、Tert、zfp42、Sox2、Oct3/4和Nanog中的2种或多种(例如，3、4、5、6、7、8、9或10种)基因。 
在另一方面，本发明提供了人类干细胞，其在此处提供的表13、15或16中列出的基因中的2种或多种(例如，3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、10种或更多种、15种或更多种、25种或更多种、50种或更多种、75种或更多种、100种或更多种或200种或更多种)基因方面具有比人类胚胎干细胞更高的基因表达水平。在某些实施方案中，这些人类干细胞是碱性磷酸酶阳性的，并且表达选自TDGF1、Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26a1、Tert、zfp42、Sox2、Oct3/4和Nanog中的2种或多种(例如，3、4、5、6、7、8、9或10种)基因。 
在一个进一步的方面，本发明提供了人类干细胞，其在此处提供的表14中列出的基因中的2种或多种(例如，3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、10种或更多种、15种或更多种、25种或更多种、50种或更多种、75种或更多种、100种或更多种或200种或更多种)基因方面具有比人类胚胎干细胞更低的基因表达水平。在某些实施方案中，这些人类干细胞是碱性磷酸酶阳性的，并且表达选自TDGF1、Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26a1、Tert、zfp42、Sox2、Oct3/4和Nanog中的2种或多种(例如，3、4、5、6、7、8、9或10种)基因。 
在另一方面，本发明提供了人类干细胞，其在1至1000种基因(例如，1至300种基因或1至50种基因)方面具有比人类胚胎干细胞更低的基因表达水平。在某些实施方案中，这些人类干细胞是碱性磷酸酶阳性的，并且表达选自TDGF1、Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26a1、Tert、zfp42、Sox2、Oct3/4和Nanog中的2种或多种(例如，3、4、5、6、7、8、9或10种)基因。 
在一个进一步的方面，本发明提供了人类干细胞，其中，1至100种基因的表达水平比在人类胚胎干细胞中的表达水平更接近于在人类成纤维细胞中的表达水平。在某些实施方案中，这些人类干细胞是碱性磷酸酶阳性的，并且表达选自TDGF1、Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26a1、Tert、zfp42、Sox2、Oct3/4和Nanog中的2种或多种(例如，3、4、5、6、7、8、9或10种)基因。 
在另外的一方面，本发明提供了通过促使在来自人类受试者的非胚胎、出生后细胞的培养群体中表达Oct3/4多肽、Sox2多肽和Klf4多肽来产生自体干细胞的方法。在某些实施方案中，通过这种方法产生的自体干细胞能够形成畸胎瘤。在一种实施方案中，如此产生的自体干细胞是多潜能性的。 
在一个进一步的方面，本发明提供了通过包括以下步骤的方法产生的人类干细胞：促使在人出生后细胞中表达Oct3/4多肽、Sox2多肽和Klf4多肽，以获得一个或多个细胞集落，该细胞具有高核质比并且比围绕该一个或多个集落的细胞更小，并且分离该一个或多个集落中的至少一个。在某些实施方案中，通过以上提到的方法产生的人类干细胞是多潜能的人类干细胞。在某些实施方案中，通过将一种或多种表达载体例如逆转录病毒表达载体、慢病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、腺病毒表达载体、重组逆转录病毒或核酸表达载体如质粒表达载体引入人出生后细胞中，来促使Oct3/4、Sox2和Klf4多肽的表达。在一种实施方案中，上述方法不包括促使在人出生后细胞中表达c-Myc多肽。在另一种实施方案中，该方法不包括促使在人出生后细胞中表达编码c-Myc多肽的外源基因。在进一步的实施方案中，该方法还包括促使在人出生后细胞中表达c-Myc多肽。在其中该方法还包括促使c-Myc多肽表达的某些实施方案中，该方法包括促使4种且只有4种编码诱导因子的外源基因的表达，其中，该外源基因编码Oct3/4多肽、Sox2多肽、Klf4多肽和c-Myc多肽。在一种实施方案中，该方法包括促使4种编码诱导因子的外源基因的表达，其中，该外源基因编码Oct3/4多肽、Sox2多肽、Klf4多肽和c-Myc多肽。在其它的实施方 案中，该方法包括促使基本上由Oct3/4多肽、Sox2多肽、Klf4多肽和c-Myc多肽组成的一组多肽的表达。在另一种实施方案中，该方法包括促使3种且只有3种编码诱导因子的外源基因的表达，其中，该外源基因编码Oct3/4多肽、Sox2多肽和Klf4多肽。在另一种实施方案中，该方法包括促使基本上由Oct3/4多肽、Sox2多肽和Klf4多肽组成的一组多肽的表达。在又另一实施方案中，上述用于产生人类干细胞的方法还包括将人出生后细胞与组蛋白脱乙酰基酶抑制剂接触。在其它实施方案中，上述方法包括通过将以下多肽引入人出生后细胞中来促使Oct3/4、Sox2和Klf4多肽的表达：(i)包含Oct3/4多肽的氨基酸序列的第一纯化多肽；(ii)包含Sox2多肽的氨基酸序列的第二纯化多肽；和(iii)包含Klf4多肽的氨基酸序列的第三纯化多肽。在某些实施方案中，第一、第二和第三纯化多肽中的至少一种进一步包含蛋白转导域。 
在某些实施方案中，此处公开的人类干细胞具有一种或多种以下性质：多潜能性；多能性；形成畸胎瘤的能力；正常的二倍体核型；可以传代至少大约30次到至少大约100次的后代；比人类胚胎干细胞短的端粒；在大气氧气条件(例如大于5％的氧气至大约21％的氧气)下增殖而具有未分化的表型的能力；集落增殖；在由生物样品制备后，从已经传代4次或更少次数的人的体细胞或出生后细胞诱导；从胎儿体细胞诱导；从成人体细胞诱导；从包括以下任何细胞的细胞群体诱导：成人皮肤成纤维细胞、成人外周血单核细胞、成人骨髓衍生单核细胞、新生儿皮肤成纤维细胞、人脐静脉内皮细胞、人脐动脉平滑肌细胞、人出生后的骨骼肌细胞、人出生后的脂肪细胞、人出生后的外周血单核细胞或人脐血单核细胞；从上述细胞群体诱导，其中，所述群体从已经冷冻储存并在制备前融化的细胞组合物制备。 
此处提供的许多方面涉及任何上述人类干细胞。这些方面包括：人类干细胞的纯化群体；从人类干细胞分化的细胞(如纯化的分化细胞的群体)。这些分化的干细胞包括但不限于：胰腺β细胞、神经干细胞、皮层神经元、多巴胺能神经元、少突胶质细胞(oligodendrocyte)或少突胶质细胞祖细胞、肝细胞或肝干细胞或心肌细胞。其它相关方 面包括以下方法：通过将人类干细胞悬浮于低温保藏培养基中并冷冻产生的悬浮液来存储人类干细胞的方法；通过分化人类干细胞来产生分化细胞(包括任何上述分化的细胞)的方法；将分化细胞(例如，基本上不含其它细胞类型的分化细胞)引入人类受试者的方法，其中所述分化的细胞与所述受试者具有相同的基因组或与所述受试者免疫相容。进一步有关的方面包括：包含人类干细胞和低温保藏培养基的组合物；包含人类干细胞和含有纯化的生长因子(例如，大约4ng/ml至大约100ng/ml的浓度)的培养基的组合物。在各种实施方案中，这些生长因子可以包括bFGF、FGF-2、PDGF、EGF、IGF、胰岛素、TGFb-1、激活蛋白A(activin A)、Noggin、BDNF、NGF、NT-1、NT-2或NT-3、IGF、IGFI、IGFII或FGF生长因子家族成员中的一种或多种。 
在又另一方面，本发明提供了包含至少一种以下成分的组合物： 
i.包含蛋白转导域和Oct3/4多肽的氨基酸序列的纯化的多肽； 
ii.载体试剂和纯化的Oct3/4多肽； 
iii.包含蛋白转导域和Sox2多肽的氨基酸序列的纯化的多肽； 
iv.载体试剂和纯化的Sox2多肽； 
v.包含蛋白转导域和Klf4多肽的氨基酸序列的纯化的多肽； 
vi.载体试剂和纯化的Klf4多肽； 
vii.包含蛋白转导域和c-Myc多肽的氨基酸序列的纯化的多肽； 
viii.载体试剂和纯化的c-Myc；或 
(i)至(viii)的任意组合。 
在某些实施方案中，上述组合物包含成分(i)至(vii)中的至少2种、3种或4种。在另一方面，本发明提供了通过促使在人出生后细胞中表达多肽来产生人类干细胞的方法，其中，所述多肽包括Oct3/4多肽、Sox2多肽和Klf4多肽。在某些实施方案中，在本方法中使用的人出生后细胞在由生物样品制备后传代4次或更少的次数。在某些实施方案中，由包含已经冷冻储存然后融化的人出生后细胞的组合物制备人出生后细胞。在一种实施方案中，人出生后细胞来自成年人。在某些实施方案中，用于本方法的人出生后细胞包括成人骨髓衍生单核细胞、 新生儿皮肤成纤维细胞、脐静脉内皮细胞、脐动脉平滑肌细胞、出生后骨骼肌细胞、出生后脂肪细胞、出生后外周血单核细胞、脐血单核细胞或胎盘细胞。在某些实施方案中，在本方法中使用的人出生后细胞在由生物样品制备后传代4次或更少的次数。在某些实施方案中，在促使表达前，以大约103细胞/cm2至大约104细胞/cm2的密度培养人出生后细胞。在某些实施方案中，在5％或更低(如2％或更低)的血清浓度的存在下，培养人出生后细胞。在某些实施方案中，在促使表达前，在bFGF、FGF-2、PDGF、EGF、IGF、胰岛素、TGFb-1、激活蛋白A、Noggin、BDNF、NGF、NT-1、NT-2、NT-3或FGF生长因子家族成员中的一种或多种的存在下，培养人出生后细胞。在某些实施方案中，通过将一种或多种编码Oct3/4、Sox2和Klf4多肽的表达载体引入人出生后细胞中来促使Oct3/4、Sox2和Klf4多肽的表达。这些载体包括，例如，重组逆转录病毒、慢病毒或腺病毒；逆转录病毒表达载体、慢病毒表达载体、核酸表达载体或质粒表达载体。在其中重组逆转录病毒用于促使表达的其它实施方案中，该方法包括在引入一种或多种编码Oct3/4、Sox2和Klf4多肽的逆转录病毒载体之前，将用于表达小鼠来源的阳离子氨基酸转运体(mCAT)多肽的表达载体引入培养的人类细胞群体中。 
在某些实施方案中，这种方法不包括促使c-Myc多肽的表达。在其它实施方案中，该方法包括促使c-Myc多肽的表达。在一种实施方案中，该方法不包括促使TERT多肽的表达。 
在某些实施方案中，这种方法还包括将人出生后细胞与组蛋白脱乙酰基酶抑制剂接触。 
在某些实施方案中，促使Oct3/4、Sox2和Klf4多肽的表达包括将一种或多种表达载体引入人出生后细胞中。在某些实施方案中，上述用于产生人类干细胞的方法还包括在促使表达后，分离比周围细胞更小的细胞的一个或多个集落，并确定所述一个或多个集落中的至少一个，其表达碱性磷酸酶、Nanog、TDGF1、Dnmt3b、FoxD3、GDF3、CYP26A1、TERT和zfp42。 
在某些实施方案中，该方法包括通过将以下多肽引入人出生后细胞的培养物中促使Oct3/4、Sox2和Klf4多肽的表达：(i)包含Oct3/4多肽的氨基酸序列的第一纯化多肽；(ii)包含Sox2多肽的氨基酸序列的第二纯化多肽；和(iii)包含Klf4多肽的氨基酸序列的第三纯化多肽。在一种实施方案中，以上提到的多肽中的至少一种进一步包含蛋白转导域。 
在其它实施方案中，促使在人出生后细胞中表达Oct3/4、Sox2和Klf4多肽通过将它们与以下至少一种接触来完成： 
i.包含蛋白转导域和Oct3/4多肽的氨基酸序列的纯化的多肽； 
ii.载体试剂和纯化的Oct3/4多肽； 
iii.包含蛋白转导域和Sox2多肽的氨基酸序列的纯化的多肽； 
iv.载体试剂和纯化的Sox2多肽； 
v.包含蛋白转导域和Klf4多肽的氨基酸序列的纯化的多肽； 
vi.载体试剂和纯化的Klf4多肽； 
vii.包含蛋白转导域和c-Myc多肽的氨基酸序列的纯化的多肽；或 
(i)至(vii)的任意组合。 
在某些实施方案中，由这种方法产生的人类干细胞能够形成畸胎瘤。在某些实施方案中，由这种方法产生的人类干细胞是多潜能性的，因而能够产生外胚层、中胚层和内胚层。 
在另一方面，本发明提供了用于确定在人的体细胞(例如，人出生后体细胞)中刺激多潜能性或多能性的物质的方法，包括： 
(i)提供第一和第二培养的人的体细胞； 
(ii)将第一培养的人的体细胞与测试物质接触； 
(iii)将第二培养的人的体细胞与阴性对照物接触； 
(iv)测定在接触的第一和第二培养的细胞中胚胎干细胞标记基因的表达水平；和 
(v)比较在步骤(iii)中测定的表达水平，如果胚胎干细胞标记基因在接触的第一培养细胞中的表达水平大于在接触的第二培养细胞中 测定的表达水平，则表明该测试物质刺激多潜能性或多能性，如果胚胎干细胞标记基因在接触的第一培养细胞中的表达水平等于或低于在接触的第二培养细胞中测定的表达水平，则表明该测试物质不能刺激多潜能性或多能性，其中，测定胚胎干细胞标记基因的表达水平包括测定Tert或Cyp26A1的表达水平。 
比较在步骤(iii)中测定的表达水平，如果胚胎干细胞标记基因在接触的第一培养细胞中的表达水平大于在接触的第二培养细胞中测定的表达水平，则表明该测试物质刺激多潜能性或多能性，如果胚胎干细胞标记基因在接触的第一培养细胞中的表达水平等于或低于在接触的第二培养细胞中测定的表达水平，则表明该测试物质不能刺激多潜能性或多能性，其中，测定胚胎干细胞标记基因的表达水平的包括测定Tert或Cyp26A1的表达水平。 
在另一方面，本发明提供了在需要的受试者中进行细胞移植的方法，包括： 
(i)确定与受试者免疫相容的供体； 
(ii)由供体的出生后细胞产生诱导的多潜能干细胞系；和 
(iii)将一种或多种由诱导的多潜能干细胞系分化的细胞移植到受试者中。在某些实施方案中，如果HLA基因型与接受者的HLA基因型匹配，那么确定该供体为免疫相容的。在一种实施方案中，通过对来自免疫相容的供体的血液样品进行基因型分型，确定免疫相容的供体。在某些实施方案中，从单核血细胞诱导所述诱导的多潜能干细胞系。 
在本文所述的人类干细胞、组合物和方法的某些实施方案中，Oct3/4多肽包含与SEQ ID NO：7至少70％(例如，75％、80％、85％、90％、95％或100％)相同的氨基酸序列，Sox2多肽包含与SEQ ID NO：9至少70％(例如，75％、80％、85％、90％、95％或100％)相同的氨基酸序列，Klf4多肽包含与SEQ ID NO：11至少70％(例如，75％、80％、85％、90％、95％或100％)相同的氨基酸序列，或c-Myc多肽包含与SEQ ID NO：13至少70％(例如，75％、80％、85％、90％、95％或100％) 相同的氨基酸序列。在其它实施方案中，Oct3/4多肽包含与SEQ IDNO：6至少70％(例如，75％、80％、85％、90％、95％或100％)相同的氨基酸序列，Sox2多肽包含与SEQ ID NO：8至少70％(例如，75％、80％、85％、90％、95％或100％)相同的氨基酸序列，Klf4多肽包含与SEQ ID NO：10至少70％(例如，75％、80％、85％、90％、95％或100％)相同的氨基酸序列，或c-Myc多肽包含与SEQ ID NO：12至少70％(例如，75％、80％、85％、90％、95％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，Oct3/4多肽包含人Oct3/4或小鼠Oct3/4多肽的氨基酸序列，Sox2多肽包含人Sox2或小鼠Sox2的氨基酸序列，且Klf4多肽包含人Klf4或小鼠Klf4的氨基酸序列。在某些实施方案中，Oct3/4多肽是除Oct3/4之外的Oct家族成员，Sox2多肽是除Sox2之外的Sox家族成员，Klf4多肽是除Klf4之外的Klf家族成员，且c-Myc多肽是除c-Myc之外的c-Myc家族成员。在某些实施方案中，c-Myc多肽具有可诱导的活性。在一种实施方案中，c-Myc多肽是c-Myc-雌激素受体(c-Myc-ER)融合多肽。 
引用参考
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都引入本文作为参考，如同每一单独的出版物、专利或专利申请具体且单独地引入作为参考。 
附图简述 
在所附的权利要求中具体说明了本发明的新特征。通过参考下面使用本发明原理的阐明示例性实施方案的详述和附图可以获得对本发明的特征和优势的更好理解： 
图1是细胞的诱导方法和应用的概述。 
图2显示Nanog和Tert基因在引入4种基因的成人骨髓衍生细胞中的相对表达。将Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc引入在低血清条件下由成人骨髓衍生的单核细胞建立的细胞中。从所获得的集落中提取RNA， 并通过定量PCR证明人Nanog和人Tert基因的表达。没有引入这4种基因的成纤维细胞和间充质干细胞用作实验中的对照。基因表达量表示为相对值，其中表达量用人次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)基因的表达量标准化，并通过设置为在由新生儿皮肤成纤维细胞诱导的碱性磷酸酶(ALP)阳性集落中HPRT基因的表达量。现证明，Nanog和Tert在已引入4种基因(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)并且为碱性磷酸酶阳性的集落中的表达明显较高。 
图3显示Nanog和Tert基因在已引入4种基因的新生儿成纤维细胞中的相对表达。将Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc引入源自新生儿皮肤的初始培养的成纤维细胞；从获得的集落中提取RNA；并通过定量PCR确定人Nanog和人Tert基因的表达量。其中没有引入4种基因的亲本成纤维细胞和间充质干细胞用作实验中的对照。使用与图2中列出的程序相同的程序对基因表达标准化。现证明，Nanog和Tert在已引入4种基因并且为ALP阳性的集落中的表达明显较高。 
图4显示Nanog和Tert基因在已引入3种基因并用组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂处理的成年小鼠骨髓衍生细胞中的相对表达。将3种基因(Oct3/4、Sox2和Klf4)引入在低血清条件下建立的小鼠骨髓衍生的细胞中。也用HDAC抑制剂MS-275(0.1或1.0μM)处理该细胞。从所获得的集落中提取RNA，并通过定量PCR测定Nanog的表达量。从已引入3种基因并用组蛋白脱乙酰基酶抑制剂处理的细胞形成ALP-阳性细胞组(集落)，并且证明Nanog在这些集落中的表达明显高于ALP-阴性集落。在图中，W1、W2、W3、W4、W5和W6代表在实施例12中使用的6孔板的每孔的名称。 
图5显示人类iPS克隆1-8的表征。图a显示其亲本成纤维细胞(批号5F0438)的形态；图b显示在鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养细胞上培养的人类iPS克隆1-8细胞的形态；图c显示人类iPS克隆1-8细胞在mTeSR1培养基中的形态；图d显示在mTeSR1培养基中的克隆2-4细胞；图e显示在mTeSR1培养基中的克隆3-2细胞。图f和g显示克隆1-8的生长曲线。箭头指示检查的日期。正方形表示计数细胞数来估计细 胞增殖率的时期。图h是表明iPS克隆1-8衍生的细胞在第101天的正常核型(karyotype)的多色核型图。 
图6显示人类iPS克隆1-8中转录因子、细胞表面抗原和ALP活性的表征。针对Nanog(图a)、SSEA-3(图b)、SSEA-4(图c)、TRA-1-60(图d)、TRA-1-81(图e)、CD9(图f)、CD24(图g)、Thy-1(也称为CD90)(图h)染色人类iPS细胞(克隆1-8)。绿色荧光染色表明，人类iPS克隆1-8表达所有这些表面抗原。ALP染色表明iPS克隆1-8是ALP阳性的。箭头指示绿色荧光染色的区域。 
图7显示人类iPS克隆1-8细胞的基因表达的RT-PCR分析。图a显示hES标记基因在克隆1-8及其亲本成纤维细胞(NeoFB)中的表达的RT-PCR分析。除了CYP26A1(35个循环)，以30个循环检测基因。图b显示4种转基因在克隆1-8中的沉默化。使用基因转导17天后获得的粗成纤维细胞作为对照。“外”(″Exo″)引物组选择性地检测外源基因的表达；“总”引物组检测内源和外源基因的表达。 
图8显示人类iPS克隆1-8细胞的全基因表达的散点图分析。散点图显示在mTeSR1中培养的人类iPS克隆1-8细胞与使用MEF的H14 hES细胞(来自公共数据库GEO的GSM151741)之间全基因表达的比较(图a)，或克隆1-8与其亲本成纤维细胞之间的全基因表达的比较(图b)。在两个散点图中，用线条指出ES细胞特异性的基因的标记。用从红色(高)到绿色(低)的比色度显示表达强度。箭头指示代表性颜色区域。 
图9显示基于全基因表达分析，不同的细胞系和基因树的全基因表达。基于由International Stem Cell Initiative确定的一组基因(见表21)将细胞在基因树上聚类。样品分别命名如下：在mTeSR中培养的克隆1-8命名为″1-8mTeSR″；在MEF调节培养基中培养的克隆1-8命名为″1-8CM″；在冻融处理后在mTeSR中培养的克隆1-8命名为″1-8mTeSR(f&t)″；在MEF上培养的克隆1-8命名为″1-8MEF″；在mTeSR培养基中培养的克隆2-4命名为″2-4mTeSr″；在MEF上培养的克隆2-4命名为″2-4MEF″；在mTeSR培养基中培养的克隆3-2命名为 ″3-2mTeSR″；亲本成纤维细胞命名为“5F0438”或“5F0416”；在MEF上培养的Sheff 4系命名为″hES1″、″hES2″、″hES3″(分别为GSM194307、GSM 194308、GSM 194309)；在基质胶(matrigel)上培养的Sheff 4系命名为″hES4″或″hES5″(分别为GSM 194313、GSM194314)；在MEF上培养的H14系命名为″hES6″或″hES7″(GSM151739、GSM151741)；GSM96262命名为″成纤维细胞1″；GSM96263命名为″成纤维细胞2″；GSM96264命名为″成纤维细胞3″。用从红色(高)到绿色(低)的比色度显示表达强度。 
图10显示基于全基因表达分析，不同的细胞系和基因树的全基因表达。基于与在人类ES细胞(7种GEO数据)中和在成纤维细胞(3种GEO数据)中相比为0.99至1的比率的Nanog基因表达的相关的一组基因，在基因树上聚类细胞。分别命名以下样品：在mTeSR中培养的克隆1-8命名为″1-8mTeSR″；在MEF调节培养基中培养的克隆1-8命名为″1-8CM″；亲本成纤维细胞命名为“5F0438”；在MEF上培养的Sheff4系命名为″hES1″、″hES2″、″hES3″(分别为GSM 194307、GSM 194308、GSM 194309)；在基质胶上培养的Sheff 4系命名为″hES4″或″hES5″(分别为GSM 194313、GSM 194314)；在MEF上培养的H14系命名为″hES6″、″hES7″(GSM151739、GSM151741)；GSM96262命名为″成纤维细胞1″；GSM96263命名为″成纤维细胞2″；GSM96264命名为″成纤维细胞3″。用从红色(高)到绿色(低)的比色度显示表达强度。 
图11显示人类iPS 1-8中的启动子的甲基化分析。对于CpG的甲基化(图a)，分析Oct3/4启动子(包括远端增强子(Oct3/4-Z1)和近端启动子区域(Oct3/4-Z2))和Nanog启动子的部分(包括近端启动子区域(Nanog-Z1、-Z2))。图b显示由圆形所示的、用百分比表示的CpG上的甲基化的比例。 
图12显示由培养94天的人类iPS-1-8mTeSR细胞衍生的细胞的形成畸胎瘤的能力。将人类iPS-1-8mTeSR细胞注射进入SCID小鼠睾丸，并在注射后56天分析。图a显示甲醛固定的畸胎瘤组织的HE和爱茜蓝(alcian blue)染色。畸胎瘤包含代表三种胚层的组织；ne：神经上 皮，ca：软骨，et：内胚道。通过HuNu染色区别源自移植的组织与宿主组织(图b-d)。图b显示表达巢蛋白的神经上皮；图c显示表达II型胶原的软骨细胞；图d显示表达甲胎蛋白的内胚道。箭头指示代表性染色区域。 
图13显示在不同条件下培养的细胞的形成畸胎瘤的能力。畸胎瘤1(图T-1)源自培养94天的人类iPS-1-8mTeSR细胞。将人类iPS-1-8mTeSR细胞注射进入SCID小鼠睾丸，并在注射后56天分析。畸胎瘤2(图T-2)源自培养102天的人类iPS-1-8mTeSR细胞。将人类iPS-1-8mTeSR细胞注射进入SCID小鼠睾丸，并在注射后48天分析。在畸胎瘤-1(图T-1)中，除了在图12中观察的3种胚层，还观察平滑肌细胞(α-SMA阳性)和分泌性上皮(MUC-1阳性)。箭头指示代表性染色区域。 
图14显示在不同条件下培养的细胞的形成畸胎瘤的能力。畸胎瘤3(图T3)源自培养114天的人类iPS-1-8mTeSR细胞。将人类iPS-1-8mTeSR细胞注射进入SCID小鼠睾丸，并在注射后42天分析。观察类似于图12和13的三种胚层。图T-F1和F2显示源自培养134天(传代19次)的冷冻-融化的iPS-1-8mTeSR细胞的畸胎瘤。将人类iPS-1-8mTeSR细胞注射进入SCID小鼠睾丸，并在注射后46天(图T-F1)和48天(图T-F2)分析。观察由3种胚层组成的组织。在T-F2实验中还观察黑素细胞。甚至在冷冻和融化后，仍保持多潜能性。箭头指示代表性染色区域。 
图15显示在人类iPS克隆1-8中检测到的转基因的Southern印迹和PCR分析。通过Southern印迹分析检测Oct3/4、Sox2和Klf4转基因。据评估人类iPS克隆1-8具有各自大约10份拷贝的Oct3/4转基因和Sox2转基因及一份拷贝的Klf4转基因。对于c-Myc转基因，进行基因组PCR分析。设计引物组包含完整的第二内含子。黑色箭头指示目标转基因的位置。白色箭头指示内源性c-Myc的位置。 
图16显示在由4种基因(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)诱导的ALP阳性集落中hES标记基因的表达谱。在4种基因转导后17天，针对ALP 对集落染色。仔细分析所有的ALP(+)集落，并评价hES标记基因表达。图a显示表达Nanog、TDGF1、Dnmt3b、zfp42、FoxD3、TERT、CYP26A1和GDF3的集落数。图b显示八阳性集落的形态。图c-d显示通过各个实验分类的hES细胞标记基因的数目。 
图17-图23显示根据ES细胞相关的8种基因(Nanog、TDGF1、Dnmt3b、zfp42、FoxD3、TERT、CYP26A1和GDF3)的基因表达谱以及ALP活性分类的4种基因(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)诱导的集落的形态。圆形表示选出的集落。 
图24是人类Oct3/4的预测的突变耐受性图谱的图示。 
图25是人类Sox2的预测的突变耐受性图谱的图示。 
图26是人类Klf4的预测的突变耐受性图谱的图示。 
图27是人类c-Myc的预测的突变耐受性图谱的图示。 
图28显示使用转基因由小鼠胚胎成纤维细胞诱导ALP阳性集落。(Sox2、c-Myc和Klf4)和(Oct4、Sox2和c-Myc)的基因组合可以在第12天诱导ALP集落。 
图29显示使用转基因由小鼠成年神经干细胞诱导ALP阳性集落。相比MEF细胞，成年神经干细胞不需要外源性Sox2的表达来诱导ALP集落。 
图30显示使用3或4种转基因由小鼠骨髓衍生细胞诱导ALP阳性集落。可以在不使用c-Myc或Klf4的情况下诱导ALP集落。 
图31显示使用2种或4种转基因由小鼠骨髓衍生细胞诱导ALP阳性集落。Sox2和cMyc的组合可以诱导ALP集落。 
发明详述 
目录 
I.概述____________________________________________________________17 
II.细胞的制备_____________________________________________________18 
A.可诱导细胞的描述________________________________________________18 
B.细胞的收集______________________________________________________20 
III.诱导____________________________________________24 
A.概述______________________________________________24 
B.细胞培养__________________________________________24 
C.诱导因子__________________________________________30 
D.HDAC抑制剂________________________________________31 
E.IF表达载体________________________________________34 
1.重组病毒__________________________________________36 
2.核酸载体__________________________________________44 
3.蛋白质转导________________________________________45 
F.诱导因子序列______________________________________47 
G.亚克隆诱导的细胞集落______________________________60 
H.传代并维持诱导的细胞______________________________61 
IV.诱导细胞的分析___________________________________62 
A.甲基化分析________________________________________64 
B.自我更新分析______________________________________64 
C.核型分析__________________________________________65 
D.畸胎瘤分析________________________________________65 
E.全基因表达________________________________________66 
V.诱导细胞的描述____________________________________67 
VI.细胞分化_________________________________________73 
VII.细胞疗法________________________________________77 
VIII.分析方法_______________________________________80 
IX.细胞的存储_______________________________________83 
X.实施例____________________________________________84 
XI.表格_____________________________________________133 
I.概述
本公开内容的特征在于诱导的多能和多潜能干细胞和相关的方法和组合物。多潜能干细胞具有分化成所有三种胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞的能力；与之相比，多能干细胞能够产生一种或多种特定胚层的细胞类型，但不一定是所有三种。 
诱导细胞成为多能性或多潜能性的方法基于促使多肽的表达，尤其是在维持或调节ES细胞的自我更新和/或多潜能性方面发挥作用的蛋白质的表达。这些蛋白质的例子是Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc转录因子，所有这些都在ES细胞中高表达。促使表达可以包括将编码目标多肽的表达载体引入细胞中，用重组病毒转导细胞，将外源性的纯化的目标多肽引入细胞中，将细胞与非天然存在的诱导编码目标多肽(例如，Oct3/4、Sox2、Klf4或c-Myc)的内源性基因表达的试剂接触，或任何其它诱导编码目标多肽的基因(例如，内源基因Oct3/4、Sox2、Klf4或c-Myc)表达的生物学、化学或物理学方法。一些诱导细胞的基本步骤如图1所示。这些步骤可以包括：从供体例如人类供体或第三方收集细胞(100)；例如通过促使多肽如Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc的表达诱导细胞(110)；确定多能或多潜能干细胞(120)；分离集落(130)；和可选地存储细胞(140)。维持细胞的步骤散布于所有这些步骤之间，包括培养或扩增细胞。此外，细胞的储存可以发生于该方法的许多步骤之后。之后细胞可以用于许多情况，如治疗或其它用途(150)。 
胚胎干(ES)细胞具有自我更新和多潜能性。诱导的细胞也可以是自我更新和多潜能性的。然而，与ES细胞不同，诱导的细胞可以源自广泛的细胞和组织，包括非胚胎组织。 
诱导的细胞(例如，诱导的多能或多潜能干细胞)具有许多用途。它们可以经受使它们能够产生分化的细胞如神经元、肝细胞或心肌细胞的条件。它们也可以产生具有分化成特定谱系的其它细胞的能力的其它类型的干细胞，如神经干细胞、肝干细胞或心脏干细胞。诱导的细胞和由它们分化的细胞也可以用于医学治疗，如细胞替代治疗。由 于诱导的细胞可以从非胚胎干细胞诱导，细胞治疗可以包括向受试者提供源自他或她的自身组织的细胞，从而减轻免疫排斥的可能性。 
本公开内容描述了诱导的多潜能和多能干细胞、它们的制备及它们的存储。本公开内容进一步描述由诱导的多潜能和多能干细胞分化的细胞、它们的制备和它们的存储。还描述了诱导的细胞或由它们分化的细胞用于细胞治疗的用途。还提供了分析方法和细胞储库(cellbanking)的方法。 
II.细胞的制备
A.可诱导细胞的描述
多能或多潜能干细胞可以由多种哺乳动物细胞诱导。哺乳动物细胞的合适群体的例子包括那些包括但不限于以下细胞的群体：成纤维细胞、骨髓衍生的单核细胞、骨骼肌细胞、脂肪细胞、外周血单核细胞、巨噬细胞、肝细胞、角质形成细胞、口腔角质形成细胞、毛囊真皮细胞、胃上皮细胞、肺上皮细胞、滑膜细胞、肾细胞、皮肤上皮细胞或成骨细胞。 
该细胞也可以来源于许多不同类型的组织，如骨髓、皮肤(如真皮、表皮)、肌肉、脂肪组织、外周血、包皮、骨骼肌或平滑肌。这些细胞也可以来自新生儿组织，包括但不限于：脐带组织(例如，脐带、脐血、脐血管)、羊膜、胎盘或其它各种新生儿组织(如骨髓液、肌肉、脂肪组织、外周血、皮肤、骨骼肌等)。 
所述细胞可以来自在从出生包括剖腹产出生到死亡的期间内从受试者收集的新生儿或出生后组织。例如，该组织可以来自＞10分钟大的、＞1小时大的、＞1天大的、＞1个月大的、＞2个月大的、＞6个月大的、＞1岁大的、＞2岁大的、＞5岁大的、＞10岁大的、＞15岁大的、＞18岁大的、＞25岁大的、＞35岁大的、＞45岁大的、＞55岁大的、＞65岁大的、＞80岁大的、＜80岁大的、＜70岁大的、＜60岁大的、＜50岁大的、＜40岁大的、＜30岁大的、＜20岁大的或＜10岁大的受试者。该受试者可以是新生婴儿。在某些情况下，受试者是儿童或成人。在某些实例中，所述组织来自2、5、10或20小时大的人。在其它实例中，组织来自1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、9个月或12个月大的人。在某些情况下，所述组织来自1岁、2岁、3岁、4岁、5岁、18岁、20岁、21岁、23岁、24岁、25岁、28岁、29岁、31岁、33岁、34岁、35岁、37岁、38岁、40岁、41岁、42岁、43岁、44岁、47岁、51岁、55岁、61岁、63岁、65年、70岁、77岁或85岁大的人。
所述细胞可以来自非胚胎组织，例如，处于迟于胚胎期的发育期。在某些情况下，细胞可以来自处于迟于胎儿期的发育期的组织。 
所述细胞优选地来自人类受试者，但也可以源于非人类受试者，例如，非人哺乳动物。非人哺乳动物的例子包括但不限于非人灵长类动物(如猿、猴子、大猩猩)、啮齿动物(如小鼠、大鼠)、牛、猪、羊、马、狗、猫或兔子。 
这些细胞可以从具有多种疾病状态的受试者中收集。这些细胞可以从未患有不利的健康状况的受试者中收集。在其它情况下，受试者患有或处于患有疾病或障碍的高风险，例如，慢性健康状况，如心血管疾病、眼睛疾病(如黄斑变性)、听觉疾病(如耳聋)、糖尿病、认知障碍、精神分裂症、抑郁症、双相型障碍、痴呆症、神经退化病、阿尔茨海默病、帕金森氏病、多发性硬化症、骨质疏松症、肝病、肾病、自身免疫性疾病、关节炎或增生症(如癌症)。在其它情况下，受试者患有或处于患有急性健康状况的高风险，例如中风、脊髓损伤、烧伤或创伤。在某些情况下，受试者提供细胞用于他或她的未来的应用(例如自体治疗)，或用于另一个可能需要接受处理或治疗的受试者(例如异体治疗)。在某些情况下，供体和接受者是免疫组织学相容或HLA匹配的。 
可以从单一细胞或细胞群体获得待诱导的细胞。群体可以是均质或不均质的。这些细胞可以是在人类细胞样本中发现的细胞群体，例如，活检组织或血液样本。细胞通常是体细胞。这些细胞可以是细胞系。在某些情况下，细胞来自与其它细胞融合的细胞。在某些情况下， 细胞不是来自与其它细胞融合的细胞。在某些情况下，细胞不是来自与其它细胞人工融合的细胞。在某些情况下，细胞不是已经历称为体细胞核转移(SCNT)的过程的细胞或由经历SCNT的细胞传下来的细胞。 
细胞群体可以包括分化和未分化的细胞。在某些情况下，群体主要包含分化的细胞。在其它情况下，群体主要含有未分化的细胞，例如，未分化的干细胞。可以诱导群体中的未分化的细胞成为多潜能性或多能性的。在某些情况下，诱导细胞群体内的分化细胞成为多潜能性或多能性的。 
细胞群体可以包括未分化的干细胞或幼稚(naive)干细胞。在某些情况下，未分化的干细胞是没有经历由于以下至少4种基因、至少3种基因、至少2种基因、至少1种基因或没有基因的DNA甲基化或组蛋白修饰而形成异染色质所导致的外遗传失活修饰的干细胞：Nanog、Oct3/4、Sox2和Tert。当从存在于人出生后组织中的未分化的干细胞诱导人类多潜能性干细胞时，可能会发生这些基因如Tert、Nanog、Oct3/4或Sox2的活化或表达。 
B.细胞的收集 
获得人的体细胞的方法是已经建立的，如Schantz和Ng(2004)，AManual for Primary Human Cell Culture，World Scientific PublishingCo.，Pte，Ltd所述。在某些情况下，该方法包括获得细胞样本，例如，通过活检(例如，皮肤样本)、抽血或肺泡灌洗或其它肺灌洗。应该理解，从组织制备的细胞的最初平板接种(plating)密度根据如下变量而变化，如预期的生命力或来自特定组织的细胞的粘附。获得不同类型的人的体细胞的方法包括但不限于以下示例的方法： 
1.骨髓
给予供体全身麻醉，并置于俯卧位。从髂骨的后缘，直接将采集针插入皮肤，并通过髂骨表面到达骨髓，将从来自骨髓的液体抽入注 射器。通过从骨髓成骨区分离骨髓细胞来富集体干细胞。然后通过密度梯度离心由抽出物制备单核细胞部分。然后在用于本文所述的诱导方法之前，培养收集的粗单核细胞部分。 
2.出生后的皮肤
收获含有真皮的皮肤组织，例如，从膝的后部或臀部收获。然后在37℃下在含有1％抗生素/抗真菌剂(antimycotics)的0.6％胰蛋白酶/Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)/F-12中培养该皮肤组织30分钟，皮肤内侧向下。 
在翻转皮肤组织后，使用镊子轻轻擦拭皮肤内侧。使用剪刀将皮肤组织细致地切成1mm2的切片，然后在室温下以1200rpm离心10分钟。除去上清液，并向组织沉淀加入25ml的0.1％胰蛋白酶/DMEM/F-12/1％抗生素、抗真菌剂。使用搅拌器在37℃下以200-300rpm搅拌该混合物40分钟。在确认该组织沉淀物完全消化后，加入3ml胎牛血清(FBS)(由JRH生产)，并依次用纱布(由PIP生产的I型)、100μm尼龙过滤器(由FALCON生产)和40μm尼龙过滤器(由FALCON生产)过滤。在室温下以1200rpm离心获得的滤液10分钟以除去上清液，之后加入DMEM/F-12/1％抗生素、抗真菌剂来清洗沉淀，然后在室温下以1200rpm离心10分钟。然后，在诱导前培养由此获得的细胞部分。 
可以通过从头皮组织分离真皮乳头来富集真皮干细胞。冲洗人头皮组织(0.5-2cm或更小)，修整以除去多余的脂肪组织，并切成小片。在4℃下、在12.5mg/ml溶于DMEM的分散酶(dispase)(Invitrogen，Carlsbad，CA)中酶消化这些组织片24小时。酶处理后，从真皮上剥下表皮；从真皮中拔出毛囊。用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗毛囊；并除去表皮和真皮。显微镜可用于此方法。通过在含有DMEM和10％FCS的培养基中在塑料组织培养皿上培养外植的乳头一周，产生源自单一真皮乳头的细胞。当产生单一真皮乳头细胞时，取出这些细胞，并在补充有FGM-2 SingleQuots(Lonza)的FBM中培养，或在20ng/ml EGF、40ng/ml FGF-2和B27的存在下无血清培养。 
可以从人头皮组织(0.5-2cm2或更小)富集表皮干细胞。冲洗人头皮组织(0.5-2cm或更小)，修整以除去多余的脂肪组织，并切成小片。在4℃下、在12.5mg/ml溶于Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)的分散酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)中酶消化这些组织片24小时。酶处理后，从真皮上剥下表皮；从真皮中拔出毛囊。在显微镜下切开毛球(bulb)和完整的外根鞘(ORS)。清洗后，将毛囊转入塑料皿。然后，使用细针从上部的毛囊切开凸起区域。清洗后，将凸起部转移到新皿中，并在包含DMEM/F12和10％FBS的培养基中培养。确认细胞后，将培养基改为EpiLifeTM Extended-Lifespan Serum-FreeMedium(Sigma)。 
3.出生后的骨骼肌
切开含有肌肉如肱二头肌的外侧头或腿部缝匠肌的结缔组织的表皮并切下肌肉组织，之后将其缝合。用剪刀或手术刀切碎获得的完整的肌肉，然后悬浮于含有0.06％IA型胶原酶和10％FBS的DMEM(高葡萄糖)中，并在37℃下孵育2小时。 
通过离心从切碎的肌肉收集细胞，并悬浮于含有10％FBS的DMEM(高葡萄糖)中。使悬浮液经过具有40μm孔径的微量过滤器、然后经过具有20μm孔径的微量过滤器，之后可以将获得的细胞部分作为含有未分化的干细胞的粗纯化细胞进行培养，并用于本文所述的人类多潜能干细胞的诱导。 
4.出生后的脂肪组织
用于本发明的源自脂肪组织的细胞可以通过本领域技术人员已知的各种方法分离。例如，在美国专利6,153,432(本文完整引入)中描述了这种方法。脂肪组织的一个优选的来源是网膜脂肪组织。在人类中，通常通过抽脂(fat aspiration)分离脂肪细胞。 
在一种分离源自脂肪细胞的细胞的方法中，用0.01％至0.5％，如 0.04％至0.2％、0.1％的胶原酶；0.01％至0.5％，如0.04％或0.2％的胰蛋白酶；和/或0.5ng/ml至10ng/ml分散酶或有效量的透明质酸酶或脱氧核糖核酸酶(DNA消化酶)，和大约0.01至大约2.0mM，如大约0.1至大约1.0mM或0.53mM乙二胺四乙酸(EDTA)在25至50℃如33至40℃或37℃下处理脂肪组织10分钟至3小时，如30分钟到1小时或45分钟。 
使细胞通过20微米至800微米、更优选40微米至400微米、最优选70微米的尼龙或粗滤布网过滤器。然后对培养液中的细胞直接进行或使用Ficoll或Percoll或另一种微粒梯度进行差速离心。在4至50℃，优选20至40℃和更优选大约25℃下，以100至3000×g、更优选200至1500×g、最优选500×g离心这些细胞1分钟至1小时，更优选2至15分钟，最优选5分钟。 
可以根据本文所述的方法，将如此获得的源自脂肪组织的细胞部分作为含有未分化的干细胞的粗纯化细胞进行培养，并用于人类多潜能或多能干细胞的诱导。 
5.血液
收集大约50ml至大约500ml的静脉血液或脐血，并通过如Kanof等人，(1993)，Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevack和W.Strober编)，ch.7.1.1.-7.1.5，John Wiley & Sons，New York所述的Ficoll-Hypaque方法获得单核细胞部分。 
在分离单核细胞部分后，将大约1×107至1×108的人外周血单核细胞悬浮于含有10％胎牛血清，100μg/ml链霉素和100单位/ml青霉素的RPMI 1640培养基中，并在清洗两次后，回收细胞。将回收的细胞重悬浮于RPMI 1640培养基中，然后以大约1×107细胞/皿的密度接种于100mm塑料培养皿中，并在37℃、8％CO2培养箱中培养。10分钟后，除去保留于悬浮液中的细胞，并通过移液操作收获贴壁细胞。然后在本文所述的诱导期之前培养产生的贴壁的单核细胞部分。在某些 情况下，可以根据本文所述的方法，将如此获得的源自外周血或源自脐血的贴壁细胞部分作为含有未分化的干细胞的粗纯化细胞进行培养，并用于人类多潜能或多能干细胞的诱导。 
通过在补充有10％的热灭活胎牛血清(FBS；JRH Biosciences，Lenexa，KS)、2mM L-谷氨酰胺、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素的低葡萄糖DMEM中培养单核细胞部分，富集外周血中的巨噬细胞。为了扩增巨噬细胞，以2×106/ml的密度在已经用10μg/ml FN(Sigma，St.Louis，MO)在4℃下过夜处理的塑料板上涂布外周血单核细胞。然后在湿润气氛中、37℃、5％CO2下，在没有任何另外的生长因子的情况下，培养细胞。每3天更换一次含有漂浮的细胞的培养基。具有可观察的成纤维细胞特征的巨噬细胞可以用于诱导实验。 
在某些情况下，如美国专利申请11/885,112所述，扩增来自外周血、脐血或骨髓的细胞部分，然后用于本文所述的诱导方法。 
III.诱导
A.概述
在诱导过程中，在培养的细胞中进行促使某些多肽的表达一段时间，之后，针对表征多能和多潜能干细胞的许多性质(如形态学、基因表达)筛选诱导的细胞。然后亚克隆并扩增满足这些筛选标准的诱导的细胞。在某些情况下，在诱导过程前，可以培养待诱导的细胞一段时间。或者，待诱导的细胞可以直接用于诱导过程而不经预先的培养期。在某些情况下，在诱导过程之前、期间和之后的不同时间点使用不同的细胞培养基。例如，可以在组织收集后和/或紧接诱导过程前使用一种类型的培养基，同时在诱导过程期间和/或之后使用第二种类型的培养基。有时，在诱导过程期间和/或之后使用第三种类型的培养基。 
B.细胞培养
收集后，可以在任何适于收集的特定细胞或组织的培养基中培养 组织或细胞样品。可以在其中培养组织或细胞的一些代表性培养基包括但不限于：多能成年祖细胞(MAPC)培养基；FBM(由Lonza生产)；胚胎干细胞(ES)ES培养基；间充质干细胞生长培养基(MSCGM)(由Lonza生产)；MCDB202改良培养基；内皮细胞培养基套装-2(EBM2)(由Lonza生产)；Iscove改良Dulbecco培养基(Sigma)；Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)；MEF调节的ES(MC-ES)；和mTeSRTM(例如，可从StemCell Technologies，Vancouver，Canada获得的)，参见，例如，Ludwig等人，(2006)，Nat Biotechnol.，24(2)：185-187。在其它情况下，使用可替代的用于人类ES细胞生长的培养条件，如Skottman等人，(2006)，Reproduction，132(5)：691-698所述。 
MAPC(2％的FBS)培养基可以包含：60％的Dulbecco改良Eagle培养基-低葡萄糖、40％MCDB 201、胰岛素转铁蛋白硒补充剂(0.01mg/ml的胰岛素；0.0055mg/ml转铁蛋白；0.005mg/ml亚硒酸钠)、1×亚麻酸白蛋白(1mg/mL白蛋白；2摩尔亚麻酸/摩尔白蛋白)、1nM地塞米松、2％胎牛血清、1nM地塞米松、10-4M抗坏血酸、10μg/ml庆大霉素。 
FBM(2％FBS)培养基可以包含：MCDB202改良培养基、2％胎牛血清、5μg/ml胰岛素、50mg/ml庆大霉素、50ng/ml两性霉素-B。 
ES培养基可以包含：40％Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、40％F12培养基、2mM L-谷氨酰胺、1×非必需氨基酸(Sigma，Inc.，St.Louis，MO)、20％Knockout Serum ReplacementTM(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)和10μg/ml庆大霉素。 
MC-ES培养基可如下制备。在丝裂霉素C处理的鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上调节ES培养基20至24小时，收获，通过0.45μM过滤器过滤，并补充大约0.1mM β-巯基乙醇、大约10ng/ml bFGF或FGF-2以及可选地大约10ng/ml激活蛋白A。在某些情况下，使用辐照的MEF替代丝裂霉素C处理的MEF。在其它情况下，使用STO(ATCC)或人类成纤维细胞替代MEF。 
可以在补充有特定血清的培养基中培养细胞。在某些实施方案 中，血清是胎牛血清(FBS)。血清也可以是胎牛血清(FCS)。在某些情况下，血清可以是人血清(例如，人AB血清)。也可以使用血清混合物，例如，FBS和人AB血清、FBS和FCS或FCS和人AB的混合物。 
在收集组织和制备细胞后，使用适当的培养条件，可以有助于促进存在于制备的细胞中的组织干细胞或祖细胞的扩增。在某些情况下，低血清培养或无血清培养基(如本文所述)可以促进组织干细胞或祖细胞的扩增。合适的培养基包括但不限于MAPC、FBM或MSCGM。 
原代培养通常在从供体如人中分离细胞后立即进行。也可以在原代培养后传代培养这些细胞。“第二次”传代培养物描述传代培养一次的原代培养细胞，“第三次”传代培养物描述传代培养两次的原代培养物，“第四次”传代培养物描述传代培养3次的原代培养物，等等。在某些情况下，原代细胞经历第二次传代培养、第三次传代培养或第四次传代培养。在某些情况下，原代细胞经历少于4次的传代培养。本文描述的培养技术一般包括原代培养到第四次传代培养之间的时期的培养，但也可以采用其它培养期。优选地，从原代培养到第二次传代培养培养细胞。在某些情况下，细胞在经历本文所述的诱导方法前可以培养大约1天至大约12天，例如，2天、3天、4.5天、5天、6.5天、7天、8天、9天、10天，或从大约1天至大约12天的任何其它天数。在其它情况下，细胞可以培养超过12天，例如，大约12天至大约20天；大约2天至大约30天；或大约12天至大约40天。在某些实施方案中，将待诱导的细胞在诱导前传代4次或更少的次数(例如，3、2、1或0次)。 
在某些情况下，在诱导前，以低浓度培养细胞，例如，大约1×103细胞/cm2至大约1×104细胞/cm2。在其它情况下，在诱导前(例如，正好在诱导之前)，以大约1×103细胞/cm2至大约3×104细胞/cm2，或大约1×104细胞/cm2至大约3×104细胞/cm2的密度培养细胞。 
通常，如上所述，在将诱导因子引入细胞之前和/或过程中，在第 一培养基中培养细胞和/或组织；然后在将诱导因子引入细胞过程中和/或之后，在第二或第三培养基中培养细胞。第二或第三培养基可以是MEF调节的(MC)-ES、mTeSR1TM培养基或其它ES细胞培养基，如Skottman等人，(2006)，Reproduction，132(5)：691-698所述。 
在许多实例中，在启动基因或多肽在细胞中促使表达前(例如，在紧接逆转录病毒感染期后)，在MAPC、FBM或MSCGM培养基中培养细胞；然后，在启动促使表达后，如本文所述，在MC-ES培养基、mTeSR1TM培养基或其它ES细胞培养基中培养细胞。 
可以在引入诱导因子之前、期间或之后，在低血清培养条件下进行细胞培养。“低血清培养条件”指使用含有以下浓度血清的细胞培养基：从0％(v/v)(即，无血清)至大约5％(v/v)，例如，0％至2％、0％至2.5％、0％至3％、0％至4％、0％至5％、0.1％至2％、0.1％至5％、0％、0.1％、0.5％、1％、1.2％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％或5％。在某些实施方案中，低血清浓度是从大约0％(v/v)至大约2％(v/v)。在某些情况下，血清浓度是大约2％。在其它实施方案中，在“高血清条件”下培养细胞，即大于5％(v/v)的血清至大约20％(v/v)血清，例如6％、7％、8％、10％、12％、15％或20％。在高血清条件下的培养可以在引入诱导因子之前、期间和/或之后进行。具有低血清浓度的培养基特别可用于富集未分化的干细胞。例如，当在含有高浓度血清(5％或以上)的培养基中培养组织如骨髓、脂肪、肌肉或皮肤等时，通常通过分离贴附于塑料培养皿上的非造血细胞(如间质细胞)获得MSC。然而，甚至在这种培养条件下，尤其是如果在某种培养条件(例如，低传代数、低密度培养或低氧)下进行细胞传代，可以维持极少数的未分化细胞。 
当使用低或高血清条件培养细胞时，一种或多种生长因子如成纤维细胞生长因子(FGF)-2、碱性生长因子(bFGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、IGF II或胰岛素可以包含在培养基中。可以用于补充细胞培养基的其它生长因子包括但不限于以下一种或多种：转化生长因子β-1(TGF β-1)、激活蛋白A、Noggin、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子(NT)-1、NT-2或NT-3。在某些情况下，在MC-ES培养基或其它细胞培养基中使用这些因子中的一种或多种代替bFGF或FGF-2。 
在本文所述的培养基(例如，MAPC、FBM、MC-ES、MSCGM、MDM、mTeSR1TM)中的生长因子(例如，FGF-2、bFGF、PDGF、EGF、IGF、胰岛素、IGF II、TGFβ-1、激活蛋白A、Noggin、BDNF、NGF、NT-1、NT-2、NT-3)的浓度可以是从大约4ng/ml到50ng/ml，例如大约2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、10ng/ml、12ng/ml、14ng/ml、15ng/ml、17ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、45ng/ml或50ng/ml。生长因子的浓度也可以是从大约4ng/ml到10ng/ml、从大约4ng/ml到大约20ng/ml、从大约10ng/ml到大约30ng/ml、从大约5ng/ml到大约40ng/ml或从大约10ng/ml到大约50ng/ml。在其它情况下，可以使用高浓度的生长因子，例如，从大约50ng/ml到大约100ng/ml或从大约50ng/ml到大约75ng/ml。 
可以单独或组合使用生长因子。例如，可以单独向培养基中加入FGF-2；在另外一种实例中，可以向培养基中加入PDGF和EGF。经常可以使用适于特定细胞类型的生长因子。例如，可以在大约20ng/mlEGF和/或大约40ng/ml FGF-2的存在下培养真皮细胞；而可以在大约50ng/ml EGF和/或5μg/ml胰岛素的存在下培养表皮细胞。 
可以在rho或rho相关的蛋白激酶(ROCK)抑制剂的存在下保持诱导的细胞以减少细胞凋亡。当细胞受到剧烈的处理如酶处理时，ROCK抑制剂可能特别有用。例如，加入Y-27632(Calbiochem；水溶性)或Fasudil(HA1077：Calbiochem)-Rho相关激酶(Rho相关的含有卷曲螺旋的蛋白激酶)的一种抑制剂-可用于培养本发明的人类多潜能和多能干细胞。在某些情况下，Y-27632或Fasudil的浓度是从大约2.5μM到大约20μM，例如，大约2.5μM、5μM、10μM、15μM或20μM。 
可以在37℃、5％CO2培养箱中(例如，在大气中的氧气水平下)，在维持培养基中培养诱导的细胞，优选地每天更换培养基。在某些实施方案中，为了培养和生长由存在于人出生后组织中的本发明的未分化干细胞诱导的人类多潜能干细胞，优选地在含有本文所述的添加剂的培养基中，在覆盖MEF的塑料培养皿或基质胶包被的塑料培养皿上，传代培养细胞5至7天。用于诱导的细胞的维持培养基的例子包括任何及所有完全ES细胞培养基(例如，MC-ES)。可以用b-FGF或FGF2补充维持培养基。在某些情况下，维持培养基补充有其它因子，例如，IGF-II、激活蛋白A或本文所述的其它生长因子，例如，参见，Bendall等人，(2007)，Nature，30：448(7157)：1015-21。在某些实施方案中，在基于形态特征确定并选择候选的多能或多潜能干细胞集落之前，培养诱导的细胞，并观察大约14天到大约40天，如15、16、17、18、19、20、23、24、27、28、29、30、31、33、34、35、36、37、38天或从大约14天至大约40天之间的其它时间。 
用于确定候选的多能或多潜能干细胞集落的形态特征包括但不限于：相对于周围细胞较圆和较小的细胞大小和高核质比。候选的诱导的细胞大小可以是从大约5μm到大约10μm；从大约5μm大约15μm；从大约5μm大约30μm；从大约10μm大约30μm；或从大约20μm大约30μm。高核质比可以是从大约1.5∶1至大约10∶1，例如，大约1.5∶1、大约2∶1、大约3∶1、大约4∶1、大约5∶1、大约7∶1、大约8∶1、大约9.5∶1或大约10∶1。在某些情况下，诱导的细胞克隆相对于小鼠ES细胞显示扁平的形态。例如，源自外周血细胞或在不含饲养层的培养基中培养的细胞的候选诱导细胞与周围的细胞相比可能显示扁平的形态。用于确定诱导的细胞克隆的另一种形态特征是在亲本细胞之间(例如，在成纤维细胞之间)的空间内形成小单层集落。 
可以在组织培养级的塑料上直接接种并培养诱导的细胞。或者，在涂覆的基质例如涂覆有纤连蛋白、明胶、基质胶TM(BD Bioscience)、胶原蛋白或层粘连蛋白的基质上接种并培养细胞。在某些情况下，可以使用未经处理的培养皿。适用的细胞培养器皿包括，例如，35mm、 60mm、100mm和150mm的细胞培养皿、6孔细胞培养板和其它大小相当的细胞培养器皿。在某些情况下，用饲养细胞培养细胞。例如，可以在一层MEF(例如，辐照或丝裂霉素处理的MEF)上培养细胞。 
通常情况下，可以以低密度接种(或培养)诱导的细胞，这可以通过以大约1∶8到大约1∶3，例如，大约1∶8、大约1∶6、大约1∶5、大约1∶4、大约1∶3分离细胞来完成。可以以大约103细胞/cm2至大约104细胞/cm2的密度接种细胞。在某些实例中，可以以大约1.5×103细胞/cm2至大约104细胞/cm2、大约2×103细胞/cm2至大约104细胞/cm2、大约3×103细胞/cm2至大约104细胞/cm2、大约4×103细胞/cm2至大约104细胞/cm2或大约103细胞/cm2至大约9×103细胞/cm2的密度接种细胞。在某些实施方案中，可以以大于104细胞/cm2例如大约1.25×104细胞/cm2至大约3×104细胞/cm2的密度接种细胞。 
C.诱导因子
可以以多种方式诱导细胞成为多能性或多潜能性的。在某些实施方案中，在一种或多种细胞中诱导多能性或多潜能性的方法包括促使一组诱导因子的表达。促使表达可以包括将编码目标多肽的表达载体引入细胞中，将纯化的外源性目标多肽引入细胞中，或将细胞与非天然存在的诱导编码目标多肽的内源基因表达的试剂接触。 
在某些情况下，IF组包括以下一种或多种：Oct3/4多肽、Sox2多肽、Klf4多肽或c-Myc多肽。在某些情况下，该组不包括c-Myc多肽。例如，IF组可以包括以下一种或多种：Oct3/4多肽、Sox2多肽和Klf4多肽，而不包括c-Myc多肽。在某些情况下，IF组不包括可能增加细胞转化的风险或诱发癌症的风险的多肽。c-Myc诱导细胞转化的能力已有描述，例如，参见Adhikary等人，(2005)，Nat.Rev.Mol.Cell Biool，6(8)：635-645。 
在某些情况下，该组包括c-Myc多肽。在某些情况下，c-Myc多肽是c-Myc的组成型活性变异体。在某些情况下，该组包括具有诱导型活性的c-Myc多肽，例如，c-Myc-ER多肽，参见，例如，Littlewood，等 人，(1995)，Nucleic Acid Res.，23(10)：1686-90。 
在其它情况下，IF组包括：Oct3/4多肽、Sox2多肽和Klf4多肽，但不包括TERT多肽、SV40大T抗原多肽、HPV16 E6多肽、HPV16 E7多肽或Bmi1多肽。在某些情况下，IF组不包括TERT多肽。在某些情况下，IF组不包括SV40大T抗原。在其它情况下，IF组不包括HPV16 E6多肽或HPV16 E7多肽。 
在某些情况下，IF组包括3种IF，其中，3种IF中的2种是Oct3/4多肽和Sox2多肽。在其它情况下，IF组包括2种IF，例如，c-Myc多肽和Sox2多肽，或Oct3/4和Klf4多肽。在某些情况下，IF组限于Oct 3/4、Sox2和Klf4多肽。在其它情况下，IF组可能限于一组4种IF：Oct3/4多肽、Sox2多肽、Klf4多肽和c-Myc多肽。 
一组IF可以包括除了Oct3/4、Sox2和Klf4多肽以外的IF。这些另外的IF包括但不限于Nanog、TERT、LIN28、CYP26A1、GDF3、FoxD3、Zfp42、Dnmt3b、Ecat1和Tcl1多肽。在某些情况下，另外的IF组不包括c-Myc多肽。在某些情况下，另外的IF组不包括可能增加细胞转化的风险或诱发癌症的风险的多肽。 
促使的IF的表达可以维持至少大约7天至少大约40天的时间，例如，8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、25天、30天、33天或37天。 
在人细胞群体的细胞中诱导多潜能性的效率是初始培养的亲本细胞总数的至少大约0.001％到至少大约0.1％，例如，0.002％、0.0034％、0.004％、0.005％、0.0065％、0.007％、0.008％、0.01％、0.04％、0.06％、0.08％或0.09％。有时，根据供体的年龄、组织的起源或培养条件，可以实现更高的效率。 
D.HDAC抑制剂
可以通过组合组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂处理和促使IF组表达来实现细胞的诱导。待诱导的细胞可以是存在于人出生后组织中的未分化的干细胞。在其它情况下，待诱导的细胞可以是分化的细 胞或是分化和未分化细胞的混合物。 
HDAC可以与促使特定一组IF如Oct3/4、Sox2和Klf4的表达相结合。例如，在HDAC抑制剂处理结合促使Oct3/4、Sox2和Klf4的表达或促使Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc的表达后，诱导人的体细胞成为多潜能性的。在某些情况下，可以通过将3种基因(例如，Oct3/4、Sox2和Klf4)或3种基因(例如，Oct3/4、Sox2和Klf4)再加上c-Myc基因或HDAC抑制剂引入存在于人出生后组织中的未分化的干细胞中，来诱导人类多潜能性干细胞，其中，Tert、Nanog、Oct3/4和Sox2中的每种基因都没有经历过外遗传失活。在另外的情况下，可以在通过原代培养或第二培养或低密度传代培养并在包含低浓度血清的培养基中传代培养来扩增未分化的干细胞之后，通过将3种基因(例如，Oct3/4、Sox2和Klf4)或3种基因(例如，Oct3/4、Sox2和Klf4)再加上c-Myc基因或组蛋白脱乙酰基酶抑制剂引入未分化的干细胞中，来诱导人类多潜能性干细胞。 
可以用一种或多种HDAC处理细胞大约2小时至大约5天，例如，3小时、6小时、12小时、14小时、18小时、1天、2天、3天或4天。可以在开始促使IF在细胞中表达之前，启动用HDAC抑制剂的处理。在某些情况下，在促使IF在细胞中的表达期间或之后，开始HDAC抑制剂处理。在其它情况下，HDAC抑制剂处理在促使表达前开始，并在促使表达期间保持。 
根据将要使用的具体HDAC抑制剂，HDAC抑制剂的合适的浓度是大约0.001nM至大约10mM，但选择不明显降低被处理细胞中的细胞存活率的浓度。HDAC的浓度可以是从0.01nM到1000nM。在某些实施方案中，HDAC的浓度是大约0.01nM至大约1000nM，例如，大约0.05nM、0.1nM、0.5nM、0.75nM、1.0nM、1.5nM、10nM、20nM、40nM、50nM、100nM、200nM、300nM、500nM、600nM、700nM、800nM，或其它从大约0.01nM至大约1000nM的浓度。细胞暴露1至5天或1至3天。例如，细胞暴露1天、2天、3天、4天或5天。 
多种HDAC抑制剂可用于诱导实验。在一种优选实施方案中，使用HDAC抑制剂MS-275。合适的HDAC抑制剂的例子包括但不限于以下任何一种： 
A.制滴菌素A(trichostatin A)及其类似物，例如：制滴菌素A(TSA)；和制滴菌素C(Koghe等人，(1998)，Biochem.Pharmacol，56：1359-1364)。 
B.肽，例如：Oxamflatin[(2E)-5-[3-[(苯磺酰基)氨基苯基]-戊-2-烯-4-炔异羟肟酸(Kim等人，(1999)，Oncogene，18：2461-2470)；Trapoxin A(环-(L-苯丙氨酰基-L-苯丙氨酰基-D-甲基哌啶基-L-2-氨基-8-氧代-9，10-环氧-癸酰)(Kijima等人，(1993)，J.Biol.Chem.，268：22429-22435)；FR901228，缩肽(depsipeptide)(Nakajima等人，(1998).Ex.Cell Res.，241：126-133)；FR225497，环四肽(H.Mori等人，(2000)，PCT国际专利公开WO 00/08048)；Apicidin，环四肽[环-(N-O-甲基-L-色氨酰基-L-异亮氨酰基-D-甲基哌啶基-L-2-氨基-8-氧代癸酰)](Darkin-Rattray等人，(1996)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，93：13143-13147)；apicidin Ia、apicidin Ib、apicidin Ic、apicidin IIa和apicidin IIb(P.Dulski等人，PCT国际专利公开WO 97/11366)；HC-毒素，环四肽(Bosch等人，(1995)，Plant Cell，7：1941-1950)；WF27082，环四肽(PCT国际专利公开WO 98/48825)；和Chlamydocin(Bosch等人，上述)。 
C.基于异羟肟酸的混合极性化合物(HPC)，例如：水杨基异羟肟酸(SBHA)(Andrews等人，(2000)，International J.Parasitology，30：761-8)；N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)(Richon等人，(1998)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，95：3003-7)；壬二异羟肟酸(azelaic bishydroxamic acid)(ABHA)(Andrews等人，上述)；壬二-1-异羟肟酸-9-苯胺(azelaic-l-hydroxamate-9-anilide)(AAHA)(Qiu等人，(2000)，Mol.Biol.Cell，11：2069-83)；M-羧基肉桂酸二异羟肟酰胺(CBHA)(Ricon等人，上述)；6-(3-氯苯基脲基)己异羟肟酸，(3-Cl-UCHA)(Richon等人，上述)；和MW2996(Andrews等人，上述)。 
D.短链脂肪酸(SCFA)化合物，例如：丁酸钠(Cousens等人，(1979)，J.Biol.Chem.，254：1716-23)；异戊酸酯(McBain等人，(1997)，Biochem.Pharm.，53：1357-68)；丙戊酸；戊酸酯(McBain等人，上述)；4-苯基丁酸(4-PBA)(Lea和Tulsyan，(1995)，Anticancer Research，15：879-3)；苯基丁酸(PB)(Wang等人，(1999)，Cancer Research 59：2766-99)；丙酸酯(McBain等人，上述)；丁酰胺(Lea和Tulsyan，上述)；异丁酰胺(Lea和Tulsyan，上述)；乙酸苯酯(Lea和Tulsyan，上述)；3-溴丙酸酯(Lea和Tulsyan，上述)；三丁酸甘油酯(Guan等人，(2000)，Cancer Research，60：749-55)；丁酸精氨酸；异丁酰胺和丙戊酸酯。 
E.苯甲酰胺衍生物，例如：MS-275[N-(2-氨基苯基)-4-[N-(吡啶-3-基-甲氧羰基)氨甲基]苯甲酰胺](Saito等人，(1999)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，96：4592-7)；和MS-275的3′-氨基衍生物(Saito等人，上述)；和CI-994。 
组蛋白脱乙酰基酶抑制剂处理可以例如如下进行。HDAC抑制剂的浓度可能取决于特定的抑制剂，但优选是0.001nM至大约10mM，更优选大约0.01nM至大约1000nM。组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的有效量或剂量定义为没有明显降低细胞、特别是未分化的干细胞的存活率的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的量。细胞暴露1至5天或1至3天。暴露时间可以是不到1天。在一种具体的实施方案中，培养细胞1至5天，然后暴露于有效量的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂。但是，可以在培养开始时加入组蛋白脱乙酰基酶抑制剂。在这样的时间范围内，通过已知方法将携带基因的载体例如含有编码3种基因(Oct3/4、Sox2和Klf4)的核酸的载体引入培养的细胞中。 
E.IF表达载体
促使的IF表达可包括向细胞群体中引入一种或多种编码Oct3/4、Sox2和Klf4多肽的哺乳动物表达载体。可以将IF作为外源基因引入细胞中。在某些情况下，外源基因整合到宿主细胞及其后代的基因组中。 在其它情况下，外源基因在宿主细胞及其后代中以附加型状态(episomal state)继续存在。外源基因是从外部来源引入细胞中的基因。本发明使用的基因是通常包括编码目标多肽例如IF的开放阅读框的核酸。该基因优选地包括可操作地连接到开放阅读框上的启动子。在某些情况下，该基因的自然形式可能已经存在于细胞中，但向细胞中加入额外的“外源基因”来诱导多肽的表达。 
可以将一种或多种哺乳动物表达载体引入占细胞总群体20％以上的细胞中，例如，25％、30％、35％、40％、44％、50％、57％、62％、70％、74％、75％、80％、90％，或大于20％的其它百分比的细胞中。一个哺乳动物表达载体可以包含两种或多种以上提到的IF。在其它情况下，使用一种或多种编码Oct 3/4、Sox2、Klf4和c-Myc多肽的表达载体。在某些实施方案中，在单独的哺乳动物表达载体上编码待表达的每种IF。 
在某些情况下，IF与转运体氨基酸序列例如以下文献中描述的VP22多肽的氨基酸序列在阅读框内遗传融合：美国专利6,773,920、6,521,455、6,251,398和6,017,735。特别地，VP22多肽包括相当于完整的HSV1 VP22序列(1-301)的氨基酸60-301和159-301的多肽，其序列在WO 97/05265中的图4中披露。美国专利6,017,735描述了基于来自其它疱疹病毒的VP22蛋白同源物的序列的同源蛋白质和片段。这些VP22序列提供VP22融合多肽从已经用VP22融合多肽表达载体转染的细胞到尚未转染或转导的相邻细胞的胞间转运。参见，例如，Lemken等人，(2007)，Mol.Ther.，15(2)：310-319。因此，在本文所述的诱导方法中，使用编码IF-VP22融合多肽的载体可以明显提高转染的哺乳动物表达载体的功能效率。 
合适的哺乳动物表达载体的例子包括但不限于：重组病毒、核酸载体，如质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、人类人工染色体、cDNA、cRNA和PCR产物表达盒。用于驱动IF表达的合适的启动子的例子包括但不限于：逆转录病毒LTR元件；组成型启动子，如CMV、HSV1-TK、SV40、EF-1α、β-肌动蛋白；PGK和诱导型启动子，例如 含有Tet-操纵子元件的启动子。在某些情况下，一种或多种哺乳动物表达载体除了编码IF，还编码有助于确认或选择已被转染或感染的细胞的标记基因。标记基因的例子包括但不限于，编码荧光蛋白例如，EGFP、DS-Red、YFP和CFP的基因；编码赋予选择剂抗性的蛋白质的基因，例如，neoR基因和杀稻瘟素抗性基因。 
1.重组病毒
可以通过向一种或多种细胞中引入携带编码IF的DNA或RNA的重组病毒来实现IF的促使表达。为便于参考，在本文中有时也用病毒编码的IF来指称该病毒。例如，编码Oct3/4多肽的病毒可以被描述为“Oct3/4病毒”。在某些情况下，有时病毒可以编码一个以上的拷贝的IF，或可以编码一种以上的IF，如2种IF。 
为了促使各组IF的表达，可以向细胞中引入重组病毒的组合或组。在某些情况下，由重组病毒表达的IF组包括以下一种或多种：Oct3/4多肽、Sox2多肽、Klf4多肽或c-Myc多肽。在某些情况下，该组不包括c-Myc多肽。例如，IF组可以包括：Oct3/4多肽、Sox2多肽和Klf4多肽，但不包括c-Myc多肽。在某些情况下，IF组不包括可能增加细胞转化的风险或诱发癌症的风险的多肽。c-Myc诱导细胞转化的能力已有描述，参见，例如Adhikary等人，(2005)，Nat.Rev.Mol.CellBiol.，6(8)：635-645。 
在某些情况下，待表达的IF组包括c-Myc多肽。在某些情况下，c-Myc多肽是c-Myc的组成型活性变异体。在某些实例中，该组包括具有诱导型活性的c-Myc多肽，例如，c-Myc-ER多肽，参见，例如，Littlewood，等人，(1995)，Nucleic Acid Res.，23(10)：1686-90。 
在其它情况下，待表达的IF组包括：Oct3/4多肽、Sox2多肽和Klf4多肽，但不包括TERT多肽、SV40大T抗原多肽、HPV16 E6多肽、HPV16E7多肽或Bmi1多肽。在某些情况下，IF组不包括TERT多肽。在某些情况下，IF组不包括SV40大T抗原。在其它情况下，IF组不包括HPV16E6多肽或HPV16 E7多肽。 
在某些情况下，IF组包括3种IF，其中，3种IF中的2种是Oct3/4多肽和Sox2多肽。在其它情况下，IF组包括2种IF，其中，两种多肽是c-Myc多肽和Sox2多肽。在某些情况下，IF组限于Oct 3/4、Sox2和Klf4多肽。在其它情况下，IF组可能限于一组4种IF：Oct3/4多肽、Sox2多肽、Klf4多肽和c-Myc多肽。 
一组IF可以包括除了Oct3/4、Sox2和Klf4多肽以外的IF。这些额外的IF包括但不限于Nanog、TERT、LIN28、CYP26A1、GDF3、FoxD3、Zfp42、Dnmt3b、Ecat1和Tel1多肽。在某些情况下，额外的IF组不包括c-Myc多肽。在某些情况下，额外的IF组不包括可能增加细胞转化的风险或诱发癌症的风险的多肽。 
可以在时间上顺序或同时向细胞中加入各种病毒。在某些情况下，在不同于加入一种或多种其它病毒的时刻向细胞中加入至少一种病毒，例如，Oct3/4病毒、Sox2病毒、Klf4病毒或c-Myc病毒。在某些实例中，同时或在非常接近的时间向细胞中加入Oct3/4病毒、Sox2病毒和Klf4病毒，并在不同于加入其它病毒的时刻向细胞中加入c-Myc病毒。 
可以同时或以非常接近的时间向细胞中加入至少两种重组病毒。在某些实例中，可以同时或在非常接近的时间加入Oct3/4病毒和Sox2病毒，并在不同的时间加入Klf4病毒或c-Myc病毒。在某些实例中，可以同时或在非常接近的时间加入Oct3/4病毒和Sox2病毒、Oct3/4病毒和Klf4病毒、Oct3/4病毒和c-Myc病毒、Sox2病毒和Klf4病毒、Sox2病毒和c-Myc病毒或Klf4病毒和c-Myc病毒。 
在某些情况下，可以同时或在非常接近的时间加入至少三种病毒，例如，Oct3/4病毒、Sox2病毒和Klf4病毒。在其它实例中，可以同时或在非常接近的时间加入至少4种病毒，例如，Oct3/4病毒、Sox2病毒、Klf4病毒和c-Myc病毒。 
有时，通过用相同的病毒重复处理可以提高病毒感染效率。在某些情况下，在至少2个、至少3个或至少4个单独的时刻，向细胞中加入一种或多种Oct3/4病毒、Sox2病毒、Klf4病毒或c-Myc病毒。 
重组病毒的例子包括但不限于，逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒和腺相关病毒。通常，重组逆转录病毒是小鼠莫洛尼氏白血病病毒(MMLV)，但也可以使用其它重组逆转录病毒，例如，禽类白血病病毒、牛白血病病毒、鼠白血病病毒(MLV)、貂细胞灶诱导病毒、鼠肉瘤病毒、网状内皮组织增生病毒、长臂猿白血病病毒、梅森猴病毒(Mason Pfizer Monkey Virus)或劳斯肉瘤病毒，参见，例如，美国专利6,333,195。 
在其它情况下，重组逆转录病毒是慢病毒(例如，人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)或猫免疫缺陷病毒(FIV))，例如，参见Johnston等人，(1999)，Journal of Virology，73(6)：4991-5000(FIV)；Nègre D等人，(2002)，Current Topics in Microbiology andImmunology，261：53-74(SFV)；Naldini等人，(1996)，Science，272：263-267(HIV)。 
重组逆转录病毒可以包括病毒多肽(例如，逆转录病毒env)，以帮助进入靶细胞。这些病毒多肽是本领域良好建立的，参见，例如，美国专利5,449,614。该病毒多肽可以是兼向性(amphotropic)病毒多肽，如兼向性env，其有助于进入源自多个物种的细胞，包括初始宿主种之外的细胞。参见，例如，同上。病毒多肽可以是异向性(xenotropic)病毒多肽，其有助于进入初始宿主种之外的细胞。参见，例如，同上。在某些实施方案中，病毒多肽是同向性(ecotropic)病毒多肽，例如，同向性env，其有助于进入初始宿主种之外的细胞。参见，例如，同上。 
能够帮助逆转录病毒进入细胞的病毒多肽的例子包括但不限于：MMLV兼向性env、MMLV同向性env、MMLV异向性env、水泡性口炎病毒-g蛋白(VSV-g)、HIV-1env、长臂猿白血病病毒(GALV)env、RD114、FeLV-C、FeLV-B、MLV 10A1 env基因及其变体，包括嵌合体。参见，例如，Yee等人，(1994)，Methods Cell Bioi，Pt A：99-112(VSV-G)；美国专利5,449,614。在某些情况下，遗传修饰病毒多肽以促进表达或增强与受体的结合。 
通常，通过将病毒DNA或RNA构建体引入生产细胞(producercell)中来产生重组病毒。在某些情况下，生产细胞不表达外源基因。在其它情况下，生产细胞是包含一种或多种外源基因的“包装细胞”，该外源基因例如是编码一种或多种gag、pol或env多肽和/或一种或多种逆转录病毒gag、pol或env多肽的基因。逆转录病毒包装细胞可以包含编码病毒多肽如有助于进入靶细胞的VSV-g的基因。在某些情况下，包装细胞包含编码一种或多种慢病毒蛋白质例如gag、pol、env、vpr、vpu、vpx、vif、tat、rev或nef的基因。在某些情况下，包装细胞包含编码一种或多种腺病毒蛋白质例如E1A或E1B或其它腺病毒蛋白质的基因。例如，包装细胞提供的蛋白质可以是源自逆转录病毒的蛋白质，如gag、pol和env；源自慢病毒的蛋白质，如gag、pol、env、vpr、vpu、vpx、vif、tat、rev和nef；和源自腺病毒的蛋白质，如E1A和E1B。在许多实例中，包装细胞提供源自病毒的蛋白质，所述病毒不同于衍生病毒载体的病毒。 
包装细胞系包括但不限于任何易于转染的细胞系。包装细胞系可以基于293T细胞、NIH3T3、COS或HeLa细胞系。包装细胞通常用于包装在至少一种编码病毒包装所需的蛋白质的基因方面有缺陷的病毒载体质粒。可以提供这种病毒载体质粒编码的蛋白质缺乏的蛋白质或多肽的任何细胞可以作为包装细胞使用。包装细胞系的例子包括但不限于：Platinum-E(Plat-E)、Plat-A、BOSC 23(ATCC CRL 11554)和Bing(ATCC CRL 11270)，参见，例如，Morita等人，(2000)，GeneTherapy，7：1063-1066；Onishi等人，(1996)，Experimental Hematology，24：324-329；美国专利6,995,009。商品包装系也是有用的，例如，Ampho-Pak 293细胞系、Eco-Pak 2-293细胞系、RetroPack PT67细胞系和Retro-X通用包装系统(以上都可以从Clontech获得)。 
逆转录病毒构建体可以源自多种逆转录病毒，例如MMLV、HIV-1、SIV、FIV或本文所述的其它逆转录病毒。该逆转录病毒可以编码特定病毒的一个以上的复制循环所必需的所有病毒多肽。在某些情况下，通过加入其它因子或其它病毒多肽提高病毒进入的效率。在 其它情况下，由逆转录病毒构建体编码的病毒多肽不支持一个以上的复制循环，例如，美国专利6,872,528。在这种情况下，加入其它因子或其它病毒多肽可以帮助病毒进入。在一种示例性的实施方案中，重组逆转录病毒是包括VSV-g多肽但不包括HTV-1 env多肽的HTV-1病毒。 
逆转录病毒构建体可以包含：启动子、多克隆位点和/或抗性基因。启动子的例子包括但不限于：CMV、SV40、EF1α、β-肌动蛋白；逆转录病毒LTR启动子和诱导型启动子。逆转录病毒构建体也可以包括包装信号(例如，源自MFG载体的包装信号；psi包装信号)。本领域已知的一些逆转录病毒构建体的例子包括但不限于：pMX、pBabeX或其衍生物。参见，例如，Onishi等人，(1996)，Experimental Hematology，24：324-329。在某些情况下，逆转录病毒构建体是自我失活的慢病毒载体(SIN)载体，参见，例如，Miyoshi等人，(1998)，J.Virol，72(10)：8150-8157。在某些情况下，逆转录病毒构建体是LL-CG、LS-CG、CL-CG、CS-CG、CLG或MFG。Miyoshi等人，(1998)，J.Virol，72(10)：8150-8157；Onishi等人，(1996)，Experimental Hematology，24：324-329；Riviere等人，(1995)，PNAS，92：6733-6737。病毒载体质粒(或构建体)包括：pMXs、pMXs-IB、pMXs-puro、pMXs-neo(pMXs-IB是携带杀稻瘟素抗性基因而不是pMXs-puro的嘌呤霉素抗性基因的载体)。Kimatura等人，(2003)，Experimental Hematology，31：1007-1014；MFG Riviere等人，(1995)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，92：6733-6737；pBabePuro；Morgenstern等人，(1990)，Nucleic Acids Research，18：3587-3596；LL-CG、CL-CG、CS-CG、CLG，Miyoshi等人，(1998)，Journal of Virology，72：8150-8157，等等，作为逆转录病毒系统，和pAdex1，Kanegae等人，(1995)，Nucleic Acids Research，23：3816-3821，等等，作为腺病毒系统。在示例性的实施方案中，逆转录病毒构建体包含杀稻瘟素(例如，pMXs-IB)、嘌呤霉素(例如，pMXs-puro、pBabePuro)或新霉素(例如，pMXs-neo)。参见，例如，Morgenstern等人，(1990)，Nucleic Acids Research，18：3587-3596。 
逆转录病毒构建体可以编码一种或多种IF。在一种示例性的实施方案中，产生或获得编码Oct3/4、Sox2、Klf4或c-Myc多肽的pMX载体或其变体。例如，将Oct3/4插入pMXs-puro，以产生pMX-Oct3/4；将Sox2插入pMXs-neo，以产生pMX-Sox2；将Klf4插入pMXs-IB，以产生pMX-Klf4；和将c-Myc插入pMXs-IB，以产生pMX-c-Myc。 
从包装细胞产生重组病毒的方法及其应用是已经确定的，例如，参见，美国专利5,834,256、6,910,434、5,591,624、5,817,491、7070994和6,995,009，本文引入作为参考。许多方法开始于将病毒构建体引入包装细胞系。可以通过本领域已知的任何方法引入病毒构建体，包括但不限于：磷酸钙法(参见，例如，Kokai，日本未经审查的专利公开2-227075)、脂转染法(lipofection method)(Feigner等人，(1987)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，84：7413-7417)、电穿孔法、显微注射、Fugene转染等，以及本文所述的任何方法。 
在一种实例中，通过Fugene HD(Roche)转染将pMX-Oct3/4、pMX-Sox2、pMX-Klf4或pMX-c-Myc引入PlatE细胞中。可以用新鲜的包含补充有FGM-2 Single Quots(Lonza)的FBM(Lonza)的培养基替换细胞培养基。在某些实施方案中，在引入病毒构建体之后大约12至大约60小时更换培养基，例如，在向生产细胞引入病毒构建体之后大约12小时至大约18小时、大约18小时至大约24小时、大约24小时至大约30小时、大约30小时至大约36小时、大约36小时至大约42小时、大约42小时至大约48小时、大约48小时至大约54小时、大约54小时至大约60小时。可以在向生产细胞引入病毒构建体之后大约24小时至大约48小时更换培养基。可以在加入新鲜培养基大约4至大约24小时例如大约4小时后回收上清液。在某些情况下，可以在加入新鲜培养基后大约每4小时回收上清液。可以将回收的上清液通过0.45μM的过滤器(Millipore)。在某些情况下，回收的上清液包含源自pMX-Oct3/4、pMX-Sox2、pMX-Klf4或pMX-c-Myc中的一种或多种的逆转录病毒。 
腺病毒转导可以用于促使IF组的表达。产生腺病毒的方法及其应用是确定的，如以下文献所述，例如，Straus，The Adenovirus，Plenum Press(NY 1984)，451496；Rosenfeld，等人，(1991)，Science，252：431-434；美国专利6,203,975、5,707,618和5,637,456。在其它情况下，腺相关病毒的转导用于促使IF组的表达。制备腺相关病毒的方法及其应用是非常确定的，如美国专利6,660,514和6,146,874所述。 
在一种示例性的实施方案中，获得或产生腺病毒构建体，其中，腺病毒构建体例如Adeno-X包含编码Oct3/4、Sox2、Klf4或c-Myc的DNA。可以通过任何本领域已知的方法例如Lipofectamine 2000(Invitrogen)或Fugene HD(Roche)将腺病毒构建体引入HEK 293细胞。在某些情况下，该方法还包括：(1)当它们表现出致细胞病变效应(CPE)时，收集细胞，这种效应发生在转染后大约10天至大约20天，如大约11、13、14、15、18或20天；(2)使细胞经历大约2至大约5次冷冻-融化循环，例如，大约3次；(3)收集所产生的含有病毒的液体；(4)使用腺病毒纯化试剂盒(Clontech)纯化病毒；和(5)在-80℃储存病毒。在某些情况下，如本文所述，使用Adeno-X快速滴度试剂盒(Clontech)测定腺病毒储备液的滴度或噬斑形成单位(PFU)。 
可以用自然地靶向不同的细胞类型或源自不同宿主的细胞的重组逆转录病毒感染细胞。为了提高感染效率，可以首先将外源受体引入人类细胞中。例如，为了帮助鼠莫洛尼氏白血病病毒(MMLV)的进入，可以向人类细胞如出生后的皮肤成纤维细胞中添加外源的小鼠受体。外源性受体可以通过促进病毒进入改善感染效率，特别是在受体识别病毒多肽如MMLV env或HTV env时。外源性受体的例子包括但不限于任何由本领域已知的特定的逆转录病毒或慢病毒识别的受体。例如，鼠受体mCAT1(GenBank登录号NM_007513)蛋白质用于帮助人靶细胞的MMLV感染。 
可以通过本文所述的方法引入外源性受体。引入外源性受体的方法包括但不限于：磷酸钙转染、Lipofectamine转染、Fugene转染、显微注射或电穿孔。在示例性的实施方案中，使用病毒如重组腺病毒或逆转录病毒(包括慢病毒)向靶细胞中引入外源性受体。在进一步的示例性的实施方案中，使用重组腺病毒向人类细胞中引入mCAT1，然 后使用重组逆转录病毒如MMLV向细胞中引入IF基因，例如，Oct 3/4、Sox2、Klf4或c-Myc。 
在某些情况下，产生或获得包含编码mCAT1蛋白质的DNA的腺病毒溶液，例如，通过使用pADEX-mCAT1构建体产生的腺病毒。腺病毒溶液可以包括Hanks平衡盐溶液。在示例性的实施方案中，通过以下步骤实现细胞的感染：(1)将p-ADEX-mCAT1腺病毒溶液接触细胞例如人的非胚胎成纤维细胞，感染复数(m.o.i.)(病毒与细胞的比例)为大约1m.o.i.至大约50m.o.i.，例如，大约1m.o.i.、大约5m.o.i.、大约7.5m.o.i.、大约10m.o.i.、大约15m.o.i.、大约20m.o.i.、大约30m.o.i.、大约40m.o.i.或大约50m.o.i.；(2)在室温下细胞与腺病毒溶液孵育大约15分钟至大约2小时，例如，大约15分钟、大约30分钟、大约45分钟、大约1小时、大约1.25小时、大约1.5小时、大约1.75小时或大约2小时；和(3)在培养基中培养体细胞群体大约24小时至大约60小时，例如，大约24小时、大约30小时、大约36小时、大约42小时、大约48小时、大约54小时或大约60小时。 
可以使用多种方法感染细胞。在某些情况下，通过以下步骤进行细胞的感染：(1)结合以下一种或多种、2种或更多种、3种或更多种或全部4种：pMX-Oct3/4逆转录病毒、pMX-Sox2逆转录病毒、pMX-Klf4或pMX-c-Myc，以获得逆转录病毒溶液；(2)向逆转录病毒溶液中补充大约2μg/ml至大约15μg/ml的聚凝胺(Polybrene)，例如，大约2μg/ml、大约3μg/ml、大约5μg/ml、大约7μg/ml、大约10μg/ml、大约12μg/ml或大约15μg/ml聚凝胺；(3)将逆转录病毒溶液接触体细胞，m.o.i.(病毒与细胞的比例)为大约0.5m.o.i.至大约10m.o.i.，例如，大约0.5m.o.i.、大约1m.o.i.、大约2m.o.i.、大约5m.o.i.、大约7.5m.o.i.或大约10m.o.i.；(4)使步骤(3)的接触在37℃下持续大约2小时至大约24小时，例如，大约2小时、大约3小时、大约4小时、大约5小时、大约6小时、大约7个小时、大约9小时、大约10小时、大约11小时、大约12小时、大约14小时、大约15小时、大约16小时、大约17小时、大约18小时、大约19小时、大约20小时、大约21小时、大约22小 时、大约23小时或大约24小时；(5)在步骤(4)的接触后不久，如本文所述，改变培养基为MC-ES培养基；和(6)每1至2天用新鲜培养基更换MC-ES培养基。在某些情况下，按照本文所述的步骤(1)至(6)进行体细胞感染，在细胞与逆转录病毒溶液接触之前，增加预孵育体细胞一段时间例如大约48小时的步骤。当体细胞表达通过病毒转导、转染或其它方法引入的外源性受体时，这种预孵育可能是必要的。因此，在某些实施方案中，如果使用腺病毒或慢病毒向体细胞中引入外源性受体如mCAT1；这些细胞可能需要培养至少大约30小时至至少大约60小时的时间长度，例如大约30、大约35、大约40、大约48、大约52、大约55或大约60小时。 
可以通过本领域已知的任何方法完成细胞的感染。例如，Palsson，B.，等人，(1995)，WO95/10619；Morling，F.J.等人，(1995)，GeneTherapy，2：504-508；Gopp等人，(2006)，Methods Enzymol，420：64-81。例如，可以通过离心感染(spin-infection)或离心接种(“spinoculation”)方法完成感染，所述方法包括在紧接在向细胞加入病毒之后的期间对细胞进行离心。在某些情况下，可以在感染前浓缩病毒，例如，通过超速离心法。在某些情况下，可以使用其它技术帮助或改善逆转录病毒进入靶细胞。例如，逆转录病毒可以接触脂质体或免疫脂质体以帮助或引导进入特定的细胞类型。参见，例如，Tan等人，(2007)，Mol.Med..13(3-4)：216-226。 
本文所述的感染细胞的方法可用于感染表达外源性受体例如本文所述的mCAT1或其它外源性受体的细胞。根据如何引入外源性受体，感染之前细胞的预孵育期可能需要改变。在某些情况下，使用不表达外源性受体的细胞。某些重组逆转录病毒如VSV-G假型重组逆转录病毒可能不需要外源性受体的帮助，就可以有效地进入细胞。在某些实例中，除了细胞预培养的时间可能会变化以外，按照本文所述的方法将VSV-G假型重组逆转录病毒引入细胞。 
2.核酸载体
核酸载体转染(如瞬时转染)方法可用于将IF引入人细胞中。制备转染级核酸表达载体的方法和转染方法已确定是良好建立的。例如，参见，Sambrook和Russell(2001)，″Molecular Cloning：A LaboratoryManual，″第3版，(CSHL Press)；和Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，N.Y.(2005)，9.1-9.14。高效转染效率的方法的例子包括，如Trompeter(2003)，J Immunol.Methods，274(1-2)：245-256和国际专利申请公开WO2002086134、WO200200871和WO2002086129所述的“核转染”(“nucleofection”)，使用以下试剂的转染：基于脂质的转染试剂如 6和 HD(Roche)、DOTAP和lipofectamineTM LTX，联合PLUSTM(Invitrogen，Carlsbad，CA)、DreamfectTM(OZ Biosciences，Marseille，France)、GeneJuiceTM(Novagen，Madison，WI)、聚乙烯亚胺(例如，参见，Lungwitz等人，(2005)，Eur.J Pharm.Biopharm.，60(2)：247-266)和GeneJammerTM(Stratagene，La Jolla，CA)以及如美国专利申请11/195,066所述的纳米微粒转染试剂。 
3.蛋白质转导
诱导方法可以利用蛋白转导将至少一种IF直接引入细胞中。在某些情况下，蛋白质转导方法包括使细胞接触包含载体试剂和至少一种含有一种上述IF的氨基酸序列的纯化多肽的组合物。合适的载体试剂及其使用方法的例子包括但不限于，市售的试剂，如美国专利6,841,535所述的ChariotTM(Active Motif，Inc.，Carlsbad，CA)；如美国专利10/138,593所述的 (Gene Therapy Systems，Inc.，San Diego，CA)、GenomeONE(Cosmo Bio Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)和ProteoJuiceTM(Novagen，Madison，WI)或纳米蛋白质转导试剂。 
蛋白质转导方法可以包括将细胞接触至少一种纯化的多肽，该多肽含有与蛋白质转导域(PTD)序列融合的一种上述IF(IF-PTD融合多肽)的氨基酸序列。PTD域可以与IF序列的氨基端融合；或者，PTD域可以与IF序列的羧基端融合。在某些情况下，向细胞添加作为变性 的多肽的IF-PTD融合多肽，其可有助于它转运到细胞中，然后在其中复性。PTD融合蛋白的生成及其使用方法是本领域已经建立的，如美国专利5,674,980、5,652,122和6,881,825所述。另外参见，Becker-Hapak等人，(2003)，Curr Protocols in Cell Biol，John Wiley & Sons，Inc。示例性的PTD域氨基酸序列包括但不限于下列任何一种：YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO：1)；RKKRRQRR(SEQ ID NO：2)；YARAAARQARA(SEQ ID NO：3)；THRLPRRRRRR(SEQ ID NO：4)；和GGRRARRRRRR(SEQ ID NO：5)。 
在某些情况下，在不同的时间顺序向细胞添加各个纯化的IF多肽。在其它实施方案中，向细胞添加没有纯化的c-Myc多肽的一组至少3种纯化的IF多肽，例如，Oct3/4多肽、Sox2多肽和Klf4多肽。在某些实施方案中，向细胞添加一组4种纯化的IF多肽，例如，纯化的Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc多肽。在某些实施方案中，向细胞添加作为一种组合物(即，包含IF多肽的混合物的组合物)的纯化的IF多肽。在某些实施方案中，在纯化的IF多肽的存在下，培养细胞大约30分钟至大约24小时，例如，1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、12小时、16小时、18小时、20小时，或大约30分钟至大约24小时的任何其它时间。在某些实施方案中，以大约每天至大约每4天的频率，例如，每1.5天、每2天、每3天或大约每天至大约每4天之间的任何其它频率，用相同或不同的IF多肽重复细胞的蛋白质转导。 
在某些情况下，本文所述的方法利用蛋白质转导和表达载体转导/转染与促使本文所述的一组IF的表达的任意组合。在某些实施方案中，利用逆转录病毒表达载体促使在细胞中表达Oct3/4、Sox2和Klf4多肽，并通过本文所述的蛋白质转导将纯化的c-Myc多肽引入细胞中。除了纯化的IF多肽，还可以使用HDAC抑制剂处理。在某些情况下，向也经历HDAC抑制剂处理的细胞中添加没有纯化的c-Myc多肽的一组至少3种纯化的IF多肽，例如，Oct3/4多肽、Sox2多肽和Klf4多肽。 
F.诱导因子序列
本文描述了包含在本文所述的诱导方法中使用的IF的氨基酸序列的多肽，和编码这些多肽的外源基因。在某些实施方案中，IF氨基酸序列是天然存在的氨基酸序列，例如，人类或小鼠Oct 3/4、人类或小鼠Sox2、人类或小鼠Klf4或人类或小鼠c-Myc多肽的氨基酸序列。在其它实施方案中，IF的氨基酸序列是IF的非天然存在的氨基酸序列变异体，但是，如本文所述，它们与IF的氨基酸序列在功能上或结构上是同源的。 
评价两种多肽的结构和功能同源性一般包括确定它们的氨基酸序列彼此的同一性百分比。通过常规方法确定两种或多种氨基酸序列的序列同一性。参见，例如，Altschul等人，(1997)，Nucleic AcidsResearch，25(17)：3389-3402；及Henikoff和Henikoff(1982)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10915(1992)。简单地说，使用空位开放罚分(gapopening penalty)10、空位延伸罚分(gap extension penalty)1及Henikoff和Henikoff(同上)的″BLOSUM62″评分矩阵，比对两种氨基酸序列，以优化比对评分。然后如下计算同一性百分比：([相同的匹配的总数]/[较长序列的长度加上为了比对两种序列而引入较长的序列中的空位数])(100)。 
本领域的技术人员将会理解，有许多已经建立的算法可用于比对两种氨基酸序列。Pearson和Lipman的“FASTA”相似性搜索算法是合适的蛋白质比对方法，用于检查本文公开的氨基酸序列和另一种肽的氨基酸序列具有的同一性的水平。Pearson和Lipman(1988)，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA，85：2444，和Pearson(1990)，Meth.Enzymol.，183：63描述了FASTA算法。简单来说，FASTA首先通过确定查询序列(例如，SEQ ID NO：6-13中的任一种)与测试序列共有的区域，表征序列相似性，所述区域具有最高的同一性密度(如果ktup变量为1)或同一性对(如果ktup＝2)，没有考虑保守的氨基酸取代、插入或缺失。然后通过使用氨基酸替换矩阵比较所有配对的氨基酸的相似性，对具有最高同一性密度的10个区域评分，并“修整”(″trimmed″)区域的末端 以只包括那些有助于最高评分的残基。如果有一些区域的评分大于“临界值”(基于序列长度和ktup值通过预定的公式计算)，那么检查修整的最初的区域，以确定该区域是否可以连接起来形成与缺口的近似对比。最后，使用Needleman-Wunsch-Sellers算法的修良来对比这两种氨基酸序列的最高评分区域(Needleman和Wunsch(1970)，J.Mol.Biol，48：444-453；Sellers(1974)，SIAM J.Appl.Math.，26：787)，其允许氨基酸的插入和缺失。用于FASTA分析的示例性的参数为：ktup＝1，空位开放罚分＝10，空位延伸罚分＝1和替代矩阵＝BLOSUM62。可以通过修改评分矩阵文件(“SMATRIX”)将这些参数引入FASTA程序，如Pearson(1990)，Meth.Enzymol.，183：63的附录2中所解释的。 
本文还描述了编码如本文所述的Oct3/4、Sox2、Klf4或c-Myc多肽的核酸(如外源基因)，该核酸在低、中或高严格条件下与来自编码SEQ ID NO：6-13中任何一种氨基酸序列的核酸的至少100个核苷酸的探针特异性杂交。低严格杂交条件包括，例如，与具有大约40％至大约70％的GC含量的100个核苷酸的探针杂交；在2×SSC和0.1％SDS中和在42℃下。中等严格杂交条件包括，例如在50℃下，在0.5×SSC和0.1％的SDS中。高严格杂交条件包括，例如，与上述探针在65℃下和在0.2×SSC和0.1％SDS中杂交。在这些条件下，由于杂交温度升高，可以获得具有较高同源性的核酸。编码Oct 3/4、Sox2、Klf4或c-Myc多肽的这些核酸可用于促使这些本文所述的IF的表达。 
在确定IF的特定氨基酸序列变异体是否适用于本文所述的方法方面，许多考虑因素对于熟练的技术人员是有用的。这些考虑因素包括但不限于：(1)对于IF已知的结构-功能关系，例如，模块域如DNA结合域或反式激活域的存在，其在许多情况下，已显示在功能上分离并能够发挥独立的功能；(2)如通过本文所述的序列比对算法所揭示的，在IF的天然存在的同源物(例如，横向同源物和直向同源物)之间氨基酸序列保守的存在。值得注意的是，许多生物信息学算法是本领域已知的，可以成功地预测功能效应，即，蛋白质的氨基酸序列中的特定氨基酸取代对于其功能的“耐受”。这些算法包括，例如，pMUT、 SIFT、PolyPhen和SNPs3D。综述参见，例如，Ng和Henikoff(2006)，AnnRev Genomics Hum Genet.，7：61-80。例如，pMUT基于序列同源性，高准确度地(总体上大约84％)预测在某一特定序列位点的特定氨基酸取代是否影响蛋白质的功能。参见，Ferrer-Costa等人，(2005)，Bioinformatics，21(14)：3176-3178；Ferrer-Costa等人，(2004)，Proteins，57(4)：811-819；和Ferrer-Costa等人，(2002)，J Mol Biol，315：771-786。PMUT算法服务器可从互联网//mmb2.pcb.ub.es:8080/PMut/公开获得。因此，对于任何IF多肽的氨基酸序列，可以产生“氨基酸取代矩阵”，其预测任何给定的氨基酸取代对IF多肽功能的中性或有害性。 
可以通过许多已知的方法产生非天然存在的序列变异体。这些方法包括但不限于：“基因改组”，如美国专利6,521,453所述；“RNA诱变”，如Kopsidas等人，(2007)，BMC Biotechnology，7：18-29所述；和“易错PCR方法”(″error-prone PCR methods.″)。易错PCR方法可分为：(a)通过使核苷酸浓度失衡和/或添加化学化合物如氯化锰来降低聚合酶的保真度的方法(参见，例如，Lin-Goerke等人，(1997)，Biotechniques，23：409-412)；(b)采用核苷酸类似物的方法，(参见，例如，美国专利6,153,745)；(c)使用“诱变”聚合酶的方法(参见，例如，Cline，J.和Hogrefe，H.H.(2000)，Strategies(Stratagene Newsletter)，13：157-161)；和(d)组合方法(参见，例如，Xu等人，(1999)，Biotechniques，27：1102-1108)。其它基于PCR的诱变方法包括，例如，Osuna等人，(2004)，Nucleic Acids Res.，32(17)：e136和Wong等人，(2004)，Nucleic Acids Res.，10；32(3)：e26所述的方法和本领域已知的其它方法。 
可以根据所评估的蛋白质的功能，用各种类型的试验确定IF的氨基酸序列变异体的功能的保留、损失或获得。例如，在IF是转录激活物例如Oct3/4时，使用基于细胞的启动子-报道基因分析容易地评估功能，其中，该报道基因构建体包含一种或多种用于待测定的反式激活多肽的同源靶元件。产生启动子-报道基因构建体、将它们引入细胞和测定各种报道多肽活性的方法，例如在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(2005)，3.16-3.17和9.1-9.14中分别详细描述。可以通过检测报道多肽的性质(例如，酶活性或荧光)、报道多肽的表达(例如，通过ELISA测定)或报道mRNA的表达(例如，通过荧光杂交技术)来量化启动子的活性。合适的报道多肽包括，例如，萤火虫萤光素酶、花虫萤光素酶、荧光蛋白质(例如，增强型绿色荧光蛋白质)、β-半乳糖苷酶、β内酰胺酶、ALP和辣根过氧化物酶。 
例如，可以通过提供合适的产荧光(luminogenic)底物，例如用于萤火虫萤光素酶的萤火虫萤光素，或用于花虫萤光素酶的腔肠素(coelenterazine)，来检测萤光素酶活性。通过许多标准技术例如发光测定法(luminometry)可以量化在合适的底物存在下的萤光素酶活性。参见，例如，美国专利5,744,320。通过许多本领域已知的检测方法(例如，荧光测定法或荧光显微镜法)可以检测和量化活细胞中的荧光多肽(例如，EGFP)。例如，在美国专利6,875,578中可以发现使用荧光多肽在活细胞中的报道分子测定筛选，包括高通量筛选方法的详细描述。 
本文描述了许多作为转录激活物的IF，即反式激活包含特定靶元件的启动子的多肽，转录激活物作为单体、多聚体或与其它多肽的杂聚复合体(heteromeric complex)结合所述靶元件。天然存在的转录激活物，例如Klf4，是最低限度地由如下两种域组成的模块化蛋白质：指示所靶向的基因的DNA结合域和通过与转录机置相互作用来控制转录应答的性质和程度的激活域。这两种域一般以独立的方式运行，使得一种转录激活物的DNA结合域如Sox2的DNA结合域可以附着于另一种转录激活物如疱疹VP16的反式激活域上，以产生全功能的、“嵌合”转录激活因子，例如，如Kamachi等人，(1999)，Mol Cell Biol.，19(1)：107-120所述的嵌合Sox2转录激活物。 
鉴于本文提供的指导，在本文所述的方法中可操作的宽范围的IF序列变异体(例如，Oct3/4、Sox2、Klf4或c-Myc序列变异体)可以很容易地由本领域普通技术人员确定，无需过多的努力。 
Oct3/4多肽
如本文中提到的，“Oct3/4多肽”包括人类Oct 3/4、小鼠Oct 3/4或如下任何多肽，其： 
(i)包括DNA结合域(DBD)，该DNA结合域结合人类nanog基因八聚体元件：5′-TTTTGCAT-3′；和 
(ii)能够反式激活包含一个或多个nanog基因八聚体元件的启动子。 
参见，例如，Kuroda等人，(2005)，Mol and Cell Biol.，25(6)：2475-2485。 
在某些实施方案中，Oct3/4是一种具有上述功能特性的多肽，且包含与对应于人类Oct 3/4的氨基酸序列的SEQ ID NO：6(也被称为智人POU 5级同源框1(POU5F1；GenBank登录号NP_002692))至少70％相同的氨基酸序列，例如，与SEQ ID NO：6有75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％，或至少70％至100％之间的任何其它百分比相同。在某些实施方案中，Oct3/4是一种具有上述功能特性的多肽，且包含与SEQ ID NO：6至少70％至不到100％相同(例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％相同)的氨基酸序列，例如，具有至少一个氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO：6。在其它实施方案中，Oct-3/4是一种具有上述功能特性的多肽，且包含具有最多总共30个氨基酸取代、缺失、插入或其任意组合的SEQID NO：6的氨基酸序列，例如，具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、15、20、25个或从0到30之间的其它任何数目的氨基酸取代、缺失、插入或其任意组合的SEQ ID NO：6。 
SEQ ID NO.6(人类Oct 3/4)：
MAGHLASDFAFSPPPGGGGDGPGGPEPGWVDPRTWLSFQGPPGGPGIGPGVGPGSEV 
WGIPPCPPPYEFCGGMAYCGPQVGVGLVPQGGLETSQPEGEAGVGVESNSDGASPEP 
CTVTPGAVKLEKEKLEQNPEESQDIKALQKELEQFAKLLKQKRITLGYTQADVGLTL 
GVLFGKVFSQTTICRFEALQLSFKNMCKLRPLLQKWVEEADNNENLQEICKAETLVQ 
ARKRKRTSIENRVRGNLENLFLQCPKPTLQQISHLAQQLGLEKDVVRVWFCNRRQKG 
KRSSSDYAQREDFEAAGSPFSGGPVSFPLAPGPHFGTPGYGSPHFTALYSSVPFPEGEA 
FPPVSVTTLGSPMHSN 
在某些实施方案中，Oct3/4是一种具有上述功能特性的多肽，且包含与对应于包含高度保守POU DNA结合域的人类Oct 3/4的氨基酸138-290的SEQ ID NO：7至少70％相同的氨基酸序列，例如，与SEQ IDNO：7有75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％，或至少70％至100％之间的任何其它百分比相同。在某些实施方案中，Oct3/4是一种具有上述功能特性的多肽，且包含与SEQ ID NO：7至少70％至不到100％相同(例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％相同)的氨基酸序列，例如，具有至少一个氨基酸取代、缺失或插入(例如，1至10个氨基酸取代、缺失或插入)的SEQID NO：7。 
SEQ ID NO：7(人类Oct 3/4的POU/DNA结合域)
DIKALQKELEQFAKLLKQKRITLGYTQADVGLTLGVLFGKVFSQTTICRFEALQLSFK 
NMCKLRPLLQKWVEEADNNENLQEICKAETLVQARKRKRTSIENRVRGNLENLFLQCP 
KPTLQQISHIAQQLGLEKDVVRVWFCNRRQKGKRSSS 
本文所述的Oct3/4多肽可以包括天然存在的或非天然存在的人类Oct 3/4的同系物。人类Oct 3/4的天然存在的同系物的例子包括但不限于GenBank登录号：NP_002692、NP_001108427、NP_001093427、NP_001009178和NP_038661列出的那些，或任何其它满足上述结构和功能标准的Oct家族成员。 
人类Oct 3/4的非天然存在的同系物的例子包括但不限于Niwa等人，(2002)，Mol Cell Biol，22(5)：1526-1536和Lunde等人，(2004)，Curr.Biol.，14(1)：48-55所描述的那些。 
基于包含250个序列的PSI-BLAST多重比对的人类Oct3/4氨基酸序列(SEQ ID NO：6)的pMUT分析产生了表17所示的氨基酸取代矩 阵(amino acid substitution matrix)(ASM)。对于在人类Oct3氨基酸序列中的每种野生型氨基酸的位置，表17显示了经预测哪些氨基酸取代(20种可能的氨基酸中)对蛋白质的功能是有害的(黑体和下划线)或中性的(普通文本)。对于Oct3/4多肽结合同源nanog基因八聚体元件(如上所述)和反式激活包含一个或多个nanog靶元件的启动子的能力的功能分析是本领域已知的，例如，如Kuroda等人(上述)；及Loh等人，(2006)，Nat.Genet.，39(4)：431-440所述。 
Sox2多肽
如本文中提到的，“Sox2多肽”包括人类Sox2、小鼠Sox2或如下任何多肽，其： 
(i)包括DNA结合域(DBD)，该DNA结合域结合人类nanog基因Sox元件：5′-TACAATG-3′；和 
(ii)能够反式激活包含一个或多个nanog基因启动子Sox元件的启动子。 
参见，例如，Kuroda等人，(2005)，Mol and Cell Biol.，25(6)：2475-2485。 
在某些实施方案中，Sox2多肽是一种具有上述功能特性的多肽，且包含与对应于人类Sox2即性别决定区Y-盒2蛋白的氨基酸序列(GenBank登录号NP_003097)的SEQ ID NO：8至少70％相同的氨基酸序列，例如，与SEQ ID NO：8有75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％相同，或至少70％至100％之间的任何其它百分比相同。在某些实施方案中，Sox2多肽是一种具有上述功能特性的多肽，且包含与SEQ ID NO：8至少70％至不到100％相同(例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％相同)的氨基酸序列，例如，具有至少一个氨基酸取代、缺失或插入(例如，1至10个氨基酸取代、缺失或插入)的SEQ ID NO：8。 
在某些实施方案中，Sox2多肽是一种具有上述功能特性的多肽，且包含具有最多总计30个氨基酸取代、缺失、插入或其任意组合的 SEQ ID NO：8的氨基酸序列，例如，具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、15、20、25个或从0到30之间的其它任何数目的氨基酸取代、缺失、插入或其任意组合的SEQ ID NO：8。 
SEQ ID NO：8(人类Sox2)： 
MYNMMETELKPPGPQQTSGGGGGNSTAAAAGGNQKNSPDRVKRPMNAFMVWSRG 
QRRKMAQENPKMHNSEISKRLGAEWKLLSETEKRPFIDEAKRLRALHMKEHPDYKY 
RPRRKTKTLMKKDKYTLPGGLLAPGGNSMASGVGVGAGLGAGVNQRMDSYAHMN 
GWSNGSYSMMQDQLGYPQHPGLNAHGAAQMQPMHRYDVSALQYNSMTSSQTYMN 
GSPTYSMSYSQQGTPGMALGSMGSVVKSEASSSPPVVTSSSHSRAPCQAGDLRDMIS 
MYLPGAEVPEPAAPSRLHMSQHYQSGPVPGTAINGTLPLSHM 
在某些实施方案中，Sox2多肽是一种具有上述功能特性的多肽，且包含与SEQ ID NO：9(包含高度保守的高速泳动族-Sox-TCF(HMG-Sox-TCF)基序DNA结合域(DBD)的人类Sox2的氨基酸40-115)至少70％相同的氨基酸序列，例如，与SEQ ID NO：9有75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％相同，或至少70％至100％之间的任何其它百分比相同。在某些实施方案中，Sox2多肽是一种具有上述功能特性的多肽，且包含与SEQ ID NO：9至少70％至不到100％相同(例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％相同)的氨基酸序列，例如，具有至少一个氨基酸取代、缺失或插入(例如，1至5个氨基酸取代、缺失或插入)的SEQ ID NO：9。 
SEQ ID NO：9(HMG-Sox2-TCF DBD)
RVKRPMNAFMVWSRGQRRKMAQENPKMHNSEISKRGAEWKLLSETEKRPFIDEAK 
RLRALHMKEHPDYKYRPRRK 
本文所述的Sox2多肽可以包括天然存在的或非天然存在的人类Sox2的同系物。人类Sox2的天然存在的同系物的例子包括但不限于GenBank登录号：NP_001098933、NP_035573、ACA58281、BAA09168、NP_001032751和NP_648694列出的那些，或任何其它满足上述结构和功能标准的Sox家族成员。 
人类Sox2的非天然存在的同系物的例子包括但不限于Kamachi等人，(1999)，Mol Cell Biol.，19(1)：107-120所描述的那些。 
基于包含250个序列的PSI-BLAST多重比对的人类Sox2氨基酸序列(SEQ ID NO：8)的pMUT分析(如上所述)产生了显示预测对蛋白质功能有害的或中性的氨基酸取代的ASM(表18)。对于Sox2多肽结合nanog基因Sox元件和反式激活包含一个或多个nanog Sox元件的启动子的能力的功能分析是本领域已知的，例如，如Kuroda等人(上述)所述。 
Klf4多肽
如本文中提到的，“Klf4多肽”包括人类Klf4、小鼠Klf4或如下任何多肽，其： 
(i)包括锌指DNA结合域(DBD)，该锌指DNA结合域结合Klf靶元件，例如，5′-GAGGTCC-3′或5′-GGGGTGT-3′；和 
(ii)能够反式激活包含一个或多个上述靶元件的启动子。 
参见，例如，Nakatake等人，(2006)，Mol Cell Biol.，24(20)：7772-7782。 
在某些实施方案中，Klf4多肽是一种具有上述功能特性的多肽，且包含与对应于人类Klf4即Kruppel样因子4的氨基酸序列(GenBank登录号NP_004226)的SEQ ID NO：10至少70％相同的氨基酸序列，例如，与SEQ ID NO：10有75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％相同，或至少70％至100％之间的任何其它百分比相同。在某些实施方案中，Klf4多肽是一种具有上述功能特性的多肽，且包含与SEQ ID NO：10至少70％至不到100％相同(例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％相同)的氨基酸序列，例如，具有至少一个氨基酸取代、缺失或插入(例如，1至10个氨基酸取代、缺失或插入)的SEQ ID NO：10。 
在其它实施方案中，Klf多肽是一种具有上述功能特性的多肽，且包含具有最多总计30个氨基酸取代、缺失、插入或其任意组合的SEQ ID NO：10的氨基酸序列，例如，具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、15、20、25个或从0到30之间的其它任何数目的氨基 酸取代、缺失、插入或其任意组合的SEQ ID NO：10。 
SEQ ID NO：10(人类Klf4)： 
MAVSDALLPSFSTFASGPAGREKTLRQAGAPNNRWREELSHMKRLPPVLPGRPYDLA 
AATVATDLESGGAGAACGGSNLAPLPRRETEEFNDLLDLDFILSNSLTHPPESVAATV 
SSSASASSSSSPSSSGPASAPSTCSFTYPIRAGNDPGVAPGGTGGGLLYGRESAPPPTAP 
FNLADINDVSPSGGFVAELLRPELDPVYIPPQQPQPPGGGLMGKFVLKASLSAPGSEY 
GSPSVISVSKGSPDGSHPVVVAPYNGGPPRTCPKIKQEAVSSCTHLGAGPPLSNGHRPA 
AHDFPLGRQLPSRTTPTLGLEEVLSSRDCHPALPLPPGFHPHPGPNYPSFLPDQMQPQV 
PPLHYQELMPPGSCMPEEPKPKRGRRSWPRKRTATHTCDYAGCGKTYTKSSHLKAHL 
RTHTGEKPYHCDWDGCGWKFARSDELTRHYRKHTGHRPFQCQKCDRAFSRSDHLAL 
HMKRHF 
在某些实施方案中，Klf4多肽是一种具有上述功能特性的多肽，且包含与SEQ ID NO：11(包含高度保守的锌指基序DNA结合域(ZF-DBD)的人类Klf4的氨基酸382-469)至少70％相同的氨基酸序列，例如，与SEQ ID NO：11有75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％相同，或至少70％至100％之间的任何其它百分比相同。在某些实施方案中，Klf4多肽是一种具有上述功能特性的多肽，且包含与SEQ ID NO：11至少70％至不到100％相同(例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％相同)的氨基酸序列，例如，具有至少一个氨基酸取代、缺失或插入(例如，1至5个氨基酸取代、缺失或插入)的SEQ ID N0：11。 
SEQ ID NO：11(人类KM4-ZF-DBD)
KRTATHTCDYAGCGKTYTKSSHLKAHLRTHTGEKPYHCDWDGCGWKFARSDELTR 
HYRKHTGHRPFQCQKCDRAFSRSDHLALHMKRH 
本文所述的Klf4多肽可以包括天然存在的或非天然存在的人类Klf4的同系物。人类Klf4的天然存在的同系物的例子包括但不限于GenBank登录号NP_001017280、NP_057354(Klf2)、AAP36222(Klf5)、NP_034767和NP_446165列出的那些，或任何其它满足上述结构和功能标准的Klf家族成员。非天然存在的Klf4多肽的例子包括但不限于如下Klf4多肽，其具有上述功能特性，并且包含与SEQ ID NO：10或SEQID NO：11至少70％相同，例如，75％、80％、85％、90％，或70％至100％ 之间的百分比相同的氨基酸序列。 
在某些实施方案中，Klf4多肽是一种具有上述功能特性的非天然存在的多肽。 
基于包含136个序列的PSI-BLAST多重比对的人类Klf4氨基酸序列(SEQ ID NO：10)的pMUT分析(如上所述)产生了显示预测对蛋白质功能有害或中性的氨基酸取代的ASM(表19)。对于Klf4多肽结合任何上述靶元件和反式激活包含一个或多个靶元件的启动子的能力的功能分析是本领域已知的，如Nakatake等人，(上述)所述。 
c-Myc多肽
如本文中提到的，“c-Myc多肽”包括人类c-Myc、小鼠c-Myc或如下任何多肽，其： 
(i)包括基本的螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链域并且结合包含以下序列的靶元件：5′-CACGTG-3′或5′-C/GACCACGTGGTG/C-3′；和 
(ii)能够反式激活包含一个或多个上述靶元件的启动子。 
参见，例如，Cowling等人，(2006)，Seminars in Canc.Biol.，16：242-252。 
在某些实施方案中，c-Myc多肽是一种具有上述功能特性的多肽，且包含与对应于人类c-Myc即髓细胞组织增生病毒癌基因同系物的氨基酸序列(GenBank登录号NP_002458)的SEQ ID NO：12至少70％相同的氨基酸序列，例如，与SEQ ID NO：12有75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％相同，或至少70％至100％之间的任何其它百分比相同。在某些实施方案中，c-Myc多肽是一种具有上述功能特性的多肽，且包含与SEQ ID NO：12至少70％至不到100％相同(例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％相同)的氨基酸序列，例如，具有至少一个氨基酸取代、缺失或插入(例如，1至10个氨基酸取代、缺失或插入)的SEQ ID NO：12。 
在其它实施方案中，c-Myc多肽是一种具有上述功能特性的多肽，且包含具有最多总计30个氨基酸取代、缺失、插入或其任意组合的 SEQ ID NO：12的氨基酸序列，例如，具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、15、20、25个或从0到30之间的其它任何数目的氨基酸取代、缺失、插入或其任意组合的SEQ ID NO：12。 
SEQ ID NO：12(人类c-Myc)： 
MDFFRVVENQQPPATMPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQ 
PPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLE 
MVTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLASYQAARK 
DSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCASQDSSAFS 
PSSDSLLSSTESSPQGSPEPLVLHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSE 
SGSPSAGGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQ 
ISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKV 
VILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRNSCA 
在某些实施方案中，c-Myc多肽是一种具有上述功能特性的多肽，且包含与SEQ ID NO：13(包含高度保守的基本螺旋-环-螺旋(bHLH)-亮氨酸拉链域(LZ)DNA结合域)的人类c-Myc的氨基酸370-454)至少70％相同的氨基酸序列，例如，与SEQ ID NO：13有75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％，或至少70％至100％之间的任何其它百分比相同。在某些实施方案中，Klf4多肽是一种具有上述功能特性的多肽，且包含与SEQ ID NO：13至少70％至不到100％相同(例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％相同)的氨基酸序列，例如，具有至少一个氨基酸取代、缺失或插入(例如，1至5个氨基酸取代、缺失或插入)的SEQ ID NO：13。 
SEQ ID NO：13(人类c-Myc bHLH-LZ域)
KRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQK 
LISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRNSCA 
本文所述的c-Myc多肽可以包括天然存在的或非天然存在的人类c-Myc的同系物。人类c-Myc的天然存在的同系物的例子包括但不限于GenBank登录号NP_001005154、NP_036735、NP_034979、P0C0N9和NP_001026123列出的那些，或任何其它满足上述结构和功能标准的c-Myc家族成员。人类c-Myc的非天然存在的同系物的例子包括但不限于例如Chang等人，(2000)，Mol Cell Biol.，20：4309-4319所描述的那些。 
基于包含250个序列的PSI-BLAST多重比对的人类c-Myc氨基酸序列(SEQ ID NO：12)的pMUT分析(如上所述)产生了显示预测对蛋白质功能有害或中性的氨基酸取代的ASM(表20)。对于c-Myc多肽结合任何上述靶元件和反式激活包含一个或多个靶元件的启动子的能力的功能分析是本领域已知的，例如，如Gu等人，(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2935-2939所述。 
在某些情况下，Oct3/4、Sox2、Klf4或c-Myc多肽DNA结合域中的任何一种与疱疹VP16反式激活域融合，产生可在本文所述的诱导方法中作为诱导因子使用的嵌合融合蛋白。在一种实施方案中，疱疹VP16反式激活域包括以下氨基酸序列： 
TKTLMKKDKYTLPGGLLAPGGNSMASGVGVGAGLGAGVNQRMDSYAHMNGWSNGSYSM 
MQDQLGYPQHSTTAPITDVSLGDELRLDGEEVDMTPADALDDFDLEMLGDVESPSPGMTHD 
PVSYGALDVDDFEFEQMFTDALGIDDFGG 
在某些实施方案中，提供Oct3/4、Sox2、Klf4或c-Myc多肽中的任何一种或其组合，作为用于本文所述诱导方法中的多肽转导组合物。这样的组合物包含至少以下之一： 
(i)在氨基端或羧基端包含蛋白质转导域的纯化的3/4Oct3/4多肽； 
(ii)载体试剂和纯化的3/4Oct3/4多肽； 
(iii)包含蛋白质转导域和Sox2多肽的氨基酸序列的纯化的Sox2多肽； 
(iv)载体试剂和纯化的Sox2多肽； 
(v)包含蛋白质转导域的纯化Klf4多肽； 
(vi)载体试剂和纯化的Klf4多肽； 
(vii)包含蛋白质转导域的纯化的c-Myc多肽； 
(viii)载体试剂和纯化的c-Myc多肽； 
(ix)(i)至(vi)的任意组合， 
其中，该组合物基本上不含纯化的包含c-Myc多肽的氨基酸的多肽。 
在某些实施方案中，蛋白质转导域融合到IF序列的氨基端。在其 它实施方案中，PTD域融合到IF序列的羧基端。在某些实施方案中，向细胞添加作为变性的多肽的IF-PTD融合多肽，这可有助于它转运进入细胞，然后在细胞中复性。PTD融合蛋白的生成及其使用方法是本领域已知的，例如，如美国专利5,674,980、5,652,122和6,881,825所述。另外参见，Becker-Hapak等人，(2003)，Curr Protocols in Cell Biol，JohnWiley & Sons，Inc。示例性的PTD域氨基酸序列包括但不限于下列任何一种：YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO：1)；RKKRRQRR(SEQ IDNO：2)；YARAAARQARA(SEQ ID NO：3)；THRLPRRRRRR(SEQ IDNO：4)；和GGRRARRRRRR(SEQ ID NO：5)。 
合适的载体剂及其使用方法的例子包括但不限于美国专利6,841,535中所描述的那些。 
G.亚克隆诱导的细胞集落
可以通过本领域已知的任何方法亚克隆细胞集落，以获得纯的人类干细胞群体，相比在纯化前的总细胞群体中发现的人类干细胞，其包含相对于总细胞群体较高比例的产生的人类干细胞。在某些情况下，如本文所述，在基于形态特征确定并选择包含“诱导细胞”的克隆之前，培养诱导的细胞，并观察大约14天到大约40天，如15天、16天、17天、18天、19天、20天、23天、24天、27天、28天、29天、30天、31天、33天、34天、35天、36天、37天、38天或从大约14天至大约40天之间的其它时间。可以在37℃、5％CO2培养箱中，在维持培养基中培养诱导的细胞，大约每1至2天更换培养基，优选每天更换培养基。维持培养基的例子包括任何和所有的完全ES培养基(例如，MC-ES)。维持培养基可以补充b-FGF或FGF2。在某些情况下，维持培养基补充有其它因子，例如，IGF-II或激活蛋白A。 
在用生理缓冲液例如Hank′s平衡盐溶液清洗细胞培养物之后，显示目标形态特征的集落用底部涂覆有硅酮油脂的克隆环围绕。然后可以向克隆环添加大约100μl(或50μl至150μl)的“用于灵长类动物ES细胞的分离培养基”(″Detachment Medium For Primate Cells″)(由 ReproCELL，Tokyo Japan生产)，并在37℃下孵育大约20分钟以形成细胞悬浮液。可以向约2ml的MC-ES培养基(或本文所述的其它培养基)中添加在包含脱离的集落的环中的细胞悬浮液，并接种到MEF包被的24孔板的一个中孔或其它相等表面积的细胞培养容器中。在37℃、5％CO2(大气CO2)培养箱中培养源自集落的细胞大约14个小时后，更换培养基。随后，大约每两天更换培养基，直到大约8天之后进行第二次传代培养。 
在某些实施方案中，在第一次传代培养中，除去培养基，用Hank′s平衡盐溶液冲洗细胞，然后向细胞加入“用于灵长类动物ES细胞的分离培养基”(ReproCELL，Tokyo Japan)，并在37℃下孵育10分钟。孵育后，向产生的细胞悬浮液添加MC-ES培养基(2ml)，以抑制分离培养基的活性。然后将细胞悬浮液转移到离心管中，并于4℃以200×g离心5分钟。除去上清液，重悬浮细胞沉淀于MC-ES培养基中，然后将重悬浮的细胞接种在MEF包被的24孔板的4个孔上，并培养大约7天，直到制备第二传代培养物。 
在通过上述方法制备的第二传代培养物中，将细胞接种到以20μg/cm2的浓度用基质胶TM包被的60mm细胞培养皿上。大约8天之后(启动促使IF的表达后大约5周)，制备第三传代培养物，其中，将细胞接种到2个基质胶TM包被的60mm细胞培养皿上，其中之一可以随后用于基因表达分析，另一个如下所述用于继续传代。一种传代培养物用于本文所述的基因表达分析，另一种按需要传代，以保持由诱导的细胞克隆产生的细胞系。 
H.传代并维持诱导的细胞
亚克隆后，诱导的细胞可以大约每5至7天传代培养一次。在某些情况下，用Hank’s平衡盐溶液清洗细胞，加入分散酶或“用于灵长类动物ES细胞的分离培养基”，并在37℃孵育5到10分钟。当分离大约超过半数的集落时，加入MC-ES培养基以抑制分离培养基的活性，并将产生的细胞/集落悬浮液转移到离心管中。让悬浮液中的集落沉淀于 管底部，小心除去上清液，然后加入MC-ES培养基以重悬浮集落。在检查过集落的大小之后，通过缓慢的往复移液操作可以将任何非常大的集落分解成较小的大小。将大小合适的集落接种到基底面积为传代培养前的大约3至6倍的基质胶包被的塑料培养皿上。例如，细胞可以大约1∶6到大约1∶3，如大约1∶6、1∶5、1∶4或1∶3分裂。 
可用于培养由存在于本发明的人出生后组织中的未分化干细胞诱导的人多潜能干细胞的培养基的例子包括但不限于：ES培养基和适于培养人类ES细胞的培养基如MEF调节ES培养基(MC-ES)或本文所述的其它培养基例如mTeSR1TM。在某些实例中，如本文所述，在ROCK抑制剂的存在下维持细胞。 
IV.诱导细胞的分析
对从最初基于形态特征确定的集落传代培养的细胞集落，可以测试其与多潜能干细胞有关的许多性质，包括但不限于，ALP活性的表达、ES细胞标记基因的表达、蛋白质标记的表达、Oct3/4和Nanog启动子相对于亲本细胞的低甲基化、长期自我更新、正常的二倍体核型和形成包括外胚层、中胚层和内胚层组织的畸胎瘤的能力。 
许多用于检测细胞中(例如，固定的细胞或活细胞中)ALP活性的试验和试剂是本领域内已知的。在一种示例性的实施方案中，在室温下用10％福尔马林中性缓冲溶液固定待分析的集落大约5分钟例如2至5分钟，然后用PBS冲洗。然后加入由Pierce(Rockford，EL)生产的ALP的生色底物，1步BCIP(5-溴-4-氯3′-吲哚基磷酸对甲苯胺盐)和NBT(氯化硝基四唑蓝)，并在室温下反应20至30分钟。具有ALP活性的细胞染为蓝紫色。 
然后可以对检测ALP活性的推定的iPS细胞集落，分析其一系列人类胚胎干细胞标记(ESCM)基因的表达，包括但不限于Nanog、TDGF1、Dnmt3b、Zfp42、FoxD3、GDF3、CYP26A1、TERT、Oct3/4、Sox2、Sall4和HPRT的表达。参见，例如，Assou等人，(2007)，Stem Cells，25：961-973。许多基因表达分析方法是本领域已知的。参见，例如， Lorkowski等人，(2003)，Analysing Gene Expression，A Handbook ofMethods：Possibilities and Pitfalls，Wiley-VCH。合适的基于核酸的基因表达分析的例子包括但不限于定量RT-PCR(qRT-PCR)、微阵列杂交、斑点印迹法、RNA印迹法、核糖核酸酶保护和SAGE。 
在某些实施方案中，通过qRT-PCR测定推定的iPS细胞集落中ESCM基因mRNA表达水平的水平。收获推定的iPS细胞集落，并用“用于甲醛或多聚甲醛固定的、石蜡包埋(FFPE)的组织的Recoverall总核酸分离试剂盒”(″Recoverall total nucleic acid isolation kit forformaldehyde-or paraformaldehyde-fixed，paraffin-embedded(FFPE)tissues″)(由Ambion，Austin，TX生产)提取总RNA。在某些实例中，用于RNA提取的集落是固定的集落，例如，测定ALP活性的集落。集落可以直接用于RNA提取，即，不需预先固定。在一种示例性的实施方案中，在从提取的RNA合成cDNA后，使用 PreAmp主混合物(由Applied Biosystems，Foster City，CA生产)扩增靶基因。使用ABI Prism 7900HT使用下面的PCR引物组(来自Applied Biosystems)进行实时定量PCR，用于检测上述ESCM基因的mRNA：Nanog、Hs02387400_g1、Dnmt3b、Hs00171876_m1、FoxD3、Hs00255287_s1、Zfp42、Hs01938187_s1、TDGF1、Hs02339499_g1、TERT、Hs00162669_m1、GDF3、Hs00220998_m1、CYP26A1、Hs00175627_m1、GAPDH、Hs99999905_m1。 
可以通过用于包括但不限于SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、CD9、CD24、Thy-1和Nanog的蛋白质标记的表达的免疫细胞化学方法分析推定的iPS细胞集落。宽范围的免疫细胞化学试验，例如，荧光免疫细胞化学试验，是已知的，例如，如Harlow等人，(1988)，Antibodies：A Laboratory Manual 353-355，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY所描述的，也参见，The Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies(2004)，Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR。 
在一种示例性的实施方案中，如下测定推定的iPS细胞集落中的 一种或多种上述蛋白标记的表达。用10％的甲醛固定培养的细胞10分钟，并用0.1％明胶/PBS在室温下封闭大约1小时。细胞与针对SSEA-3(MC-631；Chemicon)、SSEA-4(MC813-70；Chemicon)、TRA-1-60(abl6288；abcam)、TRA-1-81(abl6289；abcam)、CD9(M-L13；R&Dsystems)、CD24(ALB9；abcam)、Thy1(5E10；BD Bioscience)或Nanog(MAB 1997；R&D Systems)的第一抗体在4℃下过夜孵育。对于Nanog染色，在封闭前，用0.1％Triton X-100/PBS将细胞通透化。用PBS冲洗细胞集落3次，然后与AlexaFluor 488-偶联的第二抗体(MolecularProbes)和Hoechst 33258(Nacalai)在室温下孵育1小时。经过进一步清洗后，用荧光显微镜如Axiovert 200M显微镜(Carl Zeiss)检测荧光。 
A.甲基化分析
在某些实施方案中，诱导的细胞的特点是Oct3/4和Nanog的基因组启动子相对其亲本细胞减少的甲基化。合适的待分析的Oct3/4启动子区域包括但不限于，包括保守区1(CR1)的Oct3/4近端启动子和包括CR4的Oct3/4启动子远端增强子。合适的待分析的Nanog启动子区域包括但不限于，包括Oct3/4和Sox2结合位点的Nanog的近端启动子。参见，例如，Rodda等人，(2005)，J Biol.Chem.，280：24731-24737和Yang等人，(2005)，J Cell Biochem.，96：821-830。许多用于基因组DNA的定量分析的方法是已知的，如Brena等人，(2006)，J Mol.Med.，84(5)：365-377所述。在一种示例性的实施方案中，从推定的诱导细胞中分离基因组DNA，分离用于比较的细胞并用亚硫酸氢盐处理。然后用含有T7启动子序列的引物PCR扩增亚硫酸氢盐处理的基因组DNA。之后，使用T7聚合酶产生RNA转录物，然后用核糖核酸酶A处理以产生甲基化特异性分裂产物。通过分裂产物的MALDI-TOF质谱分析评估各个CpG位点的甲基化。例如，在Ehich等人，(2005)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，102：15785-15790中提供了该方法的详细说明。 
B.自我更新分析
干细胞的特征之一是其不经历衰老而连续增殖的能力。因此，评估诱导的细胞在体外连续传代的能力。在某些情况下，检测诱导的细胞在体外传代至少大约30次到至少大约100次的能力，例如，大约33、35、40、45、51、56、60、68、75、80、90、93、100，或从至少大约30次到至少100次传代之间的任何其它次数。 
在另一种评价中，测试诱导的细胞从启动促使IF在亲本细胞中的表达起增殖大约30天至大约500天的能力，例如，40天、50天、60天、70天、80天、100天、150天、180天、200天、250天、300天、400天、450天或从启动促使IF在亲本细胞中的表达起大约30天至大约500天之间的任何其它时间。在某些实施方案中，当细胞在成分确定的培养基(例如，mTeSR1培养基)中和在不存在饲养细胞的情况下例如在本文所述的mTeSR1培养基中传代时，确定诱导的细胞的长期自我更新。在其它实施方案中，细胞在本文所述的MC-ES的培养基中传代。 
C.核型分析
作为另一种可能的分析，评估诱导的细胞的二倍性和正常、稳定的核型，例如，细胞在体外已传代至少一年后是稳定的。许多核型分析方法是本领域已知的。在某些实施方案中，核型分析方法是例如Bayani等人，(2004)，Curr.Protoc，Cell Biol.，Chapter 22：Unit 22.5描述的多色FISH。在其它实施方案中，核型分析包括例如Vermeesch等人，(2007)，Eurr.J.Hum.Genet.，15(11)：1105-1114描述的分子核型分析。在一种示例性的实施方案中，用0.02μg/ml的秋水仙酰胺(colecemid)预处理诱导的细胞大约2至大约3小时，与大约0.06至大约0.075M的氯化钾孵育大约20分钟，然后用Carnoy′s固定剂固定。此后，对于多色FISH分析，细胞与多色FISH探针杂交，例如来自Cambio，Ltd(Cambridge，UK)的 人类多色FISH(M-FISH)试剂盒中的多色FISH探针。 
D.畸胎瘤分析
人们普遍认为，多潜能干细胞在注射到免疫受损的动物中时具有形成包括外胚层、中胚层和内胚层组织的畸胎瘤的能力。诱导的细胞或诱导的多潜能干细胞(iPS)或ES细胞样多潜能干细胞可以指具有体外长期自我更新能力和分化为3个胚层的多潜能性的细胞，所述多潜能性干细胞当移植到试验动物如小鼠中时，可能形成畸胎瘤。 
可以在畸胎瘤形成分析中，在免疫受损的动物模型中评估诱导的细胞的多潜能性。免疫受损的动物可以是被施用免疫抑制剂如环孢菌素或FK-506的啮齿动物。例如，免疫受损的动物模型可以是SCID小鼠。例如，可以向7至8周大的免疫受损动物的睾丸髓质注射大约0.5×106至大约2.0×106，例如，0.6×106、0.8×106、1.0×106、1.2×106、1.5×106、1.7×106或大约0.5×106至大约2.0×106之间的其它数量的诱导细胞/小鼠。大约6周至大约8周之后，在用PBS然后用10％缓冲福尔马林灌注动物后，切除畸胎瘤。然后将切除的畸胎瘤进行免疫组织学分析。一种区分人类畸胎瘤组织与宿主(例如，啮齿动物)的方法包括对人类特异性核标记HuNu进行免疫染色。免疫组织学分析包括确定外胚层(如神经外胚层)、中胚层和内胚层组织的存在。外胚层组织的蛋白质标记包括但不限于巢蛋白、GFAP和整联蛋白β1。中胚层组织的蛋白质标记包括但不限于胶原II、Brachyury和骨钙素。内胚层组织的蛋白质标记包括但不限于甲胎蛋白(α-FP)和HNF3β。 
E.基因表达
在某些实施方案中，对推定的iPS细胞集落进行基因表达分析。这种基因表达分析可以包括推定的iPS细胞集落的基因表达谱与一种或多种细胞类型的基因表达谱的比较，所述细胞类型包括但不限于： 
(i)亲本细胞，即，从其诱导推定的iPS细胞集落的一种或多种细胞； 
(ii)人类ES细胞系；或(iii)建立的iPS细胞系。本领域中已知，人类ES细胞系的基因表达数据可以通过公共来源获得，例如，互联网NCBI″Gene Expression Omnibus″数据库。参见，例如，Barrett等人，(2007)，Nuc.Acids Research，D760-D765。因此，在某些实施方案中，推定的 iPS集落的基因表达谱与ES细胞系的基因表达谱的比较需要将实验获得的推定的iPS细胞集落的数据与通过公共数据库获得的基因表达数据进行比较。其基因表达数据可以公开获得的人类ES细胞系的例子包括但不限于hE14(GEO数据集登记号GSM151739和GSM151741)、Sheff4(GEO登记号GSM 194307、GSM 194308和GSM 193409)、h_ES01(GEO登记号GSM 194390)、h_ES H9(GEO登记号GSM194392)和h_ES BG03(GEO登记号GSM194391)。 
也可以通过使用核酸微阵列杂交试验分析从一种或多种iPS细胞系分离的总RNA来完成基因表达。用于全基因表达分析的合适的微阵列平台的例子包括但不限于，人类基因组U133+2.0微阵列(Affymetrix)和完整人类基因组寡聚微阵列(Whole Human GenomeOligo Micoarray)(Agilent)。许多用于比较基因表达谱的分析方法是已知的，例如，如Suarez-Farinas等人，(2007)，Methods Mol.Biol.，377：139-152，Hardin等人，(2007)，BMC Bioinformatics，8：220-232，Troyanskaya等人，(2002)，Bioinformatics，18(11)：1454-1461，和Knudsen(2002)，A Biologist′s Guide to Analysis of DNA MicroarrayData，John Wiley & Sons所述。在某些实施方案中，通过本文所述的方法产生的细胞的基因表达数据与从包括但不限于人类ES细胞系、亲本细胞、多能干细胞系的其它细胞类型获得的基因表达数据进行比较。合适的统计分析度量标准和方法包括但不限于，皮尔逊相关(Pearson Correlation)、欧氏距离(Euclidean Distance)、分级群聚(Hierarchical Clustering)(参见，例如，Eisen等人，(1998)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95(25)：14863-14868)和自组织图(参见，例如，Tamayo等人，(1999)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96(6)：2907-2912)。 
V.诱导细胞的描述
诱导的细胞可能共有与多潜能或多能干细胞相关的某些属性，包括但不限于：ALP活性的表达、ES细胞标记基因的表达、蛋白质标记的表达、遗传标记相对于ES细胞或亲本细胞较高或较低的表达、某些 启动子(例如，Oct3/4和Nanog)相对于亲本细胞的低甲基化、长期自我更新能力、正常的二倍体核型、形态特征和形成包括外胚层、中胚层和内胚层组织的畸胎瘤的能力。诱导的细胞的组合物可包括细胞和另一种成分如培养基的补充物。 
诱导的细胞可能对于碱性磷酸酶(ALP)活性呈阳性。它们可以表达ALP，并表达以下ES细胞标记基因中的2到10种(例如，3、4、5、6、7、8、9或10种)：TDGF1、Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26a1、TERT、Zfp42、Sox2、Oct 3/4和Nanog。在某些情况下，诱导的细胞表达Tert或Cyp26a1。在某些情况下，诱导的细胞表达Tert和Cyp26a1。在某些情况下，诱导的细胞对于ALP活性呈阳性，并表达所有上述ES细胞标记基因。在某些情况下，诱导的细胞对于ALP活性呈阳性，并表达Nanog。在某些情况下，诱导细胞对于ALP活性呈阳性，并表达以下一种或多种：TERT、CYP26A1或GDF3。在某些情况下，诱导的细胞对于ALP活性呈阳性，并表达以下一种或多种：Nanog、TDGF和Dnmt3b。 
诱导的细胞可表达两种或多种下列标记蛋白：SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、CD9、CD24或Thy-1。在某些情况下，诱导的细胞表达所有上述标记蛋白。在示例性的实施方案中，人类多潜能性干细胞表达细胞表面抗原SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、CD9、CD24和CD90，及ES细胞标记基因Nanog、Oct3/4、TDGF1、Dnmt3b、GABRB3、GDF3、Zfp42、ALP、CD9和Thy-1。 
诱导的细胞可能会在表达水平上表现出差异，例如，一种或多种基因(例如，内源基因)的表达水平相对于这些基因在一种或多种胚胎干细胞例如人类胚胎干细胞中的表达水平较高或较低。优选地，通过一种或多种统计检验(如Student t-检验或其它参数或非参数检验)，基因表达的差异是统计显著的。例如，表达的差异可能具有小于或等于0.05、小于或等于0.01或小于或等于0.001的p值。 
在诱导的细胞和胚胎干细胞中显示不同表达水平的基因的数量可以是，例如，1到1000种基因、1到700种基因、1到500种基因、1到 300种基因、1到200种基因、1到100种基因、1到50种基因、3到20种基因、5到20种基因、5到50种基因、10到50种基因、20到50种基因、30到100种基因或50到100种基因、1种或更多基因、2种或更多基因、3种或更多基因、5种或更多基因、10种或更多基因、15种或更多基因、20种或更多基因、50种或更多基因、70种或更多基因或100种或更多基因、500种或更多基因、1000种或更多基因、9种基因、12种基因、42种基因、70种基因或100种基因。基因表达水平的差别可能是至少2倍，例如，至少3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、10倍、2至50倍、2至30倍、2至20倍、2至10倍或2至5倍。 
在某些情况下，在诱导的细胞和胚胎干细胞中显示不同表达水平的基因在诱导的细胞中比在人类胚胎干细胞中显示更高的表达水平。在某些情况下，在诱导的细胞中表达较高表达水平的基因是1种或更多种、2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、10种或更多种、15种或更多种、25种或更多种、50种或更多种、75种或更多种、100种或更多种、或200种或更多种在表13、15或16中列出的基因。在某些情况下，与胚胎干细胞相比在诱导的细胞中表现出不同表达水平的基因在人类胚胎干细胞中比在诱导的细胞中以更高的水平表达。在某些情况下，在人类胚胎干细胞中以较高的水平表达的基因是1种或更多种、2种或更多种、3种或更多、4种或更多种、5种或更多种、10种或更多种、15种或更多种、25种或更多种、50种或更多种、75种或更多种、100种或更多种或200种或更多种在表14中所列出的基因。 
在某些情况下，相对于胚胎干细胞或相对于亲本细胞例如成纤维细胞，一种基因或一组基因在诱导的细胞中显示较高的表达水平。例如，在诱导的细胞中比在胚胎干细胞和亲本细胞中显示较高的表达水平的基因是1种或更多种、2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、10种或更多种、15种或更多种、25种或更多种、50种或更多种、75种或更多种、100种或更多种、或200种或更多种在表15中列出的基因。 
一种基因或一组基因在诱导的细胞中的表达水平可以比在胚胎干细胞中的表达水平更接近于在亲本细胞(例如成纤维细胞)中的表达水平。例如，一种基因或一组基因可以在诱导的细胞中显示比在胚胎干细胞中更高，但不比在亲本细胞如成纤维细胞中更高的表达水平。在诱导的细胞中显示比在胚胎干细胞中更高，但不比在亲本细胞如成纤维细胞中更高的表达水平的基因可能是1种或更多种、2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、10种或更多种、15种或更多种、25种或更多种、50种或更多种、75种或更多种、100种或更多种、或200种或更多种在表16中列出的基因。 
诱导的细胞内的端粒长度可能比胚胎干细胞内染色体末端的端粒长度短。在某些情况下，诱导的细胞中的端粒比胚胎干细胞系中的端粒短至少0.1kB、至少0.25kB、至少0.5Kb、至少1kB、至少2Kb、至少3kB、至少4KB或至少5kB。在某些情况下，诱导的细胞具有比至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少8种、至少10种、或至少15种胚胎干细胞系短的端粒。 
诱导的细胞可能包含编码IF的外源基因(或转基因)。诱导的细胞可以包含编码本文所述的任何组IF的外源基因。例如，诱导的细胞可以包含编码Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc多肽的4种外源基因。在某些情况下，诱导的细胞包含编码Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc多肽的4种外源基因，但不包含其它编码诱导因子的外源基因。在其它情况下，诱导的细胞可以包含编码Oct3/4、Sox2和Klf4多肽的外源基因，但不包含编码c-Myc多肽的外源基因。在某些情况下，诱导的细胞包含基本上由编码Oct 3/4、Sox2和Klf4多肽的3种基因组成的外源基因。在某些情况下，人类多潜能性干细胞携带编码Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc的外源基因的至少一个拷贝。在某些情况下，任何包含外源基因的诱导的细胞也含有编码包含小鼠来源的阳离子氨基酸转运体(mCAT)(亲嗜性逆转录病毒的一种受体)的氨基酸序列的多肽的外源基因。 
在引入外源基因之后的某个时间点，一种或多种外源基因可以被沉默化。在某些情况下，Oct3/4外源基因沉默化；Klf4外源基因沉默 化；Sox2外源基因沉默化；或c-Myc转基因沉默化。在某些情况下，所有4种外源基因(例如Oct3/4、Sox2、K1f4和c-Myc)沉默化。在某些情况下，所有3种外源基因(例如，Oct3/4、Sox2和Klf4)沉默化。 
如本文所述，诱导的细胞可能共有诱导的多潜能干(iPS)细胞系的所有鉴别特性：1-8、2-4或3-2。按照布达佩斯条约的条款，细胞系iPS 1-8保藏于国际专利生物体保藏机构(International PatentOrganism Depositary)(IPOD)。保藏的证书号是FERM BP-10956。IPOD的地址如下： 
International Patent Organism Depositary(IPOD) 
AIST Tsukuba Central 6 
1-1，Higashi 1-chome 
Tsukuba-shi，Ibaraki-Ken 305-8566 
Japan 
在某些情况下，从存在于人出生后组织中的未分化的干细胞诱导人类多潜能性或多能干细胞，其中，Tert、Nanog、Oct3/4或Sox2基因还没有经历过外遗传失活。在某些情况下，从存在于组织中的未分化的细胞或存在于组织中的分化和未分化的细胞的组合诱导细胞。 
与亲本成纤维细胞相比，诱导的细胞中的Nanog和Oct3/4的启动子区域可能是低甲基化或去甲基化的。诱导的细胞可能是在人类ES细胞培养条件下培养时具有长期自我更新能力的干细胞。 
干细胞的特征之一是其不经历衰老而连续增殖的能力。因此，诱导的细胞可以在体外连续传代。在某些情况下，诱导的细胞能够在体外传代至少大约30次到至少大约100次，例如，大约33、35、40、45、51、56、60、68、75、80、90、93、100次，或从至少大约30次到至少大约100次传代之间的任何其它次数。诱导的细胞能够从启动促使IF在亲本细胞中的表达起增殖大约30天至大约500天的时间，例如，40天、50天、60天、70天、80天、100天、150天、180天、200天、250天、300天、400天、450天或大约30天至大约500天之间的任何其它时间。在某些实施方案中，诱导的细胞增殖超过500天。 
通常，诱导的细胞能够在大气氧气条件(例如，大约21％的氧气)下增殖，具有未分化的表型。在其它情况下，在大于5％的氧气至大约21％的氧气的氧气条件下，诱导细胞作为未分化细胞增殖。一般来说，诱导细胞在集落中增殖。 
诱导的细胞可能具有体外多潜能性的能力，如在诱导人类ES细胞体外分化的条件下分化成外胚层、中胚层和内胚层的能力；且这些细胞可能进一步具有分化成原生殖细胞(如精子、卵母细胞)的潜力。 
在某些情况下，诱导的人多潜能干细胞和亲本细胞(例如，存在于人出生后组织中的未分化的干细胞)有相同或几乎相同的SNP基因型。在某些情况下，诱导的细胞和亲本细胞具有相同的HLA型(例如，HLA-A、B、Cw、DR、DQ、DP和Bw)。 
本文提供的组合物除了诱导的细胞，或除了由诱导的细胞分化的细胞外，还可能包含其它成分。在某些情况下，组合物包含这些细胞和低温保藏剂，例如，美国专利申请10/902,571；11/142,651；或Ha等人，(2005)，Hum.Reprod.，20(7)：1779-1785中描述的低温保藏培养基。 
该组合物可能包含这些细胞和培养基，例如，人类ES培养基。在某些情况下，培养基是包含一种或多种生长因子的培养基，例如：FGF-2、bFGF、PDGF、EGF、IGF或其衍生物。在某些实例中，组合物包含诱导的人类多潜能或多能干细胞和包含FGF-2或bFGF或其衍生物的培养基。在其它实例中，组合物包含诱导的人类多潜能或多能干细胞和包含人类ES培养基和FGF-2或bFGF或其衍生物的培养基。在另一种实例中，组合物包含诱导的人类多潜能或多能干细胞和本文所述的MC-ES培养基。 
在某些情况下，培养基中的bFGF或FGF2的浓度为2ng/ml到大约50ng/ml，例如大约2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、10ng/ml、12ng/ml、14ng/ml、15ng/ml、17ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml。bFGF或FGF2的浓度也可以是大约4ng/ml到大约10ng/ml、大约4ng/ml到大约20ng/ml、大约10ng/ml到大约30ng/ml、大约5ng/ml到大约40ng/ml 或大约10ng/ml到大约50ng/ml。在其它情况下，可以使用较高的bFGF或FGF2浓度，例如，大约50ng/ml到大约100ng/ml、大约50ng/ml到大约75ng/ml。同样地，培养基可以包含除了bFGF或FGF2之外的生长因子，如本文所述，其浓度是大约2ng/ml到大约100ng/ml。 
VI.细胞分化
诱导的细胞可以分化成各种谱系的细胞类型。分化的细胞的例子包括来自外胚层(如神经元和成纤维细胞)、中胚层(如心肌细胞)或内胚层(如胰腺细胞)谱系的任何分化细胞。分化的细胞可以是以下一种或多种：胰腺β细胞、神经干细胞、神经元(如多巴胺能神经元)、少突胶质细胞、少突胶质细胞祖细胞、肝细胞、肝干细胞、星形胶质细胞、心肌细胞、造血细胞或心肌细胞。 
源自诱导的细胞的分化细胞可以是终末分化的细胞，或它们能够产生特定谱系的细胞。例如，诱导的细胞可以分化成多种多能细胞类型，例如，神经干细胞、心肌干细胞或肝干细胞。干细胞然后可以进一步分化成新的细胞类型，例如，神经干细胞可以分化成神经元；心肌干细胞可以分化成心肌细胞；肝干细胞可以分化成肝细胞。 
有许多分化诱导的细胞成为更特定的细胞类型的方法。分化诱导的细胞的方法可能类似于用来分化干细胞特别是ES细胞、MSC、MAPC、MIAMI、造血干细胞(HSC)的方法。在某些情况下，分化在体外发生；在某些情况下，分化在体内发生。 
任何已知的由ES细胞产生神经干细胞的方法可以用来从诱导的细胞生成神经干细胞，参见，例如，Reubinoff等人，(2001)，Nat，Biotechnol.，19(12)：1134-40。例如，可以通过在noggin或其它骨形态发生蛋白拮抗剂的存在下培养作为漂浮聚集物的细胞，产生神经干细胞，参见，例如，Itsykson等人，(2005)Mol，Cell Neurosci.，30(1)：24-36。在另一种实例中，可以通过在例如FGF-2的生长因子的存在下悬浮培养诱导的细胞以形成聚集物，产生神经干细胞，Zhang等人，(2001)，Nat.Biotech.，(19)：1129-1133。在某些情况下，在含有FGF-2的无血清培养 基中培养聚集物。在另一种实例中，诱导的细胞与小鼠基质细胞系例如PA6在包含FGF-2的无血清培养基的存在下共培养。在另外的一种实例中，将诱导的细胞直接转移到包含FGF-2的无血清培养基中以直接诱导分化。 
源自诱导的细胞的神经干细胞可以分化成神经元、少突胶质细胞或星形胶质细胞。通常，用于产生神经干细胞的条件还可以用来产生神经元、少突胶质细胞或星形胶质细胞。 
多巴胺能神经元在帕金森病和其它神经退行性疾病中发挥主要作用，因而是特别有意义的。为了促进向多巴胺能神经元的分化，诱导的细胞可以在无血清条件下与PA6小鼠血清基质细胞系共培养，参见，例如，Kawasaki等人，(2000)Neuron，28(1)：31-40。其它方法也有描述，参见，例如，Pomp等人，(2005)，Stem Cells 23(7)：923-30；美国专利6,395,546，例如，Lee等人，(2000)，Nature Biotechnol，18：675-679。 
少突胶质细胞也可以由诱导的细胞产生。可以通过已知的用于分化ES细胞或神经干细胞成为少突胶质细胞的方法实现诱导的细胞向少突胶质细胞的分化。例如，可以通过共培养诱导的细胞或神经干细胞与基质细胞产生少突胶质细胞，例如，Hermann等人(2004)，J Cell Sci.117(Pt 19)：4411-22。在另一种实例中，可以通过在融合蛋白的存在下培养诱导的细胞或神经干细胞来产生少突胶质细胞，在该融合蛋白中，白细胞介素(IL)-6受体或衍生物连接到IL-6细胞因子或其衍生物上。少突胶质细胞也可以通过本领域已知的其它方法由诱导的细胞产生，参见，例如，Kang等人，(2007)Stem Cells 25，419-424。 
星形胶质细胞也可以由诱导的细胞产生。可以通过在具有bFGF和EGF的神经组织培养基的存在下培养诱导的细胞或神经干细胞产生星形胶质细胞，参见，例如，Brustle等人，(1999)，Science，285：754-756。 
诱导的细胞可以通过本领域的已知方法分化成胰岛β细胞，例如，Lumelsky等人，(2001)Science，292：1389-1394；Assady等人，(2001)，Diabetes，50：1691-1697；D′Amour等人，(2006)，Nat.Biotechnol， 24：1392-1401；D′Amour等人，(2005)，Nat.Biotechnol 23：1534-1541。该方法可以包括在补充有激活蛋白A的无血清培养基中培养诱导的细胞，接着在补充有全反式视黄酸的无血清培养基中培养，接着在补充有bFGF和烟酰胺的无血清培养基中培养，例如，Jiang等人，(2001)，Cell Res.，4：333-444。在其它实例中，该方法包括在无血清培养基、激活蛋白A和Wnt蛋白的存在下培养诱导的细胞大约0.5天至大约6天，例如大约0.5、1、2、3、4、5、6天；接着在大约0.1％至大约2％例如0.2％的FBS和激活蛋白A的存在下培养大约1天到大约4天，例如，大约1、2、3或4天；随后在2％的FBS、FGF-10和KAAD-环巴胺(cyclopamine)(氧代-N-氨基乙基氨基己酰基二氢肉桂酰环巴胺)视黄酸的存在下培养大约1天至大约5天，例如，1、2、3、4或5天；接着与1％B27、γ分泌酶抑制剂和extendin-4培养大约1天至大约4天，例如，1、2、3或4天；并最后在1％B27、extendin-4、IGF-1和HGF的存在下培养大约1天至大约4天，例如，1、2、3或4天。 
肝细胞或肝干细胞可以从诱导的细胞分化。例如，在丁酸钠的存在下培养诱导的细胞可以产生肝细胞，参见，例如，Rambhatla等人，(2003)，Cell Transplant，12：1-11。在另一种实例中，可以通过在激活蛋白A的存在下、在无血清培养基中培养诱导的细胞，接着在成纤维细胞生长因子-4和骨形态发生蛋白-2中培养细胞，来产生肝细胞，例如，Cai等人，(2007)，Hepatology，45(5)：1229-39。在一种示例性的实施方案中，诱导的细胞通过以下步骤分化为肝细胞或肝干细胞，通过在激活蛋白A的存在下培养诱导的细胞大约2天至大约6天，例如，大约2天、大约3天、大约4天、大约5天或大约6天，然后在肝细胞生长因子(HGF)的存在下培养诱导的细胞大约5天至大约10天，例如，大约5天、大约6天、大约7天、大约8天、大约9天或大约10天。 
诱导的细胞也可以分化为心肌细胞。骨形态发生蛋白(BMP)信号传导的抑制可能导致心肌细胞(或cardiomyocytes)的产生，参见，例如，Yuasa等人，(2005)，Nat.Biotechnol，23(5)：607-11。因此，在一种示例性的实施方案中，在noggin的存在下培养诱导的细胞大约2天至 大约6天，例如大约2天、大约3天、大约4天、大约5天或大约6天，之后允许形成胚状体，并培养胚状体大约1周至大约4周，如大约1周、大约2周、大约3周或大约4周。 
在其它实例中，可以通过在血病抑制因子(LIF)的存在下培养诱导的细胞来产生心肌细胞，或通过对它们进行本领域已知的其它方法以从ES细胞产生心肌细胞，例如，Bader等人，(2000)，Circ.Res.，86：787-794，Kehat等人，(2001)，J Clin.Invest.，108：407-414；Mummery等人，(2003)，Circulation，107：2733-2740。 
从诱导的细胞产生其它细胞类型的方法的例子包括：(1)在视黄酸、白血病抑制因子(LIF)、甲状腺激素(T3)和胰岛素的存在下培养诱导的细胞，以产生脂肪细胞，例如，Dani等人，(1997)，J.Cell Sci.，110：1279-1285；(2)在BMP-2或BMP-4的存在下培养诱导的细胞以产生软骨细胞，例如，Kramer等人，(2000)，Mech.Dev.，92：193-205；(3)在产生平滑肌的条件下培养诱导的细胞，例如，Yamashita等人，(2000)，Nature，408：92-96；(4)在β-1整合素的存在下培养诱导的细胞以产生角质形成细胞，例如，Bagutti等人，(1996)，Dev.Biol，179：184-196；(5)在白细胞介素-3(IL-3)和巨噬细胞集落刺激因子的存在下培养诱导的细胞以产生巨噬细胞，例如，Lieschke和Dunn(1995)，Exp.Hemat.，23：328-334；(6)在IL-3和干细胞因子的存在下培养诱导的细胞以产生肥大细胞，例如，Tsai等人，(2000)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：9186-9190；(7)在地塞米松和基质细胞层、青灰因子(steel factor)的存在下培养诱导的细胞，以产生黑素细胞，例如，Yamane等人，(1999)，Dev.Dyn.，216：450-458；(8)在地塞米松、视黄酸、抗坏血酸、β-甘油磷酸酯的存在下共培养诱导的细胞与胎鼠成骨细胞，以产生成骨细胞，例如，Buttery等人，(2001)，Tissue Eng.，7：89-99；(9)在成骨因子的存在下培养诱导的细胞以产生成骨细胞，例如，Sottile等人，(2003)，Cloning Stem Cells，5：149-155；(10)在诱导的细胞中过量表达胰岛素样生长因子-2，并在二甲基亚砜的存在下培养细胞，以产生骨骼肌细胞，例如，Prelle等人，(2000)，Biochem.Biophys.Res.Commun.， 277：631-638；(11)使诱导的细胞经受产生白细胞的条件；或(12)在BMP4和SCF、FLT3、IL-3、IL-6和GCSF中的一种或多种的存在下培养诱导的细胞，以产生造血祖细胞，例如，Chadwick等人，(2003)，Blood，102：906-915。 
在某些情况下，可以纯化或分离分化细胞的亚群。在某些情况下，对于希望的细胞类型特异性的一种或多种单克隆抗体与细胞群体一起孵育，并分离那些结合的细胞。在其它情况下，希望的细胞亚群表达受细胞类型特异性启动子控制的报道基因。 
在一种具体实施方案中，以细胞类型特异性的方式表达潮霉素B磷酸转移酶-EGFP融合蛋白。纯化方法包括分选细胞，以选择绿色荧光细胞，并且如果必要反复分选，以便获得富集以细胞类型依赖的方式表达构建体(例如，潮霉素B磷酸转移酶-EGFP)的细胞的细胞群体。也可以通过阴性选择具有单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦(HSVtk/GCV)自杀基因系统的增殖细胞或通过阳性选择表达双顺反子报道基因的细胞，实现所需的细胞亚群的选择，例如，Anderson等人(2007)Mol Ther.(11)：2027-2036。 
VII.细胞疗法
诱导的细胞或从诱导的细胞分化的细胞可用作治疗疾病(如遗传缺陷)的疗法。该疗法可以用于治疗这种疾病的病因；或者，该疗法可以用于治疗疾病或状况的效应。可以将诱导的细胞转移到或接近受试者的损伤部位；或者可以以允许细胞迁移或回到损伤部位的方式将细胞引入受试者。转移的细胞可以有利地取代损坏或受损的细胞，并允许受试者的整体状况的改善。在某些情况下，转移的细胞可以刺激组织再生或修复。 
转移的细胞可以是从诱导的细胞分化的细胞。转移的细胞也可以是从诱导的细胞分化的多能干细胞。在某些情况下，转移的细胞可以是尚未分化的诱导的细胞。 
向受试者施用治疗的次数可以改变。向受试者中引入诱导的和/ 或分化的细胞可以是一次性事件；但在某些情况下，这样的治疗可能在有限的时间内引起改善，并需要一系列持续进行的重复治疗。在其它情况下，在观察到效应之前，可能需要多次施用细胞。确切的方案取决于疾病或状况、疾病的阶段和正在接受治疗的个体受试者的参数。 
可以向受试者通过以下任何途径引入细胞：肠胃外、静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、透皮、气管内、腹腔内或进入脊髓液。 
诱导的细胞可以分化为细胞，然后转移到患有各种疾病和障碍的受试者。患有神经系统疾病或障碍的受试者尤其可以受益于干细胞治疗。在某些方法中，诱导细胞可以分化成神经干细胞或神经细胞，然后移植到损伤部位来治疗神经疾病，如阿尔茨海默氏症、帕金森氏症、多发性硬化症、脑梗塞、脊髓损伤或其它中枢神经系统障碍，参见，例如，Morizane等人，(2008)，Cell Tissue Res.，331(1)：323-326；Coutts和Keirstead(2008)，Exp.Neurol.，209(2)：368-377；Goswami和Rao(2007)，Drugs，10(10)：713-719。 
对于帕金森氏病的治疗，诱导的细胞可以分化为起多巴胺作用的神经元，然后移植进入患有帕金森氏病的受试者的纹状体。对于多发性硬化症的治疗，神经干细胞可以分化为少突胶质细胞或少突胶质细胞的祖细胞，然后再转移到患有MS的受试者。 
对于任何神经系统疾病或障碍的治疗，成功的方法可以是向受试者引入神经干细胞。例如，为了治疗阿尔茨海默氏症、脑梗塞或脊髓损伤，诱导的细胞可以分化成为神经干细胞，接着移植到损伤部位。诱导的细胞还可以构建为响应可以针对其向损伤部位迁移的信号以进行大脑和脊髓的修复，例如，Chen等人，(2007)，Stem Cell Rev.，3(4)：280-288。 
也可以通过使用从诱导的细胞分化的细胞例如诱导的多潜能或多能干细胞的干细胞疗法治疗除了神经系统疾病以外的疾病。退行性心脏疾病，例如缺血性心肌病、传导疾病和先天缺陷，可以得益于干细胞治疗，参见，例如，Janssens等人，(2006)，Lancet，367：113-121。 
可以将胰岛细胞(或胰岛的主要细胞)移植到患有糖尿病(如1型糖尿病)的受试者中，参见，例如，Burns等人，(2006)Curr.Stem CellRes.Ther.，2：255-266。在某些实施方案中，可以将来源于诱导的细胞的胰腺β细胞移植到患有糖尿病(如1型糖尿病)的受试者中。 
在其它实例中，可以将来源于诱导的细胞的肝细胞或肝干细胞移植到患有肝脏疾病如肝炎、肝硬化或肝功能衰竭的受试者中。 
可以将来源于诱导的细胞的造血细胞或造血干细胞(HSC)移植到患有血液癌症或其它血液或免疫系统疾病的受试者中。用造血细胞或HSC可能治疗的血液癌症的例子包括：急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病、慢性骨髓性白血病(CML)、霍奇金病、多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤。通常，患有这类疾病的受试者必须接受放射和/或化疗治疗，以杀死快速分裂的血细胞。向这些受试者引入来源于诱导的细胞的HSC可以有助于重新建立消耗的细胞储库。 
在某些情况下，来源于诱导的细胞的造血细胞或HSC也可用于直接对抗癌症。举例来说，异体HSC移植在治疗肾癌方面显示出希望，参见，例如，Childs等人，(2000)，N.Engl.J.Med.，343：750-758。在某些实施方案中，为了治疗肾脏或其它癌症，可以将来源于诱导的细胞的异体的或甚至自体的HSC引入受试者中。 
也可以将来源于诱导的细胞的造血细胞或HSC引入受试者中，以产生或修复血细胞以外的细胞或组织，如肌肉、血管或骨。这些治疗可以用于治疗多种疾病。 
在某些情况下，将诱导的细胞转移到免疫受损的动物例如SCID小鼠中，并使其分化。移植的细胞可以形成分化的细胞类型和肿瘤细胞的混合物。可以通过使用谱系特异性标记从肿瘤细胞中选择和纯化特定的分化的目标细胞类型，例如，通过荧光激活的细胞分选(FACS)或其它分选方法，例如，磁激活的细胞分选(MACS)。然后可以将分化的细胞移植到受试者(例如，自体受试者、HLA匹配的受试者)中来治疗疾病或状况。该疾病或状况可以是造血障碍、内分泌不足、神经退行性疾病、脱发或本文所述的其它疾病或状况。 
VIII.分析方法
本文也描述了用于确定能够单独或结合其它物质如本文所述的诱导因子在原代体细胞(如皮肤细胞、单核血细胞或骨髓细胞)或细胞系(如HEK293细胞、Hela细胞、多能干细胞系或成人干细胞系)中诱导多潜能性的物质的分析方法。该方法还可能包括用于确定提高诱导因子诱导多潜能性的能力(例如，诱导多潜能性的效率)的物质的方法。在某些实施方案中，将在测定方法中使用的细胞没有经历过Tert、Nanog、Oct3/4或Sox2的外遗传失活。 
在某些实施方案中，通过测定测试物质诱导碱性磷酸酶(ALP)、ES标记基因或蛋白质标记中的一种或多种的表达的能力，在初级筛选终点评价测试物质诱导多潜能性和多能性的能力。在某些情况下，通过比较测试物质与阴性对照剂(例如，具有有限的或不存在的诱导受试者的基因或蛋白质标记的能力的物质)的诱导能力进行这种测定。在大多数实例中，在与测试物质或对照剂孵育之前和期间，在适于所培养的特定细胞类型的细胞培养基(例如，任何用于培养本文所述的细胞的细胞培养基)中培养细胞，虽然可以采集样本并在测定中直接使用而不需预先的培养步骤。在某些情况下，在测试物质的孵育期后，在本文所述的MC-ES培养基中培养细胞。 
适于筛选试验的ES标记基因的例子包括但不限于Tert、Cyp26A1、Nanog、Oct3/4或Sox2。可以通过标准方法，例如，本文中提到的任何方法，如qPCR，检测或量化mRNA水平或蛋白水平，来确定标记的表达。在其它实施方案中，在细胞接触测试物质之前，将包含一个或多个来自ES标记基因启动子的元件的报道构建体引入待分析的细胞中。产生启动子-报道基因构建体、将它们引入细胞和测定各种报道多肽活性的方法，在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley& Sons，N.Y.(2005)，3.16-3.17和9.1-9.14中分别详细描述。如果一个特定的细胞类型难以通过常规方法转染，例如，如本文描述，可以使用病毒转导来引入病毒启动子-报道基因构建体。可以通过检测报道多 肽的性质(例如，酶活性或荧光)、报道多肽的表达(例如，通过ELISA测定)或报道mRNA的表达(例如，通过荧光杂交技术)来量化启动子的活性。合适的报道多肽包括，例如，萤火虫萤光素酶、花虫萤光素酶、荧光蛋白质(例如，增强型绿色荧光蛋白)、β-半乳糖苷酶、β内酰胺酶和辣根过氧化物酶。用于检测Nanog、Sox2、Oct 3/4、TERT或Cyp26A1启动子活化作用的诱导的示例性启动子-报道基因构建体如以下文献中所述：Kuroda等人，(2005)，Mol.Cell Biol.，25(6)：2475-2485(对于Nanog)；Zhan等人，(2005)，Cell Biochem.Biophys.，43(3)：379-405(对于Oct3/4和Sox2；和Tzukerman等人，(2000)，Mol.Biol.Cell，11(12)：4381-4391(对于hTert)，和Loudig等人，(2005)，Biochem.J.，392(Pt 1)：241-248。在某些实施方案中，ALP活性在测试的细胞中的存在用作测试物质的诱导活性的初步测试。在上述任何试验中的阳性结果，如测试物质比对照剂明显更高的活性水平，作为测试物质具有诱导活性的初步指示。可以通过在本文所述的用于确定多潜能性或多能性的任何试验的初步筛选中检测接触测试物质的细胞，进一步筛选这些候选诱导剂，所述试验包括但不限于，确定一组ES标记基因的表达、蛋白质标记、长期自我更新、Oct3/4、Sox2和Nanog启动子的低甲基化、形成畸胎瘤的能力和体外分化成外胚层、中胚层和内胚层谱系的细胞类型的能力。 
试验的条件可能不同，取决于所利用的试验方案和所使用的细胞和物质的性质。对于这些分析，在终点测定前的细胞培养期可能会从至少大约3天到至少大约40天不等，例如，5、6、9、10、12、14、20、21、25、26、27、30、32、34、36、38天或至少大约3天到至少大约40天之间的其它期限。此外，在大多数情况下，测试物质孵育的时间是至少大约30分钟至大约40天，例如，1小时、2小时、12小时、18小时、1天、3天、5天、7天、14天、21天、25天、30天、34天，或至少大约30分钟至至少大约40天之间的任何其它期限。 
在某些实施方案中，待测试的物质是siRNA，包括但不限于包含靶基因序列的大约19个碱基对且能够抑制RNA干扰的靶基因表达的 双链RNA。参见，例如，Scherr等人，(2007)，Cell Cycle，6(4)：444-449。在某些实施方案中，待分析的siRNA包括但不限于全基因组siRNA文库，如下所述，例如，Miyagishi等人，(2003)，Oligonucleotides，13(5)：325-333；和Huesken等人，(2005)，Nat.Biotechnol，8：995-1001。合适的全基因组siRNA文库，例如，市售的阵列siRNA文库包括：来自Qiagen(Valencia，CA)的″Human Whole Genome siRNA Set V4.0″，来自Dharmacon，Inc.(Lafayette，CO)的″Human siGENOME siRNALibrary-Genome″，和来自Ambion(Austin，TX)的 HumanGenome siRNA Library。用于引入siRNA的方法和试剂包括但不限于，如LipofectamineTM  RNAiMAX(Invitrogen，Carlsbad，CA)、TransMessenger转染试剂(Qiagen，Valencia，CA)或Dharma (Dharmacon，Lafayette，CO)的商业试剂。参见，例如，Krausz(2007)，Mol.Biosyst.，3(4)：232-240。在某些实施方案中，如Root等人，(2006)，Nat.Methods，3(9)：715-719所述，使用病毒RNAi文库。 
任选地，待筛选的诱导测试物质是小分子。测试分子可以是选择的单独的小分子，或在某些情况下，待筛选的小分子测试物质来自组合文库，即通过组合许多化学“构件块”通过化学合成或生物合成产生的不同化学化合物的集合。例如，对于给定的化合物长度(即多肽化合物中的氨基酸数)，以各种可能的方式，通过组合一组称为氨基酸的化学构件块形成线性组合化学文库，如多肽文库。通过化学构件块的这种组合混合可以合成数以百万计的化合物。实际上，从理论上讲，100种可互换的化学构件块的系统组合混合可导致1亿四聚体化合物或100亿五聚体化合物的合成。参见，例如，Gallop等人，(1994)，J.Med.Chem.，37(9)，1233-1251。组合化学文库的制备和筛选是本领域众所周知的。组合化学文库包括但不限于：diversomers，如乙内酰脲、苯二氮 和二肽，如Hobbs等人，(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90：6909-6913所述；小分子化合物文库的类似有机合成，如Chen等人，(1994)，J.Amer.Chem.Soc，116：2661-2662所述；寡聚氨基甲酸酯(Oligocarbamates)，如Campbell等人，(1994)，J.Org.Chem.，59： 658-660所述；肽基膦酸酯，如Campbell等人，(1994)，J.Org.Chem.，59：658-660所述；及含有以下分子的有机小分子文库，如噻唑烷酮(thiazolidinones)和metathiazanones(美国专利5,549,974)、吡咯烷(美国专利5,525,735和5,519,134)、苯并二氮杂 (美国专利5,288,514)。 
许多组合文库可购自例如ComGenex(Princeton，NJ)、Asinex(Moscow，Russia)、Tripos，Inc.(St.Louis，MO)、ChemStar，Ltd.(Moscow，Russia)、3D Pharmaceuticals  (Exton，PA)和MartekBiosciences(Columbia，MD)。 
在某些情况下，针对诱导活性进行筛选的测试物质可以与本文所述的一种或多种诱导因子(例如，Oct3/4、Sox2、Klf4或c-Myc)，例如，1、2、3或4种本文所述的诱导因子，组合使用。在某些情况下，测试物质与一种诱导因子组合筛选，例如，Oct3/4、Sox2、Klf4或c-Myc。在其它情况下，测试物质与两种诱导因子组合筛选，例如，Oct3/4和Sox2；Oct3/4和Klf4；Oct3/4和c-Myc；Sox2和Klf4；Sox2和c-Myc；或Klf4-和c-Myc。在某些实施方案中，测试物质与3种诱导因子组合筛选，例如，Oct3/4、Sox2和Klf4；Oct3/4、Klf4和c-Myc；Oct3/4、Sox2和c-Myc；或Sox2、Klf4和c-Myc。也可以检测测试物质提高一组诱导因子例如Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc的组合诱导多潜能性的效率的能力。 
IX.细胞的存储
可以存储收获的组织、细胞、诱导的细胞、诱导的多潜能细胞、诱导的多能细胞、从收获的组织分化的细胞或本文所述的其它细胞。因此，可以存储来自过程中的任何时间点的细胞或材料，用于将来完成该过程或使用修改。 
存储方法可以是任何方法，包括本文所述的方法，例如使用低温保藏培养基。一些示例性的低温保藏培养基包括“用于灵长类动物ES细胞的低温保藏培养基”(ReproCELL，Tokyo，Japan)或mFreSRTM (StemCell Technologies，Vancouver，CA)。优选地在液氮中快速冷冻细胞，并在液氮储存容器中储存。用于低温保藏/融化本文所述的方法产生的细胞的其它合适的低温保藏培养基和方法在以下文献中提到，例如，美国专利申请10/902,571和11/142,651。也参见，Ha等人，(2005)，Hum.Reprod.，20(7)：1779-1785。 
X.实施例
下列具体的实施例可以解释为仅仅说明性的，而不是以任何方式对其余的公开内容进行限制。不需要进一步阐述，相信本领域的技术人员可以根据本文的描述，最大程度地利用本发明。本文完整地引入本文引用的所有出版物。凡提到URL或其它这样的标识符或地址，可以理解为这些标识符可以改变，互联网上的详细信息可能变化，但可以通过搜索互联网找到相当的信息。其引用证明这些信息的可用性和公开传播。 
实施例1.逆转录病毒载体的制备
使用Fugene HD(由Roche生产)，将表1中构建的用于4种基因的逆转录病毒载体质粒(Oct3/4-pMx、Sox2-pMx、Klf4-pMx和c-Myc-pMx)引入包装细胞系Plat-E[Experimental Hematology，2003，31(11)：1007-1014]。在引入逆转录病毒载体质粒大约24至48小时后，将培养基更换为适于引入基因的细胞的培养基。在培养引入逆转录病毒载体的Plat-E超过4小时后，回收上清液，并通过直径45μm的过滤器(由Millipore生产)。通过上述方法制备4种基因(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)的逆转录病毒载体溶液。 
使用Fugene HD(由Roche生产)，将用于3种基因的逆转录病毒载体质粒(Oct3/4-pMx、Sox2-pMx和Klf4-pMx)引入包装细胞Plat-E细胞。在逆转录病毒载体引入后24至48小时，将培养基更换为适于引入基因的细胞的培养基。在培养引入逆转录病毒载体的Plat-E超过4小时后，回收上清液，并通过直径45μm的过滤器(由Millipore生产)。 通过上述方法制备3种基因(Oct3/4、Sox2和Klf4)的逆转录病毒载体溶液。 
实施例2.腺病毒载体的制备
双向性逆转录病毒的使用具有感染实验者的明显的危险。这种危险受到特别关注，其中，逆转录病毒编码致癌蛋白质(例如，c-Myc)。因此，我们使用选择性地识别小鼠受体、小鼠来源的阳离子氨基酸转运体1(mCAT1)的同向性逆转录病毒载体。我们用携带编码mCAT 1的基因的腺病毒载体感染人类细胞，从而使同向性逆转录病毒选择性地感染表达mCAT1的人细胞。 
首先，构建携带具有小鼠来源的阳离子氨基酸转运体(mCAT1)基因的编码区序列的cDNA的腺病毒载体。具体来说，使用Adeno-X表达系统1试剂盒(由TakaraBio Clontech生产)。在Adeno-X表达系统1试剂盒中，基于附在TakaraBio的试剂盒中的实验方法，将mCAT1基因亚克隆到名为pShuttle的载体的多克隆位点中。 
随后，在pShuttle表达盒两末端的切割位点PI-Sce I位点和I-Ceu I位点附近切割表达盒，并将含有需要的基因的DNA片段插入上述试剂盒中的Adeno-X病毒DNA中的PI-Sce I位点和I-Ceu I位点之间，然后用限制性内切酶Swa I处理以除去整合不成功的腺病毒DNA。在将质粒转化进入大肠杆菌DH5菌株后，通过限制性内切酶处理、PCR等证实需要的基因是否正确地引入腺病毒DNA中。大量制备质粒，并用Pac I限制性内切酶酶切。使用如此获得的重组腺病毒DNA，将基因引入HEK293细胞(MicroBix)，并使用Lipofectamin 2000(Invitrogen生产)接种到6个孔中，并在2周后当细胞显示细胞致病效应(CPE)时，收集培养基中的细胞。 
随后，将细胞悬浮液冷冻并融化3次后，破坏这些细胞，并使细胞中存在的病毒微粒释放到液体中。将如此制备的病毒悬浮液添加到一个HEK293细胞等效的100mm塑料培养皿(5×106细胞)中以感染细胞，繁殖病毒。此外，在使用4个HEK293细胞等效的150mm培养 皿大量制备病毒后，使用腺病毒纯化试剂盒(Clontech生产)纯化，并在-80℃冷冻保存。 
使用Adeno-X快速滴度试剂盒，测定mCAT1腺病毒载体的滴度(噬斑形成单位，PFU)。在24孔板上，以5×104细胞/500μl每孔的浓度接种HEK293细胞。50μl的连续稀释(从10-2到10-7)的病毒载体与500μl的培养基混合，然后用于感染细胞。在5％CO2和37℃培养48小时后，吸出培养基，干燥细胞5分钟，然后使用500μl冷的100％甲醇，通过在-20℃静置10分钟固定细胞。吸出甲醇后，用500μl含有1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液洗孔3次。用含有1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液稀释小鼠抗六邻体(Hexon)抗体1000倍，并向孔中加入各250μl。 
在于37℃静置1小时后，除去抗体溶液，并用500μl含有1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液洗孔3次。用含有1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的大鼠抗小鼠免疫球蛋白抗体500倍，并向孔中加入250μl。在于37℃静置1小时后，除去抗体溶液，并用500μl含有1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液清洗3次。向孔中加入250μl DAB(二氨基联苯胺)溶液(用稳定的过氧化物酶缓冲液稀释10倍的DAB浓缩物)，并在室温下静置10分钟。吸出DAB后，加入500μl磷酸盐缓冲液。使用20倍物镜，在6个视野中计数棕色阳性细胞的数目。 
标准20倍物镜的半径：0.5mm 
1个视野的面积：7.853×10-3cm2
孔面积：2cm2
孔的视野：2cm2/7.853x 103cm2＝254.7视野 
(32/6)×254.7/(0.55×10-5)＝2.5×108ifu(感染单位)/ml 
实施例3.碱性磷酸酶染色
以下面的方式进行染色，以证明作为多潜能干细胞的特征的碱性磷酸酶活性。在除去培养基后，向孔中加入10％的福尔马林中性缓冲 溶液，并在室温下固定细胞5分钟。在用磷酸盐缓冲液等清洗后，加入碱性磷酸酶的生色底物1步BCIP/NBT(Pierce生产)，并在室温下反应20至30分钟。具有碱性磷酸酶活性的细胞均被染为蓝紫色。 
实施例4.通过定量PCR对集落的基因表达的测定
以下列方式使用定量PCR技术测定包括ALP阳性集落的每个集落中靶基因的表达。收获通过诱导多潜能或多能干细胞发展的集落，并使用用于FFPE的Recoverall总核酸分离试剂盒(Recoverall total nucleicacid isolation kit for FFPE)(由Ambion生产)提取RNA。从提取的RNA合成cDNA后，使用Taqman Preamp主混合物(由Applied Biosystems生产)扩增靶基因。 
作为定量PCR的TaqMan引物，使用Taqman gene exprESsion assay(Applied Biosystems生产)。下面显示靶基因的名称和每种引物的产物代码。人类Hprt：Hs99999909_m1、人类Nanog：Hs02387400_g1、人类Tert：Hs00162669_m1、小鼠Hprt：Mm01545399_m1、小鼠Nanog：Ma02019550_s1。 
作为定量PCR的阳性对照，使用从通过下列方式建立的间充质干细胞中提取的cDNA。 
在37℃水浴中融化1小瓶(2.5×107细胞)人骨髓衍生的单核细胞(hBMMNC(由Lonza生产)、批号060175A：女，21岁，黑人)，并悬浮于10ml的MSCGM培养基(用于间充质细胞的生长培养基)(由Lonza生产)中。为了除去冷冻溶液中的DMSO，在4℃下以300g离心7分钟，并除去上清液。将由此获得的细胞团块重悬浮于10ml的MSCGM培养基中，并以105细胞/cm2的密度接种于100mm板上，并在37℃培养。7天后，更换培养基。此时，通过在4℃下以300g离心5分钟收集旧培养基中悬浮的细胞，并连同新鲜培养基一起返回细胞中。在第13天，当贴壁的细胞汇合时，除去上清液，用磷酸盐缓冲液洗去非贴壁的细胞，并通过用0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液分离，收集贴壁的细胞，并以3000细胞/cm2的密度接种。从第三传代培养物的细胞中 收集RNA，并合成cDNA。 
实施例5.从存在于成人出生后骨髓组织中的未分化的干细胞诱导人类多潜能干细胞
在低血清(2％)和高血清(10％)培养条件下，由含有存在于成人出生后骨髓组织中的未分化干细胞的成人骨髓衍生细胞(商品名：人骨髓衍生单核细胞)建立细胞，并在用于诱导多潜能干细胞的实验中使用。因此，在37℃水浴中融化1小瓶每种(2.5×107细胞)冷冻的人骨髓衍生单核细胞(hBMMNC(由Lonza生产)、批号060809B：女，20岁，白人/和hBMMNC(由Lonza生产)、批号060470B：女，20岁，黑人)，并悬浮于10ml用于低血清培养的MAPC培养基中。为了除去冷冻溶液中的DMSO，在4℃下以300g离心7分钟，并除去上清液。 
重悬浮由此获得的细胞团块，并以105细胞/cm2的密度接种到具有10ng/ml纤连蛋白的100mm板上。加入生长因子[10ng/ml PDGF-BB(Peprotech生产)、10ng/ml EGF(Peprotech生产)、10ng/ml IGF-II(Peprotech生产)]。3天后，只加入生长因子。7天后，收集除了贴壁细胞之外的悬浮细胞和培养基，并在4℃下以300g离心5分钟。除去上清液后，将这些细胞重悬浮于新鲜培养基。将该细胞悬浮液返回到原来的10cm培养皿，并向其中加入生长因子。在第10天，当贴壁细胞汇合时，除去上清液，用磷酸盐缓冲液洗去非贴壁的细胞，并通过用0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液分离，收集贴壁细胞，并使用细胞储库(banker)(Juji Field生产)冷冻储存原代培养物。 
使用同一批的人骨髓衍生单核细胞，在高血清条件下，使用含有10％FBS的MSCGM培养基(Lonza生产)建立细胞。以105细胞/cm2的密度将人骨髓衍生的单核细胞接种到已经加入10ml MSCGM培养基的100mm板上，并在37℃培养。7天后，收集除了贴壁细胞之外的悬浮细胞和培养基，并在4℃下以300g离心5分钟，并在除去上清液后，将这些细胞重悬浮于新鲜培养基。将该细胞悬浮液返回到原来的 10cm培养皿，并继续培养。在第13天，当贴壁细胞汇合时，除去上清液，用磷酸盐缓冲液洗去非贴壁细胞。并通过用0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液分离，收集贴壁细胞，并使用细胞储库(Juji Field生产)冷冻储存原代培养物。 
在高血清和低血清条件下建立并冷冻储存的一小瓶每种人骨髓衍生的原代培养细胞在37℃培养箱中融化。分别向细胞加入2ml用于建立的培养基，并将细胞以104细胞/cm2的密度接种到6孔塑料培养皿上，所述塑料培养皿的孔已经用20μg/cm2浓度的基质胶(BDBioscience生产)包被，并培养14小时(第二次传代培养细胞)。14小时后，除去培养基，并在每孔500μl Hank’s平衡盐溶液中以相当于10m.o.i.的量加入实施例2中制备的mCAT1腺病毒载体，然后在室温下感染30分钟。 
向每孔加入各2ml用于建立的培养基，并在37℃培养。引入mCAT-1腺病毒载体48小时后，用2ml实施例1制备的4种基因(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)的逆转录病毒载体溶液(加入最终浓度为4μg/ml的聚凝胺)更换每孔中的培养基，并在37℃培养14小时。除去病毒上清液，并更换为MEF调节的ES培养基。然后，每两天连续用MEF调节的ES培养基更换培养基。在引入4种基因14天后检查，在显示诱导的多潜能性干细胞的特点的批号060809B的低血清条件组中发现一个典型的集落。所述集落由明显小于周围细胞的细胞组成。除了多潜能干细胞样的集落，在低血清组和高血清组中还观察到多个集落，但它们没有用碱性磷酸酶染色。 
为了分离多潜能干细胞样集落，用Hank’s平衡盐溶液清洗孔，然后用已向其底部应用硅脂的克隆环(Iwaki生产)围绕集落。然后在环中加入100μl用于灵长类动物ES细胞的分离培养基(ReproCELL生产)，并在37℃下培养10-20分钟。向2ml MEF调节的ES培养基中加入包含分离的集落的环中的细胞悬浮液，并接种到MEF包被的24孔板的一个孔中。在37℃培养8至14小时后，更换培养基，随后每两天连续更换培养基，并在8天后进行第二次传代培养。 
除去培养基，用Hank’s平衡盐溶液清洗，加入用于灵长类动物ES细胞的分离培养基(ReproCELL生产)，在37℃培养10分钟，加入2ml培养基以终止反应。将细胞悬浮液转移到离心管中，并在4℃以200g离心5分钟，以除去上清液。将细胞重悬浮于MEF调节的ES培养基中，并接种到MEF包被的24孔板的4个孔中。每两天连续更换培养基，并在7天后进行第二次传代培养，细胞进行碱性磷酸酶染色，源自克隆集落的细胞被染色为蓝紫色。 
此外，通过定量PCR证实，碱性磷酸酶活性阳性的多潜能干细胞的集落表达Nanog和Tert。与实施例4中建立的间充质干细胞相比，Nanog的表达量高出多达30倍。只在所述多潜能干细胞中注意到Tert的表达，而在间充质干细胞中没有注意到。图2显示Nanog和Tert基因在引入4种基因的成人骨髓衍生细胞中的相对表达。将Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc引入在低血清条件下由成人骨髓衍生的单核细胞建立的细胞中。从所获得的集落提取RNA，并通过定量PCR证明人类Nanog和人类Tert基因的表达。没有引入4种基因的成纤维细胞和间充质干细胞用作实验中的对照。基因表达量表示为相对值，其中表达量用人次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)的表达量标准化，将在由新生儿皮肤成纤维细胞诱导的碱性磷酸酶(ALP)阳性集落中的HPRT基因的表达量设为1。现证实，Nanog和Tert在引入4种基因(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)并且为ALP阳性的集落中的表达明显较高。如图2所示，Nanog和Tert基因在尽管引入了4种基因但没有形成集落的细胞中不表达。 
从以上结果可以看出，当使用成人骨髓衍生的细胞时，从低血清培养组获得多潜能干细胞，但从高血清培养组(批号060809B和批号060470B)根本没有获得(表2)。此外，在低血清培养条件下的培养适于未分化细胞的维持。 
实施例6.从存在于人类新生儿皮肤中的未分化的干细胞诱导人类多潜能干细胞
使用源自人类新生儿组织即刚出生后的人类组织的细胞(商品名：新生儿正常人类皮肤成纤维细胞，原代培养物)，尝试从存在于人类新生儿皮肤中的未分化的干细胞诱导人类多潜能干细胞。 
在37℃培养箱中融化一小瓶冷冻的新生儿正常人类皮肤成纤维细胞(原代培养物，由Lonza生产，批号5F0438)，并悬浮于MCDB202修良培养基中，即，包含2％胎牛血清、5ng/ml胰岛素、50μg/ml庆大霉素、50ng/ml两性霉素-B的培养基(FBM培养基，由Lonza生产)，以获得12ml细胞悬浮液。将各2ml细胞悬浮液接种到其底部已经用20μg/cm2浓度的基质胶(BD Bioscience)包被的6孔塑料培养皿上(第二次传代培养细胞)。 
14小时后，除去培养基，并在每孔500μl Hank’s平衡盐溶液中以相当于5m.o.i.的量加入实施例2中制备的mCAT1腺病毒载体，然后在室温感染30分钟。向每个孔中分别加入2ml FBM培养基，并在37℃下培养。引入mCAT-1腺病毒载体48小时后，用2ml实施例1制备的4种基因(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)的逆转录病毒载体溶液(加入最终浓度为4μg/ml的聚凝胺)替换每孔的培养基，并在37℃培养4小时。 
除去病毒上清液，并更换为MEF调节的ES培养基。然后，每两天连续用MEF调节的ES培养基更换培养基，并在引入4种基因14天后，对6孔板的1个孔进行碱性磷酸酶染色。结果，获得6个多潜能干细胞样的碱性磷酸酶阳性集落。碱性磷酸酶阳性集落由明显小于新生儿正常人类皮肤成纤维细胞的细胞组成。 
随后，通过定量PCR证实，碱性磷酸酶活性阳性的多潜能干细胞的集落表达Nanog和Tert。图3显示Nanog和Tert基因在引入4种基因的新生儿成纤维细胞中的相对表达。将Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc引入源自新生儿皮肤的原代培养成纤维细胞中；从获得的集落提取RNA；并通过定量PCR确定人类Nanog和人类Tert基因的表达量。没有引入4种基因的亲本成纤维细胞和间充质干细胞用作实验中的对照。使用与图2中列出的程序相同的程序对基因表达标准化。现证实，Nanog和 Tert在引入4种基因并且为ALP阳性的集落中的表达明显较高。如图3所示，与实施例5中在高血清(10％)培养条件下建立的间充质干细胞相比，引入4种基因前的新生儿正常人皮肤成纤维细胞不表达Nanog，而在引入4种基因后的细胞的情况下，观察到在没有形成集落的细胞中Nanog的表达有9倍之多，而在碱性磷酸酶活性阳性的集落中Nanog的表达有18倍之多(图3)。另一方面，只在碱性磷酸酶活性阳性集落中注意到Tert的表达。由此可见，可以通过碱性磷酸酶活性阳性和Nanog阳性和Tert阳性的特征定义多潜能性干细胞。此外，也证实了新生儿正常人类皮肤成纤维细胞是具有相对较高的诱导多潜能性干细胞的效率并能通过引入4种基因表达Nanog的细胞。 
以以下方式分离多潜能干细胞集落。在基因引入后的第17天，从剩余的孔中选择6个具有特征形状的集落。用Hank’s平衡盐溶液清洗孔之后，用已向其底部应用硅脂的克隆环(Iwaki生产)围绕集落。然后在环中加入100μl用于灵长类动物ES细胞的分离培养基(ReproCELL生产)，并在37℃下孵育20分钟。向2ml MEF调节的ES培养基中加入包含分离的集落的环中的细胞悬浮液，并接种到MEF包被的24孔板的一个孔中。在37℃下培养14小时后，更换培养基，随后每两天连续更换培养基，并在8天后进行第二次传代培养。除去培养基，用Hank’s平衡盐溶液清洗，加入用于灵长类动物ES细胞的分离培养基(ReproCELL生产)，在37℃下培养10分钟，加入2ml培养基以终止反应。 
将细胞悬浮液转移到离心管中，并在4℃下以200g离心5分钟，并除去上清液。将细胞重悬浮于MEF调节的ES培养基中，并接种到MEF包被的24孔板的4个孔中。在第二次传代培养7天后，以下面所述的传代培养方法将细胞接种到其底部已经用20μg/cm2浓度的基质胶包被的60mm塑料培养皿上。再8天之后(引入4种基因后37天)，进行第3次传代培养，并接种到基质胶包被的60mm塑料培养皿上，其中部分用于碱性磷酸酶染色和RNA提取。结果证实，源自克隆的集落的细胞是碱性磷酸酶活性阳性的，并且高比例地表达Nanog和Tert，从 而确认它们是多潜能干细胞。 
为了维持和生长，每5至7天传代培养诱导的多潜能性干细胞。从进行传代培养的塑料培养皿上除去培养基，用Hank’s平衡盐溶液清洗这些细胞，加入分散酶或用于灵长类动物ES细胞的分离培养基，并在37℃下培养5至10分钟。当分离超过半数的群体时，加入ES培养基以终止反应，并将细胞悬浮液转移到离心管中。当集落沉淀于管底部时，除去上清液，并再次加入ES培养基进行悬浮。在检查过集落的大小之后，通过缓慢的移液操作将任何非常大的集落分解成较小的大小。将大小合适的集落接种到基底面积是传代培养前的大约3至6倍的基质胶包被的塑料培养皿上。 
如表2所示，该批次(批号5F0474)而不是上述批次5F0438的新生儿正常人类皮肤成纤维细胞显示有利的多潜能干细胞诱导。与实施例5相比，源自年轻个体的细胞或培养时间短的细胞被认为适于多潜能干细胞的诱导。 
从以上结果可以看出，当包含未分化细胞的源自作为人出生后组织的人类新生儿组织的细胞在含有2％血清的培养基中进行第二次传代培养时，可能诱导多潜能干细胞。 
实施例7.从存在于成人皮肤中的未分化干细胞诱导人类多潜能干细胞
然后，使用含有存在于成人皮肤中的未分化干细胞的源自成人组织的细胞(商品名：成人正常人类皮肤成纤维细胞，原代培养物)，进行本发明的多潜能干细胞的诱导。 
在37℃培养箱中融化各一小瓶冷冻的成人正常人类皮肤成纤维细胞(原代培养物，由Lonza生产，批号6F3535：28岁，女，白人，批号6F4026：39岁，女，白人)，悬浮于FBM培养基中，分别获得12ml的细胞悬浮液。将各2ml细胞悬浮液接种到其底部已经用20μg/cm2浓度的基质胶包被的6孔塑料培养皿上(第二次传代培养细胞)。 
14小时后，除去培养基，并在每孔500μl Hank’s平衡盐溶液中以 相当于5m.o.i.的量加入实施例2中制备的mCAT1腺病毒载体，然后在室温下感染30分钟。向每个孔中加入2ml FBM培养基，并在37℃下培养。引入mCAT-1腺病毒载体48小时后，用2ml实施例1制备的4种基因(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)的逆转录病毒载体溶液(加入最终浓度为4μg/ml的聚凝胺)替换每孔的培养基，并在37℃下培养4小时。除去病毒上清液，并更换为MEF调节的ES培养基。每两天连续用MEF调节的ES培养基更换培养基，并在引入4种基因13天后，进行碱性磷酸酶染色。结果，从批号6F3535获得每孔2个多潜能干细胞样的碱性磷酸酶阳性集落，而从批号6F4242没有获得碱性磷酸酶阳性集落(表2)。 
与实施例6相比，皮肤成纤维细胞之间的来自新生儿的细胞具有更高的诱导多潜能性干细胞的效率。此外，在成人正常人类皮肤成纤维细胞中，源自较年轻的供体的细胞具有较高的转化效率。从以上可以证明，诱导多潜能干细胞的效率以年龄依赖性的方式下降。 
实施例8.使用第三次传代培养的新生儿正常皮肤成纤维细胞的检查
在37℃培养箱中融化一小瓶冷冻的新生儿正常人类皮肤成纤维细胞(原代培养物，由Lonza生产，批号5F0439)，悬浮于FBM培养基中，并接种到100mm塑料培养皿上(第二次传代培养物)。培养6天直到可以获得70％至90％的汇合后，使用0.025％胰蛋白酶-EDTA溶液(Lonza生产)分离细胞，在4℃下以300g离心5分钟，并除去上清液。使用细胞储库冷冻储存收集的第二次传代培养的细胞。 
在37℃培养箱中融化冷冻的第二次传代培养细胞，并悬浮于12ml FBM培养基中，并在4℃以200g离心5分钟，并除去上清液。悬浮细胞，以104细胞/cm2的密度接种到其底部已经用20μg/cm2浓度的基质胶包被的100mm塑料培养皿上(第三次传代培养)。14小时后，除去培养基，并在2ml Hank’s平衡盐溶液中以相当于5m.o.i.的量加入实施例2中制备的mCAT1腺病毒载体，然后在室温下感染30分钟。向每孔加入10ml的FBM培养基，并在37℃培养。 
引入mCAT-1腺病毒载体48小时后，除去培养基，替换为10ml实施例1制备的4种基因(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)的逆转录病毒载体溶液(加入最终浓度为4μg/ml的聚凝胺)，并在37℃培养4小时。除去病毒上清液，并替换为MEF调节的ES培养基。然后，每两天持续用MEF调节的ES培养基更换培养基，并在引入4种基因14天后，进行碱性磷酸酶染色。结果，获得5个多潜能干细胞样的碱性磷酸酶阳性集落。通过基于底部面积的计算，这表明，6孔板的每个孔获得0.83个集落(表2)。 
与实施例6相比，表明诱导多潜能干细胞的效率随培养期的延长而下降。 
实施例9.从存在于脐带中的未分化细胞诱导人类多潜能干细胞(1)
使用源自人脐带即刚出生后的人类组织的细胞(商品名：正常人脐静脉内皮细胞，原代培养物)，尝试从存在于脐带中的未分化的干细胞诱导本发明的人类多潜能干细胞。 
在37℃培养箱中融化1小瓶冷冻的正常人脐静脉内皮细胞(原代培养物，Lonza生产)，并悬浮于由Lonza生产的内皮细胞培养基试剂盒-2(2％血清)(下文称为EBM-2)，以获得12ml细胞悬浮液。将大约105/2ml/孔的每种悬浮细胞液接种到其底部已经用20μg/cm2浓度的基质胶包被的6孔塑料培养皿上(第二次传代培养)。6小时后，除去培养基，并在每孔500μl Hank’s平衡盐溶液中以相当于5m.o.i.的量加入实施例2中制备的mCAT1腺病毒载体，然后在室温下感染30分钟。 
向每孔中加入2.5ml EBM-2培养基，并在37℃培养。引入mCAT-1腺病毒载体48小时后，用各2ml实施例1制备的4种基因(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)的逆转录病毒载体溶液(加入最终浓度为5μg/ml的聚凝胺)替换每孔的培养基，并在37℃培养4小时。除去病毒上清液，并替换为MEF调节的ES培养基。然后，每两天连续用MEF调节的ES培养基更换培养基，并在引入4种基因12天后，证实集落。 
引入4种基因之后13天，诱导的集落针对碱性磷酸酶活性染色。 
从以上结果可以看出，当包含未分化细胞的源自作为人出生后组织的人类脐带的细胞在含有2％血清的培养基中进行第二次传代培养时，可能诱导多潜能干细胞。 
实施例10.从存在于脐带中的未分化细胞诱导人类多潜能干细胞(2)
如下所述，使用源自人脐带即刚出生后的人类组织的细胞(商品名：正常人脐动脉平滑肌细胞，第三次传代培养物)，尝试从存在于脐带中的未分化的干细胞诱导本发明的人类多潜能干细胞。 
在37℃培养箱中融化1小瓶冷冻的正常人脐动脉平滑肌细胞(第三次传代培养物，Lonza生产)，并悬浮于由Lonza生产的平滑肌细胞培养基试剂盒-2(5％血清)(下文称为SmGM-2)，以获得12ml细胞悬浮液。将大约105/2ml/孔的每种悬浮细胞液接种到其底部已经用20μg/cm2浓度的基质胶(Becton Dickinson生产)包被的6孔塑料培养皿(Becton Dickinson生产)上(第四次传代培养)。1天后，除去培养基，并在每孔500μl的Hank’s平衡盐溶液中以相当于1.25至5m.o.i.的量加入mCAT1腺病毒载体，然后在室温下感染30分钟。向每孔中加入各2.5ml SmGM-2培养基，并在37℃培养。 
引入mCAT-1腺病毒载体48小时后，用各2ml实施例1制备的4种基因(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)的逆转录病毒载体溶液(加入最终浓度为5μg/ml的聚凝胺)替换每孔的培养基，并在37℃下培养4小时。除去病毒上清液，并替换为MEF调节的ES培养基。然后，每两天连续用MEF调节的ES培养基更换培养基。在引入4种基因13天后，证实集落。但是，诱导的集落没有对碱性磷酸酶活性染色。 
以上结果揭示：尽管源自作为人出生后组织的人类脐带的细胞包含存在于脐带中的未分化的细胞，但是当细胞在含有5％血清的培养基中进行第四次传代培养时，多潜能干细胞的诱导更具挑战性。 
实施例11.从存在于小鼠出生后组织中的未分化细胞诱导小鼠多潜能干细胞
使用小鼠骨髓衍生的细胞、小鼠出生后组织，尝试从存在于小鼠出生后组织中的未分化细胞诱导小鼠多潜能干细胞。 
从4至6周大的小鼠(C57BL/6N谱系，4周大，雌性)中提取股骨和胫骨，极为谨慎以不要带出任何其它组织。通过在70％乙醇中短时间浸泡收集的骨，杀死附于骨外的细胞，以防止骨髓之外的细胞的污染。乙醇处理后，立即将骨转移到Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)(SIGMA)中，以防止骨髓内部的细胞的影响。用Kimwipe擦拭每个骨的外侧，以除去结缔组织。将所有处理的骨转移到包含IMDM的研钵中，并用研杵破碎。用IMDM清洗几次后，用剪刀将骨切成块。进一步用IMDM清洗几次后，将骨头碎片转移到离心管中。 
除去IMDM后，5只小鼠的每个骨碎片加入10ml含有0.2％胶原酶I(SIGMA生产)的IMDM，并在37℃振荡1小时。振荡后，使用Pipetman多次搅动悬浮液，然后将上清转移到另一管中，向其中加入等量的冷的含有10％FBS的IMDM以终止酶反应。酶处理后，将骨头碎片转移到含有冷的含10％FBS的IMDM的研钵中，再次用研杵破碎，多次搅拌后，收集上清液。通过依次经过直径为70μm和40μm尼龙网来过滤如此收集的细胞悬浮液。细胞悬浮液在4℃下以600g离心7分钟，并收集源自小鼠深骨髓的细胞。 
将源自小鼠深骨髓的细胞悬浮于MAPC培养基中，并以105细胞/cm2的密度接种。对于细胞的接种，使用预先用含有10ng/ml纤连蛋白(Becton Dickinson)的磷酸盐缓冲液包被的培养皿。在使用时，向培养基中加入生长因子[10ng/ml PDGF-BB(Peprotech生产)、10ng/mlEGF(Peprotech生产)、1000单位/ml LIF(Chemicon生产)]。接种后3天，只加入生长因子而不更换培养基。6天后，用磷酸盐缓冲液洗去非贴壁细胞，并通过用0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液分离(Invitrogen生产)收集贴壁细胞，并使用细胞储库(Juii Field生产)冷冻储存细胞作为原代培养物。 
在37℃水浴中融化已经冷冻储存的原代培养细胞，并悬浮于10 ml含有2％FBS的MAPC培养基中。为了除去冷冻溶液中的DMSO，在4℃下以300g离心7分钟，并除去上清液。重悬浮获得的细胞团块，并以2.5×103细胞/cm2的密度接种到底部已经用0.1％明胶/磷酸盐缓冲液包被的12孔塑料板上，并加入各2ml MAPC培养基(第二次传代培养物)。 
8至14小时后，除去培养基，向其中加入各2ml实施例1制备的4种基因的逆转录病毒载体溶液，并在37℃下培养4至14小时。然后，除去病毒溶液，替换为小鼠ES培养基[加入最终浓度为0.3％的FBS(Invitrogen生产)、1000单位/ml LIF(Chemicon生产)和0.1mM的2-巯基乙醇的ES培养基]。然后，每3天连续用小鼠ES培养基更换培养基，引入4种基因之后5至7天，所述多潜能干细胞形成包含小鼠ES细胞样小细胞的集落。由于碱性磷酸酶活性，诱导的多潜能性干细胞的集落被染色为蓝紫色。 
从12孔板的其余孔中，传代培养小鼠多潜能性干细胞，并继续传代培养到明胶包被的100mm板上。从第7次传代培养的细胞，使用RNeasy mini试剂盒(QIAGEN生产)提取RNA，并合成cDNA。使用cDNA，进行定量PCR以证实Nanog的表达。 
以3×105细胞/小鼠，将第7次传代培养的小鼠多潜能性干细胞皮下移植到3只同系C57BL/6N小鼠的后背，并在38天后提取形成的畸胎瘤。在所有3只小鼠中都形成畸胎瘤。由提取的畸胎瘤制备切片，通过免疫染色和组织学染色(HE染色、爱茜蓝染色)分析形成三个胚层的分化潜能。结果，观察到作为外胚层系统的MAP2阳性细胞(神经系统)和GFAP阳性细胞(神经系统)，作为中胚层系统的骨骼肌细胞(肌细胞)和软骨组织，和作为内胚层系统的肠道组织。 
为了保持并培养小鼠多潜能干细胞，每3至4天对它们传代培养。从在其中进行传代培养的塑料培养皿中除去培养基，用磷酸盐缓冲液冲洗，加入0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液，并在37℃培养5分钟。当分离细胞时，加入ES培养基以终止反应，并将细胞悬浮液转移到离心管中。通过在4℃以200g离心5分钟，除去上清液，并在将沉淀悬浮于小鼠 ES培养基中之后，将细胞以104细胞/cm2的密度接种到明胶包被的板中。由在低血清下以同样的传代培养方法培养的小鼠骨髓衍生的细胞诱导的多潜能干细胞可以培养较长的一段时间。 
如上所述，从在低血清条件下建立的出生后小鼠骨髓衍生的细胞诱导多潜能性干细胞。 
实施例12.通过引入3种基因和组蛋白脱乙酰基酶抑制剂处理诱导小鼠多潜能干细胞
使用源自小鼠骨髓即小鼠出生后组织的细胞，通过引入3种基因和组蛋白脱乙酰基酶抑制剂处理进行多潜能干细胞的诱导。 
将在以类似于实施例11的方式制备后已经冷冻存储的含有未分化干细胞的小鼠骨髓衍生的原代培养细胞以5×103细胞/cm2的密度接种到底部已经用0.1％明胶/磷酸盐缓冲液明胶包被的24孔塑料板(Becton Dickinson生产)上，并加入各2ml MAPC培养基。 
8小时后，除去培养基，加入各2ml实施例1制备的3种基因(人类Oct3/4、Sox2和Klf4)的逆转录病毒载体溶液，并在进一步加入终浓度为1或0.1μM的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂MS-275后，在37℃培养14小时。然后在除去病毒溶液后，加入各2ml含有终浓度为1或0.1μM的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂MS-275的MAPC培养基。3天后，将培养基更换为小鼠ES培养基[使用时向ES培养基中加入最终浓度为0.3％的FBS(Invitrogen生产)、1000单位/ml LIF(Chemicon生产)和0.1mM的2-巯基乙醇]。 
每2至3天连续用小鼠ES培养基更换培养基。引入3种基因(人类Oct3/4、Sox2和Klf4)逆转录病毒载体后12天，从24孔塑料板的每孔向6孔塑料板的每孔传代培养细胞。也在24孔塑料板中培养它的一部分。引入所述3种基因和MS-275处理之后15天，多潜能性干细胞形成由小鼠ES细胞样小细胞组成的集落。由于碱性磷酸酶活性，所述多潜能性干细胞的集落被染色为蓝紫色。 
然后，通过定量PCR确定Nanog的表达量，并确定具有磷酸酶活 性的多潜能性干细胞的集落的小鼠Nanog的表达(图4)。图4显示Nanog和Tert基因在引入3种基因并用组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂处理的成年小鼠骨髓衍生细胞中的相对表达。将3种基因(Oct3/4、Sox2和Klf4)引入在低血清条件下建立的小鼠骨髓衍生的细胞中。也用HDAC抑制剂MS-275(0.1或1.0μM)处理细胞。从所获得的集落中提取RNA，并通过定量PCR测定Nanog的表达量。从引入3种基因并用组蛋白脱乙酰基酶抑制剂处理的细胞形成ALP-阳性细胞组(集落)，并且证实Nanog在这些集落中的表达明显高于ALP-阴性集落。在该图中，W1、W2、W3、W4、W5和W6代表实施例12中使用的6孔板的每个孔的名称。 
引入所述3种基因和MS-275处理18天之后，从6孔塑料板的每孔向明胶包被的100mm板传代培养细胞。类似地持续传代培养。 
引入所述3种基因和MS-275处理29天后，以2×107细胞/小鼠，将小鼠多潜能性干细胞皮下移植到3只同系C57BL/6N小鼠的后背，34天后提取形成的畸胎瘤。从提取的畸胎瘤制备切片，通过免疫染色和组织学染色(HE染色、爱茜蓝染色)分析形成3个胚层的分化潜能。结果，观察到作为外胚层系统的GFAP阳性细胞(神经系统)和角蛋白产生细胞(皮肤细胞)，作为中胚层系统的平滑肌肌动蛋白阳性细胞(平滑肌细胞)、骨组织和软骨组织，和作为内胚层系统的肠道组织(MUC-1阳性的内胚层上皮)。 
实施例13.通过引入3种基因诱导小鼠多潜能干细胞
然后，使用源自小鼠骨髓即小鼠出生后组织的细胞，通过引入3种基因进行小鼠多潜能干细胞的诱导。 
将在实施例11中制备后已经冷冻存储的含有未分化干细胞的源自小鼠骨髓的原代培养细胞以1×104细胞/cm2的密度接种到底部已经用0.1％明胶/磷酸盐缓冲液明胶包被的24孔塑料板(Becton Dickinson生产)上，并加入各2ml MAPC培养基。 
2天后，除去培养基，加入各2ml实施例1制备的3种基因(人类 Oct3/4、Sox2和Klf4)的逆转录病毒载体溶液，并在37℃培养1天后，除去病毒溶液，加入各2ml MAPC培养基。3天后，将培养基替换为小鼠ES培养基[使用时向ES培养基中加入最终浓度为0.3％的FBS(Invitrogen生产)、1000单位/ml LIF(Chemicon生产)和0.1mM的2-巯基乙醇]。然后，每2至3天连续用小鼠ES培养基更换培养基。引入3种基因(人类Oct3/4、Sox2和Klf4)逆转录病毒载体后11天，从24孔塑料板的每孔向6孔塑料板的每孔传代培养细胞。 
然后，每2至3天连续用小鼠ES培养基更换培养基。引入3种所述基因之后19天，多潜能干细胞形成由小鼠ES细胞样小细胞组成的集落。为了证实碱性磷酸酶活性，除去培养基，然后向孔中加入10％的福尔马林中性缓冲溶液，并在室温下固定5分钟。用磷酸盐缓冲液等清洗后，加入包含碱性磷酸酶生色底物的1步NBT/BCIP溶液(Pierce生产)，并在室温下反应20至30分钟。由于碱性磷酸酶活性，所述多潜能性干细胞的集落被染色为蓝紫色。 
然后，通过定量PCR确定Nanog基因的表达量，并证实具有磷酸酶活性的多潜能性干细胞的集落的小鼠Nanog的表达。 
使用源自小鼠骨髓即小鼠出生后组织的细胞，通过引入3种基因进行多潜能干细胞的诱导。 
将在实施例11中制备后已经冷冻存储的含有未分化干细胞的源自小鼠骨髓的原代培养细胞以1×104细胞/cm2的密度接种到底部已经用0.1％明胶/磷酸盐缓冲液明胶包被的6孔塑料板(Becton Dickinson生产)上，并以2ml的部分加入MAPC培养基。 
2天后，除去培养基，以2ml的部分加入实施例1制备的3种基因(人类Oct3/4、Sox2和Klf4)的逆转录病毒载体溶液，并在37℃培养1天后，除去病毒溶液，以2ml的部分加入MAPC培养基。3天后，将羟基替换为小鼠ES培养基[使用时向ES培养基中加入最终浓度为0.3％的FBS(Invitrogen生产)、1000单位/ml LIF(Chemicon生产)和0.1mM的2-巯基乙醇]。每2至3天连续用小鼠ES培养基更换培养基。引入3种基因(人类Oct3/4、Sox2和Klf4)逆转录病毒载体后9天，从6孔塑料 板的每孔向10cm塑料皿的每孔传代培养细胞。 
每2至3天连续用小鼠ES培养基更换培养基。引入3种所述基因之后7天，多潜能干细胞形成由小鼠ES细胞样小细胞组成的集落。为了证实碱性磷酸酶活性，除去培养基，然后向孔中加入10％的福尔马林中性缓冲溶液，并在室温下固定5分钟。用磷酸盐缓冲液等清洗后，加入碱性磷酸酶的生色底物1步NBT/BCIP(Pierce生产)，并在室温下反应20至30分钟。由于碱性磷酸酶活性，所述多潜能性干细胞的集落被染色为蓝紫色。 
然后，通过定量PCR确定Nanog基因的表达量，并确定具有磷酸酶活性的多潜能性干细胞的集落的小鼠Nanog的表达。 
引入所述3种基因49天后，以2×107细胞/小鼠，将小鼠多潜能性干细胞皮下移植到同系C57BL/6N小鼠的后背，13至17天后提取形成的畸胎瘤。从提取的畸胎瘤制备切片，通过免疫染色和组织学染色(HE染色、爱茜蓝染色)分析形成3个胚层的分化潜能。结果，观察到作为外胚层系统的GFAP阳性细胞(神经系统)和角蛋白产生细胞(皮肤细胞)，作为中胚层系统的平滑肌肌动蛋白阳性细胞(平滑肌细胞)、骨组织和软骨组织，和作为内胚层系统的肠道组织(MUC-1阳性的内胚层上皮)。 
同样地，在所述3种基因引入后，以2×107细胞/小鼠，将用FACSAria基于GFP和SSEA-1阳性单分选的小鼠多潜能干细胞皮下移植到同系C57BL/6N小鼠的后背，并在13和14天后提取形成的畸胎瘤。从提取的畸胎瘤制备切片，通过免疫染色和组织学染色(HE染色、爱茜蓝染色)分析形成3个胚层的分化潜能。结果，观察到作为外胚层系统的GFAP阳性的神经管衍生的细胞、巢蛋白或神经丝，作为中胚层系统的软骨组织，和作为内胚层系统的肠道组织(MUC-1阳性的内胚层上皮和甲胎蛋白)。 
从以上结果可以看出，通过促使Oct3/4、Sox2和Klf4这3种基因中的每一种在存在于出生后组织中的未分化干细胞中的表达，获得多潜能干细胞。多潜能干细胞显示体外长期自我更新能力，表达的ES细胞 标记、Nanog表达和碱性磷酸酶活性，以及源自所有3个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的组织的分化能力。 
实施例14.人诱导的多能干细胞的长期扩增和特征
实施例6中由新生儿人类皮肤成纤维细胞(批号5F0438)产生的命名为iPS-1-8的人诱导多能干细胞(iPS)细胞系，进一步如实施例6所述用克隆柱(cloning cylinder)和0.25％胰蛋白酶-EDTA亚克隆。获得命名为人类iPS-1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8和1-9的9个亚克隆。在基质胶(BD Biosciences)包被的培养皿上，在补充有0.1mM的2-巯基乙醇和10ng/ml bFGF的人类ES培养基中或在mTeSR1成分确定培养基(Stem cell Technologies)中在MEF饲养细胞上成功地扩增了9个亚克隆中的一个，名为人类iPS-1-8克隆。每天更换用于培养人类iPS-1-8克隆的培养基，通常用5至20μM的Y-27632(Calbiochem)处理，以避免传代过程引发的细胞凋亡。为了进行传代以继续培养，用Hanks’s平衡溶液清洗人诱导的多潜能性干细胞，在37℃下在0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco)中培养3分钟，然后加入培养基以终止胰蛋白酶的活性。在室温或4℃下，以300×g离心人诱导的多潜能干细胞5分钟，并除去上清液。将沉淀的人诱导的多潜能干细胞重悬浮于培养基中。通常使用1∶4至1∶6分离将多潜能干细胞分到新的培养皿中。根据厂商说明书，使用用于ES细胞的细胞冷冻溶液(Reprocell)冷冻人类iPS-1-8克隆。 
当在丝裂霉素-C处理的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上培养时，人类iPS-1-8克隆从形态上与由小、圆形和紧密细胞组成的、具有明确边缘的典型人类ES细胞集落难以区分(图5)。图5显示人类iPS克隆1-8的表征。图a显示其亲本成纤维细胞(批号5F0438)的形态；图b显示在鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养细胞上培养的人类iPS克隆1-8细胞的形态；图c显示人类iPS克隆1-8细胞在mTeSR1培养基中的形态；图d显示在mTeSR1培养基中的克隆2-4细胞；图e显示在mTeSR1培养基中的克隆3-2细胞。图f和g显示克隆1-8的生长曲线。箭头指示检查 日期。正方形表示计数细胞数以估计细胞增殖率的时期。图h是表明iPS克隆1-8衍生的细胞在第101天的正常核型的多色核型图。 
人类iPS-1-8克隆在mTeSR1培养基中活跃地增殖。在mTeSR1培养基中培养的人类iPS-1-8克隆衍生细胞称为人类iPS-1-8mTeSR细胞。人类iPS-1-8克隆能够传代超过30次，并在4种因子感染后培养半年以上(图5f，g)。人类iPS-1-8mTeSR细胞能够储存于液氮中，并在5至20μM Y-27632存在下在mTeSR培养基中重新培养。当在对应于4种因子感染后第123至148天的第19至第26代之间分析时，人类iPS-1-8mTeSR细胞的群体倍增时间是大约48.5小时。 
使用吉姆萨染色和多色FISH分析，对长期培养的人类iPS-1-8克隆(1-8mTeSR)细胞进行核型分析。人iPS细胞用0.02μg/ml秋水仙酰胺预处理2小时，接着与0.075M KC 1孵育20分钟，然后再用Camoy′s固定剂固定。对于多色FISH分析，细胞与多色FISH探针(Cambio)杂交，并在DMRA2荧光显微镜(Leica)下分析。在mTeSR(68％)中长期培养后，人类iPS-1-8mTeSR细胞主要维持正常核型(46XY)，没有任何染色体易位或缺失(图5h，表3)。 
对于碱性磷酸酶染色，在室温下用10％的福尔马林中性缓冲溶液(Wako)固定细胞5分钟，用PBS清洗，并与碱性磷酸酶底物1步NBT/BCIP(Pierce)在室温下孵育20至30分钟。具有碱性磷酸酶活性的细胞被染为蓝紫色。对于免疫细胞化学，用10％甲醛固定培养的细胞10分钟，并用0.1％明胶/PBS在室温下封闭1小时。细胞与针对SSEA-3(MC-631；Chemicon)、SSEA-4(MC813-70；Chemicon)、TRA-1-60(abcam)、TRA-1-81(abcam)、CD9(M-L13；R&D systems)、CD24(ALB9；abcam)、CD90(5E10；BD bioscience)或Nanog(MAB 1997；R&D Systems)的第一抗体在4℃下孵育过夜。对于Nanog染色，在封闭前，用0.1％Triton X-100/PBSS通透化细胞。用PBS冲洗细胞3次，然后与AlexaFluor 488-偶联的第二抗体(Molecular Probes)和Hoechst33258在室温下孵育1小时。进一步清洗后，用Axiovert 200M显微镜(Carl Zeiss)检测荧光。 
人类iPS-1-8mTeSR细胞对于碱性磷酸酶(下文称为“ALP”)活性和碳水化合物抗原SSEA-3和SSEA-4、硫酸角蛋白抗原TRA-1-60和TRA-1-81及蛋白质抗原CD9、CD24、Thy-1(CD90)染色阳性(图6)。图6显示在人类iPS克隆1-8中转录因子、细胞表面抗原和ALP活性的表征。人类iPS细胞(克隆1-8)对于以下抗原染色：Nanog(图a)、SSEA-3(图b)、SSEA-4(图c)、TRA-1-60(图d)、TRA-1-81(图e)、CD9(图f)、CD24(图g)、Thy-1(也称为CD90)(图h)。绿色荧光染色表明，人类iPS克隆1-8表达所有这些表面抗原。ALP染色表明iPS克隆1-8是ALP阳性的。箭头指示绿色荧光染色区域。 
使用RNeasy(Qiagen)从基因转导后第17天获得的人类iPS-1-8克隆、其亲本成纤维细胞和粗成纤维细胞分离总RNA。通过SuperscriptIII(Invitrogen)合成cDNA。使用Extaq(Takara)通过PCR检测基因表达。表4描述引物序列。“外”引物组选择性检测外源性表达；“总”引物组检测内源性表达。 
人类iPS-1-8克隆表达人类ES标记基因Nanog、TERT、Sall4、Zfp42、GDF3、Dnmt3b、TDGF1、GABRB3和CYP26A1，但是亲本成纤维细胞不表达这些标记基因(图7a)。与粗成纤维细胞不同，人类iPS-1-8克隆下调Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc这4种基因的表达(图7b)。图7显示人类iPS克隆1-8细胞的基因表达的RT-PCR分析。图a显示hES标记基因在克隆1-8及其亲本成纤维细胞(NeoFB)中的表达的RT-PCR分析。除了CYP26A1(35个循环)以外，以30个循环检测基因。图b显示4种转基因在克隆1-8中沉默化。使用基因转导17天后获得的粗成纤维细胞作为对照。“外”引物组选择性检测外源基因的表达；“总”引物组检测内源和外源基因表达。 
分析在基质胶上的mTeSR1(1-8mTeSR)中和在基质胶上的MEF调节培养基(1-8CM)中培养的人类iPS细胞及其亲本成纤维细胞(5F0438)的全基因表达。使用Affymetrix人类基因组U133+2.0基因表达阵列(Affymetrix，Santa Clara，CA)进行微阵列研究。 Human Genome U133 Plus 2.0阵列提供了转录的人类基因组在单一阵 列上的全面覆盖并分析包括38,500个良好表征的人类基因的超过47,000种转录物和变体的表达水平。简言之，用RNAeasy(Qiagen)从细胞中提取总RNA。根据Affymetrix技术协议，从1μg总RNA逆转录生物素标记的cRNA。使15微克cRNA破碎，并在45℃下与AffymetrixU133 plus 2 GeneChip阵列杂交16小时，然后清洗，并使用AffimetrixFluidics(Affymetrix)染色。用Affimetrix GCS3000扫描仪扫描这些试验，使用GCOS软件分析获得的图像。用GeneSpring 7.3.1.软件研究这项实验和GEO的数据。 
对于散点图分析，基于一组21，080个基因分析在基质胶上的mTeSR1(1-8mTeSR)中培养的人诱导多潜能干细胞克隆-1-8及其亲本成纤维细胞(5F0438)，对于克隆1-8和H14hES系均具有当前标志检出(present flag call)(P＜0.04)或边缘标志检出(marginal flag call)(0.04≤P＜0.06)，来自GEO(GSM151741)的数据，用作用于比较目的的人类ES细胞的代表。图8显示人类iPS克隆1-8细胞的全基因表达的散点图分析。散点图显示在mTeSR1中培养的人类iPS克隆1-8细胞与使用MEF的H14hES细胞(来自公共数据库GEO的GSM151741)之间(图a)，或克隆1-8与其亲本成纤维细胞之间的全基因表达的比较(图b)。在两个散点图中，用线条指出ES细胞特异性基因的标记。用从红色(高)到绿色(低)的比色度显示表达强度。箭头指示代表性颜色区域。 
对于聚类分析，在mTeSR1中培养的克隆-1-8(1-8mTeSR)、在MEF调节培养基中培养的克隆1-8(1-8CM)及其亲本成纤维细胞(5F0438)的DNA微阵列数据，与在MEF上培养的Sheff 4系(hES1：GSM194307，hES2：GSM194308，hES3：GSM194309)、在基质胶上培养的Sheff 4系(hES4：GSM194313，hES5：GSM194314)、在MEF上培养的H14系(hES6：GSM151739，hES7：GSM151741)和3种成纤维细胞(对于成纤维细胞1的GSM96262、对于成纤维细胞2的GSM96263和对于成纤维细胞3的GSM96264)的DNA微阵列数据进行比较。 
使用微阵列技术分析人类iPS系(1-8、2-4和3-2)及其亲本成纤 维细胞的全基因表达谱。使用由International Stem Cell Initiative确定的一组基因(见表21)的分级群聚分析显示，人类iPS系(1-8、2-4和3-2)与人类ES细胞聚类，但与其亲本皮肤来源的细胞分离(图9)。图9显示基于全基因表达分析，不同的细胞系和基因树的全基因表达。基于由International Stem Cell Initiative确定的一组基因(见表21)，细胞在基因树上聚类。样品分别命名如下：在mTeSR中培养的克隆-1-8命名为″1-8mTeSR″；在MEF调节培养基中培养的克隆1-8命名为″1-8CM″；冷冻-融化处理后在mTeSR中培养的克隆1-8命名为″1-8mTeSR(f&t)″；在MEF上培养的克隆1-8命名为″1-8MEF″；在mTeSR培养基中培养的克隆2-4命名为″2-4mTeSr″；在MEF上培养的克隆2-4命名为″2-4MEF″；在mTeSR培养基中培养的克隆3-2命名为″3-2mTeSR″；亲本成纤维细胞命名为“5F0438”或“5F0416”；在MEF上培养的Sheff 4系命名为″hES 1″、″hES2″、″hES3″(分别为GSM194307、GSM 194308、GSM 194309)；在基质胶上培养的Sheff 4系命名为″hES4″或″hES5″(分别为GSM 194313、GSM 194314)；在MEF上培养的H14系命名为″hES6″或″hES7″(GSM151739、GSM151741)；GSM96262命名为″成纤维细胞1″；GSM96263命名为″成纤维细胞2″；GSM96264命名为″成纤维细胞3″。用从红色(高)到绿色(低)的比色度显示表达强度。 
皮尔逊相关系数在人类ES细胞系sheff4和H14之间为0.675，在人类iPS细胞系1-8和人类ES细胞系H14之间为0.835(图9)。在iPS系1-8、2-4和3-2与hES细胞系的全基因表达谱之间观察到类似的皮尔逊相关系数。该分析表明，人类iPS细胞系1-8具有类似于人类ES细胞系H14的基因表达模式。 
人类iPS细胞系(克隆1-8)和人类ES细胞系H14之间的散点图分析表明，人类ES细胞标记基因Nanog、Oct3/4、TDGF1、Dnmt3b、GABRB3、GDF3、Zfp42、ALP、CD9和Thy-1显示在人类iPS细胞系和人类ES细胞系H14之间高度相关(图8a)。相反，克隆1-8不同于亲本新生儿成纤维细胞(图8b)。使用Nanog相关基因通过聚类分析证 实了这一点。皮尔逊相关系数在人类iPS细胞系1-8和人类ES细胞系H14之间为0.908，在人类iPS细胞系1-8及其亲本成纤维细胞之间为0.100(图10)。图10显示基于全基因表达分析，不同的细胞系和基因树的全基因表达。基于与在人类ES细胞(7种GEO数据)中和在成纤维细胞(3种GEO数据)中相比为0.99至1的比率的Nanog基因表达相关的一组基因，细胞在基因树上聚类。样品分别命名如下：在mTeSR中培养的克隆1-8命名为″1-8mTeSR″；在MEF调节培养基中培养的克隆1-8命名为″1-8CM″；亲本成纤维细胞命名为“5F0438”；在MEF上培养的Sheff 4系命名为″hES1″、″hES2″、″hES3″(分别为GSM 194307、GSM 194308、GSM 194309)；在基质胶上培养的Sheff 4系命名为″hES4″或″hES5″(分别为GSM 194313、GSM 194314)；在MEF上培养的H14系命名为″hES6″、″hES7″(GSM151739、GSM151741)；GSM96262命名为″成纤维细胞1″；GSM96263命名为″成纤维细胞2″；GSM96264命名为″成纤维细胞3″。用从红色(高)到绿色(低)的比色度显示表达强度。1-8、2-4和3-2细胞系及其亲本成纤维细胞的全基表达数据保存在Gene Expression Omnibus(GEO)数据库中，登记号为GSE9709。这些分析表明，人类iPS细胞系在基因表达方面非常类似于人类ES细胞系。 
分析克隆1-8和2-4中Nanog和Oct3/4的启动子区域的各CpG位点的甲基化。用含有T7启动子的引物PCR扩增10纳克亚硫酸氢盐处理的基因组DNA，用RNase A处理转录物。由于源自甲基化的CpG序列的片段包含G碱基而不是A碱基，它们的分子量比那些由相应的非甲基化CpG产生的片段高16Da。使用MALDI-TOF质谱仪(Autoflex，BrukerDaltonics)检测这种质量差异。使用EpiTYPER(Sequenom)分析质谱仪产生的光谱。使用非甲基化和甲基化片段的信号的峰下面积计算各CpG位点的甲基化百分比。使用非甲基化和甲基化片段的信号的峰下面积计算各CpG位点的甲基化百分比。表9列出了用于甲基化分析的扩增子对应于基因组中的位置和大小。表10列出了用于甲基化分析的引物组。 
检查包括保守区1(CR1)的Oct3/4近端启动子、包括CR4的Oct3/4启动子远端增强子及包括Oct3/4和Sox2结合位点的Nanog近端启动子(图11a)。如图11b所示，与亲本成纤维细胞相比，在克隆1-8和2-4衍生的细胞中，这些区域中的胞嘧啶-磷酸-鸟苷(CpG)二核苷酸去甲基化。 
使用汉密尔顿注射器，将人类iPS-1-8mTeSR细胞悬浮液(0.5至2×106细胞/小鼠)注射进入7至8周大的SCID小鼠(CB17，OrientalYeast)的左侧睾丸髓质。经过6至8周后，在用PBS灌注接着用10％缓冲福尔马林灌注的情况下，切除畸胎瘤，并进行组织学分析。移植到SCID小鼠睾丸内4至8周后，人类iPS-1-8mTeSR细胞引起畸胎瘤。 
将畸胎瘤包埋于封固剂中，并在低温恒温器上切为10μm的切片。用苏木精-伊红(HE)对连续切片染色，以显示一般形态。对于软骨的检测，采用爱茜蓝染色或与HE相结合。 
对于免疫染色，用免疫阻断剂(Immunoblock)(Dainippon-Sumitomo)处理切片30分钟，以阻断非特异性结合。切片与以下第一抗体孵育：抗巢蛋白多克隆抗体(PRB-570C，COVANCE，1∶300)、抗II型胶原多克隆抗体(LB-1297，LSL，1∶200)、抗平滑肌肌动蛋白多克隆抗体(RB-9010-R7，LAB VISION，1∶1)、抗甲胎蛋白多克隆抗体(A0008，DAKO，1∶500)、抗MUC-1多克隆抗体(RB-9222-P0，LAB VISION，1∶100)和抗人细胞核单克隆抗体(HuNu)(MAB1281，CHEMICON，1∶300)。对于II型胶原，在用第一抗体处理前，切片与透明质酸酶(25mg/mL)孵育30分钟。使用合适的第二抗体(Alexa fluor 594和688，Molecular Probes，1∶600)显示抗原的定位。用DAPI对细胞核染色。在荧光显微镜下(Axio Imager Z1，Zeiss)分析免疫染色的畸胎瘤切片。 
人类iPS-1-8mTeSR细胞的畸胎瘤包含代表神经外胚层、中胚层和内胚层三个胚层的组织。图12显示由培养94天的人类iPS-1-8mTeSR细胞产生的畸胎瘤(T1)。将人类iPS-1-8mTeSR细胞注射到SCID小鼠睾丸中，并在注射56天后分析。畸胎瘤组织的HE和爱茜蓝 染色揭示，畸胎瘤包含神经上皮(巢蛋白阳性)、软骨(胶原蛋白II阳性)、内胚道(甲胎蛋白)。通过HuNu染色，难以区分人类iPS-1-8mTeSR细胞衍生的组织与宿主组织。在T1畸胎瘤中，也观察平滑肌细胞(α-SMA阳性)和分泌性上皮(MUC-1阳性)(图13)。将培养了102天和114天的人类iPS-1-8mTeSR细胞注射到SCID小鼠睾丸中，并分别在注射后48天和42天(T3)分析(T2，图13，T3，图14)。观察代表神经外胚层、中胚层和内胚层3个胚层的组织。为了确认人类iPS是否可以冷冻保存，冷冻人类iPS-1-8mTeSR细胞，在液氮中保存并再培养。将这些细胞注射到SCID小鼠睾丸中，并在注射后46天(T-F 1)和48天(T-F2)分析。观察代表神经外胚层、中胚层和内胚层3个胚层的组织。在T-F2畸胎瘤中也观察黑素细胞(图14)。因此，经冷冻和融化仍保持多潜能性。 
Southern印迹分析和基因组PCR分析表明人类iPS-1-8克隆携带4种转基因。在Southern印迹分析中，通过限制性酶消化(用于POU5F1的Xhol、用于Sox2的NotI、用于Klf4的PstI)，由相应的pMX载体质粒制备cDNA片段。用琼脂糖凝胶电泳和QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)纯化这些片段作为[32P]标记的探针。从人类iPS克隆1-8及其亲本成纤维细胞制备基因组DNA。用KpnI(POU5F1、Sox2和Klf4)消化5μg的每种基因组DNA。在0.8％琼脂糖凝胶上分离片段，印迹到HybondXL膜(GE Healthcare)上，并与[32P]标记的探针杂交。证明人类iPS克隆-1-8携带大约10个拷贝的Oct3/4转基因和Sox2转基因，以及一个拷贝的Klf4基因(图15)。在基因组PCR分析中，设计在表4中表示为c-Myc-total的引物组，使得扩增子包括c-Myc的整个第二内含子。因此，转基因的扩增子大小(338bp)小于内源基因(endogene)的扩增子(1814bp)。使用载体质粒和亲本成纤维细胞、从感染后培养17天获得的粗培养的成纤维细胞基因组作为对照模板。基因组PCR证实克隆-1-8细胞携带c-Myc转基因(图15)。 
根据使用说明书，使用GeneChip Human Mapping 500K阵列组(Affymetrix)进行SNP基因型分型。该试验分析在基质胶上的mTeSR1 中培养的人类iPS-1-8 mTeSR细胞、其亲本成纤维细胞(5F0438)和源自不同供体的成纤维细胞(5F0416)。该阵列组包括StyI和NspI芯片。分别用NspI和StyI消化各250ng两份DNA。每种酶制剂与相应的SNP阵列(在NspI和StyI阵列上分别为262,000和238,000)杂交。在各个试验中使用动态模型算法138及在P＝0.33时为93％的检出率(callrate)阈值(动态模型算法置信度阈值)。 
为了确认人类iPS-1-8mTeSR细胞是否由成纤维细胞(5F0438)产生，我们比较了人类iPS-1-8mTeSR细胞和使用的成纤维细胞之间的SNP基因型分型(表5)。人类iPS-1-8mTeSR细胞的SNP与亲本细胞的SNP在467,946个检出SNP中的464,069个(99.17％)上相一致，而在3,877个(0.83％)上不同于亲本细胞。与此不同，人类iPS-1-8mTeSR细胞的SNP与无关供体细胞(5F0416)只在470,960个检出SNP中的284,950个(60.50％)上相一致，而在186,010个(39.50％)上不同于该无关细胞。因此，人类iPS-1-8克隆(1-8mTeSR)和亲本细胞彼此具有几乎相同的SNP基因型，强烈提示两种细胞来源于一个供体。 
通过利用PCR扩增的DNA与序列特异性寡核苷酸探针(SSOP)(Luminex)杂交进行HLA DNA分型。为研究与多潜能干细胞诱导方法有关的DNA突变率，对人类iPS克隆1-8(n＝2)、其亲本皮肤衍生细胞(n＝2)和源自另一供体的皮肤细胞(n＝1)进行全基因组单核苷酸多态性阵列分析。在人类iPS克隆1-8与亲本细胞之间没有观察到明显差异(表5)。与这些观察结果一致，人类iPS细胞系1-8、2-4和3-2的HLA基因型与其各自的亲本细胞相同。根据使用说明书进行试验，以确定HLA-A、HLA-B和HLA-Cw、HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP和Bw基因座。人类iPS细胞是细胞移植治疗中有希望的材料，它们可克服免疫排斥，因为人类iPS细胞可以由受试者的细胞直接产生，且必须是相同的HLA型。我们进行了人类iPS-1-8克隆(1-8mTeSR)、亲本细胞(5F0438)和无关成纤维细胞(5F0416)的HLA分型。正如所料，iPS-1-8型克隆的HLA类型与5F0438完全相同，但与5F0416不同(表6)。 
从以上结果可以看出，通过促使Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc这4种基因中的每一种在存在于人出生后组织中的未分化干细胞中表达，获得了人类多潜能干细胞。人类多潜能干细胞显示体外长期自我更新能力和分化成为外胚层、中胚层和内胚层的能力。人类多潜能性干细胞表达细胞表面抗原SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、CD9、CD24和CD90，及ES细胞标记基因Nanog、Oct3/4、TDGF1、Dnmt3b、GABRB3、GDF3、Zfp42、ALP、CD9和Thy-1。与亲本成纤维细胞相比，人类多潜能性干细胞中的Nanog和Oct3/4的启动子区域是去甲基化的。人类多潜能性干细胞携带至少一个拷贝的Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc转基因。诱导的人多潜能干细胞和亲本细胞(存在于人出生后组织中的未分化的干细胞)具有彼此几乎相同的SNP基因型，且诱导的人类多潜能干细胞的HLA类型与亲本细胞(存在于人出生后组织中的未分化的干细胞)完全相同。 
实施例15.引入4种基因的新生儿成纤维细胞的原代培养物的基因表达谱
在转导4种基因前，以103细胞/cm2或104细胞/cm2的密度，将2批新生儿成纤维细胞(5F0416和5F0474)接种于6孔板的35mm直径的孔中，并在补充有FGM-2 SingleQuots(Lonza生产)的FBM中培养。以2×105ifu/孔，用mCAT1-腺病毒载体感染细胞，然后如实施例6所述用携带4种基因的逆转录病毒载体感染。为这项研究准备8个孔(2个用于不同的批次和2个用于不同的密度，一式两份)。 
4种基因感染17天后，如实施例3所述，固定细胞，并针对碱性磷酸酶(ALP)染色。在4个独立的实验中观察到总共163个ALP阳性(+)集落。分离所有163个ALP阳性(+)集落和18个ALP阴性(-)集落，并使用Recoverall总核酸分离试剂盒(Recoverall total nucleic acid isolationkit)提取这些集落的总RNA。cDNA制备后，使用Taqman preamp(Applied Biosystems生产)扩增目标基因。使用PCR引物组(AppliedBiosystems生产，Nanog、Hs02387400_g1、Dnmt3b、Hs00171876_m1、 FoxD3、Hs00255287_s1、Zfp42、Hs01938187_s1、TDGF1、Hs02339499_g1、TERT、Hs00162669_m1、GDF3、Hs00220998_m1、CYP26A1、Hs00175627_m1、GAPDH、Hs99999905_m1)，用ABI PRISM7900HT(Applied Biosystems生产)进行实时定量PCR，以确定集落中的人类ES细胞标记物的基因表达。据报道在人类ES细胞中表达的8种基因(Nanog、TDGF1、Dnmt3b、Zfp42、FoxD3、GDF3、CYP26A1和TERT基因)被选为多潜能干细胞标记基因。对于每个引物对生成标准曲线。所有表达值都相对于GAPDH标准化。 
已知小鼠ES细胞和小鼠iPS细胞形成多层/聚集的集落。因此，我们首先分析由人类成纤维细胞中的4种基因的异位表达诱导的小鼠ES细胞样聚集集落(例如，图23中的集落#1-2-F和#1-2-B)。然而，这些集落都是ALP(-)。接下来，我们分析集落中Nanog的基因表达。在163个ALP阳性集落中的161个中和在18个ALP阴性集落中的16个中观察到Nanog基因表达。另一方面，分别仅在163个ALP阳性集落中的26个和24个集落中观察到TERT和CYP26A1基因的表达(图16a)。已知与人类ES细胞中的多潜能状态密切相关并且强烈下调其分化的基因，如Nanog、TDGF和Dnmt3b，具有更高的被4种基因转导所诱导的趋势。 
根据8种人类标记基因的基因表达模式，ALP阳性集落可分为40组(表7)。当由8种标记基因表达的总数对集落分类时，集落数的分布遵循正态分布，提示在集落诱导中存在随机过程(图16c，d)。此外，人类ES细胞标记基因在人类成纤维细胞中的表达效率受到供体差异的影响。 
感染17天后形成的集落的定量基因表达分析表明，转基因c-Myc和Oct4在所有分析的集落中显示高表达(表11)。另外，内源性Nanog表达在大部分ALP阳性集落中非常高，包括缺乏8种人类ES细胞标记基因中的一种或多种的表达的细胞(表11)。这些结果表明，从人类皮肤成纤维细胞诱导多潜能干细胞的过程比对于小鼠iPS细胞产生所述的过程慢。163个ALP阳性集落中只有4个为Nanog、TDGF1、Dnmt3b、Zfp42、FoxD3、GDF3、Cyp26A1和TERT阳性(八阳性集 落)。这些八阳性集落中的细胞显示共同的特征：1)小的细胞大小和高核质比，和2)在成纤维细胞之间的空间内形成小单层集落。这些特征与人类ES细胞的特征一致。但是，也在一些缺乏一种或多种ES细胞标记表达的ALP(+)集落中观察到这三种特征。此外，具有这三种特征的大集落缺乏ALP表达(图23，集落#7-1-1)。具有成纤维细胞特征的ALP(+)集落(图17-23和表7、11中的集落#5-1-7、#3-1-214、#3-2-233、#3-1-212、#3-1-215、#5-1-4)通常缺乏一种或多种ES细胞标记基因的表达。 
这些结果表明，可以从包含具有高核质比的小细胞的小单层集落中分离诱导的多潜能性干细胞，而不能从成纤维细胞集落、减除集落(defused colonies)或多层集落中分离。表8总结了所有使用人类新生儿成纤维细胞的实验和关于ALP阳性集落数的结果。 
实施例16.从人类新生儿皮肤成纤维细胞产生人类iPS-2-4克隆
将用于mCAT1的腺病毒载体质粒转染到293细胞中。通过三个冻融循环从这些细胞中分离mCAT1-腺病毒，使用腺病毒纯化试剂盒(Clontech)纯化，并在-80℃保存。使用Adeno-X快速滴度试剂盒(Clontech)测定载体储备液的滴度。 
复制缺陷MMLV衍生的逆转录病毒载体pMx用于人类Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc的异位表达。通过将载体转染到Plat-E包装系统(Morita等人，(2000)，Gene Therapy，7：1063-1066)，接着在补充有FGM-2 SingleQuots(Lonza)的FBM(Lonza)中孵育，来产生重组逆转录病毒。转染后24至48小时，以至少4小时的间隔多次收集Plat-E培养物的上清液，并通过0.45μM的过滤器。 
对于MEF调节的培养基(MEF-CM)的制备，用丝裂霉素C处理的MEF(Reprocell)调节人类ES培养基(补充有20％Knockout SerumReplacement(KSR，Invitrogen)、2mM L-谷氨酰胺(Sigma)、1×非必需氨基酸(Sigma)、10μg/ml庆大霉素的DMEM/F12(Gibco))和10ng/ml bFGF 20-24小时，收获，通过0.45μm过滤器过滤，并在使用前 补充0.1mM 2-巯基乙醇(Sigma)和10ng/ml bFGF。 
使用源自人类新生儿组织即刚出生后的人类组织的细胞(商品名：新生儿正常人类皮肤成纤维细胞，原代培养物)，尝试从存在于人类新生儿皮肤中的未分化的干细胞诱导人类多潜能干细胞。 
在补充有FGM-2 SingleQuots的FBM中培养人类新生儿皮肤成纤维细胞(Lonza；批号5F0416)。4种基因引入前3天，以103细胞/cm2将新生儿成纤维细胞接种于6孔板中。18小时后，细胞与500μl Hanks′平衡盐溶液中的mCAT1腺病毒载体溶液混合，并在室温下孵育30分钟。然后向2ml培养基中加入这些细胞，并培养48小时。随后，细胞与2ml逆转录病毒/聚凝胺溶液(实施例1制备的4种基因(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)中每一种的逆转录病毒载体悬浮液的等体积混合物，补充有5μg/ml的聚凝胺)在37℃下孵育4小时至整夜。用MEF调节的ES培养基替换病毒上清液。然后每天更换培养基。 
在基因引入后第33天，用镊子从孔中挑选具有特征形状的集落。将挑选的集落转移到24孔板中的基质胶包被的孔中，并保持在补充有10μM Y-27632的mTeSR1成分确定培养基中。14个小时后，更换培养基。每天连续更换培养基。在感染后第54天，进行第二次传代培养。在第67天，亚克隆人类iPS-2-4克隆，并命名为人类iPS-2-4亚克隆。 
为了传代，除去培养基，用Hank’s平衡盐清洗这些细胞，接着在37℃下用0.25％胰蛋白酶-EDTA处理3分钟。加入新鲜培养基以终止反应。在4℃下以200×g离心细胞悬浮液5分钟，并除去上清液。将细胞重悬浮于补充有10μM Y-27632的mTeSR1成分确定培养基中，并接种。 
在基质胶(BD Biosciences)包被的培养皿上，在mTeSR1成分确定培养基(Stem cell Technologies)中成功地扩大了人类iPS-2-4亚克隆。我们将源自亚克隆iPS-2-4并在mTeSR1培养基中培养的细胞命名为人类iPS-2-4mTeSR细胞。每天更换用于人类iPS-2-4mTeSR细胞的培养基，并通常用Y-27632(Calbiochem)处理以避免在传代后细胞凋亡。为了传代，用Hanks’s平衡溶液清洗细胞，在37℃下在0.25％胰蛋 白酶-EDTA(Gibco)中孵育3分钟，然后加入培养基。在室温或4℃下，以300×g离心细胞5分钟，并除去上清液。将细胞重悬浮于培养基中。人类iPS-2-4 mTeSR细胞从形态上与在由具有高核质比的小、圆形细胞组成的、具有确定边缘的集落中生长的典型人类ES细胞和人类iPS-1-8 mTeSR细胞难以区分。 
4种基因感染59天后，如实施例3所述，固定一部分细胞，并针对碱性磷酸酶(ALP)染色。由细胞组成的集落为ALP阳性，并使用Recoverall总核酸分离试剂盒(Ambion生产)提取这些集落的总RNA。cDNA制备后，使用Taqman preamp(Applied Biosystems生产)扩增目标基因。使用PCR引物组(Applied Biosystems生产，Nanog、Hs02387400_g1、Dnmt3b、Hs00171876_m1、FoxD3、Hs00255287_s1、Zfp42、Hs01938187_s1、TDGF1、Hs02339499_g1、TERT、Hs00162669_m1、GDF3、Hs00220998_m1、CYP26A1、Hs00175627_m1、GAPDH、Hs99999905_m1)，用ABI PRISM 7900HT(AppliedBiosystems生产)进行实时定量PCR，以确定集落中的人类ES细胞标记物的基因表达。克隆2-4显示ES细胞标记基因的表达(表12)。如对于iPS 1-8系观察到的，Southem印迹分析和基因组PCR分析表明2-4系包含整合的Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc转基因。同样，2-4系表达细胞表面标记D24、CD90、TRA 1-60、TRA-1-81、SSEA3和SSEA4；具有正常的核型；HLA基因型与其亲本细胞相同；全基因表达模式类似于1-8系；并且具有如在1-8系中观察到的Oct3/4和Nanog启动子的低甲基化。 
从以上结果可以看出，通过促使Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc这4种基因中的每一种在存在于人出生后组织中的未分化干细胞中的表达，获得了人类多潜能干细胞。人类多潜能干细胞显示体外长期自我更新能力，并且表达ES细胞标记基因Nanog、Oct3/4、TDGF1、Dnmt3b、GABRB3、GDF3、Zfp42、ALP、CD9和Thy-1。 
实施例17.从人类新生儿皮肤成纤维细胞产生人类iPS-3-2克隆
根据实施例16所述，在补充有FGM-2SingleQuots的FBM中培养人类新生儿皮肤成纤维细胞(Lonza；批号5F0438)。4种基因引入前3天，以103细胞/cm2将成纤维细胞接种于6孔板中。18小时后，细胞与500μl Hanks′平衡盐溶液中的mCAT1腺病毒载体溶液混合，并在室温下孵育30分钟。然后向2ml培养基中加入这些细胞，并培养48小时。随后，细胞在2ml逆转录病毒/聚凝胺溶液(实施例1制备的4种基因(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)中每一种的逆转录病毒载体悬浮液的等体积混合物，补充有5μg/ml的聚凝胺)中37℃孵育4小时至整夜。用MEF调节的ES培养基替换病毒上清液。然后每天更换培养基。 
在基因引入后第21天，用镊子从一个皿中直接挑选具有特征形状的集落。将挑选的集落转移到24孔板中的基质胶包被的孔中，并保持在补充有10μM Y-27632的mTeSR1成分确定培养基中。 
14个小时后更换培养基。每天连续更换培养基。感染40天之后，进行第二次亚克隆，并在基质胶(BD Biosciences)包被的培养皿上在mTeSR1成分确定培养基(Stem cell Technologies)中成功地扩增细胞。每天更换培养基，并通常用Y-27632(Calbiochem)处理以避免在传代后细胞凋亡。为了传代，用Hanks’s平衡溶液清洗细胞，在37℃下在0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco)中孵育5分钟，然后加入培养基。在室温下，以300×g离心细胞5分钟，并除去上清液。将细胞重悬浮于培养基中。 
细胞从形态上与在具有确定边缘的、且由具有高核质比的小、圆形细胞组成的集落中生长的典型人类ES细胞、人类iPS-1-8 mTeSR细胞和人类iPS-2-4 mTeSR细胞难以区分。因此，我们将这种克隆命名为人类iPS-3-2克隆。人类iPS-3-2克隆在mTeSR1培养基中活跃地增殖。我们将这些源自在mTeSR1培养基中培养的人类iPS-1-8克隆的细胞命名为人类iPS-3-2mTeSR细胞。 
4种基因感染48天后，如实施例3所述，固定细胞，并针对碱性磷酸酶(ALP)染色。使用Recoverall总核酸分离试剂盒(Ambion生产)从这些集落中提取总RNA。cDNA制备后，使用Taqman preamp (Applied Biosystems生产)扩增目标基因。使用PCR引物组(AppliedBiosystems生产，Nanog、Hs02387400_g1、Dnmt3b、Hs00171876_m1、FoxD3、Hs00255287_s1、Zfp42、Hs01938187_s1、TDGF1、Hs02339499_g1、TERT、Hs00162669_m1、GDF3、Hs00220998_m1、CYP26A1、Hs00175627_m1、GAPDH、Hs99999905_m1)，用ABI PRISM7900HT(Applied Biosystems生产)进行实时定量PCR，以确定集落中的人类ES细胞标记物的基因表达。克隆3-2显示ES细胞标记基因的表达(表12)。基因组PCR分析表明3-2系包含整合的Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc转基因。同样，3-2iPS系具有与其亲本细胞相同的HLA基因型和类似于1-8系的全基因表达模式。 
从以上结果可以看出，通过促使Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc这4种基因中的每一种在存在于人出生后组织中的未分化干细胞中的表达，获得了人类多潜能干细胞。人类多潜能干细胞显示体外长期自我更新能力，并且表达ES细胞标记基因Nanog、Oct3/4、TDGF1、Dnmt3b、GABRB3、GDF3、Zfp42、ALP、CD9和Thy-1。 
实施例18.通过逆转录病毒转导加上HDAC抑制剂处理促使Oct3/4、Sox2和Klf4的表达，以诱导人类多潜能干细胞(预测实施例)
在补充有FGM-2SingleQuots的FBM中培养人出生后皮肤成纤维细胞。在逆转录病毒转导和组蛋白脱乙酰基酶抑制剂处理前3天，以103细胞/cm2将成纤维细胞接种于6孔细胞培养板中。18小时后，在含有MOI为5的mCAT1腺病毒载体(如实施例2所述)的500μl Hanks′平衡盐溶液中，在室温下孵育细胞30分钟，偶尔摇动。之后，向每孔中加入2ml FBM培养基，并培养这些细胞48小时。随后，在37℃下、在2ml逆转录病毒/聚凝胺溶液(如实施例1和5所述，编码Oct3/4、Sox2和Klf4的逆转录病毒载体的等体积的混合物，每种制备的病毒的m.o.i.大约为10，补充有5μg/ml的聚凝胺)中孵育细胞4小时至整夜。用补充有最终浓度为1μM的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂MS-275的MC-ES培养基替换该病毒上清液。第二天，用MC-ES培养基替换培养基，之后 每天替换。 
在病毒转导加上MS-275处理后17-33天，用镊子从孔中挑选具有特征形状(例如，小、圆形，并具有高核质比)的集落。然后将挑选的集落转移到24孔板中的基质胶包被的孔中，并保持在补充有10μMY-27632的mTeSR1成分确定培养基中。14个小时后，更换培养基。之后，每天连续更换培养基。在病毒转导加上MS-275处理后第38-54天，进行第二次传代培养。为了传代，除去培养基，用Hank’s平衡盐清洗这些细胞，接着在37℃用0.25％胰蛋白酶-EDTA处理3-5分钟。加入新鲜培养基以终止反应。在4℃下以200×g离心细胞悬浮液5分钟，然后除去上清液。将细胞重悬浮于补充有10μM Y-27632的mTeSR1成分确定培养基中，并接种到6孔培养皿的基质胶包被的孔中。 
在基质胶(BD Biosciences)包被的培养皿上在mTeSR1成分确定培养基(Stem cell Technologies)中扩增产生的人类iPS克隆。为了人类iPS细胞培养每天更换培养基。为了传代人类iPS细胞系，用Hanks’s平衡溶液清洗细胞，在37℃下在0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco)中孵育3-5分钟，然后加入培养基。然后在室温或4℃下，以300×g离心产生的细胞悬浮液5分钟，并除去上清液。将细胞重悬浮于培养基中，并如上所述接种。传代后，向培养基中补充10μM的Y-27632(Calbiochem)，以避免细胞凋亡。产生的细胞从形态上与在具有确定的边缘、且由具有高核质比的小、圆形细胞组成的集落中培养的典型人类ES细胞和人类iPS-1-8 mTeSR细胞难以区分。根据如实施例14-15所述的所有分析，产生的人类iPS细胞显示体外长期自我更新能力，并且在许多特征上非常类似于典型的人类ES细胞。 
实施例19.通过逆转录病毒转导促使Oct3/4、Sox2和Klf4的表达，诱导人类多潜能干细胞(预测实施例)
在补充有FGM-2 SingleQuots的FBM中培养人出生后皮肤成纤维细胞。在逆转录病毒转导前3天，以103细胞/cm2将成纤维细胞接种于6孔细胞培养板中。18小时后，在含有MOI为5的mCAT1腺病毒载体(如 实施例2所述)的500μl Hanks′平衡盐溶液中，在室温下孵育细胞30分钟，偶尔摇动。之后，向每孔中加入2ml FBM培养基，并培养这些细胞48小时。随后，在37℃下、在2ml逆转录病毒/聚凝胺溶液(如实施例1和5所述，编码Oct3/4、Sox2和Klf4的逆转录病毒载体的等体积的混合物，每种制备的病毒的m.o.i.大约为10，补充有5μg/ml的聚凝胺)中孵育细胞4小时至整夜。然后用MC-ES培养基替换该病毒上清液。第二天，用MC-ES培养基更换培养基，之后每天更换。 
在病毒转导后第17-33天，用镊子从孔中挑选具有特征形状(例如，小、圆形，并具有高核质比)的集落。然后将挑选的集落转移到24孔板中的基质胶包被的孔中，并保持在补充有10μM Y-27632的mTeSR1成分确定培养基中。14个小时后，更换培养基。之后，每天更换培养基。在病毒转导后第38-54天，进行第二次传代培养。为了传代，除去培养基，用Hank’s平衡盐清洗这些细胞，接着在37℃用0.25％胰蛋白酶-EDTA处理3-5分钟。加入新鲜培养基以终止反应。在4℃下以200×g离心细胞悬浮液5分钟，然后除去上清液。将细胞悬浮于补充有10μM Y-27632的mTeSR1成分确定培养基中，并接种于6孔培养皿的4个基质胶包被的孔中。 
在基质胶(BD Biosciences)包被的培养皿上在mTeSR1成分确定培养基中扩增产生的人类iPS克隆。为了人类iPS细胞培养每天更换培养基。为了传代人类iPS细胞系，用Hanks’s平衡溶液清洗细胞，在37℃下在0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco)中孵育3-5分钟，然后加入培养基。然后在室温或4℃下，以300×g离心产生的细胞悬浮液5分钟，并除去上清液。将细胞重悬浮于培养基中，并如上所述接种。传代后，向培养基中补充10μM的Y-27632(Calbiochem)，以避免细胞凋亡。产生的人类iPS细胞从形态上与在具有确定边缘、且由具有高核质比的小、圆形细胞组成的集落中生长的典型人类ES细胞和人类iPS-1-8mTeSR细胞难以区分。根据如实施例14-15所述的所有分析，产生的人类iPS细胞显示体外长期自我更新能力，并且在许多特征上非常类似于典型的人类ES细胞。 
实施例20.使用Tert报道构建体，用于确定与诱导因子子集组合诱导多潜能性的siRNA(“诱导siRNA”)的试验(预测实施例)
在初级筛选中使用完整人类基因组siRNA文库，以确定当与3种选自Oct 3/4、Sox2、Klf4和c-Myc的诱导因子子集组合使用时，具有在成人成纤维细胞群体中诱导多潜能性或提高多潜能性诱导的能力的siRNA。筛选采用用于激活iPS标记基因Tert的报道试验，以确定能够补充3种选自Oct 3/4、Sox2、Klf4和c-Myc的诱导因子子集的诱导活性的候选siRNA。例如，测试siRNA可以与Oct 3/4、Klf4和c-Myc组合使用，以确定补充缺失的Sox2活性的siRNA。在次级筛选中，在同一试验中再次测试候选的诱导siRNA，并且，在检测的细胞中也检测另一种iPS标记基因Cyp26A1的表达。 
tert启动子报道逆转录病毒的产生：
使用上游引物hTERT-475F： 
5′-GCAGCCCTGGGTCTCCAGATCTGGCCAGC-3′(SEQ ID NO：14)和下游引物hTERT+49R： 
5′GGTGGCCGGGGCCAGGGCTAGCCACGTGC-3′(SEQ ID NO：15)， 
从人类基因组DNA PCR扩增人tert启动子的0.5kb片段。 
引物用hTERT外显子1(染色体5，碱基1306027，互联网genome.ucsc.edu上的2003年7月的人类基因组汇编)起点上游(+)或下游(-)的碱基数进行编号。参见，例如，Padmanabhan等人，(2006)，Journal of Nuclear Medicine，47(2)270-277。 
然后将扩增的片段亚克隆到无启动子pGLA4.11[luc2P]载体(Promega，Madison，WI)中的luc2P ORF的5′端。然后如实施例1所述，PCR扩增整个tert-luc2报道盒，亚克隆到pMX逆转录病毒载体中，经测序验证，并包装在Plat-A细胞中(参见，Morita等人，(2000)，GeneTherapy，7(12)：1063-1066)以生成Tert-luc报道(“TLR”)同向性逆转录病毒。 
细胞培养、病毒感染和siRNA转染
以104细胞/cm2的密度，将10ml培养基中的6×105成人或新生儿正常人类皮肤成纤维细胞(Lonza)接种到具有10cm直径细胞培养板的培养皿中的FBM培养基中。以每培养皿10ml培养基中104细胞/cm2的密度，将成人或新生儿正常人类皮肤成纤维细胞(Lonza)接种到具有10cm直径细胞培养板的培养皿中的FBM培养基中。在补充有FGM-2SingleQuots的FBM中培养人出生后皮肤成纤维细胞。18小时后，细胞与含有MOI为1至5的mCAT1腺病毒载体(如实施例2所述)的3ml FBM培养基或Hanks′平衡盐溶液在室温下孵育30分钟，偶尔摇动。之后，向每皿中加入12ml完全FBM培养基，并培养这些细胞48小时。48小时后，除去培养基，加入TLR逆转录病毒与如上制备的编码Oct 3/4、Sox2、Klf4和c-Myc中任意3种的逆转录病毒的混合物，在每皿3ml培养基中加入m.o.i.为大约10-50的每种病毒，在室温下持续感染30分钟。之后，加入12ml FBM培养基，在37℃下孵育培养板。加入TLR逆转录病毒与编码Oct 3/4、Sox2、Klf4和c-Myc中任3种的逆转录病毒24小时后，以每孔25或100μl培养基中104细胞/cm2的密度，将细胞接种到基质胶(20g/cm2)包被的384或96孔细胞培养板的FBM培养基中。在补充有FGM-2SingleQuots的FBM中培养获得的细胞。24小时后，用50或200μl(分别对于384或96孔)含有无抗生素Opti- I Reduced Serum培养基(Invitrogen)、LipofectamineTM-RNAiMax转染试剂(Invitrogen)的混合物替换每孔的培养基，根据厂商方案与对于人类基因靶标的4种siRNA混合，每种siRNA的最终浓度为50nM(“测试siRNA孔”)。因此，在试验中测试针对总共大约25,000个靶标人类基因(即，大部分表达序列，如果不是全部的话)的siRNA。用20组杂混的siRNA(检查缺乏与载体或哺乳动物序列的同源性)转染如上所述转导的20孔细胞(“阴性对照孔”)，作为该试验中的“阴性对照”，。 
TLR的萤光素酶试验加siRNA处理的人类成纤维细胞
48小时后，从每个孔制备细胞裂解液，并在荧光素和ATP(Sigma，St.Louis，MO)的存在下使用Berthold-Lumat B9501光度计(Berthold-Lumat，St Albans，Herts，UK)测定萤光素酶活性，作为Ad-nanog-luc感染的细胞中nanog启动子活性的衡量。将每个测试siRNA孔的萤光素酶活性与阴性对照孔测定的平均萤光素酶活性进行比较。当测定到siRNA孔具有比平均阴性对照孔值明显更高的萤光素酶活性时，在次级筛选中检测相应的siRNA序列(“候选的诱导siRNA”)。 
次级筛选
在一项次级筛选中，使用如上所述的相同的细胞培养条件，将细胞接种于48孔形式中。24小时后，用在初级筛选中确定的候选诱导siRNA(每种靶基因n＝10)转染各孔，但为48孔培养形式调整体积。然后再培养细胞72小时。此后，除去培养基，用Hanks’s缓冲液盐水清洗细胞，并通过qRT-PCR测定Cyp26a1mRNA的水平。 
实施例21.使用qRT-PCR，用于确定与诱导因子子集组合诱导多潜能性的siRNA(“诱导siRNA”)的试验(预测实施例)
在初级筛选中使用完整人类基因组siRNA文库，以确定当与3种选自Oct 3/4、Sox2、Klf4和c-Myc的诱导因子子集组合使用时，具有在成人成纤维细胞群体中诱导多潜能性或提高多潜能性诱导的能力的siRNA。筛选采用用于检测iPS标记基因Tert的表达的qRT-PCR试验，以确定能够补充3种选自Oct 3/4、Sox2、Klf4和c-Myc的诱导因子子集的诱导活性的候选siRNA。例如，测试siRNA可以与Oct 3/4、Klf4和c-Myc组合使用，以确定补充缺失的Sox2活性的siRNA。在次级筛选中，在同一试验中再次测试候选的诱导siRNA，并且，在检测的细胞中也测定另一种iPS标记基因Cyp26A1的表达。 
细胞培养、病毒感染和siRNA转染
以每培养皿10ml培养基中104细胞/cm2的密度，将成人或新生儿正常人类皮肤成纤维细胞(Lonza)接种到具有10cm直径细胞培养板的培养皿中的FBM培养基中。在补充有FGM-2SingleQuots的FBM中培养人出生后皮肤成纤维细胞。18小时后，细胞与含有MOI为1至5的mCAT1腺病毒载体(如实施例2所述)的3ml FBM培养基或Hanks′平衡盐溶液在室温下孵育30分钟，偶尔摇动。之后，向每皿中加入12ml完全FBM培养基，并培养这些细胞48小时。48小时后，除去培养基，加入TLR逆转录病毒与如上制备的编码Oct 3/4、Sox2、Klf4和c-Myc中任3种的逆转录病毒的混合物，在每皿3ml培养基中加入m.o.i.为大约10-50的每种病毒，在室温下持续感染30分钟。之后，加入12ml FBM培养基，在37℃下孵育培养板。加入TLR逆转录病毒与编码Oct 3/4、Sox2、Klf4和c-Myc中任3种的逆转录病毒24小时后，以每孔25或100μl培养基中104细胞/cm2的密度，将细胞接种于基质胶(20g/cm2)包被的384或96孔细胞培养板的FBM培养基中。在补充有FGM-2SingleQuots的FBM中培养获得的细胞。24小时后，用50或200μl(分别对于384或96孔)含有无抗生素Opti- I Reduced Serum培养基(Invitrogen)、LipofectamineTM-RNAiMax转染试剂(Invitrogen)的混合物替换每孔的培养基，根据厂商方案与对于人类基因靶标的4种siRNA混合，每种siRNA的最终浓度为50nM(“测试siRNA孔”)。因此，在试验中测试对于总共大约25,000个靶标人类基因(即，大部分表达序列，如果不是全部的话)的siRNA。用20组杂混的siRNA(检查缺乏对于载体或哺乳动物序列的同源性)转染如上所述转导的20孔细胞(“阴性对照孔”)，作为试验中的“阴性对照”。 
使用Recoverall总核酸分离试剂盒(Ambion生产)从这些集落中提取总RNA。逆转录后，使用Taqman preamp(Applied Biosystems生产)扩增Tert或CYP26A1。然后，使用PCR引物组TERT、Hs00162669_m1和CYP26A1、Hs00175627_m1(从Applied Biosystems获得)，用ABI PRISM 7900HT设备(Applied Biosystems生产)进行实时定量PCR。 
当经测定siRNA孔诱导比阴性对照水平更高的Tert mRNA表达水平时，在次级筛选中检测相应的siRNA序列(“候选的诱导siRNA”)。 
次级筛选
在一项次级筛选中，使用如上所述的相同的细胞培养条件，将细胞接种于48孔形式中。24小时后，用在初级筛选中确定的候选诱导siRNA(每种靶基因n＝10)转染各孔，但为48孔培养形式调整体积。然后再培养细胞72小时。此后，如上所述，除去培养基，用Hanks’s缓冲液盐水清洗细胞，并通过qRT-PCR测定Cyp26A1 mRNA的水平。然后进一步测试确定为当与其它诱导因子组合使用时诱导Tert和Cyp26A1表达的候选诱导siRNA，以确定当与初级筛选中使用的诱导因子的相应子集组合使用时其是否确实能够诱导多潜能性。 
实施例22从包括至少一种嵌合IF-VP 16多肽的成纤维细胞诱导人类多潜能干细胞(预测实施例)
如实施例7所述进行诱导方案和试验，但代替全长人类Sox2逆转录病毒，使用表达嵌合人类Sox2-VP16融合多肽的逆转录病毒，作为4种IF中的一种。Sox2-VP16融合多肽包括包含Sox2结合域的人类Sox2的氨基酸1-183，和融合到人类Sox2片段的C-末端的疱疹VP16蛋白(GenBank登录号AAA45864)的氨基酸411-490，一种强反式激活域(参见，例如，Sadowski等人(1988)，Nature，6；335(6190)：563-564)。该Sox2-VP16融合蛋白的序列是： 
MYNMMETELKPPGPQQTSGGGGGNSTAAAAGGNQKNSPDRVKRPMNAFMVWSRG 
QRRKMAQENPKMHNSEISKRLGAEWKLLSETEKRPFIIDEAKRLRALHMKEHPDYKY 
RPRRKTKTLMKKDKYTLPGGLLAPGGNSMASGVGVGAGLGAGVNQRMDSYAHMN 
GWSNGSYSMMQDQLGYPQHSTTAPTTDVSLGDELRLDGEEVDMTPADALDDFDLEM 
LGDVESPSPGMTHDPVSYGALDVDDFEFEQMFTDALGIDDFGG(SEQ ID NO：16) 
实施例23使用Oct 3/4、Sox2和Klf4的病毒表达与c-Myc的蛋白质转导的组合，从成纤维细胞诱导人类多潜能干细胞(预测实施例)
如实施例7所述进行细胞培养和用Oct 3/4、Sox2和Klf4逆转录病毒的感染，但在病毒感染孵育4小时后，用含有包括人类c-Myc氨基酸序列的纯化人类c-Myc-PTD融合多肽的MC-培养基替换含有3种病毒的聚凝胺溶液： 
SEQ ID NO：12(人类c-Myc)： 
MDFFRVVENQQPPATMPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPS 
E 
DIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGGDM 
V 
NQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLASYQAAARKDSGSPNPARGHSVCSTSS 
LYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCASQDSSAFSPSSDSLLSSTESSPQGSPEPLVLH 
EE 
TPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESGSPSAGGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQH 
NYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRTHNVLERQRRNE 
LK 
RSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLR 
N 
SCA 
在其N-末端与具有以下氨基酸序列的蛋白质转导域融合： 
YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO：1)；RKKRRQRR(SEQ ID NO：2)； 
YARAAARQARA(SEQ ID NO：3)；THRLPRRRRRR(SEQ ID NO：4)； 
GGRRARRRRRR(SEQ ID NO：5)；或KKKKKKKK(SEQ ID NO：17)。 
基本上如Becker-Hapak等人，(2003)，Curr.Protocols Cell Biol.，Unit 20.2，John Wiley & Sons所述进行c-Myc-PTD融合蛋白的亚克隆和纯化。逆转录病毒感染期(用Oct 3/4、Sox2和Klf4逆转录病毒)后，除去聚凝胺-病毒溶液，并更换为2ml含有浓度为100nM的纯化c-Myc-PTD融合多肽的MC-ES培养基，并在37℃孵育培养物大约3个小时。此后，用MC-ES培养基替换培养基，并如实施例7所述继续诱导方案和试验。通过蛋白转导促使c-Myc的表达避免了引入外源性c-Myc基因的潜在的长期不良影响(例如，细胞转化或诱发癌症的风 险性)，特别是当外源基因整合到基因组内时，例如，下面的逆转录病毒转导。 
实施例24使用Oct 3/4、Sox2、Klf4和c-Myc的蛋白质转导，从成纤维细胞诱导人类多潜能干细胞(预测实施例)
在补充有FGM-2 SingleQuots的FBM中培养人出生后皮肤成纤维细胞。在蛋白质转导前3天，以103细胞/cm2将成纤维细胞接种于6孔细胞培养板中。 
基本上如Becker-Hapak等人，(2003)，Curr.Protocols Cell Biol.，Unit 20.2，John Wiley & Sons所述进行Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc融合蛋白的亚克隆和纯化。通过将培养基更换为2ml含有在其N-末端与具有以下氨基酸序列的蛋白转导域融合的Oct 3/4(SEQ ID NO：6)、Sox2(SEQ ID NO：8)、Klf4(SEQ ID NO：10)和c-Myc(SEQ ID NO：12)的纯化融合蛋白(每种为100nM)的MC-ES培养基启动诱导： 
YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO：1)；RKKRRQRR(SEQ ID NO：2)； 
YARAAARQARA(SEQ ID NO：3)；THRLPRRRRRR(SEQ ID NO：4)； 
GGRRARRRRRR(SEQ ID NO：5)；或KKKKKKKK(SEQ ID NO：17)。 
然后这些细胞在37℃与融合蛋白孵育大约3个小时。此后，用补充有10μM Y-27632的MC-ES培养基替换培养基。在诱导期，每天用含有各100nM融合蛋白的MC-ES培养基替换培养基1小时，然后用不含融合蛋白的MC-ES培养基替换培养基直到第二天。诱导期后，如实施例7所述进行试验，以确定诱导的多潜能干细胞候选物。 
实施例25使用Oct 3/4、Sox2和Klf4的蛋白质转导加上HDAC抑制剂处理从成纤维细胞诱导人类多潜能干细胞(预测实施例)
在补充有FGM-2SingleQuots的FBM中培养人出生后皮肤成纤维细胞。在蛋白质转导前3天，以103细胞/cm2将成纤维细胞接种于6孔细胞培养板中。 
基本上如Becker-Hapak等人，(2003)，Curr.Protocols Cell Biol.， Unit 20.2，John Wiley & Sons所述进行Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc融合蛋白的亚克隆和纯化。通过将培养基替换为2ml含有在其N-末端与具有以下氨基酸序列的蛋白转导域融合的Oct 3/4(SEQ ID NO：6)、Sox2(SEQ ID NO：8)和Klf4(SEQ ID NO：10)的纯化融合蛋白(每种为100nM)的MC-ES培养基启动诱导：YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO：1)；RKKRRQRR(SEQ ID NO：2)；YARAAARQARA(SEQ ID NO：3)；THRLPRRRRRR(SEQ ID NO：4)；GGRRARRRRRR(SEQ ID NO：5)；或KKKKKKKK(SEQ ID NO：17)。 
然后这些细胞在37℃与融合蛋白孵育大约3个小时。此后，用补充有最终浓度为1μM的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂和Rho激酶抑制剂10μM Y-27632的MC-ES培养基替换培养基。在随后的诱导期，每天用含有各100nM融合蛋白的MC-ES培养基替换培养基1小时，在随后的日子中，用不含融合蛋白、含有10μM Y-27632的MC-ES培养基替换培养基直到诱导期结束(诱导开始之后大约14天)。诱导期后，如实施例7所述进行试验，以确定诱导的多潜能干细胞候选物。 
实施例26通过逆转录病毒转导促使3或4种外源基因的表达，以诱导小鼠多潜能干细胞
将鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)接种于12孔板，以5000细胞/cm2的密度在MEF培养基(补充有10％FBS和庆大霉素的DMEM)中接种，并培养过夜(大约16小时)。然后在1ml逆转录病毒/聚凝胺的溶液中孵育细胞。逆转录病毒/聚凝胺溶液包括0.25ml补充有5μg/ml聚凝胺的编码4种因子(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)、3种因子(4种因子减去Oct3/4、Sox2、Klf4或c-Myc中的任一种)或2种因子(Oct3/4和Sox2)的每种逆转录病毒载体的混合物。对于2种或3种基因转导，向含病毒溶液中加入培养基直到1ml。在37℃用制备的每种病毒感染细胞。“Oct4a”等同于“Oct3/4”。在第二天用小鼠ES培养基替换病毒上清液。每2-3天更换培养基。 
病毒转导大约12天之后，集落进行碱性磷酸酶(ALP)染色，并 且克隆的集落衍生的细胞被染色为蓝紫色。如图28所示，记录ALP阳性集落数。在已经接受4种因子(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)、3种因子的任意组合和两种因子(Oct3/4和Sox2)的样品中观察ALP阳性集落。 
实施例27通过逆转录病毒转导进入源自小鼠的神经干细胞促使2、3或4种外源基因的表达，以诱导小鼠多潜能干细胞
如上述(Reynolds等人，1992)，从9周大的C57BL/6小鼠(OrientalYeast，Tokyo，Japan)的脑室下区域分离源自成年小鼠的神经干细胞(NSC)。简言之，通过胰酶消化将成年鼠大脑分离成单细胞，并将细胞悬浮于含有100lg/mL人转铁蛋白(Sigma)、20nM孕酮(Sigma)、1001M腐胺(Sigma)、30nM亚硒酸钠(Sigma)和5lg/mL胰岛素(Sigma)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)/Ham′s F-12培养基(DMEM/F12；Invitrogen)中。将悬浮的细胞接种于组织培养皿中。通过在NSC培养基(含有100lg/mL人转铁蛋白、20nM孕酮、1001M腐胺、30nM亚硒酸钠、5lg/mL胰岛素、20ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；Sigma)和20ng/mL表皮生长因子(EGF；Sigma)的DMEM/F12)中将它们作为自由漂浮的神经球培养，来维持细胞处于未分化的增殖状态。在感染前1天，以104细胞/cm2的密度将NSC作为单层接种于Ornitin/Lamin包被的12孔细胞培养板上，并在1ml的NSC培养基中培养。一夜后，在1ml逆转录病毒/聚凝胺的溶液中培养细胞。病毒/聚凝胺溶液包括0.25ml补充有5μg/ml聚凝胺的编码4种因子(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)、3种因子(4种因子减去Sox2或c-Myc)或2种因子(Oct3/4和Klf4)的每种逆转录病毒载体的混合物。对于2种或3种基因转导，向含病毒溶液中加入培养基直到1ml。在37℃感染细胞。在第二天用小鼠ES培养基替换病毒上清液。每2-3天更换培养基。 
病毒转导大约12天之后，集落进行碱性磷酸酶(ALP)染色，并且克隆的集落衍生的细胞被染色为蓝紫色。如图28所示，记录ALP阳 性集落数。在已经接受4种因子(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)、3种因子和2种因子(Oct3/4和Klf4)的组合的样品中观察ALP阳性集落(如图29所示)。 
实施例28通过逆转录病毒转导促使3或4种外源基因的表达，以诱导小鼠多潜能干细胞
使用与图4相关的实施例5所述的相同方法获得源自成年小鼠的骨髓细胞(Losac)。在逆转录病毒转导前一天，以104细胞/cm2将成纤维细胞接种于6孔细胞培养板中，并在2ml低血清培养基中培养。过夜后，在2ml逆转录病毒/聚凝胺的溶液(0.5ml补充有5μg/ml聚凝胺的编码4种因子(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)、3种因子(4种因子减去Oct3/4、Sox2、Klf4或c-Myc)的每种逆转录病毒载体的混合物)中培养细胞。在第二天用小鼠ES培养基替换病毒上清液。此时，也用10ng/ml FGF或0.1μM MS-275处理一些样品3天。在接下来的一天，将培养基更换为小鼠ES培养基，并且之后每2-3天更换培养基。 
病毒转导大约9或15天之后，集落进行碱性磷酸酶(ALP)染色，并且克隆的集落衍生的细胞被染色为蓝紫色。如图30所示，记录ALP阳性集落数。在第15天分析的样品中，在已经接受4种因子(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)的样品中与接受4种因子减去c-Myc、Oct3/4或Klf4的样品中观察到ALP阳性集落(图28)。 
在病毒转导后第9天分析的4种基因转导的样品中也观察到ALP阳性集落，但该数值小于在第15天的4种基因转导的样品中观察到的集落数。在第9天，在4种基因转导的样品中，与未接触MS-275的样品相比，在接触MS-275的样品中观察到更多的集落。 
实施例29通过逆转录病毒转导促使2或4种外源基因的表达，以诱导小鼠多潜能干细胞
使用与图4相关的实施例5所述的相同方法获得源自成年小鼠的骨髓细胞(Losac)。按照实施例30所述的方法进行逆转录病毒转导。 然而，在该实验中，病毒/聚凝胺溶液包括编码4种因子(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)或2种因子(Oct3/4和Klf4)的不同组合(如图31显示)的逆转录病毒载体的等体积的混合物。 
病毒转导大约15天之后，集落进行碱性磷酸酶(ALP)染色，并且克隆的集落衍生的细胞被染色为蓝紫色。如图31所示，记录ALP阳性集落数。在已经接受4种因子(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)的样品中与接受Sox2和c-Myc的组合的样品中观察到ALP阳性集落(图31)。 
实施例30在iPS细胞中相对于人类ES细胞系和亲本成纤维细胞中全基因表达差异的分析
分别如实施例14、16和17所述获得的iPS细胞系1-8、2-4和3-2的全基因表达数据(GEO登记号GSE9709)与以下人类ES细胞(hES细胞)系的全基因表达数据进行比较：在MEF上培养的Sheff4；在基质胶上培养的Sheff4，和在MEF上培养的H14系；及iPS系亲本成纤维细胞。比较基因表达数据，以确定以下基因：(1)在iPS细胞系中比在hES细胞系中以明显更高的水平表达；(2)在hES细胞系中比在iPS细胞系中以明显更高的水平表达；(3)在iPS细胞系中比在hES细胞系和亲本成纤维细胞中以明显更高的水平表达；和(4)在iPS细胞系中比在hES细胞系中以明显更高的水平表达，但没有以比在亲本成纤维细胞中明显更高的水平表达。通过使用p≤0.01的截止值(cut-off)的Student’s t-检验比较数据。结果如表13-16显示。 
表13显示以在iPS细胞系中比在hES细胞系中高5倍或更多的水平表达的基因的列表(p≤0.01)。表14显示以在hES细胞系中比在iPS细胞系中高2倍或更多的水平表达的基因的列表(p≤0.01)。表15显示以在iPS细胞系中比在hES细胞系或亲本成纤维细胞中高5倍或更多的水平表达的基因的列表(p≤0.01)。表16显示以在iPS细胞系中比在hES细胞系中高5倍或更多的水平表达，但没有以比在亲本成纤维细胞中明显高的水平表达(P≤0.05)。 
这些结果表明，尽管如实施例14所述的iPS细胞系和hES细胞系之间的全基因表达的整体相似性，iPS细胞系确实显示与hES细胞系的明显的基因表达差异。 
表13显示在iPS细胞系中的表达水平比在hES细胞系中的表达水平高5倍或更多的基因的列表(p≤0.01)。表14显示在hES细胞系中的表达水平比在iPS细胞系中的表达水平高2倍或更多的基因的列表(p≤0.01)。表15显示在iPS细胞系中的表达水平比在hES细胞系或亲本成纤维细胞中的表达水平高5倍或更多的基因的列表(p≤0.01)。表16显示在iPS细胞系中的表达水平比在hES细胞系中的表达水平高5倍或更多，但没有比在亲本成纤维细胞中的表达水平明显高的基因的列表(P≤0.05)。 
这些结果表明，尽管如实施例14所述在iPS细胞系和hES细胞系之间的全基因表达具有整体相似性，但是iPS细胞系确实显示与hES细胞系的明显的基因表达差异。 
实施例31 Oct3/4多肽氨基酸序列变异体(预测实施例)
根据表17(人类Oct3/4的PMUT分析)，通过定点诱变产生任何下列Oct3/4氨基酸序列变异体，并与Sox2多肽和Klf4多肽，或与Sox2、Klf4和c-Myc多肽一起使用，以诱导如前面实施例所述的多潜能或多能干细胞。 
具有以下任何氨基酸取代对的SEQ ID NO：6的氨基酸序列：Oct3/4变异体2AA-1(H4→N和F9→I)；Oct3/4变异体2AA-2(P15→M和G18→L)；和Oct3/4变异体2AA-3(I60→F和L84→V)。 
具有以下一组10个氨基酸取代的SEQ ID NO：6的氨基酸序列(Oct3/4变异体10AA)：H4→N，F9→I，P15→M，G18→L，I60→F，L84→V，P62→S，V101→I，G109→I和PI 12→I。 
具有以下一组20个氨基酸取代的SEQ ID NO：6的氨基酸序列(Oct3/4变异体20AA)：H4→N，F9→I，P15→M，G18→L，I60→F，P62→S，Q79→D，L84→V，V101→I，G109→I，P112→I，G161→L，D166→E，L169→I，V173→F，F175→A，E215→D，E219→D，A223→M，V227→F。 
具有以下一组25个氨基酸取代的SEQ ID NO：6的氨基酸序列(Oct3/4变异体25AA)：H4→N，F9→I，P15→M，G18→L，V51→I，I60→F，P62→S，C63→S，Y67→F，Q79→D，L84→V，L90→M，Q94→D，V101→I，G109→I，P112→I，G161→L，D166→E，L169→I，V173→F，F175→A，E215→D，E219→D，A223→M，V227→F。 
表1显示实施例中使用的基因名称、NCBI编号、在插入所述基因的病毒载体、插入物大小、5′端的限制位点、3′端的限制位点、翻译区的长度、3′-非翻译区的长度、克隆ID和4种或3种基因的供应商及小鼠同向性逆转录病毒载体(mCAT：小鼠来源的阳离子氨基酸转运体)的受体。 
表1
构建数据 
表2总结了实施例4至7的碱性磷酸酶阳性的集落数。对于细胞类型，附有传代培养数。4种基因引入的日期是逆转录病毒载体感染的日期。批号是Lonza产品的批号。供体的年龄基于Lonza产品的供应者信息。集落数是每10cm2中由碱性磷酸酶阳性的小细胞组成的集落的数目。 
表2
实施例5至8和10，通过基因引入形成的碱性磷酸酶(ALP)阳性集落的数目 
*：每10cm2中由碱性磷酸酶阳性小细胞组成的集落数。 
表2中的“BM”是指“骨髓”。 
表3总结了克隆1-8在第101天的核型分布。吉姆萨染色后，计数染色体数目。100个细胞中有67显示正常核型。 
表3核型分析 
  染色体数   细胞数
  44   1
  45   22
  46   67
  47   7
  48   1
  89   1
  136   1
在人类iPS细胞(克隆1-8mTeSR)中分析了100个细胞。 
表4显示图7和图15中使用的引物序列。 
表4 用于RT-PCR的引物序列 
    正向引物序列   反向引物序列
  HPRT   AGTCTGGCTTATATCCAACACTTCG   GACTTTGCTTTCCTTGGTCAGG
  Nanog   TACCTCAGCCTCCAGCAGAT   TGCGTCACACCATTGCTATT
  TERT   AGCCAGTCTCACCTTCAACCGC   GGAGTAGCAGAGGGAGGCCG
  Sall4   AAACCCCAGCACATCAACTC   GTCATTCCCTGGGTGGTTC
  Zfp42   TTGGAGTGCAATGGTGTGAT   TCTGTTCACACAGGCTCCAG
  GDF3   GGCGTCCGCGGGAATGTACTTC   TGGCTTAGGGGTGGTCTGGCC
  Dnmt3b   GCAGCGACCAGTCCTCCGACT   AACGTGGGGAAGGCCTGTGC
  TDGF1   ACAGAACCTGCTGCCTGAAT   AGAAATGCCTGAGGAAAGCA
  GABRB3   CTTGACAATCGAGTGGCTGA   TCATCCGTGGTGTAGCCATA
  CYP26A1   AACCTGCACGACTCCTCGCACA   AGGATGCGCATGGCGATTCG
  Oct4-total   GAGAAGGAGAAGCTGGAGCA   AATAGAACCCCCAGGGTGAG
  Oct4-exo   AGTAGACGGCATCGCAGCTTGG   GGAAGCTTAGCCAGGTCCGAGG
  Sox2-total   CAGGAGAACCCCAAGATGC   GCAGCCGCTTAGCCTCG
  Sox2-exo   ACACTGCCCCTCTCACACAT   CGGGACTATGGTTGCTGACT
  Klf4-total   ACCCTGGGTCTTGAGGAAGT   ACGATCGTCTTCCCCTCTTT
  Klf4-exo   CTCACCCTTACCGAGTCGGCG   GCAGCTGGGGCACCTGAACC
  c-Myc-total   TCCAGCTTGTACCTGCAGGATCTGA   CCTCCAGCAGAAGGTGATCCAGACT
  c-Myc-exo   AGTAGACGGCATCGCAGCTTGG   CCTCCAGCAGAAGGTGATCCAGACT
表5总结了使用GeneChip Human Mapping 500K阵列组分析的人类iPS克隆1-8和成纤维细胞(5F0438和5F04156)的SNP基因型分型。克隆1-8的SNP与亲本细胞的SNP在467,946个检出SNP中的464,069个(99.17％)中相一致，而在3,877个(0.83％)中不同于亲本细胞。与此不同，克隆1-8mTeSR的SNP与无关供体细胞(5F0416)只在470,960个检出SNP中的284,950个(60.50％)中相一致，而在186,010个(39.50％)中不同于该无关细胞。 
表5
SNP基因型分型 
表6使用PCR扩增的DNA与序列特异性寡核苷酸探针(SSOP)(Luminex)的杂交，分类人类iPS1-8(1-8mTeSR)、iPS 2-4(mTeSR)和iPS 3-29mTeSR及成纤维细胞(5F0438和5F0416)的HLA-A、HLA-B、HLA-Cw和HLA-DR类型。 
表6
HLA基因型分型 
表7总结了集落中的hES细胞标记基因表达模式。在4种基因转导后17天针对碱性磷酸酶对集落染色。分离所有ALP(+)集落和18个ALP(-)集落，并通过RT-PCR检测其hES标记基因的表达。对每个集落加以分类，并计数数目。“+”代表基因表达，“-”代表使用扩增的cDNA样本，通过40个循环的RT-PCR没有检测到基因表达。 
表7
ALP(+)和ALP(-)集落中的基因表达模式 
ALP(+)集落中的基因表达模式 
表8总结了使用新生儿成纤维细胞的实验的碱性磷酸酶阳性集落的数目。4种基因引入的日期是逆转录病毒载体感染的日期。供体表示Lonza产品的批号。集落数是每10cm2中由碱性磷酸酶阳性小细胞组成的集落的数目。ND：没有检测。 
表8
实验列表 
表9列出了用于Nanog和Oct3/4的启动子区域的甲基化分析的扩增子对应于基因组中的位置和大小。A、B和C列分别表示扩增子的名称、对应于扩增子的基因组中的位置和大小。 
表9
甲基化分析中的启动子区域 
表10列出了用于Nanog和Oct3/4的启动子区域的甲基化分析的引物组。A和B列分别表示引物的名称和引物的序列(大写字母表示基因特异性序列，小写字母表示标签序列)。 
表10
用于甲基化分析的引物序列 
表11总结了实施例15的ALP阳性集落中的相对mRNA表达。集落的编号对应于图16-23。集落#5-2-32、#5-2-49、#5-2-51、#7-2-37表达所有分析的人类ES细胞标记。相反地，成纤维细胞集落#3-1-212、#3-1-215、#5-1-4只表达Nanog，尽管它高效表达转基因。 
表11
ES细胞标记在ALP阳性集落中的相对mRNA表达 
表12总结了克隆-2-4和3-2中的相对mRNA表达。从克隆2-4和3-2提取了总RNA。如实施例16和17所述，通过qRT-PCR测定ES细胞标记基因的表达。克隆-2-4和-3-2都显示ES细胞标记基因的表达。所有的表达值均相对于人类克隆iPS-1-8(第94天)标准化。 
表12
克隆-2-4和3-2中的相对mRNA表达 

Claims (6)

1.一种从人或小鼠体细胞产生多能干细胞的体外方法，所述方法包括：
(i)将以下三种多肽或编码该多肽的基因引入体细胞：人或小鼠Oct3/4多肽或编码该Oct3/4多肽的基因、人或小鼠Sox2多肽或编码该Sox2多肽的基因，和人或小鼠Klf4多肽或编码该Klf4多肽的基因，和
(ii)将所述体细胞与组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂MS-275和/或Rho相关的蛋白激酶(ROCK)抑制剂Y-27632接触，
其中所述方法不用于克隆人或人被克隆。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述编码该Oct3/4多肽的基因、所述编码该Sox2多肽的基因和所述编码该Klf4多肽的基因被引入到步骤(i)中的体细胞中。
3.如权利要求1所述的方法，还包括将c-Myc多肽或编码c-Myc多肽的基因引入体细胞。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，还包括将体细胞与FGF-2接触。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述体细胞是人体细胞。
6.(i)人或小鼠Oct3/4多肽或编码该Oct3/4多肽的基因、人或小鼠Sox2多肽或编码该Sox2多肽的基因，和人或小鼠Klf4多肽或编码该Klf4多肽的基因，和(ii)HDAC抑制剂MS-275和/或ROCK抑制剂Y-27632在从人或小鼠体细胞制备多能干细胞中的用途。
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