CN103030690A

CN103030690A - 经改良人类干扰素分子和其用途

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Publication number: CN103030690A
Application number: CN2012104967109A
Authority: CN
Inventors: 安娜-玛丽亚·A.·海斯·蒲楠; 布鲁斯·E.·金梅尔; 周何盛; 信博诚; 大卫·C.·利辛格; 罗伯特·玛莉亚尼; 瓦蒂·科瑞诺夫; 尼克·科讷德森; 汤马斯·O.·丹尼尔; 艾伦·科德; 史都华·布鲁塞尔; 刘均阶; 苗镇威; 特瑞莎·毛洛
Original assignee: Ambrx Inc
Current assignee: Ambrx Inc
Priority date: 2005-06-03
Filing date: 2006-06-02
Publication date: 2013-04-10
Also published as: CN101247821A; CN101247821B; US20080119640A1; AU2006255122B2; EP1893229A4; US20080132681A1; ATE529442T1; WO2006133088A2; EP1893229B1; WO2006133089A2; JP2008541769A; IL187188A0; WO2006133088A3; US8093356B2; KR20080026135A; CA2609205A1; US20100135959A1; US20080108792A1; MX2007015058A; EP1893229A2

Abstract

本发明提供经改良人类干扰素多肽和其用途，所述人类干扰素多肽包括一个或一个以上非天然编码氨基酸，且具有至少一种经调节的生物活性。

Description

经改良人类干扰素分子和其用途

分案说明

本申请案是申请日为2006年6月2日，申请号为200680019729.7（国际申请号为PCT/US2006/021738），发明名称为经改良人类干扰素分子和其用途的专利申请的分案申请。

相关申请案的交叉参考

本申请案主张2005年6月3日申请的名称为“Improved Human Interferon Moleculesand Their Uses”的美国临时专利申请案60/687,173和2005年12月21日申请的名称为“Improved Human Interferon Molecules and Their Uses”的美国临时专利申请案60/753,375的优先权，其说明书是以引用的方式全部并入本文中。

技术领域

本发明涉及经至少一个非天然编码氨基酸修饰的干扰素多肽。

背景技术

生长激素（GH）超基因家族（Bazan,F.Immunology Today 11:350-354(1990)；Mott,H.R.和Campbell,I.D.Current Opinion in Structural Biology 5:114-121(1995);Silvennoinen,O.和Ihle,J.N.(1996)Signaling by the Hematopoietic Cytokine Receptors）表示一组具有类似结构特征的蛋白质。这个蛋白质家族的每一成员包括4螺旋束。尽管仍有更多家族成员尚未经鉴别，但一些家族成员包含以下各物：生长激素、泌乳激素、胎盘催乳素、促红细胞生成素（EPO）、血小板生成素（TPO）、白细胞介素-2（IL-2）、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12（p35亚单位）、IL-13、IL-15、抑瘤素M、睫状神经营养因子、白血病抑制因子、α干扰素、β干扰素、γ干扰素、ω干扰素、τ干扰素、ε干扰素、粒细胞-集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和心脏营养素-1（CT-1）（“GH超基因家族”）。GH超基因家族的成员具有类似的二级和三级结构，但其通常具有有限的氨基酸或DNA序列一致性。共有的结构特征使得基因家族的新成员易于鉴别。IFNα-2的通用结构展示于图1中。

干扰素为由受病毒侵袭或暴露于某些其它物质的细胞释放的相对较小的单链糖蛋白。目前将干扰素分为三大类，其命名为：1）白细胞干扰素（干扰素-α、α-干扰素、IFN-α）；2）成纤维细胞干扰素（干扰素-β、β-干扰素、IFN-β）；和3）免疫干扰素（干扰素-γ、γ-干扰素、IFN-γ）。回应病毒感染，淋巴细胞主要合成α-干扰素（和ω干扰素、IFN-ω），而成纤维细胞的感染通常诱发β-干扰素的产生。IFNα和IFNβ共有约20%-30%的氨基酸序列同源性。人类IFN-β的基因缺乏内含子，且编码与人类IFN-α具有29%氨基酸序列一致性的蛋白，表明IFN-α与IFN-β基因是由共同祖先进化而来（Taniguchi等人,Nature285 547-549(1980)）。相反，IFN-γ是由淋巴细胞回应有丝分裂原合成而来。已知IFNα、IFNβ和IFNω诱发MHC I类抗原表达且被称作I类干扰素，而IFNγ诱发MHC II类抗原表达且被称作II类干扰素。Pestka等人在Annu.Rev.Immunol.(2004)22:929-79（其是以引用的方式全部并入本文中）中描述2类α-螺旋细胞因子，其包含干扰素（IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ω、IFN-δ、IFN-τ和IFN-γ）以及类干扰素分子（诸如limitin、IL-28A、IL-28B和IL-29）以及配体、受体和这些分子所用的信号转导路径。干扰素具有不同种类和许多等位基因变体。另外，已从来自患有各种疾病的患者的细胞中分离出具有新颖活性和突变序列的干扰素。

已鉴别多种编码不同种类IFNα的独特基因。α干扰素分为两大类I和II，其各含有多个不连续蛋白质（Baron等人,Critical Reviews in Biotechnology 10,179-190(1990)；Nagata等人,Nature 287,401-408(1980)；Nagata等人,Nature 284,316-320(1980)；Streuli等人,Science 209,1343-1347(1980)；Goeddel等人,Nature 290,20-26(1981)；Lawn等人,Science 212,1159-1162(1981)；Ullrich等人,J.Mol.Biol.156,467-486(1982);Weissmann等人,Phil.Trans.R.Soc.Lond.B299,7-28(1982)；Lund等人,Proc.Natl.Acad.Sci.81,2435-2439(1984);Capon等人,Mol.Cell.Biol.5,768(1985)）。各种IFN-α种类包含IFN-αA（IFN-α2）、IFN-αB、IFN-αC、IFN-αC1、IFN-αD（IFN-α1）、IFN-αE、IFN-αF、IFN-αG、IFN-αH、IFN-αI、IFN-αJ1、IFN-αJ2、IFN-αK、IFN-αL、IFN-α4B、IFN-α5、IFN-α6、IFN-α74、IFN-α76（IFN-α4a）、IFN-α88和其等位基因。Trotta等人在"ApprovalStandards for Alfa Interferon Subtypes"Drug Information Journal 34:1231-1246(2000)（其是以引用的方式全部并入本文中）中描述人类IFNα基因家族的成员和这个家族的蛋白和生物活性（包含免疫调节、抗增殖、抗病毒和抗菌活性）。由Trotta等人提及的干扰素蛋白包含IFNα₁（来自IFN_A1基因）、IFNα_D、IFNα₂（IFNα_2b）、IFNα_A（IFNα_2a）、IFNα_2c、IFNα_4a（IFNα₇₆）、IFNα_4b、IFNα₅、IFNα_G、IFNα₆₁、IFN α₆、IFNα_K、IFN a₅₄、IFN a₇、IFN a_J、IFNα_J1、IFNα₈、IFNα_B2、IFNα_B、IFNα_C、ΨIFNα₁₀、ΨIFNα_L、IFNα_6L、IFNα₁₃、IFNα₁₄、IFNα_H、IFNα_H1、IFNα₁₆、IFNα_WA、IFNα_O、IFNα₁₇、IFNα₁（来自IFN_A17基因）、IFNα₈₈、IFNα₁（来自IFN_A21基因）、IFNα_F和ΨIFNα_E。Trotta等人也论述关于这个家族中的重组形式蛋白的产生、表征、质量保证、生物活性以及临床安全性和功效问题。也论述释放试验和物理化学表征试验。IFNα₂₁、IFNα₄、IFNα₁₀和IFNα₃为先前已经描述的其它干扰素蛋白。

干扰素最初源自天然存在来源，诸如血沉棕黄层白细胞和成纤维细胞，视情况使用诱发剂来增加干扰素产生。也通过重组DNA技术来制备干扰素。

Goeddel等人,Nature 287,411(1980)描述重组IFNαA（IFNαA，也被称作IFNα2）的克隆和表达。Pestka在Archiv.Biochem.Biophys.221,1(1983)中描述IFNαA、B、C、D、F、G、H、K和L的氨基酸序列以及编码核苷酸序列。Goeddel等人,Nucleic Acids Res.8,4057(1980)描述成熟IFNβ的克隆和表达。Gray等人,Nature 295,503(1982)描述成熟IFNγ的克隆和表达。Capon等人,Mol.Cell.Biol.5,768(1985)已描述IFNω。Whaley等人,J.Biol.Chem.269,10864-8(1994)已鉴别和揭示IFNτ。

干扰素具有多种生物活性（包含抗病毒、免疫调节和抗增殖特性）且已用作用于治疗诸如癌症和各种病毒疾病的疾病的治疗剂。已展示干扰素-α类别抑制各种类型的细胞增殖，且尤其适用于治疗通常与癌症相关的多种细胞增殖病症、尤其血液科恶性疾病（诸如白血病）。这些蛋白质已展示对多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病、低恶度性淋巴瘤、卡波西肉瘤（Kaposi's sarcoma）、慢性骨髓性白血病、肾细胞癌、膀胱肿瘤和卵巢癌的抗增殖活性（Bonnem,E.M.等人,(1984)J.Biol.Response Modifiers 3:580；Oldham,R.K.(1985)Hospital Practice 20:71）。

另外，干扰素-α在CNS中可具有重要的神经调节功能。IFNα与内啡肽之间已展示结构和功能相似性。已报导IFNα分子含有介导免疫和鸦片样效应的独特区域且在IFNα的止痛作用中可涉及μ类鸦片受体。已描述干扰素-α的三级结构的止痛区域，其位于分子的第122个Tyr残基附近且包含Phe残基36、38和123（Wang等人,J.Neuroimmunol.(2000)108:64-67；和Wang等人,NeuroReport(2001)12(4):857-859，其是以引用的方式并入本文中）。特定来说，Wang等人发现在残基36处的干扰素-α突变体（F36S）使得止痛活性完全丧失且抗病毒活性降低。另一IFN-α突变体（F38S）使得止痛活性完全丧失且抗病毒活性几乎完全丧失。已研究的其它IFN α突变体包含F38L和Y129S。Wang等人描述在研究由人类IFNα诱发的发热的研究中的这两种突变体，且发现IFNα疗法的这种副作用是由IFNα与类鸦片受体的相互作用和前列腺素E₂的随后诱发介导（J.ofNeuroimmunology (2004)156:107-112）。在开发预防涉及这个受体家族的副作用的新颖IFN治疗剂中，调节IFN与类鸦片受体之间的相互作用可为关键的。前列腺素调节CNS功能，所述CNS功能包含但不限于发热的产生、睡眠/醒来周期和对疼痛的感知。其是由环氧化酶COX-1和COX-2的酶活性产生。

IFN-α的投与也可产生多种神经精神副作用（包含抑郁）（Wichers和Maes,Rev.Psychiat.Neurosci.(2004)29(1):11-17）。Wichers和Maes指出涉及血清素（5-HT）脑神经传递和酶IDO（吲哚胺2,3-双加氧酶）的诱发。其它假设涉及一氧化氮和由IFN进行的可溶性ICAM-1诱发。在开发新颖IFN治疗剂中调节IFN产生这些副作用的机制可为关键的。

市售IFN产品的特定实例包含IFNγ-1b

IFNβ-1a（和

）、IFNβ-1b

IFN alfacon-1

IFNα-2

IFNα-2a

聚乙二醇干扰素α-2a

和聚乙二醇干扰素α-2b

与IFN蛋白的聚乙二醇化形式的制备相关的一些问题描述于Wang等人(2002)Adv.Drug Deliv.Rev.54:547-570；和Pedder,S.C.Semin Liver Dis.2003;23增刊1:19-22中。Wang等人表征

的位置异构体，且Pedder等人比较

与

其描述所用聚乙二醇化化学物质的不稳定性和经调配后的影响。

由9种可鉴别异形体组成，这些特定异形体的抗病毒活性不同（Foser等人,Pharmacogenomics J 2003；3:312）。尽管目前在市场上可获得众多IFN产品，但仍不能满足对干扰素治疗剂的需求。特定来说，调节伴随目前IFN治疗剂所发现的一种或一种以上副作用的干扰素治疗剂备受关注。

共价连接亲水性聚合物聚乙二醇（缩写为PEG）为众多生物活性分子（包含蛋白质、肽和尤其疏水性分子）增加水溶性和生物可用性、增加血清半衰期、增加治疗半衰期、调节免疫原性、调节生物活性或延长循环时间的方法。PEG已广泛用于药物中、人工植入物上，以及生物相容性、无毒性和无免疫原性至关重要的其它应用中。为最大化PEG的所需性质，一种或一种以上与生物活性分子连接的PEG聚合物的总分子量和水合状态应足够高以赋予通常与PEG聚合物连接相关的有利特征（诸如水溶性和循环半衰期增加），而不会不利地影响母体分子的生物活性。

PEG衍生物通常通过反应性化学官能团（诸如赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸残基、N末端和碳水化合物部分）与生物活性分子键联。蛋白质和其它分子通常具有有限数目的可用于聚合物连接的反应性位点。通常，最适于经由聚合物连接来进行修饰的位点在受体结合中起重要作用，且对于保持分子的生物活性来说是必要的。因此，聚合物链与生物活性分子上的这些反应性位点的不加选择的连接通常使得经聚合物修饰的分子的生物活性显著降低乃至全部丧失。R.Clark等人,(1996),J.Biol.Chem.,271:21969-21977。为形成具有足够聚合物分子量以赋予靶分子所需优点的接合物，先前技术方法通常已涉及众多聚合物臂与分子的随机连接，从而增加母体分子的生物活性降低乃至完全丧失的风险。

形成用于连接PEG衍生物与蛋白质的基因座的反应性位点受蛋白质的结构支配。蛋白质（包含酶）是由具有通用结构H₂N--CHR--COOH的各种α-氨基酸序列组成。一个氨基酸的α氨基部分（H₂N--）与相邻氨基酸的羧基部分（--COOH）连接形成酰胺键，其可表示为--(NH--CHR--CO)_n--，其中下标“n”可等于数百或数千。由R表示的片段可含有用于蛋白质生物活性且用于连接PEG衍生物的反应性位点。

举例来说，在氨基酸赖氨酸的情况下，在ε位置以及α位置中存在--NH₂部分。在碱性pH值条件下ε--NH₂不发生反应。在以PEG对蛋白质进行衍生的领域中的许多技术已针对开发用于连接蛋白质中存在的赖氨酸残基的ε--NH₂部分的PEG衍生物。"Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation",Nektar MolecularEngineering Catalog,2003,第1-17页。然而，这些PEG衍生物都具有共同的局限，即其不能选择性地安装于蛋白质表面上存在的众多赖氨酸残基上。如在受体结合位点的情况下一样，在其中赖氨酸残基对于蛋白质活性来说重要（例如存在于酶活性位点中）的情况下，或在其中赖氨酸残基在介导蛋白质与其它生物分子的相互作用中起作用的情况下，此可为重要限制。

用于蛋白质聚乙二醇化的现有方法的第二且同样重要的因素在于：除那些所需的反应之外，PEG衍生物可经历与残基的不需要的副反应。组氨酸含有反应性亚氨基部分（在结构上表示为--N(H)--），但与ε--NH₂反应的许多化学反应性物质也可与--N(H)--反应。类似地，氨基酸半胱氨酸的侧链带有游离巯基，其在结构上表示为-SH。在一些情况下，对准赖氨酸的ε--NH₂基团的PEG衍生物也可与半胱氨酸、组氨酸或其它残基反应。此可产生经PEG衍生的生物活性分子的复杂异质混合物，且有可能破坏所靶向生物活性分子的活性。希望开发允许在蛋白质内的单一位点处引入化学官能团的PEG衍生物，其随后会使一种或一种以上PEG聚合物与生物活性分子在蛋白质表面上经明确定义且可预测的特异性位点处选择性偶合。

除赖氨酸残基之外，所属技术领域中已针对开发靶向其它氨基酸侧链（包含半胱氨酸、组氨酸和N末端）的活化PEG试剂作出相当大的努力。例如参看美国专利第6,610,281号，其是以引用的方式并入本文中；以及“Polyethylene Glycol and Derivatives forAdvanced PEGylation”,Nektar Molecular Engineering Catalog,2003,第1-17页。可使用定点突变诱发和所属技术领域中已知的其它技术将半胱氨酸残基位点选择性地引入蛋白质结构中，且所得游离巯基部分可与带有硫醇-反应性官能团的PEG衍生物反应。然而，这种方法为复杂的，原因在于引入游离巯基会使所得蛋白质的表达、折叠和稳定性复杂化。因此，希望具有一种将化学官能团引入生物活性分子中的方法，其能够使一种或一种以上PEG聚合物与蛋白质选择性偶合，而同时与巯基和蛋白质中通常发现的其它化学官能团相容（即，不与其进行不需要的副反应）。

自所属技术领域中的取样可见，已开发许多这些衍生物用于与蛋白质的侧链连接，特定来说，赖氨酸氨基酸侧链上的--NH₂部分以及半胱氨酸侧链上的-SH部分在其合成和使用中已经证明有问题。一些衍生物与蛋白质形成不稳定键，其在水性环境中（诸如在血流中）经历水解且因此分解、降解或在其它方面不稳定。关于

中键的稳定性的论述，参看Pedder,S.C.Semin Liver Dis.2003;23增刊1:19-22。一些衍生物形成较稳定的键，但在键形成之前经历水解，其意谓PEG衍生物上的反应性基团可在蛋白质连接之前经失活。一些衍生物具有些许毒性且因此不太适用于活体内。一些衍生物反应过慢以至于实际上无用。一些衍生物通过与负责蛋白质活性的位点连接而导致蛋白质活性丧失。一些衍生物在其将连接的位点中无特异性，其也可导致所需活性丧失且结果缺乏再现性。为克服与用聚乙二醇部分修饰蛋白质相关的难题，已开发出较稳定（例如，美国专利6,602,498，其是以引用的方式并入本文中）或与分子和表面上的硫醇部分选择性反应（例如，美国专利6,610,281，其是以引用的方式并入本文中）的PEG衍生物。在所属技术领域中明显存在对于在生理环境中呈化学惰性直至要求选择性反应以形成稳定化学键的PEG衍生物的需求。

近来，在蛋白质科学中已报导一种全新的技术，其有希望克服与蛋白质的位点特异性修饰相关的许多局限。特定来说，新组分已添加到原核生物大肠杆菌（Escherichia coli；E.coli）（例如，L.Wang等人,(2001),Science 292:498-500）和真核生物酿酒酵母（Sacchromyces cerevisiae；S.cerevisiae）（例如，J.Chin等人,Science 301:964-7(2003)）的蛋白质生物合成机构中，其使得能够在活体内向蛋白质中并入非遗传编码氨基酸。使用这种方法，已经回应琥珀密码子TAG而将具有新颖化学、物理或生物性质的众多新颖氨基酸（包含光亲和性标记和可光异构化氨基酸、光交联氨基酸（例如参看Chin,J.W.等人,(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:11020-11024；以及Chin,J.W.等人,(2002)J. Am.Chem.Soc.124:9026-9027）、酮基氨基酸、含重原子氨基酸和糖基化氨基酸）有效且高保真地并入大肠杆菌和酵母中的蛋白质中。例如参看J.W.Chin等人,(2002),Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027；J.W.Chin和P.G.Schultz,(2002),ChemBioChem 3(11):1135-1137；J.W.Chin等人,(2002),PNAS United States of America99:11020-11024；以及L.Wang和P.G.Schultz,(2002),Chem.Comm..1:1-11。所有参考文献都是以引用的方式全部并入本文中。这些研究已证实有可能选择性且常规地引入诸如酮基、炔基和叠氮基部分的化学官能团，所述化学官能团在蛋白质中不存在，对20种常见遗传编码氨基酸中发现的所有官能团呈化学惰性并且可用于有效且选择性地反应以形成稳定共价键。

将非遗传编码氨基酸并入蛋白质中的能力允许引入可提供天然存在官能团的有价值替代物的化学官能团，诸如赖氨酸的ε-NH₂、半胱氨酸的巯基-SH、组氨酸的亚氨基等。已知某些化学官能团对20种常见遗传编码氨基酸中发现的官能团呈惰性，但可完全且有效地反应以形成稳定键。举例来说，在所属技术领域中已知叠氮基和乙炔在催化量的铜存在的情况下在水性条件中经历Huisgen[3+2]环加成反应。例如参看Tornoe等人,(2002)J.Org.Chem.67:3057-3064；以及Rostovtsev等人,(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599。例如，通过向蛋白质结构中引入叠氮基部分，能够并入对蛋白质中发现的胺、巯基、羧酸、羟基呈化学惰性，但也与乙炔部分平稳且有效地反应以形成环加成产物的官能团。重要的是，在不存在乙炔部分的情况下，在其它蛋白质侧链存在的情况下且在生理条件下，叠氮基保持化学惰性且不起反应。

本发明尤其解决与干扰素多肽的活性和制备相关的问题，且也针对具有改良生物或药理学性质（诸如改良治疗半衰期和/或目前IFN治疗剂中所发现的一种或一种以上生物活性或副作用的调节）的干扰素多肽的制备。

发明内容

本发明提供包括一个或一个以上非天然编码氨基酸的hIFN多肽。

在一些实施例中，hIFN多肽包括一个或一个以上翻译后修饰。在一些实施例中，hIFN多肽与连接子、聚合物或生物活性分子键联。在一些实施例中，hIFN多肽与双官能聚合物、双官能连接子或至少一种其它hIFN多肽键联。

在一些实施例中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物键联。在一些实施例中，水溶性聚合物包括聚乙二醇部分。在一些实施例中，非天然编码氨基酸与具有连接子的水溶性聚合物键联或与水溶性聚合物键结。在一些实施例中，聚乙二醇分子为双官能聚合物。在一些实施例中，双官能聚合物与第二多肽键联。在一些实施例中，第二多肽为hIFN多肽。在一些实施例中，hIFN多肽包括一个或一个以上天然编码氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施例中，hIFN多肽包括一个或一个以上天然编码氨基酸取代。

在一些实施例中，hIFN多肽包括至少两个与包括聚乙二醇部分的水溶性聚合物键联的氨基酸。在一些实施例中，至少一个氨基酸为非天然编码氨基酸。

在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是在IFN中对应于二级结构的一个或一个以上下列区域中的任何位置处并入，这些区域如下所示：1-9（N末端）、10-21（A螺旋）、22-39（A螺旋与B螺旋之间的区域）、40-75（B螺旋）、76-77（B螺旋与C螺旋之间的区域）、78-100（C螺旋）、101-110（C螺旋与D螺旋之间的区域）、111-132（D螺旋）、133-136（D螺旋与E螺旋之间的区域）、137-155（E螺旋）、156-165（C末端）（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸，其它干扰素或类干扰素细胞因子（诸如limitin））。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是在（但不限于）hIFN的一个或一个以上下列位置（如在SEQ ID NO:2中，或在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）处经取代：在位置1之前（即，在N末端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、61、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165或166（即在羧基末端）。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是在IFN中的一个或一个以上下列位置中并入：在位置1之前（即在N末端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、12、13、16、19、20、22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、40、41、42、45、46、48、49、50、51、58、61、64、65、68、69、70、71、73、74、77、78、79、80、81、82、83、85、86、89、90、93、94、96、97、100、101、103、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、117、118、120、121、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137、148、149、152、153、156、158、159、160、161、162、163、164、165、166（即在蛋白质的羧基末端）（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是在IFN中的一个或一个以上下列位置中并入：6、9、12、13、16、41、45、46、48、49、61、64、65、96、100、101、103、106、107、108、110、111、113、114、117、120、121、149、156、159、160、161和162（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1或SEQID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明的IFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：100、106、107、108、111、113、114（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明的IFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：41、45、46、48、49（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明的IFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：61、64、65、101、103、110、117、120、121、149（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明的IFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：6、9、12、13、16、96、156、159、160、161、162（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明的IFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：2、3、4、5、7、8、16、19、20、40、42、50、51、58、68、69、70、71、73、97、105、109、112、118、148、149、152、153、158、163、164、165（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明的IFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：34、78、107（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，在一个或一个以上这些或其它位置中的非天然编码氨基酸是与水溶性聚合物键联，包含但不限于位置：在位置1之前（即，在N末端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165或166（即在羧基末端）（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，在一个或一个以上这些位置中的非天然编码氨基酸是与水溶性聚合物键联，包含但不限于位置：在位置1之前（即，在N末端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、12、13、16、19、20、22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、40、41、42、45、46、48、49、50、51、58、61、64、65、68、69、70、71、73、74、77、78、79、80、81、82、83、85、86、89、90、93、94、96、97、100、101、103、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、117、118、120、121、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137、148、149、152、153、156、158、159、160、161、162、163、164、165、166（即在羧基末端）（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，非天然编码氨基酸是在一个或一个以上下列位置处与水溶性聚合物键联：6、9、12、13、16、41、45、46、48、49、61、64、65、96、100、101、103、106、107、108、110、111、113、114、117、120、121、149、156、159、160、161和162（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，非天然编码氨基酸是在一个或一个以上下列位置处与水溶性聚合物键联：100、106、107、108、111、113、114（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，非天然编码氨基酸是在一个或一个以上下列位置处与水溶性聚合物键联：41、45、46、48、49（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，非天然编码氨基酸是在一个或一个以上下列位置处与水溶性聚合物键联：61、64、65、101、103、110、117、120、121、149（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，非天然编码氨基酸是在一个或一个以上下列位置处与水溶性聚合物键联：6、9、12、13、16、96、156、159、160、161、162（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1或SEQID NO:3中的相应氨基酸）。

在一些实施例中，在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸与一个或一个以上水溶性聚合物键联：2、3、4、5、7、8、16、19、20、40、42、50、51、58、68、69、70、71、73、97、105、109、112、118、148、149、152、153、163、164、165（SEQ ID NO:2，或其中的相应氨基酸或在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸与一个或一个以上水溶性聚合物键联：34、78、107（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，水溶性聚合物是在一个或一个以上下列氨基酸位置处与IFN多肽的非天然编码氨基酸偶合：6、9、12、13、16、41、45、46、48、49、61、64、65、96、100、101、103、106、107、108、110、111、113、114、117、120、121、149、156、159、160、161和162（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，水溶性聚合物是在一个或一个以上下列氨基酸位置处与IFN多肽偶合：6、9、12、13、16、41、45、46、48、49、61、64、65、96、100、101、103、106、107、108、110、111、113、114、117、120、121、149、156、160、161和162（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，在一个或一个以上这些位置处的非天然编码氨基酸与一个或一个以上水溶性聚合物键联，位置为：34、78、107（SEQ ID NO:2，或其中的相应氨基酸或在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明的IFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸从而提供拮抗剂：2、3、4、5、7、8、16、19、20、40、42、50、51、58、68、69、70、71、73、97、105、109、112、118、148、149、152、153、158、163、164、165（SEQ ID NO:2，或其中的相应氨基酸或在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）；视所选预期位点和所需活性而定，包括这些取代中的一个的hIFN多肽可潜在地充当弱拮抗剂或弱激动剂。人类IFN拮抗剂包含但不限于在以下位置处具有一个或一个以上非天然编码氨基酸取代的hIFN多肽：22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、74、77、78、79、80、82、83、85、86、89、90、93、94、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137或其任何组合（hIFN；SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。

在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是在（但不限于）hIFN的一个或一个以上下列位置处（如在SEQ ID NO:2中，或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）经取代：31、134、34、38、129、36、122、37、121、41、125、124、149、117、39、118、120、107、108、106、100、111、113、114、41、45、46、48、49、61、64、65、101、103、102、110、117、120、121、149、96、6、9、12、13、16、68、70、109、159、161、156、160、162、24、27、78、83、85、87、89、164。在一个实施例中，非天然编码氨基酸是在hIFN的位置38处（如在SEQ IDNO:2中，或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）经取代。在一些实施例中，在一个或一个以上这些或其它位置处的非天然编码氨基酸与水溶性聚合物键联，其包含但不限于位置：31、134、34、38、129、36、122、37、121、41、125、124、149、117、39、118、120、107、108、106、100、111、113、114、41、45、46、48、49、61、64、65、101、103、102、110、117、120、121、149、96、6、9、12、13、16、68、70、109、159、161、156、160、162、24、27、78、83、85、87、89、164（如在SEQ ID NO:2中，或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。

在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是在（但不限于）hIFN的一个或一个以上下列位置（SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）处经取代：在位置1之前（即，在N末端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165或166（即在羧基末端）以及一个或一个以上天然氨基酸取代。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是与水溶性聚合物偶合。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是与PEG偶合。在一个实施例中，天然氨基酸取代为R149Y。在一些实施例中，天然氨基酸取代为R149E。在一些实施例中，天然氨基酸取代为R149S。在一个实施例中，非天然氨基酸取代在位置107处且天然氨基酸取代为R149Y。在一个实施例中，非天然氨基酸取代在位置106处且天然氨基酸取代为R149Y。在一些实施例中，一个或一个以上天然编码氨基酸取代在hIFN的一个或一个以上下列位置（SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）处，包含但不限于：10、16、13、79、83、85、86、87、90、91、93、94、96、120、121、124、125、128、149。在一些实施例中，一个或一个以上天然编码氨基酸取代为一个或一个以上下列取代（SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸），其包含但不限于：G10E、M16R、R13E、T79R、K83Q、K83S、Y85L、T86S、E87S、Q90R、Q91E、N93Q、D94V、E96K、R120K、K121T、Q124R、R125G、L128R、R149Y、R149E、R149S。在一些实施例中，天然氨基酸取代在位置1（N末端）处。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是在hIFN的一个或一个以上下列位置（如在SEQ ID NO:2中，或其它IFN中的相应氨基酸）处经取代：107、78、34。在一些实施例中，在一个或一个以上这些位置处的非天然编码氨基酸与水溶性聚合物偶合：107、78、34。

在limitin序列中发现的一个或一个以上氨基酸可经取代入hIFN多肽（杂合limitin/hIFN多肽）中。实例包含但不限于在先前段落中描述的天然氨基酸取代。或者，在干扰素多肽中发现的一组氨基酸可经limitin序列中发现的一组氨基酸置换。一组氨基酸可包括连续氨基酸或在分子的不同部分中存在的氨基酸，但涉及在多肽的结构特征或生物活性中。与其它IFNα蛋白质相比，小鼠limitin分子具有经改良CFU-GM毒性概况。人类IFNα-2a与limitin蛋白质序列的比对展示30%氨基酸一致性。也观察到50%序列保守性。特定来说，观察到C螺旋与D螺旋之间（在C螺旋与D螺旋之间的环中）的limitin序列中的显著缺失。由在hIFNα-2a（SEQ ID NO:2）中的以下取代产生“HV”突变体：D77-D94经小鼠limitin序列HERALDQLLSSLWRELQV置换。由在hIFNα-2a（SEQ ID NO:2）中的以下取代产生“CD”突变体：V105-D114经GQSAPLP取代。发现具有来自经取代入人类IFNα-2a蛋白质（“CD”突变体）中的limitin的环区的此杂合分子具有与WHO IFN标准物相当的抗病毒活性。除一个或一个以上limitin氨基酸之外，hIFN多肽可在hIFN多肽的任何一个或一个以上位置处包括一个或一个以上非天然编码氨基酸。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸可与诸如PEG的水溶性聚合物键联或与诸如PEG的水溶性聚合物直接键结。除在HV或CD突变体中的天然氨基酸取代之外，在hIFN多肽中可发现一个或一个以上其它天然氨基酸取代。

在一些实施例中，hIFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：6、16、34、39、45、46、64、65、68、78、85、87、101、107、108、111、114、118、124、125、145、146、153、156、96、149（SEQ ID NO:2，或其中的相应氨基酸或SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，hIFN多肽包括与一个或一个以上水溶性聚合物键联的在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：6、16、34、39、45、46、64、65、68、78、85、87、101、107、108、111、114、118、124、125、145、146、153、156、96、149（SEQ ID NO:2，或其中的相应氨基酸或SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，hIFN多肽包括与一个或一个以上水溶性聚合物键联的在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：6、16、34、39、45、46、64、65、68、78、85、87、101、107、108、111、114、118、124、125、145、146、153、156、96、149（SEQ ID NO:2，或其中的相应氨基酸或SEQID NO:1、SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）且包括一个或一个以上天然编码氨基酸取代。在一些实施例中，hIFN多肽包括与一个或一个以上水溶性聚合物键联的在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：6、16、34、39、45、46、64、65、68、78、85、87、101、107、108、111、114、118、124、125、145、146、153、156、96、149（SEQ ID NO:2，或其中的相应氨基酸或SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）且包括一个或一个以上下列天然编码氨基酸取代：G10E、M16R、R13E、T79R、K83Q、K83S、Y85L、T86S、E87S、Q90R、Q91E、N93Q、D94V、E96K、R120K、K121T、Q124R、R125G、L128R、R149Y、R149E、R149S。

在一些实施例中，hIFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：6、16、37、45、46、78、87、89、107、108（SEQ ID NO:2或在SEQID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，hIFN多肽包括与水溶性聚合物键联的在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：6、16、37、45、46、78、87、89、107、108（SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，hIFN多肽包括与水溶性聚合物键结的在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：6、16、37、45、46、78、87、89、107、108（SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。

在一些实施例中，hIFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：6、16、37、45、46、78、87、89、107、108；以及一个或一个以上下列天然编码氨基酸取代：T79R、L80A、K83S、Y85L、Y85S、T86S、E87S、Q91E（SEQID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，hIFN多肽包括与水溶性聚合物键联的在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：6、16、37、45、46、78、87、89、107、108且包括一个或一个以上下列天然编码氨基酸取代：T79R、L80A、K83S、Y85L、Y85S、T86S、E87S、Q91E（SEQID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，hIFN多肽包括与水溶性聚合物键结的在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：6、16、37、45、46、78、87、89、107、108且包括一个或一个以上下列天然编码氨基酸取代：T79R、L80A、K83S、Y85L、Y85S、T86S、E87S、Q91E（SEQID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。

在一些实施例中，hIFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：6、16、37、45、46、78、87、107和108（SEQ ID NO:2或在SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，hIFN多肽包括与水溶性聚合物键联的在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：6、16、37、45、46、78、87、107和108（SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，hIFN多肽包括与水溶性聚合物键结的在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：6、16、37、45、46、78、87、107和108（SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。

在一些实施例中，hIFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：6、16、37、45、46、78、87、107和108且包括一个或一个以上下列天然编码氨基酸取代：T79R、K83S、Y85L、T86S、E87S、Q91E（SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，hIFN多肽包括与水溶性聚合物键联的在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：6、16、37、45、46、78、87、107和108且包括一个或一个以上下列天然编码氨基酸取代：T79R、K83S、Y85L、T86S、E87S、Q91E（SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，hIFN多肽包括与水溶性聚合物键结的在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：6、16、37、45、46、78、87、107和108且包括一个或一个以上下列天然编码氨基酸取代：T79R、K83S、Y85L、T86S、E87S、Q91E（SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。

在一些实施例中，hIFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：37、45、46、89和107（SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，hIFN多肽包括与水溶性聚合物键联的在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：37、45、46、89和107（SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，hIFN多肽包括与水溶性聚合物键结的在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：37、45、46、89和107（SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3中的相应氨基酸）。

在一些实施例中，hIFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：37、45、46、89和107且包括一个或一个以上下列天然编码氨基酸取代：T79R、L80A、Y85L、Y85S、E87S（SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，hIFN多肽包括与水溶性聚合物键联的在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：37、45、46、89和107且包括一个或一个以上下列天然编码氨基酸取代：T79R、L80A、Y85L、Y85S、E87S（SEQID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，hIFN多肽包括与水溶性聚合物键结的在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：37、45、46、89和107且包括一个或一个以上下列天然编码氨基酸取代：T79R、L80A、Y85L、Y85S、E87S（SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。

在一些实施例中，hIFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、128、129、131、132、133、134、135、136、137、158、159、160、161、162、163、164、165（SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，hIFN多肽包括与水溶性聚合物键联或键结的在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、128、129、131、132、133、134、135、136、137、158、159、160、161、162、163、164、165（SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，hIFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：23、24、27、31、128、131、134、158（SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，hIFN多肽包括与水溶性聚合物键联或键结的在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：23、24、27、31、128、131、134、158（SEQID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，hIFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：24、27、31、128、131、134（SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，hIFN多肽包括与水溶性聚合物键联或键结的在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：24、27、31、128、131、134（SEQ IDNO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。

在一些实施例中，本发明的IFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸从而提供拮抗剂：2、3、4、5、7、8、16、19、20、40、42、50、51、58、68、69、70、71、73、97、105、109、112、118、148、149、152、153、158、163、164、165或其任何组合（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）；视所选位点和所需活性而定，包括这些取代中的一个的hIFN多肽可潜在地充当弱拮抗剂或弱激动剂。人类IFN拮抗剂包含但不限于在以下位置处具有一个或一个以上取代的那些人类IFN拮抗剂：22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、74、77、78、79、80、82、83、85、86、89、90、93、94、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137或其任何组合（hIFN；SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。

在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是在（但不限于）hIFN的一个或一个以上下列位置（如在SEQ ID NO:2中或其它IFN中的相应氨基酸）处经取代：31、134、34、38、129、36、122、37、121、41、125、124、149、117、39、118、120、107、108、106、100、111、113、114、41、45、46、48、49、61、64、65、101、103、102、110、117、120、121、149、96、6、9、12、13、16、68、70、109、159、161、156、160、162、24、27、78、83、85、87、89、164。在一个实施例中，非天然编码氨基酸是在hIFN的位置38处（如在SEQ ID NO:2中或其它IFN中的相应氨基酸）经取代。在一些实施例中，在这些或其它位置处的非天然编码氨基酸与水溶性聚合物键联，其包含但不限于位置：31、134、34、38、129、36、122、37、121、41、125、124、149、117、39、118、120、107、108、106、100、111、113、114、41、45、46、48、49、61、64、65、101、103、102、110、117、120、121、149、96、6、9、12、13、16、68、70、109、159、161、156、160、162、24、27、78、83、85、87、89、164。

在一些实施例中，hIFN多肽包括一个或一个以上非天然编码氨基酸和天然编码氨基酸取代。在一些实施例中，在hIFN多肽中存在的非天然编码氨基酸与水溶性聚合物键联且hIFN多肽包括一个或一个以上天然编码氨基酸取代。

在一些实施例中，hIFN多肽包括调节hIFN多肽对hIFN多肽受体的亲和性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，与不具有取代、添加或缺失的相应hIFN的稳定性相比，hIFN多肽包括增加hIFN多肽的稳定性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，与不具有取代、添加或缺失的相应hIFN的免疫原性相比，hIFN多肽包括增加hIFN多肽的免疫原性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，与不具有取代、添加或缺失的相应hIFN的血清半衰期或循环时间相比，hIFN多肽包括调节hIFN多肽的血清半衰期或循环时间的取代、添加或缺失。

在一些实施例中，与具有不具有取代、添加或缺失的相应hIFN的hIFN多肽受体构象相比，hIFN多肽包括调节hIFN多肽受体构象的取代、添加或缺失。在一些实施例中，与具有不具有取代、添加或缺失的相应hIFN的hIFN多肽受体的下游信号转导事件相比，hIFN多肽包括调节hIFN多肽受体的一个或一个以上下游信号转导事件的取代、添加或缺失。在一些实施例中，与具有不具有取代、添加或缺失的相应hIFN的hIFN多肽受体结合动力学相比，hIFN多肽包括调节hIFN多肽受体结合动力学的取代、添加或缺失。

在一些实施例中，与不具有取代、添加或缺失的相应hIFN的水溶性相比，hIFN多肽包括增加hIFN多肽的水溶性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，与不具有取代、添加或缺失的相应hIFN的溶解度相比，hIFN多肽包括增加在宿主细胞中产生的hIFN多肽的溶解度的取代、添加或缺失。在一些实施例中，与不具有取代、添加或缺失的相应hIFN的表达或合成相比，hIFN多肽包括增加hIFN多肽在宿主细胞中的表达或增加活体外合成的取代、添加或缺失。在一些实施例中，与不具有取代、添加或缺失的相应hIFN的蛋白酶抗性相比，hIFN多肽包括增加hIFN多肽的蛋白酶抗性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，hIFN多肽包括调节与一个或一个以上类鸦片受体家族成员的相互作用的取代、添加或缺失。在一些实施例中，hIFN多肽包括调节5-HT脑神经传递的取代、添加或缺失。在一些实施例中，hIFN多肽包括调节吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）的诱发的取代、添加或缺失。在一些实施例中，hIFN多肽包括调节IFN的一种或一种以上生物活性（包含但不限于伴随目前IFN治疗剂所发现的副作用）的取代、添加或缺失。在一些实施例中，与不具有取代、添加或缺失的相应hIFN的毒性相比，hIFN多肽包括调节毒性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，hIFN多肽包括调节一种或一种以上伴随IFN所发现的副作用的与水溶性聚合物键联的非天然编码氨基酸。在一些实施例中，hIFN多肽包括与水溶性聚合物键联的非天然编码氨基酸且具有经调节毒性。在一些实施例中，与不具有取代、添加、缺失或非天然编码氨基酸的相应hIFN的抗病毒活性相比，hIFN多肽包括调节抗病毒活性的取代、添加、缺失或非天然编码氨基酸。在一些实施例中，与不具有取代、添加、缺失或非天然编码氨基酸的相应hIFN的免疫原性相比，hIFN多肽包括调节免疫原性的取代、添加、缺失或非天然编码氨基酸。在一些实施例中，与不具有取代、添加、缺失或非天然编码氨基酸的相应hIFN的抗肿瘤活性相比，hIFN多肽包括调节抗肿瘤活性的取代、添加、缺失或非天然编码氨基酸。在一些实施例中，与不具有取代、添加、缺失或非天然编码氨基酸的相应hIFN的抗感染活性相比，hIFN多肽包括调节抗感染活性的取代、添加、缺失或非天然编码氨基酸。在一些实施例中，与不具有取代、添加、缺失或非天然编码氨基酸的相应hIFN对感染剂的预防活性相比，hIFN多肽包括调节对感染剂的预防活性的取代、添加、缺失或非天然编码氨基酸。在一些实施例中，与不具有取代、添加、缺失或非天然编码氨基酸的相应hIFN的肿瘤预防活性相比，hIFN多肽包括调节肿瘤预防活性的取代、添加、缺失或非天然编码氨基酸。

在一些实施例中，hIFN多肽中的氨基酸可经天然存在或非天然存在氨基酸取代，条件是至少一个取代是经非天然编码氨基酸进行。

在一些实施例中，非天然编码氨基酸包括羰基、乙酰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。

在一些实施例中，非天然编码氨基酸包括羰基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸具有以下结构：

其中n为0-10；R₁为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R₂为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基；且R₃为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R₄为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。

在一些实施例中，非天然编码氨基酸包括氨氧基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包括酰肼基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包括肼基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸残基包括氨基脲基。

在一些实施例中，非天然编码氨基酸残基包括叠氮基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸具有以下结构：

其中n为0-10；R₁为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R₂为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R₃为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。

在一些实施例中，非天然编码氨基酸包括炔基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸具有以下结构：

其中n为0-10；R₁为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；X为O、N、S或不存在；m为0-10，R₂为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R₃为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。

在一些实施例中，多肽为hIFN多肽激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂。在一些实施例中，hIFN多肽激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂包括与水溶性聚合物键联的非天然编码氨基酸。在一些实施例中，水溶性聚合物包括聚乙二醇部分。在一些实施例中，hIFN多肽激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂包括非天然编码氨基酸以及一个或一个以上翻译后修饰、连接子、聚合物或生物活性分子。在一些实施例中，与水溶性聚合物键联的非天然编码氨基酸是存在于hIFN多肽的位点II区域（涵盖AC螺旋束面、螺旋A的氨基末端区域和一部分螺旋C的蛋白质区域）中。在一些实施例中，包括与水溶性聚合物键联的非天然编码氨基酸的hIFN多肽通过防止hIFN多肽拮抗剂与第二hIFN多肽受体分子结合而防止hIFN多肽受体的二聚合。

本发明也提供包括在严格条件下与SEQ ID NO:21或22杂交的聚核苷酸的分离核酸，其中聚核苷酸包括至少一个选择密码子。在一些实施例中，选择密码子选自由琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子、五碱基密码子和四碱基密码子组成的群组。

本发明也提供制造与水溶性聚合物键联的hIFN多肽的方法。在一些实施例中，所述方法包括将包括非天然编码氨基酸的分离hIFN多肽与包括与非天然编码氨基酸反应的部分的水溶性聚合物接触。在一些实施例中，并入hIFN多肽中的非天然编码氨基酸可与另外不与20种常见氨基酸中的任一种反应的水溶性聚合物反应。在一些实施例中，并入hIFN多肽中的非天然编码氨基酸可与另外不与20种常见氨基酸中的任一种反应的连接子、聚合物或生物活性分子反应。

在一些实施例中，通过使包括含羰基氨基酸的hIFN多肽与包括氨氧基、肼、酰肼或氨基脲基的聚乙二醇分子反应来制备与水溶性聚合物键联的hIFN多肽。在一些实施例中，氨氧基、肼、酰肼或氨基脲基是通过酰胺键与聚乙二醇分子键联。

在一些实施例中，通过使包括羰基的聚乙二醇分子与包括包含氨氧基、肼、酰肼或氨基脲基的非天然编码氨基酸的多肽反应来制备与水溶性聚合物键联的hIFN多肽。

在一些实施例中，通过使包括含炔氨基酸的hIFN多肽与包括叠氮基部分的聚乙二醇分子反应来制备与水溶性聚合物键联的hIFN多肽。在一些实施例中，叠氮基或炔基是通过酰胺键与聚乙二醇分子键联。

在一些实施例中，通过使包括含叠氮基氨基酸的hIFN多肽与包括炔部分的聚乙二醇分子反应来制备与水溶性聚合物键联的hIFN多肽。在一些实施例中，叠氮基或炔基是通过酰胺键与聚乙二醇分子键联。

在一些实施例中，聚乙二醇分子具有介于约0.1kDa与约100kDa之间的分子量。在一些实施例中，聚乙二醇分子具有介于0.1kDa与50kDa之间的分子量。

在一些实施例中，聚乙二醇分子为分枝聚合物。在一些实施例中，聚乙二醇分枝聚合物的各支链具有介于1kDa与100kDa之间或介于1kDa与50kDa之间的分子量。

在一些实施例中，与hIFN多肽键联的水溶性聚合物包括聚烷撑二醇部分。在一些实施例中，并入hIFN多肽中的非天然编码氨基酸残基包括羰基、氨氧基、酰肼基、肼、氨基脲基、叠氮基或炔基。在一些实施例中，并入hIFN多肽中的非天然编码氨基酸残基包括羰基部分且水溶性聚合物包括氨氧基、酰肼、肼或氨基脲部分。在一些实施例中，并入hIFN多肽中的非天然编码氨基酸残基包括炔部分且水溶性聚合物包括叠氮基部分。在一些实施例中，并入hIFN多肽中的非天然编码氨基酸残基包括叠氮基部分且水溶性聚合物包括炔部分。

本发明也提供组合物，其包括包含非天然编码氨基酸的hIFN多肽和医药学上可接受的载剂。在一些实施例中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物键联。

本发明也提供包括编码包括选择密码子的hIFN多肽的聚核苷酸的细胞。在一些实施例中，细胞包括用于将非天然编码氨基酸取代入hIFN多肽中的正交RNA合成酶和/或正交tRNA。

本发明也提供制造包括非天然编码氨基酸的hIFN多肽的方法。在一些实施例中，所述方法包括在允许hIFN多肽表达的条件下培养包括一种或一种以上编码hIFN多肽的聚核苷酸、正交RNA合成酶和/或正交tRNA的细胞，和自细胞和/或培养基纯化hIFN多肽。

本发明也提供增加hIFN多肽的治疗半衰期、血清半衰期或循环时间的方法。本发明也提供调节hIFN多肽的免疫原性的方法。本发明也提供调节hIFN多肽的毒性的方法。本发明也提供调节目前IFN治疗剂的副作用的方法。在一些实施例中，所述方法包括用非天然编码氨基酸取代天然存在hIFN多肽中的任何一个或一个以上氨基酸和/或将hIFN多肽与连接子、聚合物、水溶性聚合物或生物活性分子键联。

本发明也提供用有效量的本发明的hIFN分子来治疗需要这种治疗的患者的方法。在一些实施例中，所述方法包括向患者投与治疗有效量的医药组合物，所述医药组合物包括包含非天然编码氨基酸的hIFN多肽和医药学上可接受的载剂。在一些实施例中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物键联。

除至少一个氨基酸经非天然编码氨基酸取代之外，本发明也提供包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3中展示的序列或任何其它hIFN多肽序列或类干扰素细胞因子（诸如limitin）的hIFN多肽。在一些实施例中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物键联。在一些实施例中，水溶性聚合物包括聚乙二醇部分。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包括羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。

本发明也提供医药组合物，其包括医药学上可接受的载剂和包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3中展示的序列或任何其它IFN多肽序列或类干扰素细胞因子（诸如limitin）的hIFN多肽，其中至少一种氨基酸经非天然编码氨基酸取代。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包括糖部分。在一些实施例中，水溶性聚合物通过糖部分与多肽键联。在一些实施例中，连接子、聚合物或生物活性分子通过糖部分与hIFN多肽键联。

本发明也提供包括在单一氨基酸处通过共价键与hIFN多肽键联的水溶性聚合物的hIFN多肽。在一些实施例中，水溶性聚合物包括聚乙二醇部分。在一些实施例中，与水溶性聚合物共价键联的氨基酸为多肽中存在的非天然编码氨基酸。

本发明提供包括至少一个连接子、聚合物或生物活性分子的hIFN多肽，其中所述连接子、聚合物或生物活性分子是通过经核糖体并入多肽中的非天然编码氨基酸的官能团与多肽连接。在一些实施例中，多肽经单聚乙二醇化。本发明也提供包括与一个或一个以上非天然编码氨基酸连接的连接子、聚合物或生物活性分子的hIFN多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在预选位点处经核糖体并入多肽中。

在另一实施例中，由于用于接合非天然氨基酸的独特化学反应，包括一个或一个以上非天然存在氨基酸的hIFN多肽与另一分子（包含但不限于PEG）的接合提供实质上经纯化的hIFN。可用在接合步骤之前或之后进行的其它纯化技术来进行包括一个或一个以上非天然编码氨基酸的hIFN与另一分子（诸如PEG）的接合以提供实质上纯的hIFN。

定义

应了解本发明并不限于在本文中所述的特定方法、方案、细胞系、构筑体以及试剂且因此可改变。也应了解本文中所用的术语仅出于描述特定实施例的目的，且并不打算限制本发明的范围，本发明的范围将仅由随附权利要求来限定。

除非在上下文中另外明确指出，否则如本文中和随附权利要求中所用的单数形式“一”和“所述”包含复数个指示物。因此，举例来说，提及一“hIFN”为提及一种或一种以上这些蛋白质且包含所属领域的一般技术人员已知的其等价物等等。

除非另外定义，否则在本文中所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所理解相同的含义。尽管与本文中所述类似或等效的任何方法、装置和材料可用于本发明的实施或测试中，但现在将描述优选方法、装置和材料。

在本文中提及的所有公开案和专利都是出于描述且揭示（例如）在所述公开案中描述的构筑体和方法的目的而以引用的方式并入本文中，所述构筑体和方法可结合本发明一起使用。仅提供本文所讨论的公开案在本发明申请日期之前的揭示内容。本文中没有内容将被解释为承认发明者因先前发明或任何其它原因而无权提前公开本发明。

术语“实质上经纯化”指的是可实质上或基本上不含通常伴随在多肽天然存在环境（即天然细胞，或者在重组产生hIFN多肽的情况下为宿主细胞）中发现的蛋白或与在多肽天然存在环境中发现的蛋白相互作用的组分的hIFN多肽。可实质上不含细胞物质的hIFN多肽包含具有小于约30%、小于约25%、小于约20%、小于约15%、小于约10%、小于约5%、小于约4%、小于约3%、小于约2%或小于约1%（以干重计）的污染蛋白的蛋白制剂。当hIFN多肽或其变体是由宿主细胞重组产生时，蛋白可以细胞干重的约30%、约25%、约20%、约15%、约10%、约5%、约4%、约3%、约2%或约1%或更小存在。当hIFN多肽或其变体是由宿主细胞重组产生时，蛋白可以细胞干重计约5g/L、约4g/L、约3g/L、约2g/L、约l g/L、约750mg/L、约500mg/L、约250mg/L、约100mg/L、约50mg/L、约10mg/L或约1mg/L或更小存在于培养基中。因此，如由本发明的方法所产生的“实质上经纯化”hIFN多肽可具有如由适当方法（诸如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛细管电泳）所测定至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%的纯度级别，特定来说至少约75%、80%、85%的纯度级别，且更特定来说至少约90%的纯度级别、至少约95%的纯度级别、至少约99%或更大的纯度级别。

“重组宿主细胞”或“宿主细胞”指的是不管何种方法用于插入（例如，直接吸收、转导、f配对或所属技术领域中用于产生重组宿主细胞的其它方法），包含外源聚核苷酸的细胞。外源聚核苷酸可保持为非整合载体（例如，质粒）或者可整合入宿主基因组中。

如本文中所用，术语“培养基”包含可支撑或容纳任何宿主细胞的任何培养基、溶液、固体、半固体或刚性支撑物，所述宿主细胞包含细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真核宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、CHO细胞、原核宿主细胞、大肠杆菌或假单胞菌宿主细胞和细胞内含物。因此，所述术语可涵盖宿主细胞已生长于其中的培养基，例如，hIFN多肽已分泌入其中的培养基，其包含在增殖步骤之前或之后的培养基。所述术语也可涵盖含有宿主细胞溶菌液的缓冲液或试剂，诸如在hIFN多肽于细胞内产生且宿主细胞经溶解或破裂以释放hIFN多肽的情况下。

如本文中关于蛋白质再折叠所用的“还原剂”经定义为将巯基保持在还原状态且还原分子内或分子间二硫键的任何化合物或物质。适合还原剂包含但不限于二硫苏糖醇（DTT）、2-巯基乙醇、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸、半胱胺（2-氨基乙硫醇）以及还原谷胱甘肽。所属领域的一般技术人员易于了解多种还原剂适用于本发明的方法和组合物中。

如本文中关于蛋白质再折叠所用的“氧化剂”经定义为能够自所氧化化合物移除电子的任何化合物或物质。适合氧化剂包含但不限于氧化谷胱甘肽、胱氨酸、胱胺、氧化二硫苏糖醇、氧化赤藓糖醇以及氧。所属领域的一般技术人员易于了解多种氧化剂适用于本发明的方法中。

如本文中所用的“变性剂”经定义为会造成蛋白质可逆展开的任何化合物或物质。变性剂的强度将由特定变性剂的性质和浓度决定。适合变性剂可为离液剂（chaotrope）、清洁剂、有机溶剂、水可混溶溶剂、磷脂或两种或两种以上这些试剂的组合。适合离液剂包含但不限于尿素、胍以及硫氰酸钠。有用清洁剂可包含但不限于强清洁剂，诸如十二烷基硫酸钠或聚氧乙烯醚（例如Tween或Triton清洁剂）、Sarkosyl；温和非离子型清洁剂（例如，毛地黄皂苷（digitonin））；温和阳离子型清洁剂，诸如N->2,3-(二油烯基氧基)-丙基-N,N,N-三甲基铵；温和离子型清洁剂（例如胆酸钠或脱氧胆酸钠）；或两性离子型清洁剂，其包含但不限于硫代甜菜碱（Zwittergent）、3-(3-氯酰胺基丙基)二甲基氨基-1-丙烷硫酸盐（CHAPS）以及3-(3-氯酰胺基丙基)二甲基氨基-2-羟基-1-丙烷磺酸盐（CHAPSO）。诸如乙腈、低碳烷醇（尤其C₂-C₄烷醇，诸如乙醇或异丙醇）或低碳烷二醇（尤其C₂-C₄烷二醇，诸如乙二醇）的有机、水可混溶溶剂可用作变性剂。适用于本发明中的磷脂可为天然存在磷脂，诸如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸以及磷脂酰肌醇；或合成磷脂衍生物或变体，诸如二己酰基磷脂酰胆碱或二庚酰基磷脂酰胆碱。

如本文中所用的“再折叠”描述将含有二硫键的多肽自不当折叠或展开状态转化为二硫键的天然或适当折叠构象的任何过程、反应或方法。

如本文中所用的“共折叠”特定指的是使用至少两种彼此相互作用的多肽且使得展开或不当折叠多肽转化为天然、适当折叠多肽的再折叠过程、反应或方法。

如本文中所用，“干扰素”或“IFN”应包含具有干扰素的至少一种生物活性的那些多肽和蛋白质，其包含但不限于IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNω、IFNε或IFNτ或类干扰素细胞因子（诸如limitin）（诸如描述于以下文献中的那些：美国专利4,414,150；4,456,748；4,727,138；4,762,791；4,929,554；5,096,705；4,695,623；4,614,651；4,678,751；4,925,793；5,460,811；5,120,832；4,780,530；4,908,432；4,970,161；4,973,479；4,975,276；5,098,703；5,278,286；5,661,009；6,372,206；6,433,144；6,472,512；6,572,853；6,703,225；6,200,780；6,299,869；6,300,475；6,323,006；6,350,589；5,705,363；5,738,845；5,789,551；6,117,423；6,174,996；5,540,923；5,541,293；5,541,312；5,554,513；5,593,667，其是以引用的方式并入本文中），以及IFN类似物、IFN异形体、IFN模拟物、IFN片段、杂合IFN蛋白、其融合蛋白、寡聚体和多聚体、同源物、糖基化形式变体、变体、剪接变体和突变体，而不考虑生物活性是否相同，且此外不考虑其合成或制造方法，其包含但不限于重组（无论是自cDNA、基因组DNA、合成DNA制备还是自其它形式的核酸制备）、活体外、活体内、通过微注射核酸分子、合成、转基因和基因活化方法。IFN的特定实例包含但不限于IFNγ-1bIFNβ-1a（

和

）、IFNβ-1b

复合IFN、IFN alfacon-1

IFNα-2

IFNα-2a

聚乙二醇干扰素α-2a

聚乙二醇干扰素α-2b

IFN类似物、IFN突变体、改变的糖基化人类IFN以及PEG接合IFN类似物。经修饰以表达内源性人类IFN的细胞的特定实例描述于Devlin等人,J.Leukoc.Biol.41:306(1987)；美国专利第6,610,830号；第6,482,613号；第6,489,144号；第6,159,712号；第5,814,485号；第5,710,027号；第5,595,888号；第4,966,843号中；其是以引用的方式并入本文中。关于GH家族成员的表达，也参看美国专利第6,716,606号；第6,379,661号；第6,004,548号；第5,830,705号；第5,582,823号；第4,810,643号；和第6,242,218号，其是以引用的方式并入本文中。

术语“人类IFN（hIFN）”或“hIFN多肽”指的是如上所述的干扰素或IFN，以及保留天然存在hIFN的至少一种生物活性的多肽。术语“hIFN多肽”或“hIFN”也包含其医药学上可接受的盐和前药，以及盐的前药、天然存在人类IFN的多晶型物、水合物、溶剂化物、生物活性片段、生物活性变体和立体异构体，以及天然存在人类IFN的激动剂、模拟物和拮抗剂变体和其多肽融合体。hIFN多肽的实例包含但不限于在以下文献中所述的那些：美国专利第4,604,284号；第5,582,824号；第6,531,122号；第6,204,022号；第6,120,762号；第6,046,034号；第6,036,956号；第5,939,286号；第5,908,626号；第5,780,027号；第5,770,191号；第5,723,125号；第5,594,107号；第5,378,823号；第4,898,931号；第4,892,743号，其是以引用的方式并入本文中。术语“hIFN多肽”涵盖在氨基末端、羧基末端或两者上包括其它氨基酸的融合体。例示性融合包含但不限于（例如）由缺乏分泌信号肽或其部分的成熟形式的hIFN的重组表达产生的其中甲硫氨酸与hIFN的N末端键联的甲硫氨酰基IFN、出于纯化目的的融合（包含但不限于与聚组氨酸或亲和性抗原决定基融合）、与血清白蛋白结合肽融合以及与血清蛋白（诸如血清白蛋白）融合。同样，术语“hIFN多肽”也包含来自limitin或其它类干扰素细胞因子的具有一个或一个以上氨基酸取代的杂合分子。美国专利第5,750,373号（其是以引用的方式并入本文中）描述一种选择对其各自的受体分子具有改变的结合性质的诸如生长激素和抗体片段变体的新颖蛋白质的方法。所述方法包括将编码所关注蛋白质的基因与纤维状噬菌体M13的基因III外壳蛋白的羧基末端区域融合。已知全长和成熟形式的天然存在hIFN核酸和氨基酸序列为变体（诸如单一氨基酸变体或剪接变体）。

复合干扰素为含有166个氨基酸的重组1型干扰素。通过扫描若干天然α干扰素的序列且指定各相应位置中最常观察到的氨基酸而得到复合IFN。当在活体外检定中基于相同质量与IFNα-2a和α-2b相比时，复合IFN通常显示生物活性高5-10倍（Blatt等人,J.Interferon Cytokine Res.1996;16:489-99）。

经修饰hIFN多肽可展现在不同干扰素分子中所发现的一种或一种以上性质或生物活性。举例来说，自IFNα-2a氨基酸序列产生且包括一个或一个以上未经聚乙二醇化或聚乙二醇化的非天然编码氨基酸的hIFN多肽可展现在IFNβ中所发现的一种或一种以上生物活性。一种所述活性可为抗增殖活性。

关于完整全长天然存在IFNα-2a氨基酸序列以及成熟天然存在IFNα-2a氨基酸序列，在本文中分别参看SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。在一些实施例中，本发明的hIFN多肽实质上和SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或干扰素多肽或类干扰素细胞因子（诸如limitin）的任何其它序列一致。编码hIFN突变体和突变hIFN多肽的核酸分子为人所众所周知且包含但不限于在以下文献中所揭示的那些：美国专利第6,331,525号；第6,069,133号；第5,955,307号；第5,869,293号；第5,831,062号；第5,081,022号；第5,004,689号；第4,738,931号；第4,686,191号；其是以引用的方式并入本文中。hIFN突变体的实例包含在美国专利第6,514,729号和第5,582,824号中所揭示的那些，所述文献是以引用的方式并入本文中。

干扰素具有多种生物活性（包含抗病毒、免疫调节和抗增殖特性）且已用作用于治疗诸如癌症和各种病毒疾病的疾病的治疗剂。已展示干扰素-α抑制各种类型的细胞增殖，且尤其适用于治疗通常与癌症相关的多种细胞增殖病症、尤其血液科恶性疾病（诸如白血病）。这些蛋白质已展示对多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病、低恶度性淋巴瘤、卡波西肉瘤、慢性骨髓性白血病、肾细胞癌、膀胱肿瘤和卵巢癌的抗增殖活性（Bonnem,E.M.等人,(1984)J.Biol.Response Modifiers 3:580；Oldham,R.K.(1985)HospitalPractice 20:71）。

IFNα对各种类型的病毒感染有效（Finter,N.B.等人,(1991)Drugs 42(5):749）。干扰素-α已展示对抗人类乳头状瘤病毒感染、B型肝炎和C型肝炎感染的活性（Finter,N.B.等人,1991,同上文；Kashima,H.等人,(1988)Laryngoscope 98:334；Dusheiko,G.M.等人,(1986)J.Hematology 3(增刊2):S199；Davis,G L等人,(1989)N.England J.Med.321:1501）。也已研究干扰素和干扰素受体在某些自体免疫和发炎性疾病的发病机理中的作用（Benoit,P.等人,(1993)J.Immunol.150(3):707）。另外，已批准干扰素-α用于治疗以下疾病，诸如毛细胞白血病、肾细胞癌、基底细胞癌、恶性黑素瘤、AIDS相关卡波西肉瘤、多发性骨髓瘤、慢性骨髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma）、喉乳头状瘤、蕈样肉芽肿、尖锐湿疣、慢性B型肝炎、C型肝炎、慢性D型肝炎和慢性非A、非B/C型肝炎。

在各种自体免疫疾病（诸如诸如全身性红斑狼疮、白塞病（Behcet's disease）和胰岛素依赖性糖尿病（IDDM，也被称作I型糖尿病））的发病机理中已涉及干扰素。在转基因小鼠模型中已证实IFN-α的β细胞表达可造成胰岛炎和IDDM，且已提议IFN-α拮抗剂（包含抗体）可用于治疗IDDM（WO 93/04699，公开于1993年3月18日）。在多发性硬化症（MS）患者中已观察到受损IFN-γ和IFN-α产生。在许多AIDS患者的血清中已检测到IFN-α，且已报导在来自AIDS患者的有丝分裂原刺激型单核细胞的悬浮液中IFN-γ的产生受到极大抑制。关于概述，例如参看Interferons and other RegulatoryCytokines,Edward de Maeyer(1988,John Wiley and Sons publishers)中的第16章,"ThePresence and Possible Pathogenic Role of Interferons in Disease"。α和β干扰素已用于治疗急性病毒疾病带状疱疹（T.C.Merigan等人,N.Engl.J.Med.298,981-987(1978)；E.Heidemann等人,Onkologie 7,210-212(1984)）；慢性病毒感染，例如C型肝炎和B型肝炎感染（R.L.Knobler等人,Neurology 34(10):1273-9(1984)；M.A.Faerkkilae等人,Act.Neurol.Sci.69,184-185(1985)）。rIFNα-2a（

Roche）为指定用于治疗毛细胞白血病和AIDS相关卡波西肉瘤的注射调配物。已批准重组IFNα-2b（

Schering）用于在某些患者中治疗毛细胞白血病、所选尖锐湿疣病例、AIDS相关卡波西肉瘤、慢性C型肝炎和慢性B型肝炎感染。多种IFNα亚型的组合物也用于治疗多种疾病（

Viragen,Inc.）。市售IFNγ1b（

Intermune Pharmaceuticals,Inc.）可用于治疗慢性肉芽肿病和恶性骨石化病。

在所属技术领域中已经揭示且已知I型IFN的生物活性，且可见于（例如）Pfeffer,Semin.Oncol.24(增刊9),S9-63-S9-69(1997)和美国专利第6,436,391号；第6,372,218号；第6,270,756号；第6,207,145号；第6,086,869号；第6,036,949号；第6,013,253号；第6,007,805号；第5,980,884号；第5,958,402号；第5,863,530号；第5,849,282号；第5,846,526号；第5,830,456号；第5,824,300号；第5,817,307号；第5,780,021号；第5,624,895号；第5,480,640号；第5,268,169号；第5,208,019号；第5,196,191号；第5,190,751号；第5,104,653号；第5,019,382号；第4,959,210号中；其是以引用的方式并入本文中。相关申请案为2005年10月6日公开为US 2005/0220762的名称为“Modified Human Interferon Polypeptides and Their Uses”的美国专利申请案，其是以引用的方式并入本文中。

IFNα为细胞因子基因的不同螺旋束超家族的成员（Sprang,S.R.等人,(1993)Curr.Opin.Struct.Biol.3:815-827）。人类干扰素α是由在氨基酸水平上共有85-98%序列一致性的一族20种以上衔接复制的非等位基因编码（Henco,K.等人,(1985)J.Mol.Biol.185:227-260）。人类IFNβ为由166个氨基酸残基组成的具有约22kDa的分子量的调节多肽。其可由体内大多数细胞（尤其成纤维细胞）回应病毒感染或暴露于其它试剂而产生。其与多聚细胞表面受体结合，且多产受体结合使得细胞内事件级联，引起IFNβ可诱发基因的表达，其转而产生可分为抗病毒、抗增殖和免疫调节型的效应。

人类IFNβ的氨基酸序列为已知的且（例如）在Taniguchi,Gene 10:11-15,1980以及EP 83069、EP 41313和美国专利第4,686,191号中报导，这些文献是以引用的方式并入本文中。已分别报导人类和鼠科动物IFNβ的晶体结构（Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:11813-11818,1997；J.Mol.Biol.253:187-207,1995；美国专利第5,602,232号；第5,460,956号；第5,441,734号；第4,672,108号；其是以引用的方式并入本文中）。其已在Cell Mol.Life Sci.54:1203-1206,1998中得到概述。已报导IFNβ的变体（WO 95/25170；美国专利第6,572,853号；美国专利第5,545,723号；美国专利第4,914,033号；EP 260350；美国专利第4,588,585号；美国专利第4,769,233号；Stewart等人,DNA第6卷第2期,1987第119-128页；Runkel等人,1998,J.Biol.Chem.273,第14期,第8003-8008页，其是以引用的方式并入本文中）。已报导IFNβ在CHO细胞中的表达（美国专利第4,966,843号、美国专利第5,376,567号和美国专利第5,795,779号，其是以引用的方式并入本文中）。已报导具有特定糖基化模式的IFNβ分子和其制备方法（EP 287075和EP 529300）。

用于治疗患有多发性硬化症的患者的IFNβ的商业制剂是以名称

（也被称作干扰素β1b，其未经糖基化，使用重组细菌细胞制备，具有N末端甲硫氨酸残基缺失和C17S突变）以及

和

（也被称作干扰素β1a，其经糖基化，使用重组哺乳动物细胞制备）销售，其已展示可有效降低恶化速率，且与经安慰剂治疗的患者相比，更多患者在长时期内保持不恶化。此外，伤残的积聚率降低（Neurol.51:682-689,1998）。

IFNβ1a与β1b关于结构和功能的比较已呈现于Pharmaceut.Res.15:641-649,1998中。已展示IFNβ可延迟多发性硬化症（中枢神经系统的复发性、随后进行性发炎退化性疾病）的进程。IFNβ可对白细胞增殖和抗原呈递具有抑制性作用。IFNβ可调节对抗发炎表型的细胞因子产生概况。IFNβ可通过抑制T细胞基质金属蛋白酶的活性来减少T细胞迁移。这些活性很可能协调作用以解释IFNβ在MS中的机理（Neurol.51:682-689,1998）。

IFNβ可用于治疗骨肉瘤、基底细胞癌、子宫颈发育异常、神经胶质瘤、急性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金病（Hodgkin's disease）、乳癌、黑素瘤和病毒感染，诸如乳头状瘤病毒、病毒性肝炎、生殖器疱疹、带状疱疹、疱疹性角膜炎、单纯疱疹、病毒性脑炎、巨细胞病毒性肺炎和鼻病毒。多种副作用与目前IFNβ制剂的使用相关，其包含注射部位反应、发热、发冷、肌痛、关节痛和其它类流感症状（Clin.Therapeutics,19:883-893,1997）。

考虑到与目前IFNβ产品相关的众多副作用、其与频繁注射的相互关系、形成阻止IFNβ的所需治疗效应的中和抗体的风险以及获得具有伴随增强的治疗效应的更佳治疗性IFNβ含量的可能性，明显存在对于改良的类IFNβ分子的需求。

在接受干扰素疗法的患者中发现的其它副作用包含类流感症状，诸如疲乏、头痛和发热、厌食、骨髓抑制以及嗜中性白血球减少症。诸如这些的副作用可能需要停止治疗和减少剂量。参看Jonasch,E.Oncologist 2001；6:34-55，其是以引用的方式并入。IFNα2a疗法具有包含血小板减少症的其它相关毒性。IFNα目前疗法的最常见副作用为热病、头痛、寒战和肌痛。导致剂量减少的副作用为骨髓抑制的最常见血液学影响，其包含贫血和嗜中性白血球减少症。甚至由IFN/病毒唑（ribavirin）组合疗法产生的IFN的不利影响为难以解决的；聚乙二醇化干扰素α（或

）与病毒唑

的组合使用为目前HCV疗法中的谨慎标准。此外，已展示具有HCV基因型1（1a或1b）的患者比HCV基因型2或3更不易回应组合疗法。此外，发现这些组合方案在具有高病毒载量的患者中显著不太有效。因此，明显存在对于经改良类IFN治疗剂的需求。

已描述其它干扰素（IFN-ε、IFN-κ、IFN-δ、IFN-τ）和四种类干扰素细胞因子（limitin、IL-28A、IL-28B、IL-29）。干扰素和类干扰素分子与受体分子的相互作用以及其生物活性和临床应用由Pestka,S.等人在“Interferons,interferon-like cytokines,and theirreceptors,”Immunol Rev.2004年12月;202:8-32中描述，所述文献是以引用的方式并入本文中。包含IFN-α、IFN-β和limitin的众多干扰素利用I型受体链IFNαRl和IFNαR2。编码IFNαRl序列的基因最初由Uze等人,Cell 1990;60:225克隆，所述文献是以引用的方式并入本文中。其为110kDa蛋白质，而IFNαR2以两种不同形式存在。两种形式的IFNαR2是来自相同基因且作为不同剪接产物产生（Lutfalla等人,EMBO J 1995;14:5100；Domanski等人,J.Biol.Chem.1995;270:21606；以及Novick等人,Cell 1994;77:391，其是以引用的方式并入本文中）。短形式（IFNAR2b）具有51kDa的分子质量且长形式（IFNAR2c）为90-100kDa。因此，因此存在两种形式的受体复合物，其中IFNαRl与IFNAR2b或IFNAR2c缔合。Colamonici等人,J.Biol.Chem.1994;269:5660（其是以引用的方式并入本文中）已展示两种受体类型均转导信号且介导干扰素的生物效应。除其它路径之外，IFN利用Jak-Stat信号转导路径。

仅在小鼠中发现Limitin（干扰素-ξ）且其是基于其抑制骨髓单核细胞性白血病细胞系增殖的能力经分离（Oritani,K.等人,Nature Medicine 20006(6):659-666，其是以引用的方式并入本文中）。已展示Limitin（SEQ ID NO:23）杀死或抑制某些淋巴-造血细胞系的增殖（B淋巴细胞增殖），但其展示对红血球生成或骨髓组织生成无影响。对182个氨基酸蛋白的序列分析已展示与IFN-α和IFN-β同源（在166个重叠氨基酸中31.9%和25.9%一致）以及在氨基末端处的一组疏水性残基。Kawamoto等人,J Virol.2003年9月;77(17):9622-31（其是以引用的方式并入）描述具有脑心肌炎病毒（EMCV）和单纯疱疹病毒（HSV）感染细胞的limitin的抗病毒活性的研究，以及在小鼠肝炎病毒（MHV）感染细胞中的斑块形成。

已论述limitin与诸如IFNα的干扰素之间的差异，其包含但不限于抗病毒效应的信号转导路径、抗病毒效应自身以及骨髓抑制效应的差异。参看Kawamoto等人,J Virol.2003年9月;77(17):9622-31。Kawamoto等人,Experimental Hematology 2004；32:797-805（其是以引用的方式并入本文中）描述在测量抗病毒、免疫调节、抗肿瘤和骨髓抑制活性的检定中和在活体内研究中limitin与IFN-α之间存在的差异。发现Limitin分离抗病毒活性与骨髓毒性。

13种不同α干扰素通过单一配对α/β双链受体复合物来传递不同信号。调节在通过相同受体复合物介导的一个或一个以上信号转导路径中涉及的组分可提供hIFN多肽的抗病毒效应的最优化，以及毒性副作用的调节。在下游信号转导路径中涉及多种分子。Platanias等人使用抑制这些分子的蛋白质表达的CrkL和CrkII的反义寡核苷酸，且发现其逆转IFNα或IFNγ对骨髓细胞（CFU-GM和BFU-E）增殖的抑制作用。已知IFNα活化STAT1路径，且基因剔除小鼠研究针对在抗击病毒感染时STAT1信号级联的重要性。

Durbin等人（Cell.1996年2月,9;84(3):443-50）已展示除非STAT1基因剔除纯合小鼠在无菌环境中培育，否则其形成自发病毒感染。另外，通过STAT5和CrkL信号转导最终导致RAP1蛋白的活化，其对于产生生长抑制信号可为必要的。也可测量STAT3的磷酸化。

各种参考文献揭示由聚合物接合或糖基化进行的多肽修饰。术语“hIFN多肽”包含与诸如PEG的聚合物接合的多肽且可包括半胱氨酸、赖氨酸或其它残基的一个或一个以上其它衍生。另外，hIFN多肽可包括连接子或聚合物，其中连接子或聚合物所接合的氨基酸可为根据本发明的非天然氨基酸，或可利用所属技术领域中已知的技术（诸如与赖氨酸或半胱氨酸偶合）与天然编码氨基酸接合。

已报导天然IFNβ或其C17S变体的聚合物修饰（EP 229108；美国专利第5,382,657号；EP 593868；美国专利第4,917,888号以及WO 99/55377，其是以引用的方式并入本文中）。美国专利第4,904,584号揭示聚乙二醇化赖氨酸缺失多肽，其中至少一个赖氨酸残基缺失或经任何其它氨基酸残基置换。WO 99/67291揭示一种用PEG接合蛋白质的方法，其中蛋白质上的至少一个氨基酸残基缺失且蛋白质在足以实现与蛋白质接合的条件下与PEG接触。WO 99/03887揭示属于生长激素超家族的多肽的聚乙二醇化变体，其中半胱氨酸残基已经位于多肽的指定区中的非必需氨基酸残基取代。聚乙二醇化IFN分子的实例包含在以下文献中揭示的那些：美国专利第6,524,570号；第6,250,469号；第6,180,096号；第6,177,074号；第6,042,822号；第5,981,709号；第5,951,974号；第5,908,621号；第5,738,846号；第5,711,944号；第5,382,657号，其是以引用的方式并入本文中。提及IFNβ作为属于生长激素超家族的多肽的一个实例。WO 00/23114揭示经糖基化和聚乙二醇化IFNβ。WO 00/23472揭示IFNβ融合蛋白。WO 00/26354揭示一种制备糖基化多肽变体的方法，与包括至少一个其它糖基化位点的相应母体多肽相比，其具有降低的变应原性。揭示IFNβ为可根据美国专利第5,218,092号（其是以引用的方式并入本文中）中所述的技术经修饰的众多多肽中的一个实例。美国专利第5,218,092号（其是以引用的方式并入本文中）揭示粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和其它多肽的修饰以引入至少一个其它碳水化合物链（与天然多肽相比）。

术语“hIFN多肽”也包含糖基化hIFN，诸如（但不限于）在任何氨基酸位置处糖基化的多肽、N键联或O键联糖基化形式的多肽。这些形式包含但不限于在SEQ ID NO:1的位置129或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的相同位置处具有O键联糖基化位点的多肽，或任何其它IFN多肽（Adolf等人,Biochem.1276:511(1991)）。

也认为含有单一核苷酸变化的变体为hIFN多肽的生物活性变体。另外，也包含剪接变体。术语“hIFN多肽”也包含由化学方式键联或表示为融合蛋白形式的任何一种或一种以上hIFN多肽或任何其它多肽、蛋白质、碳水化合物、聚合物、小分子、连接子、配体或任何类型的其它生物活性分子的hIFN多肽异二聚体、同二聚体、异多聚体或同多聚体，以及含有（例如）特定缺失或其它修饰而仍保持生物活性的多肽类似物。

除非另外说明（即，当说明比较是基于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或其它hIFN序列或类干扰素细胞因子（诸如limitin）时），否则对本文中所述的hIFN中氨基酸位置的所有提及是基于在SEQ ID NO:2中的位置。所属领域的技术人员应了解在任何其它hIFN分子或类干扰素细胞因子（诸如limitin）（诸如hIFN融合、变体、片段等）中可易于鉴别对应于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或任何其它IFN序列或类干扰素细胞因子（诸如limitin）中位置的氨基酸位置。举例来说，诸如BLAST的序列比对程序可用于比对且鉴别符合SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或其它IFN序列或类干扰素细胞因子（诸如limitin）中位置的蛋白质中的特定位置。关于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或其它IFN序列的本文中所述的氨基酸的取代、缺失或添加也意欲指本文中所述或所属技术领域中已知的hIFN融合、变体、片段、类干扰素细胞因子（诸如limitin）等的相应位置中的取代、缺失或添加且由本发明明确涵盖。

术语“hIFN多肽”或“hIFN”涵盖包括一个或一个以上氨基酸取代、添加或缺失的hIFN多肽。本发明的hIFN多肽可包括经一个或一个以上天然氨基酸修饰以及一个或一个以上非天然氨基酸修饰。举例来说，hIFN多肽可包括非天然编码氨基酸取代以及天然氨基酸取代N末端处的第一氨基酸。已描述在天然存在hIFN多肽中的多种氨基酸位置中的例示性取代，其包含但不限于调节hIFN多肽的一种或一种以上生物活性（诸如（但不限于）增加激动剂活性、增加多肽的溶解性、降低蛋白酶敏感性、将多肽转变为拮抗剂等）的取代且由术语“hIFN多肽”涵盖。

人类IFN拮抗剂包含但不限于在2、3、4、5、7、8、16、19、20、40、42、50、51、58、68、69、70、71、73、97、105、109、112、118、148、149、152、153、158、163、164、165或其任何组合（SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3中的相应氨基酸或任何其它IFN序列）处具有取代的那些IFN拮抗剂；视所选位点和所需活性而定，包括这些取代中的一种的hIFN多肽可潜在地充当弱拮抗剂或弱激动剂。人类IFN拮抗剂包含但不限于在以下位置处具有取代的那些IFN拮抗剂：22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、74、77、78、79、80、82、83、85、86、89、90、93、94、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137或其任何组合（hIFN；SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，hIFN拮抗剂包括在区域1-9（N末端）、10-21（A螺旋）、22-39（介于A螺旋与B螺旋之间的区域）、40-75（B螺旋）、76-77（介于B螺旋与C螺旋之间的区域）、78-100（C螺旋）、101-110（介于C螺旋与D螺旋之间的区域）、111-132（D螺旋）、133-136（介于D螺旋与E螺旋之间的区域）、137-155（E螺旋）、156-165（C末端）中的至少一个取代，使得IFN充当拮抗剂。在其它实施例中，并入非天然编码氨基酸的例示性位点包含螺旋A的氨基末端区域和一部分螺旋C内的残基。在其它实施例中，上述取代是与其它取代组合，使得hIFN多肽为hIFN拮抗剂。在一些实施例中，hIFN拮抗剂包括存在于hIFN分子的受体结合区中的与水溶性聚合物键联的非天然编码氨基酸。

在一些实施例中，hIFN多肽进一步包括调节hIFN多肽的生物活性的添加、取代或缺失。举例来说，添加、取代或缺失可调节hIFN的一种或一种以上性质或活性。举例来说，添加、取代或缺失可调节hIFN多肽受体的亲和性，调节（包含但不限于增加或降低）受体二聚合，调节hIFN受体结合后的下游信号转导事件，稳定受体二聚体，调节循环半衰期，调节治疗半衰期，调节多肽的稳定性，调节由蛋白酶裂解，调节剂量，调节释放或生物可用性，调节目前IFN治疗剂所发现的一种或一种以上副作用，调节毒性，促进纯化，或改良或改变特定投药途径。类似地，hIFN多肽可包括蛋白酶裂解序列、反应性基团、抗体结合域（包含但不限于FLAG或poly-His）或其它基于亲和性的序列（包含但不限于FLAG、poly-His、GST等）或改良多肽的检测（包含但不限于GFP）、纯化或其它特性的键联分子（包含但不限于生物素）。术语“hIFN多肽”也涵盖键联的同二聚体、异二聚体、同多聚体和异多聚体，其包含但不限于通过非天然编码氨基酸侧链与相同或不同非天然编码氨基酸侧链、与天然编码氨基酸侧链直接键联或通过连接子间接键联的那些。例示性连接子包含但不限于小有机化合物、多种长度的水溶性聚合物（诸如聚乙二醇或葡萄聚糖）或各种长度的多肽。

“非天然编码氨基酸”指的是并非20种常见氨基酸或焦赖氨酸或硒半胱氨酸中的一种的氨基酸。可与术语“非天然编码氨基酸”同义使用的其它术语为“非天然氨基酸”、“非天然编码氨基酸”、“非天然存在氨基酸”以及其各种带连字符和不带连字符形式。术语“非天然编码氨基酸”也包含但不限于通过修饰（例如翻译后修饰）天然编码氨基酸（包含但不限于20种常见氨基酸或焦赖氨酸和硒半胱氨酸）产生，但其自身并不通过翻译复合物天然并入生长多肽链中的氨基酸。这些非天然存在氨基酸的实例包含但不限于N-乙酰基葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基葡糖胺基-L-苏氨酸以及O-磷酸酪氨酸。

“氨基末端修饰基”指的是可与多肽的氨基末端连接的任何分子。类似地，“羧基末端修饰基”指的是可与多肽的羧基末端连接的任何分子。末端修饰基包含但不限于各种水溶性聚合物、肽或蛋白质（诸如血清白蛋白），或增加肽的血清半衰期的其它部分。

术语“官能团”、“活性部分”、“活化基团”、“离去基”、“反应活性位点”、“化学反应性基团”以及“化学反应部分”用于所属技术领域中和本文中是指分子的独特的可定义部分或单位。这些术语在化学技术中有些同义且用在本文中来指示实施一些功能或活性且可与其它分子反应的分子部分。

术语“键”或“连接子”用在本文中是指通常由于化学反应形成且通常为共价键的基团或键。水解稳定键意谓键在水中实质上稳定且在有用pH值下（其包含但不限于在生理条件下）长时期地、或许甚至无限期地不与水反应。水解不稳定或可降解键意谓键可在水或水溶液（包含例如血液）中降解。酶促不稳定或可降解键意谓键可由一种或一种以上酶降解。如在所属技术领域中所理解，PEG和相关聚合物在聚合物主链中或在聚合物主链与聚合物分子的一个或一个以上末端官能团之间的连接基团中可包含可降解键。举例来说，由PEG羧酸或活化PEG羧酸与生物活性剂上的醇基反应所形成的酯键在生理条件下通常水解以释放药剂。其它可水解降解键包含但不限于碳酸酯键；由胺与醛反应所产生的亚胺键；由醇与磷酸酯基反应所形成的磷酸酯键；作为酰肼与醛的反应产物的腙键；作为醛与醇的反应产物的缩醛键；作为甲酸酯与醇的反应产物的原酸酯键；由胺基（包含但不限于在诸如PEG的聚合物末端处的胺基）与肽的羧基形成的肽键；以及由亚磷酰胺基（包含但不限于在聚合物末端处的亚磷酰胺基）与寡核苷酸的5'羟基形成的寡核苷酸键。

术语“生物活性分子”、“生物活性部分”或“生物活性剂”在用于本文中时意谓可影响与有机体（包含但不限于病毒、细菌、噬菌体、转座子、朊病毒、昆虫、真菌、植物、动物以及人类）有关的生物系统、路径、分子或相互作用的任何物理或生物化学性质的任何物质。特定来说，如本文中所用的生物活性分子包含但不限于打算用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防人类或其它动物的疾病或用于以其它方式增强人类或动物的身体或精神良好状态的任何物质。生物活性分子的实例包含但不限于肽、蛋白质、酶、小分子药物、硬药（hard drug）、软药（soft drug）、碳水化合物、无机原子或分子、染料、脂质、核苷、放射性核素、寡核苷酸、毒素、细胞、病毒、脂质体、微粒以及胶团。适用于本发明的生物活性剂的种类包含但不限于药物、前药、放射性核素、显影剂、聚合物、抗生素、杀真菌剂、抗病毒剂、抗炎药、抗肿瘤药、心血管类药物、抗焦虑药、激素、生长因子、类固醇类药物、微生物产生的毒素等等。

“双官能聚合物”指的是包括两个能够与其它部分（包含但不限于氨基酸侧基）特异性反应以形成共价键或非共价键的不连续官能团的聚合物。具有一个可与特定生物活性组分上的基团反应的官能团和另一个可与第二生物组分上的基团反应的基团的双官能连接子可用于形成包含第一生物活性组分、双官能连接子以及第二生物活性组分的接合物。已知用于将各种化合物与肽连接的众多程序和连接子分子。例如参看欧洲专利申请案第188,256号、美国专利第4,671,958号、第4,659,839号、第4,414,148号、第4,699,784号、第4,680,338号和第4,569,789号，其是以引用的方式并入本文中。“多官能聚合物”指的是包括两个或两个以上能够与其它部分（包含但不限于氨基酸侧基）特异性反应以形成共价键或非共价键的不连续官能团的聚合物。双官能聚合物或多官能聚合物可具有任何所需长度或分子量，且可经选择以在与hIFN和其受体或hIFN所键联的一个或一个以上分子之间提供所需间隔或构象。

如果取代基是由从左向右书写的其常规化学式表示，那么其同样涵盖从右向左书写结构所得到的化学上相同的取代基，例如，结构-CH₂O-等同于结构-OCH₂-。

术语“取代基”包含但不限于“无干扰取代基”。“无干扰取代基”为产生稳定化合物的那些基团。适合的无干扰取代基或基团包含但不限于卤基、C₁-C₁₀烷基、C₂-C₁₀烯基、C₂-C₁₀炔基、C₁-C₁₀烷氧基、C₁-C₁₂芳烷基、C₁-C₁₂烷芳基、C₃-C₁₂环烷基、C₃-C₁₂环烯基、苯基、经取代苯基、甲苯酰基、二甲苯基、联苯基、C₂-C₁₂烷氧基烷基、C₂-C₁₂烷氧基芳基、C₇-C₁₂芳氧基烷基、C₇-C₁₂氧基芳基、C₁-C₆烷基亚磺酰基、C₁-C₁₀烷基磺酰基、-(CH₂)_m-O-(C₁-C₁₀烷基)（其中m为1至8）、芳基、经取代芳基、经取代烷氧基、氟烷基、杂环基、经取代杂环基、硝基烷基、-NO₂、-CN、-NRC(O)-(C₁-C₁₀烷基)、-C(O)-(C₁-C₁₀烷基)、C₂-C₁₀烷基硫烷基、-C(O)O-(C₁-C₁₀烷基)、-OH、-SO₂、=S、-COOH、-NR₂、羰基、-C(O)-(C₁-C₁₀烷基)-CF₃、-C(O)-CF₃、-C(O)NR₂、-(C₁-C₁₀芳基)-S-(C₆-C₁₀芳基)、-C(O)-(C₁-C₁₀芳基)、-(CH₂)_m-O-(-(CH₂)_m-O-(C₁-C₁₀烷基)（其中各m为1至8）、-C(O)NR₂、-C(S)NR₂、-SO₂NR₂、-NRC(O)NR₂、-NRC(S)NR₂、其盐等等。如本文中所用的R各自为H、烷基或经取代烷基、芳基或经取代芳基、芳烷基或烷芳基。

术语“卤素”包含氟、氯、碘以及溴。

除非另外说明，否则自身或作为另一取代基的部分的术语“烷基”意谓直链或支链或环状烃基或其组合，其可为完全饱和、单不饱和或多不饱和且可包含具有指定数目碳原子（即C₁-C₁₀意谓1至10个碳）的二价基团和多价基团。饱和烃基的实例包含但不限于诸如以下各基的基团：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基；（例如）正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体。不饱和烷基为具有一个或一个以上双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包含但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基以及更高同系物和异构体。除非另外说明，否则术语“烷基”也打算包含在下文中更详细定义的那些烷基衍生物，诸如“杂烷基”。限于烃基的烷基被称作“均烷基”。

自身或作为另一取代基的部分的术语“亚烷基”意谓由烷烃衍生的二价基团，例如（但不限于）结构-CH₂CH₂-和-CH₂CH₂CH₂CH₂-，且进一步包含下文描述为“亚杂烷基”的那些基团。通常，烷基（或亚烷基）将具有1至24个碳原子，其中具有10个或更少碳原子的那些基团为本文中所述方法和组合物的特定实施例。“低碳烷基”或“低碳亚烷基”为通常具有8个或更少碳原子的较短链烷基或亚烷基。

术语“烷氧基”、“烷基氨基”以及“烷基硫基”（或硫烷氧基）是以其常规意义使用，且指的是分别通过氧原子、氨基或硫原子与分子的其余部分连接的那些烷基。

除非另外说明，否则自身或与另一术语组合的术语“杂烷基”意谓由指定数目的碳原子以及至少一个选自由O、N、Si和S组成的群组的杂原子组成的稳定直链或支链或环状烃基或其组合，且其中氮和硫原子可视情况经氧化且氮杂原子可视情况经季铵化。一个或一个以上杂原子O、N和S以及Si可位于杂烷基的任何内部位置或烷基与分子的其余部分连接的位置。实例包含但不限于-CH₂-CH₂-O-CH₃、-CH₂-CH₂-NH-CH₃、-CH₂-CH₂-N(CH₃)-CH₃、-CH₂-S-CH₂-CH₃、-CH₂-CH₂-S(O)-CH₃、-CH₂-CH₂-S(O)₂-CH₃、-CH=CH-O-CH₃、-Si(CH₃)₃、-CH₂-CH=N-OCH₃以及-CH=CH-N(CH₃)-CH₃。至多两个杂原子可为连续的，诸如，-CH₂-NH-OCH₃和-CH₂-O-Si(CH₃)₃。类似地，自身或作为另一取代基的部分的术语“亚杂烷基”意谓由杂烷基衍生的二价基团，例如（但不限于）-CH₂-CH₂-S-CH₂-CH₂-和-CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-CH₂-。对于亚杂烷基来说，相同或不同杂原子也可占据链末端的一端或两端（包含但不限于亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基、氨氧基亚烷基等等）。此外，对于亚烷基和亚杂烷基键联基团来说，由键联基团的化学式书写的方向来暗示键联基团的无方向性。举例来说，式-C(O)₂R'-表示-C(O)₂R'-与-R'C(O)₂-。

除非另外说明，否则自身或与其它术语组合的术语“环烷基”和“杂环烷基”分别表示“烷基”和“杂烷基”的环状形式。因此，环烷基或杂环烷基包含饱和、部分不饱和和完全不饱和环键。另外，对于杂环烷基来说，杂原子可占据杂环与分子的其余部分连接的位置。环烷基的实例包含但不限于环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等等。杂环烷基的实例包含但不限于1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等等。另外，所述术语涵盖双环和三环环结构。类似地，自身或作为另一取代基的部分的术语“亚杂环烷基”意谓自杂环烷基衍生的二价基团，且自身或作为另一取代基的部分的术语“亚环烷基”意谓自环烷基衍生的二价基团。

如本文中所用，术语“水溶性聚合物”指的是可溶于水性溶剂中的任何聚合物。水溶性聚合物与hGH多肽的键联可产生以下改变，其包含但不限于相对于未经修饰形式增加或经调节的血清半衰期或增加或经调节的治疗半衰期、经调节的免疫原性、经调节的物理缔合特性（诸如聚集和多聚体形成）、改变的受体结合、改变的受体二聚合或多聚、经调节毒性以及包含目前IFN治疗剂中所发现的副作用的IFN的一种或一种以上生物活性的调节。水溶性聚合物可具有或可不具有其自身生物活性，且可用作用于连接hIFN与其它物质（包含但不限于一种或一种以上hIFN多肽或一种或一种以上生物活性分子）的连接子。适合聚合物包含但不限于聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其单C₁-C₁₀烷氧基或芳氧基衍生物（描述于美国专利第5,252,714号中，其是以引用的方式并入本文中）、单甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯醚马来酸酐、N-(2-羟基丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物（包含硫酸葡聚糖）、聚丙二醇、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖、纤维素和纤维素衍生物（包含但不限于甲基纤维素和羧甲基纤维素）、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚烷撑二醇和其衍生物、聚烷撑二醇和其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙醚以及α-β-聚[(2-羟基乙基)-DL-天冬酰胺等等或其混合物。这些水溶性聚合物的实例包含但不限于聚乙二醇和血清白蛋白。

如本文中所用，术语“聚烷撑二醇”或“聚(烯烃二醇)”指的是聚乙二醇（聚(乙二醇)）、聚丙二醇、聚丁二醇和其衍生物。术语“聚烷撑二醇”涵盖线性和分枝聚合物且平均分子量介于0.1kDa与100kDa之间。其它例示性实施例列于（例如）商业供应商目录中，诸如Shearwater Corporation的目录“Polyethylene Glycol and Derivatives forBiomedical Applications”(2001)。

除非另外说明，否则术语“芳基”意谓可为单环或稠合在一起或共价键联的多环（包含但不限于1至3个环）的多不饱和芳香族烃取代基。术语“杂芳基”指的是含有1至4个选自N、O和S的杂原子的芳基（或环），其中氮和硫原子视情况经氧化，且一个或一个以上氮原子视情况经季铵化。杂芳基可通过杂原子与分子的其余部分连接。芳基和杂芳基的非限制性实例包含苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述芳基和杂芳基环系统中的每一者的取代基选自下文所述的可接受取代基的群组。

为了简便起见，当与其它术语（包含但不限于芳氧基、芳基硫氧基、芳基烷基）组合使用时，术语“芳基”包含如上所定义的芳基与杂芳基环。因此，术语“芳基烷基”打算包含其中芳基与烷基连接的那些基团（包含但不限于苄基、苯乙基、吡啶基甲基等等），烷基包含其中碳原子（包含但不限于亚甲基）已经（例如）氧原子置换的那些烷基（包含但不限于苯氧基甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(1-萘基氧基)丙基等等）。

以上术语（包含但不限于“烷基”、“杂烷基”、“芳基”以及“杂芳基”）各自打算包含指定基团的经取代与未经取代形式。每一类型基团的例示性取代基提供于下文。

烷基和杂烷基（包含通常被称作亚烷基、烯基、亚杂烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基以及杂环烯基的那些基团）的取代基可为选自（但不限于）以下各基的多种基团中的一种或一种以上：-OR'、=O、=NR'、=N-OR'、-NR'R"、-SR'、-卤素、-SiR'R"R″′、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO₂R'、-CONR'R"、-OC(O)NR'R"、-NR"C(O)R'、-NR'-C(O)NR"R"'、-NR"C(O)₂R'、-NR-C(NR'R"R″′)=NR""、-NR-C(NR'R")=NR″′、-S(O)R'、S(O)₂R'、-S(O)₂NR'R"、-NRSO₂R'、-CN以及-NO₂，其数目在0至(2m'+1)的范围内，其中m'为此基团中碳原子的总数。R'、R″、R″′和R""各自独立地指代氢、经取代或未经取代杂烷基、经取代或未经取代芳基（其包含但不限于经1-3个卤素取代的芳基）、经取代或未经取代烷基、烷氧基或硫烷氧基或芳基烷基。当本发明的化合物包含一个以上R基团时，例如，各R基团是如当存在一个以上这些基团时各R'、R″、R″′和R""基团一样独立地选择。当R'和R"与同一氮原子连接时，其可与氮原子组合形成5元、6元或7元环。举例来说，-NR'R"打算包含但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据对取代基的上述论述，所属领域的技术人员应了解术语“烷基”打算包含包括与除氢基之外的基团结合的碳原子的基团，诸如卤烷基（包含但不限于-CF₃和-CH₂CF₃）和酰基（包含但不限于-C(O)CH₃、-C(O)CF₃、-C(O)CH₂OCH₃等等）。

与对于烷基所述的取代基类似，芳基和杂芳基的取代基经改变且选自（但不限于）：卤素、-OR'、=O、=NR'、=N-OR'、-NR'R"、-SR'、-卤素、-SiR'R"R″'、-OC(O)R'、C(O)R'、-CO₂R'、-CONR'R"、-OC(O)NR'R''、-NR"C(O)R'、-NR'-C(O)NR"R″′、-NR"C(O)₂R'、-NR-C(NR'R"R″′)=NR″″、-NR-C(NR'R")=NR"'、-S(O)R'、-S(O)₂R'、-S(O)₂NR'R"、-NRSO₂R'、-CN和-NO₂、-R'、-N₃、-CH(Ph)₂、氟(C₁-C₄)烷氧基和氟(C₁-C₄)烷基，其数目在0至芳香族环系统上开放价态的总数的范围内；且其中R'、R"、R″′和R″"独立地选自氢、烷基、杂烷基、芳基和杂芳基。当本发明的化合物包含一个以上R基团时，例如，各R基团是如当存在一个以上这些基团时各R'、R″、R″′和R″"基团一样独立地选择。

如本文中所用，术语“经调节的血清半衰期”意谓经修饰hIFN相对于其未经修饰形式的循环半衰期的阳性或阴性变化。通过在投与hIFN后各个时间点取血样且测定每一样品中所述分子的浓度来测量血清半衰期。血清浓度与时间的相互关系允许计算血清半衰期。希望增加的血清半衰期具有至少约两倍的增加，但较小增加也可为有用的，例如当其能够促成令人满意的给药方案或避免毒性作用的情况。在一些实施例中，增加为至少约3倍、至少约5倍或至少约10倍。

如在本文中所用的术语“经调节的治疗半衰期”意谓治疗有效量的hIFN相对于其未经修饰形式的半衰期的阳性或阴性变化。通过在投与后各个时间点测量分子的药物动力学和/或药效性质来测量治疗半衰期。希望增加的治疗半衰期能够促成特定有益给药方案、特定有益总剂量或避免不需的效应。在一些实施例中，增加的治疗半衰期是由增加的效力、经修饰分子与其标靶的增加或降低的结合、由酶（诸如蛋白酶）对分子的增加或降低的分解或未经修饰分子的另一参数或作用机制的增加或降低而产生。

当应用于核酸或蛋白质时，术语“经分离”表示核酸或蛋白质不含在天然状态下与其有关的至少一些细胞组分，或核酸或蛋白质已经浓缩至大于其在活体内或活体外产生时的浓度的含量。其可为均质状态。经分离物质可为干燥或半干燥状态，或为溶液（其包含但不限于水溶液）形式。其可为包括其它医药学上可接受的载剂和/或赋形剂的医药组合物的组分。通常使用诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱的分析化学技术来测定纯度和均质性。作为制剂中存在的主要物质的蛋白质实质上经纯化。特定来说，经分离基因是自侧接基因且编码除所关注基因之外的蛋白质的开放阅读框分离。术语“经纯化”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生实质上一个条带。其尤其意谓核酸或蛋白质为至少85%纯、至少90%纯、至少95%纯、至少99%纯或更纯。

术语“核酸”指的是单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸以及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述核酸具有与参考核酸相似的结合性质且是以类似于天然存在核苷酸的方式代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也指寡核苷酸类似物，其包含PNA（肽核酸）、反义技术中使用的DNA类似物（硫逐磷酸酯、氨基磷酸酯等等）。除非另外说明，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰变体（包含但不限于简并密码子取代）和互补序列以及明确指示的序列。特定来说，通过产生其中一种或一种以上经选定（或所有）密码子的第三位置是经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代（Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994)）。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可在本文中互换使用来指代氨基酸残基的聚合物。也就是说，针对多肽的描述同样适用于对肽的描述以及对蛋白质的描述，且反之亦然。所述术语适用于天然存在氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如在本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白质，其中氨基酸残基是通过共价肽键键联。

术语“氨基酸”指的是天然存在和非天然存在氨基酸，以及以类似于天然存在氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码氨基酸为20种常见氨基酸（丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸）以及焦赖氨酸和硒半胱氨酸。氨基酸类似物指的是具有与天然存在氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即，与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳，诸如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有经修饰R基团（诸如，正亮氨酸）或经修饰肽主链，但保持与天然存在氨基酸相同的基本化学结构。

在本文中可由氨基酸的通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会（IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission）推荐的单字母符号来指代氨基酸。同样，可由核苷酸的通常接受的单字母编码来指代核苷酸。

“保守性修饰变体”适用于氨基酸与核酸序列。对于特定核酸序列来说，“保守性修饰变体”指的是编码一致或基本上一致氨基酸序列的那些核酸，或其中核酸不将氨基酸序列编码成基本上一致序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定蛋白质。举例来说，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子表示丙氨酸的每一位置处，密码子可改变为所述相应密码子中的任一个而不会改变所编码多肽。这些核酸变异为“沉默变异”，其为保守性修饰变化的一种。编码多肽的本文中的每一核酸序列也描述核酸的每一可能沉默变异。所属领域的一般技术人员应认识到核酸中的每一密码子（除AUG和TGG之外，AUG通常为甲硫氨酸的独特密码子，且TGG通常为色氨酸的独特密码子）可经修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每一沉默变异在每一所述序列中为隐含的。

至于氨基酸序列，所属领域的一般技术人员应认识到改变、添加或缺失所编码序列中的单一氨基酸或小百分比氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加为“保守性修饰变体”，其中所述改变使得氨基酸缺失、氨基酸添加或氨基酸经化学上类似的氨基酸取代。所属领域的一般技术人员已知提供功能类似氨基酸的保守性取代列表。这些保守性修饰变体是在本发明的多态变体、种间同源物和等位基因的范围之外且不将其排除在外。

所属领域的一般技术人员已知提供功能类似胺基酸的保守性取代列表。以下八组各自含有作为彼此的保守性取代的氨基酸：

1）丙氨酸（A）、甘氨酸（G）；

2）天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）；

3）天冬酰胺（N）、谷氨酰胺（Q）；

4）精氨酸（R）、赖氨酸（K）；

5）异亮氨酸（I）、亮氨酸（L）、甲硫氨酸（M）、缬氨酸（V）；

6）苯丙氨酸（F）、酪氨酸（Y）、色氨酸（W）；

7）丝氨酸（S）、苏氨酸（T）；以及

8）半胱氨酸（C）、甲硫氨酸（M）

（例如参看Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W H Freeman &Co.;第2版(1993年12月)）

在两个或两个以上核酸或多肽序列的上下文中，术语“一致”或“一致性”百分比指的是相同的两个或两个以上序列或子序列。当经比较窗比较且比对最大符合或如使用以下序列比较算法（或所属领域的一般技术人员可用的其它算法）中的一种或通过手工比对且目测检查所测量指定区域时，如果其具有相同（即，在指定区域上约60%一致性，视情况约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%或约95%一致性）的氨基酸残基或核苷酸百分比，那么序列为“实质上一致”。此定义也指测试序列的补体。一致性可存在于长度为至少约50个氨基酸或核苷酸的区域上，或长度为75-100个氨基酸或核苷酸的区域上，或（在未指定时）在整个序列或聚核苷酸或多肽上。

对于序列比较来说，通常一个序列充当与测试序列相比较的参考序列。在使用序列比较算法时，将测试序列与参考序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，且指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或可指定替代参数。随后序列比较算法根据程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。

如本文中所用，“比较窗”包含参考选自由20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150组成的群组的连续位置数中的任一者的区段，其中在两个序列经最佳比对之后，序列可与具有相同数目的连续位置的参考序列进行比较。所属领域的一般技术人员已知用于比较的序列比对方法。可通过以下方法进行用于比较的最佳序列比对，这些方法包含但不限于Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源比对算法；Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 85:2444的相似性搜索方法；这些算法的计算机化实施（Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA）；或手工比对和目测检查（例如参看Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology(1995年增刊)）。

适用于测定序列一致性百分比和序列相似性百分比的算法的一个实例为BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等人,(1997)Nuc.Acids Res.25:3389-3402和Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。用于进行BLAST分析的软件可通过经由万维网在ncbi.nlm.nih.gov上访问的国家生物技术信息中心（National Center forBiotechnology Information）公开获得。BLAST算法参数W、T和X测定比对的灵敏性和速度。BLASTN程序（对于核苷酸序列来说）使用字长（W）11、期望值（E）10、M=5、N=-4以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列来说，BLASTP程序使用字长3和期望值（E）10作为默认值，且BLOSUM62得分矩阵（参看Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915）使用比对数（B）50、期望值（E）10、M=5、N=-4以及两条链的比较作为默认值。通常在“低复杂性”过滤器关闭的情况下进行BLAST算法。

BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计学分析（例如参看Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787）。由BLAST算法提供的相似性的一个量度为最小和概率（smallest sum probability，P(N)），其提供关于两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然会发生匹配的概率的指标。举例来说，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小和概率小于约0.2、或小于约0.01，或小于约0.001，那么认为核酸类似于参考序列。

短语“与……选择性（或特异性）杂交”指的是当复杂混合物（包含但不限于总细胞DNA或RNA或文库DNA或RNA）中存在特定核苷酸序列时，在严格杂交条件下分子仅与所述序列结合、二联或杂交。

短语“严格杂交条件”指的是在如所属技术领域中已知的低离子强度和高温条件下DNA、RNA、PNA或其它核酸模拟物或其组合的序列的杂交。通常，在严格条件下，探针会与核酸的复杂混合物（包含但不限于总细胞DNA或RNA或文库DNA或RNA）中的其靶子序列杂交，但不与复杂混合物中的其它序列杂交。严格条件具序列依赖性且在不同环境下会不同。较长序列在较高温度下特异性杂交。对核酸杂交的广泛指导见于Tijssen,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization withNucleic Probes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays"(1993)中。对于在指定离子强度pH值下的特异性序列来说，严格条件通常经选定为低于热熔点（T_m）约5℃-10℃。T_m为与标靶互补的探针的50%与靶序列杂交处于平衡（因为靶序列过量存在，在T_m下，在平衡时占据50%的探针）时的温度（在指定离子强度、pH值以及核酸浓度下）。严格条件可为在pH值7.0至8.3下盐浓度小于约1.0M钠离子、通常约0.01M至1.0M钠离子浓度（或其它盐）且温度对于短探针（包含但不限于10至50个核苷酸）来说为至少约30℃且对于长探针（包含但不限于大于50个核苷酸）来说为至少约60℃的那些条件。也可通过添加诸如甲酰胺的去稳定剂来实现严格条件。对于选择性或特异性杂交来说，正信号可为至少两倍背景、视情况10倍背景杂交。例示性严格杂交条件可为如下：50%甲酰胺、5×SSC以及1%SDS，在42℃下培育；或5×SSC、1%SDS，在65℃下培育，其中在65℃下在0.2×SSC和0.1%SDS中洗涤。这些洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。

如本文中所用，术语“真核生物”指的是属于系统发育真核领域的有机体，诸如动物（包含但不限于哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟类等）、纤毛虫、植物（包含但不限于单子叶植物、双子叶植物、藻类等）、真菌、酵母、鞭毛虫、微孢子虫、原生生物等。

如本文中所用，术语“非真核生物”指的是非真核有机体。举例来说，非真核有机体可属于真细菌（包含但不限于大肠杆菌、嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）、嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）等）系统发育领域，或古细菌（包含但不限于詹氏甲烷球菌（Methanococcus jannaschii）、嗜热自养甲烷杆菌（Methanobacterium thermoautotrophicum）、嗜盐杆菌（Halobacterium）（诸如嗜盐富饶菌（Haloferax volcanii）和嗜盐杆菌种NRC-1）、闪烁古生球菌（Archaeoglobusfulgidus）、嗜热古菌（Pyrococcus furiosus）、极端嗜热古菌（Pyrococcus horikoshii）、超嗜热需氧古生菌（Aeuropyrum pernix）等）系统发育领域。

如本文中所用，术语“个体”指的是动物，在一些实施例中为哺乳动物，且在其它实施例中为人类，其为治疗、观察或实验的对象。

如本文中所用的术语“有效量”指的是所投与的经修饰非天然氨基酸多肽的量，所述量会在一定程度上减轻欲治疗的疾病、病状或病症的一种或一种以上症状。可投与含有本文中所述的经修饰非天然氨基酸多肽的组合物以进行预防性、增强性和/或治疗性治疗。

术语“增强”意谓所需效应的效力或持续时间增加或延长。因此，对于增强治疗剂的效应来说，术语“增强”指的是增加或延长其它治疗剂对系统的效应的效力或持续时间的能力。如本文中所用，“增强有效量”指的是足以增强另一治疗剂在所需系统中的效应的量。当用于患者中时，对于此用途有效的量将视以下因素而定：疾病、病症或病状的严重性和病程、先前疗法、患者的健康状况和对药物的反应以及主治医师的判断。

如本文中所用，术语“经修饰”指的是指的是对给定多肽作出的任何改变，诸如对多肽长度、胺基酸序列、化学结构、多肽的共翻译修饰或翻译后修饰的改变。形式“（经修饰）”术语意谓所述多肽视情况经修饰，也就是说，所讨论多肽可经修饰或未经修饰。

术语“经翻译后修饰”指的是在天然或非天然氨基酸已并入多肽链中之后，对所述氨基酸发生的天然或非天然氨基酸的任何修饰。仅举例来说，所述术语涵盖共翻译活体内修饰、共翻译活体外修饰（诸如在不含细胞的翻译系统中）、翻译后活体内修饰以及翻译后活体外修饰。

在预防应用中，将含有经修饰非天然氨基酸多肽的组合物投与易患上特定疾病、病症或病状或以其它方式处于特定疾病、病症或病状的风险下的患者。所述量经定义为“预防有效量”。在此使用中，精确量也视患者的健康状况、体重等等而定。认为通过常规实验（例如，剂量递增临床试验）确定所述预防有效量是在所属领域的技能范围内。

术语“经保护”指的是存在防止化学反应性官能团在特定反应条件下发生反应的“保护基”或部分。保护基将视欲保护的化学反应性基团的类型而定。举例来说，如果化学反应性基团为胺或酰肼，那么保护基可选自叔丁氧羰基（t-Boc）和9-芴基甲氧基羰基（Fmoc）的群组。如果化学反应性基团为硫醇，那么保护基可为邻吡啶基二硫化物。如果化学反应性基团为羧酸（诸如丁酸或丙酸）或羟基，那么保护基可为苄基或诸如甲基、乙基或叔丁基的烷基。所属技术领域中已知的其它保护基也可用于本文中所述的方法和组合物中或与其一起使用，其包含诸如Nvoc和MeNvoc的光不稳定基团。所属技术领域中已知的其它保护基也可用于本文中所述的方法和组合物中或与其一起使用。

仅举例来说，阻断/保护基团可选自：

其它保护基描述于Greene和Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,第3版,John Wiley & Sons,New York,NY，1999中，其是以引用的方式全部并入本文中。

在治疗应用中，将足以治愈或至少部分抑制疾病、病症或病状的症状的量的含有经修饰非天然氨基酸多肽的组合物投与已罹患疾病、病状或病症的患者。所述量经定义为“治疗有效量”，且将视以下因素而定：疾病、病症或病状的严重性和病程、先前疗法、患者的健康状况和对药物的反应以及主治医师的判断。认为通过常规实验（例如，剂量递增临床试验）确定所述治疗有效量是在所属领域的技能范围内。

术语“治疗”是用于指预防性和/或治疗性治疗。

在本文中呈现的非天然编码氨基酸多肽可包含其中一个或一个以上原子经具有不同于自然界中通常发现的原子质量或质量数的原子质量或质量数的原子置换的经同位素标记化合物。可并入本发明的化合物中的同位素的实例包含氢、碳、氮、氧、氟和氯的同位素，分别为诸如²H、³H、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁸O、¹⁷O、³⁵S、⁸F、³⁶Cl。本文中所述的某些经同位素标记化合物（例如，诸如³H和¹⁴C的放射性同位素并入其中的那些化合物）可用于药物和/或底物组织分布检定中。此外，经诸如氘（即²H）的同位素取代可得到由更大代谢稳定性产生的某些治疗优点，例如增加的活体内半衰期或降低的剂量需求。

认为所有异构体（包含但不限于非对映异构体、对映异构体和其混合物）为本文中所述组合物的部分。在额外或其它实施例中，非天然编码氨基酸多肽在向需要的有机体投与之后代谢以产生代谢物，其随后用于产生所需效应（包含所需治疗效应）。在其它或额外实施例中为非天然编码氨基酸多肽的活性代谢物。

在一些情况下，非天然编码氨基酸多肽可以互变异构体形式存在。另外，本文中所述的非天然编码氨基酸多肽可以未溶剂化形式以及与医药学上可接受的溶剂（诸如水、乙醇等等）形成的溶剂化形式存在。也认为在本文中揭示溶剂化形式。所属领域的一般技术人员应认识到本文中的一些化合物可以若干互变异构形式存在。认为所有这些互变异构形式是本文中所述组合物的部分。

除非另外说明，否则使用在所属技术领域的技能范围内的质谱、NMR、HPLC、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术以及药理学的常规方法。

附图说明

图1展示四螺旋束蛋白质干扰素α-2（IFNα-2）的通用结构的图；

图2展示自pSTAT1检定获得的结果的图；

图3展示显示pSTAT1检定的特异性的图；

图4展示内毒素对pSTAT1检定的影响的图；

图5展示自抗增殖检定获得的结果的图；

图6展示内毒素对抗增殖检定的影响的图；

图7展示自测量HLA表达的诱发的检定获得的结果的图；

图8展示U266细胞中的Tyk2磷酸化的图；

图9展示由9种聚乙二醇化hIFN多肽和

获得的CPE结果的图；

图10展示

和四种hIFN多肽的CFU-GM菌落计数对国际单位的图；

图11展示对IFNR2的抗病毒IC50和Kd的分析；

图12展示造血毒性检定的结果；

图13展示造血毒性检定的结果；

图14展示造血毒性检定的结果；

图15展示造血毒性检定的结果；

图16展示造血毒性检定的结果；

图17展示造血毒性检定的结果；

图18展示由5种聚乙二醇化hIFN多肽和

获得的CPE结果的图；

图19展示线性30kDa单甲氧基-聚(乙二醇)-2-氨氧基乙胺氨基甲酸酯盐酸盐的结构的图；

图20展示自mPEG（40K）对硝基苯酚碳酸酯合成mPEG（40K）氨基乙氧基胺盐酸盐的图。

具体实施方式

I.引言

在本发明中提供包括至少一个非天然氨基酸的干扰素分子。在本发明的某些实施例中，具有至少一个非天然氨基酸的hIFN多肽包含至少一个翻译后修饰。在一个实施例中，所述至少一个翻译后修饰包括利用适用于特定反应性基团的所属领域的一般技术人员已知的化学方法，将包括第二反应性基团的分子与至少一个包括第一反应性基团的非天然氨基酸连接，所述包括第二反应性基团的分子包括但不限于标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇的衍生物、光交联剂、放射性核素、细胞毒性化合物、药物、亲和性标记、光亲和性标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白质或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、聚核苷酸、DNA、RNA、反义聚核苷酸、糖、水溶性树枝状聚合物、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属的部分、放射性部分、新颖官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光笼蔽部分、光化学辐射可激发部分、可光异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、结合有重原子的部分、可化学裂解的基团、可光裂解的基团、延长的侧链、碳键联的糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、毒性部分、经同位素标记的部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子、量子点、纳米传递素、放射性核苷酸、放射性传递素、中子俘获剂或上述物质的任何组合，或任何其它所需化合物或物质。举例来说，第一反应性基团为炔基部分（包含但不限于在非天然氨基酸对炔丙基氧基苯丙氨酸中，其中炔丙基有时也被称作乙炔部分），且第二反应性基团为叠氮基部分，且利用[3+2]环加成化学方法。在另一实例中，第一反应性基团为叠氮基部分（包含但不限于在非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸中）且第二反应性基团为炔基部分。在本发明的经修饰hIFN多肽的某些实施例中，使用至少一种包括至少一个翻译后修饰的非天然氨基酸（包含但不限于含有酮基官能团的非天然氨基酸），其中所述至少一个翻译后修饰包括糖部分。在某些实施例中，翻译后修饰是在真核细胞或非真核细胞中在活体内进行。连接子、聚合物、水溶性聚合物或其它分子可将所述分子与多肽连接。分子可与多肽直接键联。

在某些实施例中，蛋白质包含至少一个由一种宿主细胞在活体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰通常不由另一宿主细胞类型进行。在某些实施例中，蛋白质包含至少一个由真核细胞在活体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰通常不由非真核细胞进行。翻译后修饰的实例包含但不限于糖基化、乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成（palmitate addition）、磷酸化、糖脂键联修饰等等。在一个实施例中，翻译后修饰包括通过GlcNAc-天冬酰胺键联将寡糖与天冬酰胺连接（包含但不限于其中寡糖包括(GlcNAc-Man)₂-Man-GlcNAc-GlcNAc等等）。在另一个实施例中，翻译后修饰包括通过GalNAc-丝氨酸、GalNAc-苏氨酸、GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键联将寡糖（包含但不限于Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等）与丝氨酸或苏氨酸连接。在某些实施例中，本发明的蛋白质或多肽可包括分泌或定位序列、附加表位、FLAG标签、聚组氨酸标签、GST融合体等等。分泌信号序列的实例包含但不限于原核分泌信号序列、真核分泌信号序列、5'经最优化以进行细菌表达的真核分泌信号序列、新颖分泌信号序列、果胶裂解酶分泌信号序列、Omp A分泌信号序列和噬菌体分泌信号序列。分泌信号序列的实例包含但不限于STII（原核）、Fd GIII和M13（噬菌体）、Bgl2（酵母）和自转座子获得的信号序列bla。

所关注的蛋白质或多肽可含有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或十个或十个以上非天然氨基酸。非天然氨基酸可相同或不同，例如，在蛋白质中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上不同位点可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上不同非天然氨基酸。在某些实施例中，蛋白质的天然存在形式中所存在的特定氨基酸中的至少一个但少于全部经非天然氨基酸取代。

本发明提供基于包括至少一个非天然编码氨基酸的GH超基因家族成员（尤其hIFN）的方法和组合物。将至少一个非天然编码氨基酸引入hIFN中可允许应用涉及特定化学反应（其包含但不限于与一个或一个以上非天然编码氨基酸反应而不与通常存在的20种氨基酸反应）的接合化学。在一些实施例中，包括非天然编码氨基酸的hIFN是通过非天然编码氨基酸的侧链与水溶性聚合物（诸如聚乙二醇（PEG））键联。本发明提供一种用PEG衍生物选择性修饰蛋白质的高效方法，其涉及回应选择密码子而将非遗传编码氨基酸（包含但不限于含有在20种天然并入氨基酸中未发现的官能团或取代基（包含但不限于酮基、叠氮基或乙炔部分）的那些氨基酸）选择性并入蛋白质中，且随后用适合反应性PEG衍生物修饰那些氨基酸。一旦并入，随后就可通过利用所属领域的一般技术人员已知适用于非天然编码氨基酸中存在的特定官能团或取代基的化学方法来修饰氨基酸侧链。多种已知的化学方法适用于本发明中以将水溶性聚合物并入蛋白质中。这些方法包含但不限于分别与（包含但不限于）乙炔或叠氮基衍生物进行Huisgen[3+2]环加成反应（例如参看Padwa,A.在Comprehensive Organic Synthesis，第4卷,(1991)Trost,B.M.编,Pergamon,Oxford,第1069-1109页中；以及Huisgen,R.在1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry,(1984)Padwa,A.编,Wiley,New York,第1-176页中）。

因为Huisgen[3+2]环加成方法涉及环加成而非亲核取代反应，所以蛋白质可在极高选择性下经修饰。通过向反应混合物中添加催化量的Cu(I)盐，可在室温下在水性条件下以出色的区域选择性（1,4>1,5）进行此反应。例如参看Tornoe等人,(2002)J.Org. Chem.67:3057-3064；和Rostovtsev等人,(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599；以及WO 03/101972。可通过[3+2]环加成反应加成到本发明的蛋白质上的分子包含具有适合官能团或取代基（包含但不限于叠氮基或乙炔衍生物）的几乎任何分子，这些分子可分别加成到具有乙炔的非天然氨基酸（包含但不限于对炔丙基氧基苯丙氨酸）或具有叠氮基的非天然氨基酸（包含但不限于对叠氮基-苯丙氨酸）上。

由Huisgen[3+2]环加成得到的5元环在还原性环境中通常为不可逆的且在水性环境中于长时期内对水解是稳定的。因此，在苛刻水性条件下多种物质的物理和化学特征可经本发明的活性PEG衍生物修饰。更重要的是，因为叠氮基和乙炔部分彼此具有特异性（且（例如）不与20种常见遗传编码氨基酸中的任一种反应），所以可在一个或一个以上特异性位点以极高的选择性修饰蛋白。

本发明也提供PEG衍生物的水溶性和水解稳定衍生物以及具有一个或一个以上乙炔或叠氮基部分的相关亲水性聚合物。含有乙炔部分的PEG聚合物衍生物对于与已回应选择密码子而选择性地引入蛋白质中的叠氮基部分偶合来说具有极高选择性。类似地，含有叠氮基部分的PEG聚合物衍生物对于与已回应选择密码子而选择性地引入蛋白质中的乙炔部分偶合来说具有极高选择性。

更特定来说，叠氮基部分包括但不限于烷基叠氮化物、芳基叠氮化物和这些叠氮化物的衍生物。烷基和芳基叠氮化物的衍生物可包含其它取代基，只要保持乙炔特异性反应性即可。乙炔部分包括烷基和芳基乙炔和各自的衍生物。烷基和芳基乙炔的衍生物可包含其它取代基，只要保持叠氮化物特异性反应性即可。

本发明提供具有多种官能团、取代基或部分的物质与其它物质的接合物，所述其它物质包含但不限于标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；放射性核素；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖；水溶性树枝状聚合物；环糊精；抑制性核糖核酸；生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团；含金属的部分；放射性部分；新颖官能团；与其它分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；光化学辐射可激发部分；可光异构化部分；生物素；生物素的衍生物；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；量子点；纳米传递素；放射性核苷酸；放射性传递素；中子俘获剂；或上述物质的任何组合，或任何其它所需化合物或物质。本发明也包含具有叠氮基或乙炔部分的物质与具有相应乙炔或叠氮基部分的PEG聚合物衍生物的接合物。举例来说，含有叠氮基部分的PEG聚合物可在含有带有乙炔官能团的非遗传编码氨基酸的蛋白质中的位置处与生物活性分子偶合。偶合PEG与生物活性分子的键包含但不限于Huisgen[3+2]环加成产物。

在所属技术领域中已确定PEG可用于修饰生物材料的表面（例如参看美国专利6,610,281；Mehvar,R.,J.Pharm Pharm Sci.,3(1):125-136(2000)，其是以引用的方式并入本文中）。本发明也包含包括具有一个或一个以上反应性叠氮基或乙炔位点的表面的生物材料和通过Huisgen[3+2]环加成键联与表面偶合的一种或一种以上本发明的含叠氮基或乙炔聚合物。生物材料和其它物质也可通过除叠氮基或乙炔键外的其它键联（诸如通过包括羧酸、胺、醇或硫醇部分的键联）与经叠氮基或乙炔活化的聚合物衍生物偶合以留下叠氮基或乙炔部分用于随后反应。

本发明包含一种合成本发明的含叠氮基聚合物和含乙炔聚合物的方法。在含叠氮基PEG衍生物的情况下，叠氮化物可与聚合物的碳原子直接键结。或者，可通过在一个末端处将具有叠氮基部分的键联剂与常规经活化聚合物连接来制备含叠氮基PEG衍生物，以使得所得聚合物在其末端具有叠氮基部分。在含乙炔PEG衍生物的情况下，乙炔可与聚合物的碳原子直接键结。或者，可通过在一个末端处将具有乙炔部分的键联剂与常规经活性聚合物连接来制备含乙炔PEG衍生物，以使得所得聚合物在其末端具有乙炔部分。

更特定来说，在含叠氮基PEG衍生物的情况下，具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物经历反应以产生其上具有反应性更强部分（诸如甲磺酸根、三氟乙基磺酸根、甲苯磺酸根或卤素离去基）的经取代聚合物。所属领域的一般技术人员已知含有磺酰基卤、卤素原子以及其它离去基的PEG衍生物的制备和使用。所得经取代聚合物随后经历反应以在聚合物的末端处用叠氮基部分取代反应性更强的部分。或者，具有至少一个活性亲核或亲电子部分的水溶性聚合物与在一个末端处具有叠氮基的键联剂进行反应，以使得在PEG聚合物与键联剂之间形成共价键，且叠氮基部分位于聚合物的末端处。所属领域的一般技术人员已知亲核和亲电子部分，其包含胺、硫醇、酰肼、肼、醇、羧酸酯、醛、酮、硫酯等等。

更特定来说，在含乙炔PEG衍生物的情况下，具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物经历反应以将卤素或其它经活化离去基自含有乙炔部分的前体置换。或者，具有至少一个活性亲核或亲电子部分的水溶性聚合物与在一个末端处具有乙炔的键联剂进行反应，以使得在PEG聚合物与键联剂之间形成共价键，且乙炔部分位于聚合物的末端处。所属技术领域的专业人员良好确定卤素部分、经活化离去基、亲核和亲电子部分在有机合成上下文中的使用以及PEG衍生物的制备和使用。

本发明也提供一种选择性修饰蛋白质以将其它物质加成到经修饰蛋白质上的方法，所述其它物质包含但不限于水溶性聚合物，诸如PEG和含有叠氮基或乙炔部分的PEG衍生物。含叠氮基和含乙炔的PEG衍生物可用于改变其中生物相容性、稳定性、溶解性和缺乏免疫原性至关重要的表面和分子的性质，而同时提供一种比所属技术领域中先前已知更具选择性的将PEG衍生物与蛋白质连接的方法。

II.生长激素超基因家族

以下蛋白质包含由生长激素（GH）超基因家族的基因编码的那些（Bazan,F.,Immunology Today 11:350-354(1990)；Bazan,J.F.Science 257:410-413(1992)；Mott,H.R.和Campbell,I.D.,Current Opinion in Structural Biology 5:114-121(1995)；Silvennoinen,O.和Ihle,J.N.,SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC Cytokine Receptors(1996)）：生长激素、泌乳激素、胎盘催乳素、促红细胞生成素（EPO）、血小板生成素（TPO）、白细胞介素-2（IL-2）、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12（p35亚单位）、IL-13、IL-15、抑瘤素M、睫状神经营养因子（CNTF）、白血病抑制因子（LIF）、α干扰素、β干扰素、ε干扰素、γ干扰素、ω干扰素、τ干扰素、粒细胞-集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和心脏营养素-1（CT-1）（“GH超基因家族”）。预期在未来会通过基因克隆和测序来鉴别这个基因家族的其它成员。GH超基因家族的成员具有类似的二级和三级结构，但其通常具有有限的氨基酸或DNA序列一致性。共有的结构特征使得基因家族的新成员易于鉴别且在本文中所述的非天然氨基酸方法和组合物类似地适用。考虑到GH超基因家族成员之间的结构同源性程度，可使用本发明将非天然编码氨基酸并入GH超基因家族的任何成员中。这个蛋白质家族的各成员都包括四螺旋束。家族成员IFNα-2的通用结构展示于图1中。

包含G-CSF（Zink等人,FEBS Lett.314:435(1992)；Zink等人,Biochemistry 33:8453(1994)；Hill等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5167(1993)）、GM-CSF（Diederichs,K.等人,Science 154:1779-1782(1991)；Walter等人,J.Mol.Biol,224:1075-1085(1992)）、IL-2（Bazan,J.F.和McKay,D.B.Science 257:410-413(1992)）、IL-4（Redfield等人,Biochemistry 30:11029-11035(1991)；Powers等人,Science 256:1673-1677(1992)）和IL-5（Milburn等人,Nature 363:172-176(1993)）的众多细胞因子的结构已由X射线衍射和NMR研究测定且展示GH结构的惊人保守性，但缺乏显著的一级序列同源性。根据建模和其它研究，认为IFN为这个家族的成员（Lee等人,J.Interferon Cytokine Res.15:341(1995)；Murgolo等人,Proteins 17:62(1993)；Radhakrishnan等人,Structure 4:1453(1996)；Klaus等人,J.Mol.Biol.274:661(1997)）。根据建模和突变诱发研究，认为EPO为这个家族的成员（Boissel等人,J.Biol.Chem.268:15983-15993(1993)；Wen等人,J.Biol.Chem.269:22839-22846(1994)）。现在认为所有上述细胞因子和生长因子组成一个大基因家族。

除共有类似的二级和三级结构之外，这个家族的成员共有以下性质：其应寡聚细胞表面受体以活化细胞内信号转导路径。一些GH家族成员（包含但不限于GH和EPO）与单一类型的受体结合且使其形成同二聚体。其它家族成员（包含但不限于IL-2、IL-4和IL-6）与一种以上类型的受体结合且使这些受体形成异二聚体或更高级聚集体（Davis等人,(1993),Science 260:1805-1808；Paonessa等人,(1995),EMBO J.14:1942-1951；Mott和Campbell,Current Opinion in Structural Biology 5:114-121(1995)）。突变诱发研究已展示，如同GH一样，这些其它细胞因子和生长因子含有多个受体结合位点（通常两个）且依次与其同源受体结合（Mott和Campbell,Current Opinion in Structural Biology5:114-121(1995)；Matthews等人,(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:9471-9476）。如同GH一样，这些其它家族成员的主要受体结合位点主要存在于四个α螺旋和A-B环中。不同家族成员中参与受体结合的螺旋束中的特定氨基酸不同。与GH超基因家族成员相互作用的大多数细胞表面受体在结构上是相关的且包括第二大的多基因家族。例如参看美国专利第6,608,183号，其是以引用的方式并入本文中。

从GH超基因家族的各个成员的突变研究得到的一般结论为连接α螺旋的环通常倾向于不牵涉于受体结合中。特定来说，对于大多数（如果不是全部）家族成员中的受体结合来说，短B-C环似乎是非必需的。出于这个原因，在GH超基因家族成员中，B-C环可经如本文中所述的非天然编码氨基酸取代。A-B环、C-D环（以及干扰素/GH超家族的类IL-10成员的D-E环）也可经非天然存在氨基酸取代。最接近螺旋A且远离最后螺旋的氨基酸也倾向于不牵涉于受体结合中且也可为用于引入非天然存在氨基酸的位点。在一些实施例中，非天然编码氨基酸在环结构内的任何位置（包含但不限于A-B、B-C、C-D或D-E环的前1、2、3、4、5、6、7或7个以上氨基酸）处经取代。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在A-B、B-C、C-D或D-E环的后1、2、3、4、5、6、7或7个以上氨基酸内经取代。

GH家族的某些成员（包含但不限于EPO、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、G-CSF、GM-CSF、TPO、IL-10、IL-12p35、IL-13、IL-15和β干扰素）含有N键联和/或O键联的糖。蛋白质中的糖基化位点几乎仅存在于环区域中且不在α螺旋束中。因为环区域通常不牵涉于受体结合中且因为其为用于共价连接糖基团的位点，所以其可为将非天然存在氨基酸取代引入蛋白质中的有用位点。在蛋白质中包括N键联和O键联的糖基化位点的氨基酸可为非天然存在氨基酸取代的位点，因为这些氨基酸为表面暴露的。因此，天然蛋白质可容许在这些位点处与蛋白质连接的庞大糖基且糖基化位点倾向于远离受体结合位点定位。

未来可能发现GH超基因家族的其它成员。可通过预测蛋白质序列的计算机辅助式二级和三级结构分析且通过经设计以鉴别与特定标靶结合的分子的选择技术来鉴别GH超基因家族的新成员。GH超基因家族的成员通常具有4个或5个由非螺旋氨基酸连接的两性螺旋（环区域）。蛋白质可在其N末端含有疏水性信号序列以促进自细胞分泌。这些后来发现的GH超基因家族成员也包含于本发明内。相关申请案为2005年8月18日公开为WO 05/074650的名称为“Modified Four Helical Bundle Polypeptides and TheirUses”的国际专利申请案，其是以引用的方式并入本文中。

因此，提供对于生长激素超基因家族的描述仅为说明性目的且仅为举例且并不作为对本文中所述的方法、组合物、策略和技术的范围的限制。此外，在本申请案中提及GH和IFN多肽是打算使用一般术语作为GH超基因家族的任何成员的实例。因此，应了解在本文中关于hIFN多肽或蛋白质所述的修饰和化学可同样适用于GH超基因家族的任何成员（包含在本文中特定列出的那些）。

III.用于本发明的通用重组核酸方法

在本发明的众多实施例中，将使用重组方法分离、克隆且通常改变编码所关注hIFN多肽的核酸。这些实施例用于（包含但不限于）蛋白质表达或用于自hIFN多肽获得的变体、衍生物、表达盒或其它序列的产生期间。在一些实施例中，编码本发明的多肽的序列是可操作地键联至异源启动子上。hIFN的分离和IFN在宿主细胞中的产生描述于（例如）美国专利第6,489,144号；第6,410,697号；第6,159,712号；第5,955,307号；第5,814,485号；第5,710,027号；第5,595,888号；第5,391,713号；第5,244,655号；第5,196,323号；第5,066,786号；第4,966,843号；第4,894,330号；第4,364,863号中，其是以引用的方式并入本文中。

可以母体多肽的氨基酸序列为基础来合成编码包括非天然编码氨基酸的hIFN多肽的核苷酸序列，其（包含但不限于）具有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列（hIFN），且随后改变核苷酸序列以实现相关氨基酸残基的引入（即，并入或取代）或移除（即，缺失或取代）。可根据常规方法通过定点突变诱发来方便地修饰核苷酸序列。或者，核苷酸序列可由化学合成（包含但不限于通过使用寡核苷酸合成器，其中寡核苷酸是根据所需多肽的氨基酸序列来设计）来制备，且优先选择在将产生重组多肽的宿主细胞中有利的那些密码子。举例来说，可通过PCR、连接或连接链式反应来合成且组装编码所需多肽部分的若干小寡核苷酸。例如参看Barany等人,Proc.Natl.Acad.Sci.88:189-193(1991)；美国专利6,521,427，其是以引用的方式并入本文中。

本发明利用重组遗传学领域中的常规技术。揭示用于本发明中的通用技术的基础文章包含Sambrook等人,Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版,2001)；Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990)；以及Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等人编,1994)。

描述分子生物技术的一般文章包含Berger和Kimmel,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzvmology第152卷Academic Press,Inc.,San Diego,CA(Berger)；Sambrook等人,Molecular Cloning-A Laboratory Manual (第2版),第1-3卷,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1989("Sambrook")以及Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel等人编,Current Protocols,GreenePublishing Associates,Inc.与John Wiley & Sons,Inc.的合资,(于1999年增补)(″Ausubel"))。这些文章描述突变诱发、载体和启动子的使用以及许多其它相关主题，其涉及（包含但不限于）包含用于制备包含非天然氨基酸、正交tRNA、正交合成酶以及其对的蛋白质的选择密码子的基因或聚核苷酸的产生。

各种类型的突变诱发是出于多种目的用于本发明中，其包含但不限于为产生新颖合成酶或tRNA、为突变tRNA分子、为突变编码合成酶的聚核苷酸、为产生tRNA文库、为产生合成酶文库、为产生选择密码子、为在所关注蛋白质或多肽中插入编码非天然氨基酸的选择密码子。所述突变诱发包含但不限于定点突变诱发、随机点突变诱发、同源重组、DNA改组或其它递归突变诱发方法、嵌合建构、使用含尿嘧啶模板的突变诱发、寡核苷酸定向突变诱发、硫逐磷酸酯修饰DNA突变诱发、使用缺口双链DNA的突变诱发等等，或其任何组合。其它适合方法包含点错配修复、使用修复缺陷宿主菌株的突变诱发、限制选择和限制纯化、缺失突变诱发、通过总基因合成进行的突变诱发、双链断裂修复等等。（包含但不限于）涉及嵌合构筑体的突变诱发也包含在本发明中。在一个实施例中，可由天然存在分子或改变或突变的天然存在分子的已知信息（包含但不限于序列、序列比较、物理性质、三级或四级结构、晶体结构等等）来指导突变诱发。

在本文中出现的文章和实例描述这些程序。其它信息见于以下公开案和其中引用的参考文献中：Ling等人，Approaches to DNA mutagenesis:an overview，Anal Biochem.254(2):157-178(1997)；Dale等人,Oligonucleotide-directed random mutagenesis using thephosphorothioate method,Methods Mol.Biol.57:369-374(1996)；Smith,In vitromutagenesis,Ann.Rev.Genet.19:423-462(1985)；Botstein和Shortle,Strategies andapplications of in vitro mutagenesis,Science 229:1193-1201(1985)；Carter,Site-directedmutagenesis,Biochem.J.237:1-7(1986)；Kunkel,The efficiency of oligonucleotide directedmutagenesis,在Nucleic Acids & Molecular Biology(Eckstein,F.和Lilley,D.M.J编,Springer Verlag,Berlin)(1987)中；Kunkel,Rapid and efficient site-specificmutagenesis-without phenotypic selection,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492(1985)；Kunkel等人,Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection,Methods in Enzymol.154,367-382(1987)；Bass等人,Mutant Trp repressors with newDNA-binding specificities,Science 242:240-245(1988)；Zoller和Smith,Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors:an efficient and generalprocedure for the production of point mutations in any DNA fragment,Nucleic Acids Res.10:6487-6500(1982)；Zoller和Smith,Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNAfragments cloned into M13 vectors,Methods in Enzymol.100:468-500(1983)；Zoller和Smith,Oligonucleotide-directed mutagenesis:a simple method using two oligonucleotideprimers and a single-stranded DNA template,Methods in Enzymol.154:329-350(1987)；Taylor等人,The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions toprepare nicked DNA,Nucl.Acids Res.13:8749-8764(1985)；Taylor等人,The rapidgeneration of oligonucleotide-directed mutations at high frequency usingphosphorothioate-modified DNA,Nucl.Acids Res.13:8765-8785(1985)；Nakamaye和Eckstein,Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groupsand its application to oligonucleotide-directed mutagenesis,Nucl.Acids Res.14:9679-9698(1986)；Sayers等人,5′-3'Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directedmutagenesis,Nucl.Acids Res.16:791-802(1988)；Sayers等人,Strand specific cleavage ofphosphor othioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in thepresence ofethidium bromide,(1988)Nucl.Acids Res.16:803-814；Kramer等人,Thegapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction,Nucl.Acids Res.12:9441-9456(1984)；Kramer和Fritz Oligonucleotide-directed construction ofmutations via gapped duplex DNA,Methods in Enzymol.154:350-367(1987)；Kramer等人,Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach tooligonucleotide-directed construction of mutations,Nucl.Acids Res.16:7207(1988)；Fritz等人,Oligonucleotide-directed construction of mutations:a gapped duplex DNA procedurewithout enzymatic reactions in vitro,Nucl.Acids Res.16:6987-6999(1988)；Kramer等人,Different base/base mismatches are corrected with different efficiencies by themethyl-directed DNA mismatch-repair system of E.coli,Cell 38:879-887(1984)；Carter等人,Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using Ml3 vectors,Nucl.Acids Res.13:4431-4443(1985)；Carter,Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using Ml3 vectors,Methods in Enzymol.154:382-403(1987)；Eghtedarzadeh和Henikoff，Use ofoligonucleotides to generate large deletions,Nucl.Acids Res.14:5115(1986)；Wells等人,Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin,Phil. Trans.R.Soc.Lond.A 317:415-423(1986)；Nambiar等人,Total synthesis and cloning of agene coding for the ribonuclease S protein,Science 223:1299-1301(1984)；Sakamar和Khorana,Total synthesis and expression of a gene for the alpha-subunit of bovine rod outersegment guanine nucleotide-binding protein(transducin),Nucl.Acids Res.14:6361-6372(1988)；Wells等人,Cassette mutagenesis:an efficient method for generation of multiplemutations at defined sites,Gene 34:315-323(1985)；Grundstrom等人,Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun'gene synthesis,Nucl.Acids Res.13:3305-3316(1985)；Mandecki,Oligonucleotide-directed double-strand break repairin plasmids of Escherichia coli:a method for site-specific mutagenesis,Proc.Natl.Acad.Sci. USA,83:7177-7181(1986)；Arnold，Protein engineering for unusual environments,Current Opinion in Biotechnology 4:450-455(1993)；Sieber等人,Nature Biotechnology,19:456-460(2001)；W.P.C.Stemmer,Nature 370,389-91(1994)；以及I.A.Lorimer,I.Pastan,Nucleic Acids Res.23,3067-8(1995)。关于众多上述方法的其它细节可见于Methods in Enzymology第154卷中，其也描述对于各种突变诱发方法带来的故障检修问题的有用控制。

通常根据由Beaucage和Caruthers,Tetrahedron Letts.22(20):1859-1862,(1981)所述的固相亚磷酰胺三酯法，使用如Needham-VanDevanter等人,Nucleic acids Res.,12:6159-6168(1984)中所述的自动合成器来化学合成用于本发明的突变诱发（例如，使合成酶文库突变或改变tRNA）中的寡核苷酸。

本发明也涉及通过正交tRNA/RS对在活体内并入非天然氨基酸的真核宿主细胞、非真核宿主细胞和有机体。宿主细胞经基因工程改造（包含但不限于转化、转导或转染）具有本发明的聚核苷酸或包含本发明的聚核苷酸的构筑体（其包含但不限于本发明的载体，其可为（例如）克隆载体或表达载体）。举例来说，正交tRNA、正交tRNA合成酶和欲衍生的蛋白质的编码区域是与在所需宿主细胞中起作用的基因表达控制元件可操作地键联。载体可为（例如）质粒、粘粒、噬菌体、细菌、病毒、裸聚核苷酸或接合聚核苷酸的形式。载体可通过标准方法引入细胞和/或微生物中，所述方法包含电穿孔（Fromm等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82,5824(1985)）、通过病毒载体感染、在小珠粒或粒子基质内或在表面上由具有核酸的小粒子高速弹道渗透（Klein等人,Nature 327,70-73(1987)）等等。

经改造宿主细胞可于经调节适用于诸如筛检步骤、活化启动子或选择转化株的活动的常规营养培养基中培养。这些细胞可视情况经培养为转基因有机体。（包含但不限于）关于细胞分离和培养（例如，关于随后的核酸分离）的其它有用参考文献包含Freshney(1994)Culture of Animal Cells,a Manual of Basic Technique,第3版,Wiley-Liss,NewYork以及其中引用的参考文献；Payne等人,(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons,Inc.New York,NY；Gamborg和Phillips(编)(1995)Plant Cell, Tissue and Organ Culture;Fundamental Methods Springer Lab Manual,Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York)以及Atlas和Parks(编)The Handbook of Microbiological Media(1993)CRC Press,Boca Raton,FL。

可使用将靶核酸引入细胞中的若干种众所周知的方法，其中任一种都可用于本发明中。这些方法包含：受体细胞与含有DNA的细菌原生质体融合、电穿孔、基因枪法以及经病毒载体（在下文中进一步论述）感染等。细菌细胞可用于扩增含有本发明的DNA构筑体的质粒的数目。使细菌生长至对数生长期且可通过所属技术领域中已知的多种方法分离细菌中的质粒（例如参看Sambrook）。另外，在市场上购得多种试剂盒以自细菌中纯化质粒（例如参看都来自Pharmacia Biotech的EasyPrep^TM、FlexiPrep^TM；来自Stratagene的StrataClean^TM；以及来自Qiagen的QIAprep^TM）。随后进一步操作经分离且经纯化的质粒以产生其它质粒，所述质粒用于转染细胞或并入相关载体中以感染有机体。典型载体含有转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列以及可用于调节特定靶核酸的表达的启动子。载体视情况包括通用表达盒，其含有至少一个独立终止子序列、允许表达盒在真核细胞或原核细胞或两者（包含但不限于穿梭载体）中复制的序列以及用于原核系统与真核系统的选择标记。载体适用于在原核细胞、真核细胞或两者中复制且整合。参看Giliman和Smith,Gene 8:81(1979)；Roberts等人,Nature.328:731(1987)；Schneider,B.等人,Protein Expr.Purif.6435:10(1995)；Ausubel,Sambrook,Berger(都同上文)。适用于克隆的细菌和噬菌体的目录由（例如）ATCC提供，例如，由ATCC出版的The ATCC Catalogue ofBacteria and Bacteriophage(1992)Gherna等人（编）。用于测序、克隆和分子生物学的其它方面的其它基本程序以及基础理论考虑也见于Watson等人(1992)Recombinant DNA第2版Scientific American Books,NY中。另外，基本上任何核酸（以及实际上任何标记核酸，无论标准或非标准）都可自多种商业来源中的任一种定制或标准定购，这些商业来源诸如Midland Certified Reagent Company（Midland,TX，可通过万维网在mcrc.com上获得）、The Great American Gene Company（Ramona,CA，可通过万维网在genco.com上获得）、ExpressGen Inc.（Chicago,IL，可通过万维网在expressgen.com上获得）、Operon Technologies Inc.（Alameda,CA）以及许多其它来源。

选择密码子

本发明的选择密码子扩展蛋白质生物合成机构的遗传密码子框架。举例来说，选择密码子包含但不限于独特三碱基密码子、无义密码子（诸如终止密码子，其包含但不限于琥珀密码子（UAG）、赭石密码子或蛋白石密码子（UGA））、非天然密码子、四个或四个以上碱基密码子、稀有密码子等等。所属领域的一般技术人员易于了解可引入所需基因或多肽中的选择密码子的数目范围很广，其包含但不限于在编码至少一部分hIFN多肽的单一聚核苷酸中存在一个或一个以上、两个或两个以上、三个或三个以上、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或10个以上。

在一个实施例中，所述方法涉及使用作为用于在活体内并入一个或一个以上非天然氨基酸的终止密码子的选择密码子。举例来说，产生识别终止密码子（包含但不限于UAG）的O-tRNA，且通过具有所需非天然氨基酸的O-RS使其氨基酰基化。此O-tRNA并不由天然存在宿主的氨基酰基-tRNA合成酶识别。常规定点突变诱发可用于在所关注多肽中的所关注位点处引入终止密码子（包含但不限于TAG）。例如参看Sayers,J.R.等人,(1988),5′-3'Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directedmutagenesis.Nucleic Acids Res,16:791-802。当O-RS、O-tRNA和编码所关注多肽的核酸在活体内组合时，回应UAG密码子而并入非天然氨基酸以得到在指定位置处含有非天然氨基酸的多肽。

可在真核宿主细胞无显著扰动的情况下在活体内进行非天然氨基酸的并入。举例来说，因为对于UAG密码子的抑制效率取决于O-tRNA（包含但不限于琥珀抑制tRNA）与真核释放因子（包括但不限于eRF）（其与终止密码子结合且启动核糖体释放生长肽）之间的竞争，所以可通过（包含但不限于）增加O-tRNA和/或抑制tRNA的表达水平来调节抑制效率。

非天然氨基酸也可由稀有密码子编码。举例来说，当在活体外蛋白质合成反应中精氨酸浓度降低时，已证明通过经丙氨酸酰化的合成tRNA可有效将Ala插入稀有精氨酸密码子AGG中。例如参看Ma等人,Biochemistry,32:7939(1993)。在这种情况下，合成tRNA与在大肠杆菌中作为次要种类存在的天然存在tRNA Arg竞争。一些有机体不使用所有三联密码子。藤黄微球菌（Micrococcus luteus）中的未指定密码子AGA已用于在活体外转录/翻译提取物中插入氨基酸。例如参看Kowal和Oliver,Nucl.Acid.Res.,25:4685(1997)。可产生本发明的组分以在活体内使用这些稀有密码子。

选择密码子也包括延长密码子，其包含但不限于四个或四个以上碱基密码子，诸如，四个、五个、六个或六个以上碱基密码子。四碱基密码子的实例包含但不限于AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等等。五碱基密码子的实例包含但不限于AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等等。本发明的特征包含使用基于移码抑制的延长密码子。四个或四个以上碱基密码子可将（包含但不限于）一个或一个以上非天然氨基酸插入同一蛋白质中。举例来说，在突变O-tRNA（包含但不限于具有反密码子环（例如，具有至少8-10个核苷酸反密码子环）的特定移码抑制tRNA）存在的情况下，四个或四个以上碱基密码子被读成单一氨基酸。在其它实施例中，反密码子环可解码（包含但不限于）至少一个四碱基密码子、至少一个五碱基密码子或至少一个六碱基密码子或更多碱基密码子。因为存在256种可能的四碱基密码子，所以可使用四个或四个以上碱基密码子在同一细胞中编码多种非天然氨基酸。参看Anderson等人,(2002)Exploring theLimits of Codon and Anticodon Size,Chemistry and Biology,9:237-244；Magliery，(2001)Expanding the Genetic Code:Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons andIdentification of"Shifty"Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli,J. Mol.Biol.307:755-769。

举例来说，使用活体外生物合成方法，已经用四碱基密码子将非天然氨基酸并入蛋白质中。例如参看Ma等人,(1993)Biochemistry,32:7939；以及Hohsaka等人,(1999)J.Am. Chem.Soc.121:34。CGGG和AGGU用于在活体外通过两种化学酰化的移码抑制tRNA将2-萘基丙氨酸和赖氨酸的NBD衍生物同时并入抗生蛋白链菌素中。例如参看Hohsaka等人,(1999)J.Am.Chem.Soc,121:12194。在活体内研究中，Moore等人研究具有NCUA反密码子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密码子（N可为U、A、G或C）的能力，并且发现四联UAGA可由具有UCUA反密码子的tRNALeu以13%至26%的效率解码，其中在0或-1框架中几乎无解码。参看Moore等人,(2000)J.Mol.Biol.,298:195。在一个实施例中，以稀有密码子或无义密码子为基础的延长密码子可用于本发明中，其可降低在其它不需位点处的错义通读和移码抑制。

对于给定系统来说，选择密码子也可包含天然三碱基密码子中的一种，其中内源系统不使用（或很少使用）天然碱基密码子。举例来说，此包含缺乏识别天然三碱基密码子的tRNA的系统和/或其中三碱基密码子为稀有密码子的系统。

选择密码子视情况包含非天然碱基对。这些非天然碱基对进一步扩展现有遗传代码。一个额外碱基对将三联密码子的数目从64增加到125。第三碱基对的性质包含稳定和选择性的碱基配对、通过聚合酶在高保真度下有效地酶促并入DNA中以及在合成初生非天然碱基对之后有效持续的引物延伸。可用于方法和组合物的非天然碱基对的描述包含（例如）Hirao等人,(2002)An unnatural base pair for incorporating amino acidanalogues into protein,Nature Biotechnology,20:177-182。也参看Wu,Y.等人,(2002)J.Am.Chem.Soc.124:14626-14630。其它相关公开案列于下文中。

对于活体内使用来说，非天然核苷可透过膜且经磷酸化以形成相应三磷酸盐。另外，增加的遗传信息为稳定的且不受细胞酶破坏。Benner等人的先前努力利用不同于规范Watson-Crick对中的氢键合模式，其最值得注意的实例为iso-C:iso-G对。例如参看Switzer等人,(1989)J.Am.Chem.Soc111:8322；以及Piccirilli等人,(1990)Nature,343:33；Kool,(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.,4:602.。这些碱基通常在一定程度上与天然碱基错配且不能酶促复制。Kool和同事证实碱基之间的疏水填充相互作用可替代氢键合来驱动碱基对的形成。参看Kool,(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.,4:602；以及Guckian和Kool,(1998)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,36,2825。在致力于开发满足所有上述要求的非天然碱基对的过程中，Schultz、Romesberg和同事已系统地合成且研究了一系列非天然疏水性碱基。发现PICS:PICS自身对比天然碱基对更稳定，且可通过大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段（KF）有效地并入DNA中。例如参看McMinn等人,(1999)J.Am.Chem.Soc,121:11585-6；以及Ogawa等人,(2000)J.Am.Chem.Soc,122:3274。可通过KF在对于生物功能来说足够的效率和选择性下合成3MN:3MN自身对。例如参看Ogawa等人,(2000)J.Am.Chem.Soc,122:8803。然而，两种碱基都充当进一步复制的链终止子。突变DNA聚合酶近来已得到发展，其可用于复制PICS自身对。另外，可复制7AI自身对。例如参看Tae等人,(2001)J.Am.Chem.Soc,123:7439。也已开发新颖金属碱基对Dipic:Py，其在结合Cu(II)后形成稳定对。参看Meggers等人,(2000)J.Am.Chem.Soc,122:10714。因为延长密码子和非天然密码子固有地与天然密码子正交，所以本发明的方法可利用此性质来产生它们的正交tRNA。

翻译旁路系统（translational bypassing system）也可用于将非天然氨基酸并入所需多肽中。在翻译旁路系统中，将大序列并入基因中，但并不翻译入蛋白质中。所述序列含有充当诱发核糖体跃过序列的线索且继续插入下游的翻译的结构。

在某些实施例中，在本发明的方法和/或组合物中的所关注蛋白质或多肽（或其部分）是由核酸编码。通常，核酸包括至少一个选择密码子、至少两个选择密码子、至少三个选择密码子、至少四个选择密码子、至少五个选择密码子、至少六个选择密码子、至少七个选择密码子、至少八个选择密码子、至少九个选择密码子、十个或十个以上选择密码子。

可使用所属领域的一般技术人员众所周知且在本文中所述的方法诱变编码所关注蛋白质或多肽的基因以包含（例如）一个或一个以上选择密码子以并入非天然氨基酸。举例来说，针对所关注蛋白质的核酸经诱变以包含一个或一个以上选择密码子，以提供一个或一个以上非天然氨基酸的并入。本发明包含（例如）包含至少一个非天然编码氨基酸的任何蛋白的任何此种变异（包含但不限于突变）形式。类似地，本发明也包含相应核酸，即，具有编码一个或一个以上非天然氨基酸的一个或一个以上选择密码子的任何核酸。

编码所关注蛋白质（诸如hIFN多肽）的核酸分子可容易地突变以在多肽的任何所需位置处引入半胱氨酸。半胱氨酸广泛用于将反应性分子、水溶性聚合物、蛋白质或多种其它分子引入所关注蛋白质上。所属领域的一般技术人员已知适于将半胱氨酸并入多肽的所需位置处的方法，诸如在美国专利第6,608,183号（其是以引用的方式并入本文中）中所述的那些方法，以及标准突变诱发技术。

IV.非天然编码氨基酸

多种非天然编码氨基酸适用于本发明中。任何数目的非天然编码氨基酸可引入hIFN多肽中。一般来说，经引入的非天然编码氨基酸实质上对20种常见遗传编码氨基酸（即，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸）呈化学惰性。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含可与20种常见氨基酸中未发现的官能团（包含但不限于叠氮基、酮、醛以及氨氧基）有效且选择性地反应以形成稳定接合物的侧链官能团。举例来说，包含含有叠氮基官能团的非天然编码氨基酸的hIFN多肽可与聚合物（包含但不限于聚乙二醇）或者含有炔部分的第二多肽反应以形成稳定接合物，所述稳定接合物是由叠氮基与炔官能团的形成Huisgen[3+2]环加成产物的选择性反应形成。α-氨基酸的一般结构说明如下（式I）：

非天然编码氨基酸通常为具有上述式（其中R基团为除用于20种天然氨基酸中的取代基之外的任何取代基）的任何结构，且可适用于本发明中。因为本发明的非天然编码氨基酸通常仅在侧链结构上不同于天然氨基酸，所以非天然编码氨基酸以其形成于天然存在多肽中的相同方式与其它氨基酸（包含但不限于天然或非天然编码氨基酸）形成酰胺键。然而，非天然编码氨基酸具有将其区别于天然氨基酸的侧链基团。举例来说，R视情况包括烷基-、芳基-、酰基-、酮基-、叠氮基-、羟基-、肼、氰基-、卤基-、酰肼、烯基、炔基、醚、硫醇、硒基-、磺酰基-、硼酸酯基、

酸酯基、磷酸基、膦酰基、膦、杂环基、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺、氨基等等或其任何组合。可适用于本发明中的其它所关注非天然存在氨基酸包含但不限于包括可光活化交联剂的氨基酸、自旋标记氨基酸、荧光氨基酸、结合金属的氨基酸、含金属氨基酸、放射性氨基酸、具有新颖官能团的氨基酸、与其它分子共价或非共价相互作用的氨基酸、光笼蔽和/或可光异构化氨基酸、包括生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化氨基酸（诸如糖取代丝氨酸）、其它碳水化合物修饰氨基酸、含酮基氨基酸、包括聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代氨基酸、可化学裂解或可光裂解的氨基酸、与天然氨基酸相比具有延长侧链（包含但不限于聚醚或长链烃，包含但不限于大于约5个或大于约10个碳）的氨基酸、碳键联含糖氨基酸、氧化还原活性氨基酸、含氨基硫代酸的氨基酸以及包括一个或一个以上毒性部分的氨基酸。

可适用于本发明中且适用于与水溶性聚合物反应的例示性非天然编码氨基酸包含但不限于具有羰基、氨氧基、肼、酰肼、氨基脲、叠氮化物以及炔反应性基团的那些非天然编码氨基酸。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包括糖部分。这些氨基酸的实例包含N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-半乳糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-苏氨酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-天冬酰胺以及O-甘露糖胺基-L-丝氨酸。这些氨基酸的实例也包含其中氨基酸与糖之间的天然存在N或O键由在自然界中不常见的共价键（包含但不限于烯烃、肟、硫醚、酰胺等等）置换的实例。这些氨基酸的实例也包含在天然存在蛋白质中不常见的糖，诸如2-脱氧-葡萄糖、2-脱氧半乳糖等等。

本文中提供的众多非天然编码氨基酸可购自（例如）Sigma-Aldrich（St.Louis,MO,USA）、Novabiochem（EMD Biosciences,Darmstadt,Germany的分公司）或Peptech（Burlington,MA,USA）。不可购得的那些非天然编码氨基酸是视情况如本文中所提供进行合成或使用所属领域的一般技术人员已知的标准方法进行合成。关于有机合成技术，例如参看Fessendon和Fessendon的Organic Chemistry,(1982,第2版,Willard Grant Press,Boston Mass.)；March的Advanced Organic Chemistry(第3版,1985,Wiley and Sons,NewYork)；以及Carey和Sundberg的Advanced Organic Chemistry(第3版,A及B部分,1990,Plenum Press,New York)。也参看美国专利第7,045,337号和美国专利申请公开案第2003/0108885号，其是以引用的方式并入本文中。除含有新颖侧链的非天然氨基酸之外，可适用于本发明中的非天然氨基酸也视情况包括（包含但不限于）如由式II和III的结构说明的经修饰主链结构：

其中Z通常包括OH、NH₂、SH、NH-R'或S-R'；X和Y（其可相同或不同）通常包括S或O，且R和R'（其视情况相同或不同）通常选自上文对于具有式I的非天然氨基酸所述的R基团的相同组分列表以及氢。举例来说，本发明的非天然氨基酸视情况包括在如式II和III所示的氨基或羧基中的取代。此类型的非天然氨基酸包含但不限于α-羟基酸、α-硫代酸、α-氨基硫代羧酸酯，包含但不限于具有对应于20种常见天然氨基酸的侧链或非天然侧链。另外，在α-碳上的取代视情况包含但不限于L、D或α-α-二取代氨基酸，诸如D-谷氨酸盐、D-丙氨酸、D-甲基-O-酪氨酸、氨基丁酸等等。其它结构替代物包含环状氨基酸，诸如脯氨酸类似物以及3、4、6、7、8和9元环脯氨酸类似物；β和γ氨基酸，诸如经取代β-丙氨酸和γ-氨基丁酸。

许多非天然氨基酸是以诸如酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸等天然氨基酸为基础且适用于本发明中。酪氨酸类似物包含但不限于对位取代酪氨酸、邻位取代酪氨酸以及间位取代酪氨酸，其中经取代酪氨酸包括（包含但不限于）酮基（包含但不限于乙酰基）、苯甲酰基、氨基、肼、羟胺、硫醇基、羧基、异丙基、甲基、C₆-C₂₀直链或支链烃、饱和或不饱和烃、O-甲基、聚醚基团、硝基、炔基等等。另外，也涵盖多取代芳基环。可适用于本发明中的谷氨酰胺类似物包含但不限于α-羟基衍生物、γ-取代衍生物、环状衍生物以及酰胺取代谷氨酰胺衍生物。可适用于本发明中的苯丙氨酸类似物的实例包含但不限于对位取代苯丙氨酸、邻位取代苯丙氨酸和间位取代苯丙氨酸，其中取代基包括（包含但不限于）羟基、甲氧基、甲基、烯丙基、醛、叠氮基、碘、溴、酮基（包含但不限于乙酰基）、苯甲酰基、炔基等等。可适用于本发明中的非天然氨基酸的特定实例包含但不限于对乙酰基-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸以及对炔丙基氧基-苯丙氨酸等等。可适用于本发明中的多种非天然氨基酸的结构的实例提供于（例如）名称为“In vivoincorporation of unnatural amino acids”的WO 2002/085923中。关于其它甲硫氨酸类似物也参看Kiick等人,(2002)Incorporation of azides into recombinant proteins forchemoselective modification by the Staudinger ligation,PNAS 99:19-24，其是以引用的方式并入本文中。

在一个实施例中，提供包含非天然氨基酸（诸如对-(炔丙基氧基)-苯丙氨酸）的hIFN多肽的组合物。也提供包括对-(炔丙基氧基)-苯丙氨酸和（包含但不限于）蛋白质和/或细胞的各种组合物。在一方面中，包含对-(炔丙基氧基)-苯丙氨酸非天然氨基酸的组合物进一步包含正交tRNA。非天然氨基酸可与正交tRNA键结（包含但不限于共价键结），其包含但不限于通过氨基-酰基键与正交tRNA共价键结、与正交tRNA的末端核糖的3'OH或2'OH共价键结等。

经由非天然氨基酸可并入蛋白质中的化学部分提供多种优点以及对蛋白质的操作。举例来说，酮基官能团的独特反应性允许蛋白质在活体外以及活体内由众多含肼或含羟胺试剂中的任一种进行选择性修饰。重原子非天然氨基酸（例如）可用于定相X射线结构数据。使用非天然编码氨基酸进行重原子的位点特异性引入在选择重原子的位置时也提供选择性和灵活性。光反应性非天然氨基酸（包含但不限于具有二苯甲酮和芳基叠氮化物（包含但不限于叠氮基苯）侧链的氨基酸）（例如）允许蛋白质的有效活体内和活体外光交联。光反应性非天然氨基酸的实例包含但不限于对叠氮基-苯丙氨酸以及对苯甲酰基-苯丙氨酸。随后可通过激发提供光反应性基团的时间控制使具有光反应性非天然氨基酸的蛋白质随意交联。在一个实例中，非天然氨基的甲基可通过使用（包含但不限于）核磁共振以及振动光谱经作为局部结构和动力学的探针的同位素标记（包含但不限于）甲基取代。炔基或叠氮基官能团（例如）允许通过[3+2]环加成反应由分子对蛋白质进行选择性修饰。

在氨基末端处并入多肽中的非天然氨基酸可由R基团（其为除用于20种天然氨基酸中的取代基之外的任何取代基）和不同于α-氨基酸（参看式I）中通常存在的NH₂基团的第二反应性基团组成。具有不同于α-氨基酸（参看式I）中通常存在的COOH基团的第二反应性基团的类似非天然氨基酸可在羧基末端处并入。

本发明的非天然氨基酸可经选择或设计以提供在20种天然氨基酸中不可获得的其它特性。举例来说，非天然氨基酸可视情况经设计或选择以改变（例如）其并入其中的蛋白质的生物性质。举例来说，可视情况通过将非天然氨基酸引入蛋白质中来改变以下性质：毒性、生物分布、溶解性、稳定性（例如，热稳定性、水解稳定性、氧化稳定性、抗酶促降解等等）、纯化和加工的便利性、结构性质、光谱性质、化学和/或光化学性质、催化活性、氧化还原电位、半衰期、与其它分子（例如）共价或非共价反应的能力等等。

非天然氨基酸的化学合成

适用于本发明中的许多非天然氨基酸是购自（例如）Sigma（USA）或Aldrich（Milwaukee,WI,USA）。不可购得的那些是视情况如本文中所提供进行合成或如各种公开案中所提供进行合成或使用所属领域的一般技术人员已知的标准方法进行合成。关于有机合成技术，例如参看Fessendon和Fessendon的Organic Chemistry,(1982,第2版,Willard Grant Press,Boston Mass.)；March的Advanced Organic Chemistry(第3版,1985,Wiley and Sons,New York)；以及Carey和Sundberg的Advanced Organic Chemistry(第3版,A及B部分,1990,Plenum Press,New York)。描述非天然氨基酸合成的其它公开案包含（例如）名称为“In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids”的WO 2002/085923；Matsoukas等人,(1995)J.Med.Chem.,38,4660-4669；King,F.E.和Kidd,D.A.A.(1949)ANew Synthesis of Glutamine and of γ-Dipeptides of Glutamic Acid from PhthylatedIntermediates,J.Chem.Soc,3315-3319；Friedman,O.M.和Chatterrji,R.(1959)Synthesis ofDerivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents.J.Am.Chem.Soc.81,3750-3752；Craig,J.C.等人(1988)Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4[[4-(diethylamino)-l-methylbutyl]amino]quinoline(Chloroquine).J.Org.Chem.53,1167-1170；Azoulay,M.,Vilmont,M.和Frappier,F.(1991)Glutamine analogues asPotential Antimalarials,.Eur.J.Med.Chem.26,201-5；Koskinen,A.M.P.和Rapoport,H.(1989)Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino AcidAnalogues.J.Org.Chem.54,1859-1866；Christie,B.D.和Rapoport,H.(1985)Synthesis ofOptically Pure Pipecolates from L-Asparagine.Application to the Total Synthesis of(+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization.J.Org. Chem.50:1239-1246；Barton等人,(1987)Synthesis of Novel alpha-Amino-Acids andDerivatives Using Radical Chemistry:Synthesis of L-and D-alpha-Amino-Adipic Acids,L-alpha-aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives.Tetrahedron43:4297-4308；以及Subasinghe等人,(1992)Quisqualic acid analogues:synthesis ofbeta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novelquisqualate-sensitized site.J.Med.Chem.35:4602-7。也参看标题为“Protein Arrays”的美国专利公开案第US 2004/0198637号，其是以引用的方式并入本文中。

A.羰基反应性基团

具有羰基反应性基团的氨基酸允许多种反应以通过亲核加成或醇醛缩合反应与分子（包含但不限于PEG或其它水溶性分子）键联。

例示性含羰基氨基酸可如下表示：

其中n为0-10；R₁为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R₂为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基；且R₃为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，且R₄为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为1，R1为苯基且R₂为简单烷基（即，甲基、乙基或丙基）且酮部分位于烷基侧链的对位。在一些实施例中，n为1，R₁为苯基且R₂为简单烷基（即，甲基、乙基或丙基）且酮部分位于烷基侧链的间位。

对乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸和间乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸的合成描述于Zhang,Z.等人,Biochemistry 42:6735-6746(2003)中，其是以引用的方式并入本文中。其它含羰基氨基酸可由所属领域的一般技术人员类似地制备。

在一些实施例中，包括非天然编码氨基酸的多肽经化学修饰以产生反应性羰基官能团。举例来说，可用于接合反应的醛官能团可由具有相邻氨基和羟基的官能团产生。如果生物活性分子为多肽，那么（例如）N末端丝氨酸或苏氨酸（其可通常存在或可通过化学或酶促消化暴露）可用于在温和氧化性裂解条件下使用高碘酸盐产生醛官能团。例如参看Gaertner等人,Bioconjug.Chem.3:262-268(1992)；Geoghegan,K.和Stroh,J.,Bioconjug.Chem.3:138-146(1992)；Gaertner等人,J.Biol.Chem.269:7224-7230(1994)。然而，在所属技术领域中已知的方法局限于在肽或蛋白质的N末端的氨基酸。

在本发明中，带有相邻羟基和氨基的非天然编码氨基酸可作为“掩蔽”醛官能团并入多肽中。举例来说，5-羟基赖氨酸带有与ε胺相邻的羟基。用于产生醛的反应条件通常涉及在温和条件下添加摩尔过量的偏高碘酸钠以避免在多肽内的其它位点处发生氧化。氧化反应的pH值通常为约7.0。典型反应涉及向多肽的缓冲溶液中添加约1.5摩尔过量的偏高碘酸钠，接着在黑暗中培育约10分钟。例如参看美国专利第6,423,685号，其是以引用的方式并入本文中。

羰基官能团可在温和条件下在水溶液中与含肼、酰肼、羟胺或氨基脲的试剂选择性反应以分别形成在生理条件下稳定的相应腙、肟或缩氨基脲键。例如参看Jencks,W.P.,J.Am.Chem.Soc.81,475-481(1959)；Shao,J.和Tam,J.P.,J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899(1995)。此外，羰基的独特反应性允许在其它氨基酸侧链存在的情况下的选择性修饰。例如参看Cornish,V.W.等人,J.Am.Chem.Soc.118:8150-8151(1996)；Geoghegan,K.F.和Stroh,J.G.,Bioconjug.Chem.3:138-146(1992)；Mahal,L.K.等人,Science276:1125-1128(1997)。

B.肼、酰肼或氨基脲反应性基团

含有亲核基团（诸如肼、酰肼或氨基脲）的非天然编码氨基酸允许与多种亲电子基团反应以形成接合物（包含但不限于与PEG或其它水溶性聚合物反应）。

例示性含肼、酰肼或氨基脲的氨基酸可如下表示：

其中n为0-10；R₁为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基或不存在；X为O、N或S或不存在；R₂为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，且R₃为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。

在一些实施例中，n为4，R₁不存在且X为N。在一些实施例中，n为2，R₁不存在且X不存在。在一些实施例中，n为1，R₁为苯基，X为O，且氧原子位于芳基环上的脂肪族基团的对位。

含酰肼、肼和氨基脲的氨基酸是获自商业来源。举例来说，L-谷氨酸-γ-酰肼是获自Sigma Chemical（St.Louis,MO）。不可购得的其它氨基酸可由所属领域的一般技术人员制备。例如参看美国专利第6,281,211号，其是以引用的方式并入本文中。

含有带有酰肼、肼或氨基脲官能团的非天然编码氨基酸的多肽可与含有醛或具有类似化学反应性的其它官能团的多种分子有效且选择性地反应。例如参看Shao,J.和Tam,J.,J Am.Chem.Soc.117:3893-3899(1995)。与20种常见氨基酸上存在的亲核基团（包含但不限于丝氨酸或苏氨酸的羟基或赖氨酸的氨基以及N末端）相比，酰肼、肼和氨基脲官能团的独特反应性使其对醛、酮和其它亲电子基团的反应性显著更强。

C.含氨氧基的氨基酸

含有氨氧基（也被称作羟胺）的非天然编码氨基酸允许与多种亲电子基团反应形成接合物（包含但不限于与PEG或其它水溶性聚合物反应）。如同肼、酰肼以及氨基脲一样，氨氧基的增强亲核性允许其与含有醛或具有类似化学反应性的其它官能团的多种分子有效且选择性地反应。例如参看Shao,J.和Tam,J.,J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899(1995)；H.Hang和C.Bertozzi,Acc.Chem.Res.34:727-736(2001)。尽管与肼基团反应的结果为相应腙，但氨氧基与含羰基的基团（诸如酮）的反应通常产生肟。

例示性含氨氧基的氨基酸可如下表示：

其中n为0-10；R₁为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；Y=C(O)或不存在；R₂为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，且R₃为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为1，R₁为苯基，X为O，m为1，且Y存在。在一些实施例中，n为2，R₁和X不存在，m为0，且Y不存在。

含氨氧基的氨基酸可由易于获得的氨基酸前体（高丝氨酸、丝氨酸以及苏氨酸）来制备。例如参看M.Carrasco和R.Brown,J.Org.Chem.68:8853-8858(2003)。某些含氨氧基的氨基酸（诸如L-2-氨基-4-(氨氧基)丁酸）已自天然来源分离（Rosenthal,G.,Life Sci.60:1635-1641(1997)）。其它含氨氧基的氨基酸可由所属领域的一般技术人员来制备。

D.叠氮化物以及炔反应性基团

叠氮化物以及炔官能团的独特反应性使其尤其适用于多肽和其它生物分子的选择性修饰。有机叠氮化物（尤其是脂肪族叠氮化物）以及炔通常对常用反应性化学条件稳定。特定来说，叠氮化物与炔官能团对在天然存在多肽中发现的20种常见氨基酸的侧链（即，R基团）呈惰性。然而，当达到紧密接近时，显示出叠氮化物和炔基团的“弹簧负载（spring-loaded）”本质且其通过Huisgen[3+2]环加成反应选择性且有效地反应以产生相应三唑。例如参看Chin J.等人,Science 301:964-7(2003)；Wang,Q.等人,J.Am.Chem.Soc.125,3192-3193(2003)；Chin,J.W.等人,J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027(2002)。

因为Huisgen环加成反应涉及选择性环加成反应（例如参看Padwa,A.,在COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS,第4卷,(Trost,B.M.编,1991),第1069-1109页中；Huisgen,R.在1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry,(Padwa,A.编,1984),第1-176页中）而非亲核取代，所以并入带有含叠氮基和炔侧链的非天然编码氨基酸允许所得多肽在非天然编码氨基酸的位置处经选择性修饰。涉及含叠氮基或炔的hIFN多肽的环加成反应可在催化量的用于将Cu(II)原位还原为Cu(I)的还原剂存在的情况下通过添加Cu(II)（包含但不限于催化量的CuSO₄的形式）在室温下在水性条件下进行。例如参看Wang,Q.等人,J.Am.Chem.Soc.125,3192-3193(2003)；Tornoe,C.W.等人,J.Org.Chem.67:3057-3064(2002)；Rostovtsev等人,Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599(2002)。例示性还原剂包含（包含但不限于）抗坏血酸盐、金属铜、奎宁（quinine）、氢醌、维生素K、谷胱甘肽、半胱氨酸、Fe²⁺、Co²⁺以及所施加电势。

在需要叠氮化物与炔之间的Huisgen[3+2]环加成反应的一些情况下，hIFN多肽包括包含炔部分的非天然编码氨基酸且欲与氨基酸连接的水溶性聚合物包括叠氮基部分。或者，逆向反应（即，在氨基酸上具有叠氮基部分且在水溶性聚合物上存在炔部分）也可进行。

叠氮基官能团也可与含有芳基酯的水溶性聚合物选择性地反应且经芳基膦部分适当官能化以产生酰胺键。芳基膦基团原位还原叠氮基且所得胺随后与最接近的酯键有效反应以产生相应酰胺。例如参看E.Saxon和C.Bertozzi,Science 287,2007-2010(2000)。含叠氮基的氨基酸可为烷基叠氮化物（包含但不限于2-氨基-6-叠氮基-1-己酸）或芳基叠氮化物（对叠氮基-苯丙氨酸）。

例示性含有芳基酯和膦部分的水溶性聚合物可如下表示：

其中X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基，W为水溶性聚合物且R可为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基。例示性R基团包含但不限于-CH₂、-C(CH₃)₃、-OR'、-NR'R"、-SR'、-卤素、-C(O)R'、-CONR'R"、-S(O)₂R'、-S(O)₂NR'R"、-CN以及-NO₂。R'、R″、R'"和R""各自独立地指代氢、经取代或未经取代杂烷基、经取代或未经取代芳基（包含但不限于经1-3个卤素取代的芳基）、经取代或未经取代烷基、烷氧基或硫烷氧基或芳基烷基。当本发明的化合物包含一个以上R基团时，例如，各R基团是如当存在一个以上这些基团时各R'、R"、R″′和R″″基团一样独立地选择。当R'和R"与同一氮原子连接时，其可与氮原子组合以形成5元、6元或7元环。举例来说，-NR'R"打算包含但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据关于取代基的上述论述，所属领域的技术人员应了解术语“烷基”打算包含包括与除氢基之外的基团结合的碳原子的基团，诸如卤烷基（包含但不限于-CF₃和-CH₂CF₃）和酰基（包含但不限于-C(O)CH₃、-C(O)CF₃、-C(O)CH₂OCH₃等等）。

叠氮基官能团也可与含有硫酯的水溶性聚合物选择性反应且经芳基膦部分适当官能化以产生酰胺键。芳基膦基团原位还原叠氮基且所得胺随后与硫酯键有效反应以产生相应酰胺。含有硫酯和膦部分的例示性水溶性聚合物可如下表示：

其中n为1-10；X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基，且W为水溶性聚合物。例示性含炔氨基酸可如下表示：

其中n为0-10；R₁为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10，R₂为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，且R₃为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为1，R₁为苯基，X不存在，m为0且乙炔部分位于烷基侧链的对位。在一些实施例中，n为1，R₁为苯基，X为O，m为1且炔丙基氧基位于烷基侧链的对位（即，O-炔丙基-酪氨酸）。在一些实施例中，n为1，R₁和X不存在且m为0（即，炔丙基甘氨酸）。

含炔氨基酸在市面上有售。举例来说，炔丙基甘氨酸是购自Peptech（Burlington,MA）。或者，可根据标准方法来制备含炔氨基酸。举例来说，可如（例如）Deiters,A.等人,J.Am.Chem.Soc.125:11782-11783(2003)中所述来合成对炔丙基氧基苯丙氨酸，且可如Kayser,B.等人,Tetrahedron 53(7):2475-2484(1997)中所述来合成4-炔基-L-苯丙氨酸。所属领域的一般技术人员可制备其它含炔氨基酸。

例示性含叠氮基的氨基酸可如下表示：

其中n为0-10；R₁为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R₂为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，且R₃为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为1，R₁为苯基，X不存在，m为0且叠氮基部分位于烷基侧链的对位。在一些实施例中，n为0-4且R₁和X不存在，且m=0。在一些实施例中，n为1，R₁为苯基，X为O，m为2且对叠氮基乙氧基部分位于烷基侧链的对位。

含叠氮基的氨基酸可获自商业来源。举例来说，4-叠氮基苯丙氨酸可获自Chem-Impex International,Inc.（Wood Dale,IL）。对于那些不可购得的含叠氮基的氨基酸来说，可相对容易地使用所属领域的一般技术人员已知的标准方法来制备叠氮基，所述方法包含但不限于通过适合离去基（包含但不限于卤离子、甲磺酸根、甲苯磺酸根）置换或通过打开经适当保护的内酯。例如参看March的Advanced Organic Chemistry(第3版,1985,Wiley and Sons,New York)。

E.氨基硫醇反应性基团

β取代氨基硫醇官能团的独特反应性使其极其适用于通过形成噻唑烷来对含有醛基的多肽和其它生物分子进行选择性修饰。例如参看J.Shao和J.Tam,J.Am.Chem.Soc.1995,117(14)3893-3899。在一些实施例中，β取代氨基硫醇氨基酸可并入hIFN多肽中且随后与包括醛官能团的水溶性聚合物反应。在一些实施例中，水溶性聚合物、药物接合物或其它有效负载可通过形成噻唑烷而与包括β取代氨基硫醇氨基酸的hIFN多肽偶合。

非天然氨基酸的细胞吸收

细胞对非天然氨基酸的吸收为设计且选择（包含但不限于）用于并入蛋白质中的非天然氨基酸时通常考虑的一个问题。举例来说，α-氨基酸的高电荷密度表明这些化合物未必可透过细胞。通过以蛋白质为基础的输送系统的集合将天然氨基酸吸收入真核细胞中。可进行迅速筛检，其评估哪种非天然氨基酸（如果存在）是由细胞吸收。例如参看名称为“Protein Arrays”的美国专利公开案第US 2004/0198637号，其是以引用的方式并入本文中；以及Liu,D.R.和Schultz,P.G.(1999)Progress toward the evolution of anorganism with an expanded genetic code.PNAS United States 96:4780-4785中的毒性检定。尽管通过各种检定可容易地分析吸收，但设计适合于细胞吸收路径的非天然氨基酸的替代方案为提供在活体内产生氨基酸的生物合成路径。

非天然氨基酸的生物合成

许多生物合成路径已存在于细胞中以用于产生氨基酸和其它化合物。尽管用于特定非天然氨基酸的生物合成方法在自然界中（包含但不限于在真核细胞中）可能不存在，但本发明提供这些方法。举例来说，非天然氨基酸的生物合成路径是通过添加新酶或改变现有宿主细胞路径视情况在宿主细胞中产生。其它新酶视情况为天然存在的酶或人工发展的酶。举例来说，对氨基苯丙氨酸的生物合成（如在名称为“In vivo incorporation ofunnatural amino acids”的WO 2002/085923中的实例中所呈现）依赖于添加来自其它有机体的已知酶的组合。针对这些酶的基因可通过用包括所述基因的质粒转化细胞而引入真核细胞中。当表达于细胞中时，基因提供合成所需化合物的酶促路径。视情况添加的酶的类型的实例提供于下文实例中。其它酶序列见于（例如）Genbank中。人工发展的酶也以相同方式视情况添加到细胞中。以此方式操纵细胞的细胞机构和资源以产生非天然氨基酸。

多种方法可用于产生用于生物合成路径中或用于发展现有路径的新颖酶。举例来说，如由（包含但不限于）Maxygen,Inc.（可通过万维网在maxygen.com上获得）开发的递归重组视情况用于开发新颖酶和路径。例如参看Stemmer(1994),Rapid evolution ofa protein in vitro by DNA shuffling,Nature 370(4):389-391；以及Stemmer,(1994),DNAshuffling by random fragmentation and reassembly:In vitro recombination for molecularevolution,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,91:10747-10751。类似地，由Genencor（可通过万维网在genencor.com上获得）开发的DesignPath^TM视情况用于代谢路径改造，其包含但不限于改造在细胞中产生O-甲基-L-酪氨酸的路径。此技术使用（包含但不限于）经由功能基因组学以及分子发展和设计鉴别的那些新基因的组合在宿主有机体中重建现有路径。Diversa Corporation（可通过万维网在diversa.com上获得）也提供用于迅速筛检基因文库和基因路径的技术（包含但不限于）以产生新路径。

通常，由本发明的经改造生物合成路径产生的非天然氨基酸是以足以进行有效蛋白质生物合成（包含但不限于天然细胞量），但未达到影响其它氨基酸的浓度或耗尽细胞资源的程度的浓度产生。以此方式在活体内产生的典型浓度为约10mM至约0.05mM。一旦细胞经包括用于产生特定路径所需的酶的基因的质粒转化且产生非天然氨基酸，那么活体内选择视情况用于进一步最优化用于核糖体蛋白质合成与细胞生长的非天然氨基酸的产生。

具有非天然氨基酸的多肽

可出于多种目的进行非天然氨基酸的并入，所述目的包含但不限于定制蛋白质结构和/或功能的改变；改变尺寸、酸度、亲核性、氢键合、疏水性、蛋白酶靶位点的可接近性；靶向部分（包含但不限于，对于蛋白质阵列来说）；添加生物活性分子；连接聚合物；连接放射性核素；调节血清半衰期；调节组织渗透（例如肿瘤）；调节活性输送；调节组织、细胞或器官特异性或分布（例如肝）；调节免疫原性；调节蛋白酶抗性等。可通过hIFN的位点特异性聚乙二醇化来实现信号转导的改变。包含非天然氨基酸的蛋白质可具有增强或甚至全新的催化或生物物理性质。举例来说，视情况通过将非天然氨基酸包含于蛋白质中来改变以下性质：毒性、生物分布、结构性质、光谱性质、化学和/或光化学性质、催化能力、半衰期（包含但不限于血清半衰期）、与其它分子反应的能力（包含但不限于共价或非共价）等等。包含包括至少一个非天然氨基酸的蛋白质的组合物适用于（包含但不限于）新颖疗法、诊断学、催化酶、工业酶、结合蛋白（包含但不限于抗体）以及（包含但不限于）蛋白质结构和功能的研究。例如参看Dougherty,(2000)Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function,Current Opinion in Chemical Biology,4:645-652。

在本发明的一个方面中，组合物包含至少一种具有至少一个（包含但不限于至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个或十个以上）非天然氨基酸的蛋白质。非天然氨基酸可相同或不同，包含但不限于在蛋白质中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或10个以上不同位点可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或10个以上不同非天然氨基酸。在另一方面中，组合物包含其中蛋白质中存在的特定氨基酸中的至少一个（但少于全部）经非天然氨基酸取代的蛋白质。对于具有一个以上非天然氨基酸的给定蛋白质来说，非天然氨基酸可相同或不同（包含但不限于所述蛋白质可包含两个或两个以上不同类型的非天然氨基酸，或可包含两个相同的非天然氨基酸）。对于具有两个以上非天然氨基酸的给定蛋白质来说，非天然氨基酸可相同、不同或为相同种类的多个非天然氨基酸与至少一个不同的非天然氨基酸的组合。

具有至少一个非天然氨基酸的所关注蛋白质或多肽为本发明的特征。本发明也包含使用本发明的组合物和方法产生的具有至少一个非天然氨基酸的多肽或蛋白质。赋形剂（包含但不限于医药学上可接受的赋形剂）也可与蛋白质一起存在。

通过在真核细胞中由至少一个非天然氨基酸来产生所关注蛋白质或多肽，蛋白质或多肽通常应包含真核翻译后修饰。在某些实施例中，蛋白质包含至少一个非天然氨基酸和至少一个在活体内由真核细胞进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰并非由原核细胞进行。举例来说，翻译后修饰包含（包含但不限于）乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化、糖脂键联修饰、糖基化等等。在一方面中，翻译后修饰包含通过GlcNAc-天冬酰胺键联将寡糖（包含但不限于(GlcNAc-Man)₂-Man-GlcNAc-GlcNAc）与天冬酰胺连接。参看表1，其列出真核蛋白的N键联寡糖的一些实例（也可存在其它残基，其未显示）。在另一方面中，翻译后修饰包含通过GalNAc-丝氨酸或GalNAc-苏氨酸键联或GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键联将寡糖（包含但不限于Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等）与丝氨酸或苏氨酸连接。

表1：通过GlcNAc键联的寡糖的实例

在另一方面中，翻译后修饰包含前体（包含但不限于降血钙素前体、降血钙素基因相关肽前体、前甲状旁腺激素原、前胰岛素原、胰岛素原、前阿黑皮素原、阿黑皮素原等等）的蛋白水解处理、组装成多亚单位蛋白或大分子组装、翻译至细胞中的另一位点中（包含但不限于翻译至诸如内质网、高尔基体（Golgi apparatus）、核、溶酶体、过氧物酶体、线粒体、叶绿体、液泡等细胞器中，或通过分泌路径）。在某些实施例中，蛋白质包括分泌或定位序列、附加表位、FLAG标签、聚组氨酸标签、GST融合体等等。以引用的方式并入本文中的美国专利第4,963,495号和第6,436,674号详述经设计以改良hGH多肽分泌的构筑体。

非天然氨基酸的一个优点在于其呈现可用于添加其它分子的其它化学部分。这些修饰可在活体内在真核或非真核细胞中或在活体外进行。因此，在某些实施例中，翻译后修饰是通过非天然氨基酸进行。举例来说，翻译后修饰可通过亲核-亲电子反应进行。目前用于蛋白质的选择性修饰的大多数反应涉及亲核与亲电子反应搭配物之间的共价键形成，其包含但不限于α-卤酮与组氨酸或半胱氨酸侧链的反应。在这些情况下通过蛋白质中亲核残基的数目和可接近性来测定选择性。在本发明的蛋白质中，可使用其它选择性更大的反应，诸如在活体外以及活体内非天然酮基氨基酸与酰肼或氨氧基化合物的反应。例如参看Cornish等人,(1996)J.Am.Chem.Soc,118:8150-8151；Mahal等人,(1997)Science,276:1125-1128；Wang等人,(2001)Science292:498-500；Chin等人,(2002)J.Am. Chem.Soc.124:9026-9027；Chin等人,(2002)Proc.Natl.Acad.Sci..99:11020-11024；Wang等人,(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.,100:56-61；Zhang等人,(2003)Biochemistry,42:6735-6746；以及Chin等人,(2003)Science,301:964-7，其是以引用的方式并入本文中。此允许用包含荧光团、交联剂、糖衍生物以及细胞毒性分子的大量试剂选择性标记几乎任何蛋白质。也参看名称为“Glycoprotein synthesis”的美国专利第6,927,042号，其是以引用的方式并入本文中。翻译后修饰（包含但不限于通过叠氮基氨基酸进行）也可通过施陶丁格连接（Staudinger ligation）（包含但不限于用三芳基膦试剂）进行。例如参看Kiick等人,(2002)Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselectivemodification by the Staudinger ligation,PNAS 99:19-24。

本发明提供用于选择性修饰蛋白质的另一高效方法，其涉及回应选择密码子而将非天然氨基酸（包含但不限于含有叠氮基或炔基部分）遗传并入蛋白质中。这些氨基酸侧链随后可通过（包含但不限于）分别与（包含但不限于）炔基或叠氮基衍生物的Huisgen[3+2]环加成反应（例如参看Padwa,A.Comprehensive Organic Synthesis,第4卷,(1991)Trost,B.M.编,Pergamon,Oxford,第1069-1109页；以及Huisgen,R.1.3-Dipolar Cycloaddition Chemistry,(1984)Padwa,A.编,Wiley,New York,第1-176页）而经修饰。因为此方法涉及环加成而非亲核取代，所以可在极高选择性下对蛋白质进行修饰。通过向反应混合物中添加催化量的Cu(I)盐，可在室温下在水性条件下以出色的区域选择性（1,4>1,5）进行此反应。例如参看Tornoe等人,(2002)J.Org.Chem.67:3057-3064；以及Rostovtsev等人,(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599。可使用的另一方法为在双砷化合物上用四半胱氨酸基元进行配体交换，例如参看Griffin等人,(1998)Science281:269-272。

可通过[3+2]环加成反应加成到本发明的蛋白质中的分子几乎包含具有叠氮基或炔基衍生物的任何分子。分子包含但不限于染料、荧光团、交联剂、糖衍生物、聚合物（包含但不限于聚乙二醇的衍生物）、光交联剂、化学毒性化合物、亲和性标记、生物素的衍生物、树脂、珠粒、第二蛋白质或多肽（或更多）、一种或一种以上聚核苷酸（包含但不限于DNA、RNA等）、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物等等。这些分子可分别加成到具有炔基的非天然氨基酸（包含但不限于对炔丙基氧基苯丙氨酸）或具有叠氮基的非天然氨基酸（包含但不限于对叠氮基-苯丙氨酸）中。

V.包含非遗传编码氨基酸的hIFN多肽的活体内产生

可使用经修饰tRNA和tRNA合成酶在活体内产生本发明的hIFN多肽以加成到在天然存在系统中未编码的氨基酸上或将其取代。

使用在天然存在系统中未编码的氨基酸来产生tRNA和tRNA合成酶的方法描述于（例如）美国专利第7,045,337号（第10/126,927号）和美国专利申请公开案第2003/0108885号（第10/126,931号）中，其是以引用的方式并入本文中。这些方法涉及产生独立于翻译系统（且因此有时被称作“正交”）的内源性合成酶和tRNA起作用的翻译机构。通常，翻译系统包括正交tRNA（O-tRNA）以及正交氨基酰基tRNA合成酶（O-RS）。通常，O-RS优先在翻译系统中使具有至少一个非天然氨基酸的O-tRNA氨基酰基化且O-tRNA识别至少一种未由系统中的其它tRNA识别的选择密码子。因此翻译系统回应经编码的选择密码子而将非天然编码氨基酸插入在系统中产生的蛋白质中，从而将氨基酸“取代”入所编码多肽中的位置中。

在所属技术领域中已描述用于将特定合成氨基酸插入多肽中的多种正交tRNA和氨基酰基tRNA合成酶，且其通常适用于本发明中。举例来说，酮基特异性O-tRNA/氨基酰基-tRNA合成酶描述于Wang,L.等人,Proc.Natl.Acad Sci.USA 100:56-61(2003)以及Zhang,Z.等人,Biochem.42(22):6735-6746(2003)中。例示性O-RS或其部分是由聚核苷酸序列编码且包含美国专利第7,045,337号以及美国专利申请公开案第2003/0108885号中所揭示的氨基酸序列，这些文献各自以引用的方式并入本文中。与O-RS一起使用的相应O-tRNA分子也描述于美国专利第7,045,337号（第10/126,927号）以及美国专利申请公开案第2003/0108885号（第10/126,931号）中，其是以引用的方式并入本文中。

叠氮基特异性O-tRNA/氨基酰基-tRNA合成酶系统的实例描述于Chin,J.W.等人,J，Am.Chem.Soc.124:9026-9027(2002)中。对叠氮基-L-Phe的例示性O-RS序列包含但不限于如美国专利申请公开案第2003/0108885号（第10/126,931号）中所揭示的核苷酸序列SEQ ID NO:14-16和29-32以及氨基酸序列SEQ ID NO:46-48和61-64，所述文献是以引用的方式并入本文中。适用于本发明中的例示性O-tRNA序列包含但不限于如美国专利申请公开案第2003/0108885号（第10/126,931号）中所揭示的核苷酸序列SEQ ID NO:1-3，所述文献是以引用的方式并入本文中。对特定非天然编码氨基酸具特异性的O-tRNA/氨基酰基-tRNA合成酶对的其它实例描述于美国专利第7,045,337号（第10/126,927号）中，其是以引用的方式并入本文中。在酿酒酵母中并入含酮基与含叠氮基氨基酸的O-RS和O-tRNA描述于Chin,J.W.等人,Science 301:964-967(2003)中。

已报导若干种其它正交对。已描述来源于酿酒酵母tRNA和合成酶的谷氨酰胺酰基（例如参看Liu,D.R.和Schultz,P.G.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:4780-4785）、天冬氨酰基（例如参看Pastrnak,M.等人,(2000)Helv.Chim.Acta 83:2277-2286）和酪氨酰基（例如参看Ohno,S.等人,(1998)J.Biochem.(Tokyo,Jpn.)124:1065-1068；以及Kowal,A.K.等人,(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:2268-2273）系统在大肠杆菌中用于潜在并入非天然氨基酸。已描述来源于大肠杆菌谷氨酰胺酰基（例如参看Kowal,A.K.等人,(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:2268-2273）和酪氨酰基（例如参看Edwards,H.和Schimmel,P.(1990)Mol.Cell.Biol.10:1633-1641）合成酶的系统适用于酿酒酵母中。大肠杆菌酪氨酰基系统已用于在活体内在哺乳动物细胞中并入3-碘-L-酪氨酸。参看Sakamoto.K..等人,(2002)Nucleic Acids Res.30:4692-4699。

O-tRNA/氨基酰基-tRNA合成酶的用途涉及选择编码非天然编码氨基酸的特定密码子。尽管可使用任何密码子，但通常希望选择在O-tRNA/氨基酰基-tRNA合成酶表达于其中的细胞中很少或从未使用的密码子。举例来说，例示性密码子包含无义密码子（诸如终止密码子（琥珀、赭石以及蛋白石））、四个或四个以上碱基密码子以及很少或未使用的其它天然三碱基密码子。

可使用所属技术领域中已知的突变诱发方法（包含但不限于位点特异性突变诱发、盒式突变诱发、限制选择突变诱发等）将特定选择密码子引入hIFN聚核苷酸编码序列中的适当位置中。

用于产生可用于并入非天然编码氨基酸的蛋白质生物合成机构的组分（诸如O-RS、O-tRNA以及正交O-tRNA/O-RS对）的方法描述于Wang,L.等人,Science 292:498-500(2001)；Chin,J.W.等人,J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027(2002)；Zhang,Z.等人,Biochemistry 42:6735-6746(2003)中。用于在活体内并入非天然编码氨基酸的方法和组合物描述于美国专利第7,045,337号（第10/126,927号）中，其是以引用的方式并入本文中。用于选择用于有机体的活体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法也描述于美国专利第7,045,337号（第10/126,927号）和美国专利申请公开案第2003/0108885号（第10/126,931号）中，其是以引用的方式并入本文中。名称为“SiteSpecific Incorporation of Keto Amino Acids into Proteins”的PCT公开案第WO 04/035743号（其是以引用的方式全部并入本文中）描述用于并入酮基氨基酸的正交RS和tRNA对。名称为“Expanding the Eukaryotic Genetic Code”的PCT公开案第WO 04/094593号（其是以引用的方式全部并入本文中）描述在真核宿主细胞中并入非天然编码氨基酸的正交RS和tRNA对。

用于产生至少一种重组正交氨基酰基-tRNA合成酶（O-RS）的方法包括：（a）自第一有机体产生来源于至少一种氨基酰基-tRNA合成酶（RS）的（视情况突变）RS的文库，所述第一有机体包含但不限于原核有机体，诸如詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、嗜盐杆菌、大肠杆菌、闪烁古生球菌、嗜热古菌、极端嗜热古菌、超嗜热需氧古生菌、极端嗜热菌（T.thermophilus）等等；或真核有机体；（b）在RS（视情况突变RS）的文库中选择（和/或筛检）在非天然编码氨基酸和天然氨基酸存在的情况下使正交tRNA（O-tRNA）氨基酰基化的成员，从而提供活性（视情况突变）RS的集合；和/或（c）在所述集合中选择（视情况通过阴性选择）在不存在非天然编码氨基酸的情况下优先使O-tRNA氨基酰基化的活性RS（包含但不限于突变RS），从而提供至少一种重组O-RS；其中所述至少一种重组O-RS优先使具有非天然编码氨基酸的O-tRNA氨基酰基化。

在一个实施例中，RS为非活性RS。非活性RS可通过使活性RS突变而产生。举例来说，非活性RS可通过使至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个或至少约10个或10个以上氨基酸突变为不同氨基酸（包含但不限于丙氨酸）来产生。

可使用所属技术领域中已知的各种技术来产生突变RS的文库，这些技术包含但不限于以蛋白质三维RS结构为基础的理性设计或在随机或理性设计技术中RS核苷酸的突变诱发。举例来说，可通过位点特异性突变、随机突变、产生多样性的重组突变、嵌合构筑体、理性设计以及在本文中所述或所属技术领域中已知的其它方法产生突变RS。

在一个实施例中，在RS（视情况突变RS）的文库中选择（和/或筛检）（包含但不限于）在非天然编码氨基酸和天然氨基酸存在的情况下使正交tRNA（O-tRNA）氨基酰基化的活性成员包含：将阳性选择或筛检标记（包含但不限于抗生素抗性基因等等）和（视情况突变）RS的文库引入多个细胞中，其中阳性选择和/或筛检标记包括至少一个选择密码子（包含但不限于琥珀、赭石或蛋白石密码子）；使所述多个细胞在选择剂存在的情况下生长；通过抑制阳性选择或筛检标记中的至少一个选择密码子来鉴别在选择剂和/或筛检剂存在的情况下存活（或显示特异性反应）的细胞，从而提供含有活性（视情况突变）RS的集合的经阳性选择细胞的子集。视情况可改变选择剂和/或筛检剂浓度。

在一方面中，阳性选择标记为氯霉素（chloramphenicol）乙酰基转移酶（CAT）基因且在CAT基因中选择密码子为琥珀终止密码子。视情况，阳性选择标记为β-内酰胺酶基因且在β-内酰胺酶基因中选择密码子为琥珀终止密码子。在另一方面中，阳性筛检标记包括荧光或发光筛检标记或以亲和性为基础的筛检标记（包含但不限于细胞表面标记）。

在一个实施例中，在集合中阴性选择或筛检在不存在非天然编码氨基酸的情况下优先使O-tRNA氨基酰基化的活性RS（视情况突变）包含：将阴性选择或筛检标记与来自阳性选择或筛检的活性（视情况突变）RS的集合引入第二有机体的多个细胞中，其中阴性选择或筛检标记包括至少一个选择密码子（包含但不限于抗生素抗性基因，其包含但不限于氯霉素乙酰基转移酶（CAT）基因）；以及鉴别在补充有非天然编码氨基酸和筛检剂或选择剂的第一培养基中存活或显示特异性筛检反应、但在未补充非天然编码氨基酸和选择剂或筛检剂的第二培养基中不能存活或显示特异性反应的细胞，从而提供具有至少一种重组O-RS的存活细胞或筛检细胞。举例来说，CAT鉴别方案在测定适当O-RS重组体时视情况充当阳性选择和/或阴性筛检。举例来说，视情况在一个或一个以上非天然编码氨基酸存在或不存在的情况下于含有CAT（其包括至少一个选择密码子）的生长板上复制克隆集合。因此认为仅在含有非天然编码氨基酸的平板上生长的菌落含有重组O-RS。在一方面中，改变选择（和/或筛检）剂的浓度。在一些方面中，第一与第二有机体不同。因此，第一和/或第二有机体视情况包括：原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌（archaebacterium）、真细菌（eubacterium）、植物、昆虫、原生生物等。在其它实施例中，筛检标记包括荧光或发光筛检标记或以亲和性为基础的筛检标记。

在另一个实施例中，在集合中筛检或选择（包含但不限于阴性选择）活性（视情况突变）RS包含：自阳性选择步骤（b）分离活性突变RS的集合；将阴性选择或筛检标记和活性（视情况突变）RS的集合引入第二有机体的多个细胞中，其中阴性选择或筛检标记包括至少一个选择密码子（包含但不限于毒性标记基因，其包含但不限于包括至少一个选择密码子的核糖核酸酶barnase基因）；以及鉴别在未补充非天然编码氨基酸的第一培养基中存活或显示特异性筛检反应、但在补充有非天然编码氨基酸的第二培养基中不能存活或显示特异性反应的细胞，从而提供具有至少一种重组O-RS的存活细胞或筛检细胞，其中所述至少一种重组O-RS对非天然编码氨基酸具特异性。在一方面中，所述至少一个选择密码子包括约两个或两个以上选择密码子。这些实施例视情况可包含其中所述至少一个选择密码子包括两个或两个以上选择密码子，且其中第一与第二有机体不同（包含但不限于各有机体视情况为（包含但不限于）原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等）。同样，一些方面包含其中阴性选择标记包括核糖核酸酶barnase基因（其包括至少一个选择密码子）。其它方面包含其中筛检标记视情况包括荧光或发光筛检标记或以亲和性为基础的筛检标记。在本文中的实施例中，筛检和/或选择视情况包含筛检和/或选择严格度的变化。

在一个实施例中，用于产生至少一种重组正交氨基酰基-tRNA合成酶（O-RS）的方法可进一步包括：（d）分离所述至少一种重组O-RS；（e）产生来源于所述至少一种重组O-RS的第二组O-RS（视情况突变）；以及（f）重复步骤（b）和（c）直至获得包括优先使O-tRNA氨基酰基化的能力的突变O-RS。视情况，将步骤（d）-（f）重复（包含但不限于）至少约两次。在一方面中，可通过突变诱发（包含但不限于随机突变诱发、位点特异性突变诱发、重组或其组合）产生来源于至少一种重组O-RS的第二组突变O-RS。

上述方法中选择/筛检步骤（包含但不限于阳性选择/筛检步骤（b）、阴性选择/筛检步骤（c）或阳性与阴性选择/筛检步骤（b）与（c））的严格度视情况包含改变选择/筛检严格度。在另一个实施例中，阳性选择/筛检步骤（b）、阴性选择/筛检步骤（c）或阳性与阴性选择/筛检步骤（b）与（c）包括使用报告基因，其中报告基因是由荧光活化细胞分选（FACS）检测或其中报告基因是由发光检测。视情况，报告基因是展示于细胞表面上、噬菌体展示上等等且根据涉及非天然编码氨基酸或类似物的亲和性或催化活性进行选择。在一个实施例中，突变合成酶是展示于细胞表面上、噬菌体展示上等等。

用于产生重组正交tRNA（O-tRNA）的方法包含：（a）自第一有机体产生来源于至少一种tRNA（包含但不限于抑制tRNA）的突变tRNA文库；（b）在所述文库中选择（包含但不限于阴性选择）或筛检在来自第一有机体的RS不存在的情况下由来自第二有机体的氨基酰基-tRNA合成酶（RS）氨基酰基化的（视情况突变）tRNA，从而提供tRNA（视情况突变）的集合；以及（c）在所述tRNA（视情况突变）集合中选择或筛检由经引入正交RS（O-RS）氨基酰基化的成员，从而提供至少一种重组O-tRNA；其中所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子且并不由来自第二有机体的RS有效识别且由O-RS优先氨基酰基化。在一些实施例中，所述至少一种tRNA为抑制tRNA和/或包括具有天然和/或非天然碱基的独特三碱基密码子，或为无义密码子、稀有密码子、非天然密码子、包括至少4个碱基的密码子、琥珀密码子、赭石密码子或蛋白石终止密码子。在一个实施例中，重组O-tRNA具有正交性的改良。应了解在一些实施例中，O-tRNA无需修饰而视情况自第二有机体引入第一有机体中。在各种实施例中，第一与第二有机体相同或不同且视情况选自（包含但不限于）原核生物（包含但不限于詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、大肠杆菌、嗜盐杆菌等）、真核生物、哺乳动物、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等。另外，重组tRNA是由非天然编码氨基酸视情况氨基酰基化，其中非天然编码氨基酸是在活体内天然生物合成或通过基因操作生物合成。非天然编码氨基酸视情况添加到至少第一或第二有机体的生长培养基中。

在一方面中，在所述文库中选择（包含但不限于阴性选择）或筛检由氨基酰基-tRNA合成酶氨基酰基化的（视情况突变）tRNA（步骤（b））包含：将毒性标记基因和（视情况突变）tRNA文库引入来自第二有机体的多个细胞中，其中毒性标记基因包括至少一个选择密码子（或导致产生毒性剂或抑制剂（static agent）的基因或有机体必需的基因，其中所述标记基因包括至少一个选择密码子）；以及选择存活细胞，其中存活细胞含有包括至少一个正交tRNA或非功能tRNA的（视情况突变）tRNA的集合。举例来说，可通过使用比较比率细胞密度检定来选择存活细胞。

在另一方面中，毒性标记基因可包含两个或两个以上选择密码子。在这些方法的另一个实施例中，毒性标记基因为核糖核酸酶barnase基因，其中核糖核酸酶barnase基因包括至少一个琥珀密码子。核糖核酸酶barnase基因视情况可包含两个或两个以上琥珀密码子。

在一个实施例中，在（视情况突变）tRNA的集合中选择或筛检由经引入正交RS（O-RS）氨基酰基化的成员可包含：将阳性选择或筛检标记基因以及O-RS和（视情况突变）tRNA的集合引入来自第二有机体的多个细胞中，其中阳性标记基因包括药物抗性基因（其包含但不限于β-内酰胺酶基因，其包括至少一个选择密码子，诸如至少一个琥珀终止密码子）或有机体必需的基因或使得毒性剂解毒的基因；以及鉴别在选择剂或筛检剂（包含但不限于抗生素）存在的情况下生长的存活或筛检细胞，从而提供具有至少一种重组tRNA的细胞集合，其中所述至少一种重组tRNA是由O-RS氨基酰基化且回应至少一个选择密码子而将氨基酸插入由阳性标记基因编码的翻译产物中。在另一个实施例中，改变选择剂和/或筛检剂的浓度。

提供用于产生特异性O-tRNA/O-RS对的方法。所述方法包含：（a）自第一有机体产生来源于至少一种tRNA的突变tRNA的文库；（b）在所述文库中阴性选择或筛检在来自第一有机体的RS不存在的情况下由来自第二有机体的氨基酰基-tRNA合成酶（RS）氨基酰基化的（视情况突变）tRNA，从而提供（视情况突变）tRNA的集合；（c）在（视情况突变）tRNA集合中选择或筛检由经引入正交RS（O-RS）氨基酰基化的成员，从而提供至少一种重组O-tRNA。所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子且并不由来自第二有机体的RS有效识别且由O-RS优先氨基酰基化。所述方法也包含（d）自第三有机体产生来源于至少一种氨基酰基-tRNA合成酶（RS）的（视情况突变）RS的文库；（e）在突变RS文库中选择或筛检在非天然编码氨基酸和天然氨基酸存在的情况下优先使至少一种重组O-tRNA氨基酰基化的成员，从而提供活性（视情况突变）RS的集合；以及（f）在所述集合中阴性选择或筛检在非天然编码氨基酸不存在的情况下优先使至少一种重组O-tRNA氨基酰基化的活性（视情况突变）RS，从而提供至少一种特异性O-tRNA/O-RS对，其中所述至少一种特异性O-tRNA/O-RS对包括至少一种对非天然编码氨基酸具特异性的重组O-RS和所述至少一种重组O-tRNA。包含由所述方法产生的特异性O-tRNA/O-RS对。举例来说，特异性O-tRNA/O-RS对可包含（包含但不限于）mutRNATyr-mutTyrRS对，诸如mutRNATyr-SS12TyrRS对、mutRNALeu-mutLeuRS对、mutRNAThr-mutThrRS对、mutRNAGlu-mutGluRS对等等。另外，这些方法包含其中第一与第三有机体相同（其包含但不限于詹氏甲烷球菌）。

在本发明中也包含用于选择用于第二有机体的活体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法。这些方法包含：将标记基因、tRNA和自第一有机体分离或获得的氨基酰基-tRNA合成酶（RS）引入来自第二有机体的第一组细胞中；将标记基因和tRNA引入来自第二有机体的复制细胞组中；以及选择在复制细胞组中不能存活的第一组中的存活细胞或筛检显示特异性筛检反应但在复制细胞组中不能提供这种反应的细胞，其中第一组与复制细胞组是在选择剂或筛检剂存在的情况下生长，其中存活或筛检细胞包括用于第二有机体的活体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对。在一个实施例中，比较和选择或筛检包含活体内互补检定。可改变选择剂或筛检剂的浓度。

本发明的有机体包括多种有机体和多种组合。举例来说，本发明的方法的第一与第二有机体可相同或不同。在一个实施例中，有机体视情况为原核有机体，其包含但不限于詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、嗜盐杆菌、大肠杆菌、闪烁古生球菌、嗜热古菌、极端嗜热古菌、超嗜热需氧古生菌、极端嗜热菌等等。或者，有机体视情况包括真核有机体，其包含但不限于植物（包含但不限于复杂植物，诸如单子叶植物或双子叶植物）、藻类、原生生物、真菌（包含但不限于酵母等）、动物（包含但不限于哺乳动物、昆虫、节肢动物等）等等。在另一个实施例中，第二有机体为原核有机体，其包含但不限于詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、嗜盐杆菌、大肠杆菌、闪烁古生球菌、嗜盐杆菌、嗜热古菌、极端嗜热古菌、超嗜热需氧古生菌、极端嗜热菌等等。或者，第二有机体可为真核有机体，其包含但不限于酵母、动物细胞、植物细胞、真菌、哺乳动物细胞等等。在各种实施例中，第一与第二有机体不同。

VI.非天然存在氨基酸在hIFN多肽中的位置

本发明涵盖将一个或一个以上非天然存在氨基酸并入hIFN多肽中。一个或一个以上非天然存在氨基酸可在不破坏多肽活性的特定位置处并入。此可通过进行“保守性”取代来实现，其包含但不限于用疏水性氨基酸取代疏水性氨基酸、用庞大氨基酸取代庞大氨基酸、用亲水性氨基酸取代亲水性氨基酸和/或在活性不需的位置中插入非天然存在氨基酸。

hIFN的区域可说明如下，其中在hIFN中的氨基酸位置是根据SEQ ID NO:2：

1-9（N末端）、10-21（A螺旋）、22-39（介于A螺旋与B螺旋之间的区域）、40-75（B螺旋）、76-77（介于B螺旋与C螺旋之间的区域）、78-100（C螺旋）、101-110（介于C螺旋与D螺旋之间的区域）、111-132（D螺旋）、133-136（介于D螺旋与E螺旋之间的区域）、137-155（E螺旋）、156-165（C末端）。

可使用多种生物化学和结构方法来选择用于在hIFN多肽内经非天然编码氨基酸取代的所需位点。所属领域的一般技术人员易于了解多肽链的任何位置适于选择以并入非天然编码氨基酸，且选择可基于理性设计或出于任何或无特定所需目的通过随机选择进行。所需位点的选择可用于产生具有任何所需性质或活性的hIFN分子（包含但不限于激动剂、超激动剂、反向激动剂、拮抗剂、受体结合调节剂、受体活性调节剂）、二聚体或多聚体形成、与天然分子相比不改变活性或性质或操纵多肽的任何物理或化学性质，诸如溶解性、聚集或稳定性。举例来说，可使用所属技术领域中已知的点突变分析、丙氨酸扫描或同源物扫描方法来鉴别hIFN多肽的生物活性所需的多肽中的位置。关于IFN，例如参看Di Marco等人,Biochem Biophys Res Com 202:1445(1994)；Walter等人,Cancer Biotherapy&Radiopharm.13:143(1998)；Runkel等人,J.B.C.273:8003(1998)。美国专利第5,580,723号、第5,834,250号、第6,013,478号、第6,428,954号和第6,451,561号（其是以引用的方式并入本文中）描述通过用靶物质鉴别影响多肽活性的活性域来系统分析多肽（诸如hGH）的结构和功能的方法。视多肽所追求的所需活性而定，除由丙氨酸或同源物扫描突变诱发鉴别为对生物活性关键的那些残基之外的残基可为用非天然编码氨基酸取代的良好候选者。或者，仍然视多肽所追求的所需活性而定，经鉴别对生物活性关键的位点也可为用非天然编码氨基酸取代的良好候选者。另一替代方法可为在多肽链上的各位置中用非天然编码氨基酸简单进行连续取代且观察对多肽活性的影响。或者，调节包含伴随目前IFN治疗剂所发现的副作用的IFN的一种或一种以上生物活性的残基可为用非天然编码氨基酸取代的良好候选者。这些副作用包含但不限于嗜中性白血球减少症。或者，调节毒性的残基可为用非天然编码氨基酸取代的良好候选者。这些残基可包含但不限于与类鸦片受体家族的一个或一个以上成员相互作用的残基和/或调节吲哚胺2,3-双加氧酶的诱发的残基。改良抗病毒活性的残基可为用非天然编码氨基酸取代的良好候选者。嵌合hIFN多肽可经设计以将来自limitin的区域或位点并入IFNα中以提供具有保留或改良抗病毒活性和/或经调节副作用和/或经调节毒性的改良hIFN多肽。hIFN中的一个或一个以上残基可经limitin中发现的一个或一个以上残基取代。C-D环中的一个或一个以上残基可为用非天然编码氨基酸取代或其它修饰（包含但不限于用limitin中发现的残基取代IFN中的残基）的良好候选者。hIFN的C-D环中的大多数残基可经limitin中发现的残基取代。可通过在limitin与hIFN的序列、三维结构、二级结构、一种或一种以上生物活性或受体结合之间进行比较来确定用于取代入hIFN中的来自limitin的适合残基。所属领域的一般技术人员易于了解用于选择用于经非天然氨基酸取代入任何多肽中的位置的任何方式、技术或方法适用于本发明中。

也可研究含有缺失的hIFN多肽的天然存在突变体的结构和活性以确定可能容许经非天然编码氨基酸取代的蛋白质区域。以类似方式，蛋白酶消化和单克隆抗体可用于鉴别负责结合hIFN受体的hIFN的区域。一旦消除可能不容许经非天然编码氨基酸取代的残基，就可从hIFN和其结合蛋白质的三维晶体结构来研究在每一剩余位置上的提议取代的影响。hIFN的X射线结晶和NMR结构也可获自蛋白质数据库（Protein Data Bank）（包含1RH2和1ITF）（PDB，通过万维网在rcsb.org上获得）（其为含有大分子蛋白质和核酸的三维结构数据的集中数据库）以及美国专利第5,602,232号；第5,460,956号；第5,441,734号；第4,672,108号中，其是以引用的方式并入本文中。如果不可获得三维结构数据，那么可建立研究多肽的二级和三级结构的模型。因此，所属领域的一般技术人员可容易地鉴别可经非天然编码氨基酸取代的氨基酸位置。

在一些实施例中，本发明的hIFN多肽包括位于不破坏多肽的螺旋或β折叠二级结构的蛋白质区域中的一个或一个以上非天然存在氨基酸。

并入非天然编码氨基酸的例示性残基可为不包含潜在受体结合区（包含但不限于位点I和位点II）的那些残基，其可完全或部分暴露在溶剂中，与附近残基具有最小或无氢键相互作用，可最小程度地暴露于附近反应性残基中且可在如由与其受体结合或未结合的hIFN多肽的三维晶体结构、二级、三级或四级结构所预测的高度可挠性（包含但不限于C-D环）或结构刚性（包含但不限于B螺旋）的区域中。并入非天然编码氨基酸的残基可为调节包含伴随目前IFN治疗剂所发现的副作用的IFN的一种或一种以上生物活性的那些残基。并入非天然编码氨基酸的残基可为调节毒性的那些残基。这些残基包含但不限于涉及与类鸦片受体家族的一个或一个以上成员结合的残基和/或调节吲哚胺2,3-双加氧酶的诱发的残基。

在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是在一个或一个以上对应于IFN的二级结构的以下区域中并入或取代，其中hIFN中的氨基酸位置是根据SEQ ID NO:2：

1-9（N末端）、10-21（A螺旋）、22-39（A螺旋与B螺旋之间的区域）、40-75（B螺旋）、76-77（B螺旋与C螺旋之间的区域）、78-100（C螺旋）、101-110（C螺旋与D螺旋之间的区域）、111-132（D螺旋）、133-136（D螺旋与E螺旋之间的区域）、137-155（E螺旋）、156-165（C末端）。

在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是在（但不限于）hIFN的一个或一个以上下列位置处（如在SEQ ID NO:2中或在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）经取代：在位置1之前（即，在N末端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165或166（即在羧基末端）。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是在IFN中的一个或一个以上下列位置处并入：在位置1之前（即在N末端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、12、13、16、19、20、22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、40、41、42、45、46、48、49、50、51、58、61、64、65、68、69、70、71、73、74、77、78、79、80、81、82、83、85、86、89、90、93、94、96、97、100、101、103、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、117、118、120、121、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137、148、149、152、153、156、158、159、160、161、162、163、164、165、166（即在蛋白质的羧基末端）（如在SEQ ID NO:2中或在其它IFN中的相应氨基酸）。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是在IFN中的一个或一个以上下列位置处并入：6、9、12、13、16、41、45、46、48、49、61、64、65、96、100、101、103、106、107、108、110、111、113、114、117、120、121、149、156、159、160、161和162（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明的IFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：100、106、107、108、111、113、114（SEQ ID NO:2，或其它IFN中的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明的IFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：41、45、46、48、49（SEQ ID NO:2，或其它IFN中的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明的IFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：61、64、65、101、103、110、117、120、121、149（SEQ ID NO:2，或其它IFN中的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明的IFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：6、9、12、13、16、96、156、159、160、161、162（SEQ ID NO:2，或其它IFN中的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明的IFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然存在氨基酸：2、3、4、5、7、8、16、19、20、40、42、50、51、58、68、69、70、71、73、97、105、109、112、118、148、149、152、153、158、163、164、165（SEQ ID NO:2，或其它IFN中的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明的IFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：34、78、107（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，在一个或一个以上这些或其它位置处的非天然编码氨基酸与水溶性聚合物键联，其包含但不限于以下位置：在位置1之前（即，在N末端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165或166（即在羧基末端）（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1、SEQID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，在这些或其它位置处的非天然编码氨基酸与水溶性聚合物键联，其包含但不限于以下位置：在位置1之前（即N末端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、12、13、16、19、20、22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、40、41、42、45、46、48、49、50、51、58、61、64、65、68、69、70、71、73、74、77、78、79、80、81、82、83、85、86、89、90、93、94、96、97、100、101、103、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、117、118、120、121、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137、148、149、152、153、156、158、159、160、161、162、163、164、165、166（即羧基末端）（SEQ ID NO:2，或其它IFN中的相应氨基酸）。在一些实施例中，水溶性聚合物是在一个或一个以上氨基酸位置处偶合：6、9、12、13、16、41、45、46、48、49、61、64、65、96、100、101、103、106、107、108、110、111、113、114、117、120、121、149、156、159、160、161和162（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1、SEQID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，非天然编码氨基酸是在一个或一个以上下列位置处与水溶性聚合物键联：100、106、107、108、111、113、114（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，非天然编码氨基酸是在一个或一个以上下列位置处与水溶性聚合物键联：41、45、46、48、49（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，非天然编码氨基酸是在一个或一个以上下列位置处与水溶性聚合物键联：61、64、65、101、103、110、117、120、121、149（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，非天然编码氨基酸是在一个或一个以上下列位置处与水溶性聚合物键联：6、9、12、13、16、96、156、159、160、161、162（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。

在一些实施例中，在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸与一个或一个以上水溶性聚合物键联：2、3、4、5、7、8、16、19、20、40、42、50、51、58、68、69、70、71、73、97、105、109、112、118、148、149、152、153、158、163、164、165（SEQ ID NO:2，或其中的相应氨基酸或SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸与一个或一个以上水溶性聚合物键联：34、78、107（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，水溶性聚合物与IFN多肽的一个或一个以上下列氨基酸位置处的非天然编码氨基酸偶合：6、9、12、13、16、41、45、46、48、49、61、64、65、96、100、101、103、106、107、108、110、111、113、114、117、120、121、149、156、159、160、161和162（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，水溶性聚合物是在一个或一个以上下列氨基酸位置处与IFN多肽偶合：6、9、12、13、16、41、45、46、48、49、61、64、65、96、100、101、103、106、107、108、110、111、113、114、117、120、121、149、156、159、160、161和162（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，在一个或一个以上这些位置处的非天然编码氨基酸与一个或一个以上水溶性聚合物键联，其中位置为：34、78、107（SEQ ID NO:2，或其中的相应氨基酸或SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明的IFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸从而提供拮抗剂：2、3、4、5、7、8、16、19、20、40、42、50、51、58、68、69、70、71、73、97、105、109、112、118、148、149、152、153、158、163、164、165（SEQ ID NO:2，或其中的相应氨基酸或SEQ ID NO:1、SEQID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）；视所选预期位点和所需活性而定，包括这些取代中的一个的hIFN多肽可潜在地充当弱拮抗剂或弱激动剂。人类IFN拮抗剂包含但不限于在以下位置处具有一个或一个以上非天然编码氨基酸取代的hIFN多肽：22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、74、77、78、79、80、82、83、85、86、89、90、93、94、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137或其任何组合（hIFN；SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。

在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是在（但不限于）hIFN的一个或一个以上下列位置处（如在SEQ ID NO:2中或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）经取代：31、134、34、38、129、36、122、37、121、41、125、124、149、117、39、118、120、107、108、106、100、111、113、114、41、45、46、48、49、61、64、65、101、103、102、110、117、120、121、149、96、6、9、12、13、16、68、70、109、159、161、156、160、162、24、27、78、83、85、87、89、164。在一个实施例中，非天然编码氨基酸是在hIFN的位置38处（如在SEQ ID NO:2中或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）经取代。在一些实施例中，在一个或一个以上这些或其它位置处的非天然编码氨基酸与水溶性聚合物键联，其包含但不限于以下位置：31、134、34、38、129、36、122、37、121,41、125、124、149、117、39、118、120、107、108、106、100、111、113、114、41、45、46、48、49、61、64、65、101、103、102、110、117、120、121、149、96、6、9、12、13、16、68、70、109、159、161、156、160、162、24、27、78、83、85、87、89、164（如在SEQ ID NO:2中或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。

在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是在（但不限于）hIFN的一个或一个以上下列位置处（SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）经取代：在位置1之前（即，在N末端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165或166（即在羧基末端）以及一个或一个以上天然氨基酸取代。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是与水溶性聚合物偶合。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是与PEG偶合。在一个实施例中，天然氨基酸取代为R149Y。在一些实施例中，天然氨基酸取代为R149E。在一些实施例中，天然氨基酸取代为R149S。在一个实施例中，非天然氨基酸取代是在位置107处且天然氨基酸取代为R149Y。在一个实施例中，非天然氨基酸取代在位置106处且天然氨基酸取代为R149Y。在一些实施例中，一个或一个以上天然编码氨基酸取代是在hIFN的一个或一个以上下列位置（SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）处，包含但不限于：10、16、13、79、83、85、86、87、90、91、93、94、96、120、121、124、125、128、149。在一些实施例中，一个或一个以上天然编码氨基酸取代为一个或一个以上下列取代（SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸），其包含但不限于：G10E、M16R、R13E、T79R、K83Q、K83S、Y85L、T86S、E87S、Q90R、Q91E、N93Q、D94V、E96K、R120K、K121T、Q124R、R125G、L128R、R149Y、R149E、R149S。在一些实施例中，天然氨基酸取代是在位置1（N末端）处。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是在hIFN的一个或一个以上下列位置（如在SEQ ID NO:2中，或在其它IFN中的相应氨基酸）处经取代：107、78、34。在一些实施例中，在一个或一个以上这些位置处的非天然编码氨基酸与水溶性聚合物偶合：107、78、34。

在一些实施例中，本发明的IFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸从而提供拮抗剂：2、3、4、5、7、8、16、19、20、40、42、50、51、58、68、69、70、71、73、97、105、109、112、118、148、149、152、153、158、163、164、165或其任何组合（SEQ ID NO:2，或在其它IFN中的相应氨基酸）；视所选位点和所需活性而定，包括这些取代中的一个的hIFN多肽可潜在地充当弱拮抗剂或弱激动剂。人类IFN拮抗剂包含但不限于在以下位置处具有一个或一个以上取代的那些人类IFN拮抗剂：22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、74、77、78、79、80、82、83、85、86、89、90、93、94、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137或其任何组合（hIFN；SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。

在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是在（但不限于）hIFN的一个或一个以上下列位置（如在SEQ ID NO:2中或在其它IFN中的相应氨基酸）处经取代：31、134、34、38、129、36、122、37、121、41、125、124、149、117、39、118、120、107、108、106、100、111、113、114、41、45、46、48、49、61、64、65、101、103、102、110、117、120、121、149、96、6、9、12、13、16、68、70、109、159、161、156、160、162、12、13、24、27、78、83、85、87、89、164。在一个实施例中，非天然编码氨基酸是在hIFN的位置38处（如在SEQ ID NO:2中或在其它IFN中的相应氨基酸）经取代。在一些实施例中，在这些或其它位置处的非天然编码氨基酸与水溶性聚合物键联，其包含但不限于位置：31、134、34、38、129、36、122、37、121、41、125、124、149、117、39、118、120、107、108、106、100、111、113、114、41、45、46、48、49、61、64、65、101、103、102、110、117、120、121、149、96、6、9、12、13、16、68、70、109、159、161、156、160、162、24、27、78、83、85、87、89、164。

在一些实施例中，hIFN多肽包括一个或一个以上非天然编码氨基酸和天然编码氨基酸取代。在一些实施例中，在hIFN多肽中存在的非天然编码氨基酸是与水溶性聚合物键联且hIFN多肽包括一个或一个以上天然编码氨基酸取代。

多种非天然编码氨基酸可经取代或并入hIFN多肽中的给定位置中。一般来说，根据对hIFN多肽与其受体的三维晶体结构的研究来选择用于并入的特定非天然编码氨基酸，优选保守性取代（即，基于芳基的非天然编码氨基酸，诸如对酰基苯丙氨酸或O-炔丙基酪氨酸取代Phe、Tyr或Trp），以及希望引入多肽中的特异性接合化学（例如，如果想实现与带有炔部分的水溶性聚合物的Huisgen[3+2]环加成或与带有（转而）结合膦部分的芳基酯的水溶性聚合物的酰胺键形成，那么引入4-叠氮基苯丙氨酸）。

在一个实施例中，所述方法进一步包含向蛋白质中并入非天然编码氨基酸，其中非天然编码氨基酸包括第一反应性基团；以及使蛋白质与包括第二反应性基团的分子（包含但不限于标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇的衍生物、光交联剂、放射性核素、细胞毒性化合物、药物、亲和性标记、光亲和性标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白质或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、聚核苷酸、DNA、RNA、反义聚核苷酸、糖、水溶性树枝状聚合物、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属的部分、放射性部分、新颖官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光笼蔽部分、光化学辐射可激发部分、可光异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、结合有重原子的部分、可化学裂解的基团、可光裂解的基团、延长的侧链、碳键联的糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、毒性部分、经同位素标记的部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子、量子点、纳米传递素、放射性核苷酸、放射性传递素、中子俘获剂或上述物质的任何组合，或任何其它所需化合物或物质）接触。第一反应性基团与第二反应性基团反应以通过[3+2]环加成将分子与非天然编码氨基酸连接。在一个实施例中，第一反应性基团为炔基或叠氮基部分且第二反应性基团为叠氮基或炔基部分。举例来说，第一反应性基团为炔基部分（包含但不限于在非天然编码氨基酸对炔丙基氧基苯丙氨酸中）且第二反应性基团为叠氮基部分。在另一实例中，第一反应性基团为叠氮基部分（包含但不限于在非天然编码氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸）且第二反应性基团为炔基部分。

在一些情况下，一个或一个以上非天然编码氨基酸取代将与hIFN多肽内的其它添加、取代或缺失组合以影响hIFN多肽的其它生物特性。在一些情况下，其它添加、取代或缺失可增加hIFN多肽的稳定性（包含但不限于耐蛋白水解降解）或增加hIFN多肽对其受体的亲和性。在一些情况下，其它添加、取代或缺失可增加hIFN多肽的溶解性（包含但不限于在表达于大肠杆菌或其它宿主细胞中时）。在一些实施例中，添加、取代或缺失可增加在大肠杆菌或其它重组宿主细胞中表达之后的多肽溶解性。在一些实施例中，选择除用于并入非天然氨基酸的另一位点之外的用于经天然编码或非天然氨基酸取代的位点，其使得在大肠杆菌重组宿主细胞中表达后多肽溶解性增加。在一些实施例中，hIFN多肽包括另一添加、取代或缺失，其调节对hIFN多肽受体的亲和性、调节（包含但不限于增加或降低）受体二聚合、在hIFN受体结合后调节下游信号转导事件、使受体二聚体稳定、调节循环半衰期、调节释放或生物可用性、促进纯化或改良或改变特定投药途径。本发明的hIFN多肽可调节包含在目前IFN治疗剂中所发现的副作用的IFN的一种或一种以上生物活性。本发明的hIFN多肽可调节目前IFN治疗剂中所发现的毒性。类似地，hIFN多肽可包括改良多肽的检测（包含但不限于GFP）、纯化、通过组织或膜输送、前药释放或活化、hIFN尺寸减小或其它特性的化学或酶裂解序列、蛋白酶裂解序列、反应性基团、抗体结合域（包含但不限于FLAG或poly-His）或其它以亲和性为基础的序列（包含但不限于FLAG、poly-His、GST等）或键联分子（包含但不限于生物素）。

在一些实施例中，非天然编码氨基酸的取代产生hIFN拮抗剂。用于并入一个或一个以上非天然编码氨基酸的例示性位点的子集包含：2、3、4、5、7、8、16、19、20、40、42、50、51、58、68、69、70、71、73、97、105、109、112、118、148、149、152、153、158、163、164、165（如在SEQ ID NO:2中或在其它IFN中的相应氨基酸）。用于并入非天然编码氨基酸的例示性位点的另一子集包含：22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、74、77、78、79、80、82、83、85、86、89、90、93、94、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137（hIFN；SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，hIFN拮抗剂包括在区域1-9（N末端）、10-21（A螺旋）、22-39（介于A螺旋与B螺旋之间的区域）、40-75（B螺旋）、76-77（介于B螺旋与C螺旋之间的区域）、78-100（C螺旋）、101-110（介于C螺旋与D螺旋之间的区域）、111-132（D螺旋）、133-136（介于D螺旋与E螺旋之间的区域）、137-155（E螺旋）、156-165（C末端）中的至少一个取代，其使得IFN充当拮抗剂。在其它实施例中，并入非天然编码氨基酸的例示性位点包含螺旋A的氨基末端区域和一部分螺旋C内的残基。在其它实施例中，上述取代是与其它取代组合，使得hIFN多肽为hIFN拮抗剂。在一些实施例中，hIFN拮抗剂包括存在于hIFN分子的受体结合区中的与水溶性聚合物键联的非天然编码氨基酸。

在一些情况下，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上氨基酸经一个或一个以上非天然编码氨基酸取代。在一些情况下，hIFN多肽进一步包含一个或一个以上非天然编码氨基酸对天然存在氨基酸的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上取代。在一些实施例中，在hIFN的以下区域中的一个或一个以上残基经一个或一个以上非天然编码氨基酸取代：1-9（N末端）、10-21（A螺旋）、22-39（介于A螺旋与B螺旋之间的区域）、40-75（B螺旋）、76-77（介于B螺旋与C螺旋之间的区域）、78-100（C螺旋）、101-110（介于C螺旋与D螺旋之间的区域）、111-132（D螺旋）、133-136（介于D螺旋与E螺旋之间的区域）、137-155（E螺旋）、156-165（C末端）。在一些情况下，一个或一个以上非天然编码残基与一个或一个以上较低分子量线性或分枝PEG（质量为约5-20kDa或更小）键联，从而相对于与单一较高分子量PEG连接的物质增强结合亲和性和相当的血清半衰期。

用于在hIFN中并入一个或一个以上非天然编码氨基酸的位点包含以下残基的组合（如在SEQ ID NO:2中或在其它IFN或类干扰素细胞因子中的相应氨基酸）：在位置1之前（即在N末端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、12、13、16、19、20、22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、40、41、42、45、46、48、49、50、51、58、61、64、65、68、69、70、71、73、74、77、78、79、80、81、82、83、85、86、89、90、93、94、96、97、100、101、103、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、117、118、120、121、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137、148、149、152、153、156、158、159、160、161、162、163、164、165、166（即在蛋白质的羧基末端）或其任何组合。用于在hIFN中并入一个或一个以上非天然编码氨基酸的位点包含以下残基的组合（如在SEQ ID NO:2中或在其它IFN或类干扰素细胞因子中的相应氨基酸）：31、134、34、38、129、36、122、37、121、41、125、124、149、117、39、118、120、107、108、106、100、111、113、114、41、45、46、48、49、61、64、65、101、103、102、110、117、120、121、149、96、6、9、16、68、70、109、159、161、156、160、162、12、13、24、27、78、83、85、87、89、164。

VII.在非真核细胞和真核细胞中表达

为获得克隆hIFN聚核苷酸的高水平表达，通常将编码本发明的hIFN多肽的聚核苷酸亚克隆入含有指导转录的强启动子、转录/翻译终止子以及（对于编码蛋白质的核酸来说）用于翻译起始的核糖体结合位点的表达载体中。所属领域的一般技术人员已知适合细菌启动子且其描述（例如）于Sambrook等人以及Ausubel等人中。

用于表达本发明的hIFN多肽的细菌表达系统可获自（包含但不限于）大肠杆菌、芽孢杆菌（Bacillus sp.）、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌和沙门氏菌（Salmonella）（Palva等人,Gene 22:229-235(1983)；Mosbach等人,Nature 302:543-545(1983)）。用于这些表达系统的试剂盒在市面上有售。所属领域的一般技术人员已知用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统且其也在市面上有售。在正交tRNA和氨基酰基tRNA合成酶（上述）用于表达本发明的hIFN多肽的情况下，用于表达的宿主细胞是根据其使用正交组分的能力进行选择。例示性宿主细胞包含革兰氏阳性细菌（包含但不限于短小芽孢杆菌（B.brevis）、枯草杆菌（B.subtilis）或链霉菌（Streptomyces）和革兰氏阴性细菌（大肠杆菌、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌），以及酵母和其它真核细胞。如本文中所述可使用包括O-tRNA/O-RS对的细胞。

本发明的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供合成大有用量的包括非天然氨基酸的蛋白质的能力。在一方面中，组合物视情况包含（包含但不限于）至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、至少500微克、至少1毫克、至少10毫克、至少100毫克、至少1克或更多包括非天然氨基酸的蛋白质，或可通过活体内蛋白质制备方法实现的量（关于重组蛋白制备和纯化的细节提供于本文中）。在另一方面中，蛋白质视情况是以于（包含但不限于）细胞溶菌液、缓冲液、医药缓冲液或其它液体悬浮液（包含但不限于体积（包含但不限于）介于约1nl至约100L或更多之间）中的（包含但不限于）每升至少10微克蛋白质、每升至少50微克蛋白质、每升至少75微克蛋白质、每升至少100微克蛋白质、每升至少200微克蛋白质、每升至少250微克蛋白质、每升至少500微克蛋白质、每升至少1毫克蛋白质、或每升至少10毫克蛋白质或更多的浓度存在于组合物中。在包含至少一个非天然氨基酸的真核细胞中产生大量（包含但不限于大于其它方法（包含但不限于活体外翻译）通常可能获得的量）蛋白质是本发明的特征。

本发明的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供生物合成大有用量的包括非天然氨基酸的蛋白质的能力。举例来说，包括非天然氨基酸的蛋白质可以于细胞提取物、细胞溶菌液、培养基、缓冲液等等中的（包含但不限于）至少10微克/升、至少50微克/升、至少75微克/升、至少100微克/升、至少200微克/升、至少250微克/升或至少500微克/升、至少1毫克/升、至少2毫克/升、至少3毫克/升、至少4毫克/升、至少5毫克/升、至少6毫克/升、至少7毫克/升、至少8毫克/升、至少9毫克/升、至少10毫克/升、至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900毫克/升、1克/升、5克/升、10克/升或更多的蛋白质的浓度制备。

I.表达系统、培养和分离

hIFN多肽可表达于任何数目的适合表达系统（包含（例如）酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞和细菌）中。例示性表达系统的描述提供于下文中。

酵母如本文中所用，术语“酵母”包含能够表达编码hIFN多肽的基因的各种酵母中的任一种。这些酵母包含但不限于产子囊酵母（ascosporogenous yeast）（内孢霉目（Endomycetales））、担孢子酵母（basidiosporogenous）和属于半知菌（芽孢纲（Blastomycetes））类的酵母。产子囊酵母分为两个科：蚀精霉科（Spermophthoraceae）和酵母菌科（Saccharomycetaceae）。后者由四个亚科组成，Schizosaccharomycoideae（例如，裂殖酵母属（Schizosaccharomyces））、拿逊酵母亚科（Nadsonioideae）、Lipomycoideae和Saccharomycoideae（例如，毕赤酵母属（Pichia）、克鲁维酵母属（Kluyveromyces）和酵母属（Saccharomyces）。担孢子酵母包含白冬孢酵母属（Leucosporidium）、红冬孢酵母属（Rhodosporidium）、锁掷酵母属（Sporidiobolus）、线黑粉酵母属（Filobasidium）和香灰拟锁担菌属（Filobasidiella）。属于半知菌（芽孢纲）类的酵母分为两个科：掷孢酵母科（Sporobolomycelaceae）（例如，掷孢酵母属（Sporoholomyces）和布勒掷孢酵母属（Bullera））和隐球酵母科（Cryptococcaceae）（例如，假丝酵母属（Candida））。

用于本发明的尤其关注者为毕赤酵母属、克鲁维酵母属、酵母菌属（Saccharomyces）、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces）、汉逊酵母属（Hansenula）、球拟酵母属（Torulopsis）和假丝酵母属内的物种，其包含但不限于巴斯德毕赤酵母（P.pastoris）、谷勒氏酵母（P.guillerimondii）、酿酒酵母、卡尔斯伯酵母（S.carlsbergensis）、糖化酵母（S.diastaticus）、道格拉斯酵母（S.douglasii）、克鲁维酵母（S.kluyveri）、诺本酵母（S.norbensis）、卵形酵母（S.oviformis）、乳酸克鲁维酵母（K.lactis）、脆壁克鲁维酵母（K.fragilis）、白假丝酵母菌（C.albicans）、麦芽糖假丝酵母（C.maltosa）和汉森酵母（H.polymorpha）。

选择用于表达hIFN多肽的适合酵母是在所属领域的一般技术人员的技能范围内。在选择用于表达的酵母宿主时，适合宿主可包含显示具有（例如）良好分泌能力、低蛋白水解活性、良好分泌能力、良好可溶性蛋白质产生以及总体坚固性的那些酵母宿主。酵母通常可获自多种来源，其包含但不限于Yeast Genetic Stock Center,Department ofBiophysics and Medical Physics,University of California（Berkeley,CA）和American TypeCulture Collection（“ATCC”）（Manassas,VA）。

术语“酵母宿主”或“酵母宿主细胞”包含可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的接受者的酵母。所述术语包含已接受重组载体或其它转移DNA的原始酵母宿主细胞的后代。应了解由于意外或故意突变，单一母体细胞的后代在形态或在与原始母体互补的基因组DNA或总DNA上可能未必完全相同。与由相关性质（诸如存在编码hIFN多肽的核苷酸序列）表征的母体充分类似的母体细胞的后代包含在由此定义意指的后代中。

已开发包含染色体外复制子或整合载体的表达和转化载体以转化入许多酵母宿主中。举例来说，已开发用于以下酵母的表达载体：酿酒酵母（Sikorski等人,Genetics(1989)122:19；Ito等人,J.Bacteriol.(1983)153:163；Hinnen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)75:1929）；白假丝酵母菌（Kurtz等人,Mol.CELL.BIOL.(1986)6:142）；麦芽糖假丝酵母（Kunze等人,J.Basic Microbiol.(1985)25:141）；汉森酵母（Gleeson等人,J.Gen.Microbiol.(1986)132:3459；Roggenkamp等人,Mol.Genetics and genomics(1986)202:302）；脆壁克鲁维酵母(Das等人,J.Bacteriol.(1984)158:1165）；乳酸克鲁维酵母（De Louvencourt等人,J.Bacteriol.(1983)154:737；Van den Berg等人,Biotechnology(NY)(1990)8:135）；谷勒氏酵母（Kunze等人,J.Basic Microbiol.(1985)25:141）；巴斯德毕赤酵母（美国专利第5,324,639号；第4,929,555号；和第4,837,148号；Cregg等人,Mol.Cell.Biol.(1985)5:3376）；粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）（Beach等人,NATURE(1982)300:706）；以及解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）；构巢曲霉（A.nidulans）（Ballance等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.(1983)112:284-89；Tilburn等人,Gene(1983)26:205-221；和Yelton等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81:1470-74）；黑曲霉（A.niger）（Kelly和Hynes,EMBO J.(1985)4:475-479）；T.reesia（EP 0244234）；和诸如脉孢菌（Neurospora）、青霉（Penicillium）、木霉菌（Tolypocladium）（WO 91/00357）的丝状真菌，其中各文献是以引用的方式并入本文中。

所属领域的一般技术人员众所周知用于酵母载体的控制序列且其包含但不限于来自诸如以下基因的启动子区域：诸如醇脱氢酶（ADH）（EP 0 284 044）；烯醇化酶；葡萄糖激酶；葡萄糖-6-磷酸异构酶；甘油醛-3-磷酸-脱氢酶（GAP或GAPDH）；己糖激酶；磷酸果糖激酶；3-磷酸甘油酸变位酶；和丙酮酸激酶（PyK）（EP 0 329 203）。编码酸性磷酸酶的酵母PHO5基因也可提供有用启动子序列（Miyanohara等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80:1）。用于酵母宿主的其它适合启动子序列可包含3-磷酸甘油酸激酶（Hitzeman等人,J.BIOL.Chem.(1980)255:12073）和其它糖解酶（诸如丙酮酸脱羧酶、磷酸丙糖异构酶和磷酸葡萄糖异构酶（Holland等人,Biochemistry(1978)17:4900；Hess等人,J.Adv.Enzyme Reg.(1969)7:149））的启动子。具有由生长条件控制的转录的其它优点的可诱发酵母启动子可包含醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、与氮代谢相关的降解酶以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区域。用于酵母表达中的适合载体和启动子进一步描述于EP 0 073 657中。

酵母增强子也可与酵母启动子一起使用。另外，合成启动子也可充当酵母启动子。举例来说，酵母启动子的上游活化序列（UAS）可与另一酵母启动子的转录活化区域连接，产生合成杂合启动子。这些杂合启动子的实例包含与GAP转录活化区域键联的ADH调节序列。参看美国专利第4,880,734号和第4,876,197号，其是以引用的方式并入本文中。杂合启动子的其它实例包含与诸如GAP或PyK的糖解酶基因的转录活化区域组合的由ADH2、GAL4、GAL10或PHO5基因的调节序列组成的启动子。参看EP 0 164 556。此外，酵母启动子可包含具有与酵母RNA聚合酶结合且起始转录的能力的非酵母来源的天然存在启动子。

可包括酵母表达载体的部分的其它控制元件包含（例如）来自GAPDH或烯醇酶基因的终止子（Holland等人,J.Biol.Chem.(1981)256:1385）。另外，来自2μ质粒来源的复制起点适用于酵母。用于酵母中的适合选择基因为酵母质粒中存在的trp1基因。参看Tschumper等人,Gene(1980)10:157；Kingsman等人,Gene(1979)7:141。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母的突变菌株提供选择标记。类似地，Leu2缺陷型酵母菌株（ATCC 20,622或38,626）是由带有Leu2基因的已知质粒补充。

所属领域的一般技术人员已知将外源DNA引入酵母宿主中的方法，且其通常包含但不限于转化原生质球状体或经碱性阳离子处理的完整酵母宿主细胞。举例来说，可根据Hsiao等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979)76:3829和Van Solingen等人,J.Bact.(1977)130:946中所述的方法来进行酵母的转化。然而，也可如Sambrook等人,MolecularCloning:ALab.Manual (2001)中通常所述使用将DNA引入细胞中的其它方法（诸如通过核注射、电穿孔或原生质体融合）。随后可使用所属领域的一般技术人员已知的标准技术来培养酵母宿主细胞。

所属领域的一般技术人员已知用于在酵母宿主细胞中表达异源蛋白的其它方法。通常参看美国专利公开案第20020055169号；美国专利第6,361,969号；第6,312,923号；第6,183,985号；第6,083,723号；第6,017,731号；第5,674,706号；第5,629,203号；第5,602,034号；和第5,089,398号；美国复查专利第RE37,343号和第RE35,749号；PCT公开专利申请案WO 99/07862；WO 98/37208；和WO 98/26080；欧洲专利申请案EP 0946736；EP 0 732 403；EP 0 480 480；WO 90/10277；EP 0 340 986；EP 0 329 203；EP 0 324274；和EP 0 164 556。也参看Gellissen等人,Antonie Van Leeuwenhoek(1992)62(l-2):79-93；Romanos等人,Yeast(1992)8(6):423-488；Goeddel,Methods in Enzymology(1990)185:3-7，其都是以引用的方式并入本文中。

在使用所属领域的一般技术人员已知的标准进料分批发酵方法的扩增阶段期间，酵母宿主菌株可在发酵罐中生长。发酵方法可经调节以适应特定酵母宿主的碳利用路径或表达控制模式的差异。举例来说，酵母菌酵母宿主的发酵可能需要单一葡萄糖进料、复杂氮源（例如，酪蛋白水解产物）和多种维生素补充。相反，甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母可能需要甘油、甲醇和痕量矿物进料，但仅需要简单铵（氮）盐以进行最佳生长和表达。例如参看美国专利第5,324,639号；Elliott等人,J.Protein Chem.(1990)9:95；和Fieschko等人,Biotech.Bioeng.(1987)29:1113，其是以引用的方式并入本文中。

然而，这些发酵方法可具有与所用酵母宿主菌株无关的某些常见特征。举例来说，在扩增期间，生长限制营养素（通常为碳）可添加到发酵罐中以允许最大生长。另外，发酵方法通常使用经设计含有足够量的碳、氮、基本盐、磷和其它微量营养素（维生素、痕量矿物和盐等）的发酵培养基。适于毕赤酵母使用的发酵培养基的实例描述于美国专利第5,324,639号和第5,231,178号中，其是以引用的方式并入本文中。

感染杆状病毒的昆虫细胞术语“昆虫宿主”或“昆虫宿主细胞”指的是可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的接受者的昆虫。所述术语包含已经转染的原始昆虫宿主细胞的后代。应了解由于意外或故意突变，单一母体细胞的后代在形态或在与原始母体互补的基因组DNA或总DNA上可能未必完全相同。与由相关性质（诸如存在编码hIFN多肽的核苷酸序列）表征的母体充分类似的母体细胞的后代包含在由此定义意指的后代中。

所属领域的一般技术人员已知用于表达hIFN多肽的适合昆虫细胞的选择。若干种昆虫物种在所属技术领域中充分描述且在市面上有售，其包含埃及伊蚊（Aedes aegypti）、桑蚕（Bombyx mori）、黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）、草地贪夜蛾（Spodopterafrugiperda）和粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）。在选择用于表达的昆虫宿主时，适合宿主可包含显示尤其具有良好分泌能力、低蛋白水解活性和总体坚固性的那些宿主。昆虫通常可获自多种来源，其包含但不限于Insect Genetic Stock Center,Department of Biophysicsand Medical Physics,University of California（Berkeley,CA）；和American Type CultureCollection（“ATCC”）（Manassas,VA）。

通常，感染杆状病毒的昆虫表达系统的组分包含：转移载体（通常为细菌质粒），其含有杆状病毒基因组的片段和用于插入欲表达异源基因的的方便限制位点；具有与转移载体中的杆状病毒特异性片段同源的序列的野生型杆状病毒（此允许异源基因同源重组入杆状病毒基因组中）；以及适当昆虫宿主细胞和生长培养基。在所属技术领域中已知在建构载体、转染细胞、挑选斑块、使细胞在培养物中生长等等中所用的材料、方法和技术且可使用描述这些技术的手册。

在将异源基因插入转移载体中之后，载体和野生型病毒基因组经转染入载体和病毒基因组重组于其中的昆虫宿主细胞中。经包裹重组病毒经表达且重组斑块经鉴别且纯化。呈试剂盒形式的杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可购自（例如）InvitrogenCorp.（Carlsbad,CA）。所属领域的一般技术人员通常已知这些技术且其充分描述于Summers and Smith,Texas Agricultural Experiment Station Bulletin第1555期(1987)中，其是以引用的方式并入本文中。也参看RICHARDSON,39METHODS IN MOLECULARBiology:Baculovirus Expression Protocols(1995)；Ausubel等人,Current Protocols inMolecular Biology 16.9-16.11(1994)；King和Possee,The Baculovirus System:ALaboratory Guide(1992)；以及O'Reilly等人,Baculovirus Expression Vectors:A LaboratoryManual(1992)。

实际上，所属领域的一般技术人员已知使用杆状病毒/昆虫细胞表达系统来制备各种异源蛋白质。例如参看美国专利第6,368,825号；第6,342,216号；第6,338,846号；第6,261,805号；第6,245,528号；第6,225,060号；第6,183,987号；第6,168,932号；第6,126,944号；第6,096,304号；第6,013,433号；第5,965,393号；第5,939,285号；第5,891,676号；第5,871,986号；第5,861,279号；第5,858,368号；第5,843,733号；第5,762,939号；第5,753,220号；第5,605,827号；第5,583,023号；第5,571,709号；第5,516,657号；第5,290,686号；WO 02/06305；WO 01/90390；WO 01/27301；WO 01/05956；WO 00/55345；WO 00/20032；WO 99/51721；WO 99/45130；WO 99/31257；WO 99/10515；WO 99/09193；WO 97/26332；WO 96/29400；WO 96/25496；WO 96/06161；WO 95/20672；WO 93/03173；WO 92/16619；WO 92/02628；WO 92/01801；WO 90/14428；WO 90/10078；WO 90/02566；WO 90/02186；WO 90/01556；WO 89/01038；WO 89/01037；WO 88/07082，其是以引用的方式并入本文中。

所属技术领域中已知适用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统中的载体且其包含（例如）自杆状病毒苜蓿银纹夜蛾（Autographa californica）核型多角体病毒（AcNPV）获得的昆虫表达和转移载体，其为不依赖于辅助细胞的病毒表达载体。自此系统得到的病毒表达载体通常使用强病毒多角体蛋白基因启动子以驱动异源基因的表达。通常参看O'Reilly等人,Baculovirus Expression Vectors:A Laboratory Manual(1992)。

在将外来基因插入杆状病毒基因组中之前，包括启动子、前导序列（必要时）、所关注编码序列和转录终止序列的上述组分通常组装入中间错位构筑体（转移载体）中。中间错位构筑体通常保持在能够稳定保持在宿主（诸如细菌）中的复制子（诸如染色体外元件（例如，质粒））中。复制子将具有复制系统，因此允许其保持在用于克隆和扩增的适合宿主中。更特定来说，质粒可含有多角体蛋白聚腺苷酸化信号（Miller,Ann.Rev.Microbiol.(1988)42:177）和用于在大肠杆菌中选择和繁殖的原核抗氨比西林（ampicillin）（amp）基因和复制起点。

一种用于将外来基因引入AcNPV中的常用转移载体为pAc373。所属领域的技术人员已知的许多其它载体也已经设计，其包含（例如）pVL985，其将多角体蛋白起始密码子自ATG改变为ATT，且其在ATT下游32个碱基对处引入BamHI克隆位点。参看Luckow和Summers,Virology 170:31(1989)。其它市售载体包含（例如）PBlueBac4.5/V5-His；pBlueBacHis2；pMelBac；pBlueBac4.5（Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA）。

在插入异源基因之后，转移载体和野生型杆状病毒基因组经共转染入昆虫细胞宿主中。所属技术领域中已知将异源DNA引入杆状病毒中的所需位点中的方法。参看Summers和Smith,Texas Agricultural Experiment Station Bulletin第1555期(1987)；Smith等人,Mol.Cell.Biol.(1983)3:2156；Luckow和Summers,Virology(1989)170:31。举例来说，可通过同源双交叉重组插入诸如多角体蛋白基因的基因中；也可将经改造限制酶位点插入所需杆状病毒基因中。参看Miller等人,Bioessays(1989)11(4):91。

可通过电穿孔来实现转染。参看Trotter和Wood,39Methods in Molecular Biology(1995)；Mann和King,J.Gen.Virol.(1989)70:3501。或者，脂质体可用于以重组表达载体和杆状病毒转染昆虫细胞。例如参看Liebman等人,BIOTECHNIQUES(1999)26(1):36；Graves等人,Biochemistry(1998)37:6050；Nomura等人,J.Biol.Chem.(1998)273(22):13570；Schmidt等人,Protein Expression and Purification(1998)12:323；Siffert等人,Nature Genetics(1998)18:45；Tilkins等人,Cell Biology:A Laboratory Handbook145-154(1998)；Cai等人,Protein Expression and Purification(1997)10:263；Dolphin等人,Nature Genetics(1997)17:491；Kost等人,Gene(1997)190:139；Jakobsson等人,J.Biol.Chem.(1996)271:22203；Rowles等人,J.Biol.chem.(l996)271(37):223/6；Reverey等人,J.Biol.Chem.(1996)271(39):23607-10；Stanley等人,J.Biol.Chem.(1995)270:4121；Sisk等人,J.Virol.(1994)68(2):766；以及Peng等人,BioTechniques(1993)14(2):274。市售脂质体包含（例如）

和

（Invitrogen,Corp.,Carlsbad,CA）。另外，也可使用磷酸钙转染。参看Trotter和Wood,39Methods in Molecular Biology(1995)；Kitts,NAR(1990)18(19):5667；以及Mann和King,J.Gen.Virol.(1989)70:3501。

杆状病毒表达载体通常含有杆状病毒启动子。杆状病毒启动子为能够与杆状病毒RNA聚合酶结合且起始编码序列（例如，结构基因）的下游（3'）转录进入mRNA中的任何DNA序列。启动子将具有通常与编码序列的5'端最接近放置的转录起始区。此转录起始区通常包含RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。杆状病毒启动子也可具有被称作增强子的第二区域，其在存在时通常在结构基因的末梢。此外，表达可经调节或为组成性。

在感染周期末期大量转录的结构基因提供尤其有用的启动子序列。实例包含自编码病毒多面体蛋白的基因（Friesen等人,The Regulation of Baculovirus Gene Expression,在The Molecular Biology of Baculoviruses(1986)中；EP 0 127 839和0 155 476）和编码p10蛋白的基因（Vlak等人,J.GEN.VIROL.(1988)69:765）得到的序列。

新近形成的杆状病毒表达载体经包裹入感染性重组杆状病毒中且随后可通过所属领域的一般技术人员已知的技术来纯化所生长斑块。参看Miller等人,BIOESSAYS(1989)11(4):91；SUMMERS和Smith,Texas Agricultural Experiment Station Bulletin第1555期(1987)。

已开发用于感染入若干种昆虫细胞中的重组杆状病毒表达载体。举例来说，已开发尤其用于埃及伊蚊（ATCC第CCL-125号）、桑蚕（ATCC第CRL-8910号）、黑腹果蝇（ATCC第1963号）、草地贪夜蛾和粉纹夜蛾的重组杆状病毒。参看Wright,Nature(1986)321:718；Carbonell等人,J.Virol.(1985)56:153；Smith等人,Mol.Cell.Biol.(1983)3:2156。通常参看Fraser等人,In Vitro Cell.Dev.Biol.(1989)25:225。更特定来说，用于杆状病毒表达载体系统的细胞系通常包含但不限于Sf9（草地贪夜蛾）（ATCC第CRL-1711号）、Sf21（草地贪夜蛾）（Invitrogen Corp.,目录号11497-013(Carlsbad,CA)）、Tri-368（粉纹夜蛾）和High-Five^TM BTI-TN-5B1-4（粉纹夜蛾）。

用于异源多肽在杆状病毒表达载体中的直接表达和融合表达的细胞和培养基在市面上有售，且所属领域的一般技术人员通常已知细胞培养技术。

大肠杆菌、假单胞菌种和其它原核生物所属领域的一般技术人员已知细菌表达技术。多种载体可用于细菌宿主中。载体可为单拷贝或低或高多拷贝载体。载体可用于克隆和/或表达。鉴于关于载体的丰富文献、许多载体的可购得以及甚至描述载体和其限制酶图谱以及特征的手册，在本文中无需详述。众所周知，载体通常涉及允许选择的标记，这些标记可提供细胞毒性剂抗性、原营养或免疫性。通常存在多个标记，其提供不同特征。

细菌启动子为能够结合细菌RNA聚合酶且起始编码序列（例如结构基因）的下游（3'）转录进入mRNA中的任何DNA序列。启动子将具有通常与编码序列的5'端最接近放置的转录起始区。此转录起始区通常包含RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。细菌启动子也可具有被称作操纵子的第二区域，其可与RNA合成开始的相邻RNA聚合酶结合位点重叠。操纵子允许阴性调节（可诱导）转录，因为基因抑制蛋白可结合操纵子且从而抑制特定基因的转录。在不存在阴性调节元件（诸如操纵子）的情况下可发生组成性表达。另外，通过基因活化蛋白结合序列可实现阳性调节，所述序列在存在时通常最接近RNA聚合酶结合序列的（5'）。基因活化蛋白的实例为代谢产物活化蛋白（CAP），其有助于起始大肠杆菌中lac操纵子的转录[Raibaud等人,Annu.Rev.Genet.(1984)18:173]。调节表达因此可为阳性或阴性，从而增强或减弱转录。

编码代谢路径酶的序列提供尤其有用的启动子序列。实例包含来源于糖代谢酶（诸如半乳糖、乳糖（lac）[Chang等人,Nature(1977)198:1056]以及麦芽糖）的启动子序列。其它实例包含来源于生物合成酶（诸如色氨酸（trp））的启动子序列[Goeddel等人,Nuc.Acids Res.(1980)8:4057；Yelverton等人,Nucl.Acids Res.(1981)9:731；美国专利第4,738,921号；欧洲公开案第036776号以及第121775号，其是以引用的方式并入本文中]。β-半乳糖苷酶（bla）启动子系统[Weissmann(1981)"The cloning of interferon and othermistakes."在Interferon 3(I.Gresser编)中]、噬菌体λPL[Shimatake等人,Nature(1981)292:128]以及T5[美国专利第4,689,406号，其是以引用的方式并入本文中]启动子系统也提供有用的启动子序列。本发明的优选方法利用强启动子（诸如T7启动子）以诱发高含量的hGH多肽。所属领域的一般技术人员已知这些载体的实例且其包含来自Novagen的pET29系列以及WO99/05297（其是以引用的方式并入本文中）中所述的pPOP载体。这些表达系统在宿主中产生高含量的hIFN多肽，而不损害宿主细胞生存能力或生长参数。pET19（Novagen）为所属技术领域中已知的另一种载体。

另外，在自然界中不存在的合成启动子也充当细菌启动子。举例来说，一个细菌或噬菌体启动子的转录活化序列可与另一细菌或噬菌体启动子的操纵子序列连接，从而产生合成杂合启动子[美国专利第4,551,433号，其是以引用的方式并入本文中]。举例来说，tac启动子为由trp启动子与lac操纵子序列组成的杂合trp-lac启动子，其由lac阻遏物调节[Amann等人,Gene(1983)25:167；de Boer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(1983)80:21]。此外，细菌启动子可包含非细菌来源的天然存在启动子，其具有与细菌RNA聚合酶结合且起始转录的能力。非细菌来源的天然存在启动子也可与相容性RNA聚合酶偶合以产生一些基因在原核生物中的高表达水平。噬菌体T7RNA聚合酶/启动子系统为偶合启动子系统的实例[Studier等人,J.Mol.BIOL.(1986)189:113；Tabor等人,Proc Natl.Acad.Sci.(1985)82:1074]。另外，杂合启动子也可由噬菌体启动子和大肠杆菌操纵子区域组成（欧洲公开案第267851号）。

除功能启动子序列之外，有效核糖体结合位点也适用于在原核生物中表达外来基因。在大肠杆菌中，核糖体结合位点被称作Shine-Dalgarno（SD）序列且包含起始密码子（ATG）和位于起始密码子上游3-11个核苷酸处的长度为3-9个核苷酸的序列[Shine等人,Nature(1975)254:34]。认为SD序列通过SD序列与大肠杆菌16S rRNA的3'端之间的碱基配对来促进mRNA与核糖体的结合[Steitz等人,"Genetic signals and nucleotidesequences in messenger RNA",在Biological Regulation and Development:GeneExpression(Ed.R.F.Goldberger,1979)中]。为表达具有弱核糖体结合位点的真核基因和原核基因[Sambrook等人,"Expression of cloned genes in Escherichia coli",MolecularCloning:A Laboratory Manual,1989]。

术语“细菌宿主”或“细菌宿主细胞”指的是可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的接受者的细菌。所述术语包含已经转染的原始细菌宿主细胞的后代。应了解由于意外或故意突变，单一母体细胞的后代在形态或在与原始母体互补的基因组DNA或总DNA上可能未必完全相同。与由相关性质（诸如存在编码hIFN多肽的核苷酸序列）表征的母体充分类似的母体细胞的后代包含在由此定义意指的后代中。

所属领域的一般技术人员已知用于表达hIFN多肽的适合宿主细菌的选择。在选择用于表达的细菌宿主时，适合宿主可包含显示尤其具有良好包涵体形成能力、低蛋白水解活性以及总体坚固性的那些宿主。细菌宿主通常可获自多种来源，其包含但不限于Bacterial Genetic Stock Center,Department of Biophysics and Medical Physics,UniversityofCalifornia（Berkeley,CA）；以及American Type Culture Collection（“ATCC”）（Manassas,VA）。工业/医药发酵通常使用来源于K菌株（例如W3110）的细菌或来源于B菌株（例如BL21）的细菌。这些菌株尤其有用，因为其生长参数众所周知且坚固。另外，这些菌株为非病原性的，出于安全性和环境原因，其在商业上为重要的。适合大肠杆菌宿主的其它实例包含但不限于BL21、DH10B或其衍生物的菌株。在本发明的方法的另一实施例中，大肠杆菌宿主为蛋白酶缺乏菌株，其包含但不限于OMP-和LON-。宿主细胞株可为假单胞菌种，包含但不限于荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌以及恶臭假单胞菌。已知荧光假单胞菌生物型1（命名为菌株MB 101）适用于重组制备且可用于治疗性蛋白质的制备过程。假单胞菌表达系统的实例包含以宿主菌株形式获自Dow Chemical Company的系统（Midland,MI，可通过万维网在dow.com上获得）。美国专利第4,755,465号和第4,859,600号（其是以引用的方式并入本文中）描述假单胞菌菌株作为用于hGH制备的宿主细胞的用途。

一旦形成重组宿主细胞株（即，表达构筑体已经引入宿主细胞中且分离具有合适表达构筑体的宿主细胞），那么重组宿主细胞株即在适于制备hIFN多肽的条件下培养。所属领域的技术人员将了解，重组宿主细胞株的培养方法将依赖于所利用的表达构筑体的性质以及宿主细胞的特点。通常使用所属领域的一般技术人员已知的方法来培养重组宿主菌株。重组宿主细胞通常是在含有可吸收的碳源、氮源以及无机盐源且视情况含有维生素、氨基酸、生长因子和所属领域的一般技术人员已知的其它蛋白质培养补充物的液体培养基中培养。用于培养宿主细胞的液体培养基可视情况含有抗生素或抗真菌剂以防止不需的微生物和/或化合物（包含但不限于用于选择含有表达载体的宿主细胞的抗生素）的生长。

重组宿主细胞可以分批或连续模式培养，其中细胞收集（在hIFN多肽在细胞内积聚的情况下）或培养物上层清液的收集为分批或连续模式。对于在原核宿主细胞中的制备来说，优选分批培养和细胞收集。

本发明的hIFN多肽通常在于重组系统中表达之后纯化。Voss等人,Biochem J.(1994)298:719-725；Rosendahl等人,Bioconjugate Chem(2005)16:200-207；Swaminathan等人,Protein Expression and Purification (1999)15:236-242；以及Neves等人,Protein Expressionand Purification (2004)35:353-359（其是以引用的方式并入本文中）描述表达、纯化、分离和表征重组干扰素的方法。hIFN多肽可通过所属技术领域中已知的多种方法自宿主细胞或培养基纯化。在细菌宿主细胞中产生的hIFN多肽可溶性较差或不可溶（呈包涵体形式）。在本发明的一个实施例中，使用本文中揭示的方法以及所属技术领域中已知的那些方法，可容易地在为增加重组制备蛋白质的溶解性的目的而选择的hIFN多肽中进行氨基酸取代。在不溶性蛋白质的情况下，可通过离心自宿主细胞溶菌液收集蛋白质，且其后可接着进行细胞的均质化。在可溶性不良的蛋白质的情况下，可添加包含但不限于聚乙烯亚胺（PEI）的化合物以诱发部分可溶性蛋白质的沉淀。随后可通过离心方便地收集沉淀蛋白。使用所属领域的一般技术人员已知的多种方法，可使重组宿主细胞破裂或均质化以自细胞内释放包涵体。可使用众所周知技术来进行宿主细胞破裂或均质化，这些技术包含但不限于酶促细胞破裂、超声波降解法、杜恩斯均质化（douncehomogenization）或高压释放破裂。在本发明方法的一个实施例中，高压释放技术是用于使大肠杆菌宿主细胞破裂以释放hIFN多肽的包涵体。在处理hIFN多肽的包涵体时，最小化重复的均质化时间以最大化包涵体产率可为有利的，由于诸如溶解、机械剪切或蛋白质水解的因素，其不造成损失。

随后可使用所属技术领域中已知的众多适合溶解剂中的任一种来溶解不溶性或沉淀hIFN多肽。hIFN多肽可经尿素或盐酸胍溶解。溶解hIFN多肽-BP的体积应最小化以使得可使用可方便操作的批量大小制备大批量。在其中重组宿主可以体积为数千升的批量生长的大规模商业装置中，这个因素可为重要的。另外，当在大规模商业装置中制造hIFN多肽时，特别是对于人类医药用途来说，如果可能的话，那么应避免可损害机器和容器的苛刻化学品或其蛋白质产物。在本发明的方法中已展示较温和变性剂尿素可代替较苛刻变性剂盐酸胍用于溶解hIFN多肽包涵体。尿素的使用显著降低损害在hIFN多肽的制造和纯化过程中使用的不锈钢设备的风险，同时有效溶解hIFN多肽包涵体。

在可溶性hIFN蛋白的情况下，hIFN可分泌入周质空间或培养基中。另外，可溶性hIFN可存在于宿主细胞的细胞质中。可能需要在进行纯化步骤之前浓缩可溶性hIFN。所属领域的一般技术人员已知的标准技术可用于自（例如）细胞溶菌液或培养基浓缩可溶性hIFN。另外，所属领域的一般技术人员已知的标准技术可用于破裂宿主细胞且自宿主细胞的细胞质或周质空间释放可溶性hIFN。

当制备呈融合蛋白形式的hIFN多肽时，可移除融合序列。可通过酶促或化学裂解来实现融合序列的移除。可使用所属领域的一般技术人员已知的方法来实现融合序列的酶促移除。如所属领域的一般技术人员所了解，用于移除融合序列的酶的选择将由融合的特点决定，且反应条件将由酶的选择指定。可使用所属领域的一般技术人员已知的试剂（包含但不限于溴化氰、TEV蛋白酶和其它试剂）来实现化学裂解。可通过所属领域的一般技术人员已知的方法自裂解的融合序列来纯化裂解hIFN多肽。如所属领域的技术人员所了解，这些方法将由融合序列和hIFN多肽的特点和性质决定。纯化方法可包含但不限于尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱、离子交换色谱或透析或其任何组合。

hIFN多肽也可经纯化以自蛋白质溶液移除DNA。DNA可通过所属技术领域中已知的任何适合方法（诸如沉淀或离子交换色谱）来移除，但可通过用核酸沉淀剂（诸如（但不限于）硫酸鱼精蛋白）沉淀来移除。可使用包含但不限于离心或过滤的标准众所周知方法自沉淀DNA分离hIFN多肽。宿主核酸分子的移除在其中hIFN多肽欲用于治疗人类的装置中为重要因素且本发明的方法将宿主细胞DNA降至医药学上可接受的含量。

用于小规模或大规模发酵的方法也可用于蛋白质表达中，所述方法包含但不限于发酵罐、振荡烧瓶、流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶培养系统以及搅拌槽生物反应器系统。这些方法中的每一种都可以分批式、流加式或连续式模式过程进行。

通常可使用所属技术领域中的标准方法来回收本发明的人类hIFN多肽。举例来说，培养基或细胞溶菌液可经离心或过滤以移除细胞碎片。上层清液可经浓缩或稀释至所需体积或透滤入适合缓冲液中以适应用于进一步纯化的制剂。本发明的hIFN多肽的进一步纯化包含自完整形式分离脱酰氨化、剪短、乙酰化和氧化形式的hIFN多肽变体。

以下例示性程序中的任一种都可用于纯化本发明的hIFN多肽：亲和色谱；阴离子或阳离子交换色谱（使用（包含但不限于）DEAE SEPHAROSE）；硅胶色谱；高效液相色谱（HPLC）；反相HPLC；凝胶过滤（使用（包含但不限于）SEPHADEX G-75）；疏水相互作用色谱；尺寸排阻色谱；金属螯合物色谱；超滤/透滤；乙醇沉淀；硫酸铵沉淀；色谱聚焦；置换色谱；电泳程序（包含但不限于制备型等电聚焦）、差示溶解度（包含但不限于硫酸铵沉淀）、SDS-PAGE或萃取。"Protein Purification"(1998)Janson et Ryden编(A.John Wiley and Sons,Inc.Publishers)描述各种色谱和电泳方法以及可在用于最优化纯化流程的各方法内进行的更改。

根据所属领域的技术人员已知且所用的标准程序，本发明的蛋白质（包含但不限于包括非天然氨基酸的蛋白质）、包括非天然氨基酸的蛋白质的抗体、包括非天然氨基酸的蛋白质的结合搭配物等可部分或实质上经纯化至均质。因此，可通过所属领域的一般技术人员已知的众多方法中的任一种来回收和纯化本发明的多肽，这些方法包含但不限于硫酸铵或乙醇沉淀、酸或碱萃取、柱色谱、亲和柱色谱、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、羟基磷灰石色谱、外源凝集素色谱、凝胶电泳等等。必要时，在制备正确折叠成熟蛋白质时可使用蛋白质再折叠步骤。高效液相色谱（HPLC）、亲和色谱或其它适合方法可用于需要高纯度的最后纯化步骤中。在一个实施例中，将针对非天然氨基酸（或包括非天然氨基酸的蛋白质）形成的抗体用作纯化试剂（包含但不限于）以用于包括一个或一个以上非天然氨基酸的蛋白质的以亲和性为基础的纯化。必要时，一旦纯化（部分或至均质），多肽即视情况用于多种应用，其包含但不限于作为检定组分、治疗剂、预防剂、诊断剂、研究试剂和/或作为用于抗体产生的免疫原。

除了本文中指出的其它参考文献之外，所属领域的一般技术人员已知多种纯化/蛋白质折叠方法，其包含但不限于在以下文献中列出的那些：R.Scopes,Protein Purification.Springer-Verlag,N.Y.(1982)；Deutscher,Methods in Enzymology第182卷:Guide to Protein Purification,Academic Press,Inc.N.Y.(1990)；Sandana,(1997)Bioseparation of Proteins.Academic Press,Inc.；Bollag等人,(1996)Protein Methods,第2版Wiley-Liss,NY；Walker,(1996)The Protein Protocols Handbook Humana Press,NJ；Harris和Angal,(1990)Protein Purification Applications:A Practical ApproachIRL Press at Oxford,Oxford,England；Harris和Angal,Protein Purification Methods:A Practical Approach IRL Press atOxford,Oxford,England；Scopes,(1993)Protein Purification:Principles and Practice第3 版Springer Verlag,NY；Janson和Ryden,(1998)Protein Purification:Principles,High Resolution Methods and Applications，第2版Wiley-VCH,NY；以及Walker(1998),Protein Protocols on CD-ROM Humana Press,NJ；以及其中引用的参考文献。

在真核宿主细胞或非真核宿主细胞中用非天然氨基酸产生所关注蛋白质或多肽的一个优点在于通常蛋白质或多肽将折叠为其天然构象。然而，在本发明的某些实施例中，所属领域的技术人员应认识到，在合成、表达和/或纯化之后，蛋白质可具有与相关多肽的所需构象不同的构象。在本发明的一个方面中，经表达蛋白质或多肽视情况经变性且随后复性。这是利用所属技术领域中已知的方法来实现，所述方法包含但不限于通过向所关注蛋白质或多肽中添加伴侣蛋白（chaperonin）、通过将蛋白质溶解于诸如盐酸胍的离液剂中、利用蛋白质二硫化物异构酶等。

一般来说，有时候需要变性且还原表达多肽且随后使多肽再折叠成优选构象。举例来说，胍、尿素、DTT、DTE和/或伴侣蛋白可添加到所关注的翻译产物中。所属领域的一般技术人员已知还原、变性和复性蛋白质的方法（参看上述参考文献以及Debinski等人,(1993)J.Biol.Chem.,268:14065-14070；Kreitman和Pastan(1993)Bioconjug.Chem.,4:581-585；以及Buchner等人,(1992)Anal.Biochem.,205:263-270）。例如，Debinski等人描述胍-DTE中包涵体蛋白质的变性和还原。蛋白质可再折叠入含有（包含但不限于）氧化谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化还原缓冲液中。再折叠试剂可流动或以其它方式移动以与一种或一种以上多肽或其它表达产物接触，或反之亦然。

在原核制备hIFN多肽的情况下，如此产生的hIFN多肽可能错折叠且因而缺乏生物活性或具有降低的生物活性。可通过“再折叠”来恢复蛋白质的生物活性。一般来说，通过使用（例如）一种或一种以上离液剂（例如尿素和/或胍）和能够还原二硫键的还原剂（例如二硫苏糖醇、DTT或2-巯基乙醇（2-ME））溶解（其中hIFN多肽也为不溶性的）、展开且还原多肽链而将错折叠hIFN多肽再折叠。在中等浓度的离液剂下，随后添加氧化剂（例如，氧、胱氨酸或胱胺），其允许再形成二硫键。可使用所属技术领域中已知的标准方法将hIFN多肽再折叠，这些方法为诸如在美国专利第4,511,502号、第4,511,503号和第4,512,922号中所述的那些方法，所述文献是以引用的方式并入本文中。hIFN多肽也可与其它蛋白质共折叠以形成异二聚体或异多聚体。

在再折叠之后，hIFN可经进一步纯化。可使用所属领域的一般技术人员已知的多种技术实现hIFN的纯化，这些技术包含疏水相互作用色谱、尺寸排阻色谱、离子交换色谱、反相高效液相色谱、亲和色谱等等或其任何组合。其它纯化也可包含经纯化蛋白质的干燥或沉淀步骤。

在纯化后，hIFN可交换入不同缓冲液中和/或通过所属技术领域中已知的多种方法（包含但不限于透滤和透析）中的任一种浓缩。以单一纯化蛋白质形式提供的hIFN可经历聚集和沉淀。

经纯化hIFN可为至少90%纯（如由反相高效液相色谱（RP-HPLC）或十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）所测量）、或至少95%纯、或至少98%纯、或至少99%或更纯。不考虑hIFN的纯度的确切数值，hIFN足够纯以用作医药产品或用于进一步处理（诸如与诸如PEG的水溶性聚合物接合）。

在不存在其它活性成分或蛋白质（除赋形剂、载剂和稳定剂、血清白蛋白等等之外）的情况下，某些hIFN分子可用作治疗剂，或其可与另一种蛋白质或聚合物复合。

通用纯化方法可对包括hIFN多肽的细胞溶菌液、提取物、培养基、包涵体、宿主细胞的周质空间、宿主细胞的细胞质或其它材料或由任何分离步骤得到的任何hIFN多肽混合物进行多种分离步骤中的任一种，所述任何分离步骤包含但不限于亲和色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱、凝胶过滤色谱、高效液相色谱（“HPLC”）、反相-HPLC（“RP-HPLC”）、膨胀床吸附或其任何组合和/或重复且以任何适当次序。

用于实施本文中所述技术的设备和其它必要材料在市面上有售。泵、馏分收集器、监控器、记录器以及整个系统可获自（例如）Applied Biosystems（Foster City，CA）、Bio-RadLaboratories,Inc.（Hercules,CA）以及Amersham Biosciences,Inc.（Piscataway，NJ）。包含但不限于交换基质材料、培养基以及缓冲液的色谱材料也可获自这些公司。

使用专用设备（诸如泵）可更迅速地实现平衡以及在本文中所述的柱色谱过程中的其它步骤（诸如洗涤和洗提）。市售泵包含但不限于

泵P-50、蠕动泵P-1、泵P-901和泵P-903（Amersham Biosciences,Piscataway,NJ）。

馏分收集器的实例包含RediFrac馏分收集器、FRAC-100和FRAC-200馏分收集器以及

馏分收集器（Amersham Biosciences,Piscataway,NJ）。混合器也可用于形成pH值和线性浓度梯度。市售混合器包含梯度混合器GM-1和管道混合器（Amersham Biosciences,Piscataway,NJ）。

可使用任何市售监控器来监控色谱过程。这些监控器可用于收集如UV、pH值以及传导率的信息。检测器的实例包含监控器UV-1、S II、监控器UV-M II、监控器UV-900、监控器UPC-900、监控器pH/C-900以及传导率监控器（AmershamBiosciences,Piscataway,NJ）。实际上，整个系统在市面上有售，其包含来自AmershamBiosciences（Piscataway,NJ）的各种

系统。

在本发明的一个实施例中，例如，可通过首先在尿素中使所得纯化hIFN多肽变性，接着在适合pH值下稀释于含有还原剂（诸如DTT）的TRIS缓冲液中来还原hIFN多肽且使其变性。在另一个实施例中，hIFN多肽是以约2M至约9M的浓度范围于尿素中变性，接着在约5.0至约8.0的范围内的pH值下于TRIS缓冲液中稀释。随后可培育这个实施例的再折叠混合物。在一个实施例中，再折叠混合物在室温下培育4小时至24小时。随后可将还原且变性hIFN多肽混合物进一步分离或纯化。

如本文中所述，在进行任何随后分离步骤之前，可调节第一hIFN多肽混合物的pH值。另外，可使用所属技术领域中已知的技术来浓缩第一hIFN多肽混合物或其任何随后混合物。此外，可使用所属领域的一般技术人员已知的技术将包括第一hIFN多肽混合物或其任何随后混合物的洗提缓冲液交换为适用于下个分离步骤的缓冲液。

离子交换色谱在一个实施例中，且作为可选的额外步骤，可对第一hIFN多肽混合物进行离子交换色谱。通常参看Ion Exchange Chromatography:Principles and Methods（目录号18-1114-21,Amersham Biosciences(Piscataway,NJ)）。市售离子交换柱包含

和

柱（Amersham Biosciences,Piscataway,NJ）。这些柱利用强阴离子交换剂，诸如Q

Fast Flow、Q

High Performance和Q

XL；强阳离子交换剂，诸如SP

High Performance、SP

Fast Flow和SP

XL；弱阴离子交换剂，诸如DEAE

Fast Flow；以及弱阳离子交换剂，诸如CM

Fast Flow（Amersham Biosciences,Piscataway,NJ）。可在纯化过程的任何阶段对hIFN多肽进行阴离子或阳离子交换柱色谱以分离实质上经纯化的hIFN多肽。可使用任何适合阳离子交换基质来进行阳离子交换色谱步骤。有用的阳离子交换基质包含但不限于纤维状、多孔、无孔、微粒、珠粒或交联阳离子交换基质材料。这些阳离子交换基质材料包含但不限于纤维素、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、二氧化硅、聚醚或任何上述物质的复合物。

在hIFN多肽吸附于阳离子交换剂基质上之后，可通过使基质与具有足够高pH值或离子强度的缓冲液接触以自基质置换hIFN多肽来洗提实质上经纯化的多肽。用于实质上经纯化hIFN多肽的高pH值洗提中的适合缓冲液包含但不限于浓度在至少约5mM至至少约100mM的范围内的柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、HEPES以及MES缓冲液。

反相色谱可根据所属领域的一般技术人员已知的适合方案进行RP-PIPLC以纯化蛋白质。例如参看Pearson等人,Anal BIOCHEM.(1982)124:217-230(1982)；Rivier等人,J.Chrom.(1983)268:112-119；Kunitani等人,J.Chrom.(1986)359:391-402。可对hIFN多肽进行RP-HPLC以分离实质上经纯化的hIFN多肽。在这方面，可使用具有多种长度（包含但不限于至少约C₃至至少约C₃₀、至少约C₃至至少约C₂₀或至少约C₃至至少约C₁₈）的烷基官能团的二氧化硅衍生树脂。或者，可使用聚合物树脂。举例来说，可使用TosoHaas Amberchrome CG1000sd树脂，其为苯乙烯聚合物树脂。也可使用具有多种烷基链长度的氰基或聚合物树脂。此外，可用诸如乙醇的溶剂洗涤RP-HPLC柱。Source RP柱为RP-HPLC柱的另一个实例。

含有离子配对剂和有机改质剂（诸如甲醇、异丙醇、四氢呋喃、乙腈或乙醇）的适合洗提缓冲液可用于自RP-HPLC柱洗提hIFN多肽。最常用离子配对剂包含但不限于乙酸、甲酸、高氯酸、磷酸、三氟乙酸、七氟丁酸、三乙胺、四甲基铵、四丁基铵、乙酸三乙基铵。可使用一种或一种以上梯度或等度条件来进行洗提，其中优选减少分离时间且降低峰宽度的梯度条件。另一种方法涉及使用具有不同溶剂浓度范围的两种梯度。用于本文中的适合洗提缓冲液的实例可包含但不限于乙酸铵和乙腈溶液。

疏水相互作用色谱纯化技术可对hIFN多肽进行疏水相互作用色谱（HIC）。通常参看Hydrophobic Interaction Chromatography Handbook:Principles and Methods（目录号18-1020-90,Amersham Biosciences(Piscataway,NJ)），其是以引用的方式并入本文中。适合HIC基质可包含但不限于经烷基或芳基取代的基质，诸如经丁基、己基、辛基或苯基取代的基质，所述基质包含琼脂糖、交联琼脂糖、琼脂糖凝胶、纤维素、二氧化硅、葡聚糖、聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸酯)基质以及混合模式树脂（包含但不限于聚乙烯胺树脂或经丁基或苯基取代的聚(甲基丙烯酸酯)基质）。疏水相互作用柱色谱的市售来源包含但不限于

和

柱（Amersham Biosciences,Piscataway,NJ）。

简单地说，在装载之前，可使用所属领域的一般技术人员已知的标准缓冲液（诸如乙酸/氯化钠溶液或含有硫酸铵的HEPES）来平衡HIC柱。硫酸铵可用作用于装载HIC柱的缓冲液。在装载hIFN多肽后，随后可使用标准缓冲液和条件来洗涤柱以移除不需要的物质，但将hIFN多肽留在HIC柱上。可用约3至约10倍柱体积的标准缓冲液（诸如含有EDTA和浓度低于平衡缓冲液的硫酸铵的HEPES缓冲液，或乙酸/氯化钠缓冲液）来洗提hIFN多肽。使用（例如）磷酸钾梯度的降低的线性盐梯度也可用于洗提hIFN分子。随后可（例如）通过过滤（诸如透滤或超滤）来浓缩洗出液。可使用透滤来移除用于洗提hIFN多肽的盐。

其它纯化技术可对第一hIFN多肽混合物或其任何随后混合物进行使用（例如）凝胶过滤（Gel Filtration:Principles and Methods（目录号18-1022-18,Amersham Biosciences,Piscataway,NJ），其是以引用的方式并入本文中）、羟基磷灰石色谱（适合基质包含但不限于HA-Ultrogel、High Resolution（Calbiochem）、CHT陶瓷羟基磷灰石（BioRad）、Bio-Gel HTP羟基磷灰石（BioRad））、HPLC、膨胀床吸附、超滤、透滤、冻干等等的另一分离步骤，以移除任何过量盐且用适合缓冲液来代替所述缓冲液以用于下个分离步骤或甚至最后药物产品的调配。

在本文中所述的各步骤下可使用所属领域的一般技术人员已知的技术来监控hIFN多肽（包含实质上经纯化hIFN多肽）的产率。这些技术也可用于在最后分离步骤后评估实质上经纯化hIFN多肽的产率。举例来说，可使用具有多种烷基链长度的若干反相高压液相色谱柱（诸如氰基RP-HPLC、C₁₈RP-HPLC以及阳离子交换HPLC和凝胶过滤HPLC）中的任一种来监控hIFN多肽的产率。

在本发明的特定实施例中，在各纯化步骤后hIFN的产率可为至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、至少约99.9%或至少约99.99%的各纯化步骤的起始物质中的hIFN。

可使用诸如SDS-PAGE的标准技术或通过使用Western印迹法和ELISA检定测量hIFN多肽来测定纯度。举例来说，可针对自阴性对照酵母发酵和阳离子交换回收分离的蛋白质产生多克隆抗体。抗体也可用于探测污染性宿主细胞蛋白质的存在。

RP-HPLC材料Vydac C4（Vydac）由硅胶粒子组成，其表面带有C4-烷基链。hIFN多肽与蛋白质杂质的分离是基于疏水相互作用强度的差别。用于稀三氟乙酸中的乙腈梯度进行洗提。使用不锈钢柱（填充2.8至3.2升Vydac C4硅胶）进行制备型HPLC。通过添加三氟乙酸来酸化羟基磷灰石Ultrogel洗出液且将其装载于Vydac C4柱上。对于洗涤和洗提来说，使用于稀三氟乙酸中的乙腈梯度。收集馏分且立即用磷酸盐缓冲液将其中和。汇集在IPC限度内的hIFN多肽馏分。

DEAE Sepharose（Pharmacia）材料由与琼脂糖凝胶珠粒的表面共价结合的二乙基氨基乙基（DEAE）基团组成。通过离子性相互作用来介导hIFN多肽与DEAE基团的结合。乙腈和三氟乙酸无滞留地通过柱。在这些物质经洗掉之后，通过用低pH值的乙酸盐缓冲液洗涤柱来移除痕量杂质。随后用中性磷酸盐缓冲液洗涤柱且用具有增加的离子强度的缓冲液洗提hIFN多肽。用DEAE Sepharose fast flow填充柱。调节柱体积以确保hIFN多肽装载量在每毫升凝胶3-10mg hIFN多肽的范围内。用水和平衡缓冲液（磷酸钠/钾）洗涤柱。装填HPLC洗出液的汇集馏分且用平衡缓冲液洗涤柱。随后用洗涤缓冲液（乙酸钠缓冲液）洗涤柱，接着用平衡缓冲液洗涤。随后，根据标准洗提概况用洗提缓冲液（氯化钠、磷酸钠/钾）将hIFN多肽自柱洗提且收集于单一馏分中。将DEAE Sepharose柱的洗出液调节至指定传导率。将所得药物物质无菌过滤入铁氟隆（Teflon）瓶中且储存在-70℃下。

可使用的其它方法包含但不限于移除内毒素的步骤。内毒素为位于革兰氏阴性宿主细胞（诸如，大肠杆菌）的外部膜上的脂多糖（LPS）。所属领域的一般技术人员已知用于降低内毒素含量的方法且其包含但不限于使用硅胶支撑物、玻璃粉末或羟基磷灰石的纯化技术、反相色谱、亲和色谱、尺寸排阻色谱、阴离子交换色谱、疏水相互作用色谱、这些方法的组合等等。可能需要修饰或其它方法以自所关注的多肽移除污染物（诸如共迁移蛋白质）。所属领域的一般技术人员已知用于测量内毒素含量的方法且其包含但不限于鲎试剂溶菌酶（Limulus Amebocyte Lysate；LAL）检定。EndosafeTM-PTS检定为利用预装载LAL试剂、显色基质和对照标准内毒素的料筒以及手持分光光度计的比色、单管系统。替代性方法包含但不限于测量浊度且使用96孔形式的动力学LAL方法。

多种方法和程序可用于评估包括一个或一个以上非天然编码氨基酸的hIFN蛋白质的产率和纯度，其包含但不限于Bradford检定、SDS-PAGE、银染色SDS-PAGE、考马斯（coomassie）染色SDS-PAGE、质谱（包含但不限于MALDI-TOF）和所属领域的一般技术人员已知的用于表征蛋白质的其它方法。

其它方法包含但不限于：与蛋白质染色方法组合的SDS-PAGE、免疫印迹法、基质辅助激光解吸附/离子化质谱（MALDI-MS）、液相色谱/质谱、等电聚焦、分析型阴离子交换、色谱聚焦和圆二色谱。

VIII.在替代系统中的表达

已使用若干种策略以在非重组宿主细胞、突变宿主细胞或不含细胞的系统中将非天然氨基酸引入蛋白质中。这些系统也适用于制造本发明的hIFN多肽。氨基酸经诸如Lys、Cys和Tyr的反应性侧链衍生使得赖氨酸转化为N²-乙酰基-赖氨酸。化学合成也提供并入非天然氨基酸的直接方法。通过肽片段的酶促连接和天然化学连接的新近发展，有可能制造较大蛋白质。例如参看P.E.Dawson和S.B.H.Kent,Annu.Rev.Biochem,69:923(2000)。化学肽连接和天然化学连接描述于美国专利第6,184,344号、美国专利公开案第2004/0138412号、美国专利公开案第2003/0208046号、WO 02/098902和WO 03/042235中，其是以引用的方式并入本文中。能够支持蛋白质生物合成的其中经所需非天然氨基酸化学酰化的抑制tRNA添加到活体外提取物中的通用活体外生物合成方法已用于将100个以上非天然氨基酸位点特异性地并入几乎任何尺寸的多种蛋白质中。例如参看V.W.Cornish,D.Mendel和P.G. Schultz,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995,34:621(1995)；C.J.Noren,S.J.Anthony-Cahill,M.C.Griffith,P.G. Schultz,Ageneral method forsite-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins,Science 244:182-188(1989)；以及J.D.Bain,C.G.Glabe,T.A.Dix,A.R.Chamberlin,E.S.Diala,Biosyntheticsite-specific incorporation of a unnatural amino acid into a polypeptide,J.Am.Chem.Soc.111:8013-8014(1989)。多种官能团已经引入用于蛋白质稳定性、蛋白质折叠、酶机理和信号转导的研究的蛋白质中。

已开发被称作选择性压力并入的活体内方法以使用野生型合成酶的杂乱性。例如参看N.Budisa,C.Minks,S.Alefelder,W.Wenger,F.M.Dong,L.Moroder和R.Huber,FASEB J.,13:41(1999)。其中向细胞供应特定天然氨基酸的相关代谢路径关闭的营养缺陷型菌株是生长于含有有限浓度的天然氨基酸的基本培养基中，而靶基因的转录受到抑制。在固定生长期开始时，天然氨基酸被耗尽且经非天然氨基酸类似物替换。重组蛋白表达的诱发使得含有非天然类似物的蛋白质积聚。举例来说，已使用这种策略将邻氟苯丙氨酸、间氟苯丙氨酸和对氟苯丙氨酸并入蛋白质中，且其在UV光谱中显示两个可容易地鉴别的特征性肩，例如参看C.Minks,R.Huber,L.Moroder和N.Budisa,Anal. Biochem.,284:29(2000)；三氟甲硫氨酸已用于代替噬菌体T4溶菌酶中的甲硫氨酸以通过¹⁹F NMR研究其与壳寡糖配体的相互作用，例如参看H.Duewel,E.Daub,V.Robinson和J.F.Honek,Biochemistry,36:3404(1997)；且三氟亮氨酸已代替亮氨酸并入，使得亮氨酸-拉链蛋白的热和化学稳定性增加。例如参看Y.Tang,G.Ghirlanda,W.A.Petka,T.Nakajima,W.F.DeGrado和D.A.Tirrell,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,40:1494(2001)。此外，硒代甲硫氨酸和碲代甲硫氨酸经并入各种重组蛋白中以促进X射线结晶学中的相溶解。例如参看W.A.Hendrickson,J.R.Horton和D.M.Lemaster,EMBO J.,9:1665(1990)；J.O.Boles,K.Lewinski,M.Kunkle,J.D.Odom,B.Dunlap,L.Lebioda和M.Hatada,Nat. Struct.Biol.,1:283(1994)；N.Budisa,B.Steipe,P.Demange,C.Eckerskorn,J.Kellermann和R.Huber,Eur.J.Biochem.,230:788(1995)；以及N.Budisa,W.Karnbrock,S.Steinbacher,A.Humm,L.Prade,T.Neuefeind,L.Moroder和R.Huber,J.Mol.Biol.,270:616(1997)。具有烯或炔官能团的甲硫氨酸类似物也已有效并入，其允许通过化学方式对蛋白质进行其它修饰。例如参看J.C.M.vanHest和D.A.Tirrell,FEBS Lett.,428:68(1998)；J.C.M.vanHest,K.L.Kiick和D.A.Tirrell,J.Am.Chem.Soc.122:1282(2000)；以及K.L.Kiick和D.A.Tirrell,Tetrahedron,56:9487(2000)；美国专利第6,586,207号；美国专利公开案第2002/0042097号，其是以引用的方式并入本文中。

这种方法的成功取决于氨基酰基-tRNA合成酶对非天然氨基酸类似物的识别，所述合成酶通常需要高选择性以确保蛋白质翻译的保真度。扩展这种方法的范围的一种方式在于放宽氨基酰基-tRNA合成酶的底物特异性，其已在有限数目的情况下达成。举例来说，在大肠杆菌苯丙氨酰基-tRNA合成酶（PheRS）中由Gly置换Ala²⁹⁴可增加底物结合位点的尺寸，且导致对Cl-苯丙氨酸（p-Cl-Phe）对tRNAPhe的酰化。参看，M.Ibba,P.Kast和H.Hennecke,Biochemistry,33:7107(1994)。带有这种突变PheRS的大肠杆菌菌株允许对Cl-苯丙氨酸或对Br-苯丙氨酸代替苯丙氨酸并入。例如参看M.Ibba和H.Hennecke,FEBS Lett.,364:272(1995)；以及N.Sharma,R.Furter,P.Kast和D.A.Tirrell,FEBS Lett.,467:37(2000)。类似地，显示接近大肠杆菌酪氨酰基-tRNA合成酶的氨基酸结合位点的点突变Phe130Ser允许重氮酪氨酸比酪氨酸更有效地并入。参看F.Hamano-Takaku,T.Iwama,S.Saito-Yano,K.Takaku,Y.Monden,M.Kitabatake,D.Soil和S.Nishimura,J.Biol.Chem.,275:40324(2000)。

在活体内将非天然氨基酸并入蛋白质中的另一种策略为修饰具有校对机制的合成酶。这些合成酶不能区分在结构上与同源天然氨基酸类似的氨基酸且因此将其活化。此错误在单独位点上得到修正，使来自tRNA的错装配氨基酸去酰基化以保持蛋白质翻译的保真度。如果合成酶失去校对活性，那么错活化的结构类似物可避开编辑功能且经并入。目前已用缬氨酰基-tRNA合成酶（ValRS）证实这种方法。参看V.Doring,H.D.Mootz,L.A.Nangle,T.L.Hendrickson,V.de Crecy-Lagard,P.Schimmel和P.Marliere,Science,292:501(2001)。ValRS可使具有Cys、Thr或氨基丁酸根（Abu）的tRNAVal错氨基酰基化；随后通过编辑域水解这些非同源氨基酸。在大肠杆菌染色体的随机突变诱发之后，选择在ValRS的编辑位点中具有突变的突变大肠杆菌菌株。这种编辑缺陷型ValRS错误地用Cys装配tRNAVal。因为Abu与Cys在空间上类似（Cys的-SH基团是由Abu中的-CH3置换），所以当这种突变大肠杆菌菌株在Abu存在的情况下生长时，突变ValRS也将Abu并入蛋白质中。质谱分析显示在天然蛋白质中的各缬氨酸位置处约24%的缬氨酸由Abu置换。

固相合成和半合成方法也已允许合成含有新颖氨基酸的多种蛋白质。举例来说，参看以下公开案和其中引用的参考文献，其为如下：Crick,F.H.C.,Barrett,L.Brenner,S.Watts-Tobin,R.General nature of the genetic code for proteins.Nature,192:1227-1232(1961)；Hofmann,K.,Bohn,H.Studies on polypeptides.XXXW，The effect ofpyrazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S-peptidefragment,J.Am Chem,88(24):5914-5919(1966)；Kaiser,E.T.Synthetic approaches tobiologically active peptides and proteins including enyzmes,Ace Chem Res,22:47-54(1989)；Nakatsuka,T.,Sasaki,T.,Kaiser,E.T.Peptide segment coupling catalyzed by thesemisynthetic enzyme thiosubtilisin,J Am Chem Soc,109:3808-3810(1987)；Schnolzer,M.,Kent,S B H.Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides:backbone-engineered HIV protease,Science,256(5054):221-225(1992)；Chaiken,I.M.Semisynthetic peptides and proteins,CRC Crit Rev Biochem,11(3):255-301(1981)；Offord,R.E.Protein engineering by chemical means? Protein Eng.,1(3):151-157(1987)；以及Jackson,D.Y.,Burnier,J.,Quan,C,Stanley,M.,Tom,J.,Wells,J.A.A Designed PeptideLigasefor Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues,Science,266(5183):243(1994)。

化学修饰已用于在活体外向蛋白质中引入多种包含辅因子、自旋标记和寡核苷酸的非天然侧链。例如参看Corey,D.R.,Schultz,P.G.Generation of a bybrid sequence-specificsingle-stranded deoxyribonuclease,Science,238(4832):1401-1403(1987)；Kaiser,E.T.,Lawrence D.S.,Rokita,S.E.The chemical modification of enzymatic specificity，Annu Rev Biochem,54:565-595(1985)；Kaiser,E.T.,Lawrence,D.S.Chemical mutation of enyzmeactive sites,Science,226(4674):505-511(1984)；Neet,K.E.,Nanci A,Koshland,D.E.Properties of thiol-subtilisin,J Biol.Chem,243(24):6392-6401(1968)；Polgar,L.B.et M.L.Bender,Anew enzyme containing a synthetically formed active site.Thiol-subtilisin.J.Am Chem Soc,88:3153-3154(1966)；以及Pollack,S.J.,Nakayama,G.Schultz,P.G.Introductionofnucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites,Science,242(4881):1038-1040(1988)。

或者，使用化学修饰氨基酰基-tRNA的生物合成方法已用于将若干种生物物理探针并入在活体外合成的蛋白质中。参看以下公开案和其中所引用的参考文献：Brunner,J.New Photolabeling and crosslinking methods,Annu.Rev Biochem,62:483-514(1993)；以及Krieg,U.C.,Walter,P.,Hohnson,A.E.Photocrosslinking of the signal sequence of nascentpreprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle,Proc.Natl. Acad.Sci,83(22):8604-8608(1986)。

先前已显示可通过向由含有所需琥珀无义突变的基因编程的蛋白质合成反应中添加化学氨基酰基化的抑制tRNA而在活体外将非天然氨基酸位点特异性地并入蛋白质中。使用这些方法，我们使用对特定氨基酸来说为营养缺陷型的菌株，可用接近的结构同源物代替多种20种常见氨基酸，例如，用氟苯丙氨酸代替苯丙氨酸。例如参看Noren,C.J.,Anthony-Cahill,Griffith,M.C.,Schultz,P.G.A general method for site-specificincorporation of unnatural amino acids into proteins,Science,244:182-188(1989)；M.W.Nowak等人,Science 268:439-42(1995)；Bain,J.D.,Glabe,C.G.,Dix,T.A.,Chamberlin,A.R.,Diala,E.S.Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural amino acid into apolypeptide,J.Am Chem Soc,111:8013-8014(1989)；N.Budisa等人,FASEB J.13:41-51(1999)；Ellman,J.A.,Mendel,D.,Anthony-Cahill,S.,Noren,C.J.,Schultz,P.G.Biosyntheticmethod for introducing unnatural amino acids site-specifically into proteins,Methods in Enz.,301-336(1992)；以及Mendel,D.,Cornish,V.W.和Schultz,P.G.Site-Directed Mutagenesiswith an Expanded Genetic Code,Annu Rev Biophvs.Biomol Struct.24,435-62(1995)。

举例来说，制备识别终止密码子UAG的抑制tRNA且用非天然氨基酸使其化学氨基酰基化。常规定点突变诱发用于在蛋白质基因中的所关注位点处引入终止密码子TAG。例如参看Sayers,J.R.,Schmidt,W.Eckstein,F.5'-3'Exonuclease inphosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagensis,Nucleic Acids Res,16(3):791-802(1988)。当酰基化抑制tRNA和突变基因组合于活体外转录/翻译系统中时，回应UAG密码子而并入非天然氨基酸，得到在指定位置处含有所述氨基酸的蛋白质。使用[³H]-Phe的实验以及使用α-羟基酸的实验证实在由UAG密码子指定的位置处仅并入所需氨基酸且此氨基酸未在蛋白质中的任何其它位点处并入。例如参看Noren等人,同上文；Kobayashi等人,(2003)Nature Structural Biology 10(6):425-432；以及Ellman,J.A.,Mendel,D.,Schultz,P.G.Site-specific incorporation of novel backbone structures intoproteins,Science,255(5041):197-200(1992)。

tRNA可通过任何方法或技术（包含但不限于化学或酶促氨基酰基化）经所需氨基酸氨基酰基化。

可由氨基酰基tRNA合成酶或其它酶促分子（包含但不限于核糖酶）来实现氨基酰基化。术语“核糖酶”可与“催化性RNA”互换。Cech和同事（Cech,1987,Science,236:1532-1539；McCorkle等人,1987,Concepts Biochem.64:221-226）证实可充当催化剂（核糖酶）的天然存在RNA的存在。然而，尽管仅已展示这些天然RNA催化剂作用于核糖核酸底物上以进行裂解和剪接，但关于核糖酶的人工发展的新近发展已扩展对各种化学反应的催化清单。研究已鉴别可在其自身（2'）3'-末端上催化氨基酰基-RNA键的RNA分子（Illangakekare等人,1995Science 267:643-647），以及可将氨基酸自一个RNA分子转移到另一个RNA分子的RNA分子（Lohse等人,1996,Nature 381:442-444）。

美国专利申请公开案2003/0228593（其是以引用的方式并入本文中）描述建构核糖酶的方法和其在具有天然编码和非天然编码氨基酸的tRNA的氨基酰基化中的用途。可氨基酰基化tRNA的底物固定形式的酶性分子（包含但不限于核糖酶）可能够促成氨基酰基化产物的有效亲和性纯化。适合底物的实例包含琼脂糖、琼脂糖凝胶和磁性珠粒。用于氨基酰基化的底物固定形式的核糖酶的制备和使用描述于Chemistry and Biology2003,10:1077-1084以及美国专利申请公开案2003/0228593中，其是以引用的方式并入本文中。

化学氨基酰基化方法包含但不限于由Hecht和同事（Hecht,S.M.Ace.Chem.Res.1992,25,545；Heckler,T.G.；Roesser,J.R.；Xu,C；Chang,P.；Hecht,S.M.Biochemistry1988,27,7254；Hecht,S.M.；Alford,B.L.；Kuroda,Y.；Kitano,S.J.Biol.Chem.1978,253,4517）以及由Schultz、Chamberlin、Dougherty和其它人（Cornish,V.W.；Mendel,D.；Schultz,P.G.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995,34,621；Robertson,S.A.；Ellman,J.A.；Schultz,P.G.J.Am.Chem.Soc.1991,113,2722；Noren,C.J.；Anthony-Cahill,S.J.；Griffith,M.C；Schultz,P.G.Science 1989,244,182；Bain,J.D.；Glabe,C.G.；Dix,T.A.；Chamberlin,A.R.J.Am.Chem.Soc.1989,111,8013；Bain,J.D.等人,Nature 1992,356,537；Gallivan,J.P.；Lester,H.A.；Dougherty,D.A.Chem.Biol.1997,4,740；Turcatti等人,J.Biol.Chem.1996,271,19991；Nowak,M.W.等人,Science,1995,268,439；Saks,M.E.等人,J.Biol.Chem.1996,271,23169；Hohsaka,T.等人,J.Am.Chem.Soc.1999,121,34）（其是以引用的方式并入本文中）介绍的那些，以避免在氨基酰基化中使用合成酶。这些方法或其它化学氨基酰基化方法可用于氨基酰基化tRNA分子。

用于产生催化性RNA的方法可涉及产生随机化核糖酶序列的单独集合，对集合进行经指导发展，筛检集合的所需氨基酰基化活性，且选择显示所需氨基酰基化活性的那些核糖酶的序列。

核糖酶可包括促进酰化活性的基元和/或区域，诸如GGU基元和富含U的区域。举例来说，已报导富含U的区域可促进氨基酸底物的识别，且GGU基元可与tRNA的3'末端形成碱基对。GGU基元和富含U的区域组合起来同时促进氨基酸与tRNA的同时识别，且从而促进tRNA的3'末端的氨基酰基化。

可通过使用与tRNA^Asn _CCCG接合的部分随机化r24mini进行活体外选择，接着系统性改造在活性克隆中发现的一致序列来产生核糖酶。由这种方法获得的例示性核糖酶被称作“Fx3核糖酶”且描述于美国公开申请案第2003/0228593号（其内容是以引用的方式并入本文中）中，其充当用于合成各种经装配同源非天然氨基酸的氨基酰基-tRNA的通用催化剂。

在底物上固定可用于促成氨基酰基化tRNA的有效亲和性纯化。适合底物的实例包含但不限于琼脂糖、琼脂糖凝胶和磁性珠粒。可利用RNA的化学结构将核糖酶固定于树脂上，诸如RNA的核糖上的3'-顺式二醇可经高碘酸盐氧化以产生相应二醛以促进RNA在树脂上的固定。可使用各种类型的树脂（包含廉价酰肼树脂），其中还原性胺化使树脂与核糖酶之间的相互作用产生不可逆键联。可由此柱上氨基酰基化技术显著促进氨基酰基-tRNA的合成。Kourouklis等人,Methods 2005;36:239-4描述以柱为基础的氨基酰基化系统。

可以多种方式实现氨基酰基化tRNA的分离。一种适合方法为自具有缓冲液的柱洗提氨基酰基化tRNA，其中所述缓冲液为诸如具有10mM EDTA的乙酸钠溶液、含有50mM N-(2-羟基乙基)哌嗪-N'-(3-丙烷磺酸)、12.5mM KCl（pH 7.0）、10mM EDTA的缓冲液或简单经EDTA缓冲的水（pH 7.0）。

氨基酰基化tRNA可添加到翻译反应中以并入氨基酸，tRNA在由翻译反应产生的多肽中的所选位置中经其氨基酰基化。其中可使用本发明的氨基酰基化tRNA的翻译系统的实例包含但不限于细胞溶菌液。细胞溶菌液提供自所输入mRNA活体外翻译多肽所必需的反应组分。这些反应组分的实例包含但不限于核糖体蛋白、rRNA、氨基酸、tRNA、GTP、ATP、翻译起始和延伸因子以及与翻译相关的其它因子。另外，翻译系统可为分批翻译或间隔翻译。分批翻译系统将反应组分组合于单一隔室中，而间隔翻译系统将翻译反应组分与可展示翻译效率的反应产物隔开。这些翻译系统在市面上有售。

此外，可使用偶合转录/翻译系统。偶合转录/翻译系统允许将所输入DNA转录为相应mRNA，其转而由反应组分进行翻译。市售偶合转录/翻译的实例为Rapid TranslationSystem（RTS,Roche Inc.）。所述系统包含含有大肠杆菌溶菌液以提供诸如核糖体和翻译因子的翻译组分的混合物。另外，包含RNA聚合酶以将所输入DNA转录为用于翻译的mRNA模板。RTS可经由反应隔室（包含供应/消耗隔室和转录/翻译隔室）之间插入的膜使用反应组分的分隔化。

可由其它试剂（包含但不限于转移酶、聚合酶、催化抗体、多官能蛋白质等等）进行tRNA的氨基酰基化。

Lu等人在Mol Cell.2001年10月;8(4);759-69中描述其中蛋白质与含有非天然氨基酸的合成肽化学连接（经表达蛋白质连接）的方法。

微注射技术也已用于将非天然氨基酸并入蛋白质中。例如参看M.W.Nowak,P.C.Kearney,J.R.Sampson,M.E.Saks,C.G.Labarca,S.K.Silverman,W.G.Zhong,J.Thorson,J.N.Abelson,N.Davidson,P.G.Schultz,D.A.Dougherty和H.A.Lester,Science,268:439(1995)；以及D.A.Dougherty,Curr.Opin.Chem.Biol.,4:645(2000)。爪蟾卵母细胞与在活体外产生的以下两种RNA物质共同注射：在所关注氨基酸位置处具有UAG终止密码子的编码靶蛋白的mRNA和经所需非天然氨基酸氨基酰基化的琥珀抑制tRNA。卵母细胞的翻译机构随后在由UAG指定的位置处插入非天然氨基酸。这种方法已允许通常不适用于活体外表达系统的整体膜蛋白的活体内结构-功能研究。实例包含将荧光氨基酸并入速激肽神经激肽-2受体中以通过荧光共振能量转移测量距离，例如参看G.Turcatti,K.Nemeth,M.D.Edgerton,U.Meseth,F.Talabot,M.Peitsch,J.Knowles,H.Vogel和A.Chollet,J.Biol.Chem.,271:19991(1996)；并入生物素化氨基酸以鉴别离子通道中的表面暴露残基，例如参看J.P.Gallivan,H.A.Lester和D.A.Dougherty,Chem.Biol.,4:739(1997)；使用笼蔽酪胺酸类似物以实时监控离子通道中的构象变化，例如参看J.C.Miller,S.K.Silverman,P.M.England,D.A.Dougherty和H.A.Lester,Neuron,20:619(1998)；以及使用α羟基氨基酸以改变用于探究其选通机制的离子通道主干。例如参看P.M.England,Y.Zhang,D.A.Dougherty和H.A.Lester,Cell,96:89(1999)；以及T.Lu,A.Y.Ting,J.Mainland,L.Y.Jan,P.G.Schultz和J.Yang,Nat.NeuroscL 4:239(2001)。

在活体内直接将非天然氨基酸并入蛋白质中的能力提供多种优点，其包含但不限于突变蛋白的高产率、技术简易性、在细胞中或可能在活有机体中研究突变蛋白的可能性以及这些突变蛋白在治疗性治疗和诊断性用途中的用途。将具有各种尺寸、酸度、亲核性、疏水性以及其它性质的非天然氨基酸包含入蛋白质中的能力可极大地扩展我们理性且系统性地操纵蛋白质结构的能力，以探究蛋白质功能且产生具有新颖性质的新蛋白质或有机体。

在位点特异性地并入对F-Phe的一次尝试中，酵母琥珀抑制tRNAPheCUA/苯丙氨酰基-tRNA合成酶对用于对F-Phe抗性、Phe营养缺陷型大肠杆菌菌株中。例如参看R.Furter,Protein Sci.,7:419(1998)。

使用不含细胞的（活体外）翻译系统获得本发明的hIFN聚核苷酸的表达也为可能的。翻译系统可为细胞性或不含细胞，且可为原核或真核。细胞翻译系统包含但不限于其中所需核酸序列可经转录为mRNA且mRNA经翻译的全细胞制剂，诸如渗透细胞或细胞培养物。不含细胞的翻译系统在市面上有售且众所周知许多不同类型和系统。不含细胞的系统的实例包含但不限于原核溶菌液，诸如大肠杆菌溶菌液；以及真核溶菌液，诸如麦芽提取物、昆虫细胞溶菌液、兔网状细胞溶菌液、兔卵母细胞溶菌液和人类细胞溶菌液。当所得蛋白质经糖基化、磷酸化或以其它方式经修饰时，可优选真核提取物或溶菌液，因为许多这些修饰仅可能在真核系统中。一些这些提取物和溶菌液在市面上有售（Promega；Madison,Wis.；Stratagene；La Jolla,Calif.；Amersham；Arlington Heights,Ill.；GIBCO/BRL；Grand Island,N.Y.）。也可用膜提取物（诸如含有微粒体膜的犬胰腺提取物），其适于翻译分泌蛋白。在可包含mRNA作为模板（活体外翻译）或DNA作为模板（组合型活体外转录和翻译）的这些系统中，由核糖体指导活体外合成。对于开发不含细胞的蛋白质表达系统已作出相当大的努力。例如参看Kim,D.M.和J.R.Swartz,Biotechnology and Bioengineering,74:309-316(2001)；Kim,D.M.和J.R.Swartz,Biotechnology Letters,22,1537-1542,(2000)；Kim,D.M.和J.R.Swartz,BiotechnologyProgress,16,385-390,(2000)；Kim,D.M.和J.R.Swartz,Biotechnology and Bioengineering,66,180-188,(1999)；以及Patnaik,R.和J.R.Swartz,Biotechniques 24,862-868,(1998)；美国专利第6,337,191号；美国专利公开案第2002/0081660号；WO 00/55353；WO 90/05785，其是以引用的方式并入本文中。可应用于包括非天然编码氨基酸的hIFN多肽表达的另一种方法包含mRNA-肽融合技术。例如参看R.Roberts和J.Szostak,Proc.Natl Acad.Sci.(USA)94:12297-12302(1997)；A.Frankel等人,Chemistry & Biology 10:1043-1050(2003)。在这种方法中，在核糖体上将与嘌呤霉素（puromycin）键联的mRNA模板翻译为肽。如果一种或一种以上tRNA分子已经修饰，那么非天然氨基酸也可并入肽中。在已读取最后一个mRNA密码子之后，嘌呤霉素捕获肽的C末端。如果发现所得mRNA-肽接合物在活体外检定中具有引人关注的性质，那么易于自mRNA序列揭示其特性。用这种方式，可筛检包括一个或一个以上非天然编码氨基酸的hIFN多肽的文库以鉴别具有所需性质的多肽。最近，已报导利用经纯化组分的活体外核糖体翻译，其允许合成经非天然编码氨基酸取代的肽。例如参看A.Forster等人,Proc.Natl Acad.Sci.(USA)100:6353(2003)。

也可使用重构翻译系统。经纯化翻译因子的混合物也已成功地用于将mRNA翻译为蛋白质以及溶菌液或补充有经纯化翻译因子（诸如起始因子-1（IF-1）、IF-2、IF-3（α或β）、延伸因子T（EF-Tu）或终止因子）的溶菌液的组合。不含细胞的系统也可为偶合转录/翻译系统，其中DNA经引入系统中，转录为mRNA且mRNA经翻译，如CurrentProtocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编辑,Wiley Interscience,1993)中所述，其是以引用的方式特定地并入本文中。转录于真核转录系统中的RNA可为异核RNA（hnRNA）或5'-端帽（7-甲基鸟苷）和3'-端poly A尾成熟mRNA的形式，其在某些翻译系统中可为优点。举例来说，在网状细胞溶菌液系统中封端mRNA在高效率下经翻译。

IX.与hIFN多肽偶合的大分子聚合物

可使用本文中所述的组合物、方法、技术和策略来实现对本文中所述的非天然氨基酸多肽的各种修饰。这些修饰包含将其它官能团并入到多肽的非天然氨基酸组分上，这些官能团包含但不限于标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；放射性核素；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖；水溶性树枝状聚合物；环糊精；抑制性核糖核酸；生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团；含金属的部分；放射性部分；新颖官能团；与其它分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；光化学辐射可激发部分；可光异构化部分；生物素；生物素的衍生物；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；量子点；纳米传递素；放射性核苷酸；放射性传递素；中子俘获剂；或上述物质的任何组合，或任何其它所需化合物或物质。作为本文中所述组合物、方法、技术和策略的说明性、非限制性实例，以下描述将集中于将大分子聚合物加成到非天然氨基酸多肽上，同时应理解，对其所述的组合物、方法、技术和策略也适用于（必要时经适当更改且所属领域的技术人员可用本文中的揭示内容进行）添加其它官能团（包含但不限于上文列出的那些官能团）。

多种大分子聚合物和其它分子可与本发明的hIFN多肽键联以调节hIFN多肽的生物性质和/或向hIFN分子提供新颖生物性质。这些大分子聚合物可通过天然编码氨基酸、通过非天然编码氨基酸或天然或非天然氨基酸的任何官能取代基或加成到天然或非天然氨基酸上的任何取代基或官能团与hIFN多肽键联。聚合物的分子量可为宽范围，其包含但不限于介于约100Da与约100,000Da或更大之间。聚合物的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，其包含但不限于100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约10,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量为30,000Da。在一些实施例中，在一些实施例中，聚合物的分子量为40,000Da。

本发明提供实质上均质的聚合物:蛋白质接合物的制剂。如在本文中所用的“实质上均质”意谓观察到聚合物:蛋白质接合物分子大于总蛋白质的一半。所述聚合物:蛋白质接合物具有生物活性且本文中提供的本发明的“实质上均质”的聚乙二醇化hIFN多肽制剂为足够均质以显示均质制剂的优点（例如，在批次之间药物动力学的可预测性的临床应用中的简易性）的制剂。

也可选择制备聚合物:蛋白质接合物分子的混合物，且本文中提供的优点在于可选择包含于混合物中的单聚合物:蛋白质接合物的比例。因此，必要时，可制备各种蛋白质与各种数目的所连接的聚合物部分（即，二-、三-、四-等）的混合物，且将所述接合物与所述使用本发明的方法制备的单聚合物:蛋白质接合物组合，并获得具有预定比例的单聚合物:蛋白质接合物的混合物。

所选聚合物可为水溶性的以使得其所连接的蛋白质在水性环境（诸如生理环境）中不沉淀。聚合物可分枝或未分枝。对于最终产品制剂的治疗性用途来说，聚合物将为医药学上可接受的。

聚合物的实例包含但不限于聚烷基醚和其烷氧基封端类似物（例如，聚乙二醇（polyoxyethylene glycol）、聚乙二醇/丙二醇以及其甲氧基或乙氧基封端类似物，尤其聚乙二醇，后者也被称作聚乙二醇（polyethyleneglycol）或PEG）；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯基烷基醚；聚噁唑啉、聚烷基噁唑啉和聚羟基烷基噁唑啉；聚丙烯酰胺、聚烷基丙烯酰胺和聚羟基烷基丙烯酰胺（例如，聚羟基丙基甲基丙烯酰胺和其衍生物）；聚羟基烷基丙烯酸酯；聚唾液酸和其类似物；亲水性肽序列；聚糖和其衍生物，其包含葡聚糖和葡聚糖衍生物，例如，羧甲基葡聚糖、硫酸葡聚糖、氨基葡聚糖；纤维素和其衍生物，例如，羧甲基纤维素、羟基烷基纤维素；几丁质和其衍生物，例如，壳聚糖、琥珀酰基壳聚糖、羧甲基几丁质、羧甲基壳聚糖；透明质酸和其衍生物；淀粉；藻酸盐；硫酸软骨素；白蛋白；支链淀粉和羧甲基支链淀粉；聚氨基酸和其衍生物，例如，聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚天冬氨酸、聚天冬酰胺；马来酸酐共聚物，诸如苯乙烯马来酸酐共聚物、二乙烯基乙醚马来酸酐共聚物；聚乙烯醇；其共聚物；其三聚物；其混合物；以及上述物质的衍生物。

聚乙二醇分子与蛋白质分子的比例将改变，其在反应混合物中的浓度也将改变。一般来说，通过所选聚乙二醇的分子量和可提供的可用反应性基团的数目可确定最佳比率（就反应效率来说，因为存在最小过量的未反应蛋白质或聚合物）。当涉及分子量时，通常聚合物的分子量越高，可与蛋白质连接的聚合物分子的数目就越少。类似地，当最佳化这些参数时，应将聚合物的分枝考虑在内。通常，分子量越高（或支链越多），聚合物:蛋白质比率就越高。

如本文中所用，且当涵盖PEG:hIFN多肽接合物时，术语“治疗有效量”指的是得到向患者提供益处的病毒量降低的量。所述量在不同个体之间将改变且将视多种因素而定，其包含患者的整体身体状况和病状的潜在原因。用于疗法的hIFN多肽的量提供病毒量的可接受的降低。所属领域的一般技术人员使用公开可用的材料和程序可容易地确定本发明的组合物的治疗有效量。

水溶性聚合物可为包含但不限于线性、分叉或分枝的任何结构形式。水溶性聚合物通常为聚(烷撑二醇)（诸如聚乙二醇（PEG）），但也可使用其它水溶性聚合物。举例来说，使用PEG来描述本发明的某些实施例。

PEG为众所周知的水溶性聚合物，其在市面上有售或可根据所属领域的一般技术人员已知的方法（Sandler和Karo,Polymer Synthesis,Academic Press,New York,第3卷,第138-161页）通过乙二醇的开环聚合来制备。术语“PEG”广泛用于涵盖任何聚乙二醇分子而不用考虑尺寸或在PEG末端处的修饰，且可由下式表示为与hIFN多肽键联：

XO-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-Y

其中n为2至10,000且X为H或末端修饰，其包含但不限于C_1-4烷基、保护基或末端官能团。

在一些情况下，在本发明中所用的PEG在一个末端上经羟基或甲氧基封端，即，X为H或CH₃（“甲氧基PEG”）。或者，PEG可经反应性基团封端，从而形成双官能聚合物。典型反应性基团可包含通常用于与20种常见氨基酸中发现的官能团反应的那些反应性基团（包含但不限于马来酰亚胺基、活化碳酸酯（包含但不限于对硝基苯酯）、活化酯（包含但不限于N-羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯酯）和醛）以及对20种常见氨基酸呈惰性、但与非天然编码氨基酸中存在的互补官能团特异性反应的官能团（包含但不限于叠氮基、炔基）。应注意，PEG的另一末端（在上式中由Y表示）将通过天然存在或非天然编码氨基酸与hIFN多肽直接或间接连接。举例来说，Y可为与多肽的胺基（包含但不限于赖氨酸的ε胺或N末端）键联的酰胺、氨基甲酸酯或尿素。或者，Y可为与硫醇基团（包含但不限于半胱氨酸的硫醇基团）键联的马来酰亚胺。或者，Y可为与通过20种常见氨基酸通常不可接近的残基的键。举例来说，PEG上的叠氮基可与hIFN多肽上的炔基反应以形成Huisgen[3+2]环加成产物。或者，PEG上的炔基可与非天然编码氨基酸中存在的叠氮基反应以形成类似产物。在一些实施例中，强亲核试剂（包含但不限于肼、酰肼、羟胺、氨基脲）可与非天然编码氨基酸中存在的醛或酮基反应以形成腙、肟或缩氨基脲，适当时，在一些情况下其可通过由适当还原剂处理而进一步还原。或者，强亲核试剂可通过非天然编码氨基酸并入hIFN多肽中且用于优先与水溶性聚合物中存在的酮或醛基反应。

可按照实际需要使用任何分子质量的PEG，其必要时包含但不限于约100道尔顿（Dalton；Da）至100,000道尔顿或更大（包含但不限于有时为0.1-50kDa或10-40kDa）。PEG的分子量可为宽范围，其包含但不限于介于约100Da与约100,000Da或更大之间。PEG可介于约100Da与约100,000Da之间，其包含但不限于100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中，PEG介于约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中，PEG介于约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中，PEG介于约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，PEG介于约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，PEG介于约10,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量为30,000Da。在一些实施例中，PEG的分子量为40,000Da。也可使用支链PEG，其包含但不限于各链具有在1-100kDa（包含但不限于1-50kDa或5-20kDa）范围内的MW的PEG分子。支链PEG的各链的分子量可（包含但不限于）介于约1,000Da与约100,000Da或更大之间。支链PEG的各链的分子量可介于约1,000Da与约100,000Da之间，其包含但不限于100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da和1,000Da。在一些实施例中，支链PEG的各链的分子量介于约1,000Da与50,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的各链的分子量介于约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的各链的分子量介于约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的各链的分子量介于约5,000Da与20,000Da之间。多种PEG分子描述于（包含但不限于）Shearwater Polymers,Inc.目录、Nektar Therapeutics目录中，其以引用的方式并入本文中。

通常，PEG分子的至少一个末端可用于与非天然编码氨基酸反应。举例来说，带有用于与氨基酸侧链反应的炔基和叠氮基部分的PEG衍生物可用于将PEG与如本文中所述的非天然编码氨基酸连接。如果非天然编码氨基酸包括叠氮基，那么PEG通常将含有实现[3+2]环加成产物形成的炔部分或实现酰胺键形成的含有膦基的活化PEG物质（即，酯、碳酸酯）。或者，如果非天然编码氨基酸包括炔，那么PEG通常将含有实现[3+2]Huisgen环加成产物形成的叠氮基部分。如果非天然编码氨基酸包括羰基，那么PEG通常将分别包括有效亲核试剂（包含但不限于酰肼、肼、羟胺或氨基脲官能团）以实现相应腙、肟和缩氨基脲键的形成。在其它替代物中，可使用上述反应性基团的相反定向，即，非天然编码氨基酸中的叠氮基部分可与含有炔的PEG衍生物反应。

在一些实施例中，具有PEG衍生物的hIFN多肽变体含有可与非天然编码氨基酸的侧链上存在的化学官能团反应的化学官能团。

在一些实施例中，本发明提供含叠氮基和乙炔的聚合物衍生物，其包括具有约800Da至约100,000Da的平均分子量的水溶性聚合物主链。水溶性聚合物的聚合物主链可为聚乙二醇。然而，应了解包含但不限于聚乙二醇和其它相关聚合物（包含聚(葡聚糖)和聚丙二醇）的多种水溶性聚合物也适用于实施本发明，且术语PEG或聚乙二醇的使用打算涵盖且包含所有这些分子。术语PEG包含但不限于其任何形式的聚乙二醇，包含双官能PEG、多臂PEG、衍生PEG、分叉PEG、支链PEG、侧接PEG（即具有一种或一种以上与聚合物主链侧接的官能团的PEG或相关聚合物）或其中具有可降解键的PEG。

PEG通常为透明、无色无味的，可溶于水中，对热稳定，对许多化学剂呈惰性，不水解或变质，且通常无毒。认为聚乙二醇为生物相容性的，也就是说PEG能够与活组织或有机体共存而不造成伤害。更特定来说，PEG实质上为非免疫原性的，也就是说PEG在体内不倾向于产生免疫反应。当与在体内具有一些所要功能的分子（诸如生物活性剂）连接时，PEG倾向于掩蔽所述药剂且可减少或消除任何免疫反应以使得有机体可耐受所述药剂的存在。PEG接合物倾向于不产生实质免疫反应或造成凝血或其它不需的效应。具有式--CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n--CH₂CH₂--（其中n为约3至约4000，通常约20至约2000）的PEG适用于本发明中。在本发明的一些实施例中，具有约800Da至约100,000Da的分子量的PEG尤其适于用作聚合物主链。PEG的分子量可为宽范围，其包含但不限于介于约100Da与约100,000Da或更大之间。PEG的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，其包含但不限于100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中，PEG的分子量介于约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量介于约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量介于约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量介于约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量介于约10,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量为30,000Da。在一些实施例中，PEG的分子量为40,000Da。

聚合物主链可为线性或分枝的。所属技术领域中通常已知分枝聚合物主链。通常，分枝聚合物具有中心分枝核心部分和多个与中心分枝核心键联的线性聚合物链。PEG通常以分枝形式使用，其可通过向各种多元醇（诸如甘油、甘油寡聚物、季戊四醇以及山梨糖醇）上加成环氧乙烷来制备。中心分枝部分也可自若干种氨基酸（诸如赖氨酸）衍生。分枝聚乙二醇可以通用形式表示为R(-PEG-OH)_m，其中R是衍生自诸如甘油、甘油寡聚物或季戊四醇的核心部分，且m表示臂数目。多臂PEG分子（诸如在美国专利第5,932,462号；第5,643,575号；第5,229,490号；第4,289,872号；美国专利申请案2003/0143596；WO 96/21469；以及WO 93/21259中所述的那些，这些文献各自是以引用的方式全部并入本文中）也可用作聚合物主链。

分枝PEG也可为由PEG(--YCHZ₂)_n表示的分叉PEG的形式，其中Y为键联基团且Z为通过规定长度的原子链与CH键联的活化末端基团。

另一分枝形式侧接PEG沿PEG主链而不是在PEG链的末端上具有诸如羧基的反应性基团。

除这些形式的PEG之外，也可制备在主链中具有弱键或可降解键的聚合物。举例来说，可制备在聚合物主链中具有受水解影响的酯键的PEG。如下文所示，此水解使聚合物裂解为较低分子量的片段：

-PEG-CO₂-PEG-+H₂O→PEG-CO₂H+HO-PEG-。

所属领域的一般技术人员应了解，术语聚乙二醇或PEG表示或包含所属技术领域中已知的所有形式，其包含但不限于在本文中所揭示的那些形式。

许多其它聚合物也适用于本发明中。在一些实施例中，具有2至约300个末端的水溶性聚合物主链尤其适用于本发明中。适合聚合物的实例包含但不限于其它聚(烷撑二醇)，诸如聚丙二醇（“PPG”）、其共聚物（包含但不限于乙二醇与丙二醇的共聚物）、其三聚物、其混合物等等。尽管聚合物主链的各链的分子量可改变，但其通常在约800Da至约100,000Da、通常约6,000Da至约80,000Da的范围内。聚合物主链的各链的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，其包含但不限于100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中，聚合物主链的各链的分子量介于约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物主链的各链的分子量介于约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物主链的各链的分子量介于约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物主链的各链的分子量介于约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物主链的各链的分子量介于约10,000Da与40,000Da之间。

所属领域的一般技术人员将认识到，实质上水溶性主链的上述列表绝非详尽的且仅为说明性的，且预期具有上述品质的所有聚合物材料都适用于本发明中。

在本发明的一些实施例中，聚合物衍生物为“多官能的”，意谓聚合物主链具有经官能团官能化或活化的至少两个末端且可能多达约300个末端。多官能聚合物衍生物包含但不限于具有两个末端的线性聚合物，其中每一末端与可相同或不同的官能团键结。

在一个实施例中，聚合物衍生物具有以下结构：

X—A—POLY—B—N=N=N

其中：

N=N=N为叠氮基部分；

B为键联部分，其可存在或不存在；

POLY为水溶性非抗原聚合物；

A为键联部分，其可存在或不存在且其可与B相同或不同；且

X为第二官能团。

关于A和B的键联部分的实例包含但不限于含有多达18个且可含有介于1-10个之间的碳原子的多官能化烷基。诸如氮、氧或硫的杂原子可包含于烷基链中。烷基链也可在杂原子上分枝。关于A和B的键联部分的其它实例包含但不限于含有多达10个且可含有5-6个碳原子的多官能化芳基。芳基可经一个或一个以上碳原子、氮、氧或硫原子取代。适合键联基团的其它实例包含在美国专利第5,932,462号；第5,643,575号；以及美国专利申请公开案2003/0143596中所述的那些键联基团，这些文献是以引用的方式并入本文中。所属领域的一般技术人员将认识到，键联部分的上述列表绝非详尽的且仅为说明性的，且预期具有上述品质的所有键联部分都适用于本发明中。

用作X的适合官能团的实例包含但不限于羟基、经保护羟基、烷氧基、活性酯（诸如N-羟基琥珀酰亚胺基酯以及1-苯并三唑基酯）、活性碳酸酯（诸如N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯以及1-苯并三唑基碳酸酯）、缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸盐、甲苯磺酸盐、三氟乙基磺酸盐、烯烃、酮以及叠氮化物。如所属领域的一般技术人员所了解，所选X部分应与叠氮基相容以使得不与叠氮基发生反应。含叠氮基的聚合物衍生物可为同双官能的，意谓第二官能团（即，X）也是叠氮基部分，或异双官能的，意谓第二官能团为不同官能团。

术语“经保护”指的是存在防止在某些反应条件下化学反应性官能团的反应的保护基或部分。保护基应视待保护的化学反应性基团的类型而改变。举例来说，如果化学反应性基团为胺或酰肼，那么保护基可自叔丁氧羰基（t-Boc）和9-芴基甲氧基羰基（Fmoc）的群选出。如果化学反应性基团为硫醇，那么保护基可为邻吡啶基二硫化物。如果化学反应性基团为羧酸（诸如丁酸或丙酸）或羟基，那么保护基可为苄基或诸如甲基、乙基或叔丁基的烷基。所属技术领域中已知的其它保护基也可用于本发明中。

文献中末端官能团的特定实例包含但不限于N-琥珀酰亚胺基碳酸酯（例如参看美国专利第5,281,698号、第5,468,478号）、胺（例如参看Buckmann等人,Makromol.Chem.182:1379(1981)；Zalipsky等人,Eur.Polym.J.19:1177(1983)）、酰肼（例如参看Andresz等人,Makromol.Chem.179:301(1978)）、琥珀酰亚胺基丙酸酯和琥珀酰亚胺基丁酸酯（例如参看Olson等人,Poly(ethylene glycol)Chemistry&Biological Applications,第170-181页,Harris和Zalipsky编,ACS,Washington,D.C.,1997；也参看美国专利第5,672,662号）、琥珀酰亚胺基琥珀酸酯（例如参看Abuchowski等人,Cancer Biochem.Biophys.7:175(1984)以及Joppich等人,Makromol.Chem.180:1381(1979)）、琥珀酰亚胺基酯（例如参看美国专利第4,670,417号）、苯并三唑碳酸酯（例如参看美国专利第5,650,234号）、缩水甘油醚（例如参看Pitha等人,Eur.J Biochem.94:11(1979)；Elling等人,Biotech.Appl.Biochem.13:354(1991)）、氧基羰基咪唑（例如参看Beauchamp等人,Anal.Biochem.131:25(1983)；Tondelli等人,J.Controlled Release 1:251(1985)）、碳酸对硝基苯酯（例如参看Veronese等人,Appl.Biochem.Biotech.,11:141(1985)；以及Sartore等人,Appl.Biochem.Biotech.,27:45(1991)）、醛（例如参看Harris等人,J.Polym.Sci.Chem.Ed.22:341(1984)；美国专利第5,824,784号、美国专利第5,252,714号）、马来酰亚胺（例如参看Goodson等人,Biotechnology(NY)8:343(1990)；Romani等人,Chemistry of Peptidesand Proteins 2:29(1984))；以及Kogan,Synthetic Comm.22:2417(1992)）、邻吡啶基-二硫化物（例如参看Woghiren等人,Bioconj.Chem.4:314(1993)）、丙烯醇（例如参看Sawhney等人,Macromolecules,26:581(1993)）、乙烯基砜（例如参看美国专利第5,900,461号）。所有上述参考文献和专利都是以引用的方式并入本文中。

在本发明的某些实施例中，本发明的聚合物衍生物包括具有以下结构的聚合物主链：

X-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-N=N=N

其中：

X为如上所述的官能团；且

n为约20至约4000。

在另一个实施例中，本发明的聚合物衍生物包括具有以下结构的聚合物主链：

X-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-O-(CH₂)_m-W-N=N=N

其中：

W为包括介于1-10个之间的碳原子的脂肪族或芳香族键联部分；

n为约20至约4000；且

X为如上所述的官能团，m介于1与10之间。

可通过所属技术领域中已知和/或在本文中揭示的多种方法来制备本发明的含叠氮基的PEG衍生物。在下文展示的一种方法中，具有约800Da至约100,000Da的平均分子量的水溶性聚合物主链（所述聚合物主链具有与第一官能团键结的第一末端和与适合离去基键结的第二末端）与叠氮基阴离子（其可与众多适合抗衡离子（包含钠、钾、叔丁基铵等等）中的任一种配对）反应。离去基经历亲核置换且由叠氮基部分置换，得到所需含叠氮基的PEG聚合物。

X-PEG-L+N₃ ^-→X-PEG-N₃

如所示，用于本发明中的适合聚合物主链具有式X-PEG-L，其中PEG为聚乙二醇且X为不与叠氮基反应的官能团且L为适合离去基。适合官能团的实例包含但不限于羟基、经保护羟基、缩醛、烯基、胺、氨氧基、经保护胺、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、马来酰亚胺、二硫吡啶和乙烯基吡啶以及酮。适合离去基的实例包含但不限于氯离子、溴离子、碘离子、甲磺酸根、三氟乙基磺酸根以及甲苯磺酸根。

在用于制备本发明的含叠氮基聚合物衍生物的另一种方法中，使带有叠氮基官能团的键联剂与具有约800Da至约100,000Da的平均分子量的水溶性聚合物主链接触，其中键联剂带有会与PEG聚合物上的化学官能团选择性反应的化学官能团，以形成含叠氮基聚合物衍生物产物，其中叠氮基是由键联基团与聚合物主链分离。

例示性反应流程展示如下：

X-PEG-M+N-键联剂-N=N=N→PG-X-PEG-键联剂-N=N=N

其中：

PEG为聚乙二醇且X为诸如烷氧基的封端基团或如在上文中所述的官能团；且

M为不可与叠氮基官能团反应、但可与N官能团有效且选择性反应的官能团。

适合官能团的实例包含但不限于：如果N为胺，那么M为羧酸、碳酸酯或活性酯；如果N为酰肼或氨氧基部分，那么M为酮；如果N为亲核基团，那么M为离去基。

可由已知方法（包含但不限于沉淀产物，必要时接着色谱）实现粗产物的纯化。

下文展示在PEG二胺的情况下的更特定实例，其中一个胺经诸如叔丁基-Boc的保护基部分保护且所得单保护PEG二胺与带有叠氮基官能团的键联部分反应：

BocHN-PEG-NH₂+HO₂C-(CH₂)₃-N=N=N。

在这种情况下，可使用多种活化剂（诸如亚硫酰氯）或碳化二亚胺试剂以及N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基苯并三唑使胺基与羧酸基团偶合以在单胺PEG衍生物与带有叠氮基的键联剂部分之间产生酰胺键。在酰胺键成功形成之后，所得经N-叔丁基-Boc-保护的含叠氮基衍生物可直接用于修饰生物活性分子或其可经进一步精制以安装其它有用官能团。举例来说，可通过用强酸处理使N-t-Boc基团水解以产生ω-氨基-PEG-叠氮化物。所得胺可用作安装其它有用官能团（诸如马来酰亚胺基团、活化二硫化物、活化酯等等）的合成把手（synthetic handle）以产生有价值的异双官能试剂。

当需要将不同分子与聚合物的每一末端连接时，异双官能衍生物尤其有用。举例来说，ω-N-氨基-N-叠氮基PEG会允许具有活化亲电子基团（诸如醛、酮、活化酯、活化碳酸酯等等）的分子与PEG的一个末端连接且具有乙炔的分子与PEG的另一个末端连接。

在本发明的另一个实施例中，聚合物衍生物具有以下结构：

X-A-POLY-B-C≡C-R

其中：

R可为H或烷基、烯烃、烷氧基或芳基或经取代芳基；

B为键联部分，其可存在或不存在；

POLY为水溶性非抗原性聚合物；

A为键联部分，其可存在或不存在且其可与B相同或不同；且

X为第二官能团。

A和B的键联部分的实例包含但不限于含有多达18个且可含有介于1-10个之间的碳原子的多官能化烷基。诸如氮、氧或硫的杂原子可包含于烷基链中。烷基链也可在杂原子上分枝。A和B的键联部分的其它实例包含但不限于含有多达10个且可含有5-6个碳原子的多官能化芳基。芳基可经一个或一个以上碳原子、氮、氧或硫原子取代。适合键联基团的其它实例包含在美国专利第5,932,462号和第5,643,575号以及美国专利申请公开案2003/0143596中所述的那些键联基团，这些文献是以引用的方式并入本文中。所属领域的一般技术人员将认识到，键联部分的上述列表绝非详尽的且仅为说明性的，且预期具有上述品质的多种键联部分适用于本发明中。

用作X的适合官能团的实例包含羟基、经保护羟基、烷氧基、活性酯（诸如N-羟基琥珀酰亚胺基酯以及1-苯并三唑基酯）、活性碳酸酯（诸如N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯以及1-苯并三唑基碳酸酯）、缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙基磺酸盐、烯烃、酮以及乙炔。如所属领域的技术人员所了解，所选X部分应与乙炔相容以使得不与乙炔发生反应。含乙炔的聚合物衍生物可为同双官能的，意谓第二官能团（即，X）也是乙炔部分，或异双官能的，意谓第二官能团为不同官能团。

在本发明的另一个实施例中，聚合物衍生物包括具有以下结构的聚合物主链：

X-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-O-(CH₂)_m-C≡CH

其中：

X为如上所述的官能团；

n为约20至约4000；且

m介于1与10之间。

各异双官能PEG聚合物的特定实例展示如下。

可使用所属领域的一般技术人员已知和/或在本文中揭示的方法来制备本发明的含乙炔的PEG衍生物。在一种方法中，使具有约800Da至约100,000Da的平均分子量的水溶性聚合物主链（所述聚合物主链具有与第一官能团键结的第一末端和与适合亲核基团键结的第二末端）与适于与PEG上的亲核基团反应的带有乙炔官能团与离去基的化合物反应。当带有亲核部分的PEG聚合物与带有离去基的分子组合时，离去基经历亲核置换且由亲核部分置换，得到所需含乙炔的聚合物。

X-PEG-Nu+L-A-C→X-PEG-Nu-A-C≡CR'

如所示，用于反应中的优选聚合物主链具有式X-PEG-Nu，其中PEG为聚乙二醇，Nu为亲核部分且X为不与Nu、L或乙炔官能团反应的官能团。

Nu的实例包含但不限于主要通过SN2型机理反应的胺、烷氧基、芳氧基、巯基、亚氨基、羧酸酯、酰肼、氨氧基。Nu基团的其它实例包含主要通过亲核加成反应来反应的那些官能团。L基团的实例包含氯离子、溴离子、碘离子、甲磺酸根、三氟乙基磺酸根和甲苯磺酸根和预期经历亲核置换的其它基团，以及酮、醛、硫酯、烯烃、α-β不饱和羰基、碳酸酯和预期经历亲核试剂加成的其它亲电子基团。

在本发明的另一个实施例中，A为具有介于1-10个之间的碳原子的脂肪族键联剂或具有介于6-14个之间的碳原子的经取代芳基环。X为不与叠氮基反应的官能团且L为适合离去基。

在用于制备本发明的含乙炔聚合物衍生物的另一种方法中，使具有约800Da至约100,000Da的平均分子量、在一个末端上带有经保护官能团或封端剂且在另一个末端上带有适合离去基的PEG聚合物与乙炔阴离子接触。

例示性反应流程展示如下：

X-PEG-L+-C≡CR'→X-PEG-C≡CR'

其中：

PEG为聚乙二醇且X为诸如烷氧基的封端基团或如上所述的官能团；且

R'为H、烷基、烷氧基、芳基或芳氧基或经取代烷基、烷氧基、芳基或芳氧基。

在上文实例中，当与足够浓度的乙炔阴离子接触时，离去基L应充分反应以经历SN2型置换反应。所属领域的一般技术人员已知由乙炔阴离子实现离去基的SN2置换所需的反应条件。

通常可由所属技术领域中已知的方法（包含但不限于沉淀产物，必要时接着色谱）来实现粗产物的纯化。

水溶性聚合物可与本发明的hIFN多肽键联。水溶性聚合物可通过并入hIFN多肽中的非天然编码氨基酸或非天然编码或天然编码氨基酸的任何官能团或取代基，或加成到非天然编码或天然编码氨基酸上的任何官能团或取代基键联。或者，水溶性聚合物是通过天然存在氨基酸（包含但不限于半胱氨酸、赖氨酸或N末端残基的胺基）与并有非天然编码氨基酸的hIFN多肽键联。在一些情况下，本发明的hIFN多肽包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个非天然氨基酸，其中一个或一个以上非天然编码氨基酸与一种或一种以上水溶性聚合物（包含但不限于PEG和/或寡糖）键联。在一些情况下，本发明的hIFN多肽包括与水溶性聚合物键联的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上天然编码氨基酸。在一些情况下，本发明的hIFN多肽包括一个或一个以上与水溶性聚合物键联的非天然编码氨基酸以及一个或一个以上与水溶性聚合物键联的天然存在氨基酸。在一些实施例中，相对于未接合形式，在本发明中所用的水溶性聚合物增强hIFN多肽的血清半衰期。

与本发明的hIFN多肽键联的水溶性聚合物的数目（即，聚乙二醇化或糖基化程度）可经调节以提供改变（包含但不限于增加或降低）的药理学、药物动力学或药效特征，诸如活体内半衰期。在一些实施例中，hIFN的半衰期比未经修饰多肽增加至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍或至少约100倍。

含有强亲核基团（即，酰肼、肼、羟胺或氨基脲）的PEG衍生物

在本发明的一个实施例中，包括含羰基非天然编码氨基酸的hIFN多肽经含有与PEG主链直接键联的末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分的PEG衍生物修饰。

在一些实施例中，羟胺末端PEG衍生物将具有以下结构：

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-O-NH₂

其中R为简单烷基（甲基、乙基、丙基等），m为2-10且n为100-1,000（即，平均分子量介于5-40kDa之间）。

在一些实施例中，含肼或含酰肼PEG衍生物将具有以下结构：

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-X-NH-NH₂

其中R为简单烷基（甲基、乙基、丙基等），m为2-10且n为100-1,000且X视情况为可存在或不存在的羰基（C=O）。

在一些实施例中，含氨基脲PEG衍生物将具有以下结构：

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-NH-C(O)-NH-NH₂

其中R为简单烷基（甲基、乙基、丙基等），m为2-10且n为100-1,000。

在本发明的另一个实施例中，包括含羰基氨基酸的hIFN多肽经含有借助于酰胺键与PEG主链键联的末端羟胺、酰肼、肼或氨基脲部分的PEG衍生物修饰。

在一些实施例中，羟胺末端PEG衍生物具有以下结构：

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_m-O-NH₂

在一些实施例中，含肼或含酰肼PEG衍生物具有以下结构：

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_m-X-NH-NH₂

其中R为简单烷基（甲基、乙基、丙基等），m为2-10，n为100-1,000且X视情况为可存在或不存在的羰基（C=O）。

在一些实施例中，含氨基脲PEG衍生物具有以下结构：

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_m-NH-C(O)-NH-NH₂

在本发明的另一个实施例中，包括含羰基氨基酸的hIFN多肽经含有末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分的分枝PEG衍生物修饰，其中分枝PEG的各链具有在10-40kDa且可为5-20kDa的范围内的MW。

在本发明的另一个实施例中，包括非天然编码氨基酸的hIFN多肽经具有分枝结构的PEG衍生物修饰。举例来说，在一些实施例中，肼或酰肼末端PEG衍生物将具有以下结构：

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)]₂CH(CH₂)_m-X-NH-NH₂

其中R为简单烷基（甲基、乙基、丙基等），m为2-10且n为100-1,000，且X视情况为可存在或不存在的羰基（C=O）。

在一些实施例中，含有氨基脲基团的PEG衍生物将具有以下结构：

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂]₂CH-X-(CH₂)_m-NH-C(O)-NH-NH₂

其中R为简单烷基（甲基、乙基、丙基等），X视情况为NH、O、S、C(O)或不存在，m为2-10且n为100-1,000。

在一些实施例中，含有羟胺基团的PEG衍生物将具有以下结构：

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂]₂CH-X-(CH₂)_m-O-NH₂

一种或一种以上水溶性聚合物与hIFN多肽键联的程度和位点可调节在位点1处hIFN多肽与hIFN多肽受体的结合。在一些实施例中，如由平衡结合检定（诸如在Spencer等人,J.Biol.Chem.,263:7862-7867(1988)中关于hGH所述）所测量，键联经排列以使得在位点1处hIFN多肽与hIFN多肽受体的结合具有约400nM或更低的K_d，具有150nM或更低的K_d，且在一些情况下具有100nM或更低的K_d。

用于聚合物的活化以及肽的接合的方法和化学描述于文献中且在所属技术领域中已知。用于活化聚合物的常用方法包含但不限于用溴化氰、高碘酸盐、戊二醛、双环氧化物、表氯醇、二乙烯基砜、碳化二酰亚胺、磺酰卤、三氯三嗪等活化官能团。（参看R.F.Taylor,(1991),PROTEIN Immobilisation.Fundamental and Applications,MarcelDekker,N.Y.；S.S.Wong,(1992),Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking,CRCPress,Boca Raton；G.T.Hermanson等人,(1993),Immobilized Affinity Ligand Techniques,Academic Press,N.Y.；Dunn,R.L.等人编,POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERYSYSTEMS,ACS Symposium Series第469卷,American Chemical Society,Washington,D.C.1991）。

可获得关于PEG的官能化和接合的若干概述和专论。例如参看Harris,Macromol.Chem.Phys.C25:325-373(1985)；Scouten,Methods in Enzymology 135:30-65(1987)；Wong等人,Enzyme Microb.Technol 14:866-874(1992)；Delgado等人,Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems 9:249-304(1992)；Zalipsky,Bioconjugate Chem.6:150-165(1995)。

用于活化聚合物的方法也可见于WO 94/17039、美国专利第5,324,844号、WO94/18247、WO 94/04193、美国专利第5,219,564号、美国专利第5,122,614号、WO90/13540、美国专利第5,281,698号和WO 93/15189中，以及使活化聚合物与包含但不限于凝血因子VIII（WO 94/15625）、血红蛋白（WO 94/09027）、携氧分子（美国专利第4,412,989号）、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶（Veronese等人,App.Biochem.Biotech.11:141-52(1985)）的酶之间接合的方法。所引用的所有参考文献和专利都是以引用的方式并入本文中。

通过任何便利方法进行含有非天然编码氨基酸（诸如对叠氮基-L-苯丙氨酸）的hIFN多肽的聚乙二醇化（即，添加任何水溶性聚合物）。举例来说，用经炔基封端的mPEG衍生物使hIFN多肽聚乙二醇化。简单地说，在室温下在搅拌下向含对叠氮基-L-Phe的hIFN多肽的水溶液中添加过量固体mPEG(5000)-O-CH₂-C≡CH。通常用具有接近反应进行的pH值（通常pH值约为4-10）的pK_a的缓冲液缓冲水溶液。用于在pH 7.5下聚乙二醇化的适合缓冲液的实例（例如）包含但不限于HEPES、磷酸盐、硼酸盐、TRIS-HCl、EPPS和TES。必要时连续监控且调节pH值。通常使反应持续进行约1-48小时之间。

反应产物随后经历疏水相互作用色谱以将聚乙二醇化hIFN多肽变体与游离mPEG(5000)-O-CH₂-C≡CH和当未封闭PEG在分子两端经活化从而使hIFN多肽变体分子交联时可形成的聚乙二醇化hIFN多肽的任何高分子量复合物分离开来。疏水相互作用色谱期间的条件应使得游离mPEG(5000)-O-CH₂-C≡CH流过柱，而任何交联聚乙二醇化hIFN多肽变体复合物在所需形式后洗提出，其含有与一个或一个以上PEG基团接合的一种hIFN多肽变体分子。适合条件视交联复合物相对于所需接合物的相对尺寸而改变且易于由所属领域的一般技术人员确定。将含有所需接合物的洗出液通过超滤浓缩且通过透滤脱盐。

必要时，可由一种或一种以上所属领域的一般技术人员已知的程序进一步纯化获自疏水性色谱的聚乙二醇化hIFN多肽，这些程序包含但不限于亲和色谱；阴离子或阳离子交换色谱（使用（包含但不限于）DEAE SEPHAROSE）；硅胶色谱；反相HPLC；凝胶过滤（使用（包含但不限于）SEPHADEX G-75）；疏水相互作用色谱；尺寸排阻色谱；金属螯合物色谱；超滤/透滤；乙醇沉淀；硫酸铵沉淀；色谱聚集；置换色谱；电泳程序（包含但不限于制备型等电聚焦）；差示溶解度（包含但不限于硫酸铵沉淀）；或萃取。可通过与球状蛋白质标准物（Preneta,AZ,在Protein purification methods中,A practicalapproach(Harris和Angal编)IRL Press 1989,293-306）进行比较由GPC来估计表观分子量。可通过蛋白水解降解（包含但不限于胰蛋白酶裂解），接着质谱分析来评估hGH-PEG接合物的纯度。Pepinsky RB.等人,J，Pharmcol.& Exp.Ther.297(3):1059-66(2001)。

可不受限制地进一步衍生或取代与本发明的hIFN多肽的氨基酸键联的水溶性聚合物。

含叠氮基的PEG衍生物

在本发明的另一个实施例中，hIFN多肽是经含有可与非天然编码氨基酸的侧链上存在的炔基部分反应的叠氮基部分的PEG衍生物修饰。一般来说，PEG衍生物具有在1-100kDa且在一些实施例中10-40kDa的范围内的平均分子量。

在一些实施例中，叠氮基末端PEG衍生物将具有以下结构：

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-N₃

在另一实施例中，叠氮基末端PEG衍生物将具有以下结构：

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-NH-C(O)-(CH₂)_p-N₃

其中R为简单烷基（甲基、乙基、丙基等），m为2-10，p为2-10且n为100-1,000（即，平均分子量介于5-40kDa之间）。

在本发明的另一个实施例中，包括含炔氨基酸的hIFN多肽是经含有末端叠氮基部分的分枝PEG衍生物修饰，其中分枝PEG的各链具有在10-40kDa且可为5-20kDa的范围内的MW。举例来说，在一些实施例中，叠氮基末端PEG衍生物将具有以下结构：

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)]₂CH(CH₂)_m-X-(CH₂)_pN₃

其中R为简单烷基（甲基、乙基、丙基等），m为2-10，p为2-10，且n为100-1,000，且X视情况为O、N、S或羰基（C=O），在每一情况下X可存在或不存在。

含炔PEG衍生物

在本发明的另一个实施例中，hIFN多肽是经含有可与非天然编码氨基酸的侧链上存在的叠氮基部分反应的炔部分的PEG衍生物修饰。

在一些实施例中，炔末端PEG衍生物将具有以下结构：

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-C≡CH

在本发明的另一个实施例中，包括含炔非天然编码氨基酸的hIFN多肽是经含有借助于酰胺键与PEG主链键联的末端叠氮基或末端炔部分的PEG衍生物修饰。

在一些实施例中，炔末端PEG衍生物将具有以下结构：

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_mNH-C(O)-(CH₂)_p-C≡CH

其中R为简单烷基（甲基、乙基、丙基等），m为2-10，p为2-10且n为100-1,000。

在本发明的另一个实施例中，包括含叠氮基氨基酸的hIFN多肽是经含有末端炔部分的分枝PEG衍生物修饰，其中分枝PEG的各链具有在10-40kDa且可为5-20kDa的范围内的MW。举例来说，在一些实施例中，炔末端PEG衍生物将具有以下结构：

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)]₂CH(CH₂)_m-X-(CH₂)_pC≡CH

其中R为简单烷基（甲基、乙基、丙基等），m为2-10，p为2-10，且n为100-1,000，且X视情况为O、N、S或羰基（C=O）或不存在。

含膦PEG衍生物

在本发明的另一个实施例中，hIFN多肽是经含有活化官能团（包含但不限于酯、碳酸酯）的PEG衍生物修饰，所述官能团进一步包括会与非天然编码氨基酸的侧链上存在的叠氮基部分反应的芳基膦基团。一般来说，PEG衍生物将具有在1-100kDa且在一些实施例中10-40kDa的范围内的平均分子量。

在一些实施例中，PEG衍生物将具有以下结构：

其中n为1-10；X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基，且W为水溶性聚合物。

在一些实施例中，PEG衍生物将具有以下结构：

其中X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基，W为水溶性聚合物且R可为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基。例示性R基团包含但不限于-CH₂、-C(CH₃)₃、-OR'、-NR'R"、-SR'、-卤素、-C(O)R'、-CONR'R"、-S(O)₂R'、-S(O)₂NR'R"、-CN和-NO₂。R'、R″、R″′和R″"各自独立地指氢、经取代或未经取代杂烷基、经取代或未经取代芳基（包含但不限于经1-3个卤素取代的芳基）、经取代或未经取代烷基、烷氧基或硫烷氧基或芳基烷基。当本发明的化合物包含一个以上R基团时，例如，各R基团是如当存在一个以上这些基团时各R'、R″、R″′和R″"基团一样独立地选择。当R'和R"与同一氮原子连接时，其可与氮原子组合以形成5元、6元或7元环。举例来说，-NR'R"打算包含但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据关于取代基的上述论述，所属领域的技术人员应了解术语“烷基”打算包含包括与除氢基之外的基团结合的碳原子的基团，诸如卤烷基（包含但不限于-CF₃和-CH₂CF₃）和酰基（包含但不限于-C(O)CH₃、-C(O)CF₃、-C(O)CH₂OCH₃等等）。

其它PEG衍生物和通用聚乙二醇化技术

可与hIFN多肽键联的其它例示性PEG分子以及聚乙二醇化方法包含在以下文献中所述的那些：例如，美国专利公开案第2004/0001838号；第2002/0052009号；第2003/0162949号；第2004/0013637号；第2003/0228274号；第2003/0220447号；第2003/0158333号；第2003/0143596号；第2003/0114647号；第2003/0105275号；第2003/0105224号；第2003/0023023号；第2002/0156047号；第2002/0099133号；第2002/0086939号；第2002/0082345号；第2002/0072573号；第2002/0052430号；第2002/0040076号；第2002/0037949号；第2002/0002250号；第2001/0056171号；第2001/0044526号；第2001/0021763号；美国专利第6,646,110号；第5,824,778号；第5,476,653号；第5,219,564号；第5,629,384号；第5,736,625号；第4,902,502号；第5,281,698号；第5,122,614号；第5,473,034号；第5,516,673号；第5,382,657号；第6,552,167号；第6,610,281号；第6,515,100号；第6,461,603号；第6,436,386号；第6,214,966号；第5,990,237号；第5,900,461号；第5,739,208号；第5,672,662号；第5,446,090号；第5,808,096号；第5,324,844号；第5,252,714号；第6,420,339号；第6,201,072号；第6,451,346号；第6,306,821号；第5,559,213号；第5,612,460号；第5,747,646号；第5,834,594号；第5,849,860号；第5,980,948号；第6,004,573号；第6,129,912；WO 97/32607、EP 229,108、EP 402,378、WO 92/16555、WO 94/04193、WO94/14758、WO 94/17039、WO 94/18247、WO 94/28024、WO 95/00162、WO 95/11924、WO 95/I3090、WO 95/33490、WO 96/00080、WO 97/18832、WO 98/41562、WO 98/48837、WO 99/32134、WO 99/32139、WO 99/32140、WO 96/40791、WO 98/32466、WO 95/06058、EP 439508、WO 97/03106、WO 96/21469、WO 95/13312、EP 921131、WO 98/05363、EP 809996、WO 96/41813、WO 96/07670、EP 605963、EP 510356、EP 400472、EP 183503和EP 154316，其是以引用的方式并入本文中。本文中所述的任一种PEG分子可以任何形式使用，所述形式包含但不限于单链、分枝、多臂链、单官能、双官能、多官能或其任何组合。

增强对血清白蛋白的亲和性

各种分子也可与本发明的hIFN多肽融合以调节hIFN多肽在血清中的半衰期。在一些实施例中，分子与本发明的hIFN多肽键联或融合以增强对动物中内源血清白蛋白的亲和性。

举例来说，在一些情况下，制造hIFN多肽与白蛋白结合序列的重组融合体。例示性白蛋白结合序列包含但不限于来自链球菌（streptococcal）蛋白G的白蛋白结合域（例如参看Makrides等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.277:534-542(1996)和Sjolander等人,J.Immunol.Methods 201:115-123(1997)），或白蛋白结合肽（诸如在（例如）Dennis等人,J.Biol.Chem.277:35035-35043(2002)中所述的那些）。

在其它实施例中，本发明的hIFN多肽经脂肪酸酰化。在一些情况下，脂肪酸促进与血清白蛋白的结合。例如参看Kurtzhals等人,Biochem.J.312:725-731(1995)。

在其它实施例中，本发明的hIFN多肽是直接与血清白蛋白（包含但不限于人类血清白蛋白）融合。所属领域的技术人员将认识到多种其它分子也可与本发明的hIFN键联以调节与血清白蛋白或其它血清组分的结合。

X.hIFN多肽的糖基化

本发明包含并有一种或一种以上带有糖残基的非天然编码氨基酸的hIFN多肽。糖残基可为天然（包含但不限于N-乙酰基葡糖胺）或非天然（包含但不限于3-氟半乳糖）。糖可通过N或O键联的糖苷键（包含但不限于N-乙酰基半乳糖-L-丝氨酸）或非天然键（包含但不限于肟或相应的C或S键联糖苷）与非天然编码氨基酸键联。

糖（包含但不限于糖基）部分可在活体内或活体外添加到hIFN多肽中。在本发明的一些实施例中，包括含羰基非天然编码氨基酸的hIFN多肽是经以氨氧基衍生的糖修饰以通过肟键键联产生相应糖基化多肽。一旦与非天然编码氨基酸连接，糖即可通过用糖基转移酶和其它酶处理而进一步精制以产生与hIFN多肽结合的寡糖。例如参看H.Liu等人,J.Am.Chem.Soc.125:1702-1703(2003)。

在本发明的一些实施例中，包括含羰基非天然编码氨基酸的hIFN多肽是经制备为氨氧基衍生物的具有规定结构的聚糖直接修饰。所属领域的技术人员将认识到，其它官能团（包含叠氮基、炔、酰肼、肼和氨基脲）可用于将糖与非天然编码氨基酸键联。

在本发明的一些实施例中，包括含叠氮基或炔基非天然编码氨基酸的hIFN多肽随后可分别经（包含但不限于）炔基或叠氮基衍生物由（包含但不限于）Huisgen[3+2]环加成反应进行修饰。这种方法允许在极高选择性下修饰蛋白质。

XI.GH超基因家族成员二聚体和多聚体

本发明也提供GH超基因家族成员组合（包含但不限于hIFN和hIFN类似物），诸如同二聚体、异二聚体、同多聚体或异多聚体（即，三聚体、四聚体等），其中含有一个或一个以上非天然编码氨基酸的GH超基因家族成员多肽（诸如hIFN）直接与多肽主链或通过连接子与另一GH超基因家族成员或其变体或作为非GH超基因家族成员或其变体的任何其它多肽结合。由于其与单体相比分子量增加，所以GH超基因家族成员（诸如hIFN）二聚体或多聚体接合物相对于单体GH超基因家族成员可显示新颖或所需性质（包含但不限于不同的药理学、药物动力学、药效性质）、经调节的治疗半衰期或经调节的血浆半衰期。在一些实施例中，本发明的GH超基因家族成员（诸如hIFN）二聚体将调节GH超基因家族成员受体的二聚合。在其它实施例中，本发明的GH超基因家族成员二聚体或多聚体将充当GH超基因家族成员受体的拮抗剂、激动剂或调节剂。

在一些实施例中，在含有二聚体或多聚体的hIFN中存在的一个或一个以上hIFN分子包括与位点II结合区内存在的水溶性聚合物键联的非天然编码氨基酸。同样，二聚体或多聚体的各hIFN分子可通过位点I界面与hIFN多肽受体结合，但不可通过位点II界面与第二hIFN多肽受体结合。因此，hIFN多肽二聚体或多聚体可进入两种不同hIFN多肽受体的每一者的位点I结合位点，但因为hIFN分子具有与位点II区域中存在的非遗传编码氨基酸连接的水溶性聚合物，所以hIFN多肽受体不能进入hIFN多肽配体的位点II区域且二聚体或多聚体充当hIFN多肽拮抗剂。在一些实施例中，在含有二聚体或多聚体的hIFN多肽中存在的一个或一个以上hIFN分子包括与存在于位点I结合区内的水溶性聚合物键联的非天然编码氨基酸，从而允许与位点II区域结合。或者，在一些实施例中，在含有二聚体或多聚体的hIFN多肽中存在的一个或一个以上hIFN分子包括与存在于不在位点I或位点II结合区内的位点处的水溶性聚合物键联的非天然编码氨基酸，以使得两者可用于结合。在一些实施例中，使用具有可用于结合的位点I、位点II或两者的hIFN分子的组合。其中至少一个分子具有可用于结合的位点I且至少一个分子具有可用于结合的位点II的hIFN分子的组合可提供具有所需活性或性质的分子。另外，具有可用于结合的位点I和位点II的hIFN分子的组合可产生超激动剂hIFN分子。

在一些实施例中，GH超基因家族成员多肽（包含但不限于）通过Asn-Lys酰胺键或Cys-Cys二硫键直接键联。在一些实施例中，经键联GH超基因家族成员多肽和/或经键联非GH超基因家族成员将包括不同的非天然编码氨基酸以促进二聚合，其包含但不限于第一hIFN多肽的一个非天然编码氨基酸中的炔基与第二GH超基因家族成员多肽的第二非天然编码氨基酸中的叠氮基将通过Huisgen[3+2]环加成接合。或者，第一GH超基因家族成员和/或经键联非GH超基因家族成员（即，包括含酮非天然编码氨基酸的多肽）可与包括含羟胺非天然编码氨基酸的第二GH超基因家族成员多肽接合且所述多肽是通过形成相应肟进行反应。

或者，两种GH超基因家族成员多肽和/或经键联非GH超基因家族成员是通过连接子键联。任何异双官能连接子或同双官能连接子都可用于键联两种GH超基因家族成员和/或经键联非GH超基因家族成员多肽，其可具有相同或不同一级序列。在一些情况下，用于将GH超基因家族成员和/或经键联非GH超基因家族成员多肽连接在一起的连接子可为双官能PEG试剂。连接子可具有宽范围的分子量或分子长度。较大或较小分子量连接子可用于在GH超家族成员与键联实体之间提供所需空间关系或构象。具有较长或较短分子长度的连接子也可用于在GH超家族成员与键联实体之间提供所需空间或可挠性。类似地，在GH超家族成员到达其标靶之前或之后，具有特定形状或构象的连接子可用于赋予GH超家族成员或键联实体特定形状或构象。这种GH超家族成员与键联实体之间的空间关系的最优化可向分子提供新颖的、经调节的或所需的性质。

在一些实施例中，本发明提供具有哑铃结构的水溶性双官能连接子，其包含：a）在聚合物主链的至少一个第一末端上的含有叠氮基、炔、肼、酰肼、羟胺或羰基的部分；以及b）在聚合物主链的第二末端上的至少一个第二官能团。第二官能团可与第一官能团相同或不同。在一些实施例中，第二官能团不与第一官能团反应。在一些实施例中，本发明提供包括分枝分子结构的至少一个臂的水溶性化合物。举例来说，分枝分子结构可为树枝状。

在一些实施例中，本发明提供通过与水溶性活化聚合物反应而形成的包括一个或一个以上GH超基因家族成员（诸如hIFN）的多聚体，其中所述聚合物具有以下结构：

R-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-X，

其中n为约5至3,000，m为2-10，X可为含有叠氮基、炔、肼、酰肼、氨氧基、羟胺、乙酰基或羰基的部分，且R为可与X相同或不同的封端基团、官能团或离去基。R可为（例如）选自由以下各官能团组成的群组的官能团：羟基、经保护羟基、烷氧基、N-羟基琥珀酰亚胺基酯、1-苯并三唑基酯、N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯、1-苯并三唑基碳酸酯、乙缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和三氟乙磺酸酯、烯烃以及酮。

XII.测量hIFN多肽活性和hIFN多肽对hIFN多肽受体的亲和性

可如美国专利第6,566,132号、第5,889,151号、第5,861,258号、第5,731,169号、第5,578,707号中所述来制备hIFN受体，所述文献是以引用的方式并入本文中。可使用标准或已知活体外或活体内检定来测定hIFN多肽活性。举例来说，回应hIFN来调节生长或MHC I类或II类抗原产生或结合hIFN的细胞或细胞系（包含但不限于含有活性IFN受体的细胞（诸如人类类淋巴母细胞Daudi细胞），或产生重组IFN受体的细胞）可用于监控hIFN受体结合。对于包括非天然氨基酸的非聚乙二醇化或聚乙二醇化hIFN多肽来说，可通过使用所属技术领域中已知的技术（诸如BIAcoreTM生物传感器（Pharmacia））来测量激素对其受体的亲和性。用于测试hIFN活性的活体内动物模型以及人类临床试验包含在例如以下文献中所述的那些：Kontsek等人,Acta Virol.43:63(1999)；Youngster等人,Current Pharma Design 8:2139(2002)；Kozlowski等人,BioDrugs 15:419(2001)；美国专利第6,180,096号；第6,177,074号；第6,042,822号；第5,981,709号；第5,951,974号；第5,908,621号；第5,711,944号；第5,738,846号，其是以引用的方式并入本文中。

不管使用哪种方法产生本发明的hIFN类似物，类似物都经历对于生物活性的检定。可进行氚化胸苷检定以确定细胞分裂的程度。然而，其它生物检定也可用于确定所需活性。诸如检定抑制病毒复制的能力的生物检定也提供IFN活性的指标。参看Bailon等人,Bioconj.Chem.12:195(2001)；Forti等人,Meth.Enzymol.119:533(1986)；Walter等人,Cancer Biother.&Radiopharm.13:143(1998)；DiMarco等人,BioChem.Biophys.Res.Com.202:1445(1994)；Foser等人,Pharmacogenomics Journal 3:312-319(2003)；以及美国专利第4,675,282号；第4,241,174号；第4,514,507号；第4,622,292号；第5,766,864号，其是以引用的方式并入本文中。诸如由Oritani等人,Nature Medicine 20006(6):659-666；Kawamoto等人,Experimental Hematology 200432:797-805；以及Kawamoto等人,J Virol.2003年9月;77(17):9622-31所述的那些检定也可用于评估本发明的hIFN多肽的生物活性和潜在副作用。

Platanias等人在Experimental Hematology 1999;27:1583-1592（其是以引用的方式并入本文中）中论述由包含Jak-Stat路径、胰岛素受体底物（IRS）/PI-3'-激酶路径的干扰素活化的信号转导路径，以及CBL和Crk-信号转导路径的活化。论述Vav原癌基因的重要性和其在IFN依赖性生长抑制中的作用和酪胺酸磷酸酶在I型IFN信号转导中的作用，以及对由II型干扰素受体进行的信号级联至关重要的分子。评估信号转导和干扰素受体结合下游路径的检定可用于评估本发明的hIFN多肽，所述检定包含Platanias等人在Experimental Hematology 199927:1315-1321（其是以引用的方式并入本文中）中所述的研究，其研究蛋白质Crk家族的两个成员CrkL和CrkII。

为评估hIFN多肽对正常骨髓（CFU-GM）和红系祖细胞（BFU-E）的作用，可使用诸如由Kawamoto等人,Experimental Hematology 200432:797-805或Giron-Michel,Leukemia 2002 16:1135-1142所述的菌落形成检定，所述文献是以引用的方式并入本文中。也可进行巨核细胞的克隆增殖。在菌落形成检定与骨髓毒性之间存在相关性。可在（例如）经注射hIFN多肽后的小鼠的外周血或骨髓中测量对正常造血作用的活体内影响，或可如Kawamoto等人所述测量对小鼠体温的影响。寡腺苷酸合成酶mRNA也可用作抗病毒活性的生物标记（分枝DNA检定）。

可用本发明的hIFN多肽进行病毒复制检定或活体内研究以筛检抗病毒活性。所属领域的技术人员已知病毒复制检定且其可涉及HCV（C型肝炎病毒）、VSV（水疱性口腔炎病毒）或EMCV（脑心肌炎病毒）。可对由各种方法（包含但不限于RT-PCR、实时PCR或分枝DNA方法）测量的RNA表达进行涉及人类WISH或Huh-7细胞的HCV复制子检定。可使用不同HCV基因型，其包含但不限于HCV基因型1a和1b。也可通过hIFN多肽测量细胞（诸如感染VSV的幼仓鼠肾BHK21细胞）的细胞病理效应（CPE）的降低。各种细胞系和计算算法可用于测定CPE检定中的效能。与已知参考标准物进行比较且可计算国际单位。其它检定包含但不限于涉及在特定细胞系和感染EMCV的人类包皮成纤维细胞中的HCV复制的检定（Trotta等人,Drug Information Journal(2000);34:1231-1246），其是以引用的方式并入本文中。

其它活体外检定可用于确定生物活性。一般来说，对于生物活性的测试应提供对于所需结果的分析，诸如生物活性增加或降低（与未改变IFN相比）、不同生物活性（与未改变IFN相比）、受体亲和性分析或血清半衰期分析。

以前已报导Daudi细胞将与¹²⁵I标记鼠科动物IFN结合且此结合可通过添加未经标记IFN而得到竞争（例如参看美国专利第5,516,515号；第5,632,988号）。测试天然IFN和hIFN竞争结合人类和鼠科动物白血病细胞的¹²⁵I-IFN的能力。经高度纯化的天然IFN（大于95%纯；1μg）经碘化[Tejedor等人,Anal.Biochem.,127,143(1982)]，且通过凝胶过滤和离子交换色谱与反应物分离。天然¹²⁵I-IFN的比活性可为约100μCi/μg蛋白质。

Trotta等人,Drug Information Journal 2000；34:1231-1246（其是以引用的方式并入本文中）论述IFNα的众多生物活性，包含免疫调节、抗增殖、抗病毒和抗菌活性。尽管氨基酸序列具有高度同源性，但不同人类IFNα种类显示变化的生物活性的相对水平。所属领域的技术人员已知用于测量一种或一种以上IFNα种类的免疫调节、抗增殖、抗病毒和抗菌活性的检定可用于评估本发明的hIFN多肽。

可进行测量前列腺素（例如PGE2）的分泌的活体外检定来评估本发明的hIFN多肽。前列腺素调节多种CNS功能，诸如发热的产生和疼痛的感知，且目前IFN疗法的副作用的一种为发热。

使用寡核苷酸阵列转录物分析的单聚乙二醇化干扰素-α-2a异构体的转录活性描述于Foser等人,Pharmacogenomics Journal 2003；3:312-319中，其是以引用的方式全部并入本文中。可用本发明的hIFN多肽进行类似检定。可用于基因表达研究中的细胞系包含但不限于黑素瘤细胞系（诸如ME15）。ME15或类似细胞系也可用于研究本发明的hIFN多肽的功能性质。可用本发明的hIFN多肽进行DNA微阵列的替代性检定以提供mRNA分布数据、差示基因表达信息或改变的基因表达数据（转录或翻译产物含量的变化）。也可进行细胞阵列。DNA微阵列或DNA芯片研究涉及以高密度形式或阵列装配在固体表面上的基因组内的一组基因或所有基因的PCR产物。可使用关于阵列建构和使用的通用方法（参看Schena M,Shalon D,Davis R W，Brown P O.,Quantitative monitoringof gene expression patterns with a complementary DNA microarray.Science.Oct.20,1995；270(5235):467-70）。DNA微阵列允许通过将包括这些基因或这些基因的PCR产物的DNA微阵列与由欲分析样品制备的cDNA探针杂交同时进行对许多基因的基因表达谱或概况的分析。DNA微阵列或“芯片”技术允许在基因组层面上研究基因表达，从而允许同时测量许多基因的转录水平。所属领域的一般技术人员已知用于各种阵列和类似分析的方法和材料。

关于检定方法的参考文献的上述编辑并非详尽的，且所属领域的技术人员将了解适用于测试所需最终结果的其它检定。所属领域的一般技术人员已知对这些检定的改变。

XIII.测量效能、功能性活体内半衰期、毒性和药物动力学参数

本发明的一个重要方面为通过在存在或不存在多肽与水溶性聚合物部分接合的情况下建构hIFN多肽而获得的延长的生物半衰期。hIFN多肽血清浓度的迅速减小已使其对于评估经接合和未接合hIFN多肽和其变体治疗的生物反应来说为重要的。在经皮下或静脉内投与后，本发明的接合和未接合hIFN多肽和其变体也可具有延长的血清半衰期，使其有可能通过（例如）ELISA方法或初步筛选检定来测量。可使用来自BioSourceInternational（Camarillo,CA）或Diagnostic Systems Laboratories（Webster,TX）的ELISA或RIA试剂盒。用于测量IFN或其变体的活体内半衰期的检定的另一个实例描述于Kozlowski等人,BioDrugs 15:419(2001)；Bailon等人,Bioconj.Chem.12:195(2001)；Youngster等人,Current Pharm.Design 8:2139(2002)；美国专利第6,524,570号；第6,250,469号；第6,180,096号；第6,177,074号；第6,042,822号；第5,981,709号；第5,591,974号；第5,908,621号；第5,738,846号中，其是以引用的方式并入本文中。如本文中所述进行活体内生物半衰期的测量。

可根据美国专利第5,711,944号；第5,382,657号（其是以引用的方式并入本文中）中所述的方案来测定包括非天然编码氨基酸的hIFN多肽的效能和功能性活体内半衰期。

可在正常Sprague-Dawley雄性大鼠（N为每治疗组5只动物）中评估包括非天然编码氨基酸的hIFN多肽的药物动力学参数。动物将静脉内接受每只大鼠25μg的单剂量或经皮下接受每只大鼠50μg的单剂量，且将根据预定时程取约5-7个血样，对于未与水溶性聚合物接合的包括非天然编码氨基酸的hIFN多肽来说，通常历时约6小时；且对于包括非天然编码氨基酸且与水溶性聚合物接合的hIFN多肽来说，通常历时约4天。在若干种物种中良好研究hIFN多肽的药物动力学数据且其可与关于包括非天然编码氨基酸的hIFN多肽获得的数据直接进行比较。关于涉及hGH的研究，参看Mordenti J.等人,Pharm.Res.8(11):1351-59(1991)。

也可在灵长类动物（例如，猕猴）中评估药物动力学参数。通常，经皮下或静脉内施用单次注射，且随时间监控血清hIFN含量。

Uno等人（其是以引用的方式并入本文中）在J Interferon Cytokine Res.1998年12月;18(12):1011-8中描述回应IFN在THP-1细胞中诱发2',5'寡腺苷酸合成酶。特定来说，所述检定对IFNα敏感且可用作对于血清干扰素的生物检定。

用于研究hIFN多肽的抗病毒活性的动物模型包含但不限于黑猩猩HCV（Purcell RH,FEMS Microbiol Rev.1994年7月；14(3):181-91）、HCV-Trimera小鼠（Ilan E等人,J InfectDis.2002年1月15日;185(2):153-61）以及Alb-uPA转基因小鼠模型（Mercer DF等人,Nat Med.2001年8月;7(8):927-33；Kneteman,N等人,(2003)10th HCV Meeting KyotoJapan,P-187），所有文献都是以引用的方式并入本文中。其它动物模型可用于评估诸如发热、抑郁和痛阈的副作用。

可使用人类骨髓NOD/SCID重建模型来评估本发明的hIFN多肽。所属领域的一般技术人员已知对这种方案的改变。使用这种模型，移植方案如下：在无菌条件下将NOD/SCID小鼠圈养于微隔离笼中。仅在全身照射之前和两个月之后使小鼠接受酸化H₂O（pH=3）。使用137Csγ-辐射器（约1cGy/min）对NOD/SCID小鼠次致命照射325-350cGy。在照射当天通过静脉内注射用人类MNC（来自骨髓或脐血的单核细胞）移植细胞。对于重建分析来说，在注射6-8周后，通过尾静脉或眼窝后对小鼠放血，收集入肝素化真空管中。通过FACS使用抗人类CD45和抗小鼠CD45来分析外周血细胞以评估重建。认为在外周血中具有大于0.1%人类细胞的小鼠为阳性。

由给药方案用

或hIFN多肽来治疗小鼠。可使用各种给药方案。小鼠经每周给药的药物对缓冲液皮下注射。在第4周时，将动物处死且收集外周血、脾、肝和骨髓用于分析。用以下方式处理样品：将外周血收集入肝素化真空管中。移除脾和肝且产生单细胞悬浮液。收集胫骨和大腿骨骨髓。通过包含但不限于ELISA的方法来测量血液和组织中

或hIFN多肽的含量。Peled等人在Science(1999)283:845-848中以及Kim等人在Stem Cells(1999)17:286-294中论述SCID小鼠的再生细胞。

使用猕猴来评估hIFN多肽的活体内活性和骨髓毒性。在猴中测量2',5'-寡腺苷酸合成酶（2'5'-OAS）的诱发且其反映hIFN多肽的活性。通过测量循环血细胞（包含但不限于嗜中性粒细胞、RBC和血小板）以及潜在地收集和评估骨髓来评估骨髓毒性。

用于评估本发明的hIFN多肽的其它动物模型包含研究抑郁症的动物模型。Capuron,L等人,Am.J.Psychiatry 2003;160:1342-1344呈现表明IFN-α、HPA轴与抑郁症之间的相互关系的临床数据。在前12周的IFN-α疗法期间，在投药之前和投药1小时、2小时和3小时后都测量患者中促肾上腺皮质激素（ACTH）、皮质醇和白细胞介素-6（IL-6）的血浆浓度。在研究过程中也对患者评估重症抑郁的症状。发现随后满足重症抑郁的症状标准的患者显示比不满足症状标准的患者更高的对初始投与IFN-α的ACTH和皮质醇反应（但并非IL-6反应）。

Yamano,M.等人,JPET 2000;292:181-187（其是以引用的方式并入本文中）论述噬菌抗原（Sumiferon）、人类IFN-α的类淋巴母细胞制剂（Sumitomo Pharmaceuticals）和YM643（IFN-alphacon-1；Amgen）以及其对小鼠的影响。在静脉内给药之后，如以剂量依赖性方式由悬尾试验（Tail Suspension Test；TST）所测量，两种化合物在小鼠中诱发不活动的类抑郁行为。通过皮下和侧脑室注射得到类似结果，但剂量和一般给药方案不同。发现丙咪嗪（Imipramine）（一种三环抗抑郁药和对HPA轴的下调剂）显著降低由IFN诱发的不活动性，而消炎痛（indomethacin）（环氧化酶抑制剂）和纳洛酮（naloxone）（类鸦片受体拮抗剂）不降低所观察到的由IFN诱发的不活动性。Yamano等人也展示CRF拮抗剂CP-154,526阻断由IFN诱发的不活动性且以剂量依赖方式也同样如此，表明在IFN-α诱发的抑郁中涉及HPA轴。

悬尾试验为“行为绝望”和游泳试验（其中强迫动物在无法逃脱的特定区域中游泳）的替代试验。在悬尾试验中，将动物自尾部悬挂规定时间长度（例如，6分钟）且不能逃脱。在试验期间，进行各种测量，其包含但不限于每只动物作出逃脱行为（被称作事件）（例如挣扎事件）的次数、事件的持续时间和每次事件的平均强度。悬尾试验设备可获自（例如）Lafayette Instrument（Lafayette,Indiana）。

其它研究涉及在目前IFN疗法中所发现的其它副作用（诸如嗜中性白血球减少症）的动物模型。所进行的动物研究可与病毒唑（Ribavirin）和另一种化合物组合进行。

可由所属技术领域中已知的各种检定来测定根据本发明的hIFN多肽的比活性。可由本文中所述或参考和所属领域的一般技术人员已知的方法来测试根据本发明获得且纯化的hIFN多肽突变型蛋白或其片段的生物活性。

XIV.投药和医药组合物

本发明的多肽或蛋白质（包含但不限于包括一个或一个以上非天然氨基酸的hIFN、合成酶、蛋白质等）视情况（包含但不限于）与适合医药载剂组合用于治疗用途。这些组合物（例如）包括治疗有效量的化合物和医药学上可接受的载剂或赋形剂。所述载剂或赋形剂包含但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇和/或其组合。制备适用于投药模式的调配物。一般来说，所属领域的一般技术人员已知投与蛋白质的方法且其可用于投与本发明的多肽。

根据所属领域的一般技术人员已知的方法，包括一种或一种以上本发明的多肽的治疗组合物视情况在一种或一种以上适当活体外和/或活体内患病动物模型中进行测试以确认功效、组织代谢且评估剂量。特定来说，可由本文中的非天然氨基酸与天然氨基酸同源物相比（包含但不限于经修饰以包含一个或一个以上非天然氨基酸的hIFN多肽与天然氨基酸hIFN多肽的比较）（即，在相关检定中）的活性、稳定性或其它适合量度来初始确定剂量。

通过通常用于引入分子以最终与血液或组织细胞接触的任何途径进行投药。本发明的非天然氨基酸多肽是视情况与一种或一种以上医药学上可接受的载剂以任何适合方式一起投与。可使用向患者投与本发明上下文中的这些多肽的适合方法，且尽管一种以上途径可用于投与特定组合物，但特定途径通常可提供比另一途径更即时且更有效的作用或反应。

医药学上可接受的载剂是部分由欲投与的特定组合物以及由用于投与组合物的特定方法决定。因此，存在多种本发明的医药组合物的适合调配物。

可由适用于蛋白质或肽的任何常规途径（包含但不限于非经肠，例如包含但不限于皮下或静脉内注射或任何其它形式的注射或输液）来投与本发明的hIFN多肽。可由包含但不限于口服、静脉内、腹膜内、肌肉内、经皮、皮下、局部、舌下或经直肠方式的多种途径投与多肽组合物。经修饰或未经修饰的包括非天然氨基酸多肽的组合物也可通过脂质体投与。所属领域的技术人员通常已知这些投药途径以及适当调配物。包括非天然编码氨基酸的hIFN多肽可单独使用或与其它适合组分（诸如医药载剂）组合使用。

单独或与其它适合组分组合的包括非天然氨基酸的hIFN多肽也可制成通过吸入投与的气溶胶调配物（即，其可“雾化”）。气溶胶调配物可置于加压的可接受推进剂（诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等等）中。

适用于非经肠投药（诸如，通过关节内（在关节中）、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内和皮下途径）的调配物包含水性和非水性等张无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物与预期接受者的血液等张的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。hIFN的调配物可呈现于单位剂量或多剂量密封容器（诸如安瓿和小瓶）中。

非经肠投药和静脉内投药为优选投药方法。特定来说，已用于天然氨基酸同源物治疗剂的投药途径（包含但不限于通常用于EPO、GH、G-CSF、GM-CSF、IFN、白细胞介素、抗体和/或任何其它医药递送蛋白的那些投药途径）以及目前使用的调配物一起提供优选投药途径和本发明的多肽的调配物。

在本发明的上下文中，视应用而定，投与患者的剂量足以随时间在患者中产生有益治疗反应，或（包含但不限于）抑制病原体感染，或其它适当活性。剂量是由以下因素决定：特定载体或调配物的功效和所用非天然氨基酸多肽的活性、稳定性或血清半衰期和患者的状况，以及欲治疗的患者的体重或表面积。剂量大小也由特定患者中伴随特定载体、调配物等等的投与产生的任何有害副作用的存在、性质和程度决定。

在确定在治疗或预防疾病（包含但不限于癌症、遗传性疾病、糖尿病、AIDS等等）中欲投与的载体或调配物的有效量时，医师评估循环血浆含量、调配物毒性、疾病进程和/或（相关时）抗非天然氨基酸多肽抗体的产生。

（例如）向70千克患者投与的剂量通常在相当于目前使用的治疗性蛋白的剂量的范围内，其是根据相关组合物的改变的活性或血清半衰期进行调节。本发明的载体或医药调配物可通过任何已知的常规疗法来补充治疗条件，这些常规疗法包含抗体投与、疫苗投与、投与细胞毒性剂、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物、生物反应调节剂等等。

对于投药来说，本发明的调配物是在由相关调配物的LD-50或ED-50和/或对在各种浓度下非天然氨基酸多肽的任何副反应（包含但不限于当关系到患者的体重和整体健康时）的观测所确定的速率下投与。可通过单剂量或分剂量实现投药。

如果经历调配物输液的患者出现发热、发冷或肌痛，那么他/她接受适当剂量的阿司匹林（aspirin）、布洛芬（ibuprofen）、醋氨酚（acetaminophen）或其它疼痛/发热控制药物。在即将输液前30分钟，用阿司匹林、醋氨酚或（包含但不限于）苯海拉明（diphenhydramine）对经历输液反应（诸如发热、肌痛和发冷）的患者进行前驱用药。度冷丁（meperidine）用于不能对退热剂和抗组胺剂迅速作出反应的更严重的发冷和肌痛。视反应的严重性而定减缓或中断细胞输液。

本发明的人类hIFN多肽可直接投与哺乳动物个体。通过通常用于向个体引入hIFN多肽的任何途径进行投药。根据本发明的实施例的hIFN多肽组合物包含适于口服、经直肠、局部、吸入（包含但不限于通过气溶胶）、经颊（包含但不限于舌下）、经阴道、非经肠（包含但不限于皮下、肌肉内、皮内、关节内、胸膜内、腹膜内、脑内、动脉内或静脉内）、局部（即，皮肤与粘膜表面，其包含气管表面）以及经皮投药的那些hIFN多肽组合物，但在任何给定情况下最适合途径将视欲治疗的病状的性质和严重性而定。投药可为局部或全身性投药。化合物的调配物可呈现于单位剂量或多剂量密封容器（诸如安瓿和小瓶）中。本发明的hIFN多肽可制备为单位剂量可注射形式（包含但不限于溶液、悬浮液或乳液）与医药学上可接受的载剂的混合物。也可通过连续输液（使用（包含但不限于）微型泵，诸如渗透泵）、团注或缓释储槽调配物来投与本发明的hIFN多肽。

适于投药的调配物包含水性和非水性溶液（等张无菌溶液），其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物等张的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。可由先前所述类型的无菌粉末、颗粒和片剂来制备溶液和悬浮液。

冷冻干燥为用于自所关注蛋白质制剂移除水的用于呈现蛋白质的常用技术。冷冻干燥或冻干为使欲干燥材料首先冷冻且随后通过在真空环境中升华来移除冰或冷冻溶剂的方法。在预冻干调配物中可包含赋形剂以增强在冷冻干燥过程中的稳定性和/或改良冻干产品在储存时的稳定性。Pikal,M.Biopharm.3(9)26-30(1990)和Arakawa等人,Pharm.Res.8(3):285-291(1991)。

所属领域的一般技术人员也已知药物的喷雾干燥。举例来说，参看Broadhead,J.等人,"The Spray Drying of Pharmaceuticals,"在Drug Dev.Ind.Pharm,18(11和12),1169-1206(1992)中。除小分子药物之外，多种生物材料也已经喷雾干燥且这些生物材料包含：酶、血清、血浆、微生物和酵母。喷雾干燥为有用的技术，因为其可将液体药物制剂在一步过程中转化为精细、无尘或凝聚的粉末。基本技术包括以下四个步骤：a）将进料溶液雾化成喷雾；b）喷雾-空气接触；c）干燥喷雾；和d）自干燥空气分离经干燥产物。美国专利第6,235,710号和第6,001,800号（其是以引用的方式并入本文中）描述通过喷雾干燥来制备重组促红细胞生成素。

本发明的医药组合物可包括医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。医药学上可接受的载剂部分是由欲投与的特定组合物以及由用于投与组合物的特定方法决定。因此，存在多种本发明的医药组合物（包含可选的医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂）的适合调配物。（例如参看Remington′s Pharmaceutical Sciences,第17版,1985））。

适合载剂包含但不限于：缓冲剂，其含有琥珀酸盐、磷酸盐、硼酸盐、HEPES、柠檬酸盐、组氨酸、咪唑、乙酸盐、重碳酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包含但不限于抗坏血酸；低分子量多肽，包含但不限于少于约10个残基的那些多肽；蛋白质，包含但不限于血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，包含但不限于聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，包含但不限于甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、组氨酸或组氨酸衍生物、甲硫氨酸、谷氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包含但不限于海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，包含但不限于EDTA和乙二胺四乙酸二钠；二价金属离子，包含但不限于锌、钴或铜；糖醇，包含但不限于甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，包含但不限于钠和氯化钠；和/或非离子型表面活性剂，包含但不限于Tween^TM（包含但不限于Tween 80（聚山梨醇酯80）和Tween 20（聚山梨醇酯20））、Pluronics^TM和其它泊洛尼克酸（pluronic acid）（包含但不限于泊洛尼克酸F68（poloxamer 188））或PEG。适合表面活性剂（例如）包含但不限于以聚(氧化乙烯)-聚(氧化丙烯)-聚(氧化乙烯)（即，(PEO-PPO-PEO)）或聚(氧化丙烯)-聚(氧化乙烯)-聚(氧化丙烯)（即，(PPO-PEO-PPO)）或其组合为基础的聚醚。PEO-PPO-PEO和PPO-PEO-PPO以商品名Pluronics^TM、R-Pluronics^TM、Tetronics^TM和R-Tetronics^TM（BASF Wyandotte Corp.,Wyandotte,Mich.）在市面上有售且进一步描述于美国专利第4,820,352号中，其是以引用的方式全部并入本文中。其它乙烯/聚丙烯嵌段聚合物可为适合的表面活性剂。表面活性剂或表面活性剂的组合可用于稳定聚乙二醇化hIFN以抵抗一种或一种以上应力（包含但不限于由搅拌产生的应力）。一些上述物质可被称作“膨松剂”。一些也可被称作“张力调节剂”。对于产物稳定性和抗菌有效性来说，也可应用抗菌防腐剂；适合防腐剂包含但不限于苄醇、苯扎氯铵（bezalkonium chloride）、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯/对羟基苯甲酸丙酯、甲酚和苯酚或其组合。

干扰素分子（包含但不限于干扰素α和干扰素α的聚乙二醇化形式）的调配物描述于美国专利第5,762,923号、第5,766,582号和第5,935,566号中，其是以引用的方式全部并入本文中。也描述用于制造干扰素分子和测试其稳定性的方法。Allen等人,International Journal of Pharmaeutics(1999)187:259-272也论述杂合干扰素-α分子的调配物和在各种条件（诸如高和低pH值）下发现的降解产物。

本发明的hIFN多肽（包含与诸如PEG的水溶性聚合物键联的hIFN多肽）也可通过持续释放系统或作为其部分来投与。持续释放组合物包含（包含但不限于）呈定形物品（包含但不限于薄膜或微胶囊）形式的半渗透性聚合物基质。持续释放基质包含生物相容性材料，诸如聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)（Langer等人,J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981)；Langer,Chem.Tech.,12:98-105(1982)）、乙烯乙酸乙烯酯（Langer等人，同上文）或聚-D-(-)-3-羟基丁酸（EP 133,988）、聚乳酸（polylactide；polylactic acid）（美国专利第3,773,919号；EP 58,481）、聚乙醇酸（乙醇酸的聚合物）、聚乳酸-共-乙醇酸（乳酸与乙醇酸的共聚物）、聚酐、L-谷氨酸与γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物（Sidman等人,Biopolymers,22,547-556(1983)）、聚（原酸）酯、多肽、透明质酸、胶原蛋白、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸（诸如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸）、聚核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮以及硅酮。持续释放组合物也包含脂质体捕获的化合物。含有化合物的脂质体是由本身已知的方法来制备：DE3,218,121；Epstein等人,Proc.Natl.Acad，Sci U.S.A.,82:3688-3692(1985)；Hwang等人,Proc.Natl Acad.Sci U.S.A.,77:4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；美国专利第4,619,794号；EP 143,949；美国专利第5,021,234号；日本专利申请案83-118008；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；以及EP 102,324。所引用的所有参考文献和专利都是以引用的方式并入本文中。

脂质体捕获的hIFN多肽可由以下方法来制备，其描述于（例如）DE 3,218,121；Epstein等人,Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.,82:3688-3692(1985)；Hwang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77:4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；美国专利第4,619,794号；EP 143,949；美国专利第5,021,234号；日本专利申请案83-118008；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；以及EP 102,324中。脂质体的组成和尺寸为众所周知的或能够由所属领域的一般技术人员根据经验容易地确定。脂质体的一些实例描述于（例如）ParkJW等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:1327-1331(1995)；Lasic D和Papahadjopoulos D(编):Medical Applications of Liposomes(1998)；Drummond DC等人,Liposomal drugdelivery Systems for cancer therapy,在Teicher B(编):CANCER DRUG Discovery andDevelopment(2002)中；Park JW等人,Clin.Cancer Res.8:1172-1181(2002)；Nielsen UB等人,Biochim.Biophys.Acta 1591(1-3):109-118(2002)；Mamot C等人,Cancer Res.63:3154-3161(2003)中。所引用的所有参考文献和专利都是以引用的方式并入本文中。

在本发明的上下文中，向患者投与的剂量应足以随时间在个体中产生有益反应。通常，每剂量非经肠投与的本发明的hIFN多肽的总医药学有效量在每天每千克患者体重约0.01μg至约100μg或约0.05mg至约1mg的范围内，但此受治疗判断影响。给药频率也由治疗判断影响，且可比经批准用于人类的市售hIFN多肽产品的频率更大或更小。通常，本发明的聚乙二醇化hIFN多肽可通过上述任何投药途径投与。

XV. 本发明的hIFN多肽的治疗用途

本发明的hIFN多肽适用于治疗多种病症。

激动剂hIFN变体可通过增加免疫系统的免疫功能起作用以刺激哺乳动物的免疫系统，无论所述增加是由于抗体介导还是细胞介导，且无论免疫系统对经hIFN多肽治疗的宿主为内源性的还是自供体向提供hIFN多肽的宿主接受体移植（如在骨髓移植物中）。“免疫病症”包含其中个体的免疫系统具有低于正常值的对抗原的抗体或细胞反应的任何病状，包含由于药物（例如，化疗剂）治疗而具有降低的免疫性的小脾的那些个体。患有免疫病症的个体的实例包含（例如）老年患者、经历化疗或放射疗法的个体、从严重疾病恢复或即将经历手术的个体、患有AIDS的个体、患有先天性和后天性B细胞缺乏（诸如低丙球蛋白血症、通常改变无丙种球蛋白血症和选择性免疫球蛋白缺乏）的患者（例如，IgA缺乏、感染具有比患者的免疫反应更短的培育时间的病毒（诸如狂犬病）的患者；以及患有遗传性病症（诸如迪乔治综合症（diGeorge syndrome））的个体。IFNα显示许多免疫调节活性，参看Zoon等人,(1986)The Biology of the Interferon System.Cantell和Schellenkens编,Martinus Nyhoff Publishers,Amsterdam。

投与本发明的hIFN产品在人类中产生由市售IFN制剂展示的活性中的任一种。含有hIFN的医药组合物可以有效强度经调配以通过各种方式投与人类患者，其经历可由IFN激动剂或拮抗剂（诸如（但不限于）使用抗增殖药物、抗发炎药物或抗病毒药物）影响的单独或作为病状或疾病的部分的病症。

本发明的hIFN因此可用于中断或调节病毒复制周期、调节炎症或作为抗增殖剂。可由本发明治疗的病状包含HCV、HBV和其它病毒感染、肿瘤细胞生长或生存能力，以及多发性硬化症。本发明也提供投与治疗有效量的另一种活性剂，诸如抗癌化疗剂。所属领域的技术人员可根据利用hIFN的疗法容易地确定欲提供的量。

尽管IFN首先由病毒学家发现，但其首次临床使用（在1979年）是作为骨髓瘤的治疗剂（Joshua等人,(1997)Blood Rev.11(4):191-200）。后来已展示IFNα可有效抵抗众多病毒性、恶性、血管生成性、过敏性、发炎性和纤维化来源的疾病（Tilg,(1997)Gastroenterology.112(3):1017-1021）。也已证实其可有效治疗转移性肾癌和慢性骨髓性白血病（Williams和Linch,(1997)Br.J.Hosp.Med.57(9):436-439）。IFN的临床使用概述于Gresser(1997)J.Leukoc.Biol.61(5):567-574和Pfeffer(1997)Semin.Oncol.24(3Suppl.9):S9-S63S969中，其是以引用的方式并入本文中。

hIFN的平均量可改变且尤其应根据合格医师的推荐和处方。hIFN的确切量优选受以下因素影响：欲治疗的病状的确切类型、欲治疗的患者的状况以及组合物中的其它成分。本发明也提供投与治疗有效量的另一种活性剂。所属领域的一般技术人员可根据利用hIFN的疗法容易地确定所提供的量。

可以常规方式制备本发明的医药组合物。

实例

提供以下实例以说明而不是限制本发明。

实例1

本实例描述用于选择将非天然编码氨基酸并入hIFN中的优选位点的多组潜在标准中的一种。

本实例展示如何选择用于引入非天然编码氨基酸的hIFN多肽内的优选位点。使用具有PDB ID 1RH2的晶体结构和NMR结构1ITF（24种不同NMR结构）来确定可引入一个或一个以上非天然编码氨基酸的优选位置。这些结构的坐标是获自蛋白质数据库（Protein Data Bank；PDB）或通过在万维网rcsb.org上可访问的The Research Collaboratoryfor Structural Bioinformatics PDB获得。

在本实例中所用的序列编号是根据SEQ ID NO:2中所示的成熟hIFN的氨基酸序列。以下标准用于评估用于引入非天然编码氨基酸的各hIFN位置：（a）根据对与hIFN受体接合的hIFN的结晶结构的结构分析，残基不应干扰hIFN的结合；（b）残基不应受丙氨酸扫描突变诱发影响；（c）残基应为表面暴露的且呈现与周围残基的最小范德华或氢键合相互作用；（d）残基应在hIFN变体中缺失或可变；（e）残基在经非天然编码氨基酸取代后会产生保守性变化；且（f）残基可见于高可挠性区域（包含（但不限于）CD环）或结构刚性区域（包含（但不限于）螺旋B）中。在位点评估中所用的公开案包含：Bioconj.Chemistry 2001(12)195-202；Current Pharmaceutical Design 2002(8)2139-2157；Neuroreport 2001(12),857-859；BBRC 1994(202)1445-1451；Cancer Biotherapy+Radiopharmaceuticals 1998(第13卷)143-153；Structure 1996(14)1453-1463；JMB 1997(274)661-675。另外，利用Cx程序（Pintar等人Bioinformatics,18,第980页）对hIFN分子进行进一步计算以评估各蛋白质原子突出的程度。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是在（但不限于）hIFN的一个或一个以上下列位置处（如在SEQ IDNO:2中或在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应胺基酸）经取代：在位置1之前（即在N末端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165或166（即在羧基末端）。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是在（但不限于）hIFN的一个或一个以上下列位置处（如在SEQ ID NO:2中或在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应胺基酸）经取代：在位置1之前（即在N末端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、12、13、16、19、20、22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、40、41、42、45、46、48、49、50、51、58、61、64、65、68、69、70、71、73、74、77、78、79、80、81、82、83、85、86、89、90、93、94、96、97、100、101、103、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、117、118、120、121、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137、148、149、152、153、156、158、159、160、161、162、163、164、165或166（即在羧基末端）。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是并入IFN中的一个或一个以上下列位置中：6、9、12、13、16、41、45、46、48、49、61、64、65、96、100、101、103、106、107、108、110、111、113、114、117、120、121、149、156、159、160、161和162（SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明的IFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：100、106、107、108、111、113、114（SEQ ID NO:2，或其中的相应氨基酸或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明的IFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：41、45、46、48、49（SEQ ID NO:2，或其中的相应氨基酸或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明的IFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：61、64、65、101、103、110、117、120、121、149（SEQ ID NO:2，或其中的相应氨基酸或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明的IFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：6、9、12、13、16、96、156、159、160、161、162（SEQ ID NO:2，或其中的相应氨基酸或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明的IFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：2、3、4、5、7、8、16、19、20、40、42、50、51、58、68、69、70、71、73、97、105、109、112、118、148、149、152、153、158、163、164、165（SEQ ID NO:2，或其中的相应氨基酸或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明的IFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：34、78、107（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，在一个或一个以上这些或其它位置中的非天然编码氨基酸是与水溶性聚合物键联，包含但不限于位置：在位置1之前（即，在N末端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165或166（即在羧基末端）（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，在一个或一个以上这些位置处的非天然编码氨基酸与一个或一个以上水溶性聚合物键联，包含但不限于位置：在位置1之前（即，在N末端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、12、13、16、19、20、22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、40、41、42、45、46、48、49、50、51、58、61、64、65、68、69、70、71、73、74、77、78、79、80、81、82、83、85、86、89、90、93、94、96、97、100、101、103、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、117、118、120、121、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137、148、149、152、153、156、158、159、160、161、162、163、164、165、166（即在羧基末端）（SEQ ID NO:2，或其中的相应氨基酸或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，非天然编码氨基酸是在一个或一个以上下列位置处与水溶性聚合物键联：6、9、12、13、16、41、45、46、48、49、61、64、65、96、100、101、103、106、107、108、110、111、113、114、117、120、121、149、156、159、160、161和162（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）。在一些实施例中，在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸与一个或一个以上水溶性聚合物键联：100、106、107、108、111、113、114（SEQ ID NO:2，或其中的相应氨基酸或在SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸与一个或一个以上水溶性聚合物键联：41、45、46、48、49（SEQ ID NO:2，或其中的相应氨基酸或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸与一个或一个以上水溶性聚合物键联：61、64、65、101、103、110、117、120、121、149（SEQ ID NO:2，或其中的相应氨基酸或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸与一个或一个以上水溶性聚合物键联：6、9、12、13、16、96、156、159、160、161、162（SEQ ID NO:2，或其中的相应氨基酸或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸与一个或一个以上水溶性聚合物键联：2、3、4、5、7、8、16、19、20、40、42、50、51、58、68、69、70、71、73、97、105、109、112、118、148、149、152、153、158、163、164、165（SEQ ID NO:2，或其中的相应氨基酸或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸与一个或一个以上水溶性聚合物键联：34、78、107（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，水溶性聚合物在一个或一个以上下列氨基酸位置处与IFN多肽的非天然编码氨基酸偶合：6、9、12、13、16、41、45、46、48、49、61、64、65、96、100、101、103、106、107、108、110、111、113、114、117、120、121、149、156、159、160、161和162（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，水溶性聚合物在一个或一个以上下列氨基酸位置处与IFN多肽偶合：6、9、12、13、16、41、45、46、48、49、61、64、65、96、100、101、103、106、107、108、110、111、113、114、117、120、121、149、156、159、160、161和162（SEQ ID NO:2，或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，在一个或一个以上这些位置处的非天然编码氨基酸与一个或一个以上水溶性聚合物键联，位置为：34、78、107（SEQID NO:2，或其中的相应氨基酸或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，本发明的IFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸从而提供拮抗剂：2、3、4、5、7、8、16、19、20、40、42、50、51、58、68、69、70、71、73、97、105、109、112、118、148、149、152、153、158、163、164、165（SEQ ID NO:2，或其中的相应氨基酸或在SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）；视所选预期位点和所需活性而定，包括这些取代中的一个的hIFN多肽可潜在地充当弱拮抗剂或弱激动剂。人类IFN拮抗剂包含但不限于在以下位置处具有一个或一个以上非天然编码氨基酸取代的hIFN多肽：22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、74、77、78、79、80、82、83、85、86、89、90、93、94、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137或其任何组合（hIFN；SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。

在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是在（但不限于）hIFN的一个或一个以上下列位置处（如在SEQ ID NO:2中，或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）经取代：31、134、34、38、129、36、122、37、121、41、125、124、149、117、39、118、120、107、108、106、100、111、113、114、41、45、46、48、49、61、64、65、101、103、102、110、117、120、121、149、96、6、9、12、13、16、68、70、109、159、161、156、160、162、24、27、78、83、85、87、89、164。在一个实施例中，非天然编码氨基酸是在hIFN的位置38处（如在SEQ IDNO:2中，或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）经取代。在一些实施例中，在一个或一个以上这些或其它位置处的非天然编码氨基酸与水溶性聚合物键联，其包含但不限于位置：31、134、34、38、129、36、122、37、121、41、125、124、149、117、39、118、120、107、108、106、100、111、113、114、41、45、46、48、49、61、64、65、101、103、102、110、117、120、121、149、96、6、9、12、13、16、68、70、109、159、161、156、160、162、24、27、78、83、85、87、89、164（如在SEQ ID NO:2中或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。

在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是在（但不限于）hIFN的一个或一个以上下列位置（SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）处经取代：在位置1之前（即，在N末端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165或166（即在羧基末端）以及一个或一个以上天然氨基酸取代。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是与水溶性聚合物偶合。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是与PEG偶合。在一个实施例中，天然氨基酸取代为R149Y。在一些实施例中，天然氨基酸取代为R149E。在一些实施例中，天然氨基酸取代为R149S。在一个实施例中，非天然氨基酸取代在位置107处且天然氨基酸取代为R149Y。在一个实施例中，非天然氨基酸取代在位置106处且天然氨基酸取代为R149Y。在一些实施例中，一个或一个以上天然编码氨基酸取代在hIFN的一个或一个以上下列位置（SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）处，包含但不限于：10、16、13、79、83、85、86、87、90、91、93、94、96、120、121、124、125、128、149。在一些实施例中，一个或一个以上天然编码氨基酸取代为一个或一个以上下列取代（SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸），其包含但不限于：G10E、M16R、R13E、T79R、K83Q、K83S、Y85L、T86S、E87S、Q90R、Q91E、N93Q、D94V、E96K、R120K、K121T、Q124R、R125G、L128R、R149Y、R149E、R149S。在一些实施例中，天然氨基酸取代在位置1（N末端）处。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是在hIFN的一个或一个以上下列位置（如在SEQ ID NO:2中，或在其它IFN中的相应氨基酸）处经取代：107、78、34。在一些实施例中，在一个或一个以上这些位置处的非天然编码氨基酸与水溶性聚合物偶合：107、78、34。

在limitin序列中存在的一个或一个以上氨基酸可经取代入hIFN多肽（杂合limitin/hIFN多肽）中。实例包含但不限于在先前段落中描述的天然氨基酸取代。或者，在干扰素多肽中发现的一组氨基酸可经limitin序列中发现的一组氨基酸置换。一组氨基酸可包括连续氨基酸或在分子的不同部分中存在的氨基酸，但涉及在多肽的结构特征或生物活性中。与其它IFNα蛋白质相比，小鼠limitin分子具有经改良CFU-GM毒性概况。人类IFNα-2a与limitin蛋白质序列的比对展示30%氨基酸一致性。也观察到50%序列保守性。特定来说，观察到C螺旋与D螺旋之间（在C螺旋与D螺旋之间的环中）的limitin序列中的显著缺失。由在hIFNα-2a（SEQ ID NO:2）中的以下取代产生“HV”突变体：D77-D94经小鼠limitin序列HERALDQLLSSLWRELQV取代。由在hIFNα-2a（SEQ ID NO:2）中的以下取代产生“CD”突变体：V105-D114经GQSAPLP取代。发现具有来自经取代入人类IFNα-2a蛋白质（“CD”突变体）中的limitin的环区的此杂合分子具有与WHO IFN标准物相当的抗病毒活性。除一个或一个以上limitin氨基酸之外，hIFN多肽可在hIFN多肽的任何一个或一个以上位置处包括一个或一个以上非天然编码氨基酸。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸可与诸如PEG的水溶性聚合物键联或与诸如PEG的水溶性聚合物直接键结。除在HV或CD突变体中的天然氨基酸取代之外，在hIFN多肽中可发现一个或一个以上其它天然氨基酸取代。

在一些实施例中，hIFN多肽包括在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：6、16、34、39、45、46、64、65、68、78、85、87、101、107、108、111、114、118、124、125、145、146、153、156、96、149（SEQ ID NO:2，或其中的相应氨基酸或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，hIFN多肽包括与一个或一个以上水溶性聚合物键联的在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：6、16、34、39、45、46、64、65、68、78、85、87、101、107、108、111、114、118、124、125、145、146、153、156、96、149（SEQ ID NO:2，或其中的相应氨基酸或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）。在一些实施例中，hIFN多肽包括与一个或一个以上水溶性聚合物键联的在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：6、16、34、39、45、46、64、65、68、78、85、87、101、107、108、111、114、118、124、125、145、146、153、156、96、149（SEQ ID NO:2，或其中的相应氨基酸或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）且包括一个或一个以上天然编码氨基酸取代。在一些实施例中，hIFN多肽包括与一个或一个以上水溶性聚合物键联的在一个或一个以上下列位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：6、16、34、39、45、46、64、65、68、78、85、87、101、107、108、111、114、118、124、125、145、146、153、156、96、149（SEQ ID NO:2，或其中的相应氨基酸或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸）且包括一个或一个以上下列天然编码氨基酸取代：G10E、M16R、R13E、T79R、K83Q、K83S、Y85L、T86S、E87S、Q90R、Q91E、N93Q、D94V、E96K、R120K、K121T、Q124R、R125G、L128R、R149Y、R149E、R149S。

实例2

本实例详述经修饰hIFN多肽在大肠杆菌中的克隆和表达。

本实例展示包含非天然编码氨基酸的hIFN多肽可如何表达于大肠杆菌中。参看Nagata等人,Nature,第284卷,316-320(1980)和美国专利第4,364,863号，其是以引用的方式并入。编码全长hIFN和成熟形式的缺乏N末端信号序列的hIFN的cDNA分别展示于SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22中。在不改变氨基酸序列的情况下最优化用于克隆和表达的序列之后，将全长和成熟hIFN编码cDNA插入pBAD HISc、pET20b和pET19b表达载体中。

包括正交tRNA（O-tRNA）和正交氨基酰基tRNA合成酶（O-RS）的经引入翻译系统用于表达含有非天然编码氨基酸的hIFN。O-RS优先使具有非天然编码氨基酸的O-tRNA氨基酰基化。翻译系统转而回应经编码选择密码子而将非天然编码氨基酸插入hIFN中。

表2：O-RS和O-tRNA序列。

用含有经修饰hIFH基因和正交氨基酰基tRNA合成酶/tRNA对（对所需非天然编码氨基酸具特异性）的质粒转化大肠杆菌允许将非天然编码氨基酸位点特异性地并入hIFN多肽中。在37℃下在含有介于0.01-100mM之间的特定非天然编码氨基酸的培养基中生长的经转化大肠杆菌在高保真度和高效率下表达经修饰hIFN。含有非天然编码氨基酸的His标记hIFN是由大肠杆菌宿主细胞以包涵体或聚集体形式产生。在6M盐酸胍中在变性条件下将聚集体溶解且进行亲和纯化。在4℃下在50mM TRIS-HCl（pH 8.0）、40μMCuSO₄和2%（w/v）Sarkosyl中通过透析进行再折叠整夜。随后将物质对20mM TRIS-HCl（pH 8.0）、100mM NaCl、2mM CaCl₂透析，接着移除His标签。参看Boissel等人,(1993)268:15983-93。用于纯化hIFN的方法在所属技术领域中众所周知且由SDS-PAGE、Western印迹分析或电喷雾-电离离子阱质谱等等证实。

为产生在N末端具有6个His标签的hIFN多肽，将hIFN核苷酸序列克隆在标签下游。用含有hIFN聚核苷酸序列和正交氨基酰基tRNA合成酶/tRNA对（对所需非天然编码氨基酸具特异性）的构筑体转化大肠杆菌（BL21（DE3））允许将非天然编码氨基酸（对乙酰基-苯丙氨酸）位点特异性地并入hIFN多肽中。

实例3

本实例详述含羰基氨基酸的引入以及其与含氨氧基PEG的随后反应。

本实例展示用于产生结合有含酮非天然编码氨基酸的hIFN多肽的方法，所述氨基酸随后与约5,000MW的含氨氧基PEG反应。根据实例1的标准鉴别的各残基（包含但不限于100、106、107、108、111、113、114（hIFN））经具有以下结构的非天然编码氨基酸单独取代：

用于将对乙酰基-苯丙氨酸位点特异性地并入hIFN中的序列为SEQ ID NO:2（hIFN）和SEQ ID NO:4（muttRNA），以及在上述实例2中所述的16、17或18（TyrRS LW1、5或6）。

一旦经修饰，包括含羰基氨基酸的hIFN多肽变体就与以下形式的含氨氧基PEG衍生物反应：

R-PEG(N)-O-(CH₂)_n-O-NH₂

其中R为甲基，n为3且N为约5,000MW。将含有对乙酰基苯丙氨酸的经纯化hIFN以10mg/mL的浓度溶解于25mM MES（Sigma Chemical,St.Louis,MO）（pH 6.0）、25mM Hepes（Sigma Chemical,St.Louis,MO）（pH 7.0）或10mM乙酸钠（Sigma Chemical,St.Louis,MO）（pH 4.5）中，与10至100倍过量的含氨氧基PEG反应，且随后在室温下搅拌10-16小时（Jencks,W.J.Am.Chem,Soc.1959,81,第475页）。PEG-hIFN随后经稀释于适当缓冲液中以进行立即纯化和分析。

实施例4

与由通过酰胺键与PEG键联的羟胺基组成的PEG接合。

具有以下结构的PEG试剂是使用实例3中所述的程序与含酮非天然编码氨基酸偶合：

R-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_n-O-NH₂

其中R为甲基，n=4且N为约20,000MW。反应、纯化和分析条件如实例3中所述。

实例5

本实例详述将两种不同非天然编码氨基酸引入hIFN多肽中。

本实例展示用于产生结合有在根据实例1鉴别的残基中的两个位置上包括酮官能团的非天然编码氨基酸的hIFN多肽的方法，其中X^*表示非天然编码氨基酸。除选择密码子是在核酸内的两个不同位点处引入之外，如实例1和实例2中所述来制备hIFN多肽。

实例6

本实例详述hIFN多肽与含酰肼PEG的接合以及随后的原位还原。

结合有含羰基氨基酸的hIFN多肽是根据实例2和3中所述的程序来制备。一旦经修饰，具有以下结构的含酰肼PEG就与hIFN多肽接合：

R-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_n-X-NH-NH₂

其中R为甲基，n=2且N=10,000MW且X为羰基（C=O）。将含有对乙酰基苯丙氨酸的经纯化hIFN在介于0.1-10mg/mL之间的浓度下溶解于25mM MES（SigmaChemical,St.Louis,MO）（pH 6.0）、25mM Hepes（Sigma Chemical,St.Louis,MO）（pH7.0）或10mM乙酸钠（Sigma Chemical,St.Louis,MO）（pH 4.5）中，与1至100倍过量的含酰肼PEG反应，且通过添加溶解于H2O中至最终浓度为10-50mM的储备液1MNaCNBH₃（Sigma Chemical,St.Louis,MO）原位还原相应腙。在黑暗中在4℃至室温下进行反应18-24小时。通过添加约pH 7.6的1M Tris（Sigma Chemical,St.Louis,MO）至最终Tris浓度为50mM来终止反应或将反应稀释于适当缓冲液中以进行立即纯化。

实例7

本实例详述将含炔氨基酸引入hIFN多肽中以及用mPEG-叠氮化物进行衍生。

根据实例1鉴别的hIFN的残基中的任一个（包含但不限于100、106、107、108、111、113、114）经此非天然编码氨基酸取代：

用于将对炔丙基-酪氨酸位点特异性地并入hIFN中的序列为SEQ ID NO:2（hIFN）、SEQ ID NO:4（muttRNA，詹氏甲烷球菌

），以及在上文实例2中所述的9、10或11。将含有炔丙基酪氨酸的hIFN多肽表达于大肠杆菌中且使用实例3中所述的条件进行纯化。

将含有炔丙基-酪氨酸的经纯化hIFN在介于0.1-10mg/mL的浓度下溶解于PB缓冲液（100mM磷酸钠，0.15M NaCl，pH=8）中且向反应混合物中添加10至1000倍过量的含叠氮基PEG。随后将催化量的CuSO₄和铜丝添加到反应混合物中。在混合物经培育（包含但不限于在室温或37℃下约4小时，或在4℃下整夜）后，添加H₂O且将混合物经透析膜过滤。可对样品分析加成。

在本实例中，PEG具有以下结构：

R-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_n-N₃

其中R为甲基，n为4且N为10,000MW。

实例8

本实例详述hIFN多肽中的大疏水性氨基酸经炔丙基酪氨酸的取代。

在hIFN的以下区域：1-9（N末端）、10-21（A螺旋）、22-39（A螺旋与B螺旋之间的区域）、40-75（B螺旋）、76-77（B螺旋与C螺旋之间的区域）、78-100（C螺旋）、101-110（C螺旋与D螺旋之间的区域）、111-132（D螺旋）、133-136（D螺旋与E螺旋之间的区域）、137-155（E螺旋）、156-165（C末端）（如在SEQ ID NO:2中或其它IFN多肽的相应氨基酸）中的一个内所存在的Phe、Trp或Tyr残基是经如实例7中所述的以下非天然编码氨基酸取代：

一旦经修饰，PEG就连接到包括含炔氨基酸的hIFN多肽变体上。PEG将具有以下结构：

Me-PEG(N)-O-(CH₂)₂-N₃

且偶合程序将遵循实例7中的程序。这个过程会产生hIFN多肽变体，其包括大致与一种天然存在的大疏水性氨基酸等比容的非天然编码氨基酸且在多肽内的不同位点处经PEG衍生物修饰。

实例9

本实例详述由一个或一个以上PEG连接子分隔的hIFN多肽同二聚体、异二聚体、同多聚体或异多聚体的产生。

在实例7中产生的含炔hIFN多肽变体与以下形式的双官能PEG衍生物反应：

N₃-(CH₂)_n-C(O)-NH-(CH₂)₂-O-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)-(CH₂)_n-N₃

其中n为4且PEG具有约5,000的平均MW，以产生其中两个hIFN分子由PEG物理隔开的相应hIFN多肽同二聚体。hIFN多肽可以类似方式与一种或一种以上其它多肽偶合以形成异二聚体、同多聚体或异多聚体。将按照实例7和实例3中进行偶合、纯化和分析。

实例10

本实例详述糖部分与hIFN多肽的偶合。

以下的一个残基经下文的非天然编码氨基酸取代：1、2、3、4、5、6、7、8、9、12、13、16、19、20、22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、40、41,42、45、46、48、49、50、51、58、61、64、65、68、69、70、71、73、74、77、78、79、80、81、82、83、85、86、89、90、93、94、96、97、100、101、103、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、117、118、120、121、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137、148、149、152、153、156、158、159、160、161、162、163、164、165（如在SEQ ID NO:2中或其它IFN多肽的相应氨基酸）。

一旦经修饰，包括含羰基氨基酸的hIFN多肽变体就与N-乙酰基葡糖胺（GlcNAc）的β-键联氨氧基类似物反应。将hIFN多肽变体（10mg/mL）与氨氧基糖（21mM）混合于100mM水性乙酸钠缓冲液（pH 5.5）中且在37℃下培育7小时至26小时。通过在周围温度下将接合糖的hIFN多肽（5mg/mL）与UDP-半乳糖（16mM）和β-1,4-半乳糖基转移酶（0.4单位/毫升）在150mM HEPES缓冲液（pH 7.4）中培育48小时而将第二种糖与第一种糖酶促偶合（Schanbacher等人,J.Biol.Chem.1970,245,5057-5061）。

实例11

本实例详述聚乙二醇化hIFN多肽拮抗剂的产生。

以下残基2、3、4、5、7、8、16、19、20、40、42、50、51、58、68、69、70、71、73、97、105、109、112、118、148、149、152、153、158、163、164、165（hIFN；SEQID NO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）中的一个是如实例3中所述经以下非天然编码氨基酸取代；视所选位点和所需活性而定，包括这些取代中的一个的hIFN多肽可潜在地充当弱拮抗剂或弱激动剂。以下残基22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、74、77、78、79、80、82、83、85、86、89、90、93、94、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137（hIFN；SEQ IDNO:2或在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸）中的一个是如实例3中所述经以下非天然编码氨基酸取代。

一旦经修饰，包括含羰基氨基酸的hIFN多肽变体将与以下形式的含氨氧基PEG衍生物反应：

R-PEG(N)-O-(CH₂)_n-O-NH₂

其中R为甲基，n为4且N为20,000MW，以产生在多肽内的单一位点处经PEG衍生物修饰的包括非天然编码氨基酸的hIFN多肽拮抗剂。如实例3中所述进行偶合、纯化和分析。

实例12

其中hIFN分子是直接键联的hIFN多肽同二聚体、异二聚体、同多聚体或异多聚体的产生

包括含炔氨基酸的hIFN多肽变体可与包括含叠氮基氨基酸的另一种hIFN多肽变体直接偶合，其各自包括在（但不限于）实例10中所述位点处的非天然编码氨基酸取代。这会产生其中两个hIFN多肽变体经物理连接的相应hIFN多肽同二聚体。hIFN多肽可以类似方式与一种或一种以上其它多肽偶合以形成异二聚体、同多聚体或异多聚体。按照实例3、实例6以及实例7中进行偶合、纯化和分析。

实例13

PEG-OH+Br-(CH₂)_n-C≡CR'→PEG-O-(CH₂)_n-C≡CR'

A B

聚烷撑二醇（P-OH）与烷基卤化物（A）反应以形成醚（B）。在这些化合物中，n为1至9的整数且R'可为直链或支链、饱和或不饱和C1至C20烷基或杂烷基。R'也可为C3至C7饱和或不饱和环状烷基或环状杂烷基、经取代或未经取代芳基或杂芳基或经取代或未经取代烷芳基（烷基为C1至C20饱和或不饱和烷基）或杂烷芳基。通常，PEG-OH为具有800至40,000道尔顿（Da）的分子量的聚乙二醇（PEG）或单甲氧基聚乙二醇（mPEG）。

实例14

mPEG-OH+Br-CH₂-C≡CH→mPEG-O-CH₂-C≡CH

将具有20,000Da的分子量的mPEG-OH（mPEG-OH 20kDa；2.0g，0.1mmol，Sunbio）用THF（35mL）中的NaH（12mg，0.5mmol）处理。随后将呈溶解于二甲苯（0.56mL，5mmol，50当量，Aldrich）中的80重量%溶液形式的炔丙基溴溶液和催化量的KI添加到溶液中且将所得混合物加热至回流历时2小时。随后添加水（1mL）且在真空下移除溶剂。向残余物中添加CH₂Cl₂（25mL）且将有机层分离，经无水Na₂SO₄干燥，且将体积缩减到约2mL。将此CH₂Cl₂溶液逐滴添加到乙醚（150mL）中。将所得沉淀物收集，用若干份冷乙醚洗涤且干燥以得到炔丙基-O-PEG。

实例15

mPEG-OH+Br-(CH₂)₃-C≡CH→mPEG-O-(CH₂)₃-C≡CH

将具有20,000Da的分子量的mPEG-OH（mPEG-OH 20kDa；2.0g，0.1mmol，Sunbio）用THF（35mL）中的NaH（12mg，0.5mmol）处理。随后将50当量的5-溴-1-戊炔（0.53mL，5mmol，Aldrich）和催化量的KI添加到混合物中。将所得混合物加热至回流历时16小时。随后添加水（1mL）且在真空下移除溶剂。向残余物中添加CH₂Cl₂（25mL）且将有机层分离，经无水Na₂SO₄干燥，且将体积缩减到约2mL。将此CH₂Cl₂溶液逐滴添加到乙醚（150mL）中。将所得沉淀物收集，用若干份冷乙醚洗涤且干燥以得到相应炔。5-氯-1-戊炔可用于类似反应中。

实例16

（1）m-HOCH₂C₆H₄OH+NaOH+Br-CH₂-C≡CH→m-HOCH₂C₆H₄O-CH₂-C≡CH

（2）m-HOCH₂C₆H₄O-CH2-C≡CH+MsCl+N(Et)₃→m-MsOCH₂C₆H₄O-CH₂-C≡CH

（3）m-MsOCH₂C₆H₄O-CH₂-C≡CH+LiBr→m-Br-CH₂C₆H₄O-CH₂-C≡CH

（4）mPEG-OH+m-Br-CH₂C₆H₄O-CH₂-C≡CH→mPEG-O-CH₂-C₆H₄O-CH₂-C≡CH

向3-羟基苄醇（2.4g，20mmol）于THF（50mL）和水（2.5mL）中的溶液中首先添加粉末状氢氧化钠（1.5g，37.5mmol）且随后添加呈溶解于二甲苯（3.36mL，30mmol）中的80重量%溶液形式的炔丙基溴溶液。将反应混合物在回流下加热6小时。向混合物中添加10%柠檬酸（2.5mL）且在真空下移除溶剂。将残余物用乙酸乙酯（3×15mL）萃取且将经合并有机层用饱和NaCl溶液（10mL）洗涤，经MgSO₄干燥且浓缩以得到3-炔丙基氧基苄醇。

在0℃下将甲烷磺酰氯（2.5g，15.7mmol）和三乙胺（2.8mL，20mmol）添加到化合物3（2.0g，11.0mmol）于CH₂Cl₂中的溶液中，且将反应置于冰箱中16小时。常用处理得到呈浅黄色油状的甲磺酸酯。将所述油状物（2.4g，9.2mmol）溶解于THF（20mL）中且添加LiBr（2.0g，23.0mmol）。将反应混合物加热至回流历时1小时且随后冷却到室温。向混合物中添加水（2.5mL）且在真空下移除溶剂。将残余物用乙酸乙酯（3×15mL）萃取且将经合并有机层用饱和NaCl溶液（10mL）洗涤，经无水Na₂SO₄干燥且浓缩以得到所需溴化物。

将mPEG-OH 20kDa（1.0g，0.05mmol，Sunbio）溶解于THF（20mL）中且将溶液在冰浴中冷却。在强烈搅拌下经一段若干分钟的时期添加NaH（6mg，0.25mmol），接着添加上文获得的溴化物（2.55g，11.4mmol）和催化量的KI。移除冷却浴且将所得混合物加热至回流历时12小时。向混合物中添加水（1.0mL）且在真空下移除溶剂。向残余物中添加CH₂Cl₂（25mL）且将有机层分离，经无水Na₂SO₄干燥，且将体积缩减到约2mL。逐滴添加到乙醚溶液（150mL）中产生白色沉淀物，将其收集得到PEG衍生物。

实例17

mPEG-NH₂+X-C(O)-(CH₂)_n-C≡CR'→mPEG-NH-C(O)-(CH₂)_n-C≡CR'

如上所示，也可通过将含有末端官能团的聚乙二醇聚合物与含有炔官能团的反应性分子偶合来获得末端含炔的聚乙二醇聚合物。n介于1与10之间。R'可为H或C1至C4小烷基。

实例18

（1）HO₂C-(CH₂)₂-C≡CH+NHS+DCC→NHSO-C(O)-(CH₂)₂-C≡CH

（2）mPEG-NH₂+NHSO-C(O)-(CH₂)₂-C≡CH→mPEG-NH-C(O)-(CH₂)₂-C≡CH

将4-戊炔酸（2.943g，3.0mmol）溶解于CH₂Cl₂（25mL）中。添加N-羟基琥珀酰亚胺（3.80g，3.3mmol）和DCC（4.66g，3.0mmol）且在室温下将溶液搅拌整夜。所得粗NHS酯7未经进一步纯化即用于下个反应中。

将具有5,000Da的分子量的mPEG-NH₂（mPEG-NH2，1g，Sunbio）溶解于THF（50mL）中且将混合物冷却到4℃。在强烈搅拌下逐份添加NHS酯7（400mg，0.4mmol）。将混合物搅拌3小时，同时温至室温。随后添加水（2mL）且在真空下移除溶剂。向残余物中添加CH₂Cl₂（50mL）且将有机层分离，经无水Na₂SO₄干燥，且将体积缩减到约2mL。将此CH₂Cl₂溶液逐滴添加到乙醚（150mL）中。将所得沉淀物收集且在真空中干燥。

实例19

本实例表示聚乙二醇的甲烷磺酰基酯（其也可被称作聚乙二醇的甲烷磺酸酯或甲磺酸酯）的制备。可通过类似程序来制备相应甲苯磺酸酯和卤化物。

mPEG-OH+CH₃SO₂C1+N(Et)₃→mPEG-O-SO₂CH₃→mPEG-N₃

在氮气下将于150mL甲苯中的mPEG-OH（MW=3,400，25g，10mmol）共沸蒸馏2小时且将溶液冷却至室温。将40mL无水CH₂Cl₂和2.1mL无水三乙胺（15mmol）添加到溶液中。将溶液在冰浴中冷却且逐滴添加1.2mL经蒸馏甲烷磺酰氯（15mmol）。在氮气下在室温下将溶液搅拌整夜，且通过添加2mL无水乙醇来中止反应。将混合物在真空下蒸发以移除溶剂（主要是除甲苯之外的溶剂），过滤，再次真空浓缩且随后沉淀于100mL乙醚中。将滤液用若干份冷乙醚洗涤且在真空下干燥以得到甲磺酸酯。

将甲磺酸酯（20g，8mmol）溶解于75ml THF中且将溶液冷却到4℃。向冷却溶液中添加叠氮化钠（1.56g，24mmol）。在氮气下将反应加热至回流历时2小时。随后蒸发溶剂且用CH₂Cl₂（50mL）稀释残余物。将有机馏分用NaCl溶液洗涤且经无水MgSO₄干燥。将体积缩减至20ml且通过添加到150ml冷无水乙醚中来沉淀产物。

实例20

（1）N₃-C₆H₄-CO₂H→N₃-C₆H₄CH₂OH

（2）N₃-C₆H₄CH₂OH→Br-CH₂-C₆H₄-N₃

（3）mPEG-OH+Br-CH₂-C₆H₄-N₃→mPEG-O-CH₂-C₆H₄-N₃

可使用美国专利第5,998,595号中所述的方法来制备4-叠氮基苄醇，所述文献是以引用的方式并入本文中。在0℃下将甲烷磺酰氯（2.5g，15.7mmol）和三乙胺（2.8mL，20mmol）添加到4-叠氮基苄醇（1.75g，11.0mmol）于CH₂Cl₂中的溶液中且将反应置于冰箱中16小时。常用处理得到呈浅黄色油状的甲磺酸酯。将所述油状物（9.2mmol）溶解于THF（20mL）中且添加LiBr（2.0g，23.0mmol）。将反应混合物加热至回流历时1小时且随后冷却至室温。向混合物中添加水（2.5mL）且在真空下移除溶剂。将残余物用乙酸乙酯（3×15mL）萃取且将经合并有机层用饱和NaCl溶液（10mL）洗涤，经无水Na₂SO₄干燥且浓缩以得到所需溴化物。

将mPEG-OH 20kDa（2.0g，0.1mmol，Sunbio）用THF（35mL）中的NaH（12mg，0.5mmol）处理且向混合物中添加溴化物（3.32g，15mmol）和催化量的KI。将所得混合物加热至回流历时12小时。将水（1.0mL）添加到混合物中且在真空下移除溶剂。向残余物中添加CH₂Cl₂（25mL）且将有机层分离，经无水Na₂SO₄干燥，且将体积缩减到约2mL。逐滴添加到乙醚溶液（150mL）中产生沉淀物，将其收集得到mPEG-O-CH₂-C₆H₄-N₃。

实例21

NH₂-PEG-O-CH₂CH₂CO₂H+N₃-CH₂CH₂CO₂-NHS→N₃-CH₂CH₂-C(O)NH-PEG-O-CH₂CH₂CO₂H

将NH₂-PEG-O-CH₂CH₂CO₂H（MW 3,400Da，2.0g）溶解于NaHCO₃饱和水溶液（10mL）中且将溶液冷却到0℃。在强烈搅拌下添加3-叠氮基-1-N-羟基琥珀酰亚胺基丙酸酯（5当量）。3小时后，添加20mL H₂O且在室温下将混合物另外搅拌45分钟。用0.5N H₂SO₄将pH值调节到3且添加NaCl至浓度为约15重量%。将反应混合物用CH₂Cl₂（100mL×3）萃取，经Na₂SO₄干燥且浓缩。在用冷乙醚沉淀后，将产物通过过滤收集且在真空下干燥以得到ω-羧基-叠氮化物PEG衍生物。

实例22

mPEG-OMs+HC≡CLi→mPEG-O-CH₂-CH₂-C≡C-H

在强烈搅拌下向如所属技术领域中已知所制备且冷却到-78℃的乙炔锂（4当量）于THF中的溶液中逐滴添加溶解于THF中的mPEG-OMs溶液。3小时后，使反应温至室温且通过添加1mL丁醇中止反应。随后添加20mL H₂O且在室温下将混合物另外搅拌45分钟。用0.5N H₂SO₄将pH值调节到3且添加NaCl至浓度为约15重量%。将反应混合物用CH₂Cl₂（100mL×3）萃取，经Na₂SO₄干燥且浓缩。在用冷乙醚沉淀后，将产物通过过滤收集且在真空下干燥以得到1-(丁-3-炔基氧基)-甲氧基聚乙二醇（mPEG）。

实例23

使用以下文献中描述的方法将含叠氮基氨基酸和含乙炔氨基酸位点选择性地并入蛋白质中：L.Wang等人,(2001),Science 292:498-500；J.W.Chin等人,Science 301:964-7(2003)；J.W.Chin等人,(2002),Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027；J.W.Chin和P.G.Schultz,(2002),Chem Bio Chem 11:1135-1137；J.W.Chin等人,(2002),PNAS United States of America 99:11020-11024；和L.Wang和P.G.Schultz,(2002),Chem. Comm.1-10。一旦并入氨基酸，就在37℃下在2mM PEG衍生物、1mM CuSO₄和约1mg铜丝存在的情况下用磷酸盐缓冲液（PB）（pH 8）中的0.01mM蛋白质进行环加成反应4小时。

如下文中所述进行对乙酰基-D,L-苯丙氨酸（pAF）和间-PEG-羟胺衍生物的合成。使用在Zhang,Z.,Smith,B.A.C,Wang,L.,Brock,A.,Cho,C.和Schultz,P.G.,Biochemistry,(2003)42,6735-6746中先前所述的程序来合成外消旋pAF。为合成间-PEG-羟胺衍生物，完成以下程序。向在室温（RT）下搅拌1小时的(N-t-Boc-氨氧基)乙酸（0.382g，2.0mmol）和1,3-二异丙基碳化二酰亚胺（0.16mL，1.0mmol）于二氯甲烷（DCM，70mL）中的溶液中添加甲氧基-聚乙二醇胺（m-PEG-NH₂，7.5g，0.25mmol，Mt.30K，来自BioVectra）和二异丙基乙胺（0.1mL，0.5mmol）。将反应在室温下搅拌48小时，且随后浓缩至约100mL。将混合物逐滴添加到冷乙醚（800mL）中。经t-Boc保护的产物沉淀出且通过过滤收集，用乙醚（3×100mL）洗涤。通过再溶解于DCM（100mL）中且于乙醚（800mL）中沉淀两次将其进一步纯化。将产物在真空下干燥，其由NMR和Nihydrin试验得以证实。

在50%TFA/DCM（40mL）中在0℃下进行上文获得的经保护产物（7.0g）的去叔丁氧羰基作用1小时且随后在室温下进行1.5小时。在真空中移除大多数TFA之后，通过向残余物中添加于二噁烷（1mL）中的4N HCl而将羟胺衍生物的TFA盐转化为HCl盐。将沉淀物溶解于DCM（50mL）中且再沉淀于乙醚（800mL）中。将最终产物通过过滤收集，用乙醚（3×100mL）洗涤，在真空中干燥，储存在氮下。使用相同程序来合成其它PEG（5K、20K）羟胺衍生物。

实例24

根据以下方案来分离hIFN多肽。也已对再折叠方法进行改变以分离本发明的hIFN多肽，从而调节接收溶解IFN的缓冲液的组成。可进行其它更改，诸如在程序过程中或之后添加Cu++或其它温和氧化剂、改变变性剂或还原剂、改变pH值以评估在各种pH值下的再折叠效率。使用HIC、以染料为基础、尺寸排阻或离子交换树脂的柱基再折叠方法可用于再折叠。所属领域的一般技术人员已知对这些方法的其它更改。

包涵体制备和再折叠

将新鲜或冷冻大肠杆菌宿主细胞丸粒再悬浮于约10mL/g的20mM Tris（pH 7.5）、200mM NaCl、1mM EDTA中。将丸粒超声波降解6次历时30秒，在每次超声波降解之间在冰上培育1分钟。将1mg/mL溶菌酶和脱氧核糖核酸酶I添加到各超声波降解样品中，且在室温下将样品培育30分钟。

在4℃下将样品以12,000rpm离心10分钟，且移出各样品的上层清液以进行分析。通过将其自管侧分离且由超声波降解将丸粒再悬浮30秒而将丸粒用40ml冷冻IB洗涤缓冲液1（20mM Tris（pH 7.5）、100mM NaCl、1mM EDTA、1%Triton）洗涤三次。在每次洗涤之间，在4℃下将样品以12,000rpm离心5分钟。随后用40ml冷IB洗涤缓冲液2（20mM Tris（pH 7.5）、100mM NaCl、1mM EDTA）将丸粒再悬浮/洗涤两次。在每次洗涤之间，在4℃下将样品以12,000rpm离心5分钟。

在两组洗涤之后，通过在5-20ml溶解缓冲液（50mM Tris（pH 7.5）、8M Gdn-HCl）中杜恩斯均质化而将丸粒溶解。使用完全溶解各丸粒所必需的最小量缓冲液。随后在4℃下将样品以12,000离心15分钟来移除任何不溶性粒子，且将上层清液转移到新鲜管中。

自每一样品取等分试样，且将所述等分试样于溶解缓冲液中稀释20倍，且测量每一样品的OD280以测定蛋白质浓度。在280nm下的消光系数为22,500M-1或1.17mg/ml-1。

将包涵体等分为3-5ml等分试样且储存在-80℃下。在4℃下将0.15mg/ml IFN最终物质（于6-8M GndHCl中的5mg/mL溶液，pH 8）以三个等分试样注射入快速搅拌缓冲液（20-50mM Tris HCl（pH 8.2）、0.5M L-精氨酸、10%甘油或蔗糖）（加上来自经溶解IFN的200-250mM Gnd）中。在溶液表面下进行注射以避免起泡。在注射后，在4℃下使用缓慢搅拌约16-24小时。在再折叠反应完成后，进一步处理样品。

用Amicon搅拌单元（YM-10膜）将样品浓缩至约1-1.5mg/ml（15-30ml）。随后在4℃下将样品对30mM Tris（pH 7.8）、20mM NaCl、5%甘油透析整夜。用Q HP缓冲液A（10mM Tris，pH 7.5）将样品稀释到50ml，且使用大于15倍柱体积的0-30%B（10mM Tris（pH 7.5）、1M NaCl）的梯度于5ml Q HPAKTA柱上进行纯化。用2.5M NaCl、接着1M NaCl/1M NaOH洗涤柱。对柱馏分进行SDS-PAGE分析，且将含有单体再折叠hIFN多肽的馏分汇集。通过添加1/20体积的1M NaAc（pH 4.5）来调节各集合的pH值，且将各集合对20mM NaAc（pH 4）、20mM NaCl、5%甘油透析整夜。将hIFN多肽浓缩至大于1mg/ml以进行聚乙二醇化。

聚乙二醇化

以1:12摩尔比率（30mg/mg IFN/ml）将氧基氨基衍生30K PEG添加到hIFN多肽中，且将混合物在28℃下培育16-48小时。图19展示在接合中所用的30K PEG。

聚乙二醇化hIFN多肽的分离

使用Source Q 30柱来分离聚乙二醇化hIFN多肽。在所述柱中所用的缓冲液为缓冲液A（10mM Tris，pH 8.0）；缓冲液B（10mM Tris，pH 8.0；1M NaCl）；以及清洗缓冲液（1M NaOH；1M NaCl）。将聚乙二醇化hIFN的馏分汇集，对以下储存缓冲液透析：20mM乙酸钠（pH 6）、0.005%Tween、125mM NaCl。随后将样品浓缩到大于8mM且储存在4℃下。

将缓冲液管道灌注且用适当缓冲液洗涤，且用30-40mL清洗缓冲液清洗柱和样品管道。用缓冲液A冲洗样品管道以移除任何痕量清洗缓冲液，且灌注管道以进行样品添加。用5-10倍柱体积的缓冲液A平衡柱，直至诸如UV和传导率的参数达到稳定。

将聚乙二醇化hIFN多肽样品注射于柱上，且用4倍柱体积的缓冲液A洗涤柱。所用梯度如下：对于20倍体积柱来说为0-20%缓冲液B；对于4倍体积柱来说为100%缓冲液B。自柱收集1-1.5mL馏分且由SDS-PAGE进行分析以确定用于汇集的馏分。将PEG单体馏分汇集。通过用30-40mL清洗缓冲液清洗柱和样品管道来准备用于下个样品的柱。

实例25

本实例详述hIFN活性和hIFN多肽对hIFN受体的亲和性的测量。

Biacore研究(受体结合亲和性)

自纯系MHS1011-61064（OpenBiosystems,Huntsville,AL）扩增IFNAR2胞外域的序列（由以序列LLPPGQ结束的206个氨基酸组成）。将此插入物克隆入在T7启动子下游的pET20表达载体（Novagen）中。在BL21（DE3）细胞（Novagen）中用0.4mM IPTG诱发蛋白质表达。

因为经表达蛋白质为不溶性的，所以将包涵体自溶解细胞纯化且溶解于6M GndCl中。在37℃下用10mM DTT将5ml等分试样（50mg量）还原45分钟。随后在4℃下将混合物注射入200ml由50mM Tris pH 8、20mM NaCl、0.5M精氨酸、10%甘油组成的再折叠缓冲液中且在轻微搅拌下培育整夜。

随后使用Amicon搅拌单元将再折叠反应物浓缩到25ml，且对20mM Tris（pH 8）、20mM NaCl、10%甘油透析整夜。使用AKTA FPLC系统（Amersham）用HP Q Sepharose纯化单体再折叠IFNAR ECD。使用由制造商推荐的赖氨酸特异性偶合程序将经纯化IFNAR2ECD固定于CM5 Biacore芯片上。约200RU的功能性蛋白质经固定。以每分钟50mcl的流动速率将于HBS-EP缓冲液（Biacore）中的各种浓度的IFN变体注射于含有经固定IFNAR2的流动池和含有经固定牛血清白蛋白的对照流动池上。使用BiaEvaluation软件（Biacore）将产生的Sensogram拟合为1:1相互作用模式以计算k_on、k_off和K_d值。在经由实例25中所述的方法分离后，测试包括非天然编码氨基酸对乙酰基-苯丙氨酸（pAF）的N末端6-His hIFN多肽，以及包括pAF的聚乙二醇化hIFN多肽。在这些研究中利用的对照物包含获自Sigma的IFNαA、N-6His标记野生型IFN和

关于hIFN多肽所收集的数据展示于表3中。在这个检定中在SEQ ID NO:2的位置149处具有对乙酰基苯丙氨酸取代的非-聚乙二醇化hIFN多肽展示改变的结合动力学（更快k_off）。

表3：如由SPR所测定的IFNα-2a:IFNAR2相互作用的结合参数

测量磷酸化STAT1

为评估经修饰hIFNα2a多肽的生物活性，使用人类单核细胞白血病THP-1细胞进行测量STAT1（信号转导子和转录活化因子家族成员）的磷酸化的检定。已展示STAT1的活化对于IFN的抗病毒活性为必要的（Durbin JE等人,Cell 199684:443-450）。人类单核细胞系THP-1是购自ATCC（Manassas,VA）且常规在RPMI 1640、丙酮酸钠、青霉素（penicillin）、链霉素（streptomycin）、10%热灭活胎牛血清和50μM 2-巯基乙醇中传代。在37℃下将细胞保持在5%CO₂的潮湿气氛中。

将THP-1细胞在含有经1%热灭活木炭/葡聚糖处理的胎牛血清的检定培养基中饥饿整夜，随后在37℃下用增加浓度的hIFN多肽刺激30分钟。按照制造商（Cell SignalingTechnology,Beverly,MA）建议，将所有经刺激细胞固定以进行渗透且用适当磷酸基抗体染色。在FACS阵列上进行样品获取，其中所获取的数据是在Flowjo软件（Tree StarInc.,Ashland,OR）上分析。自使用SigmaPlot以平均荧光强度对蛋白质浓度绘制的剂量反应曲线得到EC₅₀值（图2）。

进行其它对照以证实由IFN诱发的STAT1的磷酸化对IFNα受体2（IFNAR2）具有选择性。在37℃下用增加浓度的IFNAR2胞外域（ECDR2）将血清饥饿THP-1进行预培育15分钟，随后添加EC₈₀剂量的IFN。发现IFNα受体2的胞外域与IFNαA刺激的STAT1磷酸化有效竞争，表明由IFNαA诱发的STAT1的磷酸化对IFNAR2有选择性。图3展示ECDR2与IFNαA诱发的pSTAT活性竞争。

在纯化hIFN多肽后的潜在污染物为内毒素。为测定内毒素是否影响STAT1的磷酸化，在此细胞检定中测试多种内毒素含量。图4展示在所测试的含量下内毒素对检定不具有实质影响。所测试的内毒素浓度范围（如所示）提供与不含内毒素的对照样品相当的MFI（PE）。

或者，可用

细胞基Stat1（Tyr701）ELISA试剂盒（Raybiotech,Norcross,GA）来测量STAT1的磷酸化。使用这种试剂盒，检定是在96孔板中进行且具有可由分光光度平板读取器测量的比色读数。

测量抗增殖活性

也检定hIFN多肽的抗增殖活性。IFNα的显著影响在于其抑制细胞生长的能力，其在测定抗肿瘤作用时尤其重要。已证实人类类淋巴母细胞Daudi细胞系对IFNα尤其敏感，且其已用于测量许多IFNα和衍生杂合多肽中的抗增殖活性（Meister等人,J Gen Virol.(1986)8月；67(Pt 8):1633-43）。通过其在悬浮液培养物中生长的能力已促进这种细胞系的使用（Evinger和Pestka,(1981)Methods Enzymol.79:362-368）。

人类Daudi B细胞系是购自ATCC（Manassas,VA）且生长于补充有丙酮酸钠、青霉素、链霉素（Invitrogen,Carlsbad,San Diego）和10%热灭活胎牛血清（Hyclone,Logan,UT）的RPMI 1640中。在37℃下将细胞培养物保持在5% CO₂的潮湿气氛中。

以每孔1×10⁴个细胞的密度将Daudi细胞接种于平底96孔板中。用每个剂量浓度三份增加浓度的IFNα2A来活化细胞。在37℃下在5%CO₂下4天培育时期之后，将40μlCellTiter 96 Aqueous One溶液试剂（Promega Corporation,Madison,WI）添加到每一孔中，且将培养物另外培育3小时。使用Spectromax在490nm下读取吸光度。自用SigmaPlot以OD_490nm（三份的平均值）对蛋白质浓度绘制的剂量反应曲线获得EC_50S。参看图5。

因为在纯化hIFN多肽后的潜在污染物为内毒素，所以在抗增殖检定中测试多种内毒素含量。图6展示在所测试的含量下内毒素对检定不具有实质影响。

测量磷酸化Tyk2

Kawamoto等人在Experimental Hematology 200432:797-805以及Ishida等人Experimental Hematology 200533:495-503（其是以引用的方式并入本文中）中论述limitin与涉及Tyk2、CrkL、CrkII和Daxx的IFN-α之间的信号转导差异以及IFN的副作用。测量CrkL、CrkII和Tyk2的磷酸化的检定可用于评估本发明的hIFN多肽。可如Platanias等人在Experimental Hematology 1999;27:1315-1321（其是以引用的方式并入本文中）中所述进行评估CrkII在U-266中的磷酸化。为测量Tyk2的磷酸化，将人类U266B1细胞（ATCC,Manassas,VA）保持在补充有丙酮酸钠、青霉素、链霉素（Invitrogen,Carlsbad,SanDiego）和15%热灭活胎牛血清的RPMI 1640中。在37℃下将细胞培养物保持在5%CO₂的潮湿气氛中。在测量Tyk2时，在37℃下用IFNα2A将血清饥饿U266细胞活化5分钟。按照制造商（Cell Signaling Technology,Beverly,MA）所建议，将所有刺激细胞固定、渗透且用适当磷酸基抗体染色。在FACS阵列上进行样品获取，其中所获取的数据是在Flowjo软件（Tree Star Inc.,Ashland,OR）上分析。自使用SigmaPlot以平均荧光强度对蛋白质浓度绘制的剂量反应曲线得到EC₅₀值。IFNAR2的胞外域的竞争检定适用于测定特异性。关于Tyk2参看图8。

表4和表5概述由作为IFNα2a变体的hIFN多肽所获得的数据。展示自IFNAR2的胞外域的亲和性研究获得的pSTAT1数据、抗增殖数据、K_d值。测试包括非天然编码氨基酸对乙酰基-苯丙氨酸（pAF）的hIFN多肽以及包括pAF的聚乙二醇化hIFN多肽。在这些研究中所用的对照物包含WHO IFNα2A、获自Sigma的IFNαA以及

表4

表5展示固定为100%的

的检定结果。

菌落形成检定

诸如由Giron-Michel,J.在Leukemia 2002 16:1135-1142中所述的菌落形成检定可用于通过本发明的hIFN多肽评估祖细胞的增殖。在菌落形成检定中可使用脐血。

评估hIFN多肽对人类骨髓和红系祖细胞的毒性

使用以甲基纤维素为基础的活体外菌落形成检定来测试10种化合物（9种hIFN多肽和

）的造血毒性。

细胞：将正常人类骨髓光密度细胞（Poietics Inc.,Maryland）储存在-152℃下直至检定需要。在实验当天，将细胞在37℃下迅速解冻，将小瓶内含物稀释于10ml含有2%胎牛血清的Iscove氏培养基中且通过离心洗涤。丢弃上层清液，且将细胞丸粒再悬浮于已知体积的含有2%FBS的Iscove氏培养基中。通过台盼蓝排除法进行细胞计数（3%冰乙酸）和生存能力评估。

测试样品：化合物为于20mM NaAc、50mM NaCl、5%甘油的缓冲液（pH 6.0）中的40×储备液。用相同缓冲液制备每一化合物的稀释液以产生浓度为144、72、36、18和9μg/ml的储备液。当添加到甲基纤维素中时，缓冲液为2.5%的最终浓度且化合物浓度在3.6-0.225μg/ml范围内。用相同缓冲液将在20mM NaAc、50mM NaCl、5%甘油的缓冲液（pH 6.0）中含有50EU/ml内毒素的对照物1:40稀释于甲基纤维素中以研究相似含量的内毒素的影响。

方法：在含有饱和浓度的细胞因子SCF（干细胞因子；50ng/mL）、GM-CSF（粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；10ng/mL）、IL-3（白细胞介素3；10ng/mL）和EPO（促红细胞生成素；3U/mL）的以甲基纤维素为基础的培养基（MethoCult^TM 4434）中评估克隆源性红系祖细胞（CFU-E和BFU-E）、粒细胞-单核细胞（CFU-GM）和多潜能（CFU-GEMM）谱系。CFU-E为来源于最成熟红血球系菌落形成细胞的小红血球系菌落。其含有一至两个具有总数为8-200个成红血球细胞的丛集。BFU-E为来源于更原始细胞的较大红血球系菌落。其含有多于200个成红血球细胞。CFU-GM为来源于能够产生具有40个或40个以上粒细胞-单核细胞和/或巨噬细胞的菌落的菌落形成细胞的菌落。CFU-GEMM为含有来自一个以上谱系的细胞的菌落。其来源于最原始菌落形成细胞且含有红血球系细胞以及20个或20个以上粒细胞、巨噬细胞和巨核细胞。作为对照，也设立含有媒剂（20mM NaAc、50mM NaCl、5%甘油，pH 6.0）、含内毒素的媒剂和各种浓度的5-氟尿嘧啶（已知骨髓抑制性化合物）的培养物。也建立不含缓冲液或化合物的标准培养物。

在所述以甲基纤维素为基础的培养基中设立克隆源性红系祖细胞（CFU-E和BFU-E）、粒细胞-单核细胞/骨髓（CFU-GM）和多潜能（CFU-GEMM）谱系。将化合物添加到MethoCult^TM中以得到最终浓度为3.6、1.8、0.9、0.45和0.225μg/ml。也起始不含化合物但浓度与媒剂缓冲液相当的媒剂对照培养物、不含化合物但浓度与内毒素相当的内毒素对照培养物以及不含化合物或媒剂缓冲液的标准对照物。另外，用浓度为5、1、0.5和0.1μg/ml的5-氟尿嘧啶（5-FU）起始培养物以充当毒性的阳性对照物。以每个培养物1×10⁴个细胞的浓度分三份设立所有培养物。在培养物中历时14天之后，对菌落进行评估且计分。根据尺寸和形态，将菌落分为以下种类：CFU-E、BFU-E、CFU-GM和CFU-GEMM。

结果和分析：对CFU-E、BFU-E、CFU-GM和CFU-GEMM的三重复培养物计数。另外，分析菌落类型的分布以及一般菌落和细胞形态。在复本培养物中所检测的菌落数的变化表示菌落计数的变化系数。结果展示于表6中。对于统计学分析来说，将所有化合物与媒剂对照物进行比较。进行标准t检验以评估在由对照物与经处理培养物产生的菌落数之间是否存在差异。由于菌落计数的潜在主观性，认为小于0.01的p值为显著的。

ND=未检测到

总红血球系=CFU-E+BFU-E

总CFC=总红血球系+CFU-GM+CFU-GEMM

$p<0.01

*p<0.005

#p<0.001

**p<0.0005

在媒剂和内毒素对照物中检测的菌落数目和分布与标准对照物（不含化合物与媒剂缓冲液）没有区别。在用5-氟尿嘧啶培育的培养基中可见剂量依赖性毒性效应（对红血球系和骨髓祖细胞增殖的抑制性作用）。在5μg/ml的最高浓度下可见生长的完全抑制。在1μg/ml（对于红血球系和骨髓生长来说）下且在0.5μg/ml（仅对于骨髓生长来说）下也可见自对照物数目的显著减少，表明5-FU对骨髓细胞谱系毒性更大。在0.1μg/ml下菌落数目恢复至接近对照物含量。

在各hIFN多肽或

存在的情况下，所得红血球系和骨髓菌落的形态未受干扰。然而，如果菌落数受到影响，那么两种菌落类型的尺寸也如此。发现在所测试的所有浓度下所有hIFN多肽和对菌落形成细胞（骨髓和红系祖细胞）的总数有毒性，其展示轻微剂量依赖性效应。hIFN多肽和确实对祖细胞化合物产生轻微逐渐剂量依赖性影响。在0.225μg/ml下未发现

具显著毒性，且在0.45μg/ml（仅6HisM16pAF-30K PEG）和0.225μg/ml下未发现6His M16pAF-30K PEG和6HisN65pAF-30K PEG对红系祖细胞具显著毒性。然而，对于所有化合物来说，在所测试的所有浓度下CFC的总数得到显著抑制。在所有化合物存在的情况下也发现菌落尺寸较小且尺寸反映可见毒性。举例来说，在3.6μg/ml

存在的情况下的菌落比在0.225μg/ml下所观测到的菌落更小。

如图10展示CFU-GM菌落计数（Y轴）的进一步分析，其中抗病毒活性的国际单位在X轴上。在抗病毒检定中

的比活性为1纳克/单位。使用在VSV复制检定中所测量的抗病毒IC50值将聚乙二醇化hIFN多肽的质量浓度转变为国际单位。对照标准物的FU-GM菌落计数绘制于图的右侧。绘制在检定中测试的5种浓度的

的CFU-GM菌落计数。随着

浓度自约3600单位/毫升降低到225单位/毫升，菌落计数增加。也展示聚乙二醇化hIFN多肽的菌落计数。

所有hIFN多肽展示对CFU-GM计数的浓度依赖性影响。以每单位计，在此检定中hIFN多肽6HisI24pAF-30K PEG和6HisN65pAF-30K PEG似乎比

毒性更大。在抗病毒检定中6HisN65pAF-30K PEG比

的效力小至少5倍，但发现其与IFNR2受体紧密结合。相反，具有相等菌落计数的6HisE78pAF-30K PEG似乎比在两倍高单位浓度下的的毒性小约两倍。举例来说，在1600单位/毫升的浓度下6HisE78pAF-30K PEG菌落计数为22，与之相比，在900单位/毫升下PEGASYS菌落计数为21。关于毒性的其它研究包含但不限于CFU-GM毒性研究，对于每一hIFN多肽其具有自15000单位/毫升至1单位/毫升操作的12点浓度曲线以测定CFU-GM毒性的IC50。

表7展示由

和病毒唑所获得的造血毒性数据。

是在20mM乙酸钠、137mM NaCl、0.005%聚山梨酸酯80的缓冲液（pH 6.0）中且具有180μg/ml的起始浓度。病毒唑（Calbiochem目录号555580）在PBS中的起始浓度为7.63mg/ml。如表7中所示，测试每一样品的稀释液。

对于各化合物绘制BFU-E、CFU-GM或总CFC对浓度（μg/ml）产生的图展示于图12-17中。

抗病毒检定

可由多种检定来测量hIFN多肽的抗病毒活性。一种此检定涉及研究经水疱性口腔炎病毒（VSV）感染的细胞的细胞病理效应（CPE）的降低。通过感染幼仓鼠肾细胞系BHK21（ATCC）产生VSV（ATCC）。简单来说，将细胞经各种量的病毒感染，且在感染24小时后收集含有病毒的上层清液。通过在1,200rpm下将上层清液离心5分钟来消除细胞碎片。在-80℃下将病毒储备液以1ml等分试样储存。通过使用斑块检定来计算病毒滴度。由PFU/ml（斑块形成单位）来表示滴定。用于测试本发明的hIFN多肽的抗病毒活性的其它检定包含但不限于以HCV复制子为基础的检定（Dr.Brent Korba,Department of Microbiology and Immunology,Georgetown University Medical Center）。在稳定HCV RNA-复制细胞系AVA5中检定多种hIFN多肽；此细胞系是人类肝母细胞瘤Huh7的衍生物。在添加最后剂量的hIFN多肽24小时后测量细胞内HCV RNA含量。使用标准印迹杂交技术来测量RNA含量。测试HCV复制子的两种菌株，HCV菌株1a和1b。另一种HCV检定是基于在支持HCV复制的特异性人类细胞中HCV复制的测量（Dr.Brent E.Korba或Dr.Thomas I.Michalak,M.D.,Ph.D.(Faculty of Medicine HealthScience Centre Memorial University St.John's,Canada)）。评估hIFN多肽的生物活性的另一种检定利用旱獭肝细胞。人类IFN-α上调在此类型细胞中的I类MHC抗原表达和2'-5-OAS mRNA（Dr.Thomas I.Michalak,M.D.,Ph.D）。在肝细胞中测量本发明的hIFN多肽对I类MHC表达和/或2'-5'-OAS含量的影响。

为评估hIFN多肽活性，将3×10⁴个人类WISH细胞（ATCC）于96孔板中接种且随后经每孔10,000PFU的VSV感染。在感染时，添加不同量的hIFN多肽。在感染后48小时，评估CPE；42-48小时为获得100%CPE所需的最少时间。通过用0.1ml的1mg/ml溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)2,5-二苯基四唑鎓（MTT）将细胞染色，接着在570nm下分光光度读数（其中690nm作为参考波长）来鉴别CPE。在线粒体中MTT测量代谢降低。

表8概述由

和33种在指定位点处具有取代且经聚乙二醇化的hIFN多肽所获得的IC50值。也由此检定测试具有对乙酰基苯丙氨酸取代的未聚乙二醇化hIFN多肽。图9展示由9种聚乙二醇化hIFN多肽和

所获得的剂量依赖性曲线。

发现位点特异性聚乙二醇化改变IFN的活性且可分离蛋白质的各种生物化学性质。如图11中所示，发现这种位点特异性聚乙二醇化的效应是由于用各hIFN多肽对高亲和性IFN受体IFNR2的K_d对抗病毒IC50数据进行分析产生。气泡的尺寸表示各hIFN多肽对IFNR2的经测量K_d。在以细胞为基础的抗病毒检定中，两种IFN多肽6HisI24pAF-30K PEG和6HisE107pAF-30K PEG比

的效力高约5倍。同样，在IFNR2受体K_d与抗病毒活性之间缺乏相关性。因此，有证据表明位点特异性聚乙二醇化可有差别地改变IFN的生物化学活性。因此，已制备具有改良的抗病毒效力的hIFN多肽，其各种其它所测量生物化学性质也不同。

实例26

其它检定

HLA-A,B,C表达的测量

测量THP-1细胞中细胞表面MHC I类表达增加的检定也可用于测试hIFN多肽的活性。如上文所指示来培养人类单核细胞系THP-1。首先在5nM佛波醇（phorbol）12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（Sigma,St Louis,MO）存在的情况下使细胞浓度为每毫升5×10⁵个细胞的THP-1细胞分化。随后在37℃下将分化THP-1细胞用增加浓度的IFNα2A刺激24小时。随后将IFNα2A活化细胞收集、洗涤且染色以进行表面HLA表达。在碘化丙啶（BD Biosciences,San Diego,CA）存在的情况下用APC接合抗-HLA-A,B,C抗体进行免疫荧光染色能够促成在FACS阵列上进行样品分析，其中所获取的数据是在Flowjo软件上分析。自利用SigmaPlot用平均荧光强度对蛋白质浓度绘制的剂量反应曲线来估计EC50值。参看图7。

PGE2和cAMP检定

用于评估hIFN多肽的活体外检定的实例包含但不限于检测前列腺素E2（PGE2）增加或cAMP降低的检定，如（例如）Wang等人,J.ofNeuroimmunology 2004 156:107-112和Jiang等人,Neurochemistry 2000 36:193-196中所述，其是以引用的方式并入本文中。描述PGE2分泌检定的其它引用包含但不限于Mazzucco等人,J.Leukoc Biol 1996；60(2):271-7；Hoozemans等人,Exp.Gerontol.2001年3月;36(3):559-70；Fiebich等人,JNeurochem.2000年11月;75(5):2020-8；Schwende等人,J Leukoc Biol 1996；59(4):555-61；以及Hoozemans等人,Acta Neuropathol(Berl.)2001年1月;101(l):2-8，其是以引用的方式并入本文中。所属领域的一般技术人员已知对这些方法的更改。

进行以细胞为基础的检定，例如，将本发明的hIFN多肽与调节PGE2或cAMP含量的对照物或目前IFN治疗剂进行比较。测量PGE2分泌的这些检定涉及诸如人类THP-1白血病细胞和人类成神经细胞瘤细胞（SK-N-SH）的细胞系。经脂多糖（LPS）攻毒的分化THP-1细胞展示PGE2的分泌增加。在SK-N-SH细胞中，IL-1β增加PGE2分泌。这些检定可用于研究由目前IFN疗法所发现的发热诱发和/或止痛作用与前列腺素E2（PGE2）或cAMP含量的经调节分泌的相关性。

如下检测cAMP含量：使5×10⁴个SK-N-SH成神经细胞瘤细胞（ATCC）粘附于96孔检测板（Applied Biosystems,Foster City,CA）上整夜。随后在37℃下用以下物质刺激细胞15分钟：（a）单独10μM佛司可林（forskolin）；（b）10μM佛司可林加hIFN多肽（对于非PEG形式为60pM且对于PEG形式为600pM）和（c）10μM佛司可林加hIFN多肽加20μM纳洛酮（类鸦片受体拮抗剂）。随后将细胞溶解，且在室温下用cAMP-碱性磷酸酶接合物和抗-cAMP抗体将溶菌酶培育1小时。随后添加化学发光底物且在Topcount发光读取器上测量发光量。根据cAMP标准曲线来定量溶菌酶中存在的cAMP的量。

基因表达概况

使用寡核苷酸阵列转录分析的单聚乙二醇化干扰素-α-2a异构体的转录活性描述于Foser等人,Pharmacogenomics Journal 2003；3:312-319中。可用于表达研究中的细胞系包含但不限于黑素瘤细胞系（诸如ME15）。可对本发明的hIFN多肽进行DNA阵列的替代性检定以提供mRNA概况或差示基因表达信息。

其它检定

支持初步调配物研究的检定包含对于蛋白质脱酰胺化、聚集、氧化、乙酰化的检定和其它指示稳定性的检定。其它检定包含但不限于研究其它潜在降解产物（包含但不限于二硫化物重排和蛋白水解降解产物）的检定。

实例27

本实例描述用于克隆、表达和纯化本发明的hIFN多肽的替代性系统。这种替代性系统的可能优点包含但不限于取消一个或一个以上涉及hIFN多肽的再折叠的步骤。NusA融合蛋白和TEV论述于Davis等人,Biotechnol Bioeng(1999);65:382-388；Shih等人,Protein Science 2005;14:936-941；以及美国专利第5,162,601号；第5,532,142号；第5,766,885号；和第5,989,868号中，所有文献都是以引用的方式并入本文中。

Nus-hIFN多肽融合体的克隆和构筑体

为产生NusA-hIFN融合体，在由序列GSGENLYFQ（其包含GSG连接子和TEV的识别序列）隔开的Spel和Kpnl限制位点之间的NusA下游克隆hIFN核苷酸序列。使用Novagen的pET44载体完成所有初始克隆步骤，且随后将整个Nus-IFN融合体盒转移到另一载体中，其允许由T71ac启动子控制的hIFN的表达以及蛋白质经1mM IPTG诱发。用含有经修饰hIFN聚核苷酸序列和正交氨基酰基tRNA合成酶/tRNA对（对所需非天然编码氨基酸具特异性）的构筑体转化大肠杆菌（Origami 2）允许将非天然编码氨基酸位点特异性地并入hIFN多肽中。

Nus-hIFN融合体的纯化和裂解

将5ml LB培养物自经编码NusA-hIFN融合体的构筑体转化的单一大肠杆菌菌落生长。将0.5升具有氨比西林LB接种，且将非天然编码氨基酸对乙酰基-苯丙氨酸添加到培养物中。在28℃-32℃下使培养物生长整夜。当培养物的OD大于0.8-1时，将培养物转移至30℃，且用1mM IPTG进行诱发。培养物在30℃下持续生长4小时，且收集样品用于SDS-PAGE分析。通过离心收集细胞且将其冷冻在-80℃下。

将细胞溶解于25-30ml的50mM Tris（pH 8）、200mM NaCl、5%甘油中。将样品在玻璃烧杯中超声波降解25秒5-6次，同时将样品保持在冰上。在室温下将细胞用10μL脱氧核糖核酸酶培育30分钟。随后将样品旋转且移除上层清液。将5mM咪唑添加到上层清液中。

随后以3ml/min将上层清液装载于5ml HisTrap柱上。在装载上层清液之前，用20mM Tris pH 8、300mM NaCl、0.005%Tween80、10mM咪唑（缓冲液A）平衡HisTrap柱。在用缓冲液A洗涤柱之后，用以下步骤梯度进行洗提：4柱体积的8%缓冲液B（20mM Tris pH 8、300mM NaCl、0.005%Tween80、0.5M咪唑）；5柱体积的30%缓冲液B；以及100%缓冲液B洗涤液。在30%缓冲液B步骤期间洗提NusA-hIFN融合体。将柱用1M NaOH/1M NaCl洗涤且在5次操作后汽提且再进料（或替换）。

由SDS-PAGE分析来自步骤梯度的样品，且将具有融合体的馏分（约75kDa）汇集且在4℃下对20mM Tris（pH 8）、20mM NaCl、5%甘油透析整夜。用透析缓冲液将样品稀释至30μM蛋白质。将以下物质添加到样品中：半胱胺至0.2mM，EDTA至1mM，且TEV至0.8μM。随后将样品在4℃下培育24-48小时，或在室温下培育整夜。

在培育之后，将样品用ddH₂O 1:3稀释且装载于5ml Q HP柱上。用0-40%梯度的10mM Tris（pH 8）（缓冲液A'）进行洗提进入大于18倍柱体积的缓冲液B'（10mM Tris（pH 8）、1M NaCl）中。HFN多肽在约100mM NaCl下洗提；TEV在250mM NaCl下，且NusA在400mM NaCl下。用2.5mM NaCl、接着1M NaCl/1M NaOH洗涤柱。

由SDS-PAGE分析洗提级分。将hIFN多肽级分汇集，且通过添加1/20体积的1MNaAc（pH 4.5）来调节集合的pH值，且随后将hIFN集合对20mM NaAc（pH 4）、20mMNaCl、5%甘油透析整夜。随后将样品浓缩至大于1mg/ml，保持体积大于300mcl。在280nm下的消光系数为22,500M^-1或1.17mg/ml^-1。

聚乙二醇化

以1:12摩尔比率（30mg/mg IFN/ml）将氧基氨基衍生30K PEG添加到hIFN多肽中，且将混合物在28℃下培育16-48小时。图19展示在接合中所用的30K PEG。用SP缓冲液A（50mM乙酸钠，pH 5）将样品稀释10倍。为纯化聚乙二醇化hIFN多肽，5mlSP HP AKTA柱使用大于10倍柱体积的梯度为0-50%的SP缓冲液B（50mM乙酸钠（pH5）、0.5M NaCl、10%乙二醇）。聚乙二醇化IFN洗提约100mM盐、接着未经聚乙二醇化单体（基线分离）。将聚乙二醇化hIFN的级分汇集，对以下储存缓冲液透析：20mM乙酸钠（pH 6）、0.005%Tween、125mM NaCl。随后将样品浓缩到大于8mM且储存在4℃下。

TEV的纯化

用以下方案产生经纯化TEV。在30℃下用pRK793-TEV(S219V)质粒（来自NCI）转化0.5-2升BL21(DE3)RIL细胞（Stratagene）的培养物。当OD600为0.8-1.2时进行诱发，且在30℃下持续生长4-5小时。将细胞再悬浮于20-30ml的NTA缓冲液（50mMTris（pH 7）、300mM NaCl）中。随后将样品在冰上超声波降解30秒5次，在室温下培育30分钟，且在12,000rpm下离心20分钟。将上层清液移除，且添加咪唑至15mM。

将上层清液装载于在补充有15mM咪唑的NTA缓冲液中平衡的5mL HisTrap柱上。用大于18倍柱体积的梯度为0-100%的B（具有0.5M咪唑的NTA缓冲液）进行洗提。TEV洗提为起始200mM咪唑的宽峰。由SDS-PAGE分析洗提级分，且将含有洁净TEV的级分汇集。将经汇集级分对以下缓冲液（30mM Tris（pH 7.2）、200mM NaCl、0.5mMEDTA、1mM DTT）透析整夜。将经透析样品离心以移除任何沉淀物。

随后将旋转物质用ddH₂O透析四倍且装载于用缓冲液A（10mM Tris pH 7、50mMNaCl）平衡的5ml SP FF AKTA柱上。将柱用大于18倍柱体积的线性梯度为0-100%的B（10mM Tris（pH 7）、0.5M NaCl）洗提。将经洗提TEV级分汇集，且将以下物质添加到集合中：1mM DTT、1mM EDTA、20%甘油。将样品浓缩到大于20μM（消光系数32,500，pI为9.6），等分为每管500mcl，且储存在-20℃下。

抗病毒活性

为评估通过本实例中所述的方法产生的hIFN多肽的活性，将3×10⁴个人类WISH细胞（ATCC）接种于96孔板中且随后经每孔10,000PFU的VSV感染。在感染时，添加不同量的hIFN多肽。在感染后48小时评估CPE；42-48小时为获得100%CPE所需的最少时间。通过用0.1ml的1mg/ml溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)2,5-二苯基四唑鎓（MTT）将细胞染色，接着在570nm下分光光度读数（其中690nm作为参考波长）来鉴别CPE。在线粒体中MTT测量代谢降低。5种聚乙二醇化hIFN多肽和

的抗病毒活性展示于图18中。包括非天然编码氨基酸的甲硫氨酰基hIFN多肽由“M-”hIFN多肽指定，其中不存在作为第一氨基酸的甲硫氨酸，其也是由涉及NusA的方法产生。

实例28

本实例描述测量本发明的hIFN多肽的活体外和活体内活性的方法。

细胞结合检定

在0℃下在各种浓度（体积：10μl）的未经标记IFN、hIFN或GM-CSF不存在或存在的情况下且在I-IFN（约100,000cpm或1ng）存在的情况下将细胞（3×10⁶个）在PBS/1%BSA（100μl）中双份培育90分钟（总体积：120μl）。随后将细胞再悬浮且成层于350μl塑料离心管中的200μl冰冷FCS上且离心（1000g；1分钟）。通过切断管的末端来收集丸粒且以γ计数器（Packard）对丸粒和上层清液分别计数。

特异性结合（cpm）经确定为在不存在竞争试剂的情况下的总结合（复本的平均值）减去在100倍过量的未标记IFN存在的情况下的结合（cpm）（非特异性结合）。对所用各细胞类型测量非特异性结合。实验是使用相同¹²⁵I-IFN制剂不在同一天进行且应显示内部一致性。¹²⁵I-IFN证实与Daudi细胞结合。所述结合是以剂量依赖性方式受到未经标记天然IFN或hIFN抑制，但并不受GM-CSF或其它阴性对照物抑制。hIFN竞争结合天然¹²⁵I-IFN的能力与天然IFN类似，表明受体同样良好地识别两种形式。

根据聚乙二醇化IFN的活体内研究

将PEG-hIFN、未经修饰hIFN和缓冲溶液投与小鼠或大鼠。与未经修饰hIFN相比，结果将展示本发明的聚乙二醇化hIFN的出色活性和延长的半衰期，其是由使用每只小鼠或大鼠相同剂量的显著增加的病毒复制抑制作用来表明。

测量接合和未接合hIFN和其变体的活体内半衰期

使用雄性Sprague Dawley大鼠（约7周龄）。在投药当天，测量每只动物的体重。将每千克体重100μg的未接合和接合hIFN样品各自经静脉内注射入三只大鼠的尾静脉内。在注射后1分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时和24小时时，在CO₂麻醉下自每只大鼠取500μl血液。通过离心（4℃，18000×g，5分钟）自血液样品分离血清。将血清样品储存在-80℃下，直至分析时。在解冻冰上的样品后，由IFN活体外活性检定来定量血清样品中的活性IFN的量。

抗病毒活性

存在许多测量细胞对病毒的抵抗程度的所属领域的技术人员已知的检定（McNeillTA,J Immunol Methods.(1981)46(2):121-7）。这些检定通常可分为三类：抑制细胞病理效应；病毒斑块形成；和降低病毒产量。病毒细胞病理效应检定测量在经IFN预处理且随后感染病毒的细胞培养物中诱发的保护程度。举例来说，水疱性口腔炎病毒为用于此检定的适当病毒。这种类型的检定可方便地筛检众多不同的IFN，因为其可在96孔板中进行。细胞病理效应降低检定的实例详述于Wang等人,NeuroReport(2001)12(4):857-859中。斑块减少检定测量经IFN处理的细胞培养物对斑块形成病毒（举例来说，麻疹病毒）的抗性。这种检定的一个益处在于其允许精确测量斑块形成的50%减少。最后，病毒产量检定测量在（例如）单一生长周期期间自细胞释放的病毒量。这些检定适用于测试IFN对不产生细胞病理效应或在靶细胞培养物中不形成斑块的病毒的抗病毒活性。病毒感染剂量（感染多重度）为使用斑块减少或病毒产量检定时应考虑的重要因素。

在实验室装置中也易于检定其它临床上重要的干扰素特征。一个此种特征为干扰素多肽与特异性细胞表面受体结合的能力。举例来说，一些IFNα-2a显示与IFNα-2b（在临床试验中最广泛使用的IFN）相比不同的细胞表面性质。尽管IFNα-2b为有效抗病毒剂，但其产生显著不利的副作用。显示与IFNα-2b不同结合性质的干扰素可能不产生相同不利作用。因此，在细胞上与IFNα-2b不良竞争结合位点的干扰素受到临床关注。所属技术领域中众所周知竞争性干扰素结合检定（Hu等人,J Biol Chem.(1993)6月15日;268(17):12591-5；Di Marco等人,(1994)Biochem.Biophys.Res.Comm.202:1445-1451，其是以引用的方式并入本文中）。一般来说，这些检定涉及用经¹²⁵I标记的IFNα-2b和所关注的未经标记干扰素的混合物来培育细胞培养物细胞。随后移除未经结合干扰素，且测量结合标记（且补充来说，结合经¹²⁵I标记的IFNα-2b）的量。通过比较在竞争干扰素存在或不存在的情况下与细胞结合的标记的量，可计算相对结合亲和性。

IFNα的另一个显著作用在于其抑制细胞生长的能力，其在测定抗肿瘤作用时尤其重要。生长抑制检定已良好形成，且通常视氚化胸苷（[³H]胸苷）或另一种放射性标记的细胞计数或吸收而定。已证实人类类淋巴母细胞Daudi细胞系对IFNα尤其敏感，且其已用于测量许多IFNα和衍生杂合多肽的抗增殖活性（Meister等人,J Gen Virol.(1986)8月；67(Pt 8):1633-43）。通过其在悬浮液培养物中生长的能力已促进这种细胞系的使用（Evinger和Pestka,(1981)Methods Enzymol.79:362-368）。IFNα也显示许多免疫调节活性（Zoon等人,(1986)在The Biology of the Interferon System.Cantell和Schellenkens编,Martinus Nyhoff Publishers,Amsterdam中）。

尽管IFN首先由病毒学家发现，但其首次临床使用（在1979年）是作为骨髓瘤的治疗剂（Joshua等人,(1997)Blood Rev.11(4):191-200）。后来已展示IFNα可有效抵抗众多病毒性、恶性、血管生成性、过敏性、发炎性和纤维化来源的疾病（Tilg,(1997)Gastroenterology.112(3):1017-1021）。也已证实其可有效治疗转移性肾癌和慢性骨髓性白血病（Williams和Linch,(1997)Br.J.Hosp.Med.57(9):436-439）。IFN的临床使用概述于Gresser(1997)J.Leukoc.Biol.61(5):567-574和Pfeffer(1997)Semin.Oncol.24(3增刊9):S9-S63S969中。

镇痛检定

可用hIFN多肽进行痛阈研究以研究这些化合物的止痛作用。一种此镇痛检定描述于Wang等人,NeuroReport(2001)12(4):857-859中，其是以引用的方式并入本文中。

实例29

本实例描述测量本发明的hIFN多肽的活体内活性和毒性的方法。

用于研究hIFN多肽的抗病毒活性的动物模型包含但不限于黑猩猩HCV（Purcell RH,FEMS Microbiol Rev.1994年7月；14(3):181-91）、HCV-Trimera小鼠（Ilan E等人,J InfectDis.2002年1月15日;185(2):153-61）以及Alb-uPA转基因小鼠模型（Mercer DF等人,Nat Med.2001年8月;7(8):927-33；Kneteman,N等人,(2003)10th HCV Meeting KyotoJapan,P-187），所有文献都是以引用的方式并入本文中。旱獭中的旱獭肝炎病毒（WHV）感染为研究HBV感染的发病机理、预防和治疗的有用模型（Berraondo,P.等人,J.Med.Virology 2002；68,424-432）。在产前暴露于WHV中的旱獭的病状类似于HBV感染。在旱獭肝炎模型中评估化合物，即聚乙二醇化人类干扰素多肽、聚乙二醇化旱獭干扰素化合物类似物或以一些方式经修饰以增加其对旱獭的物种交叉反应性足以进行抗病毒功效聚乙二醇化人类干扰素多肽。

也使用猕猴来研究活体内活性和骨髓毒性。通过测量与诸如

的目前IFN治疗剂相比，由本发明的hIFN多肽对下游标记（包含但不限于2',5'-OAS）的诱发来检定活性。与诸如

的目前IFN治疗剂相比，在投与hIFN多肽后，在骨髓毒性研究中评估循环血细胞（包含但不限于嗜中性粒细胞、RBC和血小板）。2',5'-OAS为由干扰素诱发的酶且与干扰素的抗病毒活性直接相关。这种酶产生寡核苷酸（2-5A）的混合物，认为其活化细胞中存在的非活性核糖核酸酶且通过mRNA的分解阻止细胞或病毒的蛋白质合成。可由所属领域的一般技术人员已知的多种检定（包含但不限于放射性免疫检定（RIA；EIKEN），其测量2-5A的含量）进行2',5'-OAS活性的检测。例如，猕猴血清可用于测量2',5'-OAS活性量。新喋呤为在暴露于干扰素中之后由巨噬细胞产生的非物种特异性免疫标记。可由所属领域的一般技术人员已知的多种检定（包含但不限于EIA（IBL））来进行新喋呤的检测。在这些研究中可测量其它分子的含量（包含但不限于皮质醇含量）。在抑郁症、压力症和体重增加中已牵涉皮质醇（HPA轴的元件）。可由所属领域的一般技术人员已知的多种检定（包含但不限于EIA（RnD））来进行皮质醇的检测。在投与本发明的hIFN多肽后可贯穿研究过程实施细胞因子板且比较各种细胞因子含量与基本含量以评估hIFN多肽的毒性。也可使用所属领域的一般技术人员已知的多种检定（包含但不限于ELISA、微珠阵列（BD Biosciences）和其它检定形式（Luminex））且其可涉及不同类型的读数（包含但不限于荧光读数）。可使用所属领域的一般技术人员已知的多种检定（包含但不限于ELISA（PBL））来检测血清或血浆中化合物含量的测量，用于由ELISA或其它方法检测的抗体可为经聚乙二醇化的hIFN多肽的抗-IFNα抗体或抗-PEG抗体。所属领域的一般技术人员已知的各种检定形式可用于检测（包含涉及荧光的那些检测）。

用以下临床前计划进行本发明的hIFN多肽的评估。在研究1中，在雌性猕猴中起始剂量范围发现药物动力学（PK）、药效学（PD）和安全性研究且其涉及安慰剂和四个剂量的

（0、1.5、15、50和150μg/kg）。使猴适应两周。在第1天和第5天投与15μg/kg、50μg/kg和150μg/kg的

在第1天仅投与1.5μg/kg

在5组中各有三只雌性猴。在生命中持续时间为14天，其中在数据允许的情况下选择另外进行至少一周。端点为通过整合至第8天与第15天的AUG所测量的血浆中的化合物含量；以及至第15天的2',5'-OAS和新喋呤含量。在此研究中，在第3天、第8天和第15天进行研究经投与hIFN多肽对嗜中性粒细胞和血小板的影响的血液学研究。也对用于比较的动物进行预放血。也实施细胞因子板至第15天，其测量各种细胞因子（包含但不限于IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、TNF和IFN-γ）的含量。也测量皮质醇至第15天。也测量猴的直肠体温，因为发热也是目前IFN治疗剂的已知副作用。

在已从第一研究中选择一个或两个剂量后，研究2涉及在一个或两个剂量下比较本发明的hIFN多肽与

如果单一剂量适于比较PK、功效和毒性，那么在猕猴中测试

的特定剂量且将其与相同剂量的一种或一种以上hIFN多肽以及安慰剂进行比较。每一组中有三只雌性猴；适应时期为两周。与研究1中一样研究2',5'-OAS含量、血液学、体温、皮质醇和细胞因子板。如果需要两种剂量，即PK和功效需要低剂量且毒性比较需要另一种剂量，那么将

与两种剂量下的一种或一种以上hIFN多肽以及安慰剂进行比较。与研究1中一样研究2',5'-OAS含量、血液学、体温、皮质醇和细胞因子板。生命中研究的末端为第15天，其中在数据允许的情况下选择另外进行至少一周。

将骨髓自暴露于本发明的hIFN多肽的动物收集且评估。举例来说，从组织学上研究来自经治疗动物（例如，来自灵长类动物）的骨髓穿刺和/或穿刺活检，且估计骨髓细胞与有核红血球系细胞的比率（M:E比）。低M:E比结合嗜中性白血球减少症可表明具有降低的嗜中性粒细胞产生的粒细胞减少症。对来自经治疗动物的分离骨髓细胞检定造血祖细胞。也就是说，使细胞分离物经受CFU-GM或BFU-E菌落检定。结果（即造血祖细胞的数目）会展示（如果存在的话）治疗对骨髓和/或红血球系祖细胞的影响。

这些骨髓毒性研究可涉及通过不同途径（包含但不限于经皮下和静脉内）投与的hIFN多肽。静脉内投药可允许比皮下投药更长的给药方案和更好的骨髓毒性评估。这些改进可由调节免疫原性或对经投与化合物的抗体反应而产生。毒性研究包含评估每毫升血浆或血清的嗜中性粒细胞和血小板数目。

其它动物模型包含但不限于抑郁症模型。一个小鼠模型涉及悬尾试验。也进行在投与hIFN多肽后测量小鼠中皮质醇和ACTH的含量的检定。皮质醇与ACTH都是HPA轴的组分且已暗示其在患者中在干扰素治疗诱发的抑郁症中起作用。

实例30

本实例详述hIFN多肽的分离以及hIFN活性和这些hIFN多肽对hIFN受体的亲和性的测量。

由铜柱进行纯化

500ml LB振荡烧瓶表达：

对于每一种hIFN多肽来说，将经具有突变hIFN聚核苷酸的编码正交tRNA（美国专利公开案第20030108885号中所述的J17）和正交氨基酰基tRNA合成酶（在名称为“Compositions of Aminoacyl-tRNA Synthetase and Uses Thereof”的美国专利申请案第11/292,903中所述的E9）的构筑体转化的大肠杆菌划线于平板上以获得菌落。用来自新鲜转化平板的单一菌落接种2mL含有抗生素的LB。在37℃下在恒定搅拌（250rpm）下培育培养物直至培养物达到约0.05-0.3的OD600（约5-6小时）。用所有或部分2mL培养物接种500mL LB（含有抗生素和4mM pAF），从而将接种规范化以同步培养物。在37℃下在恒定搅拌（250rpm）下培育培养物直至培养物达到约1.0的OD600（约4-5小时）。随后用1mM IPTG诱发培养物，且在37℃下将培养物培育整夜。通过在4℃下在8000rpm/12000g下离心15分钟来收集细胞。将细胞糊状物刮出且储存在40mL OakRidge管中。随后将细胞丸粒冷冻在-80℃下直至起始包涵体制备。

自500mL振荡烧瓶制备包涵体：

缓冲液1为50mM NaAc pH 6.0；100mM NaCl；1mM EDTA；1.0%Triton X-100。缓冲液2为50mM NaAc pH 6.0；100mM NaCl；1mM EDTA。表9展示用于包涵体制备的程序。

对于溶解步骤来说，通过在4℃下振荡1小时将细胞再悬浮于23mL冷缓冲液1中。用100mL水以及随后30mL缓冲液1来清洁且冲洗Avestin C3。随后用以下方式在4℃下在冷却下在15,000-20,000psi下将细胞在Avestin中均质化两个回合：1）添加样品。2）将样品处理一次直至Avestin储槽几乎为空；将样品收集于原始管中（在随后步骤中也进行）。3）将所收集样品添加回至Avestin储槽中且再均质化。4）通过均质化12mL缓冲液1将样品洗出；将此添加到样品中。5）将样品转移到40mL Oak Ridge离心管中。6）将样品储存且使100mL水流经Avestin，在流动以冲洗系统时将其缓慢添加。7）随后将30mL缓冲液1添加到储槽中且均质化以制备下个样品。8）随后重复步骤以处理下个样品。

对于洗涤和冲洗步骤来说，在自最后洗涤液倒出上层清液且倒入新鲜缓冲液中之后，使用刮刀使丸粒离开管。在75%功率下用正常尖端而不是微尖端来进行超声波降解。在不同样品之间用水冲洗且用Kimwipe擦拭尖端。

在前4个步骤期间，将样品于用于储存细胞丸粒的40mL Oak Ridge管中旋转。通过将每个样品分到2个15mL圆锥形管中而旋转冲洗2。

溶解和再折叠：

使用50mM NaAc或Tris用pH值介于5.5-8.5之间的8M GndHCl来进行溶解。将包涵体溶解至最终浓度在5-10mg/mL之间。将物质再折叠或储存于-80℃下以进行长期储存。

通过在4℃再折叠缓冲液（100mM NaAc（pH 6.0）或50mM Tris（pH 8.0）；0.1%Tween 20）中将溶解物质稀释到最终总蛋白质浓度为0.5mg/mL来进行再折叠。将再折叠混合物储存在4℃下历时24小时至72小时。

Cu纯化：

使再折叠样品温至室温。将最终浓度为50μM的CuCl添加到再折叠样品中，且在室温下将样品培育10-30分钟。将样品用0.22μm PES过滤器过滤且装载于装有Cu且经Cu缓冲液A（50mM NaAc，pH 5.0；150mM NaCl；0.1%Tween 20）平衡的螯合琼脂糖凝胶HP柱（GE Healthcare）上。流过大于18倍柱体积的达到100%Cu缓冲液B（100mM NaAc，pH 3.5；150mM NaCl；0.1%Tween 20）的线性梯度，且将样品收集于含有1mM EDTA的管中。

Cu集合的SP HP纯化：

将hIFN多肽峰自Cu柱收集且直接装载于在SP缓冲液A（50mM NaAc，pH 5.0；1mM EDTA）中平衡的SP HP柱（GE Healthcare）上。流过大于15倍柱体积的达到50%SP缓冲液B（50mM NaAc，pH 5.0；0.5M NaCl；10%乙二醇；1mM EDTA）的线性梯度。

聚乙二醇化和纯化：

将hIFN多肽样品自SP HP柱汇集且浓缩到1.0-2.0mg/mL。将10%乙酸添加到样品中以使pH值降至4.0。以1:12摩尔比率（30mg/mg IFN/ml）将氧基氨基衍生30K PEG添加到hIFN多肽中，且将混合物在28℃下培育48-72小时。图19展示在接合中所用的30K PEG。将在位置107处包括非天然氨基酸对乙酰基苯丙氨酸的一种hIFN多肽与分枝40K PEG接合。此PEG作为化合物IV（mPEG（40K）氨基乙氧基胺盐酸盐）展示于图20中，且所述图展示自mPEG（40K）对硝基苯酚碳酸盐的合成流程。用于40K聚乙二醇化产物的摩尔比率和接合条件以及纯化方法与30K聚乙二醇化产物相同。用SP缓冲液A（50mM乙酸钠，pH 5；1mM EDTA）将样品稀释10倍。为纯化聚乙二醇化hIFN，SP HP柱（GE Healthcare）使用大于15倍柱体积的梯度为0-50%的SP缓冲液B（50mM乙酸钠（pH 5）、0.5M NaCl、10%乙二醇；1mM EDTA）。聚乙二醇化IFN洗提约100mM盐、接着未经聚乙二醇化单体（基线分离）。将聚乙二醇化hIFN的级分汇集，对以下储存缓冲液透析：20mM乙酸钠（pH 6）、0.005%Tween、125mM NaCl。将样品浓缩到1.0-2.0mg/mL且储存在-80℃下。

用于官能化甘油基分枝40K PEG的方法展示于下（图20）。向mPEG(40K)对硝基苯酚碳酸盐I（20g，0.5mmol）和N-氨基乙氧基邻苯二甲酰亚胺盐酸盐II（0.6g，2.5mmol）于N，N-二甲基甲酰胺-二氯甲烷（1:2，150mL）中的混合物中添加二异丙基乙胺（DIEA，0.27mL，1.5mmol）和4-二甲基氨基吡啶（DMAP，催化剂）。在室温下将所得混合物搅拌20小时。添加乙酸乙酯-己烷（1:1，1L）。将沉淀物过滤，用乙酸乙酯-己烷（1L）洗涤且在真空中干燥以得到呈白色粉末状的产物III。

将来自上个步骤的mPEG（40K）N-氨基乙氧基邻苯二甲酰亚胺III溶解于肼于二氯甲烷-甲醇（1:1，100mL）中的0.5M溶液中。将所得混合物在室温下搅拌1.0小时且随后用HCl水溶液（0.5N，300mL）洗涤。将有机层经无水Na₂SO₄干燥、过滤且浓缩。将残余物溶解于CH₂Cl₂（100mL）中。添加乙酸乙酯-己烷（1:1，1L）以沉淀呈白色粉末状的mPEG（40K）氨基乙氧基胺盐酸盐产物IV（17.6g，I的88%）。

Biacore研究(受体结合亲和性)

随后使用Amicon搅拌单元将再折叠反应物浓缩到25ml，且对20mM Tris（pH 8）、20mM NaCl、10%甘油透析整夜。使用AKTA FPLC系统（Amersham）用HP Q Sepharose纯化单体再折叠IFNAR ECD。使用由制造商推荐的赖氨酸特异性偶合程序将经纯化IFNAR2ECD固定于CM5Biacore芯片上。约200RU的功能性蛋白质经固定。以每分钟50mcl的流动速率将于HBS-EP缓冲液（Biacore）中的各种浓度的IFN变体注射于含有经固定IFNAR2的流动池和含有经固定牛血清白蛋白的对照流动池上。使用BiaEvaluation软件（Biacore）将产生的Sensogram拟合为1:1相互作用模式以计算k_on、k_off和K_d值。观测在非天然编码氨基酸（对乙酰基苯丙氨酸；pAF）处聚乙二醇化的hIFN多肽的受体结合亲和性。测试在pAF处聚乙二醇化且在位置149处具有天然编码氨基酸取代的其它突变体。包含甲硫氨酰基野生型干扰素（M-WT）作为对照样品。表10展示所获得的k_on、k_off和K_d。所展示hIFN多肽不具有6-His标签且如本实例中所述经再折叠。

表10：如由SPR所测定的IFNα2A:IFNAR2相互作用的结合参数

抗病毒检定

为评估hIFN多肽抗病毒活性，将3×10⁴个人类WISH细胞（ATCC）接种于96孔板中且随后经每孔10,000PFU的VSV感染。在感染时，添加不同量的hIFN多肽。在感染后48小时评估CPE；42-48小时为获得100%CPE所需的最少时间。通过用0.1ml的1mg/ml溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)2,5-二苯基四唑鎓（MTT）将细胞染色，接着在570nm下分光光度读数（其中690nm作为参考波长）来鉴别CPE。在线粒体中MTT测量代谢降低。

表11和表12展示基于由在指定位点处具有非天然氨基取代（对乙酰基苯丙氨酸，pAF）且在所述位点处经聚乙二醇化的hIFN多肽获得的IC50值的相对抗病毒活性%。少数hIFN多肽在位置149处也具有天然氨基酸取代。使用实例27中所述的NusA系统制造一对突变体且其在N末端含有甲硫氨酸（由“M-”指示）。

用作对照物。

实例31

本实例详述hIFN活性和hIFN多肽对hIFN受体的亲和性的测量。使用实例27中的NusA系统来产生本实例中所述的hIFN多肽。基于limitin与IFNα2a之间的序列比较对IFNα2a多肽序列（SEQ ID NO:2）进行天然氨基酸取代。“M-”指示甲硫氨酸为多肽中的第一氨基酸。由在hIFNα-2a（SEQ ID NO:2）中的以下取代产生M-IFN“HV”或“HV”突变体：D77-D94经小鼠limitin序列HERALDQLLSSLWRELQV取代。由在hIFNα-2a（SEQ ID NO:2）中的以下取代产生M-IFN“CD”或“CD”突变体：V105-D114经GQSAPLP取代。

Biacore研究(受体结合亲和性)

随后使用Amicon搅拌单元将再折叠反应物浓缩到25ml，且对20mM Tris（pH 8）、20mM NaCl、10%甘油透析整夜。使用AKTA FPLC系统（Amersham）用HP Q Sepharose纯化单体再折叠IFNAR ECD。使用由制造商推荐的赖氨酸特异性偶合程序将经纯化IFNAR2ECD固定于CM5Biacore芯片上。约200RU的功能性蛋白质经固定。以每分钟50mcl的流动速率将于HBS-EP缓冲液（Biacore）中的各种浓度的IFN变体注射于含有经固定IFNAR2的流动池和含有经固定牛血清白蛋白的对照流动池上。使用BiaEvaluation软件（Biacore）将产生的Sensogram拟合为1:1相互作用模式以计算k_on、k_off和K_d值。包含甲硫氨酰基野生型干扰素（M-WT）作为对照样品。

表13展示由包括一个或一个以上天然氨基酸取代的hIFN多肽所获得的k_on、k_off和K_d。这些突变体是使用实例27中所述的NusA系统制造且其在N末端含有甲硫氨酸（由“M-”指示）。基于IFNα2a与limitin之间所发现的氨基酸差异来产生突变体序列。

表14展示由图19中所示的线性30K PEG聚乙二醇化的包括非天然氨基酸取代（对乙酰基苯丙氨酸）的hIFN多肽所获得的k_on、k_off和K_d。这些突变体是使用上述NusA系统制造且其在N末端含有甲硫氨酸（由“M-”指示）。

表13：如由SPR所测定的IFNα2A:IFNAR2相互作用的结合参数

IFNα2A	k_on，×10^-41/M*s	k_off，1/s	K_d，nM
				M-WT	6.4	0.025	4
M-G10E	6	0.03	5
				M-M16R	11	0.012	1.1
M-T79R	9.2	0.026	2.8
				M-K83Q	5.1	0.027	5.4
M-K83S	3.7	0.029	7.7
				M-Y85L	7.3	0.051	7
M-T86S	6.6	0.024	3.6
				M-E87S	8	0.066	9
M-Q90R	9.9	0.021	2.1
				M-Q91E	5.5	0.041	7.5
M-D94V	7	0.017	2.4
				M-E96K	7.5	0.025	3.3
M-R120K	5.5	0.026	4.6
				M-K121T	6	0.027	4.5
M-Q124R/R125G	6.5	0.023	3.5
				M-L128R	8.3	0.026	3.1
M-IFN“HV”	7.5	0.056	7.5
				M-N93Q	4.9	0.027	5.5
M-IFN“CD”	6.5	0.022	3.3
				M-M16R/Q90R/D94V	52	0.03	0.58
M-M16R/Q20R	21	0.022	1
				M-R149E			>10μM

表14：如由SPR所测定的IFNα2A:IFNAR2相互作用的结合参数

抗病毒检定

表15展示基于由包括一个或一个以上天然氨基取代的hIFN多肽获得的IC₅₀值的相对抗病毒活性%。

实例32

本实例详述hIFN活性和hIFN多肽对hIFN受体的亲和性的测量。在本实例中所述的hIFN多肽是使用以下方法产生。

由HIC柱纯化

500ml LB振荡烧瓶表达：

自500mL振荡烧瓶制备包涵体：

缓冲液1为50mM NaAc pH 6.0；100mM NaCl；1mM EDTA；1.0%Triton X-100。缓冲液2为50mM NaAc pH 6.0；100mM NaCl；1mM EDTA。表16展示用于包涵体制备的程序。

对于溶解步骤来说，通过在4℃下振荡1小时将细胞再悬浮于23mL冷冻缓冲液1中。用100mL水以及随后30mL缓冲液1来清洁且冲洗Avestin C3。随后用以下方式在4℃下在冷却下在15,000-20,000psi下将细胞在Avestin中均质化两个回合：1）添加样品。2）将样品处理一次直至Avestin储槽几乎为空；将样品收集于原始管中（在随后步骤中也进行）。3）将所收集样品添加回至Avestin储槽中且再均质化。4）通过均质化12mL缓冲液1将样品洗出；将此添加到样品中。5）将样品转移到40mL Oak Ridge离心管中。6）将样品储存且使100mL水流经Avestin，在流动以冲洗系统时将其缓慢添加。7）随后将30mL缓冲液1添加到储槽中且均质化以制备下个样品。8）随后重复步骤以处理下个样品。

对于洗涤和冲洗步骤来说，在自最后洗涤液倒出上层清液且倒入新鲜缓冲液之后，使用刮刀使丸粒离开管。在75%功率下用正常尖端而不是微尖端来进行超声波降解。在不同样品之间用水冲洗且用Kimwipe擦拭尖端。

在前4个步骤期间，将样品于用于储存细胞丸粒的40mL Oak Ridge管中旋转。通过将每个样品分于2个15mL圆锥形管中而旋转冲洗2。

溶解和再折叠：

使用50mM NaAc或Tris用pH值介于5.5-8.5之间的8M GndHCl来进行溶解。将包涵体溶解至最终浓度在5-10mg/mL之间。添加最终浓度为10mM的β-巯基乙醇，且在室温下将样品培育30-60分钟。将物质再折叠或储存于-80℃下以进行长期储存。

通过在4℃再折叠缓冲液（50mM Tris，pH 8.3；0.5M精氨酸）中将溶解物质稀释到最终总蛋白质浓度为0.5mg/mL来进行再折叠。将再折叠混合物储存在4℃下2-4天。

HIC纯化：

使hIFN多肽再折叠样品温至室温。将最终浓度为1.5M的NaCl添加到样品中，且在室温下将样品培育30-60分钟。将样品用0.22μm PES过滤器过滤且装载于在HIC缓冲液A（20mM磷酸钠，pH 7.0；1.5M NaCl；2M尿素）中平衡的Butyl 650M柱（Tosoh）上。流过大于20倍柱体积的达到100%HIC缓冲液B（20mM磷酸钠，pH 7.0；2M尿素）的线性梯度。

HIC集合的SP HP纯化：

将IFN多肽峰自Butyl柱收集且用水稀释至小于30m/S。用HCl将样品的pH值调节到3.0且将其装载于在SP缓冲液A1（50mM NaAc，pH 3.0；1mM EDTA）中平衡的SP HP柱（GE Healthcare）上。在样品经装载后，用2柱体积的SP缓冲液A以及随后4柱体积的SP缓冲液A2（50mM NaAc，pH 5.0；1mM EDTA）洗涤柱。流过大于15倍柱体积的100%SP缓冲液A2至50%SP B缓冲液（50mM NaAc，pH 5.0；0.5M NaCl；10%乙二醇；1mM EDTA）的线性梯度。

聚乙二醇化和纯化：

将hIFN多肽样品自SP HP柱汇集且浓缩到1.0-2.0mg/mL。将10%乙酸添加到样品中以使pH值降至4.0。以1:12摩尔比率（30mg/mg IFN/ml）将氧基氨基衍生30K PEG添加到hIFN多肽中，且将混合物在28℃下培育48-72小时。图19展示在接合中所用的30K PEG。用SP缓冲液A（50mM乙酸钠，pH 5；1mM EDTA）将样品稀释10倍。为纯化聚乙二醇化hIFN，SP HP柱（GE Healthcare）使用大于15倍柱体积的梯度为0-50%的SP缓冲液B（50mM乙酸钠（pH 5）、0.5M NaCl、10%乙二醇；1mM EDTA）。聚乙二醇化IFN洗提约100mM盐、接着未经聚乙二醇化单体（基线分离）。将聚乙二醇化hIFN的级分汇集，对以下储存缓冲液透析：20mM乙酸钠（pH 6）、0.005%Tween、125mM NaCl。将样品浓缩到1.0-2.0mg/mL且储存在-80℃下。

Biacore研究(受体结合亲和性)

随后使用Amicon搅拌单元将再折叠反应物浓缩到25ml，且对20mM Tris（pH 8）、20mM NaCl、10%甘油透析整夜。使用AKTA FPLC系统（Amersham）用HP Q Sepharose纯化单体再折叠IFNAR ECD。使用由制造商推荐的赖氨酸特异性偶合程序将经纯化IFNAR2ECD固定于CM5 Biacore芯片上。约200RU的功能性蛋白质经固定。以每分钟50mcl的流动速率将于HBS-EP缓冲液（Biacore）中的各种浓度的IFN变体注射于含有经固定IFNAR2的流动池和含有经固定牛血清白蛋白的对照流动池上。使用BiaEvaluation软件（Biacore）将产生的Sensogram拟合为1:1相互作用模式以计算k_on、k_off和K_d值。观测在非天然编码氨基酸（对乙酰基苯丙氨酸；pAF）处聚乙二醇化的hIFN多肽的受体结合亲和性。包含甲硫氨酰基野生型干扰素（M-WT）和

作为对照样品。

表17展示由包括非天然编码氨基酸pAF且在所述非天然编码氨基酸处经如图19中所示的线性30K PEG聚乙二醇化的hIFN多肽所获得的k_on、k_off和K_d。另外，一些所测试hIlFN多肽具有天然氨基酸取代。举例来说，通过取代SEQ ID NO:2的位置45处的非天然氨基酸pAF来产生T79R/N45pAcF-30K PEG且在位置79处的苏氨酸氨基酸是经天然编码氨基酸精氨酸取代。

表17：如由SPR所测定的IFNα2A:IFNAR2相互作用的结合参数

抗病毒检定

表18展示基于由在指定位点处具有非天然氨基取代且在所述位点处经聚乙二醇化的hIFN多肽获得的IC50值的相对抗病毒活性%。具有较低IC50值的hIFN多肽展示较高相对活性%。另外一些聚乙二醇化hIFN多肽具有天然编码氨基酸取代（T79R；Y85L；E87S；Y85S）。

实例33

测量抗增殖活性

也检定在先前实例（实例30-32）中所述hIFN多肽的抗增殖活性。IFNα的显著影响在于其抑制细胞生长的能力，其在测定抗肿瘤作用时尤其重要。已证实人类类淋巴母细胞Daudi细胞系对IFNα尤其敏感，且其已用于测量许多IFNα和衍生杂合多肽的抗增殖活性（Meister等人,J Gen Virol.(1986)8月；67(Pt 8):1633-43）。通过其在悬浮液培养物中生长的能力已促进这种细胞系的使用（Evinger和Pestka,(1981)Methods Enzymol.79:362-368）。

人类Daudi B细胞系是购自ATCC（Manassas,VA）且生长于补充有10%热灭活胎牛血清（Hyclone,Logan,UT）的RPMI 1640中。在37℃下将细胞培养物保持在5%CO₂的潮湿气氛中。

以每孔1×10⁴个细胞的密度将Daudi细胞接种于平底96孔板中。用最终体积为200μl的每个剂量浓度三份增加浓度的IFNα2A来处理细胞。在37℃下在5%CO₂下4天培育时期之后，将20μl WST-1溶液试剂（Roche目录号1644807）添加到每一孔中，且将培养物另外培育6小时。使用Spectromax在440nm下读取吸光度。自用SigmaPlot以OD 440nm（三份的平均值）对蛋白质浓度绘制的剂量反应曲线获得IC₅₀。

表19展示由未经聚乙二醇化和经聚乙二醇化的不同hIFN分子获得的结果。“Cu”指示使用如实例30中所述的铜柱制备的多肽。“HIC”指示使用如实例32中所述的HIC方法制备的多肽。

实例34

菌落形成检定

诸如由Giron-Michel,J.在Leukemia 200216:1135-1142中所述的菌落形成检定可用于评估本发明的hIFN多肽的祖细胞的增殖。在菌落形成检定中可使用脐血。

评估hIFN多肽对人类骨髓和红系祖细胞的毒性

使用以甲基纤维素为基础的活体外菌落形成检定来测试21种未经聚乙二醇化化合物（20种hIFN多肽，其中

作为对照物）和18种聚乙二醇化化合物（17种经30K PEG聚乙二醇化的多肽，其中作为对照物）的造血毒性。由实例27中所示的NusA方法制备未经聚乙二醇化hIFN多肽且其如实例31中所示经表征。如实例30和实例31中所示产生且表征聚乙二醇化hIFN多肽。

细胞：将正常人类骨髓轻密度细胞（Poietics Inc.,Maryland）储存在-152℃下直至检定需要。在实验当天，将细胞在37℃下迅速解冻，且将小瓶内含物稀释于10ml含有2%胎牛血清的Iscove氏培养基中且通过离心洗涤。丢弃上层清液，且将细胞丸粒再悬浮于已知体积的含有2%FBS的Iscove氏培养基中。通过台盼蓝排除法进行细胞计数（3%冰乙酸）和生存能力评估。

测试样品：化合物处于20mM NaAc、125mM NaCl、0.005%Tween 80（pH 6.0）的缓冲液中。以连续5倍稀释的10个测试浓度测试每一化合物。在每一剂量浓度下进行三份。用相同缓冲液制备每一化合物的稀释液以产生所需稀释液。当添加到甲基纤维素中时，缓冲液为6.7%的最终浓度且对于未经聚乙二醇化hIFN测试多肽来说化合物浓度在5-0.00000256μg/ml范围内且对于30K聚乙二醇化hIFN测试多肽来说化合物浓度在26-0.0000133μg/ml范围内。在初始30K聚乙二醇化hIFN测试多肽浓度较低的情况下，代替采用14-0.000007168μg/ml的浓度范围。

方法：在含有饱和浓度的细胞因子SCF（干细胞因子；50ng/mL）、GM-CSF（粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；10ng/mL）、IL-3（白细胞介素3；10ng/mL）和EPO（促红细胞生成素；3U/mL）的以甲基纤维素为基础的培养基（MethoCult^TM 4434）中评估克隆源性红系祖细胞（CFU-E和BFU-E）、粒细胞-单核细胞（CFU-GM）和多潜能（CFU-GEMM）谱系。CFU-E为来源于最成熟红血球系菌落形成细胞的小红血球系菌落。其含有一至两个具有总数为8-200个成红血球细胞的丛集。BFU-E为来源于更原始细胞的较大红血球系菌落。其含有多于200个成红血球细胞。CFU-GM为来源于能够产生具有40个或40个以上粒细胞-单核细胞和/或巨噬细胞的菌落的菌落形成细胞的菌落。CFU-GEMM为含有来自一个以上谱系的细胞的菌落。其来源于最原始菌落形成细胞且含有红血球系细胞以及20个或20个以上粒细胞、巨噬细胞和巨核细胞。在每次检定时设立含有MethoCult^TM 4434、细胞和培养基的标准对照物以及含有MethoCult^TM 4434、细胞和等量缓冲液、但不含化合物的缓冲液对照物以形成其中不应观测到毒性的状况。

在所述以甲基纤维素为基础的培养基中设立克隆源性红系祖细胞（CFU-E和BFU-E）、粒细胞-单核细胞/骨髓（CFU-GM）和多潜能（CFU-GEMM）谱系。将化合物添加到MethoCult^TM中以得到如上所述的最终浓度。也起始不含化合物但浓度与媒剂缓冲液相当的媒剂对照培养物，以及不含化合物或媒剂缓冲液但仅含培养基的标准对照物。以每个培养物1×10⁴个细胞的浓度分三份设立所有培养物。在培养物中历时14天之后，对菌落进行评估且计分。根据尺寸和形态，将菌落分为以下种类：CFU-E、BFU-E、CFU-GM和CFU-GEMM。

结果和分析：对CFU-E、BFU-E、CFU-GM和CFU-GEMM的三重复培养物计数。另外，分析菌落类型的分布以及一般菌落和细胞形态。在所有经设定测试中，未观测到与缓冲液对照物相比在标准培养物中所产生的菌落数之间的差异。然而，在各未经聚乙二醇化或聚乙二醇化hIFN多肽存在的情况下，当与标准和缓冲液检定对照物相比时，骨髓与红血球谱系的菌落数以及菌落尺寸受到干扰。然而，所得红血球系和骨髓菌落的形态未受影响。对于包含化合物对照物

和的所测试所有未经聚乙二醇化和聚乙二醇化hIFN来说，可见对骨髓与红系祖细胞的剂量依赖性毒性影响。

对测试化合物进行其它分析以标准化在化合物之间所观测到的抗病毒活性的差异。将在菌落形成检定中所用的hIFN多肽的质量浓度除以在VSV复制检定中所测量的抗病毒IC50值。随后将骨髓和红血球系菌落计数相对于对数x轴上的标准化蛋白质浓度绘制于Y轴上。与适当化合物对照物相比各测试多肽的相对毒性由因子rho决定，其中rho表示两个曲线之间x轴的移位。当rho>l时，测试化合物最有效且因此比对照物毒性更大。当rho>l时，改良倍数表示为负数，其具有rho的值（-rho）（参看表22和表23）。当rho<1时，测试化合物比化合物对照物的毒性更小。当rho<1时，改良倍数表示为正数，其具有1/rho的值（1/rho）（参看表20和表21）。对于未经聚乙二醇化hIFN多肽来说，

用作化合物对照物。对于聚乙二醇化hIFN多肽来说，

用作化合物对照物。

实例34

hIFN多肽的比较

对于VSV检定来说，活性较大的分子具有较低IC₅₀值。如果测试化合物的VSV IC₅₀小于M-WT（在N末端处具有甲硫氨酸的野生型干扰素）的VSV IC₅₀，那么改良倍数表示为VSV IC₅₀M-WT/VSV IC₅₀测试化合物。如果测试化合物的VSV IC₅₀大于M-WT的VSV IC₅₀，那么改良倍数表示为-(VSV IC₅₀测试化合物/VSV IC₅₀M-WT)。表22展示也在实例33中所述的一组hIFN多肽的改良倍数数据。

对于VSV检定来说，活性较大的分子具有较低IC₅₀值。如果测试化合物的VSV IC₅₀小于

的VSV IC₅₀，那么改良倍数表示为VSV IC50/VSV IC₅₀测试化合物。如果测试化合物的VSV IC₅₀大于

的VSV IC₅₀，那么改良倍数表示为-(VSV IC₅₀测试化合物/VSV IC₅₀

)。表23展示也在实例33中所述的一组聚乙二醇化hIFN多肽的改良倍数数据。

表24展示具有改良毒性的候选物以及其相关抗病毒活性改良倍数的列表。

实例35

包括非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hIFN的安全性和/或功效的人类临床试验。

进行0阶段研究以研究本发明的hIFN多肽的微量给药。此研究涉及小数目的个体。这些研究涉及测量由于投与一部分治疗性剂量而产生的分子标记变化。当药物投与受感染个体时，这些相同标记与治疗性反应相关。所获得的药物-反应信息适用于I阶段和II阶段试验设计。

目的为了比较经皮下投与的包括非天然编码氨基酸的聚乙二醇化重组人类hIFN与市售hIFN产品

或

的安全性和药物动力学。

患者在研究中招收18名年龄介于20-40岁且体重介于60-90kg之间的范围内的健康志愿者。所述个体应对血液学或血清化学以及阴性尿毒物学筛检、HIV筛检和B型肝炎表面抗原不具有临床显著异常实验值。其不应具有任何以下迹象：高血压；任何原发性血液疾病史；严重肝、肾、心血管、胃肠、泌尿生殖器、代谢、神经疾病史；贫血或抽搐病症史；对细菌或哺乳动物来源产品、PEG或人类血清白蛋白的已知过敏性；对含咖啡因饮料的习惯性和重度消费者；在进入研究的30天内参与任何其它临床试验或经输血或献血；在进入研究的3个月内曾接触hIFN；在进入研究的7天内患有疾病；且在进入研究的14天内在研究前身体检查或临床实验室评估时具有显著异常。可对所有个体评估安全性且按照预定时间收集用于药物动力学分析的所有血液收集物。所有研究都是在机构伦理委员会批准和患者同意下进行。

研究设计此将为在健康男性志愿者中的I阶段、单一中心、开放标记、随机性、两个时期交叉研究。将18名个体随机指定为两个治疗序列组（每组9名个体）中的一个。使用相等剂量的包括非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hIFN和所选市售产品在大腿上部经两个分开的给药期以皮下团注形式投与IFN。市售产品的剂量和投药频率是按照包装标签中所指示。必要时，通过包含其它组个体可将使用市售产品的其它剂量、给药频率或其它参数添加到研究中。各给药期由14天洗脱期分隔。对于两个给药期的每一个来说，个体在给药之前至少12小时以及给药后72小时被限制在研究中心，但在给药期之间不必如此。如果也存在欲对聚乙二醇化hIFN测试的其它剂量、频率或其它参数，那么可添加其它组个体。在这个研究中可使用经批准用于人类用途的多种IFN调配物。

和/或

为经批准用于人类用途的市售IFN产品。hIFN的实验调配物为包括非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hIFN。

血液取样在投与hIFN之前和之后通过直接静脉刺孔来连续取血。在给药之前约30分钟、20分钟和10分钟时（3个基线样品）以及在给药后大致以下时间：30分钟和1小时、2小时、5小时、8小时、12小时、15小时、18小时、24小时、30小时、36小时、48小时、60小时和72小时时获得用于测定血清IFN浓度的静脉血液样品（5mL）。将各血清样品分为两个等分试样。将所有血清样品储存在-20℃下。在干冰上运输血清样品。在第1天初始给药前不久、第4天早晨、第16天给药前不久以及第19天早晨进行快速临床实验测试（血液学、血清化学和尿分析）。

生物分析方法使用ELISA试剂盒程序（BioSource International（Camarillo,CA））来测定血清IFN浓度。

安全性测定在每次给药（第1天和第16天）前不久且在每次给药后6小时、24小时、48小时和72小时时记录生命特征。安全性测定是基于不利事件的发生率和类型以及临床实验测试自基线的变化。另外，评估生命特征（包含血压和身体检查结果）测量自研究前的变化。

数据分析通过自各给药后值减去由在给药前30分钟、20分钟和10分钟时收集的三个样品的IFN含量取平均值测定的平均基线IFN浓度而将给药后血清浓度值对给药前基线IFN浓度进行修正。如果给药前血清IFN浓度低于检定的定量含量，那么其不包含在平均值的计算中。自对基线IFN浓度修正的血清浓度数据来测定药物动力学参数。通过模型独立性方法在Digital Equipment Corporation VAX 8600计算机系统上使用最新版本BIOAVL软件来计算药物动力学参数。测定以下药物动力学参数：峰血清浓度（C_max）；出现峰血清浓度的时间（t_max）；通过使用线性梯形规则计算的从时间零时到最后血液取样时间（AUC_0-72）的浓度-时间曲线（AUC）下的面积；以及自清除速率常数计算的末期清除半衰期（t_1/2）。清除速率常数是由对数线性浓度-时间曲线的末期线性区域中的连续数据点的线性回归估计。对于每一次治疗计算药物动力学参数的平均标准偏差（SD）和变化系数（CV）。计算参数平均值的比率（经保存调配物/未经保存调配物）。

安全性结果不利事件的发生率在治疗组之间平均分布。与基线或研究前临床实验测试或血压无临床显著变化，且身体检查结果和生命特征测量与研究前无显著变化。两个治疗组的安全性概况似乎应类似。

药物动力学结果在所测量的每一时间点下将接受单一剂量的市售hIFN（例如

或

）后的所有18名个体的平均血清IFN浓度-时间概况（未对基线IFN含量进行修正）与包括非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hIFN进行比较。所有个体应具有在正常生理学范围内的给药前基线IFN浓度。自关于给药前平均基线IFN浓度修正的血清数据来测定药物动力学参数且测定C_max和t_max。hIFN（例如

）的平均t_max比包括非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hIFN的t_max显著更短。与包括非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hIFN的末期半衰期相比，hIFN（例如

）的末期半衰期值显著更短。

尽管本发明的研究是在健康男性个体中进行，但预期将在其它患者群体中出现类似吸收特征和安全性概况；诸如患有癌症或慢性肾衰竭的男性或女性患者、儿童肾衰竭患者、预存自体程序中的患者或计划进行选择性手术的患者。或者，在HCV个体中进行I阶段研究以评估聚乙二醇化hIFN多肽。

总之，经皮下投与的单一剂量的包括非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hIFN应为安全的且由健康男性个体或HCV个体良好耐受。根据不利事件的比较性发生率、临床实验值、生命特征和身体检查结果，hIFN（例如

）和包括非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hIFN的安全性概况应相当。包括非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hIFN向患者和卫生保健提供者潜在地提供巨大临床效用。

实例36

本实例详述用于产生包括非天然编码氨基酸的hIFN多肽的方法。经纯化再折叠hIFN多肽是根据下文中所述的方法与聚乙二醇接合。所属领域的一般技术人员已知对于用于再折叠多肽（诸如hIFN多肽）的下文中所述方法以及替代性方法的更改。对所述方法的更改包含但不限于一个或一个以上下文中所述步骤的添加、替换或删减。可使用的潜在方法或对所述方法的一个或一个以上更改包含但不限于用降低潜在地与hIFN多肽相互作用的污染蛋白质的量的试剂洗涤包涵体，这些试剂包含但不限于尿素和脱氧胆酸；向再折叠反应中添加试剂，这些试剂包含但不限于变性剂、盐酸胍、尿素、胱氨酸和催化量的还原剂。可使用除所述柱之外的柱以分离或纯化包括非天然编码氨基酸的hIFN多肽。这些柱包含但不限于疏水相互作用色谱（HIC）柱，诸如丁基、辛基或苯基HIC柱。替代性条件和溶液可用于hIFN多肽的分离或纯化，其包含但不限于使用诸如硫酸铵、柠檬酸钠和其它盐的替代性盐；缓冲液组分的调节包含但不限于调节盐浓度以促进与纯化/分离中使用的柱结合；改变pH值；替换一种或一种以上试剂；且包含一种或一种以上试剂（包含但不限于精氨酸）。

替代方法包含但不限于用胍溶解细胞丸粒以及所属领域的一般技术人员已知的其它方法。不同细菌菌株也可用于表达hIFN多肽。

IFN包涵体的纯化

对于各hIFN多肽来说，大肠杆菌菌株BL21(A1)、BL21(DE3)或W3110(B2)经具有突变hIFN聚核苷酸的编码正交tRNA（美国专利公开案第20030108885号中所述的J17）和正交氨基酰基tRNA合成酶（在名称为“Compositions of Aminoacyl-tRNA Synthetaseand Uses Thereof”的美国专利申请案第11/292,903中所述的E9）的构筑体转化。将细菌接种于具有氨比西林的LB Agar平板上且在37℃下培育整夜。将菌落选择且生长于培养物中以制备甘油储备液。

早晨使用甘油储备液的5μl等分试样来制备5ml发酵剂培养物。早晨将发酵剂培养物添加到含有对乙酰基苯丙氨酸（pAF）的LB培养基（1×LB；4mM pAF；1×AMP）中，且在晚上或当培养物具有大于1.0的OD时诱发细胞。在以250rpm振荡的情况下在37℃下使培养物生长/诱发整夜。

次日早晨测量培养物的OD，且使细胞形成丸粒。培养物的OD测量值介于约3与约8之间。将细胞丸粒在-80℃下冷冻或立即自丸粒来制备包涵体。用考马斯染色剂由SDS-PAGE分析等分试样以检查表达和所产生产物的长度。将细菌丸粒再悬浮于35mlIB1缓冲液（50mM NaAc，pH 6.0；100mM NaCl；1mM EDTA；0.1%Triton X）中。随后将样品超声波降解6次以再悬浮且溶解细胞。经历30秒超声波降解脉冲后，接着在冰上进行1分钟培育。在4℃下将细菌溶菌液在50ml Oakridge管中在13,000rpm下离心20分钟，且丢弃上层清液。用IB1缓冲液将丸粒洗涤4次，使用超声波降解以再悬浮。将包涵体旋转，且丢弃上层清液。用IB2缓冲液（50mM NaAc，pH 6.0；100mMNaCl；1mM EDTA）将丸粒洗涤两次，且丢弃上层清液。将丸粒再悬浮于5-15ml的8M盐酸胍（8M GnHCl；50mM NaAc pH 6.0）中且使用杜恩斯均化器（douncer）再悬浮。使用100倍稀释液测定样品浓度，且在280nm下测量OD。IFN消光系数为22800或1.17。样品浓度经标准化至5.0mg/ml蛋白质。用考马斯染色剂由SDS PAGE凝胶来测定包涵体的纯度。27种具有对乙酰基苯丙氨酸取代的hIFN多肽得到抑制，且27种突变体的包涵体得以分离。所产生的27种突变体中的每一种都具有一个非天然编码氨基酸取代，其中对乙酰基苯丙氨酸置换hIFN（SEQ ID NO:2）中的天然编码氨基酸。所产生的27种hIFN多肽在一个以下位置处具有取代：23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、128、129、131、132、133、134、135、136、137、158、159、160、161、162、163、164和165。

使用经纯化包涵体使hIFN再折叠

将100mg 5.0mg/ml hIFN添加到400ml再折叠缓冲液（50mM NaAc pH 6.0；0.1%Tween 20）中，同时在4℃下缓慢旋转。再折叠进行24小时至48小时。随后使再折叠混合物升到室温。随后添加50μM CuCl，且将样品混合。在室温下将样品培育15分钟。

蛋白质纯化和聚乙二醇化

将在再折叠期间形成的任何沉淀物旋转或过滤，且使用铜螯合物柱将正确折叠hIFN多肽纯化。铜柱缓冲液A为50mM NaAc，pH 5.0；0.15M NaCl；0.1%Tween 20。铜柱缓冲液B为100mM NaAc，pH 3.5；0.15M NaCl；0.1%Tween 20。

此时用考马斯染色剂由SDS-PAGE检查等分试样。将来自铜柱的汇集馏分装载于5ml SP HP阳离子交换柱上。5ml SP HP缓冲液A为50mM NaAc pH 6.0；1mM EDTA。5ml SP HP缓冲液B为50mM NaAc pH 6.0；1mM EDTA；500mM NaCl；10%乙二醇。此时通过在280nm下测量OD来测量总蛋白质的量，且也用考马斯染色剂实施SDS-PAGE。

将来自铜螯合物柱的馏分汇集且浓缩到大于1.0mg/ml且将10%乙酸添加到各样品中以使pH值达到4.0。以12:1摩尔比率添加在图19中所示的线性30K PEG。将样品在28℃下培育24小时至48小时。随后用Milli-Q水将样品稀释10倍，且用5ml SP HP柱纯化聚乙二醇化hIFN多肽。用考马斯染色剂实施SDS-PAGE以分析样品且测定较高分子量物质和未经聚乙二醇化的污染物的含量。收集来自SP柱的馏分，且随后将集合对储存缓冲液（25mM NaAc，pH 6.0；120mM NaCl；0.005%Tween 80）透析。随后由SDS-PAGE来分析最终产物的等分试样。将最终产物浓缩到180μg/ml，且将等分试样储存在-80℃下。

实例37

VSV抗病毒检定

可由多种检定测量hIFN多肽的抗病毒活性。使用水疱性口腔炎病毒（VSV）测定聚乙二醇化hIFN多肽的抗病毒活性。用于此检定的培养基为DMEM、10%FBS、1%青霉素/链霉素、5ml HEPES。其它试剂包含不含FBS和酚红的RPMI。在PBS中所用MTT储备液的浓度为5mg/mL。在4℃下仅将此储备溶液储存两周。

以每孔30,000个细胞的密度将人类WISH细胞接种于50μL培养基中。第二天，在培养基中进行hIFN多肽的2倍连续稀释。在这些实验中使用

作为对照物。以三份进行，将100μl经稀释hIFN多肽添加到WISH细胞中使最终孔体积为150μl。在37℃下在CO₂恒温箱中将细胞和hIFN多肽培育6小时。在此6小时培育之后，于体积为50μL的培养基中每孔添加10,000PFU的VSV；将20μL VSV稀释于每96孔/平板的5ml培养基中。通过在感染后吸气45小时来移除培养基。将平板在纸巾上轻轻敲击以移除残余培养基。

自5mg/mL MTT储备溶液添加50μl在不含酚红和FBS的RPMI中制备的1mg/mLMTT（溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-二基)2,5-二苯基四唑鎓）。对于每一次检定来说，通常新鲜制备1mg/mL MTT。随后，将平板在37℃下在CO₂恒温箱中培育3小时。通过吸气小心地移除MTT。每孔添加50μl异丙醇。将平板置于平板振荡器上30秒至40秒以完成MTT的形成。在560nm下读取平板，其中690nm作为参考波长。绘制数据且使用Sigma-Plot程序来计算IC₅₀。

表25概述通过多肽中的对乙酰基苯丙氨酸取代与30K PEG接合的20种hIFN多肽的抗病毒活性。第二列列出多个抗病毒活性实验中每一化合物的平均IC₅₀值。第三列为相对于在第二列中发现的平均IC₅₀值的功效%。

第四列为平均功效%。对于此数据来说，通过比较个别实验中IC₅₀与

的IC₅₀形成功效%。随后对所有实验的功效%取平均值。

表25：

实例38

本实例详述hIFN活性和hIFN多肽对hIFN受体的亲和性的测量。

Biacore研究(受体结合亲和性)

随后使用Amicon搅拌单元将再折叠反应物浓缩到25ml，且对20mM Tris（pH 8）、20mM NaCl、10%甘油透析整夜。使用AKTA FPLC系统（Amersham）用HP Q Sepharose纯化单体再折叠IFNAR ECD。使用由制造商推荐的赖氨酸特异性偶合程序将经纯化IFNAR2ECD固定于CM5 Biacore芯片上。约200RU的功能性蛋白质经固定。以每分钟50mcl的流动速率将于HBS-EP缓冲液（Biacore）中的各种浓度的IFN变体注射于含有经固定IFNAR2的流动池和含有经固定牛血清白蛋白的对照流动池上。使用BiaEvaluation软件（Biacore）将产生的Sensogram拟合为1:1相互作用模式以计算k_on、k_off和K_d值。包含

作为对照样品。表26展示由在实例37中表征的hIFN多肽所获得的平均k_on、k_off和K_d。也展示对每一值计算的标准偏差（SD）。

表26：

实例39

可由多种不同检定来评估本发明的hIFN多肽。潜在检定包含但不限于mRNA基因表达概况、CFU检定（包含但不限于CFU-GM和CFU-MK检定）、测量CrkL/STAT磷酸化的检定、MHC I类表达检定和mRNA概况以及动物研究（诸如在大鼠中的药物动力学研究、使用NOD/SCID重建模型的研究和在猴中的药物动力学/药效学）。诸如由Giron-Michel,J.在Leukemia 2002 16:1135-1142中所述或在本文中所述的那些菌落形成检定可用于评估由本发明的hIFN多肽进行的祖细胞增殖。骨髓或脐血可用于菌落形成检定中。

为评估本发明的经修饰hIFN多肽的生物活性，使用人类腺癌HeLa细胞系进行测量STAT3（信号转导子和转录活化因子家族成员）的磷酸化的检定。人类细胞系HeLa是购自ATCC（Manassas,VA）且常规在DMEM加10%热灭活胎牛血清中传代。将细胞保持在37℃下5%CO₂的潮湿气氛中。将HeLa细胞在不具有胎牛血清的检定培养基中饥饿整夜，随后在37℃下用增加浓度的hIFN多肽刺激10分钟。可用PathScanPhospho-STAT3（Tyr705）ELISA试剂盒（Cell Signaling Technology）测量STAT3的磷酸化。用此试剂盒，在96孔板中进行检定且其具有可由分光光度平板读取器测量的比色读数。

可使用NOD/SCID重建模型来评估本发明的hIFN多肽。可如先前所述在猴中进行PK/PD研究。猕猴也用于研究活体内活性和骨髓毒性。通过测量本发明的hIFN多肽对下游标记（包含但不限于2',5'-OAS）的诱发来检定活性。在投与hIFN多肽后，在骨髓毒性研究中评估循环血细胞（包含但不限于嗜中性粒细胞、RBC和血小板）。将骨髓自暴露于本发明的hIFN多肽的动物收集且评估。举例来说，从组织学上研究来自经治疗动物（例如，来自灵长类动物）的骨髓穿刺和/或穿刺活检，且估计骨髓细胞与有核红血球系细胞的比率（M:E比）。低M:E比结合嗜中性白血球减少症可表明具有降低的嗜中性粒细胞产生的粒细胞减少症。对来自经治疗动物的分离骨髓细胞检定造血祖细胞。也就是说，使细胞分离物经受CFU-GM或BFU-E菌落检定。结果（即造血祖细胞的数目）会展示（如果存在的话）治疗对骨髓和/或红血球系祖细胞的影响。这些骨髓毒性研究可涉及通过不同途径（包含但不限于经皮下和静脉内）投与的hIFN多肽。静脉内投药可允许比皮下投药更长的给药方案和更好的骨髓毒性评估。这些改进可由调节免疫原性或对经投与化合物的抗体反应而产生。毒性研究包含评估每毫升血浆或血清的嗜中性粒细胞和血小板数目。

可进行支持初步调配物研究的检定，其包含但不限于对于蛋白质脱酰胺化、聚集、氧化、乙酰化的检定和其它指示稳定性的检定。可使用研究其它潜在降解产物（包含但不限于二硫键重排物和蛋白水解降解产物）的其它检定。

应了解在本文中所述的实例和实施例仅为说明性目的且对其进行的各种更改或变化将建议给所属领域的技术人员且包含在本申请案的精神和范围内以及随附申请专利范围的范围内。在本文中所引用的所有公开案、专利和专利申请案因此是出于所有目的以引用的方式全部并入本文中。

表27：所引用的hIFN序列。

Claims

1.一种包括一个或一个以上非天然编码氨基酸的hIFN多肽，其具有至少一种经调节的生物活性。

2.根据权利要求1所述的hIFN多肽，其中所述hIFN多肽包括一个或一个以上翻译后修饰。

3.根据权利要求1所述的hIFN多肽，其中所述多肽是与连接子、聚合物或生物活性分子键联。

4.根据权利要求3所述的hIFN多肽，其中所述多肽是与水溶性聚合物键联。

5.根据权利要求1所述的hIFN多肽，其中所述多肽是与双官能聚合物、双官能连接子或至少一个其它hIFN多肽键联。

6.根据权利要求5所述的hIFN多肽，其中所述双官能连接子或聚合物是与第二多肽键联。

7.根据权利要求6所述的hIFN多肽，其中所述第二多肽为hIFN多肽。

8.根据权利要求4所述的hIFN多肽，其中所述水溶性聚合物包括聚乙二醇部分。

9.根据权利要求4所述的hIFN多肽，其中所述水溶性聚合物是与所述hIFN多肽中存在的非天然编码氨基酸键联。

10.根据权利要求1所述的hIFN多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由来自SEQ ID NO:2的残基1-9、10-21、22-39、40-75、76-77、78-100、101-110、111-132、133-136、137-155、156-165组成的群组的位置处经取代。

11.根据权利要求1所述的hIFN多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由来自SEQ ID NO:2的以下各残基组成的群组的位置处经取代：位置1之前（即在N末端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165或166（即在羧基末端）和其任何组合。

12.根据权利要求11所述的hIFN多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由来自SEQ ID NO:2的残基100、106、107、108、111、113、114和其任何组合组成的群组的位置处经取代。

13.根据权利要求11所述的hIFN多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由来自SEQ ID NO:2的残基41、45、46、48、49和其任何组合组成的群组的位置处经取代。

14.根据权利要求11所述的hIFN多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由来自SEQ ID NO:2的残基61、64、65、101、103、110、117、120、121、149和其任何组合组成的群组的位置处经取代。

15.根据权利要求11所述的hIFN多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由来自SEQ ID NO:2的残基6、9、12、13、16、96、156、159、160、161、162和其任何组合组成的群组的位置处经取代。

16.根据权利要求11所述的hIFN多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由来自SEQ ID NO:2的残基2、3、4、5、7、8、16、19、20、40、42、50、51、58、68、69、70、71、73、97、105、109、112、118、148、149、152、153、158、163、164、165和其任何组合组成的群组的位置处经取代。

17.根据权利要求4所述的hIFN多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由来自SEQ ID NO:2的以下各残基组成的群组的位置处经取代：位置1之前（即在N末端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100.101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165或166（即在羧基末端）和其任何组合。

18.根据权利要求17所述的hIFN多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由来自SEQ ID NO:2的残基6、9、12、13、16、41、45、46、48、49、61、64、65、96、100、101、103、106、107、108、110、111、113、114、117、120、121、149、156、159、160、161和162和其任何组合组成的群组的位置处经取代。

19.根据权利要求1所述的hIFN多肽，其中所述hIFN多肽包括一个或一个以上调节所述hIFN多肽对hIFN受体的亲和性的氨基酸取代、添加或缺失。

20.根据权利要求1所述的hIFN多肽，其中所述hIFN多肽包括一个或一个以上增加所述hIFN多肽的稳定性或溶解性的氨基酸取代、添加或缺失。

21.根据权利要求1所述的hIFN多肽，其中所述hIFN多肽包括一个或一个以上增加所述hIFN多肽在重组宿主细胞中的表达的氨基酸取代、添加或缺失。

22.根据权利要求1所述的hIFN多肽，其中所述hIFN多肽包括一个或一个以上增加所述hIFN多肽的蛋白酶抗性的氨基酸取代、添加或缺失。

23.根据权利要求1所述的hIFN多肽，其中所述非天然编码氨基酸可与另外不与所述多肽中的20种常见氨基酸中的任一种反应的连接子、聚合物或生物活性分子反应。

24.根据权利要求1所述的hIFN多肽，其中所述非天然编码氨基酸包括羰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。

25.根据权利要求24所述的hIFN多肽，其中所述非天然编码氨基酸包括羰基。

26.根据权利要求25所述的hIFN多肽，其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构：

27.根据权利要求24所述的hIFN多肽，其中所述非天然编码氨基酸包括氨氧基。

28.根据权利要求24所述的hIFN多肽，其中所述非天然编码氨基酸包括酰肼基。

29.根据权利要求24所述的hIFN多肽，其中所述非天然编码氨基酸包括肼基。

30.根据权利要求24所述的hIFN多肽，其中所述非天然编码氨基酸残基包括氨基脲基。

31.根据权利要求24所述的hIFN多肽，其中所述非天然编码氨基酸残基包括叠氮基。

32.根据权利要求31所述的hIFN多肽，其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构：

33.根据权利要求24所述的hIFN多肽，其中所述非天然编码氨基酸包括炔基。

34.根据权利要求33所述的hIFN多肽，其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构：

其中n为0-10；R₁为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R₂为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R₃为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。

35.根据权利要求4所述的hIFN多肽，其中所述水溶性聚合物具有介于约0.1kDa与约100kDa之间的分子量。

36.根据权利要求35所述的hIFN多肽，其中所述水溶性聚合物具有介于约0.1kDa与约50kDa之间的分子量。

37.根据权利要求4所述的hIFN多肽，其是通过使包括含羰基氨基酸的hIFN多肽与包括氨氧基、肼、酰肼或氨基脲基的水溶性聚合物反应来制备。

38.根据权利要求37所述的hIFN多肽，其中所述氨氧基、肼、酰肼或氨基脲基是通过酰胺键与所述水溶性聚合物键联。

39.根据权利要求4所述的hIFN多肽，其是通过使包括羰基的水溶性聚合物与包括包含氨氧基、肼、酰肼或氨基脲基的非天然编码氨基酸的多肽反应来制备。

40.根据权利要求4所述的hIFN多肽，其是通过使包括含炔氨基酸的hIFN多肽与包括叠氮基部分的水溶性聚合物反应来制备。

41.根据权利要求4所述的hIFN多肽，其是通过使包括含叠氮基氨基酸的hIFN多肽与包括炔部分的水溶性聚合物反应来制备。

42.根据权利要求24所述的hIFN多肽，其中所述叠氮基或炔基是通过酰胺键与水溶性聚合物键联。

43.根据权利要求4所述的hIFN多肽，其中所述水溶性聚合物为分枝或多臂聚合物。

44.根据权利要求43所述的hIFN多肽，其中所述分枝聚合物的各链具有介于约1kDa与约100kDa之间的分子量。

45.根据权利要求1所述的hIFN多肽，其中所述多肽为hIFN拮抗剂。

46.根据权利要求45所述的hIFN多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由来自SEQ ID NO:2的残基2、3、4、5、7、8、16、19、20、40、42、50、51、58、68、69、70、71、73、97、105、109、112、118、148、149、152、153、158、163、164、165和其任何组合组成的群组的位置处经取代。

47.根据权利要求45所述的hIFN多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由来自SEQ ID NO:2的残基22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、74、77、78、79、80、82、83、85、86、89、90、93、94、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137和其任何组合组成的群组的位置处经取代。

48.根据权利要求45所述的hIFN多肽，其中所述多肽包括一个或一个以上翻译后修饰、连接子、聚合物或生物活性分子。

49.根据权利要求48所述的hIFN多肽，其中所述聚合物包括选自由水溶性聚合物和聚乙二醇组成的群组的部分。

50.根据权利要求45所述的hIFN多肽，其中所述非天然编码氨基酸是存在于所述hIFN多肽的受体结合区内。

51.根据权利要求45所述的hIFN多肽，其中所述多肽防止所述hIFN受体的二聚合。

52.根据权利要求1所述的hIFN多肽，其中所述非天然编码氨基酸包括糖部分。

53.根据权利要求3所述的hIFN多肽，其中所述连接子、聚合物或生物活性分子是通过糖部分与所述多肽键联。

54.一种分离核酸，其包括在严格条件下与SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22杂交的聚核苷酸，其中所述聚核苷酸包括至少一个选择密码子。

55.根据权利要求54所述的分离核酸，其中所述选择密码子选自由琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子和四碱基密码子组成的群组。

56.一种制备权利要求3的hIFN多肽的方法，所述方法包括使包括非天然编码氨基酸的分离hIFN多肽与包括与所述非天然编码氨基酸反应的部分的连接子、聚合物或生物活性分子接触。

57.根据权利要求56所述的方法，其中所述聚合物包括选自由水溶性聚合物和聚乙二醇组成的群组的部分。

58.根据权利要求56所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包括羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。

59.根据权利要求56所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包括羰基部分且所述连接子、聚合物或生物活性分子包括氨氧基、肼、酰肼或氨基脲部分。

60.根据权利要求59所述的方法，其中所述氨氧基、肼、酰肼或氨基脲部分是通过酰胺键与所述连接子、聚合物或生物活性分子键联。

61.根据权利要求56所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包括炔部分且所述连接子、聚合物或生物活性分子包括叠氮基部分。

62.根据权利要求56所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包括叠氮基部分且所述连接子、聚合物或生物活性分子包括炔部分。

63.根据权利要求58所述的方法，其中所述叠氮基或炔部分是通过酰胺键与连接子、聚合物或生物活性分子键联。

64.根据权利要求57所述的方法，其中所述聚乙二醇部分具有介于约0.1kDa与约100kDa之间的平均分子量。

65.根据权利要求57所述的方法，其中所述聚乙二醇部分为分枝或多臂聚合物。

66.一种组合物，其包括权利要求1的hIFN多肽和医药学上可接受的载剂。

67.根据权利要求66所述的组合物，其中所述非天然编码氨基酸是与水溶性聚合物键联。

68.一种治疗患有由hIFN调节的病症的患者的方法，其包括向所述患者投与治疗有效量的权利要求66的组合物。

69.一种细胞，其包括权利要求54的核酸。

70.根据权利要求69所述的细胞，其中所述细胞包括正交tRNA合成酶或正交tRNA。

71.一种制备包括非天然编码氨基酸的hIFN多肽的方法，所述方法包括在允许包括非天然编码氨基酸的所述hIFN多肽表达的条件下培养包括一种或一种以上编码hIFN多肽的聚核苷酸且包括选择密码子、正交RNA合成酶和正交tRNA的细胞；以及纯化所述hIFN多肽。

72.一种增加hIFN多肽的血清半衰期或循环时间的方法，所述方法包括用一个或一个以上非天然编码氨基酸取代所述hIFN多肽中的任何一个或一个以上天然存在氨基酸。

73.根据权利要求1所述的hIFN多肽，其中所述多肽是经化学合成。

74.根据权利要求1所述的hIFN多肽，其中所述多肽是经核糖体合成。

75.一种包括非天然编码氨基酸的hIFN多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由SEQ ID NO:2的23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、128、129、131、132、133、134、135、136、137、158、159、160、161、162、163、164、165或SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸组成的群组的位置处经取代。

76.根据权利要求75所述的hIFN多肽，其中所述非天然编码氨基酸包括羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。

77.根据权利要求75所述的hIFN多肽，其中所述非天然编码氨基酸是与水溶性聚合物偶合。

78.根据权利要求75所述的hIFN多肽，其中所述水溶性聚合物为具有介于约0.1kDa与约100kDa之间的分子量的聚乙二醇部分。

79.根据权利要求78所述的hIFN多肽，其中所述聚乙二醇部分为分枝或多臂聚合物。

80.根据权利要求79所述的hIFN多肽，其中所述聚乙二醇部分具有介于约1kDa与约100kDa之间的分子量。

81.一种组合物，其包括权利要求75的hIFN多肽和医药学上可接受的载剂。

82.一种hIFN多肽，其包括一个或一个以上增加所述hIFN多肽在重组宿主细胞中的表达的氨基酸取代、添加或缺失。

83.一种hIFN多肽，其包括在单一氨基酸处通过共价键与所述hIFN多肽键联的水溶性聚合物。

84.根据权利要求83所述的hIFN多肽，其中所述水溶性聚合物包括聚乙二醇部分。

85.根据权利要求83所述的hIFN多肽，其中与所述水溶性聚合物共价键联的所述氨基酸为非天然编码氨基酸。

86.根据权利要求1所述的hIFN多肽，其中所述非天然编码氨基酸是与聚乙二醇分子键联。

87.根据权利要求1所述的hIFN多肽，其包括至少一个连接子、聚合物或生物活性分子，其中所述连接子、聚合物或生物活性分子是通过经核糖体并入所述多肽中的非天然编码氨基酸的官能团与所述多肽连接。

88.根据权利要求87所述的hIFN多肽，其中所述hIFN多肽经单聚乙二醇化。

89.根据权利要求1所述的hIFN多肽，其包括与一个或一个以上非天然编码氨基酸连接的连接子、聚合物或生物活性分子，其中所述非天然编码氨基酸是在预选位点处经核糖体并入所述多肽中。

90.根据权利要求89所述的hIFN多肽，其中所述hIFN多肽包括一个所述连接子、聚合物或生物活性分子。

91.根据权利要求1所述的hIFN多肽，其中所述hIFN多肽包括一个或一个以上翻译后修饰、连接子、聚合物、生物活性分子、水溶性聚合物、双官能聚合物、双官能连接子、其它hIFN多肽、第二多肽或聚乙二醇部分，且其中所述hIFN多肽选自由复合IFN、IFNα、IFNβ、IFNε、IFNγ、IFNω、IFNτ、IFNα-1a、IFNα-1b、IFNα-2a、IFNα-2b、IFNβ-1a、IFNβ-1b和IFNγ-1a组成的群组。

92.根据权利要求1所述的hIFN多肽，其中所述hIFN多肽包括一个或一个以上氨基酸取代、添加或缺失，其增加所述hIFN多肽对hIFN受体的亲和性、增加所述hIFN多肽的稳定性或溶解性、增加重组宿主细胞中或在活体外合成的所述hIFN多肽的表达或增加所述hIFN多肽的蛋白酶抗性，且其中所述hIFN多肽选自由复合IFN、IFNα、IFNβ、IFNε、IFNγ、IFNω、IFNτ、IFNα-1a、IFNα-1b、IFNα-2a、IFNα-2b、IFNβ-1a、IFNβ-1b和IFNγ-1a组成的群组。

93.根据权利要求1所述的hIFN多肽，其中所述hIFN多肽包括一个或一个以上调节所述hIFN多肽的免疫原性的氨基酸取代、添加或缺失。

94.根据权利要求1所述的hIFN多肽，其中所述hIFN多肽包括一个或一个以上调节所述hIFN多肽的血清半衰期或循环时间的氨基酸取代、添加或缺失。

95.一种调节hIFN多肽的免疫原性的方法，所述方法包括用一个或一个以上非天然编码氨基酸取代所述hIFN多肽中的任何一个或一个以上天然存在氨基酸。

96.根据权利要求1所述的hIFN多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由以下残基组成的群组的位置处经取代：31、134、34、38、129、36、122、37、121、41、125、124、149、117、39、118、120、107、108、106、100、111、113、114、41、45、46、48、49、61、64、65、101、103、102、110、117、120、121、149、96、6、9、12、13、16、68、70、109、159、161、156、160、162、24、27、78、83、85、87、89、164或其任何组合（SEQ ID NO:2）。

97.根据权利要求1所述的hIFN多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在位置107（SEQ ID NO:2）处经取代。

98.根据权利要求1所述的hIFN多肽，其中所述hIFN多肽包括一个或一个以上调节与类鸦片受体的相互作用的氨基酸取代、添加或缺失。

99.根据权利要求98所述的hIFN多肽，其中所述类鸦片受体为μ类鸦片受体。

100.根据权利要求1所述的hIFN多肽，其中所述hIFN多肽包括一个或一个以上调节5-HT脑神经传递的氨基酸取代、添加或缺失。

101.根据权利要求1所述的hIFN多肽，其中所述hIFN多肽包括一个或一个以上调节吲哚胺2,3-双加氧酶的诱发的氨基酸取代、添加或缺失。

102.根据权利要求1或96所述的hIFN多肽，其中所述hIFN具有抗病毒活性以及与hIFN相比降低的非抗病毒活性和副作用。

103.根据权利要求1所述的hIFN多肽，其进一步包括一个或一个以上选自由G10E、M16R、R13E、T79R、K83Q、K83S、Y85L、T86S、E87S、Q90R、Q91E、N93Q、D94V、E96K、R120K、K121T、Q124R、R125G、L128R、R149Y、R149E、R149S组成的群组的氨基酸取代，SEQ ID NO:2的D77-D94是经HERALDQLLSSLWRELQV置换，且SEQID NO:2的V105-D114是经GQSAPLP置换。