CN102517292A - 免疫刺激性寡核糖核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫刺激性寡核糖核苷酸。本发明提供了免疫刺激性组合物以及这些化合物在药物制备以及体外用途中的用途，所述药物用于治疗疾病。本发明的组合物尤其包括加入了序列依赖性免疫刺激性序列基序的免疫刺激性寡核糖核苷酸。本发明提供了涉及磷酸联接、核苷酸类似物、加合物及其组合的特定修饰。可以任选地含有抗原的本发明组合物能够单独使用，或与其它治疗一起用于刺激或增强免疫应答。本发明还提供了适用于治疗下述受试者的方法，所述受试者患有感染、癌症、变应性病症、哮喘、气道再造或免疫缺陷。本发明的免疫刺激性寡核糖核苷酸被认为能刺激Toll样受体8(TLR8)。

Description

免疫刺激性寡核糖核苷酸

本申请是基于申请日为2006年11月22日的发明专利申请200680044030.6的分案。

技术领域

一般而言，本发明涉及免疫学领域，更具体地涉及免疫刺激性分子。更特别地，本发明涉及具有免疫刺激活性的核糖核酸(RNA)分子，包括寡核糖核苷酸。

背景技术

Toll样受体(TLR)是高度保守的模式识别受体(PRR)多肽家族，其识别与病原体结合的分子模式(PAMP)，在哺乳动物的先天免疫(innate immunity)中起关键作用。目前已经鉴定出了至少十个家族成员，它们被命名为TLR1-TLR10。多种TLR的胞浆结构域特征在于Toll-白介素1受体(TIR)结构域。Medzhitov R et al.(1998)Mol Cell 2：253-8。TLR对微生物侵入的识别引发信号级联放大的激活，这在果蝇(Drosophila)和哺乳动物中是保守的。已经报导：含TIR结构域的适体蛋白MyD88与TLR结合，将与白介素1受体结合的激酶(IRAK)和肿瘤坏死因子(TNF)受体结合的因子6(TRAF6)募集至TLR。人们认为，MyD88-依赖性的信号转导途径导致NF-κB转录因子和c-Jun NH₂末端激酶(Jnk)促有丝分裂剂(mitogen)-激活的蛋白激酶(MAPK)的活化，这是免疫激活中及炎症细胞因子产生的关键步骤。综述参阅Aderem A et al.(2000)Nature 406：782-87和Akira S et al.(2004)Nat Rev Immunol 4：499-511。

已经鉴定出了大量的特异性TLR配体。TLR2的配体包括肽聚糖和脂肽。Yoshimura A et al.(1999)J Immunol 163：1-5；Yoshimura A et al.(1999)J Immunol 163：1-5；Aliprantis AO et al.(1999)Science 285：736-9。脂多糖(LPS)是TLR4的配体。Poltorak A et al.(1998)Science 282：2085-8；HoshinoK et al.(1999)J Immunol 162：3749-52。细菌鞭毛蛋白是TLR5的配体。Hayashi F et al.(2001)Nature 410：1099-1103。已经报导：肽聚糖不仅是TLR2的配体，而且还是TLR6的配体。Ozinsky A et al.(2000)Proc NatlAcad Sci USA 97：13766-71；Takeuchi O et al.(2001)Int Immunol 13：933-40。最近报导：某些低分子量合成化合物咪唑喹啉咪喹莫德(imidazoquinolinesimiquimod，R-837)和瑞喹莫德(resiquimod，R-848)是TLR7和TLR8的配体。Hemmi H et al.(2002)Nat Immunol 3：196-200；Jurk M et al.(2002)Nat Immunol 3：499。

从近来发现未甲基化的细菌DNA及其合成的类似物(CpG DNA)是TLR9的配体(Hemmi H et al.(2000)Nature 408：740-5；Bauer S et al.(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98，9237-42)开始，已经有报导：某些TLR的配体包括某些核酸分子。目前已经报导某些类型的RNA以序列非依赖性或序列依赖性形式是免疫刺激性的。另外，已经报导：这些多种免疫刺激性RNA能刺激TLR3、TLR7或TLR8。

发明内容

一般而言，本发明涉及含有某些免疫刺激性RNA基序的免疫刺激性的寡核糖核苷酸(ORN)，以及含有这类免疫刺激性ORN的相关免疫刺激性组合物，和这类免疫刺激性ORN和组合物的使用方法。本发明的免疫刺激性ORN适用于任何用于刺激或增强免疫应答的装置(setting)或应用中。如下文所公开的，本发明的免疫刺激性ORN尤其适用于制备含有佐剂、疫苗、和其它药剂的药物组合物，所述药物组合物用于治疗多种病症，包括感染、癌症、变态反应和哮喘。因此，本发明在某些方面涉及含有本发明的免疫刺激性ORN的免疫刺激性组合物，以及它们的使用方法。如下文所公开的，本发明的免疫刺激性ORN和免疫刺激性组合物尤其适用于下述方法中，所述方法用于激活免疫细胞，疫苗接种受试者，治疗患有免疫系统缺陷的受试者，治疗患有感染的受试者，治疗患有自身免疫疾病的受试者，治疗患有癌症的受试者，治疗患有变应性病症的受试者，治疗患有哮喘、气道重建(airway remodeling)、促进表位扩展和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的受试者。

如下文更详细地公开的，本发明的免疫刺激性ORN的特征在于它们包含至少一种序列依赖性的免疫刺激性RNA基序。序列依赖性的免疫刺激性RNA基序通常是短的RNA序列，尽管在某些实施方案中该基序也可以含有修饰，例如经修饰的核苷酸间磷酸联接、经修饰的核碱基(nucleobase)、经修饰的糖、核苷酸类似物或其任何组合。如下文更详细地描述的，在一个实施方案中，免疫刺激性RNA基序存在于本发明的较长免疫刺激性ORN的环境中。免疫刺激性RNA基序也可以存在于嵌合的DNA:RNA核酸分子的环境中。

序列依赖性的免疫刺激性RNA基序和加入有了这些基序的免疫刺激性ORN被公开为TLR8的激动剂。更具体地，至少某些序列依赖性免疫刺激性RNA基序、免疫刺激性ORN和免疫刺激性DNA:RNA核酸分子被公开为是TLR8的激动剂而不是TLR7的激动剂。

根据本发明一些方面的免疫刺激性RNA基序是N-U-R₁-R₂。

N是核糖核苷酸，并且N不包括U。在一些实施方案中，N为腺苷或胞嘧啶(C)或其衍生物。

U是尿嘧啶或其衍生物。

R是核糖核苷酸，其中R₁和R₂至少之一是腺苷(A)或胞嘧啶或其衍生物。R不是U，除非N-U-R₁-R₂含有至少两个A。

本发明的ORN含有至少一个以及在一些实施方案中含有多于一个(即2、3或4个)免疫刺激性基序N-U-R₁-R₂。ORN不含有TLR7/8基序。ORN优选长度为4-100，并任选地含有至少一处主链修饰。

在一些实施方案中N-U-R₁-R₂可含有至少3个As或至少2个Cs。任选地，N-U-R₁-R₂含有至少一个G或C。

在一些实施方案中，ORN不是ACCCAUCUAUUAUAUAACUC(SEQID NO：89)。

在其它一些实施方案中，ORN基序通过非核苷酸接头与5’核糖核苷酸分隔。还在其它一些实施方案中，ORN基序通过非核苷酸接头与3’核糖核苷酸分隔。任选地，ORN基序通过非核苷酸接头与5’和3’核糖核苷酸分隔。

ORN还包含可药用的运载体，其任选地是脂质运载体如N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N三甲基铵甲基硫酸酯(DOTAP)。在其它一些实施方案中，ORN不与DOTAP复合。

ORN可以是单链或双链的。

在其它一些实施方案中，ORN含有至少一个AU。还在其它一些实施方案中，ORN含有至少一个CU。

在一些实施方案中，ORN为以下之一：A*U*A*G*G*C*A*C(SEQ IDNO：4)、G*C*C*A*C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*A*U*A*C*C(SEQ IDNO：11)、A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U(SEQ IDNO：12)、U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U(SEQ IDNO：13)、A*A*U*A*A*U*A*A*U*A*A*U*A*A*U*A*A*U*A*A(SEQ IDNO：16)、A*A*A*U*A*A*A*U*A*A*A*U*A*A*A*U*A*A*A*U(SEQ IDNO：17)、A*A*A*A*U*A*A*A*A*U*A*A*A*A*U*A*A*A*A*U(SEQ IDNO：18)、C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U(SEQ IDNO：24)、U*U*A*U*U*A*U(SEQ ID NO：30)、U*A*U*A*U*A*U(SEQ IDNO：33)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*U*A*C*C*C(SEQ ID NO：48)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*U*U*G*A*A*C*C(SEQ ID NO：76)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*A*C*C*C*C(SEQ ID NO：42)、C*C*G*A*G*C*C*A*U*A*U*A*U*A*U*C(SEQ ID NO：39)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*U*A*U*U*A*C*C(SEQ ID NO：65)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*C*C*C*C*C(SEQ ID NO：44)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*C*U*A*C*C*C*C(SEQ ID NO：47)、C*C*G*A*G*C*C*A*U*A*U*A*U*C*C*C(SEQ ID NO：38)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*U*A*U*A*C*C*C(SEQ ID NO：37)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*A*A*C*C*C(SEQ ID NO：40)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*U*A*U*C*C*C*C(SEQ ID NO：55)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*G*U*A*C*C(SEQ ID NO：82)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*A*U*A*C*C(SEQ ID NO：85)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*G*U*A*C*C(SEQ ID NO：63)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*C*U*A*A*C*C*C(SEQ ID NO：43)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*A*U*C*C*C(SEQ ID NO：36)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*C*U*A*C*C(SEQ ID NO：87)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*A*C*C*C*C(SEQ ID NO：45)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*A*A*C*C*C(SEQ ID NO：41)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*G*U*G*C*C(SEQ ID NO：83)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*C*C*C*C*C(SEQ ID NO：46)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*C*U*G*C*C(SEQ ID NO：88)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*C*G*C*C*C*C*C(SEQ ID NO：35)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*C*U*C*C*C(SEQ ID NO：84)，或C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*G*C*A*C*C(SEQ ID NO：56)。

ORN特别排除TLR7/8基序。TLR7/8基序可含有例如选自以下的核糖核苷酸序列：

(i)5′-C/U-U-G/U-U-3′，

(ii)5′-R-U-R-G-Y-3′，

(iii)5′-G-U-U-G-B-3′，

(iv)5′-G-U-G-U-G/U-3′，和

(v)5′-G/C-U-A/C-G-G-C-A-C-3′，

其中C/U为胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)，G/U为鸟嘌呤(G)或U，R为嘌呤，Y为嘧啶，B为U、G或C，G/C为G或C，且A/C为腺嘌呤(A)或C。

在多种实施方案中，5′-C/U-U-G/U-U-3′为CUGU、CUUU、UUGU或UUUU。

在多种实施方案中，5′-R-U-R-G-Y-3′为GUAGU、GUAGC、GUGGU、GUGGC、AUAGU、AUAGC、AUGGU或AUGGC。在一个实施方案中，碱基序列为GUAGUGU。

在多种实施方案中，5′-G-U-U-G-B-3′为GUUGU、GUUGG或GUUGC。

在多种实施方案中，5′-G-U-G-U-G/U-3′为GUGUG或GUGUU。在一个实施方案中，碱基序列为GUGUUUAC。

在多种实施方案中，5′-G/C-U-A/C-G-G-C-A-C-3′为GUAGGCAC、GUCGGCAC、CUAGGCAC或CUCGGCAC。

本发明的一个方面提供了包含本发明免疫刺激性ORN和佐剂的免疫刺激性组合物。在多种实施方案中，佐剂为产生储存作用(depot effect)的佐剂、免疫刺激性佐剂、或产生储存作用并刺激免疫系统的佐剂。在一个实施方案中，根据本发明该方面的免疫刺激性组合物是免疫刺激性ORN和佐剂的缀合物。在根据本发明该方面的一个实施方案中，免疫刺激性ORN与佐剂共价连接。在其它一些实施方案中它们不缀合。在一个实施方案中，佐剂是TLR9的激动剂。在一个实施方案中，佐剂是免疫刺激性的CpG核酸。

本发明的组合物可任选地含有抗原。因此，本发明的一个方面提供了下述疫苗，其中所述疫苗含有本发明的免疫刺激性ORN和抗原。本发明的一个方面提供了一种疫苗，所述疫苗含有本发明的免疫刺激性ORN和抗原的缀合物。在一个实施方案中，根据本发明该方面的缀合物含有与抗原共价连接的免疫刺激性ORN。在其它一些实施方案中，它们不缀合。在多个实施方案中，抗原可以是抗原本身。抗原可以是任何抗原，包括癌症抗原、微生物抗原或变应原。

本发明的一个方面提供了免疫刺激性组合物，所述组合物含有本发明的免疫刺激性ORN与亲脂部分的缀合物。在一个实施方案中，免疫刺激性的ORN与亲脂部分共价连接。在一个实施方案中，亲脂部分选自胆固醇基、棕榈基和脂肪酰基。在一个实施方案中，亲脂部分是胆固醇的衍生物，例如胆固醇基。

在一个实施方案中，免疫刺激性ORN含有至少一个脱氧核糖核苷酸。所述至少一个脱氧核糖核苷酸通常可以出现在免疫刺激性RNA基序之外的任何地方。在多个实施方案中，所述至少一个脱氧核糖核苷酸为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个连续的脱氧核糖核苷酸。本发明也考虑了包含非连续的脱氧核糖核苷酸的免疫刺激性ORN。在多个实施方案中，至少一个脱氧核糖核苷酸是免疫刺激性ORN的5’端、3’端或5’和3’两端。所述至少一个脱氧核糖核苷酸也对应于嵌合的DNA:RNA分子的DNA部分。在一个实施方案中，嵌合的DNA:RNA分子的DNA组分包括CpG核酸，即TLR9激动剂。在一个实施方案中，嵌合的DNA:RNA分子的DNA和RNA部分通过核苷酸间磷酸键共价连接。在另一实施方案中，嵌合的DNA:RNA分子的DNA和RNA部分通过接头(例如非核苷酸接头)共价连接。

本发明的一个方面提供了免疫刺激性组合物，所述组合物包含共价闭合的、部分单链的、哑铃形的核酸分子，其中该分子的至少一个单链部分包含本发明的免疫刺激性RNA基序。

本发明的一个方面提供了包含本发明前述任何方面的组合物和任选的可药用运载体的药物组合物，所述组合物与选自以下的递送媒介物结合：阳离子脂质、脂质体、螺旋状的(cochleate)、病毒颗粒、免疫刺激性复合物(ISCOM)、微粒、微球、毫微球、单层囊泡(LUV)、多层囊泡、水包油乳剂、油包水乳剂、乳体(emulsome)和聚阳离子肽。在根据本发明该方面的一个实施方案中，药物组合物包含抗原。

可以在喷雾器或吸入器中配制ORN，例如定量吸入器(metered doseinhaler)或干粉吸入器。在一些实施方案中，ORN还包含额外的组合物，例如化学治疗剂、抗病毒剂或可药用运载体。可药用运载体可以被配制为用于注射或粘膜施用。

另外，根据本发明的这些方面和其它方面，在多种实施方案中，免疫刺激性ORN可任选包含至少一个5′-5′核苷酸间联接、至少一个3′-3′核苷酸间联接、至少一个包含接头部分的5′-5′核苷酸间联接、至少一个包含接头部分的3′-3′核苷酸间联接，或其任何组合。在一个实施方案中，接头部分是非核苷酸接头部分。

另外，还根据本发明的这些方面和其它方面，在多种实施方案中，免疫刺激性ORN可任选包含至少一个2′-2′核苷酸间联接、至少一个2′-3′核苷酸间联接、至少2′-5′核苷酸间联接或其任何组合。在优选的实施方案中，所述至少一个2′-2′核苷酸间联接、至少一个2′-3′核苷酸间联接、或至少2′-5′核苷酸间联接存在于免疫刺激性RNA基序之外。

还根据本发明的这些和其它方面，在一个实施方案中，免疫刺激性ORN包含至少一个倍增单元(multiplier unit)。因此，在某些实施方案中，本发明的免疫刺激性ORN可以具有分支结构。分支的组合物可以包含任意组合的3′-5′、5′-5′、3′-3′、2′-2′、2′-3′或2′-5′核苷酸间键。在一个实施方案中，免疫刺激性ORN包含至少两个倍增单元，产生所谓的树状聚体(dendrimer)。另外，在某些实施方案中，本发明的免疫刺激性ORN可包含两个或更多的免疫刺激性RNA基序，其例如在分支结构的不同臂上沿线性ORN随机排列，或均沿线性ORN随机排列并位于分支结构的不同臂上。分支结构(包括树状聚体)可任选的包含至少一个免疫刺激性的CpG核酸，例如作为分支结构的独立臂。

还根据本发明的这些和其它方面，在一个实施方案中，免疫刺激性ORN不包含CG DNA或RNA二核苷酸。

本发明的一个方面提供了用于下调免疫抑制性CD4+调节(Treg)细胞的方法。根据本发明该方面的方法包括下述步骤：将CD4+Treg细胞与有效量的含本发明的TLR8-特异性免疫刺激ORN的组合物接触，以降低CD4+Treg细胞的抑制作用。在一个实施方案中，组合物包含TLR8-特异性ORN和免疫刺激性CpG核酸，其中TLR8-特异性ORN和免疫刺激性CpG核酸未连接。在一个实施方案中，组合物含有TLR8-特异性ORN和免疫刺激性CpG核酸，其中TLR8-特异性的ORN和免疫刺激性CpG核酸作为缀合物存在。

本发明另一方面提供了用于调控受试者中免疫应答的方法。根据本发明该方面的方法包括对受试者施用有效量的本发明组合物的步骤。在一些实施方案中，ORN可以被递送给受试者，以在受试者中治疗自身免疫疾病或气道重建。ORN可以单独或与抗原一起被施用给受试者。任选地，以例如口、鼻、舌下、静脉内、皮下、粘膜、呼吸、直接注射和经皮的途径递送ORN。ORN可以以有效量递送给受试者以诱导细胞因子表达，例如TNFα、IL-10、IL-6、IFN-γ、MCP1和IL-12。

本发明的一个方面提供了对受试者疫苗接种的方法。根据本发明该方面的方法包括对受试者施用抗原和本发明的免疫刺激性ORN的步骤。

本发明的一个方面提供了用于治疗受试者的方法，所述受试者患有传染性疾病或具有患传染性疾病的风险。根据本发明该方面的方法包括对受试者施用有效量的本发明组合物的步骤。在一个实施方案中，该方法包括对受试者施用有效量的本发明免疫刺激性ORN的步骤。在一个实施方案中，受试者患有病毒感染。病毒感染可以是例如乙型肝炎或丙型肝炎。也可以对受试者施用抗病毒剂。任选地，抗病毒剂与ORN连接。

本发明的一个方面提供了用于治疗受试者的方法，所述受试者患有癌症或具有患癌症的风险。根据本发明该方面的方法包括对受试者施用有效量的本发明组合物的步骤。在一个实施方案中，该方法包括对受试者施用有效量的本发明免疫刺激性ORN的步骤。在一个实施方案中，也对受试者施用化学治疗或辐射。

本发明的一个方面提供了用于治疗受试者的方法，所述受试者患有癌症或具有患癌症的风险。根据本发明该方面的方法包括对受试者施用有效量的组合物的步骤，所述组合物含有本发明的TLR8-特异性免疫刺激性ORN以降低CD4+Treg细胞的抑制作用。在一个实施方案中，组合物包含TLR8-特异性ORN和免疫刺激性CpG核酸，其中TLR8-特异性ORN和免疫刺激性CpG不连接。在一个实施方案中，组合物包含TLR8-特异性ORN和免疫刺激性CpG核酸，其中TLR8-特异性ORN和免疫刺激性CpG核酸作为缀合物存在。

本发明的一个方面提供了用于治疗受试者的方法，所述受试者患有变应性病症或具有患变应性病症的风险。根据本发明该方面的方法包括对受试者施用有效量的本发明组合物的步骤。在一个实施方案中，该方法包括对受试者施用有效量的本发明免疫刺激性ORN的步骤。在一个实施方案中，受试者患有变应性鼻炎。

本发明的一个方面提供了用于治疗受试者的方法，所述受试者患有哮喘或具有患哮喘的风险。根据本发明该方面的方法包括对受试者施用有效量的本发明组合物的步骤。在一个实施方案中，该方法包括对受试者施用有效量的本发明免疫刺激性ORN的步骤。在一个实施方案中，哮喘是被病毒感染加重的哮喘。ORN可以单独或与变应原一起被施用。

本发明的另一方面提供了用于治疗患有气道重建的受试者的方法。根据本发明该方面的方法包括对受试者施用有效量的本发明免疫刺激性ORN的步骤。

本发明的一个方面提供了用于提高抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的方法。根据本发明该方面的方法包括下述步骤：对需要增加的ADCC的受试者施用有效量的本发明的免疫刺激性ORN和抗体，以增加ADCC。在一个实施方案中，抗体是对癌症抗原或癌细胞表达的其它抗原特异的抗体。在一个实施方案中，抗体为IgG抗体。

本发明的一个方面提供了用于增强表位扩展的方法。根据本发明该方面的方法包括下述顺序步骤：将免疫系统的细胞与抗原接触，随后将该细胞与至少两份剂量的本发明的免疫刺激性ORN接触。在一个实施方案中，该方法体内进行。在一个实施方案中，该方法包括下述步骤：以能有效诱导多重表位特异性免疫应答的量对受试者施用包含抗原和佐剂的疫苗，随后对受试者施用至少两份剂量的本发明的免疫刺激性ORN。该方法在一个实施方案中涉及应用治疗方案，所述方案导致受试者中的免疫系统抗原暴露，然后以能有效诱导多重表位特异性免疫应答的量对受试者施用至少两份剂量的本发明的免疫刺激性ORN。在多种实施方案中，治疗方案为手术、辐射、化学治疗、其它癌症药剂、疫苗或癌症疫苗。在一个实施方案中，所述至少两份剂量的免疫刺激性ORN彼此隔开至少一天到一周被施用。在一个实施方案中，所述至少两份剂量的免疫刺激性ORN彼此隔开至少一周到一个月被施用。在一个实施方案中，所述至少两份剂量的免疫刺激性ORN彼此隔开至少一个月到六个月被施用。

一方面，本发明是通过将表达TLR8的细胞与下述用量的包含N-U-R₁-R₂的RNA寡核糖核苷酸(ORN)接触，其中N是核糖核苷酸且N不包括U，U是尿嘧啶或其衍生物，R是核糖核苷酸，其中R₁和R₂至少之一是腺苷(A)或胞嘧啶或其衍生物，其中R不是U，除非N-U-R₁-R₂含有至少两个A，其中所述ORN不包含TLR7/8基序，并且其中所述ORN长度为4-100，所述用量有效刺激前炎性细胞因子生产并且其中应答于ORN的IFN-α生产相对于背景而言不被显著诱导。在一些实施方案中，应答于ORN的IFN-α生产少于300pg/ml。在一个实施方案中，ORN不是ACCCAUCUAUUAUAUAACUC(SEQ ID NO：89)。ORN可以与N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N三甲基铵甲基硫酸酯(DOTAP)复合或不复合。

在一些实施方案中，表达TLR8的细胞是单核细胞或mDC。还在其它一些实施方案中，表达TLR8的细胞是体外的或体内的。

本发明的这些和其它特征将在发明详述部分被更详细地描述。

附图概述

图1是描述在PBMC刺激时由ORN诱导的细胞因子生产。通过测量IFN-α和TNF-α细胞因子生产，观察到TLR8和TLR7/8之间的差异。在完全滴定曲线上用与DOTAP(25μg/ml，1/3稀释度)复合的指定ORN(2μM，1/3稀释度)或用R-848(2μM，1/3稀释度)刺激人PBMC。16小时后收集上清液，并通过ELISA测量IFN-α(图1a)和TNF-α(图1b)。数据显示了至少三份独立实验的三个血供体的均值。DOTAP单独不显示作用。ORN可与DOTAP复合，R-848不复合。DOTAP单独是对照。在图1c中，用与DOTAP(2.2μg/ml)或与R-848(2μM)复合的0.2μM指定的ORN刺激人PBMC。16小时后收集上清液并通过ELISA测量IFN-α(左图)和TNF-α(右图)。数据显示了3个供体的均值(±SEM)。

图2是一组柱状图，其描述了经分离的pDC(图2a)、单核细胞(图2b)和mDC(图2c)刺激时由ORN诱导的细胞因子生产。用与10μg/mlDOTAP、0.5μM CpG ODN或DOTAP复合的0.5μM ORN或单独的培养基刺激细胞，并测量IFN-α(图2a)、TNF-α(图2c)和IL-12p40(图2c)。

图3是一组柱状图，其阐述了PBMC刺激时由ORN诱导的细胞因子生产。用与10μg/ml DOTAP复合的指定ORN(0.5μM ORN)刺激人PBMC，并通过ELISA技术测量IFN-α(图3A)和TNF-α(图3B)和通过Luminex技术测量细胞因子生产。

图4是阐述指定ORN的(图4a)和TNF-α(图4b)最大活性比较的柱状图。用与DOTAP(从25μg/ml开始，稀释度1/3)复合的ORN(7种浓度，从2μg/ml开始，1/3稀释度)刺激人PBMC，并对两份单独实验中0.6μM处3-6个血供体的平均最大活性进行了测定。

图5是阐述IFN-α最大活性(图5a)与IFN-αEC50(图5b)比较的柱状图。用于DOTAP复合的ORN刺激人PBMC并测量IFN-α。

图6是一组图，其比较了带有TLR8(SEQ ID NO：13)或TLR7/8(SEQID NO：21)的ORN对3个血供体的PBMC、经分离的pDC或经分离的单核细胞的滴定曲线。用与DOTAP(从25μg/ml开始，1/4稀释度)复合的ORN(4种浓度，从1μg/ml开始，1/4稀释度)刺激细胞。16小时后收集上清液并通过Luminex技术测量细胞因子生产。图显示SEQ ID NO：21(0、3μM)细胞因子生产百分比。

图7-1到7-4显示了一组柱形图，其阐述在任何浓度的3个血供体对PMBC、经分离的单核细胞、经分离的pDC和CD14-CD123-PBMC的平均最大活性。用与DOTAP(从25μg/ml开始，1/4稀释度)复合的ORN(4种浓度，从1μg/ml开始，1/4稀释度)刺激细胞。16小时后收集上清液并通过Luminex技术测量细胞因子生产。红色正方形指示在DOTAP和培养基的背景上的阳性反应。

图8是一组柱形图，其显示了TLR8(SEQ ID NO：13)和TLR7/8(SEQID NO：21)ORN之间的差异。用与DOTAP(从25μg/ml开始，1/4稀释度)复合的ORN(4种浓度，从1μg/ml开始，1/4稀释度)刺激细胞。16小时后收集上清液并通过Luminex技术测量细胞因子生产。图表显示测量的任何浓度下的平均最大细胞因子生产，其表示为TLR8 ORN(SEQ ID NO：13)比TLR7/8 ORN (SEQ ID NO：21)的百分比。针对经分离的pDC、PBMC、经分离的单核细胞和CD123-CD14-PBMC显示。

图9是一组图和曲线，其显示了经稳定转染的HEK-293细胞中通过TLR8作用的TLR8 ORN(SEQ ID NO：13)和TLR7/8 ORN(SEQ ID NO：21)的反应。用指定的ORN将HEK-293细胞刺激16小时，所述HEK-293细胞用NFκB-萤光素酶读出报告子和人TLR8稳定转染。16个小时后去除上清液，将细胞裂解并测量萤光素酶活性或细胞因子水平。图9a和9b显示了刺激后NFκB-萤光素酶的倍数诱导。图9c显示了存在抑制剂时刺激后NFκB-萤光素酶的倍数诱导。图9d显示了通过萤光素酶测定测量的刺激后的IP-10刺激。

图10是一组图表，其显示了用富含AU或富含GU的ORN刺激的人pDC上的表面标记物表达。用与25μg/ml DOTAP复合的1μM ORN或单独用DOTAP(图10a)，或指定量的与DOTAP复合的ORN或单独用DOTAP(图10b-10c)孵育CD123+经纯化的pDC(图10a和10b)或经分离的单核细胞(图10c)。16小时后收集细胞并用CD123、CD11c和HLA-DR抗体(图10a和10b)或CD14和CD19(图10c)染色。通过CD86(图10a和10b)或CD80(图10c)表达测量细胞表面标记物激活。图10a显示FACS分析，其证明了富含AU的ORN(SEQ ID NO：13)和富含GU的ORN(SEQ ID NO：21)在pDC刺激时的CD86表面标记物表达中显示差异。图10b是阐述人pDC刺激时的CD86表面标记物表达是剂量依赖性的。图10c是显示以下内容的图：富含AU的ORN(SEQ ID NO：13)和富含GU的ORN(SEQ ID NO：21)在人PBMC(数据未显示)和CD14-阳性细胞刺激时在CD80表面标记物表达中显示无差异。

图11是一组柱形图，其显示了TLR8 ORN(SEQ ID NO：13)和TLR7/8ORN(SEQ ID NO：21)之间的差异。使用SEQ ID NO：5 ORN作为对照。将牛PBMC与10μg/ml ORN(HD)或2.5μg/ml ORN(LD)孵育48小时。收集上清液并用ELISA分析。图11a-c分别显示了IL-12、IFN-γ和TNF-α的水平。

图12是一组展示出下述内容的图表：鼠细胞体内或体外不应答于富含AU的ORN SEQ ID NO：13。使用的细胞是小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞(图12a)、J774细胞(图12b)、经纯化的小鼠CD11c+细胞(sv129小鼠)(图12c-12g)和体内小鼠细胞。通过ELISA评价细胞因子浓度。

图13是展示下述内容的图表：大鼠脾细胞不应答于富含AU的ORNSEQ ID NO：13。将来自3只Sprague-Dawley大鼠的脾细胞合并，并用指定浓度的SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：13(均与62.5μg/ml DOTAP复合，1/5稀释度)、R-848或DOTAP单独(62.5μg/ml->1/5稀释度)刺激。20小时后收集上清液并通过ELISA测量TNF-α水平。

发明详述

本发明的一部分涉及本发明的发明人对大量序列特异性的免疫刺激性RNA基序的发现。目前已经发现：含有免疫刺激性RNA基序的分子(单独或与某些其它成分组合)是重要的免疫刺激性化合物，其在用于治疗患有病症或具有患病症风险的受试者的大量方法中有用，所述病症中诱导、增加或更改免疫应答会是有利的。在一个实施方案中，本文所使用的本发明的免疫刺激性组合物是本发明的免疫刺激性ORN。

已经发现某些序列特异性RNA基序是免疫刺激性的，其通过TLR8作用，与作用于TLR7和TLR8的其它基序(富含GU和富含CU)相反。RNA寡核苷酸(RON)(优选含有富含AU的序列)通过TLR8刺激免疫应答。已经在不同种类的ORN(例如含有含AU和含GU重复的ORN)中观察到IFN-α、TNF-α、IFN-γ和IL-12生产之间的差异。有趣的是，已经发现本发明的免疫刺激性ORN生产强的前炎性细胞因子应答，而IFN-α和IFN-α相关的分子除外。用这些新颖的ORN刺激时IFN-α生产减少或缺乏。

根据本发明一些方面的免疫刺激性RNA基序为N-U-R₁-R₂。

N是核糖核苷酸，并且N不包括U。在一些实施方案中，N为腺苷或胞嘧啶(C)或其衍生物。

U是尿嘧啶或其衍生物。

R是核糖核苷酸，其中R₁和R₂至少之一是腺苷(A)或胞嘧啶或其衍生物。R不是U，除非N-U-R₁-R₂含有至少两个A。

本发明的ORN含有至少一个和在一些实施方案中含有多于一个(即2、3或4个)免疫刺激性基序N-U-R₁-R₂。ORN不含有TLR7/8基序。

ORN是寡核苷酸。任选地，该寡核苷酸长度为4-100。ORN长度也可以是例如8-40、15-25或20-30个核苷酸。ORN任选地含有至少一个主链修饰。

在一些实施方案中N-U-R₁-R₂可含有至少3个As或至少2个Cs。任选地，N-U-R₁-R₂含有至少一个G或C。

在一些实施方案中，ORN不是ACCCAUCUAUUAUAUAACUC(SEQID NO：89)。

ORN还可包含可药用的运载体，其任选地是脂质运载体如N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N三甲基铵甲基硫酸酯(DOTAP)。在其它一些实施方案中，ORN不与DOTAP复合。在其它一些实施方案中可药用运载体可以是肽，如聚阳离子肽。聚阳离子肽包括例如多重的多聚赖氨酸、多聚精氨酸和多聚肽(其在多于5个、特别是多于8个氨基酸残基的范围内含有多于50％的碱性氨基酸、特别是精氨酸或赖氨酸残基)或其混合物，并可例如含有天然存在的昆虫抗菌蛋白质。

在其它一些实施方案中，ORN含有至少一个AU。

除了是序列特异性的以外，作为单链RNA、部分双链RNA或完全双链RNA的免疫刺激性RNA基序是有效的。

对本发明的ORN和具有TLR7/8基序(即含GU的重复)的ORN而言，观察到IFN-α和IFN-α相关分子和其它前炎性细胞因子如TNF-α、IFN-γ、IL-10、IL-6和IL-12的生产之间的清晰差异。具有N-U-R₁-R₂基序的本发明的ORN，例如那些含有AU或AUU重复(SEQ ID NO：12，SEQ IDNO：13)的ORN在PBMC和pDC刺激时显示无IFN-α细胞因子生产。相反，具有一列中三个或更多U(SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15)的ORN诱导IFN-α生产，尽管存在As。有趣的是，使用相同的、单室用A交换G的ORN组时，观察到PBMC刺激时的强IFN-α生产。本文存在的数据强烈地提示两个不同ORN种类的存在：一种作用于表达TLR8的细胞，如单核细胞和mDC(SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：16-SEQ IDNO：18)、含本发明的N-U-R₁-R₂基序的ORN，另一种作用于表达TLR7/8二者的细胞，例如含有CU、GU和GUU序列的单核细胞、mDC和pDC(SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：19-SEQ ID NO：23)。

因此，本发明的ORN具有诱导免疫应答而不诱导相对于背景的显著量IFN-α或IFN-α相关分子的能力。相对于背景的显著量的IFN-α或IFN-α相关分子优选是相对于背景的IFN-α或IFN-α相关分子水平改变少于20％。在一些实施方案中，其少于15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。在其它一些实施方案中，被诱导的IFN-α或相关分子等于背景或少于背景水平。还在其它一些实施方案中，被本发明ORN诱导的IFN-α少于或等于被TLR7/8 ORN诱导的IFN-α的20％。被本发明的ORN诱导的IFN-α在体外测试中可任选的少于300pg/ml，或可以具有大于1.5μM的EC50。

本文使用的IFN-α相关分子是与IFN-α表达相关的细胞因子或因素。这些分子包括但不限于MIP1-β、IP-10和MIP1-α。

目前报导CD4+Treg细胞表达TLR8，且这些细胞中的TLR8信号转导降低或逆转了它们的免疫刺激性功能。Peng G et al.(2005)Science309：1380-4。在患有多种类型癌症的患者中观察到增加的CD4+Treg细胞种群，其中免疫抑制可有助于免疫“逃逸”和下调这些癌症的生长。因此，预计Treg-介导的抑制的反转在治疗癌症中是有利的。

PRN特别排除TLR7/8基序。已经发现TLR7/8基序可以产生显性结果，其屏蔽了本发明ORN的独特的免疫刺激特性。TLR7/8基序包括例如核糖核苷酸序列，如5′-C/U-U-G/U-U-3′、5′-R-U-R-G-Y-3′、5′-G-U-U-G-B-3′、5′-G-U-G-U-G/U-3′或5′-G/C-U-A/C-G-G-C-A-C-3′。C/U是胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)，G/U是鸟嘌呤(G)或U，R是嘌呤，Y是嘧啶，B是U、G或C，G/C是G或C，A/C是腺嘌呤(A)或C。5′-C/U-U-G/U-U-3′可以是CUGU、CUUU、UUGU或UUUU。在多个实施方案中，5′-R-U-R-G-Y-3′是GUAGU、GUAGC、GUGGU、GUGGC、AUAGU、AUAGC、AUGGU或AUGGC。在一个实施方案中，碱基序列是GUAGUGU。在多个实施方案中，5′-G-U-U-G-B-3′是GUUGU、GUUGG或GUUGC。在多个实施方案中，5′-G-U-G-U-G/U-3′是GUGUG或GUGUU。在一个实施方案中，碱基序列是GUGUUUAC。在多个实施方案中，5′-G/C-U-A/C-G-G-C-A-C-3′是GUAGGCAC、GUCGGCAC、CUAGGCAC或CUCGGCAC。

一般而言，本发明涉及免疫刺激性寡核糖核苷酸，其包含一个或多个免疫刺激性RNA基序、含有一个或多个本发明的免疫刺激性ORN的免疫刺激性组合物，和本发明的免疫刺激性ORN和免疫刺激性组合物的使用方法。

本文使用的术语“RNA”和等效的“天然RNA”旨在表示通过3′-5′磷酸二酯键共价连接在一起的两个或更多的核糖核苷酸(即每个分子包含与磷酸基和嘌呤或嘧啶核碱基(例如鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶)连接的一个核糖)。

免疫刺激性的RNA基序可以存在于免疫刺激性ORN的末端(当免疫刺激性ORN具有游离末端时)。例如，具有游离末端的免疫刺激性ORN和位于免疫刺激性ORN末端的免疫刺激性RNA基序可以作为X_aM或作为MX_b存在，其中M表示免疫刺激性RNA基序，X_a和X_b各自独立地表示免疫刺激性ORN除免疫刺激性RNA基序外的一个或多个相同或不同的核苷酸。

或者，免疫刺激性RNA基序可以在其两侧末端连接有免疫刺激性ORN的至少一个额外的核苷酸，无论该免疫刺激性ORN是否具有游离末端。例如，具有游离末端和免疫刺激性RNA基序侧翼的核苷酸的免疫刺激性ORN可以作为X_aMX_b存在，其中M表示免疫刺激性RNA基序，X_a和X_b各自独立地表示免疫刺激性ORN除免疫刺激性RNA基序外的一个或多个相同或不同的核苷酸。

在不同的实施方案中，包含免疫刺激性RNA基序的免疫刺激性ORN可含有单个基序或多于一个的免疫刺激性RNA基序。单个免疫刺激性ORN中具有两个或更多免疫刺激性RNA基序被认为可能是有利的，例如如果基序被隔开使得免疫刺激性ORN能够结合两个或更多的TLR的时候。例如，免疫刺激性ORN可以结合两个或更多的TLR8受体，从而扩增或修饰得到的免疫刺激作用。

当免疫刺激性ORN包含多于一个免疫刺激性RNA基序时，在一个实施方案中免疫刺激性ORN可作为M₁XM₂存在，其中M₁和M₂各自独立地表示免疫刺激性RNA基序，X表示免疫刺激性ORN除免疫刺激性RNA基序外的一个或多个相同或不同的核苷酸。在一个实施方案中，X包含本文所述的非核苷酸接头。在一个实施方案中，X包含本文所述的分支单元。

当免疫刺激性ORN中存在多于一个免疫刺激性RNA基序时，该基序一般可以在沿着免疫刺激性ORN的任何位置发生。例如，当存在两个基序时，它们可各自存在于免疫刺激性ORN的末端。或者，一个基序可以存在于一个末端，一个基序可以通过免疫刺激性ORN的至少一个外的核苷酸包围在其两侧末端。还在另一实施方案中，各基序可以通过免疫刺激性ORN的至少一个额外的核苷酸包围在其两侧末端。

免疫刺激性ORN包括但不限于以下，以从左到右读出5’到3’显示：

在一些实施方案中，ORN是下表1和表2显示的活性ORN之一，例如以下：U*U*A*G*G*C*A*C(SEQ ID NO：2)、A*U*A*G*G*C*A*C(SEQID NO：4)、G*C*C*A*C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*A*U*A*C*C(SEQ IDNO：11)、A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U(SEQ IDNO：12)、U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U(SEQ IDNO：13)、A*A*U*A*A*U*A*A*U*A*A*U*A*A*U*A*A*U*A*A(SEQ IDNO：16)、A*A*A*U*A*A*A*U*A*A*A*U*A*A*A*U*A*A*A*U(SEQ IDNO：17)、A*A*A*A*U*A*A*A*A*U*A*A*A*A*U*A*A*A*A*U(SEQ IDNO：18)、C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U(SEQ IDNO：24)、U*U*A*U*U*A*U(SEQ ID NO：30)、U*A*U*A*U*A*U(SEQ IDNO：33)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*U*A*C*C*C(SEQ ID NO：48)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*U*U*G*A*A*C*C(SEQ ID NO：76)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*A*C*C*C*C(SEQ ID NO：42)、C*C*G*A*G*C*C*A*U*A*U*A*U*A*U*C(SEQ ID NO：39)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*U*A*U*U*A*C*C(SEQ ID NO：65)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*C*C*C*C*C(SEQ ID NO：44)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*C*U*A*C*C*C*C(SEQ ID NO：47)、C*C*G*A*G*C*C*A*U*A*U*A*U*C*C*C(SEQ ID NO：38)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*U*A*U*A*C*C*C(SEQ ID NO：37)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*A*A*C*C*C(SEQ ID NO：40)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*U*A*U*C*C*C*C(SEQ ID NO：55)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*G*U*A*C*C(SEQ ID NO：82)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*A*U*A*C*C(SEQ ID NO：85)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*G*U*A*C*C(SEQ ID NO：63)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*C*U*A*A*C*C*C(SEQ ID NO：43)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*A*U*C*C*C(SEQ ID NO：36)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*C*U*A*C*C(SEQ ID NO：87)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*A*C*C*C*C(SEQ ID NO：45)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*A*A*C*C*C(SEQ ID NO：41)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*G*U*G*C*C(SEQ ID NO：83)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*C*C*C*C*C(SEQ ID NO：46)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*C*U*G*C*C(SEQ ID NO：88)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*C*G*C*C*C*C*C(SEQ ID NO：35)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*C*U*C*C*C(SEQ ID NO：84)或C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*G*C*A*C*C(SEQ ID NO：56)。

如上所述，RNA是通过3’-5’磷酸二酯键连接的核糖核苷酸的多聚物。在某些实施方案中，本发明的免疫刺激性ORN是RNA。然而，本发明的免疫刺激性ORN不限于RNA，如下文将描述的。

在一个实施方案中，本发明的免疫刺激性ORN可以包含两个或更多经修饰的核碱基，即A、C、G和U的衍生物。这些经修饰的核碱基的特定实施方案包括但不限于5-取代的胞嘧啶(例如5-甲基-胞嘧啶、5-氟-胞嘧啶、5-氯-胞嘧啶、5-溴-胞嘧啶、5-碘-胞嘧啶、5-羟基-胞嘧啶、5-羟甲基-胞嘧啶、5-二氟甲基-胞嘧啶，和未取代的或取代的5-炔基-胞嘧啶)、6-取代的胞嘧啶，N4-取代的胞嘧啶(例如N4-乙基-胞嘧啶)、5-氮杂-胞嘧啶、2-巯基-胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、带有稠环系统的胞嘧啶类似物(例如N，N’-丙烯胞嘧啶或吩噁嗪)，和尿嘧啶及其衍生物(例如5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-溴乙烯基-尿嘧啶、4-硫代-尿嘧啶、5-羟基-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶)，胸腺嘧啶衍生物(例如2-硫代胸腺嘧啶、4-硫代胸腺嘧啶、6-取代的胸腺嘧啶)，鸟苷衍生物(7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-7-取代的鸟嘌呤(例如7-脱氮-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤)、7-脱氮-8-取代的鸟嘌呤、次黄嘌呤、N2-取代的鸟嘌呤(例如N2-甲基-鸟嘌呤)、8-取代的鸟嘌呤(例如8-羟基鸟嘌呤和8-溴代鸟嘌呤)和6-硫代鸟嘌呤)或腺苷衍生物(5-氨基-3-甲基-3H，6H-噻唑基[4，5-d]嘧啶-2，7-二酮、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、嘌呤、吲哚、腺嘌呤、取代的腺嘌呤(例如N6-甲基-腺嘌呤、8-氧-腺嘌呤))。碱基也可以被通用碱基(例如4-甲基-吲哚、5-硝基-吲哚、3-硝基吡咯、P-碱基和K-碱基)、芳环(例如苯并咪唑或二氯-苯并咪唑、1-甲基-1H-[1，2，4]三唑-3-羧酸胺)、芳环系统(例如氟苯或二氟联二苯)或氢原子(dSpacer)取代。优选的碱基修饰是尿嘧啶和7-脱氮-鸟嘌呤。这些经修饰的U核碱基和它们对应的核糖核酸可从商业供应商得来。

经修饰的G核碱基的特定实施方案包括N²-二甲基鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮-7-取代的鸟嘌呤、7-脱氮-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤、7-脱氮-8-取代的鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤、6-硫代鸟嘌呤和8-氧代鸟嘌呤。在一个实施方案中，经修饰的G核碱基是8-羟基鸟嘌呤。这些经修饰的G核碱基和它们相应的核糖核苷可得自商业供应商。

在某些实施方案中，至少一个β-核糖单元可以被β-D-脱氧核糖或经修饰的糖单元置换，其中经修饰的糖单元例如选自β-D-核糖、α-D-核糖、β-L-核糖(如‘Spiegelmers’中)、α-L-核糖、2’-氨基-2’-脱氧核糖、2’-氟-2’-脱氧核糖、2’-O-(C1-C6)烷基核糖，优选2′-O-(C1-C6)烷基核糖为2′-O-甲基核糖、2’-O-(C2-C6)链烯基核糖、2’-[O-(C1-C6)烷基-O-(C1-C6)烷基]核糖、LNA和α-LNA(Nielsen P et al.(2002)Chemistry-A European Journal8：712-22)、β-D-木-呋喃糖、α-阿拉伯呋喃糖、2’-氟代阿拉伯呋喃糖和碳环和/或开环糖类似物(描述于例如Vandendriessche et al.(1993)Tetrahedron49：7223中)和/或双环糖类似物(描述于例如Tarkov M et al.(1993)HelvChim Acta 76：481中)。

或者，本发明的免疫刺激性ORN的各核糖核苷酸和核糖核苷可以通过非核酸的接头连接，尤其是脱碱基接头(abasic linkers(dSpacers))、三乙二醇单元或六乙烯基乙二醇(hexaethylene glycol)单元。其它接头为烷氨基(alkylamino)接头，例如C3、C6和C12氨基接头，以及烷基硫醇(alkylthiol)接头，例如C3或C6硫醇接头。或者，本发明的免疫刺激性ORN的个体核苷酸和核糖核苷可以通过芳香族残基连接，所述芳香族残基还可被烷基或取代的烷基取代。

RNA是通过3’-5’磷酸二酯联接而连起来的核糖核苷酸的多聚物。本发明的免疫刺激性ORN的核苷酸也可以通过3’-5’磷酸二酯联接连起来。然而，本发明也包括具有异常核苷酸间联接的ORN，特异地包含5′-5′、3′-3′、2′-2′、2′-3′和2′-5′核苷酸间键。在一个实施方案中，这类异常联接被排除在免疫刺激性RNA基序外，尽管一个或多个这种联接可存在于免疫刺激性ORN的别处。对于具有游离末端的免疫刺激性ORN而言，包含一个3’-3’核苷酸间联接可导致免疫刺激性ORN具有两个游离的5’端。相反，对于具有游离末端的免疫刺激性ORN而言，包含一个5’-5’核苷酸间联接可导致免疫刺激性的ORN具有两个游离的3’末端。

本发明的免疫刺激性组合物可含有两个或更多的免疫刺激性RNA基序，其可以通过分支的单元连接。核苷酸间联接可以是3′-5′、5′-5′、3′-3′、2′-2′、2′-3′或2′-5′联接。其中，名称2’-5’根据核糖的碳原子选择。异常核苷酸间联接可以是磷酸二酯联接，但是其也可以被修饰为硫代磷酸酯或本文所述的任何其它经修饰的联接。下式通过核苷酸分支单元显示本发明的分支的免疫刺激性ORN的一般结构。其中Nu₁、Nu₂和Nu₃可以通过3′-5′、5′-5′、3′-3′、2′-2′、2′-3′或2′-5′-联接来连接。免疫刺激性ORN的分支也可以涉及非核苷酸接头和脱碱基间隔的使用。在一个实施方案中，Nu₁、Nu₂和Nu₃表示相同或不同的免疫刺激性RNA基序。在另一实施方案中，Nu₁、Nu₂和Nu₃包含至少一个免疫刺激性RNA基序和至少一个免疫刺激性CpG DNA基序。

免疫刺激性ORN可含有双倍的或三倍的单元(Glen Research，Sterling，VA)，尤其是具有3’-3’键的免疫刺激性ORN。在一个实施方案中，双倍单元可以以1，3-双-[5-(4，4′-二甲氧基三四丁酚醛)戊基酰胺基]丙基-2-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺为基础。在一个实施方案中，三倍单元可以以Tris-2，2，2-[3-(4，4′-二甲氧基三四丁酚醛)丙基氧甲基]乙基-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺的整合为基础。多重双倍、三倍或其它多倍单元对免疫刺激性ORN的分支导致树状聚体，其为本发明的另一实施方案。分支的免疫刺激性ORN可以导致免疫刺激性RNA的受体(如TLR3、TLR7和TLR8)的交联，具有与未分枝形式的免疫刺激性ORN相比不同的免疫作用。另外，分支或其它的多体(multimeric)免疫刺激性ORN的合成可以稳定RNA不被降解，或可以使弱的或部分有效的RNA序列显示出治疗有用的免疫活性水平。免疫刺激性ORN也可以含有接头单元，其得自肽修饰试剂或寡核苷酸修饰试剂(Glen Research)。另外，免疫刺激性ORN可含有通过肽(酰胺)联接与多聚物连接的一个或多个天然的或非天然的氨基酸残基。

3′-5′，5′-5′，3′-3′，2′-2′，2′-3′和2′-5′核苷酸间联接可以是直接的或非直接的。在该上下文中，直接联接是指本文公开的磷酸联接或经修饰的磷酸联接，不含插入接头部分。插入接头部分是与本文公开的磷酸联接或经修饰的磷酸联接不同的有机部分，其可包括例如聚乙二醇、三乙二醇、六乙二醇、dSpacer(即脱碱基脱氧核苷酸)、二倍单元或三倍单元。

在某些实施方案中，免疫刺激性ORN与另一实体缀合产生缀合物。本文使用的缀合物是指通过任何物理化学途径(包括疏水相互作用和共价偶合)彼此结合的任两个或多个实体的组合。

在另一实施方案中，免疫刺激性ORN可以与被免疫刺激性受体识别的小分子量配体缀合。该受体优选是TLR家族的成员，例如TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8或TLR9。小分子量配体是针对这些受体的天然配体的拟态。例子包括但不限于：刺激TLR7和TLR8二者的R-848(Resiquimod)、R-837(Imiquimod；ALDARA^TM，3M Pharmaceuticals)、7-脱氮-鸟苷、7-硫代-8-氧-鸟苷和7-烯丙基-8-氧-鸟苷(Loxoribine)。D-吡喃葡萄糖衍生物如3D-MPL(TLR4配体)也可以与免疫刺激性ORN缀合。Pam3-Cys是能够与免疫刺激性ORN缀合的TLR2配体的一个例子。含有CpG基序的寡脱氧核苷酸是TLR9配体，这些也可以与本发明的免疫刺激性ORN缀合。在一个实施方案中，至少一个包含对刺激TLR9信号转导有效的CpG基序的寡脱氧核苷酸与本发明的免疫刺激性ORN缀合。针对不同TLR的配体进入一个分子的缀合可导致受体的多聚化，这导致与任何单个这类配体引起的相比增强的免疫刺激或不同的免疫刺激谱。

本发明一方面提供了本发明的免疫刺激性ORN和亲脂部分的缀合物。在某些实施方案中，免疫刺激性ORN与亲脂性部分共价连接。亲脂性部分通常会存在于具有游离末端的免疫刺激性ORN的一个或多个末端上，尽管在某些实施方案中，亲脂性部分可以在免疫刺激性ORN的别处存在，并从而不要求免疫刺激性ORN具有游离末端。在一个实施方案中，免疫刺激性ORN具有3’末端，亲脂性部分与所述3’末端共价连接。亲脂性基团一般可以是胆固醇基、经修饰的胆固醇基、胆固醇衍生物、被还原的胆固醇、被取代的胆固醇、胆甾烷、C16烷基链、胆汁酸、胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸、油酰基石胆酸(oleyl litocholic acid)、油酰胆烯酸、糖脂、磷脂、鞘脂、类异戊二烯如类固醇、维生素如维生素E、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、脂肪酸酯如甘油三酯、芘、紫菜碱、Texaphyrine、金刚烷胺、吖啶、生物素、香豆素、荧光素、罗丹明、Texas-Red、地高辛(digoxygenin)、二对甲氧三苯甲基、t-丁基二甲基甲硅烷、t-丁基联二苯甲硅烷、花青染料(例如Cy3或Cy5)、Hoechst33258染料、补骨脂素或布洛芬。在某些实施方案中，亲脂性部分选自胆固醇基、棕榈基和脂肪酰基。在一个实施方案中，亲脂性部分为胆固醇基。认为本发明的免疫刺激性ORN中包括一个或多个这类亲脂性部分又赋予它们针对核酸酶降解的额外的稳定性。当本发明的单个免疫刺激性ORN中存在两个或多个亲脂性部分时，这类亲脂性部分可以彼此独立地被选择。

在一个实施方案中，亲脂性部分附着在免疫刺激性ORN的核苷酸的2’位置上。亲脂性基团或者或额外地与免疫刺激性ORN的核苷酸的杂环核碱基连接。亲脂性部分可以通过任何合适的直接或间接联接与免疫刺激性ORN共价连接。在一个实施方案中，该联接是直接的并且是酯或酰胺。在一个实施方案中，该联接是间接的并包括间隔部分，例如一个或多个脱碱基的核苷酸残基、寡聚乙二醇如三乙二醇(间隔9)或六乙二醇(间隔18)或链烷二醇如丁二醇。

在一个实施方案中，本发明的免疫刺激性ORN有利地与阳离子脂质或阳离子肽组合。阳离子脂质和阳离子肽被认为帮助将免疫刺激性ORN运输进核内体区室中，TLR8存在于其中。在一个实施方案中，阳离子脂质为DOTAP(N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲基铵甲基硫酸酯)。DOTAP被认为将RNA寡聚体转运进入细胞并特异地运输至核内体区室中，在那里其可以以pH依赖性的模式释放RNA寡聚体。在核内体区室中时，RNA可以与某些细胞内TLR相互作用，引发设计免疫应答产生的TLR介导的信号转导途径。具有相似特性(包括运输至核内体区室)的其它试剂可以代替DOTAP或除DOTAP外使用。其它液体配方包括例如EFFECTENE^TM(具有特异DNA压缩增强子的非脂质体脂质)和SUPERFECT^TM(新颖的作用dendrimeric技术)。脂质体可商业得自Gibco BRL，例如LIPOFECTIN^TM和LIPOFECTACE^TM，它们是由阳离子脂质如N-[1-(2，3二油酰氧)-丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)和二甲基溴化二十八烷铵(DDAB)形成的。用于制造脂质体的方法是本领域已知的并描述于许多出版物中。脂质体也已由Gregoriadis G(1985)TrendsBiotechnol 3：235-241综述。

在一个实施方案中，本发明的免疫刺激性ORN是具有一级结构和二级结构的共价闭合的、哑铃形分子的形式。如本文所公开的，在一个实施方案中这类环状寡核糖核苷酸包含通过插入的双链区段连接的两个单链环。在一个实施方案中，至少一个单链环包含本发明的免疫刺激性RNA基序。本发明的其它共价闭合的、哑铃形的分子包括嵌合的DNA:RNA分子，其中例如双链区段至少部分是DNA(例如同源二聚体dsDNA或医院二聚体DNA:RNA)且至少一个单链的环包含本发明的免疫刺激性RNA基序。或者，嵌合分子的双链区段为RNA。

在某些实施方案中，免疫刺激性的ORN是经分离的。经分离的分子是基本纯净的并且不含其它物质的分子，所述其它物质与所述分子通常一起存在于自然界中或体内系统中，存在程度达到对所述分子目的用途而言能够实践的并且适当的程度。免疫刺激性ORN尤其是足够纯净和足够不含细胞的其它生物学组分的，从而适用于例如生产药物制剂。因为经分离的本发明的刺激性ORN可以与可药用运载体在药物制剂中混合，所以免疫刺激性ORN可仅包含按重量计小量百分比的制剂。但是免疫刺激性ORN是基本纯净的，因为所述ORN已经基本与生活系统中可与之结合的物质分离。

为了本发明中的用途，本发明的免疫刺激性ORN可以使用或适应本领域公知的大量步骤的任何来从新合成。例如β氰乙基亚磷酰胺方法(Beaucage SL et al.(1981)Tetrahedron Lett 22：1859)；核苷H-磷酸酯方法(Garegg P et al.(1986)Tetrahedron Lett 27：4051-4；Froehler BC et al.(1986)Nucl Acid Res 14：5399-407；Garegg P et al.(1986)Tetrahedron Lett 27：4055-8；Gaffney BL et al.(1988)Tetrahedron Lett 29：2619-22)。这些化学可以通过市售的大量自动化核酸合成仪进行。根据本发明适用的其它合成方法公开于Uhlmann E et al.(1990)Chem Rev 90：544-84和Goodchild J(1990)Bioconjugate Chem 1：165中。

对寡核糖核苷酸的合成可以在溶液中或在固相支持物上进行。在溶液中，优选阻滞偶联反应(二聚体、三聚体、四聚体等)，而固相合成优选使用单体构件块在分步的过程中进行。已经描述(Eckstein F(1991)Oligonucleotides and Analogues，A Practical Approach，IRL Press，Oxford)了不同的化学，例如磷酸三酯法、H-磷酸酯方法和亚磷酰胺方法。尽管在磷酸三酯方法中，反应性的磷基团在氧化速率+V中，但是根据亚磷酰胺和H-磷酸酯途径，偶联反应中使用更具反应性的Phosphor+III衍生物。在后两种途径中，磷在偶联步骤后被氧化产生稳定的P(V)衍生物。如果氧化剂是碘/水/碱基，则在脱保护后获得磷酸二酯。相反，如果氧化剂是硫化剂如Beaucage’s试剂，则在脱保护后获得硫代磷酸酯。

用于寡核糖核苷酸合成的一个有效方法是使用(如Matteucci andCaruthers最初针对寡聚脱氧核苷酸所描述的)亚磷酰胺化学的固体支持合成法的组合。Matteucci MD et al.(1981)J Am Chem Soc 103：3185。

对寡核糖核苷酸的合成与对寡脱氧核苷酸的合成是类似的，差异在于寡核糖核苷酸中存在的2’羟基必须被合适的羟基保护基团保护。单体可以例如被RNA单体构件块中的2’-O-t-丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)基团保护。然而，使用含有2′-O-三异丙基甲硅烷基氧甲基(TOM)基团(TOM-Protecting-Group^TM)的单体合成RNA已经被报导产生更高的偶联效力，因为TOM保护基团显示比TBDMS基团更低的位阻。尽管使用氟化物去除TBDMS保护基团，但是使用乙醇/水中的甲胺在室温下达成TOM基团的快速脱保护。在寡聚(核糖)核苷酸合成中，优选从3’-5’末端的链延伸，这通过将具有3’-磷(III)基团的核糖核苷酸单元或其被活化的衍生物与另一核苷酸单元的游离5’羟基基团偶联达成。

合成可以使用自动化DNA/RNA合成仪便利地进行。其中可使用合成仪供应商推荐的合成循环。对于核糖核苷亚磷酰胺单体而言，偶联时间与脱氧核苷单体相比更长(例如400秒)。作为固体支持物，可以使用500到

的可控多孔玻璃(CPG)支持物或有机多聚体支持物，例如引物支持物PS200(Amersham)。固体支持物通常含有通过其3’-末端结合的第一个核苷，例如5’-O-二对甲氧三苯甲基-N-6-苯甲酰腺苷。用三氯乙酸切割5’-O-二对甲氧三苯甲基基团后，使用例如5’-O-二对甲氧三苯甲基-N-保护的-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-核苷-3’-O-亚磷酰胺达成链延伸。连续的重复循环后，通过用浓氨水/乙醇(3∶1，v∶v)在30℃处理24小时将完成的寡核糖核苷酸从支持物上切割并脱保护。最后使用三乙胺/HF将TBDMS封闭基团切除。可以通过离子交换柱高压液相色谱(HPLC)、离子对反相HPLC或聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化粗的寡核糖核苷酸并通过质谱法来分析。

5’缀合物的合成后直接在固相合成中将待连接的的分子的亚磷酰胺与末端核苷酸的5’羟基偶联。可商业获得这类配体的多种亚磷酰胺衍生物，例如胆固醇、吖啶、生物素、普素拉伦(psoralene)、乙二醇或氨基烷基残基。或者，可以在固相合成期间引入氨基烷基功能，其允许通过活化的缀合物分子(例如活性酯、异硫脲或碘-乙酰胺)进行合成后衍生化。

3’端缀合物的合成通常通过使用相应被修饰的固体支持物完成，所述支持物例如可商业获得的胆固醇基衍生的固体支持物。然而，缀合也可以在核苷酸间键、核碱基或核糖残基(例如核糖的2’-位置)上进行。

对于环状寡核糖核苷酸而言，寡核苷酸链的延伸可以使用标准亚磷酰胺化学在核苷酸PS固体支持物(Glen Research)上进行。然后使用磷酸三酯偶联步骤(Alazzouzi et al.(1997)Nucleosides Nucleotides 16：1513-14)在固体支持物上进行环化反应。在用氢氧化铵最终脱保护时，事实上进入溶液中的唯一产物是期望的环状寡核苷酸。

本发明的环状寡核糖核苷酸包括闭环形式的RNA，并可包括带有或不带有双链RNA的单链RNA。例如，在一个实施方案中，所述环状寡核糖核苷酸包括双链的RNA并呈现具有两个单一标准环的哑铃构象，所述两个环通过插入的双链区段连接。共价闭合的、哑铃形的CpG寡脱氧核苷酸已经描述于U.S.Pat.No.6,849,725中。在另一实施方案中，环状寡核糖核苷酸包括双链的RNA并呈现下述构型，所述构型具有通过插入的双链区段连接的三个或更多的单链环。在一个实施方案中，免疫刺激性RNA位于一个或多个单链区段中。

本发明的免疫刺激性ORN适用于单独或与其它试剂如佐剂组合使用。本文使用的佐剂表示：除抗原以外增强应答抗原的免疫细胞活化(例如体液和/或细胞免疫应答)的物质。佐剂促进佐细胞的聚集和/或活化，以增强抗原特异的免疫应答。佐剂被用于增强疫苗的效率，所述疫苗即用于诱导针对抗原的保护性免疫的含抗原组合物。

佐剂通常包括传见储存效应的佐剂、免疫刺激佐剂和创建储存效应并刺激免疫系统的佐剂。本文使用的创建储存效应的佐剂是指引起抗体在体内缓慢释放，从而延长免疫细胞对抗原暴露的佐剂。这种佐剂包括但不限于明矾(例如氢氧化铝、磷酸铝)；基于乳剂的配方，包括矿物油、非矿物油、油包水或油包水包油乳剂，水包油乳剂例如Montanide佐剂的Seppic ISA系列(例如Montanide ISA 720；AirLiquide，Paris，法国)；MF-59(用Span 85和Tween 80稳定的水包角鲨烯乳剂，Chiron Corporation，Emeryville，Calif.)；和PROVAX(含有稳定洗涤剂和成微团剂的水包油乳剂；IDEC Pharmaceuticals Corporation，San Diego，Calif.)。

免疫刺激佐剂是引起免疫系统细胞活化的佐剂。其可例如引起免疫细胞的生产和细胞因子的分泌。这类佐剂包括但不限于从Q.saponaria树树皮中纯化的皂苷，如QS21(在HPLC级分的第21个峰中洗脱的糖脂；Aquila Biopharmaceuticals，Inc.，Worcester，Mass.)；多聚[二(羧酸苯氧基(carboxylatophenoxy))磷腈](PCPP多聚物；Virus Research Institute，美国)；脂多糖衍生物如单磷酸类脂A(MPL；Ribi ImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，Mont.)、胞壁酰二肽(MDP；Ribi)、andthreonyl-胞壁酰二肽(t-MDP；Ribi)；OM-174(与脂质A相关的葡糖胺二糖；OM Pharma SA，Meyrin，Switzerland)和Leishmania延伸因子(经纯化的Leishmania蛋白；Corixa Corporation，Seattle，Wash.)。该种类的佐剂也包括CpGDNA。

创建储存作用并刺激免疫系统的佐剂是具有上述两种功能的化合物。这类佐剂包括但不限于ISCOMS(免疫刺激复合物，其含有混合的皂苷、脂质并与可保留抗原的孔形成病毒大小的颗粒；CSL，Melbourne，Australia)；SB-AS2(SmithKline Beecham佐剂系统#2，其为含有MPL和QS21的水包油乳剂：SmithKline Beecham Biologicals[SBB]，Rixensart，比利时)；SB-AS4(SmithKline Beecham佐剂系统#4，其含有明矾和MPL；SBB，比利时)；非离子嵌段共聚物，其形成微团如CRL 1005(这些含有侧翼为聚氧乙烯链的疏水性聚氧丙烯线性链；Vaxcel，Inc.，Norcross，Ga.)；和Syntex佐剂配方(SAF，含有Tween 80的水包油乳剂和非例子的嵌段共聚物；Syntex Chemicals，Inc.，Boulder，Colo.)。

本发明一方面提供了自身包含本发明的免疫刺激性ORN的佐剂。在另一实施方案中，本发明提供了包含本发明的免疫刺激性ORN和至少一种其它佐剂的佐剂(组合佐剂)。所述其它佐剂可包含创建储存作用的佐剂、免疫刺激的佐剂、创建储存作用并刺激免疫系统的佐剂及其任何组合。在一个实施方案中，本发明的免疫刺激性ORN和至少一种其它佐剂彼此共价连接。根据本发明的组合佐剂与免疫刺激ORN单独和至少一种其它佐剂单独的作用之和相比，可显示协同的免疫刺激作用。另外或或者，根据本发明的组合佐剂可显示与免疫刺激性ORN单独或至少一种其它佐剂单独相比，改变的免疫刺激谱。例如，组合佐剂可以在一个实施方案中提供更分支形式的Th1/Th2免疫刺激，或其可以在另一实施方案中提供更倾斜(skewed)形式的Th1/Th2免疫刺激。本领域的这些技术人员应当明白如何选择个体组分以促进期望类型的免疫刺激，例如关于Th1和Th2特征更加分支或更倾斜。Th1和Th2在下文中有进一步描述。

还提供了一种组合物，所述组合物包含本发明的免疫刺激性ORN加上另一佐剂，其中所述其它佐剂为细胞因子。在一个实施方案中，该组合物是本发明的免疫刺激性ORN和细胞因子的缀合物。

细胞因子是由许多种细胞生产的介导炎症反应和免疫反应的可溶性蛋白质和糖蛋白。细胞因子介导免疫系统细胞之间的交流，局部和全身性地作用以募集细胞和调节它们的功能和增殖。细胞因子的范畴包含先天免疫的介质和调节器、适应性免疫的介质和调节器，以及血细胞生成的刺激器。包括在细胞因子内的是白介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18和白介素19-32(IL-19-IL-32)，除了别的以外)、趋化因子(例如IP-10、RANTES、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、嗜酸细胞活化趋化因子、I-TAC和BCA-1，除了别的以外)以及其它细胞因子，包括1型干扰素(例如IFN-α和IFN-β)、2型干扰素(例如IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)和多种集落刺激因子(CSF)，包括GM-CSF、G-CSF和M-CSF。

还提供了包含本发明的免疫刺激性ORN加上免疫刺激性CpG核酸的组合物。在一个实施方案中，该组合为本发明的免疫刺激性ORN和CpG核酸的缀合物，例如RNA:DNA缀合物。在一个实施方案中，该组合物是本发明的免疫刺激性ORN与CpG核酸的混合物，即不是RNA:DNA缀合物。

本文使用免疫刺激性CpG核酸是指天然或合成的DNA序列，其含有CpG基序并刺激免疫系统细胞的活化或增殖。免疫刺激性CpG核酸已经在大量出版的专利、公开的专利申请和其它出版物中描述，包括U.S.Pat.Nos.6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116和6,339,068。在一个实施方案中，免疫刺激性CpG核酸是6-100个核苷酸长的CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)。在一个实施方案中，免疫刺激性CpG核酸是8-40个核苷酸长的CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)。

免疫刺激性CpG核酸包括不同种类的CpG核酸。一种能够激活B细胞但是在诱导IFN-α和NK细胞活化时相对弱；该种类已经被命名为B类。典型地，B类CpG核酸被完全稳定，其在某些优选的碱基环境中具有未甲基化的CpG二核苷酸。参阅例如U.S.Pat.Nos.6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116和6,339,068。另一种类能够诱导IFN-α和NK细胞活化，但是在刺激B细胞时相对弱，该种类已经被称作A类。A类CpG核酸在5’和3’两个末端典型地具有回文的至少6个核苷酸的含磷酸二酯CpG二核苷酸的序列和稳定的多聚G序列。参阅例如公开的国际专利申请WO 01/22990。CpG核酸的再一种类激活B细胞和NK细胞并诱导IFN-α；该种类已经被称作C类。如首先分析的，C类CpG核酸典型地被完全稳定，包括B类型序列和富含GC的回文序列或近似回文序列。该种类已经描述于公开的U.S.专利申请2003/0148976中，其全部内容通过引用并入本文。

免疫刺激性CpG核酸也包括如公开的U.S.专利申请2003/0148976中所公开的所谓的软性和半软性CpG核酸，所述申请的全部内容通过引用并入本文。这类软性和半软性免疫刺激性CpG核酸整合核酸酶抗性和核酸酶敏感性核苷酸间键的组合，其中不同类型的键根据某些原则定位。

还提供了包含本发明的免疫刺激性ORN系上另一佐剂的组合物，其中所述另一佐剂是脂肽如Pam3Cys、阳离子多糖如壳聚糖，或阳离子肽如鱼精蛋白。在一个实施方案中，组合物为本发明的免疫刺激性ORN和另一佐剂的缀合物。

本发明一方面提供了包含本发明的免疫刺激性ORN和抗原的疫苗。本文使用的“抗原”表示：能够被T细胞抗原受体或B细胞抗原受体识别的任何分子。该术语广泛地包含被宿主免疫系统识别为外源的任何类型的分子。抗原一般包括但不限于细胞、细胞提取物、蛋白质、多肽、肽、多糖、多糖缀合物、多糖和其它分子的肽和非肽拟态、小分子、脂质、糖脂、多糖、碳水化合物、病毒和病毒提取物以及多细胞生物如寄生虫和变应原。对于为蛋白质、多肽或肽的抗原而言，这类抗原可包括编码这类抗原的核酸分子。抗原更特异地包括但不限于：癌症抗原，其包括癌细胞和在癌细胞中或癌细胞上表达的分子；微生物抗原，其包括微生物和在微生物中或微生物上表达的分子；和变应原。因此，本发明在某些实施方案中提供了用于癌症、传染原和变应原的疫苗。

本发明的一个方面提供了本发明的免疫刺激性ORN用于制备药剂的用途，所述药剂用于疫苗接种受试者。

本发明的一个方面提供了用于制备疫苗的方法。该方法包括下述步骤：将本发明的免疫刺激性ORN置于与抗原和任选的可药用运载体的直接结合中。

在多种实施方案中，抗原为微生物抗原、癌症抗原或变应原。本文使用的“微生物抗原”是指微生物的抗原，其包括但不限于病毒、细菌、寄生虫和真菌。这类抗原包括完整的微生物及其天然的隔离群或片段或衍生物，也包括与天然微生物抗原相同或相似并诱导对该微生物特异的免疫应答的合成化合物。如果化合物诱导对天然微生物抗原的免疫应答(体液和/或细胞)，则其与天然微生物抗原类似。这类抗原是本领域常规使用的并是本领域常规技术人员公知的。

病毒是小传染原，其一般含有核酸核心和蛋白质外壳，但是不能独立生活的生物。病毒也可以采取缺乏蛋白质的传染性核酸的形式。不存在病毒在其中能够复制的生活细胞时，病毒不能存在。病毒通过胞吞作用或直接注射DNA(噬菌体)进入特异的生活细胞并繁殖，引起疾病。然后繁殖的病毒可以被释放或感染其它细胞。一些病毒是含DNA的病毒，其它是含RNA的病毒。在一些方面，本发明也旨在治疗疾病，所述疾病中感染性月元蛋白质(prion)在疾病进展中被复制，所述疾病例如牛海绵状脑病(即疯牛病，BSE)或动物中的绵羊瘙痒病感染，或人中的Creutzfeldt-Jakob疾病。

病毒包括但不限于：肠道病毒(包括但不限于picornaviridae科，例如脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒(coxsackie virus)、艾柯病毒(echo virus))、轮状病毒、腺病毒、肝炎病毒。已经在人中发现的病毒的特异例子包括但不限于：Retroviridae(例如人免疫缺陷病毒如HIV-1(也称作HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV或HIV-III；和其它隔离群，例如HIV-LP))；Picornaviridae(例如脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒；肠道病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、艾柯病毒)；Calciviridae(例如引起胃肠炎的菌株)；Togaviridae(例如马脑炎病毒、风疹病毒)；Flaviviridae(例如登革热病毒、脑炎病毒、黄热病病毒)；Coronaviridae(例如冠形病毒)；Rhabdoviridae(例如疱疹性口炎病毒、狂犬病病毒)；Filoviridae(例如埃博拉病毒)；Paramyxoviridae(例如副流感病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；Orthomyxoviridae(例如流感病毒)；Bunyaviridae(例如汉坦病毒(Hantaan viruses)、bunya病毒、静脉病毒(phleboviruses)和Nairo病毒)；Arenaviridae(出血热病毒)；Reoviridae(例如呼肠病毒、orbiviurses和轮状病毒)；Birnaviridae；Hepadnaviridae(乙型肝炎病毒)；Parvoviridae(细小病毒组)；Papovaviridae(乳头瘤病毒属、多瘤病毒)；Adenoviridae(大部分腺病毒)；Herpesviridae(单纯疱疹病毒(HSV)1和2、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV))；Poxviridae(类天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)；Iridoviridae(例如非洲猪瘟病毒)；和未分类的病毒(例如海绵状脑病的病原(etiological agent)，丁型病毒性肝炎的病原(被认为是乙型肝炎病毒的有缺陷的随体)，非甲型、非乙型肝炎的病原(种类1＝内部传输；种类2＝肠胃外传输)(即丙型肝炎)；Norwalk及相关病毒和星状病毒)。

细菌是通过二元裂变无性繁殖的单细胞生物。根据其形态学、染色反应、营养和代谢需要、抗原结构、化学组成和遗传同源性对它们进行分类和命名。细菌根据其形态学形式可以被分为三类：球形(球菌)、直棒状(杆菌)和弯曲或螺旋棒状(弧菌、弯曲杆菌、螺菌和螺旋体)。细菌也更通常根据它们的染色反应被分为两类生物，革兰氏阳性和革兰氏阴性。革兰氏是指在微生物学实验室中通常进行的染色方法。革兰氏阳性生物在染色步骤后保持染色并显示深紫色。革兰氏阴性生物不保持染色但是吸收复染，并从而显示粉色。

传染性的细菌包括但不限于革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：Pasteurella的种、Staphylococci的种和Streptococcus的种。革兰氏阴性细菌包括但不限于：Escherichia coli、Pseudomonas的种和Salmonella的种。传染性细菌的特异例子包括但不限于：Helicobacter pyloris、Borrelia burgdorferi、Legionella pneumophilia、Mycobacteria sps(例如M.tuberculosis、M.avium、M.intracellulare、M.kansasii、M.gordonae)、Staphylococcus aureus、Neisseria gonorrhoeae、Neisseria meningitidis、Listeria monocytogenes、Streptococcus pyogenes (A组Streptococcus)、Streptococcus agalactiae(B组Streptococcus)、Streptococcus(viridans组)、Streptococcus faecalis、Streptococcus bovis、Streptococcus(厌氧种)、Streptococcus pneumoniae、pathogenicCampylobacter sp.、Enterococcus sp.、Haemophilus influenzae、Bacillusanthracis、Corynebacterium diphtheriae、Corynebacterium sp.、Erysipelothrix rhusiopathiae、Clostridium perfringens、Clostridium tetani、Enterobacter aerogenes、Klebsiella pneumoniae、Pasturella multocida、Bacteroides sp.、Fusobacterium nucleatum、Streptobacillus moniliformis、Treponema pallidum、Treponema pertenue、Leptospira、Rickettsia和Actinomyces israelli。

寄生虫是依赖于其它生物而存活的生物，因此其必须进入或感染其它生物以持续它们的生命周期。被感染的生物(即宿主)对寄生虫提供营养和生境。尽管该术语寄生虫以其最广泛的含义可以包括所有的传染原(即细菌、病毒、真菌、原生动物和蠕虫)，但是一般而言，该术语用于单独表示原生动物、蠕虫和外寄生节肢动物(例如蜱、螨等)。原生动物是单细胞的生物，其可细胞内或细胞外复制，尤其是在血、肠道或组织的细胞外基质中。蠕虫是几乎总是在细胞外的多细胞生物(除Trichinella spp.外)。蠕虫通常需要从初级宿主中退出并转移进入次级宿主中，从而复制。与这些上述的种类相反，外寄生节肢动物形成与宿主身体外表面的寄生关系。

寄生虫包括细胞内寄生虫和专性的细胞内寄生虫。寄生虫的例子包括但不限于Plasmodium falciparum、Plasmodium ovale、Plasmodiummalariae、Plasmdodium vivax、Plasmodium knowlesi、Babesia microti、Babesia divergens、Trypanosoma cruzi、Toxoplasma gondii、Trichinellaspiralis、Leishmania major、Leishmania donovani、Leishmaniabraziliensis、Leishmania tropica、Trypanosoma gambiense、Trypanosomarhodesiense和Schistosoma mansoni。

真菌是真核生物，只有一部分在脊椎动物哺乳动物中引起感染。因为真菌是真核生物，所以它们与原核的细菌在尺寸、结构组建、生命周期和繁殖机制上显著不同。真菌通常以其形态学特征、生殖模式和培养特征被分类。尽管真菌可在受试者中引起不同类型的疾病，例如吸入真菌抗原后的呼吸变态反应、由于摄取毒性物质(例如由毒蘑菇生产的Amanitaphalloides毒素和毒蕈肽和由曲霉的种生产的黄曲霉毒素)引起的真菌中毒，但是不是所有的真菌引起传染病。

传染性真菌可以引起全身性的或浅表性的感染。初级全身性感染可以在正常的健康受试者中发生，机会性感染最经常存在于免疫妥协的受试者中。引起初级全身性感染的最常见真菌物质包括Blastomyces、Coccidioides和Histoplasma。在免疫妥协的或免疫抑制的受试者中引起机会性感染的常见真菌包括但不限于Candida albicans、Cryptococcusneoformans和多种Aspergillus的种。全身性真菌感染是内部器官的侵入性感染。生物通常经过肺、胃肠道或静脉内导管进入身体。这些类型的感染可以由初级病原真菌或机会性真菌引起。

浅表性的真菌感染涉及真菌在外部表面的生长而不侵入内部组织。典型的浅表性真菌感染包括涉及皮肤、毛发或指甲的表皮真菌感染。

与真菌感染相关的疾病包括曲霉病，芽生菌病，念珠菌病，着色芽生菌病，球孢子菌病，隐球菌病，真菌眼感染，真菌毛发、指甲和皮肤感染，组织胞浆菌病，瘢痕疙瘩性芽生菌病，足菌肿，耳真菌病，副球孢子菌病，散布的Penicillium marneffei，暗色丝孢霉病，鼻孢子菌病，孢子丝菌病和接合菌病。

其它医学相关的微生物已经在文献中广泛描述，例如参阅C.G.AThomas，Medical Microbiology，Bailliere Tindall，Great Britain 1983，其整体内容通过引用并入本文。前述列表的每一内容都是阐述性的而非旨在限制。

本文使用的术语“癌症抗原”和“肿瘤抗原”可交换地使用来表示化合物，如肽、蛋白质或糖蛋白，其与肿瘤或癌细胞相关，并且在主要组织相容性复合物(MHC)分子环境中的抗原呈递细胞表面上表达时能够激发免疫应答。由癌细胞差异表达的癌症抗原能够被利用以靶向癌细胞。癌症抗原是可能明显地刺激肿瘤特异免疫应答的抗原。这些抗原中的一些由正常细胞编码，尽管不必须由正常细胞表达。这些抗原可以被表征为在正常细胞中通常沉默(即不表达)的、仅在分化的某些阶段表达的，和短暂表达的抗原(例如胚胎抗原和胎儿抗原)。其它癌症抗原由突变的细胞基因编码，例如癌基因(例如激活的ras癌基因)、抑制基因(例如突变的p53)、得自内部缺失或染色体易位的融合蛋白。还有其它癌症抗原可以由病毒基因编码，例如RNA和DNA肿瘤病毒上载有的病毒基因。

癌症抗原可以通过制备癌细胞粗提物(例如Cohen PA et al.(1994)Cancer Res 54：1055-8中所述)、通过部分纯化抗原、通过重组激素或通过已知抗原的从新合成从癌细胞中制备。癌症抗原包括但不限于被重组表达的抗原、其免疫原性部分或其完整的肿瘤或癌症或细胞。这类抗原可以被重组地或通过本领域已知的任何其它手段分离或制备。

肿瘤抗原的例子包括MAGE、MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、亲环蛋白b、结肠直肠相关抗原(CRC)--C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2、etv6、aml1、前列腺特异抗原(PSA)及其免疫原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、前列腺特异膜抗原(PSMA)、T-细胞受体/CD3-ζ链、MAGE-家族的肿瘤抗原(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、GAGE-家族的肿瘤抗原(例如GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α-肽蛋白、E-钙粘蛋白、α-连环蛋白、β-连环蛋白和γ连环蛋白、p120ctn、gp100^Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤性结肠息肉病蛋白(APC)、胞影蛋白、连接蛋白37、Ig-独特型、p15、gp75、GM2和GD2神经节苷酯、病毒产物如人乳头状瘤病毒蛋白、Smad家族的肿瘤抗原、lmp-1、P1A、EBV-编码的核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7，以及c-erbB-2。该列表不表示限制。

本文使用的“变应原”是能够激发免疫应答的分子，所述免疫应答特征在于生产IgE。变应原也是能够在易感的受试者中诱导变应性应答或哮喘应答的物质。因此，在本发明的上下文中，术语变应原表示特异类型的抗原，其引发由IgE抗体介导的变应性应答。

变应原的列表是庞大的并可包括花粉、昆虫毒液、动物皮屑粉尘、真菌孢子和药物(例如青霉素)。天然的动物和植物变应原的例子包括对以下属特异的蛋白质：Canis(Canis familiaris)；Dermatophagoides(例如Dermatophagoides farinae)；Felis(Felis domesticus)；Ambrosia(Ambrosiaartemisiifolia)；Lolium(例如Lolium perenne和Lolium multiflorum)；Cryptomeria(Cryptomeria japonica)；Alternaria(Alternaria alternata)；Alder；Alnus(Alnus gultinosa)；Betula(Betula verrucosa)；Quercus(Quercus alba)；Olea(Olea europa)；Artemisia(Artemisia vulgaris)；Plantago(例如Plantagolanceolata)；Parietaria(例如Parietaria officinalis和Parietaria judaica)；Blattella(例如Blattella germanica)；Apis(例如Apis multiflorum)；Cupressus(例如Cupressus sempervirens、Cupressus arizonica和Cupressusmacrocarpa)；Juniperus(例如Juniperus sabinoides、Juniperus virginiana、Juniperus communis和Juniperus ashei)；Thuya(例如Thuya orientalis)；Chamaecyparis(例如Chamaecyparis obtusa)；Periplaneta(例如Periplaneta americana)；Agropyron(例如Agropyron repens)；Secale(例如Secale cereale)；Triticum(例如Triticum aestivum)；Dactylis(例如Dactylis glomerata)；Festuca(例如Festuca elatior)；Poa(例如Poapratensis和Poa compressa)；Avena(例如Avena sativa)；Holcus(例如Holcus lanatus)；Anthoxanthum(例如Anthoxanthum odoratum)；Arrhenatherum(例如Arrhenatherum elatius)；Agrostis(例如Agrostisalba)；Phleum(例如Phleum pratense)；Phalaris(例如Phalarisarundinacea)；Paspalum(例如Paspalum notatum)；Sorghum(例如Sorghum halepensis)和Bromus(例如Bromus inermis)。

本发明一方面提供了本发明的免疫刺激性ORN和抗原的缀合物。在一个实施方案中，本发明的免疫刺激性ORN与抗原共价连接。免疫刺激性ORN和抗原之间的共价联接可以是任何合适种类的共价联接，只要免疫刺激性ORN和抗原如此结合时保留各自组建的可测量的功能活性即可。在一个实施方案中，共价联接是直接的。在另一实施方案中，共价联接是间接的，例如通过接头部分。共价连接的免疫刺激性ORN和抗原可以在细胞内被加工以彼此释放。以此种方式，任一组分递送至细胞与作为独立制剂或独立组分施用时其递送相比可被增强。在一个实施方案中，抗原是抗原本身，即其为预先形成的抗原。

本发明的一个方面提供了一种药物组合物，其包含与递送媒介结合的本发明的组合物。在多种实施方案中，递送媒介可选自阳离子脂质、脂质体、螺旋体、病毒颗粒、免疫刺激复合物(ISCOM)、微粒、微球、毫微球、单层囊泡(LUV)、多层囊泡、水包油乳剂、油包水乳剂、乳体和聚阳离子肽，和任选的可药用的运载体。可药用的运载体在下文讨论。本发明的药物组合物任选地可以进一步包含抗原。本发明的组合物与存在的抗原一起，使用合适的方法被送入与递送媒介的物理结合中。免疫刺激性组合物可以包含在递送媒介中，或其可以存在于递送媒介的溶剂暴露的表面上或与之结合。在一个实施方案中，免疫刺激性ORN存在于递送媒介的溶剂暴露的表面上或与之结合，且如果存在抗原的话，其包含在递送媒介中。在另一实施方案中，免疫刺激性ORN和抗原二者均存在于递送媒介的溶剂暴露表面上或与之结合。还在另一实施方案中，抗原存在于递送媒介的溶剂暴露表面上或与之结合，免疫刺激性ORN包含在递送媒介中。还在另一实施方案中，免疫刺激性ORN和抗原二者(如果包含抗原的话)均包含在递送媒介中。

本发明还提供了本发明的免疫刺激性组合物的使用方法。本发明一方面提供了激活免疫细胞的方法。根据本发明该方面的方法包括下述步骤：将免疫细胞与有效量的本发明组合物体外或体内接触，以激活免疫细胞。本发明的组合物可任选地含有抗原。本文使用的“免疫细胞”是指任何骨髓衍生的细胞，其参与先天的或适应的免疫应答。免疫系统的细胞包括，但不限于树状突细胞(DC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、B淋巴细胞、浆细胞、T淋巴细胞及其前体细胞。

本文使用的术语“有效量”是指导致期望的生物效应的必要或充分的物质量。有效量能够但是不必须受限于单次施用中施用的量。

本文使用的术语“激活免疫细胞”是指诱导免疫细胞进入与免疫应答相关的活化状态。术语“激活免疫细胞”是指诱导和增加免疫应答二者。本文使用术语“免疫应答”是指先天的或适应的免疫应答的任何方面，所述免疫应答反映了免疫细胞增殖、进行效应器免疫功能或生产涉及免疫应答的基因产物的活化。涉及免疫应答的基因产物可包括分泌的产物(例如抗体、细胞因子和趋化因子)以及免疫功能的特征性的细胞内和细胞表面分子(例如某些分化抗原簇(CD)、转录因子和基因转录物)。术语“免疫应答”可以应用于单个细胞或细胞种群。

可以通过本领域公知的若干方法中的任何方法来评估细胞因子的生产，所述方法包括生物反应测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、细胞内荧光激活细胞分选术(FACS)分析和反转录酶/聚合酶链式反应(RT-PCR)。

在一个实施方案中，免疫应答涉及前炎性细胞因子免疫应答的产生。前炎性细胞因子免疫应答可包括某些细胞因子和趋化因子中任何的表达，包括IFN-γ、TNF-α、IL-12、IL-10、IL-6及其任何组合。其特异地就本发明的目的排除IFN-α。

在一个实施方案中，免疫应答涉及免疫细胞激活的细胞表面标记的上调，例如CD25、CD80、CD86和CD154。用于测量这类标记的细胞表面表达的方法是本领域公知的并包括FACS分析。

为了测量细胞或细胞种群中的免疫应答，在一个实施方案中，细胞或细胞种群表达TLR8。细胞可以天然地表达TLR，或可以通过向细胞中引入TLR的合适表达载体将其操作为表达TLR。在一个实施方案中，获得的细胞或细胞种群为外周血单核细胞(PBMC)。在一个实施方案中，获得的细胞或细胞种群为表达TLR的细胞系。在一个实施方案中，获得的细胞或细胞种群为表达TLR的瞬时转染体。在一个实施方案中，获得的细胞或细胞种群是表达TLR的稳定转染体。

还为了用于测量细胞或细胞种群中的免疫应答，向细胞或细胞种群中引入报告子构建体可以是便利的，所述构建体应答于TLR引起的细胞内信号转导。在一个实施方案中，这里报告子是位于NF-κB启动子调控下的基因。在一个实施方案中，位于所述启动子调控下的基因是萤光素酶。在合适的激活条件下，萤光素酶报告子构建体被表达并发出可检测的光信号，所述信号可以使用发光计定量地测量。这类报告子构建体和其它合适的报告子构建体是可商业获得的。

本发明还考虑了监测TLR激活的无细胞方法的用途。

本发明在某些方面涉及用于治疗用途的组合物和方法。本发明的免疫刺激性组合物可以单独使用或与其它治疗剂组合使用。免疫刺激性组合物和其它治疗剂可以同时或连续施用。当本发明的免疫刺激性组合物和其它治疗剂同时施用时，它们可以在相同或独立的配方中施用，但是同时施用。另外，当本发明的免疫刺激性组合物和其它治疗剂同时施用时，它们可以通过相同或独立的施用途径被施用，但是同时施用。当本发明的免疫刺激性组合物的施用暂时与另一治疗剂的施用分离时，本发明的免疫刺激性组合物和另一治疗剂被连续施用。这些化合物施用之间时间上的分离可以是大约数分钟或可以更久。在一个实施方案中，本发明的免疫刺激性组合物在施用另一治疗剂之前被施用。在一个实施方案中，本发明的免疫刺激性组合物在施用另一治疗剂之后被施用。另外，当本发明的免疫刺激性组合物和另一治疗剂被连续施用时，它们可以通过相同或独立的施用途径被施用。其它治疗剂包括但不限于适用于治疗感染、癌症、变态反应和哮喘的佐剂、抗原、疫苗和药物。

本发明的一方面提供了对受试者疫苗接种的方法。根据本发明该方面的方法包括对受试者施用抗原和本发明组合物的步骤。在一个实施方案中，施用抗原包括施用编码抗原的核酸。

本文使用的“受试者”是指脊椎动物。在多个实施方案中，受试者是人、非人灵长类、或其它哺乳动物。在某些实施方案中，受试者是小鼠、大鼠、荷兰猪、兔、猫、犬、猪、绵羊、山羊、牛或马。

为了在疫苗接种受试者的方法中使用，本发明的组合物在一个实施方案中包含抗原。抗原可以从本发明的ORN中分离或与之共价连接。在一个实施方案中，本发明的组合物自身不包含抗原。在该实施方案中，该抗原可以与本发明的组合物分离地或与本发明的组合物一起被施用给受试者。独立的施用包括时间的独立、位点或施用途径的独立，或时间和位点或施用途径均独立。当本发明的组合物和抗原在时间上被独立施用时，抗原可以在本发明的组合物之前或之后被施用。在一个实施方案中，抗原在本发明的组合物施用之后48小时到4周被施用。该方法还考虑了在最初施用抗原和组合物之后，一个或多个加强免疫剂量的抗原单独施用、组合物单独施用、或抗原和组合物的施用。

本发明还包括：可以通过对受试者施用本发明的组合物来制备将来遭遇未知抗原的受试者，其中所述组合物不含有抗原。根据该实施方案，受试者的免疫系统被制备为具有对受试者稍后遭遇的抗原更有力的应答，所述遭遇例如通过环境或职业暴露。这类方法可用于例如可能暴露于微生物物质的旅行者、医疗工作者和战士。

本发明的一方面提供了治疗患有免疫系统缺陷的受试者的方法。根据本发明该方面的方法包括对受试者施用有效量的本发明的组合物以治疗受试者的步骤。本文使用的“免疫系统缺陷”是指被异常阻抑的免疫系统针对抗原发生免疫应答的能力。在一个实施方案中，免疫系统缺陷是一种疾病或病症，其中受试者的免疫系统不以正常的能力作用，或其中加强受试者的免疫应答会适用于例如消除受试者中的肿瘤或癌症或感染。本文使用的“患有免疫缺陷的受试者”是指下述受试者，其中受试者的免疫系统针对抗原发生免疫应答的能力被阻抑。患有免疫缺陷的受试者包括具有获得性免疫缺陷的受试者以及具有先天性免疫系统缺陷的受试者。患有获得性免疫缺陷的受试者包括但不限于：患有慢性炎性病症的受试者、患有慢性肾功能不全或肾功能衰竭的受试者、患有感染的受试者、患有癌症的受试者、接受免疫抑制药的受试者、接受其它免疫抑制治疗的受试者和患有营养不良的受试者。在一个实施方案中，受试者具有被抑制的CD4+T细胞种群。在一个实施方案中，受试者感染了人免疫缺陷病毒(HIV)或患有获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。根据本发明该方面的方法从而提供了用于在需要更有力的免疫应答的受试者中加强免疫应答或加强发生免疫应答的能力的方法。

本发明的组合物和方法可以单独使用或与适用于治疗感染的其它试剂和方法结合使用。本发明一方面提供了治疗患有感染的受试者的方法。根据本发明该方面的方法包括向患有感染的受试者施用有效量的本发明组合物以治疗受试者的步骤。

本发明的一方面提供了治疗患有感染的受试者的方法。根据本发明该方面的方法包括向患有感染的受试者施用有效量的本发明组合物和感染药物以治疗受试者的步骤。

本发明的一方面提供了本发明的免疫刺激性ORN用于制备药物的用途，所述药物用于治疗受试者中的感染。

本发明的一方面提供了适用于治疗感染的组合物。根据该方面的组合物包含本发明的免疫刺激性ORN和感染药物。

本文关于患有疾病或病症的受试者的方面使用的术语“治疗”应当表示在受试者中预防、改善或消除疾病或病症的至少一个征兆或症状。

“患有感染的受试者”是下述受试者，所述受试者患有由传染性微生物对受试者浅表的、局部的或全身性的入侵引起的病症。传染性微生物可以是如上所述的病毒、细菌、真菌或寄生虫。

感染药物包括但不限于：抗菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂和抗寄生虫剂。例如“抗感染剂”、“抗生素”、“抗菌剂”、“抗病毒剂”、“抗真菌剂”、“抗寄生虫剂”、“杀寄生虫剂”对本领域常规技术人员而言具有确定的含义并在标准的医学文章中定义。简言之，抗菌剂杀死或抑制细菌，并包括抗生素以及其它具有类似功能的合成或天然的化合物。抗病毒剂可以从天然来源中分离或合成，并适用于杀死或抑制病毒。抗真菌剂被用于治疗浅表的真菌感染以及机会性的和初级全身性真菌感染。抗寄生虫剂杀死或抑制寄生虫。很多抗生素是低分子量分子，其作为细胞如微生物的刺激代谢产物被生产。抗生素一般感染微生物特异的、不存在于宿主细胞中的一种或多种功能或结构。

抗感染疗法的问题之一是用抗感染剂治疗时宿主中发生的副作用。例如，许多抗感染剂可杀死或抑制广谱的微生物，而不对具体类型的物种特异。用这些类型的抗感染剂治疗导致杀死宿主中生活的正常菌群以及感染性微生物。所述菌群的丧失可导致疾病并发症并使宿主易于被其它病原体感染，因为所述菌群与传染性病原体竞争并起到对传染性病原体的屏障的作用。其它副作用可以由这些化学实体对宿主的非微生物细胞细胞或组织的特异性或非特异性作用引起。

广泛使用抗感染剂的另一问题在于抗生素抗性的微生物菌株的发展。已经发展了万古霉素抗性的enterococci、青霉素抗性的pneumococci、多重抗性的S.aureus和多重抗性的tuberculosis菌株，并且成为主要的临床问题。抗感染剂的广泛使用可能会产生许多抗生素抗性的细菌菌株。因此，需要新的抗感染策略来抗击这些微生物。

能有效杀死或抑制大范围细菌的抗菌抗生素是指广谱抗生素。其它类型的抗菌抗生素主要对革兰氏阳性或革兰氏阴性种类的细菌有效。这些类型的抗生素被称作窄谱抗生素。对单个生物或疾病有效而不针对其它类型的细菌的其它抗生素被称作限谱抗生素(limited-spectrum antibiotics)。

抗菌剂有时根据它们的主要作用模式被分类。抗菌剂一般是细胞壁合成抑制剂、细胞膜抑制剂、蛋白质合成抑制剂、核酸合成或功能抑制剂和竞争性抑制剂。细胞壁合成抑制剂抑制细胞壁合成过程中的一个步骤，通常在细菌肽聚糖的合成中。细胞壁合成抑制剂包括β-内酰胺抗生素、天然青霉素、半合成青霉素、氨苄西林、克拉维酸、头孢菌素类和杆菌肽。

β-内酰胺是含有四元β-内酰胺环的抗生素，其抑制肽聚糖合成的最后一步。β-内酰胺抗生素可以是合成的或天然的。由penicillium生产的β-内酰胺抗生素是天然的青霉素，例如青霉素G或青霉素V。这些通过Penicillium chrysogenum的发酵产生。天然青霉素具有窄谱的活性，并通常针对Streptococcus、Gonococcus和Staphylococcus有效。对革兰氏阳性细菌也有效的其它类型的天然青霉素包括青霉素F、X、K和O。

半合成的青霉素通常是由霉菌生产的6-氨基青霉烷酸分子的修饰。6-氨基青霉烷酸可以通过添加侧链被修饰，这产生了与天然青霉素相比具有更广谱的活性或多种其它有利特征的青霉素。一些类型的半合成青霉素具有针对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的广谱，但是被青霉素酶灭活。这些半合成的青霉素包括氨苄西林、羧苄西林、苯唑西林、阿洛西林、美洛西林和哌拉西林。其它类型的半合成青霉素具有针对革兰氏阳性细菌的较窄的活性，但是具有发达的特性从而不被青霉素酶灭活。这些包括例如甲氧西林、双氯西林和萘夫西林。一些广谱半合成青霉素可以与β-内酰胺酶抑制剂例如克拉维酸和舒巴坦(sulbactam)组合使用。β-内酰胺酶抑制剂不具有抗菌作用，但是它们作用于抑制青霉素酶，从而保护半合成的青霉素不被降解。

另一种类型的β-内酰胺抗生素是头孢菌素类。它们对细菌β-内酰胺酶的降解敏感，并从而通常不单独有效。然而，头孢菌素类是青霉素酶抗性的。它们对多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌是有效的。头孢菌素类包括，但不限于头孢噻吩、头孢匹林、头孢氨苄、头孢孟多、头孢克洛、头孢唑林、头孢呋辛、头孢西丁、头孢噻肟、头孢磺啶、头孢他美、头孢克肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶和拉氧头孢。

杆菌肽是另一种类的抗生素，其通过抑制胞壁肽亚单元或肽聚糖从下述分子的释放来抑制细胞壁合成，所述分子将亚基递送至膜的外侧。尽管杆菌肽对革兰氏阳性细菌是有效的，但是因为它的高毒性，其用途通常被限制在局部施用中。

碳青霉烯类是另一种广谱β-内酰胺抗生素，其能够抑制细胞壁合成。碳青霉烯的例子包括，但不限于亚胺培南(imipenem)。单环β-内酰胺也是广谱β-内酰胺抗生素，其包括优特纳(euztreonam)。由Streptomyces生产的一种抗生素万古霉素，也是通过抑制细胞膜合成对革兰氏阳性菌有效的。

另一类抗菌剂是属于细胞膜抑制剂的抗菌剂。这些化合物破坏细菌膜的结构或抑制其功能。属于细胞膜抑制剂的抗菌剂的一个问题是：因为细菌和真核生物膜中磷脂的类似性，它们可以在真核细胞中以及细菌中产生作用。因此，这些化合物很少足够特异以允许这些化合物被全身性地使用，并预防高剂量的局部施用。

一种临床有用的细胞膜抑制剂为多粘菌素(Polymyxin)。多粘菌素通过与膜磷脂结合干涉膜功能。多粘菌素主要针对革兰氏阴性细菌有效，并通常被用于对较小毒性抗生素有抗性的严重的Pseudomonas感染或Pseudomonas感染中。与全身性施用该化合物相关的严重副作用包括对肾和其它器官的损伤。

其它细胞膜抑制剂包括两性霉素B(Amphotericin B)和制霉菌素(Nystatin)，其为主要用于治疗全身性真菌感染和Candida酵母感染中的抗真菌剂。咪唑是属于细胞膜抑制剂的另一类抗生素。咪唑被用作抗菌剂以及抗真菌剂，例如用于治疗酵母感染、皮肤寄生虫感染和全身性真菌感染。咪唑包括但不限于克霉唑(clotrimazole)、咪康唑(miconazole)、酮康唑(ketoconazole)、伊曲康唑(itraconazole)和氟康唑(fluconazole)。

许多抗菌剂是蛋白质合成抑制剂。这些化合物阻止细菌合成结构蛋白质和酶，从而引起细菌细胞生长或功能的抑制或细胞死亡。通常，这些化合物干扰转录或翻译的过程。妨碍转录的抗菌剂包括但不限于利福平(Rifampins)和乙胺丁醇(Ethambutol)。抑制RNA聚合酶的利福平具有广谱活性，并对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌以及Mycobacterium tuberculosis有效。乙胺丁醇对Mycobacterium tuberculosis有效。

封闭转录的抗菌剂干扰细菌核糖体，以阻止mRNA被翻译为蛋白质。通常，该种类的化合物包括但不限于四环素类、氯霉素、大环内酯类(例如红霉素)和氨基糖苷类(例如链霉素)。

氨基糖苷类是由细菌Streptomyces生产的一种抗生素，例如链霉素、卡那霉素、妥布霉素、阿米卡星(amikacin)和庆大霉素。氨基糖苷类已经用于针对由革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌引起的多种细菌感染。链霉素已经被广泛地用作治疗结核病(tuberculosis)的主要药物。庆大霉素被用于(特别是与妥布霉素组合)针对多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌包括Pseudomonas的感染。卡那霉素被用于针对许多革兰氏阳性细菌，包括青霉素抗性的Staphylococci。限制氨基糖苷类临床用途的一个副作用是：在功效必需的剂量下，长期使用显示损伤肾功能并引起导致耳聋的听神经损伤。

另一种类型的翻译抑制剂抗菌剂是四环素类。四环素类是一种抗生素，其为广谱的并针对多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌有效。四环素类的例子包括四环素、米诺环素、多西环素和金霉素。它们对于治疗许多类型的细菌是重要的，但是在莱姆病(Lyme disease)的治疗中尤其重要。因为它们的低毒性和最小的直接副作用，四环素类已经被医学界超量使用和滥用，引起多个问题。例如，它们的超量使用已经引起抗性的广泛产生。

抗菌剂如大环内酯类与50S核糖体亚基可逆结合，并通过肽基转移酶抑制蛋白质的延伸或阻止不带电的tRNA从细菌核糖体上释放，或二者兼有。这些化合物包括红霉素、罗红霉素、克拉霉素、竹桃霉素和阿奇霉素。红霉素对多数革兰氏阳性细菌、Neisseria、Legionella和Haemophilus是活性的，但是对Enterobacteriaceae不是活性的。封闭蛋白质合成期间肽键形成的林可霉素和克林霉素用于针对革兰氏阳性细菌。

另一种类型的翻译抑制剂是氯霉素。氯霉素结合70 S核糖体，抑制细菌酶肽基转移酶，从而阻止蛋白质合成期间肽链的生长。与氯霉素相关的一个严重的副作用是再生障碍性贫血。在小部分(1/50,000)患者中，再生障碍性贫血在有效治疗细菌的氯霉素剂量下发生。由于贫血导致的死亡，曾经被大量开处方的抗生素氯霉素现在很少使用。其因为有效性而仍然用于危及生命的状况(例如伤寒病)。

一些抗菌剂破坏核酸合成或功能，例如与DNA或RNA结合从而它们的信号不能被阅读它们包括但不限于：喹诺酮类和复方新诺明(co-trimoxazole)(二者均为合成的化学品)和利福霉素(天然或半合成的化学品)。喹诺酮通过抑制DNA旋转酶(gyrase)封闭细菌的DNA复制，细菌需要所述旋转酶来生产它们的环状DNA。它们是广谱的，例子包括诺氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、萘啶酸和替马沙星。萘啶酸是结合DNA旋转酶(拓扑异构酶)的杀菌剂，其对于DNA的复制是关键的，并允许超螺旋被释放和再形成，抑制DNA旋转酶活性。萘啶酸的主要用途是治疗下泌尿道感染(UTI)，因为其对UTI的常见原因——若干种革兰氏阴性菌如E.coli、Enterobacter aerogenes、K.pneumoniae和Proteus的种是有效的。复方新诺明是磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole)和甲氧苄啶(trimethoprim)的组合，其封闭制造DNA核苷酸所需的叶酸的细菌合成。利福平是对革兰氏阳性细菌(包括Mycobacterium tuberculosis和由Neisseria meningitidis引起的脑膜炎)和一些革兰氏阴性细菌有活性的利福霉素的衍生物。利福平与聚合酶的β亚基结合并封闭第一个核苷酸(其是激活聚合酶所必需的)的添加，从而封闭mRNA合成。

另一类抗菌剂是起到细菌酶的竞争性抑制剂作用的化合物。竞争性抑制剂几乎全部与细菌生长因子结构类似并竞争结合，但是在细胞中不进行代谢功能。这些化合物包括磺胺类和化学修饰形式的磺胺，其具有更高或更广泛的抗菌活性。磺胺类(例如磺胺异噁唑和甲胺苄啶)适用于治疗Streptococcus pneumoniae、β-溶血性链球菌和E.coli，并已经用于治疗由E.coli引起的不复杂的UTI和用于脑膜炎球菌性脑膜炎的治疗中。

抗病毒剂是防止细胞被病毒感染或防止细胞中病毒复制的化合物。存在比抗菌药更少的抗病毒药，因为病毒复制的过程与宿主细胞中的DNA复制密切相关，使得非特异性的抗病毒剂通常对宿主细胞有毒。在病毒感染的过程中存在若干阶段，其可以被抗病毒剂封闭或抑制。这些阶段包括病毒与宿主细胞结合(免疫球蛋白或结合肽)、病毒脱壳(例如金刚烷胺)、病毒mRNA的合成或翻译(例如干扰素)、病毒RNA或DNA的复制(例如核苷类似物)、新的病毒蛋白质的成熟(例如蛋白酶抑制剂)和病毒的出芽和释放。

抗病毒剂的另一范畴是核苷类似物。核苷类似物是与核苷类似的合成的化合物，但是具有不完全的或异常的脱氧核糖或核糖基团。核苷类似物一旦处于细胞中就被磷酸化，产生三磷酸盐形式，其与正常的核苷酸竞争整合进病毒DNA或RNA中。一旦核苷类似物的三磷酸盐形式被整合进生长的核酸链中，其引起与病毒聚合酶的不可逆的结合和由此导致的链终止。核苷类似物包括，但不限于阿昔洛韦(用于治疗单纯疱疹病毒和水痘-带状疱疹病毒)、更昔洛韦(gancyclovir)(用于治疗巨细胞病毒)、碘苷、利巴韦林(用于治疗呼吸道合胞病毒(respiratory syncitial virus))、双脱氧肌苷、扎西他滨和齐多夫定(叠氮胸苷)。

另一类抗病毒剂包括细胞因子，例如干扰素。干扰素是由病毒感染的细胞以及免疫细胞分泌的细胞因子。干扰素如下作用：与被感染细胞邻近细胞上的特异受体结合，引起细胞中的改变，所述改变保护细胞免受病毒感染。α和β干扰素也诱导被感染的细胞表面上I类和II类MHC分子的表达，导致增加的抗原出现用于宿主免疫细胞识别。α和β干扰素可作为重组体形式获得，并已经被用于治疗慢性乙型肝炎和丙型肝炎感染。在对抗病毒治疗有效的剂量下，干扰素具有严重的副作用例如发烧、不适和体重减轻。

免疫球蛋白疗法被用于预防病毒感染。用于病毒感染的免疫球蛋白疗法与用于细菌感染的不同，因为免疫球蛋白疗法通过结合细胞外病毒体并阻止它们攻击和进入对病毒感染易感的细胞，而不是抗原特异的。该疗法适用于在抗体存在于宿主中的一段时期内预防病毒感染。通常有两种类型的免疫球蛋白疗法，正常的免疫球蛋白疗法和超免疫球蛋白疗法。正常的免疫球蛋白疗法利用一种抗体产物，所述抗体产物从正常血供体的血清中制备并合并。该合并的产物具有对大范围的人病毒的低抗体效价，所述病毒例如甲型肝炎、细小病毒、肠道病毒(特别是在新生儿中)。超免疫球蛋白疗法利用从下述个体的血清中制备的抗体，所述个体具有对具体病毒的高抗体效价。然后使用这些抗体针对特异的病毒。超免疫球蛋白的例子包括带状疱疹免疫球蛋白(适用于在免疫妥协的儿童和新生儿中预防水痘)、人狂犬病免疫球蛋白(适用于被患狂犬病的动物咬伤的受试者的暴露后预防中)、乙型肝炎免疫球蛋白(适用于预防乙型肝炎病毒，特别是在暴露于该病毒的受试者中)和RSV免疫球蛋白(适用于治疗呼吸道合胞病毒感染)。

抗真菌剂适用于治疗和预防感染性真菌。抗真菌剂有时通过它们的作用机制被分类。一些抗真菌剂通过抑制葡萄糖合酶作为细胞壁抑制剂作用。这些包括但不限于basiungin/ECB。其它抗真菌剂通过使膜完整性失稳定而作用。这些包括，但不限于咪唑，例如克霉唑、sertaconzole、氟康唑、伊曲康唑、酮康唑、咪康唑和伏立康唑，以及FK 463、两性霉素B、BAY 38-9502/MK 991、普拉米星、UK 292、布替萘芬和特比萘芬。其它抗真菌剂通过降解壳多糖(例如壳多糖酶)或免疫抑制(501乳霜)作用。

杀寄生虫剂是直接杀死寄生虫物质。这类化合物是本领域已知的并通常可商业获得。适用于人施用的杀寄生虫剂的例子包括但不限于阿苯达唑、两性霉素B、苄硝唑、硫氯酚、氯喹HCl、磷酸氯喹、克林霉素、去氢依米丁、乙胺嗪、二氯尼特(diloxanide furoate)、依氟鸟氨酸、呋喃唑酮、糖皮质激素、氯氟菲醇(halofantrine)、双碘喹啉(iodoquinol)、伊维菌素(ivermectin)、甲苯达唑(mebendazole)、甲氟喹(mefloquine)、葡甲胺锑酸盐(meglumine antimoniate)、美拉胂醇(melarsoprol)、美曲磷酯(metrifonate)、甲硝唑(metronidazole)、氯硝柳胺(niclosamide)、硝呋替莫(nifurtimox)、奥沙尼喹(oxamniquine)、巴龙霉素(paromomycin)、羟乙磺酸戊氧苯脒(pentamidine isethionate)、哌嗪(piperazine)、吡喹酮(praziquantel)、伯氨喹(primaquine phosphate)、氯胍(proguanil)、噻嘧啶(pyrantel pamoate)、乙胺嘧啶-磺胺类(pyrimethanmine-sulfonamides)、乙胺嘧啶-磺胺多辛(pyrimethanmine-sulfadoxine)、盐酸喹纳克林(quinacrineHCl)、硫酸奎宁、奎尼丁葡萄糖酸盐(quinidine gluconate)、螺旋霉素、葡萄糖酸锑钠(葡萄糖酸锑钠sodium antimony gluconate)、苏拉明、四环素、多西环素、噻苯达唑、替硝唑、trimethroprim-sulfamethoxazole和锥虫胂胺。

ORN也适用于治疗和预防自身免疫疾病。自身免疫疾病是一类疾病，其中受试者自身的抗体与宿主组织反应，或其中免疫效应T细胞与内源的自身肽自动反应并引起组织破坏。因此，引发了针对受试者自身的抗原(称作自体抗原)的免疫应答。自身免疫疾病包括但不限于类风湿性关节炎、Crohn′s病、多发性硬化、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫脑脊髓炎、重症肌无力(MG)、Hashimoto’s甲状腺炎、Goodpasture’s综合征、天疱疮(例如寻常天疱疮)、Grave’s病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、带有抗胶原抗体的硬皮病、混合性结缔组织病、多肌炎、恶性贫血、原发性Addison’s病、自身免疫相关性不育、肾小球肾炎(例如新月体肾小球肾炎、增生性肾小球肾炎)、大疱性类天疱疮、综合征、胰岛素抵抗和自身免疫糖尿病。

本文使用“自体抗原”是指正常宿主组织的抗原。正常的宿主组织不包括癌细胞。因此，在自身免疫病的上下文中，针对自体抗原引发的免疫应答是不期望的免疫应答，并有助于破坏和损伤正常组织，而针对癌症抗原引发的免疫应答是期望的免疫应答，并有助于肿瘤或癌症的破坏。因此，在本发明针对治疗自身免疫病症的一些方面，不推荐将ORN与自体抗原一起施用，尤其是属于自身免疫病症的靶标的那些自体抗原。

在其它情况下，ORN可以与低剂量的自体抗原一起被递送。大量动物研究已经证明低剂量抗原的粘膜施用可以导致免疫低反应性或“耐受”的状态。有效机制显示是细胞因子介导的免疫偏差，所述偏差是从Th1到主要为Th2和Th3(即TGF-b支配的)的应答偏差。低剂量抗原递送的有效抑制也可以抑制不相关的免疫应答(旁观者抑制)，其在自身免疫疾病(例如类风湿性关节炎和SLE)治疗中受到重要关注。旁观者抑制涉及Th1-反-调节的、抑制剂细胞因子在局部环境中的分泌，所述局部环境中促炎症的细胞因子和Th1细胞因子以抗原特异的或抗原非特异的方式被释放。本文使用“耐受”是指该现象。事实上，口服耐受在动物中大量自身免疫病的治疗中已经是有效的，所述疾病包括：实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、实验性自身免疫重症肌无力、胶原诱导的关节炎(CIA)和胰岛素依赖性糖尿病。在这些模型中，自身免疫疾病的预防和抑制与抗原特异的体液和细胞应答从Th1到Th2/Th3应答的迁移相关。

本发明的组合物和方法可以单独使用或与适用于治疗癌症的其它试剂和方法结合使用。本发明一方面提供了治疗患有癌症的受试者的方法。根据本发明该方面的方法包括对患有癌症的受试者施用有效量的本发明组合物以治疗受试者的步骤。

本发明的一个方面提供了治疗患有癌症的受试者的方法。根据本发明该方面的方法包括对患有癌症的受试者施用有效量的本发明的组合物和抗癌疗法以治疗受试者的步骤。

本发明的一个方面提供了本发明的免疫刺激性ORN用于制备药物的用途，所述药物用于治疗受试者中的癌症。

本发明的一个方面提供了适用于治疗癌症的组合物。根据该方面的组合物包括本发明的免疫刺激性ORN和癌症药物。

患有癌症的受试者是具有可检测到的癌细胞的受试者。癌症可以是恶性或非恶性的癌症。本文使用“癌症”是指不受控制的细胞生长，其干扰身体器官和系统的正常功能。从它们最初位置迁移并进入重要器官的癌症可通过受影响的器官的功能衰退最终导致受试者死亡。造血癌症例如白血病能够在受试者中战胜正常的造血区室，从而导致造血失败(以贫血、血小板减少和中性粒细胞减少的形式)，最终引起死亡。

转移灶是一个区域的癌细胞，其与原发性肿瘤的位置不同，得自癌细胞从最初的肿瘤散布至身体的其它部分。诊断原发性肿瘤块时，可以监测受试者的转移灶的存在。除监测特异的症状外，转移灶通常通过单独或组合使用磁共振成像(MRI)扫描、计算机断层摄影(CT)扫描、血和血小板计数、肝功能研究、胸X射线检查和骨扫描来探测。

癌症包括但不限于：基底细胞癌、胆管癌；膀胱癌；骨癌；脑和中枢神经系统(CNS)癌；乳腺癌；子宫颈癌；绒毛膜癌；结肠和直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌；子宫内膜癌；食管癌；眼癌；头与颈癌；上皮内新生物；肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如小细胞和非小细胞肺癌)；淋巴瘤，包括Hodgkin’s和Non-Hodgkin’s淋巴瘤；黑素瘤；骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌(例如唇、舌、嘴和咽癌)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；肉瘤；皮肤癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫癌；泌尿系统癌症以及其它癌(carcinomas)、腺癌和肉瘤(sarcomas)。

本发明的免疫刺激性组合物还可以与抗癌疗法一起被施用。抗癌疗法包括癌症药剂、辐射和手术操作。本文使用的“癌症药剂”是指被使用给受试者、目的在于治疗癌症的试剂。本文使用的“治疗癌症”包括预防癌症的发生、减少癌症的症状，和/或抑制确定的癌症的生长。在其它方面，癌症药剂被施用给处于发生癌症风险下的受试者，目的在于降低发生癌症的风险。本文公开了用于治疗癌症的多种类型的药剂。就该说明书的目的而言，癌症药剂被分类为化学治疗剂、免疫治疗剂、癌症疫苗、激素治疗和生物学反应修饰剂。

化学治疗剂可选自：甲氨喋呤、长春新碱、阿霉素、顺铂、不含糖的氯乙基亚硝基脲类、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、博来霉素、多柔比星、达卡巴嗪、泰素、fragyline、Meglamine GLA、戊柔比星、卡莫司汀和poliferposan、MMI270、BAY 12-9566、RAS法尼基转移酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂、MMP、MTA/LY231514、LY264618/Lometexol、Glamolec、CI-994、TNP-470、和美新/托泊替康(Hycamtin/Topotecan)、PKC412、伐司朴达(Valspodar)/PSC833、诺安托(Novantrone)/Mitroxantrone、Metaret/苏拉明(Suramin)、巴马司他(Batimastat)、E7070、BCH-4556、CS-682、9-AC、AG3340、AG3433、Incel/VX-710、VX-853、ZD0101、ISI641、ODN 698、TA2516/Marmistat、BB2516/Marmistat、CDP 845、D2163、PD183805、DX8951f、Lemonal DP 2202、FK 317、溶链菌(Picibanil)/OK-432、AD 32/戊柔比星(Valrubicin)、氯化锶(Metastron)/锶衍生物、Temodal/替莫唑胺(Temozolomide)、阿霉素脂质体(Evacet)/多柔比星脂质体、Yewtaxan/紫杉醇(Paclitaxel)、泰素(Taxol)/紫杉醇(Paclitaxel)、西罗达(Xeload)/卡培他滨(Capecitabine)、氟铁龙(Furtulon)/去氧氟尿苷(Doxifluridine)、Cyclopax/口服紫杉醇、口服紫杉烷、SPU-077/顺铂、HMR 1275/Flavopiridol、CP-358(774)/EGFR、CP-609(754)/RAS癌基因抑制剂、BMS-182751/口服铂、UFT(替加氟/尿嘧啶)、Ergamisol/左旋咪唑(Levamisole)、恩尿嘧啶(Eniluracil)/776C85/5FU增强子、Campto/左旋咪唑(Levamisole)、Camptosar/伊立替康(Irinotecan)、Tumodex/Ralitrexed、Leustatin/克拉屈滨(Cladribine)、Paxex/紫杉醇、Doxil/多柔比星脂质体、Caelyx/多柔比星脂质体、福达华(Fludara)/氟达拉滨(Fludarabine)、Pharmarubicin/表柔比星(Epirubicin)、DepoCyt、ZD 1839、LU 79553/Bis-Naphtalimide、LU 103793/多拉司他汀(Dolastain)、Caetyx/多柔比星脂质体、健择(Gemzar)/吉西他滨(Gemcitabine)、ZD 0473/Anormed、YM 116、碘粒子(Iodine seeds)、CDK4和CDK2抑制剂、PARP抑制剂、D4809/Dexifosamide、Ifes/Mesnex/异环磷酰胺(Ifosamide)、威猛(Vumon)/替尼泊苷(Teniposide)、伯尔定(Paraplatin)/卡铂(Carboplatin)、顺铂(Plantinol)/顺铂、足叶乙苷(Vepeside)/依托泊苷(Etoposide)、ZD 9331、泰索帝(Taxotere)/多西紫杉醇(Docetaxel)、鸟嘌呤阿糖胞苷的前药、紫杉烷类似物、亚硝基脲、烷化剂如melphelan和环磷酰胺、氨鲁米特(Aminoglutethimide)、天冬酰胺酶、白消安(Busulfan)、卡铂、苯丁酸氮芥(Chlorombucil)、盐酸阿糖胞苷(Cytarabine HCl)、更生霉素(Dactinomycin)、盐酸柔红霉素(DaunorubicinHCl)、雌莫司汀磷酸钠(Estramustine phosphate sodium)、依托泊苷(VP16-213)、氟尿嘧啶脱氧核苷(Floxuridine)、氟尿嘧啶(5-FU)、氟他胺、羟基脲(羟基尿素)、异磷酰胺(Ifosfamide)、干扰素α-2a、α-2b、醋酸亮丙瑞林(Leuprolide acetate)(LHRH-释放因子类似物)、洛莫司汀(Lomustine)(CCNU)、盐酸双氯乙基甲胺(Mechlorethamine HCl)(氮芥)、巯嘌呤(Mercaptopurine)、美司钠(Mesna)、米托坦(Mitotane)(o.p′-DDD)、盐酸米托蒽醌(Mitoxantrone HCl)、奥曲肽(Octreotide)、普卡霉素(Plicamycin)、盐酸丙卡巴阱(Procarbazine HCl)、链佐星(Streptozocin)、枸橼酸他莫昔芬(Tamoxifen citrate)、硫代鸟嘌呤、塞替派(Thiotepa)、长春碱(Vinblastinesulfate)、安吖啶(Amsacrine)(m-AMSA)、阿扎胞苷(Azacitidine)、Erthropoietin、六甲蜜胺(Hexamethylmelamine)(HMM)、白细胞介素(Interleukin)2、米托胍腙(Mitoguazone)(甲基-GAG；甲基丙酮醛二-丙咪腙；MGBG)、喷司他丁(Pentostatin)(2’脱氧柯福霉素)、司莫司汀(Semustine)(甲基-CCNU)、替尼泊苷(Teniposide)(VM-26)和硫酸长春地辛，但不仅限于此。

免疫治疗剂可选自3622W94、4B5、ANA Ab、抗-FLK-2、抗-VEGF、ATRAGEN，AVASTIN(贝伐单抗(bevacizumab)；Genentech)、BABS、BEC2、BEXXAR  (托西莫单抗(tositumomab)；GlaxoSmithKline)、C225、CAMPATH(阿仑单抗(alemtuzumab)；Genzyme Corp.)、CEACIDE、CMA 676、EMD-72000、ERBITUX(西妥昔单抗(cetuximab)；ImClone Systems，Inc.)、Gliomab-H、GNI-250、HERCEPTIN(曲妥单抗(trastuzumab)；Genentech)、IDEC-Y2B8、ImmuRAIT-CEA、ior c5、ior egf.r3、ior t6、LDP-03、LymphoCide、MDX-11、MDX-22、MDX-210、MDX-220、MDX-260、MDX-447、MELIMMUNE-1、MELIMMUNE-2、Monopharm-C、NovoMAb-G2、Oncolym、OV103、Ovarex、Panorex、Pretarget、Quadramet、Ributaxin、RITUXAN(美罗华(rituximab)；Genentech)、SMART 1D10 Ab、SMART ABL 364 Ab、、SMART M195、TNT和ZENAPAX(daclizumab；Roche)，但不仅限于此。

癌症疫苗可选自EGF、抗个体基因型的癌症疫苗、Gp75抗原、GMK黑瘤疫苗、MGV神经节苷脂缀合物疫苗、HeR2/neu、Ovarex、M-Vax、O-Vax、L-Vax、STn-KHL theratope、BLP25(MUC-1)、脂质体个体基因型疫苗、黑素瘤疫苗(Melacine)、肽抗原疫苗、毒素/抗原疫苗、基于MVA的疫苗、PACIS、BCG vacine、TA-HPV、TA-CIN、DISC-virus andImmuCyst/TheraCys，但不仅限于此。

本发明的组合物和方法可以单独使用，或与适用于治疗变态反应的其它试剂和方法组合使用。本发明一方面提供了治疗患有变应性病症的受试者的方法。根据本发明该方面的方法包括对患有变应性病症的受试者施用有效量的本发明的组合物以治疗受试者。

本发明的一个方面提供了治疗患有变应性病症的受试者的方法。根据本发明该方面的方法包括对患有变应性病症的受试者施用有效量的本发明的组合物和抗变态反应疗法以治疗受试者。

本发明的一个方面提供了本发明的免疫刺激性ORN用于制备药物的用途，所述药物用于治疗受试者中的变应性病症。

本发明一方面提供了适用于治疗变应性病症的组合物。根据该方面的组合物包含本发明的免疫刺激性ORN和变态反应药剂。

“患有变应性病症的受试者”表示目前正在经历或先前曾经经历过应答于变应原的变应性反应的受试者。

“变应性病症”或“变态反应”是指对物质(变应原)的获得性超敏感性。变应性病症包括但不限于湿疹、变应性鼻炎或鼻炎(coryza)、枯草热(hay fever)、变应性结膜炎、支气管哮喘、荨麻疹(hives)和食物变态反应，其它的特异反应性病症，包括特异性皮炎；过敏症(anaphylaxis)；药物变态反应和血管性水肿。

典型地，变态反应是与针对变应原的抗体生产相关的短暂病症，所述抗体来自具体的免疫球蛋白种类IgE。由IgE介导的对一般气源性过敏源应答的发生也是指示趋向于发生哮喘的诱因的一个因素。如果变应原遭遇嗜碱白细胞(在血中循环)或肥大细胞(分散于固体组织各处)表面上与IgE Fc受体(FceR)结合的特异IgE，则细胞被激活，导致介质的生产和释放，所述介质例如组胺、5-羟色胺和脂质介质。

当IgE型的组织敏感免疫球蛋白与外源变应原反应时，发生变应性反应。IgE抗体与肥大细胞和/或嗜碱白细胞结合，然后在受到与抗体分子末端桥接的变应原刺激时，这些专门化的细胞释放变应性反应的化学介质(血管活性胺)。组胺、血小板活化因子、花生四烯酸代谢产物和5-羟色胺是人中变应性反应的已知的最好介质。组胺和其它血管活性胺通常储存于肥大细胞和嗜碱性白细胞中。肥大细胞分散在动物组织各处，嗜碱白细胞在维管系统中循环。这些细胞制造组胺并将其储存在细胞中，除非涉及IgE结合的专门化序列的事件发生，引发其释放。

变应性反应的症状根据身体中的位置而不同，所述位置是IgE与抗原反应的位置。如果反应在呼吸上皮上发生，则症状通常是打喷嚏、咳嗽和哮喘反应。如果相互作用发生在消化道中(例如在食物变态反应的情况下)，则常见腹痛和腹泻。全身性的变应性反应(例如在蜜蜂叮咬后或对受试者施用青霉素后)可以是严重的，并常常是危及生命的。

变态反应与Th2型免疫应答相关，其至少部分由Th2细胞因子IL-4和IL-5以及抗体同种型转换为IgE表征。Th1和Th2免疫应答是互相反调节的，从而免疫应答朝向Th1型免疫应答的偏移可以预防或改善Th2型的免疫应答，包括变态反应。因此，本发明的免疫刺激性ORN自身适用于治疗患有变应性病症的受试者，因为免疫刺激性ORN可以使免疫应答偏向Th1型的免疫应答。或者或另外，本发明的免疫刺激性ORN可以与变应原组合使用以治疗患有变应性病症的受试者。

本发明的免疫刺激性组合物也可以与抗变态反应疗法组合施用。用于治疗或预防变态反应的常规方法涉及变态反应药剂或脱敏疗法的使用。用于治疗或预防变态反应的一些发展中疗法包括中和抗IgE抗体的使用。封闭变应性反应的化学介质的抗组胺和其它药物帮助调节变应性症状的严重性，但是不能预防变应性反应，并且对随后的变应性应答没有作用。优选脱敏疗法，所述脱敏疗法通过给予(通常通过皮下注射)小剂量变应原来诱导针对变应原的IgG型应答。认为IgG的存在帮助中和介质的生产，所述介质的生产得自IgE抗体的诱导。最初用非常低剂量的变应原治疗受试者以避免诱导严重的反应，将剂量缓慢增加。该类型的疗法是危险的，因为受试者实际上被施用了引起变应性应答的化合物并能够导致严重的变应性反应。

变态反应药剂包括但不限于，抗组胺、皮质激素和前列腺素诱导物。抗组胺是抵消肥大细胞或嗜碱粒细胞释放的组胺的化合物。这些化合物是本领域公知的，并通常用于治疗变态反应。抗组胺包括，但不限于阿伐斯汀(acrivastine)、阿司咪唑(astemizole)、阿扎他定(azatadine)、氮卓斯汀(azelastine)、betatastine、溴苯那敏(brompheniramine)、布克力嗪(buclizine)、西替利嗪(cetirizine)、西替利嗪类似物、氯苯那敏(chlorpheniramine)、氯马斯汀(clemastine)、CS 560、赛庚啶(cyproheptadine)、地氯雷他定(desloratadine)、右氯苯那敏(dexchlorpheniramine)、依巴斯汀(ebastine)、依匹斯汀(epinastine)、非索非那定(fexofenadine)、HSR 609、羟嗪(hydroxyzine)、左卡巴斯汀(levocabastine)、loratidine、甲基东莨菪碱(methscopolamine)、咪唑斯汀(mizolastine)、诺阿斯咪唑(norastemizole)、苯茚胺(phenindamine)、异丙嗪(promethazine)、甲氧苯二胺(pyrilamine)、特非那定(terfenadine)和曲尼司特(tranilast)。

皮质激素包括但不限于：甲泼尼龙(methylprednisolone)、泼尼松龙(prednisolone)、泼尼松(prednisone)、倍氯米松(beclomethasone)、布地奈德(budesonide)、地塞米松(dexamethasone)、氟尼缩松(flunisolide)、氟替卡松丙酸盐(fluticasone propionate)和曲安西龙(triamcinolone)。尽管地塞米松是具有抗炎作用的皮质类固醇，但是它通常不以吸入的形式用于治疗变态反应或哮喘，因为它被高度吸收并且在有效剂量下有长期的抑制性副作用。然而，地塞米松可以根据本发明被用于治疗变态反应或哮喘，因为与本发明的组合物组合施用时，其能够以低剂量使用从而减少副作用。与皮质类固醇使用相关的一些副作用包括咳嗽、发声困难、鹅口疮(念珠菌病)和在更高剂量时的全身效应，例如肾上腺抑制、葡萄糖耐受不良、骨质疏松症、骨无菌性坏死、白内障生成、生长抑制、高血压、肌无力、皮肤变薄(skin thinning)和容易擦伤。Barnes & Peterson(1993)Am Rev Respir Dis148：S1-S26和Kamada AK et al.(1996)Am J Respir Crit Care Med 153：1739-48。

本发明的组合物和方法可以单独使用或与适用于治疗哮喘的其它试剂和方法结合使用。本发明一方面提供了治疗患有哮喘的受试者的方法。根据本发明该方面的方法包括对患有哮喘的受试者施用有效量的本发明组合物以治疗受试者的步骤。

本发明的一个方面提供了治疗患有哮喘的受试者的方法。根据本发明该方面的方法包括对患有哮喘的受试者施用有效量的本发明的组合物和抗哮喘疗法以治疗受试者的步骤。

本发明的一个方面提供了本发明的免疫刺激性ORN用于制备药物的用途，所述药物用于治疗受试者中的哮喘。

本发明的一个方面提供了适用于治疗哮喘的组合物。根据该方面的组合物包括本发明的免疫刺激性ORN和哮喘药剂。

本文使用的“哮喘”是指呼吸系统的病症，其特征在于气道的炎症和狭窄，以及气道对吸入剂的提高的反应性。哮喘通常(但不专有地)与特异反应性或变应性病症结合。哮喘的症状包括由气流阻碍引起的喘鸣、气喘、胸部紧迫和咳嗽的周期性发作。与哮喘相关的气道炎症可以通过观察大量生理学改变被监测，例如气道上皮的剥蚀、基底膜下的胶原沉着、水肿、肥大细胞活化、炎性细胞(包括中性粒细胞、嗜酸粒细胞和淋巴细胞)浸润。作为气道炎症的结果，哮喘患者常经历气道高反应性、气道限制、呼吸症状和疾病慢性。气道限制包括极性支气管收缩、气道水肿、宫颈粘液塞形成和气道重建，这些特征常导致支气管梗阻。在哮喘的一些情况下可发生半基底膜纤维化(sub-basement membrane fibrosis)，导致肺功能永久性异常。

过去几年间的研究显示哮喘可能是由炎症细胞、介质和气道中固有的其它细胞和组织间的复杂相互作用引起的。肥大细胞、嗜酸粒细胞、上皮细胞、巨噬细胞和激活的T细胞均在与哮喘相关的炎症过程中起到重要的作用。Djukanovic R et al.(1990)Am Rev Respir Dis 142：434-457。认为这些细胞可以通过分泌预先形成的和新近合成的介质影响气道功能，所述介质可以直接或间接地作用于局部组织。已经认为T淋巴细胞(Th2)亚群通过释放选择性的细胞因子和建立疾病慢性在调节气道的变应性炎症中起重要作用。Robinson DS et al.(1992)N Engl J Med 326：298-304。

哮喘是一种复杂的病症，其在发育的不同阶段发生，并可以根据症状的程度被分类为急性、亚急性或慢性。急性的炎症应答与细胞进入气道的早期募集相关。亚急性炎症应答涉及细胞的募集以及固有细胞的激活，这引起更持久的炎症模式。慢性炎症应答特征在于持久水平的细胞损伤和进行中的修复过程，其可导致气道中的永久性异常。

“患有哮喘的受试者”是指患有呼吸系统病症的受试者，所述病症的特征在于气道的炎症和狭窄，以及气道对吸入剂的提高的反应性。与哮喘发作相关的因素包括，但不限于变应原、冷的温度、运动、病毒感染和SO₂。

如上所述，哮喘可能与Th2型免疫应答相关，其至少部分由Th2细胞因子IL-4和IL-5以及抗体同种型转换为IgE表征。Th1和Th2免疫应答是互相反调节的，从而免疫应答朝向Th1型免疫应答的偏移可以预防或改善Th2型的免疫应答，包括变态反应。因此，本发明的经修饰的寡核糖核苷酸类似物自身适用于治疗患有哮喘的受试者，因为所述类似物能够使免疫应答偏向Th1型的免疫应答。或者或另外，本发明的经修饰的寡核糖核苷酸类似物可以与变应原组合使用以治疗患有哮喘的受试者。

本发明的免疫刺激性组合物也可以与哮喘疗法组合施用。用于治疗或预防哮喘的常规方法涉及抗变态反应疗法(如上所述)和大量其它试剂(包括吸入剂)的使用。

用于治疗哮喘的药物通常被分为两类，快速释放药物和长期控制药物。哮喘患者在每日的基础上采用长期控制药物以达到和维持长期哮喘的控制。长期控制药物包括抗炎剂，例如皮质激素、克罗默(chromolyn)钠和奈多罗米(nedocromil)；长效支气管扩张剂，例如长效β₂-激动剂和甲基黄嘌呤；和白细胞三烯修饰剂。快速释放药物包括短效β₂-激动剂、抗胆碱能药物和全身性皮质激素。存在与这些药物中每种相关的许多副作用，没有一种药物或其组合能够预防或完全治疗哮喘。

哮喘药物包括，但不限于PDE-4抑制剂、支气管扩张剂/β-2激动剂、K+通道开放剂、VLA-4拮抗剂、神经激肽(neurokin)拮抗剂、血栓素(thromboxane)A2(TXA2)合成抑制剂、黄嘌呤、花生四烯酸拮抗剂、5脂肪氧化酶抑制剂、TXA2受体拮抗剂、TXA2拮抗剂、5-lipox活化蛋白质的抑制剂和蛋白酶抑制剂。

支气管扩张剂/β₂-激动剂是引起支气管扩张或平滑肌松弛的一类化合物。支气管扩张剂/β₂-激动剂包括，但不限于沙美特罗(salmeterol)、沙丁胺醇(salbutamol)、沙丁胺醇(albuterol)、特布他林(terbutaline)、D2522/福莫特罗(formoterol)、非诺特罗(fenoterol)、比托特罗(bitolterol)、吡布特罗甲基黄嘌呤(pirbuerol methylxanthines)和奥西那林(orciprenaline)。长效β₂激动剂和支气管扩张剂是除抗炎疗法外用于长期预防症状的化合物。长效β₂激动剂包括，但不限于沙美特罗和沙丁胺醇。这些化合物通常与皮质激素组合使用，并且不在没有任何炎症疗法时使用。它们已经与超剂量中例如心动过速、骨骼肌震颤、低钾血和QTc间隔延长的副作用相关。

甲基黄嘌呤(包括例如茶碱)已经被用于长期控制和预防症状。这些化合物引起由磷酸二酯酶抑制和可能的腺苷拮抗导致的支气管扩张。剂量相关的急性毒性是这些类型化合物的具体问题。因此，必需监测常规血清浓度从而计算毒性并限制代谢清除率个体差异引起的治疗性范围(therapeutic range)。副作用包括心动过速、过速心律市场、恶心和呕吐、中枢神经系统兴奋、头痛、癫痫发作、呕血、高血糖症和低钾血。短效β₂激动剂包括，但不限于沙丁胺醇(albuterol)、比托特罗(bitolterol)、吡布特罗(pirbuterol)和特布他林(terbutaline)。与短效β₂激动剂施用相关的一些不良作用包括心动过速、骨骼肌震颤、低钾血、乳酸增加、头痛和高血糖。

克罗默(chromolyn)钠和奈多罗米被用作长期控制药物，所述药物用于预防由运动引起的原发性哮喘症状或由变应原引起的变应性症状。这些化合物被认为通过干扰氯化物途径功能来封闭对变应原的早期和晚期反应。它们也稳定肥大细胞膜并抑制介质的活化及其从inosineophils和上皮细胞中的释放。通常需要四到六周的施用以达到最大的益处。

抗胆碱能类通常被用于缓解急性支气管痉挛。这些化合物被认为通过竞争性抑制毒蕈碱胆碱能受体来发挥作用。抗胆碱能类包括，但不限于异丙托溴铵。这些化合物仅能逆转类胆碱方式(cholinerigically)介导的支气管痉挛，并不改变对抗原的任何反应。副作用包括口干和呼吸分泌(respiratory secretions)、在一些个体中增加的喘鸣和如果喷入眼睛时的视野模糊。

本发明的免疫刺激性ORN也可适用于治疗气道重建。气道重建由气道中平滑肌细胞增殖和/或粘膜下层增厚导致，并最终引起气道狭窄，导致气流受限。本发明的免疫刺激性ORN可预防进一步重建，并且甚至可能减少重建过程导致的组织构建。

本发明的免疫刺激性ORN也适用于促进树状突细胞的存活、分化、活化和成熟。免疫刺激性的寡核糖核苷酸具有促进树状突细胞的细胞存活、分化、活化和成熟的独特能力。

本发明的免疫刺激性ORN也提高天然杀伤细胞溶解活性和抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)。ADCC可以通过与抗体组合使用免疫刺激性ORN进行，所述抗体对细胞靶标如癌细胞特异。当免疫刺激性ORN与抗体组合施用给受试者时，受试者的免疫系统被诱导杀死肿瘤细胞。适用于ADCC过程中的抗体包括与细胞在体内相互作用的抗体。对细胞靶标特异的许多这类抗体已经在本领域被描述，并且许多可以商业获得。在一个实施方案中，所述抗体为IgG抗体。

在某些方面，本发明提供了用于增强表位扩展的方法。本文使用“表位扩展”是指表位特异性从最初集中的、主要的表位特异性免疫应答(指向自身或外源蛋白质)多样化为所述蛋白质(分子内扩展)或其它蛋白质(分子间扩展)上的次要的和/或隐藏的表位。表位扩展引起多表位特异的免疫应答。

免疫应答由初始的放大期(magnification phase)和后来的下调期组成，所述放大期可以是有害的(如在自身免疫疾病中)或有益的(如在疫苗接种中)，所述下调期将免疫系统恢复为稳态并产生记忆。表位扩展可以是这两个阶段的重要部分。在肿瘤发生中表位扩展的增强允许受试者的免疫系统确定额外的靶表位(其最初不被应答于原始治疗方案的免疫体系识别)，同时减少肿瘤种群中逃逸变体的可能性，从而影响疾病的发展。

本发明的寡核糖核苷酸可适用于促进治疗上有益的适应症(例如癌症、病毒和细菌感染，以及变态反应)中的表位扩展。所述方法在一个实施方案中包括下述步骤：对受试者施用包含抗原和佐剂的疫苗，随后对受试者施用一定用量的至少两份剂量的本发明的免疫刺激性ORN，所述用量有效诱导多表位特异的免疫应答。该方法在一个实施方案中包括下述步骤：对受试者施用包含肿瘤抗原和佐剂的疫苗，随后对受试者施用一定用量的至少两份剂量的本发明的免疫刺激性ORN，所述用量有效诱导多表位特异的免疫应答。该方法在一个实施方案中涉及应用一种治疗方案，所述治疗方案导致受试者中的免疫系统抗原暴露，随后施用至少两次本发明的免疫刺激性寡核糖核苷酸，以诱导多表位特异的免疫应答，即促进表位扩展。在多个实施方案中，该治疗方案是外科手术、辐射、化学疗法、其它癌症药物、疫苗或癌症疫苗。

除了随后的免疫刺激疗法外，治疗方案可以与免疫促进剂组合进行。例如，当治疗方案是疫苗时，其可以与佐剂结合施用。疫苗和佐剂的组合可以是混合物或独立的施用，即注射(即相同的引流区(drainage field))。施用不必须是同时的。如果使用非同时的注射，则时间安排可包括先注射佐剂，然后是疫苗配方。

完成治疗方案后，开始免疫刺激单一疗法。最佳的施用频率、持续时间和位点应取决于靶标和其它因素，但是可例如是在六个月到两年的时间段内每月或每两月的施用。或者，施用可以基于每日、每周或每两周进行，或施用可以是一天、一周或一月内多次。在一些情况下，施用的持续时间可取决于疗法的长度，例如其可以在一周后、一个月后、一年后或数年后停止。在其它情况下，单一疗法可以是连续的，如使用静脉滴注。免疫刺激剂可以被施用给靶标常见的引流区。

就疗法中的用途而言，不同的剂量对于治疗受试者可能是必需的，这取决于化合物的活性、施用途径、免疫的目的(即预防性或治疗性)、病症的性质和严重性受试者的年龄和体重。给定剂量的施用可以以个体剂量单位的形式或若干个小剂量单位的形式通过单一施用完成。以分开数周或数月的特异间隔多次施用剂量适用于加强抗原特异性的免疫应答。

结合本文提供的教导，通过在多种活性化合物和称量因子(例如潜能、相对的生物可利用率、患者体重、不良副作用的严重性和施用的优选模式)中选择，可以计划有效的预防性或治疗性治疗制度，所述治疗制度不引起显著毒性并对于治疗具体受试者而言是完全有效的。用于任何具体应用的有效量可根据下述因素而不同，所述因素如治疗的疾病或病症、施用的具体治疗剂、受试者的块头，或疾病或病症的严重性。本领域常规技术人员之一可根据经验确定具体核酸和/或其它治疗剂的有效量而不必需进行不适当的实验。

本文所述的化合物的受试者剂量典型地在从约0.1mg到10,000mg、更典型地从约1mg/到8000mg、最典型地从约10mg到100mg的范围内。以受试者体重而言，典型的剂量在从约0.1mg到20mg/kg/天、更典型地从约1到10mg/kg/天、最典型地从约1到5mg/kg/天的范围内。

含有核酸和/或其它化合物的药物组合物可以通过用于施用药物的任何合适途径被施用。可以获得多种施用途径。当然，选择的具体模式将取决于选择的一种或多种具体试剂、治疗的具体病症和治疗效果所需的剂量。一般而言，本发明的方法可以施用医学可接受的任何施用模式进行，即产生有效的免疫应答水平而不引起临床上不可接受的不良作用的任何模式。优选的施用模式在本文讨论。对治疗中的用途而言，有效量的核酸和/或其它治疗剂可以通过任何模式被施用给受试者，所述模式将所述试剂递送至期望的表面，例如粘膜的、全身性的。

施用本发明的药物组合物可以通过技术人员已知的任何途径完成。施用的途径包括但不限于口、肠胃外、静脉内、肌内、腹膜内、鼻内、舌下、气管内、吸入、皮下、眼、阴道和直肠。就哮喘或变态反应的治疗或预防而言，这类化合物优选地被吸入、摄入或通过全身性途径被施用。全身性途径包括口服和肠胃外。在一些实施方案中优选吸入的药物，因为直接递送至肺，哮喘患者中原发的炎症位点。通常使用若干类型的设备用于通过吸入施用。这些类型的设备包括计量吸入器(MDI)、呼吸开动的MDI、干粉吸入器(DPI)、与MDI组合的间隔/储藏仓和喷雾器。

本发明的治疗剂可以借助于载体被递送至具体的组织、细胞类型，或递送至免疫系统，或二者兼有。“载体”在其最广泛的含义中是指能够便于将组合物转移至靶细胞的任何媒介。载体通常将免疫刺激性核酸、抗体、抗原和/或疾病特异性药物转运至靶细胞，具有相对于不存在载体时得到的降解范围而言减少的降解。

通常，适用于本发明的载体被分为两类：生物学载体和化学/物理载体。生物学载体和化学/物理载体适用于本发明的治疗剂的递送和/或摄入。

多种生物学载体被用于递送核酸，这在属于免疫刺激性核酸或包含免疫刺激性核酸的治疗剂递送中最为合适。

除了本文讨论的生物学载体外，化学/物理载体可被用于递送包含免疫刺激性核酸、抗体、抗原和病症特异性药剂的治疗剂。本文使用“化学/物理载体”是指除了来自细菌或病毒来源之外的天然或合成分子，其能够递送核酸和/或其它药物。

本发明优选的化学/物理载体是胶体分散体系。胶体分散体系包括以脂质为基础的体系，包括水包油乳剂、微团、混合的微团和脂质体。本发明优选的胶体系统是脂质体。脂质体是适用于体内或体外递送载体的人工膜脉管(vessel)。已经显示：尺寸范围从0.2-4.0mm的大单层囊泡(LUV)可以将大的大分子包胶。RNA、DNA和完整的病毒粒可以被包胶在水性内部中并以生物活性形式被递送至细胞。Fraley et al.(1981)Trends Biochem Sci6：77。

可以通过将脂质体与特异的配体(例如单克隆抗体、糖、糖脂或蛋白质)偶联将脂质体靶向具体的组织。可用于将脂质体靶向免疫细胞的配体包括但不限于：与免疫细胞特异受体和分子(如抗体)相互作用的完整分子或片段，所述受体和分子与免疫细胞的细胞表面标记物相互作用。这类配体可容易地通过本领域技术人员公知的结合测定鉴定。还在其它一些实施方案中，可以通过将脂质体与前文讨论的免疫治疗性抗体之一偶联使脂质体被靶向癌症。另外，载体可以与核靶向肽偶联，所述核靶向肽会将载体指向宿主细胞核。

用于转染的脂质配方可从QIAGEN以商业途径获得，例如EFFECTENE^TM(具有特异的DNA压缩增强子的非脂质体脂质)和SUPERFECT^TM(新颖的作用树状聚体技术)。

脂质体可从Gibco BRL以商业途径获得，例如LIPOFECTIN^TM和LIPOFECTACE^TM，其由阳离子脂质如N-[1-(2，3 dioleyloxy)-丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)和二甲基二十八烷基溴化铵(DDAB)形成。用于制造脂质体的方法是本领域公知的，并在许多出版物中被描述过。脂质体也已经由Gregoriadis G(1985)Trends Biotechnol 3：235-241综述。

某些阳离子脂质(尤其包括N-[1-(2，3二油酰氧)-丙基]-N，N，N-三甲基铵甲基硫酸酯(DOTAP))显示与本发明的经修饰的寡核糖核苷酸类似物组合时特别有利。

在一个实施方案中，媒介是适用于植入或施用至哺乳动物受体的生物相容的微粒或植入物。适用于该方法的示范性生物蚀解植入物描述于PCT国际申请no.PCT/US/03307(公开No.WO95/24929，题为“PolymericGene Delivery System”)。PCT/US/0307描述了生物相容的、优选生物可降解的多聚体基质，所述基质用于包含处于适当启动子调控下的外源基因。多聚体基质可被用于达成治疗剂在受试者中的持续释放。

多聚体基质优选是微粒的形式，例如微球(其中核酸和/或其它治疗剂被分散于固体多聚体基质各处)或微胶囊(其中核酸和/或其它治疗剂被储存于多聚体壳的核心中)。用于包含治疗剂的其它形式的多聚体基质包括薄膜、包衣、凝胶、埋植剂和支架。选择多聚体基质设备的尺寸和组成，使得在所述基质被引入的组织中产生良好的释放动力学。该根据待使用的递送方法选择多聚体基质的尺寸，所述递送方法典型地是注射进组织或通过气雾剂将悬浮液施用进鼻和/或肺区域。优选地，当使用气雾剂途径时，多聚体基质和核酸和/或其它治疗剂包括在表面活性剂媒介中。可以选择多聚体基质组合物，使其既具有良好的降解率，又由生物粘附的材料形成，从而当基质被施用给持续损伤的鼻和/或肺表面时进一步提高转移的有效性。也可以选择不降解但是通过扩散在延长的时间段中释放的基质组合物。在一些优选的实施方案中，当其它治疗剂被急性施用时通过植入物将核酸施用给受试者。适用于递送(例如口或粘膜递送)的生物相容的微球公开于Chickering et al.(1996)Biotech Bioeng 52：96-101和Mathiowitz E etal.(1997)Nature 386：410-414和PCT专利申请WO97/03702中。

非生物可降解的和生物可降解的多聚体基质均可以用于将核酸和/或其它治疗剂递送给受试者。优选生物可降解的基质。这类多聚体可以是天然的或合成的多聚体。多聚体根据所期望的释放时间段选择，通常按数小时到一年或更久的顺序。典型地，范围在数小时和三到十二个月之间的时间段上的释放是最期望的，尤其是对于核酸试剂而言。多聚体任选地是水凝胶(其在水中能够吸附至多约其重量的99％)的形式，或者任选地与多价离子或其它多聚体交联。

人们特别感兴趣的生物粘附多聚体包括H.S.Sawhney，C.P.Pathak andJ.A.Hubell in Macromolecules，(1993)26：581-587描述的生物蚀解水凝胶，该参考文献的教导并入本文。这些包括多聚透明质酸、酪蛋白、明胶、明胶蛋白、聚酐、聚丙烯酸、藻酸盐、壳聚糖、多聚(甲基丙烯酸酸甲酯)、多聚(甲基丙烯酸乙酯)、多聚(甲基丙烯酸丁酯)、多聚(甲基丙烯酸异丁酯)、多聚(甲基丙烯酸己酯)、多聚(甲基丙烯酸异癸酯)、多聚(甲基丙烯酸十二烷基酯)、多聚(甲基丙烯酸苯酯)、多聚(丙烯酸甲酯)、多聚(丙烯酸异丙酯)、多聚(丙烯酸异丁酯)和多聚(丙烯酸十八烷基酯)。

如果治疗剂是核酸，则也期望使用压缩剂(compaction agent)。压缩剂也可以单独使用或与生物载体或化学/物理载体组合使用。本文使用“压缩剂”是指中和核酸上的负电荷从而允许核酸压缩为精细颗粒的一种试剂，例如组蛋白。核酸的压缩便于核酸被靶细胞摄入。压缩剂可以单独使用，即以被细胞更有效吸收的形式递送核酸，或更优选其与一种或多种上述载体组合使用。

可用于促进核酸吸收的其它示范性组合物包括磷酸钙和胞内运输的其它化学媒介、微注射组合物、电穿孔和同源重组组合物(例如用于将核酸整合进靶细胞基因组中预先选定的位点中)。

化合物可以单独施用(例如在盐水或缓冲液中)或使用本领域已知的任何递送媒介施用。例如以下的递送媒介已经被描述：螺旋体(Gould-Fogerite et al.，1994，1996)；Emulsomes(Vancott et al.，1998，Lowell et al.，1997)；ISCOMs(Mowat et al.，1993，Carlsson et al.，1991，Hu et.，1998，Morein et al.，1999)；脂质体(Childers et al.，1999，Michalek et al.，1989，1992，de Haan 1995a，1995b)；活细菌载体(例如Salmonella、Escherichia coli、Bacillus Calmette-Guérin、Shigella、Lactobacillus)(Hone et al.，1996，Pouwels et al.，1998，Chatfield et al.，1993，Stover et al.，1991，Nugent et al.，1998)；活病毒载体(例如牛痘、腺病毒、单纯疱疹)(Gallichan et al.，1993，1995，Moss et al.，1996，Nugent et al.，1998，Flexner et al.，1988，Morrow et al.，1999)；微球(Gupta et al.，1998，Jones et al.，1996，Maloy et al.，1994，Mooreet al.，1995，O’Hagan et al.，1994，Eldridge et al.，1989)；核酸疫苗(Fynan et al.，1993，Kuklin et al.，1997，Sasaki et al.，1998，Okada et al.，1997，Ishii et al.，1997)；多聚体(例如羧甲基纤维素、壳聚糖)(Hamajima et al.，1998，Jabbal-Gill et al.，1998)；多聚体环(Wyatt et al.，1998)；蛋白体(Vancott etal.，1998，Lowell et al.，1988，1996，1997)；氟化钠(Hashi et al.，1998)；转基因植物(Tacket et al.，1998，Mason et al.，1998，Haq et al.，1995)；病毒小体(Gluck et al.，1992，Mengiardi et al.，1995，Cryz et al.，1998)和病毒样颗粒(Jiang et al.，1999，Leibl et al.，1998)。

本发明的配方在可药用的溶液中被施用，所述溶液常规地含有可药用浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、适合的运载体、佐剂和任选的其它治疗成分。

术语可药用运载体表示适用于施用给人或其它脊椎动物的一种或多种适合的固体或液体填充剂、稀释剂或包胶物质。术语运载体表示天然或合成的有机或无机成分，活性成分与之组合以便于应用。药物组合物的成分也能够以下述方式与本发明的化合物彼此混合：不存在会显著损伤期望的药物有效性的相互作用。

对于口服施用而言，可以通过将活性化合物与本领域公知的可药用运载体混合来容易地对化合物(即核酸、抗原、抗体和其它治疗剂)加以配制。这类运载体使得本发明的化合物能够被配制为片剂、烷基、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、悬浮液等，用于被待治疗的受试者口服摄取。用于口服用途的药物制剂可以作为固体赋形剂获得，如果期望的话在添加合适的辅料后任选地研磨得到的混合物并加工混合物颗粒，获得片剂或锭剂核。合适的赋形剂尤其是填充剂如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂如玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄芪树胶(gum tragacanth)、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯酮(PVP)。如果期望的话，可以添加崩解剂例如交联的聚乙烯吡咯酮、琼脂或海藻酸或其盐例如海藻酸钠。任选地，口服制剂也可以被配制在盐水或缓冲液中用于中和内部酸条件，或可以不与任何运载体一起被施用。

锭剂核与合适的包衣一起提供。为了该目的可以使用浓缩的糖溶液，其可任选的含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液(lacquer solution)和合适的有机溶剂或溶剂混合物。染料或色素可以被添加至片剂或锭剂包衣中用于鉴定或表征活性化合物剂量的不同组合。

可口服使用的药物制剂包括由明胶制成的push-fit胶囊，以及由明胶和增塑剂(例如甘油或山梨醇)制成的软密封胶囊。push-fit胶囊可以含有与填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉和/或润滑剂如滑石或硬脂酸镁和任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可溶于或悬浮于合适的液体中，例如脂肪油、液体石蜡，或液体聚乙二醇中。另外，可以添加稳定剂。也可以使用配制用于口施用的微球。这类微球已经是本领域确定的。用于口施用的所有配方应当是适用于这类施用的剂量。

对于含服施用而言，组合物可以采取以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。

对于通过吸入施用而言，用于本发明用途的化合物可以以来自增压包装或喷雾器的喷雾剂的形式用合适的推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体)便利地被递送。在加压气雾剂的情况下，单位剂量可以通过提供用于递送测定量的值来确定。用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(例如明胶)可以被配制为含有化合物和合适粉末基础(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。

当期望全身性递送化合物时，其可以被配制为用于通过注射肠胃外施用，例如通过推注(bolus injection)或连续输注。用于注射的配方可以以单位剂型存在，例如安瓿或带有添加的防腐剂的多剂量容器中。组合物可以采用例如油性或水性媒介中的悬浮液、溶液或乳剂的形式，并可以含有配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。

用于肠胃外施用的药物配方包括水溶性形式的活性化合物的水性溶液。另外，活性化合物的悬浮液可以被制备为合适的油性注射悬浮液。合适的亲脂溶剂或媒介包括脂肪油(如芝麻油)或合成的脂肪酸酯(如油酸乙酯)或甘油三酯，或脂质体。水性注射悬浮液可含有提高悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选的，悬浮液也可以含有合适的稳定剂或提高化合物溶解度的试剂，以允许制备高浓度溶液。

或者，活性化合物可以是用于在使用前与合适媒介(例如灭菌无热原水)组合的粉末形式。

组合物也可以被配制在直肠或阴道组合物例如栓剂或灌肠剂中，其例如含有常规的栓剂基质，如可可脂或其它甘油酯。

除了前述配方外，化合物也可以被配制为储存制剂。这类长效配方可以用合适的多聚体或疏水材料(例如可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂配制，或被配制为微溶衍生物(例如微溶盐)。

药物组合物也可包含合适的固体或凝胶相运载体或赋形剂。这类运载体或赋形剂的例子包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、多种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和多聚体如聚乙二醇。

合适的液体或固体药物制剂形式为例如用于吸入的水性或盐水溶液、被微囊包埋、螺旋包埋(encochleated)、包衣在微金颗粒上、包含在脂质体中、被喷洒、气溶胶、用于植入皮肤的小团、或干燥在要擦入皮肤中的尖锐物品上。药物组合物也包括颗粒、粉末、片剂、包衣的片剂、(微)胶囊、栓剂、糖浆、乳剂、悬浮液、霜、滴剂或延长活性化合物释放的制剂，所述制剂中如上所述常规地使用赋形剂和添加剂和/或辅料，例如崩解剂、粘合剂、包衣剂、溶胀剂、润滑剂、调味剂、甜味剂或增溶剂。药物组合物适用于多种药物递送体系。用于药物递送的方法的概括综述参见Langer R(1990)Science 249：1527-1533，其通过参考并入本文。

核酸和任选的其它治疗剂和/或抗原可以自身(纯的)被施用或者以可药用盐的形式被施用。当用于药物中时，盐应当是可药用的，但是可以便利地使用非可药用盐以制备其可药用盐。这些盐包括，但不限于从以下酸制备的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、p-甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。这类盐也可以被制备为碱金属或碱土金属盐，例如羧酸基团的钠盐、钾盐或钙盐。

合适的缓冲剂包括：乙酸和盐(1-2％w/v)；柠檬酸和盐(1-3％w/v)；硼酸和盐(0.5-2.5％w/v)；和磷酸和盐(0.8-2％w/v)。合适的防腐剂包括苯扎氯胺(0.003-0.03％w/v)；三氯叔丁醇(0.3-0.9％w/v)；对羟基苯甲酸酯(0.01-0.25％w/v)和柳硫汞(0.004-0.02％w/v)。

组合物可以以单位剂量形式便利地存在，并可通过制药领域公知的任何方法制备。所有方法都包括使化合物与运载体组合的步骤，所述运载体组成一种或多种助剂(accessory ingredients)。通畅，通过将化合物均一地和直接地与液体运载体、精细分散的固体运载体或这二者组合，如果需要的话随后使产物成形来制备组合物。液体剂量单位是管或安瓿。固体剂量单位是片剂、胶囊和栓剂。

其它递送系统可包括即时释放(time-release)、延迟释放或延长释放递送体系。这类体系可以避免化合物的重复施用，增进对受试者和医师的便利。许多类型的递送体系是可获得的，并且是本领域常规技术人员已知的。它们包括多聚物基础系统如多聚(丙交酯-乙交酯)、共聚草酸酯、聚己酸内酯、聚酯酰胺、多聚正酯、多聚羟基丁酸和多聚酸酐。含有前述多聚体微胶囊的药物公开于例如U.S.Pat.No.5,075,109中。递送体系也包括下述非多聚体体系：脂质，包括甾醇如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸或中性脂肪如甘油单、二和三酯；水凝胶释放体系；硅胶体系；基于肽的体系；蜡包衣；使用常规粘合剂和赋形剂的压缩片剂；部分融合的埋植剂等。特异的例子包括，但不限于：(a)侵蚀体系(erosional system)，其中本发明的试剂以基质中的形式被包含，例如U.S.Pat.Nos.4,452,775、4,675,189和5,736,152中所公开的那些，和(b)不扩散体系(diffusional system)，其中活性成分以受控的速率从例如U.S.Pat.Nos.3,854,480、5,133,974和5,407,686中所述的多聚体渗透。另外，可以使用基于泵的硬件递送体系，其中一些适用于植入。

以下的实施例将进一步阐述本发明，所述实施例不应以任何方式被认为用于进一步限制。

实施例

实施例1

人PMBC对含N-U-R ₁ -R ₂ 的寡核糖核苷酸的应答性

方法：Luminex技术

称作微球的Luminex色彩代码小珠分为100个不同的组。每个小珠组可以用对具体生物测定特异的实际包被，允许从样品中捕获并检测特异的分析物。在Luminex简便分析仪中，激光激发鉴定每个微球颗粒的内部染料，并且任何报告子染料也在该测定期间被捕获。对每个小珠组进修许多读数，进一步确认结果。以此种方式，Luminex技术允许在单个样品中快速并精确地复合多至100个独特的测定。

从健康的供体中分离人外周血单核细胞(PBMC)，对其进行涂布并用多种测试和对照免疫刺激剂刺激16个小时。16小时后收集上清液，然后通过ELISA测定分析。在与DOTAP复合和完全滴定曲线(7个浓度)的条件下测试含N-U-R₁-R₂的寡核糖核苷酸，所述曲线从与25μg/ml DOTAP复合的2μM ORN开始并具有1/3的稀释度步骤。还包括某些阴性对照，包括单独用培养基和单独用DOTAP(25mg/ml培养基孔；“脂质体”)。对照免疫刺激剂包括咪唑喹啉R-848(2μM，1/3稀释度步骤和7个浓度)、报导的TLR7的配体、具有TLR7基序如AU和AUU序列(SEQ IDNO：13-SEQ ID NO：15)的ORN、具有TLR8基序如CU、GU和GUU序列(SEQ ID NO：19-SEQ ID NO：23)的ORN。结果显示在图1和3中。

使用经分离的pDC、单核细胞和mDC刺激进行用于测试不同ORN序列的类似测定。用与10μg/ml DOTAP、0.5μM CpG ODN复合的0.5μMORN，或单独用DOTAP或培养基刺激细胞。16小时后收集上清液并通过ELISA测量IFN-α、TNF-α和IL-12p40。结果显示在图2中。

图1显示了用含AU序列的SEQ ID NO：12和含GU序列的SEQ IDNO：21对PBMC刺激时TNF-α和IFN-α生产之间的清晰差异。其它的序列分析显示CUA重复(SEQ ID NO：24)是另一诱导TNF-α而不产生IFN-α的ORN。含有AU和GU重复(SEQ ID NO：29-SEQ ID NO：34)的较短ORN显示与较长ORN(SEQ ID NO：12-SEQ ID NO：23)相比相似的结果，但是效率和能力降低。

图2和6显示了在经分离的单核细胞、pDC和mDC上对AU-ORN(SEQ ID NO：13)和GU-ORN(SEQ ID NO：21)的分析，反映了对AU-ORN(SEQ ID NO：13)而言强烈降低的IFN-α生产，和对两种ORN而言清晰的TNF-α和IL-12p40生产。来自pDC的ORN刺激时的IFN-α生产似乎是TLR7介导的，而来自经分离的单核细胞和mDC的TNF-α和IL-12p40生产似乎是TLR8介导的。

Luminex结果反映了与ELISA数据相当的结果，并证明了GU-ORN和AU-ORN之间主要的区别归因于IFN-α生产和IFN-α相关的基因/细胞因子(图3和8a)。另外，其它Luminex数据显示与IFN-α和IFN-α相关的基因/细胞因子相反，其它细胞因子/趋化因子不受来自CD123-CD14-细胞的一个异常值的影响(图7和8a-d)。该IL-6生产可能归因于TLR7介导的B细胞激活。

实施例2

对寡核糖核苷酸的IFN-α和TNF-α最大活性的比较

用与DOATP复合的ORN来刺激人PBMC。16个小时后收集上清液并测量TNF-α和IFN-α水平。测定了3-6个血供体和两个独立实验在0.6μM处的平均/最大活性。结果显示在图4中。这些数据在TLR8和TLR7/8基序间清晰地不同：具有基序N-U-R₁-R₂的ORN显示在300pg/ml下的IFN-α生产，而TLR7/8 ORN显示在PBMC刺激时更高的IFN-α生产(图4a)。TLR8和TLR7/8用红线分开。相反，TNF-α水平测量指出具有TLR8的ORN和具有TLR7/8基序的ORN二者均刺激TNF-α生产。

实施例3

对寡核糖核苷酸的IFN-α最大活性与IFN-αEC50的比较

用与DOATP复合的ORN刺激人PBMC。16个小时后收集上清液并测量INF-α水平。测定了3-6个血供体和两个独立实验在0.6μM处和在完全滴定曲线(范围2μM到0.9nM)的EC50处的平均/最大活性。结果显示在图5中。EC50和最大活性显示涉及TLR8和TLR7/8基序的可比较的结果。低EC50/高最大活性表示TLR7/8ORN(图5a)而高EC50和低最大活性表示TLR8ORN(图5b)。

在人PBMC刺激时对表1所列的ORN序列进行IFN-α和TNF-α生产测试。用指定的ORN刺激人PBMC 16小时，收集上清液并通过ELISA测量细胞因子生产。表2概括了ORN针对IFN-α和TNF-α生产的最小/最大活性和EC50。

表1：

+：细胞因子生产

-：无细胞因子生产。

表2

实施例4

在人PMBC刺激时，合成的ORN在IFN-α和TNF-α释放之间不同

用与25μg/ml DOTAP复合的1μM ORN或单独用DOTAP(图10a)，或指定量的与DOTAP复合的ORN或单独用DOTAP(图10b-10c)孵育CD123+经纯化的pDC(图10a和10b)或经分离的单核细胞(图10c)。16小时后收集细胞并用CD123、CD11c和HLA-DR抗体(图10a和10b)或CD14和CD19(图10c)染色。对CD86的FACS分析显示，富含AU的ORN(SEQ ID NO：13)和富含GU的ORN(SEQ ID NO：21)在pDC刺激时在CD86表面标记物表达中显示差异。用富含AU的ORN(SEQ ID NO：13)刺激导致非常少的CD86激活，而用富含GU的ORN(SEQ ID NO：21)刺激导致显著的CD86激活。该激活被确定为是级联依赖性的(图10b)。富含AU的ORN(SEQ ID NO：13)和富含GU的ORN(SEQ ID NO：21)在人PBMC(数据未显示)和CD14-阳性细胞刺激时在CD80表面标记物表达中显示无差异(图10c)。

实施例5

富含AU的ORN(SEQ ID NO：13)和富含GU的ORN(SEQ ID NO：21)以剂 量依赖的方式刺激特异的人TLR8信号转导

用人TLR3或TLR8表达质粒和NFκB-萤光素酶报告基因构建体稳定转染不应答的HEK-293细胞。用指定的ORN序列(10μM，与50μM/mlDOATP复合)或对照刺激(10μM R-848、50μg/ml polyIC、3，3μM ODN10103或50μg/ml DOTAP)将细胞孵育16小时。通过测定萤光素酶活性测量NFκB-激活。结果作为高于背景(培养基)的倍数诱导给出。显示了6个独立重复的一个代表性实验(图9a)。

用与DOTAP(50μg/ml->1/3稀释度)复合的指定浓度的ORN或单独用DOTAP(50μg/ml->1/3稀释度)将表达人TLR8的稳定转染的HEK-293细胞刺激16小时。通过测定萤光素酶活性测量NFκB-激活。结果作为高于背景(培养基)的倍数诱导给出。显示了3个独立重复的一个代表性实验(图9b)。

用人TLR8表达质粒和NFκB-萤光素酶报告基因构建体稳定转染不应答的HEK-293细胞。用指定的ORN序列(15μM，与75μM/ml DOATP复合)或对照刺激(15μM R-848或75μg/ml DOTAP)和用培养基(左)、200nM Bafilomycin(Baf.，中)或1mM氯喹(CQ，右)将细胞孵育16小时。通过测定萤光素酶活性测量NFκB-激活。结果作为高于背景(培养基)的倍数诱导给出。显示了4个独立重复的一个代表性实验(图9c)。

将RPMI 8226细胞与1000U/mlIntron A孵育3小时，用培养基洗涤两次，然后用指定浓度的与DOTAP(50μg/ml->1/3稀释度)复合的ORN刺激。通过ELISA测量IP-10的细胞因子释放。结果以pg/ml给出。显示了3个独立重复的一个代表性实验(图9d)。

这些数据证明SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：21对TLR8的特异性。

用高剂量(H.D.，10μg/ml)和低剂量(L.D.，2.5μg/ml)的TLR8 ORN(SEQID NO：13)、TLR 7/8 ORN(SEQ ID NO：21)和对照ORN(SEQ ID NO：5)(表3)重复该测定。仅SEQ ID NO：21处理导致了显著的IL-12和TNF-α生产(分别为图11a和11b)。所有的ORN刺激IFN-γ的生产(图11c)。

SEQ ID NO	ORN
		SEQ ID NO：5	C＊C＊G＊U＊C＊U＊G＊U＊U＊G＊U＊G＊U＊G＊A＊C＊U＊C
SEQ ID NO：13	U＊U＊A＊U＊U＊A＊U＊U＊A＊U＊U＊A＊U＊U＊A＊U＊U＊A＊U＊U
		SEQ ID NO：21	U＊U＊G＊U＊U＊G＊U＊U＊G＊U＊U＊G＊U＊U＊G＊U＊U＊G＊U＊U

实施例6

小鼠巨噬细胞体内或体外不对富含AU的ORN(SEQ ID NO：13)应答

Raw264.7细胞(图12a)、J774细胞(图12b)和经纯化的CD11c+细胞(Milteny，磁性小珠标记)分离自sv129小鼠脾细胞(图12c-12e)并用与DOTAP(50μg/ml并用ORN稀释)复合的指定浓度的ORN、单独的R-848或DOTAP(50μg/ml)刺激。16个小时(图12a和12b)或20个小时(图12c-12e)后收集上清液并用于TNF-α(图12a和12b)、IL-12p40(图12c)、IFN-α(图12d)和IP-10(图12e)的ELISA。数据表示了来自至少三个实验的一个个体(图12a和12b)和3只小鼠的均值(图12c-12e)。为了测量富含AU的ORN体内刺激小鼠细胞的能力，用与DOTAP(60、20或6μg/ml)配制的指定量的ORN注射sv129小鼠(n＝5/组)并在3小时后采血。用ELISA在全血中测量IL-12p40(图12f)、IFN-α(图12g)和IP-10(图12h)生产。

实施例7

经纯化的大鼠脾细胞不对富含AU的ORN SEQ ID NO：13应答

将来自3只Sprague-Dawley大鼠的脾细胞合并并用指定浓度的SEQID NO：21、SEQ ID NO：13(均与62.5μg/ml DOTAP复合，1/5稀释度)、R-848或DOTAP单独(62.5μg/ml->1/5稀释度)刺激。20小时后收集上清液并通过ELISA测量TNF-α水平。如图13中所示，用富含GU的ORNSEQ ID NO：21刺激导致TNF-α生产，而用富含AU的ORN SEQ ID NO：13生产导致不生产TNF-α。

实施例8

啮齿动物细胞对富含AU的ORN SEQ ID NO：13的失败应答可由物种间的 TLR8多态性导致

用富含AU的ORN刺激人和牛细胞导致细胞因子生产，而刺激小鼠和大鼠细胞则不导致。进行TLR8序列比对和分析。不同脊椎动物(人、猴子、猩猩、犬、牛、猪、小鼠和大鼠)间TLR8的蛋白质序列比对显示结构域1的富含亮氨酸重复(LRR)3中强烈的差异。尽管人、猩猩和猴子是高度保守的，但是与人相比，大鼠、小鼠和猪被证明在位置106(小鼠)、103(大鼠)或102(猪)删除4AA，牛被证明具有2AA(105-106)的插入。有趣的是，猪和牛显示出在相同区域(位置97)中的另一个2AA删除。可能结构域1的富含亮氨酸重复区域中的删除可干扰富含AU的ORN结合。

等同物

前述书面说明书被认为足够使本领域技术人员实现本发明。本发明的范围不受提供的实施例限制，因为实施例仅旨在单独阐述本发明的一个方面，其它功能等同的实施方案都在本发明的范围之内。除了本文所示和所述的之外，本领域的技术人员根据前文描述将显而易见本发明的多种修饰，这些都在附加的权利要求的范围之内。本发明的优点不一定被本发明的每个实施方案包含。

本申请中引用的所有参考文献、专利和专利出版物都一起整体通过引用并入本文。

Claims (8)

1.SEQ ID NO：21的寡核苷酸。

2.SEQ ID NO：21的寡核苷酸在制造用于在受试者中调控免疫应答的药剂中的用途。

3.权利要求2所述的用途，其中所述寡核苷酸以能诱导细胞因子表达的有效量递送给受试者。

4.权利要求2所述的用途，其中所述细胞因子选自IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α和IFN-γ。

5.组合物，其包含处于可药用的运载体中的SEQ ID NO：21的寡核苷酸。

6.权利要求5所述的组合物，其还包含下述抗原，其中所述抗原任选地与所述寡核苷酸缀合。

7.权利要求5或6所述的组合物，其中所述可药用的运载体被配制为用于注射。

8.权利要求5或6所述的组合物，其中所述可药用的运载体被配制为用于口服施用、鼻施用、舌下施用、粘膜施用、呼吸施用或经皮施用。

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