CN102782143A

CN102782143A - 用于酶促过酸生产的过水解酶

Info

Publication number: CN102782143A
Application number: CN2010800548020A
Authority: CN
Inventors: R·迪科西莫; J·E·加瓦根; M·S·佩恩
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2009-10-01
Filing date: 2010-09-29
Publication date: 2012-11-14
Also published as: EP2470666A1; WO2011041367A1; US20110081693A1; MX2012003966A; BR112012007253A2; EP2470666B1; US8222012B2; JP2013506421A; CA2775798A1; RU2012117762A

Abstract

本发明提供了从羧酸酯中快速制备目标浓度的过氧羧酸的方法。更具体地讲，羧酸酯在酶催化剂的存在下与过氧源如过氧化氢反应，所述酶催化剂包含与来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的具有过水解活性的乙酰木聚糖酯酶具有同一性的酶。多肽为结构上归类为糖酯酶家族7(CE-7)成员的酶。通过本发明方法制备的过氧羧酸可用于消毒、漂白和其他衣物洗涤护理应用。本发明也提供了包含所述反应组分的组合物和通过所述方法制备的过氧羧酸。

Description

用于酶促过酸生产的过水解酶

技术领域

本发明涉及过氧羧酸生物合成和原位酶催化领域。具体地讲，提供使用酶催化剂制备过氧羧酸的方法，所述酶催化剂包含与来自乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)的乙酰木聚糖酯酶具有同一性的酶催化剂。

发明背景

过氧羧酸组合物可为有效的抗微生物剂。已经描述了使用过氧羧酸清洁、灭菌和/或消毒硬质表面、织物、肉制品、活植物组织和医疗器械以杀灭不良微生物生长的方法(美国专利公开6,545,047；美国专利公开6,183,807；美国专利公开6,518,307；美国专利公开申请公布20030026846；和美国专利公开5,683,724)过氧羧酸也已经在多种衣物洗涤护理应用中使用，例如它们用作漂白剂(美国专利公开3,974,082；美国专利公开5,296,161；和美国专利公开5,364,554)。

过氧羧酸可通过羧酸烷基酯和过氧化物试剂如过氧化氢(参见Organic Peroxides，Daniel Swern编辑，第1卷，第313-516页；WileyInterscience，New York，1971)的化学反应来制备。然而，在轻度碱性至酸性pH(约8至约4)下，所述反应进行的速度通常不足以产生适合多种商业消毒和/或漂白应用的过氧羧酸浓度。

克服过氧羧酸化学法制备缺点的一种方法是使用具有过水解活性的酶催化剂。授予DiCosimo等人的美国专利公开申请11/638,635和美国专利公开申请公布2008/0176783；2008/0176299；以及2009/0005590公开了结构上归类为糖酯酶CE-7家族的成员的酶(例如先锋霉素C脱乙酰酶[CAH]和乙酰木聚糖酯酶[AXE])，它们特征在于将羧酸酯(在合适的过氧来源如过氧化氢的存在下)转化成浓度足以用作消毒剂和/或漂白剂的过氧羧酸的显著过水解活性。糖酯酶CE-7家族的一些成员已显示具有过水解活性，一旦反应组分混合，其活性足以在1分钟内从醇、二醇和甘油的乙酰基酯中产生4000-5000ppm过乙酸，以及在5分钟至30分钟内产生至多9000ppm过乙酸(DiCosimo等人，美国专利申请公开2009/0005590)。通常，在包括过量底物，pH约6.0至约8.5和合适的温度范围内的合适含水反应条件下，在30分钟或更长时间后CE-7过水解酶将产生浓度提高的过酸。通常使用有效量的至少一种缓冲液保持反应pH。使用此类条件产生的过氧乙酸量可能超出期望的量或者可能花费时间太长而不能最终达到某些应用的有效浓度。

过氧羧酸(例如过乙酸)的酶促生产通常使用含水反应条件进行。同样地，水解反应(化学的和/或酶促的)通常通过水解酯底物和/或水解过氧羧酸产生相应的羧酸(例如乙酸)，从而破坏所需的产物。酶促过水解(过氧羧酸或过氧羧酸与相应的羧酸水解产物的混合物)的产物可腐蚀某些金属表面。同样地，可能期望限制反应期间产生的过氧羧酸总量以防止或最小化所得溶液的腐蚀效应。例如，需要在1分钟内产生不超过200ppm至1000ppm过酸的应用通常使用产生的过酸最终浓度远高于这些限制的反应条件。在原位生成用于消毒硬质表面的过酸的应用中，希望具有快速生成不显著超过有效消毒剂浓度上限的期望浓度过酸的能力，从而限制或防止表面某些组分的腐蚀。在原位生成用于漂白衣物或织物的过酸的应用中，也期望对生成的高于漂白所需过酸的浓度进行类似的限制。同样地，需要提供快速制备期望的“目标”浓度的过氧羧酸的方法，尤其是在过量底物的存在下更是如此。

当pH下降至低于约6.0时，多种CE-7糖酯酶表现出过水解活性的降低或灭活，大多数CE-7过水解酶在等于或低于pH5.0时被灭活。授予DiCosimo等人的美国专利公开申请12/539,025提出了通过选择反应组分和从而形成反应产物的条件(即过氧羧酸和对应的羧酸水解产物)制备期望“目标”浓度的过氧羧酸的方法，所述条件将反应混合物的pH降低至其中酶催化剂具有极低或无过水解活性的值。选择反应组分和条件从而在10分钟或更短时间内将反应混合物的pH降至低于6.0，使得人们能够控制产生的过氧羧酸浓度。然而，pH小于6.0的产物混合物可能不是一些消毒和/或漂白应用所期望的，尤其是当接触反应产物的表面易于腐蚀和漂白过度时更是如此。在此类环境下，需要控制酶促产生的过氧羧酸的量，所述过氧羧酸不依赖反应混合物pH的大幅下降。

需解决的问题是提供酶促制备在含水反应混合物中的期望浓度的过氧羧酸的方法，所述反应混合物不依赖显著降低的pH或低于6.0的pH。选择的反应组分和反应条件应能够快速产生期望的过氧羧酸，其浓度一旦达到目标浓度不再显著提高。

发明概述

已经通过发现在5分钟或更短时间内制备期望浓度的过氧羧酸的酶促方法解决了所述问题，所述酸浓度一旦达到期望浓度基本上不再提高；其中反应混合物的pH在反应期间保持在6.0和9.0之间。所述方法包括使用包含具有过水解活性的酶的酶催化剂，所述酶与来自乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)的乙酰木聚糖酯酶具有至少95％的同一性。本发明的酶催化剂能够在5分钟或更短时间内快速产生具有基本上稳定的目标浓度的过氧羧酸的产物混合物，甚至在过多底物的存在下和pH6.0至9.0的范围内依然如此；所述条件下其他CE-7过水解酶通常在5分钟或更长时间后产生浓度显著提高的过氧羧酸。

在一个实施方案中，提供了制备目标浓度的过氧羧酸的方法，包括：

a)选择一组反应组分，所述反应组分包含：

1)至少一种底物，所述底物选自：

i)具有以下结构的酯

[X]_mR₅

其中；

X＝式R₆-C(O)O的酯基；

R₆＝C1-C7直链、支链或环状烃基部分，其任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代，其中当R₆＝C2-C7时，R₆任选地包含一个或多个醚键；

R₅＝C1-C6直链、支链或环状烃基部分，其任选地被羟基取代；其中R₅中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基或不超过一个酯基；其中R₅任选地包含一个或多个醚键；

m＝1至R₅中的碳原子数目；并且

其中在25℃下所述酯具有至少5ppm的水中溶解度；

ii)具有以下结构的甘油酯

其中R₁＝C1-C7直链或支链烷基，其任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代，并且R₃和R₄各自为H或R₁C(O)；和

iii)选自乙酰化单糖、乙酰化二糖和乙酰化多糖的乙酰化糖；

2)过氧源；和

3)具有过水解活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂包含具有特征基序的酶，使用CLUSTALW将所述特征基序与参考序列SEQ ID NO：2比对，所述特征基序包含：

i)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置118-120的RGQ基序；

ii)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置179-183的GXSQG基序；和

iii)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置298-299的HE基序；

其中所述酶与SEQ ID NO：4具有至少95％的氨基酸同一性；以及

b)在含水反应下混合所述反应组分以形成反应混合物；从而形成包含酶促产生的过氧羧酸的反应产物；其中

1)所述反应混合物的pH保持在约6.0至约9.0的范围内；并且

2)在等于或大于混合所述反应组分后五分钟的反应时间，在混合所述反应组分后一分钟产生的过氧羧酸浓度的增加不超过100％。

在另一个实施方案中，提供了制备过氧羧酸的方法，包括：

a)选择一组反应组分，所述反应组分包含：

1)至少一种底物，所述底物选自：

i)具有以下结构的酯

[X]_mR₅

其中

X＝式R₆-C(O)O的酯基；

m＝1至R₅中的碳原子数目；并且

其中在25℃下所述酯具有至少5ppm的水中溶解度；

ii)具有以下结构的甘油酯

iii)选自乙酰化单糖、乙酰化二糖和乙酰化多糖的乙酰化糖；

2)过氧源；和

(i)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置118-120的RGQ基序；

(ii)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置179-183的GXSQG基序；和

(iii)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置298-299的HE基序；

其中所述酶与SEQ ID NO：4具有至少95％的氨基酸同一性；以及

1)所述反应混合物的pH保持在约6.0至约9.0的范围内；并且

2)在等于或大于混合所述反应组分后30分钟的反应时间，在混合所述反应组分后一分钟产生的过氧羧酸浓度的增加不超过100％。

在另一方面，还提供了组合物，包含：

a)一组反应组分，所述反应组分包含：

1)至少一种底物，所述底物选自：

i)具有以下结构的酯

[X]_mR₅

其中

X＝式R₆-C(O)O的酯基；

m＝1至R₅中的碳原子数目；并且

其中在25℃下所述酯具有至少5ppm的水中溶解度；

ii)具有以下结构的甘油酯

iii)选自乙酰化单糖、乙酰化二糖和乙酰化多糖的乙酰化糖；

2)过氧源；和

i)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置118-120的RGQ基序；

ii)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置179-183的GXSQG基序；和

iii)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置298-299的HE基序；

其中所述酶也与SEQ ID NO：4具有至少95％的氨基酸同一性；以及

b)在混合(a)的该组反应组分时形成的至少一种过氧羧酸。

本发明方法当混合所述反应组分时产生所述期望的过氧羧酸。所述反应组分可保持分开状态直至使用时。在另一方面，还提供了包含所述反应组分的试剂盒，所述试剂盒包括：

a)第一隔室，所述第一隔室包含

1)酶催化剂，所述酶催化剂包含的酶与SEQ ID NO：4具有至少95％的氨基酸同一性；

2)至少一种底物，所述底物选自：

i)具有以下结构的酯

[X]_mR₅

其中

X＝式R₆-C(O)O的酯基；

m＝1至R₅中的碳原子数目；并且

其中在25℃下所述酯具有至少5ppm的水中溶解度；

ii)具有以下结构的甘油酯

iii)选自乙酰化单糖、乙酰化二糖和乙酰化多糖的乙酰化糖；和

3)任选的缓冲液；和

b)第二隔室，所述第二隔室包含

1)过氧源；

2)过氧化物稳定剂；和

3)任选的缓冲液。

附图简述

图1A和1B显示多个具有过水解酶活性的酶的CLUSTALW比对(1.83版)结果，所述酶包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

31954^TM先锋霉素C脱乙酰酶参考序列(SEQ ID NO：2)、乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)乙酰木聚糖酯酶(SEQ ID NO：4)、百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)乙酰木聚糖酯酶(SEQ IDNO：6)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)乙酰木聚糖酯酶、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)乙酰木聚糖酯酶(SEQ ID NO：39)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)乙酰木聚糖酯酶(SEQ ID NO：40)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)乙酰木聚糖酯酶(SEQ ID NO：41)。所有酶都具有过水解酶活性并在结构上归类为糖酯酶家族7(CE-7)的成员，它们均有保守的亚基序(用下划线标示)，这些亚基序一起形成所有CE-7糖酯酶的特征基序(参见Vincent等人，J.Mol.Biol.，330：593-606(2003)和授予DiCosimo等人的美国专利公开申请公布2008/0176783)。

生物序列简述

下面的序列遵循37C.F.R.1.821-1.825(“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求-序列规则”)，并且符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)、欧洲专利公约(EPC)序列表要求、专利合作条约(PCT)细则5.2和49.5(a-bis)、以及行政指令(Administrative Instructions)第208节和附录C。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中所列出的规定。

SEQ ID NO：1是编码来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

31954^TM(

登录号D10935)的先锋霉素C脱乙酰酶的核酸序列。

SEQ ID NO：2来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

31954^TM的先锋霉素C脱乙酰酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3是编码来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(

登录号EU255910)的乙酰木聚糖酯酶的核酸序列。

SEQ ID NO：4是来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(

登录号ABX75634.1)的乙酰木聚糖酯酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5是编码来自百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)(

登录号NC_002678.2)的乙酰木聚糖酯酶的核酸序列。

SEQ ID NO：6是来自百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)(

登录号BAB53179.1)的乙酰木聚糖酯酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7是编码来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)(

登录号AF038547.2)的乙酰木聚糖酯酶的核酸序列。

SEQ ID NO：8是来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)(

登录号AAF70202.1)的乙酰木聚糖酯酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：9是卡那霉素抗性基因的核酸序列。

SEQ ID NO：10是质粒pKD13的核酸序列。

SEQ ID NO：11和12是用于产生编码卡那霉素基因的PCR产物的引物，所述卡那霉素基因的侧翼是与大肠杆菌(E.coli)MG1655中的katG过氧化氢酶基因具有同源性的区域。所述产物用于破坏内源性katG基因。

SEQ ID NO：13是编码卡那霉素抗性基因的PCR产物的核酸序列，所述卡那霉素抗性基因的侧翼是与大肠杆菌MG1655中的katG过氧化氢酶基因具有同源性的区域。所述产物用于破坏内源性katG基因。

SEQ ID NO：14是大肠杆菌MG1655中的katG过氧化氢酶基因的核酸序列。

SEQ ID NO：15是大肠杆菌MG1655中的KatG过氧化氢酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：16是质粒pKD46的核酸序列。

SEQ ID NO：17和18是用于证实katG基因破坏的引物。

SEQ ID NO：19是质粒pCP20的核酸序列。

SEQ ID NO：20和21是用于产生编码卡那霉素基因的PCR产物的引物，所述卡那霉素基因的侧翼是与大肠杆菌(E.coli)MG1655中的katE过氧化氢酶基因具有同源性的区域。所述产物用于破坏内源性katE基因。

SEQ ID NO：22是编码卡那霉素抗性基因的PCR产物的核酸序列，所述卡那霉素抗性基因的侧翼是与大肠杆菌MG1655中的katE过氧化氢酶基因具有同源性的区域。所述产物用于破坏内源性katE基因。

SEQ ID NO：23是大肠杆菌MG1655中的katE过氧化氢酶基因的核酸序列。

SEQ ID NO：24是大肠杆菌MG1655中的KatE过氧化氢酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：25和26是用于证实以下菌株中的katE基因破坏的引物：单敲除菌株大肠杆菌MG1655 ΔkatE和双敲除菌株大肠杆菌MG1655ΔkatG ΔkatE，后者在本文中称为大肠杆菌KLP18。

SEQ ID NO：27和28是用于生成编码密码子优化的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)乙酰木聚糖酯酶的PCR产物的引物，所述酶被亚克隆到pTrcHis2-

中以生成质粒pSW229。

SEQ ID NO：29是质粒pSW229中的PCR产物的核酸序列。

SEQ ID NO：30是质粒pSW229的核酸序列。

SEQ ID NO：31和32是用于生成编码密码子优化的百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)乙酰木聚糖酯酶的PCR产物的引物，所述酶被亚克隆到pTrcHis2-

中以生成质粒pSW231。

SEQ ID NO：33是质粒pSW231中的PCR产物的核酸序列。

SEQ ID NO：34是质粒pSW231的核酸序列。

SEQ ID NO：35和36是用于生成编码密码子优化的嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)乙酰木聚糖酯酶的PCR产物的引物，所述酶被亚克隆到pTrcHis2-

中以生成质粒pSW236。

SEQ ID NO：37是质粒pSW236中的PCR产物的核酸序列。

SEQ ID NO：38是质粒pSW236的核酸序列。

SEQ ID NO：39是那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)酶的氨基酸序列，所述酶具有过水解活性(美国专利申请公布2008-0176299；

AAB70869.1)。

SEQ ID NO：40是海栖热袍菌(Thermotoga maritima)酶的氨基酸序列，所述酶具有过水解活性(美国专利申请公布2008-0176299；

NP_227893.1)。

SEQ ID NO：41是短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)酶的氨基酸序列，所述酶具有过水解活性(美国专利申请公布2008-0176299；Degrassi等人，Microbiology，146：1585-1591(2000))。

例证性实施方案的详述

提供了通过混合底物、过氧源和具有过水解活性的酶催化剂制备过氧羧酸的方法，其中所述酶催化剂包含具有CE-7特征基序的酶并且其与SEQ ID NO：4具有至少95％的氨基酸同一性。所述酶催化剂当与其他反应组分混合时，特征在于当在pH范围介于约6.0至约9.0内的含水反应混合物中进行反应时，初始过氧羧酸生成速率很高，然后生成速率迅速下降和/或丧失过水解活性。这些特征的组合有利于快速制备某浓度的过氧羧酸(“目标”浓度)，一旦达到期望的过酸浓度，所述浓度基本上不再升高。

应当理解，通过本发明方法产生的过氧羧酸量不受反应混合物中的底物量或过氧量的限制。在这个方法中，技术人员能够控制使用本发明酶催化剂在本文所述反应条件下产生的过氧羧酸量，在所述条件下具有过水解活性的其他CE-7酶通常继续产生过氧羧酸，在混合反应组分超过5分钟后，浓度大幅提高。

通过本发明方法产生的过氧羧酸可在多个应用中使用，包括但不限于消毒、漂白或为衣物护理应用的织物提供有益效果，所述应用也可包括(除消毒和漂白之外)脱色、除臭、以及它们的组合。本发明方法尤其吸引人的地方是在过氧羧酸过量和/或pH低于6.0可具有不良效应(例如腐蚀或漂白过度)的情况下使用。

在本公开中，使用了大量的术语和缩写。除非另外特别说明，下述定义适用。

如本文所用，术语“包含”是指如权利要求中提及的所述特征、整数、步骤或组分的存在，但它不预先排除一种或多种其他特征、整数、步骤、组分或其组的存在或添加。术语“包含”旨在包括由术语“基本上由...组成”和“由...组成”涵盖的实施方案。类似地，术语“基本上由...组成”旨在包括由术语“由...组成”涵盖的实施方案。

如本文所用，用术语“约”修饰成分或反应物的数量时是指数值量的变化，该变化可能发生在例如典型的测量和用于制备浓缩液或实际使用溶液的液体处理程序中；这些程序中的偶然误差中；制造、来源、或用于制备组合物或实施方法的成分的纯度的差异中；等。术语“约”还包括由于对于起因于特定起始混合物的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求包括量的等同量。

如本文所用，术语“过氧羧酸(peroxycarboxylic acid)”与过酸(peracid)、过氧酸(peroxyacid/peroxy acid)、过羧酸(percarboxylicacid)和过氧性酸(peroxoic acid)同义。

如本文所用，术语“过乙酸”缩写为“PAA”，并与过氧乙酸、乙过氧酸以及CAS登记号79-21-0的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“甘油一乙酸酯”与甘油单乙酸酯、甘油一醋酸酯和甘油单醋酸酯同义。

如本文所用，术语“甘油二乙酸酯”与二乙酸甘油酯；甘油二醋酸酯、二醋酸甘油酯以及CAS登记号25395-31-7的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“甘油三乙酸酯”与三乙酸甘油酯；三乙酸甘油酯；甘油三醋酸酯，1，2，3-三乙酰氧基丙烷、1，2，3-丙三醇三乙酸酯以及CAS登记号102-76-1的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“甘油一丁酸酯”与一丁酸甘油酯、甘油单丁酸酯和一丁酸甘油基酯同义。

如本文所用，术语“甘油二丁酸酯”与二丁酸甘油酯和二丁酸甘油基酯同义。

如本文所用，术语“甘油三丁酸酯”与三丁酸甘油酯、1，2，3-三丁酰基甘油以及CAS登记号60-01-5的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“甘油一丙酸酯”与一丙酸甘油酯、甘油单丙酸酯和一丙酸甘油基酯同义。

如本文所用，术语“甘油二丙酸酯”与二丙酸甘油酯和二丙酸甘油基酯同义。

如本文所用，术语“甘油三丙酸酯”与三丙酸甘油基酯、三丙酸甘油酯、1，2，3-三丙酰基甘油以及CAS登记号139-45-7的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“乙酸乙酯”与醋酸乙酯、乙酰氧基乙烷、乙酸乙基酯、醋酸乙基酯、乙基乙酸酯以及CAS登记号141-78-6的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“乳酸乙酯”与乳酸乙基酯以及CAS登记号97-64-3的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“乙酰化糖”和“乙酰化多糖”是指包含至少一个乙酰基的单糖、二糖和多糖。实例包括但不限于葡萄糖五乙酸酯、木糖四乙酸酯、乙酰化木聚糖、乙酰化木聚糖片段、β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙酰基-D-半乳醛和三-O-乙酰基-葡萄烯糖。

如本文所用，术语“烃基”和“烃基部分”指直链、支链或环状排列的碳原子，碳原子通过碳-碳单键、双键或三键和/或醚键连接且氢原子被相应取代。此类烃基可以是脂族的和/或芳族的。烃基基团的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、环丙基、环丁基、戊基、环戊基、甲基环戊基、己基、环己基、苄基和苯基。在一个优选的实施方案中，烃基部分为直链、支链或环状排列的碳原子，其中碳原子通过碳-碳单键和/或醚键连接且氢原子被相应取代。

如本文所用，术语1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、2，3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，2-戊二醇、2，5-戊二醇、1，6-戊二醇、1，2-己二醇、2，5-己二醇、1，6-己二醇的单酯或二酯的“单酯”和“二酯”指包含式RC(O)O的至少一个酯基的所述化合物，其中R是C1-C7直链烃基部分。在一个实施方案中，所述底物包含丙二醇二乙酸酯(PGDA)、乙二醇二乙酸酯(EGDA)或它们的混合物。

如本文所用，术语“合适的酶促反应混合物”、“适于产生过氧羧酸的组分”、“合适的反应组分”、“反应组分”、“合适的含水反应混合物”和“反应混合物”是指反应物和本发明酶催化剂在其中发生接触的材料和水。本文提供了反应混合物的组分，并且本领域技术人员应当理解适于本发明方法的组分变化范围。在一个实施方案中，酶促反应混合物在反应组分混合后原位生产过氧羧酸。像这样，反应组分可以作为其中一种或多种反应组分保持分离直至使用的多组分体系被提供。用于使多种活性组分分开与混合的系统和装置的设计是本领域已知的，并且一般将取决于各反应组分的物理形式。例如，多活性流体(液-液)系统通常使用多室分配瓶或两相系统(美国专利申请公开2005/0139608；美国专利公开5,398,846；美国专利公开5,624,634；美国专利公开6,391,840；欧洲专利公开0807156B1；美国专利公开申请公布2005/0008526；以及PCT公开WO 00/11713A1)，例如在其中期望的漂白剂在混合反应性流体时产生的某些漂白应用中发现的。用于产生过氧羧酸的其他形式的多组分系统可包括但不限于，设计用于一种或多种固体组分或固体-液体组分混合的那些，例如粉剂(例如许多商购可得的漂白组合物，美国专利5,116,575)、多层片(美国专利6,210,639)、具有多个隔室的水溶性包(如美国专利6,995,125)和加水后发生反应的固体附聚物(如美国专利6,319,888)。

如本文所用，术语“底物”将指用本发明的酶催化剂在合适过氧源如过氧化氢的存在下酶促过水解的反应组分。在一个实施方案中，所述底物包含至少一个酯基，能够用本发明的酶催化剂酶促过水解，从而产生过氧羧酸。在另一个实施方案中，本发明方法包括反应组分和其中在过量底物的存在下达到基本上稳定的目标过氧羧酸浓度的条件。

如本文所用，术语“反应产物”将指在混合所选反应组分后在反应混合物中形成的化合物的混合物。所述反应产物包括酶促产生的过氧羧酸(例如过乙酸)以及一种或多种水解产物(酶促产生的和/或化学水解的产物)，例如相应的羧酸(例如乙酸)。在一个实施方案中，混合所选的组反应组分产生反应混合物，其能够在混合反应组分10分钟内，优选地在约1分钟至约10分钟内形成大幅减少和/或灭活过水解催化剂的反应产物，其中所述反应混合物的pH保持在6.0和9.0之间，优选地在6.5和8.0之间，直到达到期望的过氧羧酸目标浓度。在一个实施方案中，所述酶催化剂的过水解活性在混合所述反应组分后10分钟或更短时间内被降低至少80％。

如本文所用，将术语“过水解”定义为所选的底物与过氧化氢反应形成过氧羧酸。一般地，无机过氧化物与所选底物在催化剂存在下反应以产生过氧羧酸。如本文所用，术语“化学过水解”包括其中底物(过氧羧酸前体)与过氧化氢源组合的过水解反应，其中过氧羧酸在不存在酶催化剂的情况下形成。如本文所用，术语“酶促过水解”指选择底物与过氧化氢源反应以形成过氧羧酸，其中所述反应由具有过水解活性的酶催化剂催化。

如本文所用，术语“过氧化水解酶活性”是指每单位质量(例如毫克)蛋白、干细胞重量或固定的催化剂重量的酶催化剂活性。

如本文所用，“一个酶活性单位”或“一个活性单位”或“U”定义为，在指定温度每分钟产生1μmol过氧羧酸产物所需的过水解酶活性的量。

如本文所用，术语“酶催化剂”和“过水解酶催化剂”是指包含具有过水解活性的酶的催化剂，并且可以是完整微生物细胞、透化的微生物细胞、微生物细胞提取物的一种或多种细胞成分、部分纯化的酶或纯化的酶的形式。酶催化剂还可以是化学修饰的(例如通过聚乙二醇化或者通过与交联试剂反应来修饰)。还可以使用本领域技术人员众所周知的方法将过水解酶固定在可溶性或不溶性载体上；参见例如Immobilization of Enzymes and Cells；Gordon F.Bickerstaff编辑；HumanaPress，Totowa，NJ，USA；1997。如本文所述，本发明具有过水解活性的酶在结构上归类为糖酯酶家族7(CE-7家族)的成员(参见Coutinho，P.M.，Henrissat，B.“Carbohydrate-active enzymes：an integrated databaseapproach”，Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering，H.J.Gilbert，G.Davies，B.Henrissat和B.Svensson编辑，(1999)The Royal Societyof Chemistry，Cambridge，第3-12页)。本发明的CE-7过水解酶催化剂包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：4的酶或基本上类似于SEQ ID NO：4的酶。用于鉴定基本上类似生物分子的方法是本领域众所周知的(例如序列比对方案、核酸杂交、保守特征基序的存在等)。在一个方面，本发明方法中的酶催化剂包含的酶基本上类似于与SE ID NO：4具有至少95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸同一性的酶。本文也提供了编码本发明具有过水解活性的酶的核酸分子。在另一个实施方案中，本发明方法中使用的过水解酶催化剂由在严格条件下与编码具有氨基酸序列SEQ ID NO：4的多肽的核酸分子杂交的核酸分子编码。

如本文所用，术语“先锋霉素C脱乙酰酶”和“先锋霉素C乙酰基水解酶”是指催化先锋霉素如先锋霉素C和7-氨基头孢烷酸的脱乙酰作用的酶(E.C.3.1.1.41)(Mitsushima等人，Appl.Environ.Microbiol.，61(6)：2224-2229(1995)；美国专利申请5,528,152；和美国专利申请5,338,676)。归类为先锋霉素C脱乙酰酶的酶已经显示通常具有显著的过水解酶活性(DiCosimo等人，美国专利公开申请公布2008/0176783)。

如本文所用，“乙酰木聚糖酯酶”是指催化乙酰木聚糖以及其他乙酰化糖的脱乙酰作用的酶(E.C.3.1.1.72；AXEs)。归类为乙酰木聚糖酯酶的酶已经显示具有过水解酶活性(DiCosimo等人，美国专利申请2009/0005590)。

如本文所用，术语“枯草芽孢杆菌

31954^TM”是指保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的细菌细胞，其国际保藏登录号为

31954^TM。以前已经描述过具有来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)31954^TM的显著过水解酶活性的酶(美国专利申请11/638,635)并且该酶以SEQ ID NO：2提供(

登录号BAA01729.1)。枯草芽孢杆菌(B.subtilis)

31954^TM过水解酶序列(SEQ ID NO：2)用作参考序列以示出保守的CE-7特征基序，该基序限定CE-7糖酯酶家族内的保守结构(美国专利申请2008/0176783和Vincent等人，同上)。使用CLUSTALW与参考序列SEQ ID NO：2进行的氨基酸序列比对可用于鉴定具有CE-7特征基序的酶。在图1A和1B中提供了示出保守基序的多个家族7糖酯酶的CLUSTAL比对实例。由于小的插入或删除，预期在基序的相对氨基酸位点间会发生微小变异(通常6个或更少的氨基酸)。同样地，当提到并要求包含CE-7特征基序的氨基酸序列的权利时，使用参考序列的氨基酸残基编号。

如本文所用，术语“乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)”指已经用于乳产品发酵和非乳产品发酵如植物材料发酵的菌种(Siezen等人，Appl.Environ.Microbiol.(2008)74(2)：424-436)。乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)是通常与发酵植物材料相关联的亚种，而乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.remoris)是通常与乳产品发酵相关联的亚种。在一个实施方案中，过水解酶催化剂包含与SEQ ID NO：4具有至少95％的氨基酸序列同一性(或者在不同实施方案中，96％、97％、98％或99％的序列同一性)的酶。在一个优选的实施方案中，本发明的酶催化剂包含来自乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcuslactis subsp.lactis)的乙酰木聚糖酯酶，其具有过水解活性，包含氨基酸序列SEQ ID NO：4(登录号ABX75634.1)。

如本文所用，术语“百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)”指包含具有过水解活性的乙酰木聚糖酯酶并以SEQ ID NO：6(

登录号BAB53179.1)提供的嗜热细菌。

如本文所用，术语“嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)”指包含具有过水解活性的乙酰木聚糖酯酶并以SEQID NO：8(登录号AAF70202.1)提供的嗜热细菌。

如本文所用，术语“那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)”指包含具有过水解活性的乙酰木聚糖酯酶并以SEQ ID NO：39(

AAB70869；美国专利公开申请公布2008-0176299；以引用方式并入本文)提供的细菌。

如本文所用，术语“海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8”指包含具有过水解活性的乙酰木聚糖酯酶并以SEQ ID NO：40(

NP_227893.1；美国专利公开申请公布2008-0176299)提供的嗜热细菌。

如本文所用，术语“短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)PS213”指包含具有过水解活性的乙酰木聚糖酯酶并以SEQ ID NO：41(

AJ249957；美国专利公开申请公布2008-0176299；以引用方式并入本文)提供的细菌。

术语“氨基酸”是指蛋白质或多肽的基本化学结构单元。在本文中使用下列缩写来表示具体的氨基酸：

如本文所用，核酸分子可与另一个核酸分子(例如cDNA、基因组DNA、或RNA)杂交是指在适当的温度和溶液离子强度条件下，第一分子的单链可与其他分子退火。杂交和洗涤条件是熟知的并且例示于Sambrook，J.和Russell，D.，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor(2001)。温度和离子强度条件决定了杂交的“严格度”。

杂交需要两种核酸含有互补序列，但是取决于杂交的严格度，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适的严格度取决于核酸的长度和互补的程度，它们是本领域内熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应较高的Tm)按以下顺序依次降低：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。就长度大于100个核苷酸的杂交体而言，已经导出了用于计算Tm的公式(Sambrook和Russell，上文)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更重要，而且寡核苷酸的长度决定了其特异性(Sambrook和Russell，同上)。在一个方面，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。优选地，可杂交核酸的最小长度为至少约15个核苷酸，更优选地为至少约20个核苷酸，甚至更优选地为至少30个核苷酸，甚至更优选地为至少300个核苷酸，最优选地为至少800个核苷酸。此外，技术人员将认识到，必要时可根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液的盐浓度。

如本文所用，术语“百分比同一性”是两条或更多条多肽序列之间或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较确定。在本领域中，“同一性”还表示多肽或多核苷酸序列之间序列关联的程度，根据具体情况，它由这些序列的序列串之间的匹配程度确定。“同一性”和“相似性”可通过已知的方法容易地计算，所述方法包括但不限于下列中所述的那些：Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.编辑)，Oxford University Press，NY(1988)；Biocomputing： Informatics and Genome Projects(Smith，D.W.编辑)，Academic Press，NY(1993)；Computer Analysis of Sequence Data，Part I(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑)，Humana Press，NJ(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje，G.编辑)Academic Press(1987)；以及Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.和Devereux，J.编辑)StocktonPress，NY(1991)。确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中编成了代码。序列比对和百分比同一性计算可通过LASERGENE生物信息学计算套件中的Megalign程序(DNASTAR Inc.，Madison，WI)、Vector NTI v.7.0(Informax，Inc.，Bethesda，MD)或EMBOSS Open Software Suite(EMBL-EBI；Rice等人，Trends inGenetics 16，(6)第276-277页(2000))。序列多重比对可使用Clustal比对方法进行(即CLUSTALW；例如1.83版)(Higgins和Sharp，CABIOS，5：151-153(1989)；Higgins等人，Nucleic Acids Res.22：4673-4680(1994)；以及Chenna等人，Nucleic Acids Res 31(13)：3497-500(2003))，它们得自European Molecular Biology Laboratory viathe European Bioinformatics Institute)，使用默认参数。CLUSTALW蛋白比对的合适参数包括空位存在罚分(GAP Existence penalty)＝15、空位延伸＝0.2、矩阵＝Gonnet(如Gonnet250)、Protein ENDGAP＝-1，ProteinGAPDIST＝4、以及KTUPLE＝1。在一个实施方案中，使用默认设置进行快速或慢速比对，其中优选慢速比对。作为另外一种选择，也可将使用CLUSTALW方法的参数(1.83版)修改成KTUPLE＝1，空位罚分＝10，空位延伸＝1，矩阵＝BLOSUM(例如BLOSUM64)，窗口＝5，TOPDIAGONALS SAVED＝5。

如本文所用，术语“序列分析软件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件将包括但不限于：GCG程序包(WisconsinPackage Version 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)、BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)和DNASTAR(DNASTAR，Inc.1228 S.Park St.Madison，WI53715USA)、CLUSTALW(例如1.83版；Thompson等人，Nucleic AcidsResearch，22(22)：4673-4680(1994)，以及包含Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date 1992，111-20.编辑：Suhai，Sandor.Publisher：Plenum，New York，NY)、Vector NTI(Informax，Bethesda，MD)和Sequencher v.4.05。在本专利申请的上下文中应当理解，使用序列分析软件进行分析时，分析结果将基于所参考程序的“默认值”，除非另外指明。如本文所用，“默认值”将指在首次初始化时由软件制造商为软件最初加载的任何值或参数集。

如本文所用，术语“生物污染物”是指一种或多种不想要的和/或病原性的生物实体，包括但不限于微生物、孢子、病毒、朊病毒、以及它们的混合物。本发明的酶可以用生产有效浓度的至少一种过羧酸，用于降低和/或消除存在的活体生物污染物。在一个优选的实施方案中，生物污染物为活体病原性微生物。

如本文所用，术语“消毒”指破坏或防止生物污染物生长的方法。如本文所用，术语“消毒剂”指通过破坏/中和、或抑制生物污染物生长来进行消毒的制剂。通常，将消毒剂用于处理无生命的物体或表面。如本文所用，术语“防腐剂”是指抑制带病微生物生长的化学试剂。在实施方案的一个方面，生物污染物是病原微生物。

如本文所用，术语“杀病毒剂”是指抑制或破坏病毒的药剂，并与“病毒杀灭剂”同义。将表现出抑制或破坏病毒能力的药剂称为具有“杀病毒”活性。过氧羧酸具有杀病毒活性。可适用于本发明使用的本领域已知的典型备选杀病毒剂包括例如醇、醚、氯仿、甲醛、苯酚、β丙内酯、碘、氯、汞盐、羟胺、环氧乙烷、乙二醇、季铵化合物、酶和洗涤剂。

如本文所用，术语“生物杀灭剂”是指灭活或破坏微生物的通常为广谱的化学试剂。将表现出灭活或破坏微生物能力的化学试剂称为具有“生物杀灭”活性。过氧羧酸具有生物杀灭活性。本领域已知的可适用于本发明的典型备选生物杀灭剂包括例如氯、二氧化氯、氯异氰尿酸盐、次氯酸盐、臭氧、丙烯醛、胺、氯酚、铜盐、有机硫化合物和季铵盐。

如本文所用，短语“最低生物杀灭浓度”指生物杀灭剂在特定接触时间内的最低浓度，其将产生期望的杀灭效果，不可逆的减少目标微生物的活体数量。效力可通过处理后活体微生物log₁₀的减少来度量。在一个方面，处理后活体微生物的目标减少为至少3-log的减少，更优选至少4-log的减少，最优选至少5-log的减少。在另一方面，最低生物杀灭浓度为减少活体微生物细胞至少6-log。

如本文所用，术语“过氧源”和“过氧的来源”是指当在水溶液中时能够提供约1mM或更高浓度的过氧化氢的化合物，包括但不限于过氧化氢、过氧化氢加合物(如尿素-过氧化氢加合物(过氧化脲))、过硼酸盐、以及过碳酸盐。如本文所述，在将反应组分混合后，通过含水反应混合物中的过氧化合物提供的过氧化氢初始浓度为至少1mM或更高。在一个实施方案中，含水反应混合物中的过氧化氢浓度为至少10mM。在另一个实施方案中，含水反应混合物中过氧化氢浓度为至少100mM。在另一个实施方案中，含水反应混合物中过氧化氢浓度为至少200mM。在另一个实施方案中，在含水反应混合物中的过氧化氢浓度为500mM或更高。在另一个实施方案中，在含水反应混合物中的过氧化氢浓度为1000mM或更高。含水反应混合物中过氧化氢对酶底物如甘油三酯的摩尔比(H₂O₂：底物)可为约0.002至20，优选地约0.1至10，最优选地约0.5至5。

如本文所用，术语“有益剂”指某些促进或提高有用的优点或有益效应的物质。在一个实施方案中，提供了方法，从而有益剂如包含过氧羧酸的组合物可施用于织物以获得期望的有益效果，例如消毒、漂白、脱色、除臭、以及它们的任何组合。

如本文所用，当涉及反应混合物中的过氧羧酸浓度相对于在指定时间点测得的过氧羧酸浓度提高时，使用术语“非大幅提高”、“非显著提高”和“未超出”，其中所述时间点指混合反应组分后产生过氧羧酸的时间量。本发明的方法制备在特定时间点上浓度基本上稳定的过氧羧酸。如本文所用，“基本上稳定的浓度”将指反应混合物中的过氧羧酸浓度经限定的时间间隔不增加超过100％(即2X或更低)。在一个实施方案中，在混合反应组分后1分钟产生的过氧羧酸浓度是参考浓度，在1分钟后的浓度改变与其进行比较。可将浓度变化报告为相对于参考时间浓度的浓度百分比(％)变化。在另一个实施方案中，过氧羧酸的参考浓度是在混合反应组分后5分钟时测得的浓度。在一个实施方案中，过氧羧酸浓度的非大幅提高将被定义为比在指定时间点测得的参考浓度高100％或更少(即2X)，优选地不超过50％，并且最优选地不超过20％的提高。

在一个实施方案中，在等于或大于混合反应组分后30分钟，优选地5分钟的反应时间，混合反应组分后一分钟时产生的过氧羧酸浓度的增加不超过(即，不提高)100％，优选地不超过50％，并且更优选地不超过20％。

在另一个实施方案中，在等于或大于混合反应组分后30分钟的反应时间，在混合反应组分后5分钟时产生的过氧羧酸浓度的增加不超过(即，不提高)100％，优选地不超过50％，并且更优选地不超过20％。

如本文所用，术语“特征基序”、“CE-7特征基序”和“标签基序”是指具有定义活性的酶家族共有的保守结构。特征基序可用于定义和/或鉴定对限定的底物家族具有类似酶活性的、在结构上相关的酶家族。特征基序可为单个邻接氨基酸序列或不邻接的保守基序的集合，它们一起形成特征基序。通常每种保守基序通过保守氨基酸序列表示。本文描述了鉴定具有CE-7特征基序的酶的方法。

具有过水解活性和CE-7特征基序的糖酯酶家族7酶

属于CE-7糖酯酶家族的酶共有不连续基序的集合，所述基序一起形成CE-7特征基序(由Vincent等人限定，同上)。CE-7酯酶的特征基序包含3个保守基序(相对于参考序列SEQ ID NO：2的残基位置编号)：

a)Arg118-Gly119-Gln120；

b)Gly179-Xaa180-Ser181-Gln182-Gly183；以及

c)His298-Glu299。

通常，第180氨基酸残基位置的Xaa为甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、色氨酸或苏氨酸。属于催化三联体的三个氨基酸残基中的其中两个以粗体表示。在一个实施方案中，第180氨基酸残基位置的Xaa选自：甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和苏氨酸。

属于催化三联体的氨基酸残基以粗体表示。在位点269(Asp269)上的天冬氨酸残基是催化三联体(Ser181-Asp269-His298；所有残基位点相对于SEQ ID NO：2的氨基酸编号)的第三个成员。

CE-7糖酯酶家族的成员已经显示具有过水解活性，该活性适于在合适的过氧源如过氧化氢的存在下从羧酸酯中产生过氧羧酸(DiCosimo等人，美国专利12/143,375)。本发明的过水解酶是CE-7糖酯酶家族的成员。本发明过水解酶的CLUSTALW比对表明它属于CE-7糖酯酶家族(图1A和1B；表2)。

许多熟知的全局比对算法可用于比对两个或更多个代表具有过水解酶活性的酶的氨基酸序列，以确定酶是否包含CE-7特征基序。将比对的序列与本发明的参考序列(SEQ ID NO：2)进行比较，以确定特征基序的存在。在一个实施方案中，将利用参考氨基酸序列(如本文所用的得自枯草芽孢杆菌31954^TM的过水解酶序列(SEQ ID NO：2))的CLUSTAL比对(例如CLUSTALW)用于鉴定属于CE-7酯酶家族的过水解酶。保守氨基酸残基的相对编号基于参考氨基酸序列的残基编号，用以说明在比对序列中的小插入或缺失(例如，6个或更少的氨基酸)。

可用于鉴定包含CE-7特征基序(当与参考序列进行比较时)的序列的其他合适算法的实例包括但不限于Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48，443-453(1970)；全局比对工具)和Smith-Waterman(J.Mol.Biol.147：195-197(1981)；局部比对工具)。在一个实施方案中，采用默认参数进行Smith-Waterman比对。合适的默认参数的实例包括使用BLOSUM62计分矩阵，其中GAP open penalty＝10和GAP extensionpenalty＝0.5。

美国专利公开申请公布2008/0176783提供了具有过水解酶活性的多个CE-7酶之间的整体百分比同一性比较，表明在具有保守CE-7特征基序的成员之间常观察到非常低的百分比同一性。表1提供了在CE-7糖酯酶家族成员之间的BLASTP比较。甚至即使表1中提供的CE-7酶可能在它们的全长上具有非常低的整体百分比同一性，所有成员均共有保守CE-7特征基序，如表2所示。

表1中所有具有过水解酶活性的CE-7糖酯酶均具有CE-7特征基序，如图1A和1B(用下划线标示)以及表2所示。

表2：在多个具有过水解活性的CE-7糖酯酶中发现的保守基序。

a＝保守基序，该基序由Vincent等人定义，同上，用于定义特征基序。“X”是GXSQG基序，其通常是Gly、Ala或Asp。

本发明实例示出了乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)过水解酶(SEQID NO：4)在于来自以下菌种的过水解酶进行比较时的特征：百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)过水解酶(SEQ ID NO：6)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)过水解酶(SEQ ID NO：8)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(SEQ ID NO：2)、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)(SEQ ID NO：39)、海栖热袍菌(Thermotogamaritima)(SEQ ID NO：40)、以及短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)(SEQ ID NO：41)。更具体地讲，乳酸乳球菌(L.lactis)过水解酶特征在于能够快速产生目标浓度的过氧羧酸，所述浓度在混合所述反应组分后5分钟，优选地一分钟时基本上不在提高。如实例所示，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)过水解酶的快速酶失活特性不依赖pH的大幅降低，其中所述反应混合物的pH在酶催化反应期间保持在6.0至约9.0，优选地6.5至8.5的范围内。只要酶催化剂包含具有过水解活性的酶，可通过调节选择的反应组分量控制期望的浓度，所述酶与SEQ ID NO：4具有至少95％的氨基酸同一性。在一个实施方案中，所述酶催化剂包含具有过水解活性的酶，所述酶具有氨基酸序列SEQ ID NO：4。在另一个实施方案中，所述反应组分在以下条件下混合：其中期望浓度在混合反应组分5分钟内(从混合反应组分，从而开始酶促过水解时测量)，优选地在1分钟内达到，其中过氧羧酸浓度在达到期望浓度后基本上不再提高。

基本上类似于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)过水解酶的CE-7酶

本领域的技术人员将认识到本发明的范围包括具有过水解活性的CE-7酶，所述酶基本上类似于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)过水解酶，其以SEQ ID NO：4提供。如本文所用，“基本上类似的”可指与SEQID NO：4具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸同一性并包含CE-7特征基序的氨基酸序列的酶，其中所得酶保留过水解酶的功能特性(即，高过水解活性，随后在pH未大幅下降的情况下丧失过水解活性)。在一个实施方案中，本发明的酶还包含CE-7特征基序。

在一个实施方案中，术语“基本上类似的”可用于指编码CE-7过水解酶的氨基酸序列的核酸分子，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：4具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸同一性并包含CE-7特征基序。例如，在本领域中熟知的是，导致在给定位点产生化学等价的氨基酸但不影响编码蛋白的功能性质的基因改变是常见的。出于本发明的目的，将置换定义为以下五组之一中的互换：

1.小的脂族非极性残基或稍微极性的残基：Ala、Ser、Thr(Pro、Gly)；

2.极性的、带负电荷的残基和它们的酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；

3.极性的、带正电荷的残基：His、Arg、Lys；

4.大的脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val(Cys)；和

5.大的芳族残基：Phe、Tyr和Trp。

因此，氨基酸中丙氨酸(疏水性氨基酸)的密码子可以被编码另一个疏水性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电荷的残基替换为另一个带负电荷的残基(例如，天冬氨酸替代谷氨酸)或者一个带正电荷的残基替换为另一个带正电荷的残基(例如，赖氨酸替换精氨酸)的改变也可以预期产生功能上等价的产物。在许多情况下，导致蛋白分子的N-端和C-端部分改变的核苷酸变化也预计不会改变蛋白的活性。

所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内，如测定所编码的产物的特征生物活性的保留。在一个实施方案中，基本上类似的核酸序列通过它们在高严格条件下(0.1X SSC，0.1％SDS，65℃并用2XSSC，0.1％SDS洗涤，然后用0.1X SSC，0.1％ SDS，65℃洗涤)与SEQID NO：3的互补序列杂交的能力来定义。

在一个方面，合适的核酸分子编码具有过水解活性的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：4具有至少95％的同一性并具有CE-7特征基序。本发明的合适核酸分子编码长度为约300个至约340个氨基酸，更优选约310个至约330个氨基酸，最优选约312个氨基酸的多肽。

如本文所用，“pH的大幅下降”或“pH的大幅改变”指在酶催化反应期间pH下降超过约1。应当理解，在反应期间反应混合物的pH将不低于约6.0并且优选地将保持在约6.0至约9.0，更优选地约6.5至约8.5，甚至更优选地约7.0至约8.5，并且最优选地约7.0至约8.0之间。

如本文所用，“在反应期间”指从初始混合反应组分以形成反应混合物(使用本发明的催化剂开始酶促过水解)到其中酶催化剂不再表现出过水解活性的时间点的时间段。可通过一旦达到期望的目标浓度(或浓度范围)，反应混合物中的过氧羧酸浓度不再显著提高测定或推导出过水解活性的丧失。

从羧酸酯和过氧化氢中酶催化制备过氧羧酸的合适反应条件

提供了通过在具有过水解活性的酶催化剂的存在下羧酸酯与无机过氧化物(例如过氧化氢、过硼酸钠或过碳酸钠)的反应制备包含至少一种氧羧酸的含水混合物的方法，其中所述酶催化剂包含具有CE-7特征基序并与SEQ ID NO：4具有至少95％的氨基酸同一性的酶，并且所述酶保留乳酸乳球菌(L.lactis)过水解酶的特征，即过水解酶活性能够在五分钟内，优选地在一分钟内在反应混合物中快速产生过氧羧酸，所述过氧羧酸在接下来的至少30分钟内(或者优选实施方案限定的其他时间点)不大幅增加。

在一个实施方案中，合适的底物包括下式的酯：

[X]_mR₅

其中X＝式R₆C(O)O的酯基

m＝1至R₅中的碳原子数目；并且

其中在25℃下所述酯具有至少5ppm的水中溶解度。

在另一个实施方案中，合适的底物包括用下式表示的甘油酯：

其中R₁＝C1-C7直链或支链烷基，其任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代，并且R₃和R₄分别为H或R₁C(O)。

在另一个实施方案中，R₆为任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7支链的烃基部分，任选地包含一个或多个醚键。在另一个优选的实施方案中，R₆为任选地被羟基取代的C2-C7直链的烃基部分和/或任选地包含一个或多个醚键。

合适的底物还包括选自乙酰化单糖、二糖和多糖的乙酰化糖类。在另一个实施方案中，乙酰化糖类选自乙酰化木聚糖、乙酰化木聚糖片段、乙酰化木糖(例如木糖四乙酸酯)、乙酰化葡萄糖(例如葡萄糖五乙酸酯)、β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-邻-乙酰基-D-半乳醛、三-邻-乙酰基-D-葡萄烯糖，以及乙酰化纤维素。在一个优选的实施方案中，乙酰化糖类选自β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-邻-乙酰基-D-半乳醛、三-邻-乙酰基-D-葡萄烯糖，以及乙酰化纤维素。

在另一个实施方案中，合适的底物选自甘油一乙酸酯；甘油二乙酸酯；甘油三乙酸酯；甘油一丙酸酯；甘油二丙酸酯；甘油三丙酸酯；甘油一丁酸酯；甘油二丁酸酯；甘油三丁酸酯；葡萄糖五乙酸酯；木糖四乙酸酯；乙酰化木聚糖；乙酰化木聚糖片段；β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯；三-邻-乙酰基-D-半乳醛；三-邻-乙酰基-葡萄烯糖；1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、2，3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，2-戊二醇、2，5-戊二醇、1，6-戊二醇、1，2-己二醇、2，5-己二醇、1，6-己二醇的单酯或二酯；以及它们的混合物。在另一个实施方案中，合适的底物包含丙二醇二乙酸酯(PGDA)、乙二醇二乙酸酯(EDGA)、或它们的混合物。

在另一个实施方案中，羧酸酯选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、以及它们的组合。在另一个实施方案中，所述底物为包含一个或多个酯基的C1-C6多元醇。在一个优选的实施方案中，在C1-C6多元醇上的一个或多个羟基被一个或多个乙酰氧基(例如1，3-丙二醇二乙酸酯、1，4-丁二醇二乙酸酯等)取代。

在另一个实施方案中，合适的底物选自乙酸乙酯、乳酸甲酯、乳酸乙酯、乙醇酸甲酯、乙醇酸乙酯、甲氧基乙酸甲酯、甲氧基乙酸乙酯、3-羟基丁酸甲酯、3-羟基丁酸乙酯、2-乙酰柠檬酸三乙酯、葡萄糖五乙酸酯、葡糖酸内酯、甘油酯(单甘油酯、二甘油酯和三甘油酯)如甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯(二丙酸甘油基酯)、甘油三丙酸酯(1，2，3-三丙酰基甘油)、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸酯(二丁酸甘油基酯)、甘油三丁酸酯(1，2，3-三丁酰基甘油)、乙酰化糖、以及它们的混合物。

在另一个实施方案中，合适的底物选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯、甘油三丙酸酯、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸酯、甘油三丁酸酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯。在又一方面，所述底物选自甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯。

羧酸酯在反应混合物中存在的浓度当酶催化过水解时足以产生期望浓度的过氧羧酸。羧酸酯不必完全溶于反应混合物，但具有足够的溶解度，以便通过过水解酶催化剂将酯转化成相应的过氧羧酸。羧酸酯在反应混合物中的浓度为0.0005重量％至40重量％，优选地为0.1重量％至20重量％，更优选地为0.5重量％至10重量％。羧酸酯的重量％可任选地大于羧酸酯的溶解度限制，使得反应混合物中的羧酸酯浓度为至少0.0005重量％，所述反应混合物包括水、酶催化剂和过氧化物源，其中羧酸酯的残留保留作为两相含水/有机反应混合物的第二分离相。不是所有加入的羧酸酯必然立即溶解在含水反应混合物中，并且在初始混合所有反应组分后，任选地进行附加的连续或不连续混合。

一旦使用本发明的酶催化剂，由本发明的反应组分产生的过氧羧酸可取决于选择的底物而不同。在一个实施方案中，产生的过氧羧酸为过乙酸、过丙酸、过丁酸、过乳酸、过乙醇酸、过甲氧基乙酸、过-β-羟基丁酸、或它们的混合物。

过氧源可包括但不限于过氧化氢、过氧化氢加合物(如尿素-过氧化氢加合物(过氧化脲))、过硼酸盐和过碳酸盐。过氧化合物在反应混合物中的浓度可在0.0033重量％至约50重量％的范围内，优选地在0.033重量％至约40重量％的范围内，更优选地在0.33重量％至约30重量％的范围内。

据报道，许多过水解酶催化剂(全细胞、透化的全细胞和部分纯化的全细胞提取物)都具有过氧化氢酶活性(EC 1.11.1.6)。过氧化氢酶催化过氧化氢转化成氧和水。在一个方面，具有过水解酶活性的所述酶催化剂缺乏过氧化氢酶活性。在另一方面，将过氧化氢酶抑制剂加到反应混合物中。过氧化氢酶抑制剂的实例包括但不限于叠氮化钠和羟胺硫酸盐。本领域的技术人员可以根据需要调节过氧化氢酶抑制剂的浓度。过氧化氢酶抑制剂的浓度通常在约0.1mM至约1M的范围内；优选地在约1mM至约50mM的范围内；更优选地在约1mM至约20mM的范围内。在一个方面，叠氮化钠浓度通常在约20mM至约60mM的范围内，而羟胺硫酸盐的浓度通常在约0.5mM至约30mM的范围内，优选地约10mM。

可以用熟知的技术通过破坏负责过氧化氢酶活性的基因的表达来下调或消除宿主细胞中的过氧化氢酶活性，这些技术包括但不限于转座子诱变、RNA反义表达、定向诱变和随机诱变。在一个优选的实施方案中，可以使编码内源性过氧化氢酶活性的一种或多种基因下调或破坏(即敲除)。如本文所用，“被破坏的”基因是其中不再存在由改性基因编码的蛋白的活性和/或功能的基因。破坏基因的方法是本领域熟知的，包括但不限于插入、去除、或突变，只要相应蛋白的活性和/或功能不再存在即可。在另一个优选的实施方案中，生产宿主是大肠杆菌生产宿主，其包含破坏的过氧化氢酶基因，该基因选自katG和katE(参见授予DiCosimo等人的美国专利公开申请公布2008/0176783，其以引用方式并入本文)。在另一个实施方案中，生产宿主是大肠杆菌菌株，它包含下调和/或破坏的katG和katE过氧化氢酶基因。本文已经制备并描述了包含katG和katE双敲除的大肠杆菌菌株是大肠杆菌菌株KLP18(实施例3)。

含水反应混合物中催化剂的浓度取决于催化剂的特定催化活性，对该浓度进行选择以获得所需的反应速率。过水解反应中的催化剂的重量通常在每mL总反应体积0.0005mg至10mg，优选地每mL总反应体积0.010mg至2.0mg的范围内。还可以使用本领域技术人员众所周知的方法将催化剂固定在可溶性或不溶性载体上；参见例如Immobilization of Enzymes and Cells；Gordon F.Bickerstaff编辑；Humana Press，Totowa，NJ，USA；1997。使用固定化催化剂允许在后续反应中进行回收和重复使用。酶催化剂的形式可以是完整的微生物细胞、透化的微生物细胞、微生物细胞提取物、部分纯化的酶或纯化的酶、以及它们的混合物。

在一个方面，通过羧酸酯的化学法过水解和酶催化法过水解相结合产生的过氧羧酸浓度足够以所需的pH值提供用于漂白或消毒的过氧羧酸有效浓度。在另一方面，本发明的方法提供酶和酶底物的组合以生产期望有效浓度的过氧羧酸，其中在不加入酶的情况下，产生的过氧羧酸浓度显著更低。虽然通过无机过氧化物与酶底物的直接化学反应，酶底物可发生一些化学过水解，但产生的过氧羧酸浓度可能不足以在所需的应用中提供有效浓度的过氧羧酸，而通过在反应混合物中加入合适的过水解酶催化剂可以显著提高过氧羧酸的总浓度。

在酶促过水解反应开始的5分钟内，更优选地在1分钟内，通过酶促过水解而产生的过氧羧酸(例如过乙酸)浓度为至少约2ppm，优选地为至少20ppm，优选地为至少100ppm，更优选地为至少约200ppm，更优选地为至少300ppm，更优选地为至少500ppm，更优选地为至少700ppm，更优选地为至少约1000ppm，最优选地为至少2000ppm。

包含过氧羧酸的产物混合物可任选地用稀释剂进行稀释以制备具有期望的较低目标浓度的过氧羧酸的混合物，所述稀释剂是包含水或主要包含水的溶液。在一个方面，制备期望浓度(或浓度范围)过氧羧酸所需的反应时间为约5分钟或更短的时间，更优选约1分钟或更短的时间。

在其他方面，在将所述反应组分结合后约1分钟至约168小时内，或约1分钟至约48小时内，或约1分钟至2小时内，或其中的任何此类时间间隔内，将被一定浓度的生物污染物污染的表面或无生命物体与根据本文所述的方法形成的过氧羧酸接触。

在另一方面，根据本文所述方法形成的过氧羧酸用于衣物洗涤护理应用，其中使过氧羧酸与织物接触以提供有益效果，如消毒、漂白、脱色、除臭或它们的组合。过氧羧酸可用于多种衣物洗涤护理产品，包括但不限于织物预洗处理剂、衣物洗涤剂、脱色剂、漂白组合物、除臭组合物和清洗剂。在一个实施方案中，制备用于目标表面的过氧羧酸的本发明方法是原位进行的。

选择反应温度以控制反应速率和酶催化活性的稳定性。反应温度可在恰好高于反应混合物的凝固点(大约0℃)至约75℃的范围内，优选的反应温度范围为约5℃至约55℃。

当酶促制备过氧羧酸时，反应混合物的pH保持在约6.0至约9.0，优选地约6.5至约8.5，甚至更优选地约6.5至约7.5的范围内。在一个实施方案中，在混合反应组分至少30分钟内反应混合物的pH范围为约6.5至约8.5。可通过添加或掺入合适的缓冲液，包括但不限于磷酸盐、焦磷酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐、或柠檬酸盐，来控制反应混合物的pH值。在一个实施方案中，缓冲液选自磷酸盐缓冲液和碳酸氢盐缓冲液。当使用时，缓冲液浓度通常为0.1mM至1.0M，优选地1mM至300mM，最优选地10mM至100mM。

在另一方面，酶过水解反应混合物可包含有机溶剂，其作为分散剂提高反应混合物中的羧酸酯的溶解速率。此类溶剂包括但不限于丙二醇甲醚、丙酮、环己酮、二乙二醇丁醚、三丙二醇甲醚、二乙二醇单甲醚、丙二醇丁醚、二丙二醇甲醚、环己醇、苄醇、异丙醇、乙醇、丙二醇、以及它们的混合物。

在另一方面，酶促过水解产物可包含提供期望功能的附加组分。这些附加组分包括但不限于缓冲液、洗涤剂助剂、增稠剂、乳化剂、表面活性剂、润湿剂、腐蚀抑制剂(如苯并三唑)、酶稳定剂和过氧化物稳定剂(如金属离子螯合剂)。许多附加组分是洗涤剂工业中熟知的(参见例如美国专利公开5,932,532；以引用方式并入本文)。乳化剂的实例包括但不限于聚乙烯基醇或聚乙烯吡咯烷酮。增稠剂的实例包括但不限于RD、玉米淀粉、PVP、

聚山梨酸酯20、聚乙烯醇和卵磷脂。缓冲体系的实例包括但不限于磷酸二氢钠/磷酸氢二钠；氨基磺酸/三乙醇胺；柠檬酸/三乙醇胺；酒石酸/三乙醇胺；琥珀酸/三乙醇胺；和乙酸/三乙醇胺。表面活性剂的实例包括但不限于a)非离子表面活性剂如环氧乙烷或环氧丙烷的嵌段共聚物、乙氧基化的或丙氧基化的直链和支链的伯醇和仲醇、以及脂族膦氧化物；b)阳离子表面活性剂如季铵化合物，尤其是具有结合氮原子，附加地结合三个C1-C2烷基的C8-C20烷基的季铵化合物；c)阴离子表面活性剂如烷烃羧酸(例如C8-C20脂肪酸)、烷基膦酸酯、烷基磺酸盐(例如十二烷基磺酸钠“SDS”)或直链或支链的烷基苯磺酸盐、烯基磺酸盐；和d)两性和两性离子表面活性剂如氨基羧酸、氨基二羧酸、烷基甜菜碱、以及它们的混合物。附加组分可包括芳香剂、染料、过氧化氢稳定剂(例如金属螯合剂如1-羟基亚乙基-1，1-二膦酸(

2010(Solutia Inc.，St.Louis，MO))和乙二胺四乙酸(EDTA))、

SL、

0520、0531、酶活性稳定剂(例如聚乙二醇(PEG))、以及洗涤剂助剂。

在另一方面，可将酶促过水解产物预混合以在接触要消毒和/或漂白的表面或无生命的物体之前产生期望浓度的过氧羧酸。

在另一方面，不将酶促过水解产物预混合以在接触要消毒的表面或无生命的物体之前产生期望浓度的过氧羧酸，而是将产生期望浓度的过羧酸的反应混合物的组分与要消毒的表面或无生命的物体接触，产生期望浓度的过氧羧酸。在一些实施方案中，在所述位点组合或混合反应混合物的组分。在一些实施方案中，将反应组分递送或施涂到所述位点并且随后混合或组合以产生期望浓度的过氧羧酸。

用过水解酶催化剂制备过氧羧酸

一旦制备出过氧羧酸，其反应性非常强并且在一段时间后浓度可降低，这取决于包括但不限于温度和pH在内的变量。因此，可期望将各种反应组分分开，尤其是液体制剂。在一个方面，过氧化氢源与或者底物或者过水解酶催化剂分开，优选地与二者都分开。这能够使用多种技术完成，所述技术包括但不限于使用多隔室分配器(美国专利公开4,585,150)，并且在使用时完全混合过水解酶催化剂与无机过氧化物以及本发明的底物以开始含水酶过水解反应。过水解酶催化剂可任选地固化在反应室体内或在接触拟处理的表面和/或物体前与包含过氧羧酸的反应产物分离(例如过滤分离等)。过水解酶催化剂可为液体基质或固体形式(例如粉末、片剂)，或置于固体基质内，随后与底物混合以开始酶促过水解反应。在另一方面，过水解酶催化剂可包含在可溶解的或多孔小袋内，可将其加到含水底物基质中以开始酶促过水解。在附加的另一方面，将包含酶催化剂的粉末悬浮在底物(例如甘油三乙酸酯)中，并且在使用时与水中的过氧源混合。

用于测定过氧羧酸和过氧化氢浓度的方法。

本发明的方法能够使用多种分析方法分析反应物和产物，包括但不限于滴定、高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、质谱(MS)、毛细管电泳(CE)、由U.Karst等人描述的分析方法(Anal.Chem.，69(17)：3623-3627(1997))、以及2，2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸(ABTS)检测分析法(S.Minning等人，Analytica Chimica Acta378：293-298(1999)和WO 2004/058961 A1)，如美国专利公开申请公布2008/0176783所述。

确定过氧羧酸的最低生物杀灭浓度

可以用J.Gabrielson等人(J.Microbiol.Methods 50：63-73(2002))所述的方法确定过氧羧酸或过氧化氢与酶底物的最低生物杀灭浓度(MBC)。该检测分析法基于XTT还原抑制，其中XTT((2，3-双[2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基]-5-[(苯基氨基)羰基]-2H-四唑翁内盐，单钠盐)是氧还染料，该染料通过在490nm或450nm测量的光密度(OD)变化指示微生物呼吸活性。然而，有多种其他方法可用于测量消毒剂和防腐败剂的活性，包括但不限于活体平板计数、直接显微镜计数、干重、浊度测量、吸光度和生物发光(参见例如Brock，Semour S.，Disinfection， Sterilization，and Preservation，第5版，Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia，PA，USA；2001)。

酶法制备的过氧羧酸组合物的用途

根据本发明的方法用酶催化剂产生的过氧羧酸生产可用于多种硬质表面/无生命物体以减少生物污染，例如消毒医疗设备(如内窥镜)、织物(如衣服、地毯)、食品制备表面、食品贮藏和食品包装设备、用于食物产品包装的材料、鸡孵卵和生长设施、畜栏、以及具有微生物和/或病毒活性的水处理过程。酶促生产的过氧羧酸可用于设计灭活朊病毒的制剂(例如某些蛋白酶)以附加地提供生物杀灭活性。在一个优选的方面，本发明的过氧羧酸组合物尤其适合用作非高压灭菌医疗器械和食品包装设备的消毒剂。由于含过氧羧酸的制剂可以用GRAS或食品级组分(酶、酶底物、过氧化氢和缓冲液)制备而得，因此酶催化法产生的过氧羧酸也可用于动物尸体、肉、水果和蔬菜的消毒，或用于预制食品的消毒。可将酶促生产的过氧羧酸掺入最终形式是粉末、液体、薄膜、固体或气溶胶的产品。可以将酶催化法产生的过氧羧酸稀释至仍能提供有效消毒的浓度。

可以使用包含有效浓度的过氧羧酸的组合物，通过使表面或物体与通过本发明方法制备的产品接触，对受生物污染物污染(或怀疑被污染)的表面和/或物体进行消毒。如本文所用，“接触”是指使包含有效浓度的过氧羧酸的消毒组合物与怀疑被生物污染物污染的表面或无生命物体接触一段足以达到清洁和消毒效果的时间。接触包括通过喷洒、处理、浸入、冲洗、倾注、混合、组合、涂抹、涂覆、施加、粘附以及其他方式，使包含有效浓度的过氧羧酸的过氧羧酸溶液或组合物，或者可形成有效浓度的过氧羧酸的溶液或组合物与怀疑被一定浓度的生物污染物污染的表面或无生命物体相连。可以将消毒组合物与清洁组合物结合在一起，以同时提供清洁和消毒功能。作为另外一种选择，可以将清洁剂(如表面活性剂或脱色剂)掺入制剂中，以通过单一组合物同时提供清洁和消毒功能。

包含有效浓度的过氧羧酸的组合物也可包含至少一种附加的抗微生物剂、朊病毒降解蛋白酶、杀病毒剂、杀孢子剂、或生物杀灭剂的组合。当将这些药剂与通过受权利要求书保护的方法制备的过氧羧酸的组合用于对被生物污染物污染(或怀疑被污染)的表面和/或物体进行清洁和消毒时，可以提供增强和/或协同效应。合适的抗微生物剂包括羧酸酯(例如对-羟基烷基苯甲酸盐和烷基肉桂酸酯)、磺酸(例如十二烷基苯磺酸)、碘代化合物或活性卤素化合物(例如卤素单质、卤素氧化物(如NaOCl、HOCl、HOBr、ClO₂)、碘、卤间化合物(例如一氯化碘、二氯化碘、三氯化碘、四氯化碘、一氯化溴、一溴化碘或二溴化碘)、多卤化物、次氯酸盐、次氯酸、次溴酸盐、次溴酸、氯代-和溴代-乙内酰脲、二氧化氯、以及亚氯酸钠)、有机过氧化物包括过氧化苯甲酰、烷基过氧化苯甲酰、臭氧、单重态氧发生器、以及它们的混合物、苯酚衍生物(例如邻-苯基苯酚、邻-苯甲基-对-氯酚、叔-戊醇酚和C₁-C₆烷基羟基苯甲酸盐)、季铵盐化合物(例如烷基苄基二甲基氯化铵、二烷基二甲基氯化铵以及它们的混合物)、以及此类抗微生物剂的混合物，其量足以提供期望的微生物防护程度。抗微生物剂的有效量包括约0.001重量％至约60重量％的抗微生物剂，约0.01重量％至约15重量％的抗微生物剂，或约0.08重量％至约2.5重量％的抗微生物剂。

在一个方面，当将用本发明方法形成的过氧羧酸施用到某场所上和/或某场所处时，可用于降低活生物污染物(如活微生物群体)的浓度。如本文所用，“场所”包括适于进行消毒或漂白的部分或全部目标表面。目标表面包括有可能被生物污染物污染的所有表面。非限制性实例包括存在于食品或饮料工业中的设备表面(例如罐、传送机、地面、排水沟、冷却器、冷冻机、设备表面、墙面、阀门、束带、管道、排水沟、接头、裂缝、以及它们的组合等)；建筑表面(例如墙面、地面和窗户)；非食品工业相关的管道和排水沟，包括水处理设施、水池和矿泉池、以及发酵罐；医院或兽医院表面(如墙面、地面、床、设备(例如内窥镜)、医院/兽医院或其他保健机构中穿着的衣服，包括衣服、洗擦布、鞋子和其他医院或兽医院表面)；餐馆表面；浴室表面；盥洗室；衣服和鞋子；谷仓或畜栏表面，例如家禽、牛、乳牛、山羊、马和猪的畜栏；家禽或虾的孵卵处；以及药物或生物药物表面(例如药物或生物药物制造设备、药物或生物药物成分、药物或生物药物赋形剂)。附加的硬质表面也包括食物产品，例如牛肉、禽肉、猪肉、蔬菜、水果、海产品、它们的组合等。场所还可以包括吸水材料，如被污染的亚麻布或其他织物。场所也包括收获的植物或植物产品，包括种子、球茎、块茎、果实和蔬菜、生长的植物、尤其是作物生长植物、包括谷类食物、叶片蔬菜和色拉作物、根用蔬菜、豆类、浆果果实、柑橘类水果和坚果。

硬质表面材料的非限制性实例是金属(例如钢、不锈钢、铬、钛、铁、铜、黄铜、铝、以及它们的合金)、矿物质(例如混凝土)、聚合物和塑料(例如聚烯烃，如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚(甲基)丙烯酸酯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚丙烯腈丁二烯苯乙烯、聚(丙烯腈、丁二烯)、丙烯腈丁二烯；聚酯如聚对苯二甲酸乙二醇酯；和聚酰胺如尼龙)。附加表面包括砖块、瓷砖、陶瓷、瓷器、木质(地板)、聚乙烯树脂(地板)、油毡和地毯。

可使用通过本发明方法形成的过氧羧酸为织物提供有益效果，包括但不限于漂白、去污和除臭。用本发明方法形成的过氧羧酸可用于许多衣物洗涤护理产品，包括但不限于织物预洗处理剂、衣物洗涤剂、去污剂、漂白组合物、除臭组合物和清洗剂。

重组微生物的表达

本发明序列的基因和基因产物可在异源宿主细胞尤其是微生物宿主细胞中生产。用于表达本发明基因和核酸分子的优选异源宿主细胞为微生物宿主，所述微生物宿主可在真菌或细菌家族中找到并且其可在广泛的温度、pH值和溶剂耐受性下生长。例如，预期任何细菌、酵母和丝状真菌可为表达本发明核酸分子的合适宿主。过水解酶可在细胞内、细胞外、或细胞内和细胞外组合表达，其中细胞外表达细胞外表达比细胞内表达能够从发酵产物中更容易地回收期望蛋白。转录、翻译和蛋白生物合成设备相对于用于生成细胞生物质的细胞原料保持不变；无论如何将表达功能基因。宿主菌株的实例包括但不限于细菌、真菌或酵母物种例如曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、糖酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、红发夫酵母属(Phaffia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、耶氏酵母属(Yarrowia)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、农杆菌属(Agrobacterium)、赤细菌属(Erythrobacter)、绿菌属(Chlorobium)、着色菌属(Chromatium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、噬纤维菌属(Cytophaga)、红细菌属(Rhodobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacteria)、分支杆菌属(Mycobacterium)、异常球菌属(Deinococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基细菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基弯菌属(Methylosinus)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、产碱菌属(Alcaligenes)、集胞蓝细菌属(Synechocystis)、聚球蓝细菌属(Synechococcus)、鱼腥蓝细菌属(Anabaena)、硫杆菌属(Thiobacillus)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和粘球菌属(Myxococcus)。在一个实施方案中，细菌宿主菌株包括埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、以及假单胞菌属(Pseudomonas)。在一个优选的实施方案中，细菌宿主细胞是大肠杆菌。

工业生产

多种培养方法可用来生产过水解酶催化剂。例如，从重组微生物宿主中大规模生产特定基因产物可通过分批和连续培养方法进行。分批培养和补料分批培养方法在本领域内是常用的且众所周知，并且实例可见干如下文献：Thomas D.Brock，Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第二版，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA(1989))，以及Deshpande，Mukund V.，(Appl.Biochem.Biotechnol.，36：227(1992)。

所需过水解酶催化剂的商业生产也可用连续培养的方法实现。连续培养是开放式系统，其中将成分确定的培养基连续加入生物反应器中，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续培养一般使细胞维持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高液相密度。或者，连续培养可以用固定化细胞来进行，其中连续添加碳和营养素，并且连续从细胞团块中取出有价值的产物、副产物或废弃物。细胞固定可使用范围广泛的固体支持体进行，所述固体支持体由天然材料和/或合成材料组成。

可通过本领域的技术人员已知的任何方法实现从分批或分批补料发酵或连续培养中回收所需过水解酶催化剂。例如，当酶催化剂是细胞内产生时，可通过离心或膜过滤从培养基分离细胞沉淀物，任选地可用水或所需pH的含水缓冲液洗涤，然后将所需pH的含水缓冲液中的细胞沉淀物的悬浮液混匀以产生含有所需酶催化剂的细胞提取物。细胞提取物可任选地通过合适的助滤剂例如硅藻土或二氧化硅过滤来去除细胞残片，然后进行热处理步骤，将不需要的蛋白质从酶催化剂溶液中沉淀出。然后通过膜过滤或离心将包含所需酶催化剂的溶液从沉淀的细胞残片和蛋白质分离，并且所得的部分纯化的酶催化剂溶液通过额外的膜过滤浓缩，然后任选地与合适的载体(例如，麦芽糖糊精、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或其混合物)混合并喷雾干燥以产生包含所需酶催化剂的固体粉末。

当数量、浓度或其他数值或参数以范围、优选范围或优选上限数值和优选下限数值的列表形式给出时，其应理解为具体地公开由任何范围上限或优选数值和任何范围下限或优选数值的任何一对所构成的所有范围，而不管所述范围是否被单独地公开。除非另外指明，凡在本文中给出某一数值范围之处，该范围均旨在包含其端点，以及位于该范围内的所有整数和分数。当定义一个范围时，不旨在将范围限定于所列举的具体数值。

一般方法

提供以下实施例来说明优选实施方案。本领域的技术人员应认识到下文实施例中公开的技术代表本发明人发现的在本文所公开方法的实施中功能良好的技术，因此可认为其构成实施的优选模式。然而，本领域的技术人员应依据本发明理解的是，在不背离本发明所公开方法的实质和范围的情况下，可对所公开的具体实施方案进行许多更改并仍能获得相同或相似的结果。

所有试剂和材料获取自DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)、TCI America(Portland，OR)、RocheDiagnostics Corporation(Indianapolis，IN)或Sigma-Aldrich ChemicalCompany(St.Louis，MO)，除非另外指明。

说明书中的以下缩写对应于测量、技术、性能或化合物单位如下：“sec”或“s”指秒，“min”指分钟，“h”或“hr”指小时，“μL”指微升，“mL”指毫升，“L”指升，“mM”指毫摩尔，“M”指摩尔，“mmol”指毫摩尔，“ppm”指百万分之一或几，“wt”指重量，“M％”指重量百分比，“g”指克，“μg”指微克，“ng”指纳克，“g”指重力，“HPLC”指高效液相色谱，“dd H₂O”指蒸馏并去离子水，“dcw”指干细胞重量，“ATCC”或“

”指美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，VA)，“U”指过水解酶活性单位，“rpm”指每分钟转数，“EDTA”指乙二胺四乙酸。

HPLC方法：

Supelco Discovery C8柱(10-cm×4.0-mm，5μm)(目录号569422-U)，带Supelco Supelguard Discovery C8预柱(Sigma-Aldrich；目录号59590-U)；10微升注射体积；采用CH₃CN(Sigma-Aldrich；#270717)和去离子水以1.0mL/min，以及环境温度的梯度方法：

实施例1

构建katG过氧化氢酶破坏的大肠杆菌菌株

通过PCR(94℃下0.5分钟，55℃下0.5分钟，70℃下1分钟，30个循环)用标识为SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的引物从质粒pKD13(SEQ ID NO：10)扩增卡那霉素抗性基因(kan；SEQ ID NO：9)，以生成标识为SEQ ID NO：13的PCR产物。katG核酸序列以SEQ ID NO：14提供，并且相应的氨基酸序列为SEQ ID NO：15。大肠杆菌MG1655(

47076^TM)采用温敏质粒pKD46(SEQ ID NO：16)进行转化并于30℃在LB-amp平板上培养24小时以进行筛选，该质粒包含λ-Red重组酶基因(Datsenko和Wanner，2000，PNAS USA 97：6640-6645)。MG1655/pKD46采用50-500ng的PCR产物通过电穿孔(BioRad GenePulser，0.2cm电击杯，2.5kV，200W，25μF)进行转化并于37℃在LB-kan平板上培养24小时以进行筛选。将几个菌落划线于LB-kan平板上并在42℃下培养过夜以修复pKD46质粒。对菌落进行检查以确定kanR/ampS的表型。基因组DNA使用

DNA纯化系统(Gentra Systems，Minneapolis，MN)分离自多个菌落，并且通过PCR检查以确认katG基因的破坏，所述PCR使用标识为SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的引物。多个katG破坏的菌株用温敏质粒pCP20(SEQ ID NO：19)进行转化，所述质粒包含FLP重组酶，用于切除kan基因，并且于37℃下在LB-amp平板上选择24小时。将几个菌落划线于LB平板上并在42℃下培养过夜以修复pCP20质粒。对两个菌落进行检查以确定kanS/ampS的表型，并且将这两个菌落称为MG1655 KatG1和MG1655 KatG2。

实施例2

构建katE过氧化氢酶破坏的大肠杆菌菌株

通过PCR(94℃下0.5分钟，55℃下0.5分钟，70℃下1分钟，30个循环)用标识为SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21的引物从质粒pKD 13(SEQ ID NO：10)扩增卡那霉素抗性基因(SEQ ID NO：9)，以生成标识为SEQ ID NO：22的PCR产物。katE核酸序列以SEQ ID NO：23提供，并且相应的氨基酸序列为SEQ ID NO：24。大肠杆菌MG1655(

47076^TM)采用温敏质粒pKD46(SEQ ID NO：16)进行转化并于30℃在LB-amp平板上培养24小时以进行筛选，该质粒含有λ-Red重组酶基因。MG1655/pKD46采用50-500ng的PCR产物通过电穿孔(BioRad GenePulser，0.2cm电击杯，2.5kV，200W，25μF)进行转化并于37℃在LB-kan平板上培养24小时以进行筛选。将几个菌落划线于LB-kan平板上并在42℃下培养过夜以修复pKD46质粒。对菌落进行检查以确定kanR/ampS的表型。基因组DNA使用

DNA纯化系统(Gentra Systems，Minneapolis，MN)分离自多个菌落，并且通过PCR检查以确认katE基因的破坏，所述PCR使用标识为SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的引物。多个katE破坏的菌株用温敏质粒pCP20(SEQ ID NO：19)进行转化，所述质粒包含FLP重组酶，用于切除kan基因，并且于37℃下在LB-amp平板上选择24小时。将几个菌落划线于LB平板上并在42℃下培养过夜以修复pCP20质粒。对两个菌落进行检查以确定kanS/ampS的表型，并且将这两个菌落称为MG1655 KatE1和MG1655 KatE2

实施例3

构建katG过氧化氢酶和katE过氧化氢酶破坏的大肠杆菌菌株 (KLP18)

通过PCR(94℃下0.5分钟，55℃下0.5分钟，70℃下1分钟，30个循环)用标识为SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21的引物从质粒pKD13(SEQ ID NO：10)扩增卡那霉素抗性基因(SEQ ID NO：9)，以生成标识为SEQ ID NO：22的PCR产物。大肠杆菌MG1655 KatG1(实施例1)采用温敏质粒pKD46(SEQ ID NO：16)进行转化并于30℃在LB-amp平板上培养24小时以进行筛选，该质粒包含λ-Red重组酶基因。MG1655KatG1/pKD46采用50-500ng的PCR产物通过电穿孔(BioRad GenePulser，0.2cm电击杯，2.5kV，200W，25μF)进行转化并于37℃在LB-kan平板上培养24小时以进行筛选。将几个菌落划线于LB-kan平板上并在42℃下培养过夜以修复pKD46质粒。对菌落进行检查以确定kanR/ampS的表型。基因组DNA使用

DNA纯化系统分离自多个菌落，并且通过PCR检查以确认katE基因的破坏，所述PCR使用标识为SEQID NO：25和SEQ ID NO：26的引物。多个katE破坏的菌株(ΔkatE)用温敏质粒pCP20(SEQ ID NO：19)进行转化，所述质粒包含FLP重组酶，用于切除kan基因，并且于37℃下在LB-amp平板上选择24小时。将几个菌落划线于LB平板上并在42℃下培养过夜以修复pCP20质粒。对两个菌落进行检查以确定kanS/ampS的表型，并且将这两个菌落称为MG1655KatG1KatE18.1和MG1655 KatG1KatE23。MG1655KatG1KatE18.1称为大肠杆菌KLP18。

实施例4

克隆并表达来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)

的过水解酶编码来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，在

(登录号ABX75634.1)中报告的乙酰木聚糖酯酶的基因用经优化以在大肠杆菌(DNA 2.0，Menlo Park，California)中表达的密码子合成。随后通过PCR(94℃下0.5分钟，55℃下0.5分钟，70℃下1分钟，30个循环)扩增所述基因，所述PCR使用标识为SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的引物。将所得核酸产物(SEQ ID NO：29)亚克隆到pTrcHis2-

(Invitrogen，Carlsbad CA)中以生成标识为pSW229(SEQ ID NO：30)的质粒。质粒pSW229用于转化大肠杆菌KLP18(过氧化氢酶双敲除；实施例3)以生成标识为KLP18/pSW229的菌株。KLP18/pSW229在37℃在LB培养基中振荡培养至OD_600nm＝0.4-0.5，此时加入IPTG至终浓度为1mM并继续孵育2-3小时。离心收集细胞并进行SDS-PAGE以确定过水解酶的表达量占可溶性总蛋白的10-20％。

实施例5

克隆并表达来自百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)的过水解酶

编码来自百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)，在

(登录号BAB53179.1)中报告的乙酰木聚糖酯酶的基因用经优化以在大肠杆菌(DNA 2.0)中表达的密码子合成。随后通过PCR(94℃下0.5分钟，55℃下0.5分钟，70℃下1分钟，30个循环)扩增所述基因，所述PCR使用标识为SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32的引物。将所得核酸产物(SEQ ID NO：33)亚克隆到pTrcHis2-

(Invitrogen)中以生成标识为pSW231(SEQ ID NO：34)的质粒。质粒pSW231用于转化大肠杆菌KLP18(过氧化氢酶双敲除；实施例3)以生成标识为KLP18/pSW231的菌株。KLP18/pSW231在37℃在LB培养基中振荡培养至OD_600nm＝0.4-0.5，此时加入IPTG至终浓度为1mM并继续孵育2-3小时。离心收集细胞并进行SDS-PAGE以确定过水解酶的表达量占可溶性总蛋白的10-20％。

实施例6

克隆并表达来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的过水解酶

编码来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)，在

(登录号AAF70202.1)中报告的乙酰木聚糖酯酶的基因用经优化以在大肠杆菌(DNA 2.0)中表达的密码子合成。随后通过PCR(94℃下0.5分钟，55℃下0.5分钟，70℃下1分钟，30个循环)扩增所述基因，所述PCR使用标识为SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36的引物。将所得核酸产物(SEQ ID NO：37)亚克隆到pTrcHis2-

(Invitrogen)中以生成标识为pSW236(SEQ ID NO：38)的质粒。质粒pSW236用于转化大肠杆菌KLP18(过氧化氢酶双敲除)以生成标识为KLP18/pSW236的菌株。KLP18/pSW236在37℃在LB培养基中振荡培养至OD_600nm＝0.4-0.5，此时加入IPTG至终浓度为1mM并继续孵育2-3小时。离心收集细胞并进行SDS-PAGE以确定过水解酶的表达量占可溶性总蛋白的10-20％。

实施例7

乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(Lla)过水解酶，KLP18/pSW229

制备表达乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(Lla)过水解酶的菌株KLP18/pSW229并在摇瓶培养基中生长，所述培养基中掺入IPTG以诱导过水解酶表达(实施例4)。通过使在50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中的20重量％的细胞悬浮液两次通过在16,000psi(～110.32MPa)下运行的French细胞压榨机制备收获细胞浆液的提取物。然后在20,000×g(5℃)下离心提取物以除去细胞碎片并随后将所有提取物分成等分试样，然后贮藏在-80℃。然后将澄清提取物的两个250μL等分试样在65℃或75℃下加热20分钟，随后在冰浴中冷却。然后在14,000rpm下将热处理过的提取物离心以除去热沉淀的蛋白质。然后按照制造商的说明书对澄清的、热处理的提取物进行BCA测定(用于蛋白测定的Bicinchoninic Acid Kit，Sigma目录号BCA1-KT；Sigma Aldrich，St.Louis，MO)以测定热处理之前和之后的蛋白质浓度。结果示于下表4中。

表4：KLP18/pSW229 BCA测定结果

样品	[蛋白质]mg/mL	％回收
			预热	21.4	100
65℃	8.9	42
			75℃	2.2	10.3

进行SDS-PAGE以评估乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)过水解酶占可溶性总蛋白的百分比。预热的、65℃热处理的和75℃热处理的提取物的蛋白载量为15μg/泳道。65℃热处理的样品具有85-90％的预计纯度。在75℃下热处理20分钟导致澄清提取物中的过水解酶蛋白质消失。

为了测定比活性，使用甘油三乙酸酯(250mM)、过氧化氢(1000mM)、磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.2)和或者15μg/mL的65℃澄清提取蛋白或者20μg/mL的75℃热处理的澄清提取蛋白进行反应。所述反应在1、2、3、4和5分钟时取样，然后用Karst衍生化规程(Karst等人，同上)进行分析；移出反应混合物的等分试样(0.040mL)并与0.960mL的5mM磷酸水溶液混合；调节稀释样品的pH至小于pH 4，紧接着终止反应。所得溶液使用

MC-过滤单位(30,000Normal Molecular Weight Limit(NMWL)，Millipore目录号UFC3LKT00)，通过在12,000rpm离心2分钟进行过滤。将所得滤液的等分试样(0.100mL)转移到1.5-mL螺帽HPLC小瓶(Agilent Technologies，PaloAlto，CA；#5182-0715)中，所述小瓶中包含0.300mL去离子水，然后加入0.100mL在乙腈中的20mM的MTS(甲基-对-甲苯硫醚)，给小瓶拧上螺帽，将内容物短暂混合，然后在大约25℃避光孵育10分钟。然后向每个小瓶中加入0.400mL的乙腈和0.100mL的三苯基膦(TPP，40mM)的乙腈溶液，再次盖上小瓶，混合所得溶液并在大约25℃避光孵育30分钟。然后向每个小瓶加入0.100mL的10mM的N，N-二乙基-间甲苯甲酰胺(DEET；HPLC外标)并用HPLC分析所得溶液。

也进行不加入过水解酶的对照反应以评估化学过水解的相对速率。包含65℃热处理蛋白的反应在1分钟内产生1100ppm的PAA，并且在2、3、4、或5分钟不产生更多的PAA。包含75℃热处理蛋白的反应相对于无酶对照反应未产生显著浓度的PAA。

实施例8

百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)过水解酶(Mlo； KLP18/pSW231)

制备表达百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)过水解酶的菌株KLP18/pSW231并在摇瓶培养基中生长，所述培养基中掺入IPTG以诱导过水解酶表达(实施例5)。然后使用包含1mM二硫苏糖醇的50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)制备20重量％的细胞悬浮液。然后均匀的细胞悬浮液两次通过在16,000psi(～110.32MPa)下运行的French细胞压榨机。然后粗制提取物在20,000×g(5℃)下离心25分钟以除去细胞碎片。然后将所述提取物等分到多个Eppendorf测试管中，每管包含250μL提取物。然后在65℃或75℃将这些提取物中的两个加热20分钟。在每次热处理后，在14,000rpm下离心后除去每个样品的热沉淀蛋白。然后进行Bradford测定(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)以测定样品热处理之前和之后的蛋白浓度。结果示于表5中。

表5：KLP18/pSW231 Bradford测定结果

样品	[蛋白质]mg/mL	％蛋白回收
			预热	17.6	100
65℃加热后	3.2	18.2
			75℃加热后	1.3	7.3

进行SDS-PAGE以评估过水解酶纯度。标识为百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)过水解酶的过水解酶条带在或者65℃或者75℃热处理提取物后消失，指示百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)过水解酶在这些温度下变性。澄清的、未加热的提取物的SDS-PAGE指示低水平的过水解酶表达(大约5％的可溶性总蛋白)。为了测定过水解酶比活性，进行包含甘油三乙酸酯(250mM)、过氧化氢(1000mM)、磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.2)和澄清提取物未加热蛋白(100μg/mL)的反应。在五分钟内每分钟对反应(25℃)取样。使用Karst衍生化规程(Karst等人，同上)，然后通过HPLC分析样品的过乙酸(PAA)产量。比活性为3.9U/mg。

使用第二摇瓶生长规程以改善Mlo过水解酶的表达。所述规程包括在包含10mL培养基的125-mL一次性挡板瓶中的种子期，以及在每个包含250mL培养基的两个1-L挡板瓶中的生产期。种子瓶中的培养基包含酵母提取物(Difco，5.0g/L)，K₂HPO₄(10.0g/L)，KH₂PO₄(7.0g/L)，二水合柠檬酸钠(1.0g/L)，(NH₄)₂SO₄(4.0g/L)和柠檬酸铁铵(0.10g/L)。将培养基的pH调节到6.8，并且使培养基通过0.2微米的过滤器过滤除菌。除菌后加入葡萄糖5g/L，痕量元素溶液(5mL/L)，MgSO₄(5mM)和氨苄青霉素(50μg/mL)。痕量元素溶液包含一水合柠檬酸(10g/L)，MnSO₄水合物(2g/L)，NaCl(2g/L)，FeSO₄七水合物(0.5g/L)，ZnSO₄七水合物(0.2g/L)，CuSO₄五水合物(0.02g/L)和NaMoO₄二水合物(0.02g/L)。用1mL冷冻原液接种种子瓶并孵育至7OD₅₅₀。在37℃和300rpm的培养振荡器中培养种子和生产瓶。生产瓶的培养基与种子瓶相同，不同的是酵母提取物的浓度降低至2g/L。每个生产瓶用7mL种子培养物接种。在约3OD₅₅₀加入IPTG至浓度为0.1mM，然后继续培养12小时，其中继续生长至约9OD。离心收获细胞，并且在-80℃冷冻细胞沉淀物用于进一步加工。从如上所述的这种收获细胞浆液中制备提取物。基于SDS-PAGE凝胶，预测过水解酶占总可溶性澄清提取蛋白大约10％。使用Karst衍生化规程(Karst等人，同上)，然后通过HPLC分析测定比活性，并且所述比活性为3.6U/mg蛋白。

实施例9

嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)(Gst； KLP18/pSW236)：过水解酶评估

嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)(Gst；KLP18/pSW236)在摇瓶中生长并诱导，随后如上所述制备提取物(实施例7)。然后在或者65℃或者75℃加热提取物样品(250μL)20分钟，随后离心以除去热沉淀的蛋白质。进行SDS-PAGE以预计加热澄清的和未加热澄清的提取物的过水解酶纯度。基于SDS-PAGE凝胶，预计过水解酶占未加热和加热(75℃)提取物的可溶性蛋白的小于5％。预计在澄清提取物中65℃热处理的过水解酶占可溶性总蛋白的15-20％。

在反应(25℃)后测定比活性，所述反应包含TA(250mM)，过氧化氢(1000mM)，磷酸钾缓冲液(50mM，pH 7.2)和100μg/mL澄清的、未加热或热处理(65℃)的提取蛋白。进行五分钟的反应以及1分钟的取样，然后进行Karst衍生化规程(Karst等人，同上)和HPLC分析。比活性经测定为4.4U/mg未加热蛋白和3.3U/mg热处理蛋白。如果嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)过水解酶是热稳定的，预计热处理蛋白的比活性将高于未加热蛋白的比活性。澄清的、热处理的提取蛋白的比活性低于澄清的、未加热的提取蛋白的比活性，指示过水解酶在65℃仅是适度稳定的。

实施例10

使用来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的过水解酶制备过乙酸

制备表达来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(KLP18/pSW229)过水解酶的转化体的细胞提取物(实施例7)。然后以20,000×g和5℃下离心粗提取物以去除细胞碎片，得到澄清的细胞提取物，对所得提取物进行可溶性总蛋白的分析(二喹啉甲酸法蛋白浓度测定试剂盒，Sigma-Aldrich，目录号BCA1-KT)。在65℃加热澄清提取物20分钟，随后立即在冰/水浴中冷却。离心所得混合物以除去沉淀蛋白，并且收集澄清的热处理细胞提取物并如前述测定可溶性总蛋白。经热处理的澄清细胞提取物的SDS-PAGE显示过水解酶达到至少85-90％的纯度。如前述测定澄清的热处理细胞提取物的可溶性总蛋白，在干冰中冷冻并贮存在-80℃。

在24℃下，在包含甘油三乙酸酯、过氧化氢和来自热处理的离心细胞提取物(8.8mg/mL)(如上所述制备)的50μg/mL总蛋白的50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2)或50mM碳酸氢钠缓冲液(pH 8.5)中进行反应(2mL总体积)。每个反应条件进行对照反应以测定在不加入提取蛋白的情况下通过过氧化氢化学过水解甘油三乙酸酯制备的过乙酸的浓度。反应混合物中的过乙酸浓度根据如实施例7所述的Karst等人的方法进行测定。表6列出了在1分钟、5分钟和30分钟时在50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2)中产生的过乙酸浓度，表7列出了在相同时间在50mM碳酸氢钠缓冲液(pH 8.5)中产生的过乙酸浓度。由乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)过水解酶产生的过乙酸浓度在反应5分钟至30分钟后不再显著提高，而由百脉根中慢生根瘤菌(M loti)、嗜热脂肪芽孢杆菌(G.stearothermophilus)、那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)、海栖热袍菌(T.maritima)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和短小芽孢杆菌(B.pumilus)过水解酶在相似条件下产生的过乙酸浓度通常在反应5分钟后继续提高(参见下文实施例11-15)。

表6：过乙酸(PAA)浓度对甘油三乙酸酯(TA)、过氧化氢和来自澄清热处理(65℃)细胞提取物的总蛋白，所述细胞提取物从表达来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的过水解酶(大肠杆菌KLP18/pSW229)的转化体中制备；磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.2)的浓度的依赖性

表7：过乙酸(PAA)浓度对甘油三乙酸酯(TA)、过氧化氢和来自澄清热处理(65℃)细胞提取物的总蛋白，所述细胞提取物从表达来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的过水解酶(大肠杆菌KLP18/pSW229)的转化体中制备；50mM碳酸氢钠缓冲液(pH 8.5)的浓度的依赖性。

实施例11

使用来自百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)的过水解酶制备过乙酸(对比)

如实施例8所述制备表达来自百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobiumloti)过水解酶(KLP18/pSW231)的转化体的细胞提取物，使用通过用于改善Mlo过水解酶表达的摇瓶生长规程制备的细胞。在干冰中冷冻澄清的、未加热的细胞提取物并贮存在-80℃。

在24℃下，在包含甘油三乙酸酯、过氧化氢和来自澄清的、未加热的离心细胞提取物(22.8mg/mL)(如上所述制备)的500μg/mL总蛋白的50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2)中进行反应(2mL总体积)。进行对照反应，以测定在没有加入提取蛋白的情况下用过氧化氢化学过水解甘油三乙酸酯产生的过乙酸的浓度。反应混合物中的过乙酸浓度根据Karst等人，同上的方法进行测定。表8中列出了在1分钟、5分钟和30分钟时产生的过乙酸浓度。

表8：过乙酸(PAA)浓度对甘油三乙酸酯(TA)、过氧化氢和来自澄清的、未加热的细胞提取物的总蛋白，所述细胞提取物从表达来自百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)的过水解酶(大肠杆菌KLP18/pSW231)的转化体中制备；50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2)的浓度的依赖性

实施例12

使用来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的过水解酶的制备过乙酸(对比)

如实施例9所述制备表达来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)的过水解酶(KLP18/pSW236)的转化体的细胞提取物。在干冰中冷冻澄清的、未加热的细胞提取物并贮存在-80℃。

在24℃下，在包含甘油三乙酸酯、过氧化氢和来自澄清的、未加热的离心细胞提取物(21.4mg/mL(如上所述制备)的500μg/mL总蛋白的50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2)中进行反应(2mL总体积)。每个反应条件进行对照反应以测定在不加入提取蛋白的情况下通过过氧化氢化学过水解甘油三乙酸酯制备的过乙酸的浓度。反应混合物中的过乙酸浓度根据Karst等人，同上的方法进行测定。表9中列出了在1分钟、5分钟和30分钟时产生的过乙酸浓度。

表9：过乙酸(PAA)浓度对甘油三乙酸酯(TA)、过氧化氢和来自澄清的、未加热的细胞提取物的总蛋白，所述细胞提取物从表达来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的过水解酶(大肠杆菌KLP18/pSW236)的转化体中制备；50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2)的浓度的依赖性

实施例13

通过那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)过水解酶制备过乙酸(对比)

表达来自那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)(KLP18/pSW196)的过水解酶的大肠杆菌转化体的细胞提取物通过如下方式制备：将50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)(包含二硫苏糖醇(1mM))中的细胞沉淀物(20重量％细胞湿重)的悬浮液两次经过工作压力为16,000psi(约110MPa)的弗氏压碎器。然后以20,000×g离心粗提取物以去除细胞碎片，得到澄清的细胞提取物，对所得提取物进行可溶性总蛋白的分析(二喹啉甲酸法蛋白浓度测定试剂盒，Sigma Aldrich)。在75℃加热澄清提取物20分钟，随后立即在冰/水浴中冷却。离心所得混合物以除去沉淀蛋白，并且收集澄清的热处理细胞提取物并如前述测定可溶性总蛋白。经热处理的澄清细胞提取物的SDS-PAGE显示过水解酶达到至少90％的纯度。在干冰中冷冻澄清的、热处理的细胞提取物并贮存在-80℃。

在25℃下，在包含甘油三乙酸酯、过氧化氢和50μg/mL澄清的、热处理的细胞提取物(如上所述制备)的25mM碳酸氢盐缓冲液(初始反应pH约8.1)中进行反应(10mL总体积)。每个反应条件进行对照反应以测定在不加入提取蛋白的情况下通过过氧化氢化学过水解甘油三乙酸酯制备的过乙酸的浓度。反应混合物中过酸浓度的测定根据Karst等人，同上所述的方法进行。在表10中列出了当使用或者250mM或者100mM过氧化氢时，在1分钟、5分钟和30分钟时产生的过乙酸浓度。

实施例14

通过海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8过水解酶制备过乙酸(对比)

表达来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8(KLP18/pSW207)的过水解酶的大肠杆菌转化体的细胞提取物通过如下方式制备：将0.05M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)(包含二硫苏糖醇(1mM))中的细胞沉淀物(20重量％细胞湿重)的悬浮液两次经过工作压力为16,000psi(约110MPa)的弗氏压碎器。然后以20,000×g离心粗提取物以去除细胞碎片，得到澄清的细胞提取物，对所得提取物进行可溶性总蛋白的分析(二喹啉甲酸法蛋白浓度测定试剂盒，Sigma Aldrich)。在75℃加热澄清提取物20分钟，随后立即在冰/水浴中冷却。离心所得混合物以除去沉淀蛋白，并且收集澄清的热处理细胞提取物并如前述测定可溶性总蛋白。经热处理的澄清细胞提取物的SDS-PAGE显示过水解酶达到至少85-90％的纯度。在干冰中冷冻澄清的、热处理的细胞提取物并贮存在-80℃。

在25℃下，在包含甘油三乙酸酯、过氧化氢和澄清的、热处理的细胞提取物(如上所述制备)的25mM碳酸氢钠缓冲液(初始pH约8.1)中进行反应(2mL总体积)。每个反应条件进行对照反应以测定在不加入提取蛋白的情况下通过过氧化氢化学过水解甘油三乙酸酯制备的过乙酸的浓度。反应混合物中过酸浓度的测定根据Karst等人，同上所述的方法进行。在表11中列出了使用或者250mM或者100mM过氧化氢时，在1分钟、5分钟和30分钟时产生的过乙酸浓度。

表11：在25mM碳酸氢盐缓冲液(初始反应pH＝8.1)中，使用包含海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8过水解酶的50μg/mL大肠杆菌KLP18/pSW207热处理提取总蛋白产生的过乙酸(PAA)浓度对时间的依赖性。

实施例15

通过过水解酶制备过乙酸(对比)

通过使在0.05M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中包含二硫苏糖醇(1mM)的细胞浆液悬浮液(20重量％细胞湿重)两次通过在16,000psi(～110MPa)工作压力下运行的French细胞压榨机，制备表达来自短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)PS213(KLP18/pSW195)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8(KLP18/pSW207)、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)(KLP18/pSW196)、或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ATCC 31954^TM(KLP18/pSW194)的过水解酶的转化体细胞提取物。然后以20,000×g离心粗提取物以去除细胞碎片，得到澄清的细胞提取物，对所得提取物进行可溶性总蛋白的分析(二喹啉甲酸法蛋白浓度测定试剂盒，Sigma Aldrich)。在干冰中冷冻上清液并贮存在-80℃。

在25℃下，进行反应(10mL总体积)，所述反应在50mM柠檬酸钠缓冲液(初始pH 7.2或6.5)中包含甘油三乙酸酯、过氧化氢和离心的细胞提取物上清液(如上所述制备)。每个反应条件进行对照反应以测定在不加入提取蛋白的情况下通过过氧化氢化学过水解甘油三乙酸酯制备的过乙酸的浓度(未显示数据)。反应混合物中过酸浓度的测定根据Karst等人，同上所述的方法进行。表13中列出了在1分钟、5分钟和30分钟时产生的过乙酸浓度。

表13：在25℃使用来自大肠杆菌KLP18/pSW195(短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)PS213过水解酶)、大肠杆菌KLP18/pSW207(海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8过水解酶)、大肠杆菌KLP18/pSW196(那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)过水解酶)、或大肠杆菌KLP18/pSW194(枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 31954^TM过水解酶)的50μg/mL提取总蛋白产生的过乙酸(PAA)浓度对柠檬酸钠缓冲液(50mM，初始pH 7.2或6.5)初始反应pH的依赖性。

Claims

1.制备目标浓度的过氧羧酸的方法，包括：

(a)选择一组反应组分，所述反应组分包含：

(1)至少一种底物，所述底物选自：

(i)具有以下结构的酯

[X]_mR₅

其中

X＝式R₆-C(O)O的酯基；

m＝1至R₅中的碳原子数目；并且

其中在25℃下所述酯具有至少5ppm的水中溶解度；

(ii)具有以下结构的甘油酯

(iii)选自乙酰化单糖、乙酰化二糖和乙酰化多糖的乙酰化糖；

(2)过氧源；和

(3)具有过水解活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂包含具有特征基序的酶，使用CLUSTALW将所述特征基序与参考序列SEQ ID NO：2比对，所述特征基序包含：

(i)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置118-120的RGQ基序；

(ii)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置179-183的GXSQG基序；和

(iii)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置298-299的HE基序；

其中所述酶与SEQ ID NO：4具有至少95％的氨基酸同一性；以及

(b)在含水反应下混合所述反应组分以形成反应混合物；从而形成包含酶促产生的过氧羧酸的反应产物；其中

(1)所述反应混合物的pH保持在约6.0至约9.0的范围内；并且

(2)在等于或大于混合所述反应组分后五分钟的反应时间，混合所述反应组分后一分钟产生的过氧羧酸浓度的增加不超过100％。

2.权利要求1的方法，其中在等于或大于混合所述反应组分后30分钟的反应时间，在混合所述反应组分后一分钟产生的过氧羧酸浓度的增加不超过100％。

3.权利要求1的方法，其中在等于或大于混合所述反应组分后五分钟的反应时间，在混合所述反应组分后一分钟产生的过氧羧酸浓度的增加不超过50％。

4.权利要求3的方法，其中在等于或大于混合所述反应组分后五分钟的反应时间，在混合所述反应组分后一分钟产生的过氧羧酸浓度的增加不超过20％。

5.权利要求1的方法，其中通过所述方法产生的过氧羧酸总量不受所述反应混合物中的底物量或过氧量的限制。

6.权利要求1的方法，其中所述反应混合物的pH范围为约6.5至约8.5。

7.权利要求6的方法，其中所述反应混合物的pH范围为约7.0至约8.0。

8.权利要求1的方法，其中所述反应混合物包含至少一种缓冲液。

9.权利要求8的方法，其中所述至少一种缓冲液选自碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠和碳酸氢钾的混合物、磷酸钠、磷酸钾、以及磷酸钠和磷酸钾的混合物。

10.权利要求1的方法，其中所述底物选自：甘油一乙酸酯；甘油二乙酸酯；甘油三乙酸酯；甘油一丙酸酯；甘油二丙酸酯；甘油三丙酸酯；甘油一丁酸酯；甘油二丁酸酯；甘油三丁酸酯；葡萄糖五乙酸酯；木糖四乙酸酯；乙酰化木聚糖；乙酰化木聚糖片段；β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯；三-邻-乙酰基-D-半乳醛；三-邻-乙酰基-葡萄烯糖；1，2-乙二醇；1，2-丙二醇；1，3-丙二醇；1，2-丁二醇；1，3-丁二醇；2，3-丁二醇；1，4-丁二醇；1，2-戊二醇；2，5-戊二醇；1，6-戊二醇；1，2-己二醇；2，5-己二醇；1，6-己二醇的单酯或二酯；丙二醇二乙酸酯；乙二醇二乙酸酯；以及它们的混合物。

11.权利要求1的方法，其中所述产生的过氧羧酸为过乙酸、过丙酸、过丁酸、过乳酸、过乙醇酸、过甲氧基乙酸、过-β-羟基丁酸、或它们的混合物。

12.权利要求1的方法，其中所述酶催化剂为微生物细胞、透化的微生物细胞、微生物细胞提取物、部分纯化的酶或纯化的酶的形式。

13.权利要求1的方法，其中所述酶催化剂缺乏过氧化氢酶活性。

14.权利要求1的方法，还包括以下步骤：(c)使表面或无生命的物体与步骤(b)中产生的过氧羧酸接触，从而将所述表面或所述无生命的物体消毒、脱色、除臭或漂白。

15.权利要求1的方法，还包括以下步骤：(c)使织物与步骤(b)中产生的过氧羧酸接触，从而所述织物获得有益效果。

16.权利要求15的方法，其中所述有益效果选自消毒、漂白、脱色、除臭、以及它们的任何组合。

17.制备目标浓度的过氧羧酸的方法，包括：

(a)选择一组反应组分，所述反应组分包含：

(1)至少一种底物，所述底物选自：

(i)具有以下结构的酯

[X]_mR₅

其中

X＝式R₆-C(O)O的酯基；

m＝1至R₅中的碳原子数目；并且

其中在25℃下所述酯具有至少5ppm的水中溶解度；

(ii)具有以下结构的甘油酯

(2)过氧源；和

(i)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置118-120的RGQ基序；

(ii)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置179-183的GXSQG基序；和

(iii)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置298-299的HE基序；

其中所述酶与SEQ ID NO：4具有至少95％的氨基酸同一性；以及

(b)在含水反应条件下混合所选择组的反应组分以形成反应混合物；从而形成包含酶促产生的过氧羧酸的反应产物；其中

(1)所述含水反应混合物的pH保持在约6.0至约9.0的范围内；并且

(2)在等于或大于混合所述反应组分后30分钟的反应时间，在混合所述反应组分后五分钟产生的过氧羧酸浓度的增加不超过100％。

18.权利要求17的方法，其中在等于或大于混合所述反应组分后30分钟的反应时间，在混合所述反应组分后五分钟产生的过氧羧酸浓度的增加不超过50％。

19.权利要求18的方法，其中在等于或大于混合所述反应组分后30分钟的反应时间，在混合所述反应组分后五分钟产生的过氧羧酸浓度的增加不超过20％。

20.组合物，包含：

(a)一组反应组分，所述反应组分包含：

(1)至少一种底物，所述底物选自：

(i)具有以下结构的酯

[X]_mR₅

其中

X＝式R₆-C(O)O的酯基；

m＝1至R₅中的碳原子数目；并且

其中在25℃下所述酯具有至少5ppm的水中溶解度；

(ii)具有以下结构的甘油酯

(2)过氧源；和

(i)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置118-120的RGQ基序；

(ii)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置179-183的GXSQG基序；和

(iii)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置298-299的HE基序；

(b)在混合(a)的该组反应组分时形成的至少一种过氧羧酸。

21.权利要求20的组合物，其中所述酶催化剂包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：4的酶。

22.试剂盒，包括：

(a)第一隔室，所述第一隔室包含

(1)酶催化剂，所述酶催化剂包含与SEQ ID NO：4具有至少95％的氨基酸同一性的酶；

(2)至少一种底物，所述底物选自：

(i)具有以下结构的酯

[X]_mR₅

其中

X＝式R₆-C(O)O的酯基；

m＝1至R₅中的碳原子数目；并且

其中在25℃下所述酯具有至少5ppm的水中溶解度；

(ii)具有以下结构的甘油酯

(iii)选自乙酰化单糖、乙酰化二糖和乙酰化多糖的乙酰化糖；和

(3)任选的缓冲液；和

(b)第二隔室，所述第二隔室包含

(1)过氧源；

(2)过氧化物稳定剂；和

(3)任选的缓冲液。