CN102317464A - 从α-酮酸生物合成双官能烷烃 - Google Patents

从α-酮酸生物合成双官能烷烃 Download PDF

Info

Publication number
CN102317464A
CN102317464A CN2009801566945A CN200980156694A CN102317464A CN 102317464 A CN102317464 A CN 102317464A CN 2009801566945 A CN2009801566945 A CN 2009801566945A CN 200980156694 A CN200980156694 A CN 200980156694A CN 102317464 A CN102317464 A CN 102317464A
Authority
CN
China
Prior art keywords
host cell
acid
decarboxylase
engineering
engineering approaches
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2009801566945A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102317464B (zh
Inventor
布莱恩·M·拜内斯
约翰·迈克尔·杰雷米亚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Celexion LLC
Original Assignee
Celexion LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Celexion LLC filed Critical Celexion LLC
Publication of CN102317464A publication Critical patent/CN102317464A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102317464B publication Critical patent/CN102317464B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/005—Amino acids other than alpha- or beta amino acids, e.g. gamma amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/50—Polycarboxylic acids having keto groups, e.g. 2-ketoglutaric acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters

Abstract

本发明各个方面涉及在宿主细胞中生产双官能烷烃的方法。具体地，本发明的各个方面描述了与在宿主细胞中从碳水化合物原料生产双官能烷烃有关的基因组件。更具体地，本发明的各个方面描述了用于经由2-酮庚二酸生产己二酸、氨基己酸、己内酰胺和六亚甲基二胺的代谢途径。

Description

从α-酮酸生物合成双官能烷烃
技术领域
本发明各方面涉及在宿主细胞中生产双官能烷烃的方法。具体地，本发明的多个方面描述了与在宿主细胞中从碳水化合物原料生产双官能烷烃有关的基因组件。更具体地，本发明的多个方面描述了用于经由2-酮庚二酸生产己二酸、氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺的代谢途径。
背景技术
原油是用于合成重要化学品和聚合物的第一原料。随着原油逐渐枯竭和昂贵，人们逐渐关注在化学品生产中使用活的微生物和它们纯化的酶对可再生原料进行生物加工。使用生物加工特别是发酵来生产饮料已有几个世纪。在过去的50年中，商业上已经使用微生物来生产诸如抗生素、维生素和氨基酸等化合物。然而，目前用微生物生产工业化学品的普遍性很低。最近已认识到微生物能为常规化学方法难以生产或昂贵生产的某些化合物提供经济的途径。
发明内容
本发明各方面涉及用于从α-酮酸生产α，ω双官能Cn烷烃的代谢工程化的宿主细胞，其中α和ω末端官能团选自-OH、-COOH和-NH3的组，并且其中n是4-8范围内的整数，所述代谢工程化的宿主细胞被包含编码至少一种生物合成途径酶的至少一个核苷酸序列的核酸进行遗传修饰。在一些实施方式中，所述核酸包含编码两个或多个基因产物的核苷酸序列。所述代谢工程化的宿主细胞可以是原核细胞。例如，在一些实施方式中，所述代谢工程化的宿主细胞可以是厌氧型原核细胞。所述代谢工程化的宿主细胞可选自大肠杆菌(E.Coli)、谷氨酸棒杆菌(C.Glutanicum)、黄色短杆菌(B.Flavum)和乳糖发酵短杆菌(B.lactofermentum)组成的组。
在优选的实施方式中，α-酮酸是α-酮戊二酸，并被转化成α-酮己二酸、α-酮庚二酸或α-酮辛二酸。在优选的实施方式中，宿主细胞包含编码高柠檬酸合酶、高乌头酸酶和同分异构高柠檬酸脱氢酶的核酸序列。高柠檬酸合酶可选自由AksA、NifV、hcs和Lys20/21组成的组。高乌头酸酶可选自由AksD/E、LysT/U、Lys4，3-异丙基苹果酸脱水酶大/小亚单位及其同源物组成的组。所述同分异构高柠檬酸脱氢酶可选自由AksF、Hicdh、Lys12，2-氧代辛二酸合酶、3-异丙基苹果酸脱水酶及其同源物组成的组。
在优选的实施方式中，所述α，ω双官能Cn烷烃具有6个碳原子，并且选自由氨基己酸、己二酸、六亚甲基二胺、6-羟基六胺、1，6-己二醇、6-氨基己醛、6-氨基己醇和6-羟基己酸组成的组。
本发明的方面涉及用于从α-酮庚二酸生产己二酸的代谢工程化宿主细胞，所述宿主细胞还包含编码脱羧酶和醛脱氢酶的核酸。在一些实施方式中，所述脱羧酶是2-酮脱羧酶，并且催化α-酮庚二酸向己二酸半醛的转化；所述醛脱氢酶催化己二酸半醛向己二酸的转化。所述2-酮脱羧酶可选自由2-酮戊二酸脱羧酶(kgd)、2-酮异戊酸脱羧酶(kivD)、促转氨的氨基酸脱羧酶(ARO10)、苯甲酰甲酸脱羧酶(mdlC)、2-酮精氨酸脱羧酶(aruI)、膦酰基丙酮酸脱羧酶(fom2)、丙酮酸脱羧酶同工酶(PDC6、PDC1)、丙酮酸脱羧酶同工酶2(PDC5、PDC1、PDC6、Aro10、KivD)、吲哚丙酮酸脱羧酶(ipdC及其同源物组成的组。在一些实施方式中，所述脱羧酶与2-酮戊二酸脱羧酶(kgd)、2-酮异戊酸脱羧酶(kivD)、促转氨的氨基酸脱羧酶(ARO10)、苯甲酰甲酸脱羧酶(mdlC)、2-酮精氨酸脱羧酶(aruI)、膦酰基丙酮酸脱羧酶(fom2)、丙酮酸脱羧酶同工酶(PDC6、PDC1)、丙酮酸脱羧酶同工酶2(PDC5、PDC1、PDC6、Aro10、KivD)、吲哚丙酮酸脱羧酶(ipdC)及及其同源物具有至少30％同一性。在优选的实施方式中，所述醛脱氢酶是6-氧代己酸脱氢酶(ChnE)及其同源物。在其他优选实施方式中，所述醛脱氢酶与6-氧代己酸脱氢酶(ChnE)具有至少30％同一性。
本发明的方面涉及用于从α-酮庚二酸生产氨基己酸的代谢工程化宿主细胞，所述宿主细胞还包含编码氨基转移酶和脱羧酶的核酸。在一些实施方式中，所述氨基转移酶催化α-酮庚二酸向2-氨基庚二酸的转化；所述脱氢酶催化2-氨基庚二酸向氨基己酸的转化。所述氨基转移酶可选自由α-氨基己二酸氨基转移酶-1(AADAT)、氨基己二酸氨基转移酶(LysN)、二氨基庚二酸脱氢酶(ddb和dapdh)及其同源物组成的组。在一些实施方案中，脱羧酶是谷氨酸脱羧酶。在一些实施方式中，谷氨酸脱羧酶由选自Gad6/7、GadA、GadB和lysA的组的基因或片段编码。在一些实施方式中，所述脱羧酶催化α-酮庚二酸向己二酸半醛的转化；所述氨基转移酶催化己二酸半醛向氨基己酸的转化。所述酮脱羧酶可选自由2-酮戊二酸脱羧酶(kgd)、2-酮异戊酸脱羧酶(kivD)、促转氨的氨基酸脱羧酶(ARO10)、苯甲酰甲酸脱羧酶(mdlC)、2-酮精氨酸脱羧酶(aruI)、膦酰基丙酮酸脱羧酶(fom2)、丙酮酸脱羧酶同工酶(PDC6、PDC1)、丙酮酸脱羧酶同工酶2(PDC5、PDC1、PDC6、Aro10、KivD)、吲哚丙酮酸脱羧酶(ipdC)及其同源物组成的组。所述氨基转移酶可选自由GABA转氨酶、Lys6脱氢酶、鸟氨酸-含氧酸转氨酶、赖氨酸氨基转移酶、4-氨基丁酸氨基转移酶、4-氨基丁酸氨基转移酶、4-氨基丁酸氨基转移酶、酵母氨酸脱氢酶(LYS9和LYS1)或其任意同源蛋白组成的组。
本发明的方面涉及用于从氨基己酸生产六亚甲基二胺的代谢工程化宿主细胞，所述宿主细胞包含编码醛脱氢酶和氨基转移酶的核酸。在一些实施方式中，所述醛脱氢酶催化氨基己酸向6-氨基己醛的转化；所述氨基转移酶催化6-氨基己醛向6-己二胺的转化。在优选的实施方式中，所述醛脱氢酶是ALDH酶(EC 1.2.1-)。在一些实施方式中，所述氨基转移酶可选自由α-氨基己二酸氨基转移酶-1(AAADAT)、氨基己二酸氨基转移酶(LysN)、二氨基庚二酸脱氢酶(ddb和dapdh)及其同源蛋白组成的组。
本发明的方面涉及用于从α-酮庚二酸生产六亚甲基二胺的代谢工程化宿主细胞，所述宿主细胞包含编码氨基转移酶、还原酶、脱氢酶和脱羧酶的核酸。在一些实施方式中，所述氨基转移酶催化α-酮庚二酸向2-氨基庚二酸的转化；所述还原酶催化2-氨基庚二酸向2-氨基-7-氧代庚酸的转化，所述脱氢酶催化2-氨基-7-氧代庚酸向2，7-二氨基庚酸的转化，且所述脱羧酶催化2，7-二氨基庚酸向六亚甲基二胺的转化。所述氨基转移酶可选自由α-氨基己二酸氨基转移酶-1(AADAT)、氨基己二酸氨基转移酶(LysN)、二氨基庚二酸脱氢酶(ddb和dapdh)及其变体组成的组。在一些实施方式中，所述还原酶是氨基己二酸还原酶或其同源物。在一些实施方式中，所述氨基己二酸还原酶由Sc-Lys2编码。在一些实施方式中，所述脱氢酶是酵母氨酸脱氢酶或其同源物，并且由Sc-Lys9或Sc-Lys1或其变体编码。所述脱羧酶可选自由赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶及其变体组成的组。
本发明的一些方面涉及用于从α-酮庚二酸生产6-羟基己酸的代谢工程化宿主细胞，所述宿主细胞包含编码醇脱氢酶的核酸。本发明的方面涉及用于从6-羟基己酸生产1，6-己二醇的代谢工程化宿主细胞，所述宿主细胞包含编码醇脱氢酶或醛脱氢酶的核酸。所述醇脱氢酶可选自6-羟基己酸脱氢酶、丁醇脱氢酶、ADHIV脱氢酶、丙二醇脱氢酶、ADH6及其同源物。
本发明的方面涉及用于从α-酮戊二酸生产αω-双官能Cn烷烃的方法，其中α和ω末端官能团选自-OH、-COOH和-NH3基团，其中n是4-7范围内的整数，所述方法包含在足以生产α，ω-双官能Cn烷烃的条件下培养所述宿主细胞，并分离α，ω-双官能Cn烷烃。
在一些方面，本发明涉及包含一个或多个外源核酸序列的宿主细胞，所述外源核酸序列编码选自高柠檬酸合酶(EC 2.3.3.-)、高乌头酸酶(EC2.3.3.14)、同分异构高柠檬酸脱氢酶(EC 1.1.1.-)及其组合的至少一个多肽。在一些实施方式中，代谢工程化的宿主细胞从α-酮戊二酸生产α-酮己二酸、α-酮庚二酸、α-酮辛二酸或其组合。在一些方面，本发明涉及包含一个或多个外源核酸序列的宿主细胞，所述外源核酸序列编码选自α-酮酸脱羧酶(EC4.1.1.-)和脱氢酶(EC 1.1.1.-)及其组合的至少一个多肽。在一些实施方式中，所述工程化宿主细胞生产Cn二羧酸，其中n是4-7范围中的整数。例如所述工程化宿主细胞生产己二酸。在其他实施方式中，所述工程化宿主细胞生产Cn羟基羧酸，其中n是4-7范围中的整数。例如所述工程化宿主细胞生产6-羟基己酸。在另一些实施方式中，所述工程化宿主细胞生产Cn烷二醇，其中n是4-7范围中的整数，例如1，6-己二醇。
在本发明的一些方面，本发明涉及从α-酮戊二酸生产α-酮己二酸、α-酮庚二酸、α-酮辛二酸或其组合的工程化宿主细胞，其包含编码选自α-酮酸脱羧酶(EC 4.1.1.-)、氨基转移酶(EC 1.4.1.-)、氨基转移酶(EC 2.6.1.-)及其组合的至少一个多肽的一个或多个外源核酸序列。在优选的实施方式中，所述工程化宿主细胞生产氨基己酸。在一些实施方式中，所述工程化宿主细胞还进一步包括一个或多个编码选自醛脱氢酶(EC 1.2.1.3)的至少一个多肽的外源核酸序列，并且生产Cn氨基醛或Cn二氨基烷烃，其中n是4-7范围内的整数。例如，所述工程化宿主细胞生产六亚甲基二胺或6-羟基六胺。
在一些方面，所述工程化宿主细胞包含一个或多个外源核酸序列，所述外源核酸序列编码选自氨基己二酸转移酶(EC 2.6.1.39)、二氨基庚二酸脱氢酶(EC 1.4.1.16)、谷氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.-)及其组合的至少一个多肽。在一些实施方式中，所述宿主细胞生产Cn氨基-羧酸，其中n是4-7范围中的整数。例如所述工程化宿主细胞生产氨基己酸。
本发明的一些方面涉及从α-酮酸生产α，ω-双官能Cn烷烃的工程化宿主细胞，其包含编码选自α-氨基己二酸-氨基转移酶(EC 2.6.1.39)、二氨基庚二酸脱氢酶(EC 1.4.1.16)、氨基己二酸还原酶(EC 1.2.1.31)、酵母氨酸脱氢酶(EC1.5.1.-)、赖氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.18)、鸟氨酸脱羧酶(EC4.1.1.17)及其组合的至少一个多肽的一个或多个外源核酸序列。在一些实施方式中，所述工程化宿主细胞生产Cn氨基醛或Cn二氨基烷烃，其中n是4-7范围中的整数。例如所述工程化宿主细胞生产六亚甲基二胺。在本发明的一些方面，所述工程化宿主细胞还包含一个或多个外源核酸序列，所述外源核酸序列编码3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白]还原酶(EC 1.1.1.100)、脂肪酸合酶(EC 2.3.1.-)、脱水酶(EC 4.2.1.59)、3-羟基辛酰基-[酰基-载体-蛋白]脱水酶(EC 4.2.1.59)、烯酰基-[酰基-载体-蛋白]还原酶(EC 1.3.1.9)及其组合的至少一个多肽。在一些优选实施方式中，所述工程化宿主细胞生产Cn二羧酸，其中n是5-8范围中的整数。例如所述工程化宿主细胞生产己二酸。在一些实施方式中，所述工程化宿主细胞还包括编码选自醛脱氢酶(EC 1.2.1.3)的至少一个多肽的一个或多个外源核酸序列，并且生产Cn羟基羧酸，其中n是5-8范围内的整数，例如，6-羟基己酸。在一些实施方式中，所述工程化宿主细胞生产Cn烷二醇，其中n是5-7范围中的整数，例如1，6-己二醇。
本发明的一些方面涉及从α-酮酸生产α，ω-双官能Cn烷烃的工程化宿主细胞，其包含编码选自α-氨基己二酸-氨基转移酶
Figure BPA00001422088200061
二氨基庚二酸脱氢酶(EC 1.4.1.16)、氨基己二酸还原酶(EC 1.2.1.31)、酵母氨酸脱氢酶(EC1.5.1.-)、赖氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.18)、鸟氨酸脱羧酶(EC4.1.1.17)及其组合的至少一个多肽的一个或多个外源核酸序列，选自3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白]还原酶(EC 1.1.1.100)、脂肪酸合酶(EC 2.3.1.-)、脱水酶(EC 4.2.1.59)、3-羟基辛酰基-[酰基-载体-蛋白]脱水酶(EC 4.2.1.59)、烯酰基-[酰基-载体-蛋白]还原酶(EC 1.3.1.9)及其组合的至少一个多肽的一个或多个外源核酸序列，选自醛脱氢酶的至少一个多肽的一个或多个外源核酸序列，和编码选自氨基转移酶(EC 1.4.1.-)和氨基转移酶(EC 2.6.1.-)的至少一个多肽的一个或多个外源核酸序列。在一些实施方式中，所述工程化宿主细胞生产Cn氨基羧酸，其中n是5-8范围中的整数，例如氨基己酸。在一些方面，本发明涉及包含一个或多个外源核酸序列的宿主细胞，所述外源核酸序列编码选自醛脱氢酶(EC1.2.1.3)、氨基转移酶(EC 1.4.1.-)和氨基转移酶(EC 2.6.1.-)及其组合的至少一个多肽。在一些实施方式中，所述工程化宿主细胞生产1，n-二氨基烷烃，其中n是5-8范围中的整数，例如六亚甲基二胺。在其他实施方式中，所述工程化宿主细胞生产n-氨基醇，其中n是5-8范围中的整数，例如6-氨基己醇。
本发明的一些方面涉及工程化宿主细胞，其包含编码选自氨基转移酶(EC 2.6.1.7)、醛脱氢酶(EC 1.2.1.3)、谷氨酸半醛变位酶
Figure BPA00001422088200062
3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白]还原酶(EC 1.1.1.100)、脂肪酸合酶
Figure BPA00001422088200063
脱水酶
Figure BPA00001422088200064
3-羟基辛酰基-[酰基-载体-蛋白]脱水酶(EC 4.2.1.59)、烯酰基-[酰基-载体-蛋白]还原酶(EC 1.3.1.9)及其组合的至少一个多肽的一个或多个外源核酸序列。在一些实施方式中，所述工程化宿主细胞生产n-氨基羧酸，其中n是5-8范围中的整数，例如氨基己酸。
本发明的一些方面涉及用于从α-酮戊二酸生产α，ω-双官能Cn烷烃的方法，其中α和ω末端官能团选自-OH、-COOH和-NH3基团，其中n是5-8范围中的整数，所述方法包含在足以生产α，ω-双官能Cn烷烃的条件下培养所述宿主细胞，并分离α，ω-双官能Cn烷烃。
附图说明
参考形成本申请部分的具体实施方式和附图可更充分地理解本发明。
图1显示了己二酸的生物合成途径。通过1的步骤a描述了来自詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的辅酶B生物合成途径的2-酮延长途径。标记步骤a、b、c、d、e、f、g、h、m和n代表下面描述的底物向产物的转化。
图2代表用于从α-酮酸Cn开始生物生产双官能烷烃C(n-1)的流程图。
图3代表用于从α-酮庚二酸开始生物生产双官能己烷的流程图。
图4代表用于从α-酮酸Cn开始生物生产双官能烷烃Cn的流程图。
图5代表用于从α-酮己二酸开始生物生产双官能己烷的流程图。
具体实施方式
本说明书中使用的以下术语具有下文所述的含义。除非另有说明，本文使用的所有科技术语具有与本领域普通技术人员通常理解相同的含义。
除非文中清楚指明，否则单数形式(“a，”“an，”和“the”)包括复数涵义。
所使用的术语“包含”(“comprise”和“comprising”)为开放式的包括，是指还可包括其他元素。
所使用的术语“包括”是指“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可相互交换使用。
本说明书中提到的所有公开均通过引用并入本文。本文讨论的公开仅用于提供其在本发明申请日之前的公开。本文中不应有任何内容被解释为承认本发明没有依靠在先发明而先于此公开的资格。
本发明一方面提供了以快速、便宜且环境响应的方式生产目标有机脂肪族化合物的方法和材料。因此，本发明满足了多种商业和工业需要。术语“有机分子”是指，例如主要由碳和氢构成的任何分子，例如烷烃。目标有机化合物，例如双官能烷烃、二醇、二羧酸等可用于合成塑料、尼龙和通常原子石油和烃的其他产物。本发明的一方面涉及双官能n-烷烃的合成，其中烃链Cn源自烃链Cn或Cn+1，其中n是从约1至约8的数，例如从约2至约5，或从约3至约4。在优选的实施方式中，所述双官能n-烷烃源自α-(n+1)或n酮酸。
本发明的一方面涉及在微生物中生产目标双官能烷烃，并且提供了在微生物中从碳水化合物源生产双官能烷烃的方法。本文使用的“双官能烷烃”是指具有两个官能团的烷烃。术语“官能团”是指，例如原子的排列方式决定了该基团以及与其相连分子的化学性质的基团。官能团的实例包括卤素原子，羟基(-OH)、羧酸基(-COOH)和氨基(-NH2)等。“醇”是指，例如其中一个或多个氢原子被-OH基团取代的烷基部分。术语“伯醇”是指，例如-OH与末端或链末端碳原子结合的醇，例如1-丁醇、1-己醇等。术语“仲醇”是指，例如-OH与结合一个氢原子和两个其他碳原子的碳原子结合的醇，例如2-丁醇、2-己醇等。术语“叔醇”是指，例如-OH与结合三个其他碳原子的碳原子结合的醇，例如甲基丙醇(叔丁醇)等。“氨基”是指，例如其中一个或多个氢原子被-NH2基团取代的烷基部分。“羰基化合物”是指，例如包含羰基C＝O的有机化合物，例如具有通式RCOH的醛；具有通式RCOR′的酮；具有通式RCOOH的羧酸；和具有通式RCOOH的酯。
所述方法引入了能够生产以下目标双官能烷烃中至少一种的微生物，特别是己酸、氨基己酸、HMD、6-羟基己酸。其他目标双官能烷烃包括：1，3-丙二醇、丙三醇、丙烯酸、尸胺、3-羟基丙酸、五亚甲基二胺、马来酸、琥珀酸、己二酸、癸二酸、戊二酸和辛二酸等。现已描述了多个化学合成途径，例如用于己酸及其中间产物，例如粘康酸和己二酸半醛；用于己内酰胺及其中间产物，例如6-氨基己酸；用于己烷，1，6二氨基己烷或己烷亚甲基二胺；用于3-羟基丙酸及其中间产物，例如丙二酸半醛，但仅公开了用于这些有机化学品中一部分的少数生物途径。因此，本发明的方面提供了用于从可持续性给料生产双官能烷烃的工程化代谢途径、分离核酸或工程化核酸、多肽或工程化多肽、宿主细胞或基因工程化宿主细胞，方法和材料。适合作为起始点的碳源包括碳水化合物和合成的中间产物。细胞能够代谢的碳水化合物的实例包括糖、右旋糖、甘油三酸酯和脂肪酸。来自代谢途径的中间产物，例如丙酮酸、草酰乙酸、2-酮戊二酸也可用作起始点。本发明的方面涉及工程化多肽和编码对天然或非天然底物具有活性或改进活性，或具有宽底物特异性(例如无差别催化，例如无差别底物)的酶的多核苷酸。在本文中可交换使用的术语“多肽”和属于“蛋白”和“肽”是指氨基酸的多聚物，包括，例如基因产物、天然存在的蛋白、同源物、直向同源物、旁系同源物、片段以及上述的等效物、变体和类似物。属于“具有酶活性的多肽”是指催化其他物质的化学反应，而其本身在反应完成时不被破坏或改变的任何多肽。具有酶活性的多肽通常催化从一种或多种底物形成一种或多种产物。在本发明的一些方面，一些酶的催化无差别性可以与蛋白工程化组合，或者可用于新的代谢途径和生物合成应用。在一些实施方式中，可修饰现有的酶以用于有机生物合成。在一些优选的实施方式中，参与目标双官能n-烷烃生产的酶包括但不限于2氨基-脱羧酶、2-酮脱羧酶、末端-氨基转移酶、2-氨基转移酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、氨基-醛脱氢酶、脱氢酶和脱水酶。在一些实施方式中，可改变酶的反应机制以催化新反应、改变、拓展或改进底物特异性。应理解，如果酶结果(例如结晶结果)是已知的，则可通过合理的再设计修饰酶的性质(参见美国专利申请US20060160138、US20080064610和US20080287320，其通过引用全文并入本文)。酶性质的修饰或改进可来自于向多肽链中引入修饰，其可有效干扰酶的结构-功能和/或与其他分子的相互作用(例如底物和非天然底物)。本领域已知多肽的一些区域可能对酶活性至关重要。例如，对参与催化的和/或底物结合域中氨基酸组成的小干扰将对酶功能产生显著的影响。一些氨基酸残基可位于对于维持酶的二级或三级结构重要的位置，并因此在被修饰时产生显著变化的酶性质。在一些实施方式中，潜在的途径组分是上述任一种的变体。此类变体可通过随机突变产生，或通过合理设计产生以生产具有例如改变的底物特异性、增加的酶活性、较高的稳定性等酶活性。因此，在一些实施方式中，对参照母本酶进行的用于产生具有期望性质的修饰的数量可包括一个或多个氨基酸、2个或更多氨基酸、5个或更多氨基酸、10个或更多氨基酸，或20个或更多氨基酸，至氨基酸总数的10％、至氨基酸总数的20％、至氨基酸总数的30％、至构成所述参照酶的氨基酸总数的40％或至构成所述参照酶的氨基酸总数的50％。
本领域技术人员应理解，本文例示的工程化途径的描述涉及但不限于物种、特异基因，并且包括核酸或氨基酸序列的同源物或直向同源物。在使用本领域已知的方法比对时，同源物或直向同源物序列具有相对高度的序列同一性/类似性。
本发明的一方面涉及新微生物或“基因修饰的”微生物或宿主细胞，其经工程化以具有新代谢能力或新代谢途径。本文使用的属于“基因修饰的”微生物是指具有通常不见于参照物种的野生型菌株中的至少一个基因变化。在一些实施方式中，基因工程化的微生物经工程化以表达或过表达位于代谢途径关键点和/或阻断其他酶合成的至少一个具体酶，以克服或避开代谢瓶颈。术语“代谢途径”是指两个或更多连续的酶反应，其中一个酶反应的产物称为后一个酶反应的底物。在代谢途径的每一步，中间产物化合物形成或被用作后一步的底物。这些化合物可被称作“代谢中间产物”。每一步的产物也被称作“代谢物”。
本发明的一方面提供了用于涉及和制造工程化代谢途径的方法。在本发明的一些方面，可在一个或多个宿主细胞或目标微生物中进行从一个或多个可得且可持续底物制备目标产物的可选途径。应理解，用于制造双官能烷烃的工程化途径可涉及多个酶，因此，通过该途径的流可能不是最适宜用于生产目标产物。因此，在本发明的一些方面，任选通过调整途径酶相对于另一种途径酶的活性水平来平衡流。在整个申请中提供了此类调整的实例。
本发明一方面提供了基因修饰的宿主细胞或微生物，以及使用所述基因修饰的宿主细胞或微生物从α-酮酸生产双官能n-烷烃的方法。本文使用的宿主细胞是指体内或体外的真核细胞，原核细胞，或来自作为单细胞实体的多细胞生物的细胞(例如细胞系)。宿主细胞可以为原核细胞(例如细菌，如大肠杆菌(E.Coli)或枯草杆菌(B.subtilis))或真核细胞(例如，酵母、哺乳动物或昆虫细胞)。例如，宿主细胞可以是细菌细胞(例如，大肠杆菌、枯草杆菌、分支杆菌属(Mycobacterium spp.)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)或其他适合的细菌细胞)、古核生物(例如，詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)或海沼甲烷球菌(Methanococcus Maripaludis)或其他适合的古核细胞)、酵母细胞(例如，酵母属(Saccharomyces)物种，例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)、裂殖酵母(S.pombe)、毕赤酵母属(Picchia)物种、念珠菌属(Candida)物种，例如，白色念珠菌(C.albicans)或其他适合的酵母物种)。原核和真核宿主细胞可以是，或经过基因修饰(也称作“重组宿主细胞”、“代谢工程化细胞”或“基因工程化细胞”)，并用作核酸的受体，例如包含编码一个或多个生物合成或工程化途径基因产物的核苷酸序列的表达载体。原核和真核宿主细胞还表示通过核酸进行基因工程化的初始细胞的后裔。在一些实施方式中，可根据其代谢性质选择宿主细胞。例如，如果选择或筛选涉及具体代谢途径，使用具有相关途径的宿主细胞是有帮助的。此宿主细胞可具有某些生理适应性，以允许其具有或输入或输出一种或多种中间产物或途径的产物。然而，在其他实施方式中，可选自不表达与目标具体途径相关的酶的宿主细胞，以能够使用适合的基因元件设置而不依赖于宿主细胞提供一个或多个缺失的步骤，从而鉴定出该途径所需的所有组分。
在一些实施方式中，对厌氧细菌生物进行代谢工程化。本文使用的厌氧生物是生长不需要氧(即厌氧条件)的任何生物。有利地，细菌细胞可以是大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)、黄色短杆菌(B.Flavum)或乳糖发酵短杆菌(B.lactofermentum)细胞；目前这些菌株在工业上应用以使用细菌发酵法制造氨基化合物。例如，谷氨酸棒杆菌(C.Glutanicum)广泛用于生产氨基酸(例如，L-谷氨酸，L-赖氨酸，参见Eggleging L et al.，2005，Handbook forCorynebacterium glutanicum.Boca Raton，USA：CRC Press)
本发明的代谢工程化细胞是通过使用编码参与工程化代谢途径的酶的至少一个核苷酸序列转化宿主细胞而制成的。本文使用的术语“核苷酸序列”、“核酸序列”和“基因构建体”可互相交换使用，并且是指单链或双链的RNA或DNA聚合物，其任选包含合成、非天然或改变的核苷酸碱基。核苷酸系列可包含cDNA、基因组DNA、合成DNA或RNA的一个或多个片段。在优选的实施方式中，核苷酸序列经过密码子优化以反应宿主细胞的典型密码子使用，而不改变通过该核苷酸序列编码的多肽。在某些实施方式中，属于“密码子优化”或“密码子优化的”是指修饰核酸序列的密码子含量，而不修饰通过该核酸编码的多肽序列，从而增强具体宿主细胞中的表达。在某些实施方式中，该属于是指包括修饰核酸序列的密码子含量，作为控制多肽表达水平的方式(例如，增加或降低表达水平)。因此，本发明的一方面包括编码参与工程化代谢途径的酶的核酸序列。在一些实施方式中，代谢工程化细胞可表达具有实施下述步骤所必须的酶活性的一个或多个多肽。例如，具体细胞可包含一个、两个、三个、四个、五个或多于五个的核酸序列，每个核酸序列编码实施α-酮酸向双官能烷烃转化所必须的多肽。或者，单个核酸分析可编码一个或多于一个的多肽。例如，单个核酸分析可包含编码两个、三个、四个，乃至五个不同多肽的核酸序列。用于本文所述发明的核酸序列可以从多种途径获得，例如cDNA序列的扩增、DNA文库、从头合成、基因组区段切除。随后，可使用标准分子生物学和/或重组DNA技术修饰由此来源获得的序列，从而产生具有期望修饰的核酸序列。核酸序列的修饰的示例方法包括，例如定点突变、PCR突变、删除、插入、取代、使用限制性酶交换序列部分，任选与连接、同源重组、位点特异性重组或其各种组合进行组合。在其他实施方式中，核酸序列可以是合成的核酸序列。可以使用美国专利7,323,320、共同待审申请No.11/804,996，和美国专利公开Nos.1006/0160138和2007/0269870中描述的多种方法生产合成的多核苷酸序列。
用于转化细菌、植物和动物细胞的方法是本领域熟知的。常见的细菌转化方法包括电穿孔和化学修饰。
在一些实施方式中，基因修饰的宿主细胞经过基因修饰，从而在适合的培养基中进行体外培养时，产生水平在至少0.1g/l，至少1g/l或至少10g/l的目标产物或中间产物。应理解，可通过多种方式控制基因修饰的宿主细胞产生的目标产物或其代谢中间产物的水平。在一些实施方式中，通过编码参与工程化途径的一种或多种酶的核酸序列的拷贝数量控制表达的水平(例如，高拷贝表达载体与中或低拷贝表达载体)。优选使用载体将核酸序列引入细胞。地拷贝表达载体通常提供少于每细胞20个载体拷贝(例如每个细胞1至约5个，5至约10个，10至约15个，15至约20个拷贝的表达载体)。用于原核细胞的(例如大肠杆菌)适合的低拷贝表达载体包括但不限pAYC184、pBeloBac11、pBR332、pBAD33、pBBR1MCS及其衍生物、pSC101、SuperCos(粘粒)和pWE15(粘粒)。中拷贝数量的表达载体通常提供每细胞约20至约50个表达载体拷贝，或每细胞约20至80个表达载体拷贝。用于原核细胞的(例如大肠杆菌)适合的中拷贝表达载体包括但不限pTrc99A，pBAD24和包含ColE1复制起点及其衍生物的载体。高拷贝表达载体通常提供每细胞约80至约200或更多的表达载体拷贝。用于原核细胞的(例如大肠杆菌)适合的高拷贝表达载体包括但不限pUC、PCV1、pBluescript、pGEM和pTZ载体。
本发明的一方面提供了表达编码参与工程化途径的多肽的核酸或其子序列的表达盒。在一些实施方式中，所述表达盒可包含操作性地连接到转录元件(例如启动子)和终止子的核酸。本文使用的术语“盒”是指如果将具体基因插入以操作性地连接到存在于所述核苷酸序列中的一个或多个调控序列，即能够给表达所述基因的核苷酸序列。因此，例如表达盒可包含期望在宿主细胞中表达的杂合基因。在一些实施方式中，可通过已知的重组技术向载体中引入一个或多个表达盒。启动子是启动并控制RNA聚合酶转录期望核酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，启动子可以是诱导型。在一些实施方案中，启动子可以是组成型。用于原核宿主生物的适合的启动子的非限定性实例包括噬菌体T7RNA聚合酶启动子、trp启动子、lac操作子启动子等。用于原核宿主生物的适合的强启动子的非限定性实例包括lacUV5启动子、T5，T7，Trc，Tac等。用于真核宿主生物的适合的启动子的非限定性实例包括CMV立即早期启动子、HSV早期或晚期启动子、胸腺嘧啶激酶启动子等。终止控制区也可源自原产于优选宿主的多种基因。
在一些实施方式中，工程化途径的第一酶可以受到第一启动子的控制，而工程化途径的第二酶受到第二启动子的控制，其中所述第一和第二启动子具有不同的强度。例如，第一启动子可强于第二启动子，或者第二启动子可强于第一启动子。因此，通过增加第一酶的拷贝数量和/或通过提高与第一酶操作性连接的启动子的强度相对于与第二酶操作性连接的启动子的强度，可提高工程化途径中第一酶的水平相对于第二酶的水平。在一些其他实施方式中，工程化途径的多个酶受相同启动子的控制。在其他实施方式中，改变核糖体结合位点影响途径中不同酶的相对翻译和表达。改变核糖体结合位点能够单独使用，以控制途径中酶的相对表达，或者可以与同样影响基因表达水平的上述启动子修饰和密码子优化一起使用。
在示例性实施方式中，潜在途径酶的表达可依赖于反应混合物中途径酶作用底物的存在。例如，可通过培养基中A的存在诱导催化A向B转化的酶的表达。可通过添加导致诱导的化合物，或通过所述化合物在生物合成途径过程中的天然装配(例如，诱导物可以是生物合成过程中产生的中间产物，以产生期望的产物)诱导此途径酶的表达。
在一些实施方式中，可使用计算机参与的设计技术以产生用于产生目标有机分子的可选途径。在一些实施方式中，可使用包含有关基因组及其连接的信息的数据库来设计新的代谢途径。数据库的实例为MetaCyc(代谢途径和酶的数据库)、明尼苏达大学生物催化/生物降解数据库(微生物催化反应和有机化学化合物的生物降解途径的数据库)、LGAND(提供有关代谢物和其他化学化合物、体现代谢和其他反应的底物-产物相关性的信息，以及有关酶分子信息的复合数据库)。途径成分数据库还可包含预期的、假定的或未知功能的成分。其还可包含具有限定功能的假组分，其可具有不定的组成。在一些实施方式中，程序可设计位于公共域(例如，未被专利权覆盖和/或需要执照费的域)中调控和/或功能元件的组合。可产生可自由获得的基因元件的数据库和/或将其用作可组合的核酸序列的来源以产生可选途径。可设计、组装和/或测试包含已知的功能和/或调控元件(例如来自不同物种)的不同组合的可选途径。可使用包括酶元件区中变量的文库以确定不同类型的酶或相同酶的不同变体的相对作用。可使用包括酶元件区中变量的文库以确定一系列基因中的最优表达水平或调控水平。
可组装编码不同途径的核酸。在一些实施方式中，可通过使用适合的组装核酸转化宿主细胞或生物，并分析工程化生物的性质，从而在体内测试不同工程化途径的功能性质。在一些实施方式中，可通过分离由组装核酸表达的成分，并在体外系统中测试成分的适合组合，从而在体外测试不同工程化途径的功能性质。
I.用于生产2-酮酸(C5至C8)的工程化辅酶B合成途径
本发明的多个方面提供了经由辅酶B生物合成中α-酮酸链延长反应生产双官能正烷烃的新型工程化途径(参见图1)。如本文所用，α-酮酸或2-氧代酸或2-酮酸可互换使用，且设计包含靠近羧酸基团的酮官能团的有机酸。本文所用的辅酶B生物合成中的α-酮酸链延长反应(也称为2-氧代酸延长)是指将α-酮戊二酸(C5链)和乙酰辅酶A转化为α-酮辛二酸(C8链)、辅酶B的前体(7-巯基庚酰苏氨酸磷酸)和可能的生物素的生物合成途径。许多生物体可经由草酰乙酸合成α-酮戊二酸，此草酰乙酸经由酶PEP羧化酶从PEP产生或经由生物素依赖的酶丙酮酸羧化酶从丙酮酸产生。α-酮戊二酸是三羧酸循环(Krebs cycle)中重要的中间产物，且起到α-酮酸延长途径中原料的作用。α-酮酸延长辅酶B途径包括催化以下步骤的酶：
(1)α-酮戊二酸和乙酰辅酶A缩合形成高柠檬酸(通过高柠檬酸合成酶如AksA、NifV、Hcs、Lys 20/21的作用)
(2)通过起到中间产物作用的顺式高乌头酸的脱水和水合变为(2R，3S)高异柠檬酸(通过高乌头酸酶如AskD/E、LysT/U、Lys4，3-异丙基苹果酸脱水酶的作用)
(3)(2R，3S)高异柠檬酸氧化脱羧为α-酮己二酸(通过同分异构高柠檬酸脱氢酶如AksF、Hicdh、Lys12，2-氧代辛二酸合成酶、3-异丙基苹果酸脱水酶的作用)。
所得的α-酮己二酸(C6链)随后经历两个连续的α-酮酸链延长反应，以产生作为中间产物的α-酮庚二酸和α-酮辛二酸。由此一系列反应产生的α-酮辛二酸随后经历非氧化脱羧作用，以形成7-氧代庚酸(辅酶B的前体)。
α-酮酸延长途径的一个特征实例为詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)的辅酶B生物合成途径。在此途径中，图1中有三种酶催化步骤a-l。AksA(催化步骤a、e和i)是高柠檬酸合酶；AksD/E(催化步骤b、c、f、g、j、k)是AksD和AksE的异四聚体，且为高乌头酸酶；AksF(催化步骤d、h和l)是同分异构高柠檬酸脱氢酶。这些酶全部显示出催化反应步骤，且詹氏甲烷球菌AksD/E是目前唯一显示出催化两种水解酶反应的高乌头酸酶(Howell et al.，Biochem.，1998；Howell et al.，J.Bacteriol.，2000；Drevland etal.，JBC，2008)。应注意詹氏甲烷球菌是嗜热的产甲烷菌，且全部Aks酶已经在50-60℃得到表征。在一些实施方式中，可使用来自在37℃繁殖的其它产甲烷菌的Aks同源物。此类Aks同源物已被鉴定且包括海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)S2基因aksA(MMP0153)、MMP1480、MMP0381和aksF(MMP0880)。
从α-酮戊二酸(C5)起始的途径具有依赖于延长循环的数目的不同的以下中间产物：α-酮己二酸(C6)、α-酮庚二酸(C7)和α-酮辛二酸(C8)。因此，在本发明的一些方面中，依据所需产物的烃链长度(如C4、C5、C6、C7)，可能需要不延长(用于生产双官能丁烷)、仅单次延长循环(如步骤a至d，用于生产双官能戊烷)、两次延长(如步骤a至h，用于生产双官能己烷)或三次延长(如步骤a至l，用于生产双官能庚烷)。因此，应理解，根据烃链的长度，可希望最大化2-酮己二酸中间产物或酮庚二酸中间产物的利用率。在一些实施方式中，希望保持步骤a至d且消除步骤e至l，以最大化2-酮己二酸中间产物的利用率。在其它实施方式中，希望保持步骤a至h且消除步骤i至l，以最大化酮庚二酸中间产物的利用率。
如上所述，每个延长步骤包括三组酶：酰基转移酶或酰基转移酶同源物、高乌头酸酶或高乌头酸酶同源物，和同分异构高柠檬酸脱氢酶或同分异构高柠檬酸脱氢酶同源物。每个延长步骤的第一次反应由将酰基转化为烷基的酰基转移酶在转移时催化。在一些实施方式中，酰基转移酶是高柠檬酸合酶(EC2.3.3.14)。催化下列化学反应的高柠檬酸合酶：
Figure BPA00001422088200171
产物(R)-2-羟基丁烷-1，2，4-三羧酸也称为高柠檬酸。现已显示一些高柠檬酸合酶如AksA具有宽的底物范围且催化氧代己二酸和氧代庚二酸与乙酰辅酶A的缩合(Howell et al.，1998，Biochemistry，Vol.37，pp10108-10117)。本发明的一些方面提供了对酮戊二酸或酮戊二酸和酮己二酸具有底物特异性的高柠檬酸合酶。已知的优选高柠檬酸合酶为EC编号2.3.3.14。通常，用于选择适合的酶的方法可包括通过检索来自其它生物体的同源物在天然多样性中检索酶，和/或构建和检索人工多样性并选择具有所选酶特异性和活性的变体。候选高柠檬酸合酶、候选高乌头酸酶和候选同分异构高柠檬酸脱氢酶列在表1中。
表1
Figure BPA00001422088200172
Figure BPA00001422088200181
在一些实施方式中，途径的第一步被工程化为由高柠檬酸合酶NifV或NifV同源物催化。NifV的同源物存在于多种生物体中，包括但不限于棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)、圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)、弗兰克氏菌(Frankia sp.)(菌株FaC1)、鱼腥藻属(Anabaena sp.)(菌株PCC 7120)、巴西固氮螺菌(Azospirillumbrasilense)、巴斯德梭菌(Clostridium pasteurianum)、球形红假单胞菌(Rhodobacter sphaeroides)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、桤木弗兰克氏菌(Frankia alni)、生氢氧化碳嗜热菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)(菌株Z-2901/DSM 6008)、鱼腥藻属(Anabaena sp.)(菌株PCC 7120)、桤木弗兰克氏菌(Frankia alni)、成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)、胡萝卜软腐欧文氏菌马铃薯黑胫亚种(Erwinia carotovora subsp.Atroseptica)(黑胫病菌(Pectobacterium atrosepticum))、绿硫菌(Chlorobium tepidum)、固氮弧菌属(Azoarcus sp.)(菌株BH72)、格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌(Magnetospirillumgryphiswaldense)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)(菌株ORS278)、Bradyrhizobium sp.(菌株BTAi1/ATCC BAA-1182)、梭状芽孢杆菌(Clostridium kluyveri)(菌株ATCC 8527/DSM 555/NCIMB 10680)、梭状芽孢杆菌(菌株ATCC 8527/DSM 555/NCIMB 10680)、酪酸梭菌(Clostridiumbutyricum)5521、本土根瘤菌(Cupriavidus taiwanensis)(菌株R1/LMG19424)、Ralstonia taiwanensis(菌株LMG 19424)、肉毒杆菌(Clostridiumbotulinum)(菌株Eklund 17B/type B)、肉毒杆菌(菌株Alaska E43/type E3)、聚球藻(Synechococcus sp.)(菌株JA-2-3B′a(2-13))(Cyanobacteria bacteriumYellowstone B-Prime)、聚球藻(菌株JA-3-3Ab)(Cyanobacteria bacteriumYellowstone A-Prime)、硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)。已显示NifV使用酮戊二酸(酶促步骤a)和酮己二酸(酶促步骤e)作为底物，而未说明使用酮庚二酸作为底物(参见Zhenget al.，(1997)J.Bacteriol.Vol.179，pp5963-5966)。因此，包括高柠檬酸合酶NifV的工程化的2-酮-延长途径消除了2-酮延长途径中的步骤i至l，且最大化了2-酮庚二酸中间产物的利用率。
在一些实施方式中，途径的第一步被工程化以被高柠檬酸合酶Lys 20或Lys 21催化。Lys 20和Lys 21为与酿酒酵母中赖氨酸生物合成途径第一步有关的两种高柠檬酸合酶同工酶。Lys 20或Lys 21的同源物存在于多种生物体如树干毕赤酵母(Pichia stipitis)和极端嗜热菌(Thermus thermophilus)中。Lys20和Lys 21酶已显示出使用酮戊二酸作为底物，但不使用酮己二酸或酮庚二酸。因此，包括Lys20/21的工程化的2-酮延长途径消除了2-酮延长途径中的步骤e至l，且最大化了2-酮己二酸的利用率。在一些实施方式中，使用催化涉及乙酰辅酶A和α-酮酸作为底物的反应的酶将α-酮酸转化为高柠檬酸(如EC 2.3.3.-)。产甲烷太古菌包含三种紧密相关的AksA同源物：2-异丙基苹果酸合酶(LeuA)和将乙酰辅酶A与丙酮酸缩合的柠苹酸(2-甲基马来酸)合酶(CimA)。认为此酶参与产甲烷菌和可能地其它缺少苏氨酸脱水酶的物种中异亮氨酸的生物合成。在一些实施方式中，乙酰转移酶是异丙醇(isopromylate)合酶(如LeuA，EC 2.3.3.13)或柠平酸合酶(如CimA，EC2.3.1.182)。
酮延长途径的第二步由高乌头酸酶催化。高乌头酸酶催化水合和脱水反应：
Figure BPA00001422088200201
Figure BPA00001422088200202
在一些实施方式中，高乌头酸酶为AksD/E、lysT/U或lys4或它们的同源物或变体。高乌头酸酶AksD/E和lysT/U已显出处分别由两种多肽AksD和AksE，以及lysT和lysU组成。
每个酮延长循环的最后一步由同分异构高柠檬酸脱氢酶催化。同分异构高柠檬酸脱氢酶(如EC 1.1.1.87)是催化化学反应的酶。
Figure BPA00001422088200203
Figure BPA00001422088200204
在一些实施方式中，高柠檬酸脱氢酶包括但不限于AksF、Hicdh、lys12和LeuB(EC1.1.1.85)。LeuB为3-异丙基苹果酸脱氢酶(EC1.1.1.85)(IMDH)，且催化细菌和真菌中亮氨酸生物合成的第三步，即将3-异丙基苹果酸氧化脱羧为2-氧代-4-甲基戊酸。已显出2-酮异戊酸通过亮氨酸生物合成途径中LeuA(2-异丙基苹果酸合酶)、LeuC、LeuD(3-异丙基苹果酸异构酶复合物)和LeuB(3-异丙基苹果酸脱氢酶)的第三步骤延长循环被转化为2-酮异己酸。人们应理解这些酶具有广泛的底物特异性(如Zhang et al.，(2008)，P.N.A.S)且可催化α-酮酸延长反应。在一些实施方式中，LeuA、LeuC、LeuD和LeuB催化α-酮戊二酸向α-酮己二酸的延长和α-酮己二酸向α-酮庚二酸的延长。
II.用于从α-酮酸(C5至C8)生产双官能烷烃(C4至C7)的工程化途径
如图2所示，有若干使用重组微生物从α-酮酸生产双官能烷烃的潜在途径。本发明的多个方面涉及将α-酮中间产物生物转化为双官能丁烷、双官能戊烷、双官能己烷、双官能庚烷分子。目的双官能丁烷分子包括但不限于1，4-丁烷二醇、1-羟基丁酸、琥珀酸、1，4-二氨基丁烷、4-氨基丁醛和4-氨基丁醇。目的双官能戊烷分子包括但不限于1-羟基戊酸、1，5-戊二醇、戊二酸、尸胺(戊烷-1，5-二胺)、5-氨基戊醛和5-氨基戊醇。目的双官能己烷分子包括但不限于1-羟基己酸、1，6-己二醇、己二酸、六亚甲基二胺、氨基己酸、6-氨基己醛和6-氨基己醇。目的双官能庚烷分子包括但不限于1-羟基庚酸、1，7-庚二醇、庚二酸、1，7-二氨基庚烷、7-氨基庚醛和7-氨基庚醇。
在一些实施方式中，用于生产双官能烷烃的第一潜在途径包括第一α-酮酸脱羧(酶促步骤I)。本发明的一些步骤公开了通过非氧化脱羧去除羧基。这可通过在宿主细胞中表达具有基本类似于α-酮酸脱羧酶的生物活性的蛋白以产生羧酸半醛来实现。术语“α-酮酸”(KDCs)是指催化α-酮酸转化为羧酸半醛和二氧化碳的酶。已知特别感兴趣的一些KDCs为以下EC编号：EC4.1.1.1；EC 4.1.1.80、EC 4.1.1.72、4.1.1.71、4.1.1.7、4.1.1.75、4.1.1.82、4.1.1.74(参见下表2)。一些KDCs具有广泛的底物范围，然而其它KDCs的底物特异性更高。KDCs可商购自很多来源，包括但不限于酿酒酵母和细菌。在一些示例性实施方式中，所用的KDCs包括但不限于来自乳酸乳球菌(UniProtQ684J7)的KivD、来自酿酒酵母的ARO10(UniProt Q06408)、来自酿酒酵母的PDC1(UniProt P06169)，PDC5(UniProt P16467)，PDC6(UniProt P26263)，Thi3、来自结核分枝杆菌(M.tuberculosis)(UniProt 50463)的kgd、来自荧光假单胞菌(P.putida)(UniProt P20906)的mdlc、来自绿脓杆菌(P.aeruginosa)(UniProt AAG08362)的arul、来自威德摩尔链德菌(S.wedmorensis)(UniProtQ56190)的fom2、来自梭菌属Clostridium acetobutyculum的Pdc、来自阴沟肠杆菌(E.coacae)(UniProt P23234)的ipdC、或来自相同或其它微生物物种的任何同源蛋白质。在一些实施方式中，酮酸脱羧酶为EC编号EC 4.1.1.1的丙酮酸脱羧酶。丙酮酸脱羧酶为催化丙酮酸脱羧为乙醛和二氧化碳的酶。丙酮酸脱羧酶可商购自很多来源，包括但不限于酿酒酵母和细菌(参见美国专利20080009609，其通过引用并入)。在一些实施方式中，α-酮酸脱羧酶为自然催化α-酮异戊酸转化为异丁醛和二氧化碳的α-酮异戊酸脱羧酶KivD。在一些实施方式中，α-酮酸脱羧酶为支链α-酮酸脱羧酶(EC编号4.1.1.72)。人们应理解因为一些KDCs已显示出具有广泛的底物范围，所以当选择基因来源时要重要考虑底物特异性。因此，在一些实施方式中，将丙酮酸脱羧酶工程化，以显示出相比于丙酮酸更优选α-酮辛二酸、α酮庚二酸、α酮己二酸或α酮戊二酸。优选地，相比于丙酮酸，工程化的酶显示出增加至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍。
在优选实施方式中，重组宿主细胞中表达的KDC催化α-酮辛二酸转化为庚二酸半醛、或α-酮庚二酸转化为己二酸半醛、或α-酮己二酸转化为戊二酸半醛、或α-酮戊二酸转化为琥珀酸二醛。
在一些实施方式中，羧酸半醛(如琥珀酸半醛、戊二酸半醛、己二酸半醛和/或庚二酸半醛)通过将醛官能团转化为醇官能团的醇脱氢酶被转化为羟基羧酸(羟基丁酸、羟基戊酸、羟基己酸、羟基庚酸)(酶促步骤1，图2)。醇脱氢酶(ADHs)(EC 1.1.1.1和EC 1.1.1.2)催化酮和醛向醇的可逆还原(NAD+向NADH的还原)。在一些实施方式中，醇脱氢酶包括但不限于adhA或adhB(来自运动发酵单胞菌(Z.mobilis))，丁醇脱氢酶(来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum))、丙二醇氧化还原酶(来自大肠杆菌)和ADHIV醇脱氢酶(来自酵母属Saccharomyces)、或ADH6(来自酿酒酵母S.cerevisiae)。
在一些实施方式中，使用醇脱氢酶或醛脱氢酶(酶促步骤2，图2和图3)将氢羧酸脱氢，以产生烷二醇如1，4-丁二醇、1，5-戊二醇、1，6-己二醇和/或1，7-庚二醇。
醛NAD(+)脱氢酶活性和醇NAD(+)脱氢酶活性可通过两种不同的多肽来进行，或通过单独多肽如来自大肠杆菌(Goodlove等.Gene 85：209-14，1989；GenBank登录号M33504)的的多官能醛-醇脱氢酶(EC 1.2.1.10)来进行。具有醛脱氢酶(NAD(P)+)(EC 1.2.1.-)或醛脱氢酶(NAD(+))(EC 1.2.1.3)活性的多肽可与醇脱氢酶组合使用，以将剩余的羧酸还原为醇，产生烷二醇。编码此类多肽的核酸可获得自不同物种，包括但不限于酿酒酵母。
在其它实施方式中，羧酸半醛(如琥珀酸半醛、戊二酸半醛、己二酸半醛、庚二酸半醛)通过使用醛脱氢酶被转化为二羧酸(酶促步骤3，图2和图3)，如己二酸、琥珀酸、戊二酸和/或庚二酸。
在本发明的一个方面中，初始α-酮酸脱羧步骤后为用于生产氨基羧酸的1-氨基转移酶酶促步骤(酶促步骤4，图2和图3)。特别地，可使用此工程化途径合成的感兴趣的产物包括氨基己酸、氨基丁酸、氨基庚酸和/或氨基戊酸。在一些实施方式中，酶促步骤4包括羧酸半醛氨基转移酶。具有羧酸半醛氨基转移酶活性的酶商购自许多来源，包括但不限于枯草杆菌、酿酒酵母、智人(H.sapiens)、黄木香(F.lutescens)、棒状链霉菌(S.clavuligerus)。能够催化氨基转移酶反应的示例性酶为鸟氨酸-氧代-酸转氨酶(来自枯草杆菌的rodD、来自智人的OAT、EC 2.6.1.13)、精氨酸-降解酶鸟氨酸转氨酶(EC2.6.1.13)、来自黄木香或棒状链霉菌的赖氨酸-氨基转移酶(EC 2.6.1.36)、小鼠(Mus musculus)4-氨基丁酸氨基转移酶(EC 2.6.1.19)、欧洲中部野猪(Susscrofa)4-氨基丁酸氨基转移酶(EC 2.6.1.19)、酿酒酵母4-氨基丁酸氨基转移酶(EC 2.6.1.19)、酵母氨酸脱氢酶LYS9和LYS1(分别为EC 1.5.1.10和1.5.1.7)、或来自相同或其它微生物物种的任何同源蛋白。
用于生产感兴趣的二氨基烷烃或氨基醇的两种潜在途径包括使用醛脱氢酶(酶促步骤5，图2和图3)、随后使用酶促步骤6或酶促步骤7将氨基羧酸转化为氨基-醛。在另一个实施方式中，可用2-氨基脱羧酶(酶促步骤8)处理2-氨基二羧酸，产生氨基羧酸。在一些实施方式中，酶促步骤8之后为由醛脱氢酶(酶促步骤5)催化的脱氢步骤。所得的氨基醛代谢物额可用作两种不同酶促步骤的底物。酶促步骤6包括1-氨基转移酶，且催化氨基-醛转化为二氨基烷烃。或者，包括醇脱氢酶的酶促步骤7催化氨基-醛转化为氨基-醇。酶促步骤6包括氨基转移酶，且产生二氨基烷烃，如六亚甲基二胺(HDD)，尸胺(或五亚甲基二胺)，二氨基丁烷和/或二氨基庚烷。酶促步骤7包括醇脱氢酶，并产生氨基丁醇，氨基戊醇，氨基己醇(或6羟基六
Figure BPA00001422088200241
6HH)和氨基庚醇。
第二种潜在途径包括第一2-氨基转移酶(酶促步骤II，图2和图3)，产生2氨基二羧酸。表现氨基转移酶活性的感兴趣的优选候选基因包括但不限于lysN(编码来自嗜热菌(T.thermophilus)EC 2.6.1.7的α-氨基己二酸氨基转移酶)和同源物(如kat2)；aadat(编码沟鼠(R.norvegicus)中的氨基己二酸氨基转移酶，EC 2.6.1.39)、AADAT(编码智人中的氨基己二酸氨基转移酶)。具有氨基转移酶活性的其它酶包括但不限于ddh(来自谷氨酸棒杆菌，编码间二氨基庚二酸D-脱氢酶，EC 1.4.1.16)和dapdh(来自Lysinibacillussphaericus，编码间二氨基庚二酸脱氢酶，EC 1.4.1.16)。表现氨基庚二酸脱羧酶活性的候选基因包括但不限于谷氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.15)，如gadA/B，编码大肠杆菌中的同种型A或同种型B、GAD1(来自酿酒酵母)、GAD1/2(来自拟南芥(A.thaliana))、GAD1/2(来自智人)和它们的同源物或二氨基庚二酸脱羧酶，如LysA(EC 1.1.1.20，来自大肠杆菌或枯草杆菌)或AT5G11880(来自拟南芥)或AT3G14390(来自拟南芥A.thaliana)。
III.用于从α-酮庚二酸生产C6双官能烷烃的工程化途径
本发明的多个方面涉及用于生产感兴趣的C6双官能烷烃的工程化途径。特别地，本发明的多个方面涉及生产己二酸，氨基己酸(己内酰胺酸的稳定前体)、六亚甲基二胺和6-羟基己酸(图3)。人们应理解对于生物生产C6双官能烷烃，希望去除步骤i至l，以最大化用于生物转化为己二酸半醛的2-酮庚二酸的利用率(步骤m)。在一些实施方式中，AksA被NifV替代，其是一种来自棕色固氮菌(A.vinelandii)，且已显示出对2-酮戊二酸和2-酮己二酸均起作用但对2-酮庚二酸不起作用的酶(Howell et al.，Biochem.，1998；Howell et al.，J.Bacteriol.，2000；Drevland et al.，JBC，2008)。此替代将在2-酮酸延长途径中消除步骤i至l。应理解，根据所需产物的烃链的长度，可仅需要单次延长循环(如步骤a-d)。在一些示例性实施方式中，戊二酸(一种普通塑化剂和聚酯的前体且具有式HO2C(CH2)3CO2H(也称为戊二酸))可从2-酮戊二酸生物生产，此2-酮戊二酸经历单次延长循环以产生酮己二酸。戊二酸用在聚酯如聚酯多元醇和聚酰胺的生产中。在一些实施方式中，为了能够进行单次延长循环，Hcs和Lys20/21酶(来自酿酒酵母和嗜热菌的赖氨酸生物合成途径)能够消除步骤e-l，以最大化用于生物生产戊二酸的2-酮己二酸的效率。
A.用于生产己二酸的工程化途径
1.己二酸的综述：
在2005年，全球对己二酸的需要为百万公吨。历史上，对己二酸的需要每年增加2％，且预计到2009年增加2-3％。己二酸连续排名美国生产的50种化学品之一。约90％的国产己二酸被用于生产尼龙-6，6。己二酸的其它用途包括生产润滑剂树脂、聚酯多元醇和塑化剂，以及作为食品酸化剂。
有三种主要的商业生产方法：环己烷方法、环己醇方法、丁二烯羰基化方法。用于合成己二酸的主要工业化方法最初对环己烷进行空气氧化以产生被称为KA(参见如美国专利第5,221,800号)的环己酮(酮)和环己醇(醇)的混合物。虽然此方法占全部己二酸生产的2％，但商业上使用也酚加氢生产KA。经由两种方法生产的KA被硝酸氧化以生产己二酸。还原的氮的氧化物(包括NO2、NO和N2O)作为副产物产生且以不同程度变回硝酸。工业上和环境工程师越来越感兴趣使用非合成的生物途径生产己二酸。已描述了大量微生物途径。野生型和突变的生物体已显示出将可再生的原料如葡萄糖和其它烃转化为己二酸(参见如WO9507996以及美国专利5,272,073、US5,487,987和US 5,616,496)。类似地，具有腈水解酶活性的生物体已显示出将腈转化为包括己二酸在内的羧酸(参见如美国专利第5,629,190号)。此外，野生型生物体已被用于将环己烷和环己醇和其它醇转化为己二酸(参见如美国专利6,794,165；和美国专利申请2003087403和20020127666)。例如，在一个酶促途径中，环己醇被转化为己二酸，此酶促途径包括分离自不动杆菌属(Acinetobacter)且编码羟基酰基辅酶A脱氢酶、烯酰基辅酶A水合酶、酰基辅酶A脱氢酶、泛醌氧化还原酶、一氧化物酶、醛脱氢酶的基因。已提示用于将环己醇转化为己二酸的另一种酶促途径包括中间产物环己醇、环己酮、2-羟基环己酮、ε-己内酯、6-羟基己酸。已表明了此途径中的一些特定酶活性，包括环己醇脱氢酶、NADPH-连接的环己酮加氧酶、ε-己内酯水解酶和NAD(NADP)-连接的6-羟基己酸脱氢酶(Tanaka et al.，Hakko KogakuKaishi(1977)，55(2)，62-7)。已推测其它酶促途径包括环己醇，环己酮，1-氧代-2-氧代环庚烷，6-羟基己酸，6-氧代己酸和己二酸(Donoghue et al.，Eur.JBiochem.，1975，60(1)，1-7)。
因此，待解决的问题提供一种己二酸的合成途径，此途径不仅避免依赖环境敏感的原料如石油，而且有效利用非石化的、便宜的、可再生的来源。进一步希望提供一种己二酸的合成途径，此途径避免需要显著的能量输入，且最小化毒性副产物的形成。
2.经由α-酮庚二酸途径的己二酸生物生产
本发明的一些方面涉及2-酮庚二酸脱羧为己二酸半醛(或6-氧代己酸)和己二酸半醛脱氢产生己二酸。在一些实施方式中，筛选用于候选2-酮庚二酸脱羧酶的全部公布的MetaCyc脱羧酶反应。基于标准(i)2-酮羧酸的所示活性和(ii)蛋白序列信息的可用性来产生酶和活性的列表(参见表2)。在一些实施方式中，在表2所列的酶中，筛选在所提议的工程化途径中对全部2-酮酸(即2-酮庚二酸、2-酮己二酸和2-酮戊二酸)具有脱羧酶活性的酶。
表2
Figure BPA00001422088200281
Figure BPA00001422088200291
在优选实施方式中，己二酸半醛向己二酸(步骤n)的转化使用ChnE酶或ChnE酶的同源物催化。ChNE是NADP+-连接的6-氧代己酸脱氢酶，且已显示出催化不动杆菌属的环己醇降解中6-氧代己酸脱氢成为己二酸(参见Iwakiet al.，Appl.Environ.Microbiol.1999，65(11)：5158-5162)。在另一个实施方式中，α-酮戊二酸半醛脱氢酶(EC 1.2.1.26，如AraE)将己二酸半醛转化为己二酸。
B.用于生产己内酰胺的工程化途径
1.己内酰胺综述
己内酰胺主要用于生产合成纤维，特别是用在鬃刷、织物硬化剂、膜涂料、人造革、塑料、塑化剂、载体(vehicles)、聚氨酯的交联中的尼龙6，和赖氨酸的合成。世界上每年生产月25亿吨尼龙6。尼龙6的生产通过单体ε-己内酰胺的开环聚合完成。用于生产ε-己内酰胺的化学原料时被转化为环己烷或苯酚的苯，且或者化学品经由环己酮被转化为环己酮肟，随后此中间产物在硫酸中加热。因此，待解决的问题提供一种己酸的合成途径，此途径不仅避免依赖环境敏感的原料如石油，而且有效利用非石化的、便宜的、可再生的来源。进一步希望提供一种己酸的合成途径，此途径避免需要显著的能量输入，且最小化毒性副产物的形成。
用于生产己内酰胺的工程化途径
本发明的多个方面涉及从α-酮庚二酸生物生产氨基己酸的两种工程化途径。第一种潜在途径包括第一酮庚二酸氨基转移酶(酶促步骤II，图2和图3)，随后氨基庚二酸脱羧酶(酶促步骤8)。表现酮庚二酸氨基转移酶活性的感兴趣的候选基因包括但不限于lysN(编码来自嗜热菌EC 2.6.1.7的α-氨基己二酸氨基转移酶)和同源物(如kat2)；aadat(编码R.norvegicus中的氨基己二酸氨基转移酶)和AADAT(编码智人中的氨基己二酸氨基转移酶)。基于标准(i)在戊二酸存在下2-酮庚二酸向2-氨基庚二酸潜在转化和(ii)蛋白序列信息的可用性来产生候选酶和活性的列表(参见表3)。
表3
Figure BPA00001422088200301
Figure BPA00001422088200311
表达氨基庚二酸脱羧酶活性的候选基因包括但不限于谷氨酸脱羧酶(gadA/B，编码大肠杆菌(E.Coli)中的同种型A或同种型B、酿酒酵母中的GAD1、拟南芥中的GAD1/2、智人中的GAD1/2)和它们的同源物。基于标准(i)在戊二酸存在下2-氨基庚二酸向6-氨基己酸潜在转化和(ii)蛋白序列信息的可用性来产生候选酶和活性的列表(参见表4)。
表4
第二种潜在途径包括第一酮庚二酸脱羧酶(酶促步骤I)，随后己二酸半醛氨基转移酶(酶促步骤4)。
在一些实施方式中，催化脱羧的酶为KivD酶(如上所述)或KivD酶的同源物。在一些实施方式中，第二工程化途径中所用的己二酸半醛氨基转移酶包括但不限于鸟氨酸-氧代-酸转氨酶(来自枯草杆菌的rodD、来自智人的OAT，EC 2.6.1.13)、精氨酸-降解酶鸟氨酸转氨酶(EC 2.6.1.13)、来自黄木香或棒状链霉菌的赖氨酸-氨基转移酶(EC 2.6.1.36)、小鼠4-氨基丁酸氨基转移酶(EC 2.6.1.19)、欧洲中部野猪4-氨基丁酸氨基转移酶(EC 2.6.1.19)、酿酒酵母4-氨基丁酸氨基转移酶(EC 2.6.1.19)、酿酒酵母酵母氨酸脱氢酶LYS9和LYS1(分别为EC 1.5.1.10和1.5.1.7)，或或来自相同或其它微生物物种的任何同源蛋白。
表5
Figure BPA00001422088200331
Figure BPA00001422088200341
C.用于生产六亚甲基二胺(HMD)的工程化途径
本发明的多个方面涉及从α-酮庚二酸生物生产六亚甲基二胺的工程化途径。六亚甲基二胺最常用于生产尼龙6，6、Nylon 6，10、Nylon 6，66。尼龙6，6和Nylon 6，10可制成各种种类的尼龙树脂和尼龙纤维。
图2和3所示的第一工程化途径包括在上述氨基己二酸工程化途径中的2-酮庚二酸向氨基己酸的第一脱羧(酶促步骤I，随后为酶促步骤4，或酶促步骤II，随后为酶促步骤8)。在一些实施方式中，醛脱氢酶被表达并催化氨基己酸转化为6-氨基己醛中间产物(酶促步骤5)，且1-转氨酶被表达并催化6-氨基己醛转化为HMD(酶促步骤6)。或者，工程化途径包括上述脱氢和氨基转移酶促反应之前的磷酸化步骤(使用激酶)。人们应理解磷酸化步骤和脱氢步骤类似于磷酸化步骤(由天冬氨酸激酶EC 2.7.2.4催化)，和赖氨酸途径中参与天冬氨酸半醛合成的脱氢步骤(由EC 1.2.1.11酶催化)。
根据第二工程化途径，由α-酮庚二酸产生的2-氨基庚二酸(酶促步骤II，图3)向六亚甲基二胺的转化由步骤9、10或11和12组成，其合并在赖氨酸生物合成IV途径中表征的酶或同源酶。此途径包括将以下底物向产物的转化：
酶促步骤9：2-氨基庚二酸至2-氨基-7-氧代庚酸(或2氨基庚二酸7半醛)，由如氨基己二酸还原酶或同源酶(如Sc-Lys2，EC 1.2.1.31)催化；
酶促步骤10或11：氨基-7-氧代庚酸至2，7-二氨基庚酸，由如酵母氨酸脱氢酶(如Sc-Lys9，EC 1.5.1.10或Sc-Lys1，EC 1.5.1.7)催化；
酶促步骤12：1，7-di氨基庚酸至六亚甲基二胺，由如赖氨酸脱羧酶或鸟氨酸脱羧酶催化。
人们应理解从α-酮己二酸起始，类似的途径将导致尸胺的产生。
D.用于生产6-羟基己酸(6HH)的工程化途径
本发明的一个方面公开了从己二酸半醛(上述己二酸工程化途径的中间产物)生物生产6-羟基己酸(6HH)的工程化途径。6HH是可环化为己内酯或直接聚合以产生聚酯塑料(聚羟基烷酸PHA)的6-碳羟基烷酸。在一些实施方式中，己二酸半醛通过简单的加氢被转化为6HH，且此反应被醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)催化。此酶属于氧化还原酶家族，特别是那些通过受体NAD+或NADP+作用于供体CH-OH基团的那些。在一些实施方式中，使用催化以下化学反应的6-羟基己酸脱氢酶(EC 1.1.1.258)。
Figure BPA00001422088200361
其它醇脱氢酶包括但不限于adhA或adhB(来自运动发酵单胞菌)、丁醇脱氢酶(来自Clostridium acetobutylicum)、丙二醇氧化还原酶(来自大肠杆菌和ADHIV醇脱氢酶(来自酵母属)。
E.用于生产1，6-己二醇的工程化途径
本发明的一个方面公开了从己二酸半醛(上述己二酸工程化途径的中间产物)生物生产1，6-己二醇的工程化途径。1，6-己二醇是化工中有价值的中间产物。其应用于各种聚合物的合成，如用于生产聚氨酯弹性体和聚合塑化剂的聚酯，且也用在汽油精制中。
在一些实施方式中，己二酸半醛通过醇脱氢酶(酶促步骤1，图2)被转化为6-羟基己酸，且随后通过醇脱氢酶或醛脱氢酶(酶促步骤2，图2)的作用被转化为1，6-己二醇。
醇脱氢酶(ADHs)(EC 1.1.1.1和1.1.1.2)催化酮和醛向醇的可逆还原以及NAD+向NADH的还原。在一些实施方式中，醇脱氢酶包括但不限于adhA或adhB(来自运动发酵单胞菌)，丁醇脱氢酶(来自Clostridiumacetobutylicum)、丙二醇氧化还原酶(来自大肠杆菌)和ADHIV醇脱氢酶(来自酵母属)、或ADH6(来自酿酒酵母)。
醛NAD(+)脱氢酶活性和醇NAD(+)脱氢酶活性可通过两种不同的多肽来进行，或通过单独多肽如来自大肠杆菌(Goodlove等.Gene 85：209-14，1989；GenBank登录号M33504)的的多官能醛-醇脱氢酶(EC 1.2.1.10)来进行。具有醛脱氢酶(NAD(P)+)(EC 1.2.1.-)或醛脱氢酶(NAD(+))(EC 1.2.1.3)活性的多肽以及编码此多肽的核酸可从包括但不限于酿酒酵母的各种物种获得。
F.用于生产6氨基己醇的工程化途径
在一些实施方式中，Cnω-氨基醇可通过偶联γ-氨基丁醛脱氢酶(EC1.2.1.3或1.2.1.19或1.2.1.47)和醇脱氢酶从Cn末端氨基酸产生，其中碳的数量在4和7之间。在优选实施方式中，6-氨基己醇通过偶联γ-氨基丁醛脱氢酶(EC 1.2.1.3或1.2.1.19或1.2.1.47)和用于氨基己酸的代谢途径的上述醇脱氢酶从氨基己酸产生。
IV.用于从α-酮酸(C5至C8)生产双官能烷烃(C5至C8)的工程化途径
如图5所示，有若干使用重组微生物从α-酮酸(Cn)源生产双官能烷烃(Cn)的潜在途径。本发明的多个方面涉及将α-酮中间产物生物转化为双官能戊烷、双官能己烷、双官能庚烷、双官能辛烷分子。感兴趣的双官能戊烷分子包括但不限于1-羟基戊酸、1，5-戊烷二醇、戊二酸、尸胺(戊烷-1，5-二胺)、5-氨基戊醛和5-氨基戊醇。目的双官能己烷分子包括但不限于1-羟基己酸、1，6-己二醇、己二酸、六亚甲基二胺、氨基己酸、6-氨基己醛和6-氨基己醇。感兴趣的双官能庚烷分子包括但不限于1-羟基庚酸、1，7-庚烷二醇、庚二酸、1，7-二氨基庚烷、7氨基庚醛和7-氨基庚醇。感兴趣的双官能辛烷分子包括但不限于1，4-辛烷二醇、1-羟基辛酸、辛酸、1，4-二氨基辛烷、4-氨基辛醛和4-氨基辛醇。
本发明的一个方面涉及用于生产双官能烷烃的工程化途径，其包括上述2-氨基转移酶(酶促步骤II)。根据第一工程化途径，由α-酮酸Cn向双官能Cn烷烃转化由酶促步骤II、21、22、23和上述步骤5、6和7组成，此步骤包括以下酶和向产物转化的底物：
●酶促步骤II：α-酮酸Cn至2氨基1，n-二羧酸，由如2-氨基转移酶或同源物酶(如lysN(EC 2.6.1.7)、kat2；aadat和AADAT)催化。
●酶促步骤21：2氨基1，n-二羧酸至(n-1)-氨基-n-氧代羧酸，由如氨基醛脱氢酶催化。
●酶促步骤22：(n-1)-氨基-n-氧代羧酸至(n-1)-氧代-n-氨基羧酸，由2-氨基醛变位酶催化。在示例性实施方式中，氨基醛变位酶为谷氨酸-1-半醛2，1-氨基变位酶(EC 5.4.3.8)。谷氨酸-1-半醛2，1-氨基变位酶(GSAM)已描述在卟啉生物合成途径中，且催化(S)-4-氨基-5-氧代戊酸向5-氨基乙酰丙酸的反应。
在一些实施方式中，氨基醛变位酶包括来自thermosynechococcuselongates、来自嗜热菌和来自超嗜热古菌(aeropyrum pernix)(gene heml)的谷氨酸-1-半醛2，1-氨基变位酶，以及由如聚球藻的gsa基因形式编码的多肽。
●酶促步骤23：(n-1)氧代-n-氨基羧酸至n-氨基羧酸，由三种酶催化：脱氢酶(步骤23a)将酮基转化为仲醇基。脱氢之后是脱水，其由催化仲醇基转化为烯烃(步骤23b)的脱水酶和由催化烯烃转化为烷烃(步骤23c)的脱氢酶催化。
●酶促步骤5：n-氨基羧酸至n-氨基醛，由醛脱氢酶(如EC 1.2.1.3)、随后由酶促步骤6或酶促步骤7催化。
●酶促步骤6：n-氨基羧酸至n氨基醇，由醇脱氢酶如醇脱氢酶(EC1.1.1.1和EC 1.1.1.2)催化。
●酶促步骤7：n-氨基醛至1，n-二氨基烷，由1-氨基转移酶催化。
本发明的另一个方面涉及用于从相同长度(C5至C8)的α-酮酸生物生产感兴趣的双官能烷烃(C5至C8)的第二途径。第二工程化途径包括第一α-酮去除步骤(酶促步骤III)。在一些实施方式中，酮去除为三步酶促反应，包括脱氢酶催化酮基团向仲醇转化；脱水酶催化仲醇向烯烃转化，和脱氢酶催化烯烃向烷烃转化。在示例性实施方式中，己二酸通过第一脱氢酶、脱水酶和第二脱氢酶的共同活性由α-酮己二酸合成。在一些实施方式中，第一和第二脱氢酶相同。
在一些实施方式中，脱氢酶为3-氧代酰基-[酰基-载体蛋白]还原酶(EC1.1.1.100)，期显示出催化脂肪酸生物合成超途径中的以下反应：
在一些实施方式中，脱氢酶为β-酮酰基-[酰基-载体蛋白]还原酶(来自大肠杆菌(E.Coli)的FabG基因)、脂肪酸合酶(来自酿酒酵母的Fas2基因)或脂肪酸合酶(来自智人的FASN基因)。
在一些实施方式中，脱水酶为3-羟基辛酰基-[酰基-载体蛋白]脱水酶(EC4.2.1.59)，其催化以下反应：
Figure BPA00001422088200392
3-羟基辛酰基-[酰基-载体蛋白]脱水酶包括但不限于来自菠菜(Spinaciaoleracea)的3-羟基酰基-ACP脱水酶、β-羟基酰基-ACP脱水酶(来自大肠杆菌的FabA基因)、β-羟基酰基-ACP脱水酶(来自大肠杆菌的FabZ基因)。
在一些实施方式中，第二脱氢酶为烯酰基酰基载体蛋白还原酶(EC1.3.1.9)，如显出出催化以下反应的烯酰基-ACP还原酶(来自大肠杆菌的fabI基因)。
在一些实施方式中，第一和第二脱氢酶为相同的(脂肪酸合酶(来自酿酒酵母的Fas2基因或来自智人的FASN基因)。
双官能烷烃生产包括酶促步骤30，随后为取决于感兴趣的代谢物或终产物的不同的酶促步骤。用于生产n-羟基羧酸和1，n-烷二醇的生物工程化途径包括一种或多种醇和/或醛脱氢酶。在一个实施方式中，如下所述以及图4和图5所示，工程化途径包括酶促步骤30，随后为酶促步骤1和2，或酶促步骤30，随后为酶促步骤31。在一些实施方式中，用于生产n-氨基羧酸、n-氨基醛、n-氨基醇或1，n-二氨基烷烃的生物工程化途径包括一种或多种氨基转移酶(酶促步骤4和6)、醛脱氢酶(酶促步骤5)和醇脱氢酶(酶促步骤7)。在示例性实施方式中，氨基己酸通过包括醛脱氢酶(酶促步骤30)和随后氨基转移酶(酶促步骤4)的工程化途径从6-氧代己酸产生。随后，氨基己酸可通过醛脱氢酶(酶促步骤5)和随后的氨基转移酶(酶促步骤6)被转化为六亚甲基二胺。酶促步骤和底物向产物的转化列在下方且在图4和图5中示出：
●酶促步骤30：二羧酸至羧酸半醛，由醛脱氢酶催化；
●酶促步骤1：羧酸半醛至羟基l羧酸，由醇脱氢酶催化；
●酶促步骤2：羟基羧酸至1，n，烷二醇，由醛脱氢酶或醇脱氢酶催化。
●酶促步骤31：羧酸半醛至1，n-烷二醇，由醛脱氢酶或醇脱氢酶催化。
●酶促步骤4：羧酸半醛至n-氨基羧酸至n-氨基醛，由醛脱氢酶催化；
●酶促步骤6：n-氨基醛至1，n，二氨基醛，由1-氨基转移酶催化；
●酶促步骤7：n-氨基醛至n-氨基醇，由醇脱氢酶催化。
筛选技术
根据本文所述的方法，可在允许细胞生长和/或孵育的任何容器中进行用于途径开发的反应混合物。例如，反应混合物可为生物反应器、细胞培养烧瓶或板、多孔板(如96、384、1056孔微滴定板等)、培养烧瓶、发酵器、或用于细胞培养或孵育的其它容器。
筛选可通过检测选择型标记的表达来进行，此标记在一些遗传环境中允许细胞表达标记以存活而其它细胞死亡(或反之亦然)。需要有效的筛选技术以使用本文所述方法的新型途径来提供有效的开发。优选地，用于酶促途径生产的化合物的适合筛选技术允许快速和敏感筛选感兴趣的性质。此时视觉(量热)分析为最佳，且易于应用于具有适合光吸收性质的化合物。更复杂的筛选工艺包括如高通量HPLC-MS分析、SPME(固相微提取)和GC-MS(气相色谱-质谱)(参见Handbook of analytical derivatization reaction，D.R.Knapp；John Wiley & Sons，1979)。在一些情况中，将筛选机器人与HPLC-MS系统连接，以用于自动注射和快速样品分析。这些技术允许高通量检测和定量最终所希望的任何化合物。
感兴趣的生物法生产的产物可使用本领域已知方法从发酵培养基或细胞提取物分离。例如，固体或细胞残渣可通过离心或过滤去除。感兴趣的生物产物可通过蒸馏、液液提取、膜蒸发、吸附或本领域已知的任何方法分离。
在一些实施方式中，感兴趣的产物的鉴定使用HPLC进行。例如，标准样品通过培养基中已知量的有机产物制备(如己二酸、氨基己酸)。随后可将产生的己二酸的保留时间与可靠的标准的保留时间进行比较。在一些实施方式中，感兴趣的产物的鉴定可使用GC-MS进行。随后将溶解的样品通过质量选择检测器分析，且与在先质谱和可靠标准的保留时间进行比较。
在一些实施方式中，可根据酶活性筛选细胞提取物。例如，氧代己酸脱氢酶活性可通过如Donoghue and Trudgill(Eur.J.Biochem.，1975，60：1-7)所述在340nm下测定吸光度的增加率来检测。
除非另有说明，本发明方法的实施将使用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA、和免疫学、工程学、机扑学、光学、计算机软件和集成的常规技术。此技术和步骤通过根据本领域和各种文献中的常规方法进行，这在本领域人员技术范围内。此技术在文献中详细说明。参见，如Molecular Cloning A Laboratory Manual，2nd Ed.，ed.bySambrook，Fritsch and Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glover ed.，1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait ed.，1984)；Mullis et al.U.S.Patent No：4,683,195；nucleicacid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Transcription AndTranslation(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRLPress，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；thetreatise，Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene TransferVectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.，1987，ColdSpring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology，Vols.154 and 155(Wu etal.eds.)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer andWalker，eds.，Academic  Press，London，1987)；Handbook Of ExperimentalImmunology，Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，1986)；Lakowicz，J.R.Principles  of FluorescenceSpectroscopy，New York：Plenum Press(1983)，and Lakowicz，J.R.EmergingApplications of Fluorescence Spectroscopy to Cellular  Imaging：LifetimeImaging，Metal-ligand Probes，Multi-photon Excitation and Light Quenching，Scanning Microsc.Suppl  VOL.10(1996)pages  213-24，for fluorescenttechniques，Optics Guide 5 Melles Griot.RTM.Irvine Calif.for general opticalmethods，Optical Waveguide Theory，Snyder & Love，published by Chapman &Hall，and Fiber Optics Devices and Systems by Peter Cheo，published byPrentice-Hall for fiber optic theory and materials.
等价形式
本发明提供了用于代谢工程化的其它组合物和方法。尽管已经讨论了本发明的具体实施方式，但以上描述是说明性而非限制。基于本发明的评论，本发明的许多变化对本领域技术人员是显然的。本发明的全部范围应参照权利要求以及它们等价物的全部范围，和说明书，以及此变化来确定。
通过参考并入
本文所述的全部出版物和专利，包括以下列出的条目通过参考整体并入本文，如具体且单独地表明通过参考并入每个单独的出版物或专利。在冲突的情况下，以本申请，包括本文的任何定义为准。

Claims (82)

1.一种用于从α-酮酸生产α，ω双官能Cn烷的代谢工程化宿主细胞，其中α和ω末端官能团选自-OH、-COOH和-NH3的组，其中n为4至8的整数，其中所述代谢工程化宿主细胞通过包括编码至少一种生物合成途径酶的至少一个核苷酸序列的核酸来进行遗传修饰。
2.如权利要求1所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述核酸包括编码两种或更多种基因产物的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述细胞为原核细胞。
4.如权利要求1所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述细胞为厌氧型原核细胞。
5.如权利要求1所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述细胞选自由大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌和乳糖发酵短杆菌组成的组。
6.如权利要求1所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述α-酮酸为α-酮戊二酸，且被转化为α-酮己二酸、α-酮庚二酸或α-酮辛二酸。
7.如权利要求6所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞包括编码高柠檬酸合酶、高乌头酸酶和同分异构高柠檬酸脱氢酶的核酸序列。
8.如权利要求7所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述高柠檬酸合酶选自由AksA、NifV、hcs和Lys20/21组成的组。
9.如权利要求7所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述高乌头酸酶选自由AksD/E、LysT/U、Lys4，3-异丙基苹果酸脱水酶大/小亚基和它们的同源物组成的组。
10.如权利要求7所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述同分异构高柠檬酸脱氢酶选自由AksF、Hicdh、Lys12，2-氧代辛二酸合酶、3-异丙基苹果酸脱氢酶和它们的同源物组成的组。
11.如权利要求7所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述α，ω双官能烷具有6个碳原子，且选自由氨基己酸、己二酸、六亚甲基二胺、6-羟基六胺、1，6-己烷二醇、6-氨基己醛、6-氨基己醇和6-羟基己酸组成的组。
12.如权利要求1所述的代谢工程化宿主细胞，其用于从α-酮庚二酸生产己二酸，所述宿主细胞进一步包括编码脱羧酶和醛脱氢酶的核酸。
13.如权利要求12所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述脱羧酶为催化α-酮庚二酸向己二酸半醛转化的2-酮脱羧酶和催化己二酸半醛向己二酸转化的醛脱氢酶。
14.如权利要求12所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述2-酮脱羧酶选自2-酮戊二酸脱羧酶(kgd)、2-酮异戊酸脱羧酶(kivD)、促转氨的氨基酸脱羧酶(ARO10)、苯甲酰甲酸脱羧酶(mdlC)、2-酮精氨酸脱羧酶(aruI)、膦酰基丙酮酸脱羧酶(fom2)、丙酮酸脱羧酶同工酶(PDC6、PDC1)、丙酮酸脱羧酶同工酶2(PDC5、PDC1、PDC6、Aro10、KivD)、吲哚丙酮酸脱羧酶(ipdC)和它们的同源物。
15.如权利要求14所述的代谢工程化宿主细胞，其中与2-酮戊二酸脱羧酶(kgd)、2-酮异戊酸脱羧酶(kivD)、促转氨的氨基酸脱羧酶(ARO10)、苯甲酰甲酸脱羧酶(mdlC)、2-酮精氨酸脱羧酶(aruI)、膦酰基丙酮酸脱羧酶(fom2)、丙酮酸脱羧酶同工酶(PDC6、PDC1)、丙酮酸脱羧酶同工酶2(PDC5、PDC1、PDC6、Aro10、KivD)、吲哚丙酮酸脱羧酶(ipdC)和它们的同源物相比，所述脱羧酶具有至少30％的同一性。
16.如权利要求12所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述醛脱氢酶为6-氧代己酸脱氢酶(ChnE)和它们的同源物。
17.如权利要求12所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述醛脱氢酶与所述6-氧代己酸脱氢酶(ChnE)具有至少30％的同一性。
18.如权利要求1所述的代谢工程化宿主细胞，其用于从α-酮庚二酸生产氨基己酸，所述宿主细胞进一步包括编码氨基转移酶和脱羧酶的核酸。
19.如权利要求18所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述2-氨基转移酶催化α-酮庚二酸向2-氨基庚二酸的转化，且其中所述脱羧酶催化2-氨基庚二酸向氨基己酸的转化。
20.如权利要求19所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述氨基转移酶选自由α-氨基己二酸氨基转移酶-1(AADAT)、氨基己二酸氨基转移酶(LysN)、二氨基庚二酸脱氢酶(ddb和dapdh)和它们的同源物组成的组。
21.如权利要求19所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述脱羧酶为谷氨酸脱羧酶。
22.如权利要求20所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述谷氨酸脱羧酶由选自由Gad6/7、GadA、GadB和lysA组成的组的基因或基因片段编码。
23.如权利要求18所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述脱羧酶催化α-酮庚二酸向己二酸半醛的转化，且所述氨基转移酶催化己二酸半醛向氨基己酸的转化。
24.如权利要求23所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述酮脱羧酶选自2-酮戊二酸脱羧酶(kgd)、2-酮异戊酸脱羧酶(kivD)、促转氨的氨基酸脱羧酶(ARO10)、苯甲酰甲酸脱羧酶(mdlC)、2-酮精氨酸脱羧酶(aruI)、膦酰基丙酮酸脱羧酶(fom2)、丙酮酸脱羧酶同工酶(PDC6、PDC1)、丙酮酸脱羧酶同工酶2(PDC5、PDC1、PDC6、Aro10、KivD)、吲哚丙酮酸脱羧酶(ipdC)和它们的同源物。
25.如权利要求23所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述氨基转移酶选自由GABA转氨酶、Lys6脱氢酶、鸟氨酸-氧代酸转氨酶、赖氨酸氨基转移酶、4-氨基丁酸氨基转移酶、4-氨基丁酸氨基转移酶、4-氨基丁酸氨基转移酶、酵母氨酸脱氢酶(LYS9和LYS1)或它们的任何同源蛋白质组成的组。
26.如权利要求18所述的代谢工程化宿主细胞，其用于从氨基己酸生产六亚甲基二胺，所述宿主细胞进一步包括编码醛脱氢酶和氨基转移酶的核酸。
27.如权利要求26所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述醛脱氢酶催化氨基己酸向6-氨基己醛的转化，且所述氨基转移酶催化所述6-氨基己醛向6-六亚甲基二胺的转化。
28.如权利要求27所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述醛脱氢酶为ALDH酶(EC 1.2.1-)。
29.如权利要求27所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述氨基转移酶选自由α-氨基己二酸氨基转移酶-1(AADAT)、氨基己二酸氨基转移酶(LysN)、二氨基庚二酸脱氢酶(ddb、dapdh)和它们的同源蛋白质组成的组。
30.如权利要求1所述的代谢工程化宿主细胞，其用于从α-酮庚二酸生产六亚甲基二胺，所述宿主细胞进一步包括编码氨基转移酶、还原酶、脱氢酶和脱羧酶的核酸。
31.如权利要求30所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述氨基转移酶催化α-酮庚二酸向2-氨基庚二酸的转化，所述还原酶催化2-氨基庚二酸向2-氨基-7-氧代庚酸的转化，所述脱氢酶催化2-氨基-7-氧代庚酸向2，7-二氨基庚酸的转化，且所述脱羧酶催化2，7-二氨基庚酸向六亚甲基二胺的转化。
32.如权利要求31所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述氨基转移酶选自由α-氨基己二酸氨基转移酶-1(AADAT)、氨基己二酸氨基转移酶(LysN)、二氨基庚二酸脱氢酶(ddb、dapdh)和它们的变体组成的组。
33.如权利要求31所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述还原酶为氨基己二酸还原酶或其同源物。
34.如权利要求33所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述氨基己二酸还原酶由Sc-Lys2编码。
35.如权利要求31所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述脱氢酶为酵母氨酸脱氢酶或其同源物。
36.如权利要求35所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述酵母氨酸脱氢酶由Sc-Lys9或Sc-Lys1或其变体编码。
37.如权利要求30所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述脱羧酶选自由赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶和它们的变体组成的组。
38.如权利要求6所述的代谢工程化宿主细胞，其用于从α-酮庚二酸生产6-羟基己酸，所述宿主细胞进一步包括编码醇脱氢酶的核酸。
39.如权利要求38所述的代谢工程化宿主细胞，其用于从6-羟基己酸生产1，6-己烷二醇，所述宿主细胞进一步包括编码醇脱氢酶或醛脱氢酶的核酸。
40.如权利要求38所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述醇脱氢酶选自6-羟基己酸脱氢酶、丁醇脱氢酶、ADHIV脱氢酶、丙二醇氧化还原酶、ADH6和它们的同源物。
41.一种用于从α-酮戊二酸生产α，ω双官能Cn烷的方法，其中α和ω末端官能团选自-OH、-COOH和-NH3的组，其中n为4至7的整数，包括在足以生产α，ω双官能Cn烷的条件下培养权利要求1的宿主细胞；和分离所述双官能Cn烷。
42.一种工程化宿主细胞，包括一种或多种外源核酸序列，所述序列编码选自高柠檬酸合酶(EC 2.3.3.)、高乌头酸酶(EC 2.3.3.14)、同分异构高柠檬酸脱氢酶(EC 1.1.1.-)和它们的组合的至少一种多肽。
43.如权利要求42所述的工程化宿主细胞，所述细胞从α-酮戊二酸生产α-酮己二酸、α-酮庚二酸、α-酮辛二酸或它们的组合。
44.如权利要求43所述的工程化宿主细胞，进一步包括一种或多种外源核酸序列，所述核酸序列编码选自α-酮酸脱羧酶(EC 4.1.1.-)和脱氢酶(EC 1.1.1.-)和它们的组合的至少一种多肽。
45.如权利要求44所述的工程化宿主细胞，所述细胞生产Cn二羧酸，其中n为4至7的整数。
46.如权利要求44所述的工程化宿主细胞，所述细胞生产Cn羟基羧酸，其中n为4至7的整数。
47.如权利要求45所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生己二酸。
48.如权利要求46所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生6-羟基己酸。
49.如权利要求44所述的工程化宿主细胞，所述细胞产生Cn烷二醇，其中n为4至7的整数。
50.如权利要求49所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生1，6-己烷二醇。
51.如权利要求43所述的工程化宿主细胞，进一步包括一种或多种外源核酸序列，所述序列编码选自α-酮酸脱羧酶(EC 4.1.1.-)、氨基转移酶(EC 1.4.1.-)、氨基转移酶(EC 2.6.1.-)和它们的组合的至少一种多肽。
52.如权利要求51所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生氨基己酸。
53.如权利要求43所述的工程化宿主细胞，进一步包括一种或多种外源核酸序列，所述序列编码选自氨基己二酸转移酶(EC 2.6.1.39)、二氨基庚二酸脱氢酶(EC 1.4.1.16)、戊二酸脱羧酶(EC4.1.1.-)和它们的组合的至少一种多肽。
54.如权利要求53所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生Cn氨基羧酸，其中n为4至7的整数。
55.如权利要求54所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生氨基己酸。
56.如权利要求51所述的工程化宿主细胞，进一步包括一种或多种外源核酸序列，所述序列编码选自醛脱氢酶(EC 1.2.1.3)的至少一种多肽。
57.如权利要求56所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生Cn氨基醛或Cn二氨基烷，其中n为4至7的整数。
58.如权利要求57所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生六亚甲基二胺。
59.如权利要求57所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生6-羟基六胺。
60.如权利要求43所述的工程化宿主细胞，进一步包括一种或多种外源核酸序列，所述序列编码选自α-氨基己二酸-氨基转移酶(EC 2.6.1.39)、二氨基庚二酸脱氢酶(EC1.4.1.16)、氨基己二酸还原酶(EC 1.2.1.31)、酵母氨酸脱氢酶(EC1.5.1.-)、赖氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.18)、鸟氨酸脱羧酶(EC4.1.1.17)和它们的组合的至少一种多肽。
61.如权利要求60所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生Cn氨基醛或Cn二氨基烷，其中n为4至7的整数。
62.如权利要求60所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生六亚甲基二胺。
63.如权利要求43所述的工程化宿主细胞，进一步包括一种或多种外源核酸序列，所述序列编码选自3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白]还原酶(EC 1.1.1.100)、脂肪酸合酶(EC 2.3.1.-)、脱水酶(EC 4.2.1.59)、3-羟基辛酰基-[酰基-载体-蛋白]脱水酶(EC 4.2.1.59)、烯酰基-[酰基-载体-蛋白]还原酶(EC 1.3.1.9)和它们的组合的至少一种多肽。
64.如权利要求63所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生Cn二羧酸，其中n为5至8的整数。
65.如权利要求63所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生己二酸。
66.如权利要求63所述的工程化宿主细胞，进一步包括一种或多种外源核酸序列，所述序列编码选自醛脱氢酶(EC 1.2.1.3)的至少一种多肽。
67.如权利要求66所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生Cn羟基羧酸，其中n为5至8的整数。
68.如权利要求66所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生Cn烷二醇，其中n为5至8的整数。
69.如权利要求67所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生6-羟基己酸。
70.如权利要求68所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生1，6-己烷二醇。
71.如权利要求66所述的工程化宿主细胞，进一步包括一种或多种外源核酸序列，所述序列编码选自氨基转移酶(EC 1.4.1.-)和氨基转移酶(EC 2.6.1.-)的至少一种多肽。
72.如权利要求71所述的代谢工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生Cn氨基羧酸，其中n为5至8的整数。
73.如权利要求72所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生氨基己酸。
74.如权利要求73所述的工程化宿主细胞，进一步包括一种或多种外源核酸序列，所述序列编码选自醛脱氢酶(EC 1.2.1.3)、氨基转移酶(EC 1.4.1.-)和氨基转移酶(EC 2.6.1.-)和它们的组合的至少一种多肽。
75.如权利要求74所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生1，n-二氨基烷，其中n为5至8的整数。
76.如权利要求75所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生六亚甲基二胺。
77.如权利要求74所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生n-氨基醇，其中n为5至8的整数。
78.如权利要求77所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生6-氨基己醇。
79.如权利要求43所述的工程化宿主细胞，进一步包括一种或多种外源核酸序列，所述序列编码选自氨基转移酶(EC 2.6.1.7)、醛脱氢酶(EC 1.2.1.3)、谷氨酸半醛变位酶(EC 5.4.3.8)、3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白]还原酶(EC 1.1.1.100)、脂肪酸合酶(EC 2.3.1.-)、脱水酶(EC 4.2.1.59)、3-羟基辛酰基-[酰基-载体-蛋白]脱水酶(EC 4.2.1.59)、烯酰基-[酰基-载体-蛋白]还原酶(EC 1.3.1.9)和它们的组合的至少一种多肽。
80.如权利要求79所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生n-氨基羧酸，其中n为5至8的整数。
81.如权利要求79所述的工程化宿主细胞，其中所述宿主细胞产生氨基己酸。
82.一种用于从α-酮戊二酸生产α，ω双官能Cn烷的方法，其中α和ω末端官能团选自-OH、-COOH和-NH3的组，其中n为5至8的整数，包括在足以生产α，ω双官能Cn烷的条件下培养权利要求42的宿主细胞；和分离所述α，ω双官能Cn烷。
CN200980156694.5A 2008-12-12 2009-12-14 从α-酮酸生物合成双官能烷烃 Expired - Fee Related CN102317464B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US20157608P 2008-12-12 2008-12-12
US61/201,576 2008-12-12
PCT/US2009/067895 WO2010068944A2 (en) 2008-12-12 2009-12-14 Biological synthesis of difunctional alkanes from carbohydrate feedstocks

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102317464A true CN102317464A (zh) 2012-01-11
CN102317464B CN102317464B (zh) 2014-10-29

Family

ID=41508860

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980156694.5A Expired - Fee Related CN102317464B (zh) 2008-12-12 2009-12-14 从α-酮酸生物合成双官能烷烃

Country Status (11)

Country Link
US (6) US8192976B2 (zh)
EP (1) EP2366026A2 (zh)
JP (2) JP2012511910A (zh)
KR (1) KR20110104952A (zh)
CN (1) CN102317464B (zh)
AU (1) AU2009324422A1 (zh)
BR (1) BRPI0922944A2 (zh)
CA (1) CA2747241A1 (zh)
MY (1) MY153590A (zh)
RU (1) RU2496880C2 (zh)
WO (1) WO2010068944A2 (zh)

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104126012A (zh) * 2011-12-21 2014-10-29 英威达技术有限责任公司 用于生产尼龙-7、尼龙-7,7和聚酯的生物转化工艺
CN104603277A (zh) * 2012-09-14 2015-05-06 生物琥珀酸有限公司 利用发酵和催化相结合的方法制备己二酸和己二酸盐的替代合成路径
CN104725239A (zh) * 2013-12-18 2015-06-24 江南大学 一种高级脂肪胺的制备方法
CN105026569A (zh) * 2012-12-31 2015-11-04 英威达技术有限责任公司 通过丙酮酸和琥珀酸半醛羟醛缩合生产7-碳化学物的方法
CN105073997A (zh) * 2012-12-14 2015-11-18 英威达技术有限责任公司 经由与碳储存有关的CoA依赖性碳链延长生成6碳化学品的方法
CN105189770A (zh) * 2012-12-31 2015-12-23 英威达技术有限责任公司 通过与环己烷羧酸合成相关的碳链延伸生产7碳化学物的方法
CN105189764A (zh) * 2012-12-31 2015-12-23 英威达技术有限责任公司 通过与辅酶b合成相关的c1碳链延伸生产7-碳化学物的方法
CN106574283A (zh) * 2014-05-15 2017-04-19 英威达技术有限责任公司 使用2,6‑二氨基庚二酸作为2‑氨基庚二酸的前体生产6‑碳化学品的方法
CN106795537A (zh) * 2014-06-16 2017-05-31 英威达技术有限责任公司 用于生物合成化合物的方法、试剂和细胞
CN107849521A (zh) * 2015-07-03 2018-03-27 多伦多大学管理委员会 用于由羧酸合成聚合物前体的过程和微生物
CN114990043A (zh) * 2022-06-28 2022-09-02 滨州医学院 代谢赖氨酸的工程菌及其构建方法与应用
CN114990043B (zh) * 2022-06-28 2024-04-30 滨州医学院 代谢赖氨酸的工程菌及其构建方法与应用

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2675026A1 (en) * 2007-01-12 2008-07-24 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions and methods for enhancing tolerance for the production of organic chemicals produced by microorganisms
US8048624B1 (en) 2007-12-04 2011-11-01 Opx Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for 3-hydroxypropionate bio-production from biomass
CN102317464B (zh) * 2008-12-12 2014-10-29 塞莱西翁有限公司 从α-酮酸生物合成双官能烷烃
BRPI1009197A2 (pt) * 2009-03-11 2015-09-15 Dsm Ip Assets Bv preparação de ácido alfa-cetopimélico
US8404465B2 (en) 2009-03-11 2013-03-26 Celexion, Llc Biological synthesis of 6-aminocaproic acid from carbohydrate feedstocks
ES2749423T3 (es) 2009-05-07 2020-03-20 Genomatica Inc Microorganismos y métodos para la biosíntesis de adipato, hexametilendiamina y ácido 6-aminocaproico
SG176970A1 (en) 2009-07-02 2012-02-28 Verdezyne Inc Biological methods for preparing adipic acid
MX2012003604A (es) 2009-09-27 2012-09-12 Opx Biotechnologies Inc Metodo para producir acido 3-hidroxipropionico y otros productos.
US8809027B1 (en) 2009-09-27 2014-08-19 Opx Biotechnologies, Inc. Genetically modified organisms for increased microbial production of 3-hydroxypropionic acid involving an oxaloacetate alpha-decarboxylase
US20110125118A1 (en) * 2009-11-20 2011-05-26 Opx Biotechnologies, Inc. Production of an Organic Acid and/or Related Chemicals
WO2012001003A1 (en) * 2010-07-02 2012-01-05 Metabolic Explorer Method for the preparation of hydroxy acids
TWI500768B (zh) 2010-07-05 2015-09-21 Metabolic Explorer Sa 由蔗糖製備１，３－丙二醇之方法
WO2012031910A2 (en) * 2010-09-10 2012-03-15 Dsm Ip Assets B.V. Method for preparing alpha-ketopimelic acid by c1-elongation
US20130237698A1 (en) * 2010-09-10 2013-09-12 Dsm Ip Assets B.V. Preparation of 6-aminocaproic acid from alpha-ketopimelic acid
BR112013009078A2 (pt) * 2010-10-19 2016-07-19 Global Bioenergies produção de alquenos por conversão enzimática combinada de ácidos 3-hidroxialcanoicos
WO2012137771A1 (ja) * 2011-04-08 2012-10-11 昭和電工株式会社 アジピン酸の製造方法
US8728798B2 (en) 2011-05-03 2014-05-20 Verdezyne, Inc. Biological methods for preparing adipic acid
US8343752B2 (en) 2011-05-03 2013-01-01 Verdezyne, Inc. Biological methods for preparing adipic acid
EP2721161A2 (en) * 2011-06-17 2014-04-23 Invista Technologies S.à.r.l. Methods of making nylon intermediates from glycerol
EP2720997A1 (en) 2011-06-17 2014-04-23 Invista Technologies S.à.r.l. Use of hydrolases to increase monomer content in waste stream
BR112013033672A2 (pt) 2011-06-30 2017-03-14 Invista Tech Sarl método para converter um composto, cultura substancialmente pura de células hospedeiras e cèlula isolada
US9102960B2 (en) 2011-12-16 2015-08-11 Invista North America S.á.r.l. Methods of producing 6-carbon chemicals via CoA-dependent carbon chain elongation associated with carbon storage
WO2013130487A2 (en) 2012-02-29 2013-09-06 Duke University Novel oxidoreductases for enantioselective reactions
EP2647718A3 (en) * 2012-04-06 2014-12-24 Metabolic Explorer Process for producing 5-aminopentanoate empolying a recombinant microorganism
US20130288320A1 (en) * 2012-04-27 2013-10-31 Bioamber Inc. Methods and microorganisms for increasing the biological synthesis of difunctional alkanes
WO2014026162A1 (en) 2012-08-10 2014-02-13 Opx Biotechnologies, Inc. Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products
EP2885400A1 (en) * 2012-08-17 2015-06-24 Celexion, LLC Biological synthesis of difunctional hexanes and pentanes from carbohydrate feedstocks
EP2888356A1 (en) * 2012-08-23 2015-07-01 Bioamber Inc. Methods and microorganisms for the biological synthesis of (s)-2-amino-6-hydroxypimelate, hexamethylenediamine and 6-aminocaproate
BR112015013413A2 (pt) 2012-12-14 2017-11-14 Invista Tech Sarl método para biosintetizar um produto e hospedeiro recombinante
US10196657B2 (en) 2012-12-31 2019-02-05 Invista North America S.A.R.L. Methods of producing 7-carbon chemicals via methyl-ester shielded carbon chain elongation
CN105008543A (zh) 2012-12-31 2015-10-28 英威达技术有限责任公司 通过芳香族化合物生产7-碳化学物的方法
US9580733B2 (en) 2012-12-31 2017-02-28 Invista North America S.A.R.L. Methods of producing 6-carbon chemicals via methyl-ester shielded carbon chain elongation
CN105026570A (zh) 2012-12-31 2015-11-04 英威达技术有限责任公司 通过氧化裂解从长链脂肪酸生产7-碳化学物的方法
CA2905602A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Sarah M. Hoyt Flash evaporation for product purification and recovery
US9447438B2 (en) 2013-03-15 2016-09-20 Cargill, Incorporated Acetyl-coA carboxylases
US11408013B2 (en) 2013-07-19 2022-08-09 Cargill, Incorporated Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products
JP6603658B2 (ja) 2013-07-19 2019-11-06 カーギル インコーポレイテッド 脂肪酸及び脂肪酸誘導体の製造のための微生物及び方法
US10266852B2 (en) 2013-12-06 2019-04-23 Alliance For Sustainable Energy, Llc Lignin conversion to fuels, chemicals and materials
BR112016029394A2 (pt) 2014-06-16 2017-10-17 Invista Tech Sarl métodos, reagentes e células para biossintetizar composto
EP3155112A1 (en) 2014-06-16 2017-04-19 Invista Technologies S.à.r.l. Process for producing glutarate and glutaric acid methyl ester
BR112016029386A2 (pt) * 2014-06-16 2017-10-17 Invista Tech Sarl métodos, reagentes e células para biossintetizar compostos
WO2015195707A1 (en) 2014-06-16 2015-12-23 Invista Technologies S.A.R.L. Methods, reagents and cells for biosynthesizing compounds
WO2015200287A1 (en) * 2014-06-23 2015-12-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods and systems for producing products using engineered iron oxidizing bacteria and copper metal
US10017792B2 (en) 2014-07-18 2018-07-10 Alliance For Sustainable Energy, Llc Biomass conversion to fuels and chemicals
EP2993228B1 (en) 2014-09-02 2019-10-09 Cargill, Incorporated Production of fatty acid esters
BR112017013748A2 (pt) 2014-12-23 2018-03-13 Genomatica Inc método de produção & processamento de diaminas
EP3330380A1 (en) * 2016-12-05 2018-06-06 Evonik Degussa GmbH Process for producing l-methionine from methional
WO2018144701A2 (en) 2017-02-02 2018-08-09 Cargill Incorporated Genetically modified cells that produce c6-c10 fatty acid derivatives
US11136601B2 (en) 2018-08-02 2021-10-05 Alliance For Sustainable Energy, Llc Conversion of S-lignin compounds to useful intermediates
CN113330108A (zh) * 2018-11-29 2021-08-31 齐默尔根公司 通过发酵产生2-氧代己二酸的经改造的生物合成途径
US20220348890A1 (en) * 2019-04-24 2022-11-03 Genomatica, Inc. Engineered transaminase and methods of making and using
EP4317438A1 (en) * 2021-03-30 2024-02-07 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Recombinant polypeptide having acyl-coa compound reducing activity

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3485821A (en) * 1967-05-29 1969-12-23 Techni Chem Co The Process for preparing caprolactam and its alkyl substituted derivatives
US4400468A (en) * 1981-10-05 1983-08-23 Hydrocarbon Research Inc. Process for producing adipic acid from biomass
GB2108486B (en) * 1981-10-26 1986-01-29 Farmos Group Ltd Alkane and alkene derivatives and their preparation and use
US4929396A (en) * 1983-01-13 1990-05-29 Celgene Corporation Production of hexamethylenediamine muconate salt
US4725542A (en) * 1983-01-13 1988-02-16 Celgene Corporation Production of nylon 6,6 salt
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
DE3602377A1 (de) * 1986-01-28 1987-07-30 Basf Ag Verfahren zur herstellung von caprolactam
US5221800A (en) * 1989-09-05 1993-06-22 Amoco Corporation One step air oxidation of cyclohexane to produce adipic acid
FR2669643B1 (fr) * 1990-11-28 1995-04-28 Rhone Poulenc Chimie Procede de synthese enzymatique d'adipate d'ammonium.
US5272073A (en) * 1992-06-30 1993-12-21 Purdue Research Foundation Biocatalytic synthesis of catechol from glucose
US5629190A (en) * 1992-08-10 1997-05-13 Rhone-Poulenc Chimie Polypeptides possessing a nitrilase activity and method of converting nitriles to carboxylates by means of said polypeptides
US5487987A (en) 1993-09-16 1996-01-30 Purdue Research Foundation Synthesis of adipic acid from biomass-derived carbon sources
FR2736928B1 (fr) * 1995-07-18 1997-10-17 Rhone Poulenc Fibres & Polymer Enzymes ayant une activite amidase micro-organismes susceptibles de produire de telles enzymes et procede d'hydrolyse d'amides en faisant application
US6365376B1 (en) * 1999-02-19 2002-04-02 E. I. Du Pont De Nemours And Company Genes and enzymes for the production of adipic acid intermediates
US6498242B1 (en) * 1999-02-19 2002-12-24 E. I. Du Pont De Nemours And Company Biological method for the production of adipic acid and intermediates
WO2003025117A2 (en) * 2001-05-04 2003-03-27 University Of Florida Cloning and sequencing of pyruvate decarboxylase (pdc) genes from bacteria and uses therefor
FR2828711B1 (fr) 2001-08-14 2004-03-12 Serge Janiszewski Moteur thermique, a combustion interne, a cycle a deux temps avec un embiellage a plateaux oscillants indexes et un compresseur rapporte indexe
JP4402587B2 (ja) 2002-06-14 2010-01-20 ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチドおよびそれをコードする核酸
US7563600B2 (en) * 2002-09-12 2009-07-21 Combimatrix Corporation Microarray synthesis and assembly of gene-length polynucleotides
EP1706501B1 (en) * 2004-01-19 2010-01-13 DSM IP Assets B.V. Biochemical synthesis of 6-amino caproic acid
EP1812598A1 (en) * 2004-10-18 2007-08-01 Codon Devices, Inc. Methods for assembly of high fidelity synthetic polynucleotides
US20060160138A1 (en) * 2005-01-13 2006-07-20 George Church Compositions and methods for protein design
WO2007136834A2 (en) * 2006-05-19 2007-11-29 Codon Devices, Inc. Combined extension and ligation for nucleic acid assembly
WO2007136840A2 (en) * 2006-05-20 2007-11-29 Codon Devices, Inc. Nucleic acid library design and assembly
WO2008045380A2 (en) * 2006-10-04 2008-04-17 Codon Devices, Inc. Nucleic acid libraries and their design and assembly
WO2008127283A2 (en) 2006-10-06 2008-10-23 Codon Devices, Inc. Engineered metabolic pathways
DE102007005072A1 (de) 2007-02-01 2008-08-07 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur fermentativen Herstellung von Cadaverin
BRPI0817754A2 (pt) * 2007-10-04 2014-11-25 Bio Architecture Lab Inc Produção de biocombustível
EA019163B1 (ru) 2008-03-11 2014-01-30 ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. ПОЛУЧЕНИЕ 6-АМИНОКАПРОНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЗ α-КЕТОПИМЕЛИНОВОЙ КИСЛОТЫ
CN116515915A (zh) 2008-03-11 2023-08-01 基因组股份公司 己二酸酯或硫代酯合成
ES2656790T3 (es) 2008-03-27 2018-02-28 Genomatica, Inc. Microorganismos para la producción de ácido adípico y otros compuestos
CN102317464B (zh) * 2008-12-12 2014-10-29 塞莱西翁有限公司 从α-酮酸生物合成双官能烷烃

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ATSUMI SHOTA ET AL.: "Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels.", 《NATURE》 *
DREVLAND RANDY M ET AL.: "Methanogen homoaconitase catalyzes both hydrolyase reactions in coenzyme B biosynthesis.", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *
PRATHER KRISTALA L JONES ET AL.: "De novo biosynthetic pathways: rational design of microbial chemical factories.", 《CURRENT OPINION IN BIOTECHNOLOGY》 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104126012A (zh) * 2011-12-21 2014-10-29 英威达技术有限责任公司 用于生产尼龙-7、尼龙-7,7和聚酯的生物转化工艺
CN104603277A (zh) * 2012-09-14 2015-05-06 生物琥珀酸有限公司 利用发酵和催化相结合的方法制备己二酸和己二酸盐的替代合成路径
CN105073997A (zh) * 2012-12-14 2015-11-18 英威达技术有限责任公司 经由与碳储存有关的CoA依赖性碳链延长生成6碳化学品的方法
CN105189764A (zh) * 2012-12-31 2015-12-23 英威达技术有限责任公司 通过与辅酶b合成相关的c1碳链延伸生产7-碳化学物的方法
CN105026569A (zh) * 2012-12-31 2015-11-04 英威达技术有限责任公司 通过丙酮酸和琥珀酸半醛羟醛缩合生产7-碳化学物的方法
CN105189770A (zh) * 2012-12-31 2015-12-23 英威达技术有限责任公司 通过与环己烷羧酸合成相关的碳链延伸生产7碳化学物的方法
CN104725239A (zh) * 2013-12-18 2015-06-24 江南大学 一种高级脂肪胺的制备方法
CN106574283A (zh) * 2014-05-15 2017-04-19 英威达技术有限责任公司 使用2,6‑二氨基庚二酸作为2‑氨基庚二酸的前体生产6‑碳化学品的方法
CN106795537A (zh) * 2014-06-16 2017-05-31 英威达技术有限责任公司 用于生物合成化合物的方法、试剂和细胞
CN107849521A (zh) * 2015-07-03 2018-03-27 多伦多大学管理委员会 用于由羧酸合成聚合物前体的过程和微生物
CN107849521B (zh) * 2015-07-03 2022-11-15 多伦多大学管理委员会 用于由羧酸合成聚合物前体的过程和微生物
CN114990043A (zh) * 2022-06-28 2022-09-02 滨州医学院 代谢赖氨酸的工程菌及其构建方法与应用
CN114990043B (zh) * 2022-06-28 2024-04-30 滨州医学院 代谢赖氨酸的工程菌及其构建方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
US8778642B2 (en) 2014-07-15
RU2496880C2 (ru) 2013-10-27
US8133704B2 (en) 2012-03-13
CA2747241A1 (en) 2010-06-17
WO2010068944A3 (en) 2010-09-23
US20150322441A1 (en) 2015-11-12
KR20110104952A (ko) 2011-09-23
US9062314B2 (en) 2015-06-23
WO2010068944A2 (en) 2010-06-17
US20120258504A1 (en) 2012-10-11
RU2011128711A (ru) 2013-01-20
MY153590A (en) 2015-02-26
JP2012511910A (ja) 2012-05-31
EP2366026A2 (en) 2011-09-21
US20140206069A1 (en) 2014-07-24
JP2015221054A (ja) 2015-12-10
US20100151536A1 (en) 2010-06-17
CN102317464B (zh) 2014-10-29
AU2009324422A1 (en) 2011-07-07
US20110171696A1 (en) 2011-07-14
BRPI0922944A2 (pt) 2015-08-25
US20120164702A1 (en) 2012-06-28
US8192976B2 (en) 2012-06-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102317464B (zh) 从α-酮酸生物合成双官能烷烃
Skoog et al. Biobased adipic acid–The challenge of developing the production host
US20220204969A1 (en) Compositions and methods for rapid and dynamic flux control using synthetic metabolic valves
US8722385B2 (en) Biological synthesis of difunctional hexanes and pentanes from carbohydrate feedstocks
CN104718282A (zh) 用于生产脂肪酸和脂肪酸衍生产物的微生物及方法
Chen et al. Production of fatty acids in Ralstonia eutropha H16 by engineering β-oxidation and carbon storage
TW202208621A (zh) 用於生產特定長度脂肪醇及相關化合物之微生物及方法
CN102690774A (zh) 重组微生物、重组载体及制备3-羟基丙酸的方法
Henard et al. Muconic acid production from methane using rationally-engineered methanotrophic biocatalysts
WO2014165763A1 (en) Microorganisms for the conversion of methane and methanol to higher value chemicals and fuels
Sun et al. Integration of metabolic pathway manipulation and promoter engineering for the fine‐tuned biosynthesis of malic acid in Bacillus coagulans
AU2012327243A1 (en) Biological synthesis of difunctional hexanes and pentanes from carbohydrate feedstocks
JP2014155455A (ja) 組換え細胞、並びに、クロトニルＣｏＡ又はクロチルアルコールの生産方法
AU2013203263A1 (en) Biological synthesis of difunctional alkanes from carbohydrate feedstocks
Gonzalez Villanueva Expanding engineering tools for Cupriavidus necator H16 to convert waste stream into useful chemicals via rational design and evolutionary engineering approaches
TW202307202A (zh) 用於改良乙二醇之生物產生的微生物及方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20141029

Termination date: 20161214

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee