CN102895666A

CN102895666A - 化学改性的小分子

Info

Publication number: CN102895666A
Application number: CN2012103982648A
Authority: CN
Inventors: M·D·本特利; T·X·维加斯; R·R·古丁; L·陈; X·赵
Original assignee: Nektar Therapeutics
Current assignee: Nektar Therapeutics; Nektar Therapeutics AL Corp
Priority date: 2003-12-16
Filing date: 2004-12-16
Publication date: 2013-01-30
Anticipated expiration: 2024-12-16
Also published as: CA2758460A1; US20100305147A1; SI1694363T1; CN1925875A; AU2010202277B2; US8034825B2; EP1694363A2; JP4991312B2; CA2549730A1; IL229509A0; LTC1694363I2; NZ594834A; US20050136031A1; HK1146645A1; US7786133B2; FR15C0037I2; AU2004299138A1; WO2005058367A2; HRP20140361T1; EA201000994A3

Abstract

本发明提供化学改性的小分子，具体提供几种通过与取自单分散或双峰水溶性低聚物组合物的一种水溶性低聚物共价结合得到化学改性的小分子药物。本发明的轭合物在以若干给药方法中的任何一种方法给药时，表现出比未与水溶性低聚物结合的小分子药物低的生物膜穿透率。

Description

化学改性的小分子

本申请是申请号为200480041747.6、申请日为2004年12月16日、发明名称为“化学改性的小分子”的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明提供化学改性的小分子及相关方法，经化学改性的小分子与没有经过化学改性的小分子相比具有一定的优势。本文描述的化学改性小分子是有关于和/或应用于药物发现、药物治疗、生理学、有机化学、聚合物化学及其它的领域。

背景技术

近年来，使用蛋白质作为活性剂有了发展，原因是：识别、分离、提纯蛋白质及/或通过重组生产蛋白质的技术有了改进；随着蛋白质组学的出现，人们对蛋白质在生物活体内的作用有了更多的认识；以及化学改性蛋白质的制剂、药物释放载体以及增强其药物代谢动力或药效属性的方法有了改善。

在改善蛋白质的化学改性方法上，采用了聚合物，例如聚（乙二醇）或PEG与蛋白质共价结合的方法来提高循环半衰期，降低免疫原性，及/或减少蛋白水解降解。PEG与蛋白质或其它活性剂共价结合的方法通常称为聚乙二醇化。与PEG共价结合得到改性的注射用蛋白质，一般是通过与分子量较高（通常在约5,000至约40,000道尔顿）的PEG聚合物结合进行改性的。

为了提高药物效用而对较大的分子进行改性，这或许是聚乙二醇化最常见的应用之一。聚乙二醇化也在有限的程度上用来提高水溶性较差的小分子药物的生物利用度和使配制简易化。例如，水溶性聚合物，例如PEG与青蒿酸共价结合物的水溶性得到提高。参见美国第6,461,603号专利。类似地，PEG与三唑基化合物（例如三甲密醇）通过共价结合，后者的水溶性和化学稳定性得以提高。参见国际专利公告WO02/043772。PEG与二吲哚基马来酰亚胺的共价结合被用于提高此类化合物因低水溶性而较差的生物利用度。参见国际专利公告WO03/037384。为了提高水溶性而与小分子药物结合的PEG链大小一般在约500道尔顿至约5000道尔顿之间，具体取决于小分子药物的分子量。

活性剂可通过若干种途径之一给药，包括注射、口服、吸入、经鼻和经皮。由于口服的简易性，口服成为最优选的给药途径之一。口服是小分子药物（即非蛋白质为基础的药物）的最常见给药方法，不但方便，而且与其它给药方法相比，患者往往更愿意依从。不幸的是，许多小分子药物具有一些属性（例如口服生物利用度低），使得口服不可行。溶解和通过各种生物膜选择性扩散所要求的小分子药物属性往往直接与最佳目标吸附和服用所要求的小分子药物属性相冲突。限制小分子药物进入某些器官或组织的主要生物膜是与某些生理屏障（如血脑屏障、血胎盘屏障和血睾丸屏障）相关的膜。

血脑屏障保护大脑，防止大多数毒素的侵入。称为星细胞的专门细胞具有许多小支脉，这些支脉构成毛细管内皮与大脑神经细胞之间的屏障。星细胞壁上的脂质以及相邻内皮细胞之间非常紧密的接合限制了水溶性分子的通行。尽管血脑屏障允许基本营养物质通行，但屏障有效地切断了一些外来物质的通行，能够降低其它物质进入脑组织的比例。

胎盘屏障保护正在发育的、敏感的胎儿，防止母体循环中可能存在的毒素的侵入。这种屏障由胎盘内母体循环脉管和胎儿循环脉管之间的多个细胞层组成。细胞膜上的脂质限制了水溶性毒素的扩散。其它物质，如营养素、气体和发育中的胎儿产生的废物，却可以通过胎盘屏障。和血脑屏障一样，胎盘屏障虽然并非完全不能穿透，却能有效地降低了许多毒素由母体向胎儿扩散。

对于许多口服的药物，渗透穿过某些生物膜（如血脑屏障或血胎盘屏障）是应该极力防止的，因为这可能导致严重的副作用，如神经中毒、失眠、头痛、精神错乱、恶梦或胎儿畸形。这些副作用，严重时，会中断药物的发展，出现我们要防止的大脑或胎盘吸收。因此，需要新的给药方法，不但可有效地给患者用药，尤其小分子药物，而且还能减少小分子药物的不良性和常常有毒的副作用。具体而言，需要改进给药方法，能够在良好口服生物利用度、生物活性和药物代谢动力特征之间找到一个最佳的平衡。本发明正好满足这一点和其它需求。

发明内容

发明概述

本发明依据的基础是具有独特性（如较低的生物膜穿透率）的化学改性小分子药物的开发和发现，以及这些药物的制备和给药方法。

一方面，本发明提供了包含单分散或双峰轭合的组合物，每种轭合物均包含从通过稳定键联结与水溶性低聚物共价结合的小分子药物上得到的一部分。低聚物优选地取自单分散（即，单分子）或双峰、甚至是三峰或四峰组合物。由单分散低聚物组合物配制而成的轭合物称单分散轭合物，由双峰低聚物组合物配制而成的轭合物称为双峰轭合物，依此类推。

有利的是，水溶性的低聚物，当与小分子药物结合时，能有效地降低穿过某些生物膜（例如：与血脑屏障或血胎盘屏障相关的膜）的能力。在一项或多项具体实施方案中，提供了一个轭合物，其表现出的生物膜穿透率较未与水溶性低聚物结合的小分子药物低。

轭合物一般可以描述为具有O-X-D结构，其中O对应水溶性低聚物，X对应稳定的键联结，D对应从小分子药物上得到的一部分。

在一项或多项具体实施方案中，小分子药物是口服可生物利用的。此外，轭合物也具有口服生物利用度。在小分子药物和相应的小分子药物-低聚物轭合物二者均可生物利用的情况下，优选地，轭合物具有的口服生物利用度至少是未轭合形态小分子药物的口服生物利用度的10％。与未轭合形态小分子药物相比，轭合物保持的口服生物利用度所占的典型比例包括：至少约为20％；至少约为30％；至少约为40％；至少约为50％；至少约为60％；至少约为70％；至少约为80％；至少约为90％。

在一项或多项具体实施方案中，与未轭合形态小分子药物相比，轭合物用药表现出首过代谢降低。因而，本发明提供了降低活性剂新陈代谢的方法（除其他以外），该方法包含以下步骤：提供单分散或双峰轭合物，每种轭合物包含从通过稳定键联结与水溶性低聚物共价结合的小分子药物上得到的一部分，其中该轭合物表现出的新陈代谢率较未与水溶性低聚物结合的小分子药物低；以及给患者使用所述轭合物。

制备轭合物时使用的水溶性低聚物可以不同，本发明在这方面不受到特别的限制。典型的低聚物包括含有单体的低聚物，这些单体选自由下列组成的组：环氧烷烃、烯醇、乙烯吡咯烷酮、羟烷基甲基丙烯酰胺、羟烷基甲基丙烯酸盐、糖类、α羟基酸、磷腈、

唑啉、氨基酸、单糖和N-丙烯酰吗啉。在一项或多项优选的具体实施方案中，所述水溶性低聚物包括环氧乙烷单体。

本文描述的轭合物的低聚物成分包括序列结合的各个单体。典型的低聚物可包含多个序列重复的单体，单体数量符合下列范围中的一个或多个：1-25；1-20；1-15；1-12；1-10；及2-9。低聚物可以具有多个对应下列任一个值的单体：1；2；3；4；5；6；7；8；9；10；11；及12。

本文描述的轭合物的低聚物成分可以具有各种几何形状、结构和特征。非限制性例子包括直线和分枝状低聚物结构。

在一项或多项具体实施方案中，本文描述的每一种轭合物均具有单个与从小分子药物上得到的单个部分共价结合的水溶性低聚物。即，低聚物与从小分子药物上得到的部分之比为1:1。但是，在一项或多项具体实施方案中，轭合物可能具有1、2或3个与从小分子药物上得到的部分共价结合的低聚物。

尽管优选为共价键联结（通过一个或多个原子），但连接水溶性低聚物和从小分子药物上得到的部分的键联结可以是结合分子的任何合适的键联结。水溶性低聚物和小分子药物之间的合适的共价键联结包括但不限于下列：醚；酰胺；氨基甲酸乙酯；胺；硫醚及碳-碳键。

本文描述的组合物可以只包含单种的轭合物，或者包含两种、三种、四种或更多种不同的轭合物。例如，组合物可以包含单种的轭合物，而其它轭合物种类（例如在分子量、分子结构等方面不同的轭合物种类）实质上不存在。此外，本文描述的合成物也可以包含，例如，两种混合在一起的不同的轭合物，其特征为：（a）从小分子药物上得到的相同部分存在于组合物内的所有轭合物中，及（b）一种轭合物的低聚物大小不同于其它种类轭合物的低聚物大小。对于那些包含具有不同种类轭合物的混合物的组合物，每一种类将以已知的明确数量存在于组合物中。尽管任一特定组合物内的轭合物种类在上述低聚物大小方面可以有所不同，但轭合物种类的不同也可基于低聚物类型、从小分子药物上得到的部分、轭合物的立体异构体等等。

在另一方面，本发明提供了一种本文描述的此组合物的给药方法。这方面的方法包括给与含有单分散或双峰轭合物的组合物的步骤，每一种轭合物包含从通过稳定键联结与水溶性低聚物共价结合的小分子药物上得到的部分，其中，轭合物表现出的生物膜穿透率比未与水溶性低聚物结合的小分子药物低。方便地，给药步骤可以选自若干给药方法中的任意一种，包括例如由下列方法组成的组：口服、经皮、口腔含化给药、经粘膜给药、阴道给药、直肠给药、肠胃外投药和肺部给药。

在又另一方面，本发明提供了一种优化小分子药物的选择性生物膜穿透的方法。在这方面的方法包括，通过稳定的键联结共价键，将源自单分散或双峰低聚物组合物的低聚物共价结合到小分子药物上的步骤，由此形成一种轭合物，其表现出的生物膜穿透率低于轭合前小分子药物的生物膜穿透率。

在又另一方面，本发明提供了一种优化降低小分子药物穿透生物膜的方法，该方法包括下列步骤：（a）制备一系列的单分散或双峰轭合物，系列中的每一种轭合物包含从通过稳定键联结与水溶性低聚物共价结合的小分子药物上得到的部分，其中，系列中的每一种轭合物只在低聚物大小上有所不同，低聚物大小按低聚物内单体数量计；（b）表征步骤（a）中制备的每一种轭合物，达到轭合物不会穿透生物膜的最高程度；及（c）基于（b）的结果，找到步骤（a）中制备的一系列轭合物中具有最佳生物膜穿透率降低的轭合物。

本发明亦提供一种制备轭合物的方法，该方法包括将取自单分散或双峰低聚物组合物的水溶性低聚物与小分子药物共价结合的步骤。依此方法制成一种轭合物，其包含连接低聚物和从小分子药物上得到的部分的稳定键联结。提供轭合物的一个典型方法包括，在一个或多个合成步骤中，将源自单分散或多分子低聚物组合物的水溶性低聚物，其中，低聚物有一个反应性基A，与包含一个适合与A反应的反应性基B的小分子药物起反应的步骤，反应条件为可以有效地形成一个由A和B反应而得的水解稳定键联结，由此形成一种小分子药物-水溶性低聚物的轭合物。

在制备轭合物的方法产生一种异构体（或其它轭合物种类）的混合物的范围内，可以执行分离异构体（或其它轭合物种类）以获取单个轭合物异构体（或轭合物种类）的附加步骤。可选地，对于任何两个或多个组合物，其中每一个组合物具有单个轭合物异构体（或轭合物种类），可以执行两个或多个单独组合物相结合的步骤，以提供一种组合物，其具有数量已知、明确的每一种轭合物异构体（或轭合物种类）。

本发明亦提供了一种制备单分散水溶性低聚物例如低聚（环氧乙烷）的方法。该方法包括使具有(m)个单体的卤端基低聚（环氧乙烷）与具有(n)个单体的羟端基低聚（环氧乙烷）相反应的步骤，反应条件为可以有效地置换卤基，以形成具有(m)+(n)个单体亚单元(OEG_m+n)的低聚（环氧乙烷），其中(m)和(n)分别位于1-10的范围内。尽管并非必要，但(m)的范围优选为2-6（更优选为1-3）以及(n)的范围优选为2-6。

制备单分散水溶性低聚物的方法一般在有适合将羟端基低聚（环氧乙烷）的羟基转变为相应的醇盐的强碱例如钠、钾、氢化钠、氢化钾、甲醇钠、甲醇钾、叔丁醇钠或叔丁醇钾的存在下进行的。

关于与卤端基低聚（环氧乙烷）（或其它卤端基低聚物）相关的卤素（或卤素基），卤素典型地选自氯、溴和碘。此外，卤端基低聚（环氧乙烷）的封端一般例如是甲基或乙基，以提供相应的甲基或乙基醚端。优选的卤端基低聚（环氧乙烷）为H₃CO-(CH₂CH₂0)_m-Br，其中(m)的定义如上。

关于羟端基低聚（环氧乙烷），此类羟端基低聚（环氧乙烷）对应结构HO-(CH₂CH₂0)_n-H，其中(n)的定义如上。

制备单分散水溶性低聚物的方法也可以包含以下步骤，即将OEG_m+n的终端羟基转变为卤基，以形成OEG_m+n-X，其中X为卤基。上述步骤之后，可以进行OEG_m+n-X与具有(n)个单体的羟端基低聚（环氧乙烷）的反应，反应条件为可以有效地置换卤基，由此形成具有(m)+2(n)个单体亚单元(OEG_m+n)的低聚（环氧乙烷），(m)和(n)的范围如上所述。可选地，以上步骤可以重复，直至获得具有理想的离散单体数量的单分散低聚（环氧乙烷）。

本发明亦提供了一种使用上述方法制备的单分散低聚（环氧乙烷）组合物来制备轭合物的方法。尽管上述环氧乙烷的单分散低聚物的优选用于制备本发明的轭合物，但其也可用来与若干活性剂或表面的任一种结合。与按上述方法制备的单分散低聚（环氧乙烷）结合的优选生物活性剂包括小分子治疗剂、诊断剂、染料、成像剂、靶向剂、表面活性剂、润肤剂、药用化妆品、营养补充食品等等。

当与下文详细说明结合阅读时，本发明的这些或其它对象、方面、具体实施方案和特征将更明显。

本发明的详细说明

必须注意的是，除非上下文清楚地显示出其仅为单数，否则本说明书中的单数形式包括复数对象。

在描述本发明和提出权利要求时，下列术语的使用依照以下说明的定义：

“水溶性低聚物“中的“水溶性”是指，在室温下，低聚物至少35％（按重量计）可溶于水，优选为95％以上可溶于水。典型地，未经过滤的“水溶性”低聚物水溶性制剂传输的光量至少是同一溶液过滤后传输的光量的75％，更优选为95％以上。以重量为基础，“水溶性”低聚物优选为至少35％（按重量计）可溶于水为宜，更优选为至少50％（按重量计）可溶于水，进而更优选为至少70％（按重量计）可溶于水，再而更优选为至少85％（按重量计）可溶于水。但是，最优选为水溶性低聚物至少95％（按重量计）可溶于水或完全可溶于水。

术语“单体”、“单体的亚单元”和“单体单元”在本文中可以交换使用，均指聚合体或低聚物的基本结构单元之一。若是同质低聚物，单体单元定义为低聚物的结构重复单元。若是联合低聚物，将单体单元定义为通过低聚化形成低聚物的单体残基更有用，因为结构重复单元可以包括不止一种单体单元类型。本发明的优选低聚物是同质低聚物。

“低聚物”是具有约1-约30个单体的分子。低聚物的结构可以不同。在本发明中使用的特定低聚物包括那些具有各种几何形状（如直线状、分枝状或分叉状）的低聚物，下文将更详细地说明。

在本文中，“PEG”或“聚乙二醇”为包含所有水溶性聚（环氧乙烷）。除非另有说明，“PEG低聚物”或低聚乙二醇是其中所有单体亚单元均为环氧乙烷亚单元的一种。典型地，几乎所有或全部单体亚单元都是环氧乙烷亚单元，尽管低聚物可能含有不同的封端部分或功能团，例如，用于轭合。典型地，在本发明使用的PEG低聚物将包含下列两种结构的一种："-(CH₂CH₂O)_n-"或"-(CH₂CH₂O)_n-1CH₂CH₂-"，取决于终端氧是否被置换，例如，在合成转换期间。如上所述，对于本发明的PEG低聚物，变量(n)的范围为1-30，且终端基和整体PEG的结构可以有所差异。当PEG进一步包含功能团A，用以连接到例如小分子药物时，在与PEG低聚物共价结合时，功能团不会导致形成（i）氧-氧键（-O-O-，过氧化物键联结），或（ii）氮-氧键（N-O、O-N）。

“封端基”一般是结合到PEG低聚物终端氧的非反应性含碳基。为了本发明的目的，优选的封端基具有相对较低的分子量，例如甲基或乙基。封端基亦可包含可检出的标记物。这类标记物包括但不限于荧光剂、化学发光剂、酶标记成分、比色标记物（如染料）、金属离子和放射性成分。

“分枝的”在指低聚物的几何形状或整体结构时，系指低聚物具有两个或多个从分枝点上伸出的聚合体“臂”。

“分叉的”在指低聚物的几何形状或整体结构时，系指低聚物具有两个或多个从分枝点上（典型情况为通过一个或多个原子）伸出的功能团。

“分枝点”系指包含一个或多个原子的分岔点，低聚物在该点上由线性结构分枝或分叉为一个或多个另外的臂。

术语“反应性”或“活性的”系指功能团在有机合成的传统条件下很容易或以可行的速度起反应。这是相对于那些不起反应或需要很强的催化剂或不切实际的反应条件才能起反应的基团（即，“非反应性”或“惰性”基团）而言。

“不易起反应的”在指反应混合物中分子上存在的功能团时，表示功能团处于能够有效地在反应混合物中产生希望的反应的条件下基本保持不变。

“保护基”是防止或阻止一个分子中具有化学反应性的特定功能团在一定反应条件下起反应的部分。根据受保护的化学反应基和待采用的反应条件，以及分子中是否存在其它反应基或保护基，保护基可有所差异。举例而言，可能受保护的功能团包括羧酸基、氨基、羟基、硫醇基、羰基等等。对于羧酸，其代表性保护基包括酯（如p-甲氧基苄酯）、酰胺和酰肼；对于氨基为氨基甲酸盐（如叔丁基氧基羰基）和酰胺；对于羟基为醚和酯；对于硫醇基为硫醚和硫酯；对于碳酰基为缩醛和酮缩醇；等等。这些保护基已为本领域技术人员所熟悉，并且在例如T.W.Greene和G.M.Wuts所著的《有机合成中的保护基》（第三版，纽约Wiley，1999年印刷）及其引用的参考文献中已有描述。

处于“受保护形态”的功能团系指具有保护基的功能团。在本文中，“功能团”一词或其任何同义词包含功能团的受保护状态。

“生理可分裂”或“可水解”或“可降解”键是在生理条件下会与水起反应（即水解）的相对不稳定的键。键在水中分解的倾向不但取决于连接两个中心原子的键联结类型，也取决于与这些中心原子结合的取代基。适当水解地不稳定或不牢固的键联结包括但不限于羧酸酯、磷酸酯、酐、缩醛、酮缩醇、酰氧烷基醚、亚胺、原酸酯、肽、低核苷酸、硫代酸酯、硫羟酸酯和碳酸酯。

“酶降解键联结”系指可以由一个或多个酶降解的键联结。

“水解稳定”键联结或键系指，一个化学键，典型为共价键，在水中非常稳定，也就是说，在生理条件下长时间不会发生任何可察觉程度的水解。水解稳定键的例子包括但不限于：碳-碳键（如，在脂族链中）、醚、酰胺、氨基甲酸乙酯、胺等等。一般而言，水解稳定键联结是指在生理条件下表现出低于约1-2％每天的水解速率的键联结。代表性化学键的水解速率可以在多数标准的化学教科书中找到。

“实质上”或“基本上”系指，接近全部或完全，例如是给定量的95％或以上，更优选为97％或以上，进而更优选为98％或以上，再进而更优选为99％或以上，又进而更优选为99.9％或以上，最优选为99.99％或以上。

“单分散”系指低聚物组合物，其中，组合物中的几乎所有低聚物均具有明确的单一（即相同的）分子量和明确数量的单体，分子量和数量由色谱或质谱测定。单分散低聚物组合物在某种意义上是纯的，即，实质上具有单一可明确的单体数量（为一个整数），而不是大规模分布。本发明的单分散低聚物组合物具有1.0005或更低的MW/Mn值，MW/Mn值更优选为1.0000。进一步而言，包含单分散轭合物的组合物系指，组合物中所有轭合物的实质上所有低聚物均具有单一可明确的单体数量（为一个整数），而不是大规模分布，并且若低聚物未与从小分子药物上得到的部分结合，则具有1.0005或更低的MW/Mn值，，MW/Mn值更优选为1.0000。但是，包含单分散轭合物的组合物可包括一个或多个非轭合物质，如溶剂、试剂、赋形剂等等。

“双峰”在指低聚物组合物时，系指具有下列特征的低聚物组合物，其内实质上所有低聚物均具有两个可明确的、不同的单体数量（为整数）中的一个，而不是大规模分布，且分子量分布作为一个分数相对于分子量作图时，呈两个单独可辨的峰。对本文描述的双峰低聚物组合物，尽管两个峰的大小可能不同，但优选每个峰对称分布在各自均值的两边。双峰分布中每个峰的多分散性指数Mw/Mn的较理想值为1.01或更低，更优选为1.001或更低，进而更优选为1.0005或更低，而MW/Mn的最优选值为1.0000。进一步而言，包含双峰轭合物的组合物系指，组合物中所有轭合物的实质上所有低聚物均具有两个可明确的、不同的单体数量（为整数）中的一个，而不是大规模分布，并且若低聚物未与从小分子药物上得到的部分相结合，则具有1.01或更低的MW/Mn值，更优选的值为1.001或更低，进而更优选的值为1.0005或更低，而最优选的MW/Mn值为1.0000。但是，包含双峰轭合物的组合物可以包括一个或多个非轭合物质，例如溶剂、试剂、赋形剂等等。

在本文中广泛使用的“小分子药物”系指分子量一般低于约1000的有机、无机或有机金属化合物。本发明的小分子药物包含分子量小于约1000的寡肽和其它生物分子。

“从小分子药物上得到的部分”和“小分子药物部分”在本文中可以互换使用，系指来源小分子药物（或其活性的或化学改性的状态）中直到其与本发明的低聚物共价结合而产生的键联结共价键的那一部分或残余。

“生物膜”是阻碍至少一些异型生物质或其它不良物质通行的屏障的任何膜，一般由专门细胞或组织组成。在本文中使用的“生物膜”包括与生理保护屏障相关的膜，例如，包括：血脑屏障；血脑脊髓液屏障；血胎盘屏障；血奶屏障；血睾丸屏障；和粘膜屏障，包括阴道粘膜、尿道粘膜、肛门粘膜、颊粘膜、舌下粘膜、直肠粘膜等。除非上下文另有明确说明，术语“生物膜”不包括与中间胃肠道（例如胃和小肠）有关的膜。

在本文中，“生物膜穿透率”提供了衡量化合物穿透生物屏障（如血脑屏障，BBB）能力的方法。评估分子穿透任何特定生物膜的输送能力可以采用多种方法。评估与任何特定生物屏障（例如血脑脊髓液屏障、血胎盘屏障、血奶屏障、肠内屏障等）有关的生物膜穿透比率的方法已为人们所知，并在本文和/或相关的文献中有描述，和/或可以由本领域普通技术人员确定。

根据本发明的“穿透血脑屏障”化合物，是一种利用本文描述的方法以大于阿替洛尔的比率穿透BBB的化合物。

在本发明中，“降低的新陈代谢率”系指，同未与水溶性低聚物结合的小分子药物（即，小分子药物本身）或一种标准参照物的新陈代谢率相比，水溶性低聚物与小分子药物的轭合物的新陈代谢率明显降低。在“降低的首过代谢率”的特殊情况下，除了口服小分子药物（或标准参照物）和相应的轭合物的情况外，要求要有同样的“较低的新陈代谢率”。口服的药物通过胃肠道吸收到门脉循环，在到达体循环之前必须先通过肝脏。由于肝脏是药物新陈代谢或生物转化的主要部位，药物的实质部分可以在到达体循环之前在这个部位上被代谢。首过代谢的程度和因此其任何降低，可以用多种不同的方法进行衡量。例如，可以按固定的间隔时间采集动物血液样本，通过液体色谱/质谱分析血浆或血清，了解代谢物水平。衡量与首过代谢和其它代谢过程有关的“降低的新陈代谢率”的其它方法已为人们所知，并在本文和/或相关的文献中有描述，和/或可以由本领域普通技术人员进行确定。优选地，本发明的轭合物可以提供降低的新陈代谢率降低，其满足下列值中的至少一个：至少约5%，至少约10%，至少约15%；至少约20%；至少约25%；至少约30%；至少约40%；至少约50%；至少约60%；至少约70%；至少约80%；及至少约90%。

具有“口服生物利用度”的化合物（例如小分子药物或其轭合物）是在口服时具有大约1％的生物利用度的化合物，优选为大于10％，其中化合物的生物利用度是指服用的药物中以未代谢的形态到达体循环的那一部分。

“烷基”系指烃链，长度一般在约1-20个原子之间。这种烃链优选但非必要为饱和，并且可以是支链或直链，但优选为直链。实例性烷基包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、3-甲基戊基等。在本文中，在提到三个或更多个碳原子时，“烷基”包括环烷基。

“低级烷基”系指含有1-6个碳原子的烷基，并且可以是直链或支链，例如甲基、乙基、正-丁基、异-丁基、叔-丁基。

“非干扰性取代基”是指那些存在于分子中时一般不易和分子内其它功能团起反应的基。

“烷氧基”系指-O-R基，其中，R是烷基或取代烷基，优选为C₁-C₂₀烷基（例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、苯甲基等），优选为C₁-C₇。

“亲电子试剂”系指具有亲电子中心（即寻找电子的中心，能够与亲核试剂起反应）的离子、原子、或原子的离子性或中性集合。

“亲核试剂”系指具有亲核中心（即寻找亲电子中心的中心，能够与亲电子试剂起反应）的离子、原子、或原子的离子性或中性集合。

本文中使用的“药物”包括能够在活体内或活体外提供药理的往往是有益的效果的任何药剂、化合物、物质的组合或混合物。包括食物、食物添加剂、营养素、营养保健品、药物、疫苗、抗体、维生素和其它有益的药剂。在本文中，这些术语进一步包括能够在患者体内产生局部或全身效果的任何生理或药理活性物质。

“药学上可接受的赋形剂”或“药学上可接受的载体”系指本发明的组合物可包括的并且不会给患者造成重大的不利毒理效果的赋形剂。

“药理有效量”、“生理有效量”及“治疗有效量”在本文中可以互换使用，系指在血流或目标组织中提供要求水平的活性剂和/或轭合物所需的组合物中存在的水溶性低聚物与小分子药物的轭合物的量。精确的量将取决于多种因素，例如，特定的活性剂、组合物的成分和物理特征、针对的患者人群、患者的考虑等等，并且可以由本技术领域的熟练技术人员根据本文以及相关文献提供的信息轻易地确定。

“双功能”低聚物是具有两个功能团的低聚物，功能团一般在其末端。功能团相同时，低聚物被称为同质双功能低聚物。功能团不同时，低聚物被称为异质双功能低聚物。

本文描述的碱性或酸性反应物包括中性的、带电的反应物及其任何相应的盐形式。

“患者”一词系指患有或易患有可通过服用本文描述的轭合物（一般但非必要，其状态为水溶性低聚物与小分子药物的轭合物）得到预防或治疗的病症的活生物体，包括人类和动物。

“可选的”或“可选地”系指，随后描述的情形可能会或可能不会发生，因此描述的内容包括情形会发生的情况以及情形不会发生的情况。

本发明是有关于通过与从单分散或双峰水溶性低聚物组合物获取的水溶性低聚物共价结合而得到化学改性的小分子药物组合物（除其他以外）。因为水溶性低聚物是从单分散或双峰水溶性低聚物组合物获取，所以，从结构上看，本发明的小分子药物与低聚物的组合物极纯而明确。

本文描述的轭合物的一个优点是，其表现出比非轭合形态的相应活性剂降低的生物膜穿透率。在不希望受理论约束的情况下，认为分子大小是确定任何特定分子是否能够通过或穿过任何特定生物膜以及通过或穿过程度的一个重要因素。例如，多数（如果不是全部）保护性屏障，至少部分依靠构成膜的高度密集的细胞，这种膜具有只有较小的分子才能通过的紧密接合。因而，对于特定小分子药物，水溶性聚合物与小分子药物的结合提供了一种必然更大的轭合物，并且可以预期该轭合物或者被阻止通过生物膜，或者与未轭合的小分子药物相比，具有降低的生物穿透率。

正如在下文及试验部分将要详细说明的，但是，通过水溶性低聚物与小分子药物轭合来增大分子大小，从而降低生物膜穿透率，这种做法一般不会提供完全满意的轭合物。在理想情况下，轭合物是作为包含单分散或双峰轭合物的组合物的形式提供。重申一次，在不希望受理论约束的情况下，认为即便是轭合物之间单体数量非常小的差异也会导致在属性方面例如药理活性、新陈代谢、口服生物利用度、生物膜穿透率、溶解性及其它方面出现较大的差异。

此外，如图10提供的质谱所显示，可通过商业途径获得的低聚物组合物，如PEG-350，实际上相对不纯，因为组合物中存在的低聚物大小有多种。因此，在轭合物合成中使用这种相对不纯的低聚物组合物（未经进一步提纯）将导致各种各样的轭合物分子量大小（因为用来形成轭合物的组合物的分子量范围很宽）。结果是，生成的轭合物组合物包含多种轭合物，其中，每种轭合物可能有不同的属性。从医药监管和医学的角度上看，理想的情况是避免组合物包含具有显著不同属性的部分。

因此，本发明提供的轭合物不仅相对较大（与相应的未轭合小分子药物相比），以降低生物膜穿透率（也是与相应的未轭合小分子药物相比），而且实质上是纯的，以确保组合物具有一致的所要的活性和其它属性。因而，本发明提供了包含单分散或双峰轭合物的组合物，每种轭合物包含从通过稳定键联结与水溶性低聚物共价结合的小分子药物上得到的部分，其中，轭合物表现出的生物膜穿透率比未与水溶性低聚物结合的小分子药物低。

如前文所述，使用源自明确的低聚物组合物的离散低聚物来形成轭合物能够有利地改变某些与相应的小分子药物相关的属性。例如，本发明的轭合物在采用若干合适的给药途径之任意一种进行给药时，例如肠胃外投药、口服、经皮、经颊、肺部或鼻部给药，表现出降低的生物膜（如与血脑屏障和血胎盘屏障相关的生物膜）穿透率。优选的情况是，轭合物表现出减缓的、最小的或实在地没有生物膜（如与血脑屏障和血胎盘屏障相关的生物膜）穿透，但在口服时，却能穿透胃肠（GI）壁，进入体循环。若采用肺部给药，优选地，给与的轭合物无穿透进入体循环的情况或肺部组织-血液屏障的穿透率较低，从而在肺部维持药物水平，在肺里产生局部药理活性。此外，本发明的轭合物在轭合状态下维持一定程度的生物活性和生物利用度。

关于血脑屏障（“BBB”），此屏障限制药物的血液到大脑的输送。这个屏障由一层连续的，通过紧密接合部连接的独特内皮细胞而组成的。包含95％以上BBB总表面积的脑毛细管是多数溶解物和药物进入中枢神经系统的主要路径。

尽管一些化合物在脑组织内具有足够的浓度以在脑内产生药理效果是期望的结果，但许多在脑组织内没有有用的药理活性其它化合物却能够最终到达中枢神经系统组织。通过降低这些无中枢作用的化合物进入中枢神经系统的穿透率，从而降低对中枢神经系统副作用的风险，甚至可能提高治疗效果。

对于血脑屏障穿透能力的程度不易获知的化合物，这种能力可以利用合适的动物模型来确定，如本文所述的就地鼠脑灌注（“RBP”）模型。简要地说，RBP方法包括将导管插入颈动脉，在受控条件下灌注化合物溶液，随后是冲洗阶段，以清除残留在脉管空间内的化合物。（例如，可以由委托研究组织Absorption Systems、Exton、PA等进行分析。）更具体而言，在RBP模型中，在左侧颈动脉内放置一根导管，并把侧支脉扎紧。在一项单通道灌注试验中，以10毫升/分钟的流速灌注含有化合物（5微摩尔）的生理缓冲剂。30秒后停止灌注，使用不含化合物的缓冲剂冲洗30秒，冲掉脑脉管内的物质。然后切下脑组织进行分析，通过液相色谱，使用级联质谱检测（LC/MS/MS）测定化合物的浓度。另外，也可以根据计算化合物的分子极表面积（“PSA”）即分子内极性原子（通常是氧、氮和附着的氢）的表面分布总和，估计血脑屏障的穿透性。已知PSA和化合物传输属性有关，例如血脑屏障输送。确定化合物的PSA的方法可以在例如以下文献中找到：Ertl,P.,et al.,J.Med.Chem.2000,43,3714-3717；及Kelder,J.,et al.,Pharm.Res.1999,16,1514-1519。

与血脑屏障相似的一种屏障是血脑脊髓液屏障。该屏障形成一道减少毒素或不良物质到达脑脊髓液的量的屏障，脑脊髓液大多位于心室系统中和蛛网膜空间内。为了确定给患者服用的化合物（例如小分子药物或轭合物）是否能够穿过血脑脊髓液屏障以及穿过程度，可以将已知量的化合物注射到老鼠体内。化合物注射几天后，可以分析老鼠的脑脊髓液样本，确定化合物是否存在以及它的含量。

血胎盘屏障保护正在发育的胎儿，防止胎儿受到分布在母体循环内的大多数毒素的侵害。这个屏障由胎盘内母体循环脉管与胎儿循环脉管之间的若干个细胞层组成。与血脑屏障一样，胎盘屏障并非完全不能渗透，但可以有效地减缓大多数毒素的扩散。为了确定给与怀孕的哺乳动物的化合物（例如小分子药物或轭合物）是否能够穿过血胎盘屏障以及穿过程度，可以将已知量的化合物注射到孕期老鼠体内。化合物注射几天后，可以分析老鼠胎儿组织的样本，确定是否存在化合物以及它的含量。

血奶屏障通过生物膜隔离和限制体循环中某些物质的穿透，这与血脑屏障相似。至于血奶屏障，生物膜防止某些物质穿过而进入乳腺。为了确定给与怀孕的哺乳动物的化合物（例如小分子药物或轭合物）是否能够穿过血奶屏障以及穿过的程度，可以将已知量的化合物注射到哺乳老鼠体内。化合物注射几天后，可以分析取自乳腺的奶样本，确定是否存在化合物以及它的含量。

血睾丸屏障包含支柱细胞（塞托利细胞），这些细胞分布在雄性生殖道周围并通过紧密的接合部连接在一起。为了确定给与雄性哺乳动物的化合物（例如小分子药物或轭合物）是否能够穿过血睾丸屏障以及穿过程度，可以将已知量的化合物注射到雄性老鼠体内。化合物注射几天后，可以切下老鼠的睾丸并分析是否存在化合物以及它的含量。

粘膜屏障代表另一种生物膜，这个膜典型地阻止或减少不良物质进入体循环。将化合物给至特定的粘膜区，然后分析血液样本，确定是否存在化合物以及它的含量，可以确定化合物是否穿透了特定的粘膜区以及穿透程度。

对于任何生物膜，水溶性低聚物-小分子药物轭合物都表现出比未与水溶性低聚物结合的小分子药物低的生物膜穿透率。生物膜穿透率的实例性降低包括降低：至少约5％；至少约10％；至少约25％；至少约30％；至少约40％；至少约50％；至少约60％；至少约70％；至少约80％；或至少约90％，这些降低是和未与水溶性低聚物结合的小分子药物的生物膜穿透率比较而言。轭合物生物膜穿透率的降低优选为至少约20％。在某些情况下，优选的情形是小分子药物本身可以穿透一种或多种本文描述的生物膜。

表现出降低的生物膜穿透率的轭合物典型地包含结构

O-X-D

其中：O对应水溶性低聚物，X对应稳定的键联结，D对应从小分子药物上得到的部分。

在某种意义上，从小分子药物上得到的部分与原来的来源小分子药物不同，因为这个小分子药物部分和不与来源小分子药物相关的原子（一般是通过共价键）连接在一起。但是，除了与另一个原子连接这一点不同外，从小分子药物上得到的部分根本上和小分子药物是相同的并具有相似的药理作用机理。因此，对小分子药物的讨论等同于描述从小分子药物上得到的部分。

轭合物中的活性剂是小分子药物，即分子量小于约1000道尔顿的药理活性化合物。就本发明而言，小分子药物包括寡肽、寡核苷酸和其它分子量小于约1000道尔顿的生物分子。“小分子药物”也包含肽、蛋白质或抗体的片段，包括属于上述分子量范围的原生序列和变异体。

小分子药物的实例性分子量包括下列分子量：低于约950；低于约900；低于约850；低于约800；低于约750；低于约700；低于约650；低于约600；低于约550；低于约500；低于约450；低于约400；低于约350；及低于约300。

本发明使用的小分子药物，若分子是手性的，可以从消旋混合物、旋光型例如单一旋光对映体、或任何组合或比例的对映体上获得。此外，小分子药物可有一个或多个几何异构体。关于几何异构体，组合物可以仅包含一个几何异构体或者包含两个或多个几何异构体的混合物。供当前发明使用的小分子药物可以是传统的活性状态，或者可以有某种程度的改性。例如，在与低聚物共价结合之前或结合之后，小分子药物可以有与其结合的目标药剂、附属物或送载体。小分子药物也可以有与其结合的亲脂性部分，例如磷脂（例如，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺即“DSPE”、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺即“DPPE”等等）或小脂肪酸。然而，在一些情况下，优选的情况是小分子药物部分不包括与亲脂性部分结合。

用于与本发明的轭合物结合的小分子可以是下列任一种小分子。合适的药剂可以选自，例如，呼吸道药物、抗痉挛药、肌肉弛缓药、消炎药、食欲抑制剂、治偏头痛的药剂、肌肉收缩药、抗感染药（抗生素、抗病毒剂、抗真菌药和疫苗）、治风湿药、抗疟药、止呕剂、气管扩张剂、抗血栓药、抗高血压药、心血管药、抗心律失常药、抗氧化剂、抗哮喘药、利尿剂、脂类调节剂、抗雄激素药、抗寄生物药、抗凝血剂、赘生药剂、抗肿瘤药、低血糖药、营养药剂和添加剂、生长增补剂、抗肠炎药剂、疫苗、抗体、诊断剂和对比剂。

更具体而言，活性剂可属于若干种结构之一种，包括但不限于小分子、寡肽、多肽或蛋白质模拟物、片段或相似物、类固醇、核苷、寡核苷酸、电解液等等。优选地，与本发明的低聚物结合的活性剂具有适合与低聚物共价结合的游离羟基、羧基、硫代、氨基或诸如此类的物质（即，“柄体”）。药物也可以通过引进合适的“柄体”得到改性，优选地通过将其现有功能团之一转化为适合在低聚物和药物之间形成稳定的共价结合的功能团。两种方法在实验部分作例子说明。

适合与本发明的低聚物共价结合的活性剂包括下列物质的小分子拟态物和活性片段（包括变异体）：天冬酰胺酶、amdoxovir(DAPD)、安泰得、卡普勒明、降钙素、蓝藻菌病毒素、地尼白介素-毒素连接物、红血球生成素(EPO)、EPO激动剂（如，长度约10-40个氨基酸的肽，包含如WO96/40749中描述的特定核心序列）、脱氧核糖核酸酶α、刺激红血球生成的蛋白质(NESP)、凝结因子（如因子V、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子X、因子XII、因子XIII）、von Willebrand因子；Ceredase、伊米苷酶、α-葡萄糖苷酶、胶原、环孢霉素、α-防御素、β-防御素、exedin-4、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、血小板生成素(TPO)、α-1蛋白酶抑制剂、依降钙素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、纤维蛋白原、非格司亭、生长荷尔蒙人类生长荷尔蒙(hGH)、生长荷尔蒙释放荷尔蒙(GHRH)、GRO-β、GRO-β抗体、骨形态发生蛋白（如骨形态发生蛋白-2，骨形态发生蛋白-6,OP-1）；酸性纤维原细胞生长因子、碱性纤维原细胞生长因子、CD-40配合基、肝素、人类血清白蛋白、低分子量肝素(LMWH)、干扰素（如干扰素α、干扰素β、干扰素γ、干扰素Ω、干扰素τ,复合性干扰素）；白细胞介素和白细胞介素受体，如白细胞介素-1受体、白细胞介素-2、白细胞介素-2熔化蛋白、白细胞介素-1受体拮抗剂、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素-4受体、白细胞介素-6、白细胞介素-8、白细胞介素-12、白细胞介素-13受体、白细胞介素-17受体；乳铁传递蛋白和乳铁传递蛋白片段、黄体化荷尔蒙释放荷尔蒙(LHRH)、、胰岛素、胰岛素原、胰岛素相似物（如美国专利第5,922,675号描述的单酰化胰岛素）、amylin、C-肽、生长激素抑制素、生长激素抑制素类似物（包括奥曲肽）、血管压增压素、促卵泡荷尔蒙(FSH)、流感疫苗、类胰岛素因子(IGF)、胰岛素调理素、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、纤溶酶原活化剂（如阿替普酶、尿激酶、瑞替普酶、链球菌酶、帕米普酶、兰替普酶及teneteplase；神经生长因子(NGF)、护骨素、血小板衍生生长因子、组织生长因子、转化生长因子-1、血管内皮细胞生长因子、白血病抑制因子、角化细胞生长因子(KGF)、神经胶质生长因子(GGF)、T细胞受体、CD分子/抗原、肿瘤坏死因子(TNF)、单核细胞趋化蛋白-i、内皮生长因子、甲状旁腺荷尔蒙(PTH)、类胰高血糖素肽、生长激素、胸腺素α1、胸腺素α1IIb/IIIa抑制剂、胸腺素β10、胸腺素β9、胸腺素β4、α-1抗胰蛋白酶、磷酸二酯酶(PDE)化合物、VLA-4（极晚期抗原-4）、VLA-4抑制剂、二膦酸盐、呼吸多核病毒抗体、囊纤维症横跨膜调节剂(CFrR)基因、脱氧核糖核酸酶(Dnase)、杀菌/渗透性增强蛋白(BPI)及抗CMV抗体。典型的单克隆抗体包括etanercept（一种二分子融合蛋白，由链接到IgG1的Fc部分的人类75kD TNF受体的细胞外配合基结合部分组成）、阿昔单抗、阿福力莫单抗、舒莱、赛尼哌、因福利美、替伊莫单抗、米妥莫单抗、莫罗莫那-CD3、碘131脱西图莫单抗轭合物、欧力祖单抗、利妥西单抗及曲妥珠单抗（赫赛汀）。

适合共价结合到本发明低聚物的其它药剂包括但不限于阿米福汀、胺碘酮、氨甲苯酸、对氨马尿酸钠、氨鲁米特、氨基酮戊酸、氨基水杨酸、安吖啶、阿那格雷、阿纳托唑、门冬酰胺酶、蒽环霉素、视黄醛、必卡他胺、博莱霉素、布舍瑞林、白消安、卡麦角林、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、chlorambucin、西司他丁钠、顺铂、克拉曲滨、氯屈膦酸二钠、环磷酰胺、去乙酰环丙氯地孕酮、阿糖胞苷、喜树碱、13-顺式-视黄酸、全反式视黄酸；达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、去铁胺、地塞米松、双氯芬酸、已烯雌酚、多烯紫杉醇、多柔比星、表阿霉素、雌莫司汀、依托泊苷、依西美坦、非索非那定、氟达拉滨、氟氢可的松、氟尿嘧啶、氟羟甲基睾丸素、氟他胺、吉西他汀、肾上腺素、L-多巴、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、伊立替康、依曲康唑、戈舍瑞林、来曲唑、甲酰四氢叶酸、左咪唑、赖诺普利、左甲状腺素钠、洛莫司汀、氮芥气、安宫黄体素、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、间羟基去甲麻黄碱二酒石酸盐、甲氨蝶呤、灭吐灵、美西律、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、纳洛酮、烟碱、尼鲁米特、奥曲肽、奥沙利铂、帕米膦酸、喷司他丁、pilcamycin、卟吩姆、泼尼松、丙卡巴肼、普鲁氯哌嗪、恩丹西酮、雷替曲噻、西罗莫司、链脲佐菌素、他可莫司、它莫西芬、替莫唑胺、替尼泊苷、睾酮、四氢大麻酚、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、拓扑替康、维生素A酸、valrubicin、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞宾、多拉司琼、格拉司琼；福莫特罗、氟替卡松、柳菩林、咪达唑仑、阿普唑仑、两性霉素B、podophylotoxins、核苷抗病毒药、芳酰腙、舒马曲坦；大环内酯物，如红霉素、竹桃霉素、醋竹桃霉素、罗红霉素、克拉霉素、达发新、阿奇霉素、氟红霉素、地红霉素、交沙霉素、螺旋霉素、美地加霉素、白霉素、米欧卡霉素、罗他霉素、andazithromycin及swinolide A；氟喹诺酮，如环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、曲伐沙星、阿拉曲伐沙星、莫西沙星、诺氟沙星、依诺沙星、格帕沙星、加替沙星、洛美沙星、司帕沙星、替马沙星、培氟沙星、氨氟沙星、氟罗沙星、妥舒沙星、普卢利沙星、伊洛沙星、帕珠沙星、克林沙星及西他沙星；氨基糖苷类抗生素，如庆大霉素、奈替米星、草履虫素、妥布霉素、阿米卡星、卡那霉素、新霉素及链霉素、万古霉素、替考拉宁、兰普拉宁（rampolanin）、麦地拉宁、克利斯汀、达托霉素、短杆菌肽、多粘菌素E甲磺酸；多粘菌素，如多粘菌素B、卷曲霉素、杆菌肽、青霉烯；青霉素，包括青霉素酶敏感药剂，如青霉素G、青霉素V；青霉素酶抵抗剂，如甲氧苯青霉素、苯唑青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素、氟氯西林、萘夫西林；革兰氏(染色)阴性微生物活性剂，如氨苄西林、羟氨苄青霉素及海他西林、西林和格拉皮西林；抗单假胞菌青霉素，如羧苄青霉素、替卡西林、阿洛西林、美洛西林及哌拉西林；头孢菌素，如头孢泊肟酯、头孢丙烯、头孢丁烯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢噻吩、头孢匹林、头孢氨苄、头孢拉定、头孢西丁、头孢孟多、头孢唑啉、头孢娄利定、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢来星、头孢呋辛、头孢雷特、头孢噻肟、头孢曲松、头孢乙氰、头孢吡肟、头孢克肟、头孢尼西、头孢哌酮、头孢替坦、头孢美唑、头孢他啶、氯碳头孢及拉氧头孢，单内酰环类（如氨曲南）；以及碳青霉烯，如伊米配能、美洛培南、喷他脒爱瑟硫脲、沙丁胺醇硫酸盐、利多卡因、间羟异丙肾上腺素硫酸盐、二丙酸倍气米松、去炎松乙酰胺、布地奈德丙酮化合物、氟替卡松、异丙托溴化物、氟尼缩松、色甘酸钠及酒石酸麦角胺；紫杉烷类，如紫杉醇;SN-38,及泰福司汀。

上述典型药物，在适用的情况下，包括类似物、激动剂、拮抗剂、抑制剂、异构体、多晶型物以及由这些物质形成的药物学上可接受的盐态。因而，例如，若上述典型药物相对较大，不属于小分子药物类，但仍将其列入，因为可以使用具有类似活性但较小的该大分子类似物。

尤其适合本发明的小分子药物是那些可以显著地穿透生物膜的药物。能够穿透皮肤屏障的小分子药物亦是本发明的预想应用对象。在一些情况下，小分子药物，在口服或甚至肠胃外投药时，有不利的大量穿过生物膜的情况。例如，有不利的血脑屏障穿透的小分子药物是表现出脑吸收率大于阿替洛尔的小分子药物。在这点上，脑吸收率（“BUR”）（按本文描述方法测定）大于约15pmol/gm脑/秒的小分子药物是那些有不利的血脑屏障穿透的小分子药物非限制性例子。

因而，就血脑屏障而言，用于非中枢神经系统适应症但却穿透血脑屏障的小分子药物为优选对象，因为这些药物的轭合提供了具有较少的中枢神经系统副作用的分子。例如，结构上相关的核苷酸和核苷（如8-氮鸟嘌呤、6-巯基嘌呤、硫唑嘌呤、硫肌苷酸盐、6-甲基硫肌苷酸盐、6-硫尿酸、6-硫鸟嘌呤、阿糖腺苷、克拉曲滨、安西他滨、氮杂胞嘧啶核苷、赤型-9-（2-羟基-3-壬基）腺嘌呤、氟达拉滨、吉西他汀等等）为优选。

关于氟达拉滨，这种小分子药物表现出约70％的口服生物利用度，用于治疗慢性淋巴白血病以及毛细胞白血病、非霍奇金氏淋巴瘤和蕈样霉菌病。氟达拉滨还表现出中枢神经系统相关的副作用，具有严重的神经作用，包括失明、昏迷甚至死亡。对老鼠和兔子进行的动物研究显示，药物也可能会导致畸形。因此，氟达拉滨轭合物预期可以有效地阻止药物穿透血脑屏障及/或血胎盘屏障，或至少可以降低穿透这些屏障的比例，从而改善氟达拉滨的不良副作用。

另一类小分子药物虽然典型地用作周围神经活性药但具有常见的中枢神经系统相关的副作用，这类药物是抗组胺剂。在结构上，抗组胺剂作为氨烷基醚而相关自成一类。这种小分子药物包括苯海拉明、溴苯海拉明、多西拉敏、卡比沙明、氯马斯汀、茶苯海明、曲吡那敏、比拉明、美沙吡林、松齐拉敏、非尼拉敏、氯苯那敏、右氯苯那敏、溴非尼拉敏、右旋溴非尼拉敏、吡咯他敏、曲普利定、异丙嗪、阿利马嗪、甲地嗪、赛克利嗪、氯环利嗪、二苯拉林、苯茚胺、二甲茚定、敏克静、布可立嗪、安他唑、赛庚啶、阿扎他定、特非那定、非索非那定、阿司咪唑、西替利嗪、氮斯汀、阿扎他定、氯雷他定及地洛他定。

又另一类小分子药物是希望降低血脑屏障穿透率的阿片类拮抗剂小分子药物。阿片类拮抗剂包括纳洛酮、N-甲基纳洛酮、6-氨基-14-羟基-17-烯丙基诺地索吗啡、纳曲恩哚、环丙甲羟二羟吗啡酮、N-甲基纳曲酮、纳布芬、布托啡诺、环唑辛、戊唑辛、纳洛芬、纳曲恩哚、纳曲吲哚、诺丙纳托非敏、奥昔啡烷、6-氨基-6-脱氧-纳洛酮、戊唑辛、左洛啡烷甲基纳曲酮、丁丙诺啡、塞克洛凡、左洛啡烷和纳洛芬，以及在美国专利第5,159,081号、第5,250,542号、第5,270,328号及第5,434,171号和Knapp等著的《阿片类拮抗剂的药理》（L.F.TsengEd.,p.15,Harwood Academic Publishers,1995）中描述的阿片类拮抗剂。但是一般而言，包括羟吗啡酮化学类的任意成员（包括上述阿片类拮抗剂，以及羟吗啡酮、可待因、奥施康定、吗啡、盐酸乙基吗啡、二乙酰吗啡、氢吗啡酮、二氢可待因、二氢吗啡及甲二氢吗啡）。

另一类化学小分子药物的是铂配位复合基药物。这些包括，例如顺-铂、氢铂、卡铂和奥沙利铂。

另外一类尤其适宜轭合的小分子药物是类固醇类药物。优选的类固醇在分子结构内有羟基（或可以还原成羟基的酰基）。不约束本发明的类固醇例子包括醛固酮、去氧皮质酮、氟氢可的松、可的松、氢化可的松、强的松龙、强的松、甲羟松、甲泼尼松、阿氰米松、倍氯米松、倍他米松、地塞米松、双氟拉松、双氟美松、甲基泼尼松龙、帕拉米松、安西奈德、地索奈德、氟轻松、氟尼缩松、丙酮缩氟氢羟龙、去炎松、氯倍他索、哈西奈德、莫美他松、氯可托龙及去羟米松。

氟喹诺酮和这一类中相关的小分子药物可用于形成轭合物。典型的氟喹诺酮包括环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、曲伐沙星、阿拉曲沙星、莫西沙星、诺氟沙星、依诺沙星、格帕沙星、加替沙星、洛美沙星、司帕沙星、替马沙星、培氟沙星、氨氟沙星、氟罗沙星、托氟沙星、普卢利沙星、伊洛沙星、帕珠沙星、克林沙星及西他沙星。

一般用于周围神经适应症的又另一类药物，其中一些成员已知可导致畸形，是类维生素A类小分子药物。类维生素A的结构相关类包括但不限于维生素A、视黄醛、3-去氢视黄醇、α-胡罗卜素、β-胡罗卜素、γ-胡罗卜素、δ-胡罗卜素、隐黄素、维生素A酸、异维A酸、依曲替酯及eretin。由于此类小分子药物（或导致畸形的任何类别的药物）的潜在致畸性，所以，我们希望通过完全消除或降低疑为致畸因素的药剂穿透血胎盘屏障，降低对胎儿的潜在危害。

在本文中作为轭合物的一部分使用的小分子药物包括吩噻嗪、二苯并二氮杂、galactogugues（如胃复安）以及噻嗪化物。吩噻嗪的例子包括普鲁氯嗪、羟哌氯丙嗪、三氯甲哌丙嗪和羟哌氟丙嗪。二苯并二氮杂的例子有氯氮平、奥氮平和喹硫平。其它小分子药物包括氨氯地平、硝苯吡啶、尼莫地平、5-羟基色胺酸、类维A酸和异维A酸。另一种首选的药物是内维拉平，这种药物可以轻易地穿透胎盘屏障。

适合在本发明中使用的其它小分子药物可以在一些文献中找到，如：“默克索引”，第13版，Merck&CO.,Inc.(2001)；“AHFS药手册，第2版”，美国卫生系统药师协会和Lippincott、Williams及Wilkins；“医师办公桌参考”，Thomson Healthcare Inc.,2003；及“Remington：药学及实践”，第19版，1995。

利用与取自单分散或双峰低聚物组份的水溶性低聚物共价结合，对上述小分子药物进行改性后，小分子药物的输送和药理属性可以发生重大的改变。利用取自单分散或双峰低聚物组份的水溶性低聚物，可以定制药物的属性，因为生成的轭合物形成明确的组合物，并非呈具有单体亚单元（并因此而为分子量）分布的一系列小分子药物-低聚物轭合物种类的分布状态。如上所述，观察发现，增加或减少那怕是一个单体，对生成的轭合物的属性均会产生显著的影响。可以在合理的时间内筛选不同大小（从1至30个单体亚单元）的离散低聚物矩阵，从而能够定制具有最佳属性的轭合物。

与小分子药物结合时，低聚物能够提供不同于来源小分子药物的属性。也可以使用小低聚物（与典型地与蛋白质结合的5000至6万聚合物链相比）提高药物维持至少一定程度优选为显著程度的生物活性的可能性。表VI（例10）说明了这个特征，该表提供了本发明的典型轭合物的生物活性(EC₅₀)数据。用作说明的PEG低聚物-纳洛酮/纳洛酮轭合物具有范围在约为未改性母体药物的5％-35％的生物活性，进一步证明了本发明化合物的有利特性。

低聚物一般包含两种或多种单体类型，这些单体连续结合，形成一个单体链。低聚物可以由一种单体类型构成（即，同质低聚物）或两种或三种单体类型构成（即，共同低聚物）。每一个低聚物是两种单体的共同低聚物为优选，是同质低聚物则更优选。采用的单体形成可溶于水的低聚物，室温下生理pH值约为7.2-7.6时，低聚物为>95%可溶于水，优选为>99%可溶于水。

相应地，每一个低聚物包含下列最多三种不同的单体类型：环氧烷烃，如乙撑氧或环氧丙烷；烯醇，如乙烯醇、1-丙烯醇或2-丙烯醇；乙烯吡咯烷酮；羟烷基甲基丙烯酰胺或羟烷基异丁烯酸盐，其中，烷基以甲基为优选；α-羟基酸，如乳酸或乙醇酸；磷腈、

唑啉、氨基酸、碳水化合物（如单糖、糖类或甘露醇）；及N-丙烯酰吗啉。优选的单体类型包括环氧烷烃、烯醇、羟烷基甲基丙烯酰胺或异丁烯酸盐、N-丙烯酰吗啉和α-羟基酸。每一个低聚物单独是选自上述一组的两种单体类型的共同低聚物为优选，或者，是选自上述一组的一种单体类型的同质低聚物则更优选。

共同低聚物中的两种单体类型可以是相同的单体类型，例如，两种环氧烷烃，如乙撑氧和环氧丙烷。低聚物为乙撑氧的同质低聚物为优选。通常但非必要，未与小分子共价结合的低聚物的末端被封住使之不具有反应性。末端也可以包括反应基。当末端为反应基时，所选择的反应基或者在最终低聚物形成的条件下或低聚物与小分子药物共价结合期间不起反应，或者受到必要的保护。一种常见的终端功能团是羟基或-OH，尤其是对低聚环氧乙烷而言。

水溶性低聚物（轭合物O-X-D分子式中的“O”）可以具有若干不同几何形状中的任意一种。例如，“O”（在O-X-D分子式中）可以是直线状的、分枝的或分叉的。最典型的是，水溶性低聚物呈直线状或分枝状，例如，有一个枝点。尽管本文的论述更多的是利用聚（环氧乙烷）作为举例说明的低聚物，但本文的论述和结构可以很容易地延伸包含上述水溶性低聚物中的任何一种。

水溶性低聚物的分子量，不包括连接子部分，一般较轻。水溶性聚合物的实例性分子量包括：低于约1500；低于约1400；低于约1300；低于约1200；低于约1100；低于约1000；低于约900；低于约800；低于约700；低于约600；低于约500；低于约400；低于约300；低于约200；及低于约100道尔顿。

水溶性低聚物的实例性分子量（不包括连接子）范围包括：约100至约1400道尔顿之间；约100至约1200道尔顿之间；约100至约800道尔顿之间；约100至约500道尔顿之间；约100至约400道尔顿之间；约200至约500道尔顿之间；约200至约400道尔顿之间；约75至约1000道尔顿之间；及约75至约750道尔顿之间；

水溶性低聚物中的单体数量在下列一个或多个范围内为优选：在约1和约30（包括30）个之间；在约1和约25个之间；在约1和约20个之间；在约1和约15个之间；在约1和约12个之间；在约1和约10个之间。在某些情况下，低聚物（及相应的轭合物）中的连续单体数量为1、2、3、4、5、6、7或8。在其它具体实施方案中，低聚物（及相应的轭合物）包含9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续的单体。在又一些其它具体实施方案中，低聚物（及相应的轭合物）有21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连续的单体。

在水溶性低聚物有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个单体时，这些数值分别对应分子量为75、119、163、207、251、295、339、383、427和471道尔顿的甲氧封端低聚（环氧乙烷）。当低聚物有11、12、13、14或15个单体时，这些数值分别对应分子量为515、559、603、647和691道尔顿的甲氧封端低聚（环氧乙烷）。

在采用双峰低聚物的情况下，低聚物将以上述任何两个数量的单体为中心呈双峰分布。双峰分布中各个峰的多分散性指标Mw/Mn为1.01或更低为佳，1.001或更低更优选，1.0005或更低又更优选。MW/Mn值为1.0000最优选。例如，双峰低聚物可有下列任意一种单体亚单元的实例性组合：1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10等等；2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10等等；3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10等等；4-5、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10等等；5-6、5-7、5-8、5-9、5-10等等；6-7、6-8、6-9、6-10等等；7-8、7-9、7-10等等；及8-9、8-10等等。

另外，本发明的低聚物可以是三峰或甚至四峰，并具有上述范围的单体单元。具有明确的低聚物混合物（即，双峰、三峰、四峰等）的低聚物组合物可以通过混合提纯的单分散低聚物制备，以获得理想的低聚物特征（两种只在单体数量上不同的低聚物混合物为双峰；三种只在单体数量上不同的低聚物混合物为三峰；四种只在单体数量上不同的低聚物混合物为四峰），或者可以通过恢复“中心切口”从多分散低聚物的柱色谱上获取，以获得理想且明确的分子量范围内的低聚物混合物。如图10所示，可以通过商业途径获得的PEG一般是多分散混合物，即便是低分子量的物质也是如此。图示的甲氧-PEG样本经质谱分析，尽管其标签为甲氧-PEG-350，但发现该试剂含有9种不同的PEG低聚物成分，每种成分在单体亚单元数量上不同。为了本发明的目的，也就是说，为了制备具有本文描述的特性的轭合物，多分散聚合物并非特别优选，因为单体数量的细微变化对生成的轭合物有巨大的影响。这些影响在使用多分散低聚物制备的轭合物混合物中可能会得到抑制或甚至无法发现。此外，商业上各批次的多分散聚合物（或低聚物）在成分上经常有很大变化，由于这个原因，因而不是本发明应用的特别优选，各批成分一致性是本文描述的低聚物的理想特性。

如上所述，水溶性低聚物优选是从单分子或单分散的组合物上获取。也就是说，组合物中的低聚物具有相同的离散分子量值，而不是分子量呈分布状态。一些单分散低聚物可以通过商业途径购买，例如向Sigma-Aldrich购买，或者使用由商业途径（如Sigma-Aldrich）可获取的初始原材料直接制备。例如，本发明的低聚乙二醇可以按Chen Y.,Baker,G.L.,J.Org.Chem.,6870-6873(1999)或WO02/098949Al中描述的方法制备。这种低聚物也可以按本文例9描述的方法制备。

如上所述，本发明的一方面是改进了制备单分散低聚物（如低聚（环氧乙烷））的方法。这些低聚物可用于多种应用领域，包括但不限于制备具有前述有利属性的小分子药物-水溶性低聚物的轭合物。

为了提供所需的单分散低聚物，使用了一种新方法。发现卤端基低聚物试剂具有比前述试剂更高的反应性，能够产出更多的单功能产品。

因此，本发明亦包括一种制备单分散低聚物化合物的方法。该方法包括使具有(m)个单体的卤端低聚物（如低聚（环氧乙烷）与具有(n)个单体的羟端基低聚（环氧乙烷）起反应。一般而言，卤端基低聚乙二醇上的卤基是氯、溴或碘。然而，卤基以溴为优选。反应是在有效取代源自卤端基低聚物的卤基的条件下进行，从而形成具有(m)+(n)个单体亚单元的低聚（环氧乙烷）(OEGm+n)，其中，(m)和(n)的范围在1-10之间。也就是说，(m)和(n)分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。(m)和(n)分别为1-6之间为优选。在选定的具体实施方案中，(m)为1、2或3，而(n)在1-6之间。在其它情况下，(m)为1、2或3，(n)在2-6之间。反应一般在有适合将羟端基低聚环氧乙烷的羟基转变为相应的醇盐的强碱存在的情况下进行。合适的强碱包括钠、钾、氢化钠、甲醇钠、甲醇钾、叔丁醇钠和叔丁醇钾。在优选具体实施方案中，卤端基低聚乙二醇具有封端基例如含甲氧基或乙氧基。

代表性的羟端基低聚（乙二醇）对应HO-(CH₂CH₂O)_n-H结构，其中，(n)如上所述。该方法优选地包括转化末端羟基OEG_m+n为卤基-X以形成OEG_m+n-X的步骤。然后重复上述步骤，直至获得具有所要数量的亚单元的单分子低聚物。

示例性反应方案如下：

X=C1,Br，I

2.CH₃O-(CH₂CH₂O)_m+n–H→CH₃(O-CH₂CH₂)_m+n–X

4.CH₃O-(CH₂CH₂O)_m+2n–H→CH₃(O-CH₂CH₂)_m+2n–X

如上所示，该方法包括通过取代反应与两种单分子低聚物结合，其中，一个低聚物上的卤化物，优选为低聚环氧乙烷，更优选为卤派生的低聚环氧乙烷甲醚，与低聚乙二醇-醇盐反应，生成相应的低聚物（见以上反应1）。

醇盐典型地由相应的低聚环氧乙烷在强碱存在下将末端羟基转化为相应的醇盐而生成。反应一般在温度约0℃至约80℃下，在有机溶液例如四氢呋喃“THF”中发生。反应时间典型地为约10分钟至约48小时之间。上述示例性反应生成的产物——封端低聚环氧乙烷，含有卤派生低聚物的单体数量与低聚乙二醇-醇盐中的单体数量的和[(m)+(n)]。如果是提纯的结合物，典型的产量为约25％-75％，最典型的产量为约30-60％。

在以上例子中，如果有必要，反应1的产物羟基末端然后被活化，以便结合小分子。此外，如果需要，上述示例产物的羟基末端[在上述具有(m)+(n)个亚单元的例子中]然后被转化为卤化物，优选为溴化物。乙醇变为烷基卤化物的转化可以直接进行，或者通过媒介如磺酸盐或卤甲酸盐进行。适合进行这种转化的条件和试剂在例如Larock,R.所著的“Comprehensive Organic Transformations”，VCH，1994，第353至363页上找到。

优选的方法是例11中描述的方法。按上述方法，重复进行在低聚环氧乙烷中逐步添加低聚环氧乙烷卤化物，以形成具有(m)+2(n)个单体的低聚环氧乙烷。就这样，离散的低聚环氧乙烷亚单元以受控的方式逐步地被添加到现有的单体（单分子）寡聚乙撑氧产物中，确保制成具有准确亚单元数量的明确的低聚物。

通常可获得的是具有约1-3个单体亚单元的单分子低聚乙二醇(Sigma-Aldrich)。使用卤代寡聚乙二醇试剂代表着对例如使用甲磺酸的现有方法的改进，因为本文描述的方法由于卤化物的活性更强尤其是溴代低聚乙二醇试剂，可以提高产量，缩短反应时间并降低反应条件。如此制备的低聚物典型地在进一步使用之前要先纯化，例如，采用下列方法中的一个或多个：色谱（如HPLC）、离子交换色谱、柱色谱、沉淀或再结晶。然后，可以采用多种分析工艺确定纯度，如NMR、GPC和FTIR。如此形成的产物适合进一步使用。

本发明的连接子或键联结可以是单个原子，如氧或硫，两个原子或多个原子。连接子的性质典型但并非必要为直线状。“X”键（O-X-D分子式中X）具有水解稳定性，优选地也具有酶化稳定性。优选的情况是，“X”键是链长少于约12个原子的键，少于约10个原子更优选，少于约8个原子进而更优选，少于约5个原子再进而更佳，其中，长度系指单链中原子的数量，取代基不计入。例如，像Roligomer-NH-(C=O)-NH-R'_药物这样的尿素键，被认为具有3个原子的链长(-NH-C(O)-NH-)。在本文选择的具体实施方案中，键之间不包含更多的间隔基。优选为小键联结，它们适合本发明，因为像这样的小键联结比较不会统治或超过添加一个或少量单体亚单元对本发明轭合物的输送属性差异的影响。

在一些情况下，“X”连接子具有水解稳定性，并包含醚、酰胺、氨基甲酸酯、胺、硫醚、尿素或碳-碳键。下文所述以及在工作例子中说明的功能团典型地用于形成键联结。如下文进一步描述，键联结也可以较低优选地包含（或邻近或在侧面相接）间隔基。在轭合物的生物活性由于低聚物在母体药物上所处的位置而显著降低的情况下，间隔基最为有效。

更具体而言，在本文选择的具体实施方案中，本发明的连接子可以是下列任何一种：-O-,-NH-,-S-,-C(O)-,C(O)-NH,NH-C(O)-NH,O-C(O)-NH,-C(S)-,-CH₂-,-CH₂-CH₂-,-CH₂-CH₂-CH₂-,-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-,-O-CH₂-,-CH₂-O-,-O-CH₂-CH₂-,-CH₂-O-CH₂-,-CH₂-CH₂-O-,-O-CH₂-CH₂-CH₂-,-CH₂-O-CH₂-CH₂-,-CH₂-CH₂-O-CH₂-,-CH₂-CH₂-CH₂-O-,-O-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-,-CH₂-O-CH₂-CH₂-CH₂-,-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-,-CH₂-CH₂-CH₂-O-CH₂-,-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-O-,-C(O)-NH-CH₂-,-C(O)-NH-CH₂-CH₂-,-CH₂-C(O)-NH-CH₂-,-CH₂-CH₂-C(O)-NH-,-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-,-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-,-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-,-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-,-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-,-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂_CH₂-,-CH₂-CH₂_C(O)-NH-CH₂-CH₂-,-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-,-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-,-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-,-NH-C(O)-CH₂-,-CH₂-NH-C(O)-CH₂-,-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-,-NH-C(O)-CH₂-CH₂-,-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂,-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂,-C(O)-NH-CH₂-,-C(0)-NH-CH₂-CH₂-,-O-C(O)-NH-CH₂-,-O-C(O)-NH-CH₂-CH₂-,-NH-CH₂-,-NH-CH₂-CH₂-,-CH₂-NH-CH₂-,-CH₂-CH₂-NH-CH₂-,-C(O)-CH₂-,-C(O)-CH₂-CH₂-,-CH₂-C(O)-CH₂-,-CH₂-CH₂-C(O)-CH₂-,-CH₂-CH₂-C(O)-CH₂-CH₂-,-CH₂-CH₂-C(O)-,-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-,-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-,-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-、二价环烷基、-N(R6)-，R6是H或选自下列基团的有机自由基：烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基及取代的芳基。

但是，为了本发明的目的，当一序列原子与低聚物片段直接相邻时，被认为不是键联结，这一序列原子仅仅是另一种单体，因而键联结将代表纯粹的低聚物链延伸。

低聚物和小分子之间的“X”键联结，典型地通过低聚物末端的功能团与小分子药物内相应的功能团反应而形成。下文简要地描述了例举的反应。例如，低聚物上的氨基“O”可与小分子上的羧酸脂或活性羧酸脂衍生物反应，或反之生成酰胺键。或者，低聚物上的胺与药物上的活化碳酸盐（如，琥珀酰亚胺或苯三氨基碳酸盐）反应，或反之形成氨基甲酸酯键。低聚物上的胺与药物上的异氰酸盐(R-N=C=O)反应，形成尿素键(R-NH-(C=O)-NH-R')。进一步，低聚物上的乙醇（醇盐）基与药物内的烷基卤化物或卤基反应，形成醚键。在又另一种结合方法中，具有醛功能的小分子通过还原性胺化与低聚物氨基结合，从而在低聚物和小分子之间形成仲胺键。

特别优选的低聚物是具有醛功能团的低聚物。在这方面，低聚物具有下列结构：CH₃O-(CH₂-CH₂-O)_n-(CH₂)_p-C(O)H，其中，(n)为1、2、3、4、5、6、7、8、9和10中的任何一个数，(p)为1、2、3、4、5、6和7中的任何一个数。优选的(n)值包括3、5和7，优选的(p)值包括2、3和4。另外，-C(O)H部分上的碳原子α可以任选用烷基替代。低聚物试剂作为单分散组合物提供为优选。

典型地，没有功能团的低聚物末端被封住，使其不具有反应性。如果低聚物在末端除了用于形成轭合物的功能团以外另有一个功能团，那么所选择的功能团或者在形成“X”键的条件下不起反应，或者在形成“X”键的过程中受到保护。

如上所述，低聚物包括用于形成具有本文所述属性的小分子轭合物的功能团。取决于小分子内或进入小分子内的反应基，该功能团典型地包含亲电或亲核基团，以与小分子共价结合。在低聚物或小分子中可能存在的亲核基团的例子包括羟基、胺、肼(-NHNH₂)、酰肼(-C(O)NHNH₂)及硫醇。优选的亲核物质包括胺、肼、酰肼和硫醇，特别是胺。与低聚物共价结合的大多数小分子药物将具有游离羟基、氨基、硫代、醛、酮或羧基。

在低聚物或小分子中可能存在的亲电子功能团的例子包括羧酸、羧酸脂、酰亚胺酯、原酸酯、碳酸盐、异氰酸盐、异硫氰酸酯、乙醛、酮、硫、烯烃、丙烯酸盐、异丁烯酸盐、丙烯酰胺、砜、马来酰亚胺、二硫化物、碘、环氧、磺酸盐、硅烷、烷氧硅烷及卤硅烷。这些基团更为具体的例子包括琥珀酰亚胺酯或碳酸盐、咪唑酯或碳酸盐、苯并三唑酯或碳酸盐、乙烯基砜、氯乙基砜、乙烯基吡啶、吡啶二硫化物、碘代乙酰胺、乙二醛、二酮、甲磺酸盐、甲苯磺酸甲酯和三聚丙烯酸酯(2,2,2-trifluoroethanesulfonate)。

也包括几个这些基的硫类似物，如硫酮、硫酮水合物、酮缩硫醇等，以及水合物或上述任何成分的受保护衍生物（例如，醛水合物、半缩醛、乙缩醛、酮水合物、半酮缩醇、缩酮、酮缩硫醇、硫缩醛）。另一种有效的轭合试剂是2-噻唑硫酮。

如上所述，羧酸的“活化的衍生物”系指容易与亲核试剂反应的羧酸衍生物，一般比未衍生的羧酸更容易得多。活性羧酸包括，例如，酸性卤化物（如酰基氯）、酐、碳酸盐和酯。这些酯包括一般形态(-(CO)O-N[(CO)-]₂)的酰亚胺酯；例如，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯或N-羟基邻苯二甲酰亚胺酯。亦是以咪唑基酯和苯并三唑酯为佳。尤其是以活性丙酸或丁酸酯为优选，如共同拥有的美国专利第5,672,662号所述。这些包括-(CH₂)_2-3C(=O)O-Q形态，其中，Q选自N－琥珀酰亚胺、N－硫代琥珀酰亚胺、N－苯邻二甲酰亚胺、N－戊二酰亚胺、N－四氢邻苯二甲酰亚胺、N－降冰片-2、3-二羧甲酰亚胺、苯并三唑酯、7－偶氮苯并三氮唑及咪唑。

其它优选的亲电基团包括琥珀酰亚胺碳酸酯、马来酰亚胺、苯并三唑碳酸盐、缩水甘油醚、咪唑碳酸盐、p-硝基苯基碳酸酯、丙烯酸盐、三聚丙烯酸酯、醛及邻吡啶基二硫化物。

这些亲电基团与亲核试剂（如羟基、硫代或氨基）反应，生成各种结合类型。本发明的优选反应是能够支持形成水解稳定的键联结的反应。例如，包括原酸酯、琥珀酰亚胺酯、咪唑基酯和苯并三唑酯的羧酸及其活性衍生物与上述类型的亲核试剂反应，分别形成酯、硫酯和酰胺化合物，其中，酰胺化合物的分解稳定性最高。如上所述，在低聚物和药物之间具有水解稳定键联结的轭合物为最佳。碳酸盐，包括琥珀酰亚胺、咪唑基和苯并三唑碳酸盐，与氨基反应，形成氨基甲酸盐。异氰酸盐(R-N=C=O)与羟基或氨基反应，分别形成氨基甲酸盐(RNH-C(O)-OR')或尿素(RNH-C(O)-NHR')键。醛、酮、乙二醛、二酮及其水合物或乙醇加合物（即，醛合水、半缩醛、乙缩醛、酮水合物、半酮缩醇和酮缩醇）与胺反应为佳，然后，如果需要，还原生成的亚胺，以提供胺键（还原性胺化）。

可以在一些亲电子功能团团包括亲电子双键上添加亲核基团例如硫醇，形成亲电子双键，例如硫醚键。这些基团包括马来酰亚胺、乙烯基砜、乙烯基嘧啶、丙烯酸盐、异丁烯酸盐和丙烯酰胺。其它基团包含可用亲核试剂取代的离去基团；这些基团包括氯乙基砜、吡啶二硫化物（包括可裂的S-S键）、碘代乙酰胺、甲磺酸、甲苯磺酸甲酯、硫代磺酸盐和三聚丙烯酸酯。环氧化物通过开环与亲核试剂反应，以形成例如醚或胺键。在低聚物和小分子上发生的、涉及前文所述的互补反应基团的反应被用来制备本发明的轭合物。

例如，例1详细地介绍了类维生素A酸寡聚轭合物的制备。小分子即含有反应性羧基的类维生素A酸与氨基活性低聚乙二醇结合，提供具有氨基的轭合物，该氨基将小分子与低聚物键联结共价键。例1也描述了PEG 3-体（具有3个乙二醇单体亚单元的寡聚乙二醇）、PEG 7-体及PEG 11-体与类维生素A酸共价结合。

例4描述了低聚物-纳洛酮轭合物的制备。在这一代表性的合成中，在保护芳香羟基后，纳洛酮中的酮基还原为相应的羟基，然后与低聚乙二醇结合，生成一个与小分子轭合物键联结的醚(-O-)。有趣的是，在本例中，纳洛酮中羟基的还原导致形成两个在羟基取向上不同的异构体。相应的寡聚轭合物得以制备和分离，显示出具有一些不同的特性，这将在下文详细地论述。这代表了本发明的另一个特征，即，低聚物-小分子轭合物的单个单体的制备/分离及其使用。

如前文所述，本发明的轭合物表现出了较低的生物屏障穿透率。此外，轭合物保持了未改性母体小分子药物活性的至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或更多。对于具有多个适合改性的反应活性部位的特定小分子药物，可能有必要进行分子模型，或在生物体内或在生物体外进行生物活性测定，以评估生成的轭合物的生物活性和确定最适合与低聚物共价结合的部位。参见表VI中各种纳洛酮和派生纳洛酮、6-NH2-纳洛酮及6-OH-纳洛酮低聚轭合物的示例性生物活性数据。在这份研究中，变量包括母体药物上化学改性的部位、共价键的类型、立体化学以及与药物部分共价结合的低聚物的大小。如数据所示，轭合物的生物活性为母体药物的约5％至约35％。

已经发现，水溶性小低聚物与具有口服生物利用度的小分子药物稳定共价结合，可以显著地改变这些小分子的属性，使它们在临床上更有效。更具体而言，与单分散低聚物例如低聚环氧乙烷的共价结合可以有效地降低，或者在某些情况下，消除药物输送穿过血脑屏障，从而显著地降低中枢神经系统相关的副作用。最佳大小的低聚物的典型选择方法如下。

首先，从单分散或双峰水溶性低聚物获得的低聚物与小分子药物轭合。优选的情况是药物具有口服生物利用度并自己表现出生物膜穿透率。下一步，使用适当的模型以及与未改性的母体药物相比，确定轭合物穿透生物膜的能力。如果结果良好，也就是说，如果穿透率显著降低，则进一步评估轭合物的生物活性。根据本发明的有利的轭合物应具有生物活性，因为其键具有水解稳定性，不会造成未改性药物在服用时释放。因而，轭合状态的药物应该具有生物活性，相对于母体药物而言保持较高的生物活性水平为佳，即，高于母体药物生物活性的约30％，高于母体药物生物活性的约50％更佳。

然后，使用单体类型相同但具有不同数量的亚单元的低聚物，重复以上步骤。

因为胃肠管道（“GIT”）限制了食物和药物从消化内腔向血液和淋巴输送，所以，GIT代表了轭合物必须受试的另一种屏障。但是，当轭合物用于口服在体循环中输送时，GIT屏障代表了一种不得阻止轭合物的屏障。GIT屏障由通过肠上皮细胞中的紧密接合部连接的连续肠细胞层构成。

然后，对穿透生物膜的能力比非轭合小分子药物降低了的每一种轭合物评估其口服生物利用度。基于这些结果，也就是说，基于在小分子内的特定位置或部位连续添加递增数量的离散单体到特定的小分子上，可能可以确定能最有效地提供在生物膜穿透率降低、口服生物利用度和生物活性之间具有最佳平衡的轭合物的低聚物大小。由于低聚物较小，使得这种筛选可行，使我们能够有效地定制生成的轭合物的属性。通过低聚物大小的细微的递增变化，并利用试验设计方法，我们可以有效地找到在生物膜穿透率、生物活性及口服生物利用度之间具有有利平衡的轭合物。在某些情况下，按本文描述与低聚物结合可以有效地提高药物的口服生物利用度。

例如，通过先制备一系列重量不等和具有不同功能团的低聚物，然后，给患者使用轭合物并定期进行血液及/或尿液取样，获得必要的清除曲线图，那么本技术领域的普通技术人员使用常规实验，都可以找到最合适的分子大小和键联结，以提高口服生物利用度。一旦获得了每一种受试轭合物的一系列清除曲线图，即可确定合适的轭合物。

动物模型（啮齿动物和狗）也可用于研究口服药物的输送情况。此外，非生物体内方法包括啮齿动物外翻内脏切离组织和Caco-2细胞单层组织-培养模型。这些模型在预测口服药物生物利用度方面很有用。

本发明亦包括与药物赋形剂结合的本文描述之轭合物的药物制剂。一般而言，轭合物本身将会是固体状态（例如，沉淀物），可以通过固体或液体状态的合适药物赋形剂结合在一起。

典型的赋形剂包括但不限于碳水化合物、无机盐、抗菌剂、抗氧化剂、表面活性剂、缓冲剂、酸、碱及它们的组合。

碳水化合物（如糖）、衍生的糖（如醛醇）、醇醛酸、酯化糖及/或糖聚合物可以作为赋形剂存在。具体的碳水化合物赋形剂包括，如：单糖，如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖及类似物；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖及类似物；多醣，如蜜三糖、松三糖、麦芽糊精、右旋糖苷、淀粉及类似物；及醛醇，如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、山梨糖醇（葡萄糖醇）、吡喃葡萄糖山梨醇、肌醇及类似物。

赋形剂亦可包括无机盐或缓冲剂，如柠檬酸、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硝酸钾、磷酸一钠、磷酸氢二钠及其组合。

制备亦可包括抗菌剂，以预防或阻止微生物的生长。适合本发明的抗菌剂的非约束性例子包括杀藻胺、杀藻氯、苯甲醇、十六烷基氯化砒啶、三氯叔丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞、噻汞撒及其组合。

制备也可存在抗氧化剂。抗氧化剂用于预防氧化，从而预防轭合物或制剂的其它成分变质。适宜在本发明中使用的抗氧化剂包括，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁醇改性甲氧基苯酚、丁醇改性羟基甲苯、次磷酸、硫代甘油、酸丙酯、亚硫酸氢钠、醛次硫酸氢钠、焦亚硫酸钠及其组合。

表面活性剂可以作为赋形剂存在。实例性的表面活性剂包括：聚山梨醇酯，如“Tween 20”和“Tween 80”，及pluronics，如F68和F88（二者均可向BASF、Mount Olive和New Jersey购买）；山梨聚糖酯；脂质，如磷脂、卵磷脂和其它磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺（尽管不呈脂质体为优选）、脂肪酸和脂肪族醚；类固醇，如胆固醇；及螯合剂，如EDTA、锌和其它合适的此类阳离子。

制备可能作为赋形剂存在的酸和碱基。可以使用的酸的非约束性例子包括选自盐酸、乙酸、磷酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、蚁酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、硫酸、富马酸及这些酸的组合的酸。合适的碱的例子包括但不限于选自氢氧化钠、乙酸钠、氢氧化铵、氢氧化钾、醋酸铵、乙酸钾、磷酸钠、磷酸二氢钾、柠檬酸钠、甲酸钠、硫酸钠、硫酸钾、丁烯二酸钾及其这些碱的组合而成的碱。

轭合物在此合成物中的量可依据若干因素而有所差异，但在合成物储存在单元剂量容器内时，将会是最佳治疗有效剂量。治疗有效剂量可以通过重复服用递增的轭合物量的实验进行确定，以确定哪个量能够产生临床上期望的终点。

组合物中任何个体赋形剂的量基于赋形剂的活性和组合物的特殊需要而变化。典型地，任何个体赋形剂的最佳量通过常规试验来确定，即，通过制备含不同量的赋形剂（从低到高）的组份，检查稳定性和其它参数，然后确定在哪个范围可以获得最佳性能，不会造成严重的不良影响。

但是，一般而言，赋形剂在组合物中的重量占约1％至约99％，5%-98%为优选，15-95%更优选，浓度低于30％最优选。

前述药物赋形剂及其它赋形剂在下列文献中有描述：“Remington：药学及实践”，第19版，Williams&Williams，1995，“医师办公桌参考”，第52期，卫生经济学，Montvale,NJ(1998)，和kibbe A.H.,药物赋形剂手册，第3版,美国药物协会，华盛顿市，2000。

药物组合物可以呈多种形态，本发明在这方面不受限制。典型的制剂优选地采用适合口服的形态，如药片、囊片、胶囊、凝胶药丸、片剂、分散体、悬浮物、溶液、甘香酒剂、糖浆、锭剂、透皮贴剂、喷雾、栓剂和粉末。

具有口服活性的轭合物以口服剂量状态为佳，包括药片、囊片、胶囊、凝胶药丸、悬浮物、溶液、甘香酒剂和糖浆，也可以包含可选择装入胶囊内的颗粒、珠、粉末或小球。这些剂量状态使用为药物配方领域的人士所知的常规方法进行制备，在相关文本中有描述。

例如，利用标准的药片加工方法和设备，可以生产药片和囊片。制备含本文描述的轭合物的药片或囊片时，采用直接压缩和成粒工艺为佳。除轭合物之外，药片和囊片一般会包含药物学上可接受的惰性载体物质，如粘结剂、滑润剂、分解质、填充剂、稳定剂、表面活性剂、着色剂等。粘结剂用于增强药片的粘结属性，从而确保药片保持完好。合适的粘结剂材料包括但不限于淀粉（包括玉米淀粉和预糊化淀粉）、凝胶、糖（包括蔗糖、葡萄糖、右旋糖和乳糖）、聚乙二醇、蜡和天然及合成胶，例如阿拉伯胶藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素聚合物（包括羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素及类似物）及Veegum。滑润剂用于使药片生产更容易，提高粉末流动性和预防微粒在压力解除时包覆顶端（即微粒破损）。有效的润滑剂有硬脂酸镁、钙镁和硬脂酸。崩解剂用于促进药片的崩解，一般为淀粉、粘土类物质、纤维素、褐藻胶、胶体或交叉键联结的聚合物。填充剂包括二氧化硅、二氧化钛、矾土、滑石、高岭土、粉末状纤维素和微晶纤维素等物质、以及甘露醇、尿素、蔗糖、乳糖、葡萄糖、氯化钠和山梨糖醇等可溶性物质。本技术领域众所周知的稳定剂被用来抑制或减缓分解反应，其中包括氧化反应。

胶囊也是理想的口服剂形态，含有轭合物的组合物可以作为液体或凝胶体（用于凝胶药丸）或固体（包括微粒，如颗粒、珠状、粉末或小球状）装入胶囊。合适的胶囊包括硬的和软的胶囊，一般由凝胶、淀粉或纤维物质制作而成。两半组成的硬凝胶胶囊是以密封的为佳，例如用凝胶带或类似物密封。

包括实质干燥形态的肠胃外制剂（一般作为冻干剂或沉淀物，可以是粉末或块状形态），以及用于注射而制备的制剂，一般为液体，需要重组肠胃外制剂的干燥状态。合适的稀释液包括注射用抑菌水、含5％葡萄糖的水、磷酸盐缓冲盐水、Ringer溶液、盐水、无菌水、脱离子水及其组合。

在某些情况下，用于肠胃外投药的组合物可以是非水溶液、悬浮物或乳状液的状态，每一种一般均为无菌。非水溶剂或媒介物的例子有丙二醇、聚乙二醇、植物油（如橄榄油和玉米油）及可注射的有机酯（如油酸乙酯）。

本文描述的肠胃外制剂亦可包含佐药，如保存剂、润湿剂和分散剂。通过采用杀菌剂，细菌保留过滤器过滤、照射或加热，这些制剂以无菌的方式提供。

轭合物亦可使用常规的药膏贴或其它经皮给药机制，通过皮肤给药，其中，轭合物包含在作为送药装置的一个层状结构内，粘贴在皮肤上。在这种结构内，轭合物包含在一个层即“储存层”中，位于上部背面层的下方。层状结构可以包含单个储存层，或包含多个储存层。

本发明亦提供一种给患有对本文描述之轭合物治疗有反应的病症的患者服用轭合物的方法。该方法包括服用（一般是口服）达到治疗效果所需量的轭合物（作为药物制剂的一部分提供为佳）。也可以采用其它给药方式，例如肺部、鼻部、口腔、直肠、舌下、皮肤渗透给药和肠胃外投药。在本文中，“肠胃外投药”包括皮下注射、静脉注射、动脉注射、腹腔内注射、心内注射、胸腔内注射和肌肉注射。

在采用肠胃外投药的情况下，可能有必要使用比前述低聚物稍大一些的低聚物，即分子量范围在约500至3万道尔顿之间（例如，分子量约为500、1000、2000、2500、3000、5000、7500、10000、15000、20000、25000、30000道尔顿或甚至更大）。

给药方法可用来治疗可以通过使用该特定轭合物治疗或预防的任何病症。本技术领域普通技术人员知道某特定的轭合物能够有效地治疗哪种病症。根据受治疗者的年龄、体重和一般状况以及病症的严重程度、医疗人员的判断和所使用的轭合物的不同，使用的实际剂量可能有所差异。达到治疗效果所需的量已为本技术领域的熟练技术人员所知及/或在相关的参考文章和文献中有描述。一般而言，达到治疗效果所需的量将会在0.001毫克至100毫克之间，剂量在0.01毫克/天至75毫克/天之间为优选，0.10毫克/天至50毫克/天更优选。

根据临床医师的判断、患者的需要等情况，可以按多种给药方案给与单位剂量的特定轭合物（仍是作为药物制剂的一部分提供为佳）。具体的服药方案已为本技术领域的普通技术人员所知，或者可以使用常规方法进行实验确定。典型的给药方案包括但不限于每天五次、每天四次、每天三次、每天两次、每天一次、每周三次、每周两次、每周一次、每月一次以及上述频率的任意组合。一经达到临床终点，即应停止给与合成药剂。

服用本发明的轭合物的一个好处是，相对于母体药物而言，可以降低首过代谢。有关实例，请参见例8中的支持性结果。这种结果对于许多实质上通过内脏进行代谢的口服药物有利。如此一来，轭合物的间隙便可以通过选择低聚物的分子大小、键联结以及选择共价结合的位置达到提供所需的间隙属性进行调节。基于本文的讲述，本技术领域的普通技术人员能够确定低聚物的理想分子大小。与相应的非轭合小分子药物相比，优选的轭合物首过代谢降低包括：至少约10％，至少约20％，至少约30％；至少约40％；至少约50％；至少约60％，至少约70％，至少约80％及至少约90％。

因此，本发明提供了一种降低活性剂代谢的方法。该方法包括下列步骤：提供单分散或双峰轭合物，每一种轭合物包括从通过稳定键联结与水溶性低聚物共价结合的小分子药物上得到的一部分，其中，和未与水溶性低聚物结合的小分子药物的代谢率相比，轭合物表现出较低的代谢率；以及给患者使用轭合物药物。典型地，通过选自下列一组给药类型的一种进行给药：口服、皮肤渗透给药、口腔含化给药、粘膜渗透给药、阴道给药、直肠给药、肠胃外投药及肺部给药。

尽管轭合物可以有效地降低许多类型的代谢（包括阶段I和阶段II代谢），但当轭合物内的小分子药物被肝酶（例如，一个或多个P450细胞色素异构体）及/或被一种或多种肠酶代谢时，轭合物尤其有效。

附图简要说明

图1是给Sprague Dawley大鼠使用13-cis视黄酸（简称“13-cis-RA”）及其典型的小PEG轭合物（PEG₃-13-cis维胺脂（retinamide），“PEG₃-13-cis RA”；PEG₅-13-cis维胺脂，"PEG₅-13-cisRA；PEG₇-13-cis维胺脂，"PEG7-13-cis RA；及PEG₁₁-13-cis维胺脂，“PEG₁₁-13-cis RA”）后血浆浓度随时间的变化图。详细说明见例7。

图2是给Sprague Dawley大鼠使用6-纳洛酮（naloxol）及其典型的小PEG轭合物（3-基体、5-基体、7-基体）后血浆浓度随时间的变化图。详细说明见例7。

图3描绘PEG链长对各种PEG-13-cis-RA轭合物和13-cis-RA在Sprague-Dawley大鼠肠内输送（作为口服生物利用度的一个指标）的影响。

图4描绘不同大小的PEG-基体的共价结合对13-cis-RA和各种PEG-13-cis-RA轭合物的血脑屏障输送的影响。

图5描绘不同大小的PEG-基体的共价结合对纳洛酮和PEG_n-Nal的肠内输送（作为口服生物利用度的一个指标）的影响。

图6显示不同大小的PEG-基体的共价结合对纳洛酮和PEG_n-Nal的血脑屏障输送的影响。

图7描绘在口腔强饲后纳洛酮和PEG_n-Nal在大鼠体内的药物动力学。

图8和图9描绘不同大小的PEG-基体的共价结合对纳洛酮代谢物和PEG_n-Nal代谢物水平的影响。

图10是从商业供应源(Sigma-Aldrich)处获得的甲氧基-PEG-350的质谱。通过分析可见，尽管该试剂作为具有分子量350的甲氧基-PEG出售，但该试剂其实是9种不同的PEG低聚物的混合物，其单体亚单元的数量在大约7至大约15的范围内。

具体实施方式

实验

尽管本发明采用与一些优选具体实施方案结合进行描述，但前面的描述及其后的例子仅为举例说明而非限制本发明的范围。本发明所涉技术领域的熟练技术人员显然可见属于本发明范围的其它方面、优势和改性。

除非另有说明，否则，随附的例子中所有化学试剂均可通过商业途径获得。例9描述了单分子PEG-基体药剂的例子。通过反相色谱法测定，以下例子中使用的所有低聚乙二醇甲基醚都是单分散的且色谱分析是纯的。

所有¹H NMR（核磁共振）数据均由Bruker制造的300MHzNMR分光计产生。下面列出一些化合物以及这些化合物的来源。

2-溴乙基甲醚，92%，Aldrich；

1-溴-2-（2-甲氧基乙氧基）乙烷，90％，Aldrich；

CH3(OCH2CH2)3Br，由CH3(OCH2CH2)3OH制得；

三（乙二醇）单甲醚，95％，Aldrich；

二（乙二醇），99%，Aldrich；

三（乙二醇），99%，Aldrich；

四（乙二醇），99%，Aldrich；

五（乙二醇），98%，Aldrich；

六（乙二醇），97%，Aldrich；

氢化钠，95%干粉，Aldrich；

甲磺酰基氯化物，99％，ACE；

四丁基铵溴化物，Sigma。

例1

CH ₃ (OCH ₂ CH ₂ ) ₃ -NH-13-顺式-维胺脂(retinamide)

(PEG ₃ -13-顺式-RA)的合成

制备PEG₃-13-顺式-RA。合成概述如下。

0.1085克CH₃(OCH₂CH₂)₃-NH₂（0.6656毫摩尔）、0.044克1-羟基苄基三唑（“HOBT”，0.3328毫摩尔）及0.200克13-顺式-类维生素A（“13-cis-RA”，0.6656毫摩尔）溶解在10毫升的苯中。在得到的溶液中加入0.192克1,3-二环已基碳化二亚胺（“DCC”，0.9318毫摩尔），反应混合物在室温下搅拌一个晚上。过滤反应混合物，采用旋转蒸发除去溶剂。粗制的半成品在真空下进一步干燥后，溶解在20毫升二氯甲烷中得到有机相，有机相用15毫升去离子水清洗两次。在Na₂SO₄上干燥，过滤，并使用旋转蒸发除去溶剂。在得到的产物中加入2滴含50ppm丁基化羟甲苯的二氯甲烷，产物在真空下干燥。产出0.335克¹H NMR(DMSO)：δ1.02（单态，2CH₃），1.67（单态，CH₃），3.5（广域多重态，PEG），6.20（m，3H)。

例2

CH ₃ -(OCH ₂ CH ₂ ) ₇ -NH-13-顺式-维胺脂

(PEG 7-13-顺式-RA)的合成

0.2257克CH₃(OCH₂CH₂)₇-NH₂（0.6656毫摩尔）、0.044克1-羟基苄基三唑（0.3328毫摩尔）及0.200克13-顺式-类维生素A（0.6656毫摩尔）溶解在10毫升的苯中。在制成的溶液中加入0.192克1,3-二环已基碳化二亚胺（0.9318毫摩尔），生成的反应混合物在室温下搅拌一个晚上。过滤反应混合物，旋转蒸发除去溶剂，产物在真空下干燥后，溶解在20毫升二氯甲烷中，用15毫升去离子水清洗溶液两次得到有机相。有机相在Na₂SO₄上干燥，过滤，并旋转蒸发除去溶剂。在得到的产物中加入2滴含50ppm丁基化羟甲苯的二氯甲烷，产物在真空下干燥。产出0.426克¹H NMR(DMSO)：δ1.01（单态，2CH₃），1.68（单态，CH₃），3.5（广域多重态，PEG），6.20（m，3H)。

CH₃-(OCH₂CH₂)₅-NH-13-顺式-维胺脂可以使用这个方法类似地制备，但CH₃(OCH₂CH₂)₇-NH₂用CH₃(OCH₂CH₂)₅-NH₂("mPEG₅-NH₂")代替。

例3

CH ₃ -(OCH ₂ CH ₂ ) ₁₁ -NH-13-顺式-维胺脂的合成

(PEG ₁₁ -13-cis-RA)

0.349克CH₃(OCH₂CH₂)₁₁-NH₂（0.6789毫摩尔）、0.044克1-羟基苄基三唑（0.3328毫摩尔）及0.204克13-顺式-类维生素A（0.6789毫摩尔）溶解在10毫升的苯中。在制成的溶液中加入0.192克1,3-二环已基碳化二亚胺（0.9318毫摩尔），生成的反应混合物在室温下搅拌一个晚上。过滤反应混合物，旋转蒸发馏去溶剂，产物在真空下干燥后，溶解在20毫升二氯甲烷中，溶液用15毫升去离子水清洗两次，得到有机相。有机相在Na₂SO₄上干燥，过滤，并旋转蒸发馏去溶剂。在得到的产物中加入2滴含50ppm丁基化羟甲苯的二氯甲烷，产物在真空下干燥。产出0.541克¹H NMR(DMSO)：δ1.01（单态，2CH₃），1.68（单态，CH₃），3.5（广域多重态，PEG），6.20（m，3H)。

例4

PEG ₃ -3-纳洛酮的合成

纳洛酮（典型的小分子药物）的结构如下：

纳洛酮

此分子（具有受保护的羟基）作为例5描述的更大合成方案的一部分来制备。

例5

α,β-6-CH ₃ -(OCH ₂ CH ₂ ) ₁ -纳洛酮(α,β-PEG ₁ -Nal)的合成

制备α,β-PEG_l-纳洛酮。合成概述如下：

5.A.3-MEM-纳洛酮的合成

将二异丙基乙胺（390毫克，3.0毫摩尔）加到纳洛酮HC1·2H₂0（200毫克，0.50毫摩尔）的CH₂C1₂（10毫升）溶液中，边加边搅拌。然后将甲氧基已基氯化物（“MEMCl”，250毫克，2.0毫摩尔）滴加到上述溶液中。溶液在室温下N₂气氛中搅拌一个晚上。

用HPLC分析粗制的产物，显示产出3-MEM-O-纳洛酮（1），产率97％。旋转蒸发除去溶剂，得到粘油。

5.B.3-MEM-纳洛酮（2）的α和β差向异构体混合物的合成

将3毫升0.2N NaOH加到5毫升3-MEM-纳洛酮（1）（从上述5.A中获得，不进一步提纯而直接使用）的乙醇溶液中。在上述溶液中滴加NaBH₄（76毫克，2.0毫摩尔）的水溶液（1毫升）。得到的溶液在室温下搅拌5小时。旋转蒸发除去乙醇，然后加入0.1N HCl溶液，消除多余的NaBH₄，将pH值调整为1。用CHC1₃冲洗溶液，除去多余的甲氧基已基氯化物及其衍生物（3×50毫升），然后加入K₂CO₃，使溶液的pH值提高到8.0。用CHC1₃（3×50毫升）析取产物，产物在Na₂SO₄上干燥。蒸发除去溶剂，产出无色的粘性固体（192毫克，0.46毫摩尔，基于纳洛酮HCl·2H₂O的分离产率为92％）。

HPLC显示，产物为3-MEM-纳洛酮的α和β差向异构体混合物（2）。

5.C.6-CH₃-OCH₂CH₂-O-3-MEM-纳洛酮的α和β差向异构体混合物（3a）的合成

将NaH（溶解在矿物油中，含量60％，55毫克，1.38毫摩尔）加到6-羟基-3-MEM-纳洛酮（2）（192毫克，0.46毫摩尔）的二甲基甲酰胺（“DMF”，6毫升）溶液中。混合物在室温下N₂气氛中搅拌15分钟，随后加入2-溴乙甲醚（320毫克，2.30毫摩尔）的DMF溶液（1毫升）。然后，溶液在室温下N₂气氛中搅拌3小时。

HPLC分析显示形成了α-和β-6-CH₃-OCH₂CH₂-O-3-MEM-纳洛酮（3）混合物，产率约为88％。旋转蒸发除去DMF，产出粘性的白色固体。产物无进一步提纯，直接在随后的转化中使用。

5.D.6-CH₃-OCH₂CH₂-纳洛酮（4）的α和β差向异构体混合物的合成

将粗制成的α-和β-6-CH₃-OCH₂CH₂-O-3-MEM-纳洛酮（3）溶解在5毫升CH₂C1₂中，形成混浊的溶液，然后在溶液中加入5毫升三氟醋酸（“TFA”）。生成的溶液在室温下搅拌4小时。根据HPLC化验确定反应结束。用旋转蒸发器除去CH₂C1₂，然后加10毫升的水。在溶液中加入足量的K₂CO₃，消除多余的TFA并将pH调整为8。然后用CHCl₃（3×50毫升）析取溶液，将析取物混合并用0.1N HCl溶液（3×50毫升）进一步析取，得到水相。加入K₂CO₃，使水相的pH调整为8，然后用CHCl₃（3×50毫升）进一步析取。将得到的有机层混合，然后用Na₂SO₄干燥。除去溶剂，产出无色的粘性固体。

固体产物两次通过洗提液为CHCl₃/CH₃OH(30:1)的硅胶柱（2厘米x30厘米）进行提纯，产物为粘性固体。用¹H NMR确定提纯后的产物为含有ca.30%α差向异构体和ca.70%β差向异构体的6-CH₃-OCH₂CH₂-纳洛酮（4）的α-和β差向异构体[100毫克，0.26毫摩尔，基于6-羟基-3-MEM-纳洛酮（2）的分离产率为56%]。

¹H NMR(δ,ppm,CDC1₃)：6.50-6.73（2H，多重态，纳洛酮的芳族质子），5.78（1H，多重态，纳洛酮的烯族质子），5.17（2H，多重态，纳洛酮的烯族质子），4.73（1H，双重态，α纳洛酮的C₅质子），4.57（1H，双重态，β纳洛酮的C₅质子），3.91（1H，多重态，纳洛酮的C₆质子），3.51-3.75（4H，多重态，PEG），3.39（3H，单态，PEG的甲氧基质子，α差向异构体），3.36（3H，单态，PEG的甲氧基质子，β差向异构体），3.23（1H，多重态，β纳洛酮的C₆质子），1.46-3.22（14H，多重态，纳洛酮质子）。

例6

6-CH ₃ -(OCH ₂ CH ₂ ) ₃ -纳洛酮（α,β-PEG3-纳洛酮）的合成

6.A.6-CH₃-(OCH₂CH₂)₃-O-3-MEM-纳洛酮的α和β差向异构体混合物的合成

将NaH（溶解在矿物油中，含量60％，38毫克，0.94毫摩尔）加到3-MEM-纳洛酮[98毫克，0.24毫摩尔，从例5中获得，在例5示意图中显示为（2）]的二甲基甲酰胺（“DMF”8毫升）溶液中。溶液在室温下N₂气氛中搅拌15分钟，然后加入CH₃-(OCH₂CH₂)₃Br（320毫克，1.41毫摩尔）的DMF（1毫升）溶液。然后，生成的溶液在N₂下油浴加热2小时。

HPLC分析显示，所要的产物—α-和β-6-CH₃-(OCH₂CH₂)₃-O-3-MEM-纳洛酮混合物的产率约为95％。旋转蒸发除去DMF，产出粘性的白色固体。粗制的产物不进一步提纯直接使用。

6.B.6-CH₃-(OCH₂CH₂)₃-O-纳洛酮(α,β-PEG₃-Nal)α和β差向异构体的合成

将上述6.A粗制而成的α-和β-6-CH₃-(OCH₂CH₂)₃-O-3-MEM-纳洛酮混合物溶解在3毫升CH₂C1₂中，形成混浊的溶液，加入4毫升三氟乙酸（“TFA”）。生成的溶液在室温下搅拌4小时。HPLC分析显示反应结束。旋转蒸发除去溶剂CH₂C1₂。在得到的溶液中加入5毫升水，然后加入K₂CO₃，消除多余的TFA并调整pH为8。然后，用CHC1₃（3×50毫升）析取溶液。CHC1₃析取物混合后，再用0.1N HC1溶液（3×50毫升）析取。在剩下的水相中再次加入K₂CO₃，使pH调整为8，然后用CHC1₃（3×50毫升）析取。有机析取物混合后，在Na₂SO₄上干燥。然后，除去溶剂，获得无色的粘性固体。

上述固体两次通过洗提液为CHCl₃/CH₃OH(30:1)的硅胶柱（2厘米x30厘米）进行提纯。提纯后的产品是6-CH₃-(OCH₂CH₂)₃-O-纳洛酮的α和β差向异构体的混合物，其中α和β差向异构体的量大致相等，混合物具有NMR的特性。（46毫克，0.097毫摩尔，基于6-羟基-3-MEM-O-纳洛酮的分离产率为41％）。¹H NMR（δ，ppm，CDC1₃)：6.49-6.72（2H，多重态，纳洛酮的芳族质子），5.79（1H，多重态，纳洛酮的烯族质子），5.17（2H，多重态，纳洛酮的烯族质子），4.71（1H，双重态，α纳洛酮的C₅质子），4.52（1H，双重态，β纳洛酮的C₅质子），3.89（1H，多重态，α纳洛酮的C₆质子），3.56-3.80（12H，多重态，PEG），3.39（3H，单态，PEG的甲氧基质子，α差向异构体），3.38（3H，单态，PEG的甲氧基质子，β差向异构体），3.22（1H，多重态，β纳洛酮的C₆质子），1.14-3.12（14H，多重态，纳洛酮质子）。

6.C.α-6-CH₃-(OCH₂CH₂)₃-O-纳洛酮和β-6-CH₃-(OCH₂CH₂)₃-O-纳洛酮的分离

将约80毫克的α和βPEG₃-纳洛酮差向异构体的自然混合物溶解在最小量的CHC1₃中，然后注入用CHC1₃制备的硅胶柱（2厘米×30厘米）中。用CHC1₃/CH₃OH混合物(60:1)小心地洗提硅胶柱。最先洗提的是纯α-PEG₃-纳洛酮（26毫克，33％分离产率），然后是纯β-PEG₃-纳洛酮（30毫克，38％的分离产率）。两种化合物均为无色的粘性固体。α-PEG₃-Nal,¹H NMR(δ,ppm,CDCl₃)：6.49-6.73（2H，两个双重态，纳洛酮的芳族质子），5.79（1H，多重态，纳洛酮的烯族质子），5.17（2H，三重态，纳洛酮的烯族质子），4.71（1H，双重态，纳洛酮的C₅质子），3.81（1H，多重态，纳洛酮的C₆质子），3.57-3.80（12H，多重态，PEG），3.40（3H，单态，PEG的甲氧基质子），1.13-3.12（14H，多重态，纳洛酮质子）。β-PEG₃-Nal,¹H NMR(δ,ppm,CDC1₃)：6.54-6.72（2H，两个双重态，纳洛酮的芳族质子），5.77（1H，多重态，纳洛酮的烯族质子），5.15（2H，三重态，纳洛酮的烯族质子），4.51（1H，双重态，纳洛酮的C₅质子），3.58-3.78（12H，多重态，PEG），3.39（3H，单态，PEG的甲氧基质子），3.20（1H，多重态，纳洛酮的C₆质子），1.30-3.12（13H，多重态，纳洛酮质子）。

α,β-6-CH₃-(OCH₂CH₂)₅-O-纳洛酮（“α,β-PEG₅-Nal”）和α,β-6-CH₃-(OCH₂CH₂)₇-O-纳洛酮（“α,β-PEG₇-Nal”）的制备及各自异构体的分离方法相似。

例7

顺式-类维生素A酸和纳洛酮PEG-基体的口服生物利用度

雌性Sprague

大鼠（150-200克）从Harlan实验室获得。将导管插入大鼠的外颈静脉，让大鼠适应至少72小时再开始研究。大鼠禁食一个晚上（第1天），但随意给水。

在用药的那天（第0天）上午，给每只大鼠称重，用肝素（1000U/毫升）冲洗导管。用一根喂食管，给大鼠口服（强饲）含聚乙二醇化或游离药物的水溶配方。剂量按毫克/千克体重进行确定。总剂量不超过10毫升/千克。按特定的时间间隔（1、2和4小时），通过导管抽取血样（约1.0毫升），放置在含14微升肝素的1.5毫升离心管内，混合并离心分离出血浆。血浆样本在化验前冷冻（<-70℃）。血浆样本用沉淀法提纯，析取分析物并使用质谱仪（MSD）通过高性能液相色谱（LC）法进行化验。标准样本采用同样的方法进行制备，生成标准曲线，通过这个曲线可以推断出未知样本的浓度（见表二的结果）。适当时，使用内部标准进行分析。

表一概括了受试化合物的选定属性（如分子量和可溶性）。表一也给出了以IC_s0值表示的一些受试化合物的生物体外酶结合活性。

表一

受试化合物的选定属性

药物	分子量	可溶性(μM)	IC₅₀(nM)*
				13-顺式-类维生素A酸（母体药物）	300.45	0.47	-
PEG3-13-cis-RA	445.64	3.13	-
				PEG₅-13-cis-RA	549.45	可溶	-
PEG₇-13-cis-RA	621.45	58.3	-
				PEG₁₁-13-Cis-RA	797.45	可溶	-
纳洛酮“Nal”（母体药物）	327.37	与HCl盐一样可溶	6.8
				PEG₃-Nal的α异构体	475.6	可溶	7.3
PEG₃-Nal的β异构体	475.6	可溶	31.7
				PEG₅-Nal的α异构体	563.0	可溶	31.5
PEG₅-Nal的β异构体	563.0	可溶	43.3
				PEG₇-Nal的α异构体	652.0	可溶	40.6
PEG₇-Nal的β异构体	652.0	可溶	93.9
				PEG9-Nal的α异构体	740.0	可溶	64.4
PEG9-Nal的β异构体	740.0	可溶	205.0
				羟嗪“Hyd”（母体药物）	374.91	与HCl盐一样可溶	48.8
PEG₁-Hyd	433.0	可溶	70.3
				PEG₃-Hyd	521.0	可溶	105.0
PEG₅-Hyd	609.0	可溶	76.7
				西替利嗪"Cet”（母体药物）	388.89	与HCl盐一样可溶	77.1
PEG₁-Cet	446.0	可溶	61.0

PEG₃-Cet	534.0	可溶	86.4
				PEG₅-Cet	622.0	可溶	128.0

*纳洛酮系列化合物的μ-鸦片剂结合活性

羟嗪和西替利嗪系列化合物的组胺H-1结合活性

表二计算并给出了类维生素A酸系列化合物的口服生物利用度。所有数据均标准化为6毫克/千克剂量。这些化合物的血浆浓度/时间曲线见图1。

表二

类维生素A酸系列化合物的口服生物利用度

表三计算并给出了纳洛酮系列化合物中每种异构体的口服生物利用度。口服纳洛酮的剂量为5或10毫克/千克，聚乙二醇化化合物的剂量标准化为1毫克/千克。这些化合物的血浆浓度/时间曲线见图2。

表三

纳洛酮系列化合物的口服生物利用度

以上结果显示，诸如类维生素A酸和纳洛酮等亲脂性小化合物（游离碱形式）的聚乙二醇化可提高溶解度和口服生物利用度。另一方面，与低聚PEG的结合也提高了母体化合物的分子量（大于约500道尔顿），尤其是PEG-基体长度的增加，限制了高水溶性化合物的口服穿透，这可以从例如PEG₇-13-cis-RA和PEG_ll-13-cis-RA两个例子中看出。

例8

顺式-类维生素A酸和纳洛酮PEG-基体穿过

血脑屏障（BBB）的输送

在这些试验中，现场脑灌注方法采用完好的大鼠大脑，（i）以确定药物在正常的生理条件下穿透BBB的能力，及（ii）研究输送机制，例如被动扩散与载体中介输送。

使用单时间点方法进行灌注。简要地说，用一个灌输泵（20毫升/分钟），将含有测试化合物的灌注液体（灌注液）通过左外侧颈动脉以恒定的速度注入大鼠体内。灌注流速的设定是为了在正常的生理压力下（80-120mm Hg）将液体流完全输送到大脑。灌注时间持续30秒。灌注完毕，立即用不含药物的灌注液再灌注脑脉管系统30秒，以清除残留药物。关闭灌输泵，立即从头骨上取下大脑。每只大鼠的左脑样本先称重，然后用Polytron均质器进行均质化。在每个鼠脑中加入四（4）毫升20％的甲醇进行均质化。均质化后，测量并记录均质化后混合物的总量。

测得量的均匀混合物用有机溶液稀释，然后离心分离。在氮流中清除和蒸发上层清液，并用LC/MS/MS重组和分析。根据药物注射到空白（即没有药物）的大脑均匀混合物中生成的校准曲线，定量分析受试大脑均匀混合物中药物的浓度。分析三份大脑均匀混合物中药物的浓度，得出的值用来计算大脑吸收率（单位：p摩尔/克鼠脑/秒灌注）。

每一个灌注溶液含有阿替洛尔（目标浓度，50μM）、安替比林（目标浓度，5μM）及目标浓度为20μM的测试化合物（13-顺式-类维生素A酸，PEG_n-13-顺式-类维生素A酸，纳洛酮或PEG_n-Nal）。

表四计算、标准化并记录了每种受试化合物的BBB吸收情况。所有数据均标准化为以20毫升/分钟的灌注速度灌输5μM剂量溶液30秒。

表四

受试化合物的血脑屏障（BBB）吸收

以上结果显示，对亲脂性化合物例如13-顺式-类维生素A酸进行聚乙二醇化可以显著地降低亲脂性化合物的大脑吸收率（“BUR”），例如，与母体化合物“13-顺式-类维生素A酸”相比，PEG₇-13-cis-RA的大脑吸收率降低为四分之一，PEG_ll-13-cis-RA的大脑吸收率系数降低为五分之一。对于纳洛酮，PEG₅-Nal和PEG₇-Nal的BUR降低为十六分之一。至于羟嗪，作为PEG₇-Hyd给药时，BUR降低为原来的大约二十九分之一。作为PEG₇-Cet给药时，西替利嗪相对最小的穿过血脑屏障输送未发生大变化。

因而，总体而言，我们惊奇地发现，通过将水溶性小聚合物与此类小分子药物结合，修改其穿透生物膜的能力，例如与胃肠屏障、血脑屏障、胎盘屏障及类似的屏障相关的膜，可以优化药物的传输属性。更为重要的是，在口服药物时，与一个或多个水溶性小聚合物结合可以显著地降低这些药物穿透生物屏障例如血脑屏障的输送能力。在理想的情况下，此类改性的药物通过胃肠道的输送没有受到大的影响，而穿过生物屏障例如血脑屏障的输送却受到重大阻碍，改性药物的口服生物利用度保持在临床上有效的水平之上。

将例7和例8中的生成的数据作图的目的是，比较PEG的大小分别对13-顺式-类维生素A酸和纳洛酮的相对口服生物利用度和BBB输送的影响。见图3-7。图3考查了与PEG 3-体、PEG 5-体、PEG 7-体和PEG 11-体分别结合时，对13-顺式-类维生素A酸的口服生物利用度的影响。图4检查了与这些不同的PEG-基体的共价结合对13-顺式-类维生素A酸的血脑屏障输送的影响。图5检查了与PEG 3-体、PEG 5-体和PEG 7-体的共价结合对纳洛酮的口服生物利用度的影响。图6显示了与这些PEG-基体共价结合对纳洛酮的血脑屏障输送的影响。图7显示，PEG_n-Nal化合物比纳洛酮具有更高的口服生物利用度。从这些图中可以看出，当PEG低聚物增大时，BBB吸收率显著降低，而口服生物利用度相对于母体分子有所提高。

纳洛酮的α-和β-异构体之间在口服生物利用度上的差别可能是由于它们在物理化学属性方面的差异。一种异构体的亲脂性比另一种异构体稍强一些，从而导致在口服生物利用度方面出现小差别。

例9

PEG-纳洛酮的生物体外代谢

为了研究聚乙二醇化对纳洛酮的阶段II代谢（葡萄糖苷化）的影响，研制了一种生物体外方法。这个方法需要制备一种NADPH再生系统（NRS）溶液。将碳酸氢钠（22.5毫克）溶解在1毫升的去离子水中，制备NRS溶液。在溶液中加入B-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐钠盐或NADP（1.6毫克）、葡萄糖-6-磷酸盐（7.85毫克）、葡萄糖-6-磷酸盐脱氢酶（3微升）、尿苷5-二磷酸葡萄糖醛酸三钠盐或UDPGA（2.17毫克）、腺苷3'-磷酸盐5'-磷酸硫酸锂盐或PAPS（0.52毫克）及1M氯化镁溶剂（10微升）。固体完全溶解后，将溶液储存在冰浴中。

将适量的纳洛酮HCl、6-mPEG₃-O-纳洛酮、α-6-mPEG₅-O-纳洛酮及α-mPEG₇-O-纳洛酮溶解在1毫升去离子水中，制备30mM测试物储备溶液。

雄性Sprague Dawley大鼠微粒体（0.5毫升，浓度为20毫克/毫升；M00001来自In-vitro Technologies,Baltimore,MD）从冰柜中取出，放在冰浴中解冻。在试瓶中加入60微升的去离子水，将四十微升的肝微粒体稀释为100微升。在试瓶中加入tris缓冲液，pH7.4（640微升）和测试物储备溶液（10微升），使容量为750微升。

各试瓶和NRS溶液分别单独放在37℃的水浴中5分钟。在每个试瓶中加入NRS溶液（250微升）。在第一个试瓶中加入NRS时，开启反应计时器。收集各样本（200微升），然后分别加入高氯酸（20微升），终止反应。在下列时间点收集样本：0-2、20、40及60分钟。将反应终止的所有试瓶存放在一个冰浴槽中。

在每个试瓶中加入乙腈（100微升），然后以3000x g离心分离5分钟。取出上层清液（230微升），然后用LC/MS法化验10微升的测试溶液。在每个时间点，测量和记录测试物在每个样本中的浓度。

表五列出了肝微粒体培养后活性残留物的百分比。

表五

肝微粒体培养后活性残留物的百分比

时间(分)	纳洛酮	α-PEG₃-Nal	β-PEG₃-Nal	α-PEG₅-Nal	α-PEG₇-Nal
						0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0
20	47.1	64.8	83.9	84.1	87.4
						40	27.6	51.7	75.2	75.6	81.6
60	15.6	45.7	69.6	69.2	76.9

根据表五中的结果，可能得出这样的结论：采用低聚物进行聚乙二醇化可降低小分子例如纳洛酮的葡萄糖苷化速度。另外，当PEG低聚物链增大时，葡萄糖苷化速度降低。此外，PEG₃-纳洛酮的α-异构体与β-异构体对比显示，β-异构体在分离的大鼠肝微粒体内对于细胞色素P450同工酶是一种差底物。此观察结果再次确认了图7中显示的生物体内数据。

转到图8和9，数据显示，与小PEG的结合可以有效地降低药物代谢速度（如在纳洛酮一例中葡萄糖苷酸形成所显示）。血液中β-异构体的水平高于α-异构体是可能的，因为首过效果被大幅度地阻止，也就是说，由于与寡聚PEG分子的共价结合，显著地阻止了首过代谢的程度（图7）。PEG分子可能产生位阻和/或亲水或疏水效果，同PEG与α-异构体形态结合相比，PEG与β-异构体形态结合时，会在更大程度上改变β-异构体轭合物和细胞色素P450同工酶的亲合力。与α-异构体代谢物和未聚乙二醇化的纳洛酮相比，β-异构体代谢物的水平更低。

例10

μ-鸦片剂受体上各种阿片拮抗剂的活性

在单独的一系列试验中，纳洛酮、其它阿片拮抗剂和μ-鸦片剂受体上的各种轭合物在生物体外的生物活性得到了确定。表六是试验结果摘要。

表六

μ-鸦片剂受体上纳洛酮和PEG_n-6-纳洛酮轭合物在生物体外的活性。

化合物	分子量	EC₅₀(nM)
			纳洛酮	327.4	6.8
3-PEG₃-O-纳洛酮	474	2910.0
			6-NH₂-纳洛酮	601	29.2
PEG₅₅₀-6-NH-纳洛酮(PEG₁₃酰胺）	951	210.0
			α-6-纳洛酮	329	2.0

β-6-纳洛酮	329	10.8
			α-PEG₃-Nal	475.6	7.3
β-PEG₃-Nal	475.6	31.7
			α-PEG₅-Nal	563	31.5
β-PEG₅-6-Nal	563	43.3
			α-PEG₇-6-Nal	652	40.6
β-PEG₇-6-Nal	652	93.9

在上表中，对于每种化合物，每一种PEG轭合物的生物活性显示为其与母体药物相比较的相对生物活性。EC₅₀是在标准剂量反应曲线中基线和最高反应之间的半程处引起反应的激动剂的浓度。如以上数据所示，各种PEG_n-Nal轭合物均有生物活性，而且事实上，所有6-纳洛酮或纳洛酮轭合物均保持了母体药物的至少5％或更高的生物活性度，其生物活性范围在未改性母体化合物的生物活性的约5％至约35％之间。在生物活性方面，PEG₅₅₀-6-NH-纳洛酮具有其母体化合物（6-NH₂-纳洛酮）的约13％的生物活性，α-PEG₃-Nal具有其母体化合物（α-6-OH-纳洛酮）的约30％的生物活性，而β-PEG₃-Nal具有其母体化合物（α-6-OH-纳洛酮）的约35％的生物活性。

例11

制备完全单分子量的低聚（乙二醇）甲醚及其衍生物的方法

本发明单分子（单分散）PEG按照下面详细描述的方法进行制备。这些单分子PEG在提供本发明改性活性剂以及该活性剂的理想屏障输送属性方面具有尤为明显的优势。

以下举例说明的方法代表了本发明的另一方面，即，一种使用卤素衍生（如溴衍生）低聚（环氧乙烷），由低分子量的单分散低聚（乙二醇）制备单分散低聚（环氧乙烷）甲醚的方法。在本发明的另一个方面，本文亦提供了一种使用卤素衍生低聚（环氧乙烷）甲醚将低聚（环氧乙烷）甲醚（从单分子量组合物）与活性剂结合的方法。

反应式示意如下：

(m=1,2,3;n=2,3,4,5,6)

10.A.CH ₃ O-(CH ₂ CH ₂ O) ₅ -H与CH ₃ OCH ₂ CH ₂ Br的合成

将四（乙二醇）（55毫摩尔，10.7克）溶解在100毫升的四氢呋喃（“THF”）中，然后在室温下加入KOtBu（55毫升，1.0M溶解在THF中）。生成的溶液在室温下搅拌30分钟过夜，然后滴加CH₃OCH₂CH₂Br（55毫摩尔，5.17毫升溶解在50毫升的THF中）。室温下搅拌反应一个晚上，然后用H₂O（300毫升）/CH₂Cl₂（3×300毫升）析取。得到的有机析取物混合，然后在无水的Na₂SO₄上干燥。过滤掉固体干燥剂和蒸发去除溶液后，获得粗制的残余物，残余物用硅胶柱（CH₂Cl₂:CH₃OH=60:1～40:1）通过柱色谱进行提纯，产出纯的五（乙二醇）单甲醚（产量35％）。¹H NMR(CDC1₃)δ3.75-3.42(m,20H,OCH₂CH₂O)，3.39(s,3H,MeO)。

10.B.CH ₃ O-(CH ₂ CH ₂ O) ₇ -H与MeOCH ₂ CH ₂ Br的合成

慢慢地将氢化钠（2.55克，106毫摩尔）加到六（乙二醇）（10克，35毫摩尔）和2-溴乙基甲醚（4.9克，35毫摩尔）的THF（100毫升）溶液中。溶液在室温下搅拌两小时。HPLC显示，以约54％的产率形成mPEG₇-OH。通过加入稀释的盐酸，停止反应，消除多余的氢化钠。使用旋转蒸发器，除去所有溶剂，生成褐色的粘性液体。使用半制备的HPLC（20厘米×4厘米，C18柱，乙腈和水作为流动相），获得纯的mPEG₇-OH——无色液体（4.9克，分离产率为41％）。¹H NMR(CDC1₃)：2.57ppm（三重态，1H，OH）；3.38ppm（单态，3H，CH₃O）；3.62ppm（多重态，30H，OCH₂CH₂）。

10.C.CH ₃ O-(CH ₂ CH ₂ O) ₅ -Br的合成

将三乙胺（5.7毫升，40毫摩尔）加到CH₃O-(CH₂CH₂O)₅-OH（5.0克，20毫摩尔）中，边加边搅拌。溶液在冰浴槽中N₂气氛下冷却，并在30分钟内滴加2.5毫升的甲烷磺酰氯（32毫摩尔）。溶液在室温下搅拌一个晚上。然后在反应混合物中加入水（40毫升），用CH₂C1₂（3×150毫升）萃取溶液，得到的有机相用0.1N HCl（3×80毫升）和水（2×80毫升）冲洗。用Na₂SO₄干燥和除去溶液后，获得淡褐色的液体。将产物和Bu₄NBr（12.80克，39.7毫摩尔）溶解在CH₃CN（50毫升）中，生成的溶液在50℃温度N₂气氛下搅拌15小时。冷却至室温后，旋转蒸发除去CH₃CN，产出红色液体，将红色液体溶解在150毫升的水中，用EtOAc（2×200毫升）萃取。将得到的有机相合并，用水冲洗，然后在Na₂SO₄上干燥。除去溶剂后，获得淡红色的液体（4.83克，77.4％）。1^H NMR(300Hz,CDC1₃)：δ3.82(t,2H)，3.67(m,14H)，3.51(m,2H)，3.40(s,3H)。

例11

mPEG3N-美尔奎宁的合成

将氰硼氢化钠（60毫克，0.96毫摩尔）水溶液（1毫升）加到美尔奎宁（mefloquine）HCl盐（200毫克，0.48毫摩尔）和mPEG₃-丁基醛（280毫克，1.20毫摩尔）的甲醇溶液（5毫升）中。生成的溶液在50℃温度的油浴槽中氮气下加热16小时，边加热边搅拌。HPLC显示反应结束。使用旋转蒸发器，除去所有溶剂，生成粗制的产品。用备好的反相HPLC提纯，获得纯的mPEG-3-N-美尔奎宁轭合物——无色粘性液体（160毫克，0.27毫摩尔，分离产率56％），¹H NMR(CDCl₃,ppm)：8.15（多重态，3H，芳环）；7.73（三重态，1H，芳环）；5.86（双重态，1H，CH）；3.67（多重态，14H，PEG主链）；3.52（单态，3H，PEG-OCH₃）；3.18（多重态，2H，PEG-CH₂）；0.52-2.74（多重态，13H，PEG和环己基质子）。

反应式示意如下：

Claims

1.一种包含单分散或双峰轭合物的组合物，每一种轭合物均包含从通过稳定键联结与水溶性低聚物共价结合的小分子药物上得到的一部分，其特征在于所述轭合物表现出的生物膜穿透率较未与水溶性低聚物结合的小分子药物生物膜穿透率低。

2.权利要求1所述的组合物，其特征是轭合物包含O-X-D结构，其中O对应水溶性低聚物，X对应稳定键联结，D对应从小分子药物上得到的部分。

3.权利要求2所述的组合物，其特征是生物膜与选自下列一组的屏障相关：血脑屏障、血脑脊髓液屏障、血胎盘屏障及血奶屏障。

4.权利要求3所述的组合物，其特征是生物膜与血脑屏障相关。

5.权利要求3或4所述的组合物，其特征是轭合物表现的生物膜穿透率比小分子药物的生物膜穿透率降低至少20％。

6.权利要求3或4所述的组合物，其特征是轭合物表现的生物膜穿透率比小分子药物的生物膜穿透率降低至少70％。

7.权利要求1所述的组合物，其特征是小分子药物是口服可生物利用的。

8.权利要求1或7所述的组合物，其特征是轭合物的口服生物利用度是小分子药物口服生物利用度的至少10％。

9.权利要求1或7所述的组合物，其特征是轭合物的口服生物利用度是小分子药物口服生物利用度的至少50％。

10.权利要求1或7所述的组合物，其特征是轭合物在口服时表现出的首过代谢较小分子药物有所降低。

11.权利要求1所述的组合物，其特征是轭合物具有在约300和1800道尔顿之间的分子量。

12.权利要求1所述的组合物，其特征是小分子药物具有低于约750道尔顿的分子量。

13.权利要求1所述的组合物，其特征是小分子药物是非阿片拮抗剂。

14.权利要求1所述的组合物，其特征是水溶性低聚物包含选自下列一组的单体：环氧烷烃、烯醇、乙烯吡咯烷酮、羟基烷基甲基丙烯酰胺、羟基烷基异丁烯酸盐、糖类、α-羟基酸、磷腈、

唑啉、氨基酸及N-丙烯酰吗啉。

15.权利要求1所述的组合物，其特征是水溶性低聚物由环氧乙烷单体亚单元组成。

16.权利要求14和15之任一所述的组合物，其特征是低聚物的单体数量在3和15之间。

17.权利要求1所述的组合物，其特征是轭合物为单分散轭合物。

18.权利要求1所述的组合物，其特征是轭合物为双峰轭合物。

19.权利要求1、2、3、4、7、11、12、13、14、15、17及18之任一所述的组合物，其特征是轭合物具有单个与从小分子药物上得到的部分共价结合的水溶性低聚物。

20.权利要求1、2、3、4、7、11、12、13、14、15、17及18之任一所述的组合物，其特征是稳定键联结包括醚、酰胺、氨基甲酸乙酯、胺、硫醚、醚、尿素及碳-碳键。

21.权利要求1、2、3、4、7、11、12、13、14、15、17及18之任一所述的组合物，其特征是轭合物包含立体异构体混合物。

22.权利要求1、2、3、4、7、11、12、13、14、15、17及18之任一所述的组合物，其特征是轭合物为单个立体异构体。

23.一种药物组合物，包含：（1）单分散或双峰轭合物，每一个轭合物均包含从通过稳定键联结与水溶性低聚物共价结合的小分子药物上得到的一部分，其中，该轭合物表现出较未与水溶性低聚物结合的小分子药物低的生物膜穿透率；及（2）药学上可接受的赋形剂。

24.权利要求23所述的药物组合物，采用口服剂量的形式。

25.一种包括给与包含单分散或双峰轭合物的组合物的步骤的方法，每一个轭合物均包含从通过稳定键联结与水溶性低聚物共价结合的小分子药物上得到的一部分，其特征是该轭合物表现出比未与水溶性低聚物结合的小分子药物低的生物膜穿透率。

26.权利要求25所述的方法，其特征是给药步骤选自下列一组：口服、经皮给药、口腔含化给药、经粘膜给药、阴道给药、直肠给药、肠胃外给药和肺部给药。

27.一种优化小分子药物的选择性生物膜穿透的方法，该方法包含通过稳定的键联结共价键将来自低聚物单分散或双峰组合物的水溶性低聚物与小分子药物轭合的步骤，从而形成表现出比轭合前的小分子药物低的生物膜穿透率的轭合物。

28.一种优化小分子药物生物膜穿透的方法，该方法包括下列步骤：

(a)制备一系列的单分散或双峰轭合物，系列中每一种轭合物均包含从通过稳定键联结与水溶性低聚物共价结合的小分子药物上得到的一部分，其中，系列中每一种轭合物只在低聚物大小上有所不同，低聚物大小按低聚物内单体数量计；

(b)表征步骤（a）制备的系列中每一种轭合物，达到轭合物不会穿透生物膜的程度；及

(c)基于（b）的结果，找到步骤（a）制备的系列轭合物中具有最佳生物膜穿透降低的轭合物。

29.权利要求28所述的方法，进一步包括下列步骤：表征步骤（a）制备的一系列轭合物中每一种轭合物的口服生物利用度程度，以及找到在生物膜穿透性降低和生物利用度之间具有最佳平衡的轭合物。

30.权利要求28所述的方法，进一步包括下列步骤：表征步骤（a）制备的一系列轭合物中每一种轭合物的生物活性程度，找到在生物膜穿透性降低和生物活性之间具有最佳平衡的轭合物。

31.一种制备轭合物的方法，该方法包括使从单分散或双峰水溶性低聚物组合物获得的水溶性低聚物与小分子药物共价结合的步骤，以提供一种轭合物，其包含一个将低聚物和源自小分子药物的部分相连接的稳定键联结。

32.权利要求31所述的方法，其特征是稳定键联结是水解稳定的。

33.权利要求31所述的方法，其特征是键联结是酶解稳定的。

34.权利要求31、32及33之任一所述的方法，其特征是共价结合步骤包括，在一个或多个合成步骤中，使具有反应基A的低聚物与包含适合与A反应的反应基B的小分子反应，反应条件为可以有效地形成一个由A和B反应而得的稳定键联结。

35.权利要求34所述的方法，其中，轭合物包含异构体混合物。

36.权利要求35所述的方法，进一步包含分离异构体混合物的步骤，以取得实质上纯的单轭合物异构体组合物。

37.一种制备单分散低聚乙二醇试剂组合物的方法，该方法包括将具有(m)个单体亚单元的卤端基低聚乙二醇与具有(n)个单体亚单元的羟端基低聚乙二醇反应的步骤，反应条件为可以有效地置换卤基，从而形成具有(m)+(n)个单体亚单元（OEG_m+n）的低聚乙二醇，其中，(m)和(n)各自独立在1-10的范围内。

38.权利要求37所述的方法，其中(m)的范围为1-3，(n)的范围为2-6。

39.权利要求37所述的方法，其中反应步骤在强碱存在下进行。

40.权利要求37、38及39之任一所述的方法，其中卤端基低聚乙二醇包含一个封端基。

41.权利要求37所述的方法，其中羟端基低聚乙二醇对应此结构：HO-(CH₂CH₂O)_n-H。

42.权利要求41所述的方法，进一步包括将OEGm+n的终端羟基转化为卤基-X，以形成OEG_m+n-X的步骤。

43.权利要求42所述的方法，进一步包括将OEG_m+n-X与第二个具有(n)个单体亚单元的羟端基低聚乙二醇反应的步骤，反应条件为可以有效地置换卤基，从而形成具有(m)+2(n)个单体亚单元(OEG_m+2n)的低聚乙二醇，其中(m)和(n)各自独立在1-10的范围内。

44.权利要求43所述的方法，其中该第二个羟端基低聚乙二醇对应此结构：HO-(CH₂CH₂O)_n-H。

45.权利要求44所述的方法，其中(OEG_m+2n)对应CH₃O(CH₂CH₂O)_m+2nH结构，并作为CH₃O(CH₂CH₂O)_m+2nH的单分散组合物一部分存在。

46.权利要求43所述方法，其中OEG_m+2n具有伯羟基或仲羟基。

47.权利要求46所述的方法，进一步包括将上述伯羟基或仲羟基转化为卤基-X，以形成OEG_m+2n-X的步骤。

48.权利要求47所述的方法，进一步包括将OEG_m+2n-X与具有(n)个单体亚单元的第三个羟端基低聚乙二醇反应的步骤，反应条件为可以有效地置换卤基，从而形成具有(m)+3(n)个单体亚单元(OEG_m+3n)的低聚乙二醇，其中(m)和(n)各自独立在1-10的范围内。

49.权利要求48所述的方法，其中(OEG_m+3n)对应CH₃O(CH₂CH₂O)_m+3nH结构，并作为CH₃O(CH₂CH₂O)_m+3nH的单分散组合物一部分存在。

50.一种降低活性剂代谢的方法，该方法包含以下步骤：提供单分散或双峰轭合物，每种轭合物均包含从通过稳定键联结与水溶性低聚物共价结合的小分子药物上得到的一部分，其中该轭合物表现出比未与水溶性低聚物结合的小分子药物低的生物膜穿透率；以及给患者使用上述轭合物。

51.权利要求50所述的方法，其中该给药步骤按照取自下列一组的一种给药方法进行：口服、经皮给药、口腔含化给药、经粘膜给药、阴道给药、直肠给药、肠胃外给药和肺部给药。

52.权利要求51所述的方法，其中小分子药物被肝酶代谢。

53.权利要求52所述的方法，其中肝酶包含一种或多种细胞色素P450异构体。

54.权利要求51所述的方法，其中给药步骤通过口服进行。

55.权利要求54所述的方法，其中小分子药物被一种或多种肠酶代谢。