CN102586228A

CN102586228A - 用于多核苷酸序列线性等温扩增的方法及组合物

Info

Publication number: CN102586228A
Application number: CN2012100229651A
Authority: CN
Inventors: N·库恩
Original assignee: Nugen Technologies Inc
Current assignee: Nugen Technologies Inc
Priority date: 1999-09-13
Filing date: 2000-09-13
Publication date: 2012-07-18
Also published as: KR100527265B1; JP2003509068A; MXPA02002656A; NO20021223D0; IL148091A0; JP3929775B2; WO2001020035A3; ES2214319T3; DE60009323T2; EP1431303B1; ES2447419T3; WO2001020035A9; WO2001020035A2; KR20020047160A; ATE262595T1; CN1373812B; AU783873B2; JP2003116586A; NZ517121A; CA2384838A1

Abstract

本发明提供了若干新的等温单个引物线性核酸扩增方法。提供了若干利用组合引物、引物延伸、链置换以及任意的终止序列来扩增互补的DNA的方法。提供了若干利用组合引物、引物延伸、链置换、任意的模板切换、前启动子寡核苷酸以及转录来扩增有义DNA的方法。本发明还提供了用于实施所述方法的组合物及药盒，以及利用扩增产物的方法。

Description

用于多核苷酸序列线性等温扩增的方法及组合物

本申请是发明人于2000年9月13日提交的题为“用于多核苷酸序列线性等温扩增的方法及组合物”的中国专利申请00812800.6的分案申请。

相关申请的参照

本发明申请要求的优先权申请是申请日为1999年9月13日、申请号为60/153,604的美国临时专利申请和申请日为2000年1月12日、申请号为60/175,780的美国临时专利申请，这两件申请作为参考全部并入文本。

技术领域

本发明涉及多核苷酸扩增技术领域。更具体地说，本发明提供了利用单个的RNA/DNA组合引物扩增(即进行多次复制)靶多核苷酸序列的方法、组合物及药盒，该扩增技术任意地包括转录作用。

背景技术

核酸扩增和扩增产物检测方法的发展近年来业已改进了核酸序列的检测、鉴定、定量以及序列分析。

核酸分析可用于检测和鉴定病原体、检测导致确定表型的基因变异、诊断遗传病或对疾病的敏感性、评估发育、疾病和对特定刺激的反应以及不同基因组测序计划中的基因表达。核酸扩增方法的其它应用包括稀少细胞的检测、病原体的检测以及恶性肿瘤中变异基因表达的检测等等。核酸扩增技术可潜在地用于定性分析(诸如检测确定核酸序列的存在)以及确定基因序列的定量分析。其中后者可用于病原体序列的评估和定量，以及基因增殖或缺失的测定(例如经常出现在从正常细胞到肿瘤细胞的细胞转变中)。

核酸序列中的序列变异检测对于突变基因型的检测(例如有关基因分析)、导致抗药性和药物遗传性的突变检测等是非常重要的。用于检测特异突变的不同方法包括等位基因特异的引物延伸、等位基因特异的探针连接反应以及鉴别探针杂交(参见例如U.S.5,888,819；6,004,744；5,882,867；5,710,028；6,027,889；6,004,745；和WO US88/02746)。还描述了无需专门知道变异而检测确定核酸序列中序列变异的存在的方法。其中一些方法是基于对测试扩增产物与参比扩增产物杂交而形成的错配序列的检测。通过利用错配序列的结合蛋白或者通过错配序列的化学或酶裂解可以检测这些异源双链体中的错配序列的存在。最近描述了一种基于十字形四链DNA结构的分支移位抑制而检测序列变异的方法[参见例如Li shanski，A.等人的Nucleic Acids Res 28(9)：E42(2000)]。其它方法是基于对单链扩增产物的特异构象的检测。单链DNA或RNA的第二结构取决于特定的序列。相对于参比序列的测试核酸靶物的序列变异导致构象的改变。利用与参比扩增产物的电泳迁移率相比而改变的测试扩增产物的电泳迁移率可检测单链扩增产物的改变的构象。单链构象的多态性(SSCP)可广泛地用于序列变异的检测[参见例如Orita M.，等人的Proc Natl AcadSci USA 86(8)：2766-70(1989)；Suzauki，Y.等人的Oncogene5(7)：1037-43(1990)；U.S.5,871,697]。该方法还可用于基于不同菌株或样本的特定核酸序列的确定变化而进行微生物的鉴定。利用SSCP法的突变检测大多采用DNA扩增产物，然而，还业已描述了RNA-SSCP法。依赖于序列的单链RNA构象被公证和示出，从而导致确定的电泳迁移图形[参见例如Sarkar等人的Nucleic Acid Research 20(4)：871-878(1992)和Gaspar ini等人的Hum.Genet.97：492-495(1996)]。

虽然可利用探针杂交来完成确定核酸序列的存在的检测及其序列分析，但是当测试样品中存在低量的(例如较少的分子)核酸序列时，该方法通常缺乏灵敏度。解决这个障碍的一个方案是开发出用于产生确定核酸序列的多个拷贝(适用于进一步的分析)的方法。这些产生特定核酸序列的多个拷贝的方法通常被定义为靶扩增方法。用于提高杂交分析检测灵敏度的其它方法是基于由杂交探针或探针生成多个产物，例如杂交探针的裂解形成了多个产物或者相邻探针的连接反应形成一个独特的依赖于杂交的产物。同样，利用由杂交作用产生的信号的扩增方法例如基于分支DNA探针杂交的方法可获得灵敏度增大的杂交反应。

有许多不同种类的核酸扩增方法例如指数式扩增法、联动线性扩增法、基于连接反应的扩增法和基于转录的扩增法。指数式核酸扩增法的一个例子是已经在许多出版物中公开的聚合酶链式反应(PCR)[参见例如Mullis等人的Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51：263-273(1986)；

Mullis K.等人的EP201，184；Mullis等人的U.S.4,582,788；Erlich等人的EP50，424，EP84，796，EP258，017，EP237，362；以及Saiki R.等人的U.S.4,683,194]。联动线性扩增法公开在Wallace等人的U.S.6,027,923中。基于连接反应的扩增法的例子是连接扩增反应(LAR)[由Wu等人在Genomics 4：560(1989)中公开]和连接酶链式反应[在申请号为0320308B1的欧洲专利申请中公开]。不同的基于转录的扩增法公开在U.S.5,766,849和5,654,142；还有Kwoh等人的Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：1173(1989)和Ginergeras等人的WO88/10315中。

最普遍使用的靶扩增方法是聚合酶链式反应(PCR)，该方法是基于以下几个步骤的多次循环：变性；两个寡核苷酸引物的杂交，每一个杂交到靶链的相反链上；以及由核苷酸聚合酶产生的引物延伸，从而生成靶链的多个双链拷贝。业已描述了许多不同种类的PCR，并且该方法被用于DNA或RNA核酸序列的扩增、测序、突变分析及其它分析。采用单个引物的基于热循环的方法也已经得到描述(参见例如U.S.5,508,178；5,595,891；5,683,879；5,130,238；以及5,679,512)。引物可以是DNA/RNA嵌合引物(正如U.S.5,744,308中所公开的)。依赖于热循环的其它方法是连接酶链式反应(LCR)和相关修复链式反应(RCR)。

通过在不同温度下的多次保温循环即热循环或者在一个温度下保温(等温过程)可完成靶核酸的扩增。热稳定核酸修饰酶的发现业已使核酸扩增技术得到快速发展[参见Saiki等人的Science 239：487(1988)]。热稳定核酸修饰酶例如DNA及RNA聚合酶、连接酶、核酸酶及类似物可用于依赖于热循环和等温扩增法这两种方法。在Fraiser等人的U.S.5,648,211；Cleuziat等人的U.S.5,824,517；以及Walker等人的Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：392-396(1992)公开了等温方法例如链置换扩增(SDA)。其它等温靶扩增方法是基于转录的扩增法，其中RNA聚合酶启动子序列在扩增的早期阶段并入引物延伸产物中(WO89/01050)，而其它靶序列或靶互补序列通过转录步骤和DNA/RNA杂交中间产物中的RNA链的消化而被扩增(参见例如U.S.5,169,766和4,786,600)。这些方法包括转录介导的扩增(TMA)、自动维持序列扩增(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)，以及这些方法的变型。[参见例如Guatelli等人的Proc.Na t l.Acad.Sci.U.S.A.87：1874-1878(1990)；U.S.5,766,849(TMA)；以及5,654,142(NASBA)]。其它扩增方法利用模板切换寡核苷酸(TSOs)和封闭寡核苷酸。例如，U.S.5,679,512以及Patel等人的Proc.Nat l.Acad.Sci.U.S.A.93：2969-2974(1996)中公开了采用嵌合DNA引物的模板切换扩增法，而Laney等人的U.S.5,679,512中公开了封闭寡核苷酸。

等温靶扩增方法无需热循环器，并由此容易适合于公共的仪器平台。然而，以前描述的等温靶扩增方法有几个缺陷。依据SDA法的扩增需要存在用于确定限制酶的位置，从而可限制其适用性。另一方面，需要聚合酶启动子序列并入由引物生成的扩增物以及易于产生非特异扩增的过程限制了基于转录的扩增方法例如NASBA和TMB。而且，还没有很好地掌握由基于转录的扩增方法扩增DNA靶物的机理。

目前的扩增方法的另一缺陷是，前一扩增反应的扩增产物对测试样品的潜在污染，从而导致样品中发生非靶特异扩增。该缺陷是公知的难题，是靶扩增技术的动力结果和扩增产物的形成，是扩增的底物。业已描述了不同的在扩增反应结束时或者在靶扩增开始前对测试样品进行去污染的方法。另外，也描述了利用物理方式防范测试溶液。所有这些解决方案都是不方便的，并且增加了核酸测试在公共实验室设置中的复杂性。

另外，采用热循环过程的扩增方法具有的另一缺陷是较长的滞后次数，这是热循环封闭所必需的，以便达到每一循环的“靶”温度。结果，利用热循环过程实施的扩增反应需要大量时间来达到反应完成化。

因此，需要克服这些缺陷的改进的核酸扩增方法。此处所提供的本发明满足了这个需要并具有其它益处。

此处所提到的所有参考文献，包括专利申请和公开文本都作为参考全部并入本文。

本发明的描述

本发明提供了用于多核苷酸扩增的方法和组合物，以及这些扩增方法的应用。

因此，本发明一方面提供了与靶多核苷酸序列互补的多核苷酸序列的扩增方法，该方法包括：(a)用组合引物杂交包括靶序列的单链DNA模板，所述的组合引物包括RNA部分和3’DNA部分；(b)使包括终止多核苷酸序列的多核苷酸任意杂交到模板的5’区域(相对于组合引物与模板的杂交)；(c)用DNA聚合酶延伸组合引物；(d)用一种酶裂解退火组合引物的RNA部分，该酶从RNA/DNA上裂解RNA，以便通过链置换使另一组合引物可与模板杂交并重复引物延伸，由此产生靶序列的互补序列的多个拷贝。

另一方面，本发明提供了用于扩增靶多核苷酸序列的方法，该方法包括：(a)用组合引物杂交包括靶序列的单链DNA模板，所述的组合引物包括RNA部分和3’DNA部分；(b)使包括终止多核苷酸序列的多核苷酸任意杂交到模板的5’区域(相对于组合引物与模板的杂交)；(c)用DNA聚合酶延伸组合引物；(d)用一种酶裂解退火组合引物的RNA部分，该酶从RNA/DNA上裂解RNA，以便通过链置换使另一组合引物可与模板杂交并重复引物延伸，由此产生被置换的引物延伸产物；(e)在以下条件使包括前启动子的多核苷酸与杂交到被置换的引物延伸产物上的区域杂交：即该条件使转录将由RNA聚合酶产生，以便产生包括与置换引物延伸产物互补的序列的RNA转录物，由此产生靶序列的多个拷贝。

此处描述了用于本发明方法的组合引物的不同实施例。例如，在一些实施例中，组合引物的RNA部分是相对于3’DNA部分的5’部分。在另一些实施例中，该5’RNA部分邻近3’DNA部分。对于此处所描述的方法，可以使用一个或多个组合引物。

此处还描述了包括终止序列的多核苷酸的不同示例性实施例。在一些实施例中，包括终止序列的多核苷酸是模板切换寡核苷酸(TSO)，其可以(但不是必需的)包含一个或多个修饰以便加强对模板的结合。因此，在一些实施例中，TSO包括在杂交到模板上的区域中的修饰，其中在一系列给定的条件下，与无修饰点的TSO相比，该TSO更紧密地结合到该区域上。此处提供了合适的修饰的例子。在一些实施例中，包括终止序列的多核苷酸是封闭序列，象TSO，可以包含一个或多个修饰以便加强对模板的结合。因此，在一些实施例中，封闭物序列包括杂交到模板上的区域中的修饰，其中在一系列给定的条件下，与无修饰的封闭剂相比，该封闭剂更紧密地结合到该区域上。此处提供了合适的修饰的例子。

本文描述了可用于这些方法及组合物的酶。例如，裂解RNA的酶可以是RNaseH。

在一些方面，TSO具有前启动子功能并包括杂交到置换引物延伸产物上的区域(可以也可以不邻近启动子)。在其它实施例中，包括前启动子的多核苷酸具有一个3’端区域，该区域杂交到被置换的引物延伸产物上，由此被置换的延伸产物的DNA聚合酶延伸，产生发生转录的双链启动子。在一些实施例中，包括前启动子的多核苷酸是PTO。

这些方法可用于扩增任何DNA靶物(包括例如基因组DNA和cDNA)。一个或多个步骤可以合并和/或按顺序实施(经常是以任何顺序，只要所需的产物能够形成即可)。

本发明还提供了采用(通常是分析)本发明扩增方法的产物的方法，例如测序和检测序列变异。

因此，一方面，本发明提供了测序靶核苷酸序列的方法，该方法包括：(a)用组合引物杂交包括靶序列的单链DNA模板，所述的组合引物包括RNA部分和3’DNA部分；(b)使包括终止多核苷酸序列的多核苷酸任意杂交到模板的5’区域(相对于组合引物与模板的杂交)；(c)用DNA聚合酶及dNTPs与dNTP类似物(可是标记的也可以是未标记的)的混合物延伸组合引物，以便在标记或未标记的dNTP类似物掺入时终止引物的延伸；(d)用一种酶裂解退火组合引物的RNA部分，该酶从RNA/DNA杂交体上裂解RNA，以便通过链置换使另一组合引物可与模板杂交并重复引物延伸，由此产生不同长度的靶序列的互补序列的多个拷贝；(e)分析步骤(a)至(d)的产物，以便测定序列。

另一方面，本发明提供了用于测序靶核苷酸序列的方法，该方法包括：(a)用组合引物杂交包括靶序列的单链DNA模板，所述的组合引物包括RNA部分和3’DNA部分；(b)使包括终止多核苷酸序列的多核苷酸任意杂交到模板的5’区域(相对于组合引物与模板的杂交)；(c)用DNA聚合酶延伸组合引物；(d)用一种酶裂解退火组合引物的RNA部分，该酶从RNA/DNA上裂解RNA，以便通过链置换使另一组合引物可与模板杂交并重复引物延伸，由此产生被置换的引物延伸产物；(e)在以下条件使包括5’端的前启动子的多核苷酸与杂交到置换引物延伸产物上的区域杂交：即该条件使转录利用rNTPs与rNTP类似物(可是标记的也可以是未标记的)的混合物由RNA聚合酶产生，以便产生包括与置换引物延伸产物互补的序列的RNA转录物，并且在标记或未标记的rNTP类似物掺入时终止转录，由此产生不同长度的靶序列的多个拷贝；(f)分析步骤(a)至(e)的产物，以便测定序列。

在一些方面，本发明提供了鉴定或分析靶序列的方法。这些方面是基于组合引物的RNA部分并因此这些结果反映与靶物的相应区域有关的信息，如果互补或充分互补，该靶物可杂交到组合引物的RNA部分上。与在参比靶序列上实施的相同扩增反应所得到的产物的量相比，该产物的量可指示出序列的存在或缺少，而由此进一步指示出野生型、突变型或等位变异的存在或缺少。本文描述了不同的序列检测实施例。于是，例如本发明提供了检测靶多核苷酸序列的一个区域中的突变的方法，该方法包括实施本文所描述的扩增方法，其中靶多核苷酸序列的这个区域对应于组合引物的RNA部分，而靶多核苷酸的突变导致可检测的扩增产物少，这是与由参比模板所产生的扩增产物的量相比而言，而该参比模板包括与组合引物的RNA部分对应的不包含突变体的区域。在这些实施例中，与由参比模板产生的扩增相比，由链置换产生的扩增减少了，而该参比模板包括与组合引物的RNA部分对应的不包含突变体(与组合引物的RNA部分相比而言)的区域。

这样，本发明提供了鉴定靶多核苷酸中感兴趣的序列的方法，该方法包括实施本发明的扩增方法，其中组合引物的RNA部分的序列是公知的，并且(a)与由参比模板所产生的扩增产物的量相比，由模板所产生的可检测的扩增产物的量少，该参比模板包括与组合引物的RNA部分互补的一个区域，从而指示出，靶多核苷酸不包括与组合引物的RNA部分互补的序列，并且是与组合引物的RNA部分互补的序列相对应的序列变异体；或者(b)与由参比模板所产生的扩增产物的量相比，由模板所产生的可检测的扩增产物的量更大，该参比模板不包括与组合引物的RNA部分互补的区域，从而指示出，靶多核苷酸包括与组合引物的RNA部分互补的序列，并且不是与组合引物的RNA部分互补的序列相对应的序列变异体。在一个实施例中，组合引物的RNA部分的序列包括野生型序列，并且感兴趣的序列的特征在于可测定野生型序列的存在或缺少。在另一实施例中，组合引物的RNA部分的序列包括突变型序列，并且感兴趣的序列的特征在于可测定突变型序列的存在或缺少。在又一实施例中，组合引物的RNA部分的序列包括等位序列，并且感兴趣的序列的特征在于可测定等位序列的存在或缺少。

在其它方面，本发明提供了检测靶多核苷酸中突变(或者在一些方面，是鉴定一个序列)的方法，该方法包括：(a)实施本文所描述的扩增方法；以及(b)为单链构象分析该方法的扩增产物，其中与参比单链多核苷酸相比，构象上的差别指示出靶多核苷酸中的突变。在其它实施例中，本发明提供了检测靶多核苷酸突变(或者在一些方面，是鉴定一个序列)的方法，该方法包括为单链构象分析本文所描述的任何方法的扩增产物，其中与参比单链多核苷酸相比，构象上的差别指示出靶多核苷酸中的突变(或者在一些方面，鉴定靶序列)。

在其它方面，本发明提供了制备微阵列的方法，该方法包括(a)实施本文所描述的扩增方法；以及(b)将扩增产物固定到固相底物上，从而制成扩增产物的微阵列。在其它实施例中，微阵列是如下生成的：通过利用本文所描述的任何方法将扩增产物固定到固相底物上，从而制成扩增产物的微阵列。

正如本文所描述的，这些应用的任一种都采用了这些扩增方法(包括不同组分以及这些任一组分的不同实施方式)的任一种类。例如，所用的组合引物可具有邻近3’DNA部分的5’RNA部分。

本发明还提供了用于本文所描述的扩增方法的组合物、药盒、复合物、反应混合物和包括不同组分(以及这些组分的不同组合)的系统。一方面，例如，本发明提供了包括组合引物的组合物，所述组合引物包括3’DNA部分和5’RNA部分。在一些实施例中，5’RNA部分邻近3’DNA部分。在又一些实施例中，5’RNA部分是大约5-大约20个核苷酸，而3’DNA部分是大约5-大约15个核苷酸。另一方面，本发明提供了包括TSO的组合物，其中TSO在杂交到模板的区域中包括一个修饰，并且在一系列给定的条件下，与没有修饰的TSO相比，该TSO更紧密地结合到该区域中。在一些实施例中，本发明的组合物包括本文所描述的任何组合引物以及TSO。在又一些实施例中，本发明提供了包括本文所描述的任何组合引物及本文所描述的任何封闭序列的组合物，这些组合物包括含有可增强对模板的结合的修饰的组分。在其它实施例中，本发明提供了包括本文所描述的任何组合引物以及PTO的组合物。

另一方面，本发明提供了包括本文(还参见对这些不同复合物示意性描绘的附图)所描述的任何复合物(通常被认为是相对于最终扩增产物的中间体)的组合物。例如，本发明提供了包括以下组分的复合物的组合物：(a)模板链；以及(b)组合引物，所述组合引物包括3’DNA部分和5’RNA部分。该RNA部分可以是5’位置并且与DNA部分邻近。在一些实施例中，该复合物还包括具有终止序列(可以是例如TSO或一个封闭序列)的多核苷酸。在一些实施例中，该复合物还包括PTO。

另一方面，本发明提供了含有本文所描述的组分的不同组合的反应混合物(或者是包括反应混合物的组合物)。例如，本发明提供的反应混合物包括：(a)多核苷酸模板；(b)包括3’DNA部分和RNA部分的组合引物；以及(c)DNA聚合酶。正如本文所描述的，任一组合引物都可以在反应混合物(或者多个组合引物)中，包括在3’DNA部分附近具有5’RNA部分的组合引物。该反应混合物还进一步包括能够从RNA/DNA杂交体中裂解DNA的酶(例如RNaseH)。本发明的反应混合物还可包括任一具有本文所述的终止序列的多核苷酸以及包含前启动子和杂交到置换引物延伸产物上的区域的多核苷酸，还有RNA聚合酶。本发明的反应混合物还可包括PTO。

另一方面，本发明提供了用于实施本文所述方法的药盒。这些药盒在合适的包装内并且一般(但不是必需的)包含适当的说明，而且这些药盒含有用于扩增方法的一种或多种组分。例如，本发明提供的药盒包括具有3’DNA部分和RNA部分(可以在5’位置并且还邻近3’DNA部分)的组合引物。药盒中的组合引物可以是本文中描述的任何组合引物。该药盒还可以含有诸如以下这些组分的任一种：(a)包含终止多核苷酸序列的多核苷酸；(b)包含前启动子的多核苷酸；(c)本文所描述的酶的任一种，例如能够从RNA/DNA杂交体中裂解DNA的酶(例如RNaseH)；以及(d)包含前启动子和杂交到置换引物延伸产物上的区域的多核苷酸。

另一方面，本发明提供了用于本文所述的扩增方法的系统。例如，本发明提供了用于扩增靶多核苷酸序列或其补体的系统，该系统包括：(a)包括3’DNA部分和RNA部分的组合引物；(b)DNA聚合酶；以及(c)能够从RNA/DNA杂交体中裂解DNA的酶(例如RNaseH)。组合引物可以是本文所述的任何一种(或多种)，包括在3’DNA部分附近具有5’RNA部分的组合引物。

附图的简要描述

图1A-C以图示法表示出一个组合引物等温线性扩增的过程。

图2A-2C以图示法表示出利用模板切换多核苷酸序列的一个增强等温线性核酸扩增过程(包括转录)。

图3A-3D以图示法表示出利用封闭序列组分的一个增强组合引物等温线性核酸扩增过程(包括转录)。

图4以图示法表示出利用一个引物等温线性核酸扩增过程检测模板序列中的突变。“X”表示在与组合引物RNA部分互补的位置上的靶DNA的突变。如图所示，当存在突变时靶核酸的扩增被封闭。

图5绘出了合成DNA靶物的线性等温扩增产物的溴化乙锭染色的PAGE凝胶。

图6绘出了DNA扩增产物与特异性探针杂交的PAGE分析的放射自显影图。

图7绘出了对由重叠延伸产生的s sRNA转录产物进行比较的溴化乙锭染色的PAGE凝胶。

图8绘出了对用3’-封闭PTO和不用3’-封闭PTO的线性等温扩增进行比较的溴化乙锭染色的PAGE凝胶。

图9绘出了杂交到由来自E.coli基因组DNA的J基因序列的等温线性扩增产生的扩增产物上的探针的的放射自显影图。

图10绘出了利用三个不同设计的组合引物产生的线性等温扩增RNA产物的溴化乙锭染色的PAGE凝胶。

实施本发明的方式

本发明提供了用于扩增多核苷酸序列的方法、组合物及药盒。该方法通常包括使用RNA/DNA组合引物、任选地终止序列，以及在采用转录的实施例中还使用前启动子寡核苷酸序列。

作为总述，如下实施这些扩增方法：组合RNA/DNA引物形成用于复制靶序列的基础。在一些实施例中，终止序列通过沿靶链转换或封闭进一步的复制而提供了复制终点的基础。如下所述，在一些实施例中，包括终止序列的多核苷酸是模板切换寡核苷酸(TSO)，它包括互补得不足以杂交到模板链上的序列(除了互补得足以进行杂交的序列之外)；在其它实施例中，终止序列包括互补得足以杂交到模板链上的初级序列。DNA聚合酶起到从该初级序列复制靶序列的作用。从RNA/DNA杂交体上裂解RNA的酶(例如RNa seH)从该杂交体上裂解(除去)RNA序列，留下适于和另一组合引物结合的模板链上的序列。另一链由DNA聚合酶产生，然后置换以前复制的链，从而生成置换延伸产物。包括前启动子和杂交到置换引物延伸产物(可以是例如模板切换寡核苷酸或前启动子模板寡核苷酸)上的区域的多核苷酸，包括互补得足以杂交到置换延伸产物的3’端的序列，从而可结合到置换引物延伸产物上。启动子驱动转录(通过依赖于DNA的RNA聚合酶)，从而生成有义DNA产物。

因此，本发明提供了对靶多核苷酸序列进行至少一次复制的方法(通常是扩增靶多核苷酸序列的方法)，该方法包括对以下组分进行组合和反应：(a)包括靶序列的单链靶多核苷酸；(b)包括RNA部分和3’DNA部分的组合引物；(c)DNA聚合酶；(d)脱氧核糖核苷三磷酸或合适的类似物；(e)从RNA/DNA双链体上裂解RNA的酶(例如RNaseH)；以及(f)通常(但是任意地)，包括终止序列的多核苷酸，例如本文所描述的任一种，其包括杂交到模板多核苷酸上的一部分(或区域)。如果还采用基于转录的扩增(参见下文)，则使用终止序列。该组合服从适当的条件，以便(a)组合引物(并且任意地，包括终止序列的多核苷酸)杂交到模板上；(b)由组合引物产生的引物延伸，从而形成双链体；(c)RNaseH从RNA/DNA双链体上裂解组合引物的RNA；(d)另一组合引物杂交到模板上，并且产生引物延伸(由DNA聚合酶介导)的另一循环，从而置换已经由模板复制的链。

任意地，在能够发生置换链转录的条件下，以下组分也包括在扩增反应中(与以上所列出的那些组分同时或分别加入)：(e)包括前启动子序列(如本文所述，可以是许多方式中的任何一种)和杂交到置换引物延伸产物上的区域的多核苷酸；(f)核糖核苷三磷酸或适当的类似物；以及(g)RNA聚合酶。以下提供了与本发明方法的不同组分有关的细节。

在一些实施例中，本发明提供了测序核酸(DNA或RNA)的方法。对于这些测序方法，使用标记或未标记的适当dNTPs(或者rNTPs，当采用基于转录扩增的实施例时)。因此，本发明提供了测序靶核苷酸序列的方法(包括上述那些方法)，其中使用标记或未标记的作为引物延伸终止物的dNTPs和dNTP，和/或标记或未标记的作为引物延伸终止物的rNTPs和rNTP，并且如下所述，分析扩增产物，以便得到序列信息。

在其它实施例中，本发明提供了检测核酸序列突变和/或鉴定一个或多个靶序列的方法。在一个实施例中，利用本发明的方法、采用组合引物、基于扩增靶多核苷酸的能力检测靶多核苷酸突变的存在或缺少，引物的RNA部分也含有或缺少突变序列。在另一实施例中，扩增产物用于利用特异性探针通过杂交而检测突变。在又一实施例中，扩增产物用于检测和/或鉴定靶多核苷酸中的单链构象多态性。

在又一实施例中，本发明提供了利用本发明线性或加强线性核酸扩增方法的扩增产物制备核酸(DNA或RNA)微阵列的方法。

以下提供了使用本文所述的扩增产物的其它方法。

本发明的扩增方法的优点

本发明的扩增方法比核酸扩增的其它方法具有几个显著的优点。引物模板的形成、引物的延伸和以前产生的延伸产物的置换取决于由核糖核酸酶活性导致的杂交引物的RNA部分的裂解。这样，引物延伸产物缺少引物的5’最大部分。因此，由延伸产物与模板切换寡核苷酸或启动子模板寡核苷酸的复合而产生的RNA转录产物在其3’端并不包含与引物的这一部分互补的序列。于是，扩增产物不能杂交到用于生产性扩增的引物上，从而使本发明的扩增方法不能进行由于以前扩增反应生成的产物的污染而造成的非特异扩增。这个特性使其明显区别于其它公知的靶扩增方法例如PCR、NASBA以及类似方法，并且使本发明的方法适合于临床实验室、高流通量的试验场地以及类似场所所用的公共开口平台。

为了进一步实施靶核酸序列的扩增，利用核糖核酸酶如Rnase H裂解杂交及延伸形式的组合引物的RNA部分的独特需求，导致DNA靶物的不相容扩增。这样，在过量mRNA的存在下，本发明的方法可用于基因组靶物的扩增。该特性对于准确定量基因剂量是有用的。当测试靶核酸序列是RNA时，首先转录该靶物，从而生成能够用本发明的方法扩增的cDNA。

本发明的方法还可以相对于模板的高准确度扩增靶核酸。每一扩增产物是输入模板DNA(在线性扩增方法中)的靶序列或者输入模板DNA与输入模板DNA(在增强的线性扩增方法中)的引物延伸产物的直接拷贝。

本发明的方法无需可以等温实施扩增的热循环。该特性具有许多优点，包括易于实施自动化以及适合于高流通量的扩增和/或核酸的分析。例如，通过进行等温反应而使基于本发明的扩增方法的测序方法简化了。业已报道的其它方法需要热循环，以便使引物延伸产物与靶序列分离。等温反应比热循环提供的反应快并适于在微型化装置中进行靶核酸的测序。

本发明方法的另一优点是，只需要一个引物。利用一个引物来提供导致模板核酸扩增的单向引物延伸。这避免了与使用引物对有关的许多缺陷，例如设计成本和制备两个引物、需要提前知道模板核酸内的其它序列区域，以及增加了扩增产物是非特异引发结果的可能性。

本发明的线性等温扩增方法还适用于检测核酸靶物、定量确定的核酸序列以及制备用于确定核酸序列的探针。本发明的方法可用于定性检测核酸序列、定量测定靶核酸序列的量、检测确定序列变异的存在(正如基因分型所需的)以及测序。按照本发明方法的扩增产物是单链的并且易于用不同的公知核酸检测方法来检测。

本发明的方法还用于核酸序列的多重分析。也就是说，不同的靶序列可以在一个反应混合物中同时扩增。不同的靶序列可以是部分单基因组DNA，或者代表不同核酸靶物的特定序列，这些不同的靶序列可以存在于一个测试样品中。例如，本发明的方法可用于检测一个生物样品中不同病原体的存在。同样，可以在一个反应中同时测定一个基因组样品中的不同多态位置。

应该理解，关于本文所述的所有实施例，正如通常“包括(comprising)”组分或方面，本发明还包括“基本上包括(consist essentially of)”这些组分或方面的实施例。本发明还包括由这些组分或方面“组成(consistof)”的实施例。这可用于本文所述的所有实施例。

一般技术

本发明的实践除非另外指出，否则其将利用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本技术领域内。文献[例如“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，second edition(Sambrook等人，1989)；“Ologonucleotide Synthesis”(M.J.Gait，ed.，1984)；“Animal Cell Culture”(R.I.Freshney，ed.，1987)；“Methods in Enzymology”(Academic Pres s，Inc.)；“CurrentProtocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel等人，eds.，1987)；“PCR：The Polymerase Chain Reaction”，(Mullis等人，eds.，1994)]中充分解释了这些技术。

可以利用本领域内公知的标准技术制备本发明中所用的引物、寡核苷酸和多核苷酸。

定义

本文中所用的“靶序列”是需要扩增的感兴趣的多核苷酸序列。该靶序列可以是公知的也可以是未知的，以其实际序列定义。通常，本文所用的“模板”是含有靶核苷酸序列的多核苷酸。在一些例子中，术语“靶序列”“模板DNA”“模板多核苷酸”“靶核酸”“靶多核苷酸”以及这些术语的变型可以互换使用。

本文所用的“扩增”通常是指产生所需序列的多个拷贝的过程。“多个拷贝”是指至少两个拷贝。“拷贝”并不必需指与模板序列的完全互补性或同一性。例如，拷贝可以包括核苷酸类似物例如脱氧肌苷/序列变异(例如通过包括杂交但不是互补到模板上的序列的引物而介入的序列变异)和/或扩增过程中产生的序列误差。

本文可以互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核苷酸、核糖核苷酸、修饰核苷酸或碱基，和/或它们的类似物，或者任何能够利用DNA或RNA聚合酶掺入聚合物中的底物。多核苷酸可包括修饰核苷酸例如甲基化核苷酸及其类似物。如果存在核苷酸结构的修饰，那么可以在结合到聚合物中之前或之后给予该修饰。可以用非核苷酸组分来中断核苷酸序列。还可以在聚合之后诸如通过与标记组分结合来修饰多核苷酸。其它类型的修饰包括例如“帽结构(cap)”、用类似物对一个或多个自然界出现的核苷酸进行取代、核苷酸间修饰例如用不带电的键(诸如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺、N-氯甲苯基丙酯等)以及用带电的键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)进行的修饰、含有侧组成成分例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、ply-L-赖氨酸)的修饰、用嵌入剂(例如丫啶、补骨脂素等)进行的修饰、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修饰、含有烷基化剂的修饰、用修饰键(例如α-端基异构核酸等)以及多核苷酸的未修饰形式进行的修饰。另外，一般存在于糖类中的任一羟基都可以由例如膦酸酯基、磷酸酯基取代，或者由标准保护基团保护，或者被激活以便将加成键配备给加成核苷酸，或者结合到固相载体上。5’和3’末端OH可以被磷酸化或被胺或1-20碳原子的有机加帽基团组成成分取代。其它羟基也可以被衍生成标准保护基团。多核苷酸还含有本领域内一般公知的核糖或脱氧核糖糖类的类似形式，包括例如2’-O-甲基-、2’-O-烯丙基、2’-氟-或2’-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-端基异构糖、差向异构糖(例如阿拉伯糖、木糖或来苏糖)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物以及无碱基核苷类似物(例如甲基核苷)。一个或多个磷酸二酯键可由可变连接基取代。这些可变连接基包括(但不限于)以下这些实施例：在这些实施例中磷酸酯可以由P(O)S(“硫代”)、P(S)S(“二硫代”)、(O)NR₂(“酰氨化”)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH₂(“甲酰化”)取代，其中每个R或R’是独立的H或者是取代或非取代烷基(1-20个C)，这些烷基任意地包含醚(-O-)键、芳香基、链烯基、环烷基、环烯基或环氧树脂基。并不是多核苷酸中的所有键都必需一样。前面的描述可用于本文所参考的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。

本文所用的“寡核苷酸”通常是指短的、一般是单链、一般是合成的多核苷酸，这些多核苷酸的长度通常(但不是必需的)少于大约200个核苷酸。本发明的寡核苷酸包括组合引物、TSO、PTO和封闭剂序列。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”不相互排斥。以上对多核苷酸的描述可以同等或完全用于寡核苷酸。

“引物”一般是短的单链多核苷酸，一般具有游离的3’-OH，可以利用靶序列通过杂交结合到潜在地存在于样品中的靶物上，然后促进与靶物互补的多核苷酸的聚合。

本文所互换使用的“终止多核苷酸序列”或“终止序列”是，相对于包括靶序列的模板起终止由DNA聚合酶进行的DNA复制的作用的多核苷酸序列。末端序列包括一般在距离端点(位点)的5’部位杂交到模板上的部分(或区域)。杂交部分可以也可以不包含整个末端序列。本文提供了合适的末端多核苷酸序列(例如封闭剂序列和TSOs)的例子。

本文所互换使用的“封闭剂序列”或“封闭序列”是一个末端序列的例子，并且是指这样的寡核苷酸：即该寡核苷酸一般在距离端点(位点)的5’部位高亲和性结合到模板核酸上，而且相对于包括靶序列的模板起终止由DNA聚合酶进行的DNA复制的作用。对于由DNA聚合酶所进行的衍生，可以或无需封闭其3’端。

本文所互换使用的“终止位点”或“终止点”是指，在聚合(通常是引物延伸)或模板切换终止之前由DNA聚合酶最后复制的模板位点、点或区域。例如，就TSO而言，它是在将模板从模板多核苷酸切换到TSO的未杂交部分之前与引物延伸产物的3’端互补的靶序列中的部位或区域。

本文所用的“原启动子序列”和“前启动子序列”是指以双链形式能够介导RNA转录的单链DNA序列区。在一些上下文中，“原启动子序列”、“原启动子”、“前启动子序列”、“前启动子”、“启动子序列”和“启动子”可以互换使用。

文本所用的“模板切换寡核苷酸(TSO)”是指，包括这样一个部分(或区域)的寡核苷酸：即该部分在距离引物延伸的端点的5’位置可杂交到模板上并且能够在由DNA聚合酶进行的引物延伸过程中起模板切换的作用。TSOs在本领域内一般是公知的。“模板切换”是指模板核酸中的变化，一般是在引物延伸的一个循环过程中从靶核酸变为TSO的未杂交部分。

本文所用的“前启动子模板寡核苷酸(PTO)”是指包括前启动子序列和一个部分(一般是3’部分，可杂交到引物延伸产物的3’区域)的寡核苷酸。前启动子序列和杂交部分可以相同、不同或者是寡核苷酸的重叠核苷酸。

与第二序列“对应”的第一序列(例如组合引物的RNA部分)是指，第一序列具有与第二序列具有显著的序列同源性。该术语通常在检测突变或鉴定靶物序列的上下文中使用。

对于“抑制”是指与参比物相比降低或减小活性、能力和/或量。

“复合物”是若干组分的组装。复合物可以是稳定的也可以不是稳定的，并且可以直接或间接检测。例如，正如本文所述，可以推断出反应的某些给定组分以及反应产物的种类、复合物的存在。为了实现本发明的目的，复合物一般是相对于最终扩增产物的中间体。

多核苷酸或寡核苷酸的本文可互换使用的“部分”或“区域”是，两个或更多碱基的连续序列。在其它实施例中，一个区域或部分是3、5、10、15、20、25连续核苷酸中的至少任何一个。

“邻近”另一序列的区域、部分或序列直接靠近那个区域、部分或序列。例如，邻近组合引物的5’DNA部分的RNA部分直接靠近那一区域。对于该例的图示说明，参见附图1A-C。

“反应混合物”是若干组分的集合，在合适的条件下它们发生反应，从而形成一复合物(可以是中间体)和/或产物。

除非另外指出，否则“A”、“an”和“the”包括多种形式。

“包括(Comprising)”是指包括(including)。

“允许”事件(例如杂交、链延伸以及类似事件)发生的条件或者适合于事件发生的条件，或者“合适的”条件是，不阻止这样的事件发生的条件。于是，这些条件允许、增强、易于和/或有助于事件的实施。这些条件是本领域内公知的并在本文中有所描述，而且取决于核苷酸序列的性质、温度以及缓冲剂的条件。这些条件还取决于需要什么事件(例如杂交、裂解、链延伸或转录)。

本文所用的序列“突变”是指与参比序列相比，感兴趣的序列中的任何序列变异。参比序列可以是野生型序列或者希望感兴趣的序列与之比较的序列。序列突变包括单个核苷酸的变异，或者序列中多个核苷酸的变异，这是由于诸如取代、缺失或插入的缘故。单个核苷酸的多态性也是一种序列突变(正如本文所用的)。

本文所用的“单链构象多态性”和“SSCP”一般是指受其特异性核酸序列影响时的单链核酸的特定构象。单链多核苷酸的序列变异(例如一个核苷酸的取代、缺失或插入)导致单链多核苷酸构象的变化或多态性。利用本领域内公知的方法(例如用凝胶电泳、毛细管电泳测定的电泳迁移率，和/或易被内切核酸酶消化)通常可以检测、鉴定和/或区分多核苷酸的构象。

在本文中可互换使用的“微阵列”和“阵列”是指将核苷酸序列收集在集中部位的布置。阵列可以在固相底物(例如玻片)或者半固相底物(例如硝酸纤维素膜)上。核苷酸序列可以是DNA、RNA或者这些序列的任何变换。

术语“3”一般是指，从相同多核苷酸或寡核苷酸的另一区域或部位算起的多核苷酸或寡核苷酸3’(下游)的一个区域或部位。

术语“5”一般是指，从相同多核苷酸或寡核苷酸的另一区域或部位算起的多核苷酸或寡核苷酸5’(上游)的一个区域或部位。

术语“3’-DNA部分”、“3’-区域”、“3’-RNA部分”和“3’-RNA区域”是指，位于多核苷酸或寡核苷酸3’端之上的多核苷酸或寡核苷酸的部分或区域，并且可以也可以不包括固定到相同多核苷酸或寡核苷酸3’最大核苷酸上的一个或多个3’最大核苷酸或组成成分。3’最大核苷酸优选的是大约1-大约20个核苷酸，更优选的是大约3-大约18个核苷酸，甚优选的是大约5-大约15个核苷酸。

术语“5’-DNA部分”、“5’-区域”、“5’-RNA部分”和“5’-RNA区域”是指，位于多核苷酸或寡核苷酸5’端之上的多核苷酸或寡核苷酸的部分或区域，并且可以也可以不包括固定到相同多核苷酸或寡核苷酸5’最大核苷酸上的一个或多个5’最大核苷酸或组成成分。5’最大核苷酸优选的是大约1-大约20个核苷酸，更优选的是大约3-大约18个核苷酸，甚优选的是大约5-大约15个核苷酸。

“检测”包括检测的任何方式(包括直接和间接检测)。例如，可以直接或间接观察“可检测的较少”产物，并且该术语指示出任何减少(包括没有产物)。同样，“可检测更多的”产物是指任何增加，而无论该产物是直接还是间接观察到的。

本发明方法所用的组分和反应条件

模板核酸

要扩增的核酸(NA)靶物包括来自纯化或未纯化形式的任何来源的核酸，它可以是DNA(dsDNA和ssDNA)或RNA，包括tRNA、mRNA、rRNA、线粒体DNA和RNA、叶绿体DNA和RNA、DNA-RNA杂交体或以上这些核酸的混合物、基因、染色体、质粒、生物材料(例如微生物、细菌、酵母菌、病毒、类病毒、霉菌、真菌、植物、动物、人类)的基因组，以及以上这些核酸的片断。正如本领域内所公知的，RNA靶物的扩增需要初始cDNA的合成。DNA-RNA杂交体的扩增需要使杂交体变性，以便得到ssDNA，或者变性之后进行反转录，以便得到cDNA。靶核酸可以仅仅是复合混合物(例如生物样品)的一个微小组分并且利用本领域内公知的方法从不同生物材料中获得。

扩增靶核酸序列的最初步骤使得该靶物成为单链。如果靶核酸是一个或多个双链DNA，则最终步骤是靶物的变性。变性步骤可以是热变性或本领域内公知的任何其它方法例如碱处理。如果靶物是RNA，则最终步骤可以是单链cDNA的合成。用于由RNA合成cDNA的技术是本领域内公知的。

组合引物

本发明的扩增方法使用了包括RNA和DNA部分的单个组合引物。引物的这个组合物设计对于通过新(其它)组合引物的结合而随后置换引物延伸产物以及利用聚合酶进行的新引物的延伸是极其重要的。另外，引物延伸产物的RNA部分的裂解导致扩增产物的产生，该产物不是由组合引物扩增的底物(如下所述)。

用于本发明的方法和组合物的组合引物包括至少一个RNA部分，该部分能够(a)不依赖于DNA部分(或多个DNA部分)与靶核酸上的序列的杂交，而结合(杂交)到靶核酸(模板)的序列上；以及(b)当与靶DNA杂交时用核糖核酸酶裂解。组合引物结合到靶核酸上，从而形成部分异源双链体，其中只有引物的RNA部分在与核糖核酸酶接触时被裂解，而靶链依旧，从而使另一组合引物退火。

组合引物还包括3’DNA部分，该部分能够杂交到靶核酸(模板)的一个序列上，从而其与靶序列(模板)的杂交优于由DNA聚合酶从靶核酸中置换出的核酸链。基于公知的特性(这些特性影响核酸结合的亲和力，诸如序列长度和/或同一性，以及杂交条件)可以随机地设计这些引物。在一个优选实施例中，组合引物的3’DNA部分与靶核酸中其互补序列的杂交优于置换链5’端的同源序列与靶核酸的杂交。

适合于通过聚合进行延伸的引物的制备是本领域内公知的，诸如WO99/42618(以及本文所传到的文献)中所描述的。组合引物包括RNA与DNA(参见上述定义)的组合体，并且3’端核苷酸是适合于核酸延伸的核苷酸。3’端核苷酸可以是当存在于引物中时由DNA聚合酶进行延伸的任何核苷酸或类似物。通常，3’端核苷酸有3’-OH。合适的引物包括那些包含至少一个部分的RNA和至少一个部分的DNA的引物。如用于一个基因的图5(示出了用于E.coli J基因扩增的不同引物的相对性能)所示，组合引物可包括5’-RNA部分和3’-DNA部分(其中RNA部分临近3’-DNA部分)；或者具有RNA部分的5’-和3’-DNA部分。因此，在一个实施例中，组合引物包括5’-RNA部分和3’-DNA部分，优选的是，其中RNA部分临近3’-DNA部分。在另一实施例中，组合引物包括具有至少一个RNA部分(即RNA部分在两个DNA部分之间)的5’-和3’-DNA部分。在又一实施例中，本发明的组合引物包括3’-DNA部分和至少一个RNA部分(即在两个DNA部分之间的RNA部分)。

在包括3’-DNA部分和一个RNA部分的组合引物中的RNA部分的长度优选的是大约1-大约25个核苷酸，更优选的是大约3-大约20个核苷酸，甚优选的是大约4-大约15个核苷酸，最优选的是大约5-大约10个核苷酸。在包括3’-DNA部分和一个RNA部分的组合引物的一些实施例中，RNA部分可以是1、3、4、5个核苷酸中的至少大约任何一个，并具有10、15、20、25、30个核苷酸中的大约任何一个的上限。

在包括5’-RNA部分和3’-DNA部分的组合引物中，5’-RNA部分的长度优选的是大约3-大约25个核苷酸，更优选的是大约5-大约20个核苷酸，甚优选的是大约7-大约18个核苷酸，优选的是大约8-大约17个核苷酸，最优选的是大约10-大约15个核苷酸。在包括5’-RNA部分和3’-DNA部分的组合引物的其它实施方案中，5’-RNA部分可以至少大约是3、5、7、8或10个核苷酸，并大约具有15、17、18或20个核苷酸的上限。

在包括5’-RNA部分和3’-DNA部分并且还包括一个或多个非5’-RNA部分的组合引物的实施例中，非5’-RNA部分优选的是具有大约1-大约7个核苷酸，更优选的是具有大约2-大约6个核苷酸，最优选的是具有大约3-大约5个核苷酸。在包括5’-RNA部分和3’-DNA部分并且还包括一个或多个非5’-RNA部分的组合引物的某些实施例中，非5’-RNA部分可以是2、3、5个核苷酸中的至少大约任一个，并具有5、6、7、10个核苷酸中的大约任一个上限。

在包括5’-RNA部分和3’-DNA部分并且5’-RNA部分临近3’-DNA部分的组合引物的实施例中，5’-RNA部分的长度优选的是大约3-大约25个核苷酸，更优选的是大约5-大约20个核苷酸，甚优选的是大约7-大约18个核苷酸，优选的是大约8-大约17个核苷酸，最优选的是大约10-大约15个核苷酸。在包括5’-RNA部分和3’-DNA部分并且5’-RNA部分临近3’-DNA部分的组合引物的某些实施例中，5’-RNA部分可以至少大约是3、5、7、8或10个核苷酸，并大约具有15、17、18或20个核苷酸的上限。

在包括5’-和3’-DNA部分并具有至少一个间插RNA部分的组合引物中，间插RNA部分的长度优选的是大约1-大约7个核苷酸，更优选的是大约2-大约6个核苷酸，最优选的是大约3-大约5个核苷酸。在包括5’-和3’-DNA部分并且具有至少一个间插RNA部分的组合引物的某些实施例中，间插RNA部分可以是1、2、3、5个核苷酸中的至少大约任一个，并具有5、6、7、10个核苷酸中的大约任一个上限。在包括3’-DNA部分和至少一个间插RNA部分的组合引物中间插RNA部分的长度优选的是大约1-大约7个核苷酸，更优选的是大约2-大约6个核苷酸，最优选的是大约3-大约5个核苷酸。在包括3’-DNA部分和至少一个间插RNA部分的组合引物的某些实施例中，间插RNA部分可以是1、2、3、5个核苷酸中的至少大约任一个，并具有5、6、7、10个核苷酸中的大约任一个上限。在包括3’-DNA部分和至少一个间插RNA部分并且还包括一个5’-RNA部分的组合引物中，该5’-RNA部分优选的是具有大约3-大约25个核苷酸，更优选的是大约5-大约20个核苷酸，甚优选的是大约7-大约18个核苷酸，优选的是大约8-大约17个核苷酸，最优选的是大约10-大约15个核苷酸。在包括3’-DNA部分和至少一个间插RNA部分并且还包括一个5’-RNA部分的组合引物的某些实施例中，5’-RNA部分可以是3、5、7、8、10个核苷酸中的至少大约任一个，并具有15、17、18、20个核苷酸中的大约任一个上限。

在包括3’-DNA部分和一个RNA部分的组合引物中，3’-DNA部分的长度优选的是大约1-大约20个核苷酸，更优选的是大约3-大约18个核苷酸，甚优选的是大约3-大约18个核苷酸，最优选的是大约7-大约12个核苷酸。在包括3’-DNA部分和一个RNA部分的组合引物的某些实施例中，3’-DNA部分可以是1、3、5、7、10个核苷酸中的至少大约任一个，并具有10、12、15、18、20、22个核苷酸中的大约任一个上限。

在包括3’-DNA部分和5’-RNA部分的组合引物中，3’-DNA部分的长度优选的是大约1-大约20个核苷酸，更优选的是大约3-大约18个核苷酸，甚优选的是大约5-大约15个核苷酸，最优选的是大约7-大约12个核苷酸。在包括3’-DNA部分和5’-RNA部分的组合引物的某些实施例中，3’-DNA部分可以至少大约是1、3、5、7或10个核苷酸，并大约具有10、12、15、18、20或22个核苷酸的上限。

在包括5’-RNA部分和3’-DNA部分并且还包括一个或多个非3’-DNA部分的组合引物的实施例中，非3’-DNA部分优选的是具有大约1-大约10个核苷酸，更优选的是具有大约2-大约8个核苷酸，最优选的是具有大约3’-大约6个核苷酸。在包括5’-RNA部分和3’-DNA部分并且还包括一个或多个非3’-DNA部分的组合引物的某些实施例中，非3’-DNA部分可以是1、2、3、5个核苷酸中的至少大约任一个，并具有6、8、10、12个核苷酸中的大约任一个上限。

在包括5’-RNA部分和3’-DNA部分并且5’-RNA部分临近3’-DNA部分的组合引物的实施例中，3’-DNA部分的长度优选的是大约1-大约20个核苷酸，更优选的是大约3-大约18个核苷酸，甚优选的是大约5-大约15个核苷酸，最优选的是大约7-大约12个核苷酸。在包括5’-RNA部分和3’-DNA部分并且5’-RNA部分临近3’-DNA部分的组合引物的某些实施例中，3’-DNA部分可以至少大约是1、3、5、7或10个核苷酸，并大约具有10、12、15、18、20或22个核苷酸的上限。

在包括5’-和3’-DNA部分并具有至少一个间插RNA部分的组合引物中，非3’-DNA部分的长度优选的是大约1-大约10个核苷酸，更优选的是大约2-大约8个核苷酸，最优选的是大约3-大约6个核苷酸。在包括5’-和3’-DNA部分并且具有至少一个间插RNA部分的引物的某些实施例中，非3’-DNA部分可以是1、2、3、5个核苷酸中的至少大约任一个，并具有6、8、10、12个核苷酸中的大约任一个上限。

在包括5’-和3’-DNA部分并具有至少一个间插RNA部分的组合引物中，3’-DNA部分的长度优选的是大约1-大约20个核苷酸，更优选的是大约3-大约18个核苷酸，甚优选的是大约5-大约15个核苷酸，最优选的是大约7-大约12个核苷酸。在包括5’-和3’-DNA部分并且具有至少一个间插RNA部分的组合引物的某些实施例中，3’-DNA部分可以是1、3、5、7、10个核苷酸中的至少大约任一个，并具有10、12、15、18、20、22个核苷酸中的大约任一个上限。

在包括3’-DNA部分和至少一个间插RNA部分的组合引物中非3’-DNA部分(即除3’-DNA部分之外的任何DNA)的长度优选的是大约1-大约10个核苷酸，更优选的是大约2-大约8个核苷酸，最优选的是大约3-大约6个核苷酸。在包括3’-DNA部分和至少一个间插RNA部分的组合引物的某些实施例中，非3’-DNA部分可以是1、3、5、7、10个核苷酸中的至少大约任一个，并具有6、8、10、12个核苷酸中的大约任一个上限。在包括3’-DNA部分和至少一个间插RNA部分的组合引物中，3’-DNA部分的长度优选的是具有大约1-大约20个核苷酸，更优选的是大约3-大约18个核苷酸，甚优选的是大约5-大约15个核苷酸，最优选的是大约7-大约12个核苷酸。在包括3’-DNA部分和至少一个间插RNA部分的组合引物的某些实施例中，3’-DNA部分可以是1、3、5、7、10个核苷酸中的至少大约任一个，并具有10、12、15、18、20、22个核苷酸中的大约任一个上限。应该理解，不同部分的长度可以更大或更小，只要在本发明方法的反应条件下合适即可。

在一些实施例中，组合引物的5’-DNA部分包括引物的5’-最大核苷酸。

在一些实施例中，组合引物的5’-RNA部分包括引物的5’最大核苷酸。在其它实施例中，组合引物的3’-DNA部分包括引物的3’最大部分。在其它实施例中，3’-DNA部分临近5’-RNA部分并包括引物(并且5’-RNA部分包括引物的5’最大部分)的3’最大核苷酸。

组合引物的总长度优选的是大约10-大约40个核苷酸，更优选的是大约15-大约30个核苷酸，最优选的是大约20-大约25个核苷酸。在一些实施例中，该长度可以是10、15、20、25个核苷酸中的至少大约任一个，并具有25、30、40、50个核苷酸中的大约任一个上限。应该理解，该长度可以更大或更小，只要在本发明方法的反应条件下合适即可。

为了获得杂交(正如本领域内所公知和理解的那样，该杂交依赖于其它因素例如离子强度和温度)，本发明方法及组合物中所用的组合引物与靶核酸的互补优选的是至少大约60％，更优选的是至少大约75％，甚优选的是至少大约90％，最优选的是至少大约95％。组合引物的单个DNA和RNA部分与靶核酸的互补优选的是至少大约60％，更优选的是至少大约75％，甚优选的是至少大约90％，最优选的是至少大约95％。

正如本文所描述的，在一个扩增反应中可以使用一个或多个组合引物。

包括终止多核苷酸序列的多核苷酸

在本发明方法的一些实施例中，尤其是如果采用基于转录的扩增，则包括含有终止多核苷酸序列的多核苷酸，以下给出了这种多核苷酸的例子。

模板切换寡核苷酸

能够用于本发明的扩增方法的第二寡核苷酸是终止切换寡核苷酸(TSO)。在一个实施例中，TSO用作终止序列。在另一实施例中，TSO用作终止序列并提供一个前启动子序列。

以前描述的基于模板切换寡核苷酸的扩增方法受该寡核苷酸浓度的限制，这是由于当该方法被设计利用一个引物样本时，第二引物的杂交或者同一引物的第二杂交步骤受到抑制。本发明的方法不受这个限制。与以前描述的利用TSOs的方法相反，按照本发明的方法，为了扩增可以使用高浓度的模板切换寡核苷酸。这个特性确保核苷酸有效地杂交到靶链上，并使三分子复合物、用于引物延伸和模板切换的底物的产率最大。该特性的另一作用是使置换引物延伸产物有效杂交到模板切换寡核苷酸上，从而形成用于RNA聚合酶的底物(正如所描述的)。

TSO包括能够杂交到靶物上的3’部分和被设计在聚合(参见图2A-C)过程中用于链切换的5’部分。起链切换作用的TSO设计在本领域内是公知的，例如以前在Patel等人的Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 1996，93：2969-2974中所描述的。

3’部分在模板多核苷酸的位置或区域的部位5’处杂交到模板上，而该位置或区域在将模板从模板多核苷酸切换到TSO(“终止位点”)的未杂交部分之前与引物延伸产物的3’端互补。

在一实施例中，在5’和3’位点紧邻TSO的杂交与未杂交部分之间的接点的TSO区段中彼此互补的短序列的存在，促进了链切换。没有理论根据，一种解释是，在引物延伸产物被延伸到与TSO(提供TSO杂交部分的置换)杂交的靶核酸部分中时，引物延伸产物的3’端包括能够结合到紧邻TSO的杂交与未杂交部分之间的接点的TSO区段中互补短序列上的短序列。这通过增加引物延伸产物切换到作为模板的TSO尾部的可能性而增加了模板切换的效率。短互补序列的长度优选的是大约3-大约20个核苷酸，更优选的是大约5-大约15个核苷酸，最优选的是大约7-大约10个核苷酸。在一些实施例中，该长度是1、3、5、7、10个核苷酸中的至少大约任一个，并且具有10、15、20、25个核苷酸的大约任一个的上限。应该理解，该长度可以更大或更小，只要在本发明方法的反应条件下适合即可。

在一些实施例中，TSO的5’部分包括一个序列(此后称作“前启动子序列”)，该序列被设计用于形成RNA聚合酶的双链启动子。TSO的这个实施例既用作终止序列又提供了一个启动子模板。在该实施例中，TSO的前启动子序列用作一个前启动子序列(通常与模板TSO的前启动子序列互补)掺入到引物延伸产物中的模板。包括可杂交到引物延伸产物的前启动子序列上的前启动子序列的TSO的随后杂交，导致能够利用合适的RNA聚合酶进行转录的双链启动子的形成。使模板DNA转录的启动子序列正如获得和/或制备它们的方法一样，在本领域内是公知的。优选的是，选择前启动子，以便使所用的特定RNA聚合酶具有最佳的转录活性。对这种选择极为重要的是，即，被特定RNA聚合酶所特别支持的特定启动子序列在本领域内也是公知的。例如，用于由依赖于RNA聚合酶和SP6的T7DNA所进行的转录的启动子序列在本领域内是公知的。启动子序列可来自于原核或真核源。

在一个实施例中，启动子序列邻近被设计用来使由所用的RNA聚合酶进行的转录增强或更加最佳化的序列。在一些实施例中，该序列与靶核酸不相关(即基本上不发生杂交)。当来自可操纵键接到所述序列上的启动子的聚合酶的转录活性大于来自没有如此键接的启动子的聚合酶的转录活性时，可发生更优的转录。优化转录所需的这个序列通常在本领域内是公知的，正如以前在诸如U.S.5,766,849和5,654,142中对依赖于RNA聚合酶的不同DNA的描述一样。

在一个优选实施例中，杂交到模板DNA上的TSO的3’部分(包括杂交到靶物上的整个3’部分)片段被固定到模板DNA上，以便由起引物延伸作用的聚合酶进行的TSO置换被基本上或至少充分地抑制。用于实施这种固定的适当方法包括本领域内公知的技术，例如使用含有G-闭合杂环修饰点[在Flanagan等人的Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，96(7)：3513-8中有所描述]的胞嘧啶类似物；以及锁匙核酸[在例如Kumar等人的Bioorg.Med.Chem Lett.1998，8(16)：2219-22；以及Wahlestedt等人的Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000，97(10)：5633-8中有所描述]。其它适当的方法包括使用(在合适时)具有高GC含量和/或交联的序列。获得增强固定的这些方法的任一种都可以单独使用或联合使用。如果聚合酶将模板从靶核酸链切换到TSO的未杂交部分，则TSO的置换基本上或充分地被抑制到引物延伸过程的至少大约25％，优选的是至少大约50％，更优选的是至少大约75％，最优选的是至少大约90％。如果扩增方法就所需产物的量而言可导致满意的结果，那么也可以根据经验指示出基本或充分抑制TSO的置换。通常，在给定条件下，“被修饰的”TSO相对于没有如此修饰的TSO更紧密地结合到模板上。

杂交到靶核酸链上的TSO部分的长度优选的是大约15-50个核苷酸，更优选的是大约20-45个核苷酸，最优选的是大约25-40个核苷酸。在其它实施例中，该长度是以下10、15、20、25、30中的至少大约任一个；并且少于以下35、40、45、50、55中的大约任一个。应该理解，该长度可以更大或更小，只要在本发明方法的反应条件下合适即可。杂交到靶核酸链上的TSO部分与靶核酸上其预计结合的序列的互补优选的是至少大约25％，更优选的是至少大约50％，甚优选的是至少大约75％，最优选的是至少大约90％。

封闭剂序列

在一些实施例中，由封闭剂序列提供引物延伸终止序列。该封闭剂序列是多核苷酸(通常是合成的多核苷酸)，而且是单链并包括一个与靶序列5’位置的靶核酸片段杂交(优选的是互补)的序列，而靶序列的5’位置与引物延伸产物(“终止位点”)的3’端互补。该封闭剂包括以亲和性(优选的是高亲和性)结合到靶核酸上的核苷酸，从而该封闭剂序列将引物延伸过程中由DNA聚合酶进行的置换抑制到引物延伸过程的优选的30％多，更优选的是50％多，甚优选的是75％多，最优选的是90％多。封闭剂多核苷酸的长度及组合应该是，在本发明方法的条件下能够避免多余随机的非特异性杂交。封闭剂多核苷酸的长度优选的是大约3-大约30个核苷酸，更优选的是大约5-大约25个核苷酸，甚优选的是大约8-大约20个核苷酸，最优选的是大约10-大约15个核苷酸。在其它实施例中，该封闭剂多核苷酸是以下3、5、8、10、15中的至少大约任一个；并且少于以下20、25、30、35中的大约任一个。应该理解，该长度可以更大或更小，只要在本发明方法的反应条件下合适即可。该封闭剂多核苷酸与靶核酸上其预计结合的序列的互补优选的是至少大约25％，更优选的是至少大约50％，甚优选的是至少大约75％，最优选的是至少大约90％。

在一实施例中，封闭剂序列包括一个片段，该片段杂交到靶DNA上并被固定到靶DNA上，从而由起引物延伸作用的聚合酶所进行的封闭剂序列的置换基本或至少充分被抑制。用于实施这种固定并测定置换基本或充分被抑制的合适方式正如以上对本发明方法的TSO所描述的。

在一实施例中，该封闭剂多核苷酸不能有效地用作核酸延伸(即从封闭剂的延伸被减小或抑制)的引物。封闭剂多核苷酸封闭引物的技术包括阻止由DNA聚合酶将核苷酸加成到引物的3’端的任何技术。这些技术在本领域内是公知的，包括例如3’羟基的取代或修饰，或者被修饰核苷酸例如双脱氧核苷酸在封闭剂多核苷酸的3’-最大部位的掺入，这不能锚定由DNA聚合酶进行的核苷酸的加成。

包括前启动子和一个杂交到置换引物延伸产物上的区域的多核苷酸

一些实施例采用了包括前启动子和一个杂交到被置换引物延伸产物上的区域的多核苷酸。在一些实施例中，该多核苷酸是含有前启动子序列的TSO(如上所述)。在其它实施例中，该前启动子序列被包含在PTO中(如下所述)。

前启动子模板寡核苷酸

在一些实施例中，这些方法使用了由前启动子模板寡核苷酸(PTO)提供的用于转录的启动子序列。

用于本发明方法和组合物的PTO是单链多核苷酸(一般是DNA)，它包括被设计用于形成RNA聚合酶的ds启动子的前启动子序列以及一个能够杂交到引物延伸产物的3’端的部分。在一优选实施例中，该前启动子序列位于寡核苷酸的5’部分并且杂交序列位于寡核苷酸的3’部分。在一实施例中，最典型的是，启动子和杂交序列是不同的序列。在另一实施例中，启动子和杂交序列在相同序列处重叠。在又一实施例中，启动子和杂交序列是相同序列，并因此而在PTO的相同部位上。在PTO与引物延伸产物杂交导致包括突出端(不与被置换引物延伸产物杂交的PTO的5’端，典型地包括整个或部分前启动子序列)的双链体的那些实施例中，DNA聚合酶充入突出端，从而产生能够通过适当的RNA聚合酶起转录作用的双链启动子。

使模板DNA转录的启动子序列在本领域内是公知的并且在上文已经有所描述。优选的是，选择启动子序列，以便使所用的特定RNA聚合酶具有最佳的转录活性。对这种选择极为重要的是，即，被特定RNA聚合酶所特别支持的特定启动子序列在本领域内也是公知的。例如，用于由依赖于RNA聚合酶和SP6的T7DNA所进行的转录的启动子序列在本领域内是公知的。启动子序列可来自于原核或真核源。

在一些实施例中，PTO在前启动子序列与一个能够杂交到引物延伸产物3’端上的部分之间包括一个间插序列。可以根据经验确定间插序列的合适长度，并且该长度可以至少是大约1、2、4、6、8、10、12、15个核苷酸。还可以根据经验确定与间插序列相同的合适序列，并且相对于序列的遗漏，该序列被设计用来优选地(但不是必需的)增强扩增的程度。在一实施例中，间插序列是一个被设计用来使由所用的RNA聚合酶进行的转录增强或更优的序列。通常，该序列与靶核酸不相关(即基本上不发生杂交)。当来自可操纵键接到所述序列上的启动子的聚合酶的转录活性大于来自没有如此键接的启动子的聚合酶的转录活性时，可发生更优的转录。优化转录所需的这个序列通常在本领域内是公知的，正如以前在诸如U.S.5,766,849和5,654,142中对依赖于RNA聚合酶的不同DNA的描述一样，并且还可以根据经验确定该序列。

在另一实施例中，PTO包括一个是前启动子序列的5’部分的序列，即PTO包括位于前启动子序列的5’处的其它核苷酸(可以是也可以不是转录调节序列)。通常(但不是必需的)，该序列不与引物延伸产物杂交。

在一实施例中，PTO不能有效地用作核酸延伸的引物。用于PTO封闭引物的技术包括阻止由DNA聚合酶进行的核苷酸加成到PTO3’端的任何技术。这些技术在本领域内是公知的，包括例如3’羟基的取代或修饰，或者被修饰核苷酸例如双脱氧核苷酸在PTO的3’-最大部位的掺入，这不能锚定由DNA聚合酶进行的核苷酸的加成。还可以利用标记物或特异性结合对中的一员的小分子(例如生物素)来封闭3’端。

与置换引物延伸产物杂交的PTO部分的长度优选的是大约5-大约50个核苷酸，更优选的是大约10-大约40个核苷酸，甚优选的是大约15-大约35个核苷酸，最优选的是大约20-大约30个核苷酸。在一些实施例中，杂交部分是以下3、5、10、15、20中的至少大约任一个；并且少于以下30、40、50、60中的大约任一个。杂交部分与靶核酸上其预计结合的序列的互补优选的是至少大约25％，更优选的是至少大约50％，甚优选的是至少大约75％，最优选的是至少大约90％。

DNA聚合酶、核糖核酸酶以及RNA聚合酶

本发明的扩增方法采用以下酶：DNA聚合酶、核糖核酸酶(例如RNaseH)，以及任意的依赖于DNA的RNA聚合酶。

用于本发明方法及组合物的DNA聚合酶按照本发明的方法能够有效延伸组合引物。因此，优选的聚合酶是能够沿核酸模板延伸核酸引物的聚合酶，而模板至少由脱氧核苷酸主要构成。聚合酶应该能够将核酸链从多核苷酸置换到置换链被结合的程度，并且通常，聚合酶展示(即与没有这么大链置换能力的其它聚合酸相比)的更大的链置换能力是优选的。优选的是，DNA聚合酶对在杂交到核酸链上的寡核苷酸3’端的结合具有较高的亲和力。优选的是，DNA聚合酶不具有实质的切割活性。优选的是，聚合酶具有极少或无5’-＞3’外切核酸酶活性，从而对引物、终止或引物延伸多核苷酸的降解最小。通常，外切核酸酶活性取决于诸如pH、盐浓度、模板是单链还是双链等等这些因素(所有这些因素都是本领域内的技术人员熟知的)。已经缺乏5’-＞3’外切核酸酶活性的突变DNA聚合酶在本领域内是公知的并且适用于本文所述的扩增方法。用于本发明方法及组合物的合适的DNA聚合酶包括在U.S.5648211和5744312中所公开的那些物质，这些物质包括exo-Yent(New England Biolabs)、exo-Deep Vent(New EnglandBiolabs)、Bst(BioRad)、exo-Pfu(Stratagene)、Bca(Panvera)、测序级Taq(Promega)，以及来自热厌氧菌和热亚硫酸的热稳性DNA聚合酶。优选的是，DNA聚合酶将引物延伸产物从模板核酸中置换出聚合酶与引物延伸产物的5’端之间的接触量的至少大约25％，更优选的是至少大约50％，甚优选的是至少大约75％，最优选的是至少大约90％。在一些实施例中，使用具有链置换活性的热稳DNA聚合酶是优选的。这些聚合酶在本领域内是公知的，诸如U.S.5744312(以及本文所提到的参考文献)中所述的。优选的是，DNA聚合酶具有极少或无校正活性。

用于本发明方法及组合物的核糖核酸酶能够裂解RNA/DNA杂交体中的核糖核苷酸。优选的是，无论邻近待裂解的核糖核苷酸的核苷酸的同一性与类型如何，核糖核酸酶都裂解核糖核苷酸。优选的是，核糖核酸酶不依赖于序列的同一性进行裂解。用于本发明方法及组合物的适当的核糖核酸酶的例子是本领域内公知的，包括核糖核酸酶H(RNase H).

用于本发明方法及组合物的依赖于DNA的RNA聚合酶在本领域内是公知的。可以使用原核或真核聚合酶。这些例子包括T7、T3和SP6 RNA聚合酶。通常，所选择的RNA聚合酶能够从由本文所述的TSO或PTO提供的启动子序列进行转录。通常，RNA聚合酶是依赖于DNA的聚合酶，优选的是，只要启动子区域是双链的，其就能够从单链DNA模板进行转录。

总之，本发明方法及组合物所用的酶并不对所述方法及组合物的核酸组分产生实质降解。

反应条件及检测

用于完成本发明方法的合适反应介质和条件是按照本发明的方法能够使核酸扩增。这些介质和条件是本领域内的技术人员公知的，并在不同出版物例如U.S.5,679,512和WO99/42618中有所描述。例如，缓冲剂可以是Tris缓冲剂，虽然只要缓冲剂成分对本发明方法的酶组分没有抑制就还可以使用其它缓冲剂。pH优选的是大约5-大约11，更优选的是大约6-大约10，甚优选的是大约7-大约9，最优选的是大约7.5-大约8.5。反应介质还可以包括二价金属离子例如Mg²⁺或Mn²⁺，并且游离离子的最终浓度在大约0.01-大约10mM的范围内，最优选的是大约1-5mM。反应介质还可以包括其它盐(例如KCL)，其可增强介质的总离子强度。例如盐(例如KCL)的范围优选的是大约0-大约100mM，更优选的是大约0-大约75mM，最优选的是大约0-大约50mM。反应介质还可以包括能影响扩增反应性能、但不是这些方法的酶组分活性所必需的添加剂。这些添加剂包括蛋白质(例如BSA)，以及非离子型去污剂(例如NP40和吐温)。还可以包括能够使酶活性最大化的试剂例如DTT。这些试剂在本领域内是公知的。只要合适，也可以包括不抑制该方法中所用的RNase活性的RNase抑制剂(例如RNasine)。本发明方法的任何步骤都可以在相同或不同温度下进行。优选的是，等温实施反应，从而避免了麻烦的热循环过程。可以在使本发明的寡核苷酸(引物、TSO、封闭剂序列和/或PTO)与模板多核苷酸杂交并实质上不抑制所用的酶活性的温度下实施扩增反应。该温度优选的是大约25℃-大约85℃，更优选的是大约30℃-大约75℃，最优选的是大约37℃-大约70℃。在一些包括RNA转录的实施例中，转录步骤的温度低于以前步骤的温度。在这些实施例中，转录步骤的温度优选的是大约25℃-大约85℃，更优选的是大约30℃-大约75℃，最优选的是大约37℃-大约70℃。

能够用于合成本发明方法中的引物延伸产物的核苷酸和/或核苷酸类似物(例如脱氧核苷三磷酸)的量优选的是大约50-大约2500μM，更优选的是大约100-大约2000μM，甚优选的是大约500-大约1700μM，最优选的是大约800-大约1500μM。在一些实施例中，包括一个核苷酸或核苷酸类似物，它们在引物延伸链中的存在增强了链的置换(例如通过产生比常规AT、CG碱基对更弱的碱基对)。这些核苷酸或核苷酸类似物包括脱氧肌苷和其它修饰碱，所有这些都是本领域内公知的。能够用于合成本发明方法中的RNA转录物的核苷酸和/或核苷酸类似物(例如脱氧核苷三磷酸)的量优选的是大约0.25-大约6mM，更优选的是大约0.5-大约5mM，甚优选的是大约0.75-大约4mM，最优选的是大约1-大约3mM。

本发明扩增反应的寡核苷酸组分一般多于待扩增的靶核酸序列的数目。它们是以下10、10²、10⁴、10⁶、10⁸、10¹⁰、10¹²倍于靶核酸的量中的大约或至少大约任一个。组合引物、TSO、PTO及封闭剂序列的每一个都可以是以下浓度中的大约或至少大约任一个：50nM、100nM、500nM、1000nM、2500nM、5000nM。

在一实施例中，在扩增过程开始时同时加入上述组分。在另一实施例中，在扩增过程中的适当时间点之前或之后以任何顺序加入组分(正如扩增反应所需和/或所允许的)。这些时间点(以下提到其中一些)易于由本领域内的技术人员鉴定。按照本发明方法用于核酸扩增的酶可以在既可以在核酸变性步骤之前加入，也可以在变性步骤或者引物和/或封闭剂序列与靶DNA杂交之后加入，这由其热稳定性和/或本领域内的技术人员所公知的其它特性来确定。

扩增反应可以在不同的时间点被终止，并在随后的时间被恢复。所述的时间点易于由本领域内的技术人员鉴定。终止反应的方法在本领域内是公知的，包括例如将反应混合物冷却到能够抑制酶活性的温度。恢复反应的方法也是本领域内公知的，包括例如将反应混合物的温度升高到使酶激活的温度。在一些实施例中，在反应恢复之前或之后补足一种或多种反应组分。反之，使反应不中断地进行下去(即从开始到结束)。

对扩增产物的检测指示出靶序列的存在。定量分析也是切实可行的。直接或间接检测方法(包括定量)在本领域内是公知的。例如，通过将从含有包括靶序列的未知量多核苷酸的测试样品扩增的产物量与具有包括靶序列的已知量多核苷酸的参比样品的扩增产物进行比较，可以测定测试样品中靶序列的量。本发明的扩增方法还被扩大到分析序列变异和对靶核酸进行测序。另外，通过例如检查来自RNA扩增产物的翻译产物，检测也是有效的。

本发明的扩增方法

以下是本发明扩增方法的若干例子。应该理解，根据以上所给出的总的描述，可以实践其它不同的实施例。例如，对使用一个组合引物的参考意味着可以使用本文所述的任何组合引物。

本发明一方面，提供了一种用于扩增与靶核苷酸序列互补的核苷酸序列的方法。在该方法中，获得等温线性核酸序列的扩增。另一方面，提供了一种用于扩增靶多核苷酸序列的方法，其中扩增产物是有义RNA，该方法有时称作“增强”线性扩增方法。在一实施例中，提供了一种基于TSO的增强等温线性核酸序列扩增的方法(此后称作“方法1”)。在另一实施例中，提供了一种基于PTO并且是封闭剂序列的增强等温线性核酸序列扩增的方法(此后称作“方法2”)。

导致互补DNA产物生成的线性核酸扩增方法

当不涉及转录时，本发明的扩增方法用于靶核酸序列的等温线性扩增。该方法使用一个组合引物。在一实施例中，该方法还采用了终止序列例如方法2中所述的封闭剂序列或者方法1中所述的TSO。以下描述方法1和方法2。由于该线性扩增不涉及转录，因此不包括导致包括用于依赖于DNA的RNA聚合酶的启动子序列的复合物形成的组分和步骤。

为了产生确定3’端的产物，加入终止序列(如果使用，则是TSO或封闭剂序列)。在一些实施例中，引物结合位点的模板5’内的一个或多个天然序列抑制核酸的聚合，从而使引物延伸终止。这些天然序列是本领域内公知的，例如GC丰富序列，或者可以根据经验确定。当扩增基因组DNA以便提供引物延伸的确定终端时，使用终止序列尤其是有益的。当不需要该特性时，可以无需终止序列而完成按照本发明方法的等温线性扩增。该等温线性扩增还采用两种酶、一种DNA聚合酶和一种核糖核酸酶(例如RNase H)。图1A-C示出了对本发明的线性等温核酸扩增的示意性描述。

类似于如下所述的方法1和2，该线性扩增方法被设计用来扩增单链DNA靶物。当待扩增的靶物是dsDNA时，首先使靶物变性，以便产生单链靶物。利用本领域内公知的方法(例如热或碱处理)可完成靶物的变性。当靶物是单链RNA(例如mRNA或病毒RNA)时，利用本领域内公知的方法首先使靶物转录，以便生成cDNA。

如图1A-C所示，本发明的线性等温扩增方法包括与以下及图2A-C和图3A-D中所述的增强线性扩增方法(方法1和2)的初始步骤类似的步骤。首先使组合引物DNA聚合酶、核糖核酸酶(例如RNase H)以及任意的封闭剂序列组分或TSO与靶核酸结合(如上所述)。在一实施例中，每个扩增反应包括一个同一序列的组合引物。在另一实施例中，每个扩增反应包括一个组合引物变异体的混合物，其中该变异体代表两个或多个同源但不同一的序列，并且都能够与相同的靶核酸序列杂交。该互补优选的是至少大约50％，更优选的是至少大约75％，最优选的是至少大约90％。该实施例的优点包括能够将感兴趣的不同序列引入到引物延伸产物中。在又一实施例中，每个扩增反应包括若干组合引物的混合物，其中引物代表两个或多个低或非同源的不同一的序列，引物优选地与不同靶核酸序列或者沿相同的靶核酸链进行杂交。该实施例的优点包括通过在一个扩增反应中对许多靶核酸样本进行扩增而对靶核酸进行多重检测和/或分析。

图1A-C示出了一个包括终止序列的实施例。组合引物和终止序列(TSO或封闭剂序列组分)与相同的靶链杂交，从而形成三分子复合物XX(图1A-C)。组合引物的3’-端利用聚合酶沿靶链向上延伸到TSO或封闭剂序列组分杂交的位点，从而产生复合物XXI(图1A-C)。核糖核酸酶(例如RNaseH)裂解复合物XXI(图1A-C)的延伸引物的RNA(通常是5’-RNA)部分，从而生成复合物XXII(图1A-C)。第二组合引物通过RNA(通常是5’-RNA)部分的杂交而与复合物XXII(图1A-C)结合，从而产生复合物XXIII(图1A-C)。其次被结合的组合引物的游离3’部分置换引物延伸产物的5’-端并与靶物杂交，从而产生复合物XXIV(图1A-C)。组合引物的3’-端与靶物的杂交通常对引物延伸产物的5’-端的杂交是有利的，这是由于引物的被杂交的3’-端是DNA聚合酶结合的位点，而聚合酶然后又沿靶物延伸引物的3’-端。引物的延伸导致第一引物延伸产物的置换，产生复合物XXV(图1A-C)。重复该方法，从而产生通常与靶序列互补的多重单链DNA置换产物。

利用本领域内公知的许多检测方法的任一种都可容易地检测出等温线性扩增方法的单链DNA(即置换引物延伸产物)。以前描述了适合于检测单链核酸分子的不同的同源或异源检测方法，包括利用凝胶电泳的尺寸和/或迁移性质或者通过与非特异性探针杂交而进行鉴定。

对扩增产物的检测指示出靶序列的存在。定量分析也是切实可行的。例如，通过将从含有未知量的包括靶序列的多核苷酸的测试样板中扩增的产物的量与具有已知量的包括靶序列的多核苷酸的对照样品的扩增产物进行比较，可以测定测试样品中靶序列的量。本发明的扩增方法还可扩大到分析序列变异以及测序靶核酸。

希望产生模板多核苷酸的每个拷贝的至少1、至少10、至少大约100、至少大约1000、至少大约10⁵、至少大约10⁷、至少大约10⁹、至少大约10¹²的互补拷贝，由此相对于模板多核苷酸的每个拷贝，导致增强至少1、至少10、至少大约100、至少大约1000、至少大约10⁵、至少大约10⁷、至少大约10⁹、至少大约10¹²倍。

导致有义RNA产物生成的增强线性扩增

本发明还提供了用于扩增靶多核苷酸序列的方法，其中扩增产物是含有有义序列(即与靶物相同的序列)的RNA。线性扩增与转录的偶联需要按照方法1进行靶核酸的扩增，从而导致包括靶物及模板切换寡核苷酸(TSO)相关部分的独特中间扩增产物的产生。通过模板切换寡核苷酸与置换引物延伸产物的杂交而形成的复合物是由RNA聚合酶进行的转录的底物，从而产生与初试靶序列相同意义的RNA产物。同样，按照方法1进行的核酸靶物的扩增导致置换引物延伸产物的形成，当该产物与启动子模板寡核苷酸杂交时，形成了一种复合物，而该复合物又是由RNA聚合酶进行的转录的底物。希望由每个引物延伸产物优选地产生至少1、更优选的是至少大约50、甚优选的是至少大约75、更甚优选的是至少大约100、最优选的是至少大约1000个RNA转录产物，由此相对于不涉及转录的扩增方法，导致增强优选的是至少1、更优选的是至少大约50、甚优选的是至少大约75、更甚优选的是至少大约100、最优选的是至少大约1000倍。

以下是两个作为例子的方法。

方法1-基于TSO的增强线性核酸扩增

在一实施例中，本发明的基于TSO的增强线性扩增方法涉及到从引物延伸产物的转录，从而提供了增强核酸扩增。对这种新的核酸扩增方法(方法1)的示意性描述如图2A-C所示。

本发明的基于TSO的核酸扩增方法采用一个组合引物(如上所述)。用于本发明的扩增方法的第二寡核苷酸是模板切换寡核苷酸(TSO)(也如上所述)。本发明的扩增方法使用以下酶：DNA聚合酶、核糖核酸酶(例如RNaseH)、依赖于DNA的RNA聚合酶。待扩增的核酸靶物是DNA或RNA。正如本领域所公知的，RNA靶物的扩增需要初始cDNA的合成。

本发明的基于TSO的增强线性扩增方法可产生与靶DNA序列同源(即有义)的RNA产物的多个拷贝。

正如本领域内所公知的，在适合于核酸杂交及扩增的反应介质内，单链靶核酸与组合引物、DNA聚合酶、核糖核酸酶(例如RNaseH)、依赖于DNA的RNA聚合酶以及核苷酸(例如脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)及核糖核苷三磷酸(rNTPs))结合。合适的反应介质及条件如上所述。在一实施例中，在不同温度下(通常低于其前面步骤的温度)进行转录。在另一实施例中，这些方法的所有步骤都在等温下进行。

在一实施例中，每个扩增反应包括一个同一序列的组合引物。在另一实施例中，每个扩增反应包括组合引物变异体的混合物，其中该变异体代表两个或多个同源但不同一的序列，并且所有序列都能够与相同的靶核酸序列杂交。该同源(序列同一)优选的是至少大约50％，更优选的是至少大约75％，最优选的是至少大约90％。该实施例的优点包括能够将感兴趣的不同序列引入到引物延伸产物中。在又一实施例中，每个扩增反应包括若干组合引物的混合物，其中引物代表两个或多个低或非同源的不同一序列，并且引物优选地与不同靶核酸序列或者沿相同的靶核酸链的不同位点进行杂交。该实施例的优点包括通过在一个扩增反应中对许多靶核酸样本进行扩增而对靶核酸进行多重检测和/或分析。

在一实施例中，TSO用作终止序列并提供了一个前启动子序列。在另一实施例中，TSO不包括前启动子序列。在该实施例中，前启动子序列由另一寡核苷酸(例如PTO)单独提供，该寡核苷酸包括一个前启动子序列并且可与引物延伸产物的3’部分杂交，从而可以进行引物延伸产物的转录。

其次，单个组合引物和TSO杂交到待扩增核酸的相同链上。在靶核酸变性步骤之前将两个寡核苷酸加入到怀疑含有核酸靶物的样品中。这两个寡核苷酸与靶链的杂交导致三分子复合物I(图2A-C)的形成。

DNA聚合酶实施引物的延伸。引物沿复合物I(图2A-C)的靶核酸链向上延伸到TSO杂交的位点。从靶链到TSO的5’未杂交部分的模板切换以及沿TSO模板的引物的延伸导致三分子复合物II的形成。最后的产物包括靶核酸、TSO和第一引物延伸产物。第一引物延伸产物是包括依赖于靶物的部分(即与靶核酸互补的序列)和依赖于TSO的部分(即与TSO的未杂交部分互补的序列)的单一DNA。

复合物II(图2A-C)是用于RNA聚合酶及核糖核酸酶(RNase H)的底物。依赖于DNA的RNA聚合酶与复合物II的功能性ds启动子结合并转录第一引物延伸产物，从而生成有义RNA产物II (图2A-C)。专门用于RNA/DNA异源双链体的RNA链降解的核糖核酸酶(例如RNase H)使复合物II中的引物延伸产物降解，从而形成三分子复合物IV。

游离组合引物与复合物IX(图2A-C)中的靶核酸引物互补位点杂交。该杂交导致复合物V(图2A-C)的形成，其中只有引物的RNA部分(通常是5’RNA部分)与靶链杂交。部分杂交引物的3’DNA部分对引物延伸产物的5’最大部分的置换将导致作为DNA聚合酶底物的复合物VI(图2A-C)的形成。引物沿靶链(VII；图2A-C)的延伸导致第一引物延伸产物从该复合物中置换出来。重复引物的延伸和链置换导致至少基本上与靶核酸互补的多核苷酸的多个拷贝的产生。

如上所述产生的引物延伸产物被用作该实施例中转录的模板，其中提供了包括前启动子序列的TSO。被置换的引物延伸产物(VIII；图2A-C)与游离的TSO挂核苷酸杂交，从而形成部分双链体IX(图2A-C)。复合物(双链体)IX包括位于一端的一个双链部分和分别从引物延伸产物和TSO衍生的两个非互补单链。这个部分双链体的双链部分含有用于依赖于DNA的RNA聚合酶的完全功能性双链启动子。这个最好生产的产物结合到部分双链体IX的启动子上并转录引物衍生产物，从而形成有义RNA产物X(图2A-C)的多个拷贝。

利用同源或异源检测方法可以检测上述的扩增产物，包括利用凝胶电泳的尺寸和/或迁移性质或者通过杂交到特异于序列的探针上来进行鉴定。扩增产物的检测指示出靶核酸的存在。定量分析也是切实可行的。例如，通过将从含有未知量的具有靶序列的多核苷酸的测试样品扩增的产物的量与具有已知量包含靶序列的多核苷酸的对照样品的扩增产物进行比较，可以测定测试样品中靶序列的量。这个新扩增方法还可扩大到分析序列变异和测序靶序列(如下所述)。

方法2-基于封闭剂序列的增强核酸扩增

在另一实施例中，本发明的基于封闭剂序列的线性扩增方法涉及从引物衍生产物的转录，从而提供了增强核酸扩增。这个替代性增强线性扩增(方法2：不涉及模板切换步骤)如图3A-D所示。

方法2象方法1那样采用：单个的组合引物(如上所述)；一个封闭剂序列组分，该组分既可是寡核苷酸也可是寡核苷酸类似物并且如上所述还能杂交到与单个引物相同的靶核酸链上；以及第三寡核苷酸；启动子模板(PTO)，如上所述，PTO包括能够与被置换的衍生产物的3’-端杂交(并且最好是互补的)的3’-部分和在其5’-端包括一个用于依赖于DNA的RNA聚合酶的启动子序列。正如在上述的TSO中那样，紧邻启动子序列的这个序列被设计用来由按照本发明方法的扩增中所用的RNA聚合酶实施的优选的最佳转录活性。该封闭剂序列组分被设计用来在相对于单个引物杂交的位点的靶物的5’-端上游的位点与靶序列杂交。或者是，如上所述，封闭剂序列杂交到与引物衍生产物的3’-端互补的靶序列5位置的靶核酸片段上。封闭剂序列以足够高的亲和力结合，以便封闭在封闭剂与靶物杂交的位点上的引物延伸。

正如方法1中那样，用于按照方法2扩增的靶核酸是单链DNA。当靶核酸是dsDNA时，该靶物首先通过变性成为单链。利用本领域内公知的热或任何其他公知方法例如碱处理可以完成dsDNA靶物的变性。当靶核酸是RNA例如mRNA时，该靶物首先利用本领域内公知的方法进行反转录，以便产生随后要按照本发明方法进行扩增的cDNA。

正如对方法1所描述的，单链核酸靶物与以下物质结合：单个组合引物、封闭剂组分、前启动子模板(PTO)、DNA聚合酶、核糖核酸酶例如RNaseH、依赖于DNA的RNA聚合酶以及核苷酸例如NTPs(即dNTPs和rNTPs)。合适的反应介质与条件如上所述。在一实施例中，在不同温度下(通常比以前步骤的温度低)进行转录。在另一实施例中，等温实施该方法的所有步骤。

在一实施例中，每个扩增反应包括一个同一序列的组合引物、在另一实施例中，每个扩增反应包括组合引物变异体的混合物，其中该变异代表两个或多个同源但不同一的序列并且所有引物能够与相同的靶核酸序列杂交。同源(序列同一)优选的是至少大约50％，更优选的是至少大约75％，最优选的是至少大约90％。该实施例的优点包括能够将感兴趣的不同引物引入到引物延伸产物中。在又一实施例中，每个扩增反应包括若干组合引物的混合物，其中这些引物代表两个或多个低或不同源的非同一序列并且这些引物优选地与不同靶核酸序列或者沿相同靶核酸链的不同位点杂交。该实施例的优点包括通过在一个扩增反应中对多个靶核酸样本进行扩增而对靶核酸进行多重检测和/或分析。

单个组合引物和封闭剂序列组分杂交到相同的靶链上，从而形成三分子复合物。该引物沿靶物向上延伸到封闭剂序列的杂交位点上，从而形成复合物XII(图3A-D)。象方法1中那样，核糖核酸酶例如RNase H裂解复合物XII的单个组合引物的RNA部分(通常是5’RNA部分)，从而形成复合物XIII(图3A-D)。如上所述，该酶是专门用于裂解RNA/DNA杂交体的RNA链的，并且不消化单链RNA。于是，核糖核酸酶不降解游离的组合引物。引物杂交(XIV)、由组合引物(XV)的3’-DNA部分置换引物延伸产物的5’端、引物延伸和第一引物延伸产物(XVI)的置换这些下述步骤(如图3A-D所示)象方法1中那样进行，从而产生被置换的延伸产物(XVII)的多个拷贝。不象方法1的置换产物，XVII与靶序列完全互补并且不包括与靶物不互补的3’端部分。重复引物延伸和链置换可导致与靶核酸互补的多核苷酸的多个拷贝的产生。

通过前启动子模板的3’端部分(A)与被置换的引物延伸产物的3’端杂交，启动子模板寡核苷酸(PTO)结合到被置换的延伸产物上，从而形成复合物XVIII(图3A-D)。如上所述，PTO的3’端可以被封闭也可以不封闭。当不封闭前启动子模板的3’端时，将沿被置换的引物延伸产物延伸该模板。利用核苷酸(DNA)聚合酶沿杂交前启动子模板的B部分(参见图3A-D)延伸置换产物的3’端，从而形成复合物XIX，该复合物在其一端包括被依赖于DNA的RNA聚合酶采用的ds启动子序列。复合物作为启动子模板的杂交产物如图3A-D所示，在该模板中为了由聚合酶进行延伸，封闭3’端。或者是，当启动子模板的3’端没有封闭时，3’端沿被置换的引物延伸产物的延伸导致完全双链复合物的形成。依赖于DNA的RNA聚合酶将以两种形式(RNA聚合酶的选择必须考虑到其从ds和/或s sDNA模板转录的能力)即复合物的部分双链体或完全双链体形式转录复合物XIX的延伸置换引物延伸产物。利用该转录步骤可产生单链RNA产物的多个拷贝。

利用本发明的扩增方法及组合物的方法

本发明的方法及组合物可用于各种目的。为了进行示意性说明，，描述了测序方法、基因分型(核酸突变检测)、利用本发明方法产生的扩增核酸产物进行微阵列制备。

利用本发明的线性扩增方法等温测序确定的核酸靶物

本发明的线性等温扩增方法是有用的，例如可用于测序确定的核酸靶序列。如本文中所述的扩增方法那样实施测序过程。除了用于按照本发明的扩增方法的核苷酸(例如天然脱氧核糖核苷三磷酸)以外，测序反应混合物还包括合适的核苷三磷酸类似物，这些类似物在掺入到用于终止核苷酸聚合的引物延伸产物中时可以是标记的也可以是未标记的。这些类似物共同用于其他测序方法并且是本领域内公知的，例如二脱氧核糖核苷酸。它们可以例如用荧光色团或放射性同位素进行标记。这些标记物还可以是适合于质子分光计的标记物。该标记物还可以是小分子，该小分子是特异性结合对(生物素和链霉抗生物素蛋白)的一员并且在与特异性结合对的另一员结合之后能够用与酶共轭的结合对的最后一员来检测，该酶催化可以用诸如比色法、荧光法或化学发光法这些方法检测的可检测信号的产生。以上所有例子在本领域内都是公知的。这些物质可利用聚合酶并入引物延伸产物中并用于终止沿靶序列的延伸。标记所得到的截短延伸产物。根据每个类似物的结合位点，所累积的多个置换引物延伸产物在长度上不同，这表示靶序列上互补核苷酸的不同序列部位。

利用本领域内公知的任何不同方法可实施为洗脱序列信息而对反应产物的分析。这些方法包括凝胶电泳以及利用合适的扫描仪检测标记条带、测序凝胶电泳以及利用(例如)对放射性标记条带直接进行检测、利用专用于反应中所用的标记物的检测器进行毛细管电泳以及类似方法。标记物还可以是结合蛋白的配体，该蛋白用于检测结合有与结合蛋白共轭的酶的标记物，例如生物素标记的链终止器以及与酶共轭的链霉抗生物素蛋白。利用产生可检测信号的酶的酶活性可检测标记物。正如本领域内公知的其他测序方法那样，既可在单个的反应容器中也可在分开的若干反应容器(每个代表四个核苷酸中的一个)中实施四个核苷酸类型(A、C、G、T)测序反应。所用方法的选择取决于本领域内技术人员显而易见的实际考虑因素例如核苷酸三磷酸和/或所用的标记物。这样，例如，当每个类似物标记不同时，在一个容器中进行测序反应。选择使按照本发明方法的测序分析性能最佳的试剂和反应条件的考虑因素类似于以前描述的其他测序方法。试剂和反应条件正如以上对本发明的线性核酸扩增方法所描述的那样。

利用本发明的增强线性扩增方法(方法1和2)对确定的核酸靶物进行等温测序

以前在例如Sasaki等人的PNAS，95：3455-3460，1998中描述了基于转录的测序方法。当标记或未标记的rNTPs类似物在掺入RNA转录物中时，其用于终止反应混合物中rNTP的聚合，从而导致截短RNA产物的生成，这是由于在类似物结合的位点上封闭RNA聚合酶。适当的rNTP在本领域内是公知的。按照所用的方法(方法1或方法2)，在与相关复合物中的置换延伸产物上的互补核苷酸相反的方向上掺入最后的物质。

利用本领域内公知的任何不同方法可实施为洗脱序列信息而对反应产物的分析。这些方法包括以上描述的利用本发明的(非增强)线性扩增方法测序确定核酸靶物的方法。

利用本发明扩增方法的基于RNA部分的等温突变检测

用于本发明的等温扩增方法的组合引物的独特性质是检测靶核酸序列中的确定突变或多态性位点(例如SNPs)的等温方法的基础。该方法用于基因分型、导致抗药性以及类似情况的突变的检测。这些方法可用于定性模板链中一个区域的序列，该序列通常与组合引物的RNA部分杂交-然后参照“确定”的突变，这些突变一它们的位置来确定。

适合于本发明方法的靶核酸序列是ss DNA。然而，可以如上所述实施由ds DNA靶物或RNA靶物制备DNA靶物并且这些制备方法是本领域内公知的。

图4示意性示出了本发明方法的一个实施例。在该实施例中，组合引物的一个或多个RNA部分被设计用来与测试靶核酸序列互补，在该靶核酸序列中怀疑存在序列变异。或者是，该引物包括一个或多个RNA部分，该RNA部分含有与参比序列(例如野生型序列)互补的序列，测试靶核酸中的序列要与该参比序列比较。在一些实施例中，变异序列(即包括序列变异的序列)与参比序列是等位的。序列变异可以是一个核苷酸取代、缺失或插入。图4中的X示意性标出了序列变异的位点。

在另一实施例中，组合引物的一个或多个RNA部分被设计用来与测试靶核酸中怀疑存在的变异序列互补。或者是，该引物包括含有一个序列的RNA部分，该序列与测试靶核酸互补，并由此不与参比序列(例如野生型序列)互补，而测试靶核酸中的序列要与该参比序列比较。在一些实施例中，变异序列(即包括序列变异的序列)和参比序列是等位的。

组合引物的RNA部分(通常是5’RNA部分)包括一个与已知的正常野生型序列或者已知的突变或多态性基因型互补的序列。通常，合适的组合引物包括一个RNA部分，如果相比于是否具有错配序列(即引物具有突变序列并且靶物没有或者)，靶核苷酸序列包括一个与引物的RNA部分互补的序列，则该RNA部分使引物优选地与靶核酸杂交，其中靶核酸具有结合引物延伸产物并已经具有被裂解的5’-RNA部分。如图4所示，序列变异的存在通常不阻碍扩增的初始步骤。该组合引物与靶序列杂交，从而形成第一三分子复合物，并且该组合引物被延伸。然后核糖核酸酶例如RNase H裂解复合物的延伸引物的RNA部分。虽然错配序列碱基对的存在可能影响RNA/DNA杂交体的裂解图，但是该裂解无论如何都可能发生。通过5’RNA部分的杂交而使组合引物与复合物结合的下一步骤将被抑制，优选的是被错配序列阻碍。这种作用取决于诸如杂交寡核苷酸的大小以及反应条件的这些因素。按照本领域内公知的技术和规则，在设计组合引物时要考虑这些因素。错配序列还可能抑制组合引物的RNA部分的裂解，由此阻碍靶序列的扩增。另一个可能性是错配序列将导致引物的RNA部分的裂解效率低，由此导致扩增效率低或者产生极少的扩增产物。在扩增的这个步骤中组合引物不能与靶物杂交，从而阻碍了引物延伸链置换及扩增产物的多个拷贝的生产这些其他步骤。应该理解，利用本发明方法检测突变是基于引物延伸产物的缺乏或存在，或者累积引物延伸产物的量的定量比较。例如，当组合引物包括参比序列(例如野生型)时，靶链中突变的存在可导致没有可检测的扩增产物；或者是，它可导致可检测产物的生产，但是少于没有突变的模板产生的产物。

当组合引物包括RNA部分(通常是5-RNA部分)时(该部分与突变基因型完全互补)，正常基因型序列的扩增被抑制，而突变基因型靶物被扩增。于是，在这种情形中，扩增产物多个拷贝的检测和/或定量测定指示出突变基因型的靶序列的存在。例如，可以进行包括感兴趣的核酸样品或者具有野生型序列的靶核酸参比样品的平行反应。与后一反应相比，前者中更多引物延伸产物的积累指示出感兴趣样品中突变基因型的存在。另外，当组合引物包括与测试靶物的正常基因型序列完全互补的序列时，突变基因型的靶序列的扩增比抑制了，并且扩增产物的检测和/或定量测定指示出正常基因型的存在。

本发明的所有扩增方法都适合于检测突变(如上所述)。

利用本发明扩增方法的基于3’-核苷酸的等温突变检测

在该方法中，利用组合引物的3’最大核苷酸的互补性来鉴定突变序列的存在或缺少。组合引物的3’最大核苷酸与靶核酸的杂交是引物延伸所必需的。因此，产物扩增指示出，靶核酸含有由组合引物的3’最大核苷酸确定的序列。另一方面，产物扩增的减小或缺少指示出，靶核酸含有包括至少一个与组合引物的3’最大核苷酸互补的碱基的序列变异。序列的缺乏是由于位点的突变、单个核苷酸的多态性、包含由3’最大核苷酸确定的序列的序列片段的插入或缺失。

在一实施例中，基因型特异的引物(被设计具有与变异核苷酸部位(例如由于等位性)的不同序列对应的3’最大核苷酸)被用于按照本发明方法的扩增。扩增产物的存在指示出，靶核酸包括由所用的特定引物的3’最大核苷酸确定的序列。扩增产物的缺失或缺少(与具有由所用的特定引物的3’最大核苷酸确定的序列的参比核酸相比)指示出，靶核酸不包括由所用的特定引物的3’最大核苷酸确定的序列。

利用本发明的扩增方法基于单链构象进行突变检测

正如以下将讨论的，与和靶核酸序列同一而不是和序列变异同一的参比核酸序列相比，按照本发明的方法产生的DNA或RNA扩增产物还适合于靶核酸序列中任何变异检测的分析。

以前描述的线性核酸扩增方法的产物(DNA)和增强线性孔增方法的产物(RNA)适合于基于突变检测的单链构象的多态性(SSCP或rSSCP)。只要新扩增方法的RNA产物不是另一扩增的底物，按照该新方法进行的序列扩增就无需还原单链产物中的第二结构的试剂的存在。在还原第二结构的试剂(例如DMSO)的存在下，可进行由别人描述的基于转录的扩增方法，这样，可以预料，本发明的增强线性扩增方法与用于检测单链构象多态性的适当方式(例如为了阐明特定序列性质的存在或者测试核酸与参比核酸相比的任何差别的存在，用于鉴定单链RNA产物的特定迁移图的电泳分离方法)有直接的联系。

基于凝胶电泳或毛细管电泳的方法可以用于不同单链构象异构体的检测和分析。另外，利用识别依赖于序列的二级结构的核酸酶也可用于序列特异的构象多态性的测定。这些核酸酶在本领域内是公知的，例如裂解酶测定(Third Wave)。电泳方法潜在地更适合于高流通量的突变或者基因分型的检测方法。

对给定核酸序列的序列特异的电泳图形的测定可用于检测测试序列的特异性等位基因。而且，希望不同等位基因的电泳迁移图也有差别，由此可进行单个基因组DNA样品的两个等为基因的检测(正如异源基因型或多个等位基因所需)。测试核酸序列中的任何变异(例如碱基取代、插入或缺失)可利用该方法检测。希望该方法用于检测特定单个碱基的多态性、SNP以及发现新的SNPs。

制备核酸微阵列的方法

以前描述的线性核酸扩增方法的产物(DNA)和增强线性扩增方法的产物(RNA)的单链性质特别适合于制备包含扩增产物的微阵列。

用于将核酸固定到固相底物(例如玻片)上的几种技术是本领域内公知的。一种方法是将含有能够固定到固相底物上的组成成分的修饰碱基或类似物(例如氨基、氨基或其它带正电荷的基团的衍生物)掺入到扩增产物中。然后时扩增产物与固相底物(例如玻片)接触，该底物包覆有醛基或另一将与扩增产物上共价固定到玻片上的反应基团形成共价键的反应基团。其它方法(例如利用氨丙基硅烷表面性质的方法)在本领域内也是公知的，正如在http://www.cmt.corning.com andhttp://cmgm.standord.ecu/pbrownl.中所描述的。

还可以利用本领域内公知的方法将基团固定到随后能够转变成反应基团的引物上。固定到组合引物的核苷酸上的任何基团都将是线性扩增方法的单链DNA产物的一部分，该产物随后又被固定到微阵列的固相表面上。

正如所用技术需要和/或运行的，在固定到固相底物上之前或之后，通过对片段的裂解或可检测标记物的固定还可以修饰本发明方法的扩增产物。

核酸的定性

利用本发明方法得到的扩增产物特别适宜进一步的定性，这部分由于这些产物是单链的。利用本领域内公知的探针杂交技术(例如Southern andNorthern印迹法)可分析这些扩增产物(既可是DNA也可是RNA)。通过将扩增产物与包括寡核苷酸探针的微阵列接触也可以分析这些扩增产物。探针的身份提供了扩增产物序列身份的特性，并由此可外推出怀疑含有所述模板核酸的样品中存在的模板核酸的身份。

本发明的组合物及药盒

本发明还提供了用于本文所述方法的组合物及药盒。这些组合物可以是本文所述的任何一种或多种组分、反应混合物和/或中间体。例如，本发明提供了一种包括一组合引物的组合物，其中该组合引物包括RNA部分和3’DNA部分。在另一例子中，本发明提供了一种包括一组合引物的组合物，其中该组合引物包括5’-RNA部分和3’-DNA部分。在一实施例中，RNA部分邻近DNA部分。在另一例子中，，本发明提供了一种包括一组合引物的组合物，其中该组合引物包括具有至少一个间插RNA部分的5’-和3’-DNA部分。在另一例子中，本发明提供了一种包括一组合引物的组合物，其中通过能够将包含组合引物的多核苷酸固定到可用于制备核酸微阵列的固相底物上的组成成分的固定而衍生出该组合引物。在一些实施例中，通过带正电荷的组成成分(例如胺)的固定也可衍生出组合引物。在另一实施例中，本发明提供了一种包括TSO(即本文所述的TSO实施例的任一种，包括含有一个或多个增强对模板的结合的修饰的TSOs)的组合物。在一些实施例中，这些组合物包括一组合引物和一终止序列。在一些实施例中，本发明提供了一种包括含有前启动子序列(例如TSO或PTO(即本文所述的那些实施例的任一种))的多核苷酸以及组合引物和/或封闭剂序列的组合物。在一些实施例中，本发明提供了一种包括一封闭剂序列(即本文所述的任何实施例，包括具有修饰的封闭剂序列)的组合物。

在其它实施例中，本发明提供了包括以下组分的组合物：(a)一组合引物，其中该组合引物包括RNA部分和3’DNA部分(在一些实施例中，RNA部分邻近DNA部分)；以及(b)终止序列。在一些实施例中，终止序列是TSO。在其它实施例中，终止序列是封闭序列。在一些实施例中，组合引物包括5’-DNA部分和3’-DNA部分(在某些实施例中，RNA部分邻近DNA部分)。在其它实施例中，组合引物包括具有至少一个间差RNA部分的5’-及3’-DNA部分。在一些实施例中，组合物包括：(a)组合引物；(b)包含终止序列的多核苷酸；(c)包含前启动子序列的多核苷酸。在一些实施例中，该前启动子序列由PTO提供。在其它实施例中，该前启动子序列由TSO提供。上述组合物的任一种还包括模板(含有靶序列)和/或本文所述的任一种酶(例如DNA聚合酶、RNaseH和/或RNA聚合酶)。这些组合物通常是水溶液形式，最好在适当的缓冲液中。

本发明还提供了包括本文所述的扩增产物的组合物。因此，本发明提供了作为靶序列的若干拷贝并由本文所述的任一方法产生的一群DNA(反义)或RNA(有义)分子。

这些组合物虽然可以是冻干形式的，但是它们一般在合适的介质中。合适的介质包括(但不限于)含水介质(例如纯水或缓冲液)。

本发明提供了用于实施本发明方法的药盒。因此，各种药盒在合适的包装内。这些药盒可用于本文所述的任何一种或多种用途中，并因此而包含用于以下一种或多种用途的说明书：扩增核苷酸序列；测序被扩增的多核苷酸；以及检测扩增多核苷酸中的序列变异。

本发明的药盒包括一个或多个含有本文所述组分的任何组合的器皿，并且以下是这些药盒的例子。一种药盒包括本文所述组合引物的任一种。在一些实施例中，一种药盒包括两种或多种可以也可以不分别包装的组合引物。在其它实施例中，一种药盒包括组合引物和终止序列(本文所述的任一种)。一种药盒可包括组合引物、含有终止序列的多核苷酸以及含有前启动子序列(可以是PTO或TSO)的多核苷酸。组合引物可以是标记或未标记的。药盒还可任意包括本文所述的任何一种或多种酶。药盒还可包括一种或多种适当的缓冲剂(如本文所述)。用于核酸测序的药盒可任意包括在掺入到引物延伸产物中时起终止核酸聚合作用的标记或未标记核苷酸类似物。药盒中的一种或多种试剂可以是包括赋兴剂的干粉(通常是冻干)形式，干粉在溶解之后变成用于实施本文所述任一种方法的具有适当浓度的试剂溶液。每一组分都可包装在分开的器皿内或者几个组分组合在一个允许交叉反应和贮存期限的器皿中。

虽然含有说明的电子贮存介质(例如磁盘或光盘)也是可以接受的，但是本发明的药盒可任意包括一套说明书(通常是书面说明)，这些说明书涉及到本发明方法的组分在以下用途中的使用说明：即用于预计核酸的扩增；和/或合适时利用扩增产物进行诸如核酸测序及序列突变的检测。药盒所包括的说明书通常包括实施本发明方法所必需的试剂的信息、如何使用药盒和/或适当反应条件的说明。

药盒内的一种或多种组分可以装在任何便利适当的包装内。这些组分可以分开包装，也可以一个或多个组合的形式包装。当配备用于实施本发明的增强线性扩增方法的药盒时，RNA聚合酶(如果包括的话)最好与转录步骤之前的步骤中所用的组分分开配备。

药盒内不同组分的相对量可以非常不一样，从而提供了使为实施本文所述方法而必需发生的反应实质上优化和/或使任何测定的灵敏度最佳的试剂浓度。

本发明还提供了作用于本文所述方法的系统。这些系统包括以上所讨论的那些组分的不同组合体。例如，在一些实施例中，本发明提供了一种适合于产生靶多核苷酸序列(或扩增靶多核苷酸序列)的系统，该系统包括：(a)组合引物(本文所述的任一种)；(b)DNA聚合酶；以及(c)核糖核酸酶。在一些实施例中，该系统还包括含有终止序列(本文所述的任一种)的多核苷酸。在一些实施例中，该系统还包括含有前启动子序列(可以是PTO或TSO)的多核苷酸以及依赖于DNA的RNA聚合酶。系统实施例的任何一个还可包括模板(靶)序列(如上所述)。

本发明还提供了含有本文所述组分的不同组合体的反应混合物(或者是包括反应混合物的组合物)。在一些实施例中，本发明提供了包括以下组分的反应混合物：(a)多核苷酸模板；(b)含有3’DNA部分和RNA部分的组合引物；以及(c)DNA聚合酶。正如本文所述，任一种组合引物都可在反应混合物(或者许多组合引物)中，包括一种含有邻近3’DNA部分的5’RNA部分的组合引物。该反应混合物还可包括一种从RNA/DNA杂交体裂解RNA的酶(例如RNase H)。本发明的反应混合物还可包括含有本文所述终止序列的任一种多核苷酸。反应混合物的另一个例子是(a)置换引物延伸产物(并且由此在其5’端含有与组合引物的3’DNA部分互补的序列，但不含有与组合引物的RNA部分互补的序列)；(b)含有前启动子序列(例如PTO)的多核苷酸；以及(c)RNA聚合酶。其它反应混合物在本文中也有所描述并包括在本发明中。

本发明还包括含有本文所述的任一种复合物(是本文所述方法的中间体)的组合物。图1-4示意性地绘出了这些复合物。作为一个例子，本发明的一种复合物是包括以下组分的复合物：(a)模板链；以及(b)组合引物，所述组合引物包括3’DNA部分和RNA部分。该组合引物具有是5’-端并邻近3’DNA部分的RNA部分。该复合物还包括含有终止序列(例如TSO或封闭剂序列)的多核苷酸。该复合物还可包括含有前启动子(例如PTO)的多核苷酸。

以下提供的例子是为了说明(但不是限制)本发明。

实施例

实施例1：一般方法

该例中所描述的一般方法可用于本文所提供的其它例子中。

缓冲剂

用以下材料制备这些例子中所用的缓冲剂：

TE缓冲剂：10mM Tris盐酸，pH8.0，1mM EDTA

TBE缓冲剂：89mM Tris碱，89mM硼酸，2mM EDTA，pH8.3

FX缓冲剂：20mM Tris-SO₄，pH9.0，20mM(NH₄)SO₄，0.1％NP-40

采用单嵌合引物、DNA聚合酶及RNase H的等温线性扩增

在含有以下组分的15μl反应体系中进行序列扩增：20mMTris盐酸，pH8.5，6.0mMMgCl₂，1.0mM dATP，1.0mM dCTP，1.0mM dTTP，0.8mM dGTP，0.2mM dITP(dNTP’sfrom Amersham)，0-6％DMSO，0-8％甘油，0-100μg/ml乙酰化BSA(Ambion，Austin，TX)，0.6单位/μl重组核糖核酸酶抑制剂(rRNasin，Promega，Madison，WI)，0.5-5μM组合引物IA005，以及100-200nM启动子-模板寡核苷酸(PTO)IA015C。组合引物IA005是具有ACGGAUGCGGUCUCCAGTGT(SEQ ID NO：1)序列的20链节引物。启动子-模板寡核苷酸(PTO)IA015C是具有：

ggAATTCTAATACgACTCACTATAgggAgAgCggTACgCTgATCAAAgATCCgTg

-生物素(SEQ ID NO：12)序列的55链节寡核苷酸。

反应体系具有除两种酶之外的所有组分。于程序化热循环器(GeneAmp9600，Perkin Elmer)中在70℃或90℃下加热10秒钟之后，将反应混合物冷却到55℃、60℃或65℃之下(正如各个例子中所述的)。达到该低温之后，加入0.05-0.24单位的RNase H(利用以下稀释剂/贮存液对5U/ul的原液进行稀释：10mMTris盐酸，pH8.5，30％甘油；杂交热稳RNase H，Epicentre Technologies，Madison，WI)和1.0-5.0单位的Bca DNA聚合酶(2U/ul；Panvera，Madison，WI)。反应在55℃-65℃下保温30分钟。保温结束后，将反应体系冷却到4℃。反应体系可维持在4℃，直到需要RNA的转录步骤为止。

由线性扩增ssDNA产物的RNA转录而进行的增强线性扩增

在含有以下组分的10ul反应体系中于37℃进行RNA转录3小时：2.5ul的上述线性扩增反应混合物，以及40mM Tri s盐酸，pH8.5，70mM KCl，5.0mMDTT，12mM MgCl₂，110ug/ml BSA，3mM每rNTP(ATP，UTP，CTP，GTP，Amersham)，7.5％DMSO，1单位/ul rRNasin(Promega，Madison，WI)以及20单位T7RNA聚合酶(Ambion，Austin，TX)。

DNA模板

选择E.coli K12的J区域的序列作为以下几个例子的DNA模板。三个DNA模板被用于这些实验中：合成DNA靶物(IA013)、由PCR扩增产生的初级单链DNA(351个碱基)模板以及来自E.coli(例4中所述的制备)的K12菌株的基因组DNA。合成DNA靶IA013包括：

间隔物18-间隔物

(SEQ ID NO：18)。间隔

物18指的是聚氧乙烯间隔物。这些序列被加入到寡核苷酸中，以便相对于100-bp ssDNA产物阻止其流动。由PCR扩增产生的上述初级单链DNA(351个碱基)模板序列是：

CGGTACGCTGATCAAAGATCCGTGCAACAAATGTCATGGTCATGGTCGTGTTGAGCGCAGCAAA

ACGCTGTCCGTTAAAATCCCGGCAGGGGTGGACACTGGAGACCGCATCCGTCTTGCGGGCGAAG

GTGAAGCGGGCGAGCATGGCGCACCGGCAGGCGATCTGTACGTTCAGGTTCAGGTTTAAACAGC

ACCCGATTTTCGAGCGTGAAGGCAACAACCTGTATTGCGAAGTCCCGATCAACTTCGCTATGGC

GGCGCTGGGTGGCGAAATCGAAGTACCGACCCTTGATGGTCGCGTCAAACTGAAAGTGCCTGGC

GAAACCCAGACCGGTAAGCTATTCCGTATGCG (SEQ ID NO：17)。其中

PCR引物是黑体的并具有下滑线，而组合引物是黑体的，RNA部分是斜体的。

由PCR扩增产物制备ssDNA靶物

利用引物IA006和IA004由E.coliJ基因的351-bp片段的PCR扩增制备用于等温线性扩增的单链DNA模板。引物IA006是具有CGGTACGCTGATCAAAgATCCGT(SEQ ID NO：16)序列的23链节。引物IA004是具有CGCATACGGAATAGCTTACCGGTCT(SEQ ID NO：15)序列的26链节。

在含有以下组分的100ul反应体系中进行PCR：20mM Tris-SO₄，pH9.0，20mM(NH₄)₂SO₄，0.1％NP-40，2.0mM MgCl₂，300uM每dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP)，5单位Taq DNA聚合酶，400nM引物IA006，400nM5’-磷酸-引物IA004，以及0.2ul E.coli K12菌株的粗裂解物。在以下参数采纳修饰“接地PCR”方案：95℃5秒钟、68℃1分钟5次循环；94℃5秒钟、60℃30秒钟、72℃1分钟5次循环；94℃5秒钟、55℃30秒钟、72℃1分钟40次循环；72℃15分钟，然后无限期地保持在4℃下。用5-磷酸合成引物IA004，以便用α外切核酸酶(Strandase kit，Novagen，Madison，WI)保护有义链免受消化。按照制造商的指令进行Strandase的消化。简言之，通过加入1/10体积的3M醋酸钠，pH5.2以及0.6体积的异丙醇，然后在-20℃下冷却1小时并在微离心机中以最大速度离心30分钟而将如上所述制备的PCR产物从反应混合物中沉淀出来。DNA沉淀在重新悬浮到80ul水中之前马上用75％的乙醇洗涤，然后迅速进行空气干燥。在260nm下由O.D.评估浓度，并加入60单位的α外切核酸酶(Strandase，Novagen)。使消化在37℃下进行20分钟，然后使反应体系被加热到75℃10分钟，并冷却到4℃。在程序化热循环器(GeneAmp 9600，Perkin Elmer)中进行保温。在制造商发出指令之后利用QiaQuick核苷酸分离柱(Qiagen，Valencia，CA)以及药盒(Qiagen，Valencia，CA)所配备的缓冲剂纯化剩余的DNA。简言之，将10体积的缓冲剂PN(Qiagen)加入到样品中。然后将整个体积施加到Qiagen旋转柱上并离心(在微离心机上6000rmp1分钟)。弃去滤液，并用500ul缓冲剂PE(Qiagen)将柱洗涤两次。然后通过以最大速度离心3分钟而彻底干燥柱。用50ul缓冲剂EB(10mM Tris盐酸，pH8.5)(Qiagen)洗脱DNA。在260nm下由OD评估该浓度，大约为2.5X10¹²拷贝/5ul。凝胶分析揭示，剩余了显著量的dsDNA(小于总量的一半)，但是浓度误差小于2倍。DNA在TE缓冲剂中被稀释到10¹⁰拷贝/5ul。正如所需要的，由10¹⁰拷贝原液制备连续的稀释液。通过限定稀释PCR分析确定基于O.D.测定的浓度。

凝胶电泳

在Novex电泳装置(EI9001-Xce11 II Mini Cell，Novex)中，在1X TBE缓冲剂(89mM Tris碱，89mM硼酸，2mMEDTA，pH8.3)中Novex预浇铸的4-20％聚乙酰胺梯度凝胶(Invitrogen，Carl sbad，CA；partno.EC62255)上电泳分离扩增产物。来自线性扩增或转录(增强线性扩增)的反应混合物(5ul)与6X凝胶填充液(40％蔗糖，0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯苯胺)混合，并且将全部样品立刻填充到每个井中。使凝胶在250V下大约5分钟，直到所有样品进入凝胶并将电压降低到175V45分钟为止。从塑料盘之间除去凝胶并用1X TBE缓冲剂(89mMTris碱，89mM硼酸，2mMEDTA，pH8.3)中的0.5ug/ml溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基啡啶嗡对凝胶进行染色。在每个凝胶运行的一个通道内包括dsDNA分子大小标记器(Hi-Lo DNA标记器，Bionexus，San Leandro，CA)。该标记器含有以下尺寸中的16个片段：50、100、200、300、400、500、750、1000、1400、1550、20000。30000、40000、60000、80000以及100000bp。典型的是，所用的凝胶上包括50-2000bp。

杂交

用于杂交例(用于ssDNA产物的IA010；用于ssRNA产物的IA014)的寡核苷酸探针是采用T4多核苷酸激酶(New England Biolabs，Beverly，MA)以及γ-³²P-ATP(腺苷5’-[γ-³²P]三磷酸、三乙氨盐，Amersham，Piscataway，NJ；PB10218，＞5000Ci/mmo l，10mCi/ml)标记的5’-端。引物IA010是具有ATGTCATGGTCATGGTCGTGT(SEQ ID NO：13)序列的21链节。引物IA014是具有CTCAACACGACCATGACCATGACATTTGTTG(SEQ ID NO：14)序列的31链节。标记反应体系(50ul总体积)含有70mM Tris盐酸，pH7.6，10mM MgCl，5mM DTT，1ug寡核苷酸(用于引物IA010是147pmol，用于引物IA014是101pmol)、250uCiγ-³²P-ATP以及30单位T4多核苷酸激酶。在37℃下保温30分钟，然后用QIA快速核苷酸分离药盒(Qiagen，Valencia，CA)除去未结合的核苷酸。通过对1ul的标记寡核苷酸进行计数而在液体闪烁计数器上测定延迟速率(cpm)。

在30ul反应体系中进行杂交。将产物DNA(或RNA)(10ul)加入到20ul的探针混合物中。反应体系含有100mM NaCl和10⁶cpm探针(利用14.3天的半衰期校正延迟)。加热到65℃15秒之后，使杂交在42℃下进行30分钟，然后冷却到4℃。在具有热盖的程序化热循环器(GeneAmp9600，Perkin Elmer)中实施这些步骤。在1X TBE缓冲剂(89mM Tris碱，89mM硼酸，2mMEDTA，pH8.3)的10％聚乙酰胺凝胶中于150V下使整个体积的杂交反应体系电泳3小时。从玻璃板上去除凝胶，用塑料包裹并用两个鉴定屏幕在-20℃下暴露到放射自显影胶片(BioMax MR，Kodak)中过夜(大约16小时)。

实施例2-等温线性扩增

利用单个组合引物、DNA聚合酶、RNase H以及TSO或封闭剂实施等温线性扩增。将合成s sDNA靶物(IA010-例1中所列出的序列)的10拷贝添加到含有所有反应组分(如上所述)的反应混合物以及没有一种关键试剂[例如组合引物、RNase H或Bca DNA聚合酶(Panvera，Madison，WI)]的反应混合物中。也包括含有所有试剂但没有靶ssDNA的阴性对照反应体系。如上所述实施靶DNA序列的等温线性扩增。在70℃下进行靶物的变性并在65℃下进行等温扩增。

用凝胶电泳(图5)(第一通道：分子量梯度；通道#1-4：分别无DNA、无引物、无RNase H、无Bca DNA聚合酶；通道5：含有所有组分)解析扩增产物。在没有引物、RNase H或Bca DNA聚合酶的反应混合物中没有扩增产物可检测。

如图6(通道1-4：分别无DNA、无引物、无RNase H、无Bca DNA聚合酶；通道5：含有所有组分)所示，探针IA010的杂交以及对线性扩增方法的ssDNA产物的放射自显影，验证了扩增产物的鉴定。该实验中的合成寡核苷酸靶物的线性扩增利用未封闭的启动子-模板寡核苷酸(IA015b)实施。启动子-模板寡核苷酸IA015b是具有GGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGTACGCTGATCAAAGATCCGTGSEQ ID NO：11)序列的55链节。以上给出了用于该扩增反应的扩增反应标准反应组分。在70℃下进行初始变性步骤10秒钟。将反应体系冷却到65℃以下，在加入RNase H和Bca DNA聚合酶之后再于该温度下保温30分钟。在对照反应(无DNA、无引物、无RNase H、无Bca)中没有杂交可检测。

实施例3-偶联有启动子-模板寡核苷酸的等温线性扩增及转录启动子-模板寡核苷酸(PTO)含有两个基本序列基元：T7启动子序列(5’-TAATACGACTCACTATAGGGAgGAG(SEQ ID NO：20))以及与ssDNA模板互补的序列。设计了PTO的四种变形(IA012、IA012B、IA015、IA015b)。IA012PTO是67链节并具有以下序列：

GGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGATCGAGTAGCTCCGGTACGCTGATCAAAGATCCGTG (SEQ ID NO：8)。IA012PTO除了核T7启动子以外，还含有两个序列：5’-延伸(5’-GGAATTC (SEQ ID NO：21))以及在启动子与靶DNA互补序列之间的间隔物(5’-ATCGAGTAGCTC(SEQID NO：22))。IA015是较短的PTO(48链节)，缺少5’-延伸和间隔物。IA015PTO具有以下序列：

TAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGTACGCTGATCAAAGATCCGTG (SEQ ID NO：10)。IA012 PTO是含有间隔物但无延伸的60链节。IA012b PTO具有以下序列：

TAATACGACTCACTATAGGGAGAGATCGAGTAGCTCCGGTACGCTGATCAAAGATCCGTG(SEQ ID NO：9)。IA015b含有延伸但无间隔物。例2中公开了IA015b序列。除了嵌合寡核苷酸IA005、IA019和IA020以外的所有引物都是由Keystone(Division of BioSource International，Camarillo，CA)合成的并是PAGE纯化的。图2A-C示出了该扩增方法的一般示意图。通过比较合成寡核苷酸产物(IA009)与每个PTO’s之间形成的重叠-延伸产物转录之后产生的RNA的量，估算IA012、IA012b、IA015、IA015b ssDNA模板转换成T7RNA聚合酶底物的能力。合成寡核苷酸产物IA009是具有以下序列的100链节：

(SEQ ID NO：19)。在15ul含有以下组分的反应体系中进行重叠-延伸：20mM Tris盐酸，pH8.5，6mM MgCl，1mM每个dNTP聚合酶(dATP，dTTP，dCTP，dGTP)。反应体系不包含Bca DNA聚合酶，并被加热到95℃，然后冷却10分钟以上达到60℃。加入DNA聚合酶之后，在60℃下使反应保温30分钟。将反应混合物的一部分(2.5ul)加入到标准RNA转录混合物中并利用凝胶电泳评估转录反应。

如图7(通道1：分子量梯度；通道2-5：分别来自IA012、IA012b、IA015、IA015b的重叠延伸产物；通道6-13：分别来自IA012、IA012b、IA015、IA015b、IA012、IA012b、IA015、IA015b的RNA)所示，用由较短PTO’s(IA015，IA015b)而不是用IA012或IA012b产生的转录底物制备明显多的RNA。含有5’-延伸但无间隔物(IA015b)的PTO确实产生较高产率的RNA。然而，在所有情形中，除了主要的RNA条带以外还出现了多种产物。第五个PTO具有与IA015b相同的序列，但3’-封闭基团(生物素)取消了游离的3’-OH，从而证实3’-封闭的PTO的性能改进了。封闭PTO的3’-OH，从而消除了它启动功能性启动子序列与扩增产物的非特异性结合(导致转录产物的非特异产生)的能力。在增强等温线性扩增中的3’-封闭和未封闭PTO的性能可通过利用标准条件扩增合成寡核苷酸靶物来估算。如图8(通道1：分子量梯度；通道2、9：无DNA，30分钟；通道3、10：无DNA，1小时；通道4、11：无DNA，2小时；通道5、12：10拷贝IA013，30分钟；通道6、13：10拷贝IA013，1小时；通道7、14：10拷贝IA013，2小时；通道8、15：10拷贝IA013，30分钟；反应1-7没有封闭(IA015b)，反应8-15被封闭(IA015c))所示，3’-封闭PTO(IA015c)产生了比较大的特异性RNA(IA015)产率，但背景明显少。利用包括在链置换反应体系中的IA015b或IA015c，通过链置换30分钟、1小时，或者在55℃下2小时而扩增阴性对照反应体系(无DNA模板)和含有寡核苷酸靶物(IA013)的10拷贝的反应体系。当不封闭3’-OH时，在所有反应体系中产生非特异的RNA，并且模糊了特异性RNA条带的鉴定。相反，封闭的PTO主要产生单个的RNA产物。

实施例4-利用等温增强线性扩增对E.Coli基因组DNA的J基因序列进行扩增

将DNA从在Tryptone-NaCl介质中生长过夜的25ml E.ColiKl2(ATCC 10798)中分离出来。通过溶菌酶消化并且在制造商发出指令之后溶解在离液序列高的裂解液(Bactozol Kit，Molecular ResearchCenter，Cincinnati，OH)中而分离基因组DNA。简言之，通过以6000xg离心5分钟来收集细菌。细胞片被重新悬浮到Bactozyme消化缓冲剂中并在50℃下保温30分钟。所生成的裂解物在消化结束时是清楚的，而没有任何未消化细胞的可见柱。裂解物与4体积的DNazol试剂(Molecular Research Center，Cincinnati，OH)混合并在室温下保温15分钟。通过加入0.6体积的冰冻乙醇而将DNA从溶液中沉淀出来。在室温下保温5分钟之后，通过在微离心机中以最大速度离心5分钟而收集沉淀的DNA。用75％乙醇洗涤DNA片，再进行离心并利用频率振荡通过在50-55℃下加热10分钟而重新悬浮到1.5ml TE缓冲剂(10mMTris盐酸，pH8.0，1mM EDTA)中。所得到的溶液重复地通过22 gauge的注射器针头，以便剪切DNA并减小溶液的黏度。通过加入1/10体积的5M醋酸铵及3体积的冰冻乙醇而又沉淀出DNA(EPI005-35)。DNA在-20℃下保温1小时之后，通过在微离心机中以最大速度进行离心而收集DNA。DNA片用75％乙醇进行洗涤，再进行离心，并重新悬浮到150ulTE缓冲剂中。为O.D.测定(Beckman DU640 spectrophotometer)制备TE缓冲剂中的两个稀释液，通过估算50ul/ml dsDNA产生260nm处的10.D.而计算其中的DNA浓度。两个稀释液的DNA浓度是24.2ug/10ul和24.6ug/10ul。这两个测定值的平均值(24.4ug/10ul)对应于大约2.5X 10基因组拷贝/5ul(5fgE.Col i基因组DNA＝1拷贝)。

等温增强线性扩增

将DNA在TE缓冲剂中连续稀释到10⁹、10⁸或10⁷拷贝/5ul，并加热到95℃5分钟，然后在冰上迅速冷却。还将单链模板DNA稀释到10⁹拷贝/5ul。使反应体系不包含DNA但包含10⁷、10⁸或10⁹或2.5x10⁹的基因组DNA拷贝。

在15ul含有以下组分的反应体系中进行扩增：20mM Tris-盐酸，pH8.5，6.0mM MgCl₂，1.0mM dATP，1，0mM dCTP，1.0mM dTTP，0.8mM dGTP，0.2mM dITP(dNTP’s from Amersham)，6％DMSO，8％甘油，100ug/ml乙酰化BSA(Ambion，Austin，TX)，0.6单位/ul重组核糖核酸酶抑制剂(rRNasin，Promega，Madison，WI)，5uM组合引物IA005(例1中所公开的序列)，200nM启动子-模板寡核苷酸(PTO)(例1中所公开的序列)。反应体系包含除两种酶之外的所有组分。将反应体系在程序化热循环器(GeneAmp 9600，Perkin Elmer)中加热99℃10秒钟之后。在60℃下保温30分钟。达到60℃ GeneAmp 9600，Perdin Elmer之后，加入0.6ul的RNase H(由10mM Tris-盐酸，pH8.5，30％甘油中的5U/ul原液稀释成0.05单位)，Hybr idase，Epicentre Technologies，Madison，WI)和1.0ul的Bca DNA聚合酶(2.0单位，Panvera，Madison，WI)。在60℃的保温结束时，将反应体系冷却到4℃。将5.0ul体积的链置换产物加入到每个RNA转录反应体系(总体积20ul)中。利用标准条件并将反应体积增加到20ul来进行RNA转录，以便提供足够的材料进行直接的凝胶分析(5ul)和探针杂交(10ul)。

不象确定的单链合成靶物的扩增，按照本发明方法的基因组DNA的扩增需要形成确定的终点，以便形成具有确定3’-端的ssDNA产物。利用封闭剂可实现引物延伸的确定终点的形成，所述封闭剂与靶链上的确定位点杂交并不为聚合酶所置换。或者是，象在本例中那样，引物位点上游的GC丰富序列为引物延伸提供了终止点，由此导致具有确定3’-端的ssDNA的形成。

图9(通道1“无DNA；通道2：10⁷拷贝E.coli基因组DNA；通道3：空的；通道4：10⁸拷贝E.coli基因组DNA)示出了利用本发明的增强等温线性扩增方法对基因组DNA的确定序列的成功扩增。SsRNA产物被示出，以便与特异性寡核苷酸探针进行杂交。

实施例5：评估引物设计在实施增强等温线性扩增中的作用

评估在本发明的扩增方法中三个组合引物的每一个的性能。在含有以下组分的15ul反应体系中进行等温线性扩增：20mM Tris-盐酸，pH8.5，6.0mM MgCl₂，1.0mM dATP，1，0mM dCTP，1.0mM dTTP，0.8mM dGTP，0.2mM dITP(dNTP’s from Amersham)，6％DMSO，8％甘油，100ug/ml乙酰化BSA(Ambion，Austin，TX)，0.6单位/ul重组核糖核酸酶抑制剂(rRNasin，Promega，Madison，WI)，5uM组合引物，200nM启动子-模板寡核苷酸(PTO)IA015C。例1公开了PTO IA015c的序列。例1公开了组合引物IA005(20链节)的序列。具有字母数字命名的其它组合引物序列如下所示：

IA019(20链节)ACGGAUGCGGUCUCCAGTGT(SEQ ID NO：2)

IA020(21链节)GACGGAUGCGGUCUCCAGTGT(SEQ ID NO：3)

还使用四个其它组合引物序列，但是这些引物序列没有字母数字命名。它们的序列分别是：

(1)GCAAGACGGAUGCGGUCUCCAGTGT(SEQ ID NO：4)

(2)GACGATGCGUCTCCAGTGT(SEQ ID NO：5)

(3)GACGGATGCGGUCTCCAGUGT(SEQ ID NO：6)

(4)GACGGATGCGGUCTCCAGUGUCCA(SEQ ID NO：7)

这些组合引物由Dharmacon Research，Inc.(Boulder，CO)合成。利用与遇酸易变的2’-原酸酯保护基团(2’-双(乙酸基乙氧基)-甲酯或“2-ACE”(Scaringe，S.A.等人的J.Am.Chem.Soc.120：11820-11821(1998)和Scaringe，S.A.RNA寡核苷酸合成))共轭的5-甲硅烷基合成寡核苷酸的RNA部分。引物是PAGE纯化的引物。

反应体系包含除两种酶之外的所有组分。将反应体系在程序化热循环器(GeneAmp 9600，Perdin Elmer)中加热70℃10秒钟之后。冷却到50-65℃。达到这个低温之后，加入0.05单位的RNase H(利用以下稀释剂/贮存液由5U/ul原液稀释得到的：10mM Tris-盐酸，pH8.5，)和2.0单位的Bca DNA聚合酶(2U/ul；Panvera，Madison，WI)。使反应体系在55-65℃下保温30分钟。在保温结束时，将反应体系冷却到4℃，直到RNA转录开始为止。在含有以下组分的10ul反应体系中于37℃下进行RNA转录3小时：。

用凝胶电泳解析由每种组合引物产生的增强线性扩增产物，结果如图10(通道1：分子量梯度；通道1，2：IA015，60℃；通道3，4：IA019，55℃；通道5，6：IA019，60℃；通道7，8：IA015，65℃；通道9，10：IA020，55℃；通道11，12：IA020，60℃；通道12，14：IA020，65℃；)所示。组合引物被设计用来在靶链的相同位点上杂交，并由3-端上的脱氧核苷酸的数目来区分。利用引物IA020、随后同等地使用IA005和IA019，可产生最高产率的RNA产物。其它四个组合引物只产生极少的RNA产物。正如所希望的，等温线性扩增步骤的最佳温度对于不同引物是不一样的。

实施例6：利用线性扩增方法对核酸靶物进行等温测序

待分析的核酸序列首先被从其来源中分离出来。本例中所用的来源的非限定例子是动物、植物、细菌、病毒、酵母或真菌。如果核酸(DNA或RNA)的来源是动物组织，那么需要对该组织进行均化或超声或作用一些力，以便使单个细胞从相连的组织中分离出来。要小心操作，以便避免DNA和RNA(尤其是mRNA)的降解以及避免在出来组织的过程中剪切基因组DNA。还可从商业来源(即Gibco BRL)或非盈利来源(即American Tissue Type Culture(ATCC))得到动物细胞。根据所需要的核酸的形式，通过利用在Sambrook等人的supra中找到的步骤方法可分离基因组DNA、总RNA或mRNA。在Current Protocols in MolecularBiology supra中还发现了从植物细胞中分离核酸的方案。如果核酸源是来自非哺乳动物源例如细菌、酵母、真菌或病毒，则使用稍微不同的方案来分离核酸。对于细菌、酵母、真菌和病毒，这些分离方案可以在Sambrook等人或Current Protocols in Molecular Biology中找到。

正如本文所述，象等温线性扩增所描述的那样进行确定靶核酸序列的扩增。大约10²到10¹²拷贝用于模板。除了用于扩增方法的天然脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)之外，该测序反应混合物还包括标记的三磷酸类似物。如果每个类似物都单独标记，那么这四种物质可加入到同一反应管内。另外，如果每个核苷酸类似物用相同的标记物来标记，则在四个不同的反应管中进行测序反应，其中每一反应混合物都含有核苷酸类似物中的一个。这些类似物利用聚合酶掺合到引物延伸产物中并用于终止沿靶序列的延伸。标记所得到的截短延伸产物。按照每一类似物掺合的位点，累积的多个置换引物延伸产物在长度上是不同的，这表示靶序列上互补核苷酸的不同序列部位。通过在凝胶上运动产物可进行反应产物的分析，以便阐明序列信息。另外，还可以使用其它分析方法。正如其它测序方法那样，该测序反应既可在一个反应容器中进行，也可在若干分开的反应容器中进行。所要用的方法的选择取决于所用的核苷酸三磷酸类似物。由此当每一类似物被不同标记时，可以在一个容器中进行测序方法。为了使按照本发明方法的测序分析性能最佳而选择试剂和反应条件时所要考虑的因素类似于以前描述的其它方法。

根据加长终止剂的特异掺合而在尺寸上不同的多个引物延伸产物可利用本领域内公知的各种方法的任一种进行尺寸分离。由每一终止剂类似物产生多个引物延伸产物的现象指示出测试核酸序列的核苷酸序列

实施例7：利用增强扩增对核酸靶物进行测序

象等温线性扩增所述的那样进行确定靶核酸序列的扩增，如本文所述，这涉及到转录。可以利用TSO’s或PTO’s将前启动子序列添补到等温线性扩增产物上。除了用于按照本发明的增强扩增方法的天然核糖核苷三磷酸(rRTPs)之外，该测序反应混合物还包括适当标记的三磷酸类似物，这些物质都可用于本领域内公知的其它测序方法。这些物质利用聚合酶掺合到延伸产物中并用于终止沿靶序列的延伸。标记所得到的截短延伸产物。按照每一类似物掺合的位点，累积的多个置换引物延伸产物在长度上是不同的，这表示靶序列上互补核苷酸的不同序列部位。正如以上测序例子中所述的那样，进行反应产物的分析，以便阐明序列信息。

实施例8：利用等温增强线性扩增和基因型特异组合引物进行基因分型

利用以前的例子中所述的方法或者本领域内的技术人员公知的其它方式将基因组DNA从测试细胞中分离出来。对包括(但不限于)细菌、病毒、真菌、酵母、植物和动物的不同的器官进行基因分型。基因型特异引物的设计使其既可包括与特异性核酸序列的一个基因型杂交的3’-端核苷酸，也可与对应的互补基因型杂交。确定特异的基因型的序列变异是点突变、单个核苷酸的多态性(SNP)、插入缺失以及类似性质。

象以上例中对基因组E.coli序列的扩增所述的那样，进行确定靶核酸序列的扩增。利用基因型特异引物和无校正活性的DNA聚合酶，扩增产物的产生指示出确定基因型靶序列的存在。避免引物的3’-端与靶核酸序列杂交的序列变异将阻碍扩增。利用本领域内公知的、用于检测单链核酸序列的不同方法的任一种来检测该扩增产物。例如，利用凝胶电泳检测特异性标记的寡核苷酸探针与扩增产物的杂交。

在需要对二倍体细胞进行基因分型的情形(例如测定同原或异原基因型)中，利用特异性引物进行特异性核酸靶序列的扩增是切实可行的，这些特异性引物既可是野生型和突变基因型，也可是一个基因型与另一个基因型。在若干分开的反应容器内利用特异性引物进行扩增反应。只在一个反应管中有扩增产物检出或者只有极少的扩增产物被检出，这指示出纯合子基因型(即野生型或突变纯合子)的存在。这两个扩增反应中扩增产物的检测指示出纯合子基因型的存在。

实施例9：利用扩增方法进行基于RNA部分的等温突变检测

本文所公开的等温扩增方法可用于检测靶核酸序列中的确定突变或多态位点(例如SNPs)。这些方法用于基因分型或导致抗药性的突变的检测。该靶核酸序列是单链(ss)DNA。利用本文所述的等温扩增方法由双链DNA靶物或RNA靶物来制备单链DNA靶物。

如图4所示，与野生型DNA序列互补的组合引物用于和ss DNA靶物结合，通过仔细检查该靶物具有或怀疑有等位基因的突变。使用大约10²至大约10¹²的ss DNA靶物的拷贝和大约0.05-5μM的组合引物。序列变异的存在不会阻制扩增的初始步骤，由此组合引物与靶序列杂交，从而形成第一个三分子复合物，而且延伸产物生成。然后核糖核酸酶、RNase H裂解复合物的延伸引物的RNA部分。错配序列的存在影响了RNase H对组合引物或者引物延伸产物的RNA部分的裂解。这可以避免裂解、改变裂解亲权或者减小裂解效率。由于以上原因的错配序列可阻碍通过5’RNA部分的杂交而使组合引物与复合物结合的下一步骤。组合引物不能与靶物杂交，从而避免了引物延伸链置换和产生扩增产物的多个拷贝的步骤。利用凝胶电泳或者其它同等方法可目测扩增产物或其缺乏。

可抑制引物杂交的因素包括杂交寡核苷酸的尺寸和严格的反应条件。按照本领域内公知的技术和规则，在设计组合引物时要考虑这些因素。

与突变DNA序列互补的组合引物还用于同上述的等温扩增方法中的野生型ss DNA靶物结合。在这种情形下，引物与靶DNA结合并发生延伸。然而，由于寡核苷酸的错配序列，更多的引物在用RNase H处理之后不能与野生型DNA结合，由此极少或没有扩增产物生成。利用凝胶电泳或者其它同等方法可目测扩增产物或其缺乏。

还要进行包括感兴趣的核酸样品或者具有野生型序列的靶核酸的参比样品的平行反应。与后一反应相比，前一反应中更多的引物延伸产物的积累指示出感兴趣的样品中突变基因型的存在。另外，当组合引物包括与测试靶物的正常基因型序列完全互补的5’RNA序列时，可阻碍突变基因型靶序列的扩增，并且扩增产物的检测和/或定量测定指示出正常的基因型。

实施例10：利用等温扩增方法和基因型特异的探针杂交进行基因分型

在前述例子中描述了利用杂交进行测序的方法。在通过特异性探针的杂交而测定序列同一性的过程中，特别优越的是采用本发明的等温方法，只要由本发明方法产生的扩增产物和单链的并容易用于特异性探针的杂交中即可。利用本领域内公知的方法设计对确定基因型特异的探针。可确定这样一个规则：即，该规则将支持选择性探针杂交到由一基因型而不是另一基因型的扩增而产生的扩增产物上。与单核苷酸一样小的序列变异可阻碍探针的杂交。一些是杂交规则中要考虑的因素：探针长度、杂交反应的温度和缓冲剂组合物，特别是二价离子的浓度。为了分析而用的探针可以在溶液中或者附着到固体表面。而且，该探针可以直接标记或者附着到特异性结合对的一员上，并由此能够特异性结合到直接或间接标记的特异性结合对的另一员上。

利用本领域内公知的方法或者如上例中所述来将基因组DNA从测试样品中分离出来。测试DNA与所述的扩增组分、靶物特异的嵌合引物以及前启动子序列(例如PTO)结合。将该结合置于本文所述的保温条件下，从而产生单链RNA扩增产物。扩增产物与基因型特异的探针的杂交可在具有所附着的基因型特异的探针的溶液或固相中进行。由于增强等温线性扩增方法的产物是单链的，这些产物理想地适合于固定到固相上例如玻璃片，从而产生一个空间解析的特异性探针阵列(即基因芯片)。另外，固相包括特异性探针附着的颗粒。利用本领域内公知的不同方法(例如)可进行探针与扩增产物杂交的检测。该特异性探针是标记的，并且利用计算机算法可检测并记录由于杂交而导致的标记空间性质的变化。

由于特异性探针与扩增产物的杂交而形成的粒子缔合现象也可用于探针杂交的检测。标记扩增产物生成并且利用计算机算法可检测和记录其与固定在固体表面的探针的杂交产物。在由rNTP类似物取代四个rNTPs(是标记的)之一的转录步骤过程中通过标记rNTPs的掺合而产生标记扩增产物。该标记物是染料或者小分子例如生物素，该标记物然后通过与特异性结合个体例如标记的链霉抗生物素结合而被检测。用于检测固体表面是的探针杂交的方法在本领域内是公知的。

实施例11：利用rSSCP(RNA单链构象多态性)进行基因分型通过利用本文所述的方法扩增特异性靶核酸序列并测定单链RNA产物的电泳区带图可进行基因分型，该基因型可影响单链构象。用于检测序列变异的SSCP被广泛使用。通过对样品进行凝胶或毛细管电泳可测定基因型特异的单链构象。通过按照本发明方法扩增靶核酸序列而导致单链产物的生成，使该方法尤其适合于通过使扩增方法与rSSCP分析结合而进行的基因型的测定。

纯化的测试基因组DNA与本发明扩增方法的组分(如上所述)以及靶特异的组合引物和前启动子序列例如PTO结合。将该结合置于靶序列的等温扩增条件下。利用本领域内公知的仪器和条件，对含有扩增产物的反应混合物进行凝胶电泳或毛细管电泳。通过加入染料嵌入剂而实现对寡核苷酸产物的目测。将扩增产物的电泳图与通过扩增从已知基因行细胞得到的靶核酸序列而产生的扩增产物进行比较。电泳迁移图中的任何变化都指示出序列的变异性。本发明扩增方法与rSSCP的结合为确定靶序列的序列多态性的发现以及以前确定的基因型的检测提供了一种简单的方法。可以预测已知核酸序列或确定基因型的电泳图，并且将由测试DNA扩增产物产生的图形与用于基因型测定的已知图形进行比较。

Claims

1.一种用于扩增与靶多核苷酸序列互补的多核苷酸序列的方法，该方法包括：

(a)使包括靶序列的单链DNA模板与一组合引物杂交，所述组合引物包括RNA部分和3’DNA部分；

(b)相对于组合引物与模板的杂交，将包括终止多核苷酸序列的多核苷酸与模板的5’区域杂交；

(c)用DNA聚合酶延伸组合引物；

(d)用一种酶裂解退火组合引物的RNA部分，所述酶从DNA/RNA杂交体裂解RNA，以便另一组合引物可与模板杂交并通过链置换重复引物的延伸，

由此产生靶序列的互补序列的多个拷贝。

2.一种用于扩增靶多核苷酸序列的方法，该方法包括：

(c)用DNA聚合酶延伸组合引物；

(d)用一种酶裂解退火组合引物的RNA部分，所述酶从DNA/RNA杂交体裂解RNA，以便另一组合引物可与模板杂交并通过链置换重复引物的延伸，从而产生置换引物延伸产物；

(e)使包括前启动子的多核苷酸与一区域进行杂交，该区域在可发生由RNA聚合酶进行的转录的条件下杂交到置换引物延伸产物上，以便生成包括与置换引物延伸产物互补的序列的RNA转录物，

由此产生靶序列的多个拷贝。

3.权利要求1或2的方法，其特征在于组合引物的RNA部分是相对于3’DNA部分的5’部分。

4.权利要求3的方法，其特征在于5’RNA部分邻近3’DNA部分。

5.权利要求1或2的方法，其特征在于采用多个组合引物。

6.权利要求1或2的方法，其特征在于包括终止序列的多核苷酸是模板切换寡核苷酸(TSO)。

7.权利要求6的方法，其特征在于TSO在与模板杂交的区域上包括一修饰，其中在一系列给定的条件下，与没有修饰的TSO相比，该TSO更紧密地结合到该区域上。

8.权利要求1或2的方法，其特征在于包括终止序列的多核苷酸是一封闭序列。

9.权利要求8的方法，其特征在于该封闭序列在与模板杂交的区域上包括一修饰，其中在一系列给定的条件下，与没有修饰的封闭序列相比，该封闭序列更紧密地结合到该区域上。

10.权利要求1或2的方法，其特征在于裂解RNA的酶是RNase H。

11.权利要求2的方法，其特征在于包括前启动子和杂交到置换引物延伸产物上的区域的多核苷酸是模板切换寡核苷酸(TSO)。

12.权利要求2的方法，其特征在于含有前启动子的多核苷酸在3’端包括一个区域，该区域杂交到置换引物延伸产物上，由此置换引物延伸产物的DNA聚合酶的延伸产生一个用于转录的双链启动子。

13.权利要求12的方法，其特征在于包括前启动子的多核苷酸是前启动子模板寡核苷酸(PTO)。

14.权利要求1或2的方法，其特征在于步骤(a)和(b)的进行顺序可以互换。

15.权利要求1或2的方法，其特征在于步骤(a)和(b)可同时进行。

16.权利要求1或2的方法，其特征在于步骤(a)、(b)和(c)可同时进行。

17.权利要求1或2的方法，其特征在于步骤(a)和(b)可在步骤(c)之前进行。

18.权利要求1或2的方法，其特征在于所有步骤可同时进行。

19.一种测序靶核苷酸序列的方法，该方法包括：

(a)使包括靶序列的单链DNA模板与组合引物杂交，所述组合引物包括RNA部分和3’DNA部分；

(c)用DNA聚合酶以及dNTPs和dNTP类似物的混合物将组合引物延伸到一终止位点，以便在掺入dNTP类似物时终止引物的延伸；

(d)用一种酶裂解退火组合引物的RNA部分，所述酶从DNA/RNA杂交体裂解RNA，以便另一组合引物可与模板杂交并通过链置换重复引物的延伸，由此产生不同长度的靶序列的互补序列的多个拷贝；

(e)分析步骤(a)至(d)的产物，以便测定序列。

20.一种测序靶核苷酸序列的方法，该方法包括：

(b)使包括靶序列的单链DNA模板与组合引物杂交，所述组合引物包括RNA部分和3’DNA部分；

(c)用DNA聚合酶延伸组合引物；

(d)用一种酶裂解退火组合引物的RNA部分，所述酶从DNA/RNA杂交体裂解RNA，以便另一组合引物可与模板杂交并通过链置换重复引物的延伸，以便产生置换引物延伸产物；

(e)使包括前启动子的多核苷酸与一区域进行杂交，该区域在这样的条件下杂交到置换引物延伸产物上：即，可发生由RNA聚合酶、rNTPs与rNTP类似物的混合物进行的延伸产物的转录，从而产生包括与置换引物延伸产物互补的序列的RNA转录物，并且当掺入rNTP类似物时转录即被终止，由此产生不同长度的靶序列的多个拷贝；

(f)分析步骤(a)至(e)的产物，以便测定序列。

21.权利要求19或20的方法，其特征在于组合引物的RNA部分是相对于3’DNA部分的5’部分。

22.权利要求21的方法，其特征在于5’RNA部分邻近3’DNA部分。

23.一种定性靶多核苷酸中感兴趣的序列的方法，所述方法包括：

实施权利要求1或2的方法，其中组合引物的RNA部分的序列是公知的，并且

(a)与由包括组合引物RNA部分的互补区域的参比模板得到的扩增产物的量相比，由模板所生成的可检测的扩增产物的量较少，由此指示出，相对于组合引物RNA部分的互补序列，该靶多核苷酸不包括与组合引物的RNA部分互补的序列并且是一个序列变异体；或者

(b)与由不包括组合引物RNA部分的互补区域的参照模板得到的扩增产物的量相比，由模板所生成的可检测的扩增产物的量更多，由此指示出，相对于组合引物RNA部分的互补序列，该靶多核苷酸包括与组合引物的RNA部分互补的序列并且不是序列变异体。

24.权利要求23的方法，其特征在于组合引物RNA部分的序列包括野生型序列，并且感兴趣的序列的特征在于可测定该野生型序列的存在或缺少。

25.权利要求23的方法，其特征在于组合引物RNA部分的序列包括突变型序列，并且感兴趣的序列的特征在于可测定该突变型序列的存在或缺少。

26.权利要求23的方法，其特征在于组合引物RNA部分的序列包括等位型序列，并且感兴趣的序列的特征在于可测定该等位型序列的存在或缺少。

27.一种检测靶多核苷酸中的突变的方法，该方法包括：(a)实施权利要求1或2的方法；以及(b)对于单链构象，分析该方法的扩增产物，其中与参比单链多核苷酸相比，构象上的差别指示出靶多核苷酸中的突变。

28.权利要求23的方法，其特征在于组合引物的RNA部分是相对于3’DNA部分的5’部分。

29.权利要求28的方法，其特征在于5’RNA部分邻近3’DNA部分。

30.一种制备微阵列的方法，该方法包括：(a)实施权利要求1或2的扩增方法；以及(b)将扩增产物固定到固相底物上，从而产生扩增产物的微阵列。

31.一种包括一组合引物的组合物，所述组合引物包括5’RNA部分和3’DNA部分。

32.权利要求31的组合物，其特征在于5’RNA部分邻近3’DNA部分。

33.权利要求31的组合物，其特征在于5’RNA部分具有大约5-大约20个核苷酸，而3’DNA部分具有大约5-大约15个核苷酸。

34.一种包括TSO的组合物，该TSO在杂交到模板上的区域中包括一修饰，其中在一系列给定的条件下，与没有修饰点的TSO相比，TSO更紧密地结合到该区域上。

35.一种包括权利要求31的组合引物和权利要求34的TSO的组合物。

36.一种包括权利要求31的组合引物和一封闭序列的组合物。

37.一种包括权利要求31的组合引物和一前启动子模板寡核苷酸(PTO)的组合物。

38.一种包括以下组分的复合物的组合物：(a)一模板链；以及(b)一组合引物，所述组合引物包括3’DNA部分和RNA部分。

39.权利要求38的组合物，其特征在于RNA部分是5’部分并邻近3’DNA部分。

40.权利要求39的组合物，其特征在于该复合物还包括一终止序列。

41.权利要求40的组合物，其特征在于终止序列是TSO。

42.权利要求40的组合物，其特征在于终止序列是一封闭序列。

43.一种反应混合物，包括：(a)一多核苷酸模板；(b)一包括3’DNA部分和一RNA部分的组合引物；以及(c)DNA聚合酶。

44.权利要求43的反应混合物，其特征在于组合引物包括与3’DNA部分邻近的5’RNA部分。

45.权利要求44的反应混合物，其特征在于还包括一种从RNA/DNA杂交体上裂解RNA的酶。

46.权利要求45的反应混合物，其特征在于该酶是RNase H。

47.权利要求44的反应混合物，其特征在于还包括含有终止多核苷酸序列的多核苷酸。

48.权利要求47的反应混合物，其特征在于还包括含有前启动子的多核苷酸。

49.权利要求48的反应混合物，其特征在于包括前启动子的多核苷酸是TSO。

50.权利要求48的反应混合物，其特征在于包括前启动子的多核苷酸是前启动子模板寡核苷酸(PTO)。

51.一种用于扩增靶多核苷酸序列的药盒，包括一种具有3’DNA部分和RNA部分的组合引物。

52.权利要求51的药盒，其特征在于RNA部分是相对于3’DNA部分的5’部分。

53.权利要求52的药盒，其特征在于5’RNA部分邻近3’DNA部分。

54.权利要求51的药盒，其特征在于还包括含有终止多核苷酸序列的多核苷酸。

55.权利要求54的药盒，其特征在于终止多核苷酸序列是TSO。

56.权利要求54的药盒，其特征在于终止多核苷酸序列是一封闭剂序列。

57.权利要求51的药盒，其特征在于还包括含有前启动子的多核苷酸。

58.权利要求57的药盒，其特征在于含有前启动子的多核苷酸是TSO。

59.权利要求57的药盒，其特征在于含有前启动子的多核苷酸是PTO。

60.权利要求51的药盒，其特征在于还包括一种从DNA/RNA杂交体上裂解RNA的酶。

61.权利要求60的药盒，其特征在于该酶是RNase H。

62.一种用于扩增靶多核苷酸序列或其补体的系统，包括：(a)包括3’DNA部分和RNA部分的组合引物；(b)DNA聚合酶；以及(c)从DNA/RNA杂交体上裂解RNA的酶。

63.权利要求62的系统，其特征在于该酶是RNase H。

64.权利要求62或63的系统，其特征在于组合引物包括邻近3’DNA部分的5’RNA部分。